JP6145102B2 - 植物におけるアリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ遺伝子(aad−12)を検出するための材料および方法 - Google Patents
植物におけるアリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ遺伝子(aad−12)を検出するための材料および方法 Download PDFInfo
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Description
本願は、2011年10月18日に出願された米国仮特許出願第61/548,543号の利益を主張する。
Qiagen DNeasy 96 Plant Kitを使用して、ゲノムDNAを抽出した。新鮮なダイズの葉の円盤状物(1サンプルあたり8つ)を、改変されたQiagen DNeasy 96 Plant Kitプロトコルを使用するgDNA抽出のために使用した。Pico Green法を製造供給元の指示書(Molecular Probes,Eugene,OR)に従って用いて、gDNAを定量した。サンプルをDNaseフリー水で希釈して、本研究の目的のために1.2ng/μLの濃度を得た。
Taqmanアッセイによってダイズにおけるaad−12遺伝子を検出するための特異的なTaqmanプライマーおよびプローブをデザインした。これらの試薬を下記に列挙される条件とともに使用することにより、ダイズ内のaad−12遺伝子を検出することができる。表1は、ダイズにおけるaad−12遺伝子の検出のために特異的に開発されたプライマー配列およびプローブ配列を列挙している。
未知サンプルのコピー数=2ΔΔCt
を使用して、各未知サンプルの接合状態(コピー数)のコールを計算することができる。およそ1という生のコピー数を有するサンプルは、ヘミ接合であり、2は、ホモ接合であり、0は、ヌル(null)である。
本願は以下の発明に係るものである。
(1)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5または配列番号6を含む、単離されたプライマーまたはプローブ。
(2)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5または配列番号6からなる、単離されたプライマーまたはプローブ。
(3)標識されている、上記(1)または(2)に記載の単離されたプローブ。
(4)前記標識が、放射性同位体、蛍光標識、リガンド、化学発光物質または酵素である、上記(3)に記載の単離されたプローブ。
(5)容器、ならびに:
a)配列番号1、配列番号2および配列番号3;
b)配列番号4、配列番号5および配列番号6;
c)配列番号1および配列番号2;
d)配列番号4および配列番号5;
e)配列番号1および配列番号3;
f)配列番号2および配列番号3;
g)配列番号4および配列番号6;
h)配列番号1および配列番号4;
i)配列番号1および配列番号5;
j)配列番号1および配列番号6;
k)配列番号2および配列番号4;
l)配列番号2および配列番号5;
m)配列番号2および配列番号6;
n)配列番号3および配列番号4;
o)配列番号3および配列番号5;または
p)配列番号3および配列番号6
から選択される核酸配列の組み合わせを含む組成物を備える、キット。
(6)前記核酸配列のいずれかが標識されている、上記(5)に記載のキット。
(7)前記標識が、放射性同位体、蛍光標識、リガンド、化学発光物質または酵素である、上記(6)に記載のキット。
(8)ダイズ植物ゲノムのDNAの接合状態を判定する方法であって、(a)イベントpDAB4472−1606を含むダイズ植物由来の生物学的サンプル由来のゲノムDNAを含む生物学的サンプル由来のゲノムDNAを用いる核酸増幅反応において使用されたとき、該生物学的サンプルのゲノムDNA内のaad−12遺伝子の存在を識別する第1アンプリコンを生成する配列番号1および2のプライマー対と該生物学的サンプルを接触させる工程;(b)核酸増幅反応を行う工程;(c)生成された第1アンプリコンを検出する工程;(d)ダイズ植物由来のゲノムDNAを含む生物学的サンプルを用いる核酸増幅反応において使用されたとき、イベントpDAB4472−1606として識別される導入遺伝子挿入のダイズゲノム領域に相同な野生型ダイズゲノムDNAを識別するプライマーの組み合わせからアンプリコンを生成する配列番号4および5の第2プライマー対と、同じサンプルを接触させる工程;(e)核酸増幅反応を行う工程、および(f)生成された第2アンプリコンを検出する工程を包含し;ここで:(i)両方のアンプリコンの検出は、該ダイズサンプルがイベントpDAB4472−1606についてヘテロ接合であることを示唆し;(ii)前記第1アンプリコン(aad−12遺伝子の存在を識別する)のみの検出は、該生物学的サンプルが、イベントpDAB4472−1606についてホモ接合であることを示唆し;(iii)前記第2アンプリコンのみの検出は、該生物学的サンプル内にイベントpDAB4472−1606が存在しないことを示唆する、方法。
(9)前記第1アンプリコンが、配列番号3を含むプローブを用いて検出され、前記第2アンプリコンが、配列番号6を含むプローブを用いて検出される、上記(8に記載の方法。
(10)生物学的サンプル中のイベントpDAB4472−1606に対応するDNAの存在を検出する方法であって、
(a)イベントpDAB4472−1606を含む1つまたはそれ以上のダイズ植物から得られたゲノムDNAを用いる核酸増幅反応において使用されたとき、該植物を、イベントpDAB4472−1606を含むと識別するアンプリコンを生成するプライマーセットと該生物学的サンプルを接触させる工程;
(b)核酸増幅反応を行い、それにより、該アンプリコンを生成する工程;および
(c)該アンプリコンを検出する工程であって、前記アンプリコンの検出は、イベントpDAB4472−1606に対応するDNAが存在することを示唆する、工程
を包含する、方法。
(11)生物学的サンプル中のイベントpDAB4472−1606に対応するDNAの存在を検出する方法であって、
(a)イベントpDAB4472−1606を含むダイズ植物由来のゲノムDNAとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下においてハイブリダイズし、かつコントロールダイズ植物とはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下においてハイブリダイズしないプローブと該生物学的サンプルを接触させる工程;
(b)該生物学的サンプルおよびプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供する工程;および
(c)イベントpDAB4472−1606を含むDNAへの該プローブのハイブリダイゼーションを検出する工程であって、ここで、そのようなハイブリダイゼーションの検出は、該植物のゲノム内にイベントpDAB4472−1606に対応するDNAが存在することを示唆する、工程
を包含する、方法。
(12)前記プローブが、配列番号3を含む、上記(10)または(11)のいずれかに記載の方法。
(13)ダイズ植物のゲノム内のイベントpDAB4472−1606の存在を識別するために生物学的サンプル中の核酸を増幅する方法であって、
(a)イベントpDAB4472−1606を含むダイズ植物由来の生物学的サンプル由来のゲノムDNAを含む生物学的サンプル由来のゲノムDNAを用いる核酸増幅反応において使用されたとき、該生物学的サンプルのゲノムDNA内のaad−12遺伝子の存在を識別するを生成する配列番号1および2のプライマー対と該生物学的サンプルを接触させる工程;(b)核酸増幅反応を行う工程;および(c)前記増幅反応によって生成されたアンプリコンを検出する工程であって、前記アンプリコンの検出は、該生物学的サンプルがaad−12遺伝子を含むことを示唆する、工程を包含する、方法。
(14)前記アンプリコンが、配列番号3を含むプローブを用いて検出される、上記(13)に記載の方法。
(15)前記生物学的サンプルが、ダイズの細胞、ダイズの組織、ダイズの茎、ダイズの根、ダイズの葉、ダイズの花もしくはその一部、ダイズの種子、ダイズの莢またはそれらの任意の組み合わせを含む、上記(8)、(10)、(11)または(13)のいずれかに記載の方法。
(16)前記プローブが、標識されている、上記(9)、(12)または(14)のいずれかに記載の方法。
(17)前記プローブが、放射性同位体、蛍光標識、リガンド、化学発光物質または酵素で標識されている、上記(16)に記載の方法。
(18)バッファー、ならびに
a)配列番号1、配列番号2および配列番号3;
b)配列番号4、配列番号5および配列番号6;
c)配列番号1および配列番号2;
d)配列番号4および配列番号5;
e)配列番号1および配列番号3;
f)配列番号2および配列番号3;
g)配列番号4および配列番号6;
h)配列番号1および配列番号4;
i)配列番号1および配列番号5;
j)配列番号1および配列番号6;
k)配列番号2および配列番号4;
l)配列番号2および配列番号5;
m)配列番号2および配列番号6;
n)配列番号3および配列番号4;
o)配列番号3および配列番号5;または
p)配列番号3および配列番号6
から選択される核酸配列の組み合わせを含む、組成物。
(19)前記核酸分子の少なくとも1つが、放射性同位体または蛍光標識またはリガンドまたは化学発光物質または酵素で標識されている、上記(18)に記載の組成物。
(20)組換え植物における混入イベントを判定するための方法であって、(a)ゲノムDNAに隣接して連結された導入遺伝子を含むDNAフラグメントからなる組換え植物DNAサンプルを、ゲノムDNAに隣接して連結された導入遺伝子を含む前記DNAフラグメントにハイブリダイズする第1プライマー対と接触させる工程、(b)核酸増幅反応を行う工程;(c)ゲノムDNAに隣接して連結された導入遺伝子を含む前記DNAフラグメントからなる第1アンプリコンを生成する工程;(d)該第1アンプリコンを検出する工程;(e)天然のホモ接合遺伝子を含むDNAフラグメントからなる前記組換え植物DNAサンプルを、天然のホモ接合遺伝子を含む前記DNAフラグメントとハイブリダイズする第2プライマー対と接触させる工程;(f)核酸増幅反応を行う工程;(g)前記天然のホモ接合遺伝子からなる第2アンプリコンを生成する工程;(h)該第2アンプリコンを検出する工程;(i)前記第1および第2アンプリコンからのシグナル強度がほぼ等しいことを判定する工程であって、ここで、該第1および第2アンプリコンの等しいシグナル強度は、混入イベントが存在しないことを示唆する、工程;(j)導入遺伝子を含むDNAフラグメントからなる前記組換え植物DNAサンプルを、導入遺伝子を含む前記DNAフラグメントとハイブリダイズする第3プライマー対と接触させる工程;(k)核酸増幅反応を行う工程;(l)前記導入遺伝子からなる第3アンプリコンを生成する工程;(m)該第3アンプリコンを検出する工程、および;(n)第1および第3アンプリコンのシグナル強度がほぼ等しいことを判定する工程であって、ここで、該第1および第3アンプリコンの等しいシグナル強度は、混入イベントが存在しないことを示唆する、工程を包含する、方法。
Claims (11)
- a)配列番号1、配列番号2、および配列番号3;または
b)配列番号4、配列番号5および配列番号6
の各核酸配列からなる核酸を含む、プライマーおよびプローブの組み合わせであって、
配列番号3または配列番号6の核酸配列からなる核酸は、必要に応じて標識されるプローブである、
プライマーおよびプローブの組み合わせ。 - 配列番号3および/または配列番号6の核酸配列からなるプローブが、放射性同位体、蛍光標識、リガンド、化学発光物質または酵素で標識されている、請求項1に記載のプライマーおよびプローブの組み合わせ。
- 容器、および、請求項1または2に記載のプライマーおよびプローブの組み合わせを含む、キット。
- ダイズ植物ゲノムのDNAの接合状態を判定する方法であって、
(a)イベントpDAB4472−1606を含むダイズ植物由来の生物学的サンプル由来のゲノムDNAを含む生物学的サンプル由来のゲノムDNAを用いる核酸増幅反応において使用されたとき、該生物学的サンプルのゲノムDNA内のaad−12遺伝子の存在を識別する第1アンプリコンを生成する配列番号1および2からなるプライマー対と該生物学的サンプルを接触させる工程;
(b)核酸増幅反応を行う工程;
(c)生成された第1アンプリコンを検出する工程;
(d)ダイズ植物由来のゲノムDNAを含む生物学的サンプルを用いる核酸増幅反応において使用されたとき、イベントpDAB4472−1606として識別される導入遺伝子挿入のダイズゲノム領域に相同な野生型ダイズゲノムDNAを識別するプライマーの組み合わせからアンプリコンを生成する配列番号4および5からなる第2プライマー対と、同じサンプルを接触させる工程;(e)核酸増幅反応を行う工程、および
(f)生成された第2アンプリコンを検出する工程を包含し;ここで:
(i)両方のアンプリコンの検出は、該ダイズサンプルがイベントpDAB4472−1606についてヘテロ接合であることを示唆し;
(ii)前記第1アンプリコン(aad−12遺伝子の存在を識別する)のみの検出は、該生物学的サンプルが、イベントpDAB4472−1606についてホモ接合であることを示唆し;
(iii)前記第2アンプリコンのみの検出は、該生物学的サンプル内にイベントpDAB4472−1606が存在しないことを示唆する、方法。 - 前記第1アンプリコンが、必要に応じて標識される配列番号3の核酸配列からなるプローブを用いて検出され、前記第2アンプリコンが、必要に応じて標識される配列番号6からなるプローブを用いて検出される、請求項4に記載の方法。
- 生物学的サンプル中のイベントpDAB4472−1606に対応するDNAの存在を検出する方法であって、
(a)イベントpDAB4472−1606を含む1つまたはそれ以上のダイズ植物から得られたゲノムDNAを用いる核酸増幅反応において使用されたとき、該植物を、
イベントpDAB4472−1606を含むと識別するアンプリコンを生成する請求項1または2に記載のプライマーおよびプローブの組み合わせと該生物学的サンプルを接触させる工程;
(b)核酸増幅反応を行い、それにより、該アンプリコンを生成する工程;および (c)工程(b)で生成された該アンプリコンを前記プローブおよびプローブの組み合わせのプライマーにより検出する工程であって、前記アンプリコンの検出は、イベントpDAB4472−1606に対応するDNAが存在することを示唆する、工程を包含する、方法。 - 生物学的サンプル中のイベントpDAB4472−1606に対応するDNAの存在を検出する方法であって、
(a)イベントpDAB4472−1606を含むダイズ植物由来のゲノムDNAとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下においてハイブリダイズし、かつコントロールダイズ植物とはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下においてハイブリダイズしない配列番号3の核酸配列からなるプローブと該生物学的サンプルを接触させる工程;
(b)該生物学的サンプルおよびプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供する工程;および
(c)イベントpDAB4472−1606を含むDNAへの該プローブのハイブリダイゼーションを検出する工程であって、ここで、そのようなハイブリダイゼーションの検出は、該植物のゲノム内にイベントpDAB4472−1606に対応するDNAが存在することを示唆する、工程を包含する、方法。 - ダイズ植物のゲノム内のイベントpDAB4472−1606の存在を識別するために生物学的サンプル中の核酸を増幅する方法であって、
(a)イベントpDAB4472−1606を含むダイズ植物由来の生物学的サンプル由来のゲノムDNAを含む生物学的サンプル由来のゲノムDNAを用いる核酸増幅反応において使用されたとき、該生物学的サンプルのゲノムDNA内のaad−12遺伝子の存在を識別するアンプリコンを生成する配列番号1および2のプライマー対からなる該生物学的サンプルを接触させる工程;
(b)核酸増幅反応を行う工程;および
(c)必要に応じて標識される配列番号3の核酸配列からなるプローブを用いて前記増幅反応によって生成されたアンプリコンを検出する工程であって、前記アンプリコンの検出は、該生物学的サンプルがaad−12遺伝子を含むことを示唆する、工程
を包含する、方法。 - 前記生物学的サンプルが、ダイズの細胞、ダイズの組織、ダイズの茎、ダイズの根、ダイズの葉、ダイズの花もしくはその一部、ダイズの種子、ダイズの莢またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項4〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プローブが、標識されている、請求項5または8に記載の方法。
- 前記プローブが、放射性同位体、蛍光標識、リガンド、化学発光物質または酵素で標識されている、請求項10に記載の方法。
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