CN106538380A

CN106538380A - 一种利用CalS5基因突变创制光温敏不育系的方法及其应用

Info

Publication number: CN106538380A
Application number: CN201510612710.4A
Authority: CN
Inventors: 杨仲南; 许特; 朱骏
Original assignee: Shanghai Normal University
Current assignee: Shanghai Normal University; University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2015-09-23
Filing date: 2015-09-23
Publication date: 2017-03-29
Also published as: WO2017049833A1

Abstract

本发明提供一种利用CalS5基因突变创制光温敏不育系的方法及其应用，该培育方法是通过降低所述植物植株中与花粉发育相关的胼胝质合成酶的表达来实现的，本发明的主要优点在于：首次发现了对于某些特定的植物不育系，通过调控植株中与花粉发育相关的CalS5蛋白的表达或活性，来调控所述植株的育性，实现不育与可育之间的可控转换。此外，还开发了植物不育系在农业育种等方面的应用，大大简化了植物不育系的育种方法。

Description

一种利用CalS5基因突变创制光温敏不育系的方法及其应用

技术领域

本发明属于农业和生物技术领域，尤其涉及一种利用CalS5基因突变创制光温敏不育系的方法及其应用。

背景技术

农业生产中，雄性不育系在杂交制种、提高农业产量中占据巨大优势。雄性不育往往被分为细胞质雄性不育(CMS)和细胞核雄性不育(GMS)两种。三系杂交体系的建立即依赖于细胞质雄性不育。但是，细胞质雄性不育有其自身的缺陷：首先，细胞质雄性不育植株的品质普遍较差；其次，三系杂交水稻的组合增产潜力越来越小；再次，由于野败型的雄性不育细胞质单一，一旦细胞质雄性不育丧失或某种毁灭性病虫害发生，那么就会造成巨大的损失。

随着细胞核雄性不育中光温敏条件性雄性不育的发现，两系法杂交水稻应运而生。相对于三系杂交法，光温敏不育系兼有不育系和保持系两种状态。与三系法相比，两系法不受恢保关系的限制，即细胞核不育可以与大量常规品种杂交，配组自由，更容易获得性状优良的杂交优势，从根本上解决三系中雄性不育细胞质单一化的问题。近年来，两系杂交水稻在中国农业生产中的应用越来越广泛。

早在1973年石明松在中国湖北从晚粳品种(Oryza sativa ssp.Japonica)农垦58中选育出光敏感不育系，并提出了一系两用的水稻杂交优势利用新途径。随后，以农垦58S(NK58S)为父本，与籼稻杂交获得的培矮64S(PA64S)也在两系杂交中得到广泛应用，只是培矮64S的育性对温度更加敏感。水稻光温敏不育系受单基因隐性位点控制；研究表明，农垦58S与培矮64S的不育性状均受同一个遗传位点控制，且温度和光照均会对该位点产生影响。

至今，共发现十三个水稻光温敏不育系pms1、pms2、pms3、rpms1、rpms2、tms1、tms2、tms3、tms4、tms5、tms6、rtms1和ms-h，分别定位在第7、3、12、8、9、8、7、6、2、2、5、10和第9条染色体上。研究发现，一个突变的小RNA(small RNA)osa-smR5864m，导致pms2以及p/tms2-1(农垦58S和培矮64S)突变体的不育表型。

拟南芥(A.thaliana)因为具有较小的基因组、快速的生长周期以及大量的突变体库等无可比拟的优势，而在植物学、生物学领域成为模式植物。此外，还能在严格控制温度、光照等条件的狭小空间中培养。研究发现了一些拟南芥不育突变体，如PEAMT基因突变体t365以及GA/IAA生物合成受阻的ms33突变体均为温敏不育表型。

胼胝质合成酶是一类存在于不同物种中家族蛋白，在胼胝质的合成中起重要作用。在植物界，有报道称一些物种的胼胝质合成酶与植物的生殖发育有关，如在紫鸭跖草中作为暂时细胞壁机械屏障，防止细胞融合(Waterkeyn et al.1962)；在百合中为初生外壁提供糖原(Larson Lewis et al.1962)等。

目前，发掘植物雄性不育新种质的常规途径主要包括：对天然雄性不育原始株的发现，人工诱变和连续回交核置换。我国早期的野败型和马协型水稻雄性不育细胞质是对对天然雄性不育原始株的发现；新疆农科院培育的新海不育系棉花是利用海岛棉的杂种经60COγ射线诱变。但是，传统育种方法筛选和培育理想的可转育的雄性不育系存在诸多困难，如雄性不育系种质资源有限，转育周期过长，杂交不亲和，组合选育局限大等。目前，本领域尚缺乏调控方式简单方便的植物不育系用于植物育种过程，因此迫切需要调控方式简单方便的植物不育系培育技术。

发明内容

针对本领域存在的技术问题，本发明提供一种利用CalS5基因突变创制光温敏不育系的方法及其应用，从而解决目前核不育光温敏遗传位点少，制种纯度不高的问题。

本发明的第一个方面在于提供一种培育植物不育系的方法，包括步骤：降低所述植物植株中与花粉发育相关的胼胝质合成酶的表达或活性，所述胼胝质合成酶为CalS5蛋白或其同源蛋白。

作为本发明的一个优选方案，所述胼胝质合成酶参与所述植物花粉发育过程四分体时期的胼胝质合成。

作为本发明的一个优选方案，所述胼胝质合成酶在植物花序或花药的细胞、组织或器官中特异性表达。

作为本发明的一个优选方案，所述细胞或组织包括：小孢子、小孢子母细胞或其组合。

作为本发明的一个优选方案，所述胼胝质合成酶在花药发育期特异性表达。

作为本发明的一个优选方案，所述花药发育期包括前花药形成阶段(-3-0天)、花药形成阶段和后花药形成阶段(1-5天)，其中，0天指花药形成的第1天，-3天为以花药形成当天为起始点，向前推算的第3天，1天、5天分别为以花药形成当天为起始点，向后推算的第1天和第5天。

作为本发明的一个优选方案，所述胼胝质合成酶在花药发育第7期特异表达。

作为本发明的一个优选方案，所述胼胝质合成酶在花粉减数分裂完成时达到表达最高峰。

作为本发明的一个优选方案，所述“降低所述植物植株中与花粉发育相关的胼胝质合成酶的表达或活性”满足以下条件：

A1/A0＝0-80％，优选为A1/A0＝0-60％，更优选为A1/A0＝0-40％，最优选为A1/A0＝0-30％；

其中，A1为所述植株中与花粉发育相关的胼胝质合成酶的酶活性；A0为野生型同种类型植物植株中相同胼胝质合成酶的酶活性。

作为本发明的一个优选方案，所述CalS5的野生型氨基酸序列选自下组中的任意一种或几种：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6。

作为本发明的一个优选实施例，可通过以下任意一种方式降低所述胼胝质合成酶的表达或活性：

1)编码所述胼胝质合成酶的多核苷酸部分或完全缺失；

2)修饰表达调控序列以降低或抑制编码所述胼胝质合成酶的多核苷酸的表达；

3)修饰染色体上的序列以降低蛋白的活性；或

4)上述1)-3)中的任意组合。

其中，所述的编码蛋白的多核苷酸部分或完全缺失是利用染色体基因插入的载体，将编码内源性靶蛋白的多核苷酸替换为标记基因或部分核苷酸序列缺失的多核苷酸。

“部分”缺失的长度根据多核苷酸的种类不同，可以为1-300bp，优选为1-100bp，更优选为1-5bp，其中bp为碱基对。

作为本发明的一个优选实施例，可以通过以下任意一种方式修饰表达调控序列：

1)通过核苷酸序列的缺失、插入、保守、非保守性取代中的一种或几种的组合，在表达调控序列中诱导突变，以进一步降低表达调控序列的活性；

2)将表达调控序列替换成活性更低的序列。

作为本发明的一个优选实施例，所述的表达调控序列包括编码启动子序列、操纵子序列、核糖体结合位点和控制转录与翻译终止的序列。

作为本发明的一个优选实施例，可以通过以下任意一种方式修饰染色体上的多核苷酸序列以降低蛋白的活性：

1)通过核苷酸序列的缺失、插入、保守或非保守性取代中的一种或几种的组合在所述胼胝质合成酶序列中诱导突变，以进一步降低所述胼胝质合成酶的活性；

2)将多核苷酸序列替换成经修饰的序列以便获得更弱的蛋白活性。

作为本发明的一个优选方案，所述的“降低植物植株中与花粉发育相关的胼胝质合成酶的活性”的方法包括：使编码胼胝质合成酶的基因的表达水平下降。

作为本发明的一个优选方案，所述的“使编码胼胝质合成酶的基因的表达水平下降”满足条件：E1/E0＝0-80％，优选为E1/E0＝0-60％，更优选为E1/E0＝0-40％；和/或A1/A0＝0-80％，优选为A1/A0＝0-60％，更优选为A1/A0＝0-40％，最优选为A1/A0＝0-30％；

其中，E1为所述植物植株中与花粉发育相关的胼胝质合成酶的表达水平；

E0为野生型同种类型植物植株中相同胼胝质合成酶的表达水平；

A1为所述植物植株中与花粉发育相关的胼胝质合成酶的酶活性；

A0为野生型同种类型植物植株中相同胼胝质合成酶的酶活性。

作为本发明的一个优选方案，所述的“降低植株中胼胝质合成酶活性是通过基因突变、基因敲除、基因中断、RNA干扰中的一种或几种的结合实现的。

作为本发明的一个优选方案，编码所述胼胝质合成酶的基因为CalS5基因或其同源基因。

作为本发明的一个优选方案，所述CalS5基因能够编码SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6所示氨基酸序列。

其中编码所述胼胝质合成酶的多核苷酸序列选自：SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQID NO.12。

其中，编码SEQ ID NO.1的多核苷酸序列为SEQ ID NO.7。

其中，编码SEQ ID NO.2的多核苷酸序列为SEQ ID NO.8。

其中，编码SEQ ID NO.3的多核苷酸序列为SEQ ID NO.9。

其中，编码SEQ ID NO.4的多核苷酸序列为SEQ ID NO.10。

其中，编码SEQ ID NO.5的多核苷酸序列为SEQ ID NO.11。

其中，编码SEQ ID NO.6的多核苷酸序列为SEQ ID NO.12。

作为本发明的一个优选方案，所述“降低植物植株中与花粉发育相关的胼胝质合成酶的表达或活性”通过以下任意一种方式实现：

1)降低所述植物植株中CalS5基因的表达水平；

2)缺失所述植物植株中CalS5基因；

3)致所述植物植株中CalS5基因突变；或

4)上述1)-3)的任意组合。

作为本发明的一个优选方案，所述的植物包括农作物、林业植物及花卉等；优选地包括禾本科(Gramineae)、豆科(Leguminosae sp.)、十字花科(Brassicaceae)植物以及鼠耳芥属(Arabidopsis)植物，更优选地包括水稻、玉米、高粱、小麦、大豆或拟南芥。

作为本发明的一个优选方案，所述与花粉发育相关的胼胝质合成酶没有特别限定，可以来自任何植物品种，代表性的植物包括但并不限于：水稻(基因号：BGIOSGA021782，与拟南芥直系同源CalS5蛋白同源性为73％)、小米(基因号：Si008368m.g，与拟南芥直系同源CalS5蛋白同源性为77％)、高粱(基因号：Sb10g005550，与拟南芥直系同源CalS5蛋白同源性为81％)、小麦(基因号：Traes_7BS_170A2F4BB，与拟南芥直系同源CalS5蛋白同源性为75％)、玉米(基因号：GRMZM2G353905_T01，与拟南芥直系同源CalS5蛋白同源性为81％)。

本发明的第二个方面在于提供一种编码与花粉发育相关的胼胝质合成酶的基因的用途，所述基因用于培育植物不育系或用于制备培育植物不育系的试剂或试剂盒。

作为本发明的一个优选方案，所述的编码基因为CalS5基因或其同源基因。

本发明的第三个方面在于提供一种将植物从不育转为可育的方法，包括步骤：降低花粉的发育速度。

作为本发明的一个优选方案，所述植物是与花粉发育相关的胼胝质合成酶的表达水平下降的植物。

作为本发明的一个优选方案，所述植物为根据本发明的第一个方面所述的方法培育的植物不育系。

作为本发明的一个优选方案，所述“降低花粉的发育速度”是通过降低植株生长的环境温度和/或减少植株的光照时间实现的。

作为本发明的一个优选方案，降低植株生长的环境温度包括将环境温度(平均温度)控制在18-23℃，如19℃、20℃或22℃等。

作为本发明的一个优选方案，降低植株生长的环境温度的时间包括花药形成阶段，花粉成熟阶段以及开花授粉阶段或其前后2周。

作为本发明的一个优选方案，在植株抽薹或抽穗时开始降低植株的生长温度，低温培育7-14天后，恢复正常温度培育。

本发明的第四个方面在于提供一种植物育种方法，包括如下步骤：

步骤1、维持植株不育；

步骤2、将植株由不育转为可育；

步骤3、维持植株可育并育种。

其中，所述维持植株不育为维持根据本发明提供的第一个方面所述的方法培育的植物不育系；

所述将植株由不育转为可育是根据本发明提供的第三个方面所述的方法将植株由不育转为可育。

本发明的第五个方面，在于提供一种植物细胞，在由所述植物细胞发育成的植株中，与花粉发育相关的胼胝质合成酶的表达降低。

作为本发明的一个优选方案，所述降低满足以下条件：

作为本发明的一个优选方案，所述胼胝质合成酶为CalS5蛋白或其同源蛋白。

其中，“CalS5蛋白”、“CalS5多肽”指具有CalS5的氨基酸序列，如SEQID NO.1-6的蛋白或多肽，在未特别指出时，CalS5蛋白包括野生型CalS5蛋白和突变型CalS5蛋白。

本发明所述的胼胝质合成酶包含但并不仅限于SEQ ID NO.1-6所示氨基酸序列，根据植物种类或品种，所述蛋白的氨基酸序列可能有所不同。换言之，所述CalS5蛋白可以是突变型蛋白或其人工变体，只要有助于通过降低该蛋白的活性而培育植物不育系，所述突变型蛋白及其人工变体的氨基酸序列在SEQID NO.1-6所示氨基酸序列的一个或多个位置包含一个或多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒置。

本发明所述的“多个”，根据蛋白质中氨基酸残基三维结构的位置或类型而有所不同，优选为2–20个，更优选为2–10个，更优选为2–5个。此外，根据植物的个体或种类，氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒置包括人工变体或天然突变所致的氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒置。

本发明所述的“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来，如果是天然的物质，则其原始环境即为自然环境，例如，活体细胞内天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，而如果从天然状态中将同样的多聚核苷酸或多肽与其他物质分开，则为分离纯化的。

本发明所述的“分离的CalS5蛋白或多肽”是指基本上不含与CalS5蛋白相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域技术人员能够采用标准的蛋白质纯化技术纯化水稻等植物中的CalS5蛋白。基本上，纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

本发明所述的“多肽”可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽等，优选为重组多肽。

本发明所述的多肽可以是天然纯化的产物，也可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生；根据重组技术使用的宿主，所述的多肽可以是糖基化或非糖基化多肽；本发明所述多肽还可以包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明所述的CalS5蛋白还包括CalS5蛋白的片段、衍生物及其类似物。

本发明中，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指能保持与本发明所述CalS5蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。

本发明所述的多肽片段、衍生物或类似物可以是：

(1)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基被取代的多肽，并优选为保守性氨基酸残基被取代的多肽，所述被取代的氨基酸残基可以由遗传密码编码；

(2)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽；

(3)成熟多肽与另一个化合物，如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇，融合所形成的多肽；

(4)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽，如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列或融合蛋白。

本发明所述的片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明的优选实施方式中，“CalS5蛋白””或“CalS5多肽”序列如SEQID NO.1-6所示。

在本发明的优选地实施方式中，“CalS5蛋白””或“CalS5多肽”还包括与CalS5蛋白功能相同的、SEQ ID NO.1-6序列的变异形式，这些变异形式包括但并不限于一个或多个，通常为1-50个，优选为1-30个，更优选为1-20个，更优选为1-10个，氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在碳末端和/或氮末端添加1个或数个氨基酸，通常为20个以内，优选为10个以内，更优选为5个以内。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能，在碳末端和/或氮末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。

在本发明的优选地实施方式中，“CalS5蛋白””或“CalS5多肽”还包括CalS5蛋白或多肽的活性片段和活性衍生物。

其中，所述CalS5多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨度的条件下能与CalS5蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白。

本发明还提供了其他多肽，如包含CalS5蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了CalS5蛋白的可溶性片段。通常，所述片段具有CalS5蛋白序列的至少约10个连续氨基酸，通常具有至少约30个连续氨基酸，优选地，具有至少约50个连续氨基酸，更优选地，具有至少约80个连续氨基酸，最优选地，具有至少约100个连续氨基酸。

本发明中所述修饰通常不改变一级结构，所述修饰形式主要包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化；还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基的序列，如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸；还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“CalS5保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.：1-6所示的氨基酸序列相比，有至多10个，优选为至多8个，更优选为至多5个，最优选为至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基	代表性取代	优选取代
			Ala(A)	Val，Leu，Ile	Val
Arg(R)	Lys，Gln，Asn	Lys
			Asn(N)	Gln，His，Lys，Arg	Gln

Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro，Ala	Ala
			His(H)	Asn，Gln，Lys，Arg	Arg
Ile(I)	Leu，Val，Met，Ala，Phe	Leu
			Leu(L)	Ile，Val，Met，Ala，Phe	Ile
Lys(K)	Arg，Gln，Asn	Arg
			Met(M)	Leu，Phe，Ile	Leu
Phe(F)	Leu，Val，Ile，Ala，Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr，Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp，Phe，Thr，Ser	Phe
Val(V)	Ile，Leu，Met，Phe，Ala	Leu

其中，所述代表性取代是指本发明能够取代最初的残基的碱基，所述优选取代是本发明最优选的能够取代最初的残基的碱基。

本发明所述的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。其中，DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA；DNA可以是单链的或是双链的；DNA可以是编码链的，也可以是非编码链的；编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO.7-12所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。

在本发明中，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO.1-6的蛋白质，但与SEQ ID NO.7-12所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO.1-6的成熟多肽的多核苷酸选自以下任意一种：

(1)只编码成熟多肽的编码序列；

(2)成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；

(3)成熟多肽的编码序列和任选的附加编码序列以及非编码序列。

作为本发明的一个优选实施例，所述的CalS5多肽的编码序列选自下组：

(1)编码如SEQ ID NO.1-6所述多肽的多核苷酸序列；

(2)如SEQ ID NO.7-12所示的多核苷酸序列；

(3)与(1)或(2)所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。

在本发明中，“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码该多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及所述多核苷酸的变异体，所述编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物，所述多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异，如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可以是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

作为本发明的一个优选实施例，本发明还涉及与上述的序列杂交，且两个序列之间具有至少50％，优选为至少70％，更优选为至少80％相同性的多核苷酸。

本发明还涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。

本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％菲可400，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO.1-6所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段，所述“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，优选为至少含30个核苷酸，更优选为至少含50个核苷酸，最优选为至少含100个核苷酸。所述核酸片段可用于核酸的扩增技术，如PCR，以确定和/或分离编码CalS5蛋白的多聚核苷酸。

本发明所述的CalS5蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成法获得。PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。重组法是将序列克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。人工合成法尤其适用于片段长度较短时，通常，先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

本发明也涉及包含所述多核苷酸的载体以及用所述载体或CalS5蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，利用本发明的多聚核苷酸序列表达或生产重组的水稻CalS5蛋白。一般来说包含以下步骤：

(1)用本发明编码CalS5蛋白的多核苷酸或变异体，或用含有所述CalS5蛋白的多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

在本发明中，编码所述CalS5蛋白的多核苷酸序列可以插入到重组表达载体中。

术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，所述重组表达载体为能在宿主体内复制和稳定的任何质粒和载体。所述表达载体的一个重要特征是：通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域技术人员熟知的方法能用于构建含CalS5蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。所述的本领域技术人员熟知的方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术以及体内重组DNA技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。

作为本发明的一个优选实施例，所述表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子，优选地，包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

作为本发明的一个优选实施例，包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。所述宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域技术人员清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。重组DNA转化宿主细胞可采用本领域技术人员熟知的常规技术。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，采用本领域熟知的方法。另一种方法是使用MgCl₂，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主细胞是真核生物时，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械法，如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

作为本发明的一个优选方案，所述转化植物可以使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得耐受性改变的植物。

获得的转化子可以采用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所使用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，采用合适的方法，如温度转换法或化学诱导法，诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片，又称为“基因芯片”上，用于分析组织中基因的差异表达分析。用CalS5蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测CalS5蛋白的转录产物。

本发明的主要优点在于：首次发现了对于某些特定的植物不育系，通过调控植物植株中与花粉发育相关的CalS5蛋白的表达或活性，来调控所述植株的育性，实现不育与可育之间的可控转换。此外，还开发了植物不育系在农业育种等方面的应用，大大简化了植物不育系育种方法。

附图说明

以下结合附图对本发明做进一步描述，其中：

图1为胼胝质壁缺陷导致花粉外壁模式异常

图1-1为CalS5突变体的T-DNA插入位置示意图

图1-2为CalS5突变体的RT-PCR分析

图1-3为CalS5三个等位突变体实时定量PCR表达

图1-4为CalS5等位突变体胼胝质壁缺失或减少、亚历山大染色及花粉外壁模式

图2为温度对雄性不育CalS5突变体育性的影响

图2-1为低温和短光照条件下CalS5突变体植株的育性

图2-2为CalS5突变植株恢复可育种子的数量

图3为恢复育性突变体的观察

图3-1为突变体四分体胼胝质壁的染色观察

图3-2为花粉发育的扫描电镜观察。

图3-3为CalS5突变体花药发育的半薄切片观察

图4为恢复的突变体花粉发育阶段的透射电镜分析

图5为环境温度对导拟南芥花粉发育速度的影响

图5-1为不同条件下花药完成发育过程的时间

图5-2为不同条件下产生的小孢子的直径分部

图5-3为不同条件下产生小孢子减数分裂进程统计

图6为CalS5不同突变体的育性恢复图

图7为高温条件下CalS5的育性

图7-1为高温条件下CalS5突变体植株的育性

图7-2为高温条件下CalS5突变体植株产生的花粉

其中，a为野生型，b为CalS5-6，c为CalS5-2，d为CalS5-5

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解的是，这些实施例仅用于解释本发明而不用于限定本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)或植物分子生物学-实验手册(Plant Molecular Biology-A Laboratory Mannual，Melody S.Clark，Springer-verlag Berlin Heidelberg，1997)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非特别说明，涉及的百分比和份数均为质量百分比和质量份数。

材料与方法

植物材料与种植

本发明中拟南芥为Col生态型。4℃，种子预萌发于0.1％琼脂糖培养基上72h。然后将材料培养于蛭石中，培养条件为：室温24℃，光培养16h/暗培养8h(正常条件)，直至抽薹。之后，将抽薹株转移至不同条件下继续培养。低温培养(L)条件为：光照培养箱，18℃或21℃；普通光照(N)培养条件：24℃，光培养16h/暗培养8h；短光照培养(S)条件：24℃，光培养8h/暗培养16h。

细胞学分析

采用尼康数码相机(D-7000)拍摄植物材料。亚历山大染色与DAPI染色可参考Alex&Er，1969；Ross et al.，1996。对于半薄切片，选取花苞不同发育阶段进行固定并包埋于Spurr环氧树脂中。使用Powertome XL(RMC Products，Tucson，Arizona，USA)切片机进行1μm切片，并用甲苯胺蓝进行染色。使用Olympus DX51数码相机(Olympus，Japan)进行花药切片的拍摄。将8nm金颗粒包裹新鲜雄蕊和花粉粒材料进行扫描电镜实验，并利用JSM-840显微镜(JEOL，Japan)观察。对于透射电镜实验，将拟南芥花絮冰上固定于固定液中，固定液的配方为：含有2.5％戊二醛的0.1M磷酸缓冲液，pH值＝7.2。花苞材料进一步依次包埋至树脂(Hard Plus’Embedding Resin，Unite Kingdom)中。利用JEM-1230透射电镜(JEOL，Japan)进行观察超薄切片(50-70nm)。

RNA抽提和定量RT-PCR

总RNA可利用Trizol试剂(Invitrogen，USA)由成熟土培拟南芥植物花组织进行提取。poly-dT(12-18)作为引物；MMLV反转录酶和相应试剂将5μg的RNA反转第一条cDNA链(42℃转录60min)，合成好的cDNA链作为PCR模板。

定量RT-PCR是利用SYBR Green I master mix(Toyobo，Japan)通过ABI PRISM 7300系统(Applied Biosystems，USA)进行检测，以β-Tubulin作为对照。定量RT-PCR的程序参数是：95℃5min，94℃，10s变性40个循环，60℃退火延伸1min。

CalS5突变体的育性

本发明在拟南芥Col生态型的T-DNA突变体库中插入三个等位突变体，分别是CalS5-6，CalS5-2和CalS5-5(如图1-1)，考察拟南芥CalS5突变体的育性。

由图1-2～图1-4可知，CalS5-6和CalS5-2胼胝质壁缺失，CalS5-5胼胝质壁减少，图1-4中亚历山大染色显示，野生型和CalS5-5的花药中充满紫色有活力的花粉，而在CalS5-6和CalS5-2的花药中只有绿色的残余，说明CalS5-6和CalS5-2花粉败育；野生型花粉外壁模式呈现规则的网格状结构，而CalS5-6和CalS5–2呈现不规则的球状沉积，CalS5–5也呈现出不同程度的外壁异常，均表明CalS5三个等位突变体花粉外壁模式异常。常温下，纯合的CalS5-6和CalS5-2突变体植株生长正常，但CalS5-6的育性完全丧失，而CalS5-2也只有个别正常花粉，即丧失绝大部分育性。

低温下CalS5突变体的育性恢复

将CalS5突变体在常温下培养至抽薹，将其移入18℃连续培养，其后续的果荚皆恢复育性(如图2-1所示)，且种子数量较多(如图2-2所示)。在同样的低温条件下，野生型植株的育性并没有受到影响(如图2-1所示)。亚历山大染色显示，低温条件下突变体的花粉被染成紫红色(如图2-1所示)，与野生型的相同，而正常条件下的突变体花药内并无或只有较少可育花粉。这说明低温能够弥补CalS5突变体中雄配子体的发育缺陷。

本发明将抽薹的CalS5植株在18℃处理14天后，将CalS5突变体分别于18℃、20℃、23℃温度条件下进行培养，并观察育性恢复情况，结果表明：18℃下，CalS5-2突变体恢复全部育性，而在20℃和23℃的条件下育性分别降低至85％和48％，更高的温度则会导致完全不育(如图6、图7所示)，说明低温能够使CalS5突变体恢复育性，温度升高，育性降低，甚至完全丧失育性。

分别对野生型和低温恢复育性的CalS5-2突变体进行四分体胼胝质壁的染色观察，结果如图3所示，图3-1显示，与野生型植株相比，恢复育性的CalS5-2突变体植株的胼胝质壁仍然无法形成。图3-2的扫描电镜观察显示，野生型植株与恢复育性的CalS5-2植株的成熟花药中含有许多花粉，但外壁结构仍然异常。图3-3是分别对23℃和18℃培育的CalS5-2的花药发育第11期的半薄切片观察，结果显示，18℃培育的CalS5-2突变体中有明显的红色细胞内容物，而23℃培育的CalS5-2突变体的细胞内容物外漏到药室中。

图4为恢复育性的突变体发育阶段的透射电镜分析，结果显示，低温突变体与常温的一样无法形成花粉外壁。但野生型植株，在第6、7期，小孢子母细胞经历减数分裂形成四分体；随后，小孢子从四分体释放，并逐渐形成有正常花粉壁的三核花粉粒。常温CalS5突变体中，直到花药发育的第6期，均未观察到突变体和野生型的发育差异，这表明突变体雄配子体减数分裂不受影响。如图4所示，至花药发育第7期早期，与野生型相比，突变体质膜波浪型起伏与野生型相比都较为正常，但缺少电子致密度较小的初生外壁，且电子致密度较大的孢粉素提前且不规则的沉积在小孢子外侧。花药发育第7期晚期，突变体前棒状体呈现球状沉积。至花药发育第8期，CalS5小孢子从四分体释放，与野生型相比，小孢子外壁呈现多处裂口的表型。花药发育第9期，大部分CalS5小孢子开始降解，随后，小孢子的细胞质收缩和瓦解。最终，药室内只有一些败育花粉的碎片，并没有正常的花粉形成。另一方面，在低温状态下(18℃)，CalS5小孢子在花药发育第8期的外壁裂口消失，在后续的发育阶段，大部分小孢子并没有破裂降解，而是逐渐恢复正常，低温下的药室中产生了正常的成熟花粉粒。

扫描电镜结果显示，CalS5-6和CalS5-2突变体在常温的药室中没有或只有较少花粉粒，但其在低温条件下的花粉粒数量和结构与野生型的基本一致(如图3所示)。Tinapol&DIOC2染色观察表明CalS5小孢子的细胞完整性在低温条件下得以恢复。在正常温度(23℃)下，CalS5小孢子的外壁结构仍然表现出不规则状态，其细胞质已明显泄漏，这导致了小孢子后期的破裂降解。该结果表明，尽管小孢子的外壁正常形成，但该基因的缺失导致了细胞壁完整性受损。在低温条件(18℃)下，CalS5小孢子花粉细胞质保持稳定(图3-3)，表明低温能够克服CalS5突变所带来的细胞壁完整性缺陷。

利用半定量的RT-PCR技术，检测CalS5突变体背景下，与花粉初生外壁合成相关基因的相对表达，结果显示初生外壁合成相关基因在CalS5背景下表达正常，初生外壁的合成不受影响(图4)。

为了阐明CalS5突变体温敏的机制，本发明对不同温度下的野生型和突变体花苞中的CalS5转录与蛋白水平进行了检测。定量PCR检测表明，常温(23℃)与低温(18℃)条件下突变体和野生型的CalS5在转录水平上没有显著差异。这些结果表明温度不会对CalS5产生诱导表达。

温度对花粉发育速度的影响

如图5所示，本发明考察了不同温度下，花粉发育的速度，并根据花苞的生长进程对花苞作小孢子的直径统计(图5-2)，同时根据花粉发育进程进行小孢子的减数分裂进程统计(图5-3)。

将花粉发育过程分为3个时期：单核花粉期(uninucleate stage)、双核花粉期(bicellular stage)以及三核花粉期(tricellular stage)。统计结果表明小孢子从四分体时期开始，常温下的直径大约为14μm，经过第一次有丝分裂后2天后，双核期的小孢子直径大约扩大了2倍。当形成成熟花粉后，花粉直径增大到了21μm。

本发明统计了不同温度下各时期的小孢子生长速度，结果表明，随着温度升高，小孢子直径增长速度加快。此外，DAPI染色结果表明，不同温度下减数分裂进程均正常，但随温度升高进程加快。该结果说明，低温延缓的生长发育时间是弥补CalS5小孢子缺陷的重要原因。

日照条件对CalS5突变体育性的影响

本发明在常温条件下(23℃)，正常光照(16h光照/8h黑暗)培养CalS5-2突变体至抽薹阶段，然后将其置入短日照(8h光照/16h黑暗)培养5天，以考察日照条件对CalS5小孢子发育缺陷的育性恢复。结果显示突变体的育性得到了恢复(如图2所示)。亚历山大染色实验表明在正常光照条件下，突变体花药内没有花粉，但在短日照条件下有一定量的花粉形成(如图2所示)。这些结果表明CalS5在短日照条件下的育性恢复机制类似于低温处理的机制。

图6、图7为高温条件下，CalS5突变体的种子量。在高温(28℃)下，正常光照培养的CalS5弱等位突变体的种子数量明显减少，且温度升高，突变体植株中的花粉数量减少，28℃时，突变体植株中几乎没有花粉，说明在该条件下，CalS5突变体的育性严重下降。

综上所述，对于Cals5突变体来说，相对于光照周期，环境温度对育性的恢复起到更重要的作用。

本发明提及的所有文献在本申请中引用只是作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考一样。此外还应理解的是，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明做出各种改动或修改，这些等价形式同样属于本申请权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种培育植物不育系的方法，其特征在于，包括步骤：降低所述植物植株中与花粉发育相关的胼胝质合成酶的表达或活性，所述胼胝质合成酶为CalS5蛋白或其同源蛋白。

2.根据权利要求1所述的培育植物不育系的方法，其特征在于，所述“降低所述植物植株中与花粉发育相关的胼胝质合成酶的表达或活性”满足：所述植株中与花粉发育相关的胼胝质合成酶的酶活性/野生型同种类型植物植株中相同胼胝质合成酶的酶活性＝0-80％。

3.根据权利要求1所述的培育植物不育系的方法，其特征在于，所述CalS5的野生型氨基酸序列选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6。

4.根据权利要求1所述的培育植物不育系的方法，其特征在于，所述胼胝质合成酶在植物花序或花药的细胞、组织或器官中特异性表达。

5.根据权利要求1所述的培育植物不育系的方法，其特征在于，通过以下任意一种方式降低所述胼胝质合成酶的表达或活性：

1)编码所述胼胝质合成酶的多核苷酸部分或完全缺失；

2)修饰表达调控序列以降低或抑制编码所述胼胝质合成酶的多核苷酸的表达；3)修饰染色体上的序列；或

4)上述1)-3)中的任意组合。

6.一种编码如权利要求1所述胼胝质合成酶的基因在培育植物不育系或制备培育植物不育系的试剂或试剂盒中的用途。

7.一种将植物从不育转为可育的方法，其特征在于，包括步骤：降低花粉发育速度；其中：所述植物为根据权利要求1所述的方法培育的植物不育系。

8.根据权利要求7所述的将植物从不育转为可育的方法，其特征在于，所述降低花粉发育速度是通过降低植株生长的环境温度和/或减少植株的光照时间实现的。

9.一种植物育种方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1、维持植株不育；

步骤2、将植株由不育转为可育；

步骤3、维持植株可育并育种；

其中，步骤1中所述“维持植株不育”为对根据权利要求1所述的方法培育的植物不育系进行维持；所述将植株由不育转为可育的方法为权利要求7所述的将植株由不育转为可育的方法。

10.一种植物细胞，其特征在于，在由所述植物细胞发育成的植株中，与花粉发育相关的胼胝质合成酶的表达降低。