CN104427863B - 除草剂耐受性棉花事件pDAB4468.19.10.3 - Google Patents

除草剂耐受性棉花事件pDAB4468.19.10.3 Download PDF

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Abstract

棉花事件pDAB4468.19.10.3包括编码AAD‑12和PAT的基因，为含有该事件的棉花作物提供了除草剂耐受性，并实现了用于作物保护的方法。

Description

除草剂耐受性棉花事件pDAB4468.19.10.3
优先权声明
本专利申请要求获得于2012年1月23日提交的美国临时专利申请系列No.61/589,594的权益。
背景
当在转基因植物中表达时，编码AAD-12(芳氧基链烷酸(aryloxyalkanoate)双加氧酶-12)的基因能够赋予针对苯氧基乙酸类除草剂，2,4-D和MCPA，和吡啶基氧基乙酸类除草剂，绿草定和氟草烟，的产业水平的耐受性。当在转基因植物中表达时，编码PAT(膦丝菌素乙酰转移酶(phosphinothricin acetyltransferase))的基因能够引入针对膦丝菌素除草剂(草胺膦)的耐受性。PAT已经成功地在棉花中表达，同时用作生产转基因作物的可筛选标记并在转基因植物中引入针对除草剂草胺膦的商业水平的耐受性。
已知转基因在植物中的表达受到其在植物基因中定位的影响，这可能是由于染色质的结构(例如异染色质)或者转录调节元件(例如增强子)靠近整合位点(Weising etal.,Ann.Rev.Genet.22:421-477,1988)。与此同时，转基因在基因组中的不同位点的存在会以不同的方式影响植物的整体表型。由于这个原因，经常需要筛选大量的转基因事件，以便鉴定以所导入的感兴趣的基因的最佳表达为特征的特定转基因事件。例如，已经在植物和其它生物中观察到，导入基因的表达水平在不同事件中可能有很大的变化。也可能存在空间或时间表达模式的差异，例如，转基因在各种植物组织中的相对表达的差异，这可能不符合根据存在于所导入基因构建体中的转录调控元件所预期的模式。由于这个原因，通常产生数百至数千个不同的事件并对这些事件进行筛选，以便获得具有为产业目的所期望的转基因表达水平和模式的单一事件。具有期望的转基因表达水平或模式的事件可用于使用传统的育种方法通过有性异交(outcrossing)将转基因渐渗(introgressing)到其它遗传背景中。这种杂交的后代保持原有转化子的转基因表达特征。这一策略被用于在若干已经良好适应局部生长条件的品种中确保可靠的基因表达。
理想的是，能够检测特定事件的存在，以便确定有性杂交的后代中是否含有感兴趣的转基因或感兴趣的转基因群。此外，用于检测特定事件的方法将有助于遵从，例如，要求上市前审批(pre-market approval)和对从重组作物衍生的食品或纤维进行标注的法规，或者有助于进行环境监测，监测田间作物的性状，或者监测从作物的收获品衍生的产品，以及用于确保相关方遵从有关法规或合同条款。
有可能通过任何本领域已知的核酸检测方法来检测转基因事件的存在，包括但不仅限于，聚合酶链式反应(PCR)或使用核酸探针的DNA杂交。这些检测方法一般聚焦于频繁使用的遗传元件，例如启动子、终止子、标志物基因等，因为对于许多DNA构建体，编码区是可以互换的。其结果是，这些方法并不能用于区分不同的事件，特别是那些使用相同的DNA构建体或非常相似的构建体产生的事件，除非邻近所插入异源DNA的侧翼DNA的DNA序列是已知的。例如，美国专利申请2006/0070139中描述了一种关于玉米事件DAS-59122-7的事件特异性PCR测定法。建立一种用于鉴定棉花事件pDAB4468.19.10.3的简单而有判别力的方法是令人期待的。
公开
本发明的实施方案涉及一种新的抗除草剂的转基因棉花转化事件，其被命名为棉花事件pDAB4468.19.10.3，其包括如本文中描述的aad-12和pat，它们被插入到棉花细胞基因组内的一个特定位点。代表性的棉花种子已保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，其登录号在第[0032]段中示明。包含该事件的棉花植物的DNA包括本文中所述的、表征插入DNA在棉花基因组内的位置的接点/侧翼序列。SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2能鉴别棉花事件pDAB4468.19.10.3。更具体地，SEQ ID NO:1的bp1354/1355处的接点和SEQ ID NO:2的bp168/169处的接点的周围序列能鉴别棉花事件pDAB4468.19.10.3。下面的段落[0013]描述了包含这些接点的序列的实例，这些接点是含有棉花事件pDAB4468.19.10.3的棉花植物的DNA的特征。
在一个实施方案中，本发明提供了一种抗苯氧基乙酸类除草剂如2,4-D和MCPA的棉花植物或其部分。在另一个实施方案中，本发明提供了一种抗吡啶基氧基乙酸类除草剂如绿草定和氟草烟的棉花植物或其部分。在一个额外的实施方案中，本发明提供了一种具有包含一个或多个选自下组的序列的基因组的棉花植物：SEQ ID NO:1的bp1329-1380；SEQID NO:1的bp1304-1405；SEQ ID NO:1的bp1254-1455；SEQ ID NO:1的bp1154-1555；SEQ IDNO:1的bp1054-1655；SEQ ID NO:2的bp143-194；SEQ ID NO:2的bp118-219；SEQ ID NO:2的bp68-269；和SEQ ID NO:2的bp1-369，和其互补物。在另一个实施方案中，本发明提供了这类植物的种子。
在另一个实施方案中，本发明提供了耐受如下化合物的棉花植物或其部分，该化合物被转化成苯氧乙酸类生长素除草剂如2,4-D和MCPA(例如2,4-DB、MCPB等)。在进一步的实施方案中，本发明提供了耐受如下化合物的棉花植物或其部分，该化合物可以被转化成吡啶基氧基乙酸类除草剂如绿草定和氟草烟(例如绿草定B、氟草烟B等)。苯氧乙酸生长素和吡啶基氧基乙酸除草剂中存在的丁酸部分可以通过β-氧化被转变成除草剂的植物毒素形式。丁酸形式的除草剂本身是无除草活性的(nonherbicidal)。它们在易感植物(例如棉花植物)内通过β-氧化被转变成其各自的酸形式，正是乙酸形式的除草剂有植物毒性。不能够进行快速β-氧化的植物不会受到丁酸除草剂的伤害。然而，能够进行快速β-氧化并能够将丁酸除草剂转变成乙酸形式的植物可以随后被AAD-12保护。因此，本发明提供了具有包含一个或多个选自下组的序列的基因组的棉花植物：SEQ ID NO:1的bp1329-1380；SEQ IDNO:1的bp1304-1405；SEQ ID NO:1的bp1254-1455；SEQ ID NO:1的bp1154-1555；SEQ IDNO:1的bp1054-1655；SEQ ID NO:2的bp143-194；SEQ ID NO:2的bp118-219；SEQ ID NO:2的bp68-269；和SEQ ID NO:2的bp1-369，和其互补物，它们能鉴别棉花事件pDAB4468.19.10.3的存在。在另一个实施方案中，本发明提供了这类植物的种子。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于控制棉花作物中杂草的方法，包括向棉花作物施用苯氧乙酸除草剂例如2,4-D和MCPA，其中该棉花作物包括具有包含一个或多个选自下组的序列的基因组的棉花植物：SEQ ID NO:1的bp1329-1380；SEQ ID NO:1的bp1304-1405；SEQ ID NO:1的bp1254-1455；SEQ ID NO:1的bp1154-1555；SEQ ID NO:1的bp1054-1655；SEQ ID NO:2的bp143-194；SEQ ID NO:2的bp118-219；SEQ ID NO:2的bp68-269；和SEQ ID NO:2的bp1-369，和其互补物，它们能鉴别棉花事件pDAB4468.19.10.3的存在。在另一个实施方案中，本发明提供了用于控制棉花作物中杂草的方法，包括向棉花作物施用吡啶基氧基乙酸除草剂如绿草定和氟草烟，其中该棉花作物包括具有包含一个或多个选自下组的序列的基因组的棉花植物：SEQ ID NO:1的bp1329-1380；SEQ ID NO:1的bp1304-1405；SEQ ID NO:1的bp1254-1455；SEQ ID NO:1的bp1154-1555；SEQ ID NO:1的bp1054-1655；SEQ ID NO:2的bp143-194；SEQ ID NO:2的bp118-219；SEQ ID NO:2的bp68-269；和SEQ ID NO:2的bp1-369，和其互补物，它们能鉴别棉花事件pDAB4468.19.10.3的存在。棉花事件pDAB4468.19.10.3中存在的aad-12基因赋予对苯氧乙酸除草剂和吡啶基氧基乙酸除草剂的耐受性。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于控制棉花作物中杂草的方法，包括向棉花作物施用草胺膦除草剂，所述棉花作物包括具有包含一个或多个选自下组的序列的基因组的棉花植物：SEQ ID NO:1的bp1329-1380；SEQ ID NO:1的bp1304-1405；SEQ ID NO:1的bp1254-1455；SEQ ID NO:1的bp1154-1555；SEQ ID NO:1的bp1054-1655；SEQ ID NO:2的bp143-194；SEQ ID NO:2的bp118-219；SEQ ID NO:2的bp68-269；和SEQ ID NO:2的bp1-369，和其互补物，它们能鉴别棉花事件pDAB4468.19.10.3的存在。棉花事件pDAB4468.19.10.3中存在的pat基因引入对草胺膦除草剂的耐受性。
在另一个实施方案中，本发明提供了在含有棉花DNA的样品中检测棉花事件pDAB4468.19.10.3的方法，所述方法包括：
(a)使所述样品与第一引物和第二引物接触，第一引物的长度为至少10bp并且选择性结合SEQ ID NO:1的bp1-1354内的侧翼序列或其互补物，第二引物的长度为至少10bp并且选择性结合SEQ ID NO:1的bp1355-1672内的插入序列或其互补物；和
(b)对所述引物之间产生的扩增子进行测定；或
(c)使所述样品与第一引物和第二引物接触，第一引物的长度为至少10bp并且选择性结合SEQ ID NO:2的bp1-168内的插入序列或其互补物，第二引物的长度为至少10bp并且选择性结合SEQ ID NO:2的bp169-2898内的侧翼序列或其互补物；和
(d)对所述引物之间产生的扩增子进行测定。
在另一个实施方案中，本发明提供了检测棉花事件pDAB4468.19.10.3的方法，包括：
(a)使所述样品与第一引物和第二引物接触，第一引物与选自下组的侧翼序列选择性结合：SEQ ID NO:1的bp1-1354和SEQ ID NO:2的bp169-2898，及其互补物，第二引物与SEQ ID NO:3或其互补物选择性结合；
(b)使所述样品进行聚合酶链式反应；和
(c)对所述引物之间产生的扩增子进行测定。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种棉花植物育种的方法，包括：将第一植物与第二棉花植物杂交产生第三棉花植物，所述第一植物包含如下的DNA，该DNA含有一个或多个选自下组的序列：SEQ ID NO:1的bp1329-1380；SEQ ID NO:1的bp1304-1405；SEQ IDNO:1的bp1254-1455；SEQ ID NO:1的bp1154-1555；SEQ ID NO:1的bp1054-1655；SEQ IDNO:2的bp143-194；SEQ ID NO:2的bp118-219；SEQ ID NO:2的bp68-269；和SEQ ID NO:2的bp1-369，和其互补物；对所述第三棉花植物测定包含一个或多个选自下组的序列的DNA的存在：SEQ ID NO:1的bp1329-1380；SEQ ID NO:1的bp1304-1405；SEQ ID NO:1的bp1254-1455；SEQ ID NO:1的bp1154-1555；SEQ ID NO:1的bp1054-1655；SEQ ID NO:2的bp143-194；SEQ ID NO:2的bp118-219；SEQ ID NO:2的bp68-269；和SEQ ID NO:2的bp1-369，和其互补物。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的DNA分子，其能鉴别棉花事件pDAB4468.19.10.3。除了SEQ ID NOS:1和2之外，这些分子还包括长度至少为50bp，并包括跨越SEQ ID NO:1的bp1354/1355接点的多核苷酸序列的分子，和长度至少为50bp，并包括跨越SEQ ID NO:2的bp168/169接点的多核苷酸序列的分子。实例包括：SEQ ID NO:1的bp1329-1380；SEQ ID NO:1的bp1304-1405；SEQ ID NO:1的bp1254-1455；SEQ ID NO:1的bp1154-1555；SEQ ID NO:1的bp1054-1655；SEQ ID NO:2的bp143-194；SEQ ID NO:2的bp118-219；SEQ ID NO:2的bp68-269；和SEQ ID NO:2的bp1-369，和其互补物。
在另一个实施方案中，本发明提供了棉花纤维、颗粒(grain)、种子、种子油或种子粕，在所述棉花纤维、颗粒、种子、种子油或种子粕中含有棉花事件pDAB4468.19.10.3，表现为该棉花纤维、颗粒、种子、种子油或种子粕的DNA中含有一个或多个选自下组的序列：SEQID NO:1的bp1329-1380；SEQ ID NO:1的bp1304-1405；SEQ ID NO:1的bp1254-1455；SEQ IDNO:1的bp1154-1555；SEQ ID NO:1的bp1054-1655；SEQ ID NO:2的bp143-194；SEQ ID NO:2的bp118-219；SEQ ID NO:2的bp68-269；和SEQ ID NO:2的bp1-369，和其互补物。
本发明的实施方案还包括含有棉花事件pDAB4468.19.10.3的棉花植物细胞和植物部分，包括但不仅限于，花粉、胚珠、花、芽(shoot)、根和叶，以及营养细胞的细胞核、花粉细胞、种子、种子油和种子粕、及卵细胞(egg cell)。
在一些实施方案中，棉花事件pDAB4468.19.10.3可以和其它性状组合，其他性状包括例如其它除草剂耐受基因和/或昆虫抑制蛋白和转录调节序列(例如RNA干扰、dsRNA、转录因子等)。额外的性状可以通过植物育种、对含有棉花事件pDAB4468.19.10.3的转基因植物的再次转化、或同源重组介导的靶向整合添加新性状，而叠加到植物基因组内。
其它实施方案包括切离包含棉花事件pDAB4468.19.10.3的多核苷酸序列，包括例如pat基因表达盒。一旦切离多核苷酸序列，经过修饰的事件可以被重新靶定到特定的染色体位点，在该位点中额外的多核苷酸序列与棉花事件pDAB4468.19.10.3叠加。
在一个实施方案中，本发明涵盖棉花染色体靶位点，其位于A亚基因组3号的染色体上SEQ ID NOS:1和2中表示的侧翼序列之间。
在一个实施方案中，本发明涵盖制作转基因棉花植物的方法，包括将异源核酸插入到A亚基因组的3号染色体上SEQ ID NO:1和2中表示的基因组序列之间的位置，即SEQ IDNO:1的bp1-1354和SEQ ID NO:2的bp169-2898之间的位置。
此外，本发明的实施方案还提供了用于检测样品(例如棉花纤维的样品)中主题事件之存在的测定法。该测定法可以基于插入到棉花基因组中的重组构建体的DNA序列，并基于插入位点侧翼的基因组序列。还提供了可用于实施该测定法的试剂盒和条件。
本发明的实施方案还部分地涉及对转基因棉花品系中由于插入来自pDAB4468的T-DNA而产生的边界区域的DNA序列的克隆和分析。这些序列是唯一的。基于插入序列和接点序列，可以生成且实际生成了事件特异性引物。PCR分析表明，这些事件可以通过分析用这些事件特异性引物组所产生的PCR扩增子来加以辨识。因此，这些和其他相关的程序可以用于唯一地辨识包含本发明事件的棉花品系。
一个实施方案提供了一种控制棉花作物中杂草的方法，包括向棉花作物施用苯氧乙酸除草剂，所述棉花作物包括含有如下所述的DNA的棉花植物，所述DNA包含选自下组的序列：SEQ ID NO:1的bp1329-1380；SEQ ID NO:1的bp1304-1405；SEQ ID NO:1的bp1254-1455；SEQ ID NO:1的bp1154-1555；SEQ ID NO:1的bp1054-1655；SEQ ID NO:2的bp143-194；SEQ ID NO:2的bp118-219；SEQ ID NO:2的bp68-269；和SEQ ID NO:2的bp1-369。在本方法的进一步的方面中，苯氧乙酸除草剂是2,4-D。在本方法进一步的方面中，苯氧乙酸除草剂是MCPA。
一个实施方案提供了一种控制棉花作物中杂草的方法，包括向棉花作物施用吡啶氧基乙酸除草剂，所述棉花作物包括含有如下所述的DNA的棉花植物，所述DNA包含选自下组的序列：SEQ ID NO:1的bp1329-1380；SEQ ID NO:1的bp1304-1405；SEQ ID NO:1的bp1254-1455；SEQ ID NO:1的bp1154-1555；SEQ ID NO:1的bp1054-1655；SEQ ID NO:2的bp143-194；SEQ ID NO:2的bp118-219；SEQ ID NO:2的bp68-269；和SEQ ID NO:2的bp1-369。在本方法进一步的方面中，吡啶氧基乙酸除草剂是绿草定。在本方法进一步的方面中，苯氧乙酸除草剂是氟草烟。
一个实施方案提供了一种控制棉花作物中杂草的方法，包括向棉花作物施用草胺膦除草剂，所述棉花作物包括含有如下所述的DNA的棉花植物，所述DNA包含选自下组的序列：SEQ ID NO:1的bp1329-1380；SEQ ID NO:1的bp1304-1405；SEQ ID NO:1的bp1254-1455；SEQ ID NO:1的bp1154-1555；SEQ ID NO:1的bp1054-1655；SEQ ID NO:2的bp143-194；SEQ ID NO:2的bp118-219；SEQ ID NO:2的bp68-269；和SEQ ID NO:2的bp1-369。
一个实施方案提供了一种分离的DNA序列，其包含一个或多个选自下组的序列：SEQ ID NO:1的bp1329-1380；SEQ ID NO:1的bp1304-1405；SEQ ID NO:1的bp1254-1455；SEQ ID NO:1的bp1154-1555；SEQ ID NO:1的bp1054-1655；SEQ ID NO:2的bp143-194；SEQID NO:2的bp118-219；SEQ ID NO:2的bp68-269；和SEQ ID NO:2的bp1-369。
一个实施方案提供了一种棉花植物育种的方法，包括：将第一植物与第二棉花植物杂交产生第三棉花植物，所述第一植物包含含有一个或多个选自下组的序列的DNA：SEQID NO:1的bp1329-1380；SEQ ID NO:1的bp1304-1405；SEQ ID NO:1的bp1254-1455；SEQ IDNO:1的bp1154-1555；SEQ ID NO:1的bp1054-1655；SEQ ID NO:2的bp143-194；SEQ ID NO:2的bp118-219；SEQ ID NO:2的bp68-269；和SEQ ID NO:2的bp1-369，和其互补物；以及对所述第三棉花植物测定包含一个或多个选自下组的序列的DNA的存在：SEQ ID NO:1的bp1329-1380；SEQ ID NO:1的bp1304-1405；SEQ ID NO:1的bp1254-1455；SEQ ID NO:1的bp1154-1555；SEQ ID NO:1的bp1054-1655；SEQ ID NO:2的bp143-194；SEQ ID NO:2的bp118-219；SEQ ID NO:2的bp68-269；和SEQ ID NO:2的bp1-369，和其互补物。
一个实施方案提供了一种分离的DNA分子，其包含接点序列，所述接点序列包含至少一个选自下组的序列：SEQ ID NO:1的bp1329-1380；SEQ ID NO:1的bp1304-1405；SEQ IDNO:1的bp1254-1455；SEQ ID NO:1的bp1154-1555；SEQ ID NO:1的bp1054-1655；SEQ IDNO:2的bp143-194；SEQ ID NO:2的bp118-219；SEQ ID NO:2的bp68-269；SEQ ID NO:2的bp1-369，和其互补物。
一个实施方案提供了一种棉花种子，其在基因组中包含选自下组的DNA序列：SEQID NO:1的bp1329-1380；SEQ ID NO:1的bp1304-1405；SEQ ID NO:1的bp1254-1455；SEQ IDNO:1的bp1154-1555；SEQ ID NO:1的bp1054-1655；SEQ ID NO:2的bp143-194；SEQ ID NO:2的bp118-219；SEQ ID NO:2的bp68-269；SEQ ID NO:2的bp1-369，和其互补物。进一步的实施方案提供了一种棉花种子，其在基因组中包含AAD-12/PAT棉花事件pDAB4468.19.10.3，并且其代表性棉花种子被保藏在美国典型培养物保藏中心，登录号为No.PTA-12457。进一步的实施方案提供了一种通过种植这两个实施方案中任一个的棉花种子产生的棉花植物。进一步的实施方案提供了通过该棉花植物生产的棉花种子，其中所述种子在其基因组中含有AAD-12/PAT棉花事件pDAB4468.19.10.3，其与以登录号No.PTA-12457保藏在美国典型培养物保藏中心的棉花种子中存在的AAD-12/PAT棉花事件pDAB4468.19.10.3相同。进一步的实施方案提供了该棉花植物的部分，其中所述部分选自下组：花粉、胚珠、花、棉铃、芽、根和叶，并且所述部分包含所述事件。进一步的实施方案提供了从棉花植物或其部分衍生的组合物，其中所述组合物是选自下组的商业产品：棉粕、棉纤维和棉籽油。
在进一步的实施方案中，棉花植物包含与SEQ ID NO:21的残基1,355-7,741具有至少95％的序列同一性的DNA序列。一个实施方案提供了上述实施方案植物的后代棉花植物，其中所述植物对苯氧基乙酸、吡啶基氧基乙酸和草胺膦除草剂显示耐受性，并且所述耐受性是由于所述事件或所述基因组中编码的蛋白质的表达导致的。
进一步的实施方案提供了一种棉花种子，包含含有如下所述的DNA序列的基因组，所述DNA序列与SEQ ID NO:21具有至少95％的序列同一性。进一步的实施方案提供了通过种植该棉花种子产生的植物。
一个实施方案提供了一种含有棉花事件pDAB4468.19.10.3的转基因棉花植物或其部分，其中包含棉花事件pDAB4468.19.10.3的代表性棉花种子已经被保藏在美国典型培养物保藏中心，登录号为No.PTA-12457。
种子保藏
作为本公开的一部分，至少2500粒含有棉花事件pDAB4468.19.10.3的棉花品系的种子被保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)(10801University Boulevard,Manassas,VA,20110)，公众可以无限制地获得(但是受专利权保护)。该保藏被指定为ATCC登录号PTA-12457，是以陶氏益农公司(Dow AgroSciences LLC)的名义于2012年1月23日保藏的。该保藏的实施和维持遵照布达佩斯条约关于专利程序目的的种子保藏条款。
序列简述
SEQ ID NO:1是用于棉花事件pDAB4468.19.10.3的5’DNA侧翼边界序列。核苷酸1-1354是基因组序列。核苷酸1355-1672是插入序列。
SEQ ID NO:2是用于棉花事件pDAB4468.19.10.3的3’DNA侧翼边界序列。核苷酸1-168是插入序列。核苷酸169-2898是基因组序列。
SEQ ID NO:3是pDAB4468的T-链DNA序列，其在下面的表1中有注释。
SEQ ID NO:4是用于确认3’边界基因组DNA的寡核苷酸引物3endG1。
SEQ ID NO:5是用于确认3’边界基因组DNA的寡核苷酸引物3endG2。
SEQ ID NO:6是用于确认3’边界基因组DNA的寡核苷酸引物3endG3。
SEQ ID NO:7是用于确认5’边界基因组DNA的寡核苷酸引物5endG1。
SEQ ID NO:8是用于确认5’边界基因组DNA的寡核苷酸引物5endG2。
SEQ ID NO:9是用于确认5’边界基因组DNA的寡核苷酸引物5endG3。
SEQ ID NO:10是用于确认5’边界基因组DNA的寡核苷酸引物5endT1。
SEQ ID NO:11是用于确认5’边界基因组DNA的寡核苷酸引物5endT2。
SEQ ID NO:12是用于确认5’边界基因组DNA的寡核苷酸引物5endT3。
SEQ ID NO:13是用于确认3’边界基因组DNA的寡核苷酸引物3endT1。
SEQ ID NO:14是用于确认3’边界基因组DNA的寡核苷酸引物3endT2。
SEQ ID NO:15是用于确认3’边界基因组DNA的寡核苷酸引物3endT3。
SEQ ID NO:16是用于确认5’边界基因组DNA的寡核苷酸引物BACG6。
SEQ ID NO:17是用于确认5’边界基因组DNA的寡核苷酸引物UbiRev。
SEQ ID NO:18是用于确认5’边界基因组DNA的寡核苷酸引物GHBACA6。
SEQ ID NO:19是用于确认5’边界基因组DNA的寡核苷酸引物AAD3B1。
SEQ ID NO:20是用于确认5’边界基因组DNA的寡核苷酸引物5endPLs。
SEQ ID NO:21是棉花事件pDAB4468.19.10.3的序列，包括5’基因组侧翼序列、pDAB4468T-链插入、和3’基因组侧翼序列。
附图简述
图1是含有aad-12和pat基因表达盒的pDAB4468的质粒图。
图2描绘了用于确认棉花事件pDAB4468.19.10.3的5’和3’边界序列的引物位置。
实施本发明的模式
棉花事件pDAB4468.19.10.3插入的两端均已被测序和表征。事件特异性测定法已经得以开发。该事件已被定位(mapped)到棉花基因组中(A亚基因组的3号染色体)。可以令该事件渗入到更多的优良品系中。如在上文“背景”部分提到的，将转基因引入并整合到植物基因组中涉及到一些随机事件(故而将得到表达的给定插入命名为“事件”)。也就是说，由于转化技术众多，诸如土壤杆菌转化、基因枪转化(即基因枪)和碳化硅介导的转化(即WHISKERS)等，无法预测转基因将会插入在基因组中的何处。因此，鉴定插入物两侧的侧翼植物基因组DNA对于辨识具有给定插入事件的植物而言是重要的。例如，可设计PCR引物使其产生跨越插入物和宿主基因组的接点区的PCR扩增子。该PCR扩增子可用于鉴定插入事件的独特或不同的类型。
本文提供了定义和实施例，用以帮助描述本发明的实施方案，并指导本领域的普通技术人员实践这些实施方案。除非另有说明，否则术语可以被相关领域的普通技术人员根据常规的用法来理解。DNA碱基的命名根据37CFR§1.822所述。
如这里所使用的，术语“后代”是指包含棉花事件pDAB4468.19.10.3的任何一代亲本植物的后代。
转基因“事件”是通过用异源DNA，即包含感兴趣的转基因的核酸构建体转化植物细胞，再生由于转基因插入到植物的基因组中而产生的植物群体，且选择特定基因组位置中的插入为特征的特定植物而产生的。术语“事件”是指包含异源DNA的原始转化体以及该转化体的后代。术语“事件”也指通过转化体与另一含有基因组/转基因DNA的品种之间的有性异交产生的后代。即使经过与轮回亲本进行多次回交，插入的转基因DNA和来自被转化亲本的侧翼基因组DNA(基因组/转基因DNA)仍存在于杂交后代的同一染色体位置处。术语“事件”还指来自原始转化体和其后代的、包含插入的DNA和与插入的DNA紧邻的侧翼基因组序列的DNA，该DNA预期会被转移给由于一个包含插入DNA的亲本品系(例如原始转化体和通过自交产生的后代)与一个不包含插入DNA的亲本品系之间的有性杂交，而接受包括感兴趣的转基因在内的插入DNA的后代。
“接点序列”或“边界序列”跨越下述二者的连接点：插入到基因组内的DNA；和来自位于该插入点侧翼的棉花天然基因组的DNA。鉴定或检测植物遗传材料中的任一接点序列(one or the other junction sequences)足以用来鉴别该事件。跨越本文中描述的棉花事件中的插入点、和相似长度的侧翼DNA的DNA序列被包括在内。本文中提供了这样的鉴别性序列的具体实例；然而，其它与各插入物的接点、或各插入物与基因组序列的接点重叠的序列，也能鉴别，并且可以根据本发明的实施方案加以使用。
本发明的实施方案部分地涉及使用这些侧翼、接点和插入序列进行事件鉴定。相关的PCR引物和扩增子也包含在本发明的实施方案中。根据本发明的实施方案，可以利用使用跨越所插入的DNA和其边界的扩增子的PCR分析方法检测或鉴定从本专有权转基因棉花品系衍生的商业化转基因棉花品系或品种。
侧翼/接点序列能鉴别棉花事件pDAB4468.19.10.3。基于这些序列，生成了事件特异性的引物。PCR分析表明，通过分析用这些事件特异性引物组产生的PCR扩增子，可以在不同棉花基因型中鉴定这些棉花品系。因此，这些和其他相关的程序可用于唯一地鉴定这些棉花品系。本文中鉴定的序列是唯一的。
本发明实施方案的检测技术可特别用于和植物育种相结合，用来在为了向后代中引入一个或多个额外的感兴趣的性状而将包含感兴趣的事件的亲本植物与另一种植物品系杂交之后，确定哪个后代植物包含给定的事件。这些PCR分析方法有利于棉花育种计划，以及品质控制，尤其是对商业化的转基因棉花种子。现在还可以制作和使用用于这些转基因棉花品系的PCR检测试剂盒。这也有利于产品注册和产品管理。
进一步地，侧翼棉花/基因组序列可用于具体鉴定每一个插入物的基因组位置。这个信息可用于制作特异针对每个事件的分子标志系统。这些可用于快速育种策略和建立连锁数据。
更进一步地，侧翼序列信息可用于研究和表征转基因整合过程、基因组整合位点特征、事件分选(sorting)、转基因及其侧翼序列的稳定性、和基因表达(尤其是涉及基因沉默、转基因的甲基化模式、位置效应、以及潜在的表达相关元件如MARS[基质结合区]，等等)。
根据本公开的所有内容，应该明确，本发明的实施方案包括基于在段落[0032]中示明的ATCC登录号可获得的种子。本发明的实施方案还包括以在段落[0032]中示明的ATCC登录号保藏的种子所种植出的除草剂耐受性棉花植物。本发明的实施方案还包括所述植物的部分，例如叶、组织样品、由所述植物产生的种子、花粉等(其中植物的这些部分包括aad-12和pat，和SEQ ID NO:1和2)。
更进一步，本发明的实施方案还包括从所保藏种子种植出的植物的子代和/或后代植物，优选地是抗除草剂棉花植物，其中所述植物具有包含如本文中所述的可检测接点/侧翼序列的基因组。本文中所使用的术语“棉花”是指陆地棉(Gossypium hirsutum)，包括其能够用棉花植物育种而得的所有品种。
本发明实施方案的除草剂耐受性棉花植物可以通过如下所述育种：首先使第一亲本棉花植物与第二亲本棉花植物进行第一次有性杂交，其中第一亲本棉花植物由本文中提到的任何一种品系的种子长成的棉花植物构成，从而产生多个第一子代植物；然后选择抗草胺膦的第一子代植物；使该第一子代植物自交，从而产生多个第二子代植物；然后从这些第二子代植物中选出抗草胺膦的植物。这些步骤可以进一步包括使所述第一子代植物或所述第二子代植物与所述第二亲本棉花植物或第三亲本棉花植物回交。然后可以种植包含本发明实施方案的棉花种子、或其后代的棉花作物。
还应当理解，两个不同的转基因植物也可以交配而产生含有两个独立分离(segregating)、加合的外源基因的后代。合适子代的自交可以产生对两个加合的外源基因均为纯合的植物。还构想了与亲本植物的回交和与非转基因植物的异交，以及无性繁殖。其他通常用于不同性状和作物的育种方法是本领域已知的。回交育种已经被用于基因转移，以将简单遗传的、高度可遗传的性状引入到作为轮回亲本的期望纯合栽培品种中。待转移性状的来源被称为供体亲本。得到的植物可望具有轮回亲本(例如栽培种)的属性和从供体亲本转移而来的期望性状。最初的杂交之后，选择具有供体亲本表型的个体，并与轮回亲本反复杂交(回交)。得到的植物可望具有轮回亲本(例如栽培种)的属性和从供体亲本转移而来的期望性状。
类似地，本发明一个实施方案的除草剂耐受性棉花植物可以使用本领域已知的方法用额外的转基因进行转化。转化技术如土壤杆菌转化、基因枪转化(即基因枪)、和碳化硅介导的转化(即WHISKERS)，可用于将额外的转基因导入到棉花事件pDAB4468.19.10.3的基因组中。可以进行对含有新插入的转基因的转基因植物的选择和表征，以鉴定含有除本发明实施方案aad-12和pat基因之外的其他新型转基因的稳定整合体的植物。
本发明实施方案的DNA分子可以用作分子标志辅助育种(MAB)方法中的分子标志。本发明实施方案的DNA分子可以在用于鉴定遗传连锁农艺有用性状的方法(例如AFLP标志、RFLP标志、RAPD标志、SNP和SSR)中使用，如本领域已知的。可以使用MAB方法在与本发明实施方案的棉花植物(或其后代和任何其他棉花栽培品种或变种)的杂交后代中跟踪除草剂耐受性特性。这些DNA分子是此性状的标志，可以使用本领域众所周知的MAB方法在棉花植物——本发明实施方案的至少一种棉花品系或其后代在这些植物中是亲本或祖先——中跟踪耐除草剂性状。本发明实施方案的方法可以用于鉴定具有主题事件的任何棉花品种。
本发明实施方案的方法包括产生抗除草剂的棉花植物的方法，其中所述方法包括用根据本发明一个实施方案的植物育种。更具体地，所述方法可以包括使两个本发明实施方案的植物杂交，或者使一个本发明实施方案的植物与任何其它植物杂交。优选的方法进一步包括通过分析所该杂交的子代中可以根据本发明实施方案检测到的事件和有利的品种性能(例如产量)，来筛选所述杂交的后代。例如，本发明的实施方案可用于通过使用包含其它期望性状(如农艺性状、疾病耐受性或抵抗性、线虫耐受或抵抗性和成熟日期)的植物进行育种循环对主题事件进行跟踪。包含主题事件和期望性状的植物可以得到检测、鉴定、筛选和快速利用，例如在更多轮的育种中利用。主题事件/性状也可以通过育种与其他的抗昆虫性状和/或与其他的抗除草剂性状结合，并根据本发明的实施方案的方法进行跟踪。后者的实施方案是包含与cry1F和cry1Ac基因组合、或与具有编码对除草剂麦草畏耐受性的基因组合的主题事件的植物，cry1F和cry1Ac基因赋予对豆夜蛾(Pseudoplusiaincludens)(大豆尺蠖)、Anticarsia gemmatalis(绒毛豆毛虫)、Epinotia aporema、Omoides indicatus、Rachiplusia NU，草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)、斜纹夜蛾(Spodoptera cosmoides)、亚热带粘虫(Spodoptera eridania)、烟芽夜蛾(Heliothisvirescens)、美洲棉铃虫(Heliocoverpa zea)、黄色灯蛾虫(Spilosoma virginica)和南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus)的耐受性。
因此，本方面的实施方案可以与编码下述抗性的性状组合：草甘膦抗性(例如抗性植物或细菌的EPSPS,GOX,GAT)、草胺膦抗性(例如dsm-2,bar)，乙酰乳酸合酶(ALS)抑制性除草剂(例如咪唑啉酮[如咪草烟]、磺酰脲类、三唑嘧啶磺苯胺类、嘧啶硫代苯甲酸类(pyrmidinylthiobenzoates)，和其它化学品[Csr1,SurA等])抗性、溴苯腈抗性(例如Bxn)、HPPD(4-羟苯基-丙酮酸-双加氧酶)酶抑制剂抗性、八氢番茄红素去饱和酶(PDS)抑制剂抗性、光系统II型除草剂抗性(例如psbA)、光系统I型除草剂抗性、原卟啉原氧化酶IX(PPO)抑制型除草剂抗性(例如PPO-1)、苯脲除草剂抗性(例如CYP76B1)、麦草畏降解酶(见例如US20030135879)，和其它可以被单独叠加或多重组合的性状，从而提供有效控制或阻止杂草迁移和/或对任何前述类型的除草剂的抗性的能力。
此外，棉花事件pDAB4468.19.10.3可以和一种或多种额外的输入(例如昆虫抗性、病原体抗性或胁迫耐受性等)或输出(例如增加的产量、改善的油谱、提高的纤维品质等)性状组合。因此，本发明的实施方案可用于提供一套完整的改良作物品质农艺包，其能够灵活而成本高效地控制任意数量的农业害虫。
通过同源重组将多核苷酸序列整合在植物细胞中的特定染色体位点上的方法，在本领域中已有描述。例如，如在美国专利申请公开No.2009/0111188A1中描述的位点特异性整合描述了利用重组酶或整合酶介导将供体多核苷酸序列引入到染色体靶中。此外，国际专利申请No.WO2008/021207描述了锌指介导的同源重组，用于将一个或多个供体多核苷酸序列整合到基因组的特定位置。可以使用重组酶，例如在美国专利No.6720475中描述的FLP/FRT或在美国专利No.5,658,772中描述的CRE/LOX，将多核苷酸序列整合到特定的染色体位点上。最后，使用大范围核酸酶将供体多核苷酸靶定到特定的染色体位置，在Puchtaet al.,PNAS USA93(1996)pp.5055-5060中有描述。
其它用于在植物细胞中进行位点特异性整合的方法通常是已知的并且是适用的(Kumar et al.,Trends in Plant Sci.6(4)(2001)pp.155-159)。进一步，已经在多种原核和低等真核微生物中鉴定的位点特异性重组系统可以应用于植物中。这种系统的实例包括，但不限于，来自鲁氏酵母pSR1质粒的R/RS重组酶系统(Araki et al.(1985)J.Mol.Biol.182:191-203)和噬菌体Mu的Gin/gix系统(Maeser and Kahlmann(1991)Mol.Gen.Genet.230:170-176)。
在本发明的一些实施方案中，理想的是，在现有转基因事件的附近整合或叠加新的转基因。基于独特的特征(例如单插入位点、正常的孟德尔分离和稳定的表达)和卓越的功效组合(包括除草剂耐受性以及多种环境场所之内或跨越多种环境场所的农艺性能)而选择的转基因事件，可以认为是优选的基因组位点。新整合的转基因应当保持现有的转化体的转基因表达特征。而且，由于基因组侧翼序列和新整合事件的染色体位置已经被确定，开发用于检测和确认新整合事件的测定法将不是问题。最后，新的转基因整合到与现有转基因连锁的特定染色体位置中，将加快通过使用常规育种方法的有性异交将转基因向其它遗传背景的基因渗入。
在本发明的一些实施方案中，理想的是从转基因事件切出多核苷酸序列。例如，如在美国专利申请公开No.2011/0191877中所述的转基因切出，采用锌指核酸酶从染色体整合的转基因事件中除去由基因表达盒构成的多核苷酸序列。被去除的多核苷酸序列可以是可选择标志。一旦切出并去除多核苷酸序列，可以通过插入多核苷酸序列来重新靶定该经过修饰的转基因事件。多核苷酸序列的切出和后续经修饰转基因事件的重靶定可以提供许多好处，例如重复使用可选择标志物、或能够克服由于特定基因的表达导致的对植物转录组的意外改变。
本文公开了棉花基因组中A亚基因组的3号染色体上的特定位点，其对于异源核酸的插入是极为理想的。因此，本发明的实施方案提供了将感兴趣的异源核酸导入到该预先建立的目标位点或该目标位点附近的方法。本发明的实施方案还包括一种棉花种子和/或棉花植物，其包含插入在所公开的目标位点中或该位点附近的任何异源核苷酸序列。实现这种靶向整合的一个选项是，切出本文中示例的pat表达盒和/或用不同的插入物代替之。在此可以根据本发明的实施方案使用例如靶向同源重组，但不局限于此。
如本文中所使用的，基因、事件或特征“叠加”是指将期望的性状组合到一个转基因品系中。植物育种者通过将各自具有期望性状的亲本进行杂交，然后鉴定同时具有这些期望性状的后代，来叠加转基因性状。另一种叠加基因的方式是在转化期间同时向植物的细胞核内转移两个或多个基因。另一种叠加基因的方式是用另一个感兴趣的基因再次转化转基因植物。例如，基因叠加可用于组合两种或更多种不同的特征，包括例如，两种或更多种不同的昆虫性状、昆虫抗性性状和疾病抗性性状，两种或更多种除草剂抗性性状，和/或昆虫抗性性状和除草剂抗性性状。在感兴趣的基因的基础上使用可选择标志物也可以视为基因叠加。
“同源重组”是指任何在相应位置处含有相似核苷酸序列的一对核苷酸序列之间的反应，通过该反应，这两个核苷酸序列能够相互作用(重组)形成一个新的重组DNA序列。相似核苷酸序列的位点在本文中分别称为“同源序列”。一般来说，同源重组的频率随着同源序列长度的增加而增大。因此，尽管同源重组可以在两个不完全相同的核苷酸序列之间发生，但是重组的频率(或效率)随着两个序列之间差异性的增加而降低。重组可以用每个供体上的一个同源序列和靶分子实现，从而产生“单交换”重组产物。或者，可将两个同源序列放置在每个靶标和供体核苷酸序列上。供体上的两个同源序列与靶标上的两个同源序列之间的重组会产生“双交换”重组产物。如果供体分子上的同源序列位于待操作序列(例如感兴趣的序列)的两侧，则与靶分子的双交换重组将产生这样的重组产物，其中感兴趣的序列代替了原本位于靶分子上的同源序列之间的DNA序列。通过双交换重组事件实现的靶标与供体之间的DNA序列交换被称为“序列替代。”
本发明实施方案的优选植物或种子，在其基因组中含有如本文所鉴定的起作用的aad-12和pat核苷酸序列，以及如本文所鉴定的位于该插入物两侧的至少20-500个或更多个毗邻的侧翼核苷酸。除非另有说明，否则提到“侧翼序列”是指相对于SEQ ID NO:1和2鉴定的那些。这些侧翼序列的全部或一部分可以预期被转移给由于含有该事件的亲本品系的有性杂交而接收被插入的DNA的后代。
本发明的实施方案包括本发明一个实施方案的植物的可再生细胞的组织培养物。此外，还包含从这种组织培养物再生的植物，特别是当所述植物能够表达一个示范品种的所有形态学和生理学特征时。本发明实施方案的优选植物具有从所述保藏种子种植的植物的所有生理学和形态学特征。本发明的实施方案进一步包括这种种子的后代和具有感兴趣的品质性状的种子的后代。
如这里所使用的，“品系”是指个体之间就至少一个性状而言显示很小或没有遗传变异的一群植物。这些品系可以通过数代的自花授粉和选择，或者通过使用组织或细胞培养技术从单个亲本无性繁殖而获得。
如这里所使用的，术语“栽培种”和“品种”是同义的，是指用于商业生产的品系。
“稳定性”或“稳定的”是指，相对于给定的组分，该组分在代与代之间得以保持，优选为至少三代。
“商业效用”被定义为具有良好的植物活力和高生育力，使得作物能够被农民用传统的种植设备生产，并且能够使用常规的破碎和提取设备从种子中提取具有所述组分的油。
“农艺学优良”是指某个品系除了由主题事件导致的除草剂耐受性之外，还具有理想的农艺性状，如产量、成熟度、抗病性等。这些农艺学特性和数据点中的任何一个或全部均可用于辨识这样的植物，无论是作为一个点还是位于用于限定此类植物的特征范围的任一端或两端。
本领域技术人员根据本公开内容会想到，检测试剂盒的优选实施方案例如可以包括针对和/或包含“接点序列”或“过渡序列”(棉花基因组侧翼序列在此处与插入序列相接)的探针和/或引物。例如，这包括被设计用于鉴定一个或全部两个接点序列(插入物在此处与侧翼序列相接)的多核苷酸探针、引物、和/或扩增子。一种常见的设计是，一个引物与侧翼区杂交，一个引物与插入物杂交。这些引物的长度通常是每个约至少～15个残基。利用这种设置，可以利用引物生成/扩增可检测的扩增子，该扩增子指示本发明实施方案的事件的存在。这些引物可用于产生跨越(并包括)如上文所指出的接点序列的扩增子。
在侧翼序列中“触地(touching down)”的引物通常不被设计为在超出接点多于大约1200个碱基之处杂交。因此，典型的侧翼引物将被设计为包括任一链上从插入物起点开始向侧翼序列中延伸1200个碱基以内的至少15个残基。也就是说，包含来自(或者杂交于)SEQ ID NO:1的碱基对154-1672和/或SEQ ID NO:2的碱基对1-1369的大小合适的序列的引物，在本发明实施方案的范围之内。插入物的引物可以类似地设计于插入物上的任何地方，但SEQ ID NO:3的碱基对1-6287可以非排他性地用于例如此类引物的设计。
本领域的技术人员还将会认识到，引物和探针可被设计成在一定范围内的标准杂交和/或PCR条件下进行杂交，其中引物或探针与示例序列不是完美互补。也就是说，某种程度的错配或简并是可以容忍的。例如，对于约20个核苷酸的引物，通常一个或两个左右的核苷酸不需要与相反链结合，如果错配的碱基在内部或者在引物的相对于扩增子的末端的话。下面提供了各种合适的杂交条件。合成的核苷酸类似物，如肌苷，也可以用在探针中。肽核酸(PNA)探针、以及DNA和RNA探针，也可以使用。重要的是，这些探针和引物能鉴别(能够唯一地鉴定和区分)本发明实施方案的事件的存在。
应当注意的是，PCR扩增可能会出现错误，这可能导致例如轻微的测序错误。也就是说，除非另有说明，本文中所列出的序列是通过从棉花基因组DNA生成长扩增子，然后对扩增子进行克隆和测序而确定的。这种方式产生和确定的多个序列中发现细微的不同和次要的差异并非罕事，考虑到需要多轮扩增才能从基因组DNA产生足够的用于测序的扩增子。本领域的技术人员应当会意识到并且注意到，由于这些类型的常见测序错误或差异而需要进行的任何调整都在本发明实施方案的范围之内。
还应当注意，某些基因组序列被删除并不罕见，例如当创建事件的过程中插入某一序列时。因此，本主题侧翼序列与例如GENBANK中列出的基因组序列之间也可能出现一些差异。
附图中列举了DNA序列“插入物”的组分，并在下面的实施例中进行了更详细的讨论。这些组分或其片段的DNA多核苷酸序列可以用作本发明实施方案的方法的DNA引物或探针。
在本发明的一些实施方案中，提供了用于检测植物和种子等中来自棉花植物的转基因/基因组插入区的存在的组合物和方法。提供了这样的DNA序列，它们包括本文中提供的主题5′转基因/基因组插入区域接点序列(SEQ ID NO:1的碱基对1354/1355之间)、其区段、和示例序列和其任意区段的互补物。提供了这样的DNA序列，其包括本文中提供的主题3′转基因/基因组插入区域接点序列(SEQ ID NO:2的碱基对168/169之间)、其区段、和示例序列和其任意区段的互补物。插入区接点序列跨越下述二者之间的接点：插入到基因组中的异源DNA，和来自棉花细胞的位于插入位点侧翼的DNA。这些序列可能能够鉴别给定的事件。
根据这些插入物和边界序列，可以生成事件特异性的引物。PCR分析表明，可以通过分析用这些事件特异性的引物组所产生的PCR扩增子，可以在不同棉花基因型中鉴定出本发明实施方案的棉花品系。这些和其他相关程序可用于唯一地鉴定这些棉花品系。因此，从这样的引物对衍生的PCR扩增子是唯一的，并可用于鉴定这些棉花品系。
在一些实施方案中，包含新的转基因/基因组插入区域的毗邻片段的DNA序列是本发明的一个方面。包括这样的DNA序列，其包含一段足够长度的转基因插入序列的多核苷酸和一段足够长度的来自一个或多个前述棉花植物的棉花基因组序列的多核苷酸，和/或这样的序列，它们可用作引物序列，用来产生能鉴别一种或多种这些棉花植物的扩增子产物。
相关实施方案涉及如下的DNA序列，其包含在本文中鉴定的DNA序列的转基因部分(例如SEQ ID NO:1及其区段)的至少10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25或更多个毗邻核苷酸，或其互补物，和类似长度的来自这些序列的侧翼棉花DNA序列，或其互补物。这些序列可以在DNA扩增方法中用作DNA引物。使用这些引物产生的扩增子能鉴别本文中提到的任何棉花事件。因此，本发明的实施方案还包括由这样的DNA引物产生的扩增子。
本发明的实施方案还包括用于检测样品中对应于本文中提到的棉花事件的DNA的存在的方法。这些方法可以包括：(a)使包含DNA的样品与引物组接触，该引物组在被用于使用来自所述棉花事件的DNA进行的核酸扩增反应中时，产生能鉴别该事件的扩增子；(b)进行核酸扩增反应，从而产生扩增子；和(c)检测该扩增子。
本发明实施方案进一步的检测方法包括检测样品中对应于所述事件的DNA的存在的方法，其中所述方法包括：(a)使包含DNA的样品与探针接触，该探针在严格杂交条件下会与来自所述棉花事件的DNA杂交，并且在严格杂交条件下不会与对照棉花植物(非感兴趣的事件DNA)杂交；(b)将该样品和该探针置于严格的杂交条件下；和(c)检测该探针与所述DNA的杂交。
在更进一步的实施方案中，本发明包括产生包含本发明的一个实施方案的棉花事件pDAB4468.19.10.3的棉花植物的方法，其中所述方法包括如下的步骤：(a)将第一亲本棉花品系(包含本发明的一个实施方案的表达盒，该表达盒赋予所述品系的植物对2,4-D和草胺膦的耐受性)和第二亲本棉花品系(其缺少上述除草剂耐受性性状)有性杂交，从而产生多个后代植物；和(b)通过使用分子标志物对所述后代植物进行选择。这些方法可以任选地包括使所述后代植物与第二亲本棉花品系回交，从而产生包含抗除草剂性状的纯育(true-breeding)棉花植物的额外步骤。
根据本发明的另一个方面，提供了用于确定与所述事件的杂交的后代的合子型(zygosity)的方法。所述方法可以包括使包含棉花DNA的样品与本发明实施方案的引物组接触。所述的引物当被用于与来自所述棉花事件的基因组DNA进行核酸扩增反应时，可产生能鉴别所述棉花事件的第一扩增子。这些方法进一步包括进行核酸扩增反应，从而产生所述第一扩增子；检测所述第一扩增子；和使包含棉花DNA的样品与第二引物组接触(所述第二引物组当被用于与来自棉花植物的基因组DNA进行核酸扩增反应时，可产生第二扩增子，该第二扩增子含有天然棉花基因组的内源序列，且不含有所述事件的多核苷酸序列)；和进行核酸扩增反应，从而产生所述第二扩增子。该方法还包括检测第二扩增子，并比较样品中的第一和第二扩增子，其中两个扩增子的存在表明转基因插入的合子型。
可以使用本文公开的组合物和DNA检测领域公知的方法开发DNA检测试剂盒。该试剂盒可用于鉴定样品中的主题棉花事件，并可应用于含有该DNA的棉花植物的育种方法。该试剂盒含有与例如本文所公开的扩增子互补的DNA序列，或者含有与和主题事件的转基因遗传元件中所含有的DNA互补的DNA序列互补的DNA序列。这些DNA序列可以用于DNA扩增反应或者作为DNA杂交方法中的探针。该试剂盒还可以含有实施该检测方法必需的试剂和材料。
“探针”是一种分离的核酸分子，其附接有常规的可检测标记物或报告分子(例如放射性同位素、配体、化学发光剂或酶)。这种探针能够与靶核酸的链杂交，在本发明实施方案的情况下，能够与来自所述棉花事件之一(不管是来自棉花植物还是来自含有该事件DNA的样品)的基因组DNA的链杂交。根据本发明实施方案的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，还包括特异结合靶DNA序列并能够用于检测该靶DNA序列之存在的聚酰胺和其它探针材料。
“引物”是分离的/合成的核酸，其通过核酸杂交与靶DNA链退火，从而形成引物和靶DNA链之间的杂交体，然后在聚合酶，例如DNA聚合酶的作用下沿着靶DNA链延伸。本发明实施方案的引物对，是指它们用于扩增靶核酸序列，例如通过聚合酶链式反应(PCR)或其它常规的核酸扩增方法对扩增靶核酸序列的用途。
探针和引物的长度通常为5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106,107,108,109,110,111,112,113,114,115,116,117,118,119,120,121,122,123,124,125,126,127,128,129,130,131,132,133,134,135,136,137,138,139,140,141,142,143,144,145,146,147,148,149,150,151,152,153,154,155,156,157,158,159,160,161,162,163,164,165,166,167,168,169,170,171,172,173,174,175,176,177,178,179,180,181,182,183,184,185,186,187,188,189,190,191,192,193,194,195,196,197,198,199,200,201,202,203,204,205,206,207,208,209,210,211,212,213,214,215,216,217,218,219,220,221,222,223,224,225,226,227,228,229,230,231,232,233,234,235,236,237,238,239,240,241,242,243,244,245,246,247,248,249,250,251,252,253,254,255,256,257,258,259,260,261,262,263,264,265,266,267,268,269,270,271,272,273,274,275,276,277,278,279,280,281,282,283,284,285,286,287,288,289,290,291,292,293,294,295,296,297,298,299,300,301,302,303,304,305,306,307,308,309,310,311,312,313,314,315,316,317,318,319,320,321,322,323,324,325,326,327,328,329,330,331,332,333,334,335,336,337,338,339,340,341,342,343,344,345,346,347,348,349,350,351,352,353,354,355,356,357,358,359,360,361,362,363,364,365,366,367,368,369,370,371,372,373,374,375,376,377,378,379,380,381,382,383,384,385,386,387,388,389,390,391,392,393,394,395,396,397,398,399,400,401,402,403,404,405,406,407,408,409,410,411,412,413,414,415,416,417,418,419,420,421,422,423,424,425,426,427,428,429,430,431,432,433,434,435,436,437,438,439,440,441,442,443,444,445,446,447,448,449,450,451,452,453,454,455,456,457,458,459,460,461,462,463,464,465,466,467,468,469,470,471,472,473,474,475,476,477,478,479,480,481,482,483,484,485,486,487,488,489,490,491,492,493,494,495,496,497,498,499,500,或1000,或2000,或5000个多核苷酸或者更长。这些探针和引物在严格杂交条件下特异性杂交于靶序列。优选地，根据本发明实施方案的探针和引物与靶序列具有完全的序列相似性，尽管通过常规方法也可以设计出与靶序列不同但保持与靶序列杂交的能力的探针。
用于制备和使用探针和引物的方法在例如Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第二版,第1-3卷,Sambrook等编辑,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.,1989中有描述。PCR引物对可以使用例如用于该目的的计算机程序从已知的序列产生。
基于本文中公开的侧翼DNA和插入序列的引物和探针可用于通过常规方法确认(并且，如果需要的话，修正)公开的序列，例如，通过对这些序列进行重克隆和测序。
本发明实施方案的核酸探针和引物在严格条件下与靶DNA序列杂交。任何常规的核酸杂交或扩增方法均可用于鉴定样品中来自转基因事件的DNA的存在。在特定情况下，核酸分子或其片段能够与其他的核酸分子特异性杂交。如本文所使用的，如果两个分子能够形成反平行的双链核酸结构，则可以说这两个核酸分子能够彼此特异性杂交。如果两个核酸分子显示出完全的互补性，则称一个核酸分子是另一个核酸分子的“互补物”。如本文所使用的，当一个分子的每一个核苷酸都与另一个分子的核苷酸互补时，则可以说分子表现出“完全互补性”。显示完全互补性的分子通常会以足够的稳定性彼此杂交，稳定性足以允许它们在常规的“高严格性”条件下保持彼此退火。常规的高严格性条件如Sambrook etal.,1989所述。
如果两个分子能够彼此杂交并且在至少常规的“低严格性”条件具有足够的稳定性以允许它们保持彼此退火，则称两个分子显示“最小互补性”。常规的低严格性条件如Sambrook et al.,1989所述。核酸分子只需要表现出序列的最小互补性，以便能够在所用的特定溶剂和盐浓度下形成稳定的双链结构，就能够用作引物或探针。
术语“严格条件”或“严格性条件”是关于核酸探针与靶核酸杂交(即，与感兴趣的特定核酸序列杂交)的功能性定义，该杂交通过Sambrook et al.,1989在9.52-9.55中讨论的特定杂交程序实施。另外见Sambrook et al.,1989的9.47-9.52和9.56-9.58。
取决于预期的应用，可以使用不同条件的严格条件或探针或引物的多核苷酸序列简并性，以实现对靶序列不同程度的杂交选择性。对于要求高选择性的应用，通常会采用相对严格的条件来杂交一个多核苷酸序列与第二个多核苷酸序列，例如，会选择相对低盐和/或高温条件，例如大约0.02M-大约0.15M NaCl和大约50℃-大约70℃的温度。严格条件，例如，可能涉及用高严格性清洗缓冲液(0.2×SSC,0.1％SDS,65℃)至少清洗杂交滤膜两次。促进DNA杂交的合适严格条件，例如，6.0X柠檬酸钠/氯化铵(SSC)，大约45℃，随后用50℃的2.0XSSC清洗，是本领域技术人员已知的。例如，在清洗步骤中的盐浓度可以从约2.0X SSC，50℃的低严格性到大约0.2X SSC，50℃的高严格性中进行选择。另外，清洗步骤中的温度可以从低严格条件的室温、大约约22℃增加到高严格条件的大约65℃。可以变化温度和盐二者，或者可以保持温度或盐浓度恒定，而改变另一个变量。这种选择条件可容忍探针与模板或靶链之间的很小的(如果有的话)错配。通过杂交检测DNA序列是本领域技术人员众所周知的，美国专利Nos.4,965,188和5,176,995的教导是杂交分析方法的实例。
在一个特别优选的实施方案中，本发明一个实施方案的核酸会在高严格度条件下与一个或多个本文举例或建议的引物(或扩增子或其他序列)，包括其互补物或片段，特异性杂交。在本发明的一个方面中，本发明一个实施方案的标志物核酸分子具有本文在一个或多个示例序列中表示的核酸序列，或其互补物和/或片段。
在本发明的另一个方面中，本发明一个实施方案的标志物核酸分子与这样的核酸序列具有80％-100％或90％和100％的序列同一性。在本发明进一步的方面中，本发明一个实施方案的标记核酸分子与这样的序列具有95％-100％的序列同一性。这样的序列可以在植物育种方法中用作标志物，以鉴定遗传杂交的后代。探针与靶DNA分子的杂交可以通过本领域技术人员已知的许多方法中的任一种进行检测；包括但不限于，荧光标签、放射性标签、基于抗体的标签和化学发光标签。
关于使用特定扩增引物对的靶核酸序列的扩增(例如通过PCR)，“严格条件”是允许引物对仅与这样的靶核酸序列杂交的条件：具有相应野生型序列(或其互补物)的引物会与该靶核酸序列结合，并优选地产生独特的扩增产物——扩增子。
术语“对…(靶序列)特异性”是指，探针或引物在严格杂交条件下仅与包含靶序列的样品中的靶序列杂交。
如本文中所使用的，“扩增的DNA”或“扩增子”是指，作为核酸模板一部分的靶核酸序列的核酸扩增产物。例如，为了确定由于有性杂交而产生的棉花植物是否含有来自本发明实施方案的棉花植物的转基因事件基因组DNA，可以对从棉花植物组织样品提取的DNA进行核酸扩增方法，其使用的引物对包括来自植物基因组中与所插入异源DNA的插入位点相邻的侧翼序列的引物，和来自所插入异源DNA的第二引物，从而产生能鉴别该事件DNA的存在的扩增子。扩增子的长度及其具有的序列也能鉴别该事件。扩增子的长度可以改变，从长度等于引物对的总长加一个核苷酸碱基对，到长度等于引物对的总长加上大约2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106,107,108,109,110,111,112,113,114,115,116,117,118,119,120,121,122,123,124,125,126,127,128,129,130,131,132,133,134,135,136,137,138,139,140,141,142,143,144,145,146,147,148,149,150,151,152,153,154,155,156,157,158,159,160,161,162,163,164,165,166,167,168,169,170,171,172,173,174,175,176,177,178,179,180,181,182,183,184,185,186,187,188,189,190,191,192,193,194,195,196,197,198,199,200,201,202,203,204,205,206,207,208,209,210,211,212,213,214,215,216,217,218,219,220,221,222,223,224,225,226,227,228,229,230,231,232,233,234,235,236,237,238,239,240,241,242,243,244,245,246,247,248,249,250,251,252,253,254,255,256,257,258,259,260,261,262,263,264,265,266,267,268,269,270,271,272,273,274,275,276,277,278,279,280,281,282,283,284,285,286,287,288,289,290,291,292,293,294,295,296,297,298,299,300,301,302,303,304,305,306,307,308,309,310,311,312,313,314,315,316,317,318,319,320,321,322,323,324,325,326,327,328,329,330,331,332,333,334,335,336,337,338,339,340,341,342,343,344,345,346,347,348,349,350,351,352,353,354,355,356,357,358,359,360,361,362,363,364,365,366,367,368,369,370,371,372,373,374,375,376,377,378,379,380,381,382,383,384,385,386,387,388,389,390,391,392,393,394,395,396,397,398,399,400,401,402,403,404,405,406,407,408,409,410,411,412,413,414,415,416,417,418,419,420,421,422,423,424,425,426,427,428,429,430,431,432,433,434,435,436,437,438,439,440,441,442,443,444,445,446,447,448,449,450,451,452,453,454,455,456,457,458,459,460,461,462,463,464,465,466,467,468,469,470,471,472,473,474,475,476,477,478,479,480,481,482,483,484,485,486,487,488,489,490,491,492,493,494,495,496,497,498,499,or500,750,1000,1250,1500,1750,2000或更多个核苷酸碱基对(加上或减去任意上述列举的增量)。或者，引物对可以来自于插入DNA两侧的侧翼序列，从而产生一个包含整个插入核苷酸序列的扩增子。从植物基因组序列衍生的引物对的成员可能位于与插入的DNA序列有一定距离之处。这个距离的范围可以从1个核苷酸碱基对到大约两万个核苷酸碱基对。使用的“扩增子”一词，明确排除可能在DNA热扩增反应中形成的引物二聚体。
核酸扩增可以通过任何本领域已知的各种核酸扩增方法实现，包括聚合酶链反应(PCR)。多种扩增方法是本领域已知的，并且特别在美国专利No.4683195和美国专利No.4,683,202中有描述。PCR扩增方法已经被发展用来扩增高达22kb的基因组DNA。这些方法以及DNA扩增领域中已知的其它方法可用于本发明实施方案的实施。来自主题棉花事件的异源转基因DNA插入物的序列或侧翼基因组序列可以如下进行验证(以及，如果有必要，校正)：使用从本文提供的序列衍生的引物从该事件扩增此类序列，随后对PCR扩增子或克隆的DNA进行标准DNA测序。
通过这些方法产生的扩增子可以通过多种技术来检测。琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色是检测DNA扩增子的公知方法。另一种这样的方法是遗传位分析(Genetic BitAnalysis)，其中设计一个与相邻的侧翼基因组DNA序列和插入的DNA序列均重叠的DNA寡核苷酸。将该寡核苷酸固定在微孔板的孔中。对感兴趣的区域进行PCR(使用插入序列中的一个引物和相邻侧翼基因组序列中的一个引物)之后，单链PCR产物可以和该固定的寡核苷酸杂交，并作为模板，使用DNA聚合酶和特异针对所预期的下一个碱基的标记ddNTP进行单碱基延伸反应。通过对荧光信号的量进行定量，可以完成对结合产物的分析。荧光信号指示由于成功的扩增、杂交和单碱基延伸造成的插入/侧翼序列的存在。
另一种方法是焦磷酸测序技术，如Winge(Innov.Pharma.Tech.00:18-24,2000)所述。在该方法中，设计与相邻的基因组DNA和插入DNA的接点重叠的寡核苷酸。该寡核苷酸被设计成与来自感兴趣的区域的单链PCR产物杂交(一个引物位于插入序列中，一个引物位于侧翼基因组序列中)，并在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase)、腺苷5′磷酰硫酸和荧光素的存在下进行温育。分别添加dNTP，掺入导致光信号，光信号被测量。光信号指示由于成功的扩增、杂交和单或多碱基延伸造成的转基因插入/侧翼序列的存在。
荧光偏振是另一种可用于检测本发明的实施方案的扩增子的方法。根据这种方法，设计成与基因组侧翼和插入DNA接点重叠的寡核苷酸。该寡核苷酸与来自感兴趣的区域的单链PCR产物杂交(一个引物位于插入DNA中，一个引物位于侧翼基因组序列中)，并在DNA聚合酶和荧光标记的ddNTP的存在下进行温育。单碱基延伸导致ddNTP的掺入。荧光标记的ddNTP的掺入可以作为偏振变化用荧光仪加以测量。偏振的变化指示由于成功的扩增、杂交、和单碱基延伸造成的转基因插入/侧翼序列的存在。
(PE Applied Biosystems,Foster City,Calif.)是检测和定量DNA序列的存在的方法。简要地说，设计与基因组侧翼和插入DNA接点重叠的FRET寡核苷酸探针。将FRET探针和PCR引物(一个引物位于插入DNA序列中，一个位于侧翼基因组序列中)在热稳定的聚合酶和dNTP的存在下循环。在特定的扩增期间，Taq DNA聚合酶的校对机构从FRET探针的淬灭部分上释放出荧光部分。荧光信号指示由于成功的扩增和杂交造成的侧翼/转基因插入序列的存在。
分子信标(Molecular Beacon)已经被描述用于多核苷酸序列的检测。简要地说，设计与侧翼基因组和插入DNA接点重叠的FRET寡核苷酸探针。FRET探针的独特结构导致其含有二级结构，该二级结构保持荧光部分和淬灭部分紧密接近。将FRET探针和PCR引物(一个引物位于插入DNA序列中，一个位于侧翼基因组序列中)在热稳定的聚合酶和dNTP的存在下进行循环。在成功的PCR扩增之后，FRET探针与靶序列的杂交导致探针二级结构的除去和荧光部分和淬灭部分在空间上的分离。结果产生荧光信号。荧光信号指示由于成功的扩增和杂交造成的侧翼基因组/转基因插入序列的存在。
在公开了棉花基因组中的一个非常适于插入的位置的基础上，本发明的实施方案还包括在该基因组位置附近的区域内含有至少一个非棉花事件pDAB4468.19.10.3插入物的棉花种子和/或棉花植物。一个选择是用其他不同的插入物代替来自本文例举的棉花事件pDAB4468.19.10.3的插入物。一般情况下，在特定的实施方案中采用，例如，靶向同源重组。此类技术是，例如，WO03/080809A2及相应公布的美国申请(US20030232410)的主题。因此，本发明的实施方案包括如下的植物和植物细胞，其含有异源插入物(代替或连同aad-12或pat基因的多个拷贝)，异源插入物的两侧是本文所鉴定的全部侧翼序列的或可识别的部分(SEQ ID NO:1的bp1-1354和SEQ ID NO:2的bp169-2898)。aad-12或pat基因的一个额外拷贝(或多个额外拷贝)也可以通过这种/这些方式作为插入用的靶标。
下面的实施例被包括用于举例说明用于实施本发明实施方案的程序，和证明本发明的某些优选实施方案。这些实施例不应被理解为具有限制意义。本领域的技术人员应当意识到，下面实施例中公开的技术只是代表用于例证其实践的优选模式的特定方法。然而，本领域的技术人员应当，根据本公开，认识到，在不背离本发明精神和范围的前提下，可以对这些具体实施方案进行许多变化，而仍然能够获得相同或类似的结果。除非另有说明，否则所有的百分比都是按重量计，所有溶剂混合物的比例均为体积比。
除非另有说明，使用如下的缩写。
bp 碱基对
℃ 摄氏度
DNA 脱氧核糖核酸
EDTA 乙二胺四乙酸
kb 千碱基
μg 微克
μL 微升
mL 毫升
M 摩尔量(molar mass)
PCR 聚合酶链式反应
PTU 植物转录单元或表达盒
SDS 十二烷基硫酸钠
SSC 含有氯化钠和柠檬酸钠混合物的缓冲溶液，pH7.0
TBE 含有Tirs碱、硼酸和EDTA混合物的缓冲溶液，pH8.3
实施例
实施例1：aad-12和pat棉花事件pDAB4468.19.10.3的转化和选择
通过土壤杆菌介导的转化、并使用含有草胺膦的培养基进行选择，产生含有棉花事件pDAB4468.19.10.3的转基因棉花(陆地棉Gossypium hirsutum)。使用去甲(disarmed)土壤杆菌菌株EHA101(Hood et al.,1993)启动棉花植物品种Coker310的转化，上述菌株携带双元载体pDAB4468(图1)，该载体在T-链DNA区中含有可选择标志物pat和感兴趣的基因aad-12。pDAB4468的DNA T-链序列在SEQ ID NO:3中示出，且在下面表1中有注释。
表1：位于pDAB4468上的基因元件
实施例2：来自棉花事件pDAB4468.19.10.3的AAD-12蛋白的表征
对来自转基因棉花事件pDAB4468.19.10.3的重组AAD-12蛋白的生物化学性质进行了表征。使用定量酶联免疫吸附测定(ELISA)表征蛋白的生物化学性质并确认AAD-12蛋白的表达。
确定了棉花事件pDAB4468.19.10.3中AAD-12蛋白的水平。从试验植物中分离了棉叶组织样品，并准备用于表达分析。用含有去污剂Brij-56TM(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)的Tris-HCl溶液从棉花植物组织中提取AAD-12蛋白。对植物组织进行离心；收集水相上清液，根据需要用适当的缓冲液稀释，并用AAD-12ELISA试剂盒(Beacon Diagnostics,EastFalmouth,MA)以夹心模式进行分析。该试剂盒按照制造商建议的规程使用。
进行检测分析以研究棉花事件pDAB4468.19.10.3的表达稳定性和纵向(两代之间)和横向(同代的世系之间)的可遗传性。棉花事件pDAB4468.19.10.3的AAD-12蛋白的表达稳定(不分离)并且在所有世系之间恒定。
对温室种植的棉花事件pDAB4468.19.10.3植物确定了AAD-12蛋白表达水平的垂直比较(世代之间)。表达水平在T3-T4代一致并且稳定，平均表达水平为大约110-125ng/cm2的分离的AAD-12蛋白质。
对田间种植的棉花事件pDAB4468.19.10.3植物确定了AAD-12蛋白表达水平的水平比较(相同世代的世系之间)。对数株T4代棉花事件pDAB4468.19.10.3植物进行了田间表达水平研究。蛋白表达的平均水平一致并且稳定，大约为50-150ng/cm2的分离的AAD-12蛋白质。
实施例3：棉花事件pDAB4468.19.10.3的基因组侧翼边界区域的克隆和表征
分离、克隆并表征了邻近棉花事件pDAB4468.19.10.3T-链插入物的基因组侧翼边界区。为了表征边界区和描述基因组插入位点，分离了棉花事件pDAB4468.19.10.3的基因组侧翼区，其包括5’基因组侧翼边界区序列(SEQ ID NO:1)的1,354bp和3’基因组侧翼边界区序列(SEQ ID NO:2)的2,730bp。5’基因组侧翼边界序列被发现含有高度重复序列，这些序列在确认5’基因组侧翼边界序列的基因组序列时产生了技术上的困难。3’边界序列使用转基因特异性引物和基因组引物进行了确认。
用棉花事件pDAB4468.19.10.3的基因组侧翼边界序列对NCBI核苷酸数据库进行了BLAST，以确认这些区域是棉花来源的。3′侧翼边界的BLAST表明，该序列与单个的BAC克隆(陆地棉(Gossypium hirsutum)MX008C17)部分对齐。进一步，BLAST搜索表明，棉花事件pDAB4468.19.10.3位于棉花基因组A亚基因组的3号染色体上。总之，对棉花事件pDAB4468.19.10.3基因组侧翼边界序列的表征表明，在棉花基因组中存在来自pDAB4468的T-链的一个拷贝。
实施例3.1:棉花基因组序列的确认
为了确认棉花事件pDAB4468.19.10.3的基因组插入位点的序列，用不同的引物对进行聚合酶链式反应(PCR)(图2和表2和表3)。使用来自棉花事件pDAB4468.19.10.3的基因组DNA、和来自其它转基因或非转基因棉花对照品系的基因组DNA作为模板。反应使用LATaq试剂盒(TaKaRa，日本)。
表2：用于分析棉花事件pDAB4468.19.10.3的PCR引物和序列
表3：用于扩增棉花事件pDAB4468.19.10.3中的边界区域和事件特异性序列的PCR条件和反应混合物
对5′基因组侧翼边界序列进行PCR扩增和测序。这些反应使用aad-12表达盒特异性引物(例如，5endT1，5endT2和5endT3)和根据从棉花基因组获得的克隆的5′末端边界序列设计的引物(例如，5endG1和5endG2和5endG3)，来扩增跨越aad-12基因和5′端基因组侧翼边界序列的基因组DNA区段。类似地，为了确认所克隆的3′端基因组侧翼边界序列，使用pat表达盒特异性引物(例如，3endT1,3endT2和3endT3)和根据所克隆的3′末端边界序列设计的引物(例如，3endG1,3endG2和3endG3)，扩增了跨越pat基因和3′端基因组侧翼边界序列的基因组DNA片段。使用每个引物对(一个位于棉花事件pDAB4468.19.10.3的侧翼边界上的引物，和一个转基因特异性引物)从棉花事件pDAB4468.19.10.3的基因组DNA扩增出了预期大小的DNA片段。对照样品(其它转基因棉花品系或者非转基因棉花，Coker310对照)使用这些引物没有产生PCR扩增子。将PCR扩增产物亚克隆到质粒中并测序。利用这个数据来确定与棉花事件pDAB4468.19.10.3T-链插入物相邻的5′和3′基因组侧翼边界序列。
实施例4：通过Southern印迹表征棉花事件pDAB4468.19.10.3
使用Southern印迹分析来建立棉花事件pDAB4468.19.10.3的整合模式。这些实验产生的数据证明了aad-12和pat转基因在棉花基因组中的整合以及完整性。棉花事件pDAB4468.19.10.3被表征为一个全长、简单整合事件，含有来自质粒pDAB4468的aad-12和pat表达盒的单个拷贝。
Southern印迹数据提示，T-链片段插入到了棉花事件pDAB4468的基因组中。使用特异性针对包含在pDAB4468的T-链整合区内的aad-12和pat基因的探针、和描述性的限制性内切酶进行了详细的Southern印迹分析，这些酶在所述质粒中具有切割位点，并产生质粒内杂交片段或跨越质粒与棉花基因组DNA接点的片段(边界片段)。从Southern杂交可见的限制性内切酶和探针的组合的分子量对该事件是唯一的，并建立了该事件的鉴定模式。这些分析还表明，pDAB4468的T-链片段已经被插入到棉花基因组DNA中，而不存在aad-12或pat表达盒的重排。
实施例4.1:棉花叶样品收集和基因组DNA分离
从收获自含有棉花事件pDAB4468.19.10.3的个体棉花植物的叶组织中提取基因组DNA。此外，从常规棉花植物Coker310分离了gDNA，Coker310包含用于转化的棉花品系的代表性遗传背景，并且不含有aad-12或pat基因。使用QIAGENMini Prep DNA提取试剂盒(Qiagen,CA)按照经过改良的制造商方案从冷冻干燥的叶组织提取个体基因组DNA。提取之后，使用Pico试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)并用设备(Invitrogen)对DNA进行荧光光谱定量分析。然后在琼脂糖凝胶上使DNA可视化，以确认Pico分析的值并确定DNA品质。
实施例4.2:gDNA消化和分离
为了棉花事件pDAB4468.19.10.3的Southern印迹表征，对10微克(10μg)基因组DNA进行消化。通过向每个DNA样品添加大约10单位选定的限制性内切酶/μg DNA和相应的反应缓冲液，消化来自棉花事件pDAB4468.19.10.3和非转基因棉花品系Coker310的基因组DNA。将每个样品在约37℃下温育过夜。将限制性内切酶NsiI,NcoI,SbflI,SwaI,和NdeI(New England Biolabs,Ipswich,MA)单独用于消化反应。此外，通过将质粒DNA pDAB4468与来自非转基因棉花品种Coker310的基因组DNA混合来制备阳性杂交对照样品。使用与测试样品相同的程序和限制性内切酶消化质粒DNA/基因组DNA鸡尾酒。将消化体系过夜温育后，添加终浓度至0.1M的NaCl来终止酶消化反应。用异丙醇沉淀经过消化的DNA样品。将沉淀的DNA离心沉淀重悬于15μl3X上样缓冲液(0.01％溴酚蓝、10.0mM EDTA、5.0％甘油、1.0mM Tris pH7.5)中。然后在0.85％琼脂糖凝胶上，用0.4X TAE缓冲液(FisherScientific,Pittsburgh,PA)以45伏对DNA样品和分子量标记物电泳大约18-22小时，实现片段分离。用溴化乙锭(Invitrogen,Carlsbad,CA)对凝胶进行染色，并在紫外(UV)光下将DNA可视化。
实施例4.3:Southern转移和膜处理
Southern印迹基本上如Memelink,J.,Swords,K.,Harry J.,Hoge,C.,(1994)Southern,Northern,and Western Blot Analysis.Plant Mol.Biol.Manual F1:1-23所述实施。简而言之，电泳分离和可视化DNA片段之后，用1X变性溶液(1.5M NaOH,20mM EDTA)将凝胶变性20分钟整，然后用1X中和溶液(1.5M NaPO4,pH7.8)清洗至少20分钟。使用芯吸(wicking)系统，用1X转膜液(0.25M焦磷酸钠，pH10)使用尼龙膜进行过夜Southern转移。转移之后，通过将膜在65℃加热1小时或通过UV交联使DNA与膜结合，随后用1X转膜液短暂清洗膜。这个处理过程产生了准备好用于杂交的Southern印迹膜。
实施例4.4:DNA探针标记和杂交
用P32放射性标记的探针检测与尼龙膜结合的DNA片段。探针是通过基于PCR的方法，使用特异性针对基因元件的引物、并按照Taq聚合酶(Qiagen,CA)的标准制造商程序生成的。按照制造商的说明使用READY TO GO LABELING(Amersham,Piscataway,NJ)，用P32标记50ng特异针对每个基因元件的探针DNA和25ng1Kb Plus分子量梯(ladder)(Invitrogen,Carlsbad,CA)。使用Amersham生产的Nucleotide旋柱，并遵循制造商的实验方案纯化探针。
在添加P32放射性标记的探针之前，用封闭缓冲液(2％SDS,0.5％BSA,1mM EDTA,1mM邻二氮菲)在室温下在振荡器上将含有固定的DNA的尼龙膜印迹封闭至少2小时，然后用10ml Perfect HYB Plus缓冲液(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)在65℃在杂交炉中进行预杂交至少1小时。纯化的标记探针在沸水浴中变性5分钟，在冰上放置5分钟，然后加入到经封闭和预杂交的膜上，并在杂交炉中在65℃下放置过夜。
探针杂交之后，将探针溶液丢弃到放射性废物中。将膜印迹在它们原来的杂交管中用1X RibowashTM:(200mM磷酸钠,50mM焦磷酸钠,10mMEDTA,2％SDS,pH至7.8)清洗缓冲液在65℃杂交炉中清洗2次，每次15分钟。按照标准操作程序，将每次清洗液丢弃到放射性废液中。从试管中取出膜，并置于干净的漂洗托盘上，并再次在震荡温育器上在65℃额外清洗15分钟。用塑料膜包裹膜，置于胶片暗盒(film cassette)中，并暴露于感光成像仪(phoshor imager)屏1-3天。使用BioRad Personal FX Phosphor并按照设备和软件的指导进行图像获取。
表4中描述了用于杂交的探针。使用1Kb Plus DNA分子量梯(Invitrogen,Carlsbad,CA)确定Southern印迹上的片段大小。
表4：在棉花事件pDAB4468.19.10.3的Southern分析中使用的探针长度
探针名 基因元件 长度(bp)
aad-12 aad-12 671
Pat pat 525
specR 抗壮观霉素基因 750
OriRep 复制起点 852
trfA 复制起始蛋白trfA 1,119
实施例4.5:Southern印迹结果
表5中提出了基于aad-12和pat基因表达盒的已知限制性酶切位点预测的特定消化和探针的片段大小，以及观察到的片段大小。预测的片段大小是基于pDAB4468的质粒图，观察到的片段大小是来自这些分析的近似结果，并且是基于条带与1Kb Plus DNA分子量梯所指示的大小的对应关系。
从这些消化物和杂交鉴定了两种类型的片段：内部片段，其中已知的酶位点位于探针区域的两侧，并且被完全包含在aad-12表达盒的插入区域内，和边界片段，其中一个已知的酶位点位于探针区的一端，另一个位点预期位于棉花基因组中。每个事件的边界片段的大小不同，因为在大多数情况下，对每个事件而言DNA片段的整合位点是独特(unique)的。边界片段提供了一种定位限制性内切酶位点与整合的DNA的相对位置、以及评估DNA插入物的数量的手段。对多个世代的含有棉花事件pDAB4468.19.10.3的棉花品系进行的Southern印迹分析产生的数据表明，在棉花基因组中插入了一个来自质粒pDAB4468的低拷贝的、完整的aad-12表达盒，从而产生了棉花事件pDAB4468.19.10.3。
限制性内切酶NsiI和SwaI结合并切割质粒pDAB4468内的独特限制位点。随后，选用这些酶对棉花事件pDAB4468.19.10.3中的aad-12基因插入物进行表征。大于6.3Kb或大于4.3Kb的边界片段预计会在消化后分别与探针杂交(表5)。当使用NsiI和SwaI时，分别观察到了大约7.0Kb和大约5.5Kb的单一aad-12杂交条带。此外，选用限制性内切酶NcoI来表征aad-12基因插入物。用于产生棉花事件pDAB4468.19.10.3的质粒，pDAB4468，含有一个独特的位于质粒pDAB4468的表达盒中的NcoI限制位点，和两个位于质粒pDAB4468的“主链”区中的额外位点。预计一个大于2.8kb的边界片段在消化后与探针杂交(表5)。观察到一个大约9.75kb的单一aad-12杂交条带。探针与这样大小的条带的杂交，表明用于棉花事件pDAB4468.19.10.3的棉花基因组中的aad-12基因的单个插入位点的存在。选用三种限制性内切酶组合，Nde、NsiI+NcoI和NsiI+SbfI，来释放含有aad-12表达盒和pat表达盒的不同区域的片段(表5)。NdeI限制性内切酶包括从Ubi10启动子到AtuORF23UTR终止子的aad-12表达盒元件。在用NdeI消化后，在用aad-12探针探查的印迹上观察到一个3.5kb的预测片段。NsiI和NcoI的双消化包括aad-12和pat表达盒元件。双酶消化后，在用aad-12探针探查的印迹上观察到一个3.5kb的预测片段(表5)。NsiI和SbfI的双消化产物同时含有aad-12和pat表达盒元件。用双酶消化后，在用aad-12探针探查的印迹上观察到一个4.8kb的预测片段(表5)。
此外，在用pat探针探查并用上述限制性内切酶(NsiI,NcoI,SwaI,NdeI,NsiI+NcoI和NsiI+SbfI)消化的印迹上，观察到了杂交条带。所得到的印迹产生的条带表明pat表达盒存在于棉花事件pDAB4468.19.10.3中。表5列出了根据pDAB4468的质粒图预测的片段大小，以及通过用pat探测从Southern印迹观察到的片段大小。针对棉花事件pDAB4468.19.10.3得到的这些结果表明，在棉花事件pDAB4468.19.10.3的棉花基因组中插入了一个完整的来自质粒pDAB4468的aad-12表达盒和pat表达盒。
实施例4.6:不存在主链序列
还进行了Southern印迹分析以验证在棉花事件pDAB4468.19.10.3中不存在壮观霉素抗性基因(specR)、复制起点(Ori Rep)元件和复制起始蛋白trfA(trf A元件)。在NsiI消化和用specR特异性探针杂交之后，在阳性对照样品(pDAB4468+Coker310)中观察到一个大约12Kb的预测大小的条带，但在阴性对照和棉花事件pDAB4468.19.10.3中则没有。类似地，在用NcoI消化和用OriRep特异性探针和trfA特异性探针的混合物杂交之后，在阳性对照样品(pDAB4468+Coker310)中观察到一个大约7.25Kb的预测大小条带，但在阴性对照和棉花事件pDAB4468.19.10.3中则没有。这些数据表明在棉花事件pDAB4468.19.10.3中不存在壮观霉素抗性基因、Ori Rep元件和复制起始蛋白trfA。
表5：在Southern印迹分析中预测和观察到的杂交片段。1.根据pDAB4468的质粒图预测的片段大小。2.观察到的片段大小被认为是来自这些分析的近似，并且基于P32-标记的DNA分子量片段的指示大小。
实施例5：在田间试验中对2,4-D耐受
在2010年种植季中，在田间试验中研究了棉花事件pDAB4468.19.10.3对萌发后施用苯氧乙酸除草剂2,4-D的耐受性。在对2-4叶的棉花事件pDAB4468.19.10.3进行了单次萌发后2,4-D施用之后评估除草剂耐受性。对处于此发育阶段的棉花施用2,4-D代表了棉花种植者农通常用于实现满意的杂草控制的施用时机。
通过在药物施用后0-1天(DAA)、7-8DAA、12-16DAA、和24-32DAA对棉花植物的损伤进行评估来测量2,4-D的耐受性。对于上述0-1天的时间增量，测量从施用后6-24小时开始。通过使用线性百分比量表(1-100％)对百分比可见损伤进行等级评定来评估伤害，其中0％表示没有可见的除草剂伤害，而100％代表植物死亡。等级评定是对包括偏上性(epinasty)、失绿、叶片坏死和植物死亡在内的任何除草征候的综合评分。0-1DAA出现的除草征候主要是偏上性，在以后的评估中出现的征候主要是失绿和坏死。
田间试验在横跨美国典型棉花产区的11个地点进行：阿拉巴马州，阿肯色州，加利福尼亚州，佐治亚州，路易斯安那州，密西西比州，北卡罗来纳州，南卡罗来纳州，和田纳西州。试验设计为每个处理4个重复。每个重复间隔一个宽10-15英尺(3.04米至4.57米)的裸土小径(bare-soil alley)。每个处理的小地块(plot)大小为2行20英尺(6.09米)长，行间通常间隔36-40英寸(91.44cm-101.6cm)。试验处理是用2,4-D胺(Weedar64,NuFarm,BurrRidge,IL)以0,1120,2240,或4480克酸当量/公顷(g ae/ha)喷洒棉花事件pDAB4468.19.10.3，每英亩喷洒最终溶液15加仑(56.78升)。因为已知用远低于测试的最低比率(1120g ae/ha)的比率的2,4-D处理即可导致植物死亡，所以在这些实验中没有包含非转化棉花对照处理。
表6提供了萌发后施用2,4-D造成的可见损伤的处理平均值。除了在0-1DAA出现短暂偏上之外，在这些实验中没有观察到农艺学上显著的除草剂损伤。用4480g ae/ha的2,4-D进行处理(其是预期实现广谱杂草控制所需的比率的>4X)，在7-8DAA评估间隔后几乎没有导致作物损伤，证明了棉花事件pDAB4468.19.10.3对2,4-D的强耐受性。
表6：棉花事件pDAB4468.19.10.3在萌发后施用2,4-D之后的可见百分比可见损伤
2,4-D比率(g ae/ha) 0-1DAA 7-8DAA 12-16DAA 24-32DAA
0 0.0 0.0 0.0 0.0
1120 3.6 1.4 0.6 0.0
2240 11.8 3.5 2.7 0.1
4480 19.4 11.0 5.9 0.6
实施例6：在田间试验中对草胺膦的耐受性
在2010种植季的田间试验中，研究了棉花事件pDAB4468.19.10.3对萌发后施用草胺膦的耐受性。除草剂耐受性的评估在对6-8叶棉花事件pDAB4468.19.10.3进行了单次萌发后施用草胺膦之后进行，这代表了通常使用草胺膦实现满意杂草控制的除草剂施用时机。
草胺膦的耐受性通过在药物施用后2-4天(DAA),7-9DAA,13-19DAA,和22-29DAA对棉花植物进行评估来加以测量。伤害的评估是通过使用线性百分比量表(1-100％)对百分比可见损伤进行等级评定来实施，其中0％表示没有可见的除草剂伤害，而100％代表植物死亡。等级评定是包括失绿、叶片坏死、生长停滞和植物死亡在内的任何除草征候的综合评分。除草征候(当存在时)主要是失绿和坏死。
田间试验在横跨美国典型棉花产区的11个地点进行：阿拉巴马州，阿肯色州，加利福尼亚州，佐治亚州，路易斯安那州，密西西比州，北卡罗来纳州，南卡罗来纳州，和田纳西州。试验设计为每个处理4个重复。每个重复间隔一个10-15英尺(3.04米至4.57米)宽的裸土小径。每个处理的小地块(plot)大小为2行20英尺(6.09米)长，并且行间通常间隔36-40英寸(91.44cm-101.6cm)。试验处理是用草胺膦铵盐(Ignite280SLTM,Bayer,ResearchTriangle,NC)以0、542、1084或2168克酸当量/公顷(g ae/ha)喷洒棉花事件pDAB4468.19.10.3，每英亩喷洒最终溶液15加仑(56.78升)。因为比测试的最低比率(542gae/ha)还低得多的草胺膦处理比率预期会导致植物死亡，因此在这些实验中没有包含非转化棉花比照处理。
表7提供了萌发后施用草胺膦造成的可见损伤的处理平均值。除了在用2168g ae/ha(>4X典型使用比率)处理的小地块中在2-4和7-9DAA出现短暂失绿之外，在这些实验中没有观察到农艺学显著上的除草剂损伤。用2168g ae/ha的草胺膦进行处理(其代表>4X预期实现广谱杂草控制所需的比率)，在超出7-9DAA评估间隔后几乎没有导致作物损伤，证明了棉花事件pDAB4468.19.10.3的强耐受性。
表7：棉花事件pDAB4468.19.10.3的在萌发后施用草胺膦之后的百分比可见损伤
草胺膦比率(g ae/ha) 2-4DAA 7-9DAA 13-19DAA 22-29DAA
0 0.0 0.0 0.0 0.0
542 2.7 1.9 0.1 0.0
1084 6.6 4.0 0.2 0.0
2168 13.5 10.0 2.3 0.3
实施例7：在温室试验中对绿草定和氟草烟的耐受性
在温室试验中研究了棉花事件pDAB4468.19.10.3对萌发后施用吡啶氧基乙酸除草剂绿草定和氟草烟的耐受性。在单次萌发后施用绿草定和氟草烟后评估除草剂耐受性。
来自棉花事件pDAB4468.19.10.3的种子在82.5℃的水浴中加热处理1分钟，然后种植在Metro Mix360培养基中，并在温室中使其生长。温室中的温度平均为27℃，光周期设定为16小时光照和8小时黑暗，使用最大光强。让植物生长到发育的3叶期，进行非随机化研究，每种除草剂进行三次处理，三个重复。用履带式喷雾器喷洒植物，喷雾器调节为施用187L/ha的绿草定(Garlon4,Dow AgroSciences,Indianapolis,IN)和氟草烟(Starane,DowAgroSciences,Indianapolis,IN)商业制剂。使用非转化的Coker310棉花品种作为阴性对照。在3DAA(施用后天数)和11DAA评估可见损伤，在除草剂的每个比率之间进行比较。伤害通过目测评估，以使用线性百分比量表(1-100％)的棉花植物叶子的偏上性百分比来量度，其中0％表示没有可见的除草剂伤害，而100％代表植物死亡。
到3DAA为止，棉花事件pDAB4468.19.10.3提供了对高达280g ae/ha的氟草烟水平的耐受性(表8)。此外，棉花事件pDAB4468.19.10.3提供了对绿草定的耐受性(表8)。在3DAA，棉花事件pDAB4468.19.10.3植物显示对绿草定具有中等水平的耐受性，但到11DAA为止，该植物已经从最初的偏上性响应中恢复，并与非转化对照相比提供了强耐受性。由此，研究证明，棉花事件pDAB4468.19.10.3提供了对吡啶氧基乙酸除草剂绿草定和氟草烟的耐受性。
表8：在萌发后施用除草剂绿草定和氟草烟之后观察到的棉花事件pDAB4468.19.10.3的百分比可见损伤
用相同字母后注的平均值没有显著差异(P＝.05,Student-Newman-Keuls)。
实施例8：棉花事件pDAB4468.19.10.3的农艺学表征
在2010年，在横跨整个棉花带的不同地理位置进行的田间试验中，对棉花事件pDAB4468.19.10.3的农艺学特征进行了定量。这些研究比较了棉花事件pDAB4468.19.10.3(施用和不施用除草剂2,4-D和草胺膦)与非转基因近同系(near-isoline)对照Coker310的农艺学性能。在棉花事件pDAB4468.19.10.3和Coker310对照植物之间，没有观察到农艺学有意义的出乎意料的差异。这些田间试验的结果表明，棉花事件pDAB4468.19.10.3和Coker310对照植物在农艺学上等价，并且来自pDAB4468的T-链插入物的存在未改变棉花事件pDAB4468.19.10.3的期望的农艺性能。此外，与没有用除草剂处理喷洒的棉花事件pDAB4468.19.10.3植物相比，棉花事件pDAB4468.19.10.3的农艺性能未由于除草剂2,4-D和草胺膦的施用而改变。
农艺学特征的评估包括幼苗活力、％植物萌发、花芽形成、白花以上主茎节数(Nodes Above White Flower)(NAWF)，和产量确定，并用表9所示的标准进行评价。将收获的纤维送到Fiber and Biopolymer Research Institute，Lubbock,Texas，使用高容量仪器(HVI)对纤维进行评估。
表9：产量试验中评估的农艺学特征
将棉花事件pDAB4468.19.10.3的种子和近等基因系对照系Coker310的种子以每20英尺行80粒种子、行间距34-38英寸(86.36cm-96.52cm)的比率进行种植。该种植设计在每个地点重复4次。每个地点都按照一个完全随机的地块设计(CRBD)来安排，其构成为每个重复3个不喷洒地块和4个喷洒地块。使用标准田间施用率和如上所述的方法用除草剂2,4-D和草胺膦喷洒植物。利用中央的两行(第2和3行)测量农艺学特征和评估植物。对于所有经过测量并进行了统计学分析的农艺学性状，棉花事件pDAB4468.19.10.3的测量农艺性状与Coker310近等基因系对照植物相当。鉴定出的一个例外是棉花事件pDAB4468.19.10.3的除草剂喷洒地块内产生的“％植物萌发”结果。然而，“％植物萌发”数据点是在施用任何除草剂之前采集的，并且该测量结果中的变异可以归因于环境因素。在棉花事件pDAB4468.19.10.3和Coker310对照植物之间没有观察到农艺学上有意义的出乎意料的差异。这些田间试验表明，棉花事件pDAB4468.19.10.3在农艺上与Coker310对照植物等效，并且来自pDAB4468的T-链插入物的存在未改变棉花事件pDAB4468.19.10.3的预期农艺学性状。此外，与没有用除草剂喷洒的棉花事件pDAB4468.19.10.3植物相比，除草剂2,4-D和草胺膦的施用并没有导致棉花事件pDAB4468.19.10.3的农艺学性能改变。
表10：处理(喷洒除草剂)和未处理(未喷洒除草剂)事件的统计数据，与近等基因系对照棉花植物比较
实施例9：棉花事件pDAB4468.19.10.3的全长序列
SEQ ID NO:21提供了棉花事件pDAB4468.19.10.3的序列。该序列含有5’基因组侧翼序列、pDAB4468的T-链插入物和3’基因组侧翼序列。对于SEQ ID NO:21，残基1-1,354是5’基因组侧翼序列，残基1,355-7,741是pDAB4468T-链插入物的残基，而残基7,742-10,471是3’侧翼序列。因此，关于插入物5’端的接点序列或过渡出现在SEQ ID NO:21的残基1,354/1,355。关于插入物3’端的接点序列或过渡出现在SEQ ID NO:21的残基7,741/7,742。
应当注意到，在从棉花事件pDAB4468.19.10.3衍生的后续世代植物中，棉花事件pDAB4468.19.10.3的T-链插入物的实际序列可能略微偏离SEQ ID NO:21。在基因渗入过程中，插入物发生缺失或其他改变并不是罕见的。本领域技术人员会预期从棉花事件pDAB4468.19.10.3衍生的后续世代植物中找到序列的细微差别和微小的差异。因此，本文提供的质粒序列的相关区段在从棉花事件pDAB4468.19.10.3衍生的后续世代植物中可能包含一些微小变异。因此，包括具有与主题插入序列具有一定范围的同一性的多核苷酸的植物也在本发明实施方案的范围之内。与SEQ ID NO：21的序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性的多核苷酸序列，在本发明实施方案的范围内。侧翼序列加上插入序列的序列可参考所保藏的种子进行确认。因此，SEQ ID NO:21与从棉花事件pDAB4468.19.10.3衍生的后续世代植物中的实际T-链插入物之间可能鉴定出一些差异，这些差异在本发明实施方案的范围内。
实施例10：在温室试验中对绿草定及氟草烟的丁酸的耐受性
在温室试验中研究了棉花事件pDAB4468.19.10.3对萌发后施用包含丁酸基团的除草剂——绿草定-B和氟草烟-B的耐受性。在单次萌发后施用这两种分子后，评估除草剂耐受性。
将来自棉花事件pDAB4468.19.10.3的种子在82.5℃的水浴中加热处理1分钟，然后种植在Metro Mix360培养基中，并在温室中使其生长。温室中的温度平均为27℃，光周期设定为16小时光照和8小时黑暗，使用最大光强。让植物生长到发育的2-3叶期，用每种除草剂进行非随机化研究，实施三次处理，每次4个重复。获取包含额外的丁酸部分的吡啶基氧基乙酸除草剂氟草烟-B和绿草定-B，并施用给棉花植物。分别在97％丙酮和3％DMSO的溶液中配制活性成分。此外，添加作物油浓缩液至终浓度为1.25％。用履带式喷雾器喷洒植物，该喷雾器被调节以施用187L/ha的配好的技术物料。使用非转化的Coker310棉花品种作为阴性对照。在6HAA(施用后小时数),1DAA(施用后天数),3DAA,6DAA和14DAA评估可见损伤，并在每个除草剂比率之间进行比较。对伤害进行目测评估，以使用线性百分比量表(1-100％)的棉花植物叶子的偏上性百分比来量度，其中0％表示没有可见的除草剂伤害，而100％代表植物死亡。
棉花事件pDAB4468.19.10.3提供了对不同浓度的氟草烟-b和绿草定-b的耐受性(表11和表12)。在6HAA，棉花事件pDAB4468.19.10.3植物显示对氟草烟-b和绿草定-b具有中等水平的耐受性，但到14DAA为止，该植物已经从最初的偏上性响应中恢复，并与非转化对照相比提供了强耐受性。由此，研究证明，棉花事件pDAB4468.19.10.3提供了对丁酸形式的吡啶氧基乙酸除草剂氟草烟-b和绿草定-b的耐受性。

Claims (3)

1.一种具有赋予对苯氧乙酸、吡啶氧基乙酸、和草胺膦除草剂的耐受性的单一转基因事件的棉花植物的育种方法，所述方法包括：
将第一棉花植物与第二棉花植物杂交，其中所述第一棉花植物的基因组DNA包含SEQID NO:21的核苷酸序列，从而产生在其基因组中含有SEQ ID NO:21的核苷酸序列的第三棉花植物。
2.权利要求1的方法，其中所述第一棉花植物包含AAD-12/PAT棉花事件pDAB4468.19.10.3，该第一棉花植物的代表性棉花种子已经以保藏号PTA-12457保藏在美国典型培养物保藏中心。
3.权利要求1的方法，该方法进一步包括：
通过检测选自下组的核苷酸序列，测定所述第三棉花植物的基因组DNA中的所述单一转基因事件的存在：SEQ ID NO:1的bp 1329-1380；SEQ ID NO:2的bp 143-194；及其互补序列。
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