CN103890194A - 用于检测植物中的芳氧基链烷酸酯加双氧酶基因(aad-12)的材料和方法 - Google Patents
用于检测植物中的芳氧基链烷酸酯加双氧酶基因(aad-12)的材料和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本申请提供了用于检测源自重组植物的生物学样品中aad-12基因事件的材料和方法及用于检测源自重组植物的样品中污染性事件的材料和方法。
Description
对相关申请的交叉引用
本申请要求2011年10月18日提交的美国临时申请流水号61/548,543的权益。
发明背景
大豆是一种重要的作物，并且是世界上许多地区的主要食物来源。生物技术方法已经应用于大豆以改善产品的农艺学性状和质量。对大豆植物引入的农艺学性状的例子包括除草剂抗性和昆虫抗性。
aad-12基因(最初来自食酸戴尔福特菌(Delftia acidovorans))编码芳氧基链烷酸酯加双氧酶(aryloxyalkanoate dioxygenase,AAD-12)蛋白。此基因赋予对例如2,4-二氯苯氧基乙酸及对吡啶基氧基乙酸酯(pyridyloxyacetate)除草剂的耐受性。用于在植物中引入除草剂耐受性的aad-12基因自身在WO2007/053482中披露。
异源或外来基因(转基因)在植物中的表达受到外来基因在何处插入染色体中影响。例如，这可以是由于染色质结构(例如，异染色质)或转录调节元件(例如，增强子)接近整合位点的接近性(Weising等,Ann.Rev.Genet22:421-477,1988)所致。因此，相同类型的转基因植物(或其它生物体)中的相同基因可以在不同事件间展现出表达水平的广泛变化。还可能存在着空间或时间表达样式的差异。例如，转基因在各个植物组织中的相对表达差异可以不对应于自存在于导入植物中的基因构建体中的转录调节元件预期的样式。
如此，经常创建大量事件，并进行筛选以鉴定以对于给定的目的满意的水平表达导入的感兴趣基因的事件。对于商业目的，生成成百上千个不同事件，并对那些事件筛选具有期望的转基因表达水平和样式的单一事件是常见的。具有期望的转基因表达水平和/或样式的事件可用于使用常规的育种方法通过有性异型杂交(outcrossing)将转基因基因渗入(introgress)其它遗传背景中。此类杂交的后代维持初始转化体的转基因表达特征。使用此策略来确保充分适应于地方生长条件的许多品种(variety)中的可靠基因表达。
会有利的是，能够检测特定植物的转基因和/或基因组DNA的存在以测定有性杂交的后代是否含有感兴趣的转基因和/或基因组DNA。另外，在遵守要求源自重组作物植物的食物的上市前批准和加标记的规定时，用于检测特定植物中的转基因和/或基因组DNA的存在的方法会是有用的。
有可能通过任何公知的核酸检测方法检测转基因的存在。例子包括聚合酶链式反应(PCR)或使用核酸探针的DNA杂交。这些检测方法一般聚焦于常用的遗传元件，诸如启动子、终止子、标志物基因、或其它常用的遗传元件。此类方法不可用于区分不同事件，特别是那些使用相同DNA构建体生成的事件，除非与插入DNA相邻的染色体DNA序列(“侧翼DNA”)是已知的。
出于育种、性状渐渗、和种子纯度目的，能够测定植物中转基因事件的接合性也是重要的。出于管理和种子质量原因，能够快速检测大豆植物材料中的混合aad-12基因事件(有意或无意)的存在也是有利的。
发明概述
本发明涉及生物学样品中的aad-12基因事件检测。本发明提供了鉴定遗传工程化植物的方法，所述遗传工程化植物具有含有一个或多个aad-12事件的基因组DNA(gDNA)。本专利中描述的测定法是aad-12基因特异性的，非事件特异性的，并且检测且任选地测定任何aad-12基因事件的接合性。本发明能够经由转基因拷贝数分析相对于特定aad-12测定无意aad-12事件的污染。
如此，本发明的一个方面提供了用于测定生物学样品(例如来自大豆)中的aad-12转基因的存在的测定法。测定法可以基于插入大豆基因组中的重组构建体的DNA序列。还提供了可用于进行测定法的试剂盒和条件。
本发明还涉及可用于克隆和分析aad-12基因相关DNA序列的核酸序列。本发明的此方面的某些实施方案提供了用于检测aad-12的基因特异性引物及用这些基因特异性引物组生成的PCR扩增子。因此，这些和其它相关方法可以用于鉴定含有aad-12基因的植物。
附图简述
图1：aad-12事件416的基因特异性测定法。黑色上部点分组代表来自在aad-12方面纯合的大豆样品的荧光读出。中间更亮的点分组代表来自在aad-12方面半合子的大豆样品的荧光读出。更低的点分组代表来自在aad-12事件方面呈阴性的野生型大豆样品的荧光读出。
图2：aad-12事件4406的基因特异性测定法。黑色上部点分组代表来自在aad-12方面纯合的大豆样品的荧光读出。中间更亮的点分组代表来自在aad-12方面半合子的大豆样品的荧光读出。更低的点分组代表来自在aad-12事件方面呈阴性的野生型大豆样品的荧光读出。
发明详述
转基因导入和整合植物基因组涉及随机事件(因此对于表达的给定插入使用名称“事件”)，并且对于多种转化技术如土壤杆菌转化，“基因枪(genegun)”转化和WHISKERS，无法预测转基因会在何处插入植物基因组中。
在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection(ATCC)，10801University Boulevard,Manassas,VA,20110)保藏了包含一个所述aad-12基因事件pDAB4472-1606的大豆系的至少2500个种子，并使公众可以不受限制的获得(但专利权适用)。该保藏命名为ATCC保藏号PTA-11028，具有保藏日2010年6月10日。该保藏是，并会维持是为了专利程序的目的依照布达佩斯条约进行的，并受其涉及种子保藏的条款约束。该保藏会不设限地保持在ATCC保藏机构(其为公开保藏机构)至下述之中最晚者：30年，或最后一次要求之后五年，或本专利的有效期限，并在此期间，若其不具生活力，则会加以替换。
本文中提供了定义和实例以帮助描述本发明并指导本领域一般技术人员实施本发明。除非另外指明，应根据相关领域的一般技术人员的常规用法来理解术语。
“生物学样品”可以包含源自大豆细胞或组织，包括茎、根、叶、花或花部分、种子或种子荚等的任何有机材料，其含有与此类有机材料对应的可检测量的核苷酸序列。
“探针”是一种分离的核酸，其附接有常规的可检测标记物或报告物分子(例如放射性同位素、荧光团、配体、化学发光剂、或酶)。此类探针与靶核酸的链，在本发明的情况中，与编码aad-12基因的重组DNA的链互补。依照本发明的探针不仅包含脱氧核糖核酸或核糖核酸，而且还包含特异性结合靶DNA序列的聚酰胺和其它探针材料，并且此类结合可以用于检测所述靶DNA序列的存在。
“引物”是通过核酸杂交与互补靶DNA链退火以形成引物与靶DNA链间的杂合物，然后通过聚合酶，例如DNA聚合酶(例如DNA聚合酶)沿着靶DNA链延伸的分离的核酸。本发明的引物对指其用于扩增靶核酸序列的用途，例如通过聚合酶链式反应(PCR)或其它常规的核酸扩增方法来实现。
探针和引物的长度一般是11至30个核苷酸或更多。在某些例子中，探针和引物可以具有超过30个核苷酸的长度。不管大小如何，探针和引物可以在高严格性杂交条件下与靶序列特异性杂交。优选地，依照本发明的探针和引物与靶序列具有完全的序列相似性，尽管可以通过常规方法设计与靶序列不同，且保留与靶序列杂交的能力的探针。
如用于本文，术语“后代”指包含(或含有)aad-12事件的亲本植物的任何世代的后代。
转基因“事件”是通过用异源DNA，即包含感兴趣转基因的核酸构建体转化植物细胞，重新产生由将所述转基因插入植物基因组所得的植物群体，并选择由插入特定基因组位置所表征的特定植物来产生。术语“事件”指起始转化体和转化体的后代，其含有所述异源DNA。术语“事件”还指通过转化体和含有基因组/转基因DNA的另一品种之间的有性异型杂交(outcross)产生的后代。即使在与回归(recurrent)亲本的反复回交之后，插入的转基因DNA和来自转化的亲本的侧翼基因组DNA(基因组/转基因DNA)仍存在于杂交后代的相同染色体位置处。术语“事件”还指来自起始转化体及其包含插入的DNA和直接邻接插入的DNA的侧翼基因组序列的后代的DNA，期待其会转移至下述后代，所述后代作为一个含有所述插入的DNA的亲本系(例如起始转化体和其自交所得的后代)和不含有该插入的DNA的亲本系有性杂交的结果而接受了含有感兴趣的转基因的插入的DNA。
如上文讨论的，本发明的一个方面涉及aad-12转基因鉴定。本发明中包括相关PCR引物和扩增子。依照本发明，使用跨越插入DNA的扩增子的分析PCR法可以用于检测或鉴定源自含有aad-12事件的专有转基因植物的商业化转基因植物品种或品系。如此，本发明的多个实施方案提供了包含SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或其各种组合的引物及包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:3和6两者的探针。
本文中公开的检测技术与植物育种一同使用，以在为了将一种或多种其他感兴趣的性状赋予后代，将包含所述事件的亲本植物与另一种植物品系杂交之后，鉴定含有aad-12事件的后代植物。这些PCR分析方法有利于玉米育种项目以及质量控制，特别是对于商业化转基因种子，并且亦可有利于产品登记和产品管理。
本领域技术人员还会认可引物和探针可以设计为在一定范围的标准杂交和/或PCR条件(包括引物或探针与例示序列不完全互补的条件)下杂交。即，可容忍一定程度的错配。对于大约20个核苷酸的引物，例如，若错配的碱基在引物的内部或与扩增子相反的末端，通常一个或两个左右的核苷酸并不需要与相反链杂交。下面提供了多种适当的杂交条件。此外，合成的核苷酸类似物，如次黄嘌呤核苷，亦可用于探针。亦可使用肽核酸(PNA)探针，以及DNA和RNA探针。
提供了用于检测事件pDAB4472-1606存在的组合物。这些组合物包含事件特异性引物，诸如SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2，和与同不含事件pDAB4472-1606的野生型植物基因组共同的DNA杂交的引物(SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:5)。PCR分析证明了含有事件pDAB4472-1606的大豆系可以通过分析用这些事件特异性引物组(SEQ ID NO:1和2)生成的PCR扩增子鉴定。这些和其它相关程序可以用于独特鉴定含有事件pDAB4472-1606的这些大豆系。因此，PCR扩增子源自此类引物，并且可以用于鉴定含有事件pDAB4472-1606的大豆系，并且形成公开发明的另一个实施方案。
本发明还包括检测样品中DNA存在的方法，所述样品包含含有aad-12基因的植物材料。此类方法可以包括：(a)使包含DNA的样品与引物组接触，所述引物组在核酸扩增反应中与DNA一起使用时生成鉴定所述样品内aad-12序列的扩增子；(b)实施核酸扩增反应，由此生成扩增子；并且(c)检测扩增子。
本发明的其它检测方法包括检测样品中与aad-12编码序列对应的DNA的存在的方法，其中所述方法包括：(a)使包含DNA的样品与探针接触，所述杂交在严格杂交条件下与来自含有aad-12事件的植物材料的DNA杂交，且在严格杂交条件下不与来自对照植物(不含aad-12事件的植物)的植物材料杂交；(b)使样品和探针受到严格杂交条件处理；并且(c)检测探针与DNA的杂交。
依照本发明的另一个方面，提供了与含有事件pDAB4472-1606的植物杂交的后代的接合性的方法。这些方法可以包括使包含大豆DNA的样品与本文中公开的引物组接触。这些引物在核酸扩增反应中与来自含有事件pDAB4472-1606的植物的基因组DNA一起使用时生成第一扩增子，所述第一扩增子将植物鉴定为含有事件pDAB4472-1606。这些方法进一步包括实施核酸扩增反应，由此生成第一扩增子；检测第一扩增子；并且使包含大豆DNA的样品与另一引物组接触，所述另一引物组在核酸扩增反应中与来自大豆植物的基因组DNA一起使用时，生成第二扩增子，该第二扩增子包含与大豆基因组区同源的天然大豆基因组DNA。该方法还可以进一步包括实施核酸扩增反应以生成第二扩增子，检测第二扩增子，并且比较样品中的第一和第二扩增子。样品中这两种扩增子的存在指示样品在事件pDAB4472-1606方面是杂合的。
“探针”是一种分离的核酸分子，其附接有常规的可检测标记物或报告物分子(例如放射性同位素、配体、化学发光剂、或酶)。本文中公开的探针包括SEQ ID NO:3和/或6。依照本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，而且还包含特异性结合靶DNA序列的聚酰胺和其它探针材料，并且可以用于检测所述靶DNA序列的存在。用于制备和使用探针和引物的方法记载于例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed.,vol.1-3,Sambrook等编,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989。
根据应用，可使用多种杂交条件以获得探针对靶序列的不同程度的选择性。对于需要高选择性的应用，可通常采用相对严格的条件来形成杂合体，例如，会选择相对低盐和/或高温度的条件，如由约0.02M至约0.15M NaCl在约50℃至约70℃的温度提供的条件。严格条件，例如，可涉及用高严格性洗涤缓冲液(0.2X SSC,0.1%SDS,65℃)洗涤杂交滤纸至少两次。促进DNA杂交的适当严格条件，例如在约45℃的6.0X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，接着在50℃用2.0X SSC的洗涤，对于本领域技术人员是已知的。举例而言，洗涤步骤中的盐浓度可选自在50℃的约2.0X SSC的低严格度至在50℃的约0.2XSSC的高严格度。此外，洗涤步骤中的温度可从室温约22℃的低严格条件增加至约65℃的高严格条件。温度和盐均可变化，或可将温度或盐浓度之一维持恒定的同时改变另一个变量。此类选择性条件几乎不容忍探针和模板或靶链之间的错配(若有的话)。通过杂交检测DNA序列对于本领域技术人员是公知的，且美国专利号4,965,188和5,176,995的教导是杂交分析方法的实例。在一个具体的实施方案中，本文中公开的引物或探针会与含有事件pDAB4472-1606的基因组DNA特异性杂交。可以通过本领域技术人员已知的多种方法检测探针或引物对含有事件pDAB4472-1606的DNA的杂交，这些可以包括但不限于荧光标签、放射性标签、基于抗体的标签、和化学发光标签。
对于使用特定扩增引物对扩增靶核酸序列(例如，通过PCR)，“严格条件”为允许引物对仅杂交于会与具有对应的野生型序列(或其互补物)的引物结合并优选产生独特扩增产物即扩增子的靶核酸序列的条件。术语“特异于(靶序列)/对(靶序列)特异性的”表明探针或引物在严格杂交条件下仅与包含所述靶序列的样品中的靶序列杂交。
如用于本文，“扩增的DNA”或“扩增子”指作为核酸模板一部分的靶核酸序列的核酸扩增产物。举例而言，为了确定从有性杂交获得的大豆植物在其基因组DNA内是否含有事件pDAB4472-1606，可对从大豆植物组织提取的DNA进行使用本文中公开的引物对的核酸扩增方法以产生鉴定事件pDAB4472-1606存在的扩增子。所述扩增子的长度的范围可为引物对的合并长度加上一个核苷酸碱基对，和/或引物对的合并长度加上约2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106,107,108,109,110,111,112,113,114,115,116,117,118,119,120,121,122,123,124,125,126,127,128,129,130,131,132,133,134,135,136,137,138,139,140,141,142,143,144,145,146,147,148,149,150,151,152,153,154,155,156,157,158,159,160,161,162,163,164,165,166,167,168,169,170,171,172,173,174,175,176,177,178,179,180,181,182,183,184,185,186,187,188,189,190,191,192,193,194,195,196,197,198,199,200,201,202,203,204,205,206,207,208,209,210,211,212,213,214,215,216,217,218,219,220,221,222,223,224,225,226,227,228,229,230,231,232,233,234,235,236,237,238,239,240,241,242,243,244,245,246,247,248,249,250,251,252,253,254,255,256,257,258,259,260,261,262,263,264,265,266,267,268,269,270,271,272,273,274,275,276,277,278,279,280,281,282,283,284,285,286,287,288,289,290,291,292,293,294,295,296,297,298,299,300,301,302,303,304,305,306,307,308,309,310,311,312,313,314,315,316,317,318,319,320,321,322,323,324,325,326,327,328,329,330,331,332,333,334,335,336,337,338,339,340,341,342,343,344,345,346,347,348,349,350,351,352,353,354,355,356,357,358,359,360,361,362,363,364,365,366,367,368,369,370,371,372,373,374,375,376,377,378,379,380,381,382,383,384,385,386,387,388,389,390,391,392,393,394,395,396,397,398,399,400,401,402,403,404,405,406,407,408,409,410,411,412,413,414,415,416,417,418,419,420,421,422,423,424,425,426,427,428,429,430,431,432,433,434,435,436,437,438,439,440,441,442,443,444,445,446,447,448,449,450,451,452,453,454,455,456,457,458,459,460,461,462,463,464,465,466,467,468,469,470,471,472,473,474,475,476,477,478,479,480,481,482,483,484,485,486,487,488,489,490,491,492,493,494,495,496,497,498,499,或500,750,1000,1250,1500,1750,2000或更多个核苷酸碱基对(加上或减去任何上述列出的增量)。术语“扩增子”的使用特别排除了可在DNA热扩增反应中形成的引物二聚体。
核酸扩增可通过本领域中已知的多种核酸扩增方法中任一种，包括聚合酶链式反应(PCR)来实现。多种扩增方法在本领域是已知的，并描述于除其他之外，美国专利号4,683,195和美国专利号4,683,202。开发了PCR扩增方法以扩增高至22kb的基因组DNA。这些方法，以及本领域已知的其他DNA扩增的方法可用于本发明的实践。可验证(视需要，可校正)来自主题大豆事件的异源转基因DNA插入的序列，即使用来源于本文中提供的序列的引物来扩增来自事件的此类序列，接着对PCR扩增子或克隆的DNA进行标准DNA测序。可通过多种技术检测由这些方法产生的扩增子。琼脂糖凝胶电泳和用溴化乙啶的染色是检测DNA扩增子的常见公知方法。
TAQMAN(PE Applied Biosystems,Foster City,Calif.)是检测和量化DNA序列的存在的方法。简言之，设计了与感兴趣序列(例如aad-12基因或大豆基因的天然基因)的FRET寡核苷酸探针。在热稳定性聚合酶和dNTP存在下循环FRET探针和PCR引物。在特异性扩增过程中，Taq DNA聚合酶将FRET探针上的荧光模块从淬灭模块清除并释放。荧光信号表明由于成功的扩增和杂交所致的感兴趣序列的存在。已描述了分子灯塔(Molecular Beacon)用于序列检测，并且可以依照本发明使用。
依照本发明的另一个方面，提供了检测生物学样品中与事件pDAB4472-1606对应的DNA的存在的方法。这些方法包括：(a)使所述生物学样品与探针接触，所述探针在严格杂交条件下与来自含有事件pDAB4472-1606的大豆植物的基因组DNA杂交，并且在所述严格杂交条件下不与对照大豆植物杂交；(b)使所述生物学样品和探针受到严格杂交条件处理；并(c)检测所述探针与含有事件pDAB4472-1606的DNA的杂交，其中此类杂交的检出指示所述植物基因组内与事件pDAB4472-1606对应的DNA的存在。优选地，探针是SEQ ID NO:3。
本发明的又一个方面是测定含有事件pDAB4472-1606的大豆植物后代的接合性的方法。该方法包括(a)使生物学样品与SEQ ID NO:1和2的引物对接触，所述引物对在核酸扩增反应中与来自生物学样品的基因组DNA一起使用时生成第一扩增子，所述生物学样品含有来自含有事件pDAB4472-1606的大豆植物的生物学样品的基因组DNA，所述第一扩增子鉴定所述生物学样品的基因组DNA内的aad-12基因的存在；(b)实施核酸扩增反应；(c)检测生成的第一扩增子(使用SEQ ID NO:3作为标记探针进行)；(d)使相同样品与引物对SEQ ID NO:4和5接触，所述引物对SEQ ID NO:4和5在核酸扩增反应中与含有来自大豆植物的基因组DNA的生物学样品一起使用时从引物组合生成扩增子，该扩增子鉴定与鉴定为事件pDAB4472-1606的转基因插入的大豆基因组区同源的野生型大豆基因组DNA；(e)实施核酸扩增反应，并(f)检测生成的第二扩增子(使用SEQ ID NO:6作为检测探针进行)；其中：(a)这两种扩增子的检出指示所述大豆样品在事件pDAB4472-1606方面是杂合的；(b)仅所述第一扩增子(鉴定aad-12基因的存在)的检出指示所述生物学样品在事件pDAB4472-1606方面是纯合的；且(c)仅所述第二扩增子的检出指示所述生物学样品内缺乏事件pDAB4472-1606。可以使用经标记的探针(例如SEQ ID NO:3和6)实施扩增子的检测。如上文讨论，探针可以用常规的可检测标记物或报告物分子，例如放射性同位素、荧光标记物、配体、化学发光剂、或酶标记。在一些实施方案中，探针用荧光标记物标记，所述荧光标记物容许区别含有aad-12基因的扩增子和不含aad-12基因的扩增子(例如荧光团/淬灭剂组合诸如与淬灭剂诸如四甲基罗丹明(TAMRA)或二氢环吡咯并吲哚三肽(dihydrocyclopyrroloindole tripeptide,MGB)组合的6-羧基荧光素(FAM)或四氯荧光素(TET))。
在本发明的另一个实施方案中，aad-12基因特异性测定法可以与事件特异性PCR诸如记载于2011年10月18日提交的共同悬而未决的美国临时专利申请流水号61/548,533(Attorney Docket No.DAS.160P;MATERIALS ANDMETHODS FOR DETECTING THE ARYLOXYALKANOATEDIOXYGENASE GENE(AAD-12)CONTAINING EVENT pDAB4472-1606INPLANTS;发明人：Chandra Channabasavaradhya and Andrew Greenwald；其在此通过提及完整并入)的事件特异性PCR配对。此实施方案可以用于测定同一植物中是否存在有混合aad-12事件，并且通过事件特异性测定法检测的事件是半合子的还是纯合的。在此实施方案中，实施基因特异性测定法，并且基因拷贝数基于由基因特异性测定法产生的荧光信号强度评估。然后，将这与已知事件特异性接合性测定法的荧光信号强度比较。若aad-12基因拷贝数估值与通过事件特异性测定法评估的拷贝数是相似强度的，则样品视为仅具有有意的aad-12事件。若通过基因特异性测定法评估的拷贝数超过通过事件特异性测定法评估的拷贝数，则研究的样品视为在有意的事件外具有其它aad-12基因拷贝，因此指示其它aad-12基因事件的潜在污染。此方案也可以用于检测污染性事件，其携带除了aad-12基因外的相同基因元件，诸如启动子或选择标志物序列或所有事件共同的任何其它相同的序列。后一种方法可以适用于测定接合性和/或各种性状但是在基因盒中具有相似元件的转基因事件的污染。
提供了用于检测植物及自其衍生的生物学样品中aad-12的试剂盒，其使用选自SEQ ID NO:1,2,4和/或5的引物和选自SEQ ID NO:3和6的探针。在扩增子与包含SEQ ID NO:3的探针杂交时，使用所述试剂盒生成的扩增子将生物学样品鉴定为含有aad-12事件。可以提供试剂盒作为特异性检测植物(或自其衍生的生物学样品)内aad-12事件的存在的手段或者可以提供试剂盒作为用于检测来自多种不同生物学样品的多种不同转基因事件的手段。在后一种情况(即用于检测多种不同转基因事件的试剂盒)中，试剂盒可以提供微阵列或任何种类的阵列形式的探针或引物，所述任何种类的阵列给所述试剂盒的用户提供区分转基因和非转基因样品之间的差异，转基因事件的接合性，甚至事件的存在或缺乏的能力，无论批准还是未批准用于商业化。使用此类试剂盒检测或评分某些事件的存在或缺乏可以通过荧光测定、比色、同位素、或化学发光手段进行。
本文中提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和公开以其不与本说明书的明确教导不一致的程度通过全文提述并入。
包括了下述实施例以说明供实践本发明的步骤，和阐明本发明的某些优选实施方案。这些实施例不应视为限制性的。本领域技术人员应理解下述实施例中公开的技术代表用于说明供其实践的优选模式的具体方法。然而，本领域技术人员根据本公开，应理解可在这些具体实施方案中进行许多变化，而仍旧获得相似或类似的结果，而不背离本发明的精神和范围。除非另行指明，所有百分比为重量百分比，而所有溶剂混合物比例为体积，除非另行指明。
实施例
事件特异性TAQMAN
开发为检测针对大豆中aad-12基因的MGB探针的存在以及测定育种群体中植物的接合性状态。对于大豆中aad-12基因的特异性检测，使用两种基因特异性引物扩增59bp DNA片段。通过在其5’端含有FAM报告物的靶物特异性MGB探针测量此PCR产物的扩增。针对不同水平的接合性的大豆事件和非转基因大豆以双重形式用大豆特异性内源参照基因GWS116测试此Taqman检测方法对大豆中的aad-12基因的特异性。
gDNA分离
使用Qiagen DNeasy96植物试剂盒提取基因组DNA。使用新鲜的大豆叶盘(每份样品8个)进行gDNA提取，其使用修改的Qiagen DNeasy96植物试剂盒方案进行。用Pico Green法依照厂家的说明书(Molecular Probes,Eugene,OR)量化gDNA。出于本研究的目的，将样品用无DNA酶水稀释，产生浓度1.2ng/μL。
Taqman测定法和结果
设计特异性Taqman引物和探针以经由Taqman测定法检测大豆中的aad-12基因。这些试剂可以与下文所列的条件一起使用以检测大豆内的aad-12基因。表1列出了明确为了检测大豆中的aad-12基因而开发的引物和探针序列。
表2中列出了用于扩增的多重PCR条件。将混合物移液到384孔板中，并使用下列条件扩增：i)50℃持续2分钟，ii)95℃持续10分钟，iii)95℃持续15秒，iv)60℃持续60秒，iv)将步骤iii-iv重复35个循环；v)4℃保持。实时PCR在BIO-RAD ICYCLERTM和ABI Gene Amp PCR System9700热循环仪上实施。数据分析基于循环阈值(Ct)的测量，所述循环阈值(Ct)是荧光测量达到设置数值的PCR循环数。Ct值由iCycler软甲自动计算。
标准的ΔΔCt法用于测试接合性呼叫(参见图1)。首先，计算ΔCt值，其是每个样品的事件特异性系统和参照系统的Ct值间的差。然后，随后计算ΔΔCt值，其是每个未知样品的ΔCt值和半合子对照的ΔCt值(或者若超过一个半合子对照，则为平均值)之间的差。每个未知样品的接合性(拷贝数)呼叫可以使用下述等式计算：
未知样品的拷贝数=2ΔΔCt
具有1左右的原始拷贝数的样品会是半合子，具有2左右的原始拷贝数的样品会是纯合的，且具有0左右的原始拷贝数的样品会是无效的。
用大豆野生型特异性引物作为参照基因以双重形式针对纯合的、半合子的、和无效的样品测试用于大豆中aad-12基因的Taqman检测方法。此测定法特异性检测大豆中的AAD12基因，并且不从对照生成或扩增任何假阳性结果。基因特异性引物和探针可以用于检测大豆中的aad-12基因，并且这些条件和试剂适用于接合性测定法。
Claims (20)
1.一种分离的引物或探针，其包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6。
2.一种分离的引物或探针，其由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6组成。
3.依照权利要求1或2的分离的探针，其中所述探针是标记的。
4.依照权利要求3的分离的探针，其中所述标记物是放射性同位素、荧光标记物、配体、化学发光剂或酶。
5.一种包含容器和组合物的试剂盒，所述组合物包含选自下组的核酸序列组合：
a)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3；
b)SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；
c)SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；
d)SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5；
e)SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3；
f)SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3；
g)SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6；
h)SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4；
i)SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5；
j)SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:6；
k)SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4；
l)SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:5；
m)SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:6；
n)SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；
o)SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5；或
p)SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6。
6.依照权利要求5的试剂盒，其中任何所述核酸序列是标记的。
7.依照权利要求6的试剂盒，其中所述标记物是放射性同位素、荧光标记物、配体、化学发光剂或酶。
8.一种测定大豆植物基因组DNA的接合性的方法，其包括(a)使生物学样品与SEQ ID NO:1和2的引物对接触，所述引物对在核酸扩增反应中与来自生物学样品的基因组DNA一起使用时生成第一扩增子，所述生物学样品含有来自含有事件pDAB4472-1606的大豆植物的生物学样品的基因组DNA，所述第一扩增子鉴定所述生物学样品的基因组DNA内的aad-12基因的存在；(b)实施核酸扩增反应；(c)检测生成的第一扩增子；(d)使相同样品与SEQ ID NO:4和5的第二引物对接触，所述第二引物对在核酸扩增反应中与含有来自大豆植物的基因组DNA的生物学样品一起使用时从引物组合生成扩增子，该扩增子鉴定与鉴定为事件pDAB4472-1606的转基因插入的大豆基因组区同源的野生型大豆基因组DNA；(e)实施核酸扩增反应，并(f)检测生成的第二扩增子；其中：(i)这两种扩增子的检出指示所述大豆样品在事件pDAB4472-1606方面是杂合的；(ii)仅所述第一扩增子(鉴定aad-12基因的存在)的检出指示所述生物学样品在事件pDAB4472-1606方面是纯合的；且(iii)仅所述第二扩增子的检出指示所述生物学样品内缺乏事件pDAB4472-1606。
9.依照权利要求8的方法，其中用包含SEQ ID NO:3的探针检测所述第一扩增子，并且用包含SEQ ID NO:6的探针检测所述第二扩增子。
10.一种检测生物学样品中与事件pDAB4472-1606对应的DNA的存在的方法，其包括：
(a)使所述生物学样品与引物组接触，所述引物组在核酸扩增反应中与自一种或多种含有事件pDAB4472-1606的大豆植物获得的基因组DNA一起使用时生成将所述植物鉴定为含有事件pDAB4472-1606的植物的扩增子；
(b)实施核酸扩增反应，由此生成所述扩增子；并
(c)检测所述扩增子，其中所述扩增子的检出指示与事件pDAB4472-1606对应的DNA的存在。
11.一种检测生物学样品中与事件pDAB4472-1606对应的DNA的存在的方法，其包括：
(a)使所述生物学样品与探针接触，所述探针在严格杂交条件下与来自含有事件pDAB4472-1606的大豆植物的基因组DNA杂交，并且在所述严格杂交条件下不与对照大豆植物杂交；
(b)使所述生物学样品和探针受到严格杂交条件处理；并
(c)检测所述探针与含有事件pDAB4472-1606的DNA的杂交，其中此类杂交的检出指示所述植物基因组内与事件pDAB4472-1606对应的DNA的存在。
12.依照权利要求10或11中任一项的方法，其中所述探针包含SEQ IDNO:3。
13.一种扩增生物学样品中的核酸以鉴定大豆植物基因组内的事件pDAB4472-1606存在的方法，其包括：
(a)使生物学样品与SEQ ID NO:1和2的引物对接触，所述引物对在核酸扩增反应中与来自生物学样品的基因组DNA一起使用时生成扩增子，所述生物学样品含有来自含有事件pDAB4472-1606的大豆植物的生物学样品的基因组DNA，所述扩增子鉴定所述生物学样品的基因组DNA内的aad-12基因的存在；(b)实施核酸扩增反应；并(c)检测通过所述扩增反应生成的扩增子，其中所述扩增子的检出指示所述生物学样品含有所述aad-12基因。
14.依照权利要求13的方法，其中用包含SEQ ID NO:3的探针检测所述扩增子。
15.依照权利要求8、10、11或13中任一项的方法，其中所述生物学样品包括大豆细胞、大豆组织、大豆茎、大豆根、大豆叶、大豆花或其部分、大豆种子、大豆豆荚或其任何组合。
16.依照权利要求9、12或14中任一项的方法，其中所述探针是标记的。
17.依照权利要求16的方法，其中所述探针用放射性同位素、荧光标记物、配体、化学发光剂或酶标记。
18.一种包含缓冲液和选自下组的核酸序列组合的组合物：
a)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3；
b)SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；
c)SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；
d)SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5；
e)SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3；
f)SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3；
g)SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6；
h)SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4；
i)SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5；
j)SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:6；
k)SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4；
l)SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:5；
m)SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:6；
n)SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；
o)SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5；或
p)SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6。
19.依照权利要求18的组合物，其中至少一种所述核酸分子用放射性同位素或荧光标记物或配体或化学发光剂或酶标记。
20.一种用于检测重组植物中的污染性事件的方法，其包括：(a)使重组植物DNA样品与第一引物对接触，所述重组植物DNA样品由含有与基因组DNA连续连接的转基因的DNA片段组成，所述第一引物对与所述含有与基因组DNA连续连接的转基因的DNA片段杂交；(b)实施核酸扩增反应；(c)生成第一扩增子，所述第一扩增子由所述含有与基因组DNA连续连接的转基因的DNA片段组成；(d)检测所述第一扩增子；(e)使所述重组植物DNA样品与第二引物对接触，所述重组植物DNA样品由含有天然纯合基因的DNA片段组成，所述第二引物对与所述含有天然纯合基因的DNA片段杂交；(f)实施核酸扩增反应；(g)生成第二扩增子，所述第二扩增子由所述天然纯合基因组成；(h)检测所述第二扩增子；(i)确定来自所述第一和第二扩增子的信号强度大致相等，其中所述第一和第二扩增子的相等信号强度指示污染性事件的缺乏；(j)使所述重组植物DNA样品与第三引物对接触，所述重组植物DNA样品由含有转基因的DNA片段组成，所述第三引物对与所述含有转基因的DNA片段杂交；(k)实施核酸扩增反应；(l)生成由所述转基因组成的第三扩增子；(m)检测所述第三扩增子，并(n)确定第一和第三扩增子的信号强度大致相等，其中所述第一和第三扩增子的相等信号强度指示污染性事件的缺乏。
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