BRPI0917094B1 - Métodos para identificação de fibra de planta processada, para análise do genoma de uma planta de algodão produtora de fibra, e para o isolamento de DNA de ocorrência natural de fibras de planta de algodão processadas, uso dos referidos métodos, bem como métodos para o isolamento de um DNA de ocorrência natural de tecido ou de pano tricotado, para determinar as quantidades relativas de diferentes fibras de planta de algodão em uma mistura de fibras de algodão processadas, e para certificar a identidade de fibras de algodão comercializadas - Google Patents

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(54) Título: MÉTODOS PARA IDENTIFICAÇÃO DE FIBRA DE PLANTA PROCESSADA, PARA ANÁLISE DO GENOMA DE UMA PLANTA DE ALGODÃO PRODUTORA DE FIBRA, E PARA O ISOLAMENTO DE DNA DE OCORRÊNCIA NATURAL DE FIBRAS DE PLANTA DE ALGODÃO PROCESSADAS, USO DOS REFERIDOS MÉTODOS, BEM COMO MÉTODOS PARA O ISOLAMENTO DE UM DNA DE OCORRÊNCIA NATURAL DE TECIDO OU DE PANO TRICOTADO, PARA DETERMINAR AS QUANTIDADES RELATIVAS DE DIFERENTES FIBRAS DE PLANTA DE ALGODÃO EM UMA MISTURA DE FIBRAS DE ALGODÃO PROCESSADAS, E PARA CERTIFICAR A IDENTIDADE DE FIBRAS DE ALGODÃO COMERCIALIZADAS (51) lnt.CI.: C12Q 1/68 (30) Prioridade Unionista: 08/08/2008 EP 08014211.0, 11/08/2008 US 61/188,613 (73) Titular(es): BAYER CROPSCIENCE NV (72) Inventor(es): ANTONIO ARIOLI; STEVEN ENGELEN

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Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODOS PARA IDENTIFICAÇÃO DE FIBRA DE PLANTA PROCESSADA, PARA ANÁLISE DO GENOMA DE UMA PLANTA DE ALGODÃO PRODUTORA DE FIBRA, E PARA O ISOLAMENTO DE DNA DE OCORRÊNCIA NATURAL DE FIBRAS DE PLANTA DE ALGODÃO PROCESSADAS, USO DOS REFERIDOS MÉTODOS, BEM COMO MÉTODOS PARA O ISOLAMENTO DE UM DNA DE OCORRÊNCIA NATURAL DE TECIDO OU DE PANO TRICOTADO, PARA DETERMINAR AS QUANTIDADES RELATIVAS DE DIFERENTES FIBRAS DE PLANTA DE ALGODÃO EM UMA MISTURA DE FIBRAS DE ALGODÃO PROCESSADAS, E PARA CERTIFICAR A IDENTIDADE DE FIBRAS DE ALGODÃO COMERCIALIZADAS.

Campo da Invenção [0001] A presente invenção refere-se a métodos para isolamento de macromoléculas biológicas incluindo peptídeos, proteínas, e ácidos nucléicos oriundos de fibras de planta madura tais como fibras de planta. As fibras de planta foram processadas para a formação de fios, que por sua vez podem ser tecidos ou tricotados ao tecido ou peças acabadas, antes do isolamento das macromoléculas biológicas. Uma vez que as macromoléculas isoladas contêm informação codificada na sequência de seus blocos de construção, essas macromoléculas isoladas de fibras de planta de acordo com os métodos atualmente descritos podem ser convenientemente usados para caracterizar a fibra de planta ou identificar a origem ou a fonte da fibra de planta. A informação resultante pode ser usada, por exemplo, nos programas de preservação de identidade para fibras de planta especiais, certificação de origem de fibras de planta ou ainda na reconstrução de linhagens de reprodução usando-se fontes históricas de fibras de planta. Antecedentes da Invenção [0002] Fibras de planta formam uma fonte para produtos economiPetição 870170055163, de 02/08/2017, pág. 11/80

2/48 camente importantes tais como papel, cordage (cordões e cordas) e têxteis. Uma fibra é botanicamente definida como uma célula de afilamento estreita longa, morta e oca na maturidade com uma parede de célula espessa rígida composta na maioria das vezes de celulose e usualmente lignina. Fibras moles ou de floema são encontradas no floema (casca de árvore interna) de troncos de dicotiledôneas (linho, juta, cânhamo, rami). Fibras duras ou de folha são encontradas em feixes vasculares de folha monocot (sisal, cânhamo de manila, abacaxi). Fibras de superfície desenvolvidas a partir da superfície das sementes (algodão), folhas ou frutas (fibras de coco).

[0003] Algodão provê muito da fibra de alta qualidade para a indústria têxtil e principais esforços foram investigados na obtenção de fibras de planta com características que se adaptam as exigências da indústria através de reprodução ou por métodos clássicos ou por alteração genética do genoma de plantas de algodão.

[0004] Fibra de algodão origina como um tricoma na semente, mais especificamente uma célula simples que inicia da epiderme do tegumento externo dos óvulos, na ou exatamente antes da antese. O desenvolvimento morfológico de fibras de planta foi bem documentado (Basra and Malik, 1984, Int Rev of Cytology 89: 65-113; Graves and Stewart, 1988, supra; Ramsey and Berlin, 1976, American Journal of Botany 63 (6): 868-876; Ruan and Choraey, 1998, Plant Physiology 118: 399-406; Ruan e outros, 2000, Aust. J. Plant Physiol. 27:795800; Stewart, 1975, Am. J. Bot. 62, 723-730). Fibras de planta, em particular oriundas de Gossypium hirsutum, sofrem quatro estágios em desenvolvimento de sobreposição: iniciação de célula de fibra, alongamento, biossíntese da parede de célula secundária, e maturação. Iniciação de célula de fibra é um processo rápido. Fibras de penugemy brancas começam a se desenvolver imediatamente depois da antese e continuam até cerca de 3 dias pós-antese (DPA), que é seguido por

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3/48 alongamento de célula de fibra (até cerca de 10 a cerca de 17 DPA). Dependendo das condições de crescimento, biossíntese da parede de célula secundária inicia-se e continua até cerca de 25 a cerca de 40 DPA, seguido por um processo de maturação até cerca de 45 a cerca de 60 DPA. A síntese de parede de célula secundária e fase de maturação são comumente consideradas a fase de construção de resistência de fibra. Apenas cerca de 25 a 30% das células da epiderme se diferenciam para dar as fibras de pêlo comercial mente importantes (Kim and Triplett, 2001). A maioria das células não se diferenciam para dar fibras ou para se desenvolverem para formar fibras curtas ou penugem. Durante alongamento de fibra e metabolismo de parede secundário, as células de fibra se alongam rapidamente, sintetizam componentes de parede secundários, e mostram mudanças celulares dramáticas, moleculares e fisiológicas. Alongamento de fibra é acoplado com rápido crescimento e expansão de célula (Seagull, 1991. In Biosynthesis and biodegradation of celulose (Haigler, C. H. & Weimer, P. J., eds) pp. 1432163, MarcelDekker, New York) e síntese constante de uma grande quantidade de metabólitos de célula e componentes de parede de célula tal como celulose. Cerca de 95% em peso seco de fibras de planta maduras é celulose (Pfluger and Zambryski, 2001, Curr Biol 11: R436-R439; Ruan e outros, 2001, Plant Cell 13: 47-63). Componentes de não celulóide são também importantes para o desenvolvimento de célula de fibra (Haycinzai and Delmer, 1988, Carbohydr. Res. 181: 273-277; Huwyler e outros, 1979, Planta 146: 635642; Meinert and Delmer, 1977, Plant Physiol 59: 1088-1097; Peng e outros, 2002, Science 295: 147-150). Em comparação com outras células de planta, fibras de planta não contêm lignina nas paredes secundárias, mas têm vacúolos grandes que são presumidamente relacionados com rápido crescimento e expansão de célula (Basra and Malik, 1984, supra; Kim and Triplett, 2001, Plant Physiology 127:

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1361-1366; Mauney, 1984, supra; Ruan and Choraey, 1998, supra; Ruan e outros, 2000, supra; Van ‘t Hof, 1999, American Journal of Botany 86: 776-779).

[0005] Células de fibra de algodão em desenvolvimento são células vivas e correspondentemente contêm macromoléculas biológicas tais como peptídeos, proteínas, e ácidos nucléicos tais como DNA e RNA. Em contraste com isso, fibras maduras estão mortas, células ocas, que consistem principal mente em celulose. É em geral aceita que células de fibra, particularmente células de fibra de algodão, não mais contêm ácidos nucléicos ou proteínas extraíveis. Com base nesse, chumaços de algodão inertes são usados como um aplicador para substâncias médicas bem como para tirar amostras de DNA de, mais comumente, a checagem interna em investigações forenses.

[0006] Além disso, fibras de planta são submetidas um processamento extensivo antes de seu uso na indústria, particularmente antes de seu uso na indústria têxtil. No caso de algodão, processamento a partir de fibra bruta no campo para peças acabadas para venda envolve numerosas etapas que variam grandemente dependendo do produto final desejado. As várias etapas possíveis nesses processos podem ser divididas em geral em etapas mecânicas e químicas.

[0007] O processo de coleta e descaroçamento de algodão pode submeter a fibra a dano térmico e mecânico. Nenhum produto químico é aplicado durante o processo de descaroçamento. Calor é frequentemente utilizado para secar algodão durante o processo de descaroçamento se ele contiver mais do que 8% de umidade. Calor é usualmente proximamente regulado para evitar dano de fibra. Dano mecânico pode ocorrer durante as operações de colheita e descaroçamento. Esse dano mecânico afetaria uma percentagem muito baixa das fibras totais.

[0008] Durante a fiação, as etapas de processo são principal mente

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5/48 mecânicas. Fibras curtas (fibras imaturas e/ou mecanicamente danificadas e material estranho são removidos no processo de fiação). Os primeiros tratamentos químicos no processamento são produzidos na direção do processo de fiação quando fio para a tricotagem é tratado com um lubrificante e cerca da metade o fio para a tecelagem é tratado com material de engomação. Fio de algodão para a tricotagem é mais frequentemente tratado com cera como um lubrificante para facilitar movimento do fio através do equipamento de tricotagem. Lubrificantes sintéticos estão também disponíveis, mas acredita-se que cera seja ainda o tratamento mais comum. Engomação, também chamados alisamento de panos, é aplicado ao fio para a tecelagem que será usada como os fios longitudinais no pano acabado (a urdidura). O fio lateral (trama) não é tratado com engomação. O material comum usado para a engomação é amido. Álcool polivinílico é também usado para a engomação e combinações de amido e álcool polivinílico são comuns. Aditivos tais como aglutinantes, umectantes, amaciadores, agentes de umectação, desespumantes e outros auxiliares podem ser adicionados ao tratamento de engomação.

[0009] Tricotagem e tecelagem são ambos os processos mecânicos que não envolvem aplicações de calor ou produto químico. No fim dos processos de tricotagem e tecelagem, etapas para preparar o pano resultante para acabamento envolvem a aplicação de produtos químicos e em alguns casos, altas temperaturas. O objetivo de processo de preparação da etapa de acabamento é para remover impurezas que interferirá com o processamento através de tingimento, estampagem ou outras etapas de acabamento. Principalmente, a cera deve ser removida a partir de pano tecido por malhas (esfregamento) e a engomação deve ser removida a partir de pano tecido (desengomação). Outras impurezas que podem ser removidas nessa etapa incluem, cascas de semente, pectinas e outros produtos químicos. ProduPetição 870170055163, de 02/08/2017, pág. 15/80

6/48 tos químicos usados para desengomar incluem enzimas para remover amido e soda, cinza ou detergentes para remover álcool polivinílico. Esfregamento é feito com solventes orgânicos que dissolverá a cera ou outros lubrificantes usados. Depois do esfregamento ou desengomação, pano é usualmente alvejado usando-se alvejante de peróxido ou de cloro. Objetivos de alvejamento são para remover qualquer material não fibroso restante, hidrólise, oxidação e remoção de goma residual e aperfeiçoar absorbância de corante. Alvejamento com peróxido pode envolver vapor ou banho maria a temperaturas próximas a ebulição e o banho de alvejamento pode conter aditivos tais como estabilizadores e agentes sequestrantes. Alvejamento com cloro é feito a temperatura mais baixas (de 40 a 50 graus centígrados) e degradação de celulose é menos do que com peróxido. Se cloro for usado para o alvejamento, um tratamento com anticloro é também exigido. Chamuscar com uma chama controlada é realizada em alguns panos para limpar a superfície de pano e remover ou reduzir bolinhas. Abrilhantadores óticos podem ser adicionados a panos ou artigo de vestuários a serem vendido como produtos não tingidos brancos. Abrilhantadores óticos orgânicos aniõnicos são tipicamente usados no algodão. Vários compostos estão disponíveis e alguns podem ser adicionados durante o alvejamento.

[0010] Mercerização é um processo que pode ser aplicada a fio de algodão ou pano para aperfeiçoar absorção de ou reação para tingir e outros tratamentos de acabamento com produtos químicos, aperfeiçoar resistência a rompimento, aperfeiçoar estabilidade dimensional, aperfeiçoar maciez de pano e brilhar e cobrir fibras de planta imaturas. É um processo que envolve o tratamento com NaOH, lavagem, esfregamento com ácido, enxague e secagem.

[0011] O tratamento de acabamento mais comum é o tingimento. Pode ser feito no estágio de fio, pano ou de artigo de vestuário. CoranPetição 870170055163, de 02/08/2017, pág. 16/80

7/48 tes usados para algodão são numerosos e de muitos tipos diferentes. O produto de corante mais comum para o algodão é o índigo, mas representa apenas 4% de pano tingido. Tingimento pode ser feito como um processo contínuo ou por batelada. Enquanto os produtos químicos usados para o tingimento são numerosos, o processo habitualmente envolve o uso de alta temperatura, próximo a ebulição, na cuba de corante à qual o pano, fio ou artigo de vestuários pode ser submerso por tempo prolongado. Estampagem é o outro principal processo para adição de cor ou projetar a têxteis. Estampagem envolve na maioria das vezes um processo mecânico para a aplicação de tintas de coloração à superfície de pano ou artigos de vestuário. Tanto tingimento quanto estampagem podem envolver a aplicação de agentes de fixação química no fim do processo.

[0012] Um outro tratamento de acabamento comum, especialmente depois do tingimento é uma lavagem de roupa agressiva. Isso incluiria uso de detergentes e outros agentes de limpeza para remover materiais de acabamento residuais a partir do pano ou artigo de peças acabadas.

[0013] Muitas outras etapas de acabamento mecânico e químico podem ser aplicadas a pano, fio ou artigos de vestuário envolvendo numerosas opções de processos químicos e processos de tratamento. Amaciadores sozinhos podem ser de três tipos e cada tipo pode envolver vários produtos químicos diferentes.

[0014] Embora a visão geral acima de conversão de fibra de algodão bruta nos produtos têxteis de uso final seja altamente generalizada, estará claro que uma pessoa versada na técnica não esperaria ser capaz de extrair peptídeos, proteínas ou ácidos nucléicos de fios, têxteis ou produtos de peças acabadas depois das numerosas etapas de tratamento químico e térmico habitualmente envolvidas.

[0015] Há uma necessidade na indústria de ser capaz de rastrear

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8/48 a fonte e/ou a origem das fibras de planta, particularmente de fibras de planta maduras e/ou processadas. Tal identificação de fonte e/ou de origem de fibras de planta pode ser importante para processos de certificação, produção garantida e processamento de fibras de qualidade especificada produzidas a partir do germoplasma específico, tal como uma Certificação de fiberMax® (www.certifiedfibermax.com). A capacidade de localizar fonte e/ou origem nas fibras maduras e/ou processadas também permite identificação de fibras de planta que têm características especiais, tais como as fibras com reatividade ou capacidade de tingimento químico aperfeiçoado ou como descrito na WO 2006/136351.

[0016] Programas de certificação existente são com base no registro por cultivadores ou varejistas de semente de compra de sementes de germoplasma específico de uma colheita de fibra, tal como algodão, e identificação das fibras produzidas cultivadores registrados (no caso de algodão por números de identificação de fardo de USDA permanente).

[0017] A capacidade de localizar fonte e/ou origem de fibras de planta, particularmente de fibras maduras e/ou processadas seria grandemente aperfeiçoada se fosse possível extrair macromoléculas biológicas a partir de fibras de planta maduras ou processadas que contêm informação biológica relacionada com a planta de fonte da fibras, tais como peptídeos, proteínas, ácidos nucléicos, DNA ou RNA. Desse modo, auditoria de programas de certificação existente tornaria possível. Adicionalmente tornaria possível identificar fibras em um estágio tardio na cadeia de fornecimento, além dos cultivadores ou fornecedores de fibras, tal como, por exemplo, no nível de cliente de varejo, fiandeira ou tecelão.

[0018] Serviço de Pesquisa Agrícola, Ciências de DNA Aplicada e USDA trabalharam juntos para desenvolver uma sistema de etiquetaPetição 870170055163, de 02/08/2017, pág. 18/80

9/48 gem com base nas tecnologias DNA embutidas no algodão de fonte US em traço e componentes têxteis.

(htpp://seedquest.com/News/releases/2004/February/7829.htm).

[0019] Assim seria vantajoso ser capaz de extrair macromoléculas biológicas de ocorrência natural a partir de fibras de planta, tais como fibras de planta, particularmente a partir de fibras maduras e/ou processadas, têxteis, fios ou vestuário, e outros ser capaz de se obter informação relacionada com fonte de planta a partir de tais fibras de planta.

[0020] Os métodos descritos aqui em seguida nas diferentes concretizações, exemplos, figuras e reivindicações proveem uma solução para o problema mencionado acima, por permitir que se extraia macromoléculas biológicas naturais de fibras de planta, tais como fibras de planta, particularmente de fibras maduras e/ou processadas, têxteis, fios ou vestuário, e ulteriormente ser capaz de se obter informação relacionada com fonte de planta a partir de tais fibras de planta. Sumário da Invenção [0021] Em uma modalidade, a invenção provê um método para a caracterização de uma fibra de planta madura ou uma fibra de planta processada, tal como uma fibra de semente ou fibra de algodão compreendendo as etapas de isolamento da dita fibra de planta de uma macromolécula biológica de ocorrência natural na dita fibra de planta outra que não polissacarídeos ou lignina; e caracterização da informação codificada na sequência dos monômeros da dita macromolécula biológica.

[0022] Em uma outra modalidade da invenção, a invenção provê um método para a identificação de uma fibra de planta madura ou uma fibra de planta processada, tal como uma fibra de semente ou fibra de algodão compreendendo as etapas de isolamento da dita fibra de planta uma macromolécula biológica de ocorrência natural na dita

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10/48 fibra de planta outra que não polissacarídeos ou lignina; e submissão da dita macromolécula biológica a um ensaio de detecção específico para a dita fibra de planta.

[0023] Em uma modalidade a macromolécula biológica pode ser um polipeptídeo, proteína, ácido nucléico, DNA, RNA, RNA de fita simples ou RNA de fita dupla.

[0024] Em uma outra modalidade o ensaio de detecção pode ser um ensaio de detecção baseado na reação em cadeia da polimerase, um um ensaio de detecção baseado em anticorpo, ou um ensaio de detecção baseado na hibridização de ácido nucléico.

[0025] Em ainda uma outra modalidade, o ensaio de detecção pode detectar a presença ou a ausência de genes quiméricos presentes no genoma da planta que produz as fibras. O gene quimérico pode compreender uma parte ou região codificante ou uma sua porção antissenso selecionada de N-acetilglicosamina transferirase, fosfinotricinacetiltransferirase, EPSPS, hidroxifenilpiruvatodioxigenase, uma porção inseticida de proteína cristalina de Bacillus thuringiensis, poli(ADPribose) polimerase, poli(ADP-ribose) gluco-hidrolase, sacarose sintase, sacarose fosfato sintase, glucanase, celulose sintase, quitanase, expansina, calose sintase, quinase, nicotinamidase, nicotinato fosforribosiltransferase, mononucleotídeo adenil transferase de ácido nicotínico, nicotinamida adenina dinucleotídeo sintetase ou nicotinamida fosforribosiltransferase. O ensaio de detecção pode também ser um ensaio de detecção de evento-específico.

[0026] Em ainda uma outra modalidade da invenção, o ensaio de detecção pode detectar a presença ou a ausência de alelos específicos presentes no genoma da planta que produzem as fibras.

[0027] Em ainda uma outra modalidade da invenção, a fibra a partir da qual a macromolécula biológica é isolada está presente nos fios, pano, tecido ou peças acabadas.

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11/48 [0028] A invenção ulteriormente provê um método para a análise do genoma de uma planta produtora de fibra compreendendo as etapas de isolamento de ácidos nucléicos de fibras maduras ou processadas da dita planta, dos ditos ácidos nucléicos sendo de ocorrência natural na dita fibra de planta; e submissão do dito ácido nucléico a um protocolo de análise de genoma. O método pode ser aplicado a fibras maduras velhas, ou a fios velhos, a panos ou peças acabadas.

[0029] Ainda uma outra modalidade da invenção é um método para o isolamento de ácido nucléico tal como DNA oriundo das fibras de planta madura ou fibras de planta processadas compreendendo as etapas de incubação das ditas fibras de planta em um tampão contendo detergentes, proteases e sais por um tempo prolongado, de preferência por um período de 4 a 100 horas; e processamento do dito tampão de lise de acordo com métodos de isolamento padrão de ácido nucléico e isolamento do dito DNA.

[0030] Em uma outra modalidade da invenção, um método é provido para o isolamento de ácido nucléico, tal como DNA, oriundo de tecido ou pano tricotado compreendendo as etapas de não tecida dos fios do dito pano; incubação dos ditos fios em um tampão contendo detergentes, proteases e sais por um tempo prolongado, de preferência por um período de 4 a 100 horas; e processamento do dito tampão de lise de acordo com métodos de isolamento padrão de ácido nucleico e isolamento do dito ácido nucléico.

[0031] Em ainda uma outra modalidade da invenção, um método é provido para o isolamento de ácido nucléico, tal como DNA, oriundo de fibras de planta maduras colhidas compreendendo as etapas de material de refugo de tronco e folha a partir das fibras de planta maduras colhidas; incubação das ditas fibras de planta em um tampão contendo detergentes, proteases e sais por um tempo prolongado, de preferência por um período de 4 a 100 horas; e processamento do dito tampão

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12/48 de lise de acordo com métodos de isolamento padrão de ácido nucleico e isolamento do dito ácido nucléico.

[0032] A invenção também provê para o uso de um método de acordo com a invenção em um processo para certificar a identidade de fibras de planta comercializadas.

[0033] A invenção ulteriormente provê um método para determinar as quantidades relativas de diferentes fibras de planta em uma mistura de fibras de planta processadas ou maduras compreendendo as etapas de isolamento da dita mistura de fibras de planta uma macromolécula biológica de ocorrência natural nas ditas fibras de planta outra que não polissacarídeos ou lignina; submissão da dita macromolécula biológica a ensaios de detecção específicos para cada uma das ditas fibras de planta; e determinação da quantidade relativa de cada uma das fibras.

[0034] Em uma outra modalidade da invenção, um método é provido para certificar a identidade de fibras de planta comercializadas, o dito método compreendendo registro de compra de sementes de algodão certificadas por cultivadores registrados, a dita semente de algodão compreendendo uma composição de genoma específico e produção de uma qualidade particular de fibras de planta; registro de fardos de fibras de planta brutas produzidos pelos ditos cultivadores registrados a partir da dita semente de algodão certificada como a dita qualidade particular de fibras de planta; autenticação dos ditos fardos por checagem cruzada com os ditos registros de compra de semente; provisão dos dito fardos registrados a moinhos para produzir fios, panos ou vestuário a partir da qualidade de fibras de planta, de preferência predominantemente, particularmente exclusivamente a partir da dita qualidade de fibras de planta; e auditoria da identidade da dita qualidade de fibras de planta em uma ou mais etapas usando-se um protocolo como aqui descrito.

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Breve Descrição dos Desenhos [0035] Figura 1: amplificação por PCR de GhGlucl nos modelos de ácidos nucléicos isolados de material de fibra de algodão madura (FM966 de Gossypium hirsutum). Poço 1: marcador de peso molecular; poço 2: DNA de modelo oriundo de fibras purificadas (1 pl); poço 3: DNA de modelo oriundo de resíduo de folha contendo fibras não purificadas (1 pl); poço 4: DNA de modelo oriundo de resíduo de folha apenas (1 pl); poço 5: DNA de modelo oriundo de fibras purificadas (5 pl); poço 6: DNA de modelo oriundo de resíduo de folha contendo fibras não purificadas (5 pl); poço 7: DNA de modelo oriundo de resíduo de folha apenas (5 pl); poço 8: controle negativo; poço 9: controle positivo - DNA genômico isolado de material de planta de FiberMax966 (FM966).

[0036] Figura 2: amplificação por PCR de GhGlucl nos modelos de ácidos nucléicos isolados de material de fibra de algodão de FM966 Gossypium hirsutum maduro e a partir de material de fibra de algodão de Y5 de Gossypium barbadense 4 anos de idade. Poço 1: marcador de peso molecular; raias 2-3: DNA de modelo oriundo de nenhum resíduo de folha contendo fibras purificadas de FM966 (5 pl); raias 4-5: DNA de modelo oriundo de resíduo de folha contendo fibras não purificadas de FM966 (5 pl); poço 6: DNA de modelo oriundo de resíduo de folha de contendo nenhum material de fibra de FM966 (5 pl); raias 7-8: DNA de modelo oriundo de nenhum resíduo de folha contendo fibras purificadas Pima Y5 (5 pl); poço 9: controle negativo; poço 10: controle positivo - DNA genômico isolado de material de planta de FiberMax966.

[0037] Figura 3: amplificação por PCR de GhGlucl nos modelos de ácidos nucléicos isolados através de vários protocolos. Poço 1: marcador de peso molecular; poço 2: DNA de modelo isolado por Mini Kit de Planta de DNeasy® (5 pl); poço 3: DNA de modelo isolado por

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Mini Kit de Planta de DNeasy® (1 μΙ); poço 4: DNA de modelo isolado por Mini Kit de Planta de DNeasy® (1 cpl); poço 5: DNA de modelo isolado por Mini Kit de Planta de DNeasy® (5 μΙ); poço 6: DNA de modelo isolado por Kit de Purificação de DNA genômico de Wizard® (1 μΙ); poço 7: DNA de modelo isolado por Kit de Purificação de DNA genômico de Wizard® (5 μΙ); poço 8: DNA de modelo isolado por Kit de Purificação de DNA genômico de Wizard® (1 μΙ); poço 9: DNA de modelo isolado por Kit de Purificação de DNA genômico de Wizard® (5 μΙ); poço 10: DNA de modelo isolado por procedimento de CTAB (1 μΙ); poço 11: DNA de modelo isolado por procedimento de CTAB (5 μΙ); poço 12: controle negativo; poço 13: controle positivo - DNA genômico isolado de material de planta de FiberMax966.

[0038] Figura 4: amplificação por PCR de GhGlucl nos modelos de pano de algodão isolados por ácidos nucleicos. Raias 1 e 8: : marcador de peso molecular; poço 2: DNA de modelo oriundo de pano de algodão (incubação de ON) (1 μΙ); poço 3: DNA de modelo oriundo de pano de algodão (incubação por 30’) (1 μΙ); poço 4: DNA de modelo oriundo de pano de algodão (incubação de ON) (5 μΙ); poço 5: DNA de modelo oriundo de pano de algodão (incubação 30') (5 μΙ); poço 6: controle negativo; poço 7: controle positivo - material genômico isolado de material de planta FiberMax966.

[0039] Figura 5: amplificação por PCR de GhGlucl nos modelos de ácidos nucleicos isolados de camisas de algodão com diferentes tecidos (tricotados ou tecidos), poço 1: marcador de peso molecular; poço 2: DNA de modelo oriundo de camisa de algodão tecido, incubação de ON, (1 μΙ); poço 3: DNA de modelo oriundo de camisa de algodão tecido, incubação de ON, (5 μΙ); poço 4: DNA de modelo oriundo de camisa de algodão tecido, incubação de ON, (1 μΙ); poço 5: DNA de modelo oriundo de camisa de algodão tecido, incubação de ON, (5 μΙ); poço 6: DNA de modelo oriundo de camisa de algodão tricotado, incuPetição 870170055163, de 02/08/2017, pág. 24/80

15/48 bação de ON, (1 μΙ); poço 7: DNA de modelo oriundo de camisa de algodão tricotado, incubação de ON, (5 μΙ); poço 8: DNA de modelo oriundo de camisa de algodão tricotado, incubação de ON, (1 μΙ); poço 9: DNA de modelo oriundo de camisa de algodão tricotado, incubação de ON, (5 μΙ); poço 10: DNA de modelo oriundo de camisa de algodão tecido, 6 dias incubação, (1 μΙ); poço 11: DNA de modelo oriundo de camisa de algodão tecido, incubação por 6 dias, (5 μΙ); poço 12: DNA de modelo oriundo de camisa de algodão tecido, incubação por 6 dias, (1 μΙ); poço 13: DNA de modelo oriundo de camisa de algodão tecido, incubação de 6 dias, (5 μΙ); poço 14: DNA de modelo oriundo de camisa de algodão tricotado, incubação por 6 dias, (1 μΙ); poço 15: DNA de modelo oriundo de camisa de algodão tricotado, incubação por 6 dias, (5 μΙ); poço 16: DNA de modelo oriundo de camisa de algodão tricotado, incubação por 6 dias, (1 μΙ); poço 17: DNA de modelo oriundo de camisa de algodão tricotado, incubação por 6 dias, (5 μΙ); poço 18: controle negativo; poço 19: controle positivo - DNA genômico isolado de material de planta de FiberMax966.

[0040] Figura 6: amplificação por PCR de NodC nos modelos de ácidos nucleicos isolados de material transgênico maduro de fibra de algodão contendo um gene codificante de N-acetilglicosamina transferi rase quimérico. poço 1: DNA de modelo oriundo de material de fibra transgênico, duplicata 1 (1 μΙ); poço 2: DNA de modelo oriundo de material de fibra transgênico, duplicata 1 (5 μΙ); poço 3: DNA de modelo oriundo de material de fibra transgênico, duplicata 2 (1 μΙ); poço 4: DNA de modelo oriundo de material de fibra transgênico, duplicata 2 (5 μΙ); poço 5: controle negativo; poço 6: controle positivo - DNA genômico isolado de material de planta de algodão transgênico; poço 7: marcador de peso molecular.

[0041] Figura 7: Representação gráfica do ensaio de Taqman de ponto final discriminação entre o alelo de subgenoma de GhGlucl A

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16/48 de Gossypium hirsutum e de Gossypium barbadense. Amostras genômicas de DNA preparadas a partir de Pima (G. barbadense) ou material de planta (folha) de FM966 (G. hirsutum), ou na forma pura, ou misturas de várias razões (75/25, 50/50 e 25/75), sujeitas a um ensaio de detecção de TaqMan. O eixo X indica a presença do alelo de hirsutum de Glucl, enquanto o eixo Y indica a presença do alelo de barbadense de Glucl. Nas amostras de DNA mistas, a análise de Taqman permite a detecção das várias razões de ambos os alelos.

[0042] Figura 8: Representação gráfica da discriminação de ensaio de Taqman de ponto final entre o alelo de subgenoma de GhGlucl A de Gossypium hirsutum e de Gossypium barbadense no material de fibra e têxtil de camisa polo. Amostras genômicas de DNA preparadas a partir de material de planta (folha) de Pima (G. barbadense) ou de FM966 (G. hirsutum), ou na forma pura, ou na mistura de 50/50 como amostras de controle. Ácidos nucléicos preparados a partir de material de fibra (Fardo de FM966) ou a partir de material têxtil (polo) foi submetido a um ensaio de detecção de TaqMan. O eixo X indica a presença do alelo de hirsutum de Glucl, enquanto o eixo Y indica a presença do alelo de barbadense de Glucl. Na análise apenas o alelo de hirsutum foi detectada, indicando que todo o material de fibra e todo o material têxtil contém apenas fibras de tipo de hirsutum.

Descrição Detalhada das Modalidades da Invenção [0043] Os métodos presentemente descritos são com base na descoberta inesperada que é possível extrair macromoléculas biológicas (outra que não polissacarídeos) tais como peptídeos, proteínas, ácidos nucléicos, DNA ou RNA oriundos de fibras de planta maduras e/ou processadas, particularmente a partir de fibras de semente tais como fibras de planta, além do mais, o DNA isolado provou ser de qualidade suficiente a ser usável para outro processamento permitindo a caracterização das fibras por exemplo, usando-se ensaios de detecPetição 870170055163, de 02/08/2017, pág. 26/80

17/48 ção, tais como ampliações com base na reação em cadeia da polimerase.

[0044] Assim, em uma primeira modalidade, a invenção provê um método para uma fibra de planta madura ou uma fibra de planta processada compreendendo as etapas de isolamento da dita fibra de planta uma macromolécula biológica de ocorrência natural na dita fibra de planta outra que não polissacarídeos ou lignina; e caracterização da informação codificada na sequência dos monômeros da dita macromolécula biológica.

[0045] Como usado aqui, uma fibra de planta madura é uma fibra que completou seu ciclo em desenvolvimento e é considerada ser a sobra de uma célula morta. Em particular, uma fibra de planta madura é uma fibra de planta depois que foi colhida a partir da colheita de fibra que produz a fibra de planta. Para algodão, por exemplo, uma fibra madura seria considerada as fibras quando elas estão presentes nas bolas de algodão colhidas na colheita. Estará claro que as fibras de planta madura compreende todas as fibras de planta processadas pela indústria de fibra.

[0046] Uma fibra de planta processada como usada aqui, é uma fibra de planta madura quando colhida a partir da colheita de planta, que sofreu tratamentos mecânicos, térmicos e/ou químicos adicionais incluindo enceramento, tingimento, cardagem, fiação, tecelagem, engomação, mercerização etc. (ver a seção dos fundamentos).

[0047] Fibras de planta, como usadas aqui, são células de afilamento estreito longo de origem de planta, mortas e ocas na maturidade com a parede de célula espessa rígida composta na maioria das vezes de celulose e lignina.

[0048] Fibras de semente como usadas aqui são fibras desenvolvidas a partir da superfície de sementes tal como algodão. Algodão como usado aqui inclui Gossypium hirsutum ou Gossypium barPetição 870170055163, de 02/08/2017, pág. 27/80

18/48 badense incluindo Plantas originais de Algodão tais como Gossypium arboretum, Gossypium herbaceum e Gossypium raimondii e Gossypium longicalyx.

[0049] Uma macromolécula biológica de ocorrência natural em uma célula de fibra de planta é uma macromolécula biológica que não foi adicionada exogenamente à dita fibra de planta, por exemplo, através de incubação ou injeção com uma molécula tal como uma molécula de DNA estranha, peptídeo ou proteína para etiquetar as fibras de planta, e que inclui todas as macromoléculas, isto é, moléculas de natureza polimérica que têm um conteúdo informacional. O conteúdo informacional usualmente será codificado na sequência dos blocos de construção ou monômeros. Exemplos de macromoléculas biológicas são polipeptídeos, proteínas, ácidos nucléicos tal como DNA ou RNA, sejam eles de fita simples ou de fita dupla.

[0050] Caracterização de uma macromolécula biológica como usada aqui significa para decodificar o conteúdo informacional de uma macromolécula biológica. Isso pode ser convenientemente feito por submissão de uma macromolécula biológica à série de análises, incluindo determinação da sequência de monômeros cuja macromolécula é constituída, mas também submissão da macromolécula biológica a um ou mais ensaios de detecção específicos.

[0051] Um ensaio de detecção como usado aqui é um método ou protocolo direcionado na descoberta de uma sequência específica de monômeros em uma macromolécula biológica. Isso pode incluir ensaios de detecção com base na amplificação com base na reação em cadeia da polimerase, detecção de anticorpo ou hibridização de ácido nucléico.

[0052] Foi demonstrado que os métodos de extração particular, enquanto tendo uma influência na qualidade da macromolécula biológica extraída não é crítico à capacidade de ser capaz de extrair tais

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19/48 macromoléculas biológicas de fibras de planta.

[0053] No entanto, inesperadamente verificou-se que a qualidade e/ou a quantidade das macromoléculas biológicas, particularmente a sua fração de ácido nucléico, isoladas de fibras de planta maduras e/ou processadas podem ser grandemente por várias medidas.

[0054] Pode, por exemplo, ser vantajoso deixar as fibras de planta a serem analisadas por um tempo prolongado em um tampão de lise contendo detergentes e possivelmente outros constituintes. Em particular verificou-se que incubação de fibras de planta maduras e/ou processadas por um período de pelo menos 30 minutos, com mais preferência por um período de pelo menos 4 hrs até 120 hrs em um tampão de lise, de preferência a temperatura ambiente aperfeiçoaria o rendimento de macromoléculas biológicas recuperadas, particularmente a sua fração de ácido nucléico.

[0055] Foi também determinado que cuidadosamente remoção de impurezas, incluindo restos de folha, resinas e outros refugos a partir das fibras de planta, tais como fibras de planta colhidas e/ou descaroçadas, antes do isolamento das macromoléculas biológicas, grandemente aperfeiçoa a qualidade dos ácidos nucleicos isolados, particularmente com relação a outra análise e processabilidade dos ácidos nucleicos isolados.

[0056] Os métodos da presente invenção podem ser vantajosamente usados para identificar fibras de planta se obtidas a partir de plantas contendo eventos de transformação, ou combinação de eventos de transformação, que podem ser o objetivo das petições para estado não regulado, nos Estados Unidos da América, to the Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS) of the United States Department of Agriculture (USDA) se tais petições são concedidas ou estão ainda pendentes, incluindo os seguintes eventos:

Evento de trans-

Petição

Fenótipo transgênico

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formação
COT67B	07-108-01 p	resistente a leptidopterano
GHB614	06-332-01 p	tolerante a glifosato
MON88913	04-086-01 p	tolerante a glifosato
COT102	03-155-01 p	resistente a leptidopterano
281-24-236	03-036-01 p	resistente a leptidopterano
3006-210-23	03-036-02p	resistente a leptidopterano
LLCotton25	02-042-01 p	tolerante a fosfinotricina
MON15985	00-342-01 p	resistente a leptidopterano
31807&31808	97-013-01 p	tolerante a bromoxinila & resistente a leptidopterano
19-51 a	95-256-01 p	tolerante a sulfonilureia
MON 1445, 1698	95-045-01 p	tolerante a glifosato
MON 531,757,1076	94-308-01 p	resistente a leptidopterano
BXN	93-196-01 p	tolerante a bromoxinila
[0057] Para esse	ϊιίί as macromoléculas biológicas, particularmen-

te o ácido nucléico tal como DNA pode ser submetido a um ensaio de detecção especificamente projetado para detectar os eventos de transformação. Tais ensaios de detecção incluem os ensaios publicados na http://gmo-crl.jrc.it/statusofdoss.htm pelo menos para eventos MON1445, MON531, MON15985, LLCotton25, 3006-210-23 e 281-24236. Informação adicional tais como sequências de nucleotídeos da sequência de flanqueamento de planta adjacente ao DNA inserido nesses eventos de transformação (informação essa em que ensaios de detecção de DNA específicos podem ser projetados) podem ser encontrados nos seguintes pedidos de patente:

Nome do evento	Fenótipo	Pedido de patente
CE43-67B	Resistência a (CrylAb)	inseto	WO 2006/128573
CE46-02A	Resistência a	inseto	WO 2006/128572

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	(CrylAb)
CE44-69D	Resistência a inseto (CrylAb)	WO 2006/128571
1143-14A	Resistência a inseto (CrylAb)	WO 2006/128569
T342-142	Resistência a inseto (CrylAb)	WO 2006/128568
Evento 3006-21023	Resistência a inseto (CrylAc)	WO 2005103266
PV-GHGT07 (1445)	Tolerância a glifosato	US 2004-148666
MON88913	Tolerância a glifosato	WO 2004/072235
EE-GH3	Tolerância a glifosato	WO 2007/017186
T303-40	Resistência a inseto	PCT/EP 2008/002667
GHB119	Resistência a inseto	PCT/EP 2008/004652
Cot202	Resistência a inseto (VIP3)	US 2007-067868
LLcotton25	Resistente a Glufosinato	W02007/017186
evento 281-24236	Resistência a inseto (CrylF)	W02005103266
Cot102	Resistência a inseto (Vip3A)	US2006-130175
MON15985	Resistência a inseto	US2004-250317

[0058] Os métodos da presente invenção podem ser vantajosamente usados para identificar fibras de planta derivadas de plantas de algodão contendo material genético que provê características particularmente vantajosas, úteis para essas plantas. Exemplos de tais características são crescimento de planta melhor, tolerância aumentada a

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22/48 estresses bióticos tais como altas ou baixas temperaturas, secos, água extrema ou teor de sal ou mineral no solo, desempenho de floração aumentado, coleta mais fácil, maturação acelerada, rendimentos de coleta mais altos de partes de planta comercial mente relevantes (por exemplo, sementes), qualidade mais alta e/ou um valor nutricional mais alto dos produtos colhetados, melhor estabilidade e/ou processabilidade de armazenagem dos produtos colhetados. Outros exemplos e particularmente enfatizados de tais características são resistência contra estresses bióticos, isto é, uma melhor defesa das plantas contra animal e pestes microbianas, tais como contra insetos, ácaros, fungos fitopatogênicos, bactérias e/ou vírus, e também tolerância aumentada das plantas a certos compostos herbicidamente ativos.

[0059] Os métodos da presente invenção podem ser vantajosamente usados para identificar fibras de planta derivadas de plantas de algodão contendo material genético que provê resistência a herbicida, por exemplo, plantas tolerantes a glifosato, isto é, plantas se tornaram tolerantes à herbicida glifosato ou seus sais. Plantas podem ser tornadas tolerante a glifosato através de diferentes meios. Por exemplo, plantas tolerantes a glifosato podem ser obtidas por transformação da planta com um gene que codifica a enzima de sintase de 5enolpiruvilshicimato-3-fosfato (EPSPS). Exemplos de tais genes de EPSPS são o gene de AroA (CT7 de mutante) da bactéria Salmonella typhimurium (Cornai e outros, 1983, Science 221, 370-371), o gene de CP4 da bactéria Agrobacteríum sp. (Barry e outros, 1992, Curr. Topics Plant Physiol. 7, 139-145), os genes que codificam uma Petunia EPSPS (Shah e outros, 1986, Science 233, 478-481), a Tomate EPSPS (Gasser e outros, 1988, J. Biol. Chem. 263, 4280-4289), ou uma Eleusina EPSPS (WO 01/66704). Pode também ser um EPSPS transformado como descrito, por exemplo, na EP 0837944, na WO 00/66746, na WO 00/66747 ou na WO 02/26995. Plantas toleranPetição 870170055163, de 02/08/2017, pág. 32/80

23/48 tes a glifosato podem também ser obtidos por expressão de um gene que codifica uma enzima de óxido-redutase de glifosato como descrito nas patentes U.S. nos. 5.776.760 e 5.463.175. Plantas tolerantes a glifosato podem também ser obtidos por expressão de um gene que codifica uma enzima de transferirase de acetila de glifosato como descrito, por exemplo, na WO 02/36782, na WO 03/092360, na WO 05/012515 e na WO 07/024782. Plantas tolerantes a glifosato podem também ser obtidos por seleção de plantas contendo mutações de ocorrência natural dos genes mencionados acima, como descritos, por exemplo, na WO 01/024615 ou na WO 03/013226. Outras plantas resistentes a herbicida são, por exemplo, plantas que são tornadas tolerantes a herbicidas que inibem a enzima sintase de glutamina, tais como bialafos, fosfinotricina ou glufosinato. Tais plantas podem ser obtidas por expressão de uma enzima que desintoxica o herbicida ou uma enzima de sintase mutante de glutamina que é resistente a inibição. Um tal enzima de desintoxicação eficiente é uma enzima que codifica uma sofinotricina acetiltransferirase (tal como a proteína bar ou pat da espécie de Streptomyces). Plantas que expressam uma fosfinotricina acetiltransferirase exógena são, por exemplo, descritas nas patentes U.S. nos. 5.561.236; 5.648.477; 5.646.024; 5.273.894; 5.637.489; 5.276.268; 5.739.082; 5.908.810 e 7.112.665. Outras plantas tolerantes a herbicida são também plantas que são tornadas tolerantes à herbicidas que inibem a enzima hidroxifenilpiruvatodioxigenase (HPPD). Hidroxifenilpiruvatodioxigenases são enzimas que catalisam a reação em que para-hidroxifenilpiruvato (HPP) é transformado em homogentisato. Plantas tolerante a inibidores de HPPD podem ser transformados com um gene que codificam uma enzima de HPPD resistente de ocorrência natural, ou um gene que codifica uma enzima de HPPD mutada como descrito na WO 96/38567, na WO 99/24585 e na WO 99/24586. Tolerância a inibidores de HPPD podem também ser

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24/48 obtidos por transformação de plantas com genes que codificam certas enzimas que permitem a formação de homogentisato apesar da inibição da enzima de HPPD nativa pelo inibidor de HPPD. Tais plantas e genes são descritos na WO 99/34008 e na WO 02/36787. Tolerância de plantas a inibidores de HPPD pode também ser aperfeiçoada por transformação de plantas com um gene que codifica uma enzima prefenato desidrogenase além de um gene que codifica uma enzima tolerante a HPPD, como descrito na WO 2004/024928. Ainda outras plantas resistentes a herbicida são plantas que são tornadas tolerantes a inibidores de sintase de acetolactato (ALS). Inibidores de ALS conhecidos incluem, por exemplo, sulfonilureia, imidazolinona, triazolopirimidinas, priimidinióxi(tio)benzoatos, e/ou herbicidas de sulfonilaminocarboniltriazolinona. Diferentes mutações na enzima de ALS (também conhecido como sintase de ácido acetoidróxi, AHAS) são conhecidas como conferindo tolerância a diferentes herbicidas e grupos de herbicidas, como descritos, por exemplo, in Tranel and Wright (2002, Weed Science 50:700-712), mas também, nas patentes U.S. Nos. 5.605.011, 5.378.824, 5.141.870, e 5.013.659. A produção de plantas tolerantes a sulfonilureia e plantas tolerantes a imidazolinona é descrita nas patentes U.S. nos. 5.605.011; 5.013.659; 5.141.870; 5.767.361; 5.731.180; 5.304.732; 4.761.373; 5.331.107; 5.928.937; e 5.378.824; e publicação internacional WO 96/33270. Outras plantas tolerantes a imidazolinona são também descritas, por exemplo, na WO 2004/040012, na WO 2004/106529, na WO 2005/020673, na WO 2005/093093, na WO 2006/007373, na WO 2006/015376, na WO 2006/024351, e na WO 2006/060634. Outras plantas tolerantes a sulfonilureia e a imidazolinona são também descritos, por exemplo, na WO 07/024782. [0060] Os métodos da presente invenção podem ser vantajosamente usados para identificar fibras de planta derivadas de plantas de algodão contendo material genético que provê resistência ao ataque

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25/48 por certos insetos alvo. Tais plantas podem ser obtidas por transformação genética, ou por seleção de plantas contendo uma mutação que provê tal resistência a inseto e pode conter pelo menos um transgene compreendendo uma sequência codificante que codifica:

uma proteína de cristal inseticida oriunda de Bacillus thuringiensis ou uma sua porção inseticida, tais como as proteínas de cristal inseticidas listadas por Crickmore e outros, (1998, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62: 807-813), atualizadas por Crickmore e outros, (2005) na nomeclatura de toxina de Bacillus thuringiensis, online em: http://www.lifesci.sussex.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/), ou suas porções inseticidas, por exemplo, proteínas das classes de proteína de Cry de CrylAb, CrylAc, Cry1F, Cry2Ab, Cry3Aa, ou Cry3Bb ou suas porções inseticidas; ou uma proteína de cristal oriunda de Bacillus thuringiensis ou uma sua porção que é inseticida na presença de uma segunda outra proteína de cristal oriunda de Bacillus thuringiensis ou uma sua porção, tal como a toxina binária constituída das proteínas de cristal Cry34 e Cry35 (Moellenbeck e outros, 2001, Nat. Biotechnol. 19: 66872; Schnepf e outros, 2006, Applied Environm. Microbiol. 71, 17651774); ou uma proteína inseticida híbrida compreendendo partes de diferentes proteínas de cristal inseticidas oriundas de Bacillus thuringiensis, tal como um híbrido das proteínas de 1) acima ou um híbrido das proteínas de 2) acima, por exemplo, a proteína de Cry1A.1O5 produzida pelo evento de milho MON98034 (WO 2007/027777); ou uma proteína de qualquer uma de A1) a A3) acima em que alguns, particularmente de 1 a 10 aminoácidos foram substituídos por um outro aminoácido para se obter uma atividade inseticida mais alta para uma espécie de inseto alvo, e/ou para expandir a faixa de espécie de inseto alvo afetada, e/ou por causa de mudanças introduzidas

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26/48 para dentro do DNA codificante durante a clonagem ou transformação, tal como a proteína de Cry3Bb1 em eventos de milho MON863 ou MON88017, ou a proteína de Cry3A em evento de milho MIR604;

uma proteína secretada inseticida oriunda de Bacillus thuringiensis ou Bacillus cereus, ou uma sua porção inseticida, tais como as proteínas inseticidas vegetativas (VIP) listadas a: http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html, por exemplo, proteínas oriundas da classe de proteína de VIP3Aa; ou uma proteína secretada oriunda de Bacillus thuringiensis ou Bacillus cereus que é inseticida na presença de uma segunda proteína secretada oriunda de Bacillus thuringiensis ou B. cereus, tal como a toxina binária constituída das proteínas de VIP1A e VIP2A (WO 94/21795); ou uma proteína inseticida híbrida compreendendo partes de diferentes proteínas secretadas oriundas de Bacillus thuringiensis ou Bacillus cereus, tal como um híbrido das proteínas em 1) acima ou um híbrido das proteínas em 2) acima; ou uma proteína de qualquer uma de 1) a 3) acima em que alguns, particularmente de 1 a 10, aminoácidos foram substituídos por um outro aminoácido para se obter uma atividade inseticida mais alta para uma espécie de inseto alvo, e/ou para expandir a faixa de espécie de inseto alvo afetada, e/ou por causa de mudanças introduzidas para dentro do DNA codificante durante a clonagem ou a transformação (enquanto ainda codificando uma proteína inseticida), tal como a proteína de VIP3Aa em evento de algodão COT102.

[0061] Os métodos da presente invenção podem ser vantajosamente usados para identificar fibras de planta derivadas de plantas de algodão contendo material genético que provê tolerância à estresses bióticos. Tais plantas podem ser obtidas por transformação genética e podem conter um ou mais dos seguintes transgenes.

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27/48 um transgene capaz de reduzir a expressão e/ou a atividade de gene de poli(ADP-ribose)polimerase (PARP) nas células de planta ou plantas como descritas na WO 00/04173 ou na EP 04077984.5 ou na EP 06009836.5.

uma tolerância a estresse que aumenta transgene capaz de reduzir a expressão e/ou a atividade dos genes codificantes de PARG da plantas ou células de planta, como descritos por exemplo na WO 2004/090140.

uma tolerância a estresse que aumenta transgene que codifica uma enzima de planta-funcional da trajetória de síntese de recuperação de nicotineamida adenina dinucleotídeo incluindo nicotinamidase, nicotinato fosforribosiltransferirase, transferirase de adenila de mononucleotídeo de ácido nicotínico, sintase de nicotinamida adenina dinucleotídeo ou nicotina amida fosforribosiltransferirase como descrita, por exemplo, na EP 04077624.7 ou na WO 2006/133827 ou na PCT/EP07/002433.

[0062] Os métodos da presente invenção podem ser vantajosamente usados para identificar fibras de planta derivadas de plantas de algodão contendo material genético que podem modificar as características da fibra tais como resistência, comprimento, micronaire etc. incluindo os genes quiméricos descritos na WO 05/017157 (genes de silenciador de glicanase) na WO 04/0655571 (genes codificante de quitanase), na WO 02/45485 e na WO 08/012058 (sintase de genes de sacarose), na WO 01/17333 (genes de sintetase de fosfato de sacarose) na WO 98/00549 (sintase de genes de celulose) na WO 06/133827 (genes de transferirase de N-acetilglicosamina tal como sintase de quitina ou genes codificantes de NODC).

[0063] Uma outra aplicação para os métodos da presente invenção é para identificar fibras de planta, tais como fibras de planta oriundas de plantas que compreendem variações alélicas específicas de

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28/48 genes particulares. Os métodos para a identificação de tais variações alélicas são bem conhecidos na técnica. Em particular, tais variações alélicas podem ser usados para diferenciar entre fibras de espécie de planta particular tal como, por exemplo, diferenciação entre fibras de G. barbadense e G. hirsutum. Como um exemplo, o polimorfismo entre alelo de subgenoma A de glicanasel de Gossypium barbadense e de Gossypium hirsutum (pela presença de um códon de parada na região codificante de alelo de subgenoma A de Glucl em G. barbadense, como descrito no pedido de EP não publicado 08075514.3 aqui incorporada por referência) pode ser usado para diferenciar fibras que se originam de Gossypium barbadense ou Gossypium hirsutum.

[0064] Os métodos aqui descritos podem também ser usados para isolar modelos de ácido nucléico que podem ser usados para protocolos de caracterização que podem ser usados para quaisquer protocolos de caracterização de genoma, incluindo AFLP, READS e semelhantes. Os modelos de ácido nucléico isolados das fibras maduras ou processadas, podem ser ampliados usando-se métodos conhecidos na técnica tal como amplificação de genoma inteiro, antes da aplicação de um protocolo de caracterização de genoma.

[0065] Os métodos descritos aqui podem também ser usados para auxiliar nos programas de certificação, garantido o fornecimento de fibras de planta comercial mente comercializadas, tais como fibras de planta, tendo características particularmente especificadas. Usualmente, tais programas de certificação incluem gravação da compra de sementes certificadas por cultivadores registrados, pelo que a semente algodão compreende uma composição de genoma específico e produz uma qualidade particular de fibras de planta. Fardos das fibras de planta colhidas produzidas pelos cultivadores registrados a partir das ditas sementes certificadas são registradas e são autenticadas por checagem cruzada com os ditos registros de compra de semente e

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29/48 são providas a moinhos para produzir de preferência predominantemente, particularmente exclusivamente fios, panos ou vestuário a partir da dita qualidade de fibras. Os métodos descrevem aqui para permitir que se realize auditorias em diferentes pontos na cadeia de fornecimento.

[0066] Os métodos descritos aqui podem também ser aplicados para isolar macromoléculas biológicas de estrutura de tipo pêlo (como tricoma) nas sementes de planta, tais como os pêlos nas sementes de tomate ou os pêlos do urso com base nas sementes de trigo.

[0067] Os métodos descritos aqui podem também ser aplicados para caracterizar o material de ácido nucléico material de fibras velhas e têxtil de material velho (por exemplo, fibras e têxteis que têm acima de 100 anos de idade). Sem limitar a invenção a um mecanismo ou teoria específica acredita-se que uma possibilidade de que material biológico é preservado nas fibras velhas é porque nós observamos que fibras maduras são torcidas tal que material biológico esteja ‘aprisionado (e desse modo ‘preservado) nas fibras maduras.

[0068] Os métodos descritos aqui podem também ser aplicados em aplicações forenses uma vez que fibra ou material têxtil identificado em uma cena de crime pode ser caracterizado por, por exemplo, precedendo uma etapa de amplificação de genoma inteiro como no exemplo 6 nesse pedido.

[0069] Como usado aqui compreendendo deve ser interpretado como especificação da presença das características afirmadas, números inteiros, etapas ou componentes como mencionados, mas não impede a presença ou adição de uma ou mais características, números inteiros, etapas ou componentes, ou seus grupos. Assim, por exemplo, um ácido nucléico ou uma proteína compreendendo uma sequência de nucleotídeos ou aminoácidos, pode compreender mais nucleotídeos ou aminoácidos do que aqueles realmente citados, isto é, seja embutiPetição 870170055163, de 02/08/2017, pág. 39/80

30/48 do em um ácido nucléico ou uma proteína mais grande. Um gene quimérico compreendendo uma região de DNA, que é funcionalmente ou estruturalmente definida, pode compreender regiões de DNA adicionais etc.

[0070] Os seguintes exemplos não limitantes descrevem os métodos para o isolamento de macromoléculas biológicas das fibras de planta madura e das fibras processadas e seu uso para a caracterização ou identificação de fibras de planta. A não ser que de outra maneira afirmado nos exemplos, todas as técnicas de DNA recombinantes são realizadas de acordo com protocolos padrão as descritos em Sambrook e outros, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY e nos Volumes 1 e 2 de Ausubel e outros, (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA. Materiais e métodos padrão para trabalho molecular com planta são descritos na Plant Molecular Biology Labfax (1993) by R.D.D. Cray, jointly published by BIOS Scientific Publications Ltd (UK) and Blackwell Scientific Publications, UK.

[0071] Através da descrição e dos exemplos, referência é feita para as seguintes sequências representadas na listagem de sequência:

SEQ ID No 1: oligonucleotídeo 1 para a amplificação por PCR de Ghglucl

SEQ ID No 2: oligonucleotídeo 2 para a amplificação por PCR de Ghglucl

SEQ ID No 3: oligonucleotídeo 1 para a amplificação por PCR de NodC

SEQ ID No 4: oligonucleotídeo 2 para a amplificação por PCR de NodC

SEQ ID No 5: oligonucleotídeo 1 para a amplificação por PCR de expansina

SEQ ID No 6: oligonucleotídeo 2 para a amplificação por

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PCR de expansina

SEQ ID No 7: oligonucleotídeo 1 para o ensaio de detecção de Taqman de GhGlucl (iniciador avante)

SEQ ID No 8: oligonucleotídeo 2 para o ensaio de detecção de Taqman de GhGlucl (iniciador reverso)

SEQ ID No 9: oligonucleotídeo 3 para o ensaio de detecção de Taqman de alelo de A GhGlucl genômico (oligonucleotídeo marcado com VIC que detecta o alelo de G. hirsutum de Gluc1)

SEQ ID No 10: oligonucleotídeo 4 para o ensaio de detecção de Taqman de alelo de A GhGlucl genômico (oligonucleotídeo marcado por FAM que detecta o alelo de G. barbadense de Glud)

SEQ ID No 11: oligonucleotídeo 1 para a amplificação por PCR de rpl16

SEQ ID No 12: oligonucleotídeo 2 para a amplificação por PCR de rpl16

SEQ ID No 13: oligonucleotídeo 1 para a amplificação por PCR de matK

SEQ ID No 14: oligonucleotídeo 2 para a amplificação por PCR de matK

SEQ ID No 15: oligonucleotídeo 1 para a amplificação por PCR de trnT-trnL

SEQ ID No 16: oligonucleotídeo 2 para a amplificação por PCR de trnT-trnL

SEQ ID No 17: oligonucleotídeo 1 para a amplificação por PCR de ndhF

SEQ ID No 18: oligonucleotídeo 2 para a amplificação por PCR de ndhF Exemplos

Exemplo 1: Isolamento de ácidos nucleicos de material de fibra de algodão bruto.

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32/48 [0072] Isolamento de ácidos nucleicos de material de fibra de FM966 de Gossypium hirsutum.

[0073] Fibras de planta colhidas de FM966, que tinham sido descaroçadas e transformadas em fardo, foram submetidas a extração de DNA usando-se o procedimento de CTAB convencional (brometo de hexadecil trimetil-amônio) (Doyle and Doyle, 1987, Phytochem. Bull. 19, 11) para o isolamento de DNA genômico de material de planta. Embora um pellet de ácidos nucleicos foi obtido, esse material não poderia ser usado para qualquer outra aplicação incluindo amplificação por PCR, ou digestão de enzima de restrição.

[0074] As fibras de planta brutas transformadas em fardo colhido ainda contêm algumas impurezas tais como restos de folha e outros refugos. Esses materiais contaminantes foram cuidadosamente removidos por limpeza manual para se obter uma fração de fibra purificada (e uma fração de refugo). O material de fibra bruta, o material de fibra purificado e a fração de refugo foram submetidos a extração de DNA usando-se o Mini Kit de Planta DNeasy® comercializado por QIAGEN de acordo com as recomendações do fabricante (vide manual de planta DNeasy® disponível em www1.qiagen.com/HB/DNeasyPlantMiniMaxi) e as concentrações dos ácidos nucleicos isolados foram determinadas usando-se espectrofotometria de UV (tabela 1)

Tabela 1.

Amostra	ng/ul	A260	A280	260/280	260/230
Fibra pura	3,49	0,07	0,05	1,41	0,52
Fibra pura	4,19	0,084	0,065	1,29	0,51
Fibra bruta	14,91	0,298	0,194	1,54	0,43
Fibra bruta	17,4	0,348	0,239	1,46	0,43
Apenas refugo	76,55	1,531	1,09	1,4	0,45

[0075] Os ácidos nucleicos isolados foram usados como modelos

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33/48 em uma reação de PCR padrão usando-se os seguintes iniciadores para detectar um gene de glicanase de algodão endógeno (GhGlucl; vide EP 08075514.3 aqui incorporado por referência para sequências de nucleotídeos de diferentes alelos de GhGlucl ):

SE002: ggccgaagccgatcttatctagg (SEQ ID No.: 1)

SE003: cggcaacaatcttccatctccag (SEQ ID No.: 2) [0076] Tanto 1 pl quanto 5 pl de ácidos nucléicos de modelo foram usados. Os resultados da amplificação por PCR são visualizados na figura 1. Um amplicon de 656 pb (como esperado) é claramente detectado usando-se fibra pura (5 μΙ modelo) (raia 4) enquanto que um sinal fraco pode ser observado usando-se quantidade pequena (1 μΙ) de ácidos nucléicos isolado tanto de material de fibra bruta quanto pura. Nenhum sinal de amplificação pode ser detectado nos ácidos nucleicos isolados do material de refugo apenas nem dos ácidos nucléicos obtidos a partir de material não purificado quando usado em concentrações mais altas indicando que o extrato obtido a partir de materiais contaminantes parece inibir o outro processamento de ácidos nucleicos obtido a partir do material de fibra bruta.

[0077] De modo interessante, nessa experiência demonstra que ácidos nucléicos, que podem ser ulteriormente analisados, podem ser extraídos de material de fibra de algodão madura. A experiência também indica que a qualidade dos ácidos nucléicos isolados - DNA pode ser ulteriormente aperfeiçoado por remoção do resíduo de folha e outras impurezas a partir das fibras de planta colhidas brutas e descaroçadas.

[0078] Isolamento de ácidos nucléicos de material de fibra de Pima-Y5 de Gossypium barbadense.

[0079] Material de fibra de algodão bruta de 4 anos de idade oriundo de Pima5Y de Gossypium barbadense foi tratado juntamente com material de fibra de algodão de FM966 de Gossypium hirsutum,

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34/48 como descrito acima em 1.A. Os ácidos nucleicos obtidos foram usados como modelos nas reações de PCR como descritas em 1.A. Os resultados são visualizados na figura 2.

[0080] Embora fibras de Gossypium barbadense sejam mais fortes e têm diferentes arquiteturas oriundas de fibras de Gossypium hirsutum, os resultados demonstram que ácidos nucleicos incluindo DNA processável podem também ser isolados dessas fibras. De modo interessante, essas fibras tinham também sido armazenados por vários anos sob condições não ótimas indicando que DNA processável ou outros ácidos nucleicos podem ser obtidas a partir de material de fibra velha.

[0081] Amplificação de outros genes endógenos de algodão.

[0082] Os ácidos nucleicos isolados foram também usados como modelos nas reações de PCR padrão usando-se iniciadores específicos para outros genes endógenos tais como os seguintes iniciadores que ampliam um fragmento de 299 pb a partir do gene codificante de expansina:

KI51: gggagcttgtggttatggaaacc (SEQ ID No.: 5)

KI52: cagggacgatcccagctcgatattc (SEQ ID No.: 6) [0083] Os amplicons esperados poderiam também ser detectados usando-se esses outros iniciadores para outros genes endógenos. [0084] Isolamento de ácidos nucleicos de material de fibra de algodão usando-se outros tampões de lise e protocolos.

[0085] Material de fibra de algodão bruta foi purificada como descrito na seção 1.A. por remoção do material de resíduo de folha e outras impurezas contaminantes. Ácidos nucleicos foram extraídos do material de fibra purificado usando-se ou o Mini Kit de Planta DNeasy® comercializado pela QIAGEN ou o kit de purificação genômico de DNA Wizard® comercializado por PROMEGA CORPORATION ou o procedimento de CTAB convencional (Doyle and Doyle, 1987, Phytochem.

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Bull. 19, 11). As concentrações de ácidos nucléicos obtido foi determinada usando-se espectrometria de U.V. (tabela 2).

Tabela 2.

Amostra	ng/ul	A260	A280	260/280	260/230
Qiagen 1	7,66	0,153	0,069	2,21	1,4
Qiagen 2	19,97	0,399	0,241	1,66	0,76
Promega 1	21,34	0,427	0,208	2,05	1,42
Promega 2	38,14	0,763	0,389	1,96	1,06
CTAB*	225,22	4,504	2,235	2,02	1,42

[0086] Observar: Leituras de alta concentração provavelmente devido a ausência de tratamento de RNAse.

[0087] Os ácidos nucléicos isolados foram usados como modelos em uma reação de PCR padrão usando-se os seguintes iniciadores para detectar um gene de glicanase de algodão endógeno (GhGlucl; vide EP 08075514.3 aqui incorporada por referência para sequências de nucleotídeos de diferentes alelos de GhGlucl ):

SE002: ggccgaagccgatcttatctagg (SEQ ID No.: 1)

SE003: cggcaacaatcttccatctccag (SEQ ID No.: 2) [0088] Tanto 1 μΙ quanto 5 μΙ de ácidos nucléicos de modelo foram usados. Os resultados da amplificação por PCR são visualizados na figura 3. O amplicon de DNA esperado foi observado usando-se modelos ácidos nucléicos isolados por qualquer método, embora aparentemente concentrações mais altas dos ácidos nucléicos (5 μΙ de reação) isoladas por procedimento de CTAB e Wizard® tinham um efeito negativo na reação de PCR.

[0089] Embora como uma eficácia mais baixa, nós observamos que ácidos nucléicos poderiam também ser extraídos do material de fibra limpo por incubação desse material de fibra com água (H₂O) por uma certa quantidade de tempo (por exemplo, pelo menos 4 horas incubação do material de fibra limpo na presença de um volume de

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36/48 água).

Exemplo 2: Isolamento de ácidos nucléicos de têxteis.

[0090] Isolamento de ácidos nucléicos de pano de algodão.

[0091] O isolamento com sucesso de ácidos nucléicos, tal como DNA que pode ser ulteriormente processado, a partir de fibras de planta maduras, estimularam uma tentativa de isolar macromoléculas biológicas tais como ácidos nucléicos, particularmente DNA processável a partir de fibras depois do fiação e tecelagem. Para esse fim, fios foram isolados por não tecelagem de pano de algodão, cortar em pedaços menores e foram incubados em 5 ml de tampão de lise (tampão de AP1 de DNeasy®) a 65Ό por pelo menos 30 minutos ou de um dia para o outro a temperatura ambiente. Tampão foi removido por espremedura do material e 500 pl de lisado foram transferidos para um tubo eppendorf e ulteriormente foram tratados de acordo com as recomendações do fabricante, isto é:

adicionar 130 pl de Tampão de AP2, misturar e incubar em gelo por 5 minutos;

centrifugar por 5 minutos a 13000 rpm;

transferir a fase líquida para a coluna mini spin QlCinzaredder lilac;

centrifugar por 2 minutos a 13000 rpm;

transferir o fluxo através de um novo tubo eppendorf sem perturbar o pellet;

adicionar 800 μΙ de tampão de AP3/E e misturar; transferir 650 μΙ à coluna de mini spin DNeasy® e centrifugar por 1 minuto a 8000 rpm, descartar através do fluxo;

repetir essa etapa com a amostra restante; descartar o tubo de coleta e colocar a coluna em um novo tubo de coleta de 2 ml;

lavar a coluna com 500 μΙ de tampão de AW e centrifugar por 1 min a 8000 rpm, descartar através do fluxo;

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37/48 lavar uma coluna com 500 μΙ de tampão de AW e centrifugar por 2 min a 13000 rpm, descartar através do fluxo;

colocar a coluna em um tubo eppendorf de 1,5 ml, transportar sem etanol.

adicionar 50 μΙ água à coluna e incubar pelo menos 5 minutos a temperatura ambiente;

centrifugar por 1 minuto a 8000 rpm.

Armazenar o DNA a 4Ό.

e 5 μΙ amostras foram usados como DNA de modelo em uma reação de PCR usando-se os iniciadores do exemplo 1.A. Os resultados são visualizados na figura 4. Quando amostras de ácido nucleico depois de incubação de um dia para o outro foram usadas, o amplicon esperado de 669 pb poderia ser detectado, indicando que o protocolo pode ser usado para isolar ácidos nucleicos de fibras de planta depois do fiação e tecelagem. O sinal de PCR significativamente mais forte depois de incubação de um dia para o outro versus a incubação por 30 minutos, indica os resultados do primeiro protocolo em concentrações mais alta de DNA processável.

[0092] Isolamento de ácidos nucleicos de têxteis com diferentes tecidos.

[0093] O protocolo de isolamento de ácido nucléico foi também aplicado a peças acabadascom diferentes tecidos (isto é, que sofreram diferentes processamento). Para esse fim, pedaços foram cortados de uma camisa de manga longa de algodão (tecido) e uma polo de algodão (tricotados) e foram tratados como no exemplo 2A, com a exceção que incubação no tampão de lise foi realizado ou de um dia para o outro, ou ainda prolongado por 6 dias de incubação. Uma reação de PCR como descrita no exemplo 2.A foi realizada nos ácidos nucleicos isolados e os resultados são visualizados na figura 5.

[0094] O amplicon esperado foi detectado depois da amplificação

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38/48 por PCR usando-se amostras de ácido nucleico isoladas de ambas as espécies de panos. Novamente, o sinal era mais forte nas amostras em que a incubação no tampão de lise foi prolongada.

Exemplo 3: Isolamento de ácidos nucléicos de fibras especializadas. [0095] Fibras maduras foram isoladas e foram purificadas de plantas de algodão transgênicas compreendendo um gene quimérico de transferirase de N-acetilglicosamina (gene de NodC) como descrito na WO 2006/136351 Exemplo 1. Ácidos nucléicos foram isolados da extração de fibras purificadas usando-se o Mini Kit de Planta de DNeasy® comercializado por QIAGEN de acordo com as recomendações do fabricante (vide manual de planta DNeasy® disponível em www1.qiagen.com/HB/DNeasyPlantMiniMaxi) e as concentrações dos ácidos nucléicos isolados foram determinados usando-se espectrofotometria de UV (tabela 3)

Tabela 3.

Amostra	ng/ul	A260	A280	260/280	260/230
NodC1	7,95	0,159	0,105	1,51	0,56
NodC2	7,62	0,152	0,101	1,51	0,56

[0096] Os ácidos nucléicos iso ados foram também usados como modelos nas reações de PCR padrão usando-se iniciadores específicos para outros genes endógenos tais como os seguintes iniciadores que ampliam um fragmento de 1224 pb a partir do gene codificante de NodC:

ldb093: cgtttttcactcatcgtcgttttcaagtgtcgtagatgtgatcggtttgcttgcg (SEQ ID No.: 3)

Idb126: ggcgcgccttaggaactctcgcgtgatagccac (SEQ ID No.: 4) [0097] Tanto 1 μΙ quanto 5 μΙ de ácidos nucléicos de modelo foram usados. Os resultados da amplificação por PCR são visualizados na figura 6. O amplicon de DNA esperado indicativo da presença do transgene poderia ser observado em cada amostra.

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Exemplo 4: Automação diferenciação entre diferentes tipos de fibra. [0098] Como descrito no pedido de EP não publicado 08075514.3 aqui incorporado por referência, o alelo do subgenoma A de glicanasel A de Gossypium barbadense difere o alelo de subgenoma de glicanase 1 de Gossypium hirsutum pela presença de um códon de parada na região codificante de alelo do subgenoma A de Gluc1 no formador. Esse polimorfismo poderia ser usado para diferenciar entre fibras de planta tendo o alelo de Gluc1 de Gossypium barbadense ou o alelo de Glud de Gossypium hirsutum. Para esse fim, um ensaio de Taqman® foi projetado, pelo que os iniciadores de oligonucleotídeo ampliam um fragmento de DNA que transporta o polimorfismo usado eram:

Iniciador avante: GCTTTTGGAAGCGATATAACATCGA (SEQ ID No.: 7)

Iniciador reverso: GGCATAGGCAAAATAAGGGTACACA (SEQ ID No.: 8) [0099] O polimorfismo foi detectado pela monitoração da degradação dos seguintes iniciadores marcados com fluorescência que detectam o polimorfismo:

VIC- AATCCTGTCGAACCAG (alelo de hirsutum) (SEQ ID

No.: 9)

FAM- ATCCTGTCAAACCAG (alelo de barbadense) (SEQ

ID No.: 10) [00100] Esses iniciadores foram usados em um arranjos de qPCR, aumentando os números de ciclos até 60 e determinação de fluorescência no ponto final apenas. Como modelos de ácido nucléico, misturas de DNA isoladas ou de fibras de G. barbadense (ΡΙΜΑ) ou de fibras de G. hirsutum (FM966) foram usadas nas seguintes razões: 100% de ΡΙΜΑ, 75% de PIMA/25% de FM966, 50% de PIMA/50% de FM966, 25% de PIMA/75% de FM966, 100% de FM966. Os resultados

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40/48 são esquemativamente representados na figura 7.

[00101] O eixo X indica a presença do alelo de G. hirsutum de Gluc1, enquanto o eixo Y indica a presença do alelo de G. barbadense de Gluc1. No DNA isolado de fibras de ΡΙΜΑ, apenas o alelo de G. barbadense de Glud foi detectado. No DNA isolado de fibras de ΡΙΜΑ, apenas o alelo de G. hirsutum de Glud foi detectado. Nas amostras de DNA mistas, a análise de Taqman permite a detecção das várias razões de ambos os alelos.

[00102] Em uma outra etapa, a mesma análise de tipo de RT-PCR foi usada para analisar amostras de ácido nucléico a partir de têxtil de algodão e material de fibra de um fardo de FM966. Os resultados são representados na figura 8. Nos ácidos nucléicos extraídos do fardo de FM966 e da camisa de polo, apenas o alelo de G. hirsutum de Glud foi detectado, indicando que o material de algodão usado exclusivamente originando do material de tipo G. hirsutum.

[00103] Embora os ensaios possam necessitar outra otimização, tal otimização está claramente dentro do campo da pessoa versada. Exemplo 5: Caracterização do genoma de plastídio isolado de fibras de planta.

[00104] Por causa da descoberta inesperada que DNA genômico pode ser isolado e é caracterizado a partir de fibras de planta maduras nós investigamos a possibilidade de identificação de DNA de plastídio DNA na combinação de DNA extraído de essas fibras.

[00105] Embora, plastídios de leucoplasto demonstraram estar presentes nas fibras de planta em desenvolvimento (Ryser U. (1985) European journal of cell biology 39, pp. 236-256) eles não esperaram como estando presentes nas fibras de planta maduras. Leucoplastas são similares a cloroplastos por ter o mesmo genoma - uma vez que eles se diferenciam do mesmo tipo de célula progenitora - mas leucoplastos são especializados com alto acúmulo de teor de amido.

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41/48 [00106] Cronn e outros (2002) American Journal of Botany 89(4): 707-725 publicaram combinações de iniciador para ampliar 4 genes do genoma de plastídio (rpH6, matK, trnT-trnL e ndhF). Em uma primeira etapa nós optizamos as combinações do iniciador publicados para a amplificação desses quatro genes por portar nossa análise de PCR nas folhas de DNA isolado de algodão. Em uma próxima etapa, a combinação de iniciador optimizada por gene foi usada para a amplificação em uma amostra de DNA de fibra obtida a partir de um mini fardo de algodão (Certified FiberMax algodão). Nós surpreedentemente demonstramos amplificação de 4 fragmentos de PCR a partir dessa amostra de DNA de fibra. Subclonagem nos vetores abrutos de TOPO seguido por análise de sequência desses fragmentos confirmavam que esses quatro fragmentos originados do genoma de plastídio. Para rpl16, matK e trnT-trnL a sequenciação resultou em uma única sequência de consenso, para várias sequências de consenso de ndhF foram obtidas.

[00107] Uma vez que as sequências de cloroplastos completas de Gossypium hirsutum e Gossypium barbadense estão disponíveis na base de dados de EMBL (entrada DQ345959 é a sequência de DNA de cloroplasto de coqueificador 310 FR (G. hirsutum) e entrada AP009123 é a sequência de DNA de cloroplasto de G. barbadense) foi possível alinhar as sequências obtidas com as sequências publicadas. Verificou-se que as sequências obtidas eram 100% idênticas às sequências de G. hirsutum publicadas (exceto quanto aos sítios de iniciador degenerado). Isso confirma que a fibra no fardo de algodão foi derivada de G. hirsutum.

[00108] A caracterização molecular com sucesso dessas sequências de plastídios específicas agora provê novas oportunidades para genotipação de DNA de fibra. Também amostras de fibra mais velhas podem ser sondadas quanto a sequências de plastídios e sua relação

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42/48 pode ser interpretada durante a avaliação e reprodução.

Condições de PCR:

μΙ de modelo

1.5 μI de iniciador avante (10μΜ)

1.5 μI de iniciador reverso (10μΜ) μΙ de MQ μΙ de dNTP μ I de 10X tampão de XF 0,5 μΙ de Phusion

12.5 μΙ de MQ Programa de PCR 30s @ 98Ό 105@98Ό

30s @ 60Ό 60s @ 72Ό 35 ciclos 10 min @ 72Ό Manter @ 4“C

Combinações de iniciador:

rpl 16 F71: gctatgcttagtgtgtgactcgtt (SEQ ID No 11)

R1516: cccttcattcttcctctatgttg (SEQ ID No 12) matK matKF3: ctaatggatcaacagaawcgtttg (SEQ ID No 13) trnKR: aactagtcggatggagtag (SEQ ID No 14) trnT-trnL trnL2: aatattactgactccmttttkattttckag (SEQ ID No 15) trnB: tctaccgatttcgccatatc (SEQ ID No 16) ndhF 5’Fnew: gaatatgcatggatcatacc (SEQ ID No 17)

1318R: cgaaacatataaaatgcrgttaatcc (SEQ ID No 18)

Exemplo 6: caracterização do genoma de ácidos nucléicos isolados de fibras de planta.

[00109] Os exemplos anteriores mostraram que convincentemente

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43/48 que DNA pode ser isolado e caracterizado a partir de fibras de planta maduras e a partir de seus produtos a jusante. Em uma próxima etapa nós questionamos se o DNA de fibra isolado for uma representação verdadeira do genoma de algodão inteiro ou se representa apenas uma fração do genoma de algodão. Um equivalente de genoma parcial não seria útil para característica o testagem de genótipo uma vez que geraria resultados incompletos e incertos. O primeiro desafio foi superar a quantidade limitada de DNA obtida a partir de fibras de planta como material de partida para a testagem de ensaio. O método de Amplificação de Genoma Inteiro (WGA) foi escolhido para superar essa limitação. WGA não foi usada um genoma poliplóide tal como algodão, para genotipação e testagem característica. Uma tapa de amplificação de DNA é importante aumentar a quantidade do material de DNA de fibra de partida, mas não é crítica para introduzir uma tendência de genoma que é algumas vezes inerentes a uma etapa de WGA como relatado por Giardina e outros (2009) BMC Genomics Apr 14, 10:159. Nós levamos em consideração a confiança de uma etapa de WGA em DNA de fibra isolado em um ensaio de Taqman funcional. Além disso, a qualidade de DNA de fibra ampliada por WGA foi comparado com DNA de cotiledôneo ampliado por WGA da mesma fonte de fibra de algodão comercial em substancialmente o mesmo ensaio de Taqman.

[00110] Cerca de 500 gramas de fibra de FM9063B2F (500 gramas de amostras cada em 3 bolsas marrom pequenas; 3 cópias foram tiradas de diferentes fardos para a variedade de amostra, Fardo no 721134350138, 721134350154, 721134350156) foi provido por K. Merritt de uma fazenda CropMark Direct. A fibra era de algodão desenvolvida na estação de algodão 2008-9 e foi listado para um programa de certificação fiberMax.

[00111] Uma vez que nós determinamos que contaminantes que

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44/48 podem ter um impacto significativo no uso de DNA de fibra para testagem a jusante nós manualmente limpamos as fibras. Isso é feito por esticamento da quantidade pequena de fibras (por exemplo, 1,5 gramas) pelo que a maior parte do fragmento é removido com pinça até que nenhum fragmento puder ser visto com o olho nu.

[00112] Extração de DNA foi realizada com o Mini Kit de Planta Qiagen DNeasy com as seguintes etapas:

Tirar 1 grama de fibra de algodão madura limpa (nenhum resíduo de folha) e o pôr em um tubo Falcon de 50 ml. Cortar as fibras algumas vezes com tesoura limpa.

Adicionar 5 ml de tampão de lise de AP1 (Qiagen cat. 1014630) e 100 μI de RNaseA (10mg/ml). Usar um pilão para homogeneizar o contato entre amostra e tampão.

Incubar a 65Ό por 20 min, usar um tubo de 15 ml pa ra misturar o material 2 a 3 vezes durante a incubação.

Usar um tubo de 15 ml para apertar o material a fim de transferir 500 μΙ de lisado em um tubo eppendorf de 2 ml. 3 Alíquotas são tiradas e são usadas como duplicatas.

Adicionar 130 μΙ de Tampão de AP2, misturar e incubar 5 min em gelo para cada alíquota.

Centrifugar por 5 min a 13000 rpm.

Transferir a fase líquida para coluna de mini spin de QlCinzaredder lilac.

Centrifugar por 2 min a 13000 rpm.

Transferir através do fluxo para um novo tubo eppendorf sem perturbar o pellet.

Adicionar 800 μΙ de tampão de AP3/E e misturar.

Transferir 650 μΙ para a coluna de mini spin de DNeasy e centrifugar por 1 min a 8000 rpm, descartar através do fluxo.

Repetir essa etapa com a amostra restante. Descartar o

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45/48 tubo de coleta e colocar a coluna em um novo tubo de coleta de 2 ml.

Lavar a coluna com 500 μΙ de tampão de AW e centrifugar por 1 min a 8000 rpm, descartar através do fluxo.

Lavar a coluna com 500 μΙ de tampão de AW e centrifugar por 2 min a 13000 rpm, descartar através do fluxo e tubo de coleta.

Colocar a coluna em um tubo eppendorf de 1,5 ml sem transportar etanol.

Adicionar 50 μI de MQ água à coluna e incubar pelo menos 5 min a temperatura ambiente.

Centrifugar por 1 min a 8000rpm. Armazenar o DNA a 4“C (curto prazo) ou -20Ό (longo prazo).

[00113] Extração de DNA de cotiledôneo de FM9063 B2F foi realizada como se segue. 50 sementes de FM9063 B2F foram germinadas com papel de germinação e água em um germinador a 28Ό. Cotiledôneos foram coletados e foram secos com silício. DNA de cotiledôneo foi extraído. DNA de cotiledôneo extraído foi combinado em cinco tubo de 1,5 ml.

[00114] Amplificação de genoma inteiro foi realizada com o kit Amplificação de genoma inteiro completa de Sigma’s GenomePlex® (WGA) (WGA2) com as seguintes etapas:

Adicionar 1 μΙ de 10x Tampão de fragmentação a 10 μΙ de DNA extraído em um tubo de PCR.

Incubar em um ciclizador térmico a 95Ό por 2 minutos e resfriar em gelo.

Adicionar 2 μΙ de 1x Library Preparation buffer.

Adicionar 1 μΙ of Library Stabilization Solution e misturar. Incubar em um ciclizador térmico a 95Ό por 2 minutos e resfriar em gelo.

Adicionar 1 μΙ de Enzima de Preparação de Biblioteca e misturar.

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Incubar em ciclizador térmico usando-se programa WGA1

16Ό por 20 minutos

24Ό por 20 minutos

37Ό por 20 minutos

75Ό por 5 minutos

4Ό para sempre

Adicionar a seguir a principal mistura:

7,5μΙ de 10x Amplificação da Mistura Principal

47,5 μΙ de água livre de nuclease μΙ de polimerase de WGA

Incubar em ciclizador térmico usando-se programa WGA2

95Ό por 3 minutos ciclos de: 94 Ό por 15 segundos

65Ό por 5 minutos

4Ό para sempre

Pôr 5 μΙ em um gel de agarose de 1% para checar a qualidade do DNA de WGA. Uma semeadura entre 100 e 1000 bp estaria presente.

Todas as reações de WGA (fibra e cotiledôneo) provaram ser bem sucedidas.

[00115] Opcionalmente o DNA ampliado por WGA de cotiledôneo e fibra de FM9063 B2F foram ulteriormente purificados do seguinte modo. Combinar DNA de WGA de 5 amostras em 2 ml de tubo (cerca de 240 ui de DNA), adicionar 24 ui de acetato de sódio a 3 M pH 5,2 e misturar, adicionar 800 ui 100% etanol gelado e misturar totalmente e de um dia para o outro a -20Ό, centrifugar a -20Ό por 10 min a 12000 rpm, remover cuidadosamente o sobrenadante, lavar o pellet de DNA com 800 ui 70% de etanol gelado, centrifugar a -20C por 2 min a 12000 rpm, remover cuidadosamente o sobrenadante, por o tubo em uma incubadora a 65G por 15 min para secar, DNA ressuspenso em

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47/48 ul de 1x tampão de TE.

[00116] Dois diferentes ensaios de Taqman foram realizados nas amostras de DNA ampliadas. Um ensaio de Taqman visou na identificação de 40 diferentes SN Ps e um outro ensaio de Taqman visou na identificação de 3 diferentes características: Bollgard II (Mon531), Bollgard (MON15985) and Flex (MON 88913). Cada um desses ensaios de Taqman foi realizada em 4 diferentes amostras de DNA: 1) DNA ampliado por WGA extraído de fibra de FM9063 B2F, 2) DNA ampliado por WGA extraído de cotiledôneo de FM9063 B2F, 3) DNA ampliado por WGA purificado de fibra de FM9063 B2F e 4) DNA ampliado por WGA purificado de cotiledôneo de FM9063 B2F. Uma vez que é conhecido que o subgenoma A de algodão (At) é 50% maior do que o subgenoma D de algodão (Dt) no tamanho físico, 23 SN Ps foram selecionados do genoma A e 17 foram selecionados o genoma D.

[00117] Foi observado que todos os 40 SNPs poderm ser detectados com sucesso no ensaio de Taqman no DNA de fibra ampliado por WGA de FM9063 B2F purificado. Além disso, um resultado idêntico para a detecção dos mesmos 40 SNPs foi obtido com o DNA de WGA de cotiledôneo de FM9063 B2F purificado e com DNA de FM9063 B2F cotiledôneo bruto (isto é, não purificado). O ensaio de Taqman para a detecção de Bollgard II (Mon531), Bollgard (MON 15985), e Flex (MON 88913) também provou dar resultados idênticos entre as amostras de DNA ampliado por WGA da fibra e cotiledôneo. Mon531 foi analisado de acordo com Yang e outros (2005) J. Agric. Food Chem. 53, 62226229. Mon15985 e Mon88913 foram analisados de acordo com Lee e outros (2007) J. Agric. Food Chem. 55, 3351-3357.

[00118] Assim, DNA de fibra de algodão ampliado por WGA pode ser usado como uma fonte confiável para determinação de marcador molecular com sucesso uma vez que ele proveu resultados idênticos quando um ensaio de Taqman realizado no DNA de folha ampliado por

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WGA. Além disso, DNA de fibra de algodão ampliada por WGA pode ser usado como uma fonte confiável para a determinação característica com sucesso uma vez que ele proveu os mesmos resultados quando um ensaio de Taqman realizado no DNA de folha ampliado por WGA.

[00119] Embora usualmente um número mais alto de SNPs (cerca de 300) fossem usados para a caracterização e identificação de uma variedade específica de algodão, o presente exemplo mostra que essa abordagem é possível por uso de DNA de fibra de algodão ampliado por WGA.

Exemplo 7: Outras macromoléculas biológicas isoladas de material de fibra de algodão.

[00120] Espectrofotometria de UV do extratos dos diferentes protocolos para o isolamento indicam que esses extratos não consistem puramente em DNA e podem conter outras macromoléculas biológicas. Usando-se uma análise de Bradford, uma baixa concentração de proteínas (cerca de 10 ng/μΙ) foi encontrada. Além disso, os extratos de fibra continham várias concentrações de RNAs pequenos, resistente a RNAse I, que nós identificamos como micro RNAs.

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Claims (14)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método para a identificação de uma fibra de algodão processada, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

   a. isolamento, a partir da dita fibra de algodão, de DNA de ocorrência natural na dita fibra de algodão; e

   b. submissão do dito DNA a um ensaio de detecção específico para a dita fibra de algodão em que a dita fibra de algodão processada é uma fibra de algodão que foi submetida a pelo menos uma das etapas do processo selecionadas dentre o grupo de descaroçamento, empacotamento, tricô, tecelagem, limpeza, desidratação, branqueamento, mercerização, tingimento, enceramento, cardagem, fiação e engomação.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um ensaio de detecção é:

   a. um ensaio de detecção baseado em reação em cadeia da polimerase;

   b. um ensaio de detecção com base na hibridização de ácido nucléico.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o dito ensaio de detecção detecta:

   a. a presença ou a ausência de genes quiméricos presentes no genoma da planta de algodão que produz as fibras; ou

   b. a presença ou a ausência de alelos específicos presentes no genoma da planta de algodão que produz as fibras.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o dito gene quimérico compreende uma região ou parte codificante ou uma sua porção antissenso selecionada dentre Nacetilglicosamina transferase, fosfinotricina cetiltransferase, EPSPS, hidroxifenilpiruvatodioxigenase, uma porção inseticida de proteína cristalina de Bacillus thuringiensis, poli(ADP-ribose) polimerase, poli(ADPPetição 870170055163, de 02/08/2017, pág. 59/80

   2/5 ribose) gluco-hidrolase, sacarose sintase, sacarose fosfato sintase, glucanase, celulose sintase, quitanase, expansina, calose sintase, quinase, nicotinamidase, nicotinato fosforribosiltransferase, mononucleotídeo adenil transferase de ácido nicotínico, nicotinamida adenina dinucleotídeo sintetase ou nicotinamida fosforribosiltransferase.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o dito ensaio de detecção é um ensaio de eventoespecífico.
6. 6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a dita fibra está presente em fio, pano, tecido ou vestuário fino.
7. 7. Método para análise do genoma de uma planta de algodão produtora de fibra, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

   a. isolamento de ácidos nucleicos de fibras processadas da dita planta de algodão, o dito DNA sendo de ocorrência natural na dita fibra de algodão; e

   b. submissão do dito DNA a um protocolo de análise de genoma em que a dita fibra de algodão processada é uma fibra de algodão que foi submetida a pelo menos uma das etapas do processo selecionadas dentre o grupo de descaroçamento, empacotamento, tricô, tecelagem, limpeza, desidratação, branqueamento, mercerização, tingimento, enceramento, cardagem, fiação e engomação.
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o dito DNA isolado é submetido a uma etapa de amplificação do genoma inteiro antes da submissão do dito ácido nucleico a um protocolo de análise do genoma.
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que o dito método é aplicado a fibras maduras vePetição 870170055163, de 02/08/2017, pág. 60/80

   3/5 lhas, ou fios velhos, panos ou vestuário fino.
10. 10. Método para o isolamento de DNA de ocorrência natural de fibras de planta de algodão processadas, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

    a. remoção do material de refugo do tronco e da folha oriundo de fibras de algodão; e

    b. incubação das ditas fibras de planta em um tampão de lise contendo detergentes, proteases e sais por um período de 4 a 100 horas; e

    c. processamento do dito tampão de lise de acordo com métodos de isolamento de DNA padrão e isolamento do dito DNA de ocorrência natural;

    em que a dita fibra de algodão processada é uma fibra de algodão que foi submetida a pelo menos uma das etapas do processo selecionadas dentre o grupo de descaroçamento, empacotamento, tricô, tecelagem, limpeza, desidratação, branqueamento, mercerização, tingimento, enceramento, cardagem, fiação e engomação.
11. 11. Método para o isolamento de um DNA de ocorrência natural de tecido ou de pano tricotado, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

    a. desfazer a tecelagem dos fios do dito pano;

    b. incubação dos ditos fios em um tampão de lise contendo detergentes, proteases e sais por um período de 4 a 100 horas; e

    c. processamento do dito tampão de lise de acordo com métodos padrão de isolamento de ácido nucléico e isolamento do dito ácido nucléico;

    em que a dita fibra de algodão processada é uma fibra de algodão que foi submetida a pelo menos uma das etapas do processo selecionadas dentre o grupo de descaroçamento, empacotamento, tricô, tecelagem, limpeza, desidratação, branqueamento, mercerização,

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    4/5 tingimento, enceramento, cardagem, fiação e engomação.
12. 12. Uso de um método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que é em um processo para certificar a identidade de fibras de planta de algodão comercializadas.
13. 13. Método para determinar as quantidades relativas de diferentes fibras de planta de algodão em uma mistura de fibras de algodão processadas, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

    a. isolamento, a partir da dita mistura de fibras de algodão, de um DNA de ocorrência natural nas ditas fibras de algodão;

    b. submissão do dito DNA a ensaios de detecção específicos para cada uma das ditas fibras de algodão; e

    c. determinação da quantidade relativa de cada uma das fibras;

    em que a dita fibra de algodão processada é uma fibra de algodão que foi submetida a pelo menos uma das etapas do processo selecionadas dentre o grupo de descaroçamento, empacotamento, tricô, tecelagem, limpeza, desidratação, branqueamento, mercerização, tingimento, enceramento, cardagem, fiação e engomação.
14. 14. Método para certificar a identidade de fibras de algodão comercializadas, caracterizado pelo fato de que compreende:

    a. registro de compra de sementes de algodão certificadas por cultivadores registrados, a dita semente de algodão compreendendo uma composição de genoma específico e produção de uma qualidade particular de fibras de planta;

    b. registro de fardos de fibras de planta brutas produzido pelo ditos cultivadores registrados a partir da dita semente de algodão certificada como a dita qualidade particular de fibras de planta;

    c. autenticação dos ditos fardos por checagem cruzada com

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    5/5 os ditos registros de compra de semente;

    d. provisão dos ditos fardos registrados a moinhos para produzir fios, panos ou vestuário a partir da dita qualidade de fibras de planta, de preferência predominantemente, particularmente exclusivamente da dita qualidade de fibras de planta;

    e. auditoria da identidade da dita qualidade de fibras de planta em uma ou mais etapas usando-se um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9.

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