CN101553111A - 新除草剂抗性基因 - Google Patents

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Abstract

本发明提供不仅对2，4－滴具有抗性，而且还对吡啶氧乙酸类除草剂具有抗性的新植物。迄今为止，还没有预期或提出可通过引入单个基因产生具有这两种有利特性的植物。本发明还包括这样的植物：其产生与一种或多种其他除草剂抗性基因“叠加”的一种或多种本发明的酶。本发明使得可以以新的方式使用除草剂的新组合。此外，本发明提供预防产生并控制对一种或多种除草剂(如草甘膦)具有抗性的杂草株系的新方法。本发明用途中优选的酶和基因在本文中称为AAD－12(芳氧基链烷酸酯双加氧酶)。这一高度新颖的发现是重要的除草剂耐性作物性状和选择标记可能性的基础。

Description

新除草剂抗性基因
发明背景
杂草可以迅速耗尽土壤中作物和其他目的植物所需的有价值的养分。目前有多种不同类型的除草剂用于控制杂草。一种特别流行的除草剂是草甘膦。
已经开发了对草甘膦具有抗性的作物，如玉米、大豆、芸苔、棉花、甜菜、小麦、草坪草和稻。因此可以例如对草甘膦抗性大豆生长活跃的田地喷洒草甘膦以控制杂草而不显著损害大豆植物。
随着二十世纪九十年代中期遗传改造的草甘膦耐性作物(GTC)的引入，在农业中前所未有地使种植者能够以简单、便利、灵活且廉价的工具控制广谱阔叶和禾本科杂草。因此，生产者们迅速采用了GTC，并在很多情况下放弃了多种公认最佳的农业实践，如作物轮作、除草剂作用方式轮作、罐混、将杂草的化学防治和栽培防治与机械防治有机结合起来。目前在美国和西半球其他地方可以购买到草甘膦耐性大豆、棉花、玉米和芸苔。苜蓿是第一种引入的多年生GTC，助长了在一定的年限内反复地对相同的作物和田地重复使用甘草膦的可能性。取决于全球市场的接受度，更多的GTC(如小麦、稻、甜菜、草坪草等等)正准备引入。许多其他草甘膦抗性物种正处于实验至开发阶段(如甘蔗、向日葵、甜菜、豌豆、胡萝卜、黄瓜、莴苣、洋葱、草莓、番茄和烟草；林业物种如白杨和香枫；园艺物种如金盏花、矮牵牛花和秋海棠；参阅站点“isb.vt.edu/cfdocs/fieldtests1.cfm，2005”)。此外，近年来草甘膦的费用已经急剧降低，达到了几乎没有常规杂草控制程序能在价格和性能上与草甘膦GTC系统有效竞争的程度。
草甘膦已经在灭生(burndown)地区和其他非作物地区成功用于总植被控制15年以上。在许多情况下(如对于GTC)，可以在连续的3、5、10直至15年中每年使用草甘膦1-3次。这些情况已经导致对草甘膦和GTC技术的过度依赖，并对天然杂草物种中对草甘膦天然更具耐受性或已经发展出抗草甘膦除草剂活性机制的植物施加了高选择压。
仅用草甘膦的杂草控制程序的广泛使用正导致对草甘膦抗性杂草的选择，并且正在选择固有地比多数靶物种更能耐受草甘膦的杂草物种后代(即杂草演替)(Powles和Preston，2006；Ng等，2003；Simarmata等，2003；Lorraine-Colwill等，2003；Sfiligoj，2004；Millar等，2003；Heap，2005；Murphy等，2002；Martin等，2002)。尽管草甘膦已经在全球广泛使用15年以上，仅有少数杂草据报道已发展出对草甘膦的抗性(Heap，2005)，然而它们中的大多数都鉴定于过去的5年。抗性杂草包括禾本科植物和阔叶物种一硬直黑麦草(Lolium rigidum)、多花黑麦草(Lolium multiflorum)、牛筋草(Eleusine indica)、假高梁(Sorghum halepense)、豚草(Ambrosiaartemisiifolia)、小飞蓬(Conyza canadensis)、野塘蒿(Conyza bonariensis)、长叶车前(Plantago lanceolata)、长芒苋(Amaranthus palmerii)和Amaranthus rudis。此外，在广泛使用GTC之前并不是农业问题的杂草现在开始大大盛行，并且难于在GTC的范围内(包括＞80％的美国棉花和大豆地区和＞20％的美国玉米地区)控制(Gianessi，2005)。这些杂草演替主要与(但不仅与)难于控制的阔叶杂草一起出现。一些实例包括番薯属(Ipomoea)、苋属(Amaranthus)、藜属(Chenopodium)、蒲公英属(Taraxacum)和鸭跖草属(Commelina)的物种。
在种植者要面对草甘膦抗性杂草或演替成更难于控制的杂草物种的地区，种植者可以通过罐混或换用能控制遗漏杂草的其他除草剂来弥补草甘膦的弱点。在许多情况下控制阔叶逃逸的一种流行且有效的罐混伴侣为2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-滴)。2，4-滴已经在农业和非作物条件下用于广谱阔叶杂草控制60年以上。已有关于更具耐性物种的个案报道，但2，4-滴仍是全球最广泛使用的除草剂之一。对进一步使用2，4-滴的限制在于它在双子叶农作物(如大豆或棉花)中的选择性极差，因此2，4-滴一般不用于(且一般不靠近)敏感性双子叶作物。此外，2，4-滴在禾本科作物中的用途在某种程度上受限于会发生的作物损伤的性质。2，4-滴和草甘膦的组合已经用于在种植免耕大豆和棉花之前提供更强的灭生处理，然而，由于这些双子叶物种对2，4-滴的敏感性，这些灭生处理必须至少在种植前14-30天进行(Agriliance，2005)。
和MCPA一样，2，4-滴是苯氧酸类除草剂。2，4-滴已经用于在许多单子叶作物(如玉米、小麦和稻)中选择性控制阔叶杂草而不严重损伤目的作物植物。2，4-滴是合成的植物生长素衍生物，其作用为使正常的细胞激素内稳态失调，并阻碍平衡的受控生长，然而其确切的作用模式仍不了解。绿草定和氟草烟是吡啶氧乙酸类除草剂，其作用模式也与合成的植物生长素相同。
这些除草剂对某些植物具有不同水平的选择性(如双子叶植物比禾本科植物更敏感)。不同植物对这些除草剂的差异代谢是不同水平选择性的一种解释。通常植物缓慢代谢2，4-滴，因此靶位点的不同活性更可能解释植物对2，4-滴不同的应答(WSSA，2002)。2，4-滴的植物代谢一般通过两步代谢实现，通常是羟基化后接着与氨基酸或葡萄糖缀合(WSSA，2002)。
随着时间的发展，微生物种群已经发展出降解此特定外来物的有效的替代途径，这导致2，4-滴的完全矿化。对微生物连续应用除草剂选择了能利用除草剂作为碳源生长(从而使其在土壤中具有竞争优势)的微生物。因为这个原因，目前制备的2，4-滴具有相对短的土壤半衰期，并且没有遇到对其后的作物明显的延续效应(carryover effect)。这促进了2，4-滴的除草剂应用。
已经广泛研究了其降解2，4-滴能力的一种生物是真养雷氏菌(Ralstoniaeutropha)(Streber等，1987)。编码矿化途径中第一个酶促步骤的基因为tfdA。参阅美国专利No.6,153,401和GENBANK登录号M16730。TfdA通过α-酮戊二酸依赖性双加氧酶反应催化2，4-滴酸转化成二氯苯酚(DCP)(Smejkal等，2001)。DCP与2，4-滴相比几乎不具有除草剂活性。TfdA在转基因植物中用于向通常对2，4-滴敏感的双子叶植物(如棉花和烟草)赋予2，4-滴抗性(Streber等(1989)，Lyon等(1989)，Lyon(1993)和美国专利No.5,608,147)。
已在环境中鉴定了大量编码能降解2，4-滴的蛋白质的tfdA型基因并已保存于Genbank数据库。许多同源物与tfdA类似(氨基酸同一性＞85％)并具有与tfdA相似的酶特性。然而，有大量同源物与tfdA具有显著更低的同一性(25-50％)，但却具有与α-酮戊二酸双加氧酶Fe+2双加氧酶相关的特征性残基。因此这些不同的双加氧酶的底物特异性是什么并不明确。
与tfdA具有低同源性(氨基酸同一性31％)的独特实例是来自食酸戴尔福特菌(Delftia acidovorans)的sdpA(Kohler等，1999，Westendorf等，2002，Westendorf等，2003)。已经显示此酶催化(S)-2，4-滴丙酸(和其他(S)-苯氧丙酸)以及2，4-滴(苯氧乙酸)矿化的第一步(Westendorf等，2003)。迄今仍没有将此基因转化进植物的报道。
新除草剂耐受作物(HTC)技术的开发很大程度上受到GTC的效力、低费用和便利性的限制。因此，GTC在生产者中的采用率非常高。这很难刺激开发新的HTC技术。
芳氧基链烷酸酯化学亚结构是许多商业除草剂(包括苯氧乙酸植物生长素(如2，4-滴和2，4-滴丙酸)、吡啶氧乙酸植物生长素(如氟草烟和绿草定)、芳氧基苯氧丙酸酯(AOPP)乙酰辅酶A羧化酶(ACC酶)抑制剂(如吡氟氯禾灵(haloxyfop)、喹禾灵(quizalofop)和禾草灵(diclofop))和5-取代的苯氧乙酸原卟啉原氧化酶IX抑制剂(如霸草灵(pyraflufen)和氟胺草酯(flumiclorac)))的通用实体。然而，这些除草剂类别的差别都很大，并且目前的文献中没有这些化学制品类别中共有的降解途径的证据。最近已描述降解涵盖多种作用模式的除草剂的多功能酶(PCT US/2005/014737；2005年5月2日提交)。下文将描述另一种独特的多功能酶和潜在用途。
发明概述
本发明提供不仅对2，4-滴具有抗性，而且还对吡啶氧乙酸类除草剂具有抗性的新植物。迄今为止，还没有预期或提出可通过引入单个基因产生具有这两种有利特性的植物。本发明还包括这样的植物：其产生与一种或多种其他除草剂抗性基因(包括但不仅限于草甘膦-、ALS-(咪唑啉酮、磺酰脲)、芳氧基链烷酸酯-、HPPD-、PPO-和草铵膦-抗性基因)“叠加”的一种或多种本发明的酶，以提供与更广更多的强杂草控制和除草剂抗性管理选择相容的除草剂耐性植物。本发明还包括利用本文举例说明的基因和蛋白质的同源物的方法和组合物。
在一些实施方案中，本发明提供对2，4-滴、MCPA、绿草定、氟草烟和一种或多种市售除草剂(如草甘膦、草铵膦、百草枯、ALS抑制剂(如磺酰脲类、咪唑啉酮类、三唑并嘧啶磺酰胺类等)、HPPD抑制剂(如硝草酮(mesotrione)、异噁唑草酮(isoxaflutole)等)、麦草畏(dicamba)、溴草腈、芳氧基苯氧丙酸酯等等)具有耐受性的单子叶和双子叶植物。还公开了含有负责这类除草剂耐性的核酸序列的载体以及将这些耐性植物和除草剂组合用于杂草控制和防止杂草种群演替的方法。本发明使得可以以新的方法使用除草剂的新组合。此外，本发明提供预防产生并控制对一种或多种除草剂(如草甘膦)具有抗性的杂草株系的新方法。本发明赋予除草剂和作物的新组合的新用途，包括在种植否则会对该除草剂(如2，4-滴)敏感的植物的种子之前对将种植的地区进行的种植前应用。
本发明部分涉及酶的鉴定，所述酶不仅能降解2，4-滴，而且还令人吃惊地具有例如使本发明的酶区别于先前已知的tfdA蛋白质的新特性。更具体的，本发明涉及能降解2，4-滴和吡啶氧乙酸类除草剂的酶的用途。先前已报道的α-酮戊二酸依赖性双加氧酶均不具有降解苯氧乙酸和吡啶氧乙酸类植物生长素除草剂的能力。本发明使用的优选酶和基因在本文中称为AAD-12(芳氧基链烷酸酯双加氧酶)。这一高度新颖的发现是重要的除草剂耐性作物(HTC)性状和选择标记可能性的基础。本发明所述植物在其全部生命周期中具有抗性。
之前没有动机产生含有AAD-12基因(优选如本文所示例的具有为了在一种或多种类型植物中表达而优化的序列的AAD-12多核苷酸)的植物，也不会预期这类植物能有效的产生AAD-12酶以使植物对苯氧乙酸类除草剂(如2，4-滴)和/或一种或多种吡啶氧乙酸类除草剂(如绿草定和氟草烟)具有抗性。因此，本发明提供了许多本领域迄今未曾设想过的优点。
本发明还部分涉及编码能降解苯氧乙酸类植物生长素和/或吡啶氧乙酸类植物生长素除草剂的芳氧基链烷酸酯双加氧酶的基因的鉴定和用途。筛选蛋白质的这些活性的方法也在本发明的范围内。因此，本发明包括通过重组表达的AAD-12酶对2，4-二氯苯氧乙酸和其他芳氧基链烷酸酯类植物生长素除草剂的降解。本发明还包括控制杂草的方法，其中所述方法包括对含有AAD-12基因的植物应用一种或多种吡啶氧乙酸类或苯氧乙酸类植物生长素除草剂。本发明还提供使用AAD-12基因作为鉴定转化了AAD-12的植物细胞和完整植物的选择标记物的方法，所述植物细胞和完整植物任选地包含同时插入靶植物细胞的一种、两种或更多外源基因。本发明的方法包括选择对适当水平的除草剂具有抗性的转化细胞。本发明还包括通过培养本发明的植物和/或细胞制备具有芳氧基链烷酸酯双加氧酶生物活性的多肽的方法。
附图的简短说明
图1显示本发明AAD-12酶催化的一般化学反应。
图2是示例的AAD-12蛋白质、TfdA、AAD-2、AAD-1和TauD的氨基酸序列比对。
图3显示AAD-12(v2)对2，4-滴和2，4-滴丙酸对映异构体的活性。
序列简述
SEQ ID NO：1为来自食酸戴尔福特菌的AAD-12核苷酸序列。
SEQ ID NO：2为翻译的由SEQ ID NO：1编码的蛋白质序列。
SEQ ID NO：3为植物优化的核苷酸序列AAD-12(v1)。
SEQ ID NO：4为翻译的由SEQ ID NO：3编码的蛋白质序列。
SEQ ID NO：5为大肠杆菌优化的核苷酸序列AAD-12(v2)。
SEQ ID NO：6为M13正向引物序列。
SEQ ID NO：7为M13反向引物序列。
SEQ ID NO：8为正向AAD-12(v1)PTU引物序列。
SEQ ID NO：9为反向AAD-12(v1)PTU引物序列。
SEQ ID NO：10为正向AAD-12(v1)编码PCR引物序列。
SEQ ID NO：11为反向AAD-12(v1)编码PCR引物序列。
SEQ ID NO：12显示“sdpacodF”AAD-12(v1)引物序列。
SEQ ID NO：13显示“sdpacodR”AAD-12(v1)引物序列。
SEQ ID NO：14显示“Ncol of Brady”引物序列。
SEQ ID NO：15显示“Sacl of Brady”引物序列。
发明详述
本发明开发的2，4-滴抗性基因及相应的抗性作物提供用于在作物中控制草甘膦抗性(或高耐性和演替的)阔叶杂草物种的优良选择。2，4-滴是广谱、相对便宜且强力的阔叶除草剂，如果在双子叶和单子叶作物中同样能提供更强的作物耐性，则可为种植者提供优良的效用。2，4-滴耐性转基因双子叶作物还可在应用时间和用量上具有更高的灵活性。2，4-滴除草剂耐性性状的另一用途是它可用于预防2，4-滴漂移、挥发、转化(inversion)(或其他远距离的移动现象)、误用、破坏等等对正常敏感性作物的损害。AAD-12基因的另一益处是，与目前已表征的所有tfdA同源物不同，AAD-12除了能降解非手性苯氧基植物生长素(如2，4-滴、MCPA、4-氯苯氧乙酸)以外，还能降解吡啶氧乙酸类植物生长素(如绿草定、氟草烟)。见表1。图1所示为本发明AAD-12酶催化的化学反应的一般图解(O2的加入是立体特异性的；中间产物自发分解为苯酚和乙醛酸)。应当理解图1中的化学结构表示分子骨架，还应理解图1包含多种R基团以及相似的基团(如表1所示)，但并未对其进行必要地具体阐明。已经全球使用不同苯氧基植物生长素组合的多种混合来处理不同地区特定的杂草谱和环境条件。在植物中使用AAD-12基因可以提供对更广谱的植物生长素除草剂的防护，从而提高灵活性和可控制的杂草谱。本发明还可用于对所有市售苯氧基植物生长素的漂移或其他远距离合成的植物生长素除草剂损伤的防护。表1详细说明市售的吡啶氧基和苯氧基植物生长素，并提供相应的化学结构。
Figure A20068005015200171
Figure A20068005015200181
现已鉴定了单个基因(AAD-12)，其在遗传改造用于植物表达后具有允许在植物中使用苯氧基植物生长素除草剂的特性，所述植物中固有耐性根本不存在或不足以允许使用这些除草剂。此外，AAD-12可以在植物天然耐性不足以允许选择性时在植物中提供对吡啶氧乙酸除草剂的防护，扩展了这些除草剂的潜在效用。现在可以以一种、两种或几种苯氧基植物生长素除草剂的组合相继或罐混地处理仅含AAD-12的植物。用于控制广谱双子叶杂草的每种苯氧基植物生长素除草剂的用量范围从25到4000gae/ha，更通常从100到2000g ae/ha。类似的，可以对具有降低的来自吡啶氧乙酸植物生长素除草剂损伤风险的表达AAD-12的植物应用一种、两种或几种所述除草剂化合物的混合物。用于控制其他双子叶杂草的每种吡啶氧乙酸除草剂的用量范围可以从25到2000g ae/ha，更通常是从35到840g ae/ha。
草甘膦被广泛地使用，因为它控制非常广谱的阔叶和禾本科杂草物种。然而，在GTC和非作物应用中重复使用草甘膦已经(而且仍将继续)选择使杂草演替为天然更具耐性的物种或草甘膦抗性生物型。多数除草剂抗性管理策略建议使用有效用量的罐混除草剂伴侣作为延缓出现抗性杂草的方法，所述除草剂伴侣提供对同一物种的控制，但具有不同的作用模式。将AAD-12与草甘膦耐性性状(和/或其他除草剂耐性性状)叠加可通过能对同一作物选择性使用草甘膦、苯氧基植物生长素(如2，4-滴)和吡啶氧乙酸类植物生长素除草剂(如绿草定)来提供允许控制GTC中草甘膦抗性双子叶杂草物种的机制。这些除草剂的应用可以是在含有不同作用模式的两种或更多除草剂的罐混合物中同时使用；在相继应用(如种植前、出苗前或出苗后)中单个除草剂组合物的单独使用(使用的间隔时间范围从大约2小时到大约3个月)；或者备选地，可以在任何时间(从种植作物大约7个月内到收获作物时(或对于单个除草剂为收获前间隔，取最短者))应用代表每种化学类别的任意数目除草剂的任意组合。
在控制广谱禾本科和阔叶杂草中具有灵活性是很重要的，即使用时间、单个除草剂用量和控制顽固或抗性杂草的能力。作物中与草甘膦抗性基因/AAD-12叠加的草甘膦应用的范围可以是大约250-2500g ae/ha；苯氧基植物生长素除草剂(一种或多种)可按照大约25-4000g ae/ha应用；而吡啶氧乙酸植物生长素除草剂(一种或多种)可按照25-2000g ae/ha应用。这些应用的最佳组合和时间取决于具体的情况、物种和环境，并可由杂草控制领域得益于本公开内容的的技术人员最佳决定。
在完整的生长周期中，幼苗通常是抗性的。转化的植物在基因表达的任意时间一般对新除草剂应用具有抗性。本文显示贯穿生命周期的对2，4-滴的耐受性，通过使用迄今检测的组成型启动子(主要是CsVMV和AtUbi10)。一般期望如此，但是这是一种基于其他非代谢活性的改进，比如，通过减少抗性作用机制位点的表达显著影响耐性。一个例子是抗农达(Roundup Ready)棉花，如果在早期喷洒，植物具有抗性，但是如果喷洒太晚，草甘膦在分生组织聚集(因为其不被代谢和转位)；使用的病毒启动子孟山都(Monsanto)不能在花中很好的表达。本发明在这些方面提供改进。
除草剂制剂(如酯、酸或盐制剂或可溶浓缩剂、乳化浓缩剂或可溶液体)和罐混添加剂(如佐剂、表面活性剂、漂移阻滞剂或相容剂)可显著影响给定的除草剂或一种或多种除草剂的组合的杂草控制。这些和任意前述除草剂化学性质的任意组合都在本发明的范围内。
本领域技术人员还会了解，两种或更多作用模式的组合在提高受控杂草谱和/或在控制天然更具耐性或抗性杂草物种方面的益处，并还可扩展到通过人工参与(转基因或非转基因)在作物中产生除GTC外的除草剂耐性的化学性质。事实上，可以单独或以多重组合叠加编码以下抗性的性状以提供有效控制或防止杂草演替和/或对任意所述类别除草剂的抗性的能力：草甘膦抗性(如抗性植物或细菌EPSPS、草甘膦氧化还原酶(GOX)、GAT)、草铵膦抗性(如Pat、bar)、乙酰乳酸合酶(ALS)抑制性除草剂抗性(如咪唑啉酮类、磺酰脲类、三唑并嘧啶磺酰胺类、嘧啶硫代苯甲酸类(pyrmidinylthiobenzoates)和其他化学品如AHAS，Csr1，SurA等)、溴草腈抗性(如Bxn)、对HPPD(4-羟苯基丙酮酸双加氧酶)酶抑制剂的抗性、对八氢番茄红素去饱和酶(PDS)抑制剂的抗性、对光系统II抑制性除草剂的抗性(如psbA)、对光系统I抑制性除草剂的抗性、对原卟啉原氧化酶IX(PPO)抑制性除草剂的抗性(如PPO-1)、对苯脲除草剂的抗性(如CYP76B1)、二氯甲氧苯酸降解酶(参阅如US 20030135879)等等。体内修饰的EPSPS以及I类、II类和III类草甘膦抗性基因可用于某些优选的实施例。
关于其他除草剂，一些其他优选的ALS抑制剂包括但不仅限于：磺酰脲类(如绿磺隆(chlorsulfuron)、氯吡嘧磺隆(halosulfuron)、烟嘧磺隆(nicosulfuron)、甲嘧磺隆(sulfometuron)、磺酰磺隆(sulfosulfuron)、三氟啶磺隆(trifloxysulfuron))、咪唑啉酮类(如甲氧咪草烟(imazamox)、咪草烟(imazethapyr)、灭草喹(imazaquin))、三唑并嘧啶磺酰胺类(如氯酯磺草胺、双氯磺草安、双氟磺草胺、唑嘧磺草胺、磺草唑胺(metosulam)和嘧啶并三唑类磺胺(penoxsulam)、嘧啶硫代苯甲酸类(如双草醚(bispyribac)和嘧草硫醚(pyrithiobac))和氟酮磺隆(flucarbazone)。一些优选的HPPD抑制剂包括但不仅限于：甲基磺草酮、异噁唑草酮和磺草酮。一些优选的PPO抑制剂包括但不仅限于：氟胺草酯、丙炔氟草胺、氟哒嗪草酯(flufenpyr)、吡草醚(pyraflufen)、哒草氟(fluthiacet)、氟丙嘧草酯、唑草酮、甲磺草胺和二苯醚(如三氟羧草醚、氟磺胺草醚、乳氟禾草灵和乙氧氟草醚)。
此外，可以将AAD-12单独或与一种或多种其他HTC性状叠加后再与一种或多种其他输入(如昆虫抗性、真菌抗性或胁迫耐受性等)或输出(如提高的产量、改进的油谱、提高的纤维品质等)性状叠加。因此，本发明可用于提供以灵活且经济地控制任何数目的农学害虫的能力来提高作物品质的完整农学解决方案。
本发明部分涉及鉴定不仅能降解2，4-滴，而且令人惊奇地具有使本发明的酶区别于先前已知的(例如)tfdA蛋白的新特性的酶。尽管此酶与tfdA的同源性很低，但本发明的基因一般仍可归类到α-酮戊二酸依赖性双加氧酶的同一总家族。此家族蛋白质的特征在于包含活性位点的“HX(D/E)X23-26(T/S)X114-183HX10-13R”基序中的三个保守性组氨酸残基。组氨酸与活性位点中催化活性所必需的Fe+2离子配位(Hogan等，2000)。设计了本文所讨论的初步体外表达实验以帮助选择新属性。这些实验还说明AAD-12酶与先前提交的专利申请(PCT US/2005/014737；2005年5月2日提交)中公开的同类另一种不同的酶有区别。前一申请中的AAD-1酶与本发明中AAD-12蛋白质只具有大约25％的序列同一性。
更具体的，本发明部分涉及不仅能降解2，4-滴而且还能降解吡啶氧乙酸类除草剂的酶的用途。先前已经报道的α-酮戊二酸依赖性双加氧酶均不具有降解不同化学类别和作用方式的除草剂的能力。本发明用途中优选的酶和基因在本文中称为AAD-12(芳氧基链烷酸酯双加氧酶)基因和蛋白质。
本发明还部分涉及编码能降解苯氧基生长素和吡啶氧乙酸类除草剂的芳氧基链烷酸酯双加氧酶的基因的鉴定和用途。因此，本发明部分涉及通过重组表达的AAD-12酶降解2，4-二氯苯氧乙酸、其他苯氧乙酸和吡啶氧乙酸类除草剂。
在分析测定中，本发明的蛋白质对2，4-滴到2，4-二氯苯酚(“DCP”，无除草剂活性)的转化测试为阳性。部分纯化的本发明蛋白质能在体外将2，4-滴迅速转化为DCP。转化AAD-12的植物提供的另一优点是母体除草剂代谢为失活形式，从而降低谷物或秸秆中收获除草剂残留物的可能。
本发明还包括控制杂草的方法，其中所述方法包括对含有AAD-12基因的植物应用吡啶氧乙酸和/或苯氧基生长素除草剂。
根据这些发现，现在提供了含有编码这类酶的多核苷酸的新植物。迄今为止还没有产生这类植物的动机，也不会预期这样的植物能有效产生此酶，不仅赋予植物对苯氧乙酸类除草剂(如2，4-滴)的抗性，而且赋予植物对吡啶氧乙酸类除草剂的抗性。因此，本发明提供本领域从未设想过的许多优点。
可以获得(保藏于培养物保藏中心如ATCC或DSMZ的)公共可得的菌株并使用本文公开的技术筛选新基因。本文公开的序列可用于扩增同源基因并克隆进重组表达系统，以根据本发明进一步进行筛选和测试。
如上文背景章节所讨论的，已被广泛研究其降解2，4-滴能力的一种生物为真养雷氏菌(Streber等，1987)。编码降解途径中第一种酶的基因为tfdA。参阅美国专利No.6,153,401和GENBANK登录号M16730。tfdA通过α-酮戊二酸依赖性双加氧酶反应催化2，4-滴酸转化成无除草剂活性的DCP(Smejkal等，2001)。tfdA已在转基因植物中用于将2，4-滴抗性赋予通常对2，4-滴敏感的双子叶植物(如棉花和烟草)(Streber等，1989；Lyon等，1989；Lyon等，1993)。已经从环境中鉴定了编码能降解2，4-滴的蛋白质的大量tfdA型基因并保存于Genbank数据库。许多同源物与tfdA非常相似(氨基酸同一性＞85％)并具有与tfdA相似的酶特性。然而，现在鉴定了与tfdA具有低水平同源性的小部分α-酮戊二酸依赖性双加氧酶同源物。
本发明部分涉及远缘酶sdpA新用途和功能的令人惊奇的发现，该酶来自食酸戴尔福特菌(Westendorf等，2002、2003)与tfdA具有低同源性(氨基酸同一性31％)。先前已经显示以其天然形式纯化的这种α-酮戊二酸依赖性双加氧酶可降解2，4-滴和S-2，4-滴丙酸(Westendorf等，2002和2003)。然而，先前已报道的α-酮戊二酸依赖性双加氧酶均不具有降解吡啶氧乙酸化学类别除草剂的能力。从未在植物中表达过sdpA，也没有动机这样做，部分是因为新HTC技术的开发已经在很大程度上受到GTC的效能、低费用和便利性的限制(Devine，2005)。
根据新的活性，本发明的新蛋白质和基因在本文中称为AAD-12蛋白和基因。目前已证实AAD-12在体外降解多种苯氧乙酸类生长素除草剂。然而，如本文所第一次报道的，惊奇地发现此酶还能降解芳氧基链烷酸酯类分子的其他底物。具有重要农学意义的底物包括吡啶氧乙酸类生长素除草剂。这一高度新颖的发现是重要的除草剂耐受作物(HTC)和选择标记物性状可能性的基础。此酶的独特性在于其传递对一系列广谱阔叶除草剂(苯氧乙酸类和吡啶氧乙酸类生长素)的除草剂降解活性的能力。
因此，本发明部分涉及通过重组表达的芳氧基链烷酸酯双加氧酶(AAD-12)降解2，4-二氯苯氧乙酸、其他苯氧乙酸类生长素除草剂和吡啶氧乙酸类除草剂。本发明还部分涉及编码能降解苯氧基和/或吡啶氧基生长素除草剂的芳氧基链烷酸酯双加氧酶降解酶(AAD-12)的基因的鉴定和用途。
本发明的酶可进行转基因表达，导致对控制几乎所有阔叶杂草的除草剂组合的耐性。AAD-12可作为优秀的除草剂耐受作物(HTC)性状与例如其他HTC性状(如草甘膦抗性、草铵膦抗性、ALS-抑制剂(如咪唑啉酮类、磺酰脲类、三唑并嘧啶磺酰胺类)抗性、溴草腈抗性、HPPD抑制剂抗性、PPO抑制剂抗性等)和昆虫抗性性状(Cry1F、Cry1Ab、Cry 34/45、其他苏云金芽孢杆菌(Bt)蛋白质或非芽孢杆菌属来源的杀虫剂蛋白质等)叠加。此外，AAD-12可作为选择标记物辅助选择用另一个基因或基因群遗传改造的植物的原代转化体。
此外，已经重新设计了本发明的微生物基因，以使该蛋白质由单子叶和双子叶植物使用偏好的密码子编码(hemicot)。已经用含有AAD-12的构建体转化了拟南芥、玉米、烟草、棉花、大豆、芸苔和稻，并已证明了对苯氧基和吡啶氧基生长素除草剂的高水平抗性。因此，本发明还涉及编码本发明蛋白质的“植物优化的”基因。
氧基链烷酸酯(Oxyalkanoate)基团可用于将稳定的酸官能团引入除草剂。酸性基团可通过“酸捕获”赋予韧皮部活动性(除草剂作用所需的属性)，从而可以为了活动性目的而整合进新除草剂。本发明的方面还提供产生HTC的机制。存在很多可能为AAD-12底物的市售和实验性除草剂。因此，使用本发明基因还可以导致对其他除草剂的除草剂耐性。
本发明的HTC性状可用在与其他HTC性状(包括但不仅限于草甘膦耐性)的新组合中。由于对除草剂(如草甘膦)的新获得的抗性或固有的耐性，这些性状组合产生控制杂草(等)物种的新方法。因此，除了HTC性状，本发明的范围包括使用除草剂控制杂草的新方法，其中通过转基因作物中的所述酶产生对所述除草剂的耐性。
本发明可以用于使(例如)大豆中与目前的草甘膦抗性性状叠加的2，4-滴抗性性状商品化。因此，本发明提供对抗阔叶杂草物种演替和/或选择除草剂抗性阔叶杂草的工具，所述任务由于种植者在多种作物的杂草控制中对草甘膦极高的依赖性而达到白热化的程度。
本发明AAD-12基因的转基因表达示例于如拟南芥、烟草、大豆、棉花、稻、玉米和芸苔。大豆是本发明优选转化的作物。不过，本发明可应用于多种其他单子叶(如牧草禾本科或草坪草禾本科)和双子叶作物(如苜蓿、三叶草、乔木物种等)。类似的，2，4-滴(或其他AAD-12底物)可更积极地用于耐性适中的禾本科作物中，由此性状得到的提高的耐性将为种植者提供能以更有效的用量和更广的施用时间来使用这些除草剂而无作物损伤风险的可能性。
另外，本发明提供了可提供对控制阔叶杂草除草剂的抗性的单个基因。此基因可用于多种作物中，能使用广谱除草剂组合。本发明还可控制对目前的化学品具有抗性的杂草，并辅助控制目前的农业实践产生的演替的杂草谱。本发明的AAD-12还可以用于将其他除草剂底物有效解毒成非除草剂形式的尝试。因此，本发明提供了其他HTC性状和/或选择标记物技术的发展。
除了使用本发明基因产生HTC以外，本发明基因还可用作细胞培养物、温室和大田中成功选择转化体的选择标记物。本发明基因仅作为生物技术工程的选择标记物就具有很高的内在价值。AAD-12与其他芳氧基链烷酸酯生长素除草剂的混杂性提供了将此基因用于HTC和/或选择标记物目的的许多可能。
本发明的蛋白质(和来源分离物)。本发明提供功能蛋白质。“功能活性”(或“活性”)在本文中指本发明用途的蛋白质/酶(单独或与其他蛋白质组合)具有降解或减弱除草剂活性的能力。产生本发明蛋白质的植物优选产生“有效量”的蛋白质，从而在用除草剂处理植物时，蛋白质表达的水平足以给予植物对除草剂(若无特别说明则为一般用量；一般应用量可见于例如熟知的《Herbicide Handbook》(Weed Science Society of America，第八版，2002))完全或部分的抗性或耐性。可以以通常杀死靶植物的用量、正常的大田用量和浓度使用除草剂(由于本发明，水平和/或浓度可以任选地比先前所使用的更高)。优选地，本发明的植物细胞和植物被保护免受除草剂处理引起的生长抑制或损伤。本发明的转化植物和植物细胞优选具有对本文讨论的除草剂的抗性或耐性，即转化的植物和植物细胞能在有效量的一种或多种本文讨论的除草剂存在下生长。本发明优选的蛋白质具有代谢一种或多种芳氧基链烷酸酯化合物的催化活性。
不使用动词“耐受”或形容词“耐性的”，人们就无法简单地讨论术语“抗性”。工业界已花费无数的时间争论除草剂耐性作物(HTC)与除草剂抗性作物(HRC)。HTC是工业界优选的术语。然而，权威的美国治草科学学会(Weed Science Society of America)对抗性的定义是“植物接触通常对野生型致死剂量的除草剂后生存和繁殖的遗传能力，在植物中抗性可以自然发生或由诸如遗传工程的技术诱导产生或挑选通过组织培养或变异产生的突变体。”除非其他说明，正如《The Herbicide Handbook》在本发明公开递交之日时的通用版本所建议的一样，本文使用的除草剂“抗性”是可遗传的，并允许植物在除草剂对给定植物进行一般除草剂有效处理的情况下生长和繁殖。正如本领域中技术人员认可的，即使植物受到除草剂处理的一定损伤程度明显，植物仍可被认为“抗性”。如本文中所用的术语“耐性”比术语“抗性”更广泛，并包括本文定义的“抗性”，以及特定植物具有的抵抗除草剂诱导的各种程度损伤的提高的能力，而在同样的除草剂剂量下一般导致相同基因型野生型植物损伤。
功能活性到植物或细菌系统的转移可涉及编码本发明蛋白质氨基酸序列的核酸序列，所述核酸序列整合进蛋白质表达载体，所述载体适于其将居留的宿主。获得编码具有功能活性的蛋白质的核酸序列的一种方法是使用从本文公开的蛋白质的氨基酸序列推出的信息，从产生目的蛋白质的细菌物种中分离天然遗传物质。如下文更详细讨论的，可以优化天然序列进行例如植物表达。也可以基于蛋白质序列设计优化的多核苷酸。
本发明提供具有本文所鉴定新活性的蛋白质类别。表征这些蛋白质类别和编码它们的多核苷酸的一种方法是通过多核苷酸在一系列特定条件下与示例核苷酸序列(其互补物和/或来自任一链的一种或多种探针)杂交的能力和/或其使用来自示例序列的引物通过PCR被扩增的能力来定义多核苷酸。
有许多获得本发明用途的蛋白质的方法。例如，可以用本文所公开蛋白质的抗体从蛋白质混合物中鉴定和分离其他蛋白质。具体的，可以针对蛋白质中与其他相关蛋白质相比最保守或最特殊的部分产生抗体。接着可使用这些抗体通过免疫沉淀、酶联免疫吸附测定(ELISA)或免疫印迹来具体鉴定具有特征活性的等同蛋白质。可以使用标准方案便利的制备针对本文公开蛋白质、或针对等同蛋白质或针对这些蛋白质的片段的抗体。这样的抗体是本发明的一个方面。本发明的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体，优选针对示例或提出的蛋白质产生。
本领域技术人员容易认识到，可以从多种来源获得本发明的蛋白质(和基因)。由于已知完整的除草剂降解操纵子可编码在转座元件(如质粒)上、以及整合在基因组中，因此可以从广泛的多种微生物(如包括重组和/或野生型细菌)获得本发明的蛋白质。
可以通过本领域所熟知的方案产生细菌分离物的突变体。例如，可以通过分离物的甲基磺酸乙酯(EMS)诱变来获得不产孢子突变体。可以通过本领域熟知的方案使用紫外光和亚硝基胍产生突变株。
“来自”或“得自”任意受试分离物的蛋白质在本文中指该蛋白质(或相似的蛋白质)可得自该分离物或其他一些来源，如其他细菌菌株或植物。“源自”也具有这一含义，并包括可从经修饰用于(例如)在植物中表达的给定类型的细菌获得的蛋白质。本领域技术人员容易理解，在细菌基因和蛋白质公开后就可以改造植物以产生该蛋白质。可以使用本文公开的多核苷酸和/或氨基酸序列制备抗体制剂、核酸探针(如DNA、RNA或PNA)等，并用于从其他(天然)来源筛选和回收其他相关基因。
可以使用标准分子生物学技术克隆和测序本文所述蛋白质和基因。其他信息可见于本文引为参考的Sambrook等，1989。
多核苷酸和探针。本发明还提供编码本发明用途蛋白质的核酸序列。本发明还提供鉴定和表征编码具有所需除草剂活性的蛋白质的基因的方法。在一个实施方案中，本发明提供可作为杂交探针和/或PCR技术的引物使用的独有核苷酸序列。引物产生可用于鉴定、表征和/或分离特定目的基因的特征性基因片段。本发明的核苷酸序列编码与先前已描述蛋白质不同的蛋白质。
本发明的多核苷酸可用于形成完整“基因”，以在期望的宿主细胞中编码蛋白质或肽。例如，本领域技术人员容易了解，可以如本领域所熟知的那样，在目的宿主中将本发明的多核苷酸适当地置于启动子的控制之下。基因表达和时间/组织特异性表达的水平可极大地影响本发明的应用。一般而言，降解基因蛋白质较高水平的表达会导致底物(本文中为靶除草剂)更快更完全的降解。除非高表达对植物健康具有继发的负面影响，一般期望启动子以高水平表达靶基因。为了在全部生长阶段中完全保护植物，一般希望AAD-12基因在所有组织中组成型表达。然而，也可以使用无性繁殖表达的抗性基因；这允许在植物中使用靶除草剂进行杂草控制，接着通过在开花期使用来控制靶作物的有性繁殖。此外，表达所需的水平和时间还依赖于植物的类型和期望的耐性水平。一些的优选的实施方案使用组合转录增强子等的强组成型启动子来增加表达水平和增强耐性至所需水平。在实施例部分之前，一些此类的应用会在下面更详细讨论。
如本领域技术人员所知，DNA一般以双链形式存在。在这种排列下，一条链与另一条链互补，反之亦然。当DNA在(例如)植物中复制时产生了额外的互补DNA链。本领域中经常使用“编码链”指代与反义链结合的链。mRNA转录自DNA的“反义”链。“有义”或“编码”链具有一连串密码子(密码子是可以作为三残基单位阅读以指定特定氨基酸的三个核苷酸)，所述密码子可以作为开放读码框(ORF)阅读以形成目的蛋白质或多肽。为在体内产生蛋白质，一般将DNA链转录成用作蛋白质模板的mRNA互补链。因此，本发明包括所附序列表中所示的示例多核苷酸和/或等同物(包括互补链)的用途。与示例DNA分子功能性等同的RNA和PNA(肽核酸)也包含于本发明中。
在本发明的一个实施方案中，可以在使微生物高度增殖的条件下培养细菌分离物。在处理微生物以提供单链基因组核酸后，可以用本发明的引物与DNA接触并进行PCR扩增。目的基因的特征性片段将通过该操作而得以扩增，从而鉴定目的基因的存在。
本发明的其他方面包括使用本文公开的方法和核苷酸序列鉴定的基因和分离物。所鉴定的基因可编码本发明的除草剂抗性蛋白质。
可以通过如使用寡核苷酸探针鉴定和获得本发明用途的蛋白质和基因。这些探针为可检测的核苷酸序列，所述核苷酸序列由于适当的标记可被检测或如国际申请WO 93/16094所述使其具有固有的荧光性。探针(和本发明的多核苷酸)可以是DNA、RNA或PNA。除了腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U，RNA分子中)之外，本发明的合成探针(和多核苷酸)还可以含有肌苷(能与全部四种碱基配对的中性碱基，有时用于在合成探针中代替全部四种碱基的混合物)和/或其他合成的(非天然)碱基。因此，当本文中提到合成的简并寡核苷酸时一般使用“N”或“n”，“N”或“n”可以是G、A、T、C或肌苷。本文使用的多义密码子与提交本申请时的标准IUPAC命名惯例一致(如R为A或G、Y为C或T等)。
如本领域所熟知，如果探针分子与核酸样品杂交，可以合理的假设探针和样品具有显著同源性/相似性/同一性。优选地，首先进行多核苷酸杂交，之后使用本领域所熟知的技术在低、中或高严格条件下进行洗涤，如Keller，G.H.，M.M.Manak(1987)《DNA Probes》，Stockton Press，NewYork，NY，169-170页中所述。例如，如文中所述，可以通过首先在室温用2×SSC(标准柠檬酸盐水)/0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)洗涤15分钟来得到低严格条件。一般进行两次洗涤。然后可以通过降低盐浓度和/或通过提高温度得到较高的严格度。例如，在上述洗涤之后可以接着在室温用0.1×SSC/0.1％SDS洗涤两次，每次15分钟，然后在55℃用0.1×SSC/0.1％SDS接着洗涤30分钟。如本领域技术人员所知，这些温度可以与本文所示的其他杂交和洗涤方案一起使用(例如可以用SSPE代替SSC作为盐使用)。可以通过向445ml水中加入50ml 20×SSC和5ml 10％SDS制备2×SSC/0.1％SDS。可以通过混合NaCl(175.3g/0.150M)、柠檬酸钠(88.2g/0.015M)和水，用10N NaOH调整pH至7.0，然后将体积调整至1升来制备20×SSC。可以通过将10g SDS溶解到50ml高压灭菌水中，然后稀释到100ml来制备10％SDS。
检测探针提供了用已知方式测定是否保持了杂交的方法。这样的探针分析提供了鉴定本发明基因的快速方法。可以使用DNA合成仪和标准程序合成本发明用作探针的核苷酸片段。这些核苷酸片段还可以用作PCR引物以扩增本发明的基因。
可以用分子的杂交特征定义本发明的多核苷酸。因此本发明包括与本文示例的多核苷酸杂交的多核苷酸(和/或其互补物、优选其全长互补物)。即，定义基因(和其编码的蛋白质)的一种方法是通过其与已知或具体示例的基因(在本文具体公开的任意条件下)杂交的能力。
本文使用的“严格”杂交条件指实现与本申请人所使用条件相同或大致相同程度杂交特异性的条件。具体地，通过标准方法进行固定在Southern(DNA杂交)印迹上的DNA与32P标记的基因特异性探针的杂交(参阅如Maniatis等，1982)。一般在允许检测靶序列的条件下进行杂交和其后的洗涤。对于双链DNA基因探针，在6×SSPE、5×Denhardt溶液、0.1％SDS、0.1mg/ml变性DNA中在DNA杂合体解链温度(Tm)以下20-25℃进行过夜杂交。按下式描述解链温度(Beltz等，1983)：
Tm＝81.5℃+16.6Log[Na+]+0.41(G+C％)-0.61(甲酰胺％)-600/双链体碱基对长度
一般如下述进行洗涤：
(1)在1×SSPE、0.1％SDS中室温15分钟洗涤两次(低严格洗涤)。
(2)在0.2×SSPE、0.1％SDS中在Tm-20℃15分钟洗涤一次(中等严格洗涤)。
对于寡核苷酸探针，在6×SSPE、5×Denhardt溶液、0.1％SDS、0.1mg/ml变性DNA中在杂合体解链温度(Tm)以下10-20℃进行过夜杂交。按下式确定寡核苷酸探针的Tm：
Tm(℃)＝2(T/A碱基对数)+4(G/C碱基对数)(Suggs等，1981)。
一般如下述进行洗涤：
(1)在1×SSPE、0.1％SDS中室温15分钟洗涤两次(低严格洗涤)。
(2)在1×SSPE、0.1％SDS中在杂交温度15分钟洗涤一次(中等严格洗涤)。
一般可以改变盐和/或温度以改变严格度。对于长度＞70左右碱基的标记DNA片段，可以使用以下条件：
低：1或2×SSPE，室温
低：1或2×SSPE，42℃
中：0.2×或1×SSPE，65℃
高：0.1×SSPE，65℃。
双链体的形成和稳定依赖于杂合体两条链间的显著互补性，且如上文所提到的，某种程度的错配是允许的。因此，本发明的探针序列包括所述序列的突变(单突变和多重突变均包括在内)、缺失、插入及其组合，其中所述突变、插入和缺失允许与目的靶多核苷酸形成稳定的杂合体。可以以多种方法在给定的多核苷酸序列中产生突变、插入和缺失，这些方法为本领域普通技术人员所共知。其他方法可在将来逐渐被了解。
PCR技术。聚合酶链式反应(PCR)是核酸序列的引发式重复性酶合成。此方法为本领域技术人员所熟知并普遍使用(参阅Mullis，美国专利No.4,683,195、4,683,202和4,800,159；Saiki等，1985)。PCR是基于目的DNA片段的酶扩增，所述DNA片段两侧侧接与靶序列相反链杂交的两个寡核苷酸引物。引物优选在3’末端彼此指向对方。模板热变性、引物与其互补序列退火和用DNA聚合酶延伸退火引物的重复循环导致所述PCR引物5’末端所界定片段的扩增。每一引物的延伸产物可作为其他引物的模板，因此每个循环基本上倍增前一循环中产生的DNA片段数量。这导致特定靶片段的指数积累，可在几小时内多达数百万倍。通过使用热稳定的DNA聚合酶(如分离自水生栖热菌(Thermus aquaticus)的Taq聚合酶)能完全自动地完成扩增过程。可以使用的其他酶为本领域技术人员所公知。
示例DNA序列或其片段能用作PCR扩增的引物。在PCR扩增中，引物和模板间某种程度的错配是可以接受的。因此，示例引物的突变、缺失和插入(特别是在5’末端加入核苷酸)在本发明的范围内。可以通过本领域普通技术人员已知的方法在给定的引物中产生突变、插入和缺失。
基因和蛋白质的修饰。本发明的基因和蛋白质能与其他基因和蛋白质融合以产生嵌合或融合蛋白。用于本发明的基因和蛋白质不仅包括具体示例的全长序列，还包括这些序列的部分、区段和/或片段(包括连续片段和与全长分子相比内部和/或末端缺失)、其变体、突变体、嵌合体和融合物。只要保留所需的功能活性，本发明的蛋白质可以具有取代的氨基酸。“变体”基因具有编码与示例蛋白质具有等同或相似的活性的相同蛋白质或等同蛋白质的核苷酸序列。
用天然aad-12核苷酸序列进行BLAST搜索的最上面两个结果，显示超过120个碱基对序列的合理同源性水平(大约85％)。在某种条件下可预期杂交包括这两种序列。参阅GENBANK登录号DQ406818.1(89329742；红育菌属(Rhodoferax))和AJ 6288601.1(44903451；鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas))。红育菌属与戴尔福特菌属(Delftia)非常相似，但是鞘氨醇单胞菌属是系统发育学上完全不同的类型。
术语“变体蛋白质”和“等同蛋白质”指对靶底物具有相同或基本相同的生物/功能活性的蛋白质和与示例蛋白质具有等同序列的蛋白质。本文所使用的“等同”序列指含有提高或不对活性产生显著不利影响的氨基酸取代、缺失、添加或插入的序列。保留活性的片段也包含于此定义中。保留了如示例蛋白质相应片段的相同或相似功能或活性的片段和其他等同物在本发明的范围内。可以为了多种目的(如(不严重/显著降低蛋白质功能活性地)提高(或降低)蛋白质的蛋白酶稳定性、去除或加入限制性位点等)产生变化，如氨基酸取代或添加。例如，可以使用产生点突变的标准技术便利地构建基因的变异。
另外，如美国专利No.5,605,793描述了在随机或聚焦破碎后通过DNA重组装产生额外的分子多样性的方法。这可称为基因“改组”，一般包括混合两种或更多不同DNA分子的(所需大小的)片段，接着重复若干轮的复性。这可以改进起始基因所编码蛋白质的活性。结果为具有改进的活性、改变的底物特异性、提高的酶稳定性、改变的立体特异性或其他特征的嵌合蛋白。
得到并检查目的蛋白质的原子3D(三维)坐标和晶体结构之后可设计并靶向“改组”。因此，可以针对修饰理想的蛋白质的某些片段，如表面暴露的片段进行“聚焦改组”，且优选不是参与蛋白质折叠和基本的3D结构完整性的内部片段。
可对酶“活性点位”进行特定变化，以影响固有的与活性或立体特异性有关的功能性(参阅比对图2)。Mullery等(2006)。利用与其固有的底物牛磺酸结合时的已知tauD晶体结构作为双加氧酶模型确定活性位点残基。Elkins等(2002)“X-ray crystal structure of Escerichia colitaurine/alpha-ketoglutarate dioxygenase complexed to ferrous iron andsubstrates，”Biochemistry 41(16)：5185-5192。关于酶活位点的序列优化和设计参阅Chakrabarti等，PNAS，(2005年8月23日)，102(34)：12035-12040。
可利用变体基因产生变体蛋白质；可以使用重组宿主产生变体蛋白质。使用这些“基因改组”技术可以构建含有本文示例的任何序列中任何5、10或20个连续残基(氨基酸或核苷酸)的等同基因和蛋白质。例如，如本领域技术人员所了解的，可以调整基因改组技术以获得具有如与任何示例或提出的序列(或其互补物(全长互补物))中(相同大小)的片段相对应的3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292或293个连续残基(氨基酸或核苷酸)的等同物。类似大小的片段特别是保守区的片段也能作为探针和/或引物。
可以根据标准方法使用市售的外切核酸酶或内切核酸酶产生全长基因的片段。例如，可以使用酶如(Bal31)或定点诱变从这些基因的末端系统地切除核苷酸。还可以使用多种限制性酶获得编码活性片段的基因。可以使用蛋白酶直接获得这些蛋白质的活性片段。
如本文所公开的，可以截短蛋白质而仍保留功能活性，这在本发明的范围内。“截短的蛋白质”指蛋白质的部分可被切割，而切割后剩下的截短的蛋白质仍保留并表现所需活性。可以通过多种蛋白酶进行切割。另外，使用分子生物学技术能产生有效切割的蛋白质，其中通过用限制性内切核酸酶消化或本领域技术人员可使用的其他技术去除编码所述蛋白质的DNA碱基。截短后，可以在异源系统(如大肠杆菌、杆状病毒、基于植物的病毒系统、酵母等)中表达所述蛋白质，然后置于本文公开的昆虫实验中测定活性。如本领域所熟知，可以成功地产生小于完整的全长序列而保留功能活性的截短蛋白质。例如，可以以截短(核心蛋白质)形式使用Bt蛋白质(参阅如
Figure A20068005015200341
等(1989)和Adang等，(1985))。本文所使用的术语“蛋白质”包括功能活性的截短物。
在一些情况下(特别是植物中的表达)，使用表达截短蛋白质的截短基因是有利的。优选的截短基因一般编码全长蛋白质的40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％。
本发明的某些蛋白质已在本文中具体示例。由于这些蛋白质仅是本发明蛋白质的范例，很显然本发明包括具有与示例蛋白质相同或相似活性的变体或等同蛋白质(和编码其等同物的核苷酸序列)。等同蛋白质与示例蛋白质具有氨基酸相似性(和/或同源性)。氨基酸同一性一般至少为60％，优选至少为75％，更优选至少为80％，甚至更优选至少为90％并可以至少为95％。还可以根据更具体的同一性和/或相似性范围定义本发明优选的蛋白质。例如，与本文示例或提出的序列相比，同一性和/或相似性可以为49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％。上文列出的任意数字可用于定义上限和下限。
除非另有说明，使用如Karlin和Altschul(1993)中所改良的Karlin和Altschul(1990)算法测定本文所用的两个核酸的序列同一性和/或相似性百分比。这样的算法整合在Altschul等(1990)的NBLAST和XBLAST程序中。使用NBLAST程序进行BLAST核苷酸搜索，评分＝100、字宽＝12。可以如Altschul等(1997)中所述使用Gapped BLAST。使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用程序(NBLAST和XBLAST)各自的默认参数。参阅NCBI/NIH网址。使用默认参数用Vector NTI Suite 8(InforMax有限公司，North Bethesda，MD，U.S.A)中的AlignX函数得到用于比较目的的空位容许比对。它们是：空位开放罚分15、空位延伸罚分6.66和空位分隔罚分范围8。
还可以改变蛋白质的多种特性和三维特征而不对蛋白质的活性/功能性产生不利影响。保守性氨基酸取代是可以接受的/可以进行而不对分子的活性和/或三维构型产生不利影响。氨基酸可按以下分类：非极性、极性不带电荷、碱性和酸性。只要取代不损害化合物的生物活性，则一类氨基酸被同类其他氨基酸替换的保守取代落在本发明的范围内。表2提供属于每一类的氨基酸实例列表。
Figure A20068005015200351
在一些情况下，还可以进行非保守取代。然而，优选的取代不显著降低蛋白质的功能/生物活性。
本文提到的“分离的”多核苷酸和/或“纯化的”蛋白质是指这些分子不伴随有与其天然共存的其他分子。因此，提到“分离的”和/或“纯化的”表示与本文所述的“人为”相关。例如，放入植物进行表达的本发明细菌“基因”是“分离的多核苷酸”。同样，植物所产生的来自细菌蛋白质的蛋白质是“分离的蛋白质”。
由于遗传密码的简并性/冗余性，多种不同的DNA序列可以编码本文公开的氨基酸序列。产生编码相同或基本相同蛋白质的替代DNA序列在受本领域训练的技术人员的能力范围内。这些变体DNA序列在本发明的范围内。在下文标题为“用于植物表达的序列优化”的章节中对此也有更详细的描述。
用于植物表达的序列优化。为了在植物中实现异源基因的高表达，通常优选重新设计所述基因以使其在植物细胞(的胞质)中更有效的表达。玉米就是这样的一种植物，其中在转化前重新设计异源基因以提高其在所述植物中的表达水平可能是优选的。因此，在设计编码细菌蛋白质的基因中额外的步骤是使用与靶植物序列(双子叶或单子叶物种)比对更接近的密码子偏好性重新改造异源基因以得到最优表达。还可以优化序列以在本文别处讨论的更多具体类型植物中的任意一种中进行表达。
转基因宿主。可以将本发明的蛋白质编码基因引入多种微生物或植物宿主中。本发明包括转基因植物细胞和转基因植物。优选的植物(和植物细胞)为玉米、拟南芥、烟草、大豆、棉花、芸苔、稻、小麦、草坪草、豆科植物草料(如苜蓿和三叶草)和牧草等等。还可以根据本发明产生其他类型的转基因植物，如水果、蔬菜、观赏植物和树木。更一般的，双子叶植物和/或单子叶植物可用于本发明的多个方面。
在优选的实施方案中，基因的表达直接或间接导致目的蛋白质在细胞内的产生(和保持)。植物可以以这种方式得到除草剂抗性。这类宿主可以指转基因、重组、转化和/或转染的宿主和/或细胞。在本发明的一些方面(例如克隆和制备目的基因)，可以受益于本发明的公开内容根据标准技术产生和使用微生物(优选细菌)细胞。
转染了本发明多核苷酸的植物细胞可以再生为整个植株。本发明包括细胞培养物，包括组织细胞培养物、液体培养物和固体平板培养物。由本发明植物所产生和/或用于再生本发明植物的种子也包括在本发明范围内。其他植物组织和部分也包括在本发明中。本发明同样包括产生含有本发明多核苷酸的植物或细胞的方法。产生这类植物的一种优选方法为通过种植本发明的种子。
尽管可以优选植物，本发明还包括在如荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens，Pf)宿主菌株中产生高活性的重组AAD-12。本发明包括优选的生长温度、发酵条件、纯化方法、纯化方案、配制方法以及冻干方法：其中所述生长温度以在宿主中保持可溶性的活性AAD-12；所述发酵条件产生的AAD-12超过总细胞蛋白质的40％或者至少10g/L；所述纯化方法导致来自pf宿主的活性重组AAD-12的高回收；所述纯化方案每Kg细胞生产至少10g活性AAD-12；所述纯化方案每Kg细胞能产生20g活性AAD-12；所述配制方法能在溶液中贮存和复原AAD-12活性；而所述冻干方法能长贮藏期和保质期地保留AAD-12活性。
插入基因以形成转基因宿主。本发明的一个方面是用表达本发明蛋白质的本发明多核苷酸转化/转染植物、植物细胞和其他宿主细胞。以这种方式转化的植物可以获得对多种具有不同作用模式的除草剂的抗性。
可以使用多种方法在允许稳定保持和表达基因的条件下将编码所需蛋白质的基因引入靶宿主。这些方法为本领域技术人员所熟知，并描述于如美国专利No.5,135,867。
含有AAD-12多核苷酸的载体包括在本发明范围内。例如，大量克隆载体可用于将外来基因插入到高等植物中，所述载体含有大肠杆菌复制系统和允许选择转化的细胞的标记。载体包括如pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184等。因此，可以在合适的限制性位点将编码蛋白质的序列插入载体。得到的质粒用于转化进大肠杆菌中。在合适的营养培养基上培养大肠杆菌细胞，然后收获并裂解。通过纯化从基因组DNA中回收质粒。作为分析方法，一般进行序列分析、限制性分析、电泳和其他生物化学-分子生物学方法。每次操作之后，可以限制性消化所使用的DNA序列并与下一个DNA序列连接。每个质粒序列都可以克隆到同一个或其他质粒中。取决于将所需基因插入到植物中的方法，其他DNA序列可能是必要的。例如，如果使用Ti或Ri质粒转化植物细胞，则必须连接Ti或Ri质粒T-DNA序列的至少右边界(但常为右边界和左边界)作为待插入基因的侧翼区域。T-DNA用于转化植物细胞的用途已在EP 120 516、Hoekema(1985)、Fraley等(1986)和An等(1985)中有深入的研究和描述。
大量技术可用于将DNA插入植物宿主细胞。这些技术包括使用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)作为转化剂用T-DNA转化、融合、注射、生物射弹(微粒轰击)、碳化硅晶须、气溶胶柱、PEG或电穿孔以及其他可能的方法。如果用农杆菌进行转化，必须将待插入的DNA克隆进特殊的质粒中，即中间载体或二元载体中。由于存在与T-DNA中序列同源的序列，中间载体可以通过同源重组整合进Ti或Ri质粒。Ti或Ri质粒还含有转移T-DNA所必需的vir区。中间载体不能在农杆菌中自我复制。可以通过辅助质粒(接合)将中间载体转移到根癌农杆菌中。二元载体在大肠杆菌和农杆菌中都可以自我复制。它们含有选择标记基因和接头或多聚接头，两侧为右和左T-DNA边界区。它们可以直接转化进农杆菌中(Holsters等，1978)。作为宿主细胞的农杆菌含有携带vir区的质粒。vir区是将T-DNA转移进植物细胞所必需的。还可以含有额外的T-DNA。将这样转化的细菌用于转化植物细胞。可以有利地用根癌农杆菌或发根农杆菌培养植物外植体，以将DNA转移进植物细胞。然后可以在合适的培养基中从感染的植物材料(如叶碎片、茎节段、根以及原生质体或悬浮培养的细胞)再生完整植物，所述培养基可以含有用于选择的抗生素或杀虫剂。然后可以测试这样得到的植物中插入DNA的存在。在注射和电穿孔的情况下质粒没有特殊的要求。可以使用普通质粒，如pUC衍生物。
转化细胞以通常的方式在植物中生长。它们可以形成生殖细胞并将转化的性状传递到子代植物。这样的植物能以正常方式培养并与具有相同转化遗传因子或其他遗传因子的植物杂交。得到的杂合个体具有相应的表型特性。
在本发明一些优选的实施方案中，从插入植物基因组的转录单位表达编码细菌蛋白质的基因。优选地，所述转录单位是重组载体，所述重组载体能够稳定整合进植物基因组，并使得可以选择表达编码蛋白质的mRNA的转化植物株系。
插入DNA一旦整合进基因组，则相对稳定(并不再释放出来)。它一般包含赋予转化植物细胞对杀虫剂或抗生素(如卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素或氯霉素等)抗性的选择标记。植物选择标记一般还提供对多种除草剂(如草铵膦(如PAT/bar)、草甘膦(EPSPS)、ALS抑制剂(如咪唑啉酮类、磺酰脲类、三唑并嘧啶磺酰胺类等)、溴草腈、HPPD抑制剂抗性、PPO抑制剂、ACC-ase酶抑制剂及许多其他除草剂)的抗性。单独使用的标记应相应允许选择转化细胞而非不含插入DNA的细胞。目的基因在植物细胞中优选由组成型或诱导型启动子表达。mRNA一旦表达之后，就被翻译成蛋白质，从而将目的氨基酸掺入蛋白质中。在植物细胞中表达的编码蛋白质的基因可以在组成型启动子、组织特异性启动子或诱导型启动子的控制下。
存在若干将外来重组载体引入植物细胞以及获得稳定保持和表达引入基因的植物的技术。这类技术包括将包裹在微粒上的遗传物质直接引入细胞(Cornell的美国专利No.4,945,050和DowElanco公司现为陶氏益农公司(DOw AgroSciences，LLC)的US 5,141,131)。此外，可以使用农杆菌技术转化植物，参阅托莱多大学(University of Toledo)的美国专利No.5,177,010；德克萨斯农工大学(Texas A&M)的US 5,104,310；欧洲专利申请0131624B1；Schilperoot的欧洲专利申请120516、159418B1和176112；Schilperoot的美国专利No.5,149,645、5,469,976、5,464,763和4,940,838和4,693,976；Max Planck的欧洲专利申请116718、290799、320500；日本烟草公司(Japan Tobacco)的欧洲专利申请604662和627752和美国专利No.5,591,616；汽巴-嘉基公司(Ciba Geigy)现为先正达公司(Syngenta)的欧洲专利申请0267159和0292435和美国专利No.5,231,019；Calgene公司的美国专利No.5,463,174和4,762,785和艾格瑞斯特公司(Agracetus)的美国专利No.5,004,863和5,159,135。其他转化技术包括晶须技术。参阅捷利康公司(Zeneca)现为先正达公司(Syngenta)的美国专利No.5,302,523和5,464,765。其他直接DNA递送的转化技术包括气溶胶柱技术。参阅美国专利No.6,809,232。还可以使用电穿孔技术转化植物。参阅鲍依斯·汤普森研究所(Boyce Thompson Institute)的WO 87/06614；迪卡布公司(Dekalb)的美国专利No.5,472,869和5,384,253和植物遗传系统公司(Plant GeneticSystems)的WO 92/09696和WO 93/21335。另外，也可以用病毒载体产生表达目的蛋白质的转基因植物。例如，可以用麦克津植物科学有限公司(Mycogen Plant Science)和汽巴-嘉基公司(Ciba-Giegy)(现为先正达公司(Syngenta))的美国专利No.5,569,597以及生物资源公司(Biosource)现为大型生物公司(Large Scale Biology)的美国专利No.5,589,367和5,316,931中所述的方法用病毒载体转化单子叶植物。
如前所述，将DNA构建体引入植物宿主的方法对于本发明不是关键的。任何提供有效转化的方法都可以使用。例如，本文描述了多种植物细胞转化的方法并包括使用Ti或Ri质粒等进行农杆菌介导的转化。在许多情况下，期望用T-DNA边界(更具体地为右边界)与用于转化的构建体的一侧或两侧相连。这在构建体使用根癌农杆菌或发根农杆菌作为转化模式时特别有用，不过T-DNA边界也可在其他转化模式中使用。在将农杆菌用于植物细胞转化时，可以使用能引入宿主以与宿主中存在的T-DNA或Ti或Ri质粒同源重组的载体。可以通过电穿孔、三亲杂交和本领域技术人员已知的用于转化革兰氏阴性菌的其他技术进行载体引入。载体转化进农杆菌宿主的方式对于本发明不是关键的。含有用于重组的T-DNA的Ti或Ri质粒可以能够或不能引起瘤形成，只要所述宿主中存在vir基因，这对本发明就不是关键的。
将农杆菌用于转化时，在一些情况下，将T-DNA边界内的表达构建体插入广谱载体如pRK2或其衍生物中，如Ditta等(1980)和EPO 0 120 515中所述。表达构建体和T-DNA内包括一个或多个如本文所述允许选择转化农杆菌和转化植物细胞的标记。使用的具体标记对于本发明并不重要，优选的标记物取决于所使用的宿主和构建体。
为了用农杆菌转化植物细胞，可以将外植体与转化的农杆菌混合并孵育足够的时间以允许其转化。转化后，通过用适当抗生素的选择杀死农杆菌，并用适当的选择培养基培养植物细胞。一但形成愈伤组织，可以根据植物组织培养和植物再生领域熟知的方法通过使用适当的植物激素促进芽形成。然而，愈伤组织中间期并不总是必要的。芽形成以后，可以将所述植物细胞转移到促进根形成的培养基，从而完成植物再生。然后可以培养植物产生种子，所述种子可以用于建立将来的世代。不论转化技术如何，优选将编码细菌蛋白质的基因整合进基因转移载体中，通过在载体中纳入植物启动子调节元件以及3’非翻译转录终止区(如Nos等)使所述转移载体适于在植物细胞中表达该基因。
除了用于转化植物的大量技术之外，与外来基因接触的组织类型也可以多样化。这样的组织包括但不仅限于胚胎发生组织、I、II和III型愈伤组织、下胚轴、分生组织、根组织、用于韧皮部表达的组织等。使用本文所述的适当技术可在去分化过程中转化几乎所有的植物组织。
如上文所述，需要时可以使用多种选择标记。具体标记的优选由技术人员决定，但是任何以下的选择标记以及本文未列出的能发挥选择标记功能的任意其他基因都可以使用。这些选择标记包括但不仅限于编码对抗生素卡那霉素、新霉素和G41的抗性、潮霉素抗性、甲氨碟呤抗性的转座子Tn5氨基糖苷磷酸转移酶基因(Aph II)以及编码对草甘膦、草丁膦(双丙氨膦或草铵膦)、ALS-抑制除草剂(咪唑啉酮类、磺酰脲类和三唑并嘧啶类除草剂)、ACC-ase酶抑制剂(如芳氧基丙酸酯类或环己烯酮类)和其他如溴草腈和HPPD抑制剂(如硝草酮)等抗性或耐性的基因。
除了选择标记以外，可能需要使用报道基因。在一些情况下，报道基因可以与或不与选择标记一起使用。报道基因一般是在受体生物或组织中不存在的基因，一般编码引起一些表型变化或酶特性的蛋白质。Weising等1998中提供了这些基因的实例。优选的报道基因包括大肠杆菌uidA基因座的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、来自大肠杆菌Tn9的氯霉素乙酰转移酶基因、来自生物发光水母维多利亚水母(Aequorea victoria)的绿色荧光蛋白和来自北美萤火虫(Photinus pyralis)的荧光素酶基因。接着可以在所述基因引入受体细胞后的适当时间实施检测报道基因表达的试验。优选的这类试验可使用编码Jefferson等1987所述的大肠杆菌uidA基因座的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的基因鉴定转化细胞。
除了植物启动子调节元件以外，可以在植物细胞中有效地使用来自多种来源的启动子调节元件表达外源基因。例如细菌来源的启动子调节元件，如章鱼碱合酶启动子、胭脂碱合酶启动子、甘露碱合酶启动子；病毒来源的启动子，如花椰菜花叶病毒(35S和19S)、35T(再改造的35S启动子，参阅美国专利No.6,166,302，特别是实施例7E)等。植物启动子调节元件包括但不仅限于核酮醣-1，6-二磷酸(RUBP)羧化酶小亚基(ssu)、β-伴大豆球蛋白(conglycinin)启动子、β-菜豆素启动子、ADH启动子、热休克启动子和组织特异性启动子。还可以存在其他元件，如基质附着区、支架附着区、内含子、增强子、多腺苷酸化序列等，从而提高转录效率或DNA整合。尽管这些元件能通过影响转录、mRNA稳定性等提供较好的DNA表达或功能，但是它们对DNA功能可能是或不是必需的。这些元件可以如所需包含在DNA中，以得到转化DNA在植物中的优化表达。典型元件包括但不仅限于Adh-内含子1、Adh-内含子6、苜蓿花叶病毒外壳蛋白前导序列、渗调蛋白(osmotin)UTR序列、玉米线条病毒外壳蛋白前导序列以及其他本领域技术人员可用的元件。还可以使用组成型启动子调节元件从而指导在所有细胞类型和所有时间的持续基因表达(如肌动蛋白、泛素、CaMV 35S等)。组织特异性启动子调节元件负责在特定细胞或组织类型(如叶或种子)中的基因表达(如玉米醇溶蛋白、油质蛋白、napin、ACP、球蛋白等)，这些也可以使用。
启动子调节元件也可以在植物发育的某些阶段有活性(或无活性)以及在植物组织和器官中有活性。这些的实例包括但不仅限于花粉特异性、胚胎特异性、玉米穗丝特异性、棉花纤维特异性、根特异性、种子胚乳特异性或无性繁殖期特异性启动子调节元件等。在某些情况下可能需要使用诱导型启动子调节元件，其负责应答于特定信号(如物理刺激(热休克基因)、光(RUBP羧化酶)、激素(Em)、代谢物、化学品(四环素应答)和胁迫)的基因表达。可以使用在植物中发挥功能的其他所需的转录和翻译元件。本领域已知大量植物特异性基因转移载体。
基于植物RNA病毒的系统也可用于表达细菌蛋白质。为此，可以将编码蛋白质的基因插入感染目的宿主植物的适当植物病毒的外壳启动子区。然后可以表达蛋白质从而为植物提供对除草剂损害的保护。基于植物RNA病毒的系统描述于麦克津植物科学有限公司(Mycogen Plant Sciences，Inc.)的美国专利No.5,500,360和生物资源公司(Biosource)现为大型生物公司(Large Scale Biology)的美国专利No.5,316,931和5,589,367。
进一步增加耐性或抗性水平的方法。本文显示可赋予本发明植物新除草剂抗性性状，并且未观察到对表型包括产量的不利影响。这些植物在本发明范围之内。本文示例和提出的植物能耐受住如至少一种受试除草剂2×、3×、4×和5×一般应用水平。这些耐性水平的提高在本发明范围之内。例如可对本领域已知的多种技术进行可预见到的优化和进一步发展，以增加给定基因的表达。
这些方法之一包括增加本发明AAD-12基因的拷贝数(在表达盒中等)。也可以选择具有多拷贝基因的转化事件。
强启动子和增强子能用于“过度”表达。这类启动子的实例包括使用35S增强子的优选35T启动子。这类使用包括35S、玉米泛素、拟南芥泛素、拟南芥肌动蛋白和CSMV启动子。其他强病毒启动子也是优选的。增强子包括4OCS和35S双增强子。基质粘附区(MAR)也能用于如增加转化效率和转基因表达。
根据本发明，改组(直接进化)和转录因子也能用于实施方案。
还能设计多种蛋白质，所述蛋白质在序列水平变化但是保留相同或相似的全部必需的三维结构、表面电荷分布等等。参阅如美国专利No.7,058,515；Larson等Protein Sci.200211：2804-2813，“Thoroughlysampling sequence space：Large-scale protein design of structuralensembles.”；Crameri等Nature Biotechnology 15，436-438(1997)，“Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNAshuffling.”；Stemmer，W.E.C.1994.DNA shuffling by random fragmentationand reassembly：in vitro recombination for molecular evolution.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751；Stemmer，W.P.C.1994.Rapid evolution ofa protein in vitro by DNA shuffling.Nature 370：389-391；Stemmer，W.P.C.1995.Searching sequence space.Bio/Technology 13：549-553；Crameri，A.，Cwirla，S.和Stemmer，W.P.C.1996.Construction andevolution of antibody-phage libraries by DNA shuffling.Nature Medicine 2：100-103以及Crameri，A.，Whitehorn，E.A.，Tate，E.和Stemmer，W.P.C.1996.Improved green fluorescent protein by molecular evolutionusing DNA shuffling.Nature Biotechnology 14：315-319。
插入植物细胞的重组多核苷酸活性依赖于与插入物相邻的内源植物DNA的影响。因此另一种选择是利用已知的植物基因组中用于插入的绝佳位置。参阅如WO 2005/103266A1，涉及cry1F和cry1Ac棉花事件；在这些基因座本发明AAD-12基因可以替代cry1F和/或cry1Ac插入。因此，根据本发明可以使用如靶向同源重组。这类技术是例如WO 03/080809A2和相应的涉及锌指在靶向重组中的用途的已公开美国申请(USPA20030232410)的主题。本领域也已知重组酶的用途(例如cre-lox和flp-frt)。
确信AAD-12的解毒在细胞质中发生。因此本发明的方面包括进一步稳定这种蛋白质和mRNA(包括阻断mRNA的降解)的方法，并相应地应用已知的技术。可以设计本发明蛋白质以抵抗蛋白酶的降解等(通过再设计蛋白质的氨基酸序列能有效去除蛋白酶的切割位点)。这些实施方案包括使用来自渗调蛋白的5’和3’茎环结构样UTR及per5(富含AU的5’非翻译序列)。还可以使用类似7-甲基或2’-O-甲基基团的5’帽子，如7-甲基鸟苷酸残基。参阅如Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74卷，7期，2734-2738页(1977年7月)Importance of 5’-terminal blocking structure to stabilize mRNA ineukaryotic protein synthesis。也可以使用蛋白质复合体或配体封闭基团。
还可以在本发明范围内进行对于AAD-12最适的5’或3’UTR的计算机设计(合成的发夹)。一般的计算机建模以及基因改组和直接进化在本文的别处进行讨论。至于更具体的计算机建模和UTR，用于预测/评测本发明5’和3’UTR衍生物的计算机建模技术包括但不仅限于：从GeneticsCorporation Group，Madison，WI获得的MFold version 3.1(参阅Zucker等Algorithms and Thermodynamics for RNA Secondary StructurePrediction：A Practical Guide.In RNA Biochemistry and Biotechnology，11-43，J.Barciszewski & B.F.C.Clark编，NATO ASI Series，KluwerAcademic Publishers，Dordrecht，NL，(1999)；Zucker等ExpandedSequence Dependence of Thermodynamic Parameters Improves Prediction ofRNA Secondary Structure.J.Mol.Biol.288，911-940(1999)；Zucker等RNASecondary Structure Prediction.In Current Protocols in Nucleic AcidChemistry S.Beaucage，D.E.Bergstrom，G.D.Glick和R.A.Jones编，JohnWiley & Sons，New York，11.2.1-11.2.10，(2000))，COVE(RNA structureanalysis using covariance models(stochastic context free grammar methods))v.2.4.2(Eddy & Durbin，Nucl.Acids Res.1994，22：2079-2088)作为源代码免费分发并可通过进入网站genetics.wustl.edu/eddy/software/下载，以及FOLDALIGN也是免费分发并可在网站bioinf.au.dk.下载获得。FOLDALIGN/(参阅Finding the most significant common sequence andstructure motifs in a set of RNA sequences.J.Gorodlin，L.J.Heyer和G.D.Stormo.Nucleic Acids Research，25卷，18期3724-3732页，1997；FindingCommon Sequence and Structure Motifs in a set of RNA Sequences.J.Gorodkin，L.J.Heyer和G.D.Stormo.ISMB 5；120-123，1997)。
本发明的实施方案可与自然进化或化学诱导的突变体结合使用(可通过筛选技术挑选突变体，然后用AAD-12和其他可能基因转化)。本发明的植物可联合ALS抗性和/或进化的草甘膦抗性。例如氨草啶抗性也能与AAD-12基因联合或“叠加”。
传统育种技术也能联合本发明以有力结合、基因渗入和提高所需性状。
进一步的提高还包括使用合适的安全剂来进一步保护植物和/或增加对更多除草剂的交叉抗性。(安全剂一般通过活化/表达cP450发挥增强植物免疫系统的作用。安全剂是化学试剂，通过生理或分子机制降低除草剂对作物植物的植物毒性，并不损害杂草控制功效。)
除草剂安全剂包括解草嗪、解毒喹、解草胺腈、二氯丙烯胺、dicyclonon、dietholate、解草唑、解草啶、解草安、肟草安、解草噁唑、双苯噁唑酸、吡唑解草酯、mephenate、萘酐和解草腈。植物激活剂(通过激活植物的防御机制保护植物的新型化合物)也能用于本发明的实施方案。激活剂包括阿拉酸式苯和烯丙苯噻唑(probenazole)。
商业安全剂可用于保护大种子禾本科作物(如玉米、高粱粒和湿地播种稻(wet-sown rice))对抗种植前掺入土壤的或出土前施用的硫代氨基甲酸酯和氯乙酰苯胺家族除草剂。安全剂还已发展为保护冬季谷类作物(如小麦)对抗出苗后应用的芳氧基苯氧丙酸酯类和磺酰脲类除草剂。安全剂在保护玉米和稻对抗磺酰脲类、咪唑啉酮类、环己烯酮类类、异噁唑类和三酮噁除草剂中的用途也发展成熟。在使用安全剂的植物中安全剂诱导的增强除草剂的解毒作为安全剂作用的主要机制被广泛接受。安全剂诱导辅因子(如谷胱甘肽)和除草剂解毒酶(如谷胱甘肽S-转移酶、细胞色素P450单加氧酶和糖基转移酶)。Hatzios KK，Burgos N(2004)“Metabolism-basedherbicide resistance：regulation by safeners，”Weed Science：52卷，3期454-467页。
使用叠加AAD-12的细胞色素p450单加氧酶基因是一个优选的实施方案。P450参与除草剂代谢；cP450可以是如哺乳动物或植物来源。在高等植物中，已知细胞色素p450单加氧酶(P450)进行次生代谢。P450与NADPH-细胞色素P450氧化还原酶(还原酶)合作在异生物素的氧化代谢中发挥重要作用。已报道对一些除草剂的抗性作为P450和谷胱甘肽S-转移酶代谢的结果。许多参与哺乳动物的异生物素代谢的微粒体P450物质已被分子克隆表征。他们中的某些被报道有效代谢一些除草剂。因此，用植物或哺乳动物P450转基因的植物表现出对一些除草剂的抗性。
前述的一个优选的实施方案是使用cP450抵抗乙草胺(基于乙草胺的产品包括Surpass
Figure A20068005015200471
Keystone
Figure A20068005015200472
Keystone LA、FulTime
Figure A20068005015200473
和TopNotch
Figure A20068005015200474
除草剂)和/或氟乐灵(如Treflan
Figure A20068005015200475
)。某些优选的实施方案包括在大豆和/或玉米中的这种抗性。关于这些实施方案的另外的指导，参阅如Inui等“Aselectable marker using cytochrome P450 monooxygenases for Arabidopsistransformation，”Plant Biotechnology 22，281-286(2005)(涉及通过使用代谢除草剂的人细胞色素P450单加氧酶的根癌农杆菌转化拟南芥的选择系统；转化除草剂耐性树苗，并用除草剂乙草胺、甲基胺草磷、氯苯胺灵、氯磺隆、氟草敏和二甲戊乐灵选择)；Siminszky等“Expression of a soybeancytochrome P450monooxygenase cDNA in yeast and tobacco enhances themetabolism of phenylurea herbicides，”PNAS 96卷，4期，1750-1755，1999年2月16日；Sheldon等Weed Science：48卷，3期，291-295页，“Acytochrome P450 monooxygenase cDNA(CYP71A10)confers resistance tolinuron in transgenic Nicotiana tabacum”和“Phytoremediation of theherbicides atrazine and metolachlor by transgenic rice plants expressinghuman CYP1A1，CYP2B6，and CYP2C19，”J Agric Food Chem.2006年4月19日；54(8)：2985-91(涉及在稻中测试人细胞色素p450单加氧酶，其中稻植物被报道显示对氯乙酰胺类(乙草胺、甲草胺、异丙草胺、丙草胺和噻吩草胺)、氧乙酰胺类(苯噻草胺)、哒嗪酮类(氟草敏)、2，6-二硝基苯胺类(氟乐灵和二甲戊乐灵)、磷酰胺类(甲基胺草磷、硫代氨基甲酸酯类(稗草畏)和尿素类(绿麦隆))高耐性。
改变或使用不同的2，4-滴化学反应令本发明AAD-12基因更有效也是可能的。这种可能的改变包括创造更好的底物和更好的离去基团(更高的电负性)。
植物生长素运输抑制剂(如氟吡草腙)也能用于增加2，4-滴除草剂活性。
除非具体说明或暗示，如本文中所用，术语“一”、“一个/一种”和“所述”表示“至少一个”。
本文提到或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物整体引为参考，引用程度不与本说明书的明确教导相冲突。
以下为说明本发明操作方法的实施例。这些实施例不应理解为限制性的。除非另有说明，所有的百分比均以重量计并且所有的溶剂混合物比例以体积计。
实施例1-鉴定在植物中赋予对2，4-滴抗性的基因的方法
作为鉴定在植物中具有除草剂降解活性的基因的方法，可以发掘现有的公共数据库如NCBI(美国国家生物技术信息中心)。为开始此过程，需要有已鉴定为编码具有所需特征(即α-酮戊二酸双加氧酶活性)的蛋白质的功能基因序列。接着将此蛋白质序列用作BLAST(基本局部比对检索工具)(Altschul等，1997)算法的输入，以与存储的可用NCBI蛋白质序列进行比较。使用默认设置，此检索返回不同水平的100个以上同源蛋白质序列。它们在氨基酸水平的范围从高同一性(85％-98％)到极低同一性(23％-32％)。通常仅高同源性的序列可预期保留与输入序列相似的特性。在这种情况下仅选择具有≤50％的同源性的序列。如本文示例，克隆和重组表达低至31％氨基酸保守性的同源物(相对于来自于真养雷氏菌()的tfdA)不仅可用于赋予对计划内的除草剂的商品水平的抗性，还可用于对以前从未用这些酶测试过的底物赋予商品水平的抗性。
从NCBI数据库鉴定了单个基因(sdpA)，其作为与tfdA仅有31％氨基酸同一性的同源物(参阅ncbi.nlm.nih.gov站点，登录号AF516752)。通过首先将数据库中保存的sdpA和tfdA DNA序列翻译成蛋白质，然后用VectorNTI软件包中的ClustalW进行多重序列比对来测定同一性百分比。
实施例2-在植物和细菌中表达的序列优化
2.1-背景
为了在植物中得到异源基因的高表达，可以优选重新改造基因的蛋白质编码序列以使其在植物细胞中更有效的表达。玉米就是这样的一种植物，其中在转化前重新设计异源蛋白质编码区域以提高在植物中的基因表达水平和编码蛋白质的水平可能是优选的。因此，在设计编码细菌蛋白质的基因中额外的步骤是重新改造异源基因以得到最优表达。
重新改造在玉米中表达的细菌蛋白质的一个原因是由于天然基因的非最优G+C含量。例如，许多天然细菌基因极低的G+C含量(和因此高A+T含量的偏移倾向)引起产生模拟或复制已知为高度富含A+T的植物基因控制序列的序列。在引入植物的基因DNA中存在一些富含A+T的序列(如一般见于基因启动子中的TATA盒区)可能引起基因的异常转录。另一方面，转录的mRNA中其他调节序列(如多腺苷酸化信号序列(AAUAAA)或与参与前mRNA剪接的小核RNA互补的序列)的存在可能导致RNA的不稳定性。因此，设计用于玉米表达的编码细菌蛋白质的基因(更优选称为植物优化基因)的一个目的是产生具有较高G+C含量(优选与编码代谢酶的玉米基因具有接近的G+C含量)的DNA序列。设计编码细菌蛋白质的植物优化基因的另一个目的是产生其序列修饰不阻碍翻译的DNA序列。
表3展示了玉米中的G+C含量有多高。对于表3中的数据，基因的编码区出自GenBank(第71次发布)条目，并用Mac VectorTM程序(Accelerys公司，San Diego，California)计算碱基组成。计算中忽略了内含子序列。
Figure A20068005015200491
a每一类基因的数目在括号内给出。
b标准差在括号内给出。
c平均值计算中忽略了混合组平均值。
由于遗传密码的冗余性/简并性(即一些氨基酸由多于一个密码子指定)提供的可塑性，基因组在不同生物或不同纲的生物中的进化引起了对冗余密码子不同的使用。在蛋白质编码区的平均碱基组成中反映了这种“密码子偏好”。例如，具有相对低G+C含量的生物使用冗余密码子的第三个位置上为A或T的密码子，而具有较高G+C含量的使用第三个位置上为G或C的密码子。mRNA中“少见”密码子的存在被认为可降低该mRNA的绝对翻译率，特别是对应于少见密码子的载荷tRNA的相对丰度低时。这一事实可扩展为：对于多个少见密码子，单个少见密码子对翻译率的降低将至少是累加的。因此，具有相对高含量少见密码子的mRNA将相应的具有低翻译率。该翻译率将进而反映为低水平的编码蛋白质。
在设计用于玉米(或其他植物，如棉花或大豆)表达的编码细菌蛋白质的基因时已经测定了所述植物的密码子偏好。玉米的密码子偏好是该植物用于编码其蛋白质的密码子统计分布，表4显示了优选的密码子使用。测定偏好之后，测定目的基因中密码子的频率百分比。应该测定植物优选的主要密码子，在存在多种选择时，还要测定优选密码子的第二、第三和第四选择。然后设计编码细菌蛋白质的氨基酸序列的新DNA序列，但新DNA序列由于用植物(第一优选，第二优选、第三优选或第四优选)密码子进行取代以指定蛋白质氨基酸序列内每个位置的氨基酸而区别于(编码蛋白质的)天然细菌DNA序列。然后分析新序列中可能由修饰产生的限制性酶切位点。通过用第一、第二、第三或第四选择的优选密码子替换该密码子来进一步修饰鉴定出的位点。序列中可能影响目的基因转录或翻译的其他位点为外显子-内含子接合处(5’或3’)、多腺苷酸添加信号或RNA聚合酶终止信号。进一步分析和修饰序列，以降低TA或GC双联体的频率。除了双联体之外，具有多于约四个相同残基的G或C序列嵌段也能影响序列的转录。因此，也通过用下一优选的密码子选择替换首选或次选等密码子来修饰这些嵌段。
Figure A20068005015200511
编码细菌蛋白质的植物优化基因优选含有约63％的首选密码子、约22％到约37％的次选密码子和约15％到约0％的三选或四选密码子，其中总百分比为100％。最优选植物优化基因含有约63％的首选密码子、至少约22％的次选密码子、约7.5％的三选密码子和约7.5％的四选密码子，其中总百分比为100％。上述方法使本领域技术人员能够修饰就具体植物而言是外来的基因，从而使基因在植物中优化表达。PCT申请WO 97/13402中进一步说明了该方法。
因此，为了设计编码细菌蛋白质的植物优化基因，使用建立自密码子偏好表的冗余遗传密码设计编码所述蛋白质的氨基酸序列的DNA序列，所述偏好表整理自特定的一种或多种植物的基因序列。得到的DNA序列具有较高程度的密码子多样性、所需的碱基组成，可含有策略性放置的限制性酶识别位点并缺少可能干扰基因转录或产物mRNA翻译的序列。因此，功能性等同于本发明蛋白质/基因的合成基因可用于转化包括植物在内的宿主。关于合成基因产生的其他指导可见于如美国专利No.5,380,831。
2.2-AAD-12植物重建分析
对天然AAD-12编码区(SEQ ID NO：1)876个碱基对(bp)DNA序列的深入分析显示存在若干认为不利于最佳植物表达的序列基序以及非最佳密码子组成。SEQ ID NO：1(AAD-12)编码的蛋白质如SEQ ID NO：2所示。为改善重组蛋白在单子叶和双子叶植物中的生产，产生了“植物优化”DNA序列AAD-12(v1)(SEQ ID NO：3)，其编码的蛋白质(SEQ ID NO：4)除了在第二个位置(在SEQ ID NO：4中以下划线标出)加入丙氨酸残基外，它与天然SEQ ID NO：2相同。额外的丙氨酸密码子(GCT，在SEQ ID NO：3中以下划线标出)编码跨越ATG翻译起始密码子的部分NcoI限制性酶识别位点(CCATGG)。因此，它服务于双重目的，即在改善ATG起始密码子周围的序列以优化翻译起始的同时，促进其后的克隆操作。天然和植物优化(v1)的编码区所编码的蛋白质99.3％相同，仅2号氨基酸不同。相反，天然和植物优化(v1)的编码区的DNA序列仅79.7％相同。进行了天然和植物优化的DNA的序列比对，表5显示天然(列A和D)和植物优化序列(列B和E)密码子组成的差化序列(列C和F)比较。
Figure A20068005015200521
Figure A20068005015200531
表5的研究清楚得出天然和植物优化编码区尽管编码几乎相同的蛋白质，但是二者之间有显著的不同。植物优化形式(v1)接近模拟编码AAD-12蛋白的理论植物优化编码区的密码子组成。
2.3大肠杆菌表达的重建
特定设计的大肠杆菌菌株和相关的载体系统经常用来产生相对大量的蛋白质，用于生物化学和分析研究。时常发现编码所需蛋白质的天然基因(即使基因的来源生物是另一种细菌种类)不是很适合在大肠杆菌中高水平表达。在这样的情况下，重新改造基因的蛋白质编码区使其更适合在在大肠杆菌中表达是可能和需要的。大肠杆菌II类基因定义为在大肠杆菌细胞的指数生长期可高水平和持续表达的基因(Henaut，A.和Danchin，A.(1996)in Escherichia coli and Salmonella typhimurium cellular and molecularbiology，卷2，2047-2066页。Neidhardt，F.，Curtiss III，R.，Ingraham，J.，Lin，E.，Low，B.，Magasanik，B.，Reznikoff，W.，Riley，M.，Schaechter，M.和Umbarger，H.(编)American Society for Microbiology，Washington，DC)。通过研究大肠杆菌II类基因编码区的密码子组成，可以对这些大肠杆菌II类基因编码区设计平均密码子组成。认为具有模拟大肠杆菌II类基因密码子组成的平均密码子组成的蛋白质编码区将适宜在大肠杆菌细胞的指数生长期表达。使用这些指导，根据大肠杆菌II类基因编码区的平均密码子组成，设计编码AAD-12蛋白(SEQ ID NO：4)的新DNA序列；包括，如上面所提到的第二个位置上的额外的丙氨酸。将最初仅基于密码子组成设计的序列，进一步改造为包括适合于克隆进大肠杆菌表达载体的一些限制性酶识别序列。避免有害的序列特征如高度稳定的茎环结构、以及与16S核糖体RNA的3’末端同源的基因内序列(如Shine Dalgarno序列)。大肠杆菌优化序列(v2)作为SEQ ID NO：5公开，并且编码SEQ ID NO：4公开的蛋白质。
天然和大肠杆菌优化(v2)DNA序列具有84.0％同一性，而植物优化(v1)和大肠杆菌优化(v2)DNA序列具有76.0％同一性。表6显示天然AAD-12编码区(列A和D)、在大肠杆菌中表达的优化AAD-12编码区(v2；列B和E)的密码子组成，以及具有大肠杆菌II类基因优化密码子组成的AAD-12蛋白的理论编码区的密码子组成(列C和F)。
Figure A20068005015200551
表6的研究清楚得出天然和大肠杆菌优化编码区尽管编码几乎相同的蛋白质，但是二者之间有显著的不同。大肠杆菌优化形式(v2)接近模拟编码AAD-12蛋白的理论大肠杆菌优化编码区的密码子组成。
2.4-设计编码具有赋予草甘膦耐性突变的大豆EPSPS的大豆密码子 偏好DNA序列。此实施例教导设计新的DNA序列，其编码突变的大豆5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)，但经优化用于在大豆细胞中表达。三重突变的大豆EPSPS的氨基酸序列以SEQ ID NO：5公开于WO2004/009761。在其公开的序列中突变的氨基酸为残基183(用异亮氨酸替换天然蛋白质的苏氨酸)、残基186(用赖氨酸替换天然蛋白质的精氨酸)和残基187(用丝氨酸替换天然蛋白质的脯氨酸)。因此，可以通过在适当位置用天然氨基酸取代WO 2004/009761的SEQ ID NO：5中的已替换氨基酸来推出天然大豆EPSPS蛋白的氨基酸序列。这样的天然蛋白质序列作为PCT/US2005/014737(2005年5月2日递交)的SEQ ID NO：20公开。双突变的大豆EPSPS蛋白序列作为PCT/US2005/014737的SEQ ID NO：21公开，其含有残基183(用异亮氨酸替换天然蛋白质中的苏氨酸)和残基187(用丝氨酸替换天然蛋白质中的脯氨酸)处的突变。
用于大豆(Glycine max)蛋白质编码序列的密码子使用表得自“kazusa.or.jp/codon”万维网址，它从362,096个密码子(约870个编码序列)中计算得到。将这些数据重新整理示于表7。表7的D和H列代表大豆基因蛋白质编码区中每个氨基酸的同义密码子分布(以该氨基酸的所有密码子的使用百分比计)。显然在大豆蛋白质编码区中一些氨基酸的一些同义密码子(一个氨基酸可以由1、2、3、4或6个密码子指代)的存在相对稀少(例如，比较指代丙氨酸的GCG和GCT密码子的使用)。从表7的数据计算得到偏好的大豆密码子使用表。忽略在大豆基因中总出现率小于约10％的特定氨基酸密码子。为平衡氨基酸剩余密码子选择的分布，使用下式计算每个密码子加权的平均呈现率：
C1的加权百分比＝1/(％C1+％C2+％C3+其他)×％C1×100
其中C1为所讨论的密码子，C2、C3、其他代表剩余的同义密码子，相关密码子的百分比值取自表7的D和H列(忽略粗体的稀有密码子的值)。每个密码子的加权百分比值在表7的C和G列给出。任意选择TGA作为翻译终止子。接着将偏好密码子使用频率输入专业遗传密码表，以用于OptGeneTM基因设计程序(Ocimum Biosolutions LLC，Indianapolis，Indiana)。
Figure A20068005015200571
Figure A20068005015200581
＊DNU＝不使用
为产生编码双突变EPSPS蛋白的大豆优化DNA序列，使用来自上文的大豆偏好遗传密码通过OptGeneTM程序反向翻译来自PCT/US2005/014737的SEQ ID NO：21的蛋白质序列。接着通过补偿密码子变化来修饰这样产生的初始DNA序列(而保持密码子的总体加权平均呈现率)，以减少相邻密码子间CG和TA双联体数、增加相邻密码子间CT和TG双联体数、去除高度稳定的链内二级结构、去除或加入限制性酶识别位点并去除可能不利于所改造基因的表达或克隆操作的其他序列。进一步精加工序列，以消除潜在的植物内含子剪接位点、长段A/T或C/G残基和可能干扰植物细胞中RNA稳定性、转录或编码区翻译的其他基序。进行其他改变以消除内部长开放阅读框(除+1之外的框)。这些改变全在保持上述大豆偏好的密码子组成并保留PCT/US2005/014737的SEQ ID NO：21公开的氨基酸序列这一约束下产生。
编码SEQ ID NO：21EPSPS蛋白的大豆偏好DNA序列作为PCT/US2005/014737的SEQ ID NO：22的碱基1-1575公开。由商业供应商(PicoScript，Houston TX)进行含有PCT/US2005/014737的SEQ ID NO：22的DNA片段的合成。
实施例3-表达和转化载体的克隆
3.1大肠杆菌pET表达载体的构建。
使用与加入额外克隆接头位点相应的限制性酶(XbaI、XhoI)将AAD-12(v2)从picoscript载体中切出并连接进pET 280链霉素/壮观霉素抗性载体中。然后将连接产物转化进TOP10F’大肠杆菌，并涂在Luria Broth+50μg/ml链霉素&壮观霉素(LB S/S)琼脂平板上。
为区分AAD-12(v2)：pET 280和pCR2.1：pET 280连接，挑取约20个分离菌落至6ml LB-S/S中，并在37℃摇动培养4小时。然后将每个培养物点种到LB+50μg/ml卡那霉素平板上，在37℃过夜孵育。假定在LB-K上生长的菌落具有连接进的pCR2.1载体，将其弃去。如前述从剩余的培养物提取质粒，用XbaI/XhoI消化检验正确性。最终表达构建体被命名为pDAB 3222。
3.2-假单胞菌表达载体的构建
AAD-12(v2)开放阅读框作为XbaI-XhoI片段最初克隆进修饰的pET表达载体(Novagen)即“pET280S/S”中。用限制性酶消化和测序反应证实产生的质粒pDAB725。来自pDAB725的AAD-12(v2)开放阅读框作为XbaI-XhoI片段转移进假单胞菌表达载体pMYC1803中。通过限制性酶消化确认阳性克隆。将完成的构建体pDAB739转化进MB217和MB324假单胞菌表达菌株中。
3.3-二元载体的完成
植物优化基因AAD-12(v1)得自Picoscript(完成了基因重建设计(见上文)并交给Picoscript进行构建)并内部验证了序列(SEQ ID NO：3)以证实预期序列中不存在改变。如上文使用Beckman Coulter“Dye TerminatorCycle Sequencing with Quick Start Kit”试剂用M13正向(SEQ ID NO：6)和M13反向(SEQ ID NO：7)引物进行测序反应。分析序列数据，结果表明植物优化的AAD-12(v1)DNA序列中不存在异常。以Nco I-Sac I片段将AAD-12(v1)基因克隆进pDAB726。得到的构建体命名为pDAB723，其含有：[AtUbi10启动子：Nt OSM 5’UTR：AAD-12(v1)：Nt OSM 3’UTR：ORF1 polyA 3’UTR](用PvuII和Not I限制性消化验证)。然后将含有所述盒的Not I-Not I片段克隆进二元载体pDAB3038的Not I位点。(用BamHI、Nco I、Not I、SacI和Xmn I)限制性消化得到的二元载体pDAB724以验证正确的方向，pDAB724含有如下的盒：[AtUbi10启动子：Nt OSM5’UTR：AAD-12(v1)：Nt OSM 3’UTR：ORF1 polyA 3’UTR：CsVMV启动子：PAT：ORF25/263’UTR]。经验证的完整构建体(pDAB724)用于转化进农杆菌(参阅7.2章节)。
3.4-其他转化构建体的克隆。
使用本文以前所述的相似程序和其他标准分子克隆方法(Maniatis等，1982)构建用于转化进合适植物物种的所有其他构建体。表8列出了所有使用的具有适当启动子和所定义特征的转化构建体及其转化的作物。
实施例4-重组AAD-12(v2)在荧光假单胞菌中的表达和纯化
4.1-荧光假单胞菌发酵
对于摇瓶实验，将200μl携带AAD-12(v2)构建体pDAB739(3.2节)的荧光假单胞菌菌株MB324甘油保藏物接种到50ml添加了30μg/ml四环素/HCl的新鲜LB培养基中。将培养物(在250ml挡板锥形瓶中)置于振荡器(New Brunswick Scientific Model Innova 44)上，在300rpm和30℃培养16小时。将20ml种子培养物转移进2.8L挡板锥形瓶中1L添加了20μg/ml四环素/HCl和250μl Pluronic L61(抗发泡)的荧光假单胞菌培养基(酵母膏，5g/L；K2HPO4，5g/L；(NH4)2PO4，7.5g/L；(NH4)2SO4；MgSO4-7H2O，1g/L；KCl，0.5g/L；CaCl2-2H2O，0.5g/L；二水合柠檬酸钠，15g/L；甘油，95g/L；微量元素溶液，10ml/L；微量元素溶液：FeCl3-6H2O，5.4g/L；MnCl2-4H2O，1g/L；ZnSO4-7H2O，1.45g/L；CuSO4-5H2O，0.25g/L；H3BO3，0.1g/L；(NH4)6MO7O24，0.1g/L；浓盐酸，13ml/L)中。培养物在30℃和300rpm培养24小时。在培养物中加入终浓度为1mM的异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，在25℃继续培养约48小时。4℃，7krpm离心15分钟收集细胞，细胞糊置于-80℃保存或立即进行纯化。
对于发酵罐实验，将1ml每种甘油保藏物接种到含有添加了30μg/ml四环素/HCl的200ml LB培养基的1L挡板烧瓶中，300rpm和32℃培养16-24小时。然后将来自三个烧瓶的混合培养物(600ml)无菌转入含有10L用于支持高细胞密度生长的Dow proprietary已知成分培养基(来自Teknova，Hollister，CA)的20L发酵罐(B.Braun Bioreactor Systems)中。生长温度维持在32℃，并通过加入氨水将pH控制在所需的设定点。通过调节喷射气流和搅拌速率将液体培养物中的溶解氧维持在正水平。分批补料发酵过程进行大约24小时至细胞密度达到170-200OD575。加入1mM的IPTG诱导重组蛋白质的表达，使用循环的冷水供给降低温度并维持在25℃。使发酵的诱导期再持续24小时。收集样品(30ml)进行多种分析，以检测在诱导后6、12和18小时时间点的细胞密度和蛋白质表达水平。发酵过程的最后，10krpm离心30分钟收集细胞。细胞沉淀冻存于-80℃用于进一步的处理。
4.2-纯化AAD-12(v2)用于生物化学表征和抗体产生
融化大约100-200g冷冻(或新鲜)的假单胞菌细胞并重悬于1-2L含有20mM Tris-HCl，pH 8.5和25ml蛋白酶抑制剂混合物(Sigma cat#P8465)的抽提缓冲液中。在冰上使用微射流仪(型号M110L或110Y)(Microfluidics，Newton，MA)以11,000-12,000psi一次性通过来裂解细胞。将裂解物24,000rpm离心20分钟。转移上清并在4℃用10倍体积的20mM Tris-HCl，pH8.5过夜透析，或在使用层析柱分离之前用这种缓冲液渗滤并经0.45μm的膜过滤。使用法玛西亚(Pharmacia)AKTA Explorer 100进行随后所有蛋白质的分离且在4℃操作。在上柱之前，用20mM Tris-HCl，pH 8.5的缓冲液平衡Q Sepharose Fast Flow层析柱(Pharmacia XK 50/00，柱床体积500ml)。样品以15ml/min加到层析柱上，然后用这种缓冲液洗涤直到洗脱液的OD280回到基线。用2L 0到0.3M的线性梯度NaCl以15ml/min的流速洗脱蛋白质，同时收集45ml级分。合并用比色酶检测法确定为含AAD-12活性的级分，以及和预知的AAD-12蛋白分子量(在SDS-PAGE上大约32kDa的条带)对应的级分。在样品中加入终浓度为0.5M的固体硫酸铵，然后施加于在0.5M硫酸铵(溶于20mM Tris-HCl，pH 8.0)中平衡的Phenyl HP层析柱(Pharmacia XK 50/20，柱床体积250ml)。该层析柱用10ml/min的结合缓冲液洗涤，直到洗脱液的OD280回到基线，蛋白质用2倍柱体积0.5M到0的线性梯度硫酸铵(溶于20mM Tris-HCl，pH 8.0)以10ml/min洗脱，收集12.5ml的级分。合并含有AAD-12的主峰级分，如果必要的话，使用MWCO 10kDa截留膜离心过滤装置(Millipore)浓缩。在一些情况下，样品还用PBS缓冲液以1ml/min的流速施加于Superdex 75gel filtration层析柱(Pharmacia XK 16/60，柱床体积110ml)。合并含有纯AAD-12的峰级分并储存在-80℃。在大部分情况下，经过连续的离子交换层析柱和疏水相互作用层析柱两步分离之后，AAD-12蛋白的纯度接近或高于99％。纯化的AAD-12的一般产量为12-18mg/g湿细胞。大量的蛋白质样品通过渗滤配制到20mM Tris-HCl，pH 8.0、0.1M NaCl、2mM DTT和1％海藻糖中，并在Virtis Freezemobile Model 25EL(Virtis，Cardiner，NY)中冻干用于长期储存。
最初用Bradford检测法使用伯乐蛋白测定试剂盒(Bio-Rad Proteinassay kit)(cat#500-0006)测定蛋白质浓度，用牛血清白蛋白作为标准。当必要的时候，通过使用总氨基酸水解作用测定更精确的蛋白质浓度。在Agilent 1100 HPLC系统(安捷伦科技有限公司，Agilent Technologies，SantaClara，CA)中，使用从Agilent购买的氨基酸校正标准品(cat#PN5061-3330)分析样品。
在整个过程中测定AAD-12的活性(如下文实施例5所述)以确保经每一次处理和操作，酶活性没有丧失。通过使用SDS-PAGE和分析大小排阻色谱法监控蛋白质纯度。通过N-末端氨基酸测序进一步检验和证实纯化的蛋白质样品，并显示在其N-末端由预期的AQTTLQITPT残基组成。在非还原和还原条件下，以酶活性和天然PAGE及SDS-PAGE凝胶分析检测短期和长期蛋白质稳定性。要注意AAD-12倾向于通过形成二硫键寡聚化，因此通常2mM DTT用于蛋白质储存。在存在和不存在1％海藻糖的条件下，测试磷酸盐缓冲液(PBS)和Tris盐缓冲液(TBS)用于蛋白质的冻干。此外，分别检测来自于纯化样品的内毒素和DNA杂质，并且通过等电聚焦(IEF)分析评测AAD-12蛋白的完整性。
10毫克纯化的AAD-12(v2)送至Zymed Laboratories，Inc.(South SanFrancisco，CA)进行兔多克隆抗体的产生。在5周的时期内，兔子接受5次注射，每一注射剂含有悬浮于1ml完全弗氏佐剂中的0.5mg纯化的蛋白质。在亲和纯化以及辣根过氧化物酶(HRP)缀合(Zymed Lab Inc)之前，用ELISA和免疫印迹实验检测血清以证实特异性和亲和性。
实施例5-体外测定AAD-12活性
5.1-通过比色酚检测测定。
通过产物酚的比色检测测量酶活性，其中使用由Fukumori和Hausinger(1993)(J.Biol.Chem.268：24311-24317)的改良方案以允许使用96孔微孔板形式的方案。已有描述将比色测定用于测量双加氧酶的活性，其裂解2，4-滴和2，4-滴丙酸以释放产物2，4-二氯苯酚。使用前述检测方法将来自若干酚的颜色与2，4-二氯苯酚的进行比较，以确定哪种酚产物便于检测。在含有200μM NH4(FeSO4)2、200μM抗坏血酸钠的0.15ml 20mMMOPS pH 6.75中以100μM终浓度检测酚和酚类似物。来自氟草烟和绿草定的吡啶酚未产生明显的颜色。在高至约500μM的测定中，2，4-二氯苯酚的颜色产生是线性的，并与酚浓度成正比。在标准测定条件(160μl终测定体积)下得到的校正曲线表明从17.2μM酚可得到510nm处0.1的吸收。
在含有200μM NH4FeSO4、200μM抗坏血酸钠、1mMα-酮戊二酸、适当底物(以DMSO中制备的100mM原液加入)和酶的总体积0.16ml的20mM MOPS pH 6.75中进行酶测定。在零时间点加入芳氧基链烷酸酯底物、酶或α-酮戊二酸起始反应。在25℃孵育5分钟后，通过加入30μl1∶1∶1混合的50mM Na EDTA、pH 10缓冲液(3.09g硼酸+3.73g KCl+44ml1N KOH)和0.2％4-氨基安替比林终止反应。再加入10μl 0.8％铁氰化钾。5或10分钟之后，在分光光度微孔板读数器中记录510nm处的吸收。空白含有除酶以外的所有试剂，以解释底物被少量酚造成的偶然的轻微污染。
5.2-通过氯吡啶酚检测测定
AAD-12作用于潜在的底物如包含取代吡啶(而非苯环)的除草剂绿草定，在断裂芳氧基链烷酸酯键时，将释放吡啶酚。使用前面章节中所述的氨基安替吡啉/铁氰化苯酚测定法不能检测吡啶酚。然而，发现产物氯吡啶酚在近UV处有强吸收，其中λmax出现在pH7325nm处(消光系数～8,400M-1.cm-1)。这用于创建连续的基于微孔板的分光光度检测法。在总体积为0.2ml，pH 6.75的20mM MOPS中进行测定，其中含200μM NH4FeSO4、200μM抗坏血酸钠、1mMα-酮戊二酸、适当的底物(加入配制在DMSO中的100mM的贮液)和酶。在零时间点通过加入芳氧基链烷酸酯底物、酶或α-酮戊二酸起始测定，并在酶标仪中对325nm处吸光度的增加进行10分钟的跟踪检测。反应最初2分钟用于确定初始速率。在标准测定条件下(200μl最终测定体积)进行的校正曲线表明从11.9μM氯吡啶酚获得510nm处的吸光度为0.1。
5.3-使用2-(2-氯，4-硝基苯氧基)丙酸酯的比色测定法
使用2-(2-氯，4-硝基苯氧基)丙酸酯(CNPP)作为底物，发明了方便的AAD-12测定法。AAD-12断裂CNPP释放2-氯，4-硝基苯酚。苯酚在pH7、410nm处有亮黄吸收，使反应随后能进行连续或终点分析。不需要加入另外的试剂，能可视监测AAD-12活性的存在。在总体积为0.2ml，pH 6.75的20mM MOPS中进行基于微孔板的分光光度测定，其中含200μMNH4FeSO4、200μM抗坏血酸钠、1mMα-酮戊二酸、适量的CNPP(加入配制在DMSO中的10mM贮液)和酶。在零时间点通过加入CNPP、酶或α-酮戊二酸起始测定，并在酶标仪中对410nm处吸光度的增加进行10分钟的跟踪检测。反应最初2分钟用于确定初始速率。在标准测定条件下(200μl最终测定体积)进行的校正曲线表明从25.1μM 2-氯，4-硝基苯酚获得410nm处的吸光度为0.1。使用这种测定法，确定CNPP作为底物的动力学常数是Km＝31±5.5μM，而kcat＝16.2±0.79min-1。
实施例6-体外AAD-12对多种底物的活性
6.1-AAD-12(v2)对(R，S)-2，4-滴丙酸、(R)-2，4-滴丙酸、(S)-2，4-滴丙酸 和2，4-滴的活性
使用实施例5.1所述苯酚检测法，在含有4.4μg纯化的AAD-12(v2)的反应混合物中测定四种苯氧基链烷酸酯。(R，S)-2，4-滴丙酸(R，S-DP)在1mM检测，(R)-2，4-滴丙酸、(S)-2，4-滴丙酸和2，4-滴在0.5mM检测。结果如图3所示，说明AAD-12(v2)对2，4-滴和2，4-滴丙酸对映异构体的活性。4.4μg的AAD-12(v2)与0.5mM底物(对于(R，S)-2，4-滴丙酸是1mM)孵育，并通过加入α-酮戊二酸起始反应。5分钟之后，终止反应，加入比色检测试剂后确定510nm处的吸收值。减去没有酶的背景值。
AAD-12(v2)对(R，S)-2，4-滴丙酸和(S)-2，4-滴丙酸具有极好的活性，对(R)-2，4-滴丙酸活性最小。这说明AAD-12(v2)具有明显的对(S)-对映异构体的偏爱。AAD-12(v2)对2，4-滴的活性与对(S)-2，4-滴丙酸的活性等同，表明酶能有效处理氧丙酸酯和氧乙酸酯。
6.2-AAD-12(v2)对吡啶氧链烷酸酯的活性
使用实施例5.2所述的吡啶酚测定法，在含有6.8μg纯化的AAD-12(v2)的反应混合物中检测五种1mM的吡啶氧链烷酸酯。监控每个反应的速率并呈现在表9中。所有五种吡啶氧链烷酸酯被AAD-12(v2)分解释放吡啶酚。氧丙酸酯底物116844和91767的速率在某种程度上比相应乙酸酯(分别为绿草定和93833)的速率快，说明AAD-12(v2)对氧丙酸酯的偏爱超过氧乙酸酯的侧链。这些数据表明AAD-12(v2)能有效降解吡啶氧链烷酸酯除草剂(如绿草定)。
Figure A20068005015200681
6.3-AAD-12(v2)对2，4-滴、(R，S)-2，4-滴丙酸和绿草定的动力学常数
使用适当的检测方法测定纯化的AAD-12(v2)对除草剂2，4-滴、(R，S)-2，4-滴丙酸和绿草定的Km和kcat值。由于高浓度(＞1mM)的2，4-滴和(R，S)-2，4-滴丙酸发生底物抑制，因此利用低于此的浓度使用Grafit 4.0(Erithacus软件，UK)使数据拟合Michaelis-Menten方程。绿草定浓度达到2mM，没有观察到底物抑制。表10总结了动力学常数。从这些数据，在最大速率条件下，AAD-12(v2)分解绿草定的速率大约是2，4-滴的5％。
Figure A20068005015200691
＊由于AAD-12对(S)-异构体偏爱，因此假设外消旋混合物的50％可作为底物来计算Km值。
实施例7-转化进拟南芥并选择
7.1-拟南芥培养条件
将野生型拟南芥种子悬于0.1％琼脂糖(希格玛化学公司，SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)溶液中。将悬浮的种子在4℃保存2天以完成对休眠的需要并保证种子同步萌发(层积)。
用细蛭石覆盖Sunshine Mix LP5(Sun Gro Horticulture公司，Bellevue，WA)并用Hoagland溶液地下灌溉至湿润。使土壤混合物排水24小时。将层积的种子种在蛭石上并用保湿罩(KORD Products公司，Bramalea，Ontario，Canada)覆盖7天。
使种子萌发并在恒温(22℃)恒湿(40-50％)光强度为120-150μmol/m2秒的长日照条件(16小时光照/8小时黑暗)下在Conviron(型号CMP4030和CMP3244，Controlled Environments Limited公司，Winnipeg，Manitoba，Canada)中培养植物。开始用Hoagland溶液灌溉植物，接着用去离子水灌溉，保持土壤潮湿但不湿透。
7.2-农杆菌转化
带有划线接种的DH5α菌落的含红霉素(希格玛化学公司，SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)(200mg/L)或壮观霉素(100mg/L)的LB+琼脂平板用于提供菌落，接种到4ml小量制备培养物(液体LB+红霉素)中。将培养物在37℃持续摇动孵育过夜。按照生产商的说明使用Qiagen(Valencia，CA)旋转小量制备试剂盒(Spin Mini Preps)纯化质粒DNA。
使用来自Weigel和Glazebrook(2002)的方案制备电感受态的根癌农杆菌(菌株Z707、EHA101和LBA4404)细胞。使用修改自Weigel和Glazebrook(2002)的电穿孔方法转化感受态农杆菌细胞。在冰上融化50μl感受态农杆菌细胞并在细胞中加入10-25ng所需的质粒。将DNA和细胞混合物加入预冷的电穿孔杯(2mm)中。用以下条件使用Eppendorf电穿孔仪2510进行转化：电压：2.4kV，脉冲长度：5毫秒。
电穿孔后，向杯中加入1ml YEP培养液(每升：10g酵母膏、10gBacto蛋白胨、5g NaCl)并将细胞-YEP悬液转移到15ml培养管中。将细胞在水浴中持续摇动以28℃孵育4小时。孵育后，将培养物涂到含红霉素(200mg/L)或壮观霉素(100mg/L)和链霉素(希格玛化学公司，Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO)(250mg/L)的YEP+琼脂板上。28℃孵育平板2-4天。
选取菌落并划线接种到含红霉素(200mg/L)或壮观霉素(100mg/L)和链霉素(250mg/L)的新鲜YEP+琼脂平板上，在28℃孵育1-3天。选取菌落使用载体特异性引物进行PCR分析，以确认基因插入片段的存在。按照生产商的说明使用Qiagen Spin Mini Prep从选取的农杆菌菌落纯化质粒DNA，例外是另将15ml过夜小量制备培养物(液体YEP+红霉素(200mg/L)或壮观霉素(100mg/L)和链霉素(250mg/L))的4ml等分式样用于DNA纯化。使用Qiagen Spin Mini Prep DNA的替代是裂解转化的农杆菌细胞，在100℃于10μl水中悬浮5分钟。来自农杆菌转化中使用的二元载体的质粒DNA纳入作为对照。以0.5×的浓度按照生产商的说明使用Takara Mirus Bio Inc.(Madison，Wisconsin)的Taq DNA聚合酶完成PCR反应。按以下条件设置程序在MJ Research Peltier热循环仪中进行PCR反应：1)94℃3分钟，2)94℃45秒，3)55℃30秒，4)72℃1分钟，共29个循环，其后是72℃10分钟的一个循环。循环后将反应物保持在4℃。通过1％琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物，并通过溴化乙啶染色显像。选择了其PCR产物与质粒对照相同的菌落。
7.3-拟南芥转化。
使用花浸泡法转化拟南芥。用选取的菌落接种一份或多份15-30ml含红霉素(200mg/L)或壮观霉素(100mg/L)和链霉素(250mg/L)的YEP培养液的预培养物。以220rpm将培养物在28℃恒速摇动孵育过夜。每个预培养物用于接种两份500ml含红霉素(200mg/L)或壮观霉素(100mg/L)和链霉素(250mg/L)的YEP培养液的培养物并将培养物在28℃持续摇动孵育过夜。室温以约8700×g离心10分钟沉淀细胞，弃去得到的上清液。将细胞沉淀轻柔重悬于500ml渗透培养基中，所述渗透培养基含有1/2×Murashige和Skoog盐/Gamborg B5维生素、10％(重量/体积)蔗糖、0.044μM苄氨基嘌呤(10μl/升(1mg/ml DMSO中的原液)和300μl/升SilwetL-77。将约1月龄的植物在培养基中浸泡15秒，确保浸没最新的花序。接着将植物侧面放倒并覆盖(透明或不透明)24小时，接着用水洗涤并竖直放置。在22℃以16小时光照/8小时黑暗的光周期培养植物。浸泡约4周后收获种子。
7.4-转化植物的选择
将新收获的[(aAD-12(v1)基因]T1种子在室温干燥7天。将种子种在26.5×51cm萌发盘(T.O.Plastics Inc.有限公司，Clearwater，MN)中，每盘接受200mg等分式样的层积T1种子(～10,000个种子)，所述种子事先已悬于40ml 0.1％琼脂糖溶液并在4℃保存2天以完成休眠需要并保证同步的种子萌发。
用蛭石覆盖Sunshine Mix LP5(Sun Gro Horticulture Inc.有限公司，Bellevue，WA)并用Hagland溶液地下灌溉至湿透，利用重力排水。用移液管将层积种子的每个40ml等分式样均匀地种到蛭石上，并用保湿罩(KORD Products，Bramalea，Ontario，Canada)覆盖4-5天。在使用出苗后喷洒草铵膦(选择共转化的PAT基因)进行最初转化体选择前1天移去罩。
在7个种植后天数(DAP)并于11DAP再次使用DeVilbiss压缩空气喷嘴以10ml/盘(703L/ha)的喷洒体积用Liberty除草剂(200g ai/L的草铵膦，拜耳作物科学集团(Bayer Crop Sciences)，Kansas City，MO)的0.2％溶液喷洒T1植物(分别为子叶期和2-4叶期)，以提供每次应用280g ai/ha有效量的草铵膦。在最后喷洒后4-7天鉴定存活株(活跃生长的植物)，并分别移植到用盆栽基质(Metro Mix 360)制备的3英寸盆中。用保湿罩覆盖移植的植物3-4天，并如前置于22℃培养室中或直接移入温室。接着移去罩并在测试AAD-12(v1)(植物优化基因)提供苯氧基生长素除草剂抗性的能力之前至少1天将植物栽种到温室(22±5℃，50±30％RH，14小时光照：10小时黑暗，最小500μE/m2s1天然+补充光)。
然后将T1植物随机分配到多个用量的2，4-滴。对于拟南芥，50g ae/ha2，4-滴是将敏感植物与具有平均抗性水平的植物区分开的有效剂量。还使用提高的用量(50、200、800或3200g ae/ha)确定抗性的相对水平。表10和11显示与先前在PCT/US2005/014737中描述的芳氧基链烷酸酯除草剂抗性基因(AAD-1(v3))的比较。
如上述使用DeVilbiss喷雾器实现所有的生长素除草剂应用，以应用703L/ha的喷洒体积(0.4ml溶液/3英寸盆)，或者通过履带式喷雾机以187L/ha的喷洒体积应用。使用的2，4-滴为溶于DMSO并稀释于水中(＜1％DMSO终浓度)的工业级(希格玛Sigma，St.Louis，MO)或为商用二甲胺盐制剂(456g ae/L，NuFarm，St Joseph，MO)。使用的2，4-滴丙酸是商业级制备成R-2，4-滴丙酸钾盐(600g ai/L，AH Marks)。随着除草剂的量提高到超过800g ae/ha，喷洒溶液的pH变的极度酸性，烧伤拟南芥植物的幼小嫩叶，并使评估除草剂的首效变得复杂。在200mM HEPES缓冲液(pH7.5)中应用这些高用量的除草剂成为标准实践。
使一些T1个体接受代替苯氧基生长素的备选商品除草剂。一个兴趣点是测定吡啶氧乙酸生长素除草剂、绿草定和氟草烟在植物中是否可被有效降解。使用履带式喷雾机以187L/ha的喷洒体积对T1植物应用除草剂。对2，4-滴二甲胺盐表现出耐性的T1植物可进一步在T2代使用。
7.5-转化植物的选择结果
用AAD-12(v1)(植物优化基因)进行首次拟南芥转化。首先使用草铵膦选择方案从未转化种子背景中选择T1转化体。筛选了超过300,000个T1种子并鉴定了316个草铵膦抗性植物(PAT基因)，等于0.10％的转化/选择频率，该转化频率处于构建体选择频率的正常范围内，其中PAT+Liberty用于选择。其后将上述选择的T1植物移植到单个盆中并用多个用量的商品芳氧基链烷酸酯除草剂喷洒。表11比较了AAD-12(v1)和对照基因赋予拟南芥T1转化体2，4-滴抗性的应答。以目测损伤百分比2WAT显示应答。以表现小或无损伤(＜20％)、中度损伤(20-40％)或严重损伤(＞40％)的个体的直方图显示数据。由于每株T1是独立的转化事件，可以预计在给定剂量内个体T1应答的显著差异。显示了每种处理的算术平均值和标准差。还在最后一列标出了每一用量和转化的个体应答的范围。转化PAT/CrylF的拟南芥用作为生长素敏感型转化对照。AAD-12(v1)基因赋予个体拟南芥植物除草剂抗性。在给定的处理内，植物应答的水平变化显著，这可能是由于每个植物代表独立的转化事件的事实。特别需要注意在测试的每个2，4-滴用量中都存在未受影响的个体，而另一些则受到严重的影响。总体种群平均损伤率示于表11，仅证明转化AAD-12(v1)与野生型或转化PAT/CrylF的对照之间的显著差异。在升至3,200g ae/ha(或6×大田用量)的提高的用量下，损伤水平倾向于提高，且未受损植物的频率较低。同样在这些高用量下，如果不进行缓冲则喷洒溶液变成高酸性。主要在生长室中培养的拟南芥角质层很薄，严重的烧伤效应会使这些提高剂量下的测试复杂化。尽管如此，仍有一些个体在3200g ae/ha 2，4-滴的情况下小损伤或无损伤的存活下来。
表11.与AAD-1 v3(T4)纯合抗性群、或Pat-Cry1F转化的生长素敏感对照相比较，AAD-12(v1)转化的T1拟南芥对出苗后应用一系列2，4-滴用量的应答。
表11.与AAD-1 v3(T4)纯合抗性群、或Pat-Cry1F转化的生长素敏感对照相比较，AAD-12(v1)转化的T1拟南芥对出苗后应用一系列2，4-滴用量的应答。
Figure A20068005015200741
表12显示T1拟南芥对苯氧丙酸、2，4-滴丙酸类似的剂量应答。数据显示除草剂活性的2，4-滴丙酸(R-)同分异构体不能作为AAD-12(v1)合适的底物。事实上AAD-1代谢R-2，4-滴丙酸足以赋予商业上可接受的耐性，这是区分两种基因一个显著特征(表12)。认为AAD-1和AAD-12分别是R-和S-特异性的α-酮戊二酸双加氧酶。
表12.T1拟南芥对出苗后应用的一系列R-2，4-滴丙酸用量的应答
Figure A20068005015200751
7.6-AAD-12(v1)作为选择标记物。
最初用如上述转化的拟南芥分析使用AAD-12(v1)作为选择标记物的能力，其中使用2，4-滴作为选择剂。将大约50颗T4代拟南芥种子(AAD-12(v1)纯合)掺入大约5000颗野生型(敏感)种子。比较一些处理，每盘植物按以下处理方案中的一种接受一次或两次应用2，4-滴的时间：7DAP、11DAP或7DAP之后11DAP再次应用。由于所有个体在同一转化载体中也含有PAT基因，用2，4-滴选择的AAD-12能直接与用草铵膦选择的PAT进行比较。
如前面所述用DeVilbiss喷嘴实施处理。在17DAP鉴定植物为抗性或敏感。最佳处理是在种植后7和11天(DAP)运用2，4-滴(75g ae/ha)，在选择频率上同等有效，并导致对转化个体的除草剂损伤比Liberty选择方案小。这些结果表明对于转化的拟南芥群，AAD-12(v1)能有效作为替代的选择标记物使用。
7.7-遗传力。
使多个T1事件自花授粉产生T2种子。通过对100株随机T2同胞应用2，4-滴(200g ae/ha)对这些种子进行子代测试。在喷洒应用(187L/ha的应用量的履带式喷雾机)之前，先将每个T2个体植物移植到7.5cm见方的盆中。卡方分析(P＞0.05)确定75％的T1家系(T2植物)以预期的孟德尔遗传单基因座显性遗传的3抗性：1敏感模式分离。
收集12到20个T2个体的种子(T3种子)。如前述对8个随机选择T2家系按每个家系25个T3同胞进行子代测试。在每个株系中鉴定了约三分之一的预期为纯合的T2家系(未分离种群)。这些数据显示AAD-12(v1)稳定整合，且以孟德尔方式遗传至少3代。
7.8-AAD-12拟南芥中其它除草剂抗性的叶敷应用。
通过叶敷应用多种底物测定AAD-12(v1)在转基因拟南芥中提供对其他芳氧基链烷酸酯生长素除草剂的抗性的能力。使T2代拟南芥种子层积并种到与拟南芥相似的选择盘(实施例6.4)中。以类似的方式种植含有PAT和昆虫抗性基因Cry1F的转化对照株系。将苗转移到温室中单独的3英寸盆中。以187L/ha用履带式喷雾机对所有植物喷洒。对植物喷洒一系列吡啶氧乙酸类除草剂：280-2240g ae/ha绿草定(Garlon 3A，陶氏益农，DowAgroSciences)和280-2240g ae/ha氟草烟(Starane，陶氏益农，DowAgroSciences)；以及由AAD-12活性引起的2，4-D代谢物2，4-二氯苯酚(DCP，希格玛，Sigma)(摩尔数等于280-2240g ae/ha 2，4-滴，使用工业级DCP)。所有的应用配制到水中。每个处理重复3-4次。在处理后第3和第14天评估植物。
2，4-滴代谢产物2，4-滴丙酸(DCP)对转基因的非AAD-12对照拟南芥(Pat/Cry1F)没有作用。AAD-12转化的植物还明显免遭绿草定和氟草烟除草剂的损伤而受到保护，在转化的非抗性对照中可见这种损伤(参阅表13)。这些结果证实拟南芥中的AAD-12(v1)提供对测试的吡啶氧乙酸类生长素的抗性。这是第一次报道对吡啶氧乙酸类除草剂具有显著活性的酶。其它2，4-滴降解酶未见报道具有相似的活性。
Figure A20068005015200771
Figure A20068005015200781
＊该实验植物发育迟缓且严重偏上发育，但仍保持绿色且没有遭受＞75％的损伤率。
7.9-AAD-12(v1)拟南芥的分子分析。
用总DNA进行用于PAT基因拷贝数分析的侵入物测定(Third WaveAgbio试剂盒方案的方法)以确定含有PAT和AAD-12(v1)的植物转化单位的稳定整合，所述总DNA使用Qiagen DNeasy试剂盒从多个AAD-12(v1)纯合株系获得。由于它们包含于同一质粒，分析假定这些基因直接物理连锁。
结果显示测试的所有2，4-滴抗性植物都含有PAT(从而推断也含有AAD-12(v1))。拷贝数分析显示总插入物的范围从1到5个拷贝。这也与AAD-12(v1)蛋白表达数据一致，表明酶的存在产生对所有市售苯氧乙酸和吡啶氧乙酸显著高水平的抗性。
7.10-用AAD-12(v1)和草甘膦抗性基因的分子叠加转化的拟南芥。
如前述产生含有编码推定的草甘膦抗性性状的pDAB3759质粒(AAD-12(v1)+EPSPS)的T1拟南芥种子。如实施例7.6所述，使用AAD-12(v1)作为选择标记物选择T1转化体。从第一次选择尝试中回收T1植物(个体转化事件)并如前述转移到温室中的3英寸盆中。还测试了三个不同的对照拟南芥株系：野生型Columbia-0、AAD-12(v1)+PATT4纯合株系(转化了pDAB724)和PAT+Cry1F纯合株系(转化对照)。在幼苗期预筛选pDAB3759和pDAB724转化植物的2，4-滴耐性。移植4天后，将植物平均分开，如前述通过履带式喷雾机以水中的0、26.25、105、420或1680g ae/ha草甘膦(Glyphomax Plus，陶氏益农，Dow AgroSciences)进行叶处理。所有的处理重复5到20次。在处理7和14天后评估植物。
最初抗性评估表明当与三种对照株系的应答比较时，对2，4-滴具耐性的植物随后对草甘膦具耐性。这些结果说明可赋予植物对两种具有不同作用模式的除草剂的抗性，包括2，4-滴和草甘膦耐性，允许出苗后使用两种除草剂。此外，对真正的抗性选择，AAD-12+2，4-D可有效作为选择标记物。
表14.T1拟南芥对出苗后(14DAT)使用的一定量草甘膦的应答
Figure A20068005015200791
Figure A20068005015200801
7.11-AAD-12拟南芥与AAD-1遗传性叠加以提供更广的除草剂耐性 谱。
AAD-12(v1)(pDAB724)和AAD-1(v3)(pDAB721)植物相互杂交并收集F1种子。种植8颗F1种子且允许生长产生种子。从8个F1植物获得组织样品并经Western(蛋白质)分析确定两个基因的存在。得出结论所有8个测试植物表达AAD-1和AAD-12蛋白。将种子混合并允许在种植前干燥一个星期。
播种100颗F2种子并使用280g ai/ha草铵膦。96个F2植物经草铵膦选择存活，符合对于两个独立分配的草铵膦抗性位点预期的分离率(15R:1S)。然后用560g ae/ha R-2，4-滴丙酸+560g ae/ha绿草定处理草铵膦抗性植物，以与用于其它测试相同的喷洒方式运用到植物中。在3和14DAT将植物分级。经草铵膦选择存活的96个植物中的63个经使用除草剂也存活下来。这些数据与预期的两个独立分配的显性性状(其中每个基因只对一种生长素除草剂(R-2，4-滴丙酸或绿草定)产生抗性)分离模式(9R:6S)一致。结果表明AAD-12(pDAB724)能与AAD-1(pDAB721)成功叠加，因此增加了可运用于目的作物的除草剂谱[分别为(2，4-滴+R-2，4-滴丙酸)和(2，4-滴+氟草烟+绿草定)]。这对于通过常规的叠加两个单独的2，4-滴抗性基因，给非常敏感物种带来2，4-滴耐性是有用的。此外，如果通过独立转化活性使用任一基因作为第三和第四个目的基因的选择标记物，则可以通过常规育种行为将每个基因对组合在一起，并随后通过成对除草剂(专属AAD-1和AAD-12酶)的喷雾在F1代中进行选择(如上文所示R-2，4-滴丙酸和绿草定分别对应AAD-1和AAD-12)。
其它AAD叠加也在本发明范围之内。例如本文别处讨论的TfdA蛋白(Streber等)能与本发明AAD-12基因一起使用，赋予本发明转基因植物新的除草剂抗性谱。
实施例8-使用咪草烟选择，晶须介导玉米转化
8.1-AAD-12(v1)的克隆。
AAD-12(v1)基因作为NcoI/SacI片段从中间载体pDAB3283切离。将其定向连接到包含ZmUbi1单子叶植物启动子的同样进行切割的pDAB3403载体中。使用T4DNA连接酶将两个片段连接在一起并转化进DH5α细胞。使用Qiagen的QIA Spin小量制备试剂盒对得到的菌落进行小量制备，并消化菌落以检查方向。第一个中间构建体(pDAB4100)包含ZmUbi1：AAD-12(v1)盒。用NotI和PvuI消化此构建体以释放基因盒并消化不需要的骨架。基因盒与NotI切割的pDAB2212连接，其含有由稻肌动蛋白启动子OsAct1驱动的AHAS选择标记。最终的构建体命名为pDAB4101或pDAS1863，含有ZmUbi1/AAD-12(v1)/ZmPer5::OsAct1/AHAS/LzmLip。
8.2-愈伤组织/悬液起始。
为得到进行愈伤组织培养物起始的未成熟胚，进行温室培养的Hi-II亲本A和B(Armstrong等1991)之间的F1杂交。当胚大小为1.0-1.2mm(授粉后约9-10天)时，收获穗并通过用Liqui-Nox
Figure A20068005015200821
皂擦洗、浸入70％乙醇2-3分钟、接着浸入20％商品漂白剂(0.1％次氯酸钠)30分钟来表面灭菌。
在无菌蒸馏水中洗涤穗，无菌切下未成熟合子胚并在15Ag10培养基(N6培养基(Chu等，1975)、1.0mg/L 2，4-滴、20g/L蔗糖、100mg/L酪蛋白水解物(酶消化)、25mM L-脯氨酸、10mg/L AgNO3、2.5g/L固化剂(Gelrite)，pH 5.8)上培养2-3周，使子叶盘背对着培养基。在约6周中以两周间隔选择性的将显示正确形态(Welter等，1995)的组织转移到新的15Ag10培养基上，接着在约2个月中以两周间隔转移到4培养基(N6培养基、1.0mg/L2，4-滴、20g/L蔗糖、100mg/L酪蛋白水解物(酶消化)、6mML-脯氨酸、2.5g/L固化剂，pH 5.8)上。
为起始胚胎发生的悬液培养物，将约3ml细胞压积(PCV)来源于单个胚的愈伤组织加入约30ml H9CP+液体培养基(MS基础盐混合物(Murashige和Skoog，1962)、改良的MS维生素(含有更少烟酸(10倍)和更多(5倍)硫胺-HCl)、2.0mg/L 2，4-滴、2.0mg/L α-萘乙酸(NAA)、30g/L蔗糖、200mg/L酪蛋白水解物(酸消化)、100mg/L myo-肌醇、6mM L-脯氨酸、5％(体积/体积)椰汁(在马上进行传代培养前加入)，pH 6.0)中。在暗条件下，以28℃、125rpm在控温振荡器上的125ml锥形瓶中维持悬浮培养。一般在起始后2到3个月建立细胞系。在建立中，每3.5天通过使用广口移液管将3ml PCV的细胞和7ml条件培养基加入20ml新鲜H9CP+液体培养基中进行悬浮物传代培养。当组织开始倍增生长时，将悬液扩大规模并在500ml瓶中维持，其中把12ml PCV的细胞和28ml条件培养基转移到80ml H9CP+培养基中。一旦悬液完全建立后将其深低温保藏以备将来使用。
8.3-悬液的深低温保藏和融化
传代培养后两天，将4ml PCV的悬浮细胞和4ml条件培养基加入8ml冷冻保护剂(1M甘油、1M DMSO、2M蔗糖，溶于无椰汁的H9CP+培养基中，过滤灭菌)中，并在125ml瓶中以125rpm在4℃振荡1小时。1小时之后，将4.5ml加入冷的5.0ml Corning冻存瓶中。装满后，将单个瓶在控速制冷器中在4℃保持15分钟，接着以-0.5℃/分钟的速度将其冷冻，直至达到-40℃的终温度。达到终温度后，将瓶转移到充满液氮蒸汽的Cryoplus 4存储单元(Forma Scientific)内架子上的盒内。
融化时，将瓶从存储单元中取出并置于封闭的干冰容器中，接着投入保持于40-45℃的水浴中直至“沸腾”平息。融化后，将内含物倒在有盖的100×25mm皮氏培养皿中约8层的无菌70mm Whatman滤纸(No.4)层上。使液体吸收到滤纸中几分钟，然后将含有细胞的顶层滤纸转移到GN6培养基(N6培养基、2.0mg/L2，4-滴、30g/L蔗糖、2.5g/L固化剂，pH 5.8)上1周。1周后，仅将形态有希望的组织直接从滤纸上转移到新鲜的GN6培养基上。每7-14天传代培养此组织至1到3克，可用于125ml Erlenmeyer锥形瓶中约30ml H9CP+培养基中的悬液起始。每3.5天将3ml PCV在新的H9CP+培养基中传代培养，直至得到总计12ml PCV，此时如前述传代培养。
8.4-稳定转化
转化前约24小时，将12ml前述冷冻保存的胚胎发生玉米悬浮细胞加28ml条件培养基传代培养到500ml Erlenmeyer锥形瓶中的80ml GN6液体培养基(缺少固化剂的GN6培养基)中，并置于28℃125rpm的振荡器上。使用相同细胞系重复2次，以将总共36ml PCV分配到3个锥形瓶中。24小时后去除GN6液体培养基，用每瓶72ml GN6S/M渗透培养基(N6培养基、2.0mg/L2，4-滴、30g/L蔗糖、45.5g/L山梨醇、45.5g/L甘露醇、100mg/L myo-肌醇，pH 6.0)代替，以使细胞质壁分离。将瓶在黑暗中置于振荡器上在28℃以125rpm振荡30-35分钟，其间通过将8.1ml适当体积的GN6S/M液体培养基加入约405mg预先高压灭菌的碳化硅晶须(Advanced Composite Materials，Inc.有限公司)来制备50mg/ml的碳化硅晶须悬液。
在GN6S/M中孵育后，将每个瓶的内含物在250ml离心瓶中混合。当细胞沉降到底部时，去除GN6S/M液体至只余约14ml并收集在无菌1L瓶中以备将来使用。将预湿润的晶须悬液以最大速度涡旋60秒，然后将8.1ml加入瓶中，最后一步在其中加入170μg DNA。立即将瓶置于改良的Red Devil 5400商品油漆混合器中振荡10秒。振荡后，细胞、培养基、晶须和DNA的混合物与125ml新的GN6液体培养基一起加入1L瓶的内含物中以减少渗透剂(osmoticant)。使细胞在振荡器上在28℃以125rpm振荡2小时进行恢复，之后使用与房间真空线连接的玻璃细胞收集单元过滤到Whatman#4滤纸(5.5cm)上。
将约2mL分散的悬液吸到用真空抽吸的滤纸表面。将滤纸置于GN6培养基的60×20mm平板上。在28℃将平板在暗盒中培养1周。
1周后，将滤纸转移到GN6(3P)培养基(N6培养基、2.0mg/L 2，4-滴、30g/L蔗糖、100mg/L myo-肌醇、3μM咪草烟(Pursuit
Figure A20068005015200841
DG)、2.5g/L固化剂、pH 5.8)的60×20mm平板。将平板置于盒中并再培养一周。
转化两周后，通过刮下平板上的全部细胞至3.0mL融化的含有3μM咪草烟(Pursuit
Figure A20068005015200842
DG)的GN6琼脂糖培养基(N6培养基、2.0mg/L 2，4-滴、30g/L蔗糖、100mg/L myo-肌醇、7g/L Sea Plaque琼脂糖，pH 5.8，在121℃仅高压灭菌10分钟)来包埋组织。破碎组织并将3mL琼脂糖和组织均匀倒在GN6(3P)的100×15mm平板的表面上。对所有剩余的平板重复此处理。包埋后，用Nescofilm
Figure A20068005015200851
或ParafilmM
Figure A20068005015200852
单个密封平板，然后培养直至推定的分离物出现。
8.4.1-分离物恢复和再生的方案。
通过在60×20mm平板中转移同样浓度的新鲜选择培养基，约转化后9周，从含有Pursuit
Figure A20068005015200853
的包埋的平板中分离出推定的转化事件。如果在约2-3周后持续生长很明显，则认为事件是有抗性的并进行分子分析。
通过将愈伤组织转移到基于细胞分裂素的28(3P)诱导培养基中起始再生，所述诱导培养基含有3μM咪草烟(Pursuit
Figure A20068005015200854
DG)、MS盐和维生素、30.0g/L蔗糖、5mg/L BAP、0.25mg/L 2，4-滴、2.5g/L固化剂，pH 5.7。在转移到再生培养基36(3P)之前，先使细胞在低光照(13μEm-2s-1)下生长一周，接着在较高光照(40μEm-2s-1)下再生长一周，所述再生培养基除了缺乏植物生长调节剂之外与28(3P)相同。移出3-5cm的小植株并置于含有非选择SHGA培养基(Schenk和Hildebrandt基础盐和维生素，1972、1g/Lmyo-肌醇、10g/L蔗糖、2.0g/L固化剂，pH 5.8)的150×25mm培养管中。一旦小植株发育出足够的根和芽系统，将其移植到温室的土壤中。
在前述4种实验之后，在黑暗条件下，没有经历传统的愈伤组织期，在体外包埋的选择平板上形成完整幼苗(包括芽和根)。来源于9个这些“早再生体”的叶组织对AAD-12基因和基因盒分别进行编码区PCR和植物转录单位(PTU)PCR。所有9个都具有完整的AAD-12编码区，而3个没有全长的PTU(表15)。这些“早再生体”被鉴定为4101事件将他们与被鉴定为“1283”事件的传统来源的事件区分开来。通过标准的选择和再生获得的来自19个另外的事件的植物送到温室，培养到成熟，与专有近交株株系异花授粉，用来产生T1种子。由于Southern印迹之后相似的带型，一些事件似乎互为克隆，因此只有14个独特事件具代表性。事件来源的T0植物对70g/ha咪草烟具有耐性。侵入物分析(AHAS基因)表明插入复杂度范围为1至＞10个拷贝。13个事件含有完整的AAD-12编码区；然而，进一步分析表明完整的植物转化单位没被整合到9个事件中。受损的1863事件未能越过T1期，因而进一步的表征利用4101事件进行。
8.5-分子分析：玉米材料和方法。
8.5.1-收获组织的DNA的分离和定量。将新鲜组织置于试管中并在4℃冻干两天。组织完全干燥后，将钨珠(Valenite)放进管中并使用Kelco玻珠研磨机对样品干磨1分钟。其后遵循标准DNeasy DNA分离方案(Qiagen，DNeasy 69109)。然后将提取的DNA的等分试样用Pico Green(Molecular Probes P7589)染色并与已知标准品一起在荧光计(BioTek)中读数，以得到以ng/μl计的浓度。
侵入物测定分析。将DNA样品稀释到20ng/μl，接着通过在热循环仪中在95℃孵育10分钟变性。接着使用提供的寡核苷酸混合物和MgCl2(Third Wave Technologies)制备信号探针混合物。在侵入物测定板的每个孔中放入7.5μl的等分式样，接着放入7.5μl对照、标准品和20ng/μl稀释的未知样品的等分式样。用15μl矿物油(希格玛，Sigma)覆盖每个孔。接着将平板在63℃孵育1小时并在荧光计(Biotek公司)上读数。用靶探针信号占背景的百分比除以内参探针信号占背景的百分比计算出比值。由Southern印迹分析得到并确认的已知拷贝数标准品的比值用于鉴定未知事件的估计拷贝数。
8.5.3-聚合酶链式反应。用总计100ng总DNA作为模板。使用20mM每种引物和Takara Ex Taq PCR聚合酶试剂盒(Mirus TAKRR001A)。用于AAD-12(v1)PTU的引物为正向-GAACAGTTAGACATGGTCTAAAGG(SEQ ID NO：8)和反向-GCTGCAACACTGATAAATGCCAACTGG(SEQ ID NO：9)。在9700Geneamp热循环仪(Applied Biosystems)中进行PCR反应：将样品置于94℃3分钟，94℃30秒、63℃30秒、72℃1分45秒的35个循环和其后72℃的10分钟。
用于AAD-12(v1)编码区PCR的引物为正向-ATGGCTCAGACCACTCTCCAAA(SEQ ID NO：10)和反向-AGCTGCATCCATGCCAGGGA(SEQ ID NO：11)。在9700Geneamp热循环仪(Applied Biosystems)中进行PCR反应：将样品置于94℃3分钟，94℃30秒、65℃30秒、72℃1分45秒的35个循环和其后72℃的10分钟。通过用溴化乙啶染色的1％琼脂糖凝胶上的电泳分析PCR产物。
8.5.4-Southern印迹分析。
用得自Qiagen DNeasy试剂盒的基因组DNA进行Southern印迹分析。用BSM I和SWA I限制性酶过夜消化总计2μg的叶子基因组DNA或10μg的愈伤组织基因组DNA以得到PTU数据。
过夜消化后在1％凝胶上电泳约100ng的等分试样以确认完全消化。确认后将样品在大块0.85％琼脂糖凝胶上以40伏电泳过夜。接着在0.2MNaOH、0.6M NaCl中使凝胶变性30分钟。然后将胶在pH 7.5的0.5M TrisHCl、1.5M NaCl中中和30分钟。接着装配含有20×SSC的凝胶装置以过夜实现凝胶到尼龙膜(Millipore INYC00010)的重力转移。过夜转移之后，以1200×100微焦耳通过交联仪(stratagene UV stratalinker 1800)将膜置于UV光下。接着在0.1％SDS、0.1SSC中洗膜45分钟。洗涤45分钟后，将膜在80℃烘干3小时并保存于4℃直至杂交。使用上述用质粒DNA通过编码区PCR制备杂交模板片段。产物在1％琼脂糖凝胶上电泳并切开，接着使用Qiagen(28706)凝胶提取方案提取凝胶。接着将膜在Perfect Hyb缓冲液(Sigma H7033)中进行60℃的预杂交步骤1小时。使用Prime it RmTdCTP标记反应(Stratagene 300392)方案开发基于p32的探针(PerkinElmer)。使用Probe Quant.G50柱(Amersham 27-5335-01)提纯探针。用二百万计数的CPM与southern印迹杂交过夜。过夜杂交后将印迹置于65℃在0.1％SDS、0.1SSC中洗涤两次，每次20分钟。接着使印迹过夜曝光于胶片，在-80℃孵育。
8.6-AAD-12转化的T 0 玉米的出苗后除草剂耐性
使适应温室的4个T0事件植物生长至从轮生体长出2-4片新的外观正常的叶(即植物已由组织培养转变到温室生长条件)。在温室中在16小时光照：8小时黑暗的条件下在27℃培养植物。然后用商品制剂Pursuit
Figure A20068005015200871
(咪草烟)或2，4-滴胺4处理植物。喷洒Pursuit
Figure A20068005015200881
以证明受测事件内存在选择标记物基因的功能。以187L/ha的喷洒体积、50cm的喷洒高度用履带式喷雾机使用除草剂。用咪草烟致死剂量(70g ae/ha)或能严重损伤未转化玉米株系的2，4-滴二甲胺盐盐用量(2240g ae/ha)喷洒植物。致死剂量定义为引起Hi-II近交株＞95％损伤的剂量。Hi-II是本发明转化体的遗传背景。
一些个体由于相应基因提供对除草剂的抗性，因此具有除草剂安全性。然而来源于事件“001”(a.k.a.，4101(0)-001-001)的单个克隆‘001’确实招致小损伤，但是经14DAT复原。4个事件中的三个有进展，且个体与5XH751杂交并带到下一代。对于2，4-滴和咪草烟耐性植物，每种除草剂耐性植物对于分别存在4AD-12编码区(PCR测定)或存在AHAS基因(侵入物测定)是阳性的。在所有含有完整编码区的2，4-滴耐性T0植物事件中检测到AAD-12蛋白。转基因(AHAS和推定的AAD-12)的拷贝数从1至15个拷贝显著变化。个体T0植物生长至成熟并与专有近交株株系异花授粉，以产生T1种子。
Figure A20068005015200882
Figure A20068005015200891
8.7-T 1 玉米中高2，4-滴耐性的验证。
T1AAD-12(v1)种子种植到含有Metro Mix培养基的3英寸盆中，并在双叶期用70g ae/ha咪草烟喷雾以消除无效事件。存活的植物移植到含有Metro Mix培养基的1加仑盆且置于如前相同的生长条件下。在V3-V4期，用187L/ha履带式喷雾机对植物喷洒560或2240g ae/ha 2，4-滴二甲胺盐。植物在3和14DAT分级并与5XH751xHi II对照植物比较。建立0-10的分级范围(无损伤至极度生长素损伤)以区别支柱根损伤。在14DAT进行支柱根分级来显示2，4-滴耐性。2，4-滴引起支柱根畸形并且是有关玉米中生长素除草剂损伤的稳定指标。支柱根数据(如下表中所见)证明3个测试事件中的2个对2240g ae/ha 2，4-滴二甲胺盐强耐性。事件“pDAB4101(0)001.001”明显不稳定；然而，其它两个事件对2，4-滴和2，4-滴+咪草烟或2，4-滴+草甘膦强耐性(参阅表16)。
Figure A20068005015200892
Figure A20068005015200901
8.8-玉米中AAD-12(v1)遗传性。
对7个已与5XH751杂交的AAD-12(v1)T1家系也进行子代测试。将种子种植到如上述的3英寸盆中。在3叶期，如前述用履带式喷雾机对所有的植物喷洒70g ae/ha咪草烟。14DAT之后，对抗性和敏感植物进行计数。来自6个检测株系的4个分离为卡方分析确定的单基因座显性孟德性状(1R:1S)。随后用2，4-滴喷雾存活的植物且认为所有的植物对2，4-滴(用量≥560g ae/ha)耐性。当互交为商业杂合体时，AAD-12在多物种中作为强芳氧基链烷酸酯生长素抗性基因是可遗传的。
8.9-叠加AAD-12(v1)增加除草剂谱
AAD-12(v1)(pDAB4101)和原种抗农达(elite Roundup Ready)近交株(BE1146RR)互交并收集F1种子。种植来自两个F1系的种子并在V2期用70g ae/ha咪草烟处理以消除无效事件。对于存活的植物，分离重复事件(reps)并使用履带式喷雾机(校准为187L/ha)，用1120g ae/ha 2，4-滴二甲胺盐+70g ae/ha咪草烟(确定存在AHAS基因)或1120g ae/ha 2，4-滴二甲胺盐+1680g ae/ha草甘膦(确定存在抗农达基因)进行处理。植物在3和16DAT进行分级。喷雾数据显示AAD-12(v1)可常规叠加草甘膦耐性基因(如抗农达CP4-EPSPS基因)或其它除草剂耐性基因，来提供可安全用于玉米的增加的除草剂谱。同样地在F1植物中观察到咪唑啉酮+2，4-滴+草甘膦耐性，说明通过这些多重转基因的分子或育种的叠加组合，没有阴性表型。
Figure A20068005015200902
Figure A20068005015200911
8.10-pDAB4101转化的玉米植物对2，4-滴、绿草定和氟草烟除草剂的 大田耐性。
对2个AAD-12(v1)pDAB4101事件(4101(0)003.R.003.AF和4101(0)005.R001.AF)和1个抗农达(RR)对照杂合体(2P782)在印地安那州的Fowler和密西西比州的Wayside进行大田水平耐性试验。用锥形播种机在Wayside以40英寸行距种植种子，在Fowler以30英寸行距种植种子。实验设计是3次重复的随机完全区组设计。除草剂处理包括以1120、2240和4480g ae/ha使用的2，4-滴(二甲胺盐)、以840g ae/ha使用的绿草定、以280g ae/ha使用的氟草烟和未处理的对照。AAD-12(v1)事件包含AHAS基因作为选择标记物。F2玉米事件分离，因此用70g ae/ha咪草烟处理AAD-12(v1)植物以消除无效植物。当玉米到达V6期，使用以130-200kpa压力递送187L/ha载体体积的压缩空气背包式喷雾机进行除草剂处理。在处理后7、14和21天进行目测损伤评估。在28DAT使用0-10的级别进行支柱根损伤评估，其中0-1为轻度支柱根融合、1-3为中度支柱根膨大/蜿蜒(wandering)和根增殖、3-5为中度支柱根融合、5-9为重度支柱根融合和畸形以及10为完全抑制支柱根。
表18显示处理后14天AAD-12(v1)事件对2，4-滴、绿草定和氟草烟的应答。在14DAT作物损伤最严重。RR对照玉米(2P782)被以4480g ae/ha(8倍于正常大田使用量)使用的2，4-滴严重损伤(44％在14DAT)。所有AAD-12(v1)事件表明在14DAT对分别1、2和4倍于大田使用量的2，4-滴的优秀耐性(0％损伤)。对照玉米(2P782)被2倍于正常用量的绿草定(840g ae/ha)严重损伤(31％在14DAT)。AAD-12(v1)事件证明对2倍于正常使用量的绿草定具有耐性(在14DAT两个事件平均3％损伤)。在14DAT以280g ae/ha使用的氟草烟引起野生型玉米11％目测损伤。AAD-12(v1)事件表明在5DAT增加的耐性(平均8％损伤)。
在V6生长期对玉米使用生长素除草剂能引起支柱根的畸形。表18显示2，4-滴、绿草定和氟草烟引起的严重的支柱根损伤。在2P782对照型玉米中，以840g ae/ha使用的绿草定引起最严重的支柱根融合和畸形，导致平均是7的支柱根损伤分值。两个AAD-12(v1)玉米事件均未显示绿草定处理造成的支柱根损伤。随着2，4-滴用量的增加，2P782玉米中的支柱根损伤增强。AAD-12事件没有显示以4480g ae/ha使用的2，4-滴造成的支柱根损伤；然而，在2P782杂合体中见到严重的支柱根融合和畸形。在野生型玉米中，氟草烟只引起中度支柱根膨大和蜿蜒而AAD-12(v1)事件没有显示支柱根损伤。
此数据清楚表明AAD-12(v1)赋予玉米对2，4-滴、绿草定和氟草烟的高水平耐性，其中除草剂的用量远超商业用量，并引起非AAD-12(v1)玉米严重的目测和支柱根损伤。
Figure A20068005015200921
Figure A20068005015200932
实施例9.通过抗体进行转化植物的蛋白质检测
9.1-从植物的叶提取AAD-12(v1)。
将约50到100mg的叶组织切成小块(或4个单孔冲压叶片)并放入含有两个不锈钢BB珠(4.5mm；Daisy Co.，目录号145462-000)的2-ml蔟集管中。将500μL植物提取缓冲液(含有0.05％吐温20和1％牛血清白蛋白的PBS)加入每个样本中。试管盖上盖并紧固在Geno/Grinder(型号2000-115，Certiprep，Metuchen，NJ)中，设置以1×500rpm振荡6分钟。试管以5000×g离心10分钟，使用Western印迹和ELISA对含有可溶性蛋白的上清液分析AAD-12(v1)。
9.2-酶联免疫吸附测定(ELISA)。
除非另外说明，否则在室温进行测定。将100μL纯化的抗AAD-12抗体(0.5μg/mL)包被96孔微孔板并在4℃孵育16小时。使用平板洗涤器用洗涤缓冲液(含有0.05％Tween 20的100mM磷酸缓冲盐水(PBS；pH7.4))洗涤平板四次，接着用溶解在PBS中的4％脱脂乳封闭1小时。洗涤后，在孔中孵育100μL已知浓度的标准AAD-12或来自于不同样本的植物提取物。对于标准曲线，一式三份地对纯化的AAD-12进行2倍的系列稀释，浓度范围从52到0.813ng/mL。将植物提取物在PBS中稀释5、10、20和40倍，一式二份进行分析。孵育1小时后，如上文洗涤板。洗涤前在每个孔中孵育100μl抗AAD-12抗体-HRP缀合物(0.5μg/mL)1小时。在加入100μl 0.4N H2SO4终止反应之前，在每个孔中孵育100μl HRP底物1-StepTM Ultra TMB-ELISA(Pierce公司，Rockford，IL)10分钟。使用微孔板读数器在450nm处测量每个孔的OD。为测定植物提取物中AAD-12(v1)的浓度，平均两次重复的OD值，并使用Softmax
Figure A20068005015200941
Pro 4.0版(Molecular Devices)根据标准曲线进行外推。
为了进行比较，每个样品用其鲜重标准化并计算表达百分比。
9.3-Western印迹分析。
将植物提取物或AAD-12标准品(5和0.5μg/mL)与Laemmli样品缓冲液在95℃孵育10分钟并在8-16％Tris-甘氨酸预制凝胶上电泳分离。接着使用标准方案将蛋白质电转移到硝酸纤维素膜上。用PBS中的4％脱脂乳封闭后，通过抗AAD-12抗血清和其后的山羊抗兔/HRP缀合物检测AAD-12(v1)蛋白。通过化学发光底物ECL Western分析试剂(Amersham公司，NJ)使检测的蛋白质显像。
实施例10-烟草转化
通过与已发表的方法(Horsch等，1988)类似但不完全相同的方法用根癌农杆菌转化烟草。为提供用于转化的来源组织，将烟草种子(Ncotianatabacum栽培种KY160)表面灭菌并种到TOB培养基的表面上，TOB培养基是用琼脂固化的无激素Murashige和Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)。在有光照的培养室中在28-30℃培养植物6-8周，无菌收集叶用于转化方案。从这些叶上无菌切下约1平方厘米不含中脉的块。将在设置为250rpm振荡器上，28℃瓶中培养过夜的农杆菌菌株(含有pDAB3278，akapDAS1580，AAD-12(v1)+PAT的EHA101S)培养物离心沉淀并重悬于无菌Murashige & Skoog盐中，调整至600nm处的终光密度为0.5。将叶块在此细菌悬液中浸泡约30秒，接着在无菌纸巾上蘸干，右侧朝上放在TOB+培养基(含有1mg/L吲哚乙酸和2.5mg/L苄基腺嘌呤的Murashige和Skoog培养基)上并在28℃在黑暗中孵育。两天后将叶块移至含有250mg/L头孢噻肟(Agri-Bio，North Miami，Florida)和5mg/L草铵膦(Basta的活性成分，拜耳作物科学集团(Bayer Crop Sciences))的TOB+培养基并在28-30℃光照条件下孵育。前两周每周两次将叶块转移到含有头孢噻肟和Basta的新鲜TOB+培养基，其后每周一次。用细菌处理叶块四到六周后，从此组织制备物中取出从转化灶发出的小植物并种到PhytatrayTM II管(Sigma)中含有250mg/L头孢噻肟和10mg/L Basta的培养基TOB中。在光照孵育室中培养这些小植株。3周后，进行枝插并在相同的培养基中重新生根。再过2-3周后，植物即可移出至温室。
通过以下步骤将植物移至温室中：从根上洗掉琼脂，移植到13.75cm见方盆的土壤中，将盆放在Ziploc袋子(SC Johnson & Son，Inc.)中，在袋子的底部放入自来水并在30℃温室中间接光照下放置一周。3-7天后，打开袋子，给植物施肥并使其在打开的袋子中生长直至植物适应温室，此时去掉袋子。在普通温暖温室条件(30℃，16小时白天、8小时黑夜、最小自然光+补充光＝500μE/m2s1)下培养植物。
繁殖前，对T0植物取样用于DNA分析以测定其插入物拷贝数。为方便起见，测定与AAD-12(v1)分子连接的PAT基因。将新鲜组织置于管中并在4℃冻干两天。组织完全干燥后，将钨珠(Valenite)放入管中并使用Kelco玻珠研磨机干磨样品1分钟。然后遵循标准DNeasy DNA分离方法(Qiagen，DNeasy 69109)。接着用Pico Green(Molecular Probes P7589)对提取的DNA的等分试样进行染色，并与已知标准品一起在荧光计(BioTek)中读数，以得到以ng/μl计的浓度。
将DNA样品稀释到9ng/μl，接着通过在热循环仪中以95℃孵育10分钟变性。然后使用提供的寡核苷酸混合物和MgCl2(Third WaveTechnologies)制备信号探针混合物。在侵入物测定板的每个孔中加入7.5μl的等分试样，接着加入7.5μl对照、标准品和20ng/μl稀释的未知样品的等分试样。用15μl矿物油(希格玛，Sigma)覆盖每个孔。然后将平板在63℃孵育1.5小时并在荧光计(Biotek)上读数。计算的靶探针信号占背景的百分比除以内参探针信号占背景的百分比得出比率。使用用southern印迹分析获得和确认的已知拷贝数标准品的比率来鉴定未知事件的估计拷贝数。
还使用相同的提取的DNA样品通过PCR测定所有事件中AAD-12(v1)基因的存在。使用总计100ng总DNA作为模板。使用20mM的每种引物和Takara Ex Taq PCR聚合酶试剂盒。用于植物转录单位(PTU)PCRAAD-12的引物为(SdpacodF：ATGGCTCA TGCTGCCCTCAGCC)(SEQID NO：12)和(SdpacodR：CGGGCAGGCCTAACTCCACCAA)(SEQ IDNO：13)。在9700Geneamp热循环仪(Applied Biosystems)中进行PCR反应，将样品置于94℃3分钟，接着是94℃30秒、64℃30秒和72℃1分45秒的35个循环，接着是72℃10分钟。在溴化乙啶染色的1％琼脂糖凝胶上通过电泳分析PCR产物。再生了来自具有1-3个PAT基因(推测具有AAD-12(v1)，因为这些基因是物理连锁的)拷贝的18个PCR阳性事件中每一个事件4到12个克隆谱系，并移至温室。
10.1AAD-12(v1)转化的T 0 烟草中出苗后除草剂耐性
通过对3-4英寸高的植物喷洒广泛范围的2，4-滴、绿草定或氟草烟来攻击来自19个事件中每一事件的T0植物。如前述以187L/ha的喷洒体积使用履带式喷雾机进行喷洒应用。以0、140、560或2240g ae/ha(在去离子水中混合)的对每一事件的代表性克隆应用2，4-滴二甲胺盐(RiversideCorp)。同样的35、140或560g ae/ha应用氟草烟。每个处理重复1-3次。在3和14DAT记录损伤评定。测试的每个事件都比未转化的对照株系KY160对2，4-滴更具有耐性。在几个事件中，2，4-滴在560g ae/ha或更低剂量下，出现一些最初的与生长素除草剂相关的偏上发育。2，4-滴在2240gae/ha(等同于4×大田用量)应用时，一些事件未受损伤。大体上，AAD-12(v1)事件对氟草烟更加敏感，其次是绿草定，受2，4-滴的影响最小。利用T0植物对560g ae/ha氟草烟的应答辨别关于抗性大小的事件质量。将事件分为“低”(14DAT＞40％损伤)、“中”(20-40％损伤)、“高”(＜20％损伤)三类。一些事件的重复之间应答不一致，视为“可变”。
表20.用pDAS1580(AAD-12(v1)+PAT)转化的烟草T0事件
编号  植物ID      拷贝数  PTU PCR  全长PTU和  全长PTU和  相对除草剂
管                PAT     AAD-12   2个以下    1个拷贝    耐性@
1    1580[1]-001  6       +                              未检测
2    1580[1]-002  8       +                              未检测
3    1580[1]-003  10      +                              未检测
4    1580[1]-004  1       +        ＊         ＊         高
5    1580[1]-005  2       +        ＊                    可变
6    1580[1]-006  6       +                              未检测
7    1580[1]-007  4       +                              未检测
8    1580[1]-008  3       +                              可变
9    1580[1]-009  4       +                              未检测
10   1580[1]-010  8       +                              未检测
11    1580[1]-011    3     +            高
12    1580[1]-012    12    +            未检测
13    1580[1]-013    13    +            未检测
14    1580[1]-014    4     +            未检测
15    1580[1]-015    2     +    ＊      高
16    1580[1]-016    1？   +    ＊ ＊   高
17    1580[1]-017    3     +            高
18    1580[1]-018    1     +    ＊ ＊   可变
19    1580[1]-019    1     +    ＊ ＊   可变
20    1580[1]-020    1     +    ＊ ＊   未检测
21    1580[1]-021    1     +    ＊ ＊   未检测
22    1580[1]-022    3     +            可变
23    1580[1]-023    1     +    ＊ ＊   可变
24    1580[1]-024    1     +    ＊ ＊   可变
25    1580[1]-025    5     +            未检测
26    1580[1]-026    3     +            变
27    1580[1]-027    3     +            低
28    1580[1]-028    4     +            未检测
29    1580[1]-029    3     +            变
30    1580[1]-030    1     +    ＊ ＊   高
31    1580[1]-031    1     +    ＊ ＊   高
32    1580[1]-032    2     +    ＊      高
@当用导致不同事件耐性可变的560g ae/ha氟草烟处理时，除草剂耐性表现差异的事件需要评估相对耐性。
10.2在T 1 烟草中高2，4-滴耐性的验证。
在每个事件中保留在高用量2，4-滴和氟草烟下存活的2到4个T0个体，并使其在温室中自花授粉产生T1种子。使T1种子层积，并以与拟南芥(实施例7.4)十分相似的方式播种到选择盘中，随后用560g ai/ha草铵膦(PAT基因选择)在此分离群体中选择性去除未转化无效事件。将存活株转移到温室中的单个3英寸盆中。这些株系在T0代中提供对2，4-滴高水平的抗性。预期在不直接来自组织培养的T1植物中具有提高的应答一致性。将这些植物与野生型KY160烟草进行比较。使用设置为187L/ha的履带式喷雾机对所有植物喷洒。用140-2240g ae/ha范围的2，4-滴二甲胺盐(DMA)、70-1120g ae/ha范围的绿草定或35-560g ae/ha范围的氟草烟喷洒植物。所有的应用配制在水中。每个处理重复2-4次。在处理后3和14天评估植物。就发育障碍、缺绿症和坏死确定植物损伤率。T1代是分离的，因此由于接合性的差异可以预计到一些不同的应答。
在4×大田用量(2240g ae/ha)或之下的2，4-滴用量下未观察到损伤。在一个事件株系中用绿草定处理观察到一些损伤，但是用氟草烟处理观察到最大的损伤。氟草烟损伤是短期的，且14DAT时一个事件的新生长和未处理的对照几乎没有区别(表21)。值得注意的是，未转化的烟草对氟草烟极度敏感。这些结果表明AAD-12(v1)可提供商业水平的2，4-滴耐性，甚至是在对生长素非常敏感的双子叶作物(如烟草)中。这些结果还显示，可以赋予对吡啶氧乙酸类除草剂绿草定和氟草烟的抗性。能够规定用具有不同杂草控制谱的多种活性成分处理受AAD-12保护的除草剂耐性作物，这对于种植者极其有用。
Figure A20068005015201001
10.3AAD-12(v1)在烟草中的遗传性
还对AAD-12(v1)株系中的7个T1株系进行了100个植物子代测定。按以上方法使种子层积、播种并移植，只是不通过Liberty选择去除无效植物。然后，如前述用560g ae/ha 2，4-滴二甲胺盐喷洒所有的植物。14DAT后，对抗性和敏感植物计数。经卡方分析测定，7个检测株系中的5个均以单基因座显性孟德尔性状分离(3R:1S)。AAD-12可在多个物种中作为强芳氧基链烷酸酯生长素抗性基因遗传。
10.4-pDAS1580烟草植物对2，4-滴、2，4-滴丙酸、绿草定和氟草烟除 草剂的大田耐性。
在印地安纳州和密西西比州的大田中，对3个AAD-12(v1)株系(事件pDAS1580-[1]-018.001、pDAS1580-[1]-004.001和pDAS1580-[1]-020.016)和一个野生型株系(KY160))进行大田水平耐性试验。按照上文所示的生长条件，通过在包含Metro 360培养基的72孔移植平台(HummertInternational)上种植T1种子，让烟草移植物在温室中生长。如前述通过Liberty选择来选择性去除无效植物。移植的植物运送到大田中，使用工业蔬菜种植机以14或24英寸的间隔种植。密西西比州基地的滴灌和印地安纳州基地的喷灌用于保持植物旺盛生长。
实验设计为四次重复的分割区设计。主区为除草剂处理，小区为烟草株系。除草剂处理包括以280、560、1120、2240和4480g ae/ha使用的2，4-滴(二甲胺盐)、以840g ae/ha使用的绿草定、以280g ae/ha使用的氟草烟和未处理对照。区为25-30ft的一行。移植后3-4周使用以130-200kpa压力递送187L/ha载体体积的压缩空气背包式喷雾机进行除草剂处理。在处理后7、14和21天进行损伤、生长抑制和偏上发育的目测评估。
表22显示AAD-12(v1)事件对2，4-滴、绿草定和氟草烟的应答。以560g ae/ha(被认为1X大田用量)使用的2，4-滴严重损伤非转化烟草株系(63％在14DAT)。所有AAD-12(v1)株系表现在14DAT对2，4-滴的优秀耐性，即分别在2、4和8X用量观察到平均1、4和4％损伤。2X剂量的绿草定(840g ae/ha)严重损伤非转化烟草株系(53％在14DAT)；然而，AAD-12(v1)株系表现在14DAT 3个株系平均5％损伤的耐性。以280g ae/ha使用的氟草烟在14DAT引起非转化株系严重的损伤(99％)。AAD-12(v1)株系表现在14DAT平均11％损伤的增强的耐性。
这些结果说明在典型的大田条件下，AAD-12(v1)转化事件株系显示对多倍于商业用量的2，4-滴、绿草定和氟草烟高水平的耐性，其中多倍于商业用量的除草剂对非转化烟草是致死的或引起严重偏上畸形。
Figure A20068005015201011
Figure A20068005015201021
10.5AAD-12(v1)保护作用对抗升高的2，4-滴用量
表23显示在温室中AAD-12(v1)保护作用对抗升高的2，4-滴二甲胺盐用量的结果。当用如前述的相同方法以560g ai/ha Liberty选择时，从3R:1S分离事件得到T1AAD-12(v1)植物。还种植T1AAD-1(v3)种子作为转化的烟草对照(参阅PCT/US2005/014737)。未转化的KY160作为敏感对照。使用设置为187L/ha的履带式喷雾机对植物喷洒140、560、2240、8960和35840g ae/ha的2，4-滴二甲胺盐，并在3和14DAT评估。
AAD-12(v1)和AAD-1(v3)均有效保护烟草对抗剂量升至4X商业用量的2，4-滴损伤。然而，当升至64X标准大田剂量时，AAD-12(v1)明显表现出比AAD-1(v3)显著的保护优势。
Figure A20068005015201022
10.6叠加AAD-12增加除草剂谱
纯合的AAD-12(v1)(pDAS1580)和AAD-1(v3)(pDAB721)植物(后者参阅PCT/US2005/014737)均互交并收集F1种子。将来自于每个基因两次互交的F1种子层积和处理。每次杂交重复4次以与用于其它测试相同的喷雾方法处理，即使用以下处理之一：70、140、280g ae/ha氟草烟(选择AAD-12(v1)基因)；280、560、1120g ae/ha R-2，4-滴丙酸(选择AAD-1(v3)基因)；或560、1120、2240g ae/ha 2，4-滴二甲胺盐(证实2，4-滴耐性)。每个基因的纯合T2植物还可用作对照种植。在3和14DAT对植物进行分级。表24显示喷洒结果。
结果证实AAD-12(v1)能成功叠加AAD-1(v3)，因此增加可以应用到目的作物的除草剂谱(分别用于AAD-1和AAD-12的苯氧乙酸类+苯氧丙酸与苯氧乙酸类+吡啶氧乙酸类)。除草剂交叉抗性模式的互补性质允许方便地使用这两个基因作为互补和叠加的大田选择标记物。在单基因耐性也许不重要的作物中，本领域技术人员认识到一个基因通过叠加第二耐性基因能增加对相同除草剂的耐性。使用具有相同或不同启动子的同一基因能完成这些任务；然而，正如本文观察到的，通过区别对苯氧丙酸类[AAD-1(v3)]或吡啶氧乙酸类[AAD-12(v1)]的交叉保护作用能促进叠加和追踪两种互补性状。
Figure A20068005015201031
实施例11-大豆转化
已通过基因转移技术完成了对大豆以下性状的改良：如除草剂耐性(Padgette等，1995)、氨基酸修饰(Falco等，1995)和昆虫抗性(Parrott等，1994)。将外源性状引入作物物种需要允许使用含有简单插入物的选择标记序列常规产生转基因株系的方法。转基因应以单个功能基因座遗传以简化育种。已经报道了通过合子胚轴(McCabe等，1988)或体细胞胚发生培养物(Finer和McMullen，1991)的微粒轰击和农杆菌介导的子叶外植体(Hinchee等，1988)或合子胚(Chee等，1989)的转化将外源基因递送到栽培大豆。
来自农杆菌介导的转化的转化体往往具有低拷贝数的简单插入物(Birch，1991)。研究用于将基因转移进大豆的三种靶组织(合子胚轴(Chee等，1989；McCabe等，1988)、子叶(Hinchee等，1988)和体细胞胚发生培养物(Finer和McMullen，1991))都有各自的优缺点。后者已经被广泛研究作为直接基因转移的靶组织。胚发生培养物往往相当高效，并可长期维持。然而，原代转化体的不育和染色体畸变与胚发生悬液的胚龄相关(Singh等，1998)，因此持续起始新的培养物对使用这种组织的大豆转化系统似乎是必要的。这种系统需要高水平的2，4-滴(40mg/L浓度)来起始胚性愈伤组织，由于培养基中含有2，4-滴时转化的基因座不能进一步发育，因此这使AAD-12(v1)基因的使用产生了根本的问题。因此，基于分生组织的转化可理想地用于开发使用AAD-12(v1)的2，4-滴抗性植物。
11.1二元构建体的Gateway克隆
将AAD-12(v1)编码序列克隆到5个含有不同植物启动子的不同Gateway供体载体中。随后通过LR克隆酶反应(Invitrogen Corporation，Carlsbad Ca，目录号11791-019)将得到的AAD-12(v1)植物表达盒克隆到Gateway指定二元载体中。
包含AAD-12(v1)编码序列的NcoI-SacI片段从DASPICO12水解下来，连入相应的以下Gateway供体载体的NcoI-SacI限制性位点中：pDAB3912(attL1//CsVMV启动子//AtuORF233’UTR//attL2)、pDAB3916(attL1//AtUbi10启动子//AtuORF233’UTR//attL2)、pDAB4458(attL1//AtUbi3启动子//AtuORF233’UTR//attL2)、pDAB4459(attL1//ZmUbi1启动子//AtuORF233’UTR//attL2)和pDAB4460(attL1//AtAct2启动子//AtuORF233’UTR//attL2)。命名含有以下植物表达盒的得到的构建体：pDAB4463(attL1//CsVMV启动子//AAD-12(v1)//AtuORF233’UTR//attL2)、pDAB4467(attL1//AtUbi10启动子//AAD-12(v1)//AtuORF233’UTR//attL2)、pDAB4471(attL1//AtUbi3启动子//AAD-12(v1)//AtuORF233’UTR//attL2)、pDAB4475(attL1//ZmUbi1启动子//AAD-12(v1)//AtuORF233’UTR//attL2)和pDAB4479(attL1//AtAct2启动子//AAD-12(v1)//AtuORF233’UTR//attL2)。经限制性酶水解和测序证实这些构建体。
植物表达盒通过Gateway LR克隆酶反应重组到Gateway指定二元载体pDAB4484(RB7 MARv3//attR1-ccdB-氯霉素抗性-attR2//CsVMV启动子//PATv6//AtuORF1 3’UTR)中。Gateway技术使用基于λ噬菌体的位点特异性重组代替限制性内切核酸酶和连接酶将目的基因插入表达载体中。Invitrogen公司，Gateway技术：A Universal Technology toClone DNA Sequences for Functional Analysis and Expression in multipleSystems，技术手册，目录号是12535-019和12535-027，Gateway技术版本E，9/22/2003，#25-022。DNA重组序列(attL和attR)以及LR克隆酶混合物允许两侧为重组位点的任一DNA片段转移到含有相应位点的任一载体中。供体载体的attL1位点与二元载体的attR1相对应。同样地，供体载体的attL2位点与二元载体的attR2相对应。使用Gateway技术，两侧为attL位点的植物表达盒(来自于供体载体)能重组到二元载体的attR位点。含有以下植物表达盒的得到的构建体标记为：pDAB4464(RB7MARv3//CsVMV启动子//AAD-12(v1)//AtuORF233’UTR//CsVMV启动子//PATv6//AtuORF13’UTR)、pDAB4468(RB7MARv3//AtUbi10启动子//AAD-12(v1)//AtuORF233’UTR//CsVMV启动子//PATv6//AtuORF13’UTR)、pDAB4472(RB7 MARv3//AtUbi3启动子//AAD-12(v1)//AtuORF233’UTR//CsVMV启动子//PATv6//AtuORF13’UTR)、pDAB4476(RB7MARv3//ZmUbi1启动子//AAD-12(v1)//AtuORF233’UTR//CsVMV启动子//PATv6//AtuORF13’UTR)和pDAB4480(RB7MARv3//AtAct2启动子//AAD-12(v1)//AtuORF233’UTR//CsVMV启动子//PATv6//AtuORF13’UTR)(参阅表8)。经限制性酶水解和测序证实这些构建体。
11.2转化方法1：根癌农杆菌介导的大豆子叶节转化。
最先报道的大豆转化靶向子叶节区中的分生组织细胞(Hinchee等，1988)和来自顶端分生组织的芽增殖物(McCabe等，1988)。在基于根癌农杆菌的子叶节方法中，外植体制备物和培养基组合物刺激节中辅助分生组织的增殖(Hinchee等，1988)。仍不清楚这些处理是否起始了真正去分化而全能的愈伤组织培养物。从单个外植体回收多个转化事件克隆和少见的嵌合体植物回收(Clemente等，2000；Olhoft等，2003)表明单细胞来源和其后的转基因细胞增殖产生增殖的转基因分生组织培养物或单一转化的芽(再经历芽增殖)。由于此系统是基于种系嵌合体的成功鉴定，大豆芽增殖方法(最初基于微粒轰击(McCabe等，1988)，最近改造用于农杆菌介导的转化(Martinell等，2002))显然不经历与子叶节方法相同的去分化水平或类型。通过基于农杆菌的子叶节方法转化的基因型范围正稳步扩大(Olhoft和Somers，2001)。这种从头开始的分生组织和芽增殖方法较少受到具体基因型的限制。这还是不基于2，4-滴的方案，可理想地用于2，4-滴选择系统。因此，子叶节方法可能是开发2，4-滴抗性大豆栽培种应选择的方法。尽管此方法早在1988年(Hinchee等，1988)即有所描述，但直到最近才将其优化用于若干大豆基因型的常规高频转化(Zhang等，1999；Zeng等，2004)。
11.2.1-AAD-12(v1)耐性表型的植物转化产物。种子来源的“Maverick”外植体和农杆菌介导鞘节(cot-node)转化的方法用于产生AAD-12(v1)转基因植物。
11.2.2-农杆菌的制备和接种
携带5个二元pDAB载体(表8)中每一个的农杆菌菌株EHA101(Hood等，1986)用于起始转化。每个二元载体包含位于T-DNA区内的AAD-12(v1)基因和植物选择基因(PAT)盒。表8所列的启动子驱动每个基因并且这些质粒通过电穿孔移入农杆菌EHA101菌株中。然后在农杆菌处理大豆外植体之前对选择的菌落进行基因整合分析。Maverick种子用于所有的转化实验并且从密苏里大学，Columbia，MO获得种子。
遵循Zeng等(2004)改良的程序，使用PAT基因作为选择标记偶联作为选择试剂的除草剂草铵膦进行农杆菌介导的大豆(Glycine max)转化。种子在用3g/L植物凝胶(Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo.)固化的B5基础培养基(Gamborg等1968)上萌发；在共培培养基中加入400mg/L l-半胱氨酸并共培养持续5天(Olhoft和Somers 2001)；出芽起始、芽伸长和生根培养基补充50mg/L头孢噻肟、50mg/L特美汀、50mg/L万古霉素并用3g/L植物凝胶固化。然后将选择的芽转移到生根培养基。最佳选择方案是贯穿第一和第二出芽起始期在培养基中使用8mg/L草铵膦以及在芽伸长期在培养基中使用3-4mg/L草铵膦。
将伸长芽(3-5cm)转移到生根培养基之前，切除的节间末端浸泡在1mg/L吲哚3-丁酸中1-3分钟促进生根(Khan等1994)。芽在含有生根培养基的25×100mm玻璃培养管中扎根，然后转移到Conviron打开的Magenta盒中用于幼苗适应的土壤混合物的Metro-mix 200(HummertInternational，Earth City，Mo.)中。Liberty除草剂(拜耳作物科学(BayerCrop Science))中的活性成分草铵膦用于在出芽起始和伸长期进行选择。生根的幼苗在筛选和转移到温室进行进一步适应和建立之前先在打开的Magenta盒中适应几周。
11.2.3-测定推断的转化幼苗并分析在温室中建立的T 0 植物。
这些幼苗选择出的叶子的末端小叶是在1周间隔用50mg/L草铵膦涂抹2次的叶子，来观察筛选推定转化体的结果。然后将筛选的幼苗转移到温室，并在适应之后，再次在叶子上涂抹草铵膦以证实GH中这些幼苗的耐性状态并认为是推定的转化体。
转移到温室中的植物通过用草铵膦溶液[0.05-2％ v/v Liberty除草剂，优选地0.25-1.0％(v/v)，＝500-2000ppm草铵膦，拜耳作物科学(Bayer CropScience)]涂抹T0原代转化体或其子代的叶子部分这种无害方法，进一步测定活性PAT基因的存在。取决于使用浓度，在处理后1-7天可进行草铵膦损伤评估。通过对新扩张的具三小叶的一个或两个(优选两个)节点(位于最嫩的新形成的具三小叶下面)的末端小叶选择应用2，4-滴水溶液(0.25-1％v/v商业2，4-滴二甲胺盐成分，优选0.5％v/v＝2280ppm 2，4-滴ae)这种无害方式，植物还可用于检测2，4-滴耐性。这种测定通过评估从相邻小叶的平面翻转或旋转＞90度的叶子，允许在应用后6小时至几天评估2，4-滴敏感性植物。对2，4-滴耐性的植物将不对2，4-滴应答。允许T0植物在温室中自花授粉以产生T1种子。用一定剂量范围的除草剂喷射T1植物(就产生足够T0植物克隆而言)来确定转基因大豆中，由AAD-12(v1)和PAT基因提供的除草剂保护水平。T0植物的2，4-滴用量一般包含100-1120g ae/ha范围内的一种或两种选择用量，使用如前述的履带式喷雾机。用更广的除草剂剂量范围(50-3200g ae/ha 2，4-滴)处理T1植物。同样地，通过出苗后分别用200-800和50-3200g ae/ha草铵膦处理，可筛选草铵膦抗性的T0和T1植物。通过出苗后应用剂量范围为280-2240g ae/ha的草甘膦，可评估T1代中草甘膦抗性(在用含有EPSPS的构建体转化的植物中)或其它草甘膦耐性基因。蛋白质表达分析按下述进行。个体T0植物用于评估目的基因(AAD-12(v1)或PAT v6)编码区的存在和拷贝数。如前面实施例所述，使用T1和T2子代就除草剂耐性的分离进行AAD-12(v1)遗传性的确定。
根据上文方法在T0代评估最初转化体子集。被证实为具有AAD-12(v1)编码区的任一植物(不论驱动基因的启动子如何)不对涂抹叶子的2，4-滴应答，而野生型Maverick大豆应答(11.2.3部分的表)。只转化PAT的植物和野生型植物一样对涂抹叶子使用的2，4-滴应答。
应用2，4-滴的植物子集，与使用560或1120g ae 2，4-滴的野生型对照植物大小相似。与野生型Maverick大豆相比，所有含有AAD-12(v1)的植物明显对使用除草剂具有抗性。2个AAD-12(v1)植物观察到轻度水平的损伤(2DAT)，但损伤是暂时的且7DAT没有观察到损伤。7-14DAT以560gae/ha使用的2，4-滴严重损伤野生型对照植物并且在1120g ae/ha对其致死。这些数据与AAD-12(v1)能赋予敏感作物(如大豆)高耐性(＞2X大田用量)的事实一致。然后对筛选的植物取样进行分子和生物化学分析，用来证实如下文所述和表25所报道的AAD12(v1)基因整合、拷贝数和它们的基因表达水平。
Figure A20068005015201101
11.2.4-分子分析：大豆
11.2.4.1-收集的组织的DNA分离和定量。将新鲜的组织放置在试管中并在4℃冻干2天。组织完全干燥之后，将钨珠(Valenite)放置在试管中并使用Kelco砂磨机对样本进行1分钟的干燥研磨。然后进行标准的DNeasy DNA分离程序(Qiagen，DNeasy 69109)。然后用PicoGreen(分子探针P7589)对提取的DNA等分试样染色，并在具有已知标准的荧光计(BioTek)中读数以获得浓度(ng/μL)。
11.2.4.2-聚合酶链式反应。总量为100ng的总DNA用作模板。用Takara Ex Taq PCR聚合酶试剂盒(Mirus TAKRR001A)使用20mM的每种引物。用于AAD-12(v1)PTU的引物是(正向-ATAATGCCAGC CTGTTAAACGCC)(SEQ ID NO：8)和(反向-CTCAAGCATATGAATGACCT CGA)(SEQ ID NO：9)。在9700Geneamp热循环仪(Applied Biosystems)中进行PCR反应，将样品置于94℃3分钟，接着是94℃30秒、63℃30秒和72℃1分45秒的35个循环，然后是72℃10分钟。用于AAD-12(v1)编码区PCR的引物是(正向-ATGGCTCATGCTGCCCTCAGCC)(SEQ ID NO：10)和(反向-CGGGC AGGCCTAACTCCACCAA)(SEQ ID NO：11)。在9700 Geneamp热循环仪(Applied Biosystems)中进行PCR反应，将样品置于94℃3分钟，接着是94℃30秒、65℃30秒和72℃1分45秒的35个循环，然后是72℃10分钟。通过在1％用EtBr染色的琼脂糖凝胶上进行电泳分析PCR产物。
11.2.4.3-Southern印迹分析。从Oiagen DNeasy试剂盒获得的总DNA进行Southern印迹分析。将总量为10μg的基因组DNA过夜消化以得到整合数据。过夜消化之后～100ng的测试样品在1％的凝胶上跑电泳以确保完全消化。确信之后样品在大的0.85％的琼脂糖凝胶上40伏特过夜跑电泳。然后凝胶在0.2M NaOH、0.6M NaCl中变性30分钟。然后凝胶在0.5M Tris HCl、1.5M NaCl pH7.5中中和30分钟。然后设置含有20xSSC的凝胶装置以实现凝胶向尼龙膜(MilliporeINYC00010)过夜重力转移。过夜转移之后通过交联仪(Stratagene UVstratalinker 1800)再将膜在1200X100微焦耳照射UV光。然后膜在0.1％SDS、0.1SSC中洗涤45分钟。45分钟洗涤之后，膜在80℃烘烤3个小时，然后4℃储存直至杂交。通过上文编码区PCR使用质粒DNA制备杂交模板片断。产物在1％琼脂糖凝胶上跑电泳，然后切割，再使用Qiagen(28706)凝胶提取方法提取凝胶。然后膜在Perfect Hyb缓冲液(Sigma H7033)中60℃预杂交1个小时。Prime it RmTdCTP-labeling rxn(Stratagene 300392)程序用于开发基于p32的探针(Perkin Elmer)。使用Probe Quant.G50柱(Amersham 27-5335-01)提纯探针。2百万计数的CPM用于southern印迹过夜杂交。过夜杂交之后，再将印记在0.1％SDS、0.1SSC中65℃进行2次20分钟洗涤。然后将印记进行过夜胶片曝光，-80℃孵育。
11.2.5-生物化学分析：大豆
11.2.5.1-组织取样以及从大豆叶子中提取AAD-12(v1)蛋白。从涂抹2，4-滴、但是1DAT之后的N-2叶子取大约50至100mg的叶组织样本。去除末端N-2小叶并且切成小块或者2个单孔冲压叶片(直径～0.5cm)，立即在干冰上冷冻。根据实施例9所述方法完成进一步的蛋白质分析(ELISA和Western分析)。
11.2.6-T 1 子代评估。允许T0植物自花授粉以得到T1家系。使用在V1-V2生长阶段应用的560g ai/ha的草铵膦作为选择剂测定子代检验(分离分析)。存活的植物将进一步测定V2-V6中的一个或更多生长阶段的2，4-滴耐性。通过自花授粉产生的种子允许在转基因的大豆中进行更广泛的除草剂检验。
通过农杆菌介导的鞘节转化系统已产生AAD-12(v1)转基因Maverick大豆植物。T0植物获得高达2倍于大田应用水平的2，4-滴耐性并发育成可育种子。可育的转基因大豆植物的频率升至5.9％。经Southern印迹分析证实AAD1-12(v1)基因整合到大豆基因组中。此分析表明大多数转基因植物含有低拷贝数。用AAD-12(v1)抗体筛选的植物表现出ELISA阳性和Western分析中正确的带。
11.3转化方法2：气溶胶束介导的胚胎发生大豆愈伤组织的转化。
如美国专利No.6,809,232(Held等)所述，使用表8中一个或多个构建体，完成胚胎发生大豆愈伤组织的培养和其后的传代(beaming)，以创建转化体。
11.4转化方法3.基因枪轰击大豆
使用成熟种子来源的胚轴分生组织能完成此方法(McCabe等(1988))。随后建立的基因枪轰击方法能让人期待转化的大豆植物的回收。一旦植物再生，事件的评估可如实施例11.2所述进行。
11.5转化方法4.晶须介导的转化。
根据先前Terakawa等(2005)描述的方法能预期晶须制备和晶须转化。随后建立的基因枪轰击方法能让人期待转化的大豆植物的回收。一旦植物再生，事件的评估可如实施例11.2所述进行。
Maverick种子在70％乙醇中1分钟进行表面消毒，随后浸没于1％次氯酸钠中20分钟，然后用无菌的蒸馏水冲洗3次。种子在蒸馏水中浸泡18-20个小时。从种子中切除胚轴，通过去除初级叶子暴露顶端分生组织。胚轴放置在轰击培养基中[BM：MS(Murashige和Skoog 1962)基础盐培养基，3％蔗糖和0.8％植物凝胶Sigma，pH5.7]中，在含有12ml培养基的5-cm培养皿中心，尖区指向上方。
11.6转化方法5。根据以前的方法(Khalafalla等2005；El-Shemy等2004，2006)可优化颗粒轰击介导的胚性愈伤组织的转化。根据实施例11.2也能评估再生植物。
实施例12-棉花中的AAD-12(v1)
12.1-棉花转化方案。
使棉花种子(Co310基因型)在95％乙醇中表面灭菌1分钟、洗涤、用50％商品漂白剂灭菌20分钟、然后用无菌蒸馏水漂洗三次，其后使其在Magenta GA-7容器中的G培养基(表26)上萌发并在40-60μE/m2的高光强下维持，光周期设置为28℃16小时光照和8小时黑暗。
从7-10天龄的苗分离子叶节段(约5mm见方)到皮氏培养皿(Nunc，款号0875728)中的液体M液体培养基(表26)。用农杆菌溶液处理切下的节段(约30分钟)，其后转移到半固体M培养基(表26)共培养2-3天。共培养之后将节段转移至MG培养基(表26)。用羧苄青霉素作为杀死农杆菌的抗生素，用草铵膦作为仅允许含有转移基因的细胞生长的选择剂。
农杆菌的制备。接种35ml Y培养基(表26)(含有链霉素(100mg/ml贮液)和红霉素(100mg/ml贮液))和1菌环细菌在28℃在黑暗中生长过夜，同时在150rpm振荡。第二天将农杆菌溶液倒入无菌oakridge管(Nalge-Nunc，3139-0050)中并在Beckman J2-21中以8,000rpm离心5分钟。倒掉上清液并将沉淀重悬于25ml M液体(表26)中并涡旋。将等分试样放入玻璃培养管(Fisher，14-961-27)用于Klett读数(Klett-Summerson，model 800-3)。以总体积40ml用M液体培养基将新悬液稀释到Klett计读数为每ml108个菌落形成单位。
三周后，分离来自子叶节段的愈伤组织并转移至新鲜MG培养基。愈伤组织转移到MG培养基上再过3周。在并行比较中，既然2，4-滴丙酸不是AAD-12酶的底物，而在棉花中2，4-滴丙酸比2，4-滴更有作用，因此用2，4-滴丙酸(以0.01和0.05mg/L浓度加入培养基)补充MG培养基以补偿2，4-滴的降解。在独立的比较中，与标准培养基相比，放置在不含有生长调节剂的MG培养基上的节段显示减少的愈伤组织但仍有愈伤组织生长。然后将愈伤组织转移至CG培养基(表26)，并在三周后再转移至新鲜的选择培养基。再经过三周后，将愈伤组织转移至缺少植物生长调节剂的D培养基(表26)用于胚性愈伤组织诱导。在此培养基上经过4-8周后形成了胚性愈伤组织，可通过其淡黄白色的颜色和颗粒细胞区别于非胚性愈伤组织。胚在其后很快开始再生，颜色为明显的绿色。棉花需要时间再生和形成胚，加速这种过程的方法之一是胁迫组织。干燥是完成此过程的常见方法，通过使用较少的培养基和/或采用多种平皿密封方式(胶带和parafilm封口膜)改变组织和平皿的微环境。
分离较大的发育良好的胚转移到DK培养基(表26)用于胚发育。3周后(或当胚已发育时)将萌发的胚转移至新鲜培养基用于芽和根发育。4-8周后，将任何发育良好的植物转移到土壤中培养至成熟。在接下来的两三个月中，植物已经生长至可以喷洒以确定其是否具有2，4-滴抗性的时间点。
Figure A20068005015201161
12.2-细胞转化。
起始一些用含有pDAB724的农杆菌处理子叶节段的实验。使用多种用于pDAB724棉花愈伤组织增殖的生长素选择处理超过2000个得到的节段：0.1或0.5mg/L R-2，4-滴丙酸、标准2，4-滴浓度和无生长素处理。由于构建体中包含PAT基因，在草铵膦上选择愈伤组织。以PCR和侵入物形式进行愈伤组织株系分析用于测定是否和确定在愈伤组织期中存在基因；接着将胚胎发生的愈伤组织株系用于Western分析，基本上如11.2.3节所述。使用干燥技术胁迫胚胎发生的棉花愈伤组织，以提高回收组织的质和量。
对几乎200个愈伤组织事件进行了完整的PTU筛选，使用Western分析AAD-12(v1)基因的表达。下文是已检验的一些棉花愈伤组织的数据的子集。
构建体   株系编号   AAD-12PTU   AAD-12侵入物   AAD-12ng/ml
  pDAB724   1   +   +   79.89
  pDAB724   2   +   +   17.34
  pDAB724   3   +   +   544.80
  pDAB724   4   +   +   32.63
  pDAB724   5   +   +   82.77
  pDAB724   83   +   +   795.50
  pDAB724   84   +   +   613.35
  pDAB724   85   +   +   1077.75
  pDAB724   86   +   +   437.74
  pDAB724   87   +   +   286.51
  pDAB724   88   +   +   517.59
  pDAB724   89   +   +   1250.70
12.3-植物再生。
将按上述方案产生植物的AAD-12(v1)棉花株系送至温室。为证明AAD-12(v1)基因在棉花中提供对2，4-滴的抗性，用喷洒体积为187L/ha的履带式喷雾机递送560g ae/ha 2，4-滴喷洒AAD-12(v1)和野生型两种棉花植物。在处理后3和14天评估植物。2，4-滴选择量下存活的植物自花授粉产生T1种子或与原种棉花株系远交产生F1种子。种植随后产生的种子并如前述评估除草剂抗性。如实验18、19、22和23所述，AAD-12(v1)事件能与其它所需的HT或IR性状组合。
实施例13-其他作物的农杆菌转化
按照本文公开的内容，可以根据本发明使用本领域已知的技术转化其他作物。对于农杆菌介导的黑麦转化，参阅如Popelka和Altpeter(2003)。对于农杆菌介导的大豆转化，参阅如Hinchee等，1988。对于农杆菌介导的高粱转化，参阅如Zhao等，2000。对于农杆菌介导的大麦转化，参阅如Tingay等，1997。对于农杆菌介导的小麦转化，参阅如Cheng等，1997。对于农杆菌介导的稻转化，参阅如Hiei等，1997。
下文给出了这些和其他植物的拉丁名。应该明确，这些和其他(非农杆菌)转化技术可用于将例如AAD-12(v1)转化进这些植物和其他植物，包括但不仅限于玉蜀黍(Zea mays)、小麦(小麦属物种(Triticum spp.))、稻(稻属物种(Oryza spp.)和菰属物种(Zizania spp.))、大麦(大麦属物种(Hordeumspp.))、棉花(水麻(Abroma augusta)和棉花属物种(Gossypium spp.))、大豆(Glycine max)、甜菜以及食用甜菜(甜菜属物种(Beta spp.))、甘蔗(桄榔(Arenga pinnata))、番茄(番茄(Lycopersicon esculentum)和番茄属其他物种)、粘果酸浆(Physalis ixocarpa)、Solarium incanum和茄属其他物种，以及树番茄(Cyphomandra betacea))、马铃薯(Solanum tubersoum)、甘薯(Ipomoea betatas)、黑麦(黑麦属物种(Secale spp.))、胡椒(辣椒(Capsicumannuum)、C.sinense和鸟辣椒(C.frutescens))、莴苣(生菜(Lactuca sativa)、山莴苣(L.perennis)和野莴苣(L.pulchella))、卷心菜(芸苔属物种(Brassicaspp.))、芹菜(旱芹(Apium graveolens))、茄子(Solanum melongena)、花生(Arachis hypogea)、高粱(所有高粱属(Sorghum)物种)、苜蓿(紫花苜蓿(Medicago sativum))、胡萝卜(Daucus carota)、豆类(菜豆属物种(Phaseolusspp.)和其他属)、燕麦(燕麦(Avena Sativa)和粗燕麦(A.Strigosa))、豌豆(豌豆属(Pisum)、豇豆属(Vigna)和四棱豆属物种(Tetragonolobus spp.))、向日葵(Helianthus annuus)、南瓜(南瓜属物种(Cucurbita spp.))、黄瓜(Cucumissativa)、烟草(烟草属物种(Nicotiana spp.))、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、草坪草(黑麦草属(Lolium)、剪股颖属(Agrostis)、早熟禾属(Poa)、狗牙根属(Cynadon)和其他属)、三叶草(三叶草属(Tifolium))、野豌豆(野豌豆属(Vicia))。带有如AAD-12(v1)基因的这些植物包括于本发明中。
在许多落叶和常绿木材的耕作制度中，AAD-12(v1)具有增加主要生长素除草剂应季使用的实用性的潜能。绿草定、2，4-滴和/或氟草烟抗性木材物种增加了过分使用这些除草剂而不担心损伤的灵活性。这些物种包括但不局限于：桤木(桤木属物种(Alnus spp.))、梣(梣属物种(Fraxinus spp.))、白杨和杨木物种(杨属物种(Populus spp.))、山毛榉(水青冈属物种(Fagusspp.))、桦(桦木属物种(Betula spp.))、樱桃(李属物种(Prunus spp.))、桉树(桉属物种(Eucalyptus spp.))、山核桃树(山核桃属物种(Carya spp.))、枫树(枫属物种(Acer spp.))、橡树(栎属物种(Quercus spp.))和松树(松属物种(Pinus spp.))。在观赏性和结果物种中利用生长素抗性进行选择性杂草控制也在本发明范围内。实例包括但不局限于：玫瑰(蔷薇属物种(Rosa spp.))、地肤(burning bush)(卫矛属物种(Euonymus spp.))、矮牵牛(矮牵牛属物种(Petunia spp.))、秋海棠(秋海棠属物种(Begonia spp.))、杜鹃(杜鹃属物种(Rhododendron spp.))、山楂或苹果(苹果属物种(Malus spp.))、梨(梨属物种(Pyrus spp.))、桃(李属物种)和万寿菊(万寿菊属物种(Tagetes spp.))。
实施例14-令人惊奇的结果的其他证据：AAD-12对AAD-2
14.1-AAD-2(v1)起始克隆。
从NCBI数据库(参阅ncbi.nlm.nih.gov网址；登录号AP005940)鉴定了另一个基因，该基因为与tfdA只有44％氨基酸同一性的同源物。为保持一致性，此基因在本文中称为AAD-2(v1)。通过以下测定同一性百分比：首先将AAD-2和tfdA DNA序列(分别为PCT/US2005/014737的SEQ IDNO：12和GENBANK登录号M16730)翻译成蛋白质(分别为PCT/US2005/014737的SEQ ID NO：13和GENBANK登录号M16730)，接着使用VectorNTI软件包中的ClustalW进行多重序列比对。
含有AAD-2(v1)基因的慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizbium japonicum)菌株得自北方地区研究实验室(Northern Regional Research Laboratory)(NRRL，菌株号B4450)。按照NRRL方案复苏冻干的菌株并作为Dow细菌菌株DB 663在20％甘油中保存于-80℃用于内部用途。将来自此冰冻原种的一菌环细菌钩在Triptic大豆琼脂平板上用于分离，并在28℃孵育3天。将单菌落接种到500ml三角挡板瓶中的100ml胰蛋白酶大豆培养液中，以150rpm在平板振荡器上28℃孵育过夜。使用Qiagen的DNeasy试剂盒(Qiagen目录号69504)的革兰氏阴性方案从其中分离总DNA。设计以下引物以从基因组DNA中扩增靶基因，正向：5’ACT AGT AAC AAAGAA GGA GAT ATA CCA TGA CGA T3’[brjap 5’(speI)PCT/US2005/014737的SEQ ID NO：14(加入了Spe I限制性位点和核糖体结合位点(RBS))]和反向：5’TTC TCG AGC TAT CAC TCC GCC GCCTGC TGC TGC 3’[br jap 3’(xhol)PCT/US2005/014737的SEQ ID NO：15(加入了Xho I位点)]。
按如下建立50μl的反应：Fail Safe缓冲液25μl、各种引物1μl(50ng/μl)、gDNA 1μl(200ng/μl)、H2O 21μl、Taq聚合酶1μl(2.5单位/μl)。在三个独立的反应中使用三种Fail Safe缓冲液-A、B和C。然后使用FailSafe PCR系统(Epicenter目录号FS99100)在以下条件下进行PCR反应：95℃3.0分钟的热变性循环；95℃1.0分钟、50℃1.0分钟、72℃1.5分钟的30个循环；接着是72℃5分钟的终循环。用化学感受态的TOPl0F’大肠杆菌作为宿主菌株，按照所包含的方案将得到的约1kb的PCR产物克隆到pCR 2.1(Invitrogen目录号K4550-40)中来验证核苷酸序列。
挑取10个得到的白色克隆至3μl Luria培养液+1000μg/ml氨苄青霉素(LB Amp)并在37℃摇动培养过夜。按照所包含的方案使用NucleospinPlus质粒小量制备试剂盒(BD Biosciences目录号K3063-2)从每个培养物中纯化质粒。完成分离DNA的限制性消化以证实pCR2.1载体中存在PCR产物。用限制性酶EcoRI(New England Biolabs目录号R0101S)消化质粒DNA。按照生产商的说明使用M13正向[5’GTA AAA CGA CGG CCA G3’](SEQ ID NO：6)和反向[5’CAG GAA ACA GCT ATG AC 3’](SEQ IDNO：7)引物，用Beckman CEQ Quick Start试剂盒(Beckman Coulter目录号608120)进行测序。为了内部一致性，给予此基因序列及其相应蛋白质新的通用名AAD-2(v1)。
14.2-AAD-2(v1)二元载体的完成。
从pDAB3202中PCR扩增AAD-2(v1)基因。在PCR反应中，在引物内进行了改变，以在5’引物和3’引物中分别引入AflIII和SacI限制性位点。参阅PCT/US2005/014737。使用Fail Safe PCR系统(Epicentre)用引物“NcoI of Brady”[5’TAT ACC ACA TGT CGA TCG CCA TCC GGC AGCTT 3’](SEQ ID NO：14)和“SacI of Brady”[5’GAG CTC CTA TCACTC CGC CGC CTG CTG CTG CAC 3’](SEQ ID NO：15)扩增DNA片段。将PCR产物克隆到pCR 2.1 TOPO TA克隆载体(Invitrogen)中，使用Beckman Coulter“Dye Terminator Cycle Sequencing with Quick StartKit”测序试剂用M13正向和M13反向引物验证序列。测序数据鉴定了一个具有正确序列的克隆(pDAB716)。接着将AflIII/SacI AAD-2(v1)基因片段克隆到NcoI/SacI pDAB726载体中。通过限制性消化(用NcoI/SacI)验证得到的构建体(pDAB717)：AtUbi10启动子：Nt OSM 5’UTR：AAD-2(v1)：Nt OSM3’UTR：ORF1 polyA 3’UTR。将此构建体以NotI-NotI DNA片段克隆到二元载体pDAB3038中。限制性消化(用NotI，EcoRI，HinDIII，NcoI，PvuII和SalI)得到的构建体(pDAB767)：AtUbi10启动子：Nt OSM5’UTR：AAD-2(v1)：Nt OSM 3’UTR：ORF1 polyA 3’UTR：CsVMV启动子：PAT：ORF25/263’UTR以验证正确的方向。然后将完成的构建体(pDAB767)转化进农杆菌中。
14.3-评估转化的拟南芥。
种植新鲜收集的用植物优化的AAD-12(v1)或天然AAD-2(v1)基因转化的T1种子，然后将选择的如前述草铵膦抗性植物随机分配多种剂量的2，4-滴(50-3200g ae/ha)。通过喷雾体积为187L/ha的履带式喷雾机应用除草剂。使用的2，4-滴是商业二甲胺盐制剂(456g ae/L，NuFarm，St Joseph，MO)混合到200mM Tris缓冲液(pH 9.0)或200mM HEPES缓冲液(pH7.5)中。
相对于转化和未转化对照株系，AAD-12(v1)和AAD-2(v1)确实提供了可检测到的2，4-滴抗性，然而，单个构建体在其向个体T1拟南芥植物赋予2，4-滴抗性的能力上存在广泛的可变性。令人惊奇地，从高耐性植物的频率和整体平均损伤来看，AAD-2(v1)和AAD-2(v2)转化体对2，4-滴的抗性都比AAD-12(v1)基因差很多。AAD-2(v1)转化的植物不能在200g ae/ha2，4-滴下相对无损伤(＜20％的目测损伤)地存活，且总体种群损伤约为83％(参阅PCT/US2005/014737)。相反，用3,200g ae/ha 2，4-滴处理AAD-12(v1)时，其种群平均损伤约为6％(表11)。植物优化的AAD-2(v2)的耐性比天然基因略有提高，然而，AAD-12和AAD-2植物优化基因的比较表明AAD-12(v1)在植物中具有显著的优势。
考虑到AAD-2(v1)(参阅PCT/US2005/014737)和AAD-12(v1)的体外比较表明二者都高效降解2，4-滴，并且均享有对手性芳氧基链烷酸酯底物的S型特异性，这些结果是未曾预料到的。在个体T1植物中AAD-2(v1)以变化的水平表达，然而，这种表达的蛋白质几乎不提供对2，4-滴损伤的保护。天然和植物优化的AAD-2基因(参阅PCT/US2005/014737)的蛋白质表达水平(在植物中)没有明显的实质性差异。这些数据证实了早前的发现，即在植物中产生AAD-12(v1)的功能性表达并得到对2，4-滴和吡啶氧乙酸类除草剂的除草剂抗性是未预料的。
实施例15-种植前灭生性应用
此实施例和其后的实施例是本发明AAD-12可能带来的新除草剂用途的具体实例。
种植前灭生性除草剂应用旨在在种植给定作物前杀死在冬天或早春出现的杂草。一般在种植前未完成物理除草的非耕地或减少的耕地管理系统中应用。因此除草剂程序必须控制种植时存在的非常广谱的阔叶和禾本科杂草。草甘膦、克无踪和草铵膦是种植前灭生性除草剂应用中广泛使用的非选择性无残留除草剂的实例。然而，由于以下一种或多种原因使这个季节的一些杂草很难控制：杂草物种或生物型对除草剂的内在不敏感性、冬季一年生杂草的相对较大的尺寸和限制除草剂摄取和活性的凉爽的天气条件。一些除草剂选择可以与这些除草剂罐混以提高对杂草的谱系和活性，而非选择性除草剂对杂草不太有效。实例为2，4-滴与草甘膦罐混应用以辅助控制小飞蓬(Conyza canadensis)(加拿大飞蓬)。用于出现的多数杂草的种植前灭生控制的草甘膦用量可从420到1680g ae/ha，更一般的从560到840g ae/ha；然而，可以应用280-1120g ae/ha的2，4-滴以辅助控制许多阔叶杂草物种(如加拿大飞蓬)。2，4-滴是精选的除草剂，因为它对范围非常广泛的阔叶杂草有效、甚至在低温下也有效并且非常廉价。然而，如果其后的作物为敏感性双子叶作物，则土壤中的2，4-滴残留(尽管残留很短)可能对作物产生负影响。大豆是敏感性作物，需要在灭生应用和种植之间存在7天(对于280g ae/ha的2，4-滴用量)到至少30天(对于1120g ae/ha的2，4-滴应用)的最小时间周期。在棉花种植前禁止用2，4-滴进行灭生性处理(参阅联邦说明(federal labels)，多数通过CPR，2005提供或在cdms.net/manuf/manuf.asp在线提供)。使用AAD-12(v1)转化的棉花或大豆，这些作物在土壤中来自之前甚至在种植后作物出苗前的灭生性应用的2，4-滴残留下存活。罐混(或商品预混)伴侣提高的灵活性和降低的费用可改善杂草控制的选择并提高在重要的非耕地和减少耕地的地点灭生性应用的强度。此实例是可利用的多种选择之一。通过使用联邦除草剂说明(CPR，2005)中所述产品和例如Agriliance Crop Protection Guide(2003)所描述的用途，杂草控制领域的技术人员会注意到多种其他应用，包括但不仅限于克无踪+2，4-滴或草铵膦+2，4-滴。本领域技术人员还会认识到，以上实例可应用于任何由AAD-12(v1)基因(如果稳定转化)保护的2，4-滴敏感性(或其他苯氧基生长素除草剂)作物。同样，AAD-12降解绿草定和氟草烟的独特性质增强其效用，分别通过取代或罐混70-1120或35-560g ae/ha的绿草定和氟草烟来增加谱系和/或提高控制多年生或藤本杂草物种的能力。
实施例16-苯氧基生长素除草剂在仅转化AAD-12(v1)的大豆、棉花和其 他双子叶作物中的作物内应用
AAD-12(v1)使得可以在通常对2，4-滴敏感的作物中使用苯氧基生长素除草剂(如2，4-滴和MCPA)和吡啶氧基生长素(绿草定和氟草烟)直接控制广谱阔叶杂草。280到2240g ae/ha的2，4-滴应用可控制农业环境中存在的多数阔叶杂草物种。更一般地使用560-1120g ae/ha。对于绿草定，应用剂量范围一般为70-1120g ae/ha，更一般140-420g ae/ha。对于氟草烟，应用剂量范围一般为35-560g ae/ha，更一般70-280g ae/ha。
这种额外的工具的优势是阔叶除草剂成分极低的费用和以较高用量使用时较高用量的2，4-滴、绿草定和氟草烟提供的可能的短期残留杂草控制，而非残留除草剂如草甘膦不提供对后来萌发的杂草的控制。这种工具还提供了除草剂作用模式联合HTC便利性的机制，作为将除草剂抗性与杂草演替有机整合在一起的管理策略。
该工具提供的另一个优点是将广谱阔叶杂草控制除草剂(如，2，4-滴、绿草定和氟草烟)和通常使用的残留杂草控制除草剂罐混的能力。这些除草剂一般在种植前或种植期应用，但是通常对种植前在大田中存在的已出现和确定的杂草低效。通过扩展这些芳氧基生长素除草剂的效用(包括种植期、出苗前或种植前应用)，增加了残留杂草控制程序的灵活性。本领域技术人员认识到残留除草剂程序将因目的作物而异，但是一般的程序包括氯乙酰胺(chloracetmide)除草剂和二硝基苯胺除草剂家系，还包括诸如异噁草松和甲磺草胺的除草剂以及多种ALS-抑制、PPO-抑制和HPPD-抑制除草剂。
其他益处包括(提供)在芳氧基乙酸生长素除草剂应用之后，种植前所必须的对2，4-滴、绿草定或氟草烟的耐性(参阅前述实施例)；且由未完全清洁的含有2，4-滴、绿草定或氟草烟的大罐引起的对双子叶作物的污染损伤问题较小。麦草畏(和一些其他除草剂)仍可用于继续控制转化了AAD-12(v1)的双子叶作物自生作物。
本领域技术人员还会认识到，以上实例可用于被AAD-12(v1)基因(如果稳定转化)保护的任何2，4-滴(或其他芳氧基生长素除草剂)敏感性作物。杂草控制领域的技术人员会认识到，AAD-12(v1)转化使得可以使用单独或与除草剂联合的多种商品苯氧基或吡啶氧基生长素除草剂。可以通过《作物保护参考》(Crop Protection Reference，CPR)书籍中汇编的除草剂说明或类似的汇编或任何商品或学术作物保护参考文献(如来自Agriliance(2005)的《作物保护指南》(Crop Protection Guide))确定这些化学中其他代表性除草剂的具体用量。每种由于AAD-12(v1)可在HTC中使用(无论单独、罐混或相继使用)的可选除草剂都在本发明范围内。
实施例17-苯氧基生长素和吡啶氧基生长素除草剂在仅转化AAD-12(v1) 的玉米、稻和其他单子叶物种中的作物内用途
以类似的方式用AAD-12(v1)转化禾本科物种(例如但不仅限于玉米、稻、小麦、大麦或草坪草和牧草)将使得在通常选择性不确定的作物中使用高效的苯氧基和吡啶氧基生长素。多数禾本科物种对生长素除草剂如苯氧基生长素(即2，4-滴)具有天然耐性。然而，由于应用时间窗口变短或无法接受的损伤风险，相对低水平的作物选择性导致了在这些植物中应用的减少。因此转化了AAD-12(v1)的单子叶作物能使用已述用于双子叶作物的相似处理组合，如应用280到2240g ae/ha的2，4-滴控制多数阔叶杂草物种。更一般地使用560-1120g ae/ha。对于绿草定，一般应用剂量范围是70-1120g ae/ha，更一般是140-420g ae/ha。对于氟草烟，一般应用剂量范围是35-560g ae/ha，更一般是70-280ae/ha。
这种额外的工具的优势是阔叶除草剂成分极低的费用和较高用量的2，4-滴、绿草定或氟草烟提供的可能的短期残留杂草控制。相比之下，非残留除草剂(如草甘膦)不提供对后来萌发的杂草的控制。这种工具还提供了将除草剂作用模式与HTC的便利性进行轮换的机制，在草甘膦耐性作物/AAD-12(v1)HTC联合策略中作为将除草剂抗性与杂草演替有机整合在一起的管理策略(无论是否轮作作物物种)。
该工具提供的另一个优点是将广谱阔叶杂草控制除草剂(如，2，4-滴、绿草定和氟草烟)和通常使用的残留杂草控制除草剂罐混的能力。这些除草剂一般在种植前或种植期应用，但是通常对种植前在大田中存在的已出现和确定的杂草低效。通过扩展这些芳氧基生长素除草剂的效用(包括种植期、出苗前或种植前应用)，增加了残留杂草控制程序的灵活性。本领域技术人员认识到残留除草剂程序将因目的作物而异，但是一般的程序包括氯乙酰胺除草剂和二硝基苯胺除草剂家系，还包括诸如异噁草松和甲磺草胺的除草剂以及多种ALS-抑制、PPO-抑制和HPPD-抑制除草剂。
玉米、稻和其它单子叶植物对苯氧基或吡啶氧基生长素的增加的耐性使得能作物内使用这些除草剂，没有生长阶段的限制或作物倒伏的可能性，展开的现象如鼠尾(“rat-tailing”)、作物倒伏、玉米中生长调控因子诱导的茎脆性或变形的支柱根。通过AAD-12(v1)能用于HTC的每种可选的除草剂，不论是单独、罐混或相继使用，认为在本发明范围之内。
实施例18-在任意作物中与草甘膦耐性性状叠加的AAD-12(v1)
北美大田种植的绝大多数棉花、芸苔、玉米和大豆含有草甘膦耐性(GT)性状，并且对GT玉米的采用正在增加。其他GT作物(如小麦、稻、甜菜和草坪草)已在开发中，但目前尚未上市。许多其他草甘膦抗性物种正处在实验至开发阶段(如苜蓿、甘蔗、向日葵、甜菜、豌豆、胡萝卜、黄瓜、莴苣、洋葱、草莓、番茄和烟草；林业物种如白杨和香枫以及园艺物种如万寿菊、牵牛花和秋海棠，万维网上的isb.vt.edu/cfdocs/fieldtests1.cfm，2005)。GTC是有价值的工具，在于受控杂草的范围以及此系统提供的便利性和费用效益。然而，草甘膦作为目前标准的基础处理的用途正在选择草甘膦抗性杂草。此外，在实行仅用草甘膦化学品程序的大田中草甘膦固有效力较低的杂草正在演替为主要物种。通过常规育种或共同作为新转化事件将AAD-12(v1)与GT性状叠加可以改进杂草控制的效力、灵活性和管理杂草演替及除草剂抗性发展的能力。如前述实施例中所提到的，通过用AAD-12(v1)转化作物，单子叶作物将具有较高的苯氧基或吡啶氧基生长素安全余地，并可以在双子叶作物中选择性应用苯氧基生长素。可以设想改善的杂草控制选择的一些方案，其中在任意单子叶或双子叶作物物种中叠加了AAD-12(v1)和GT性状：
a)可以以标准出苗后用量(420至2160g ae/ha，优选560至840g ae/ha)应用草甘膦，用于控制多数禾本科和阔叶杂草物种。为控制草甘膦抗性阔叶杂草如小飞蓬或内在难以用草甘膦控制的杂草(如鸭跖草属物种(Commelina spp.)、番薯属物种(Ipomoea spp.)等)，可以相继、罐混或作为预混料与草甘膦一起应用280-2240g ae/ha(优选560-1120g ae/ha)2，4-滴以提供有效控制。对于绿草定，一般用量范围是70-1120g ae/ha，更一般是140-420g ae/ha。对于氟草烟，一般用量范围是35-560g ae/ha，更一般是70-280ae/ha。
b)目前，应用于GTC的草甘膦用量范围一般为每个应用时间560至2240g ae/ha。草甘膦对于禾本科物种的效力远高于阔叶杂草物种。AAD-12(v1)+GT叠加性状可允许禾本科有效的草甘膦用量(105-840g ae/ha，更优选210-420g ae/ha)。接着可以相继、罐混或作为预混料与禾本科有效用量的草甘膦一起应用2，4-滴(280-2240g ae/ha，更优选560-1120g ae/ha)以提供必要的阔叶杂草控制。上文提到的剂量水平上的绿草定和氟草烟是处理方案中可接受的成分。草甘膦的低用量还可为阔叶杂草控制提供一些益处；然而初期控制可来自2，4-滴、绿草定或氟草烟。
杂草控制领域的技术人员会认识到，AAD-12(v1)转化进作物使得可以单独或组合(相继或独立地)使用一种或多种商品芳氧基生长素除草剂。通过CPR《作物保护参考》书中汇编的除草剂说明或类似的汇编、在线(如cdms.net/manuf/manuf.asp)汇编的说明或任意商品或学术作物保护指南(如Agriliance的《作物保护指南》(2005))可以确定这些化学物质中其他代表性除草剂的具体用量。每种由于AAD-12(v1)而可以在HTC中使用(无论单独、罐混或相继使用)的可选除草剂都考虑在本发明范围内。
实施例19-在任意作物中与草铵膦耐性性状叠加的AAD-12(v1)
草铵膦耐性(PAT或bar)目前作为输入性状(如昆虫抗性蛋白)的选择标记或具体作为HTC性状存在于北美种植的大量作物中。作物包括但不仅限于草铵膦耐性芸苔、玉米和棉花。其他的草铵膦耐性作物(如稻、甜菜、大豆和草坪草)已在开发中，但目前尚未准予上市。与草甘膦相似，草铵膦是相对非选择性广谱禾本科和阔叶除草剂。草铵膦的作用方式与草甘膦不同。其作用较快，在除草剂应用24-48小时后导致受到处理的叶的脱水和“烧伤”。这对于表观快速杂草控制是有利的。然而，这也限制了草铵膦向靶植物分生组织区的转移，导致较弱的杂草控制，这被两种化合物在许多物种中的相对杂草控制性能评定所证明(Agriliance，2005)。
通过常规育种或共同作为新转化事件将AAD-12(v1)与草铵膦耐性性状叠加可以改进杂草控制的效力、灵活性和管理杂草演替及除草剂抗性发展的能力。可以设想改善的杂草控制选择的一些方案，其中在任意单子叶或双子叶作物物种中叠加了AAD-12(v1)和草铵膦耐性性状：
a)可以以标准出苗后用量(200至1700g ae/ha，优选350至500g ae/ha)应用草铵膦，用于控制多种禾本科和阔叶杂草物种。目前尚未确认草铵膦抗性杂草；然而固有对草铵膦更有耐性的杂草数目多于草甘膦。
i)内在耐性阔叶杂草物种(如田蓟(Cirsium arvensis)、加拿大麻(Apocynum cannabinum)和小飞蓬)的控制可通过罐混280-2240g ae/ha(更优选560-2240g ae/ha)的2，4-滴以有效控制这些更难以控制的多年生物种并改进对一年生阔叶杂草物种的控制强度。在杂草控制方案中，认为绿草定和氟草烟是可接受的成分。对于绿草定，一般用量范围是70-1120gae/ha，更一般是140-420g ae/ha。对于氟草烟，一般用量范围是35-560gae/ha，更一般是70-280ae/ha。
b)多重组合(如草铵膦(200-500g ae/ha)+/-2，4-滴(280-1120g ae/ha)+/-绿草定或氟草烟(以上文所列用量))可提供更强的重叠杂草控制谱。另外，重叠谱提供管理或延缓除草剂抗性杂草的另一种机制。
杂草控制领域的技术人员会认识到，AAD-12(v1)转化进作物使得可以单独或组合(相继或独立地)使用一种或多种商品芳氧基乙酸生长素除草剂。通过CPR《作物保护参考》书中汇编的除草剂说明或类似的汇编、在线(如cdms.net/manuf/manuf.asp)汇编的说明或任意商品或学术作物保护指南(如Agriliance的《作物保护指南》(2005))可以确定这些化学物质中其他代表性除草剂的具体用量。每种由于AAD-12(v1)而可以在HTC中使用(无论单独、罐混或相继使用)的可选除草剂都考虑在本发明的范围内。
实施例20-在任意作物中与AHAS性状叠加的AAD-12(v1)
咪唑啉酮除草剂耐性(AHAS等)目前存在于北美种植的大量作物中，包括但不仅限于玉米、稻和小麦。其他的咪唑啉酮耐性作物(如棉花和甜菜)已在开发中，但目前尚未上市。目前将许多咪唑啉酮类除草剂(如甲氧咪草烟、咪草烟、灭草喹和甲咪唑烟酸)选择性用于多种常规作物中。通过咪唑啉酮耐性性状如AHAS等使得可以使用咪草烟、甲氧咪草烟和非选择性的咪唑烟酸。这类化学品还具有显著的土壤残留活性，因此与基于草甘膦或草铵膦的系统不同，它能提供超过应用时间的延长的杂草控制。然而，咪唑啉酮类除草剂控制的杂草谱不如草甘膦广泛(Agriliance，2005)。另外，针对咪唑啉酮类除草剂具有的作用模式(抑制乙酰乳酸合酶，ALS)，许多杂草已经发展出抗性(Heap，2005)。通过常规育种或共同作为新转化事件将AAD-12(v1)与咪唑啉酮耐性性状叠加可以改进杂草控制的效力、灵活性和管理杂草演替及除草剂抗性发展的能力。如前述实施例中所提到的，通过用AAD-12(v1)转化作物，单子叶作物将具有较高的苯氧基或吡啶氧基生长素安全余地，并可以在双子叶作物中选择性应用这些生长素。可以设想改善的杂草控制选择的一些方案，其中在任意单子叶或双子叶作物物种中叠加了AAD-12(v1)和咪唑啉酮耐性性状：
a)可以以标准出苗后用量(35至280g ae/ha，优选70-140g ae/ha)应用咪唑啉酮，用于控制许多禾本科和阔叶杂草物种。
i)可以通过罐混280-2240g ae/ha(更优选560-2240g ae/ha)的2，4-滴来控制ALS抑制剂抗性阔叶杂草(如Amaranihus rudis、三裂叶豚草(Ambrosiatrifida)、藜(Chenopodium album)(等等，Heap，2005))。对于绿草定，一般用量范围是70-1120g ae/ha，更一般是140-420g ae/ha。对于氟草烟，一般用量范围是35-560g ae/ha，更一般是70-280ae/ha。
ii)也可以通过罐混280-2240g ae/ha(更优选560-2240g ae/ha)的2，4-滴来控制固有对咪唑啉酮类除草剂更具耐性的阔叶物种(如番薯属物种)。参阅上文绿草定或氟草烟的用量。
b)多重组合(如咪草烟(35至280g ae/ha，优选70-140g ae/ha)+/-2，4-滴(280-1120g ae/ha)+/-绿草定或氟草烟(以上文所列用量))可提供更强的重叠杂草控制谱。另外，重叠谱提供管理或延缓除草剂抗性杂草的另一种机制。
杂草控制领域的技术人员会认识到，通过AAD-12(v1)转化并通过常规育种或遗传工程与任意咪唑啉酮耐性性状叠加使得可以单独或以多种组合使用多种商品咪唑啉酮类除草剂、苯氧乙酸或吡啶氧乙酸生长素除草剂的任意一种。通过CPR《作物保护参考》书中汇编的除草剂说明或类似的汇编、在线(如cdms.net/manuf/manuf.asp)汇编的说明或任意商品或学术作物保护指南(如Agriliance的《作物保护指南》(2005))可以确定这些化学品中其他代表性除草剂的具体用量。每种由于AAD-12(v1)而可以在HTC中使用(无论单独、罐混或相继使用)的可选除草剂都考虑在本发明的范围内。
实施例21-稻中的AAD-12(v1)
21.1-培养基说明。
用1M KOH将使用的培养基调整至pH 5.8，并用2.5g/L植物凝胶(希格玛，Sigma)固化。在含有40ml半固体培养基的100×20mm皮氏培养皿中培养胚性愈伤组织。在Magenta盒中的50ml培养基中培养稻小植株。在含有35ml液体培养基的125ml锥形瓶中维持细胞悬液并以125rpm旋转。在25-26℃在黑暗中诱导和维持胚胎发生培养物，在16小时光周期下进行植物再生和全植物培养(Zhang等1996)。
如前述在NB基础培养基上诱导和维持胚性愈伤组织(Li等1993)，但调整为含有500mg/L谷氨酰胺。在SZ液体培养基(Zhang等1998)中起始和维持悬浮培养物，其中含有代替麦芽糖的30g/L蔗糖。渗透培养基(NBO)由加入各0.256M的甘露醇和山梨醇的NB培养基组成。在补充了50mg/L潮霉素B的NB培养基上选择潮霉素B抗性愈伤组织3-4周。在由NB培养基组成的培养基(PRH50)上预再生一周，其中NB培养基无2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-滴)，但加入了2mg/L 6-苄氨基嘌呤(BAP)、1mg/Lα-萘乙酸(NAA)、5mg/L脱落酸(ABA)和50mg/L潮霉素B。接着通过在再生培养基(RNH50)上培养至芽再生来再生小植株，所述再生培养基含有无2，4-滴并补充了3mg/L BAP、0.5mg/L NAA和50mg/L潮霉素B的NB培养基。将芽转移到含有半浓度Murashige和Skoog基础盐和Gamborg B5维生素、补充了1％蔗糖和50mg/L潮霉素B(1/2MSH50)的生根培养基中。
21.2-组织培养发育。
如Zhang等1996所述将粳稻栽培种台北309(Oryza sativa L.japonicacv.Taipei 309)的成熟干燥种子灭菌。通过在黑暗中在NB培养基上培养无菌成熟稻种诱导胚胎发生组织。将直径约1mm的初级愈伤组织从盾片中移出，并用于在SZ液体培养基中起始细胞悬液。接着如Zhang 1995所述维持悬液。前述继代培养后3-5天将悬液来源的胚胎发生组织从液体培养基中移出，并置于NBO渗透培养基上以在皮氏培养皿中形成约2.5cm的圆圈，在轰击前培养4小时。轰击后16到20小时，将组织从NBO培养基转移到NBH50潮霉素B选择培养基上(保证轰击表面向上)，并在黑暗中孵育14-17天。然后从原始轰击外植体分离新形成的愈伤组织，并置于旁边相同的培养基上。再过8-12天后，目测鉴定相对致密、不透明的愈伤组织，并转移到PRH50预再生培养基在黑暗中经过7天。接着将变得更加致密和不透光的生长的愈伤组织在RNH50再生培养基上继代培养，在16小时光周期下经过14-21天的时间。将再生的芽转移到含有1/2MSH50培养基的Magenta盒中。认为从单个外植体再生的多个植物是同胞，并作为一个独立的植物株系进行处理。如果植物产生白色粗根并在1/2MSH50培养基上旺盛生长，则将其评定为hph基因阳性。一旦小植株达到Magenta盒的顶部时，将其转移到100％湿度下6cm盆里的土壤中一周，接着移至14小时30℃的光照期和21℃黑暗的培养箱中2-3周，之后移植到温室中的13cm盆。收集种子，于储藏前在37℃干燥一周。
21.3-微粒轰击。
用Biolistic PDS-1000/HeTM系统(Bio-Rad，Laboratories，Inc.)实施所有轰击。将3mg、直径1.0μm的金颗粒用100％乙醇洗涤一次，用无菌蒸馏水洗涤两次并重悬于经硅化处理的Eppendorf管中的50μl水中。在金悬液中加入5μg质粒DNA(1∶6摩尔比的pDOW3303(含有Hpt的载体)和pDAB4101(AAD-12(v1)+AHAS))、20μl亚精胺(0.1M)和50μl氯化钙(2.5M)。在室温孵育混合物10分钟，以10000rpm沉淀10秒，重悬于60μl冷的100％乙醇并给每个巨载体分配8-9μl。如Zhang等(1996)所述，以1100psi和27英寸Hg真空轰击组织样品。
21.4-AAD-12(v1)转化的T 0 稻中的出苗后除草剂耐性
使用履带式喷雾器(刻度为187L/ha)用含有1％Sunit II(体积/体积)和1.25％UAN(体积/体积)的致死剂量为0.16％(体积/体积)的Pursuit溶液(为证实存在AHAS基因)喷洒3-5叶期的稻小植株。在处理后36天(DAT)，进行敏感或抗性的评估。送到温室中33个事件中的10个对Pursuit强耐性；其它的遭受多种水平的除草剂损伤。植物取样(按照下文21.7节)并进行如前面实施例8所述的分子表征，确定这10个事件中的7个包含AAD-12(v1)PTU和全部AHAS编码区。
21.5-AAD-12(v1)在T 1 稻中的遗传力
包含AAD-12(v1)PTU和AHAS编码区的AAD-12(v1)株系里的5个T1株系进行100个植物子代测试。按照上文方法种植种子并如前所述使用履带式喷雾机喷洒140g ae/ha咪草烟。14DAT之后，对抗性和敏感植物计数。5个测试株系中的2个作为单个基因座分离，用卡方分析确定显性孟德尔性状(3R:1S)。AAD-12与AHAS选择标记物共分离，这由下文2，4-滴耐性测试确定。
21.6-T 1 稻中高2，4-滴耐性的验证。
将以下T1A4D-12(v1)单个分离基因座株系，即pDAB4101(20)003和pDAB4101(27)002种植到含有Metro Mix培养基的3英寸盆中。在2-3叶期用140g ae/ha咪草烟喷洒。消除无效事件，在V3-V4期用设置为187L/ha的履带式喷雾器向个体喷洒1120、2240或4480g ae/ha 2，4-滴二甲胺盐(分别2、4和8倍于一般商业用量)。在7和14DAT对植物分级，并与作为阴性对照植物的未转化商业稻品种‘Lamont’作比较。
损伤数据(表27)显示AAD-12(v1)转化株系对高剂量2，4-滴二甲胺盐的耐性比未转化对照强。pDAB4101(20)003株系对高水平2，4-滴的耐性比pDAB4101(27)002株系强。数据还表明2，4-滴耐性对至少两代稳定。
Figure A20068005015201331
21.7-组织收获、DNA分离和定量。
将新鲜组织置于管中并在4℃冻干两天。组织完全干燥后，将钨珠(Valenite)放进管中并使用Kelco玻珠研磨机将样品干磨1分钟。其后遵循标准DNeasy DNA分离方案(Qiagen，DNeasy 69109)。将提取的DNA的等分试样用Pico Green(Molecular Probes P7589)染色并与已知标准品一起在荧光计(BioTek)中扫描，以得到以ng/μl计的浓度。
21.8-AAD-12(v1)表达。
样本准备和分析条件如前述。使用ELISA印迹对所有33个T0转基因稻株系和1个非转基因对照分析AAD-12表达。在20个株系克隆中检测到AAD-12，但是在株系台北309对照植物中没有检测到。具有一些对咪草烟耐性克隆的20个株系中的12个表达AAD-12蛋白，AAD-12PCR PTU阳性和AHAS编码区阳性。表达水平的范围是总可溶性蛋白质的2.3至1092.4ppm。
21.9-pDAB4101稻植物对2，4-滴和绿草定除草剂的大田耐性。
在密西西比州的Wayside，用AAD-12(v1)事件pDAB4101[20]和一个野生型稻(Clearfield 131)(非转基因咪唑啉酮抗性品种)进行大田水平耐性试验。实验设计是单个重复的随机完全区组设计。除草剂处理是以2240gae/ha使用的2倍剂量的2，4-滴(二甲胺盐)和以560g ae/ha使用的绿草定加上未处理的对照。在每个除草剂处理中，使用小区播种机以8英寸行间距种植两行T1代pDAB4101[20]和两行Clearfield稻。pDAB4101[20]稻包含AHAS基因作为AAD-12(v1)基因的选择标记物。在1叶期使用咪草烟作为选择剂以去除区中任一AAD-12(v1)无效植物。当稻达到2叶期，使用以130-200kpa压力递送187L/ha载体体积的压缩空气背包式喷雾器进行除草剂处理。在应用后7、14和21天进行目测损伤评估。
表28显示AAD-12(v1)事件对2，4-滴和绿草定的应答。以2240g ae/ha使用(被认为4倍于商业用量)的2，4-滴严重损伤非转化稻株系(Clearfield)(30％在7DAT和35％在15DAT)。AAD-12(v1)事件在7或15DAT没有观察到损伤，证明对2，4-滴的优良耐性。2倍剂量的绿草定(560g ae/ha)显著损伤非转化稻(15％在7DAT和25％在15DAT)。AAD-12(v1)事件在7或15DAT没有观察到损伤，证明对2倍剂量绿草定的优良耐性。
这些结果表明AAD-12(v1)转化稻表现出对2，4-滴和绿草定(在引起Clearfield稻严重目测损伤时的剂量)高水平的抗性。还证明在多种物种中AAD-12叠加多种除草剂耐性基因的能力以提供对广谱有效化学品的抗性。
Figure A20068005015201351
实施例22-芸苔中的AAD-12(v1)
22.1-芸苔转化。
用农杆菌介导的转化和质粒pDAB3759，将赋予对2，4-滴抗性的AAD-12(v1)基因转化欧洲油菜Nexera＊710变种(Brassica napus var.Nexera＊710)。构建体含有CsVMV启动子驱动的AAD-12(v1)基因和AtUbi10启动子驱动的PAT基因，以及AtUbi10启动子驱动的EPSPS草甘膦抗性性状(参阅2.4节)。
用10％商品漂白剂对种子进行10分钟表面灭菌并用无菌蒸馏水洗涤3次。然后将种子置于半浓度MS基础培养基(Murashige和Skoog，1962)上并在设置为25℃和16小时光照/8小时黑暗的光周期的生长方案下维持。
从5-7天龄的幼苗上切下下胚轴段(3-5mm)并置于愈伤组织诱导培养基K1D1(含1mg/L激动素和1mg/L 2，4-滴的MS培养基)上3天作为预处理。接着将下胚轴段转移进皮氏平板，用含有pDAB3759的农杆菌Z707S或LBA4404菌株处理。农杆菌在28℃黑暗中150rpm的振荡器上过夜培养，并接着重悬于培养基中。
用农杆菌处理下胚轴段30分钟后，将其放回愈伤组织诱导培养基3天。共培养之后将片段置于K1D1TC(含有250mg/L羧苄青霉素和300mg/L特美汀的愈伤组织诱导培养基)恢复1周或2周。或者，直接将下胚轴段置于选择培养基K1D1H1(带有1mg/L好必思(Herbiace)的上文培养基)。羧苄青霉素和特美汀是用于杀死农杆菌的抗生素。选择剂好必思允许转化细胞生长。
接着将形成愈伤组织的下胚轴段置于B3Z1H1(MS培养基、3mg/L苄氨基嘌呤、1mg/L玉米醇溶蛋白、0.5mg/L MES[2-(N-吗啉代)乙磺酸]，5mg/L硝酸银、1mg/L好必思、羧苄青霉素和特美汀)芽再生培养基。2-3周后芽开始再生。将下胚轴片段与芽一起转移到B3Z1H3培养基(MS培养基、3mg/L苄氨基嘌呤、1mg/L玉米醇溶蛋白、0.5mg/L MES[2-(N-吗啉代)乙磺酸]、5mg/L硝酸银、3mg/L好必思、羧苄青霉素和特美汀)再过三周。
从下胚轴片段上剪下芽并转移到芽伸长培养基MESH5或MESH10(MS、0.5mg/L MES、5或10mg/L好必思、羧苄青霉素、特美汀)上2-4周。将伸长的芽在MSI.1(含0.1mg/L吲哚丁酸的MS)上进行根诱导培养。待植物具有良好建立的根系时将其移植到土壤中。转移到温室之前，植物在Conviron中受控环境条件下适应1-2周。
22.2-分子分析：芸苔材料和方法
22.2.1-组织收获的DNA的分离和定量。将新鲜组织置于管中并在4℃冻干两天。组织完全干燥后，将钨珠(Valenite)放进管中并使用Kelco玻珠研磨机将样品干磨1分钟。其后遵循标准DNeasy DNA分离方案(Qiagen，DNeasy 69109)。将提取的DNA的等分试样用Pico Green(Molecular Probes P7589)染色并与已知标准品一起在荧光计(BioTek)中读数，以得到以ng/μl计的浓度。
22.2.2-聚合酶链式反应。用总计100ng的总DNA作为模板。使用20mM每种引物和Takara Ex Taq PCR聚合酶试剂盒(MirusTAKRR001A)。用于AAD-12(v1)编码区PCR的引物为(SEQ ID NO：10)(正向)和(SEQ ID NO：11)(反向)。在9700 Geneamp热循环仪(AppliedBiosystems)中进行PCR反应：将样品置于94℃3分钟，94℃30秒、65℃30秒、72℃2分钟的35个循环和其后72℃10分钟。通过在1％琼脂糖凝胶上电泳、溴化乙啶染色来分析PCR产物。来自35株含AAD-12(v1)事件植物的35个样品测试为阳性。三个阴性对照样品测试为阴性。
22.2.3-ELISA。
使用先前章节所述已建立的ELISA在5个不同芸苔转化植物事件中检测AAD-12蛋白。表达水平范围从总可溶蛋白(TSP)的14到超过700ppm。平行测试的三个不同的未转化植物样品未检测到信号，表明该测定中使用的抗体与芸苔细胞基质具有最小的交叉反应性。通过Western分析这些样品也证实为阳性。结果概括于表29。
22.4-AAD-12(v1)转化T 0 芸苔的出苗后除草剂耐性。
将来自于构建体pDAB3759转化事件中的45个T0事件送到温室并允许其在温室中适应一段时间。植物生长直到出现2-4个新的、有正常外观的叶子(即植物从组织培养转换到温室生长条件)。然后用致死剂量的2，4-滴胺4商业制剂(560g ae/ha剂量)处理植物。使用履带式喷雾器以187L/ha喷雾体积、50-cm喷雾高度应用除草剂。将引起未转化对照＞95％损伤时的剂量定义为致死剂量。
24个事件对应用2，4-D二甲胺盐除草剂耐性。一些事件确实遭受小损伤但是在14DAT恢复。在可控制的袋栽条件下，事件通过自花授粉进行到T1(和T2代)。
22.5-芸苔中的AAD-12(v1)遗传性。
还对11个AAD-12(v1)T1株系进行100个植物子代测试。播种种子并移植到充满Metro Mix培养基的3英寸盆中。接着如前述用560g ae/ha 2，4-滴二甲胺盐喷洒所有的植物。14DAT之后，对抗性和敏感植物进行计数。测试的11个株系中的7个作为单基因座分离，用卡方分析确定显性孟德尔性状(3R:1S)。AAD-12作为强芳氧基链烷酸酯生长素抗性基因在多种物种中遗传并能与一种或多种其他除草剂抗性基因叠加。
22.6-T 1 芸苔中高2，4-滴耐性的验证。
对于T1 AAD-12(v1)，将5-6mg的种子层积、播种并且加入一薄层Sunshine Mix#5培养基作为土壤的顶层。在种植后7和13天，用560gae/ha 2，4-滴选择冒出的植物。
存活的植物移植到含有Metro Mix培养基的3英寸盆中。用560g ae/ha2，4-滴选择的来自于T1子代的存活植物还移植到充满Metro Mix土壤的3英寸盆中。在2-4叶期，用280、560、1120或2240g ae/ha 2，4-滴二甲胺盐喷洒植物。在3和14DAT对植物分级并与未转化对照植物进行比较。表30可见14 DAT T1事件抽样的损伤数据。数据表明多种事件对2240gae/ha 2，4-滴强抗性，而其它事件表明对1120g ae/ha 2，4-滴的次强耐性。存活的植物移植到包含Metro Mix培养基的51/4”盆中并置于与以前相同的生长条件下，且自花授粉只产生纯合种子。
表30.T1 AAD-12(v1)和未转化对照对出苗后应用不同剂量2，4-滴二甲胺盐的应答。
22.7-pDAB3759芸苔植物对2，4-滴、2，4-滴丙酸、绿草定和氟草烟除 草剂的大田耐性。
在印地安纳州的Fowler，对两个AAD-12(v1)事件3759(20)018.001和3759(18)030.001以及一个野生型芸苔(Nex710)进行大田水平耐性试验。实验设计是3次重复的随机完全区组设计。除草剂处理包括以280、560、1120、2240和4480g ae/ha使用的2，4-滴(二甲胺盐)、以840g ae/ha使用的绿草定、以280g ae/ha使用的氟草烟和未处理对照。在每个除草剂处理中，在8英寸行间距上以四行播种机种植单20ft行/事件的事件3759(18)030.0011、3759(18)018.001和野生型株系(Nex710)。当芸苔达到4-6叶期，使用以130-200kpa压力递送187L/ha载体体积的压缩空气背包式喷雾器进行除草剂处理。在应用后7、14和21天进行目测损伤评估。
表31显示芸苔对2，4-滴、绿草定和氟草烟的应答。以2240g ae/ha使用(被认为4倍剂量)的2，4-滴严重损伤野生型芸苔(Nex710)(72％在14DAT)。AAD-12(v1)事件在14DAT分别在1、2和4倍剂量的2，4-滴应用中观察到平均2、3和2％的损伤，均证明其对2，4-滴的优良耐性。2倍剂量的绿草定(840g ae/ha)严重损伤野生型芸苔(25％在14DAT)。AAD-12(v1)事件证明在两个事件中在14DAT对2倍剂量绿草定(平均6％损伤)的耐性。在14DAT以280g ae/ha使用的氟草烟引起非转化株系严重的损伤(37％)。AAD-12(v1)事件证明在5DAT其对氟草烟(平均8％损伤)增加的耐性。
这些结果表明AAD-12(v1)转化事件表现出对2，4-滴、绿草定和氟草烟(在致死或引起非转化芸苔严重偏上性畸形时的用量)高水平的抗性。显示AAD-12具有2，4-滴＞绿草定＞氟草烟的相对功效。
每一列带有不同字母的平均值，由LSD定义为显著性差异(p＝0.05)。
实施例23-在任意作物中AAD-12(v1)与昆虫抗性(IR)或其他输入性状叠 加
作物中由转基因性状提供的昆虫抗性在北美及全球的玉米和棉花产品中是普遍的。多家种子公司已开发具有联合IR和HT性状的商业产品。这些包括Bt IR性状(如在网址lifesci.sussex.ac.uk列出的Bt毒素，2006)和任一或所有上文提到的HTC性状。这种性状提供带来的价值是通过单次性状提供的遗传方法控制多种害虫问题的能力。如果杂草控制和昆虫控制彼此独立完成，这种性状提供的便利性将受到限制。单独或与一个或多个其他HTC性状叠加的AAD-12(v1)，通过常规育种或共同作为新的转化事件，能与一个或多个其他输入性状(如昆虫抗性、真菌抗性或胁迫耐受性等)(isb.vt.edu/cfdocs/fieldtests1.cfm，2005)叠加。除了由AAD-12提供的改良的杂草控制和相关的除草剂耐性之外，益处包括上文实施例15-20所述的便利性和灵活性，以及控制昆虫害虫和/或其他农事胁迫的能力。因此，本发明可用于提供完整的改良作物品质的农事工具包，其具有灵活和低本高效控制许多农事问题的能力。
IR和HT的联合性状应用于大部分的农事和园艺/观赏性作物以及林业。AAD-12和它相称的除草剂耐性的联合以及任意数量的Bt或非Bt IR基因给予的昆虫抗性可应用到实施例13列出的作物种类(但不局限于此)。杂草控制领域的技术人员将认识到AAD-12(v1)转化和通过常规育种或基因工程与相应的HT性状或IR性状叠加，使之能够利用单独或多种组合的任何在实施例18-20中描述的多种商业除草剂、苯氧乙酸或吡啶氧乙酸类植物生长素除草剂。这些化学品的其他除草剂代表的具体用量由CPR《作物保护参考》书或相似的编辑物汇编的除草剂说明、在线汇编的说明(如cdms.net/manuf/manuf.asp)或任何商业或学术作物保护指南(如Agriliance的《作物保护指南》(2005))确定。通过AAD-12(v1)，能在HTC中使用(不管单独使用、罐混还是相继使用)的每种可选的除草剂，被认为在本发明范围内。
实施例24-AAD-12(v1)作为体外双子叶植物的选择标记物
使用合适的递送方法将目的基因插入植物细胞的过程起始植物细胞、组织、器官和植物或细胞器(如质粒)的遗传改造。然而，当基因递送进入植物细胞中，只有极少百分比的细胞将异源基因整合到其基因组中。为了选择这些已整合了目的基因的少数细胞，研究人员将可选择或筛选的“标记基因”与载体中的目的基因(GOI)连接。含有这些标记的细胞可从递入DNA质粒载体的全体细胞群/组织中鉴定出来。通过选择那些表达标记基因的细胞，研究人员能鉴定可能将GOI整合进其基因组的少数细胞。
有多种选择标记用于对得到转基因的细胞、愈伤组织、胚胎、芽和苗进行选择。农业上优选的选择标记是除草剂标记，在大田位置进行分选事件的过程中，其允许在大田中易于喷洒化合物来选择正确的转基因子代。已表明AAD-12(v1)可有效作为选择标记物(以2，4-滴作为选择试剂)用于温室和培养箱(实施例7)中被该基因转化的整株植物。使用2，4-滴联合AAD-12(v1)基因进行大田选择也是有可能的(实施例11、22)，但是事实上由于2，4-滴作为植物生长调控因子，在植物组织培养系统中被几乎广泛使用，因此在体外使用2，4-滴用于细胞水平的选择是复杂的。AAD-12(v1)对这种重要激素的降解能影响利用该基因作为体外选择标记物的能力。发展2，4-滴作为标记物基因的成功依赖于确定正确的替代的植物生长调控因子，其能模拟2，4-滴在相应培养系统中的作用，并同时具有稳定的能力且不被在转基因细胞中表达的AAD-12酶降解。R-2，4-滴丙酸是与2，4-滴接近的类似物，其不是AAD-12(v1)的底物，并且在烟草细胞培养物中用作非代谢植物生长素的替代物，允许2，4-滴作为选择试剂大量使用。此事实用于示例AAD-12(v1)能作为体外选择标记物使用。
24.1-细胞培养-备选的植物生长素。
AAD-12(v1)降解2，4-滴，却不降解R-2，4-二氯苯氧基丙酸(R-2，4-滴丙酸)，其同时具有植物生长素生长调控因子必需的结构。可用于细胞培养的其他非代谢植物生长素模拟物包括NAA(萘乙酸)、IAA(吲哚乙酸)、麦草畏、毒莠定和R-2-甲-4-氯丙酸。研究是否可能替代R-2，4-滴丙酸并成功维持两种不同的烟草细胞培养物PHL(Petite Havanna)和BY2悬液。相反，对于棉花外植体，R-2，4-滴丙酸、麦草畏和毒莠定作为备选的植物生长素进行测试，并且相比于标准生长调控因子2，4-滴，评测胚性愈伤组织诱导应答。在这些实验中使用Petite Havana烟草(PHL)和Coker棉花子叶。
24.1.1-烟草细胞悬液-2，4-滴作为选择试剂。
用R-2，4-滴丙酸驯化的PHL细胞和R-2，4-滴丙酸驯化的BY2细胞进行剂量应答研究，其中R-2，4-滴丙酸直接代替培养基中的2，4-滴。尽管焦点在PHL，也对BY2进行了剂量应答应答，以备将来研究之用，并辅助预测PHL的剂量应答。对于2，4-滴丙酸驯化的PHL剂量应答，2，4-滴使用水平(在有R-2，4-滴丙酸的LSBY2C培养基上)是0(对照)、1、2、3、5、8、10、12、15、18、20、40、60、80、100、110、120mg/L 2，4-滴。每个浓度有4个重复。对于2，4-滴丙酸驯化的BY2剂量应答，2，4-滴使用水平(在LSBY2C培养基上)是0(对照)、1、2、3、5、8、10、20、30、40mg/L 2，4-滴。
进行的剂量应答表明2，4-滴测试的10mg/L浓度之上的所有浓度是致死的。然而，在至高达10mg/L 2，4-滴的所有浓度中有生长，其中观察到PHL悬液轻微的生长。来自1-8mg/L 2，4-滴浓度的悬液集落的生长可比得上对照处理中的生长。除了发现10mg/L浓度是致死的和亚致死浓度是8mg/L浓度，BY2悬液细胞进行的观察是相似的。
24.1.2-用AAD-12(v1)转化烟草细胞和2，4-滴选择。
对于烟草转化实验，总共有11个处理：对照组涂平板于LS-BY2C+2，4-滴丙酸培养基和10组LSBY2C+2，4-滴丙酸+2，4-滴(在不同的浓度水平(1、2、3、5、8、10、12、15、18、20mg/L))。每次处理有4个重复。使用的质粒DNA载体pDAB724，用于转化的载体是根癌农杆菌EHA101S菌株。4ml OD660为0.6的PHL悬液与100μl OD660为1.0的农杆菌(EHA101或LBA4404菌株)悬液在无菌皮氏板中混合并彻底混合，在黑培养箱中非振荡条件下25C共培养3天。共培养期之后，将1.5ml农杆菌-烟草悬液混合物涂布到上述11组平板中。用13种处理重复实验：LS-BY2C+2，4-滴丙酸培养基(无2，4-滴)的对照和LS-BY2C+2，4-滴丙酸+2，4-滴(1、2、3、5、8、10、12、15、18、20mg/L)；LSBY2C+1mg/L 2，4-滴+B10(Bialophos)；LSBY2C+102，4-滴+B10+R-2，4-滴丙酸。此外，每次处理有4个重复，以及阳性和阴性对照。所有的培养基包含500mg/L羧苄青霉素(C)以控制选择培养基中含有的农杆菌生长。
这些实验中使用的质粒是pDAB724并且它还有PAT选择标记。因此，遵循上文所述的标准方法，存在10mg/L bialophos的条件下，使用R-2，4-滴丙酸驯化的PHL起始对照转化实验。4个重复平行进行处理来看在这些悬液中bialophos选择是否正常。
在所有10mg/L之上的2，4-滴测试选择浓度中，观察到很少的生长；然而在2、5和8mg/L 2，4-滴浓度中发现许多快速生长的集落，并将代表性样品转移到新鲜的选择(10mg/L选择浓度)平板中使愈伤组织膨大。同样，从12、15、18和20mg/L 2，4-滴中挑选一些推断的菌落，但是当与10mg/L相比，在这些选择平板上仅有很少的菌落。用bialophos选择进行的对照处理显示正常集落发展。发现10mg/L 2，4-滴是亚致死并且超过这个浓度，2，4-滴表现出对非转化细胞致死。将所有鉴定的集落转移至含10mg/L选择剂的新鲜培养基中，并用实施例10所述的PCR探测转基因的存在。选择的和膨大的集落具有用PCR确定的转基因，并且Western分析(如实施例10所述)确定基因的表达。将鉴定为活跃生长的一些集落转移到含10mg/L 2，4-滴的新鲜选择培养基中膨大愈伤组织。
然后将膨大的愈伤组织转移到更高水平的2，4-滴中以测试体外的耐性水平。使用的2，4-滴水平是20、40、60、80、100和120mg/L 2，4-滴。然而超过20mg/L 2，4-滴的浓度愈伤组织不生长，表明可能存在高于20mg/L的阈值浓度。
24.2.1-棉花外植体-植物生长素备选
起始剂量应答研究来测试作为2，4-滴(作为生长调控因子)在棉花中用途的替代的多个植物生长素代替物。测试的替代植物生长素是2，4-滴丙酸、麦草畏和毒莠定。这些化合物分别在0.2、2.0和20.0μM浓度进行测试。0.02μM浓度的2，4-滴用于对照处理。使用的培养基是用于棉花愈伤组织诱导的基础培养基(实施例12)。培养初期之后，植物生长素从培养基中去除来促使组织转向再生过程。
R-2，4-滴丙酸在子叶节段的愈伤组织诱导中无效，并且在最低测试浓度(0.02μM)表现出对棉花细胞的毒性。麦草畏在所有测试浓度(0.02-20μM)有效诱导愈伤组织生长并且在这个浓度范围内没有明显的毒性作用。用0.2μM至20μM的毒莠定处理外植体时，增至最大浓度的毒莠定诱导愈伤组织。在2μM毒莠定浓度的愈伤组织质量和标准2，4-滴处理一致。在最高浓度(20μM)2，4-滴也抑制棉花愈伤组织产生和生长。
棉花已显示有效应答培养物中(2，4-滴)备选植物生长素的最初能力。在足够高的浓度，2，4-滴对棉花子叶外植体有毒性。R-2，4-滴丙酸比2，4-滴或其他植物生长素对棉花有令人惊奇地更显著的毒性。2，4-滴可作为选择剂与作为选择标记物基因的AAD-12(v1)联合使用。其他的非代谢植物生长素代替品(如麦草畏、毒莠定、R-2-甲-4-氯丙酸、NAA或IAA)允许AAD-12作为选择标记物和作为选择试剂的2，4-滴在双子叶植物中使用。
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序列表
<110>美国陶氏益农公司
<120>新除草剂抗性基因
<130>DAS-129XC1 PCT
<150>US 60/731,044
<151>2005-10-28
<160>15
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>879
<212>DNA
<213>食酸戴尔福特菌(Delftia acidovorans)
<400>1
atgcagacga cgctgcagat tacccccaca ggcgccaccc tgggcgccac cgtcaccggc   60
gtgcacctgg ccacgctgga cgacgccggc ttcgccgccc tgcacgccgc ctggctgcag  120
catgcgctgc tgatcttccc cggccagcac ctcagcaacg accagcagat cacttttgcc  180
aaacgcttcg gcgcgatcga gcgcatcggc ggcggcgaca tcgtggccat ctccaatgtc  240
aaggccgatg gcacggtgcg ccagcacagc cccgccgagt gggacgacat gatgaaggtc  300
atcgtcggca acatggcctg gcatgccgac agcacctaca tgccggtgat ggcgcagggc  360
gcggtgttct cggccgaagt ggtgcccgca gtgggcgggc gcacctgctt cgccgacatg  420
cgcgccgcct acgacgcgct ggacgaggcc acccgcgccc tggtgcacca gcgctcggcg  480
cggcattcgc tggtgtattc gcagagcaag ctgggccatg tgcagcaggc cggctcggcc  540
tacatcggct acggcatgga caccaccgcc acgcccctgc gcccgctggt caaggtgcat  600
cccgagaccg gccgcccctc gctgctgatc ggccgccatg cccatgccat cccgggcatg  660
gacgccgccg aatccgagcg cttcctggaa ggcctggtcg actgggcctg ccaggcgccg  720
cgggtgcatg cccaccaatg ggccgccggc gacgtggtgg tgtgggacaa ccgctgcctg  780
ctgcaccgcg ccgagccctg ggatttcaag ctgccgcggg tgatgtggca cagccgcctg  840
gccggccgcc ccgagaccga gggcgccgcc ctggtgtaa                         879
<210>2
<211>292
<212>PRT
<213>食酸戴尔福特菌
<400>2
Met Gln Thr Thr Leu Gln Ile Thr Pro Thr Gly Ala Thr Leu Gly Ala
1               5                   10                  15
Thr Val Thr Gly Val His Leu Ala Thr Leu Asp Asp Ala Gly Phe Ala
            20                  25                  30
Ala Leu His Ala Ala Trp Leu Gln His Ala Leu Leu Ile Phe Pro Gly
        35                  40                  45
Gln His Leu Ser Asn Asp Gln Gln Ile Thr Phe Ala Lys Arg Phe Gly
    50                  55                  60
Ala Ile Glu Arg Ile Gly Gly Gly Asp Ile Val Ala Ile Ser Asn Val
65                  70                  75                  80
Lys Ala Asp Gly Thr Val Arg Gln His Ser Pro Ala Glu Trp Asp Asp
                85                  90                  95
Met Met Lys Val Ile Val Gly Asn Met Ala Trp His Ala Asp Ser Thr
            100                 105                 110
Tyr Met Pro Val Met Ala Gln Gly Ala Val Phe Ser Ala Glu Val Val
        115                 120                 125
Pro Ala Val Gly Gly Arg Thr Cys Phe Ala Asp Met Arg Ala Ala Tyr
    130                 135                 140
Asp Ala Leu Asp Glu Ala Thr Arg Ala Leu Val His Gln Arg Ser Ala
l45                 150                 155                 160
Arg His Ser Leu Val Tyr Ser Gln Ser Lys Leu Gly His Val Gln Gln
                165                 170                 175
Ala Gly Ser Ala Tyr Ile Gly Tyr Gly Met Asp Thr Thr Ala Thr Pro
            180                 185                 190
Leu Arg Pro Leu Val Lys Val His Pro Glu Thr Gly Arg Pro Ser Leu
        195                 200                 205
Leu Ile Gly Arg His Ala His Ala Ile Pro Gly Met Asp Ala Ala Glu
    210                 215                 220
Ser Glu Arg Phe Leu Glu Gly Leu Val Asp Trp Ala Cys Gln Ala Pro
225                 230                 235                 240
Arg Val His Ala His Gln Trp Ala Ala Gly Asp Val Val Val Trp Asp
                245                 250                 255
Asn Arg Cys Leu Leu His Arg Ala Glu Pro Trp Asp Phe Lys Leu Pro
            260                 265                 270
Arg Val Met Trp His Ser Arg Leu Ala Gly Arg Pro Glu Thr Glu Gly
        275                 280                 285
Ala Ala Leu Val
    290
<210>3
<211>882
<212>DNA
<213>食酸戴尔福特菌
<400>3
atggctcaga ccactctcca aatcacaccc actggtgcca ccttgggtgc cacagtcact   60
ggtgttcacc ttgccacact tgacgatgct ggtttcgctg ccctccatgc agcctggctt  120
caacatgcac tcttgatctt ccctgggcaa cacctcagca atgaccaaca gattaccttt  180
gctaaacgct ttggagcaat tgagaggatt ggcggaggtg acattgttgc catatccaat  240
gtcaaggcag atggcacagt gcgccagcac tctcctgctg agtgggatga catgatgaag  300
gtcattgtgg gcaacatggc ctggcacgcc gactcaacct acatgccagt catggctcaa  360
ggagctgtgt tcagcgcaga agttgtccca gcagttgggg gcagaacctg ctttgctgac  420
atgagggcag cctacgatgc ccttgatgag gcaacccgtg ctcttgttca ccaaaggtct  480
gctcgtcact cccttgtgta ttctcagagc aagttgggac atgtccaaca ggccgggtca  540
gcctacatag gttatggcat ggacaccact gcaactcctc tcagaccatt ggtcaaggtg  600
catcctgaga ctggaaggcc cagcctcttg atcggccgcc atgcccatgc catccctggc  660
atggatgcag ctgaatcaga gcgcttcctt gaaggacttg ttgactgggc ctgccaggct  720
cccagagtcc atgctcacca atgggctgct ggagatgtgg ttgtgtggga caaccgctgt  780
ttgctccacc gtgctgagcc ctgggatttc aagttgccac gtgtgatgtg gcactccaga  840
ctcgctggac gcccagaaac tgagggtgct gccttggttt ga                     882
<210>4
<211>293
<212>PRT
<213>食酸戴尔福特菌
<400>4
Met Ala Gln Thr Thr Leu Gln Ile Thr Pro Thr Gly Ala Thr Leu Gly
1               5                   10                  15
Ala Thr Val Thr Gly Val His Leu Ala Thr Leu Asp Asp Ala Gly Phe
            20                  25                  30
Ala Ala Leu His Ala Ala Trp Leu Gln His Ala Leu Leu Ile Phe Pro
        35                  40                  45
Gly Gln His Leu Ser Asn Asp Gln Gln Ile Thr Phe Ala Lys Arg Phe
    50                  55                  60
Gly Ala Ile Glu Arg Ile Gly Gly Gly Asp Ile Val Ala Ile Ser Asn
65                  70                  75                  80
Val Lys Ala Asp Gly Thr Val Arg Gln His Ser Pro Ala Glu Trp Asp
                85                  90                  95
Asp Met Met Lys Val Ile Val Gly Asn Met Ala Trp His Ala Asp Ser
            l00                 105                 110
Thr Tyr Met Pro Val Met Ala Gln Gly Ala Val Phe Ser Ala Glu Val
        115                 120                 125
Val Pro Ala Val Gly Gly Arg Thr Cys Phe Ala Asp Met Arg Ala Ala
    130                 135                 140
Tyr Asp Ala Leu Asp Glu Ala Thr Arg Ala Leu Val His Gln Arg Ser
145                 150                 155                 160
Ala Arg His Ser Leu Val Tyr Ser Gln Ser Lys Leu Gly His Val Gln
                165                 170                 175
Gln Ala Gly Ser Ala Tyr Ile Gly Tyr Gly Met Asp Thr Thr Ala Thr
            180                 185                 190
Pro Leu Arg Pro Leu Val Lys Val His Pro Glu Thr Gly Arg Pro Ser
        195                 200                 205
Leu Leu Ile Gly Arg Hi s Ala His Ala Ile Pro Gly Met Asp Ala Ala
    210                 215                 220
Glu Ser Glu Arg Phe Leu Glu Gly Leu Val Asp Trp Ala Cys Gln Ala
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Pro Arg Val His Ala His Gln Trp Ala Ala Gly Asp Val Val Val Trp
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Asp Asn Arg Cys Leu Leu His Arg Ala Glu Pro Trp Asp Phe Lys Leu
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Pro Arg Val Met Trp His Ser Arg Leu Ala Gly Arg Pro Glu Thr Glu
        275                 280                 285
Gly Ala Ala Leu Val
    290
<210>5
<211>882
<212>DNA
<213>食酸戴尔福特菌
<400>5
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gcaaaacgct tcggtgcgat cgaacgtatc ggtggcggtg atattgtggc gatctccaac  240
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gtgatcgtag gcaacatggc atggcatgct gacagcacct acatgccggt tatggcgcag  360
ggtgcggttt tctctgctga agtggttccg gcagtgggcg gtcgcacctg cttcgcagac  420
atgcgtgcag cttacgacgc gttagacgaa gctacccgcg cactggtaca ccagcgctct  480
gcgcgtcact ctctggtgta ttcccagagc aaactgggcc acgttcagca agcgggctcc  540
gcatatatcg gctacggtat ggataccact gcgaccccgc tgcgtccgct ggtaaaagtg  600
catccggaaa ccggccgtcc gtctctcctg atcggccgtc acgctcatgc gattccgggt  660
atggacgcgg cagaatccga gcgtttcctg gaaggtctgg ttgattgggc ttgtcaggcg  720
ccgcgtgtgc atgctcacca gtgggcagct ggcgacgtgg ttgtatggga taaccgctgc  780
ctgcttcacc gtgcagaacc gtgggacttt aagctgccac gtgttatgtg gcacagccgt  840
ctggcaggcc gcccagaaac cgagggcgcg gctctggttt aa                     882
<210>6
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的M13正向测序引物
<400>6
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<210>7
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的M13反向测序引物
<400>7
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<210>8
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>8
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<210>9
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<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的反向AAD-12(v1)PTU引物
<400>9
gctgcaacac tgataaatgc caactgg    27
<210>10
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的正向AAD-12(v1)编码PCR引物
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<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的反向AAD-12(v1)编码PCR引物
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<210>12
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>化学合成的SdpacodF：AAD-12(v1)正向编码区引物
<400>12
atggctcatg ctgccctcag cc       22
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的SdpacodR：AAD-12(v1)反向编码区引物
<400>13
cgggcaggcc taactccacc aa       22
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<213>人工序列
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<223>化学合成的引物“NcoI of Brady”
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<220>
<223>化学合成的引物“SacI of Brady″
<400>15
gagctcctat cactccgccg cctgctgctg cac    33

Claims (88)

1.转基因植物细胞，其含有编码AAD-12蛋白的多核苷酸，所述AAD-12蛋白选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：2变体和SEQ ID NO：4变体，其中所述变体具有芳氧基链烷酸酯双加氧酶活性，并与选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的序列至少95％的序列同一性。
2.权利要求1的细胞，其中所述多核苷酸的表达赋予所述细胞将苯氧乙酸生长素除草剂转换为非除草剂分子的能力。
3.权利要求1的细胞，其中所述多核苷酸的表达赋予所述细胞将吡啶氧基生长素除草剂转换为非除草剂分子的能力。
4.含有多个根据权利要求1的细胞的转基因植物，其中所述多核苷酸的表达赋予所述植物对除草剂的耐性。
5.选择至少一个权利要求1所述的转基因植物细胞的方法，其中所述方法包括向所述转基因植物细胞和/或其附近以及缺少所述多核苷酸的缺陷植物细胞应用芳氧基链烷酸酯除草剂，并允许所述转基因植物细胞和缺陷植物细胞生长。
6.权利要求5的方法，其中所述转基因植物细胞是在大田中生长的转基因作物植物的植物细胞，并且所述缺陷细胞是在所述大田中生长的杂草细胞。
7.权利要求5的方法，其中所述转基因植物细胞是用所述多核苷酸转化的植物细胞，并且所述缺陷细胞是非转化体，且所有所述细胞在组织培养基上生长。
8.控制杂草的方法，所述方法包括对作物植物和杂草应用2，4-滴除草剂，所述作物植物含有多个根据权利要求1的植物细胞。
9.权利要求8的方法，其中所述作物植物是大豆植物。
10.权利要求8的方法，其中所述杂草对草甘膦具有抗性。
11.保护作物植物免受芳氧基链烷酸酯双加氧酶除草剂损伤的方法，所述方法包括培养含有AAD-12基因的植物，并对所述植物应用所述除草剂。
12.权利要求11的方法，其中所述除草剂是2，4-滴。
13.权利要求8的方法，其中所述植物还含有草甘膦抗性基因，并且所述方法还包括对所述植物和所述杂草应用草甘膦。
14.权利要求13的方法，所述植物还含有第三除草剂抗性基因，并且所述方法还包括对所述植物和所述杂草应用第三除草剂。
15.转基因植物，含有编码赋予对吡啶氧基生长素除草剂抗性的酶的异源多核苷酸。
16.权利要求15的转基因植物，所述多核苷酸也赋予对苯氧基生长素除草剂的抗性。
17.权利要求16的植物，所述苯氧基生长素除草剂选自2，4-滴和MCPA。
18.权利要求15的植物，所述植物还含有至少一个另外的除草剂抗性基因。
19.植物，含有编码具有芳氧基链烷酸酯双加氧酶活性的蛋白质的多核苷酸，其中编码所述蛋白质的核酸分子在严格条件下与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5的序列的全长互补物杂交。
20.编码具有芳氧基链烷酸酯双加氧酶活性的蛋白质的多核苷酸，其中编码所述蛋白质的核酸分子在严格条件下与选自SEQ ID NO：1、SEQID NO：3和SEQ ID NO：5的序列的全长互补物杂交，其中所述多核苷酸含有用于在植物中表达的优化的密码子组成。
21.植物细胞，含有编码具有芳氧基链烷酸酯双加氧酶活性的蛋白质的异源多核苷酸，其中编码所述蛋白质的核酸分子在严格条件下与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5的序列的全长互补物杂交。
22.选择权利要求21的转化植物细胞的方法，其中所述方法包括用所述多核苷酸转化多个植物细胞，然后以允许表达所述多核苷酸的转化细胞生长而杀死或抑制非转化细胞生长的除草剂浓度培养所述细胞，其中所述除草剂选自苯氧基生长素和吡啶氧基生长素除草剂。
23.权利要求22的方法，其中所述细胞是植物细胞且所述方法用于选择转化植物。
24.控制大田中至少一种杂草的方法，所述方法包括在大田中种植至少一种转基因植物的种子，所述植物含有：
编码赋予对吡啶氧基生长素除草剂抗性的酶的异源多核苷酸，和
编码赋予对至少一种其他除草剂抗性的酶的第二异源多核苷酸；
所述方法还包括对所述大田至少一部分应用选自吡啶氧基生长素除草剂和苯氧基生长素除草剂的第一除草剂；并对所述大田的所述至少一部分应用所述至少一种其他除草剂。
25.权利要求24的方法，其中所述除草剂被相继或同时应用。
26.权利要求24的方法，其中所述第一除草剂是苯氧基生长素除草剂。
27.权利要求24的方法，其中所述至少一种其他的除草剂选自乙草胺、三氟羧草醚、禾草灭、酰嘧磺隆、氨草啶、阿特拉津、氟丁酰草胺、双草醚、氟丙嘧草酯、唑草胺、唑草酮、氯嘧磺隆、绿麦隆、吲哚酮草酯、烯草酮、炔草酯、异噁草松、cloproxydim、二氯吡啶酸、氯酯磺草胺、氰草津、环丙嘧磺隆、噻草酮、氰氟草酯、杀草隆、麦草畏、禾草灵、双氯磺草胺、吡氟草胺、二甲噻草胺、敌草快、氟硫草定、敌草隆、乙丁烯氟灵、精噁唑禾草灵、啶嘧磺隆、双氟磺草胺、吡氟禾草灵、氟酮磺隆、氟噻草胺、flufenican、氟哒嗪草酯、唑嘧磺草胺、氟烯草酸、丙炔氟草胺、氟草烟、哒草氟、fomesafen氟磺胺草醚、甲酰胺磺隆、草铵膦、草甘膦、halosafen、氯吡嘧磺隆、吡氟氯禾灵、咪草酯、甲氧咪草烟、甲咪唑烟酸、咪唑烟酸、咪唑喹啉酸、咪草烟、咪唑磺隆、碘甲磺隆、碘苯腈、异噁草胺、异噁唑草酮、乳氟禾草灵、利谷隆、苯噻草胺、氟磺酰草胺、甲基二磺隆、硝草酮、噁唑酰草胺、吡草胺、磺草唑胺、嗪草酮、MSMA、敌草胺、烟嘧磺隆、哒草伏、安磺灵、噁草酮、乙氧氟草醚、百草枯、克草猛、二甲戊乐灵、五氟磺草胺、毒莠定、氟吡草胺、pinoxaden、氟嘧磺隆、环苯草酮、敌稗、吡草醚、吡嘧磺隆、嘧啶肟草醚、嘧草醚、嘧草硫醚、pyroxasulfone、甲氧磺草胺、二氯喹啉酸、喹草酸、喹禾灵、玉嘧磺隆、稀禾定、西玛津、磺草酮、磺酰唑草酮、嘧磺隆、tefuryltrione、tembotrione、吡喃草酮、特草定、噻草定、噻苯隆、thiencarbazone、噻磺隆、禾草丹、topramezone、肟草酮、醚苯磺隆、苯磺隆、绿草定、三氟啶磺隆、氟乐灵、氟胺磺隆和三氟甲磺隆。
28.测定蛋白质切割吡啶氧链烷酸酯除草剂能力的方法，所述方法包括提供含有所述蛋白质的样品和吡啶氧基生长素除草剂，并测定所述样品中氯吡啶酚的存在。
29.测定蛋白质芳氧基链烷酸酯双加氧酶活性的方法，其中所述方法包括提供含有所述蛋白质的样品和2-(2-氯，4-硝基苯氧基)丙酸酯和/或乙酸酯，并测定所述样品中2-氯，4-硝基苯酚的存在。
30.可遗传的表达盒，含有编码蛋白质的核酸分子，其中蛋白质酶法降解选自苯氧基生长素和吡啶氧基生长素的至少一种除草剂，其中所述核酸分子在严格条件下与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5的序列的全长互补物杂交。
31.权利要求30的表达盒，其中所述启动子是植物启动子。
32.权利要求30的表达盒，含有的启动子选自木薯叶脉花叶病毒启动子、CaMV 35S启动子、玄参花叶病毒启动子、稻肌动蛋白启动子、菜豆蛋白启动子、拟南芥泛素10启动子、玉米泛素启动子、拟南芥Act2启动子、拟南芥泛素11启动子和拟南芥泛素3启动子。
33.权利要求24的方法，其中所述植物对包括草甘膦的除草剂制剂具有抗性。
34.控制大田中杂草的方法，其中所述方法包括对所述大田应用第一除草剂，并在应用所述第一除草剂的14天内在所述大田中种植种子，其中所述种子包括权利要求1的细胞，且其中所述第一除草剂选自苯氧基生长素和吡啶氧基生长素。
35.权利要求34的方法，其中所述第一除草剂是酸、无机盐、有机盐或酯。
36.权利要求34的方法，其中所述种子包括第二基因，其赋予所述植物对第二除草剂的抗性，且所述方法还包括在所述种植前对所述大田应用所述第二除草剂。
37.权利要求36的方法，其中所述第二除草剂选自草甘膦、克无踪和草铵膦。
38.检测是否植物含有权利要求20的多核苷酸的方法，其中所述方法包括收集来自所述植物的样品，并测定所述样品中所述多核苷酸的存在。
39.权利要求38的方法，其中所述方法包括测定所述样品中由所述多核苷酸编码的蛋白质的存在。
40.权利要求38的方法，其中所述方法包括使用PCR引物或探针来检测所述多核苷酸的存在。
41.权利要求39的方法，其中所述方法包括使用抗体来检测所述蛋白质的存在。
42.权利要求15的植物，其中所述植物还含有来源于选自苏云金芽孢杆菌、光杆状菌属(Photorhabdus)和致病杆菌属(Xenorhabdus)生物的昆虫抗性基因。
43.权利要求15的植物，其中所述植物还含有选自真菌抗性、胁迫耐受性、增加的产量、改良的油谱、改良的纤维质量、病毒抗性、延缓成熟、寒冷耐受性和盐受耐性农学性状的基因。
44.控制大田中至少一种杂草的方法，所述方法包括在所述大田中培养至少一种权利要求15的转基因植物，并对所述大田至少一部分应用吡啶氧基生长素除草剂。
45.控制大田中至少一种杂草的方法，所述方法包括在所述大田中培养至少一种权利要求16的植物，并对所述大田至少一部分应用苯氧基生长素除草剂。
46.权利要求44的方法，还包括对所述大田至少一部分应用苯氧基生长素除草剂。
47.权利要求44的方法，所述吡啶氧基生长素除草剂选自氟草烟和绿草定。
48.权利要求45的方法，所述苯氧基生长素除草剂选自2，4-滴和MCPA。
49.权利要求45的方法，其中所述植物对选自草甘膦、草铵膦、咪草烟、氯磺隆、麦草畏、硝草酮、异噁唑草酮和氟丙嘧草酯的除草剂具有抗性。
50.权利要求45的方法，其中所述除草剂是非手性苯氧基生长素。
51.权利要求24的方法，其中所述植物是单子叶植物。
52.权利要求51的方法，其中所述单子叶植物选自玉米、稻、小麦、大麦、黑麦、暖季和冷季型草坪草、燕麦、高粱和牧场草。
53.权利要求24的方法，其中所述第一除草剂是苯氧基生长素且所述植物是双子叶植物。
54.权利要求53的方法，其中所述双子叶植物选自棉花、烟草、芸苔和大豆。
55.赋予作物除草剂抗性的方法，其中所述方法包括将多核苷酸引入所述作物的至少一种植物细胞，其中多核苷酸编码能使用吡啶氧基生长素除草剂和苯氧基生长素除草剂作为底物的酶。
56.在草甘膦和/或草铵膦耐性作物植物大田中控制草甘膦抗性、天然草甘膦耐性和/或天然草铵膦耐性杂草的方法，其中所述植物含有权利要求13的多核苷酸，且所述方法包括对所述大田至少一部分应用芳氧基链烷酸酯除草剂。
57.权利要求56的方法，其中所述除草剂是苯氧基生长素。
58.权利要求57的方法，其中所述苯氧基生长素是2，4-滴。
59.在含有权利要求20的多核苷酸的作物植物大田中控制对ALS抑制性除草剂具有抗性的杂草的方法，所述方法包括对所述大田至少一部分应用芳氧基链烷酸酯除草剂。
60.权利要求1的细胞，其中所述植物细胞选自双子叶植物细胞和单子叶植物细胞。
61.权利要求60的细胞，其中所述植物细胞是双子叶植物，并选自棉花细胞、烟草细胞、芸苔细胞、大豆细胞和拟南芥细胞。
62.权利要求60的细胞，其中所述植物细胞是单子叶植物细胞，并选自稻细胞和玉米细胞。
63.权利要求61的细胞，其中所述吡啶氧基生长素除草剂选自氟草烟和绿草定。
64.权利要求4的植物，其中所述多核苷酸的表达赋予该植物对苯氧乙酸生长素除草剂和吡啶氧基生长素除草剂的抗性。
65.权利要求8的方法，其中所述方法包括应用第二除草剂。
66.权利要求22的方法，其中所述2，4-滴除草剂和所述第二除草剂相继应用。
67.权利要求22的方法，其中所述第一除草剂和所述第二除草剂同时应用。
68.权利要求8的方法，其中所述植物对草甘膦具有抗性。
69.权利要求24的方法，其中所述第二多核苷酸是修饰的EPSPS(5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶)。
70.权利要求24的方法，其中所述第一除草剂是苯氧基生长素且所述第二除草剂选自草甘膦和草铵膦。
71.权利要求70的方法，其中所述苯氧基生长素是2，4-滴且所述第二除草剂是草甘膦。
72.权利要求24的方法，其中所述方法还包括应用第三除草剂。
73.为在植物中表达优化的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有芳氧基链烷酸酯双加氧酶活性的蛋白质，其中编码所述蛋白质的核酸分子在严格条件下与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5的序列的全长互补物杂交。
74.权利要求44的多核苷酸，其中优化所述多核苷酸在双子叶植物或单子叶植物中表达。
75.分离的多核苷酸，编码酶法降解选自苯氧基生长素和吡啶氧基生长素的除草剂的蛋白质，其中编码所述蛋白质的核酸分子在严格条件下与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5的序列的全长互补物杂交，其中所述多核苷酸与在植物细胞中具有功能的启动子有效连接。
76.权利要求75的多核苷酸，其中所述启动子是植物启动子。
77.权利要求76的多核苷酸，其中所述启动子是木薯叶脉花叶病毒启动子。
78.权利要求22的方法，其中所述多核苷酸作为选择标记物。
79.种子，其含有权利要求1的植物细胞。
80.从权利要求79的种子长成的植物。
81.权利要求4的植物的再生部分、子代或无性繁殖体。
82.权利要求8的方法，其中所述方法用于处理或预防除草剂抗性杂草。
83.权利要求4的植物，其中所述植物还含有昆虫抗性基因，所述昆虫抗性基因来自选自苏云金芽孢杆菌、光杆状菌属和致病杆菌属的生物。
84.权利要求4的植物，其中所述植物还含有农学性状的基因，所述农学性状选自真菌抗性、胁迫耐受性、增加的产量、改善的油谱、改善的纤维质量、病毒抗性、延缓成熟、寒冷耐受性和盐耐受性。
85.在草甘膦耐性作物植物的大田中控制草甘膦抗性杂草的方法，其中所述植物含有权利要求20的多核苷酸，且所述方法包括对所述大田的至少一部分应用芳氧基链烷酸酯除草剂。
86.权利要求85的方法，其中所述除草剂是苯氧基生长素。
87.权利要求25的方法，其中所述除草剂罐混应用。
88.权利要求10的方法，其中所述至少一种所述杂草包括至少一种与所述转基因作物不同物种的草甘膦抗性自生植物。
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