TW201323614A - 用於檢測植物中芳氧基烷酸酯二氧合酶基因（ａａｄ－１２）的物質和方法 - Google Patents

用於檢測植物中芳氧基烷酸酯二氧合酶基因（ａａｄ－１２）的物質和方法 Download PDF

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Abstract

本申請案提供用於檢測衍生自重組型植物之生物試樣中之aad-12基因活動的物質和方法、以及用於檢測衍生自植物之試樣中之污染品件的物質和方法。

Description

用於檢測植物中芳氧基烷酸酯二氧合酶基因(AAD-12)的物質和方法 發明領域
本發明係有關於用於檢測植物中芳氧基烷酸酯二氧合酶(AAD-12)的物質和方法。
發明背景
大豆為一重要農作為且係為世界許多區域的主要食物來源。生物技術之方法業經施用至大豆以改良農藝特性及該產物的品質。經導入大豆植物內之農藝特性實例包括除草劑抗性及昆蟲抗性。
該aad-12基因(原先係得自代爾夫特食酸菌(Delftia acidovorans)可將芳氧基烷酸酯二氧合酶(AAD-12)蛋白質編碼。本基因可提供對於，例如2,4-二氯苯氧基乙酸、以及吡啶氧基乙酸酯除草劑的耐受性。用於將除草劑耐受性導入植物內之該aad-12基因本身係揭示在WO 2007/053482內。
異源性或外來基因(轉基因)在植物中的表現性係受該外來基因被插入染色體內的位置所影響。例如，其 可歸因於核染色質結構(例如異染色質)或接近整合位置之轉錄調節元素(例如增強子)的附近(Weising等人，Ann.Rev.Genet 22：421-477,1988)。因此，在相同類型之基因轉殖植物(或其它有機體)內之該相同基因在不同的品件中表現性程度可顯示廣泛變化。在表現性之間隙或暫時模式中，亦可以有差異。例如在各種植物組織內之一轉基因的相對表現性差異可不符合自存在於已導入該植物內之該基因結構內的轉錄調節元素所預期的模式。
因此，通常產生大量活動且經篩檢以確認一能為了特定目的而使一經導入的重要基因表現至令人滿意的程度之活動。就商業目的而言，通常產生數佰至數仟種不同的活動並從這些活動中篩檢出一具有所欲轉基因表現程度及模式的單一活動。經由使用習知交配方法藉性異型雜交而使一具有所欲轉基因表現程度及/或模式的活動可用以將該轉基因摻入其它基因背景內。此等雜種之後裔可維持該原有轉化株的轉基因表現特性。使用本方法以確保在許多很適於局部成長條件的變種內得到可靠的基因表現性。
有利的是可檢測一特定植物之一轉基因及/或基因組DNA的存在以測定一性交之後裔是否含有該重要的轉基因及/或基因組DNA。此外，當遵守需要上市前的許可及衍生自該等重組型農作物之食品的標籤說明之規定時，用於檢測在一特定植物內之該轉基因及/或基因組DNA的存在之方法可有助益。
可藉任何熟知的核酸檢測方法而檢測一轉基因 的存在。實例包括聚合酶連鎖反應(PCR)或使用核酸探針之DNA雜交。這些檢測方法通常集中於經常使用的基因元素，諸如啟動子(promoter)、終止子(terminator)、標誌基因、或其它常用的基因元素。除非鄰接於該經插入的DNA(“側翼DNA”)之染色體DNA的序列係已知，否則此等方法並不能用於曲別不同的活動，尤其使用相同DNA結構所產生的活動。
就培植、特性基因摻入、及種子純度目的而言，亦重要的是可測定在植物內之基因轉殖品件的接合情況。基於管理及種子品質的理由，亦有利的是可快速檢測混合型aad-12基因活動(有意或無意的)在大豆植物內之存在。
發明概要
本發明係有關於在生物試樣中之aad-12基因品件檢測。本發明提供辨識具有含一或多個aad-12品件之基因DNA(gDNA)的基因工程植物之方法。本專利內所述之該等檢定方法具aad-12基因專一性而非品件專一性，且用以檢測並選擇性測定任何aad-12基因品件的接合情況。相對於經由轉基因複製數字分析之專一性aad-12，本發明可測定非故意aad-12品件的污染。
因此，本發明之一方面係提供用於檢測一aad-12轉基因在一生物試樣(例如得自大豆)內之存在的檢定法。該等檢定法可基於已插入該大豆基因組內之該重組型結構的DNA序列。亦提供可用以進行該等檢定之套組及條件。
本發明亦有關於可用於與該等DNA序列相關之該aad-12基因的選殖及分析之核酸序列。本發明之這方面的某些實施例提供用於檢測aad-12之基因專一性引子(primer)及使用這些基因專一性引子組所產生的PCR擴增子(amplicons)。因此，可使用這些及其它相關的程序以辨識含該aad-12基因的植物。
圖1用於aad-12品件416之基因專一性檢定。上面暗的斑點群組代表得自aad-12基因之同樣胚子之大豆試樣的螢光讀數。中間較高的斑點群組代表得自aad-12之半接合子之大豆試樣的螢光讀數。下面之斑點群組代表得自就一aad-12品件而言具負性之野生型大豆試樣的螢光讀數。
圖2用於aad-12品件4406之基因專一性檢定。上面暗的斑點群組代表得自aad-12基因之同樣胚子之大豆試樣的螢光讀數。中間較高的斑點群組代表得自aad-12之半接合子之大豆試樣的螢光讀數。下面之斑點群組代表得自就一aad-12品件而言具負性之野生型大豆試樣的螢光讀數。
較佳實施例之詳細說明
將一轉基因導入一植物基因組內並進行整合包含隨機品件(因此，該名稱“品件”係用於經表現之一特定插入)且，就許多變形技術(諸如土壤桿菌屬(Agrobacterium)變形、“基因槍(gene gun)”變形及WHISKERS)而言，若一轉 基因會插入一植物之該基因組內，則其係非可預測。
存於至少2500個含一此種aad-12基因品件之大豆品系(pDAB4472-1606)種子且使公眾在未受到the American Type Culture Collection(ATCC),10801 University Boulevard,Manassas,VA,20110的限制(但是需接受專利權)下可使用。該存放物被命名為ATCC Deposit第PTA-11028號(存放日期為2010年6月10日)。製成本存放物且可根據並在有關於用於專利程序之種子存放物之the Budapest Treaty的名義下維持。於該ATCC寄存所(其係為大眾寄存所)，在不受限制下該存放物可維持30年、或在最近一次請求後3年、或該專利的有效壽命，無論那一種都可較久，且若在該期間內，其變得無生存力，則可經取代。
文中提供定義及實例以幫助說明本發明並引導一般技術者實踐本發明。除非另有指定，名詞係根據習知使用法而為相關技藝之一般技術者所瞭解。
一“生物試驗”可包含衍生自大豆細胞或組織(其包括莖、根、葉、花或花部份、種子或種豆莢等)之任何有機物質，其含有一可檢測量之相當於此有機物質的核苷酸序列。
一“探針”為一習知可檢測標記或報告分子(例如放射性同位素、螢光團、配位子、化學發光劑或酶)所連接的單離核酸。此探針係與一股靶核酸(就本發明而言係為可將該aad-12基因編碼之一股重組型DNA)互補。根據本發明之探針不僅包括去氧核糖核酸或核糖核酸，而且包括聚醯 胺、及可專一性結合至一靶DNA序列的其它探針物質，且可使用因此結合作用以檢測該靶DNA序列之存在。
“引子”為一黏結至一互補靶DNA股的單離核酸，其係藉核酸雜交以在該引子與靶DNA股之間形成一雜種，然後藉一聚合酶(例如DNA聚合酶)而沿著該DNA股延伸。本發明之引子對係指，藉該聚合酶連鎖反應(PCR)或其它習知核酸擴增方法而用於一靶核酸序列之擴增的用途。
探針及引子之長度通常為11至30個或更多的核苷酸。在某些情況下，探針及引子可具有超過30個核苷酸的長度。不管大小，探針及引子可在高嚴厲雜交條件下與一靶序列專一性雜交。雖然探針與該靶序列不同，但是根據本發明之探針及引子較佳具有與該靶序列完全類似的序列且仍保有可藉習知方法而設計之與靶序列進行雜交的能力。
如文中使用，該名詞“後裔”表示任一代包含(或含有)一aad-12品件之親本株(parent plant)的後代。
一基因轉殖“品件”係藉以下而產生：植物細胞與異源性DNA(亦即包括一重要轉基因之核酸結構)所進行的轉殖反應、得自將該轉基因插入該植物之基因組內的植物群體的再生、及其特徵為插入一特定基因組位置內之一特定植物的選用。該名詞“品件”係指該原有的轉化株及包括該異源性DNA之轉化株的後裔。該名詞“品件”亦指藉該轉化株及包括該基因組/轉基因DNA之另一變體的性異型雜交而產生的後裔。即便重複地與一回交親本(recurrent parent)進行回交(back-crossing)，得自該經轉殖之親本的插入轉基因DNA及側翼基因組DNA(基因組/轉基因DNA)係存在於該雜種之後裔的相同染色體位置內。該名詞“品件”亦指得自預期可轉移至一可接受經插入DNA(其包括由於一包括該經插入DNA之親系(例如該原有轉化株及從自交所形成的後裔)與一不含有該經插入DNA之親系的性雜交所產生的重要轉基因)之後裔的該原有轉化株及其後裔之DNA。
如上述，本發明之一方面係有關於aad-12轉基因擴增。本發明包括相關PCR引子及擴增子。根據本發明，可使用利用能生成經插入DNA之擴增子的分析性PCR方法以檢測或辨識衍生自含一aad-12品件之專利基因轉殖植物的商業化基因轉殖植物品種或品系。因此，本發明之各種實施例提供含SEQ ID NO(序列辨識編號)：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或其等之各種組合的引子、以及含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6或SEQ ID NOs：3及6兩者之探針。
一含該品件之親本株與另一植物品系雜交以使該後裔得到一或多種額外的重要特性後，文中揭示的檢測技術可以連同植物育種法使用以辨識含一aad-12品件的後裔植物。這些PCR分析方法有益於植物育種計劃以及品管(尤其就商業化基因轉殖種子而言)且亦可有益於產物登記及產物代管。
熟悉本項技藝者亦可瞭解該等引子及探針可經 設計在一系列標準的雜交及/或PCR條件(其包括其中該引子或探針並非完美地與該例示序列互補的條件)下進行雜交。亦即可耐受某程度的失配。例如就一約20個核苷酸的引子而言，若該失配基底係在內部或位於與該擴增子反向之引子的末端，則典型上大約一或兩個核苷酸並不需要與該反向股進行雜交。下文提供各種合適的雜交條件。而且，合成核苷酸類似物(諸如肌核苷)亦可用於探針內。亦可使用胜肽核酸(PNA)探針，以及DNA與RNA探針。
提供用於檢測品件pDAB4472-1606的存在之組成物。這些組成物包含品件專一性引子，諸如SEQ ID NO：1及/或SEQ ID NO：2；以及可以與不含有品件pDAB4472-1606之植物之野生型基因組常見的DNA雜交之引子(SEQ ID NO：4及/或SEQ ID NO：5)。PCR分析證明含品件pDAB4472-1606之大豆品系可藉使用這些品件專一性引子組(SEQ ID NOs：1及2)所產生之PCR擴增子的分析而辨識。可使用這些及其它相關程序以獨特地辨識這些含品件pDAB4472-1606之大豆品系。因此，可使用衍生自此等引子之PCR擴增子以辨識含品件pDAB4472-1606之大豆品系並形成本揭示發明之另一實施例。
本發明亦包括檢測在一試樣(其包含含有該aad-12基因之植物)內之NDA的存在之方法。此等方法可包含：(a)以一引子組(其當用於與DNA進行核酸擴增反應時可產生一能辨識該試樣內之aad-12序列的擴增子)接觸該含DNA之試樣；(b)進行核酸擴增反應以產生該擴增子；及(c) 檢測該擴增子。
本發明之另外檢測方法包括檢測在一試樣內之一DNA(其相當於用於aad-12之編碼序列)的方法，其中該方法包含：(a)以一可在嚴厲雜交條件下與得自含一aad-12品件之植物的DNA進行雜交且在該等嚴厲雜交條件下不會與得自一對照植物(一不含有aad-12品件的植物)之植物進行雜交的探針接觸該含DNA之試樣；(b)使該試樣及探針接受嚴厲雜交條件；及(c)檢該探針與該DNA的雜交反應。
根據本發明另一方面，係提供測定一雜種之後裔與含品件pDAB4472-1606之植物接合的方法。這些方法可包括以一文中所揭示的引子組接觸一含大豆DNA的試樣。當用於與得自一含品件pDAB4472-1606之植物的基因組DNA所進行之核酸擴增反應時，這些引子可產生能確認一植物含有品件pDAB4472-1606之第一擴增子。這些方法進一步包含進行核酸擴增反應以產生該第一擴增子；檢測該第一擴增子；並以另一引子組(其當用於與得自大豆植物之基因組DNA進行核酸擴增反應時可產生含與該大豆基因組區域同源的天然大豆基因組DNA之第二擴增子)接觸該含大豆DNA之試樣。該方法亦可進一步包含進行核酸擴增反應以產生第二擴增子、檢測該第二擴增子並比較在一試樣內之該第一及第二擴增子。這兩種擴增子在一試樣內之存在表示該試樣對於品件pDAB4472-1606具雜合性。
一“探針為一習知可檢測標記或報告分子(諸如放射性同位素、配位子、化學發光劑或酶)所連接之單離核 酸分子。文中所揭示的探針包括SEQ ID NOs：3及/或6。根據本發明之探針不僅包括去氧核糖核酸或核糖核酸，而且包括聚醯胺及可專一性結合至一靶DNA序列且可用以檢測該靶DNA序列之存在的其它探針物質。用於製造並使用探針及引子的方法描述在以下資料中：例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual,2nd ed.,vol.1-3,ed.Sambrook等人，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989。
根據該申請案，操作者可使用各種雜交條件以獲得探針對於靶序列之各種程度的選擇性。就需要高選擇性的應用而言，操作者典型上可使用相當嚴厲的條件以形成該等雜種，例如操作者可選擇相當低鹽及/或高溫的條件，諸如藉於約50℃至約70℃之溫度下約0.02M(莫耳濃度)至約0.15M NaCl而提供的條件。嚴厲條件可包括，例如以高嚴厲性清洗緩衝劑(0.2X SSC,0.1% SDS,65℃)清洗該雜交濾器至少兩次。可促進DNA雜交之合適的嚴厲條件，例如於約45℃下6.0X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)，繼而於50℃下進行20X SSC之清洗，為熟悉本項技藝者所知。例如在該清洗步驟內之鹽濃度可選自於50℃下之約20X SSC的低嚴厲性至約於50℃下之0.2X SSC的高嚴厲性。此外，在該清洗步驟內之溫度可自於室溫(約22℃)下之低嚴厲條件至於約65℃下之高嚴厲條件。溫度與鹽皆可變化，或該溫度或鹽濃度可維持恆定，而另一變數可改變，此等選擇條件可耐受該探針與模板或靶股間之即便有也很少的失配現象。經由雜 交反應而進行DNA序列的檢測為熟悉本項技藝者所熟知，且美國專利第4,965,188號及第5,176,995號為該等雜交分析方法的例證。在一特定實施例中，文中所揭示之一引子或探針可專一性與含品件pDAB4472-1606之基因組DNA雜交。該探針或引子與含品件pDAB4472-1606之DNA的雜交作用可藉熟悉本項技藝者已知的任何方法而檢測，這些方法可包括，但不限於：螢光標記物、放射性標記物、以抗體為主的標記物、及化學發光標記物。
就使用一特定擴增引子對所進行之一靶核酸序列的擴增(例如藉PCR)而言，“嚴厲條件”為可以使該引子對僅與一具有該對應野生型序列(或其補體(complement)之引子可結合且較佳可產生一獨特擴增產物(該擴增子)的該靶核酸序列雜交。該名詞“對於一靶序列具專一性”表示在嚴厲條件下，一探針或引子僅可以與一含該靶序列之試樣內的靶序列雜交。
如文中使用，“經擴增的DNA”或“擴增子”係指一靶核酸序列(其係為一核酸模板之一部份)之核酸擴增產物。例如為了測定得自一性雜交之該大豆植物的基因組DNA內是否含有品件pDAB4472-1606，可使用一文中所揭示的引子對使從一大豆植物組織試樣內所萃取的DNA進行核酸擴增方法以產生一能辨識品件pDAB4472-1606之存在的擴增子。該擴增子之長度範圍可從該等引子對加上一核苷酸鹼基對之合併長度、及/或該等引子對加上約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、 280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、或500、750、1000、1250、1500、1750、2000個或更多核苷酸鹼基對(以上列舉之增量中之任一者的加或減)之 合併長度。該名詞“擴增子”的用法明確地不包括可在該DNA末端擴增反應中所形成的引子二聚物。
核酸擴增反應可藉本項技藝中已知之各種核酸擴增方法中的任一者而進行，其包括該聚合酶連鎖反應(PCR)。多種擴增方法在本項技藝中係已知且特別描述在美國專利第4,683,195號及美國專利第4,683,202號中。PCR擴增方法業經研發以擴增至高22kb之基因組DNA。可使用這些方法以及在該DNA擴增技藝中已知之其它方法以實踐本發明。可確認(及若必要，校正)得自一實驗材料大豆品件之異源性轉基因DNA的序列，其係藉使用衍生自文中所提供的序列之引子而擴增得自該品件的此等序列，繼而進行該PCR擴增子或該經選殖DNA之標準DNA定序。可藉多種技術而檢測藉這些方法所產生的擴增子。瓊脂糖凝膠電泳並使用溴化乙錠(ethidium bromide)進行染色的技術為檢測DNA擴增子之普遍熟知的方法。
TAQMAN(PE Applied Biosystems,Foster City,Calif.)為檢測並定量一DNA序列的存在之方法。簡言之，係設計一可以與重要的序列(例如該aad-12基因或該大豆基因組之一天然基因)雜交的FRET寡核苷酸探針。在一熱安定性聚合酶及dNTPs之存在下，使該FRET探針及PCR引子循環。在專一性擴增反應期間，標記物DNA聚合酶可清除並釋放該FRET探針上之淬滅分子團的該螢光分子團。一螢光信號表示由於成功的擴增及雜交，所以存在該重要的序列。分子信標(Molecular beacon)亦業經描述用於序列檢測 且可根據本發明使用。
根據本發明之另一方面，係提供檢測一相當於品件pDAB4472-1606之DNA在一生物試樣內的存在之方法。這些方法包含：(a)以一在嚴厲雜交條件下可以與得自一含品件pDAB4472-1606之大豆植物的基因組DNA雜交且在該等嚴厲雜交條件下不會與一對照大豆植物雜交之探針接觸該生物試樣；(b)使該生物試樣及探針接受嚴厲雜交條件；及(c)檢測該探針與該含品件pDAB4472-1606之雜交反應，其中此雜交反應之檢測係表示該相當於品件pDAB4472-1606之DNA在該植物之基因組內之存在。該探針較佳為SEQ ID NO：3。
本發明之又另一方面為測定含品件pDAB4472-1606之大豆植物之後裔的合子型。該方法包含(a)以一SEQ ID NOs：1及2之引子對(其當用於與得自一含品件pDAB4472-1606之大豆植物之含基因組DNA之生物試樣的基因組DNA進行之核酸擴增反應時可產生一能辨識在該生物試樣之基因組DNA內的該aad-12基因之存在的第一擴增子)接觸一生物試樣；(b)進行一核酸擴增反應；(c)檢測所產生之第一擴增子(使用SEQ ID NO：3作為一標記探針)；(d)以該引子對SEQ ID NOs：4及5(當用於與一得自大豆植物之含基因組DNA的生物試樣進行核酸擴增反應時可產生一能辨識與一經確認為品件pDAB4472-1606之轉基因插入物的大豆基因組區域同源之野生型大豆基因組DNA的得自該等引子組合之擴增子)接觸該相同試樣；(e)進行核酸擴增 反應；及(f)檢測所產生的第二擴增子(使用SEQ ID NO：6作為檢測探針)；其中：(a)兩種擴增子的檢測表示該大豆試樣對品件pDAB4472-1606具雜合性；(b)僅該第一擴增子的檢測(其可確認該aad-12基因的存在)表示該生物試樣對品件pDAB4472-1606具同合型；及(c)僅該第二擴增子的檢測表示品件pDAB4472-1606不存在於該生物試樣內。可使用標記探針(例如SEQ ID NOs：3及6)進行該等擴增子的檢測。如上述，探針可經一習知可檢測標記物或報告分子(例如放射性同位素、螢光標記物、配位子、化學發光劑或酶)標記。在某些實施例中，該等探針係經可以使操作者區分一含該aad-12基因的擴增子及一不含該aad-12基因的擴增子(例如螢光團/淬滅劑組合，諸如6-羧基螢光素(FAM)或四氯螢光素(TET)與淬滅劑(諸如四甲基玫瑰紅(TAMRA)或二氫環吡咯吲哚三肽胜(MGB))的組合)之螢光標記物標記。
在本發明之另一實施例中，該aad-12基因專一性檢定可以與，諸如在2011年10月18日申請之同在申請中之美國臨時專利申請案序號第＿＿＿號(代理人案號DAS.160P；MATERIALS AND METHODS FOR DETECTING THE ARYLOXYALKANOATE DIOXYGENASE GENE (AAD-12)CONTAINING EVENT pDAB4472-1606 IN PLANTS；發明者：Chandra Channabasavaradhya及Andrew Greenwald；其全文在此併入本案以為參考資料)中所述之一品件專一性PCR搭配。本實施例可用以測定在該相同植物內是否有混合型aad-12品件且藉該品件專一性檢定而檢測 之該品件是否具半合型或同合型。在本實施例中，係進行該基因專一性檢定且該基因複製數係根據藉該基因專一性檢定而產生的螢光信號強度而估計。然後使其與一已知品件專一性接合狀態檢定的基因複製數比較。若該aad-12基因複製數估計值與藉該品件專一性檢定而估計之強度類似，則在研究下之該試樣被認為具有不同於該預期品件的額外aad-12基因複製且因此表示其它aad-12基因品件的潛在污染。本方案亦可用以檢測具有不同於該aad-12基因之相同基因元素(諸如啟動子或可選擇的標誌序列或所有該等品件習見的任何其它相同序列)的污染品件。後者的方法可適用於測定具有各種特徵但是在基因卡匣(gene cassette)內具有類似元素之基因轉殖品件的合子型及/或污染反應。
提供使用選自SEQ ID NOs：1、2、4及/或5之引子及選自SEQ ID NOs：3及6之探針的用於檢測植物及自其衍生之生物試樣內之一aad-12的套組。使用該套組所製成之一擴增子若與一含SEQ ID NO：3之探針雜交時，則可確認一生物試樣含有一aad-12品件。可提供該套組作為一用於專一性檢測一aad-12品件在植物(或自其衍生的生物試樣)內之存在的方法，或可提供該套組作為一用於檢測許多得自任何不同生物試樣之不同基因轉殖品件的方法。就後者(亦即一用於檢測許多不同基因轉殖品件之套組)而言，該套組可提供呈一微陣列或任何種類之陣列的形式之探針或引子，因此不論經批准或未經批准用於商業化，其可以使該套組的使用者可區別基因轉殖及非基因轉殖試樣、基因轉 殖品件之合子型、及甚至品件之存在或不存在的差異。可藉螢光分析、比色分析、同位素分析或化學發光方法而檢測或計分使用此等套組之某些品件的存在或不存在。
文中所提及或列舉的所有專利案、專利申請案、臨時申請案、及公開案之全文在此併入本案以為參考資料，其併入程度與本專利說明書之詳細教示並不一致。
涵蓋以下實例以闡明用於實踐本發明的程序並說明本發明之某些較佳實施例。這些實施例不應該被視為具限制性。熟悉本項技藝者應該瞭解以下實例中所揭示的教示係代表用以闡明其實踐之較佳模式的特定方法。然而，根據本揭示文，熟悉本項技藝者應該瞭解只要不違背本發明之精神及範圍，這些具體實施例可以有許多變化且仍可獲得同樣或類似結果。除非另有指定，所有百分率為重量%且除非另有表示所有溶劑混合物比例為體積%。
實列
研發一品件專一性TAQMAN ASSAY®以檢測一用於大豆內之該aad-12基因之MGB探針的存在並測定植物在育種群體內的接合狀態。就該aad-12基因在大豆內之專一性檢測而言，係使用兩基因專一性引子擴增一59 bp DNA片段。本PCR產物之擴增係藉一於其5’末端含有該FAM報告基因之靶專一性MGB而測定。測試用於大豆內之該aad-12基因之本特格門(Taqman)檢測法對於各種程度之合子型的大豆品件及與該大豆專一性內生性參考基因(GWS116)呈雙重格式之非基因轉殖大豆的專一性。
gDNA分離
使用Qiagen DNeasy 96 Plant Kit萃取基因組DNA。利用一經改良的Qiagen DNeasy 96 Plant Kit實驗方案，使用每一試樣8片新的大豆葉片進行gDNA萃取。根據賣者的使用說明(Molecular Probes,Eugene,OR)以Pico Green方法定量該gDNA。使試樣經無脫氧核糖核酸酶(DNase)之水稀釋以得到用於本研究之濃度(1.2毫微克/微升)。
特格門檢定及結果
設計專一性特格門引子及探針以經由特格門檢定而檢測大豆內之aad-12基因。這些試劑可併用下文列示的條件以檢測大豆內之該aad-12基因。表1列示所研發之可專一性用於檢測大豆內之該aad-12基因的該等引子及探針序列。
用於擴增之該等多重PCR條件列示在表2內。將混合劑以吸管吸入一384井平皿內，並使用以下條件進行擴增：i)50℃下，費時2分鐘，ii)95℃下，費時10分鐘，iii)95℃下，費時15秒，iv)60℃下，費時60秒，iv)重複步驟iii-iv，費時35次循環，v)維持4℃。在BIO-RAD ICYCLERTM及ABI Gene Amp PCR System 9700熱循環器上進行即時PCR。根據該循環臨限值(Ct)(其係為當該螢光測定達一指定值的PCR循環數)的測定進行數據分析。藉iCycler軟體而自動計算Ct值。
使用標準△△Ct方法以產生接合需求(見第1圖)。首先計算△Ct值，其係為該品件專一性系統之Ct值與各試樣 之參考系統的Ct值之差額。然後接著計算該等△△Ct值，其等係為各未知試樣之△Ct值與該半接合子對照之△Ct值(或若超過一種半接合子對照物的平均值)的差額。可使用以下公式計算各未知試樣之合子型(複製數)需求：一未知試樣之複製數=2△△Ct
具有約1之原始複製數的試樣可以為半合子型，2可以為同合型，而0可以是無效。
對於與作為一參考基因之大豆野生型專一性引子呈雙重格式之同合型、半合型、及無效性試樣進行用於大豆內之該aad-12基因之特格門檢測方法的測試。本檢定可專一性檢測大豆內之該AAD 12且不會產生或擴增得自該等對照物之任何假-正性結果。該等基因專一性引子及探針可用於檢測大豆內之該aad-12且這些條件及試劑可適用於接合性檢定。
<110> 陶氏農業科學公司
<120> 用於檢測植物中芳氧基烷酸酯二氧合酶(AAD-12)的物質和方法
<130> DAS.161X
<150> US 61/548,543
<151> 2011-10-18
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 正向引子
<400> 1
<210> 2
<211> 8
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 反向引子
<400> 2
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 探針
<400> 3
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 正向引子
<400> 4
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造序列
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<223> 反向引子
<400> 5
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 探針
<400> 6

Claims (20)

  1. 一種經單離之引子或探針，其包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6。
  2. 一種經單離之引子或探針，其係由EQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所組成。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之單離探針，其中該探針係經標記。
  4. 如申請專利範圍第3項之單離探針，其中該標記物為放射性同位素、螢光標記物、配位子、化學發光劑或酶。
  5. 一種含一容器及一組成物之套組，該組成物包含選自以下之核酸序列之組合：a)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3；b)SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6；c)SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2；d)SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：5；e)SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：3；f)SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3；g)SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：6；h)SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：4；i)SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：5；j)SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：6； k)SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：4；l)SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：5；m)SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：6；n)SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4；o)SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：5；或p)SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：6。
  6. 如申請專利範圍第5項之套組，其中該等核酸序列中之任一者係經標記。
  7. 如申請專利範圍第6項之套組，其中該標記物為放射性同位素、螢光標記物、配位子、化學發光劑及酶。
  8. 一種測定一大豆植物基因組之DNA之合子型的方法，其包括：a)令一生物試樣與SEQ ID NOs：1及2之引子對接觸，當該引子對在核酸擴增反應中與一生物試樣之基因組DNA一起使用時(該生物試樣包含有來自含品件pDAB4472-1606之大豆植物之生物試樣的基因組DNA)，可產生第一擴增子，該第一擴增子可確認該aad-12基因在該生物試樣之基因組DNA中的存在；(b)進行核酸擴增反應；(c)檢測所產生之第一擴增子；(d)令該同一個生物試樣與一SEQ ID NOs：4及5之第二引子對接觸，當該引子對在核酸擴增反應中與一包含有來自大豆植物之基因組DNA的生物試樣一起使用時，會由引子對之組合產生一擴增子，該擴增子能確認出野生型大豆基因組DNA，該野生型大豆基因組DNA係與具有一經確認為品件pDAB4472-1606之轉殖基因插入物的大豆 基因組區域同源；(e)進行核酸擴增反應；及(f)檢測所產生之第二擴增子；其中：(i)兩擴增子皆被檢測出，表示該大豆試樣是品件pDAB4472-1606之異合型；(ii)僅檢測出該第一擴增子(可確認該aad-12基因的存在)，表示該生物試樣是品件pDAB4472-1606之同合型；且(iii)僅檢測出該第二擴增子，表示在該生物試樣中沒有品件pDAB4472-1606存在。
  9. 如申請專利範圍第8項之方法，其中該第一擴增子可利用一含SEQ ID NO：3之探針來檢測，而該第二擴增子可利用一含SEQ ID NO：6之探針來檢測。
  10. 一種檢測在一生物試樣中存在有與該品件pDAB4472-1606相同之DNA的方法，其包括：(a)令該生物試樣與一引子組接觸，當該引子組係在核酸擴增反應中與由一或多含品件pDAB4472-1606之大豆植物(群)之基因組DNA一起使用時，可產生一能確認該植物為含有品件pDAB4472-1606者的擴增子；(b)進行核酸擴增反應以產生該擴增子；及(c)檢測該擴增子，其中，檢測出該擴增子則表示該與品件pDAB4472-1606相同之DNA存在。
  11. 一種檢測在一生物試樣中存在有與品件pDAB4472-1606相同之DNA之方法，其包括：(a)令該生物試樣與一探針接觸，該探針在嚴厲的雜交條件下可以與來自一含品件pDAB4472-1606之大豆植物的基因組DNA進行雜交，且在該等嚴厲雜交條件下 不會與一對照的大豆植物進行雜交；(b)將該生物試樣與探針置於嚴厲雜交條件下；及(c)檢測該探針與該含品件pDAB4472-1606之DNA的雜交作用，其中，檢測出此雜交作用表示該與品件pDAB4472-1606相同之DNA存在於該植物之基因組內。
  12. 如申請專利範圍第10或11項中任一項之方法，其中該探針包含SEQ ID NO：3。
  13. 一種擴增一生物試樣內之核酸以確認品件pDAB4472-1606存在於一大豆植物之該基因組內的方法，其包括：(a)令一生物試樣與一SEQ ID NOs：1或2之引子對接觸，當該引子對在核酸擴增反應中與一生物試樣之基因組DNA一起使用時(該生物試樣包含有含品件pDAB4472-1606之大豆植物之含基因組DNA之生物試樣的基因組DNA)，可產生一擴增子，該擴增子能確認該aad-12基因存在於該生物試樣之基因組DNA內；(b)進行核酸擴增反應；及(c)檢測一藉該擴增反應而產生的擴增子，其中，檢測出該擴增子表示該生物試樣含有該aad-12基因。
  14. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該擴增子可利用一含SEQ ID NO：3之探針來檢測。
  15. 如申請專利範圍第8、10、11或13項中任一項之方法，其中該生物試樣包含一大豆細胞、大豆組織、大豆莖、大豆根、大豆葉、大豆花或其部份、大豆種子、大豆莢 或其等之任何組合。
  16. 如申請專利範圍第9、12或14項中任一項之方法，其中該探針係經標記。
  17. 如申請專利範圍第16項之方法，其中該探針係經一放性同位素、螢光標記物、配位子、化學發光劑或酶標記。
  18. 一種組成物，其含有一緩衝劑以及一選自於以下之核酸序列之組合：a)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3；b)SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6；c)SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2；d)SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：5；e)SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：3；f)SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3；g)SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：6；h)SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：4；i)SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：5；j)SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：6；k)SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：4；l)SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：5；m)SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：6；n)SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4；o)SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：5；或p)SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：6。
  19. 如申請專利範圍第18項之組成物，其中該等核酸分子之 至少一者係經一放射性同位素或一螢光標記物或一配位子或一化學發光劑或酶標記。
  20. 一種用於測定在一重組型植物內之污染品件的方法，其包括：(a)令一重組型植物之DNA試樣與第一引子對接觸，該DNA試樣係由一含有連續地連接至一基因組DNA之轉殖基因的DNA片段組成，該第一引子對可與含有一連續地連接至一基因組DNA之轉殖基因的DNA片段雜交；(b)進行核酸擴增反應；(c)產生一第一擴增子，其係由該含有一連續地連接至一基因組DNA之轉殖基因的該DNA片段所組成；(d)檢測該第一擴增子；(e)令該重組型植物DNA試樣與第二引子對接觸，該DNA試樣係由含有天然同合型基因之DNA片段所組成，該第二引子對可與該含有天然同合型基因之DNA片段雜交；(f)進行核酸擴增反應；(g)產生一由該天然同合型基因所組成的第二擴增子；(h)檢測該第二擴增子；(i)確定得自該第一及第二擴增子之信號強度約相等，其中該第一及第二擴增子之相等信號強度表示污染品件不存在；(j)令該重組型植物DNA試樣與含有一轉殖基因的第三引子對接觸，該第三引子對可與該含有轉殖基因之DNA片段雜交；(k)進行核酸擴增反應；(l)產生一由該轉殖基因所組成之第三擴增子；(m)檢測該第三擴增子；及(n)確定得自第一及第三擴增子之信號強度約相等，其中該第一及第三擴增子之相等信號強度表示污染品件不存在。
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