MX2011001427A - Metodos para la caracterizacion e identificacion de fibras vegetales. - Google Patents

Abstract

Se proveen métodos para el aislamiento de macromoléculas biológicas que incluyen péptidos, proteínas y ácidos nucleicos de fibras vegetales maduras tales como fibras de algodón y de textiles; las macromoléculas biológicas pueden usarse para caracterizar la fibra vegetal (fuente, origen, composición genómica de la planta productora, etc.).

Description

MÉTODOS PARA LA CARACTERIZACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE FIBRAS VEGETALES CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos para aislar macromoléculas biológicas que incluyen péptidos, proteínas y ácidos nucleicos, de fibras vegetales maduras tales como fibras de algodón. Las fibras vegetales pueden haber sido procesadas en hilos, los cuales a su vez pueden ser tejidos o tricotados hasta tela o indumentaria acabada, antes del aislamiento de las macromoléculas biológicas. Puesto que las macromoléculas aisladas contienen información codificada en la secuencia de sus bloques estructurales, estas macromoléculas aisladas de fibras vegetales de conformidad con los métodos actualmente descritos, pueden usarse convenientemente para caracterizar la fibra vegetal o identificar el origen o la fuente de la fibra vegetal. La información resultante puede usarse, por ejemplo, en programas de preservación de identidad para fibras vegetales especiales, certificación del origen de las fibras vegetales, o incluso en la reconstrucción del mejoramiento genético de pedigríes usando fuentes históricas de las fibras vegetales.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las fibras vegetales forman una fuente para productos económicamente importantes, tales como papel, cuerdas (cordones y cuerdas) y textiles. Una fibra se define botánicamente como una célula cónica estrecha larga, muerta y hueca en la madurez, con una pared celular gruesa rígida compuesta principalmente de celulosa y usualmente lignina. Las fibras blandas o liberianas se encuentran en el floema (corteza interior) de los tallos de las dicotiledóneas (lino, yute, cáñamo, ramio). Las fibras duras de hojas o foliares se encuentran en los haces vasculares de las hojas de las monocotiledóneas (sisal, cáñamo de Manila, piña). Las fibras de superficie se desarrollan de la superficie de semillas (algodón), hojas o frutos (fibra de coco).

El algodón provee gran parte de la fibra de alta calidad para la industria textil, y se han invertido esfuerzos importantes en la obtención de fibras de algodón con características que favorezcan los requerimientos de la industria, a través de mejoramiento genético por métodos clásicos o alterando genéticamente el genoma de las plantas de algodón.

La fibra de algodón se origina como un tricoma de la semilla, más específicamente una células individual que se inicia de la epidermis del integumento exterior de los óvulos, en o poco antes de la antesis. El desarrollo morfológico de las fibras de algodón ha sido bien documentado (Basra y Malik, 1984, Int Rev of Cytology 89: 65- 13; Graves y Stewart, 1988, citado anteriormente; Ramsey y Berlín, 1976, American Journal of Botany 63 (6): 868-876; Rúan y Chourey, 1998, Plant Physiology 118: 399-406; Rúan et al. 2000, Aust. J. Plant Physiol. 27: 795-800; Stewart, 1975, Am. J. Bot. 62, 723-730). Las fibras de algodón, en particular de Gossypium hirsutum, sufren cuatro etapas de desarrollo traslapantes: inicio de la célula de la fibra, alargamiento, biosíntesis de la pared celular secundaria y maduración. El inicio de la célula de la fibra es un proceso rápido. Fibras blancas cubiertas de pelusa comienzan a desarrollarse inmediatamente después de la antesis y continúan hasta aproximadamente 3 días post-antesis (DPA), lo cual va seguido por alargamiento de la célula de la fibra (hasta aproximadamente 10 a aproximadamente 17 DPA). Dependiendo de las condiciones de crecimiento, la biosíntesis de la pared celular secundaria se inicia y continúa hasta aproximadamente 25 a aproximadamente 40 DPA, seguida de un proceso de maduración hasta aproximadamente 45 a aproximadamente 60 DPA. La síntesis de la pared celular secundaria y la fase de maduración se consideran comúnmente como la "fase de aumento de resistencia de la fibra". Sólo aproximadamente 25 a 30% de las células de la epidermis se diferencian en las fibras de pelusa comercialmente importantes (Kim y Triplett, 2001). La mayoría de las células no se diferencia en fibras, o se desarrolla en fibras cortas o tamo. Durante el alargamiento de la fibra y el metabolismo de la pared secundaria, las células de las fibras se alargan rápidamente, sintetizan los componentes de la pared secundaria, y muestran cambios celulares, moleculares y fisiológicos dramáticos. El alargamiento de la fibra se acopla con el rápido crecimiento y expansión de la célula (Seagull, 1991 , en Biosynthesis and biodegradation of cellulose (Haigler, C. H. & Weimer, P. J., eds.) pp. 1432163, Marcel Dekker, New York) y la síntesis constante de una gran cantidad de metabolitos de la célula y componentes de la pared celular tales como la celulosa. Aproximadamente 95% del peso seco en las fibras de algodón maduras, es celulosa (Pfluger y Zambryski, 2001 , Curr Biol 11 : R436-R439; Rúan et al., 2001 , Plant Cell 13: 47-63). Los componentes no celulósicos son también importantes para el desarrollo de la célula de la fibra (Hayashi y Delmer, 1988, Carbohydr. Res. 181 : 273-277; Huwyler et al., 1979, Planta 146: 635-642; Meinert y Delmer, 1977, Plant Physiol 59: 1088-1097; Peng et al., 2002, Science 295: 147-150). En comparación con otras células vegetales, las fibras de algodón no contienen lignina en las paredes secundarias, pero tienen grandes vacuolas que presumiblemente están relacionadas con el rápido crecimiento y expansión de la célula (Basra y Malik, 1984, citado anteriormente; Kim y Triplett, 2001 , Plant Physiology 127: 1361— 1366; Mauney, 1984, citado anteriormente; Rúan y Chourey, 1998, citado anteriormente; Rúan et al., 2000, citado anteriormente; Van't Hof, 1999, American Journal of Botany 86: 776-779).

Las células de las fibras de algodón en desarrollo son células vivas y, por consiguiente, contienen macromoléculas biológicas tales como péptidos, proteínas, y ácidos nucleicos tales como ADN y ARN. En contraste, las fibras maduras son células huecas muertas, consistiendo principalmente de celulosa. Se acepta generalmente que las células de las fibras, en , particular las células de las fibras de algodón, no contienen más ácidos nucleicos o proteínas extraíbles. Con base en esta inercia, se usan hisopos de algodón como un aplicador para sustancias médicas, así como para tomar muestras de ADN de, más comúnmente, la mejilla interior en investigaciones forenses.

Además, las fibras vegetales están sujetas a procesamiento extensivo antes de su uso en la industria, en particular antes de su uso en la industria textil. En el caso del algodón, el procesamiento de la fibra en bruto en el campo hasta la indumentaria acabada para venta, implica numerosos pasos que varían ampliamente, dependiendo del producto final deseado. Los varios pasos posibles en estos procedimientos pueden dividirse generalmente en pasos mecánicos y químicos.

El procedimiento de la cosecha y el desmotado del algodón, puede someter a la fibra a daño térmico y mecánico. No se aplican químicos durante el procedimiento de desmotado. Se usa con frecuencia calor para secar el algodón durante el procedimiento de desmotado, si contiene más de 8% de humedad. El calor es usualmente regulado estrechamente para evitar el daño de las fibras. Puede ocurrir daño mecánico durante las operaciones de cosecha y desmotado. Este daño mecánico debe afectar un por ciento muy bajo del total de las fibras.

Durante la hilatura, los pasos del procedimiento son principalmente mecánicos. Fibras cortas (fibras inmaduras y/o mecánicamente dañadas y material extraño) se remueven en el procedimiento de hilatura. Los primeros tratamientos químicos en el procesamiento se hacen hacia el final del procedimiento de hilatura, cuando el hilo para tricotado se trata con un lubricante y casi la mitad del hilo para tejeduría se trata con material de encolado. El hilo de algodón para tricotado se trata con más frecuencia con cera como un lubricante para facilitar el movimiento del hilo a través del equipo de tricotado. Lubricantes sintéticos están también disponibles, pero se cree que la cera es aún el tratamiento más común. El encolado, denominado también encolaje, se aplica al hilo para tejeduría que se usará como las hebras a lo largo en la tela acabada (la urdimbre). El hilo lateral (guata) no se trata con encolado. El material común usado para el encolado es el almidón. Se usa también alcohol polivinílico para el encolado, y mezclas de almidón y alcohol polivinílico son comunes. Aditivos tales como aglutinantes, humectantes, suavizantes, agentes mojantes, desespumantes y otros adyuvantes, pueden añadirse al tratamiento de encolado.

El tricotado y la tejeduría son procedimientos mecánicos que no implican aplicaciones de compuestos químicos o calor. Al final de los procedimientos de tricotado y tejeduría, los pasos para preparar la tela restante para acabado implican la aplicación de compuestos químicos y, en algunos casos, altas temperaturas. El objetivo del procedimiento de preparación del paso de acabado, es remover las impurezas que interferirán con el procesamiento a través del teñido, estampado u otros pasos de acabado. Principalmente, la cera debe ser removida de la tela tricotada (lavado a fondo), y debe removerse el encolado de la tela tejida (desencolado). Otras impurezas que pueden removerse en este paso incluyen hollejos de semillas, pectinas y otros compuestos químicos. Los compuestos químicos usados para el desencolado incluyen enzimas para remover almidón y sosa, ceniza o detergentes para remover alcohol polivinílico. El lavado a fondo se hace con solventes orgánicos que disolverán la cera u otros lubricantes usados. Después del lavado a fondo o el desencolado, la tela se blanquea usualmente usando blanqueador de peróxido o cloro. Los propósitos del blanqueo son remover cualquier material no fibroso restante, hidrólisis, oxidación y remoción del encolado residual, y mejorar la absorbancia del colorante. El blanqueo con peróxido puede implicar vapor o baño de agua a casi las temperaturas de ebullición del agua, y el baño de blanqueador puede contener aditivos tales como estabilizadores y agentes secuestrantes. El blanqueo con cloro se hace a temperaturas más bajas (40 a 50°C), y la degradación de la celulosa es menor que con peróxido. Si se usa cloro para el blanqueo, se requiere también un tratamiento anticloro. El chamuscado con una llama controlada se lleva a cabo en algunas telas para limpiar la superficie de la tela y remover o reducir el frisado. Pueden añadirse abrillantadores ópticos a las telas o prendas que se van a vender como productos no teñidos blancos. Abrillantadores ópticos orgánicos aniónicos se usan típicamente en el algodón. Varios compuestos están disponibles, y algunos pueden añadirse durante el blanqueo.

La mercerización es un procedimiento que puede aplicarse a hilo o tela de algodón para mejorar la absorción del colorante (o la reacción al mismo) y otros tratamientos de acabado químicos, así como para mejorar la resistencia a la rotura, mejorar la estabilidad dimensional, mejorar la tersura y lustre de la tela, y cubrir fibras de algodón inmaduras. Es un procedimiento que implica tratamiento con NaOH, lavado, lavado a fondo con ácido, enjuague y secado.

El tratamiento de acabado más común es el teñido. Puede hacerse en la etapa de hilo, tela o prenda. Los colorantes usados para el algodón son numerosos y de muchos tipos diferentes. El producto colorante más común para el algodón es el índigo, pero representa sólo 4% de la tela teñida. El teñido puede hacerse como un procedimiento continuo o un procedimiento intermitente. Mientras que los compuestos químicos usados para el teñido son numerosos, el procedimiento implica habitualmente el uso de alta temperatura, cerca de la ebullición, en la cuba de colorante para lo cual la tela, el hilo o las prendas pueden ser sumergidos por tiempo extendido. El estampado es el otro procedimiento importante para la adición de color o diseño a textiles. El estampado implica principalmente un procedimiento mecánico para aplicar tintes colorantes a la superficie de la tela o prendas. Tanto el teñido como el estampado pueden implicar la aplicación de agentes fijadores químicos al final del procedimiento.

Otro tratamiento de acabado común, especialmente después del teñido, es el lavado agresivo. Éste incluiría el uso de detergentes y otros agentes de limpieza para remover los materiales de acabado residuales de la tela o prenda acabada.

Muchos otros pasos de acabado químico y mecánico pueden aplicarse a la tela, hilo o prendas, implicando numerosas opciones de procedimientos de tratamiento y químicos. Los suavizantes solos pueden ser de tres tipos diferentes, y cada tipo puede implicar varios compuestos químicos diferentes.

Aunque el resumen anterior de la conversión de la fibra de algodón en bruto en productos textiles de uso final es altamente generalizado, quedará claro que el experto en la técnica no esperaría poder extraer péptidos, proteínas o ácidos nucleicos de hilos, textiles o productos de indumentaria acabados después de los numerosos pasos de tratamiento térmico y químico implicados habitualmente.

Existe la necesidad en la industria de poder investigar la fuente y/o el origen de las fibras vegetales, en particular de fibras vegetales maduras y/o procesadas. Dicha identificación de la fuente y/o el origen de las fibras vegetales puede ser importante para los procedimientos de certificación, garantizando la producción y el procesamiento de fibras de calidad especificada producidas de germoplasma específico, tal como el programa de certificación FiberMax® (www.certifiedfibermax.com). La capacidad para investigar la fuente y/o el origen de las fibras maduras y/o procesadas, permite también la identificación de fibras vegetales que tienen características especiales, tales como las fibras con reactividad química o afinidad por colorantes mejorada, como se describe en el documento WO2006/136351.

Los programas de certificación existentes se basan en el registro por agricultores o comerciantes al por menor de semillas, de la compra de semillas de germoplasma especifico de un cultivo de fibras, tales como el algodón, y la identificación de las fibras producidas de los agricultores registrados (en el caso del algodón, por números de identificación de balas permanentes de la USDA).

La capacidad para investigar la fuente y/o el origen de las fibras vegetales, en particular de fibras maduras y/o procesadas, sería ampliamente mejorada si fuese posible extraer macromoléculas biológicas de las fibras vegetales maduras y/o procesadas que contienen información biológica relacionada con la planta fuente de las fibras, tales como péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, ADN o ARN. De esta manera, se haría posible la auditoría de programas de certificación existentes. Además, llegaría a ser posible identificar fibras en una etapa posterior en la cadena de suministro, más allá de los agricultores o proveedores de fibras tal como, por ejemplo, al nivel de hilandera, tejedora o cliente minorista.

Las instituciones Agricultural Research Service, USDA y Applied DNA Sciences, trabajaron juntas para desarrollar un sistema de marcación basado en tecnologías basadas en el ADN, para investigar los componentes textiles y del algodón originados de los Estados Unidos (htpp://seedquest.com/News/releases/2004/February/7829.htm).

De esta manera, sería ventajoso poder extraer macromoléculas biológicas de ocurrencia natural de fibras vegetales, tales como las fibras de algodón, en particular de fibras maduras y/o procesadas, textiles, hilos o indumentaria, y además poder derivar información relacionada con la fuente de la planta de dichas fibras vegetales.

Los métodos descritos más adelante en las diferentes modalidades, ejemplos, figuras y reivindicaciones proveen una solución al problema mencionado anteriormente, permitiendo extraer macromoléculas biológicas naturales de fibras vegetales, tales como las fibras de algodón, en particular de fibras maduras y/o procesadas, textiles, hilos o indumentaria, y además permiten derivar información relacionada con la fuente de la planta de dichas fibras vegetales.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En una modalidad, la invención provee un método para caracterizar una fibra vegetal madura o una fibra vegetal procesada, tal como una fibra de una semilla o fibra de algodón, que comprende los pasos de aislar de dicha fibra vegetal una macromolécula biológica de ocurrencia natural en dicha fibra vegetal diferente de polisacáridos o lignina; y caracterizar la información codificada en la secuencia de los monómeros de dicha macromolécula biológica.

En otra modalidad de la invención, la invención provee un método para identificar una fibra vegetal madura o una fibra vegetal procesada, tal como una fibra de una semilla o fibra de algodón, que comprende los pasos de aislar de dicha fibra vegetal una macromolécula biológica de ocurrencia natural en dicha fibra vegetal diferente de polisacáridos o lignina; y someter dicha macromolécula biológica a una prueba de detección específica para dicha fibra vegetal.

En una modalidad, la macromolécula biológica puede ser un polipéptido, proteína, ácido nucleico, ADN, ARN, ARN de cadena sencilla o ARN de doble cadena.

En otra modalidad, la prueba de detección puede ser una prueba de detección basada en reacción en cadena de polimerasa, una prueba de detección basada en anticuerpos, o una prueba de detección basada en hibridación de ácidos nucleicos.

En otra modalidad, la prueba de detección puede detectar la presencia o ausencia de genes quiméricos presentes en el genoma de la planta que produce las fibras. El gen quimérico puede comprender una región codificante o parte de una porción antisentido de la misma seleccionada de N-acetilglucosamina transferasa, fosfinotricinacetiltransferasa, EPSPS, hidroxifenilpiruvatodioxigenasa, una porción insecticida de proteína cristalina de Bacillus thuríngiensis, poli(ADP-ribosa) polimerasa, poli(ADP-ribosa) glucohidrolasa, sacarosa sintasa, sacarosa fosfato sintasa, glucanasa, celulosa sintasa, quitinasa, expansina, calosa sintasa, cinasa, nicotinamidasa, nicotinato fosforribosiltransferasa, ácido nicotíníco mononucleótido adenil transferasa, nicotinamida adenín dinucleótido sintetasa o nicotinamida fosforribosiltransferasa. La prueba de detección puede ser también una prueba de detección específica de evento.

En otra modalidad de la invención, la prueba de detección puede detectar la presencia o ausencia de alelos específicos presentes en el genoma de la planta que produce las fibras.

En otra modalidad de la invención, la fibra de la cual la macromolécula biológica se aisla está presente en hilos, tela, tela con hilos metálicos o indumentaria acabada.

La invención provee además un método para analizar el genoma de una planta que produce fibras, que comprende los pasos de aislar ácidos nucleicos de fibras maduras o procesadas de dicha planta, dichos ácidos nucleicos siendo de ocurrencia natural en dicha fibra vegetal; y someter dicho ácido nucleico a un protocolo de análisis del genoma. El método puede aplicarse a fibras maduras añejas, o hilos añejos, telas o indumentaria acabada.

Otra modalidad de la invención es un método para aislar un ácido nucleico tal como ADN de fibras vegetales maduras o fibras vegetales procesadas, que comprende los pasos de incubar dichas fibras vegetales en un regulador de pH que contenga detergentes, proteasas y sales por un tiempo prolongado, de preferencia por un período de 4 a 100 horas; y procesar dicho regulador de pH de lisis de acuerdo con métodos estándar de aislamiento de ácidos nucleicos, y aislar dicho ADN.

En otra modalidad de la invención, se provee un método para aislar un ácido nucleico, tal como ADN, de tela tejida o tricotada, que comprende los pasos de destejer los hilos de dicha tela; incubar dichos hilos en un regulador de pH que contenga detergentes, proteasas y sales por un tiempo prolongado, de preferencia por un período de 4 a 100 horas; y procesar dicho regulador de pH de lisis de acuerdo con métodos estándar de aislamiento de ácidos nucleicos, y aislar dicho ácido nucleico.

En otra modalidad de la invención, se provee un método para aislar un ácido nucleico, tal como ADN, de fibras vegetales maduras cosechadas, que comprende los pasos de remover material de desperdicio de la hoja y el tallo de las fibras vegetales maduras cosechadas; incubar dichas fibras vegetales en un regulador de pH que contenga detergentes, proteasas y sales por un tiempo prolongado, de preferencia por un período de 4 a 100 horas; y procesar dicho regulador de pH de lisis de acuerdo con métodos estándar de aislamiento de ácidos nucleicos, y aislar dicho ácido nucleico.

La invención provee también el uso de un método de conformidad con la invención, en un procedimiento para certificar la identidad de fibras vegetales comercializadas.

La invención provee además un método para determinar las cantidades relativas de diferentes fibras vegetales en una mezcla de fibras vegetales maduras o procesadas, que comprende los pasos de aislar de dicha mezcla de fibras vegetales, una macromolécula biológica de ocurrencia natural en dichas fibras vegetales diferente de polisacáridos o lignina; someter dicha macromolécula biológica a pruebas de detección específicas para cada una de dichas fibras vegetales; y determinar la cantidad relativa de cada una de las fibras.

En otra modalidad de la invención, se provee un método para certificar la identidad de fibras de algodón comercializadas, dicho método comprendiendo registrar la compra de semillas de algodón certificadas por agricultores registrados, dicha semilla de algodón comprendiendo una composición específica del genoma y produciendo una marca particular de fibras de algodón; registrar balas de fibras de algodón en bruto producidas por dichos agricultores registrados de dichas semillas de algodón certificadas como dicha marca particular de fibras de algodón; autenticar dichas balas por verificación cruzada con dichos registros de compra de la semilla; proveer dichas balas registradas a molinos para producir hilos, telas o indumentaria de dicha marca de fibras de algodón, de preferencia predominantemente, en particular exclusivamente de dicha marca de fibras de algodón; y auditar la identidad de dicha marca de fibras de algodón en uno o más pasos usando un protocolo como se describe en la presente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1 : Amplificación por PCR de GhGlud en moldes de ácido nucleico aislados de material de fibras de algodón maduras (FM966 de Gossypium hirsutum). Campo 1 : marcador de peso molecular; campo 2: ADN molde de fibras purificadas (1 µ?); campo 3: ADN molde de fibras no purificadas que contienen desperdicio de hojas (1 pl); campo 4: ADN molde de sólo desperdicio de hojas (1 pl); campo 5: ADN molde de fibras purificadas (5 pl); campo 6: ADN molde de fibras no purificadas que contienen desperdicio de hojas (5 pl); campo 7: ADN molde de sólo desperdicio de hojas (5 pl); campo 8: sin control de ADN molde; campo 9: control positivo - ADN genómico aislado de materia vegetal de FiberMax966 (FM966).

Figura 2: Amplificación por PCR de GhGlud en moldes de ácido nucleico aislados de material de fibras de algodón maduras de F 966 de Gossypium hirsutum y de material de fibras de algodón de 4 años de Pima Y5 de Gossypium barbadense. Campo 1 : marcador de peso molecular; campos 2 a 3: ADN molde de fibras purificadas de FM966 que no contienen desperdicio de hojas (5 pl); campos 4 a 5: ADN molde de fibras no purificadas de FM966 que contienen desperdicio de hojas (5 pl); campo 6: ADN molde de desperdicio de hojas de FM966 que no contienen material de fibras (5 pl); campos 7 a 8: ADN molde de fibras purificadas de Pima Y5 que no contienen desperdicio de hojas (5 pl); campo 9: sin control de ADN molde; campo 10: control positivo - ADN genómico aislado de materia vegetal de FiberMax966.

Figura 3: Amplificación por PCR de GhGlud en moldes de ácido nucleico aislados a través de varios protocolos. Campo 1 : marcador de peso molecular; campo 2: ADN molde aislado por mini kit para plantas DNeasy® (5 pl); campo 3: ADN molde aislado por mini kit para plantas DNeasy® (1 pl); campo 4: ADN molde aislado por mini kit para plantas DNeasy® (1 pl); campo 5: ADN molde aislado por mini kit para plantas DNeasy® (5 pl); campo 6: ADN molde aislado por kit de purificación de ADN genómico Wizard® (1 pl); campo 7: ADN molde aislado por kit de purificación de ADN genómico Wizard® (5 pl); campo 8: ADN molde aislado por kit de purificación de ADN genómico Wizard® (1 pl); campo 9: ADN molde aislado por kit de purificación de ADN genómico Wizard® (5 pl); campo 10: ADN molde aislado por el procedimiento de CTAB (1 pl); campo 11 : ADN molde aislado por el procedimiento de CTAB (5 pl); campo 12: sin control de ADN molde; campo 13: control positivo - ADN genómico aislado de materia vegetal de FiberMax966.

Figura 4: Amplificación por PCR de GhGlud en moldes de ácido nucleico aislados de ropa de algodón. Campos 1 y 8: marcador de peso molecular; campo 2: ADN molde de ropa de algodón (luego de incubación) (1 pl); campo 3: ADN molde de ropa de algodón (incubación por 30 minutos) (1 pl); campo 4: ADN molde de ropa de algodón (luego de incubación) (5 pl); campo 5: ADN molde de ropa de algodón (incubación por 30 minutos) (5 pl); campo 6: sin control de ADN molde; campo 7: control positivo - material genómico aislado de materia vegetal de FiberMax966.

Figura 5: Amplificación por PCR de GhGlud en moldes de ácido nucleico aislados de camisas de algodón con diferentes ligamentos (tricotados o tejidos). Campo 1 : marcador de peso molecular; campo 2: ADN molde de camisa de algodón tejida, luego de incubación, (1 pl); campo 3: ADN molde de camisa de algodón tejida, luego de incubación, (5 pl); campo 4: ADN molde de camisa de algodón tejida, luego de incubación, (1 pl); campo 5: ADN molde de camisa de algodón tejida, luego de incubación, (5 µ?); campo 6: ADN molde de camisa de algodón tricotada, luego de incubación, (1 pl); campo 7: ADN molde de camisa de algodón tricotada, luego de incubación, (5 µ?); campo 8: ADN molde de camisa de algodón tricotada, luego de incubación, (1 pl); campo 9: ADN molde de camisa de algodón tricotada, luego de incubación, (5 pl); campo 10: ADN molde de camisa de algodón tejida, 6 días de incubación, (1 µ?); campo 11 : ADN molde de camisa de algodón tejida, 6 días de incubación, (5 µ?); campo 12: ADN molde de camisa de algodón tejida, 6 días de incubación, (1 pl); campo 13: ADN molde de camisa de algodón tejida, 6 días de incubación, (5 pl); campo 14: ADN molde de camisa de algodón tricotada, 6 días de incubación, (1 pl); campo 15: ADN molde de camisa de algodón tricotada, 6 días de incubación, (5 pl); campo 16: ADN molde de camisa de algodón tricotada, 6 días de incubación, (1 µ?); campo 17: ADN molde de camisa de algodón tricotada, 6 días de incubación, (5 pl); campo 18: sin control de ADN molde; campo 19: control positivo - ADN genómico aislado de materia vegetal de FiberMax966.

Figura 6: Amplificación por PCR de NodC en moldes de ácido nucleico aislados de material de fibras de algodón transgénico maduro que contiene un gen quimérico que codifica para N-acet¡lglucosamina transferasa. Campo 1 : ADN molde de material de fibras transgénico, duplicado 1 (1 pl); campo 2: ADN molde de material de fibras transgénico, duplicado 1 (5 pl); campo 3: ADN molde de material de fibras transgénico, duplicado 2 (1 µ?); campo 4: ADN molde de material de fibras transgénico, duplicado 2 (5 pl); campo 5: sin control de ADN molde; campo 6: control positivo - ADN genómico aislado de materia vegetal de algodón transgénico; campo 7: marcador de peso molecular.

Figura 7: Representación gráfica de la prueba Taqman de punto terminal que discrimina entre el alelo del subgenoma A de GhGlud de Gossypium hirsutum y de Gossypium barbadense. Muestras de ADN genómico preparadas de materia vegetal (hojas) de Pima (G. barbadense) o FM966 (G. hirsutum), ya sea en forma pura, o en mezclas de varias relaciones (75/25, 50/50 y 25/75), sometidas a una prueba de detección Taqman. El eje X indica la presencia del alelo hirsutum de Glud , mientras que el eje Y indica la presencia del alelo barbadense de Glud . En las muestras de ADN mixtas, el análisis Taqman permite la detección de las varias relaciones de ambos alelos.

Figura 8: Representación gráfica de la prueba Taqman de punto terminal que discrimina entre el alelo del subgenoma A de GhGlud de Gossypium hirsutum y de Gossypium barbadense en material de fibras y textil de camisa polo. Muestras de ADN genómico preparadas de materia vegetal (hojas) de Pima (G. barbadense) o FM966 (G. hirsutum), ya sea en forma pura, o en mezcla de 50/50 como muestras control. Ácidos nucleicos preparados de material de fibras (bala de FM966) o de material textil (polo), se sometieron a una prueba de detección Taqman. El eje X indica la presencia del alelo hirsutum de Glud , mientras que el eje Y indica la presencia del alelo barbadense de Glud . En el análisis, sólo se detectó el alelo hirsutum, indicando que todo el material de fibras y todo el material textil contiene sólo fibras de tipo hirsutum.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES DE LA INVENCIÓN Los métodos actualmente descritos, se basan en el hallazgo inesperado de que es posible extraer macromoléculas biológicas (diferentes de polisacáridos) tales como péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, ADN o ARN, de fibras vegetales maduras y/o procesadas, en particular de fibras de semilla tales como las fibras de algodón. Además, el ADN aislado demostró ser de calidad suficiente para ser utilizable para más procesamiento, permitiendo la caracterización de las fibras, por ejemplo, usando pruebas de detección, tales como amplificaciones basadas en reacción en cadena de polimerasa.

De esta manera, en una primera modalidad, la invención provee un método para una fibra vegetal madura o una fibra vegetal procesada, que comprende los pasos de aislar de dicha fibra vegetal una macromolécula biológica de ocurrencia natural en dicha fibra vegetal, diferente de polisacáridos o lignina; y caracterizar la información codificada en la secuencia de los monómeros de dicha macromolécula biológica.

Como se usa en la presente, una "fibra vegetal madura" es una fibra que ha completado su ciclo de desarrollo, y se considera que es el remanente de una célula muerta. En particular, una fibra vegetal madura es una fibra vegetal después de que ha sido cosechada del cultivo de fibras que produce la fibra vegetal. Par el algodón, por ejemplo, una fibra madura sería considerada las fibras como están presentes en las balas de algodón recolectadas en la cosecha. Quedará claro que las fibras vegetales maduras comprenden todas las fibras vegetales procesadas por la industria de las fibras.

Una "fibra vegetal procesada", como se usa en la presente, es una fibra vegetal madura como se cosecha de la planta de cultivo, la cual ha sufrido tratamientos mecánicos, térmicos y/o químicos adicionales, que incluyen encerado, teñido, cardado, hilatura, tejeduría, encolado, mercerización, etc. (véase la sección de antecedentes de la invención).

El término "fibras vegetales", como se usa en la presente, se refiere a células cónicas estrechas largas de origen vegetal, muertas y huecas en la madurez, con una pared celular gruesa rígida compuesta principalmente de celulosa y lignina.

Las "fibras de semilla", como se usan en la presente, son fibras desarrolladas de la superficie de semillas tales como el algodón. El término "algodón", como se usa en la presente, incluye Gossypium hirsutum o Gossypium barbadense, incluyendo "plantas progenitoras de algodón", tales como Gossypium arboretum, Gossypium herbaceum y Gossypium raimondii y Gossypium longicalyx.

Una "macromolécula biológica" de ocurrencia natural en una célula de fibra vegetal", es una macromolécula biológica que no ha sido añadida exógenamente a dicha fibra vegetal, por ejemplo, a través de incubación o inyección con una molécula tal como una molécula de ADN extraña, péptido o proteína para marcar las fibras vegetales, y la cual incluye todas las macromoléculas, es decir, moléculas de naturaleza polimérica que tienen un contenido de información. El contenido de información será usualmente codificado en la secuencia de los bloques estructurales o monómeros. Ejemplos de macromoléculas biológicas son polipéptidos, proteínas, y ácidos nucleicos tales como ADN o ARN, sean de cadena sencilla o de doble cadena.

El término "caracterización de una macromolécula biológica", como se usa en la presente, significa decodificar el contenido de información de la macromolécula biológica. Esto puede hacerse convenientemente sometiendo la macromolécula biológica a una serie de análisis, que incluyen determinación de la secuencia de monómeros de los cuales la macromolécula está compuesta, pero sometiendo también la macromolécula biológica a una o más pruebas de detección específicas.

Una "prueba de detección", como se usa en la presente, es un método o protocolo dirigido a encontrar una secuencia específica de monómeros en una macromolécula biológica. Esto puede incluir pruebas de detección basadas en amplificación basada en reacción en cadena de polimerasa, detección de anticuerpos o hibridación de ácidos nucleicos.

Se ha demostrado que los métodos de extracción particulares, mientras que tienen una influencia sobre la calidad de la macromolécula biológica extraída, no son críticos para la capacidad de poder extraer dichas macromoléculas biológicas de fibras vegetales.

Sin embargo, se ha encontrado inesperadamente que la calidad y/o la cantidad de las macromoléculas biológicas, en particular la fracción de ácido nucleico de las mismas, aisladas de fibras vegetales maduras y/o procesadas, pueden ser mejoradas ampliamente por varias medidas.

Puede ser ventajoso, por ejemplo, dejar que las fibras vegetales sean analizadas por un tiempo prolongado en un regulador de pH de lisis que contenga detergentes y posiblemente otros constituyentes. En particular, se ha encontrado que la incubación de fibras vegetales maduras y/o procesadas por un período de por lo menos 30 minutos, pero más preferiblemente por un período de por lo menos 4 horas hasta 120 horas en un regulador de pH de lisis, de preferencia a temperatura ambiente, mejorará el rendimiento de las macromoléculas biológicas recuperadas, en particular la fracción de ácido nucleico de las mismas.

Se ha determinado también que removiendo cuidadosamente impurezas, que incluyen remanentes de hojas, resinas y otros desperdicios de las fibras vegetales, tales como fibras de algodón cosechadas y/o desmotadas, antes del aislamiento de las macromoléculas biológicas, se mejora ampliamente la calidad de los ácidos nucleicos aislados, en particular con respecto a más análisis y facilidad de empleo de los ácidos nucleicos aislados.

Los métodos de la presente invención pueden usarse en forma ventajosa para identificar fibras de algodón derivadas de plantas que contienen eventos de transformación, o combinación de eventos de transformación, que pueden ser la materia de peticiones para estado no regulado, en los Estados Unidos de Norteamérica, al Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS) del United States Department of Agriculture (USDA), ya sea que dichas peticiones sean concedidas o estén aún pendientes, incluyendo los siguientes eventos: Para este fin, las macromoléculas biológicas, en particular los ácidos nucleicos tales como el ADN, pueden ser sometidos a una prueba de detección diseñada específicamente para detectar los eventos de transformación. Dichas pruebas de detección incluyen las pruebas publicadas en http://qmo-crl.irc.it/statusofdoss.htm por lo menos para los eventos MON1445, MON531 , MON15985, LLCotton25, 3006-210-23 y 281-24-236.

Información adicional tal como secuencias de nucleótidos de la secuencia de flanqueo de la planta adyacente al ADN insertado en estos eventos de transformación (después de lo cual pueden diseñarse pruebas de detección de ADN específicas de la información), puede encontrarse en las siguientes solicitudes de patente: Los métodos de la presente invención pueden usarse en forma ventajosa para identificar fibras de algodón derivadas de plantas de algodón que contienen material genético que imparte rasgos útiles particularmente ventajosos a estas plantas. Ejemplos de dichos rasgos, son mejor crecimiento de la planta, tolerancia incrementada a tensiones abióticas tales como altas o bajas temperaturas, sequía, contenido extremo de agua o sales o minerales en el suelo, cualidades de floración incrementadas, cosecha más fácil, maduración acelerada, mayores rendimientos de cosecha de partes de la planta comercialmente relevantes (por ejemplo, semillas), mayor calidad y/o mayor valor nutricional de los productos cosechados, y mejores estabilidad en almacenamiento y/o facilidad de empleo de los productos cosechados. Otros ejemplos y en particular ejemplos enfatizados de dichos rasgos, son resistencia contra tensiones bióticas, es decir, mejor defensa de las plantas contra plagas de animales y microbios, tal como contra insectos, ácaros, hongos, fitopatógenos, bacterias y/o virus, y también tolerancia incrementada de las plantas a ciertos compuestos herbicidamente activos.

Los métodos de la presente invención pueden usarse en forma ventajosa para identificar fibras de algodón derivadas de plantas de algodón que contienen material genético que imparte resistencia a herbicidas, por ejemplo, plantas tolerantes a glifosato, es decir, plantas hechas tolerantes al herbicida glifosato, o sales del mismo. Puede hacerse que las plantas sean tolerantes a glifosato a través de diferentes medios. Por ejemplo, pueden obtenerse plantas tolerantes a glifosato, transformando la planta con un gen que codifique para la enzima 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS). Ejemplos de dichos genes de EPSPS, son el gen AroA (CT7 muíante) de la bacteria Salmonella typhimurium (Comai et al., 1983, Science 221 , 370-371), el gen CP4 de la bacteria Agrobacterium sp. (Barry et al., 1992, Curr. Topics Plant Physiol. 7, 139-145), los genes que codifican para una EPSPS de petunia (Shah et al., 1986, Science 233, 478-481), una EPSPS del tomate (Gasser et al., 1988, J. Biol. Chem. 263, 4280-4289) o una EPSPS de Eleusine (véase el documento WO 01/66704). Puede ser también una EPSPS mutada como se describe, por ejemplo, en los documentos EP 0837944, WO 00/66746, WO 00/66747 o WO02/26995. Pueden obtenerse también plantas tolerantes a glifosato, expresando un gen que codifique para una enzima glifosato óxido reductasa como se describe en las patentes de E.UA Nos. 5,776,760 y 5,463,175. Pueden obtenerse también plantas tolerantes a glifosato, expresando un gen que codifique para una enzima glifosato acetil transferasa como se describe, por ejemplo, en los documentos WO 02/36782, WO 03/092360, WO 05/012515 y WO 07/024782. Pueden obtenerse también plantas tolerantes a glifosato, seleccionando plantas que contengan mutaciones de ocurrencia natural de los genes mencionados anteriormente como se describe, por ejemplo, en los documentos WO 01/024615 o WO 03/013226. Otras plantas resistentes a herbicidas son, por ejemplo, plantas que son hechas tolerantes a herbicidas que inhiben la enzima glutamina sintasa, tales como bialafós, fosfinotricina o glufosinato. Dichas plantas pueden obtenerse expresando una enzima que destoxifique el herbicida o una enzima glutamina sintasa muíante que sea resistente a la inhibición. Una de dichas enzimas destoxificantes eficientes, es una enzima que codifica para una fosfinotricina acetiltransferasa (tal como la proteína bar o pat de especies de Streptomyces). Plantas que expresan una fosfinotricina acetiltransferasa exógena se describen, por ejemplo, en las patentes de E.U A. Nos. 5,561 ,236; 5,648,477; 5,646,024; 5,273,894; 5,637,489; 5,276,268; 5,739,082; 5,908,810 y 7,112,665. Otras plantas tolerantes a herbicidas, son también plantas que son hechas tolerantes a los herbicidas que inhiben la enzima hidroxifenilpiruvatodioxigenasa (HPPD). Las hidroxifenilpiruvatodioxigenasas son enzimas que catalizan la reacción en la cual el para-hidroxifenilpiruvato (HPP) es transformado en homogentisato. Las plantas tolerantes a inhibidores de HPPD pueden ser transformadas con un gen que codifique para una enzima HPPD resistente de ocurrencia natural, o un gen que codifique para una enzima HPPD mutada como se describe en los documentos WO 96/38567, WO 99/24585 y WO 99/24586. Puede obtenerse también tolerancia a inhibidores de HPPD, transformando plantas con genes que codifiquen para ciertas enzimas que permiten la formación de homogentisato a pesar de la inhibición de la enzima HPPD nativa por el inhibidor de HPPD. Dichas plantas y genes se describen en los documentos WO 99/34008 y WO 02/36787. La tolerancia de las plantas a los inhibidores de HPPD puede ser mejorada también transformando plantas con un gen que codifique para una enzima prefenato deshidrogenasa, además de un gen que codifique para una enzima tolerante a HPPD, como se describe en el documento WO 2004/024928. Otras plantas resistentes a herbicidas, son plantas que son hechas tolerantes a inhibidores de acetolactato sintasa (ALS). Inhibidores de ALS conocidos incluyen, por ejemplo, herbicidas de sulfonilurea, imidazolinona, tnazolopirimidinas, pirimidinioxi(tio)benzoatos y/o sulfonilaminocarboniltriazolinona. Se conocen diferentes mutaciones en la enzima ALS (conocida también como acetohidroxiácido sintasa, AHAS) que confieren resistencia a diferentes herbicidas y grupos de herbicidas, como se describe, por ejemplo, en Tranel y Wright (2002, Weed Science 50: 700-712), pero también en las patentes de E.U.A. No. 5,605,011 , 5,378,824, 5,141 ,870 y 5,013,659. La producción de plantas tolerantes a sulfonilurea y plantas tolerantes a imidazolinona se describe en las patentes de E.U.A. Nos. 5,605,01 1 ; 5,013,659; 5,141 ,870; 5,767,361 ; 5,731 ,180; 5,304,732; 4,761 ,373; 5,331 ,107; 5,928,937; y 5,378,824; y en la publicación internacional WO 96/33270. Otras plantas tolerantes a imidazolinona se describen también, por ejemplo, en los documentos WO 2004/040012, WO 2004/106529, WO 2005/020673, WO 2005/093093, WO 2006/007373, WO 2006/015376, WO 2006/024351 y WO 2006/060634. Otras plantas tolerantes a sulfonilurea e imidazolinona se describen también, por ejemplo, en el documento WO 07/024782.

Los métodos de la presente invención pueden usarse en forma ventajosa para identificar fibras de algodón derivadas de plantas de algodón que contienen material genético que imparte resistencia al ataque por ciertos insectos objetivo. Dichas plantas pueden obtenerse por transformación genética, o por selección de plantas que contengan una mutación que imparta dicha resistencia a insectos, y pueden contener por lo menos un transgen que comprende una secuencia codificante que codifica para: 1) una proteína cristalina insecticida de Bacillus thuringiensis o una porción insecticida de la misma, como es el caso de las proteínas cristalinas insecticidas enlistadas por Crickmore et al. (1998, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62: 807-813), actualizadas por Crickmore ef al. (2005) en la nomenclatura de toxinas de Bacillus thuringiensis en línea en la dirección: http://www.lifesci.sussex.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/), o porciones insecticidas de las mismas, por ejemplo, proteínas de las clases de proteínas Cry CryIAb, CryIAc, CryI F, Cry2Ab, Cry3Aa o Cry3Bb, o porciones insecticidas de las mismas; o 2) una proteína cristalina de Bacillus thuringiensis o una porción de la misma que es insecticida en presencia de una segunda proteína cristalina de Bacillus thuringiensis, o una porción de la misma, tal como la toxina binaria obtenida de las proteínas cristalinas Cry34 y Cry35 (Moellenbeck et al. 2001 , Nat. Biotechnol. 19: 668-72; Schnepf et al. 2006, Applied Environm. Microbiol. 71 , 1765-1774); o 3) una proteína insecticida híbrida que comprende partes de diferentes proteínas cristalinas insecticidas de Bacillus thuringiensis, tal como un híbrido de las proteínas del inciso 1) anterior, o un híbrido de las proteínas del inciso 2) anterior, por ejemplo, la proteína Cry1A 05 producida por el evento del maíz MON98034 (WO 2007/027777); o 4) una proteína de cualquiera de los incisos A1) a A3) anteriores, en donde algunos aminoácidos, en particular 1 a 10, han sido reemplazados por otro aminoácido para obtener una actividad insecticida superior a una especie de insecto objetivo, y/o para expandir el rango de especies de insectos objetivo afectados, y/o debido a los cambios introducidos en el ADN codificante durante la clonación o transformación, tal como la proteína Cry3Bb1 en los eventos de maíz ON863 o MON88017, o la proteína Cry3A en el evento de maíz MIR604; 5) una proteína insecticida secretada de Bacillus thuringiensis o Bacillus cereus, o una porción insecticida de la misma, tal como las proteínas insecticidas vegetativas (VIP) enlistadas en: http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html, por ejemplo, las proteínas de la clase de proteínas VIP3Aa; o 6) una proteína secretada de Bacillus thuringiensis o Bacillus cereus, que es insecticida en presencia de una segunda proteina secretada de Bacillus thuringiensis o B. cereus, tal como la toxina binaria formada de las proteínas VIP1A y VIP2A (véase el documento WO 94/21795); o 7) una proteína insecticida híbrida que comprende partes de diferentes proteínas secretadas de Bacillus thuringiensis o Bacillus cereus, tal como un híbrido de las proteínas en el inciso 1) anterior o un híbrido de las proteínas en el inciso 2) anterior; o 8) una proteína de cualquiera de los incisos 1 ) a 3) anteriores, en donde algunos aminoácidos, en particular 1 a 10, han sido reemplazados por otro aminoácido para obtener una mayor actividad insecticida hacia una especie de insecto objetivo, y/o para expandir el rango de especies de insectos objetivo afectados, y/o debido a los cambios introducidos en el ADN codificante durante la clonación o transformación (mientras aún codifica para una proteína insecticida), tal como la proteína VIP3Aa en el evento de algodón COT102.

Los métodos de la presente invención pueden usarse en forma ventajosa para identificar fibras de algodón derivadas de plantas de algodón que contienen material genético que imparte tolerancia a tensiones abióticas. Dichas plantas pueden obtenerse por transformación genética, y pueden contener uno o más de los siguientes transgenes: a. un transgen capaz de reducir la expresión y/o la actividad del gen de poli(ADP-ribosa)polimerasa (PARP) en las células de la planta o las plantas, como se describe en los documentos WO 00/04173 o EP 04077984.5 o EP 06009836.5. b. un transgen que aumenta la tolerancia al estrés, capaz de reducir la expresión y/o la actividad de los genes que codifican para PARG de las plantas o células de la planta como se describe, por ejemplo, en el documento WO 2004/090140. c. un transgen que aumenta la tolerancia al estrés, que codifica para una enzima funcional en las plantas de la vía de síntesis silvestre de nicotinamida adenín dinucleótido que incluye nicotinamidasa, nicotinato fosforribosiltransferasa, ácido nicotínico mononucleótido adenil transferasa, nicotinamida adenín dinucleótido sintetasa o nicotinamida fosforribosiltransferasa como se describe, por ejemplo, en los documentos EP 04077624.7 o WO 2006/133827 o PCT/EP07/002433.

Los métodos de la presente invención pueden usarse en forma ventajosa para identificar fibras de algodón derivadas de plantas de algodón que contienen material genético que puede modificar las características de la fibra, tales como resistencia, longitud, micronaire etc., incluyendo los genes quiméricos descritos en los documentos WO05/017157 (genes de silenciamiento de glucanasa), WO04/0655571 (genes que codifican para quitinasa), WO02/45485 y WO08/012058 (genes de sacarosa sintasa), WO01/17333 (genes de sacarosa fosfato sintetasa), WO98/00549 (genes de celulosa sintasa), WO06/133827 (genes de N-acet¡lglucosamina transferasa tal como una quitina sintasa o genes que codifican para NODC).

Otra aplicación para los métodos de la presente invención, es identificar fibras vegetales, tales como fibras de algodón de plantas que comprenden variaciones alélicas específicas de genes particulares. Los métodos para identificar dichas variaciones alélicas, son bien conocidos en la técnica. En particular, dichas variaciones alélicas pueden usarse para diferenciar entre las fibras de especies de plantas particulares tales como, por ejemplo, diferenciación entre las fibras de G. barbadense y G. hirsutum. Como un ejemplo, el polimorfismo entre el alelo del subgenoma A de glucanasal de Gossypium barbadense y de Gossypium hirsutum (por la presencia de un codón de detención en la región codificante del alelo del subgenoma A de Glud en G. barbadense, como se describe en la solicitud EP no publicada 08075514.3, incorporada en la presente como referencia), puede usarse para diferenciar las fibras que se originan de Gossypium barbadense o Gossypium hirsutum.

Los métodos descritos en la presente pueden usarse también para aislar moldes de ácido nucleico que pueden usarse para cualquier protocolo de caracterización del genomá, incluyendo AFLP, READS, y similares. Los moldes de ácido nucleico aislados de las fibras maduras o procesadas, pueden ser amplificados usando métodos conocidos en la técnica, tales como la amplificación del genoma entero, antes de la aplicación de un protocolo de caracterización del genoma.

Los métodos descritos en la presente pueden usarse también para facilitar programas de certificación, garantizando el suministro de fibras vegetales vendidas comercialmente, tales como fibras de algodón que tienen características particularmente especificadas. Usualmente, dichos programas de certificación incluyen el registro de la compra de semillas certificadas por agricultores registrados, por los cuales la semilla de algodón comprende una composición específica del genoma y produce una marca particular de fibras vegetales. Las balas de las fibras vegetales cosechadas producidas por los agricultores registrados de dichas semillas certificadas, son registradas y autenticadas por verificación cruzada con dichos registros de compra de la semilla, y son provistas a molinos para producir de preferencia predominantemente, en particular exclusivamente, hilos, telas o indumentaria de dicha marca de fibras. Los métodos descritos en la presente permiten realizar auditorias en diferentes puntos en la cadena de suministro.

Los métodos descritos en la presente pueden aplicarse también para aislar macromoléculas biológicas de estructuras tipo filamento (tipo tricoma) en las semillas de la planta, tales como los filamentos en las semillas del tomate o los filamentos llevados sobre la base de las semillas de trigo.

Los métodos descritos en la presente pueden aplicarse también para caracterizar el material de ácido nucleico de fibras añejas y material textil añejo (por ejemplo, fibras y textiles que tienen más de 100 años). Sin que se limite la invención a una teoría o mecanismo específico, se cree que una posibilidad de que el material biológico sea preservado en las fibras añejas, es porque se ha observado que las fibras maduras están retorcidas, de modo que el material biológico es "atrapado" (y de esta manera "preservado") en las fibras maduras.

Los métodos descritos en la presente pueden aplicarse también en aplicaciones forenses, debido a que material textil o de fibra identificado en una escena de crimen, puede ser caracterizado, por ejemplo, precediendo a un paso de amplificación del genoma entero como se muestra en el ejemplo 6 en esta solicitud.

Como se usa en la presente, se interpretará que el término "que comprende" especifica la presencia de las características, enteros, pasos o componentes establecidos referidos, pero no excluye la presencia o la adición de uno o más rasgos, enteros, pasos o componentes, o grupos de los mismos. De esta manera, por ejemplo, un ácido nucleico o proteína que comprende una secuencia de nucleótidos o aminoácidos, puede comprender más nucleótidos o aminoácidos de los que realmente se citan, es decir, incluidos en un ácido nucleico o proteína más grande. Un gen quimérico que comprende una región de ADN, la cual es funcionalmente o estructuralmente definida, puede comprender regiones de ADN adicionales, etc.

Los siguientes ejemplos no limitativos describen los métodos para aislar macromoléculas biológicas de fibras vegetales maduras y de fibras procesadas, y su uso para caracterizar o identificar fibras vegetales. A menos que se indique de otra manera en los ejemplos, todas las técnicas de ADN recombinante se llevan a cabo de acuerdo con protocolos estándar, como se describe en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, y en los volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA. Materiales y métodos estándar para trabajo molecular en plantas, se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R.D.D. Croy, publicado conjuntamente por BIOS Scientific Publications Ltd. (Reino Unido) y Blackwell Scientific Publications, Reino Unido.

A lo largo de la descripción y los ejemplos, se hace referencia a las siguientes secuencias representadas en el listado de secuencias: SEQ ID No 1 : oligonucleótido 1 para amplificación por PCR de Ghglud SEQ ID No 2: oligonucleótido 2 para amplificación por PCR de Ghglud SEQ ID No 3: oligonucleótido 1 para amplificación por PCR de NodC SEQ ID No 4: oligonucleótido 2 para amplificación por PCR de NodC SEQ ID No 5: oligonucleótido 1 para amplificación por PCR de expansina SEQ ID No 6: oligonucleótido 2 para amplificación por PCR de expansina SEQ ID No 7: oligonucleótido 1 para prueba de detección Taqman, de GhGlud (iniciador delantero) SEQ ID No 8: oligonucleótido 2 para prueba de detección Taqman, de GhGlud (iniciador inverso) SEQ ID No 9: oligonucleótido 3 para prueba de detección Taqman, del alelo A subgenómico de GhGlud (oligonucleótido marcado con VIC que detecta el alelo de Glud de G. hirsutum) SEQ ID No 10: oligonucleótido 4 para prueba de detección Taqman, del alelo A subgenómico de GhGlud (oligonucleótido marcado con FAM que detecta el alelo de Glud de G. barbadense) SEQ ID No 1 1 : oligonucleótido 1 para amplificación por PCR de rp1 16 SEQ ID No 12: oligonucleótido 2 para amplificación por PCR de rp1 16 SEQ ID No 13: oligonucleótido 1 para amplificación por PCR de matK SEQ ID No 14: oligonucleótido 2 para amplificación por PCR de matK SEQ ID No 15: oligonucleótido 1 para amplificación por PCR de trnT-trnL SEQ ID No 16: oligonucleótido 2 para amplificación por PCR de trnT-trnL SEQ ID No 17: oligonucleótido 1 para amplificación por PCR de ndhF SEQ ID No 18: oligonucleótido 2 para amplificación por PCR de ndhF.

EJEMPLOS EJEMPL0 1 Aislamiento de ácidos nucleicos de material de fibras de algodón en bruto A. Aislamiento de ácidos nucleicos del material de fibras FM966 de Gossypium hirsutum Fibras de algodón cosechadas de FM966, que habían sido desmotadas y embaladas, se sometieron a extracción de ADN usando el procedimiento de CTAB convencional (bromuro de hexadecil trimetil amonio) (Doyle y Doyle, 1987, Phytochem. Bull. 19, 1 1 ) para el aislamiento de ADN genómico de la materia vegetal. Aunque se obtuvo una pella de ácidos nucleicos, este material no pudo usarse para alguna otra aplicación incluyendo amplificación por PCR, o digestión con enzimas de restricción.

Las fibras de algodón en bruto embaladas cosechadas contienen aún algunas impurezas tales como restos de hojas y otras impurezas. Estos materiales contaminantes se removieron cuidadosamente por limpieza manual, para obtener una fracción de fibras purificada (y una fracción de impurezas). El material de fibras en bruto, el material de fibras purificado y la fracción de impurezas, se sometieron a extracción de ADN usando el mini kit para plantas DNeasy® comercializado por QIAGEN, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (véase el manual para plantas DNeasy® disponible en www1.qiagen.com/HB/DNeasyPlantMiniMaxi), y se determinaron las concentraciones de los ácidos nucleicos aislados usando espectrofotometría UV (cuadro 1).

CUADRO 1 Los ácidos nucleicos aislados se usaron como moldes en una reacción de PCR estándar, usando los siguientes iniciadores para detectar un gen endógeno de glucanasa de algodón (GhGlud ; véase el documento EP 08075514.3 incorporado en la presente como referencia para secuencias de nucleótidos de diferentes alelos de GhGlud ): SE002: ggccgaagccgatcttatctagg (SEQ ID No.: 1 ) SE003: cggcaacaatcttccatctccag (SEQ ID No.: 2) Se usaron 1 µ? y 5 µ? de ácidos nucleicos molde. Los resultados de la amplificación por PCR se visualizan en la figura 1. Un amplicón de 656 pb (como era de esperarse) se detecta claramente usando fibra pura (molde de 5 µ?) (campo 4), mientras que puede observarse una señal débil usando una pequeña cantidad (1 µ?) de ácidos nucleicos aislados del material de fibras en bruto y puro. No pudo detectarse señal de amplificación alguna en los ácidos nucleicos aislados de sólo el material de impurezas, ni de los ácidos nucleicos obtenidos del material no purificado cuando se usó en mayores concentraciones, indicando que el extracto obtenido de los materiales contaminantes parece inhibir el procesamiento adicional de los ácidos nucleicos obtenidos del material de fibras en bruto.

De modo interesante, este experimento demuestra que pueden extraerse ácidos nucleicos, los cuales pueden analizarse adicionalmente, del material de fibras de algodón maduras. El experimento indica también que la calidad de los ácidos nucleicos aislados - el ADN puede mejorarse además removiendo el desperdicio de hojas y otras impurezas de las fibras de algodón en bruto cosechadas y desmotadas.

B. Aislamiento de ácidos nucleicos del material de fibras Pima- Y5 de Gossypium barbadense Un material de fibras de algodón en bruto de 4 años de Pima5Y de Gossypium barbadense, se trató junto con el material de fibras de algodón FM966 de Gossypium hirsutum, como se describió anteriormente en 1.A. Los ácidos nucleicos obtenidos se usaron como moldes en reacciones de PCR como se describe en 1.A. Los resultados se visualizan en la figura 2.

Aunque las fibras de Gossypium barbadense son más fuertes y tienen una diferente arquitectura de las fibras de Gossypium hirsutum, los resultados demuestran que los ácidos nucleicos que incluyen ADN procesable pueden aislarse también de estas fibras. De modo interesante, estas fibras se habían almacenado también por varios años bajo condiciones no óptimas, indicando que ADN procesable u otros ácidos nucleicos pueden obtenerse de material de fibras añejo.

C. Amplificación de otros genes endógenos del algodón Los ácidos nucleicos aislados se usaron también como moldes en reacciones de PCR estándar, usando iniciadores específicos para otros genes endógenos tales como los siguientes iniciadores que amplifican un fragmento de 299 pb del gen que codifica para expansina: K151 : gggagcttgtggttatggaaacc (SEQ ID No.: 5) K152: cagggacgatcccagctcgatattc (SEQ ID No.: 6) Los amplicones esperados pudieron detectarse también usando estos otros iniciadores para otros genes endógenos.

D. Aislamiento de ácidos nucleicos del material de fibras del algodón usando otros reguladores de pH de lisis y protocolos Se purificó material de fibras del algodón en bruto como se describió en la sección 1.A., removiendo el material de desperdicio de hojas contaminante y otras impurezas. Se extrajeron ácidos nucleicos del material de fibras purificado usando el mini kit para plantas DNeasy® comercializado por QIAGEN, o el kit de purificación de ADN genómico Wizard® comercializado por PROMEGA CORPORATION, o el procedimiento de CTAB convencional (Doyle y Doyle, 1987, Phytochem. Bull. 19, 1 1 ). La concentración de los ácidos nucleicos obtenidos se determinó usando espectrofotometría UV (cuadro 2).

CUADRO 2 *Nota: Lecturas de alta concentración debidas probablemente a la ausencia del tratamiento con ribonucleasa.

Los ácidos nucleicos aislados se usaron como moldes en una reacción de PCR estándar, usando los siguientes iniciadores para detectar un gen endógeno de glucanasa de algodón (GhGlud ; véase el documento EP 08075514.3, incorporado en la presente como referencia para secuencias de nucleótidos de diferentes alelos de GhGlud): SE002: ggccgaagccgatcttatctagg (SEQ ID No.: 1 ) SE003: cggcaacaatcttccatctccag (SEQ ID No.: 2) Se usaron 1 µ? y 5 µ? de ácidos nucleicos molde. Los resultados de la amplificación por PCR se visualizan en la figura 3. El amplicón de ADN esperado se observó usando ácidos nucleicos molde aislados por cualquier método, aunque las concentraciones aparentemente mayores de los ácidos nucleicos (reacción de 5 µ?) aislados por los procedimientos Wizard® y CTAB, tuvieron un efecto negativo sobre la reacción de PCR.

Aunque con una menor eficiencia, se observó que los ácidos nucleicos podrían extraerse también del material de fibras depurado incubando este material de fibras con agua (H20) por una cierta cantidad de tiempo (por ejemplo, por lo menos 4 horas de incubación del material de fibras depurado en presencia de un volumen de agua).

EJEMPLO 2 Aislamiento de ácidos nucleicos de textiles A. Aislamiento de ácidos nucleicos de ropa de algodón El aislamiento exitoso de ácidos nucleicos tales como el ADN, el cual puede ser procesado adicionalmente de fibras de algodón maduras, estimuló un intento por aislar macromoléculas biológicas tales como ácidos nucleicos, en particular ADN procesable de fibras después de hilatura y tejeduría. Para este fin, se aislaron hilos destejiendo una pieza de ropa de algodón cortada en piezas más pequeñas e incubada en 5 mi de regulador de pH de lisis (regulador de pH AP1 DNeasy®) a 65°C por cuando menos 30 minutos o durante la noche a temperatura ambiente. Se exprimió el regulador de pH del material y se transfirieron 500 µ? del lisado a un tubo Eppendorf, y se trataron adicionalmente de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, es decir: - añadir 130 µ? de regulador de pH AP2, mezclar e incubar en hielo por 5 minutos - centrifugar por 5 minutos a 13000 rpm - transferir la fase líquida a la columna mini spin QIAshredder lila - centrifugar por 2 minutos a 13000 rpm - transferir el flujo pasante a un nuevo tubo Eppendorf sin que se perturbe la pella - añadir 800 µ? de regulador de pH AP3/E y mezclar - transferir 650 µ? a la columna mini spin DNeasy®, y centrifugar por 1 minuto a 8000 rpm, desechando el flujo pasante - repetir este paso con la muestra restante; desechar el tubo de colecta y poner la columna en un nuevo tubo de colecta de 2 mi - lavar la columna con 500 µ? de regulador de pH AW y centrifugar por 1 minuto a 8000 rpm, desechar el flujo pasante - lavar la columna con 500 µ? de regulador de pH AW y centrifugar por 2 minutos a 13000 rpm, desechar el flujo pasante - poner la columna en un tubo Eppendorf de 1.5 mi sin sobrante de etanol - añadir 50 µ? de agua a la columna e incubar por cuando menos 5 minutos a temperatura ambiente - centrifugar por 1 minuto a 8000 rpm. Almacenar el ADN a 4°C. Se usaron muestras de 1 y 5 µ? como ADN molde en una reacción de PCR, usando los iniciadores del ejemplo 1.A. Los resultados se visualizan en la figura 4. Cuando se usaron muestras de ácido nucleico después de incubación durante la noche, el amplicón esperado de 669 pb pudo detectarse, indicando que el protocolo puede usarse para aislar ácidos nucleicos de fibras de algodón después de hilatura y tejeduría. La señal de PCR significativamente más fuerte después de la incubación durante la noche contra la incubación por 30 minutos, indica que el primer protocolo resulta en una mayor concentración de ADN procesable.

B. Aislamiento de ácidos nucleicos de textiles con diferentes ligamentos El protocolo de aislamiento de ácidos nucleicos se aplicó también a indumentaria acabada con diferentes ligamentos (es decir, la cual ha sufrido diferente procesamiento). Para este fin, se cortaron piezas de una camisa de manga larga de algodón (tejida) y de una camisa polo de algodón (tricotada) y se trataron como en el ejemplo 2A, salvo que la incubación en el regulador de pH de lisis se realizó durante la noche, o incluso se prolongó hasta 6 días de incubación. Una reacción de PCR como se describió en el ejemplo 2.A se realizó en los ácidos nucleicos aislados, y los resultados se visualizan en la figura 5.

El amplicón esperado se detectó después de la amplificación por PCR, usando muestras de ácido nucleico aisladas de ambos tipos de telas. De nuevo, la señal fue más fuerte en las muestras en las cuales la incubación en el regulador de pH de lisis se había prolongado EJEMPLO 3 Aislamiento de ácidos nucleicos de fibras de especialidad Fibras maduras se aislaron y se purificaron de plantas de algodón transgénicas que comprenden un gen quimérico de N-acetilglucosamina transferasa ("gen de NodC"), como se describe en el ejemplo 1 del documento WO2006/136351. Se aislaron ácidos nucleicos de la extracción de fibras purificadas, usando el mini kit para plantas DNeasy® comercializado por QIAGEN, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (véase el manual para plantas DNeasy® disponible en www1.qiagen.com/HB/DNeasyPlantMiniMaxi), y las concentraciones de los ácidos nucleicos aislados se determinaron usando espectrofotometria UV (cuadro 3).

CUADRO 3 Los ácidos nucleicos aislados se usaron también como moldes en reacciones de PCR estándar usando iniciadores específicos para otros genes endógenos, tales como los siguientes iniciadores que amplifican un fragmento de 1224 pb del gen que codifica para NodC: Idb093: cgtttttcactcatcgtcgttttcaagtgtcgtagatgtgatcggtttgcttgcg (SEQ ID No.: 3) Idb126: ggcgcgccttaggaactctcgcgtgatagccac (SEQ ID No.: 4) Se usaron 1 µ? y 5 µ? de ácidos nucleicos molde. Los resultados de la amplificación por PCR se visualizan en la figura 6. El amplicón de ADN esperado, indicativo de la presencia del transgen, pudo observarse en cada muestra.

EJEMPLO 4 Automatización y diferenciación entre diferentes tipos de fibras Como se describe en la solicitud EP no publicada 08075514.3, incorporada en la presente como referencia, el alelo del subgenoma A de glucanasal de Gossypium barbadense difiere del alelo del subgenoma de glucanasal de Gossypium hirsutum, por la presencia de un codón de detención en la región codificante del alelo de subgenoma A de Glud en el primero. Este polimorfismo pudo usarse para diferenciar entre fibras de algodón de plantas que tienen el alelo Glud de Gossypium barbadense o el alelo Glud de Gossypium hirsutum. Para este fin, se diseñó una prueba Taqman®, por la cual los oligonucleótidos iniciadores que amplifican un fragmento de ADN que posee el polimorfismo usado fueron: Iniciador delantero: G CTTTTG G AAG C G ATATAAC ATC G A (SEQ ID No.: 7) Iniciador inverso: GGCATAGGCAAAATAAGGGTACACA (SEQ ID No.: 8) El polimorfismo se detectó por el monitoreo de la degradación de los siguientes iniciadores marcados con fluorescencia que detectan el polimorfismo: VIC - AATCCTGTCGAACCAG (alelo de hirsutum) (SEQ ID No.: 9) FAM - ATCCTGTCAAACCAG (alelo de barbadense) (SEQ ID No.: 10) Estos iniciadores se usaron en un sistema de qPCR, aumentando el número de ciclos hasta 60 y determinando la fluorescencia sólo en el punto terminal. Como moldes de ácido nucleico, se usaron mezclas de ADN aislado de fibras de G. barbadense (PIMA) o fibras de G. hirsutum (FM966) a las siguientes relaciones: 100% de PIMA, 75% de PIMA/25% de FM966, 50% de PIMA/50% de FM966, 25% de PIMA/75% de FM966, 100% de FM966. Los resultados se muestran esquemáticamente en la figura 7.

El eje X indica la presencia del alelo de Glud de G. hirsutum, mientras que el eje Y indica la presencia del alelo de Glud de G. barbadense. En el ADN aislado de fibras PIMA, sólo se detectó el alelo de Glud de G. barbadense. En el ADN aislado de fibras PIMA, sólo se detectó el alelo de Glud de G. hirsutum. En las muestras de ADN mixtas, el análisis Taqman permite la detección de las varias relaciones de ambos alelos.

En otro paso, el mismo tipo de análisis de RT-PCR se usó para analizar muestras de ácido nucleico del material de fibras y el material textil de algodón de una bala de FM966. Los resultados se muestran en la figura 8. En los ácidos nucleicos extraídos de la bala de FM966 y de las camisas polo, sólo se detectó el alelo de Glud de G. hirsutum, indicando que el material de algodón usado se originó exclusivamente de material tipo G. hirsutum.

Aunque las pruebas pueden necesitar más optimización, dicha optimización está claramente dentro del alcance del experto en la técnica.

EJEMPLO 5 Caracterización del genoma de plastidios aislado de fibras de algodón Debido al hallazgo inesperado de que el ADN genómico puede aislarse y caracterizarse de fibras de algodón maduras, se investigó la posibilidad de identificar el ADN de los plastidios en el grupo de ADN extraído de estas fibras.

Aunque se ha mostrado que los plastidios leucoplastos están presentes en las fibras de algodón en desarrollo (Ryser U. (1985) European Journal of Cell Biology 39, pp. 236-256), no se espera que estén presentes en las fibras de algodón maduras. Los leucoplastos son similares a los cloroplastos porque tienen el mismo genoma - debido a que se diferencian del mismo tipo de células progenitoras - pero los leucoplastos son especializados con alta acumulación de contenido de almidón.

Cronn et al (2002) American Journal of Botany 89(4): 707-725 publicaron combinaciones de iniciadores para amplificar 4 genes del genoma de los plastidios (rpl16, matK, trnT-trnL y ndhF). En un primer paso, se optimizaron las combinaciones de iniciadores publicadas para la amplificación de estos 4 genes, llevando a cabo análisis por PCR en el ADN aislado de hojas de algodón. En un siguiente paso, la combinación de iniciadores optimizada por gen se usó para la amplificación en una muestra de ADN de fibras obtenida de una minibala de algodón (algodón FiberMax certificado). Se mostró sorprendentemente la amplificación de 4 fragmentos de PCR de esta muestra de ADN de las fibras. La subclonación en vectores TOPO-blunt seguida del análisis de la secuencia de estos fragmentos, confirmó que estos cuatro fragmentos se originaron del genoma de los plastidios. Para rpl16, matK y trnT-trnL, la secuenciación resultó en una secuencia consenso única, y para ndhF se obtuvieron varias secuencias consenso.

Puesto que las secuencias completas de los cloroplastos de Gossypium hirsutum y Gossypium barbadense están disponibles en la base de datos de EMBL (la entrada DQ345959 es la secuencia de ADN de los cloroplastos de coker 310 FR (G. hirsutum), y la entrada AP009123 es la secuencia de ADN de los cloroplastos de G. barbadense), fue posible alinear las secuencias obtenidas con las secuencias publicadas. Se encontró que las secuencias obtenidas eran 100% idénticas a las secuencias publicadas de G. hirsutum (salvo por los sitios de los iniciadores degenerados). Esto confirma que la fibra en la bala de algodón se derivó de G. hirsutum. La caracterización molecular exitosa de estas secuencias específicas de los plastidios, provee ahora oportunidades novedosas para genotipificar el ADN de las fibras. Asimismo, muestras de fibras añejas pueden sondearse para secuencias de los plastidios, y su relación puede interpretarse durante la evolución y el mejoramiento genético.

Condiciones de la PCR: 2 µ? de ADN molde 1.5 µ? de iniciador delantero (10 µ?) 1.5 µ? de iniciador inverso (10 µ?) 21 µ? de agua MQ 1 µ? de dNTP 10 µ? de 10X regulador de pH HF 0.5 µ? de Phusion 12.5 µ? de agua MQ Programa de la PCR: 30 segundos a 98°C 10 segundos a 98°C 30 segundos a 60°C 60 segundos a 72°C 35 ciclos 10 minutos a 72°C Mantener a 4°C.

Combinaciones de iniciadores: rpl16 F71 : gctatgcttagtgtgtgactcgtt (SEQ ID No 11) R1516: cccttcattcttcctctatgttg (SEQ ID No 12) matK matKF3: ctaatggatcaacagaawcgtttg (SEQ ID No 13) trnKR: aactagtcggatggagtag (SEQ ID No 14) trnT-trnL trnl_2: aatattactgactccmttttkattttckag (SEQ ID No 15) trnB: tctaccgatttcgccatatc (SEQ ID No 16) ndhF 5'Fnew: gaatatgcatggatcatacc (SEQ ID No 17) 1318R: cgaaacatataaaatgcrgttaatcc (SEQ ID No 18) EJEMPLO 6 Caracterización del genoma de los ácidos nucleicos aislados de las fibras de algodón Los ejemplos anteriores han mostrado convincentemente que ADN puede aislarse y caracterizarse de fibras de algodón maduras y de productos corriente abajo de las mismas. En un siguiente paso, se cuestionó si el ADN aislado de las fibras es una representación real del genoma entero del algodón, o si representa sólo una fracción del genoma del algodón. Un equivalente parcial del genoma no sería útil para la realización de pruebas de los rasgos o el genotipo, ya que generaría resultados de prueba no confiables e incompletos. El primer desafío fue superar la cantidad limitada del ADN obtenido de las fibras de algodón como material de partida para la realización de las pruebas. Se eligió el método de la amplificación del genoma entero (WGA) para superar esta limitación. No se ha usado antes la WGA para amplificar un genoma poliploide tal como el algodón, para la genotipificación y la prueba de rasgos. Un paso de amplificación del ADN es importante para aumentar la cantidad del material de partida de ADN de las fibras, pero es crítico no introducir una propensión del genoma, la cual es a veces inherente a un paso de WGA, como es reportado por Giardina et al. (2009) BMC Genomics, Abril 14, 10: 159. Se consignó la fiabilidad de un paso de WGA en el ADN aislado de las fibras, en una prueba Taqman funcional. Para esto, se comparó la calidad del ADN de las fibras amplificado por WGA, con el ADN de los cotiledones amplificado por WGA de la misma fuente comercial de fibras de algodón en sustancialmente la misma prueba Taqman.

Aproximadamente 500 gramos de fibras FM9063B2F (muestras de 500 gramos, cada una en 3 pequeñas bolsas cafés; se tomaron 3 réplicas de diferentes balas para la variedad de las muestras, bala no. 721 134350138, 721134350154, 721134350156) fueron provistas por K. Merritt de una granja CropMark Direct. La fibra era de algodón cultivado en la estación de algodón 2008-9, y enlistada para el programa de certificación FiberMax.

Puesto que se había determinado que los contaminantes en las fibras pueden tener un impacto significativo sobre el uso del ADN de las fibras para la realización de pruebas corriente abajo, se limpiaron manualmente las fibras. Esto se hizo estirando una pequeña cantidad de fibras (por ejemplo, 1.5 gramos), por lo cual la mayor parte de los restos es removido con pinzas hasta que no puedan verse restos a simple vista. Se llevó a cabo la extracción del ADN con el mini kit para plantas DNeasy® de Qiagen, con los siguientes pasos: - Tomar 1 gramo de fibra de algodón madura depurada (sin desperdicio de hojas), y ponerlo en un tubo Falcon de 50 mi. Cortar las fibras unas cuantas veces con tijeras limpias.

- Añadir 5 mi de regulador de pH de lisis AP1 (Qiagen, No. de catálogo 1014630) y 100 µ? de ribonucleasa A (10 mg/ml). Usar un mortero para homogenizar el contacto entre la muestra y el regulador de pH.

- Incubar a 65°C por 20 minutos, usar un tubo de 15 mi para mezclar el material 2 a 3 veces durante la incubación.

- Usar un tubo de 15 mi para comprimir el material para transferir 500 µ? de lisado en un tubo Eppendorf de 2 mi. Se toman 3 alícuotas y se usan como duplicados.

- Añadir 130 µ? de regulador de pH AP2, mezclar e incubar por 5 minutos en hielo para cada alícuota.

- Centrifugar por 5 minutos a 13000 rpm.

- Transferir la fase líquida a la columna mini spin QIAshredder lila.

- Centrifugar por 2 minutos a 13000 rpm.

- Transferir el flujo pasante a un nuevo tubo Eppendorf sin que se perturbe la pella.

- Añadir 800 µ? de regulador de pH AP3/E y mezclar.

- Transferir 650 µ? a la columna miní spin DNeasy® y centrifugar por 1 minuto a 8000 rpm, desechar el flujo pasante.

- Repetir este paso con la muestra restante. Desechar el tubo de colecta y poner la columna en un nuevo tubo de colecta de 2 mi.

- Lavar la columna con 500 µ? de regulador de pH AW y centrifugar por 1 minuto a 8000 rpm, desechar el flujo pasante.

- Lavar la columna con 500 µ? de regulador de pH AW y centrifugar por 2 minutos a 13000 rpm, desechar el flujo pasante y el tubo de colecta.

- Poner la columna en un tubo Eppendorf de 1.5 mi sin sobrante de etanol.

- Añadir 50 µ? de agua MQ a la columna e incubar por lo menos 5 minutos a temperatura ambiente.

- Centrifugar por 1 minuto a 8000 rpm. Almacenar el ADN a 4°C (corto plazo) o -20X (largo plazo).

Se llevó a cabo la extracción del ADN de los cotiledones de FM9063 B2F, como sigue. Se hizo que germinaran 50 semillas de FM9063 B2F con papel de germinación y agua en una germinadora a 28°C. Se colectaron los cotiledones y se secaron con silicio. Se extrajo el ADN de los cotiledones. El ADN extraído de los cotiledones se combinó en cinco tubos de 1.5 mi.

Se llevó a cabo la amplificación del genoma entero con el kit de amplificación del gehoma entero (WGA) completo GenomePlex® de Sigma, con los siguientes pasos: - Añadir 1 µ? de 10x regulador de pH de fragmentación a 10 µ? de ADN extraído en un tubo de PCR.

- Incubar en un cíclizador térmico a 95°C por 2 minutos, y enfriar en hielo.

- Añadir 2 µ? de 1x regulador de pH para la preparación de colecciones.

- Añadir 1 µ? de solución para la estabilización de colecciones, y mezclar.

- Incubar en un ciclizador térmico a 95°C por 2 minutos, y enfriar en hielo.

- Añadir 1 µ? de enzima para la preparación de colecciones, y mezclar.

- Incubar en un ciclizador térmico usando WGA1 del programa. 16°C por 20 minutos 24°C por 20 minutos 37°C por 20 minutos 75°C por 5 minutos 4°C siempre.

Añadir la siguiente mezcla maestra: 7.5 µ? de 10x mezcla maestra para amplificación 47.5 µ? de agua libre de nucleasas 5 µ? de polimerasa para WGA Incubar en el ciclizador térmico usando WGA2 del programa 95°C por 3 minutos 14 ciclos de: 94°C por 15 segundos 65°C por 5 minutos 4°C siempre.

Poner 5 µ? sobre un gel de agarosa a 1%, para verificar la calidad del ADN para WGA. Debe estar presente un frotis entre 100 y 1000 pb.

Todas las reacciones de WGA (fibras y cotiledones) demostraron ser exitosas.

Opcionalmente, el ADN amplificado por WGA de los cotiledones y las fibras de FM9063 B2F, se purificó adicionalmente de la siguiente manera. Se combina el ADN para WGA de 5 muestras en un tubo de 2 mi (aproximadamente 240 µ? de ADN), se añaden 24 µ? de acetato de sodio 3M, pH 5.2 y se mezclan, se añaden 800 µ? de etanol a 100% enfriado en hielo y se mezclan completamente y durante la noche a -20°C, se centrifugan a -20°C por 10 minutos a 12000 rpm, se remueve cuidadosamente el sobrenadante, se lava la pella de ADN con 800 µ? de etanol a 70% enfriado en hielo, se centrifugan a -20°C por 2 minutos a 12000 rpm, se remueve cuidadosamente el sobrenadante, se pone el tubo en una incubadora a 65°C por 15 minutos hasta secarse, y se resuspende el ADN en 65 µ? de 1x regulador de pH TE.

Dos diferentes pruebas Taqman se llevaron a cabo en las muestras de ADN amplificado: una prueba Taqman dirigida a identificar 40 diferentes SNPs, y otra prueba Taqman dirigida a identificar 3 rasgos diferentes: Bollgard II (Mon531 ), Bollgard (MON15985) y Flex (MON 88913). Cada una de estas pruebas Taqman se llevó a cabo en 4 diferentes muestras de ADN: 1) ADN amplificado por WGA extraído de fibras de FM9063 B2F, 2) ADN amplificado por WGA extraído de los cotiledones de FM9063 B2F, 3) ADN purificado amplificado por WGA de fibras de FM9063 B2F, y 4) ADN purificado amplificado por WGA de cotiledones de FM9063 B2F. Debido a que se sabe que el subgenoma A del algodón (At) es 50% más grande que el subgenoma D del algodón (Dt) en tamaño físico, se seleccionaron 23 SNPs del genoma A, y 17 se seleccionaron del genoma D.

Se observó que todos los 40 SNPs pudieron detectarse exitosamente en la prueba Taqman en el ADN de las fibras purificado amplificado por WGA de FM9063 B2F. Además, un resultado idéntico para la detección de los mismos 40 SNPs se obtuvo con el ADN de los cotiledones purificado amplificado por WGA de FM9063 B2F y con el ADN de los cotiledones de FM9063 B2F en bruto (es decir, no purificado). La prueba Taqman para la detección de Bollgard II (Mon531), Bollgard (MON 15985) y Flex (MON 88913) demostró también que da resultados idénticos entre las muestras de ADN amplificado por WGA de las fibras y cotiledones. Se puso a prueba Mon531 de acuerdo con Yang et al. (2005) J. Agrie. Food Chem. 53, 6222-6229. Moni 5985 y Mon88913 se pusieron a prueba de acuerdo con Lee et al. (2007) J. Agrie. Food Chem. 55, 3351 -3357.

De esta manera, puede usarse el ADN de las fibras de algodón amplificado por WGA como una fuente confiable para la determinación exitosa de marcadores moleculares, puesto que demostró resultados idénticos a los de una prueba Taqman llevada a cabo en el ADN de las hojas amplificado por WGA. Además, el ADN de las fibras de algodón amplificado por WGA puede usarse como una fuente confiable para la determinación exitosa de los rasgos, puesto que demostró los mismos resultados que una prueba Taqman llevada a cabo en el ADN de las hojas amplificado por WGA. Aunque usualmente un mayor número de SNPs (aproximadamente 300) debe usarse para la caracterización e identificación de una variedad de algodón especifica, el presente ejemplo muestra que este procedimiento es posible usando el ADN de las fibras de algodón amplificado por WGA.

EJEMPLO 7 Otras macromoléculas biológicas aisladas del material de fibras de algodón La espectrofotometría UV de los extractos usando los diferentes protocolos para el aislamiento indica que estos extractos no consisten puramente de ADN, y pueden contener otras macromoléculas biológicas. Mediante el uso de un análisis de Bradford, se encontró una baja concentración de proteínas (aproximadamente 10 ng/µ?). Además, los extractos de fibras contenían varias concentraciones de pequeñas moléculas de ARN, resistentes a la ribonucleasa I, las cuales se identificaron como micro ARNs.

Claims (25)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método para caracterizar una fibra vegetal madura o una fibra vegetal procesada, que comprende los pasos de: a. aislar de dicha fibra vegetal una macromolécula biológica de ocurrencia natural en dicha fibra vegetal diferente de polisacáridos o lignina; y b. caracterizar la información codificada en la secuencia de los monómeros de dicha macromolécula biológica.

2 - Un método para identificar una fibra vegetal madura o una fibra vegetal procesada, que comprende los pasos de: a. aislar de dicha fibra vegetal una macromolécula biológica de ocurrencia natural en dicha fibra vegetal diferente de polisacáridos o lignina; y b. someter dicha macromolécula biológica a una prueba de detección específica para dicha fibra vegetal.

3. - El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicha fibra vegetal es una fibra de semilla.

4. - El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicha fibra vegetal es una fibra de algodón.

5 - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado además porque dicha macromolécula biológica se selecciona del grupo de polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, ADN, ARN, ARN de cadena sencilla y ARN de doble cadena.

6 - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizado además porque dicha prueba de detección es una prueba de detección basada en reacción en cadena de polimerasa.

7 - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizado además porque dicha prueba de detección es una prueba de detección basada en anticuerpos.

8 - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizado además porque dicha prueba de detección es una prueba de detección basada en hibridación de ácidos nucleicos.

9 - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, caracterizado además porque dicha prueba de detección detecta la presencia o ausencia de genes quiméricos presentes en el genoma de la planta que produce las fibras.

10.- El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque dicho gen quimérico comprende una región codificante o parte de una porción antisentido de la misma seleccionada de N-acetilglucosamina transferasa, fosfinotricinacetiltransferasa, EPSPS, hidroxifenilpiruvatodioxigenasa, una porción insecticida de proteína cristalina de Bacillus thuríngiensis, poli(ADP-ribosa) polimerasa, poli(ADP-ribosa) glucohidrolasa, sacarosa sintasa, sacarosa fosfato sintasa, glucanasa, celulosa sintasa, quitinasa, expansina, calosa sintasa, cinasa, nicotinamidasa, nicotinato fosforribosiltransferasa, ácido nicotínico mononucleótido adenil transferasa, nicotinamida adenín dinucleótido sintetasa o nicotinamida fosforribosiltransferasa.

1 1. - El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque dicha prueba de detección es una prueba de detección específica de evento.

12. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, caracterizado además porque dicha prueba de detección detecta la presencia o ausencia de alelos específicos presentes en el genoma de la planta que produce las fibras.

13. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12, caracterizado además porque dicha fibra está presente en hilos, tela, tela con hilos metálicos o indumentaria acabada.

14. - Un método para analizar el genoma de una planta que produce fibras, que comprende los pasos de: a. aislar ácidos nucleicos de las fibras maduras o procesadas de dicha planta, dichos ácidos nucleicos siendo de ocurrencia natural en dicha fibra vegetal; y b. someter dicho ácido nucleico a un protocolo de análisis del genoma.

15. - El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque dicho ácido nucleico se selecciona del grupo de ADN, ARN, ARN de cadena sencilla y ARN de doble cadena.

16. - El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque dicho ácido nucleico es ADN.

17.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dicho ADN aislado es sometido a un paso de amplificación del genoma entero antes de que se someta dicho ácido nucleico a un protocolo de análisis del genoma.

18.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, caracterizado además porque dicho método se aplica a fibras maduras añejas, o hilos añejos, telas o indumentaria acabada.

19. - Un método para aislar un ácido nucleico de fibras vegetales maduras o fibras vegetales procesadas, que comprende los pasos de: a. remover el material de desperdicio del tallo y de la hoja de las fibras vegetales maduras cosechadas; y b. incubar dichas fibras vegetales en un regulador de pH de lisis que contiene detergentes, proteasas y sales por un tiempo prolongado, de preferencia por un período de 4 a 100 horas; y c. procesar dicho regulador de pH de lisis de acuerdo con métodos estándar de aislamiento de ácido nucleicos, y aislar dicho ADN.

20. - El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque dicho ácido nucleico es ADN.

21. - Un método para aislar un ácido nucleico de tela tejida o tricotada, que comprende los pasos de: a. destejer los hilos de dicha tela; b. incubar dichos hilos en un regulador de pH de lisis que contiene detergentes, proteasas y sales por un tiempo prolongado, de preferencia por un período de 4 a 100 horas; y c. procesar dicho regulador de pH de lisis de acuerdo con métodos estándar de aislamiento de ácido nucleicos, y aislar dicho ácido nucleico.

22 - El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque dicho ácido nucleico es ADN.

23.- El uso de un método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en un procedimiento para certificar la identidad de fibras vegetales comercializadas.

24 - Un método para determinar las cantidades relativas de diferentes fibras vegetales en una mezcla de fibras vegetales maduras o procesadas, que comprende los pasos de: a. aislar de dicha mezcla de fibras vegetales una macromolécula biológica de ocurrencia natural en dichas fibras vegetales diferentes de polisacáridos o lignina; b. someter dicha macromolécula biológica a pruebas de detección específicas para cada una de dichas fibras vegetales; y c. determinar la cantidad relativa de cada una de las fibras.

25.- Un método para certificar la identidad de fibras de algodón comercializadas, dicho método comprendiendo: a. registrar la compra de semillas de algodón certificadas por agricultores registrados, dicha semilla de algodón comprendiendo una composición específica del genoma y produciendo una marca particular de fibras de algodón; b. registrar balas de fibras de algodón en bruto producidas por dichos agricultores registrados de dichas semillas de algodón certificadas como dicha marca particular de fibras de algodón; c. autenticar dichas balas por verificación cruzada con dichos registros de compra de la semilla; d. proveer dichas balas registradas a molinos para producir hilos, telas o indumentaria de dicha marca de fibras de algodón, de preferencia predominantemente, en particular exclusivamente de dicha marca de fibras de algodón; y e. auditar la identidad de dicha marca de fibras de algodón en uno o más pasos usando un método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.