BR112014009264A2 - materiais e métodos para detectar o gene arilóxialcanoato dioxigenase (aad -12) em plantas - Google Patents

Abstract

materiais e métodos para detectar o gene arilóxialcanoato dioxigenase (aad-12) em plantas. a presente invenção refere-se a materiais e métodos para a detecção de eventos do gene aad-12 em amostras biológicas derivadas a partir de plantas recombinantes e materiais e métodos para a detecção de eventos contaminantes em amostras derivadas a partir de plantas recombinantes.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MATE- RIAIS E MÉTODOS PARA DETECTAR O GENE ARILÓXIALCANO- ATO DIOXIGENASE (AAD -12) EM PLANTAS". REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS DE PATENTE RELACIONA-

DOS

[001] Este Pedido de Patente reivindica os benefícios do Pedido de Patente Provisório U.S. Serial Nº 61/548.543, depositado em 18 de outubro de 2011.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] A soja é uma lavoura importante e é uma fonte primária de alimento em muitas áreas do mundo. Os métodos de biotecnologia tem sido aplicados aos grãos de soja para a melhoria das característi- cas agronômicas e a qualidade do produto. Os exemplos de caracte- rísticas agronômicas introduzidas nas plantas de soja incluem a resis- tência a herbicidas e a resistência a insetos.

[003] O gene aad-12 (originalmente a partir da Delftia acidovo- rans) codifica a proteína ariloxialcanoato dioxzigenase (AAS-112). Es- se gene confere tolerância ao ácido 2,4-diclorofenóxi acético, por e- xemplo, a aos herbicidas de acetato de piridilóxi. O gene aad-12, ele próprio, para a introdução de tolerância a herbicida em plantas foi des- crito na WO 2007/053428.

[004] A expressão de genes heterólogos ou genes estranhos (transgenes) em plantas é influenciada por onde o gene estranho é inserido no cromossomo. Isto poderia, por exemplo, ser devido à estru- turada cromatina (como por exemplo, heterocromatina) ou a proximi- dade dos elementos de regulação de transcrição (como, por exemplo, intensificadores) próximos do local de integração (Weising e outros., Ann. Rev. Genet 22:421-477, 1988). Dessa forma o mesmo gene no mesmo tipo de planta transgênica (ou outro organismo) pode exibir uma ampla variação no nível d expressão entre eventos diferente.

Também pode haver diferenças em padrões de expressão espaciais ou temporais. Por exemplo, as diferenças na expressão relativa de um transgene em vários tecidos de plantas pode não corresponder ao pa- drão esperado a partir de elementos reguladores da transcrição pre- sentes no construto de gene introduzido dentro da planta.

[005] Desse modo, um grande número de eventos é quase sem- pre criado e submetido à triagem com a finalidade de identificar um evento que expresse um gene de interesse introduzido em um nível satisfatório com relação à duma determinada finalidade. Para finalida- des comerciais, é comum a produção de centenas de milhares de dife- rentes eventos e para submeter esses eventos à triagem com relação para um único evento que tenha os níveis e padrões de expressão do transgene desejados. Um evento que tenha níveis e / ou padrões de expressão do transgene desejados é útil para introgressão do transge- neem outras origens genéticas através de cruzamento sexual com a utilização de métodos de reprodução convencionais. A progênie de tais cruzamentos mantém as características de expressão do transge- ne do transformante original. Essa estratégia é usada apara assegurar uma expressão confiável do gene em uma quantidade de variedades que estejam bem adaptadas às condições de crescimento local.

[006] Seria vantajoso ser capas de detectar a presença de um transgene e/ou de um DNA genômico de uma planta específica com a finalidade da determinação de se a progênie de um cruzamento sexual contém o transgene e/ou o DNA genômico de interesse. Alem disso, um método para a detecção da presença do transgene e/ou do DNA genômico em uma planta especifica poderia ser de auxilio quando es- tando de acordo com os regulações que requerem a aprovação prévia do mercado e da etiquetagem de alimentos derivados a partir de plan- tas de plantações recombinantes.

[007] É possível detectar a presença de um transgene através de qualquer método de detecção de ácido nucleico bem conhecido. Os exemplos incluem a reação em cadeia de polimerase (PCR) ou a hi- bridização do DNA com a utilização de sondas de ácido nucleico. Es- ses métodos de detecção em geral se focalizam nos elementos gené- ticos usados com frequência, tais como genes promotores, terminado- res, marcadores ou outros elementos genéticos usados comumente. Esses métodos podem não ser utilizáveis com relação à descrimina- ção entre os eventos diferentes, especificamente aqueles eventos pro- duzidos com a utilização do mesmo construto de DNA a não ser que a sequência de DNA adjacente a do DNA inserido ("DNA flanqueado") seja conhecida.

[008] Também é importante ser capaz de determinar a zigozida- de de um evento transgênico em plantas para reprodução, introgres- são de característica e finalidades de pureza. Com relação às razões de regulação e da qualidade de sementes, também é vantajoso ser capaz de detectar de forma rápida a presença de genes aad-12 mistu- rados (intencional ou não intencional) em materiais de plantas de soja.

BREVE RESUMO DA INVENÇÃO

[009] A presente invenção refere-se à detecção de evento do gene aad-12 em amostras biológicas. A presente invenção proporcio- na métodos para a identificação de plantas manipuladas de forma ge- nética que tenham um DNA genômico (gDNA) que contenha um ou mais eventos de aad-12. Os métodos de análise descritos nesta paten- te são específicos para o gene aad-12, não específicos para eventos, eé para detectar e opcionalmente determinar a zigosidade de qual- quer evento do gene aad-12. A invenção é capaz de determinara con- taminação de eventos de aad-12 não intencionais com relação a um aad-12 especifico através da análise do número de copias do transge- ne.

[0010] Dessa forma, um aspecto da presente invenção proporcio-

na análises para detectar a presença de um transgene aad-12 em uma amostra biológica (de grãos de soja, por exemplo). As análises podem ser baseadas na sequência de DNA do construto recombinante inseri- do dentro do genoma do grão de soja. Também são providos kits e condições úteis para a análise.

[0011] A presente invenção refere-se às sequências de ácido nu- cleico útil com relação à clonagem e a análise de sequências de DNA relacionadas com o gene aad-12. Determinadas modalidades desse aspecto da invenção proporcionam iniciadores específicos para o gene paraa detecção de aad-12 e de ampliações PCR gerada com esses conjuntos de iniciadores específicos para o gene. Dessa forma, esses e outros procedimentos relacionados podem ser úteis para a identifi- cação de plantas que contenham o gene aad-12.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

[0012] Figura 1. Análise especifica para gene com relação ao e- vento 416 do aad-12. O agrupamento superior de pontos escuros re- presenta as leituras fluorescentes a partir de amostras de grãos de so- ja homozigóticos com relação ao aad-12. O agrupamento mais claro de pontos no meio representa as leituras fluorescentes a partir de a- mostras de grãos de soja homozigóticos com relação ao aad-12. O agrupamento mais baixo de pontos representa as leituras fluorescen- tes com relação a partir de amostras de grãos de soja naturais negati- vos com relação a um evento de aad-12.

[0013] Figura 2. Análise específica para gene com relação ao e- vento 4406 do aad-12. O agrupamento superior de pontos escuros re- presenta as leituras fluorescentes a partir de amostras de grãos de so- ja homozigóticos com relação ao aad-12. O agrupamento mais claro de pontos no meio representa as leituras fluorescentes a partir de a- mostras de grãos de soja homozigóticos com relação ao aad-12. O agrupamento mais baixo de pontos representa as leituras fluorescen-

tes com relação a partir de amostras de grãos de soja naturais negati- vos com relação a um evento de aad-12.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0014] A introdução e a integração de um transgene dentro de um genoma de uma planta envolvem eventos aleatórios (por esse motivo o nome "evento" para uma determinada inserção que é expressa) e, com relação às muitas técnicas de transformação tais como a trans- formação da Agrobacterium, transformação de "canhão de genes" e WHISKERS, não é previsível quando um transgene se tornará inserido nogenoma de uma planta.

[0015] Pelo menos 2500 sementes de uma linha de grãos de soja que compreende tal evento do gene aad-12, pDAB4472-1606, foram depositados e disponibilizados ao público sem restrições (mas sujeitos a direitos de patente), com a American Type Culture Collection

15. (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110. O deposi- to foi designado como ATCC Deposit No. PTA-11028 tendo uma data de deposito de 10 de junho de 2010. Esse depósito foi feito e será mantido de acordo com e sob os termos do Tratado de Budapeste com relação aos depósitos de sementes para as finalidades de procedi- mentos de patente. O deposito será mantido sem restrição no deposi- tário ATCC, que é um depositário público, durante um período de 30 anos ou de cinco anos depois do requerimento mais recente, com du- rante a duração efetiva da patente, qual seja o mais longo, e será substituído de se tornar não viável durante esse período.

[0016] Aqui, neste pedido de patente são providos definições e exemplos para auxiliar na descrição da presente invenção e para guiar aquelas pessoas versados na técnica para a prática da invenção. À não ser que indicados de outra forma, os termos são para serem en- tendidos de acordo com a utilização convencional por aquelas pessoas versadas na técnica relevante.

[0017] Uma "amostra biológica" pode compreender qualquer mate- rial orgânico derivado a partir de células ou de tecidos de grãos de so- ja, incluindo, caules, raízes, flores ou partes de flores, sementes ou vagens de sementes e os semelhantes, que contenham uma quanti- dade detectável de uma sequência de nucleotídeos que corresponda a essa material orgânico.

[0018] Uma "sonda" é um ácido nucleico isolado ao qual é ligado um marcador ou uma molécula repórter convencional detectável, como por exemplo, um isótopo radioativo, um fosforono, ligante, um agente químico luminescente ou uma enzima. Tal sonda é complementar a um filamento de um acido nucleico objetivado, no caso da presente invenção, a um filamento de um DNA recombinante que codifica o ge- ne aad-12. As sondas de acordo com a presente invenção incluem não só os ácidos desoxirribonuclêicos ou ribonucléicos porem também as poliamidas e outros materiais de sonda que se liguem especificamente ao uma sequência de DNA alvo e essa ligação pode ser usada para detectar a presença daquela sequência de DNA.

[0019] Os "iniciadores" são ácidos nucléicos isolados que são temperados com relação a um filamento alvo de DNA a uma cadeia complementar através de hibridização de ácido nucleico para a forma- ção de um híbrido entre o iniciador e a cadeia de DNA alvo, e em se- guida de prolongando ao longo da cadeia de DNA alvo através de uma polimerase, por exemplo, uma polimerase de DNA. Os pares de inicia- dores da presente invenção se referem à utilização dos mesmos para a amplificação de uma sequência de ácido nucleico alvo, como por e- xemplo, através da reação em cadeia de polimerase (PCR) ou outros métodos de amplificação de ácido nucleico convencionais.

[0020] As sondas e os iniciadores são em geral de 11 a 30 nucleo- tídeos ou mais de comprimento, Em determinados casos, as sondas e os iniciadores podem ter comprimentos de mais do que 30 nucleotí-

deos. Sem levar em conta o tamanho, as sondas e os iniciadores po- dem se hibridizar especificamente a uma sequência alvo, sob condi- ções de hibridização de elevado rigor. De preferência, as sondas e os iniciadores de acordo com a presente invenção tem similaridade de sequência completa com a sequência alvo, embora as sondas que são diferentes da sequência alvo e que retêm a capacidade para se hibri- dizar com sequências alvo possam ser designadas através de méto- dos convencionais.

[0021] Na forma usada aqui, neste pedido de patente, "progênie" indica a prole de qualquer geração de uma planta de origem que com- preenda (ou que contenha) um evento aad-12.

[0022] Um "evento" transgênico é produzido através da transfor- mação de células de plantas com DNA heterólogo, isto é, um construto de um ácido nucleico que inclui um transgene de interesse, regenera- çãode uma população de plantas resultante da inserção do transgene dento do genoma da planta, e a seleção de uma planta especifica ca- racterizada através da inserção dentro da localização de um genoma especifico. O termo "evento" se refere ao transformante original e a progênie do transformante que inclui o DMA heterólogo. O Termo "e- vento" também se refere à progênie produzida através de um cruza- mento sexual entre o transformante e outra variedade que inclui o DNA genômico/ transgênico. Mesmo depois de retro cruzamentos repetidos com relação a uma origem recorrente, o DNA transgene inserido e o DNA genômico flanqueador (DNA genômico/ transgênico) a partir da origem transformada está presente na progênie do cruzamento a mesma locação cromossômica. O termo "evento" também se refere ao DNA a partir do transformante original e a progênie do mesmo que compreende o DNA inserido e a sequência de DNA flanqueadora ime- diatamente adjacente ao DNA inserido que poderia ser esperado em ser transformado para uma progênie que receba DNA inserido que in-

clua o transgene de interesse como o resultado de um cruzamento se- xual de uma linha de origem que inclua o DNA inserido (como por e- xemplo, o transformante original e a progênie que resulta a partir da autofecundação) e uma linha e origem que não contenha o DNA inse- rido.

[0023] Como discutido acima, um aspecto da invenção se relacio- na à identificação do transgene aad-12. Os iniciadores e produtos de ampliação PCR relacionados estão incluídos na invenção. De acordo com a presente invenção, os métodos de PCR analítico com a utiliza- ção de produtos da ampliação que estendem o DNA inserido podem ser utilizados para detectar ou identificar as variedades de plantas transgênicas comercializadas ou linhas derivadas a partir de plantas transgênicas proprietárias que contenham um evento aad-12. Dessa forma, varias modalidades da invenção proporcionam iniciadores com- preendendo as SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 ou as diversas combinações das mesmas que compreendem as SEQ ID NO; 3, SEQ ID NO:6 “ou ambas as SEQ ID Nos: 3 e”. SEQID NO:6.

[0024] As técnicas de detecção descritas aqui, neste pedido de patente são úteis, em conjunto com a cultivo de plantas para a identifi- cação da progênie de plantas que contenham um evento aad-12, de- pois de que, uma planta de origem que contenha o referido evento se- ja cruzada com outra linha de plantas em um esforço para conferir uma ou mais características adicionais de interesse na progênie. Es- ses métodos de análises por PCR incluem beneficiam os programas de cultivo de plantas bem como um controle de qualidade, especial- mente com relação a sementes transgênicas comercializadas e tam- bém podem beneficiar o registro do produto e o manejo do produto.

[0025] Uma pessoa versada na técnica também irá reconhecer que os iniciadores e as sondas podem ser projetados para se hibridi-

zarem, sob condições de uma faixa de hibridização padrão e/ou de PCR, incluindo condições nas quais a sonda ou o iniciador não sejam perfeitamente complementares a sequência exemplificada. Isto é, Isto é, um determinado grau de incompatibilidade pode ser tolerado. Com relação a um iniciador com cerca de 20 nucleotídeos, por exemplo, tipicamente um ou dois ou mais nucleotídeos não precisam de se hi- bridizar com o filamento oposto, se a base incompatível é interna ou no final do iniciador que seja oposto à dos produtos da amplificação. Várias condições de hibridação adequadas são providas abaixo. Além disso, análogos de nucleotídeos sintéticos, tais como a inosina, tam- bém podem ser utilizados em sondas. As sondas de peptídeo de acido nucleico (PNA), bem como as sondas de DNA e de e RNA, também podem ser utilizadas.

[0026] São providas composições para detectar a presença do e- vento pDAB4472-1606. Essas composições compreendem os iniciado- res específicos para evento, tais como a SEQ ID NO: 1 e/ou a SEQ ID NO: 2, e iniciadores que se hibridizam com o DNA comum com rela- ção ao genoma de tipo natural de plantas que não contêm evento o PDAB4472-1606 (SEQ ID NO: 4 e/ou SEQ ID NO: 5). A análise de PCR demonstrou que as linhas de grãos de soja que contem o evento PDAB4472-1606 podem ser identificadas através de análise com pro- dutos de amplificação de PCR gerados com esses conjuntos de inicia- dores específicos para o evento (SEQ ID Nos: 1 e 2). Esses e outros procedimentos relacionados podem ser usados para identificar unica- mente essas linhas de grãos de soja que contém o evento pDAB4472-

1606. Desse modo, os produto de amplificação de PCR a partir de tais iniciadores e que podem ser usados para a identificação das linhas de grãos de soja que contenham o evento pDAB4472-1606 e a partir de outras modalidades da invenção divulgada.

[0027] Esta invenção também inclui métodos para a detecção da presença de DNA em uma a mostra, que compreenda material de planta que contenha o gene aad-12. Esses métodos podem compre- ender: (a) por em contato a amostra de planta que compreende o DNA com um conjunto de iniciadores que, quando usado em uma rea- çãode amplificação de um ácido nucleico com DND, produz um produ- to de amplificação que identifica uma sequência de aad-12 no interior da amostra; (b) realizando uma reação de amplificação de um ácido nucleico, produzindo por meio disso o produto da amplificação. e (c) detectando o produto da amplificação.

[0028] Outros métodos de detecção da presente invenção incluem um método para a detecção da presença de um DNA, em uma amos- tra que corresponda a sequência de codificação para o aad-12, em que o referido método compreende: (a) por em contato a amostra que compreende o DNA com uma sonda que se hibridize sob condições rígidas de hibridização com o DNA a partir do material de planta que contenha um evento aad-12 e que não se hibridiza sob condições rígi- das de hibridização com o material de planta a partir de uma planta de controle (uma planta que não contenha um evento aad-12); (b) subme- tendo a amostra e a sonda a condições rígidas de hibridização; e (c) detectando a hibridização da sonda ao DNA.

[0029] De acordo com outro aspecto da invenção, são providos métodos para a determinação de zigosidade da progênie de um cru- zamento com uma planta que contenha o evento pDAB4472- 1606. Esses métodos podem compreender por em contato uma amostra que compreende o DNA de um grão de soja com um conjunto de iniciador divulgado aqui, neste pedido de patente. Esses iniciadores, quando usados em uma reação de amplificação de um ácido nucleico com o DNA genômico a partir de uma planta que contenha o evento PDAB4472- 1606, produzem um primeiro produto de amplificação que identifica uma planta que contém um evento pDAB4472- 1606. Esses métodos ainda compreendem a realização de uma reação de amplifi- cação de um ácido nucleico, produzindo por meio disso o primeiro produto da amplificação; detectando o primeiro produto da amplifica- ção, e pondo em contato a amostra que compreende o DNA do grão de soja com outro conjunto de iniciadores que, quando usados em uma reação de amplificação de um ácido nucleico com o DNA genô- mico a partir de plantas de soja, produz um segundo produto de ampli- ficação que compreende o DNA genômico do grão de soja natural ho- mologo a região genômica do grão de soja. O método também pode ainda compreender a execução de uma reação de amplificação de um ácido nucleico para a produção de um segundo produto de amplifica- ção, detecção do segundo produto de amplificação e comparando o primeiro produto de amplificação e o segundo produto de amplificação em uma amostra. A presença de ambos os produtos de amplificação em uma amostra indica que a amostra é heterozigótica com relação a um evento pDAB4472- 1606.

[0030] Uma "sonda" é uma molécula de ácido nucleico isolado a qual está ligado uma molécula de marcação que pode ser detectada ou uma molécula reportes (tal como um isótopo radioativo, ligante, um agente químico luminescente ou enzima). As sondas descritas aqui, neste pedido de patente, incluem as SEQ ID Nos 3 e/ou 6. As sondas de acordo com a presente invenção incluem não somente os ácidos desoxirribonucléico ou ribonucléico porem também as poliamidas e outros materiais de sonda que se ligam especificamente a uma se- quênciade DNA alvo e que pode ser usada para detectar a presença daquela sequência de DNA alvo, O métodos para a preparação e a utilização de sondas e iniciadores estão descritos, por exemplo, em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook e outros., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.

[0031] Dependendo da aplicação podem ser usadas condições variáveis de hibridização para alcançar graus variáveis de seletividade da sonda na direção da sequência alvo. Para aplicações que exigem uma seletividade elevada, serão tipicamente empregadas condições rigorosas para a formação dos híbridos, como por exemplo, serão se- lecionadas condições relativamente baixas de sal e/ou de alta tempe- ratura, tais como providas através de cerca de 0,02 M até cerca de 0,15 M de NaCl em temperaturas de cerca de 50€T até cerca de 70C.

As condições rigorosas, por exemplo, podem envolver a lavagem do filtro de hibridização pelo menos duas vezes com um tampão e lava- gem de alta rigorosidade (0,2 X SSC. 0,1% SDS, 65 ). As condições rigorosas apropriadas que promovem a hibridização do DNA, por e- xemplo, 6.0 x cloreto de sódio/ citrato de sódio (SSC) a cerca de 45 seguidas por uma lavagem de 2,0 X de SSC a 50% são conhecidas daquelas pessoas versadas na técnica. Por exemplo, a concentração de sal na etapa de lavagem pode ser selecionada a partir de uma bai- xa rigorosidade de cerca de 2,0 X SSC a 50T até uma alta rigorosi- dade de cerca de 0,2 X SSc a 50T. Alem disso, a te mperatura na e- tapa de lavagem pode ser aumentada a partir de condições de baixa rigorosidade em temperatura ambiente de cerca de 22 até condi- ções de alta rigorosidade a cerca de 65º. Ambas a temperatura e o sal podem ser variadas, ou seja, a temperatura ou a concentração do sal podem ser mantidas constantes enquanto a outra variável é altera- da. Tais condições seletivas toleram pouco, se alguma, incompatibili- dade entre a sonda e o gabarito ou cadeia alvo. A detecção de se- quências de DNA através de hibridização é bem conhecida das pes- Soas versadas na técnica, e os ensinamentos das Patentes U. S. Nos.

4.965.188 e 5.176.995 são exemplares da analises dos métodos de hibridização. Em uma modalidade especifica, um iniciador ou sonda descrita aqui, neste pedido de patente, irá se hibridizar especificamen-

te ao DMNA genômico que contém o evento pDAB4472- 1606. A hi- bridização da sonda ou do iniciador para o DNA que contém o evento PDAB4472- 1606 podem ser detectada através de qualquer quantida- de de métodos conhecidos das pessoas versadas na técnica, esses métodos podem incluir porem não estão limitados a marcadores fluo- rescentes, marcadores radioativos, marcadores baseados em anticor- pos e marcadores químicos luminescentes.

[0032] Com relação à amplificação de uma sequência de ácido nucleico alvo (como por exemplo, através de PCR) com a utilização de um par de iniciadores de amplificação específicos, as "condições rigo- rosas" são condições que permitem que o par de iniciadores se hibridi- ze comente com a sequência de ácido nucleico alvo a qual um inicia- dor que tenha a sequência do tipo natural correspondente (ou o com- plemento da mesma) poderia se ligar e de preferência para a produção deum único produto da amplificação, o amplicon. A expressão "espe- cifico para (uma sequência alvo)" indica que uma sonda ou um inicia- dor se hibridiza sob condições rigorosas de hibridização somente com relação à sequência alvo em uma amostra que compreenda a sequên- cia alvo.

[0033] Na forma usada aqui, neste pedido de patente, "DNA ampli- ficado" ou um "amplicon" se refere ao produto da amplificação do áci- do nucleico de uma sequência de ácido nucleico alvo que faça parte de um gabarito de ácido nucleico. Por exemplo, para a determinação de se a planta de soja resultante de um cruzamento sexual contém o evento pDAB4472- 1606, no interior do seu genoma, o DNA extraído de um tecido da planta de soja pode ser submetido a um método de amplificação do ácido nucleico com a utilização de um par de iniciado- res descrito aqui, neste pedido de patente para a produção de um am- plicon que identifique a presença do evento pDAB4472- 1606. O am- plicon pode variar em comprimento a partir do comprimento combina-

do do par de iniciadores mais um par de base de nucleotídeo, e/ou o comprimento combinado do par de iniciadores mais cerca de 2,3,4,

5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,

25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42,43,

44,45,46,47,48,49,50,51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,

82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99,

100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113,

114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127,

128,129,130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155,

156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169,

170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183,

184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197,

198,199,200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225,

226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239,

240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253,

254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267,

268,269,270,271,272,273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295,

296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309,

310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323,

324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337,

338,339,340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365,

366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379,

380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393,

394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407,

408,409,410,411,412,413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421,

422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478,479,480,481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, ou 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000 ou mais pares de base de nucleotídeos (mais ou menos qualquer um dos incrementos relacionados acima). O uso do termo "amplicon" exclui especificamente os dímeros de iniciadores que podem ser formados na reação térmica de amplificação do DNA.

[0034] A amplificação de ácido nucleico pode ser conseguida atra- vés de qualquer um dos diversos métodos de amplificação de ácido nucleico conhecidos na técnica, incluindo a reação em cadeia de poli- merase (PCR). Uma variedade de métodos de amplificação é conheci- da na técnica e estão descritos, inter alia, nas Patentes U.S. No.

4.683.195 e Patente U. S. No. 4.683.202. Os métodos de amplificação por PCR foram desenvolvidos para a amplificação de até 22 kb de DNA genômico. Esses métodos bem como outros métodos conhecidos na técnica da amplificação de DNA podem ser usados na pratica da presente invenção. A sequência da inserção de DNA do transgene he- terólogo a partir de um evento de sujeitos de soja pode ser verificada (e corrigida, se necessário) através da amplificação de tais sequências a partir do evento utilizando iniciadores derivados a partir das sequên- cias providas aqui, neste pedido de patente, seguida por sequenciação de DNA padrão do produto de amplificação por PCR ou do DNA clo- nado. O produto de amplificação produzido através de tais métodos pode ser detectado através de uma pluralidade de técnicas. A eletrofo- rese sobre gel de agarose e o coloração com brometo de edítio é um método comum bastante conhecido para a detecção de produtos da amplificação de DNA.

[0035] TAQMAN (PE Applied Biosystems, Foster City, Califórnia) é um método para detectar e quantificar a presença de uma sequência de DNA. Em resumo,é designada uma sonda de oligonucleotídeo FRET que se hibridiza com uma sequência de interesse (como por e- xemplo,o gene aad-12 ou um gene natural do genoma do grão de so- ja). A sonda FRET e os iniciadores de PCR são ciclados na presença de uma polimerase termo estável e de dNTPs. Durante a amplificação especifica a polimerase de DNA Taq limpa e libera a parte fluorescente a partir da parte de extinção da sonda FRET. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência de interesse devido ao sucesso da amplificação e da hibridização. Os sinais luminosos moleculares tam- bém têm sido descritos com relação à utilização na detecção de se- quência e podem ser utilizados de acordo com a presente invenção.

[0036] De acordo com outro aspecto da invenção, são providos métodos para a detecção da presença de um DNA que corresponda ao evento pDAB4472- 1606 em uma amostra biológica. Esses méto- dos compreendem: (a) por em contato a amostra biológica com uma sonda que se hibridize sob condições rigorosas de hibridização com o DNA genômico a partir de uma planta de soja que contenha o evento pDAB4472-1606 e que não se hibridize sob as condições rigorosas de hibridização com uma planta de soja d controle; (b) submetendo a a- mostra biológica e a sonda a condições rigorosas de hibridização; e (c) detectando a hibridização da sonda ao DNA que contenha o evento PDAB4472- 1606, em que a detecção de tal hibridização é indicativa da presença do DNA que corresponda ao evento pDAB4472- 1606 dentro do gene da planta. De preferência a sonda é a SEQ ID NO: 3.

[0037] Ainda outro aspecto da invenção é um método para a de- terminação da zigosidade da progênie de plantas de soja que conte- nham o evento pDAB4472- 1606. O método compreende (a) por em contato uma amostra biológica com um par iniciador das SEQ ID Nos:

1 e 2, que quando usados na reação de amplificação de um acido nu- cleico com o DNA genômico a partir de uma amostra biológica que contenha o DNA genômico a partir de uma amostra biológica de uma planta de soja que contenha o evento pDAB4472- 1606, produza um primeiro produto da amplificação que identifica a presença do gene aad-12 dentro do DNA genômico da amostra biológica; (b) executando uma reação de amplificação de um ácido nucleico; (c) detectando um primeiro produto de amplificação (com a utilização da SEQ IS NO: 3 como uma sonda marcada); (d) pondo em contato a mesma amostra como par iniciador das SEQ |F Nos 4 e 5, que quando usado em uma reação de amplificação de um ácido nucleico com uma amostra bioló-

gica que contenha o DNA genômico a partir de plantas de soja produz um produto de amplificação a partir da combinação dos iniciadores que identificam o DNA genômico de planta de soja do tipo natural ho-

mologo a região genômica da soja de uma inserção de transgene i- dentificado como o evento pDAB4472- 1606; (e) executando uma rea-

ção de amplificação de ácido nucleico, e (f) detectando um segundo produto de amplificação produzido (com a utilização da SEQ ID NO: 6 como uma sonda de detecção), em que: (a) a detecção de ambos os produtos da amplificação indicam que a amostra de grão de soja é he- terozigótica com relação ao evento pDAB4472- 1606; (b) detecção de somente o referido primeiro produto da amplificação (identificando a presença do gene aad-12) que indica que a amostra biológica é homo- zigótica com relação ao evento pDAB4472- 1606; e (c) detectando somente o segundo produto da amplificação que é indicativo da au- sência do evento pDAB4472- 1606 dentro da amostra biológica.

A de- tecção dos produtos de amplificação pode ser executada com a utili- zação de sondas marcadas (como por exemplo, as SEQ ID Nos: 3 e

6). Como discutido acima, as sondas podem ser marcadas com um marcador convencional detectável de molécula reportes, como por e-

xemplo, um isótopo radioativo, um marcador fluorescente, ligante, um agente de luminescência química ou uma enzima. Em algumas moda- lidades, as sondas são marcadas com marcadores fluorescentes que permitem distinguir entre um produto de amplificação que contenha o gene aad-12 e um produto de amplificação que não contenha o gene aad-12 (como por exemplo, combinações de fluóforo/ extintor tais co- mo a 6-carboxi-fluoresceína (FAM) ou tetracloro fluoresceina (TET) em combinação com os extrintores tais como a tetrametil rodamina (TA- MRA) ou o tripeptídeo dihidrociclopirroloindo! (MGB).

[0038] Em outra modalidade da invenção, a análise especifica pa- ra o gene aad-12 pode ser pareada com um evento de PCR especifico tal como um descrito no Pedido de Patente Provisório U.S. Serial No. 61/584.533, depositado em 18 de outubro de 2011 ((Attorney Docket No. DAS.160P; MATERIALS AND METHODS FOR DETECTING THE ARYLOXYALKANOATE DIOXYGENASE GENE (AAD-12) CONTAI- NING EVENT pDAB4472-1606 IN PLANTS; Inventores: Chandra Channabasavaradhya e Andrew Greenwald; incorporado aqui, neste pedido de patente por referencia em sua totalidade). Essa modalidade pode ser usada para a determinação de se existem eventos mistos de aad-12 na mesma planta e se o evento detectado através da análise especifica para o evento é hemizigótico ou homozigótico. Nessa moda- lidade, a análise específica com relação ao gene é executada e o nú- mero de copias do gene é calculado com base nas intensidades do sinal de fluorescência produzido pela análise especifica para o gene.

Esteé em seguida comparado com aquele de um analise se zigosida- de especifica para o evento conhecido. Se o calculo do numero de co- pias do aad-12 for de intensidade similar àquela calculada pela análise especifica para o evento, então a amostra é considerada como tendo somente o evento aad-12 pretendido. De o número de copias calcula- do através da analise especifica para o gene é maior do que o calcula-

do pela análise especifica para o evento, então a amostra sob estudo é considerada como tendo as copias adicionais do gene aad-12 alem do evento pretendido e por esse motivo indica a contaminação poten- cial de outros eventos do gene aad-12. Esse esquema também pode ser usado para detectar eventos contaminantes que contenham ele- mentos de gene idênticos que não o gene aad-12 tais como sequên- cias de promotor ou de marcador selecionáveis ou quaisquer outras sequências idênticas comuns a todos os eventos.Essa ultima aborda- gem pode ser aplicável para a determinação da zigosidade e/ou a con- taminação de eventos transgênicos de diversas características que porem tenham elementos similares na cassete do gene.

[0039] São providos kits para a detecção de um DAA-12 em plan- tas e as amostras biológicas derivadas, os quais usam iniciadores se- lecionados a partir das SEQ ID NOs: 1, 2, 4 e / ou 5 e sondas selecio- nadas a partir das SEQ ID NOs: 3 e 6. Um produto de amplificação produzido com o referido kit identifica uma amostra biológica como contendo o evento aad-12 quando o produto da amplificação se hibri- diza com uma sonda compreendendo a DEQ ID NO: 3. O Lit pode ser provido como um dispositivo para detectar especificamente a presença deum evento aad-12 dentro de plantas (ou de amostras biológicas de- rivadas das mesmas) ou o kit pode ser provido como um dispositivo para detectar a multiplicidade de eventos transgênicos diferentes a partir de qualquer número de amostras biológicas diferentes, Neste ultimo caso, isto é, um kit para a detecção d uma multiplicidade de e- ventos transgênicos diferentes, o kit pode prover sondas ou iniciadores na forma de um micro conjunto, ou qualquer tipo de conjunto que pro- porcione o usuário do referido Kit com a capacidade de distinguir dife- renças entre amostras transgênicas e não transgênicas, zigosidade dos eventos transgênicos,e mesmo a presença ou a ausência de e- ventos, sejam aprovados ou não aprovados para a comercialização. À detecção ou a classificação da presença ou da ausência de determi- nados eventos com a utilização de tais kits pode ser através de meios fluorométricos, colorimétricos, isotópicos ou luminescentes químicos.

[0040] Todas as patentes, pedidos de patentes, pedidos de paten- te provisórios e publicações referidas ou citadas aqui, neste pedido de patente são incorporadas por referencia em suas totalidades no grau em que elas não sejam inconsistentes com os ensinamentos explícitos desta especificação.

[0041] Os exemplos que se seguem são incluídos para ilustrar procedimentos para a pratica da invenção e para demonstrar determi- nadas modalidades de preferência da invenção. Esses exemplos não devem ser considerados como limitativos. Deve ser observado por a- quelas pessoas versado na técnica que as técnicas descritas nos e- xemplos que se seguem representam abordagens específicas usadas para ilustrar os modos de preferência para a pratica dos mesmos. No entanto aquelas pessoas versadas na técnica, na luz da presente di- vulgação, apreciarão que muitas mudanças podem ser feitas nessas modalidades especificas embora ainda obtendo resultados iguais ou similares sem que se afastem do espírito e do âmbito da invenção. À não ser que indicado d outra forma, todas as percentagens são em peso e todas as proporções de misturas de solventes são por volume a não ser que indicadas de outra forma.

EXEMPLOS

[0042] Um TAQMAN ASSAYO especifico para evento foi desen- volvido para detectar a presença de uma sonda MGB com relação ao gene aad-12 na soja e para a determinação do estado de zigosidade das plantas em populações de criação. Para a detecção específica do gene aad-12 na soja, um fragmento de DNA de 59 pb foi amplificado com a utilização de dois iniciadores específicos para o gene. A amplifi- cação desse produto de PCR foi medida através de uma sonda MGB especifica apara o alvo que continha o reportes FAM no seu final 51. À especificidade desse método de detecção Tagman com relação ao gene aad-12 no grão e soja foi testada contra os eventos na soja de níveis variados de zigosidade e de soja não transgênica em um forma- toduplocom o gene de referencia especifico para a soja GWS116. Isolamento do gDNA

[0043] O DNA genômico foi extraído com a utilização de Qiagen DNeasy 96 Kit Plant. Discos de folhas de soja frescos, 8 por amostra, foram utilizados para a extração do gODNA com a utilização de Qiagen DNeasy 96 Kit Plant.modificado. O gDNA foi quantificado com o mé- todo Pico Green de acordo com as instruções do fornecedor (Molecu- lar Probes, Eugene, OR). As amostras foram diluídas com água fresca sem DNase, resultando em uma concentração de 1,2 ng / ml para a finalidade deste estudo. Análise Tagman e resultados.

[0044] Os iniciadores e sondas Tagman específicos foram projeta- dos par a detecção do gene aad-12 na soja através de uma análise Taqman. Esses reagentes podem ser usados com as condições rela- cionadas abaixo para a detecção do geme aad-12 dentro do grão se soja. A tabela 1 relaciona as sequências de iniciador e de sonda que foram desenvolvidas especificamente para a detecção do gene aad-12 na soja. Iniciador SEQ ID NO:1 Iniciador | SEQ ID NO:2 D-SPbAAD12- SEQ ID NO:3

Descri- Iniciador | SEQ ID NO:4 Iniciador | SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:6

[0045] As condições múltiplas de PCR para a amplificação estão relacionadas na Tabela 2. O coquetel foi pipetado em uma placa de 384 cavidades e foi amplificado com a utilização das condições que se seguem: (i) 50T durante 2 minutos, (ii) 95º duran te 10 minutos, (iii) 95º durante 15 segundos, (iv) 60ºG durante 60 segu ndos, (iv) repetir as etapas iii — iv durante 35 ciclos, (v) manter em 4€. O PCR principal foi executado no BIO-RAD iCycler "'" e ABI GeneAmp PCR System 9700 termociclador. A análise dos dados foi baseada na medição do limite dos ciclos (Ct) que é o número de ciclos de PCR quando a medi- ção de fluorescência atinge um valor ajustado. O valor Ct foi calculado automaticamente através do software iCycler.

[0046] O método AACt foi usado para fazer as chamadas de zigo- sidade (ver a Figura 1). Primeiro os valores ACt que são a diferença entre os valores Ct do sistema especifico para o evento e o sistema de referencia de cada uma das amostras foram calculados. Quando os valores AACt que são a diferença entre os valores ACt e de cada a- mostra não conhecido e o valor ACt do controle hemizigótico ( ou a media se mais do que um controle hemozigótico) foi em seguida calcu- lado. A chamada de zigosidade (número de copias) de cada amostra não conhecida pode ser calculada com a utilização da fórmula que se segue

[0047] Número de copias de uma amostra não conhecida = 2 AACt

[0048] As amostras com um número em bruto de copias em trono de 1 serão hemizigóticas, 2 serão homozigóticas e O serão nulas.

Tabela 2. Mistura de reação para Taqman especifico para o gene aad- Componente is ag D-SbIC-G116-F

[0049] O método de detecção Tagman com relação ao gene aad- 12 na soja foi testado contra amostras homozigóticas, hemizigóticas e nulas em formado duplex com iniciadores específicos para a soja do tipo natural. Essa análise detecta especificamente o gene AAD-12 na soja e não produz ou amplifica nenhum resultado falso positivo a partir dos controles. Os iniciadores e as sondas específicos para o gene podem ser usados para a detecção do gene aad-12 na soja e essas condições e reagentes podem ser aplicados para análises de zigosi- dade.

Claims (20)

U7 REIVINDICAÇÕES

1. Iniciador ou sonda isolado que compreende as SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6.

2.Iniciador ou sonda isolado que consiste das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6.

3.Sonda isolada como definida na reivindicação 1 ou 2, em que a referida sonda é marcada.

4.Sonda isolada de acordo com a reivindicação 3 em que o referido marcador é um isótopo radioativo, um marcador fluorescente, um ligante, um agente de luminescência química ou uma enzima.

5.Kit que compreende um recipiente e uma composição compreendendo uma combinação de sequências de ácido nucleico selecionadas a partir de: a) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3; b) SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6; Cc) SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2; d) SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5; e) SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 3; f) SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3; g) SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 6; h) SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 4; i) SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 5; j) SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 6; k) SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4; |) SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 5; m) SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 6; n) SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4; o) SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 5; ou bp) SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 6.

6. Kit de acordo com a reivindicação 5, no qual qualquer uma das referidas sequências de ácido nucleico são marcadas.

7. Kit de acordo com a reivindicação 6, no qual o referido marcador é um isótopo radioativo, um marcador fluorescente, um |li- gante, um agente de luminescência química ou uma enzima.

8. Método para a determinação da zigosidade de DNA de um genoma de planta de soja que compreende (a) por em contato uma amostra biológica com um par iniciador das SEQ ID Nos: 1 e 2, que quando usado em uma reação de amplificação de um acido nucle- ico com o DNA genômico a partir de uma amostra biológica que con- tenha o DNA genômico a partir de uma amostra biológica de uma plan- ta de soja que contenha o evento pDAB4472- 1606, produza um pri- meiro produto da amplificação que identifica a presença do gene aad- 12 dentro do DNA genômico da amostra biológica; (b) executando uma reação de amplificação de um ácido nucleico; (c) detectando um pri- meiro produto de amplificação (com a utilização da SEQ IS NO: 3 co- mo uma sonda marcada); (d) pondo em contato a mesma amostra com o par iniciador das SEQ IF Nos 4 e 5, que quando usado em uma reação de amplificação de um ácido nucleico com uma amostra bioló- gica que contenha o DNA genômico a partir de plantas de soja produz um produto de amplificação a partir da combinação dos iniciadores que identificam o DNA genômico de planta de soja do tipo natural ho- mologo a região genômica da soja de uma inserção de transgene i- dentificado como o evento pDAB4472- 1606; (e) executando uma rea- ção de amplificação de ácido nucleico, e (f) detectando um segundo produto de amplificação produzido; em que: (i) a detecção de ambos os produtos da amplificação que indicam que a amostra de grão de soja é heterozigótica com relação ao evento pDAB4472- 1606; (ii) de- tecção de somente o referido primeiro produto da amplificação (identi-

ficando a presença do gene aad-12) que indica que a amostra biológi- ca é homozigótica com relação ao evento pDAB4472- 1606; e (iii) de- tectando de somente o segundo produto da amplificação que é indica- tivo da ausência do evento pDAB4472- 1606 dentro da amostra bioló- dgica.

9. Método de acordo com a reivindicação 8 no qual o referi- do primeiro produto da amplificação é detectado com uma sonda que compreende a SEQ ID NO: 3 e o referido segundo produto de amplifi- cação é detectado com uma sonda que compreende a SEQ ID NO: 6.

10. Método para detectar a presença de DNA correspon- dente ao evento pDAB4472- 1606 em uma amostra biológica, que compreende: (a) por em contato a amostra biológica com um conjunto de iniciadores, que quando usado em uma reação de amplificação de áci- do nucleico com um DNA genômico obtido a partir de uma ou mais plantas de soja que contenham o evento pDAB4472- 1606, produzem um produto de amplificação que identifica a planta como contendo o evento pDAB4472- 1606; (b) executando uma reação de amplificação de ácido nucle- ico, produzindo por meio disso o produto de amplificação, e (c) detectando o produto de amplificação em que a detec- ção do referido produto de amplificação é indicativa da presença do DNA correspondente ao evento pDAB4472- 1606.

11. Método para detectar a presença de DNA correspon- dente ao evento pDAB4472- 1606 em uma amostra biológica, que compreende: (a) por em contato a amostra biológica com uma sonda que se hibridize sob condições rigorosas de hibridização com o DNA ge- nômico a partir de uma planta de soja que contenha o evento pDAB4472-1606 e que não se hibridize sob as condições rigorosas de hibridização com uma planta de soja d controle; (b) submetendo a amostra biológica à sonda a condições rigorosas de hibridização; e (c) detectando a hibridização da sonda ao DNA que conte- nhaoevento pDAB4472- 1606, em que a detecção de tal hibridização é indicativa da presença do DNA que corresponda ao evento PDAB4472- 1606 dentro do gene da planta.

12. Método de acordo com a reivindicação 10 ou 11, no qual referida sonda compreende a SEQ ID NO: 3.

13. Método para a amplificação de ácidos nucléicos em uma amostra biológica para a identificação do evento pDAB4472- 1606 dentro do genoma de uma planta de soja, que compreende: (a) por em contato uma amostra biológica com um par de iniciadores das SEQ ID Nos 1 e 2, que quando usado em uma reação de amplificação de um ácido nucleico com o DNA genômico a partir de uma amostra biológica que contenha o DNA genômico a partir de uma amostra biológica a partir de uma planta de soja contendo o evento PDAB4472- 1606 produz um que identifica a presença do gene aad-12 dentro do DNA genômico da amostra biológica; (b) executando uma reação de amplificação de um ácido nucleico; e (c) detectando um produto de amplificação produzido através da referida reação de am- plificação, em que a detecção do referido produto de amplificação indi- ca que a amostra biológica contém o gene aad-12.

14. Método de acordo com a reivindicação 13 no qual o re- ferido produto de amplificação é detectado com uma sonda que com- preende | SEQ ID NO: 3.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 8, 10 11 ou 13, no qual a referida amostra biológica compreende uma célula de soja, um tecido de soja um caule de soja, uma raiz de soja, uma folha de soja, uma flor de soja ou partes da mesma, uma amostra de soja uma vagem de soja ou qualquer combinação dos mesmos.

16. Método de acordo com a reivindicação 9, 12 ou 14, no qual a referida sonda é marcada.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, no qual a re- ferida sonda é marcada com um isótopo radioativo, um marcador fluo- rescente, ligante um agente químico de luminescência ou uma enzima.

18. Composição que compreende um tampão e uma com- binação de sequências de ácido nucleico selecionadas a partir de: a) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3; b) SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6; Cc) SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2; d) SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5; e) SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 3; f) SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3; g) SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 6; h) SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 4; i) SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 5; j) SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 6; k) SEQ ID NO: 2€ SEQ ID NO: 4; |) SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 5; m) SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 6; n) SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4; o) SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 5; ou bp) SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 6.

19. Composição de acordo com a reivindicação 18, no qual pelo menos uma das referidas moléculas de ácido nucleico é marcada com ou um isótopo radioativo, ou um marcador fluorescente, ou um ligante ou um agente químico de luminescência ou uma enzima.

20. Método para a determinação de eventos contaminantes em uma planta recombinante que compreende:

(a) pondo em contato uma amostra de DNA de uma planta recombinante que consiste de um fragmento de DNA que contém um transgene ligado de forma contígua a um DNA genômico com um pri-

meiro par de iniciadores que se hibridiza ao referido fragmento de DNA que contém um transgene ligado de forma contígua a um DNA genô- mico; (b) executando uma reação de amplificação de um ácido nuclei- co; (c) produzindo um primeiro produto de amplificação que consiste do referido fragmento de DNA que contém o transgene ligado de forma contígua a um DNA genômico; (d) detectando o primeiro produto da amplificação; (e) ponto em contato a referida amostra de DNA da plan- ta recombinante que consiste de um fragmento de DNA que contém um gene homozigótico natural com um segundo par de iniciadores que se hibridiza ao referido fragmento de DNA que contém um gene ho- mozigótico natural; (f) executando uma reação de amplificação de um ácido nucleico; (g) produzindo um segundo produto de amplificação consistindo do referido gene homozigótico natural; (h) detectando o segundo produto da amplificação. (i) determinando que as forças dos sinais a partir dos primeiro e segundo produtos de amplificação sejam aproximadamente iguais, em que as forças de sinal iguais dos primeiro e segundo produtos de amplificação indicam a ausência de eventos contaminantes; (j) pondo em contato a referida amostra de DNA de planta recombinante que consiste de um fragmento de DNA que con- tém um transgene com um terceiro par de iniciadores que se hibridiza ao referido fragmento de DNA que contém um transgene; (k) execu- tando uma reação de amplificação de um ácido nucleico; (1) produzin- do um terceiro produto de amplificação consistindo do referido trans- gene; (m) detectando o terceiro produto de amplificação; e (n) deter- minando que as forças dos sinais dos primeiro e terceiro produtos de amplificação sejam aproximadamente iguais, em que as forças de si-

nal iguais dos primeiro e terceiro produtos de amplificação indicam a ausência de eventos contaminantes.

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