CN102112629A - 用于植物纤维表征和鉴定的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了用于分离生物大分子的方法，这些生物大分子包括来自成熟的植物纤维(如棉纤维)以及来自纺织品的肽、蛋白质、以及核酸。该生物大分子可用于表征该植物纤维(生产植物的来源、起源、基因组构成等等)。

Description

用于植物纤维表征和鉴定的方法
发明领域
本发明涉及用于分离生物大分子的方法，这些生物大分子包括来自成熟植物纤维(如棉纤维)的肽、蛋白质、以及核酸。在该生物大分子的分离之前，这些植物纤维可能已经加工成纱线，这些纱线随后可以被织造或针织成织物或成品服装。由于这些分离的大分子含有编码在它们的构造单元的序列中的信息，根据当前描述的方法从植物纤维分离出的这些大分子可以方便地用于表征该植物纤维或鉴定该植物纤维的起源或来源。使用植物纤维的历史来源，所生成的信息可以用在例如用于特殊植物纤维的个性特征保护(identity preservation)程序、植物纤维起源的证明中或者甚至用在育种系谱的重建中。
发明背景
植物纤维形成对于在经济上重要的产品如纸、绳索(绳和索)以及纺织品的一个来源。一种纤维被植物学地定义为一种长的窄的尖端细的细胞，其在成熟时是无活力的和中空的、具有大部份由纤维素和通常的木质素组成的硬的厚的细胞壁。在双子叶茎(亚麻、黄麻、大麻、苎麻)的韧皮部(内部树皮)中发现软纤维或韧皮纤维。在单子叶植物的(剑麻、马尼拉麻、菠萝)叶脉管束中发现硬纤维或叶纤维。表面纤维由种子类(棉花)、叶类或果实类(椰子纤维)的表面长成。
棉花提供了许多用于纺织工业的高质量纤维并且在通过经典方法或通过遗传上改变棉株的基因组获得具有适于工业要求的特征的棉纤维方面已经投入了较多的努力。
棉纤维作为一个种子毛状体，更确切地说在开花期或正好在开花期之前从胚珠的外珠被的表皮开始的单个细胞而起源。棉纤维的形态学发育已经很好地被文件证明(Basra and Malik，1984，Int Rev of Cytology 89：65-113；Graves and Stewart，1988，supra；Ramsey and Berlin，1976，American Journal of Botany 63(6)：868-876；Ruanand Chourey，1998，Plant Physiology 118：399-406；Ruan et al.2000，Aust.J.PlantPhysiol.27：795-800；Stewart，1975，Am.J.Bot.62，723-730)。棉纤维，特别是来自陆地棉的棉纤维，经历了四个重叠的发育阶段：纤维细胞开始、延长、次生胞壁生物合成、以及成熟。纤维细胞开始是一种快速的过程。在开花期之后白色毛绒纤维立即开始发育并且持续至约3个开花后天数(DPA)，此后纤维细胞延长(直到约10至约17DPA)。取决于生长条件，次生胞壁生物合成开始并且持续至约25至40DPA，随后是一个直到约45至约60DPA的成熟过程。该次生胞壁合成以及成熟期通常被视为“纤维强度建立期”。仅仅约25％至30％的表皮细胞分化成商业上重要的棉绒纤维(Kim和Triplett，2001)。大多数细胞不分化成纤维或发育成短纤维或绒毛。在纤维延长以及次生壁代谢期间，纤维细胞快速延长、合成次生壁成分、并且显示出急剧的细胞、分子以及生理学变化。纤维延长是与快速的细胞生长和膨胀(Seagull，1991.In Biosynthesis and biodegradation of cellulose(Haigler，C.H.&Weimer，P.J.，eds)pp.1432163，MarcelDekker，New York)以及大量的细胞代谢物以及细胞壁成分如纤维素的恒定合成相结合的。在成熟的棉纤维中约95％的干重是纤维素(Pfluger和Zambryski，2001，Curr Biol 11：R436-R439；Ruan et al.，2001，PlantCell 13：47-63)。非赛璐珞成分(non-celluloid component)对于纤维细胞发育也是重要的(Hayashi and Delmer，1988，Carbohydr.Res.181：273-277；Huwyler et al.，1979，Planta 146：635-642；Meinert and Delmer，1977，Plant Physiol 59：1088-1097；Peng et al.，2002，Science 295：147-150)。与其他的植物细胞比较，棉纤维在次生壁中不含有木质素但是具有推测地与快速的细胞生长和膨胀相关的大空泡(Basra andMalik，1984，supra；Kim and Triplett，2001，Plant Physiology 127：1361-1366；Mauney，1984，supra；Ruan and Chourey，1998，supra；Ruan et al.，2000，supra；Van‘t Hof，1999，American Journal of Botany 86：776-779)。
发育的棉纤维是活的细胞并且因此含有生物大分子如肽、蛋白质以及核酸(如DNA和RNA)。相比之下，成熟的纤维是无活力的中空的细胞，主要由纤维素组成。通常公认的是纤维细胞特别是棉纤维细胞不再含有可提取的核酸或蛋白质。基于这样的惰性，棉拭子被用作一种医学物质的涂抹器以及在法律学调查中用于(最通常地)从内颊取得DNA样品。
此外，植物纤维在它们的在工业中的使用(尤其是在它们的在纺织工业中的使用)之前经受了广泛的加工。关于棉花，从在大田中的粗纤维加工成出售的成品服装包括很多步骤，这些步骤取决于所希望的终产品而变化很大。通常可以将在这些过程中的不同的可能步骤分成机械和化学步骤。
收获以及轧棉的过程可以使纤维经受热损伤和机械损伤。在轧棉期间没有施用化学药品。如果它含有大于8％的水分，在该轧棉期间通常利用热量来干燥棉花。通常周密地调节加热以避免纤维损伤。在采摘和轧棉期间可以发生机械损伤。这种机械损伤将会影响一个非常低％的总纤维。
在纺纱期间，这些过程步骤主要是机械性的。在该纺纱过程中去除了短纤维(未成熟的和/或机械损伤的纤维)以及杂质。当用于针织的纱线是用一种润滑剂处理过并且用于织造的纱线的约一半是用胶料处理过时，在朝向纺纱过程的终点进行了加工中的第一化学处理。最通常地用蜡作为润滑剂处理用于针织的棉纱以便促进纱线通过针织设备移动。合成润滑剂也是可供使用的但是蜡仍然被认为是最常见的处理。对在完成的织物(经编织物)中将用作纵向股的用于织造的纱线进行上浆(还被称为浆纱)。侧面的(充填)纱线未经上浆处理。用于上浆的普通材料是淀粉。还将聚乙烯醇用于上浆并且淀粉与聚乙烯醇的混合物是常见的。还可以将添加剂如粘合剂、保湿剂、软化剂、湿润剂、消泡剂以及其他辅助剂添加至该上浆处理。
针织和织造两者都是不涉及化学或热应用的机械过程。在针织和织造结束时，用于最终处理的制备所生成的织物的步骤涉及化学药品(并且在一些情况下涉及高温)的应用。该最终处理步骤的制备过程目标在于去除杂质，这些杂质将干扰贯穿染色、印制或其他的最终处理步骤的加工。主要地，必须从针织的织物去除蜡(擦洗)并且必须从织造的织物去除浆料(脱浆)。可以在这个步骤中去除其他的杂质包括籽壳、果胶以及其他的化学药品。用于脱浆的化学药品包括用于去除淀粉的酶类以及用于去除聚乙烯醇的苏打、灰或洗涤剂。擦洗是用将溶解蜡或使用的其他的润滑剂的有机溶剂进行的。在擦洗或脱浆之后，通常使用氯漂白剂或过氧化物漂白剂对织物进行漂白。漂白的目标在于去除任何剩余的非纤维材料、残留浆料的水解、氧化、以及去除以及改善染料的吸收度。用过氧化物进行漂白可以涉及在接近沸水温度的蒸汽或水浴，并且该漂白浴可以含有添加剂如稳定剂和掩蔽剂。用氯的漂白是在较低的温度(40至50摄氏度)下进行的并且相比于用过氧化物纤维素降解是较少的。如果是用氯进行漂白的，还需要脱氯剂处理。在一些织物上用一个受控制的火焰进行烧毛以便清理织物表面并且去除或减少起球。可以将光增亮剂添加至作为白色的未染色产品待售的织物或服装。典型地将阴离子有机光增亮剂用于棉花上。若干化合物是可供使用的并且一些可以在漂白期间加入。
丝光处理是一个可以施用于棉纱或织物的过程，用于改善染料的吸收或对其的反应以及其他的化学最终处理、改善断裂强度、改善尺寸稳定性、改善平滑性和光泽以及掩盖不成熟的棉纤维。它是一个涉及用NaOH处理、洗涤、酸洗、漂洗以及干燥的过程。
最常见的最终处理是染色。它可以在纱线、织物或服装阶段进行。用于棉花的染料是很多的并且有许多不同的类型。最常见的用于棉花的染料产品是靛蓝，但是它仅仅代表4％的染色的织物。染色可以作为一种连续过程或分批过程完成。虽然用于染色的化学药品是很多的，该过程通常涉及在染缸中接近沸腾的高温的使用，在其中该织物、纱线或服装可以被浸没持续延长的时间。印制是用于对纺织品添加颜色或图样的另外的主要工艺。印制主要涉及用于对织物或服装的表面施用着色墨的一个机械过程。染色和印制两者都涉及在过程结束时应用化学固定剂。
另一个常见的最终处理(特别是在染色之后)是侵蚀性洗烫(aggressivelaundering)。这将会包括洗涤剂以及其他的清洁剂的使用以便从完成的织物或服装去除残留的最终处理物质。
可以对织物、纱线或服装施用许多其他的机械和化学最终处理步骤(涉及化学药品和处理过程的很多选项)。单独的软化剂可以是三个不同类型并且每一类型可以涉及若干不同的化学药品。
尽管以上将粗棉纤维转化成目标使用的纺织产品的综述是高度广义的，将清楚的是本领域的人员不会期望能够在许多通常涉及的化学和热处理步骤之后从纱线、纺织品或成品服装产品提取肽、蛋白质或核酸。
对于在工业中能够追踪织物纤维尤其是成熟的和/或加工的植物纤维的来源和/或起源存在着一种需要。这样的植物纤维的来源和/或起源的鉴定可能对于保证从特殊种质生产的具有特定质量的纤维的生产和加工的证明过程是重要的，如证明程序(
Figure BDA0000046350350000052
Certification Program)(www.certifiedfibermax.com)。在成熟的和/或加工的纤维中追踪来源和/或起源的能力还允许具有特殊特征的植物纤维(例如在WO2006/136351中描述的具有提高的化学反应性或可染性的纤维)的鉴定。
现有的证明程序是基于一种特异种质的纤维作物(如棉花)的种子购买的种子零售商或栽培者的记载以及注册的栽培者的生产的纤维的鉴定(在经过永久USDA棉包识别码的棉花的情况下)。
如果从含有与纤维的来源植物相关的生物信息的成熟的和/或加工的植物纤维提取生物大分子(如肽类、蛋白质类、核酸类、DNA或RNA)将是可能的话，则追踪植物纤维尤其是成熟的和/或加工的纤维的来源和/或起源的能力将会大大提高。这样，将会使现有的证明程序的审核变成可能。此外，在供应链中的一个后期像例如在纺织者、织布者或零售消费者水平(优于纤维的栽培者或供应商)鉴定纤维将会变成可能。
农业研究机构，USDA和Applied DNA Sciences一起工作以研发一种基于DNA植入技术的标签系统用于追踪US来源的棉花和纺织品成分。
(htpp://seedquest.com/News/releases/2004/February/7829.htm)。
因此能够从植物纤维如棉纤维尤其是从成熟的和/或加工的纤维、纺织品、纱线或服装中提取天然发生的生物大分子以及进一步能够从此类植物纤维导出植物来源相关信息将会是有利的。
通过允许从植物纤维如棉纤维尤其是从成熟的和/或加工的纤维、纺织品、纱线或服装中提取天然生物大分子以及进一步能够从此类植物纤维导出植物来源相关信息，在以下不同的实施方案、实例、图形以及权利要求书中描述的方法提供了一个对于上述问题的方案。
发明概述
在一个实施方案中，本发明提供了用于表征成熟的植物纤维或加工的植物纤维例如一种种子纤维或棉纤维的一种方法，该方法包括以下步骤：从所述植物纤维分离天然发生在所述植物纤维中的除多糖或木质素以外的一种生物大分子；并且表征编码在所述生物大分子的单体的序列中的信息。
在本发明的另一个实施方案中，本发明提供了用于鉴定成熟的植物纤维或加工的植物纤维例如一种种子纤维或棉纤维的一种方法，该方法包括以下步骤：从所述植物纤维分离天然发生在所述植物纤维中的除多糖或木质素以外的一种生物大分子；并且使所述生物大分子经受对所述植物纤维特异的检测分析。
在一个实施方案中，该生物大分子可以是一种多肽、蛋白质、核酸、DNA、RNA、单链RNA或双链RNA。
在另一个实施方案中，该检测分析可以是一种基于聚合酶链反应的检测分析、一种基于抗体的检测分析、或一种基于核酸杂交的检测分析。
在又另一个实施方案中，该检测分析可以检测呈现于该产生纤维的植物的基因组中的嵌合基因的存在或缺乏。该嵌合基因可以包括选自N-乙酰葡糖胺转移酶、草胺膦乙酰转移酶(phosphinotricinacetyltransferase)、EPSPS、羟基苯丙酮酸双氧化酶(hydroxyphenylpyruvatedioxygenase)、苏云金杆菌晶体蛋白的一种杀虫部分、聚(ADP核糖)聚合酶、聚(ADP核糖)葡萄糖水解酶、蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶、葡聚糖酶、纤维素合成酶、甲壳酶、扩张蛋白(expansin)、胼胝质合成酶、激酶、烟酰胺酶、烟酰酸磷酸核糖基转移酶、烟酸单核苷酸腺嘌呤转移酶(nicotinic acid mononucleotide adenyl transferase)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶(nicotinamide adenine dinucleotide synthetase)或烟酰胺磷酸核糖基转移酶(nicotine amide phosphorybosyltransferase)的一个编码区或部分或其反义部分。该检测分析还可以是一种转化事件特异性检测分析。
在本发明的又另一个实施方案中，该检测分析可以检测呈现于该产生纤维的植物的基因组中的特异等位基因的存在或缺乏。
在本发明的又另一个实施方案中，从其中分离生物大分子的纤维是存在于纱线、织物、组织或成品服装中的。
本发明进一步提供了用于分析产生纤维的植物的基因组的方法，该方法包括以下步骤：从所述植物的成熟的或加工的纤维分离核酸，所述核酸是在所述植物纤维中天然发生的；并且使所述核酸经受一个基因组分析方案。该方法可以应用于旧的成熟的纤维或旧的纱线、织物或成品服装。
本发明的又一个实施方案是一种从成熟的植物纤维或加工的植物纤维分离核酸如DNA的方法，该方法包括以下步骤：将所述植物纤维在一种含有洗涤剂、蛋白酶、以及盐的缓冲液中孵育持续一个延长的时间，优选持续一个4至100小时的时期；以及根据标准核酸分离方法加工所述裂解缓冲液并且分离所述DNA。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种从纺织的或针织的织物分离核酸如DNA的方法，该方法包括以下步骤：解开所述织物的线；将所述线在一种含有洗涤剂、蛋白酶、以及盐的缓冲液中孵育持续一个延长的时间，优选持续一个4至100小时的时期；以及根据标准核酸分离方法加工所述裂解缓冲液并且分离所述核酸。
在本发明的又一个实施方案中，提供了一种从收获的成熟的植物纤维分离核酸如DNA的方法，该方法包括以下步骤：从该收获的成熟的植物纤维去除叶和茎废料；将所述植物纤维在一种含有洗涤剂、蛋白酶、以及盐的缓冲液中孵育持续一个延长的时间，优选持续一个4至100小时的时期；以及根据标准核酸分离方法加工所述裂解缓冲液并且分离所述核酸。
本发明还提供了根据本发明在证明贸易的植物纤维的个性特征的过程中的一种方法的使用。
本发明进一步提供了确定在成熟的植物纤维或加工的植物纤维的一种混合物中的不同植物纤维的相对量的一种方法，该方法包括以下步骤：从所述植物纤维的混合物分离天然发生在所述植物纤维中的除多糖或木质素以外的一种生物大分子；使所述生物大分子经受对每一种所述植物纤维特异的检测分析；并且确定每一种纤维的相对量。
在本发明的另一个实施方案中，提供了证明贸易的棉纤维的个性特征的一种方法，所述方法包括：通过注册的栽培者记载被鉴定的棉花种子的购买，所述棉花种子包括特异的基因组构成并且产生一个特殊牌子的棉纤维；从所述被鉴定的棉花种子登记由所述注册的栽培者生产的粗棉纤维包作为所述特殊牌子的棉纤维；通过与所述种子购买记载交互核对证实所述棉包；优选主要地向磨机提供所述注册的棉包以便从所述牌子的棉纤维(特别专有地从所述牌子的棉纤维)生产纱线、织物或服装；并且使用一种如在此描述的方案以一个或多个步骤审核所述牌子的棉纤维的个性特征。
附图简要说明
图1：在从成熟的棉纤维材料(陆地棉FM966)分离的核酸模板上的GhGluc1的PCR扩增。泳道1：分子量标记；泳道2：来自纯化的纤维的模板DNA(1μl)；泳道3：来自未纯化的含有叶废料的纤维的模板DNA(1μl)；泳道4：仅仅来自叶废料的模板DNA(1μl)；泳道5：来自纯化的纤维的模板DNA(5μl)；泳道6：来自未纯化的含有叶废料的纤维的模板DNA(5μl)；泳道7：仅仅来自叶废料的的模板DNA(5μl)；泳道8：无模板对照；泳道9：阳性对照-从FiberMax966(FM966)植物材料分离的基因组DNA。
图2：在从成熟的棉纤维材料(陆地棉FM966)棉纤维材料以及从4年大的海岛棉(Gossypium barbadense)Pima Y5棉纤维材料分离的核酸模板上的GhGluc1的PCR扩增。泳道1：分子量标记；泳道2-3：来自FM966纯化的不含有叶废料的纤维的模板DNA(5μl)；泳道4-5：来自FM966未纯化的含有叶废料的纤维的模板DNA(5μl)；泳道6：来自不含有纤维材料的FM966叶废料的模板DNA(5μl)；泳道7-8：来自不含有叶废料的Pima Y5纯化的纤维的模板DNA(5μl)；泳道9：无模板对照；泳道10：阳性对照-从FiberMax966植物材料分离的基因组DNA。
图3：在通过不同的方案分离的核酸模板上的GhGluc1的PCR扩增。泳道1：分子量标记；泳道2：通过
Figure BDA0000046350350000081
Plant Mini Kit分离的模板DNA(5μl)；泳道3：通过
Figure BDA0000046350350000082
Plant Mini Kit分离的模板DNA(1μl)；泳道4：通过Plant Mini Kit分离的模板DNA(1μl)；泳道5：通过
Figure BDA0000046350350000084
PlantMini Kit分离的模板DNA(5μl)；泳道6：通过
Figure BDA0000046350350000085
Genomic DNAPurification Kit分离的模板DNA(1μl)；泳道7：通过
Figure BDA0000046350350000086
Genomic DNAPurification Kit分离的模板DNA(5μl)；泳道8：通过
Figure BDA0000046350350000087
Genomic DNAPurification Kit分离的模板DNA(1μl)；泳道9：通过Genomic DNAPurification Kit分离的模板DNA(5μl)；泳道10：通过CTAB程序分离的模板DNA(1μl)；泳道11：通过CTAB程序分离的模板DNA(5μl)；泳道12：无模板对照；泳道13：阳性对照-从FiberMax966植物材料分离的基因组DNA。
图4：在棉布分离的核酸模板上的GhGluc1的PCR扩增。泳道1和8：分子量标记；泳道2：来自棉布(在孵育)的模板DNA(1μl)；泳道3：来自棉布(30’孵育)的模板DNA(1μl)；泳道4：来自棉布(在孵育)的模板DNA(5μl)；泳道5：来自棉布(30’孵育)的模板DNA(5μl)；泳道6：无模板对照；泳道7：阳性对照-从FiberMax966植物材料分离的基因组材料。
图5：在从具有不同的织法(针织或机织)的棉衬衫分离的核酸模板上的GhGluc1的PCR扩增。泳道1：分子量标记；泳道2：来自机织棉衬衫的模板DNA，在孵育，(1μl)；泳道3：来自机织棉衬衫的模板DNA，在孵育，(5μl)；泳道4：来自机织棉衬衫的模板DNA，在孵育，(1μl)；泳道5：来自机织棉衬衫的模板DNA，在孵育，(5μl)；泳道6：来自针织棉衬衫的模板DNA，在孵育，(1μl)；泳道7：来自针织棉衬衫的模板DNA，在孵育，(5μl)；泳道8：来自针织棉衬衫的模板DNA，在孵育，(1μl)；泳道9：来自针织棉衬衫的模板DNA，在孵育，(5μl)；泳道10：来自机织棉衬衫的模板DNA，6天孵育，(1μl)；泳道11：来自机织棉衬衫的模板DNA，6天孵育，(5μl)；泳道12：来自机织棉衬衫的模板DNA，6天孵育，(1μl)；泳道13：来自机织棉衬衫的模板DNA，6天孵育，(5μl)；泳道14：来自针织棉衬衫的模板DNA，6天孵育，(1μl)；泳道15：来自针织棉衬衫的模板DNA，6天孵育，(5μl)；泳道16：来自针织棉衬衫的模板DNA，6天孵育，(1μl)；泳道17：来自针织棉衬衫的模板DNA，6天孵育，(5μl)；泳道18：无模板对照；泳道19：阳性对照-从FiberMax966植物材料分离的基因组DNA。
图6：在从成熟的转基因棉纤维材料(含有一种嵌合N-乙酰葡糖胺转移酶编码基因)分离的核酸模板上的NodC的PCR扩增。泳道1：来自转基因纤维材料的模板DNA，复本1(1μl)；泳道2：来自转基因纤维材料的模板DNA，复本1(5μl)；泳道3：来自转基因纤维材料的模板DNA，复本2(1μl)；泳道4：来自转基因纤维材料的模板DNA，复本2(5μl)；泳道5：无模板对照；泳道6：阳性对照-从转基因棉珠材料分离的基因组DNA；泳道7：分子量标记。
图7：在来自陆地棉以及来自海岛棉的GhGluc1A亚基因组等位基因之间进行鉴别的端点Taqman分析的图示。使从Pima(海岛棉)或FM966(陆地棉)植株(叶)材料制备的基因组DNA样品(或者处于纯的形式或处于不同比率(75/25、50/50以及25/75)的混合物)经受TaqMan检测分析。X轴表明陆地棉Gluc1等位基因的存在，而Y轴表明海岛棉Gluc1等位基因的存在。在该混合的DNA样品中，该Taqman分析允许不同比率的等位基因两者的检测。
图8：在来自陆地棉以及来自海岛棉给光型纤维以及马球衬衫纺织品的GhGluc1A亚基因组等位基因之间进行鉴别的端点Taqman分析的图示。从Pima(海岛棉)或FM966(陆地棉)植株(叶)材料制备的基因组DNA样品(或者处于纯的形式或者处于50/50比率的混合物)作为对照样品。使从纤维材料(FM966包)或从纺织品材料(马球衬衫)制备的核酸经受TaqMan检测分析。X轴表明陆地棉Gluc1等位基因的存在，而Y轴表明海岛棉Gluc1等位基因的存在。在该分析中，仅仅检测到陆地棉等位基因，表明所有的纤维材料以及所有的纺织品材料仅仅含有陆地棉型纤维。
本发明的实施方案的详细说明
当前描述的方法是基于这样的意外的发现，即，从成熟的和/或加工的植物纤维尤其是从种子纤维如棉纤维提取生物大分子(除多糖以外)如肽、蛋白质以及核酸是可能的。而且，该分离的DNA被证明具有足够的品质以便对于进一步的加工是有用的，该加工允许使用例如检测分析如基于聚合酶链反应的扩增对这些纤维进行表征。
因此，在一个第一实施方案中，本发明提供了用于成熟的植物纤维或加工的植物纤维的一种方法，该方法包括以下步骤：从所述植物纤维分离天然发生在所述植物纤维中的除多糖或木质素以外的一种生物大分子；并且表征编码在所述生物大分子的单体的序列中的信息。
如在此所使用，一种“成熟的植物纤维”是一种已经完成它的发育周期的纤维并且被认为是一种无活力的细胞的残余物。具体而言，一种成熟的植物纤维是将其从产生该植物纤维的纤维作物收获之后的一种植物纤维。对于棉花例如，一种成熟的纤维将会被认为是当它们在收获时采摘的棉球中存在的纤维。将会清楚的是一种成熟的植物纤维包括所有的经纤维工业加工的植物纤维。
如在此使用的一种“加工的植物纤维”是一种当从植物作物收获时的成熟的植物纤维，其已经经历了另外的机械、热和/或化学处理，包括上蜡、染色(dying)、梳理、纺纱、织造、上浆、丝光处理等(参见背景部分)。
如在此使用的“植物纤维“是一种植物源的长窄的尖端细的细胞，其在成熟时是无活力的和中空的、具有大部份由纤维素和木质素组成的硬的厚的细胞壁。
如在此所使用的“种子纤维”是由种子表面生长的纤维，如棉花。如在此使用的“棉花”包括陆地棉或海岛棉，包括“棉花祖先植物”如亚洲棉(Gossypiumarboretum)、草棉(Gossypium herbaceum)以及雷蒙德氏棉(Gossypiumraimondii)以及长萼棉(Gossypium longicalyx)。
一种“天然发生在一种植物纤维细胞中的生物大分子“是一种不是外源性地添加至所述植物纤维的生物大分子(例如将一种分子如一种外来的DNA分子、肽、或蛋白质通过孵育或注射以便标记该植物纤维)，并且包括所有的大分子，即具有一种信息内容的聚合性质的分子。该信息内容将通常被编码在构造单元或单体的序列中。生物大分子的实例是一种多肽、蛋白质、核酸(如DNA或RNA)，它们是单链的或双链的。
如在此使用的“表征一种生物大分子”表示解码该生物大分子的信息内容。这可以通过使该生物大分子经受一系列的分析来方便地进行，包括确定组成该大分子的单体的序列，而且使该生物大分子经受一种或多种特异的检测分析。
如在此使用的“检测分析”是靶向于发现在一种生物大分子中的单体的特异序列的一种方法或方案。这可以包括基于多聚酶链反应的扩增的检测分析、抗体检测或核酸杂交。
已经证明了具体的提取方法(虽然对提取的生物大分子的质量具有影响)对于能够从植物纤维提取这样的生物大分子的能力不是关键的。
尽管如此，已经乎意料地发现从成熟的和/或加工的植物纤维分离的该生物大分子(尤其是它的核酸部分)的质量和/或数量可以是很好地通过若干措施来实现。
例如可以有利的是使该有待分析的植物纤维留在一种含有洗涤剂以及可能其他的组分的裂解缓冲液中持续一个延长的时间。具体而言，已经发现在一种裂解缓冲液中孵育成熟的和/或加工的植物纤维持续一个至少30分钟(但是更优选持续一个至少4小时长达120小时)的时期将提高回收的生物大分子尤其是其核酸部分的得率。
还已经确定的是，在生物大分子的分离之前从植物纤维如收获的和/或碾轧的棉纤维仔细地去除杂质(包括叶残余物、树脂以及其他的废料)大大地改善了该分离的核酸的质量，尤其是改善了关于该分离的核酸的进一步分析和可加工性。
可以有利地使用本发明的方法以便鉴定从含有转化事件或转化事件的组合的植物得到的棉纤维，在美国，这可能是对美国农业部(USDA)的动植物卫生监督局(APHIS)的非规管状态(non-regulated status)的请求的主题，(无论这样的请求是否批准或者仍然待决定)，包括以下事件：
  转化事件   请求   转基因表型
  COT67B   07-108-01p   鳞翅类抵抗
  GHB614   06-332-01p   草甘膦耐受
  MON88913   04-086-01p   草甘膦耐受
  COT102   03-155-01p   鳞翅类抵抗
  281-24-236   03-036-01p   鳞翅类抵抗
  3006-210-23   03-036-02p   鳞翅类抵抗
  LLCotton25   02-042-01p   草铵膦耐受
  MON15985   00-342-01p   鳞翅类抵抗
  31807&31808   97-013-01p  溴草腈耐受&鳞翅类抵抗
  19-51a   95-256-01p   磺酰脲耐受
  MON 1445，1698   95-045-01p   草甘膦耐受
MON 531，757，1076   94-308-01p   鳞翅类抵抗
  BXN   93-196-01p   溴草腈耐受
为此，该生物大分子尤其是该核酸如DNA可以经受特异地设计用以检测这些转化事件的一种检测分析。这样的检测分析包括公开在http://gmo- crl.jrc.it/statusofdoss.htm的至少用于事件MON1445、MON531、MON15985、LLCotton25、3006-210-23以及281-24-236的分析。另外的信息如在这些转化事件中的邻近插入的DNA的植物侧翼序列的核苷酸序列(在此基础上可以设计信息特异性DNA检测分析)可以被发现于以下专利申请中：：
可以有利地使用本发明的方法以便鉴定从含有遗传材料(其对这些植物赋予尤其是有利的有用的性状)的棉珠得到的棉纤维。这样的性状的实例是更好的植物生长、增加的对非生物性胁迫(如高或低温、干旱、在土壤中的极端的水或盐或矿物含量)的耐受、增加的开花性能、较早的收割、加速的成熟、商业相关植物部分(例如种子)的更高的收获率、该收获的产品的更高的质量和/或更高的营养价值、以及该收获的产品的更好的储藏稳定性和/或可加工性。进一步并且特别强调的这样的性状的实例是对非生物性胁迫的抵抗，即，该植物的更好的对动物和微生物病害的防御，如对抗昆虫、螨、植物病原真菌、细菌和/或病毒，以及还有该植物的对某些除草活性化合物的增加的耐受性。
可以有利地使用本发明的方法以便鉴定从含有遗传材料的棉珠得到的棉纤维，该遗传材料赋予除草剂耐受性例如草甘膦耐受植株，即，使这些植物对除草剂草甘膦或其盐耐受。可以通过不同的手段使植物对草甘膦耐受。例如，可以通过用编码酶5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的基因转化该植株而获得草甘膦耐受植物。这样的EPSPS基因的实例是细菌鼠伤寒沙门菌的AroA基因(突变体CT7)(Comai et al.，1983，Science 221，370-371)、细菌土壤杆菌的CP4基因(Barry etal.，1992，Curr.Topics Plant Physiol.7，139-145)、编码碧冬茄属EPSPS(Shah et al.，1986，Science 233，478-481)、一种番茄EPSPS(Gasser et al.，1988，J.Biol.Chem.263，4280-4289)、或一种蟋蟀草属EPSPS(WO 01/66704)的多种基因。它还可以是突变的EPSPS，例如在EP 0837944、WO 00/66746、WO 00/66747或WO02/26995中的描述。还可以通过表达编码草甘膦氧化还原酶的一种基因获得草甘膦耐受植物，如在美国专利号5,776,760和5,463,175中的描述。还可以通过表达编码草甘膦乙酰转移酶的一种基因获得草甘膦耐受植物，例如描述于WO 02/36782、Wo03/092360、WO 05/012515以及WO 07/024782中。还可以通过选择含有上述基因的天然发生的突变的植株获得草甘膦耐受植物，例如描述于WO 01/024615或WO03/013226中。。其他的除草剂抵抗植物是例如使其对抑制酶谷氨酰胺合成酶的除草剂(如双丙氨磷、草铵膦或草丁膦)耐受的植物。可以通过表达一种对该除草剂解毒的酶或一种抵抗抑制的突变的谷氨酰胺合成酶获得这样的植物。一个这样的有效的解毒酶是一种编码草铵膦乙酰转移酶的酶(如来自链霉菌的bar或pat蛋白)。表达一种外源性草铵膦乙酰转移酶的植物是例如描述于美国专利5,561,236、5,648,477、5,646,024、5,273,894、5,637,489、5,276,268、5,739,082、5,908,810以及7,112,665中。此外的除草剂耐受植物还是使其对抑制酶羟基苯丙酮酸双氧化酶(HPPD)的除草剂耐受的植物。羟基苯丙酮酸双氧化酶是催化其中对羟基苯丙酮酸(HPP)被转化成尿黑酸盐的多种酶。可以用编码天然发生的抗HPPD酶的一种基因或编码突变的HPPD酶的一种基因转化对HPPD抑制剂耐受的植物，如描述于WO 96/38567、WO 99/24585以及WO 99/24586中。还可以通过用编码某些使得能够形成尿黑酸盐的酶的基因转化植物获得对HPPD抑制剂的耐受性，尽管被HPPD抑制剂抑制了该天然的HPPD酶。这样的植物和基因描述于WO 99/34008和WO02/36787中。还可以通过用除了一种编码HPPD耐受酶的基因之外的一种编码酶预苯酸脱氢酶的基因转化植物来提高对HPPD抑制剂的耐受性，如描述于WO2004/024928中。更进一步的除草剂抵抗植物是那些使其对乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制剂耐受的植物。已知的ALS抑制剂包括例如磺酰脲、咪唑啉酮、三唑并嘧啶类、嘧啶氧(硫)苯甲酸酯类、和/或磺酰基氨基羰基三唑啉酮除草剂。已经知道在ALS酶(还称为乙酰羟酸合成酶)中的不同突变赋予了对不同除草剂以及除草剂的组的耐受，例如描述于Tranel和Wright(2002，Weed Science 50：700-712)中，而且在美国专利号5,605,011、5,378,824、5,141,870、以及5,013,659中。硫酰脲耐受植物以及咪唑啉酮耐受植物的生产描述于美国专利号5,605,011、5,013,659、5,141,870、5,767,361、5,731,180、5,304,732、4,761,373、5,331,107、5,928,937、以及5,378,824、以及国际公开WO 96/33270中。其他的咪唑啉酮耐受植物还描述于例如WO 2004/040012、WO 2004/106529、WO 2005/020673、WO  2005/093093、WO 2006/007373、WO 2006/015376、WO 2006/024351、以及WO 2006/060634中。进一步的硫酰脲以及咪唑啉酮耐受植物还描述于例如WO 07/024782中。
可以有利地使用本发明的方法以便鉴定从含有遗传材料(其赋予对被某些目标昆虫攻击的抗性)的棉珠得到的棉纤维。这样的植物可以通过遗传转化或通过选择含有赋予这样的昆虫抗性的突变的植物而获得并且可以含有至少一个包括一种编码序列的转基因，该编码序列编码以下蛋白：
1)一种来自苏云金杆菌的杀虫晶体蛋白或它的一种杀虫部分，如由Crickmore et al.列举的杀虫晶体蛋白(1998，Microbiology and Molecular BiologyReviews，62：807-813)，由Crickmore et al.(2005)在苏云金杆菌毒素命名法中更新，联机在：http://www.lifesci.sussex.ac.uk/Home/Neil Crickmore/Bt/)，或它的杀虫部分，例如Cry蛋白类Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1F、Cry2Ab、Cry3Aa、或Cry3Bb的蛋白质或其杀虫部分；或
2)一种来自苏云金杆菌的晶体蛋白或它的一个部分，该部分在一个第二其他的来自苏云金杆菌的晶体蛋白或它的一个部分的存在下是杀虫的，如由Cry34和Cry35晶体蛋白构成的二元毒素(Moellenbeck et al.，2001，Nat.Biotechnol.19：668-72；Schnepf et al.2006，Applied Environm.Microbiol.71，1765-1774)；或
3)一种包括来自苏云金杆菌的不同的杀虫晶体蛋白的部分的杂交杀虫蛋白，如一种以上1)的蛋白质的一种杂交体或以上2)的蛋白质的一种杂交体，例如由玉米事件MON98034(WO 2007/027777)生产的Cry1A.105蛋白；或
4)以上A1)至A3)的任意一种蛋白质，其中一些尤其是1至10个氨基酸已经被另外的氨基酸取代以便获得一个对目标昆虫种系的更高的杀虫活性、和/或用以扩大所影响的目标昆虫种系的范围、和/或为了在克隆或转化期间引入编码DNA的变化的缘故，如在玉米事件MON863或MON88017中的Cry3Bb1蛋白、或在玉米事件MIR604中的Cry3A蛋白；
5)一种来自苏云金杆菌或蜡样芽胞杆菌的杀虫分泌蛋白或它的一种杀虫部分，如列举在：http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html的营养期杀虫蛋白(VIP)，例如来自VIP3Aa蛋白类的蛋白质；或
6)一种来自苏云金杆菌或蜡样芽胞杆菌的分泌蛋白，该分泌蛋白在来自苏云金杆菌或蜡样芽胞杆菌的一个第二分泌蛋白的存在下是杀虫的，如由VIP1A和VIP2A蛋白构成的二元毒素(WO 94/21795)；或
7)一种包括来自苏云金杆菌或蜡样芽胞杆菌的不同的分泌蛋白的部分的杂交杀虫蛋白，如以上1)中的蛋白质的一种杂交体或以上2)中的蛋白质的一种杂交体；或
8)以上1)至3)的任意一种蛋白质，其中一些尤其是1至10个氨基酸已经被另外的氨基酸取代以便获得一个对目标昆虫种系的更高的杀虫活性、和/或用以扩大所影响的目标昆虫种系的范围、和/或为了在克隆或转化期间引入编码DNA的变化的缘故(尽管仍然编码一种杀虫蛋白)，如在棉花事件COT102中的VIP3Aa蛋白。
可以有利地使用本发明的方法以便鉴定从含有遗传材料(其赋予对非生物性胁迫的耐受)的棉珠得到的棉纤维。这样的植物可以通过遗传转化获得并且可以含有以下转基因的一种或多种
a.在植物细胞或植物中能够减少聚(ADP核糖)聚合酶(PARP)基因的表达和/或活性的一种转基因，如描述于WO 00/04173或EP 04077984.5或EP06009836.5中。
b.能够减少植物或植物细胞的PARG编码基因的表达和/或活性的一种胁迫耐受增强转基因，例如描述于WO 2004/090140中。
c.用于编码一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸补救合成途径的植物功能性酶的一种胁迫耐受增强转基因，这些酶包括烟酰胺酶、烟酰酸磷酸核糖基转移酶、烟酸单核苷酸腺嘌呤转移酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶或烟酰胺磷酸核糖基转移酶，例如描述于EP 04077624.7或WO 2006/133827或PCT/EP07/002433中。
可以有利地使用本发明的方法以便鉴定从含有遗传材料的棉珠得到的棉纤维，该遗传材料可以改变该纤维的特征如强度、长度、马克隆尼值等，包括描述于WO05/017157(葡聚糖酶沉默基因)、WO04/0655571(甲壳酶编码基因)、WO02/45485和WO08/012058(蔗糖合成酶基因)、WO01/17333(蔗糖磷酸合成酶基因)、WO98/00549(纤维素合成酶基因)、WO06/133827(N-乙酰葡糖胺转移酶基因如甲壳质合成酶或NODC编码基因)中的多种嵌合基因。
本发明的方法的进一步的应用是鉴定植物纤维，如来自包括特定基因的特异等位基因变体的植物的棉纤维。用于鉴定这样的等位基因变体的方法在本领域是熟知的。具体而言，这样的等位基因变体可以用于在来自特殊植物种系的纤维之间进行区分，像例如在来自海岛棉和陆地棉的纤维之间进行区分。作为一个实例，在来自海岛棉和来自陆地棉的葡聚糖酶A亚基因组等位基因之间的多态性(通过在海岛棉中的Gluc1A亚基因组等位基因的编码区中的终止密码子的存在，如描述于未公开的欧洲申请08075514.3中，通过引用结合在此)可以用于在起源于海岛棉和陆地棉的纤维之间进行区分。
在此描述的方法还可以用于分离核酸模板，这些模板可以用于任何基因组表征方案，包括AFLP、READS等等。在应用一种基因组表征方案之前，可以使用本领域已知的方法(如全基因组扩增)扩增这些从成熟的或加工的纤维分离的核酸模板。
在此描述的方法还可以用于协助保证具有特殊规定的特征的商业贸易植物纤维(如棉纤维)的供应的证明程序。通常，这样的证明程序包括通过注册的栽培者的被鉴定的种子的购买记载，由此该棉花种子包括一个特异的基因组构成并且产生一个特定牌子的植物纤维。由注册的栽培者从所述被鉴定的种子生产的收获的植物纤维包通过用所述种子购买记录的交互核对进行了注册和证实并且被优选主要地提供给磨机以便从所述牌子的纤维特别专有地生产纱线、织物或服装。在此描述的方法允许在该供应链中的不同点进行审核。
在此描述的方法还可以应用于从在植物种子上的毛发样(毛状体样)结构(如番茄种子上的毛发或在小麦种子基部上的粗毛(bear hairs))分离生物大分子。
在此描述的方法还可以应用于表征旧的纤维和旧的纺织品材料(例如超过100年旧的纤维和纺织品)的核酸材料。没有将本发明限制于一个特殊的机理和理论，生物材料被保存在旧的纤维中的一个可能性被认为是因为我们已经观察到成熟的纤维被扭绞使得生物材料被“截留“(并且由此“保存”)”在成熟的纤维中。
在此描述的方法还可以应用在法律应用中，因为在一个犯罪现场鉴定的纤维或纺织品材料可以例如通过上述的一个全基因组扩增步骤进行表征，如显示于本申请的实例6中。
如在此使用的“包括“将被解释为指定如提及的陈述的特征、整体、步骤或组分的存在，但是并不预先排除一个或多个特征、整体、步骤或组分、或它们的组的存在或添加。因此，例如一种包括一个核苷酸或氨基酸的序列的核酸或蛋白质可以包括比实际引用的一个序列更多的核苷酸或氨基酸，即被包含在一个更大的核酸或蛋白质中。一种包括功能上或结构上定义的DNA区域的嵌合基因可以包括另外的DNA区域等。
以下非限制性实例描述了用于从成熟的植物纤维以及从加工的纤维分离生物大分子的方法以及它们用于表征或鉴定植物纤维的用途。除非在实例中另行说明，所有的重组DNA技术是根据如描述于Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY andin Volumes 1and 2of Ausubel et al.(1994)Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols，USA中的标准方案来进行的。用于植物分子工作的标准材料和方法描述于由R.D.D.Croy撰写的Plant Molecular Biology Labfax(1993)中，由BIOSScientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications，UK联合出版。
贯穿本说明书和实例对呈现在序列表中的以下序列进行了引用：
SEQ ID NO 1：用于Ghgluc1的PCR扩增的寡核苷酸1
SEQ ID NO 2：用于Ghgluc1的PCR扩增的寡核苷酸2
SEQ ID NO 3：用于NodC的PCR扩增的寡核苷酸1
SEQ ID NO 4：用于NodC的PCR扩增的寡核苷酸2
SEQ ID NO 5：用于扩张蛋白的PCR扩增的寡核苷酸1
SEQ ID NO 6：用于扩张蛋白的PCR扩增的寡核苷酸2
SEQ ID NO 7：用于Ghgluc1的Taqman检测分析的寡核苷酸1(正向引物)
SEQ ID NO 8：用于Ghgluc1的Taqman检测分析的寡核苷酸2(反向引物)
SEQ ID NO 9：用于亚基因组A Ghgluc1等位基因的Taqman检测分析的寡核苷酸3(检测陆地棉Gluc1等位基因的VIC标记的寡核苷酸)
SEQ ID NO 10：用于亚基因组A Ghgluc1等位基因的Taqman检测分析的寡核苷酸4(检测海岛棉Gluc1等位基因的FAM标记的寡核苷酸)
SEQ ID NO 11：用于rpl16的PCR扩增的寡核苷酸1
SEQ ID NO 12：用于rpl16的PCR扩增的寡核苷酸2
SEQ ID NO 13：用于matK的PCR扩增的寡核苷酸1
SEQ ID NO 14：用于matK的PCR扩增的寡核苷酸2
SEQ ID NO 15：用于trnT-trnL的PCR扩增的寡核苷酸1
SEQ ID NO 16：用于trnT-trnL的PCR扩增的寡核苷酸2
SEQ ID NO 17：用于ndhF的PCR扩增的寡核苷酸1
SEQ ID NO 18：用于ndhF的PCR扩增的寡核苷酸2
实例
实例1：从粗棉纤维材料分离核酸。
A.从陆地棉FM966纤维材料分离核酸。
使用常规的用于从植物材料分离基因组DNA的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)程序(Doyle和Doyle，1987，Phytochem.Bull.19，11)使从FM966收获的已经被碾轧并打包的棉纤维材料经受DNA提取。尽管获得了核酸的沉淀物，这个材料不能用于任何进一步的应用，包括PCR扩增或限制性内切酶消化酶切。
该收获的打包的粗棉纤维仍然含有一些杂质如叶残余物以及其他的废料。通过手工清理仔细地去除这些污染材料以便获得一个纯化的纤维部分(以及一个废料部分)。根据制造商的推荐使用由QIAGEN商业化的
Figure BDA0000046350350000201
Plant Mini Kit使该粗纤维材料、该纯化的纤维材料以及该废料部分经受DNA提取(参见
Figure BDA0000046350350000202
PlantHandbook，在www1.qiagen.com/HB/DNeasyPlantMiniMaxi是可获得的)并且使用紫外分光光度法确定该分离的核酸的浓度(表1)。
表1.
Figure BDA0000046350350000203
在一个标准PCR反应中这些分离的核酸被用作模板，使用以下引物以检测一种内源性棉花葡聚糖酶基因(GhGluc1；参见EP 08075514.3，对GhGluc1的不同的等位基因的核苷酸序列通过引用结合在此)：
SE002：ggccgaagccgatcttatctagg(SEQ ID NO：1)
SE003：cggcaacaatcttccatctccag(SEQ ID NO：2)
使用了1μl和5μl的模板核酸两者。PCR扩增的结果在图1中进行了可视化。使用纯纤维(5μl模板)(泳道4)清楚地检测到一个656bp的扩增子(如所期望的)，而使用一个从纯的和粗的纤维材料两者分离的小量(1μl)的核酸可以观察到一个微弱的信号。在较高浓度下使用时，仅从废料所分离的核酸没有扩增信号可以检出并且从未纯化的材料所获得的核酸也没有扩增信号可以检出，表明从污染材料所获得的提取物似乎抑制了从粗纤维材料所获得的核酸的进一步加工。
有趣的是，这项实验证明那些可以被进一步分析的核酸可以从成熟的棉纤维材料提取。该实验还表明可以通过从粗的收获的并且碾轧的棉纤维去除叶废料及其他杂质而进一步提高分离的核酸-DNA的质量。
B.从海岛棉Pima-Y5纤维材料分离核酸。
如上在1.A冲的描述将来自海岛棉Pima 5Y的4年大的旧的粗棉纤维材料连同陆地棉FM966棉纤维材料一起处理。在如在1.A中的描述将所获得的核酸用作PCR反应中的模板。结果在图2中进行了可视化。
虽然海岛棉纤维是更结实的并且具有一种不同于陆地棉纤维的结构，结果证明还可以从这些纤维分离包括可加工的DNA的核酸。有趣的是，这些纤维同样已经在非最佳条件下储存了若干年，表明可以从旧的纤维材料获得可加工的DNA或其他的核酸。
C.其他棉内源性基因的扩增。
将所分离的这些核酸也用作在标准PCR反应中的模板，该标准PCR反应使用对其他的内源性基因特异的引物，如以下从扩张蛋白编码基因扩增一种299bp片段的引物：
Kl51：gggagcttgtggttatggaaacc(SEQ ID NO：5)
Kl52：cagggacgatcccagctcgatattc(SEQ ID NO：6)
使用对于其他内源性基因的这些其他引物还可以检出所预期的多个扩增子。
D.使用其他裂解缓冲液和方案从棉纤维材料分离核酸。
如在部分1.A中的描述通过去除污染叶废料及其他杂质而纯化粗棉纤维材料。使用由QIAGEN商业化的
Figure BDA0000046350350000211
Plant Mini Kit或由PROMEGACORPORATION商业化的基因组DNA纯化试剂盒或常规的CTAB程序(Doyle and Doyle，1987，Phytochem.Bull.19，11)从该纯化的纤维材料提取核酸。使用紫外分光光度法确定所获得的核酸的浓度(表2)。
表2.
Figure BDA0000046350350000221
＊注释：高浓度读数可能是由于RNA酶处理的缺乏。
将所分离的核酸用作在一种标准PCR反应中的模板，该标准PCR反应使用以下引物以检测一种内源性的棉葡聚糖酶基因(GhGluc1；对于GhGluc1的不同等位基因的核苷酸序列参见通过引用结合在此的EP 08075514.3)：
SE002：ggccgaagccgatcttatctagg(SEQ ID NO：1)
SE003：cggcaacaatcttccatctccag(SEQ ID NO：2)
使用1μl和5μl的模板核酸两者。PCR扩增的结果在图3中进行了可视化。虽然通过
Figure BDA0000046350350000222
和CTAB程序所分离的这些核酸(5μl反应物)的明显较高的浓度对该PCR反应具有负面效应，使用通过任何方法分离的模板核酸观察到了所期望的DNA扩增子。
虽然具有一个较低的效率，我们观察到还可以通过将这种纤维材料与水(H2O)孵育持续一定量的时间(例如清理的纤维材料在一定体积的水存在下孵育至少4小时)而从该清理的纤维材料提取核酸。
实例2：从纺织品分离核酸。
A.从棉布分离核酸。
从成熟的棉纤维成功分离可被进一步加工的核酸(如DNA)促使了一个分离生物大分子如核酸的企图，特别是从在纺纱和织造之后的纤维分离可加工的DNA。为此，通过解开一块棉布，剪切成小的碎片并且在5ml的裂解缓冲液(AP1缓冲液)中在65℃下孵育至少30分钟或在室温下过夜而将纱线分离。将缓冲液挤出该材料并且将500μl裂解液转移到一种微量离心管并且根据制造商的推荐进一步处理，即：
■加入130μl AP2缓冲液、混合并且在冰上孵育5分钟
■在13000rpm下离心5分钟
■将该液相转移到lilac QIAshredder微型旋转柱上
■在13000rpm下离心2分钟
■将该液体(flow through)转移到一种新的微量离心管(未干扰沉淀物)；
■加入800μl AP3/E缓冲液并且混合
■转移650μl到该
Figure BDA0000046350350000232
微型旋转柱上并且在8000rpm下离心1分钟、丢弃液体
■用所剩余的样品重复这个步骤；丢弃该收集管并且将该柱放置在一种新的2ml收集管中
■用500μl AW缓冲液洗涤该柱并且在8000rpm下离心1分钟、丢弃该液体
■用500μl AW缓冲液洗涤该柱并且在13000rpm下离心2分钟、丢弃该液体
■将该柱放置在一种没有遗留乙醇的1.5ml微量离心管中
■加入50μl水到该柱并且在室温下孵育至少5分钟
■在8000rpm下离心1分钟。0}在4℃下储存该DNA。
在一个PCR反应(使用实例1.A的多个引物)中将1μl和5μl样品用作模板DNA。结果在图4中进行了可视化。当使用在孵育过夜之后的核酸样品时，可以检出669bp的所期望的扩增子，这表明该方案可用于从在纺纱和织造之后的棉纤维分离核酸。在孵育过夜之后比孵育30分钟具有的显著更强的PCR信号表明前者方案产生了更高浓度的可加工的DNA。
B.从具有不同织法的纺织品分离核酸。
该核酸分离方案还应用于具有不同织法的成品服装(即，它已经经历不同的加工)。为此，从一种棉长袖衬衫(机织)以及一种棉马球衬衫(针织)上剪下碎片，并且如在实例2A中处理(除在裂解缓冲液中进行孵育过夜、或甚至延长到6天的孵育以外)。在所分离的核酸上进行如在实例2.A中所描述的一种PCR反应并且将结果如在图5中进行了可视化。
在使用从织物两者所分离的核酸样品进行PCR扩增之后检出了所期望的扩增子。再次，其中在裂解缓冲液中的孵育已经被延长的样品中的信号是更强的。
实例3：从特种纤维分离核酸。
从包括一种N-乙酰葡糖胺转移酶嵌合基因(“NodC”基因)的转基因棉株分离并且纯化成熟的纤维，如在WO2006/136351实例1中的描述。根据制造商的推荐使用由QIAGEN商业化的Plant Mini Kit从这些纯化的纤维提取物分离核酸(参见在www1.qiagen.com/HB/DNeasyPlantMiniMaxi下可获得的
Figure BDA0000046350350000242
植物手册)并且使用紫外分光光度法确定所分离的核酸的浓度(表3)。
表3.
  样品   ng/ul   A260   A280   260/280   260/230
  NodC1   7.95   0.159   0.105   1.51   0.56
  NodC2   7.62   0.152   0.101   1.51   0.56
分离的这些核酸也用作在标准PCR反应中的模板，该标准PCR反应使用对其他内源性基因特异的引物，如以下从NodC编码基因扩增一种1224bp片段的引物：
Idb093：cgtttttcactcatcgtcgttttcaagtgtcgtagatgtgatcggtttgcttgcg(SEQ ID NO：3)
Idb126：ggcgcgccttaggaactctcgcgtgatagccac(SEQ ID NO：4)
使用了1μl和5μl的模板核酸两者。PCR扩增的结果在图6中进行了可视化。可以在各样品中观察到所期望的指示该转基因的存在的DNA扩增子。
实例4：在不同的纤维类型之间的自动化和区分。
如在未公开的欧洲申请08075514.3中的描述(通过引用结合在此)，来自海岛棉的葡聚糖酶1A亚基因组等位基因与来自陆地棉的葡聚糖酶1A亚基因组等位基因不同(通过在前者中Gluc1A亚基因组等位基因的编码区中一种终止密码子的存在)。这种多态性可用于在来自具有该海岛棉Gluc1等位基因或该陆地棉Gluc1等位基因植物的棉纤维之间进行区分。为此，设计了一种
Figure BDA0000046350350000251
分析，由此所使用的扩增一种携带该多态性的DNA片段的寡聚核苷酸引物是：
正向引物：GCTTTTGGAAGCGATATAACATCGA(SEQ ID NO：7)
反向引物：GGCATAGGCAAAATAAGGGTACACA(SEQ ID NO：8)
通过监测以下检测该多态性的荧光标记引物的降解而检测该多态性：
VIC-AATCCTGTCGAACCAG(陆地棉等位基因)(SEQ ID NO：9)
FAM-ATCCTGTCAAACCAG(海岛棉等位基因)(SEQ ID NO：10)
将这些引物用在一种qPCR装置中，增加循环次数高达60并且确定仅在终点的荧光。作为核酸模板，从海岛棉纤维(PIMA)或陆地棉纤维(FM966)分离的DNA混合物按以下比率使用：100％PIMA、75％PIMA/25％FM966、50％PIMA/50％FM966、25％PIMA/75％FM966、100％FM966。结果示意地表示在图7中。
X轴表明陆地棉Gluc1等位基因的存在，而Y轴表明海岛棉Gluc1等位基因的存在。在从PIMA纤维分离的DNA中，仅检测到海岛棉Gluc1等位基因。在从PIMA纤维分离的DNA中，仅检测到陆地棉Gluc1等位基因。在混合DNA样品中，该Taqman分析允许不同比率的等位基因两者的检测。
在一个进一步的步骤中，同样的RT-PCR类型分析用于分析来自棉纺织品以及来自一种FM966包的纤维材料的核酸样品。结果表示在图8中。在从该FM966包以及从该马球衬衫提取的核酸中，仅检测到陆地棉Gluc1等位基因，这表明所使用的棉材料唯一地起源于陆地棉类型材料。
虽然该分析可能需要进一步优化，这种优化清楚地是在技术人员的领域之内的。
实例5：从棉纤维分离的质体基因组的表征。
由于出乎意料发现可以从成熟的棉纤维分离并且表征基因组DNA，我们研究了在从这些纤维提取的DNA池中鉴定质体DNA的可能性。
虽然已经显示白色体质体存在于发育棉纤维之中(Ryser U.(1985)Europeanjournal of cell biology 39，pp.236-256)，没有预期它们存在于成熟的棉纤维中。白色体与叶绿体由于具有同样的基因组而相似-因为它们分化自相同的祖细胞类型-但是白色体因为淀粉含量的高积聚而特殊化。
Cronn等(2002)American Journal of Botany 89(4)：707-725公开了扩增该质体基因组的4个基因(rpl16、matK、trnT-trnL、以及ndhF)的引物组合。在一个第一步骤中，通过在从棉叶分离的DNA上进行PCR分析我们优化了用于扩增这四个基因的公开的引物组合。在一个下一步骤中，将每个基因的优化的引物组合用于扩增从一种从微型棉包(被鉴定的FiberMax棉)获得的纤维DNA样品。出人意料地，我们显示了来自这种纤维DNA样品的4个PCR片段的扩增。在TOPO平端载体中亚克隆，随后通过这些片段的序列分析证实这四个片段起源于该质体基因组。对于rpl16、matK以及trnT-trnL，该测序产生一种独特的共有序列，对于ndhF获得了若干共有序列。
由于陆地棉以及海岛棉的完全叶绿体序列是在EMBL数据库(登录号DQ345959是珂字棉310FR(陆地棉)的叶绿体DNA序列，并且登录号AP 009123是海岛棉的叶绿体DNA序列)中是可获得的，将获得的序列与该公开的序列进行比对是可能的。发现获得的序列与该公开的陆地棉序列是100％一致的(除简并引物位点外)。这证实在该棉包中的纤维源自于陆地棉。现在这些特异质体序列的成功的分子表征对于纤维DNA的基因分型提供了新的时机。同样更旧的纤维样品可以对质体序列进行探查并且它们的关系可以在进化以及育种过程中得以解释。
PCR条件：
2μl模板
1.5μl正向引物(10μM)
1.5μl反向引物(10μM)
21μl MQ
1μl dNTP
10μl 10X HF缓冲液
0.5μl Phusion
12.5μl MQ
PCR程序
98℃下30秒
98℃下10秒
60℃下30秒
72℃下60秒
35次循环
72℃下10分钟
4℃下保持
引物组合：
rpl16        F71：gctatgcttagtgtgtgactcgtt(SEQ ID No 11)
             R1516：cccttcattcttcctctatgttg(SEQ ID No 12)
matK         matKF3：ctaatggatcaacagaawcgtttg(SEQ ID No 13)
             trnKR：aactagtcggatggagtag(SEQ ID No 14)
trnT-trnL    trnL2：aatattactgactccmttttkattttckag(SEQ ID No 15)
             trnB：tctaccgatttcgccatatc(SEQ ID No 16)
ndhF         5’Fnew：gaatatgcatggatcatacc(SEQ ID No 17)
             1318R：cgaaacatataaaatgcrgttaatcc(SEQ ID No 18)
实例6：从棉纤维分离的核酸的基因组的表征。
前面的实例已经有力地显示了可以从成熟的棉纤维以及从它们的下游产品分离并且表征DNA。在下一步骤中，我们怀疑是否所分离的纤维DNA是全棉基因组的一种真实表示或者它是否仅仅表示该棉基因组的一部分。因为一部分基因组等效物将产生不可靠的以及不完全的分析结果，它对于性状或基因型测试将不会是有用的。第一挑战是克服从棉纤维获得的DNA(作为用于分析测试的起始材料)的有限量。选择了全基因组扩增(WGA)的方法来克服这种限制。以前未曾使用过WGA来扩增一种多倍体基因组(如棉)用于基因分型以及性状测试。一个DNA扩增步骤对于提高起始纤维DNA材料的量是重要的，但关键的是不要引入一种基因组偏差(genome bias)，它有时对于一个WGA步骤是固有的，如由Giardina等(2009)BMC Genomics Apr 14，10：159的报告。我们着手研究了在一种功能性Taqman分析中分离的纤维DNA的一个WGA步骤的可靠性。另外，在基本上相同的Taqman分析中，将WGA扩增的纤维DNA的质量与相同商业棉纤维来源的WGA扩增的子叶DNA进行了比较。
由来自CropMark Direct农场的K.Merritt提供了大约500克的FM9063B2F纤维(每一样品500克，在3个小的棕色包中；3个重复取自样品种类不同的包，包号721134350138、721134350154、721134350156)。该纤维来自于在该2008至2009年之间的棉花季节生长的棉花并且被列出用于FiberMax证明程序。
由于我们已经确定在纤维中的污染物对用于下游测试的纤维DNA的使用可以具有显著的影响，我们手工清理了这些纤维。这是通过伸展少量纤维(例如1.5克)由此用镊子将大部分碎片去除直到没有可以用裸眼看到的碎片为止来完成的。
用Qiagen DNeasy Plant Mini kit经以下步骤进行DNA提取：
●取1克清理的(没有叶废料)成熟的棉纤维并且将它放在一种50mlFalcon管中。用清洁的剪刀将这些纤维切割几次。
●加入5ml AP1裂解缓冲液(Qiagen目录1014630)和100μl核糖核酸酶A(10mg/ml)。使用一种研杵以使在样品与缓冲液之间的接触均匀。
●在65℃下孵育20分钟，在孵育期间使用一种15ml的管以混合该材料2到3次。
●使用一种15ml的管以挤压该材料以便转移500μl裂解液进入一种2ml的微量离心管中。取3等分部分并且用作复本。
●对各等分部分加入130μl AP2缓冲液，混合并且在冰上孵育5分钟。
●在13000rpm下离心5分钟。
●将该液相转移到lilac QIAshredder微型旋转柱上。
●在13000rpm下离心2分钟。
●将该液体转移到一种新的微量离心管(未干扰该沉淀物)。
●加入800μl AP3/E缓冲液并且混合。
●转移650μl到该微型旋转柱上并且在8000rpm下离心1分钟，丢弃该液体。
●用剩余的样品重复这个步骤。丢弃该收集管并且将该柱放置在一种新的2ml收集管中。
●用500μl AW缓冲液洗涤该柱并且在8000rpm下离心1分钟，丢弃该液体。
●用500μl AW缓冲液洗涤该柱并且在13000rpm下离心1分钟，丢弃该液体以及收集管。
●将该柱放置在一种没有遗留乙醇的1.5ml微量离心管中。
●加入50μl MQ水到该柱上并且在室温下孵育至少5分钟。
●在8000rpm下离心1分钟。在4℃(短期)或-20℃(长期)下储存该DNA。
如下进行FM 9063B2F的子叶DNA提取。使FM9063B2F的50个种子在一种28℃的种子发芽器中用发芽纸和水进行发芽。收集子叶并且用硅干燥。提取子叶DNA。将提取的子叶DNA合并到五个1.5ml管中。
用Sigma’s
Figure BDA0000046350350000292
全基因组扩增(WGA)试剂盒(WGA2)经以下步骤进行全基因组扩增：
在一种PCR管中加入1μl的10x片段化缓冲液到10μl的提取的DNA。
●在一台热循环仪中在95℃下孵育2分钟并且在冰上冷却。
●加入2μl的1x库制备缓冲液。
●加入1μl的库稳定溶液并且混合。
●在一台热循环仪中在95℃下孵育2分钟并且在冰上冷却。
●加入1μl的库制备酶并且混合。
●使用程序WGA1在热循环仪中孵育
在16℃下20分钟
在24℃下20分钟
在37℃下20分钟
在75℃下5分钟
4℃直至结束
●加入以下预混合液：
7.5μl 10x扩增预混合液
47.5μl无核酸酶水
5μl WGA聚合酶
●使用程序WGA2在热循环仪中孵育
在95℃下3分钟
14个循环：在94℃下15秒
在65℃下5分钟
4℃直至结束
将5μl放在一种1％琼脂糖凝胶上以检查该WGA DNA的质量。在100与1000bp之间应当存在一种拖尾(smear)。
所有的WGA反应(纤维与子叶)被证明是成功的。
可任选地是将FM9063B2F的子叶与纤维的WGA扩增的DNA以下列方式进一步纯化。将来自5个样品的WGA DNA合并进入2ml管(大约240ul DNA)，加入24ul 3M乙酸钠(pH 5.2)并且混合，加入800ul 100％的冰冷的乙醇并且彻底混合、并且在-20℃下过夜，在-20℃在12000rpm下离心10分钟，小心地去除上清液，用800ul 70％的冰冷的乙醇洗涤DNA沉淀物、在-20℃在12000rpm下离心2分钟，小心地去除上清液，将管放在65℃培养箱中干燥15分钟，在65ul1x TE中重悬DNA。
在这些扩增的DNA样品上进行两个不同的Taqman分析。一个Taqman分析的目的在于鉴定40个不同的SNP并且另一个Taqman分析的目的在于鉴定3个不同的性状：Bollgard II(Mon531)、Bollgard(MON15985)以及Flex(MON88913)。这些Taqman分析的在4个不同的DNA样品上进行：1)WGA扩增的从FM9063B2F纤维提取的DNA，2)WGA扩增的从子叶FM9063B2F提取的DNA，3)FM9063B2F纤维的纯化的WGA扩增的DNA，并且4)FM9063B2F子叶的纯化的WGA-扩增的DNA。由于众所周知的是，在物理尺寸方面，棉A亚基因组(At)比棉D亚基因组(Dt)大50％，从该A基因组中选出了23个SNP而从该D基因组中选出了17个SNP。
在纯化的FM9063B2F WGA扩增的纤维DNA中的Taqman分析中，观察到可以成功地检出所有的40个SNP。另外，用该纯化的FM9063B2F子叶WGA DNA以及用粗的(即未纯化的)FM9063B2F子叶DNA获得了用于检测同样的40个SNP的相同的结果。用于检测Bollgard II(Mon531)、Bollgard(MON15985)、以及Flex(MON 88913)的Taqman分析也被证明以便在纤维与子叶的WGA扩增的DNA样品之间给出相同的结果。根据Yang et al(2005)J.Agric.Food Chem.53，6222-6229分析了Mon531。根据Lee et al(2007)J.Agric.Food Chem.55，3351-3357分析了Mon15985与Mon88913。
因此，可以使用WGA扩增的棉纤维DNA作为一种可靠的来源用于成功的分子标记确定，因为作为在WGA扩增的叶DNA上进行的一种Taqman分析，它提供了相同的结果。另外，可以使用WGA扩增的棉纤维DNA作为一种可靠的来源用于成功的性状确定，因为作为在WGA扩增的叶DNA上进行的一种Taqman分析，它提供了相同的结果。
虽然通常应当将一种更高数目的SNP(大约300)用于一种特异的棉品种的表征和鉴定，本实例显示通过使用WGA扩增的棉纤维DNA这种方法是可行的。
实例7：从棉纤维材料分离的其他的生物大分子。
使用用于分离的不同方案的提取物的紫外分光光度法表明这些提取物不是纯粹由DNA组成的，并且可能含有其他的生物大分子。使用一种Bradford分析，发现了低浓度(大约10ng/μl)的蛋白质。另外，这些纤维提取物含有不同浓度的对核糖核酸酶I抵抗的小RNA，我们将其鉴定为微RNA。
Figure IDA0000046350400000011
Figure IDA0000046350400000021
Figure IDA0000046350400000051
Figure IDA0000046350400000061

Claims (25)

1.一种用于表征成熟的植物纤维或加工的植物纤维的方法，该方法包括以下步骤：
a.从所述植物纤维分离天然发生在所述植物纤维中的除多糖或木质素以外的一种生物大分子；以及
b.表征编码在所述生物大分子的单体的序列中的信息。
2.一种用于鉴定成熟的植物纤维或加工的植物纤维的方法，该方法包括以下步骤：
a.从所述植物纤维分离天然发生在所述植物纤维中除多糖或木质素以外的一种生物大分子；以及
使所述生物大分子经受对所述植物纤维特异的一种检测分析。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述植物纤维是一种种子纤维。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述植物纤维是一种棉纤维。
5.如权利要求2至4的任一项所述的方法，其中所述生物大分子是选自下组，其组成为：多肽、蛋白质、核酸、DNA、RNA、单链RNA、以及双链RNA。
6.如权利要求2至5的任一项所述的方法，其中所述检测分析是一种基于聚合酶链反应的检测分析。
7.如权利要求2至5的任一项所述的方法，其中所述检测分析是一种基于抗体的检测分析。
8.如权利要求2至5的任一项所述的方法，其中所述检测分析是一种基于核酸杂交的检测分析。
9.如权利要求2至8的任一项所述的方法，其中所述检测分析检测存在于产生这些纤维的植物的基因组中的嵌合基因的存在或缺乏。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述嵌合基因包括选自N-乙酰葡糖胺转移酶、草胺膦乙酰转移酶、EPSPS、羟基苯丙酮酸双氧化酶、苏云金杆菌晶体蛋白的一种杀虫部分、聚(ADP核糖)聚合酶、聚(ADP核糖)葡萄糖水解酶、蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶、葡聚糖酶、纤维素合成酶、甲壳酶、扩张蛋白、胼胝质合成酶、激酶、烟酰胺酶、烟酰酸磷酸核糖基转移酶、烟酸单核苷酸腺嘌呤转移酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶或烟酰胺磷酸核糖基转移酶的一个编码区或部分或其反义部分。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述检测分析是一种事件特异性检测分析。
12.如权利要求2至8的任一项所述的方法，其中所述检测分析检测存在于产生这些纤维的植物的基因组中的特异等位基因的存在或缺乏。
13.如权利要求2至12的任一项所述的方法，其中所述纤维存在于纱线、织物、组织或成品服装中。
14.一种用于分析产生纤维的植物的基因组的方法，该方法包括以下步骤：
a.从所述植物的成熟的或加工的纤维分离核酸，所述核酸是天然发生在所述植物纤维中的；以及
b.使所述核酸经受一种基因组分析方案。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述核酸是选自下组，其组成为：DNA、RNA、单链RNA以及双链RNA。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述核酸是DNA。
17.如权利要求16所述的方法，其中在使所述核酸经受一种基因组分析方案之前使所述分离的DNA经受一个全基因组扩增步骤。
18.如权利要求14至17的任一项所述的方法，其中所述方法应用于成熟的纤维或旧的纱线、织物或成品服装上。
19.一种用于从成熟的植物纤维或加工的植物纤维分离核酸的方法，该方法包括以下步骤：
a.从收获的成熟的植物纤维去除叶和茎废料；并且
b.在一种含有洗涤剂、蛋白酶以及盐类的裂解缓冲液中孵育所述植物纤维持续一个延长的时间，优选4到100小时的一段时期；以及
c.根据标准核酸分离方法加工所述裂解缓冲液并且分离所述DNA。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述核酸是DNA。
21.一种用于从机织的或针织的织物分离核酸的方法，该方法包括以下步骤：
a.解开所述织物的线；
b.在一种含有洗涤剂、蛋白酶以及盐类的裂解缓冲液中孵育所述线持续一个延长的时间、优选4到100小时的一段时期；以及
c.根据标准核酸分离方法加工所述裂解缓冲液并且分离所述核酸。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述核酸是DNA。
23.根据权利要求1至18的任一项所述一种方法在证明贸易的植物纤维的个性特征的一个过程中的用途。
24.一种用于确定在成熟的或加工的植物纤维的一种混合物中不同植物纤维的相对量的方法，该方法包括以下步骤：
a.从所述植物纤维的混合物分离天然发生在所述植物纤维中的除多糖或木质素以外的一种生物大分子；
b.使所述生物大分子经受对所述植物纤维的每一种特异的检测分析；以及
c.确定这些纤维各自的相对含量。
25.一种证明贸易的棉纤维的个性特征的方法，所述方法包括：
a.通过注册的栽培者记载被鉴定的棉花种子的购买，所述棉花种子包括特异的基因组构成并且产生一个特殊牌子的棉纤维；
b.从所述被鉴定的棉花种子登记由所述注册的栽培者生产的粗棉纤维包作为所述特殊牌子的棉纤维；
c.通过与所述种子购买记载交互核对证实所述包；
d.优选主要地向磨机提供所述注册的包以便从所述牌子的棉纤维特别专有地从所述牌子的棉纤维生产纱线、织物或服装；
e.使用根据权利要求1至18的任一项所述的方法在一个或多个步骤中审核所述牌子的棉纤维的个性特征。
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