KR101772638B1

KR101772638B1 - Ａａｄ-1 이벤트 ｄａｓ-40278-9의 검출

Info

Publication number: KR101772638B1
Application number: KR1020127006871A
Authority: KR
Inventors: 윈싱 코리 추이; 토마스 윌리암 그린; 스티븐 노박; 닝 조우
Original assignee: 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨
Priority date: 2009-08-19
Filing date: 2010-08-18
Publication date: 2017-08-31
Also published as: IL218175A0; IL218175A; MX336072B; AU2010284286A1; CA2771581A1; CA2771581C; RU2577143C2; CN102575299B; BR112012003873A2; WO2011022471A1; KR20120053038A; NZ598598A; IN2012DN01800A; ZA201201210B; JP5771208B2; HK1173194A1; AU2010284286B2; JP2013505706A; CO6511214A2; MX2012002076A

Abstract

부분적으로 본 발명은 제초제 내성 식물, 더욱 구체적으로는 콘(corn) 식물에서의 aad-1 형질전환 이벤트를 검출하는 것에 관련된다. 또한 본 발명은 샘플 (예를 들어, 콘 알곡의 샘플) 내의 대상 이벤트의 존재를 검출하기 위한 분석법을 제공한다. 이러한 분석법을 수행하는데 유용한 키트 및 조건이 또한 제공된다. 본 발명은 대상 방법을 사용하는 식물 육종에 또한 부분적으로 관련된다. 일부 실시양태에서, 상기 이벤트/폴리뉴클레오티드 서열이 다른 형질과 "스태킹(stacking)"될 수 있다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 AAD-1 콘 이벤트 40278-9에 대한 종점 택맨(TaqMan) PCR 분석법에 부분적으로 관련된다. 일부 실시양태는 고처리량 접합성 분석이 가능한 분석법에 관한 것이다. 추가로 본 발명은, 부분적으로, 접합성을 결정하는데 사용하기 위한 바람직한 기준 유전자의 용도에 관련된다.

Description

ＡＡＤ-1 이벤트 ＤＡＳ-40278-9의 검출{DETECTION OF AAD-1 EVENT DAS-40278-9}

배경기술

aad-1 유전자 (스핑고비움 허비사이도보란스(Sphingobium herbicidovorans)로부터 유래됨)는 아릴옥시알카노에이트 다이옥시저네이스(dioxygenase) (AAD-1) 단백질을 코딩한다. 이러한 형질은 2,4-디클로로페녹시아세트산 및 아릴옥시페녹시프로피오네이트 (통상적으로 "폽(fop)" 제초제 예컨대 디클로폽(diclofop) 및 퀴잘로폽(quizalofop)으로 지칭됨) 제초제에 대한 내성을 부여하고, 식물 형질전환 동안 및 육종 배양소에서 선별 마커(selectable marker)로서 사용될 수 있다. 제초제 내성을 위한 aad -1 유전자 자체는 WO 2005/107437에서 최초로 개시되었다 (US 2009-0093366을 또한 참조).

이벤트를 검출하는 다양한 방법이 공지되어 있다. 그러나, 이들 각각에 문제점이 있다. 한 방법은 문헌 [Winge, Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000]에 기술된 바와 같은 파이로시퀀싱(Pyrosequencing) 기술이다. 이러한 방법에서, 인접한 게놈 DNA와 삽입물 DNA 접합부에 중첩되는 올리고뉴클레오티드가 디자인된다. 이러한 올리고뉴클레오티드가 관심 영역으로부터의 단일 가닥 PCR 생성물 (삽입된 서열에서의 프라이머 1개 및 플랭킹(flanking) 게놈 서열에서의 프라이머 1개)에 혼성화되고, DNA 중합효소, ATP, 술프릴레이스(sulfurylase), 루시퍼레이스(luciferase), 애피레이스(apyrase), 아데노신 5' 포스포술페이트 및 루시페린의 존재 하에 인큐베이션된다. DNTP들이 개별적으로 첨가되고, 혼입은 광 신호를 초래하며, 이를 측정한다. 광 신호는 성공적인 증폭, 혼성화 및 단일 또는 다중-염기 확장에 기인하는 트랜스진(transgene) 삽입물/플랭킹 서열의 존재를 가리킨다.

형광 편광은 본 발명의 앰플리콘(amplicon)을 검출하는데 사용될 수 있는 또 다른 방법이다. 이러한 방법에 따라, 플랭킹 게놈 DNA와 삽입된 DNA 접합부에 중첩되는 올리고뉴클레오티드가 디자인된다. 이러한 올리고뉴클레오티드가 관심 영역으로부터의 단일 가닥 PCR 생성물 (삽입된 DNA에서의 프라이머 1개 및 플랭킹 게놈 DNA 서열에서의 프라이머 1개)에 혼성화되고, DNA 중합효소 및 형광-표지 ddNTP의 존재 하에 인큐베이션된다. 단일 염기 확장은 ddNTP의 혼입을 초래한다. 형광계를 사용하여 편광에서의 변화로서 혼입을 측정할 수 있다. 편광에서의 변화는 성공적인 증폭, 혼성화 및 단일 염기 확장에 기인하는 트랜스진 삽입물/플랭킹 서열의 존재를 가리킨다.

몰레큘라 비콘(Molecular Beacon)이 서열 검출에서의 사용에 대해 기술되었다. 간략하게, 플랭킹 게놈 DNA 및 삽입물 DNA 접합부에 중첩되는 FRET 올리고뉴클레오티드 프로브가 디자인된다. FRET 프로브의 독특한 구조는 형광 모이어티(moiety)와 켄칭(quenching) 모이어티를 근접하게 유지시키는 2차 구조를 프로브가 함유하는 것을 초래한다. FRET 프로브 및 PCR 프라이머 (삽입물 DNA 서열에서의 프라이머 1개 및 플랭킹 게놈 서열에서의 프라이머 1개)가 열안정인 중합효소 및 dNTP의 존재 하에 사이클링된다. 성공적인 PCR 증폭 후, 표적 서열에 대한 FRET 프로브의 혼성화는 프로브 2차 구조의 제거 및 형광 모이어티와 켄칭 모이어티의 공간적인 분리를 초래한다. 형광 신호가 초래된다. 형광 신호는 성공적인 증폭 및 혼성화에 기인하는 플랭킹 게놈/트랜스진 삽입물 서열의 존재를 가리킨다.

택맨(TaqMan) (PE 어플라이드 바이오시스템즈(PE Applied Biosystems), 미국 캘리포니아주 포스터 시티)으로 또한 알려진 가수분해 프로브 분석법은 DNA 서열의 존재를 검출 및 정량하는 방법이다. 간략하게, 플랭킹 게놈 DNA 및 삽입물 DNA 접합부에 중첩되는 FRET 올리고뉴클레오티드 프로브가 디자인된다. FRET 프로브 및 PCR 프라이머 (삽입물 DNA 서열에서의 프라이머 1개 및 플랭킹 게놈 서열에서의 프라이머 1개)가 열안정인 중합효소 및 dNTP의 존재 하에 사이클링된다. 특이적인 증폭 동안, 택(Taq) DNA 중합효소가 FRET 프로브 상의 켄칭 모이어티로부터 형광 모이어티를 손질하여 방출시킨다. 형광 신호는 성공적인 증폭 및 혼성화에 기인하는 플랭킹/트랜스진 삽입물 서열의 존재를 가리킨다.

또 다른 난점은, 특히, 소정의 테스트에 대한 적절한 기준 유전자를 발견하는 것이다. 예를 들어, 체코브스키(Czechowski) 등의 요약서에 언급된 바와 같이, "어피메트릭스(Affymetrix) ATH1 전체 게놈 진칩(GeneChip) 연구로부터의 이례적으로 큰 세트의 데이터가 모델 식물 종 아라비돕시스(Arabidopsis) (아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana))에서 발현 수준이 매우 안정적인 새로운 세대의 기준 유전자를 확인하는 수단을 제공하였다. 발육 동안, 그리고 다양한 환경 조건 하에 발현 안정성 면에서 전통적인 기준 유전자들을 능가하는 수백 개의 아라비돕시스 유전자가 발견되었다". (문헌 [Czechowski et al. (2005) Genome-wide identification and testing of superior reference genes for transcript normalization in Arabidopsis. Plant Physiol. 139, 5-17])

문헌 [Brodmann et al. (2002)]는 유럽 연합에서 승인된 4가지 상이한 옥수수 품종에 대한 식품 내의 트랜스제닉(transgenic) 옥수수 함량의 실시간 정량 PCR 검출에 관한 것이다. 문헌 [Brodmann, P.D., P.D., Ilg E.C., Berthoud H., and Herrmann, A. Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction Methods for Four Genetically Modified Maize Varieties and Maize DNA Content in Food. J. of AOAC international 2002 85 (3)].

문헌 [Hernandez et al. (2004)]에서는 실시간 PCR과 함께 사용하기 위한 4가지 가능한 유전자가 언급되었다. 문헌 [Hernandez, M., Duplan, M.-N., Berthier, G., Vaitilingom, M., Hauser, W., Freyer, R., Pla, M., and Bertheau, Y. Development and comparison of four real-time polymerase chain reaction systems for specific detection and quantification of Zea mays L. J. Agric. Food Chem. 2004, 52, 4632-4637].

문헌 [Costa et al. (2007)]에서는 이러한 4개의 유전자가 주목되었고 (또한 실시간 PCR 정황에서), 알콜 탈수소효소 및 제인(zein) 유전자가 트랜스제닉 사료 인터믹스(intermix) 이슈에 대해 샘플 "이벤트" (렉틴 유전자)를 검출하기 위한 최상의 기준 유전자인 것으로 결론지어졌다. 문헌 [Costa, L. D., and Martinelli L. Development of a Real-Time PCR Method Based on Duplo Target Plasmids for Determining an Unexpected Genetically Modified Soybean Intermix with Feed Components. J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 1264-1273)].

문헌 [Huang et al. (2004)]에서는 플라스미드 pMulM2가 옥수수에서의 MON810 및 NK603 트랜스진의 검출을 위한 기준 분자로서 사용되었다. 문헌 [Huang and Pan, "Detection of Genetically Modified Maize MON810 and NK603 by Multiplex and Real-Time Polymerase Chain Reaction Methods," J. Agric. Food Chem., 2004, 52 (11), pp 3264-3268].

문헌 [Gasparic et al. (2008)]에서는 옥수수 이벤트 (예컨대 MON810)를 정량적으로 분석하기 위해, 사이클링 프로브 기술, 택맨, 및 다양한 실시간 PCR 화학에 대한 비교로부터, LNA 기술이 제안되었다. [문헌 [Gasparic, Cankar, Zel, and Gruden, "Comparison of different real-time PCR chemistries and their suitability for detection and quantification of genetically modified organisms," BMC Biotechnol. 2008; 8: 26].

US 20070148646은 혼입된 뉴클레오티드의 양에 의해 검출 및 정량될 수 있는 개별적인 뉴클레오티드들의 제어 분배를 필요로 하는 정량을 위한 프라이머 확장 방법에 관한 것이다. 이는 내부 기준 유전자를 사용하는 택맨 PCR 방법과 상이하다.

TC1507의 동종접합성 유전자형과 반접합성 유전자형을 구별하기 위해, 인베이더(Invader) 분석법이 이러한 이벤트에 대해 성공적으로 사용되었다. 문헌 [Gupta, M., Nirunsuksiri, W., Schulenberg, G., Hartl, T., Novak, S., Bryan, J., Vanopdorp, N., Bing, J. and Thompson, S. A non-PCR-based Invader Assay Quantitatively Detects Single-Copy Genes in Complex Plant Genomes. Mol. Breeding 2008, 21, 173-181].

문헌 [Huabang (2009)]은 트랜스제닉 옥수수의 PCR-기반 접합성 테스트에 관한 것이다. 그러나, 기준 유전자가 사용된 것으로 보이지 않는다. 문헌 [Huabang, "An Accurate and Rapid PCR-Based Zygosity Testing Method for Genetically Modified Maize," Molecular Plant Breeding, 2009, Vol.7, No.3, 619-623].

발명의 개요

본 발명은 샘플 (예를 들어, 콘(corn) 알곡 샘플) 내의 DAS-40278-9로 지정된 AAD-1 콘 이벤트의 존재를 검출하기 위한 분석법을 제공한다. (대표적인 종자가 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection) (ATCC)에 등록 번호 PTA-10244 하에 기탁되었다 (옐로우 덴트(Yellow Dent) 옥수수 잡종 종자 (지아 메이스 엘(Zea Mays L.)):DAS-40278-9; 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨(Dow AgroSciences LLC)를 위해 부다페스트 조약에 따라 기탁됨; ATTC가 종자/균주(들)을 수령한 날짜: 2009년 7월 10일; 2009년 8월 17일에 생육력이 확인됨.) 이러한 분석법을 수행하는데 유용한 키트 및 조건이 또한 제공된다.

더욱 구체적으로, 부분적으로 본 발명은 옥수수 내인성 기준 유전자를 사용하는 콘에서의 AAD-1 이벤트에 대한 종점 택맨 PCR 분석법에 관한 것이다. 일부 실시양태는 고처리량 접합성 분석이 가능한 분석법에 관한 것이다. 추가로 본 발명은, 부분적으로, 접합성을 결정하는데 사용하기 위한 바람직한 인버테이스(invertase) 기준 유전자의 발견에 관한 것이다.

따라서, 부분적으로 본 발명은 본 발명의 검출 방법 중 임의의 것이 혼입된 식물 육종에 또한 관련된다. 일부 실시양태에서, 상기 이벤트는 기타 제초제 내성 유전자(들) 및/또는 곤충-억제 단백질이 예를 들어 포함되는 다른 형질과 "스태킹(stacking)"될 수 있다. 대상 절차는 본 발명의 이벤트를 포함하는 콘 계통을 독특하게 확인하는데 사용될 수 있다.

도면의 간단한 설명
도 1은 콘 이벤트 DAS-40278-9에서의 DNA 삽입물에 대한 클로닝 전략을 나타낸다.
도 2는 콘 이벤트 DAS-40278-9의 플랭킹 경계 영역의 확증을 위한 PCR 증폭에서 사용된 프라이머들의 도면이다. 이러한 개략도는 5' 경계에서 3' 경계까지 AAD-1 콘 이벤트 DAS-40278-9의 전장 시퀀싱(sequencing)을 확증하기 위한 프라이머 위치들을 도시한다.
도 3은 콘 이벤트 DAS-40278-9로부터의 플랭킹 경계 서열에 대한 클로닝 전략을 나타낸다. 콘 이벤트 DAS-40278-9의 게놈 DNA를 EcoR V, Stu I, 또는 Sca I로 소화시켜, 상응하는 게놈워커(GenomeWalker)™ 라이브러리가 생성되었고, 이를 표적 DNA 서열을 증폭시키기 위한 주형으로서 사용하였다.
서열의 간단한 설명
서열 1은 콘 이벤트 DAS-40278-9에 대한, AAD-1 삽입물의 어느 한쪽 측면 상의 5' 및 3' 게놈 플랭킹 서열 (삽입물 포함)을 제공한다.
서열 2-7은 본 발명에 따라 사용하기 위한 프라이머 및 프로브이다.
서열 8은 예시된 이벤트 앰플리콘이다.
서열 9는 예시된 기준 앰플리콘이다.

발명의 상세한 설명

트랜스제닉 AAD-1 (제초제 내성을 제공함) 콘 이벤트 DAS-40278-9는 위스커(Whisker)-매개 형질전환에 의해 생성되었다. USSN 61/235,248 (2009년 8월 19일 출원)에 상술된 바와 같이 이러한 AAD-1 트랜스진 삽입물의 5' 및 3' 말단 플랭킹 서열 양쪽 모두가 클로닝, 시퀀싱 및 특징화되었다.

특이적 택맨 프라이머 및 프로브가, 부분적으로 5' 삽입물-대-식물 접합부에 위치하는 DNA 서열에 따라, 본원에 상술된 바와 같이 디자인되었다. 프라이머 및 프로브의 이벤트 특이성이 16개의 상이한 AAD-1 콘 이벤트 및 2개의 비-트랜스제닉 콘 품종에 대해 실시간 PCR에서 콘 인버테이스를 기준 유전자로 하여 2중 양식으로 성공적으로 테스트되었다. AAD-1 콘 DAS-40278-9에 대한 종점 이벤트 특이적 택맨 분석법에 대한 절차가 본원에 상술된 바와 같이 개발되었다.

이러한 AAD-1 콘 내의 숙주 식물 DNA와 통합된 유전자 구축물 사이의 통합 접합부 영역에 스패닝된 서열은 독특한 서열이다. 이를 사용하여, GMO 테스트를 위해 AAD-1 콘 DAS-40278-9의 존재를 검출하기 위한, 그리고 육종 집단 내의 식물의 접합성 상태를 결정하기 위한 이벤트 특이적 분석법 (통상적인 PCR 또는 실시간 PCR)을 개발하였다. 본 명세서에 보고된 이벤트 특이적 택맨 분석법은 양자의 용도를 위해 채용될 수 있다.

본 발명은 샘플 내의 대상 트랜스제닉 콘 이벤트 DAS-40278-9 (pDAS 1740-278로 또한 공지됨)의 존재를 검출하기 위한 분석법을 제공한다. 본 발명의 측면들은 본원에서 예시 또는 제안된 임의의 진단용 핵산 분자를 디자인 및/또는 생산하는 방법을 포함한다.

본 발명은 임의의 이러한 방법이 혼입된 식물 육종에 또한 부분적으로 관련된다. 일부 실시양태에서, 대상 이벤트가 다른 형질 (예를 들어, 기타 제초제 내성 유전자(들) 및/또는 곤충-억제 단백질을 코딩하는 유전자(들))과 스태킹될 수 있다. 대상 이벤트를 포함하는 식물 계통이 본원에서 개시 및 제안된 서열들을 사용하여 검출될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 제초제-내성 콘 계통의 확인에 관한 것이다. 부분적으로 본 발명은 유성 교배의 자손이 관심 이벤트를 함유하는지 여부를 결정하기 위해 대상 이벤트의 존재를 검출하는 것에 관한 것이다. 또한, 이벤트를 검출하는 방법이, 예를 들어, 재조합 농작물로부터 유래된 식품의 시판전 승인 및 표기를 필요로 하는 규정을 따르기 위해 포함되고 이에 유용하다.

부분적으로 본 발명은 AAD-1 옥수수 이벤트의 고처리량 접합성 분석을 위한 기준 (카피수) 대조물로서 내인성 유전자를 사용하는 형광-기반 종점 택맨 PCR 분석법에 관한 것이다. 추가로 본 발명은, 부분적으로, 바람직한 기준 유전자인 인버테이스의 발견에 관한 것이다. 여러 기준 유전자가 가능한 선택권으로서 확인되었다.

본 발명은 AAD-1 이벤트 특이적 접합성 분석을 위한 바이플렉스(biplex) 종점 택맨 PCR의 개발에 또한 부분적으로 관련된다. 추가로, 본 발명은 AAD-1 육종 테스트 키트의 개발에 부분적으로 관련된다.

종점 택맨 분석법은 "플러스"는 분석된 유전자에 대해 샘플이 양성이라는 것을 나타내고, "마이너스"는 분석된 유전자에 대해 샘플이 음성이라는 것을 나타내는 플러스/마이너스 전략을 기초로 한다. 전형적으로 이러한 분석법은 AAD-1 트랜스진 서열 및 야생형 유전자 서열을 각각 확인하기 위한 2개의 올리고뉴클레오티드 세트, 뿐만 아니라 트랜스진 및 야생형 서열의 함량을 측정하기 위한 이중-표지 프로브를 사용한다.

인베이더 분석법은 이벤트 특성화를 위한 견실한 기술이지만, DNA 품질에 매우 민감하다. 더욱이, 이러한 분석법은 다량의 DNA를 필요로 한다. 인베이더는 추가적인 변성 단계를 또한 필요로 하고, 이러한 단계는, 적합하게 취급되지 않으면, 인베이더 분석법을 성공적이지 못하게 할 수 있다. 추가적으로, 인베이더 분석법의 더 긴 분석법 시간이 상업적인 환경에서의 분석을 위해 다수의 AAD-1 샘플을 효율적으로 취급하기 위한 이의 유연성에서 제한된다. 본 발명의 한가지 주요 장점은 시간 절약 및 변성 단계의 제거이다.

AAD-1 이벤트를 검출하기 위한 대상 종점 택맨 분석은, 특히 다수의 샘플을 분석하는 것에서, 인베이더에 비해 놀라운 장점을 제공한다.

본 발명은 콘, 대두 및 면이 포함되는 작물에서의 AAD-1 제초제 내성 형질의 개발 및 특징화에 영향을 미칠 수 있다.

본 발명을 기술하는 것을 돕고 본 발명을 실행하도록 당업자에게 지침이 되도록 정의 및 예가 본원에서 제공된다. 달리 언급되지 않는 한, 용어들은 관련 분야의 당업자에 의한 통상적인 용법에 따라 이해되어야 한다. 37 CFR §1.822에 기재된 바와 같은 DNA 염기에 대한 명명법이 사용된다. 본원에서 사용된 용어 "자손"은 AAD-1 콘 이벤트 DAS-40278-9를 포함하는 어버이 식물의 임의의 세대의 후손을 의미한다.

트랜스제닉 "이벤트"는 이종성 DNA, 즉 관심 트랜스진 유전자를 포함하는 핵산 구축물로의 식물 세포의 형질전환, 식물 게놈 내로의 트랜스진의 삽입으로부터 초래되는 식물 집단의 재생, 및 특정 게놈 위치 내로의 삽입을 특징으로 하는 특정 식물의 선별에 의해 생산된다. 용어 "이벤트"는 이러한 이종성 DNA를 포함하는 본래의 형질전환체 및 형질전환체의 자손을 지칭한다. 용어 "이벤트"는 이러한 게놈/트랜스진 DNA를 포함하는 또 다른 품종과 형질전환체 간의 유성 이종교배(outcross)에 의해 생산된 자손을 또한 지칭한다. 반복친(recurrent parent)으로의 반복된 역-교배(back-crossing) 후에도, 형질전환된 어버이로부터의 삽입된 트랜스진 DNA 및 플랭킹 게놈 DNA (게놈/트랜스진 DNA)가 동일한 염색체 위치에서 교배 자손 내에 존재한다. 용어 "이벤트"는 삽입된 DNA를 포함하는 한 어버이 계통 (예를 들어, 본래의 형질전환체 및 자가생식(selfing)으로부터 초래된 자손)과 삽입된 DNA를 함유하지 않는 어버이 계통 간의 유성 교배의 결과로서 관심 트랜스진을 포함하는 삽입된 DNA를 받는 자손으로 전달될 것으로 예상되는, 삽입된 DNA 및 삽입된 DNA에 바로 인접하는 플랭킹 게놈 서열을 포함하는 본래의 형질전환체 및 이의 자손으로부터의 DNA를 또한 지칭한다.

"접합부 서열"은 게놈 내로 삽입된 DNA가 삽입 지점에 플랭킹된 콘 천연 게놈으로부터의 DNA에 연결되는 지점에 스패닝된다. 본원에 기술된 콘 이벤트에서의 삽입물 및 유사한 길이의 플랭킹 DNA에 스패닝되는 DNA 서열이 포함된다.

본 발명은 대상 이벤트의 확인에 관한 것이다. 관련된 PCR 프라이머 및 앰플리콘이 본 발명에 포함된다. 이러한 분자들은 대상 트랜스제닉 콘 계통으로부터 유래된 시판되는 트랜스제닉 콘 품종 또는 계통을 검출 또는 확인하는데 사용될 수 있다.

각각의 플랭킹 서열 부분과 함께 삽입물의 전체 서열이 본원에서 서열 1로서 제공된다. 서열 1 (총 8557개의 염기쌍)과 관련된 이러한 이벤트에 대한 삽입물 및 플랭킹 서열의 좌표가 하기에 인쇄된다.

이러한 이벤트에 대한 AAD-1 삽입물 및 플랭킹 서열의 성분들이 도 1 내지 3에서 추가로 설명된다.

자손에서 하나 이상의 추가적인 관심 형질을 부여하기 위한 노력으로 관심 이벤트를 포함하는 어버이 식물이 또 다른 식물 계통과 교배된 후 어떤 자손 식물이 소정의 이벤트를 포함하는지를 결정하기 위해, 식물 육종에 관련하여 본 발명의 검출 기술이 사용될 수 있다. 대상 방법은, 예를 들어, 콘 육종 프로그램뿐만 아니라 품질 제어에서, 특히 시판되는 트랜스제닉 콘 종자에 대해, 유용하다. 이는 제품 등록 및 제품 책임제를 또한 이롭게 할 수 있다. 이러한 방법들은 가속 육종 전략에 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 접합성 분석을 위한 형광-기반 종점 택맨 분석법은 콘 내의 AAD-1 이벤트 및 기준 유전자의 확인을 위해 결과가 플레이트 판독기에서 직접적으로 판독되도록 한다.

본 발명은 다른 콘 계통 내로의 AAD-1 이벤트의 유전자침투(introgression)를 테스팅하는 것과 같은 육종 용도를 포함한다.

본 발명에 따른 이벤트를 확인하는데 본 발명의 검출 방법 및 키트가 사용될 수 있다. 가속 육종 전략에, 그리고 연관 데이터를 확립하는데 본 발명의 방법 및 키트가 사용될 수 있다.

자손에서 하나 이상의 추가적인 관심 형질을 부여하기 위한 노력으로 관심 이벤트를 포함하는 어버이 식물이 또 다른 식물 계통과 교배된 후 어떤 자손 식물이 소정의 이벤트를 포함하는지를 결정하기 위해, 식물 육종에 관련하여 본 발명의 검출 기술이 특히 유용하다. 이러한 택맨 PCR 분석 방법은 옥수수 육종 프로그램뿐만 아니라 품질 제어를, 특히 시판되는 트랜스제닉 옥수수 종자에 대해, 이롭게 한다. 이러한 트랜스제닉 옥수수 계통들에 대한 택맨 PCR 검출 키트들이 또한 제조되어 사용될 수 있다. 이는 제품 등록 및 제품 책임제를 또한 이롭게 할 수 있다.

추가로, 대상 방법은 트랜스진 통합 프로세스, 게놈 통합 부위 특징, 이벤트 분류, 트랜스진 및 이의 플랭킹 서열의 안정성, 및 유전자 발현 (특히, 유전자 침묵화, 트랜스진 메틸화 패턴, 위치 효과, 및 잠재적인 발현-관련 요소 예컨대 MARS [매트릭스 부착 영역] 등과 관련됨)을 연구 및 특성화하는데 사용될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "콘"은 옥수수 (지아 메이스)를 의미하고, 콘과 육종될 수 있는 이의 모든 품종을 포함한다.

추가로 본 발명은 교배물을 제조하고 본 발명의 방법을 사용하는 방법을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 예시된 식물을 상이한 (예를 들어, 근교배(in-bred) 어버이) 식물과 교배시키고, 생성된 잡종 종자를 수확하고, 대상 이벤트에 대해 검출함으로써 F₁ 잡종 종자를 생산하는 방법을 포함한다. 생성된 식물의 특징이 본 발명의 방법을 혼입함으로써 또한 개선될 수 있다.

먼저 본원에서 언급된 계통의 종자로부터 성장된 콘 식물로 구성되는 제1 어버이 콘 식물과 제2 어버이 콘 식물을 유성 교배시킴으로써 다수의 제1 자손 식물을 생산하는 단계; 그 후, 제초제에 대해 저항성인 (또는 대상 이벤트를 보유하는) 제1 자손 식물을 선별하는 단계; 제1 자손 식물을 자가생식시킴으로써 다수의 제2 자손 식물을 생산하는 단계; 그 후, 제2 자손 식물로부터 제초제에 대해 저항성인 (또는 이벤트들 중 하나 이상을 보유하는) 식물을 선별하는 단계에 의해 제초제-내성 콘 식물이 육종될 수 있다. 이러한 단계들은 제1 자손 식물 또는 제2 자손 식물의 제2 어버이 콘 식물 또는 제3 어버이 콘 식물로의 역-교배를 추가로 포함할 수 있다. 그 후, 본 발명의 콘 종자를 포함하는 콘 작물, 또는 이의 자손을 심을 수 있다.

독립적으로 분리되는 2개의 첨가된 외인성 유전자를 함유하는 후손을 생산하도록 2개의 상이한 트랜스제닉 식물이 또한 짝짓기될 수 있음을 또한 이해하여야 한다. 적합한 자손의 자가생식으로 첨가된 양쪽 외인성 유전자에 대해 동종접합성인 식물이 생산될 수 있다. 어버이 식물로의 역-교배 및 비-트랜스제닉 식물과의 이종-교배가 또한 구상되고, 무성 번식이 또한 구상된다. 상이한 형질 및 작물에 통상적으로 사용되는 기타 육종 방법들이 당업계에 공지되어 있다. 역교배 육종은 단순하게 유전되는 고도로 유전성인 형질에 대한 유전자를 반복친인 바람직한 동종 접합성 재배종 또는 근교배 계통 내로 전달하는데 사용되었다. 전달되는 형질의 공급원은 도너(donor) 어버이로 칭해진다. 생성된 식물은 반복친 (예를 들어, 재배종)의 속성 및 도너 어버이로부터 전달된 원하는 형질을 지닐 것으로 예상된다. 초기 교배 후, 도너 어버이의 표현형을 보유하는 개체를 선별하고, 반복적으로 반복친에 교배 (역교배)시킨다. 생성된 어버이는 반복친 (예를 들어, 재배종)의 속성 및 도너 어버이로부터 전달된 원하는 형질을 지닐 것으로 예상된다.

마커 보조 육종 (MAB) 방법과 관련하여 본 발명이 사용될 수 있다. 유사하게, 본 발명의 DNA 분자가 유전적으로 연관된 농학적으로 유용한 형질들을 확인하는 다른 방법 (예컨대, AFLP 마커, RFLP 마커, RAPD 마커, SNP, 및 SSR)과 함께 사용될 수 있다. MAB 방법을 사용하여 교배 후손 (또는 이의 후손 및 임의의 기타 콘 재배종 또는 품종)에서 제초제-저항성 형질을 추적할 수 있다. 대상 이벤트가 있는 임의의 콘 품종을 확인하는데 본 발명의 방법이 사용될 수 있다.

본 발명의 방법은 대상 이벤트가 있는 식물과의 육종을 포함하는, 제초제-내성 콘 식물을 생산하는 방법을 포함한다. 바람직한 방법은 본 발명에 따라 검출가능한 이벤트에 대해 자손을 분석함으로써 상기 교배의 자손을 선별하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 다른 바람직한 형질, 예컨대 작물학 형질을 포함하는 식물과의 육종 사이클 동안 대상 이벤트를 추적하는데 본 발명이 사용될 수 있다. 예를 들어, 대상 이벤트 및 원하는 형질을 포함하는 식물을 검출하고, 확인하고, 선별하여, 추가적인 육종 라운드에서 신속하게 사용할 수 있다. 대상 이벤트/형질이 또한 육종 동안 곤충 저항성 형질(들) 및/또는 추가적인 제초제 내성 형질과 조합될 수 있고, 이와 함께 본 발명에 따라 추적될 수 있다. 후자의 바람직한 실시양태는 이미다졸리논 제초제, 글리포세이트, 및/또는 글루포시네이트에 대한 저항성을 코딩하는 유전자와 조합된 대상 이벤트를 포함하는 식물이다. 디캄바 내성 유전자가 일부 실시양태에서 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명이, 예를 들어, 글리포세이트 저항성 (예를 들어, 저항성 식물 또는 박테리아 EPSPS, GOX, GAT), 글루포시네이트 저항성 (예를 들어, Pat, bar), 아세토락테이트 신테이스(synthase) (ALS)-억제 제초제 저항성 (예를 들어, 이미다졸리논 [예컨대 이마제타피르], 술포닐우레아, 트리아졸로피리미딘 술폰아닐리드, 피리미디닐티오벤조에이트, 및 기타 화학물질 [Csr1, SurA 등]), 브로목시닐 저항성 (예를 들어, Bxn), HPPD (4-히드록시페닐-피루베이트-다이옥시저네이스) 효소의 억제제에 대한 저항성, 파이토엔 디새튜레이스(desaturase) (PDS)의 억제제에 대한 저항성, 광화학계 II 억제 제초제에 대한 저항성 (예를 들어, psbA), 광화학계 I 억제 제초제에 대한 저항성, 프로토포르피리노겐 옥시데이스(oxidase) IX (PPO)-억제 제초제에 대한 저항성 (예를 들어, PPO -1), 페닐우레아 제초제에 대한 저항성 (예를 들어, CYP76B1), 디캄바-분해 효소 (예를 들어, US 20030135879 참조) 등을 코딩하는 형질과 조합될 수 있고, 이들이 단독으로 또는 다중 조합으로 스태킹되어, 잡초 시프트(weed shift)를 효과적으로 제어 또는 방지하는 능력 및/또는 상기 언급된 클래스의 임의의 제초제에 대한 저항성을 제공할 수 있다.

추가적인 제초제와 관련하여, 일부 추가적인 바람직한 ALS (AHAS로 또한 공지됨) 억제제에는 트리아졸로피리미딘 술폰아닐리드 (예컨대 클로란술람-메틸, 디클로술람, 플로라술람, 플루메트술람, 메토술람, 및 페녹스술람), 피리미디닐티오벤조에이트 (예컨대 비스피리박 및 피리티오박), 및 플루카르바존이 포함된다. 일부 바람직한 HPPD 억제제에는 메소트리온, 이속사플루톨, 및 술코트리온이 포함된다. 일부 바람직한 PPO 억제제에는 플루미클로락, 플루미옥사진, 플루펜피르, 피라플루펜, 플루티아셋, 부타페나실, 카르펜트라존, 술펜트라존, 및 디페닐에테르 (예컨대 아시플루오르펜, 포메사펜, 락토펜, 및 옥시플루오르펜)가 포함된다.

추가적으로, 단독 AAD -1 또는 하나 이상의 추가적인 HTC 형질과 조합된 AAD -1이 하나 이상의 추가적인 입력(input) 형질 (예를 들어, 곤충 저항성, 진균류 저항성, 또는 스트레스 내성 등) 또는 출력(output) 형질 (예를 들어, 증가된 수율, 개선된 오일 프로파일, 개선된 섬유 품질 등)과 스태킹될 수 있다. 따라서, 본 발명은 다양한 작물학 해충을 유연하게, 그리고 비용 효과적으로 제어하는 능력과 개선된 작물 품질의 완전한 작물학 패키지를 제공하는데 사용될 수 있다.

본원에서 사용된 "계통"은 하나 이상의 형질에 대해 개체들 간에 유전적 변이를 거의 나타내지 않거나 나타내지 않는 일군의 식물이다. 이같은 계통은 여러 세대의 자가-수분 및 선별, 또는 조직 또는 세포 배양 기술을 사용한 편친(single parent)으로부터의 무성 번식에 의해 생성될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "재배종" 및 "품종"은 동의어이고, 상업적인 생산에 사용되는 계통을 지칭한다.

"안정성" 또는 "안정적"은 소정의 성분과 관련하여, 이러한 성분이 세대에서 세대로, 바람직하게는 3대 이상 동안, 실질적으로 동일한 수준, 예를 들어, 바람직하게는 ±15％, 더욱 바람직하게는 ±10％, 가장 바람직하게는 ±5％에서 유지되는 것을 의미한다. 안정성은 온도, 장소, 스트레스 및 식재 시기에 영향을 받을 수 있다. 야외 조건 하에서의 후속 세대들의 비교가 유사한 방식으로 이러한 성분을 생산하여야 한다.

"상업적 유용성"은 양호한 식물 생장력 및 높은 번식력이 있어서, 통상적인 농업 설비를 사용하여 농부가 작물을 생산할 수 있고, 기술된 성분들이 있는 오일이 통상적인 분쇄 및 추출 설비를 사용하여 종자로부터 추출될 수 있는 것으로 정의된다. 상업적으로 유용하기 위해, 종자 중량, 오일 함량 및 에이커 당 생산된 전체 오일에 의해 측정되는 바와 같은 수율은 동일한 영역에서 성장된, 다른 면에서는 유사한 프리미엄 가치의 형질이 없는 시판되는 옥수수 품종의 평균 수율의 15％ 이내이다.

"작물학적으로 우수한(elite)"은 계통이, 대상 이벤트(들)에 기인하는 곤충 저항성에 더하여, 바람직한 작물학적 특징 예컨대 수율, 숙성도, 질환 저항성 등을 지니는 것을 의미한다. 개별적으로 또는 임의의 조합으로 취해진 작물학적 형질.

당업자가 본 개시내용의 견지에서 인지할 바와 같이, 검출 키트의 바람직한 실시양태는, 예를 들어, 프로브 및/또는 프라이머를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이는 본원에서 지시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 프로브, 프라이머 및/또는 앰플리콘을 포함한다.

당업자는 이러한 프라이머 및 프로브가 광범위한 표준 혼성화 및/또는 PCR 조건 하에 서열 1 (또는 이의 상보물)의 절편, 및 이의 상보물에 혼성화하도록 디자인될 수 있고, 이때 프라이머 또는 프로브는 예시된 서열에 대해 완벽하게 상보적이지 않다는 것을 또한 인지할 것이다. 즉, 어느 정도의 미스매치(mismatch)가 허용될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 약 20개의 프라이머에 대해, 앰플리콘을 마주 보는 프라이머의 내부 또는 끝부분에 미스매치 염기가 있는 경우 전형적으로 1개 또는 2개 정도의 뉴클레오티드가 반대 가닥과 결합할 필요가 없다. 다양한 적합한 혼성화 조건이 하기에서 제공된다. 합성 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 이노신이 또한 프로브에서 사용될 수 있다. DNA 및 RNA 프로브뿐만 아니라, 펩티드 핵산 (PNA) 프로브가 또한 사용될 수 있다. 중요한 것은 이같은 프로브 및 프라이머가 본 발명의 이벤트의 존재에 대해 진단적이다 (이를 독특하게 확인 및 구별할 수 있다)는 것이다.

각각의 "삽입물"의 성분들이 도 1 내지 3에서 도해된다. 이러한 성분들의 DNA 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편이 본 발명의 방법에서 DNA 프라이머 또는 프로브로서 사용될 수 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 콘 식물로부터, 식물 및 종자 등 내의 트랜스진/게놈 삽입 영역의 존재를 검출하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다.

일부 실시양태에서, 신규 트랜스진/게놈 삽입 영역의 연속적인 단편을 포함하는 DNA 서열이 본 발명의 측면이다. 충분한 길이의 트랜스진 삽입물 서열의 폴리뉴클레오티드 및 충분한 길이의 콘 게놈 서열의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 서열, 및/또는 이러한 콘 식물들 중 하나 이상에 대해 진단적인 앰플리콘 생성물의 생산을 위한 프라이머 서열로서 유용한 서열이 포함된다.

관련된 실시양태는 본원에서 확인된 DNA 서열의 트랜스진 부분의 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개 또는 이를 초과하는 개수의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 DNA 서열, 또는 이의 상보물에 관한 것이다. DNA 증폭 방법에서 이같은 서열이 DNA 프라이머로서 유용할 수 있다. 이러한 프라이머를 사용하여 생산된 앰플리콘은 본원에서 언급되는 콘 이벤트에 대해 진단적이다. 따라서, 본 발명은 이같은 DNA 프라이머 및 상동성 프라이머에 의해 생산된 앰플리콘 및 앰플리콘을 또한 포함한다.

본 발명은 샘플 내의 본원에서 언급된 콘 이벤트에 상응하는 DNA의 존재를 검출하는 방법을 포함한다. 이같은 방법은 (a) DNA를 포함하는 샘플을 이러한 콘 이벤트들 중 하나 이상으로부터의 DNA와 함께 핵산 증폭 반응에서 사용되는 경우 상기 이벤트(들)에 대해 진단적인 앰플리콘을 생산하는 프라이머 세트와 접촉시키는 단계; (b) 핵산 증폭 반응을 수행함으로써, 앰플리콘을 생산하는 단계; 및 (c) 앰플리콘을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.

추가적인 본 발명의 검출 방법은 (a) DNA를 포함하는 샘플을 엄격한 혼성화 조건 하에 상기 콘 이벤트들 중 하나 이상으로부터의 DNA와 혼성화하고 엄격한 혼성화 조건 하에 대조군 콘 식물 (비-관심 이벤트 DNA)과 혼성화하지 않는 프로브와 접촉시키는 단계; (b) 샘플 및 프로브를 엄격한 혼성화 조건에 적용하는 단계; 및 (c) DNA에 대한 프로브의 혼성화를 검출하는 단계를 포함하는, 샘플 내의 상기 이벤트들 중 하나 이상에 상응하는 DNA의 존재를 검출하는 방법을 포함한다.

본 발명은 샘플 내의 본원에서 언급된 옥수수 식물들 중 하나 이상으로부터의 DNA의 존재를 검출하는 방법을 포함한다. 이같은 방법은 (a) DNA를 포함하는 샘플을 이러한 옥수수 이벤트들 중 하나 이상으로부터의 DNA와 함께 본 발명의 핵산 증폭 반응에서 사용되는 경우 프라이머 세트와 접촉시키는 단계; (b) 본원에서 확인된 기준 유전자를 사용하여 택맨 PCR 증폭 반응을 수행하는 단계; 및 (c) 결과를 분석하는 단계를 포함할 수 있다.

추가적인 실시양태에서, 본 발명은 (a) 제1 어버이 콘 계통 (상기 제초제 저항성 형질을 상기 계통의 식물에게 부여하는 본 발명의 발현 카세트를 포함함) 및 제2 어버이 콘 계통 (이러한 제초제 내성 형질이 없음)을 유성 교배시켜, 다수의 자손 식물을 생산하는 단계; 및 (b) 분자 마커를 사용하여 자손 식물을 선별하는 단계를 포함하는, 본 발명의 AAD-1 이벤트를 포함하는 콘 식물을 생산하는 방법을 포함한다. 이같은 방법은 자손 식물을 제2 어버이 콘 계통에 역-교배시켜 상기 제초제 내성 형질을 포함하는 순계(true-breeding) 콘 식물을 생산하는 추가적인 단계를 임의적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 대상 이벤트를 수반하는 교배 자손의 접합성을 결정하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 콘 DNA를 포함하는 샘플을 본 발명의 프라이머 세트와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 프라이머들은, 상기 콘 이벤트들 중 하나 이상으로부터의 게놈 DNA와 함께 핵산 증폭 반응에서 사용되는 경우 상기 콘 이벤트들 중 하나 이상에 대해 진단적인 제1 앰플리콘을 생산한다. 이같은 방법은 핵산 증폭 반응을 수행함으로써 제1 앰플리콘을 생산하는 단계; 제1 앰플리콘을 검출하는 단계; 및 콘 DNA를 포함하는 샘플을 콘 식물로부터의 게놈 DNA와 함께 핵산 증폭 반응에서 사용되는 경우 콘 게놈 영역에 대해 상동성인 천연 콘 게놈 DNA를 포함하는 제2 앰플리콘을 생산하는 상기 프라이머 세트와 접촉시키는 단계; 및 핵산 증폭 반응을 수행함으로써 제2 앰플리콘을 생산하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 제2 앰플리콘을 검출하는 단계, 및 샘플 내의 제1 및 제2 앰플리콘을 비교하고, 이때 양쪽 앰플리콘의 존재는 샘플이 트랜스진 삽입에 대해 이종접합성이라는 것을 가리키는 단계를 추가로 포함한다.

본원에 개시된 조성물 및 DNA 검출 분야에 주지된 방법을 사용하여 DNA 검출 키트가 개발될 수 있다. 이러한 키트는 샘플 내의 대상 콘 이벤트 DNA의 확인에 유용하고, 이러한 DNA를 함유하는 콘 식물을 육종하는 방법에 적용될 수 있다. 이러한 키트는 앰플리콘 (예를 들어, 본원에 개시된 것)에 대해 상동성 또는 상보적인 DNA 서열, 또는 대상 이벤트의 트랜스진 유전 요소 내에 함유된 DNA에 대해 상동성 또는 상보적인 DNA 서열을 함유한다. 이러한 DNA 서열은 DNA 증폭 반응에서 또는 프로브로서 DNA 혼성화 방법에서 사용될 수 있다. 키트는 검출 방법의 수행에 필요한 시약 및 물질을 또한 함유할 수 있다.

"프로브"는 통상적인 검출가능한 표지 또는 리포터 분자 (예컨대 방사성 동위원소, 리간드, 화학발광제 또는 효소)에 부착된 단리된 핵산 분자이다. 이같은 프로브는 표적 핵산의 가닥에 상보적이고, 본 발명의 경우에는 콘 식물로부터 유래되든 또는 이벤트로부터의 DNA를 포함하는 샘플로부터 유래되든 상기 콘 이벤트들 중 하나로부터의 게놈 DNA의 가닥에 상보적이다. 본 발명에 따른 프로브는 디옥시리보핵산 또는 리보핵산뿐만 아니라, 표적 DNA 서열에 특이적으로 결합하고 이러한 표적 DNA 서열의 존재를 검출하는데 사용될 수 있는 폴리아미드 및 기타 프로브 물질을 또한 포함한다.

"프라이머"는 상보적인 표적 DNA 가닥에 핵산 혼성화에 의해 어닐링(annealing)하여 프라이머와 표적 DNA 가닥 간의 하이브리드를 형성한 후, 표적 DNA 가닥을 따라 중합효소, 예를 들어, DNA 중합효소에 의해 확장되는 단리된/합성된 핵산이다. 본 발명의 프라이머 쌍은 표적 핵산 서열의 증폭, 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 또는 기타 통상적인 핵산 증폭 방법에 의한 증폭을 위한 이의 사용을 지칭한다.

프로브 및 프라이머의 길이는 일반적으로 폴리뉴클레오티드 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 51개, 52개, 53개, 54개, 55개, 56개, 57개, 58개, 59개, 60개, 61개, 62개, 63개, 64개, 65개, 66개, 67개, 68개, 69개, 70개, 71개, 72개, 73개, 74개, 75개, 76개, 77개, 78개, 79개, 80개, 81개, 82개, 83개, 84개, 85개, 86개, 87개, 88개, 89개, 90개, 91개, 92개, 93개, 94개, 95개, 96개, 97개, 98개, 99개, 100개, 101개, 102개, 103개, 104개, 105개, 106개, 107개, 108개, 109개, 110개, 111개, 112개, 113개, 114개, 115개, 116개, 117개, 118개, 119개, 120개, 121개, 122개, 123개, 124개, 125개, 126개, 127개, 128개, 129개, 130개, 131개, 132개, 133개, 134개, 135개, 136개, 137개, 138개, 139개, 140개, 141개, 142개, 143개, 144개, 145개, 146개, 147개, 148개, 149개, 150개, 151개, 152개, 153개, 154개, 155개, 156개, 157개, 158개, 159개, 160개, 161개, 162개, 163개, 164개, 165개, 166개, 167개, 168개, 169개, 170개, 171개, 172개, 173개, 174개, 175개, 176개, 177개, 178개, 179개, 180개, 181개, 182개, 183개, 184개, 185개, 186개, 187개, 188개, 189개, 190개, 191개, 192개, 193개, 194개, 195개, 196개, 197개, 198개, 199개, 200개, 201개, 202개, 203개, 204개, 205개, 206개, 207개, 208개, 209개, 210개, 211개, 212개, 213개, 214개, 215개, 216개, 217개, 218개, 219개, 220개, 221개, 222개, 223개, 224개, 225개, 226개, 227개, 228개, 229개, 230개, 231개, 232개, 233개, 234개, 235개, 236개, 237개, 238개, 239개, 240개, 241개, 242개, 243개, 244개, 245개, 246개, 247개, 248개, 249개, 250개, 251개, 252개, 253개, 254개, 255개, 256개, 257개, 258개, 259개, 260개, 261개, 262개, 263개, 264개, 265개, 266개, 267개, 268개, 269개, 270개, 271개, 272개, 273개, 274개, 275개, 276개, 277개, 278개, 279개, 280개, 281개, 282개, 283개, 284개, 285개, 286개, 287개, 288개, 289개, 290개, 291개, 292개, 293개, 294개, 295개, 296개, 297개, 298개, 299개, 300개, 301개, 302개, 303개, 304개, 305개, 306개, 307개, 308개, 309개, 310개, 311개, 312개, 313개, 314개, 315개, 316개, 317개, 318개, 319개, 320개, 321개, 322개, 323개, 324개, 325개, 326개, 327개, 328개, 329개, 330개, 331개, 332개, 333개, 334개, 335개, 336개, 337개, 338개, 339개, 340개, 341개, 342개, 343개, 344개, 345개, 346개, 347개, 348개, 349개, 350개, 351개, 352개, 353개, 354개, 355개, 356개, 357개, 358개, 359개, 360개, 361개, 362개, 363개, 364개, 365개, 366개, 367개, 368개, 369개, 370개, 371개, 372개, 373개, 374개, 375개, 376개, 377개, 378개, 379개, 380개, 381개, 382개, 383개, 384개, 385개, 386개, 387개, 388개, 389개, 390개, 391개, 392개, 393개, 394개, 395개, 396개, 397개, 398개, 399개, 400개, 401개, 402개, 403개, 404개, 405개, 406개, 407개, 408개, 409개, 410개, 411개, 412개, 413개, 414개, 415개, 416개, 417개, 418개, 419개, 420개, 421개, 422개, 423개, 424개, 425개, 426개, 427개, 428개, 429개, 430개, 431개, 432개, 433개, 434개, 435개, 436개, 437개, 438개, 439개, 440개, 441개, 442개, 443개, 444개, 445개, 446개, 447개, 448개, 449개, 450개, 451개, 452개, 453개, 454개, 455개, 456개, 457개, 458개, 459개, 460개, 461개, 462개, 463개, 464개, 465개, 466개, 467개, 468개, 469개, 470개, 471개, 472개, 473개, 474개, 475개, 476개, 477개, 478개, 479개, 480개, 481개, 482개, 483개, 484개, 485개, 486개, 487개, 488개, 489개, 490개, 491개, 492개, 493개, 494개, 495개, 496개, 497개, 498개, 499개, 또는 500개 또는 이를 초과하는 개수이다. 이같은 프로브 및 프라이머는 고-엄격성 혼성화 조건 하에 표적 서열에 특이적으로 혼성화한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 프로브 및 프라이머는 표적 서열과의 완전한 서열 유사성을 지니지만, 표적 서열과 상이하고 표적 서열에 혼성화하는 능력을 유지하는 프로브가 통상적인 방법에 의해 디자인될 수 있다.

프로브 및 프라이머의 제조 방법이, 예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]에 기술되어 있다. PCR-프라이머 쌍이, 예를 들어, 이러한 목적에 의도된 컴퓨터 프로그램을 사용함으로써, 공지된 서열로부터 유래될 수 있다.

본원에 개시된 플랭킹 DNA 및 삽입물 서열을 기초로 하는 프라이머 및 프로브가 개시된 서열을 통상적인 방법에 의해, 예를 들어, 이같은 서열의 재-클로닝 및 시퀀싱에 의해 확인하는데 (그리고, 필요하다면 수정하는데) 사용될 수 있다.

본 발명의 핵산 프로브 및 프라이머는 엄격한 조건 하에 표적 DNA 서열에 혼성화한다. 임의의 통상적인 핵산 혼성화 또는 증폭 방법이 샘플 내의 트랜스제닉 이벤트로부터의 DNA의 존재를 확인하는데 사용될 수 있다. 핵산 분자 또는 이의 단편은 특정 환경 하에 다른 핵산 분자에 특이적으로 혼성화할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 2개의 분자가 역-평행한 이중 가닥 핵산 구조를 형성할 수 있다면 2개의 핵산 분자가 서로 특이적으로 혼성화할 수 있는 것으로 언급된다. 핵산 분자들이 완전한 상보성을 나타낸다면 핵산 분자는 또 다른 핵산 분자의 "상보물"인 것으로 언급된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 분자들 중 하나의 모든 뉴클레오티드가 다른 분자의 뉴클레오티드에 상보적인 경우 분자들이 "완전한 상보성"을 나타내는 것으로 언급된다. 2개의 분자가 적어도 통상적인 "저-엄격성" 조건 하에 이들을 서로 어닐링된 상태로 유지되도록 허용하는 충분한 안정성으로 혼성화할 수 있다면 2개의 분자가 "최소로 상보적"인 것으로 언급된다. 유사하게, 분자들이 통상적인 "고-엄격성" 조건 하에 이들을 서로 어닐링된 상태로 유지되도록 허용하는 충분한 안정성으로 혼성화할 수 있다면 분자들이 "상보적"인 것으로 언급된다. 통상적인 엄격성 조건이 문헌 [Sambrook et al., 1989]에 기술되어 있다. 따라서, 완전한 상보성으로부터 벗어나는 것이 이중 가닥 구조를 형성하는 분자들의 능력을 완전하게 방해하지 않는 한, 완전한 상보성으로부터 벗어나는 것이 허용된다. 핵산 분자가 프라이머 또는 프로브로서의 역할을 하기 위해, 사용된 특정 용매 및 염 농도 하에 안정적인 이중 가닥 구조를 형성할 수 있도록 서열 면에서 충분히 상보적인 것만이 필요하다.

본원에서 사용된 바와 같이, 실질적으로 상동성인 서열은 고-엄격성 조건 하에 자신이 비교되는 핵산 서열의 상보물에 특이적으로 혼성화할 핵산 서열이다. 용어 "엄격한 조건"은 문헌 [Sambrook et al., 1989]의 9.52-9.55에 논의된 특이적 혼성화 절차에 의해 표적 핵산에 대한 핵산 프로브의 혼성화와 관련하여 기능적으로 정의된다. 문헌 [Sambrook et al., 1989]의 9.47-9.52 및 9.56-9.58을 또한 참조한다. 따라서, DNA 단편의 상보적인 신장물(stretch)과 선택적으로 듀플렉스 분자를 형성하는 능력에 대해 본 발명의 뉴클레오티드 서열이 사용될 수 있다.

구상되는 용도에 따라, 표적 서열에 대한 프로브의 다양한 정도의 선택도를 달성하기 위해 다양한 혼성화 조건을 사용할 수 있다. 높은 선택도를 필요로 하는 용도에 대해, 하이브리드를 형성하기 위해 비교적 엄격한 조건이 선택될 것이고, 예를 들어, 비교적 낮은 염 및/또는 높은 온도 조건, 예컨대 약 50℃ 내지 약 70℃의 온도에서 약 0.02 M 내지 약 0.15 M NaCl에 의해 제공되는 조건이 선택될 것이다. 엄격한 조건은, 예를 들어, 혼성화 필터를 고-엄격도 세정 완충제 (0.2X SSC, 0.1％ SDS, 65℃)로 2회 이상 세정하는 것을 수반할 수 있다. DNA 혼성화를 촉진하는 적합한 엄격성 조건, 예를 들어, 약 45℃에서의 6.0X 염화나트륨/시트르산나트륨 (SSC)에 이어지는 50℃에서의 2.0X SSC의 세정이 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 세정 단계에서의 염 농도가 50℃에서의 약 2.0X SSC의 저-엄격성 내지 50℃에서의 약 0.2X SSC의 고-암격성에서 선택될 수 있다. 또한, 세정 단계에서의 온도가 약 22℃의 실온의 저-엄격성 조건에서 약 65℃의 고-엄격성 조건까지 증가될 수 있다. 온도 및 염 양쪽 모두가 변할 수 있거나, 또는 온도 또는 염 농도 중 하나가 변화되는 동안 다른 변수는 일정하게 유지될 수 있다. 이같은 선별 조건은 프로브와 주형 또는 표적 가닥 사이의 미스매치 (존재하는 경우)를 거의 허용하지 않는다. 혼성화를 통한 DNA 서열의 검출은 당업자에게 주지되어 있고, 미국 특허 번호 4,965,188 및 5,176,995의 교시 내용이 혼성화 분석 방법을 예시한다.

특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 고-엄격성 조건 하에 본원에서 예시 또는 제안된 프라이머들 (또는 앰플리콘들 또는 기타 서열들) (이의 상보물 및 단편 포함) 중 하나 이상에 특이적으로 혼성화할 것이다. 본 발명의 한 측면에서, 본 발명의 핵산 분자는 서열 2-7에 기재된 핵산 서열, 또는 이의 상보물 및/또는 단편을 지닌다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 마커 핵산 분자는 이같은 핵산 서열과 80％ 내지 100％ 또는 90％ 내지 100％의 서열 동일성을 공유한다. 본 발명의 추가적인 측면에서, 본 발명의 마커 핵산 분자는 이같은 서열과 95％ 내지 100％의 서열 동일성을 공유한다. 이같은 서열은 유전 교차의 자손을 확인하기 위해 식물 육종 방법에서 마커로서 사용될 수 있다. 표적 DNA 분자에 대한 프로브의 혼성화를 당업자에게 공지된 다수의 방법에 의해 검출할 수 있고, 이는 형광 태그(tag), 방사성 태그, 항체 기반 태그 및 화학발광 태그를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.

특정한 증폭 프라이머 쌍을 사용하는 표적 핵산 서열의 증폭 (예를 들어, PCR에 의한 증폭)과 관련하여, "엄격한 조건"은 프라이머 쌍이 상응하는 야생형 서열 (또는 이의 상보물)을 지니는 프라이머가 결합할 표적 핵산 서열에만 혼성화하게 하고, 바람직하게는 독특한 증폭 생성물인 앰플리콘을 생산하게 하는 조건이다.

"(표적 서열)에 대해 특이적인"이라는 용어는 프로브 또는 프라이머가 엄격한 혼성화 조건 하에 표적 서열을 포함하는 샘플 내의 표적 서열에만 혼성화하는 것을 가리킨다.

본원에서 사용된 "증폭된 DNA" 또는 "앰플리콘"은 핵산 주형의 일부분인 표적 핵산 서열의 핵산 증폭 생성물을 지칭한다. 예를 들어, 유성 교배로부터 생성된 콘 식물이 본 발명의 콘 식물로부터의 트랜스제닉 이벤트 게놈 DNA를 함유하는지 여부를 결정하기 위해, 이벤트 DNA의 존재에 대해 진단적인 앰플리콘을 생산하도록, 콘 식물 조직 샘플로부터 추출된 DNA를 삽입된 이종성 DNA의 삽입 부위에 인접한 식물의 게놈 내의 플랭킹 서열로부터 유래된 프라이머 및 이러한 삽입된 이종성 DNA로부터 유래된 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍을 사용하여 핵산 증폭 방법에 적용할 수 있다. 앰플리콘의 길이 및 서열이 또한 이벤트에 대해 진단적이다. 앰플리콘의 길이는 프라이머 쌍 + 1개의 뉴클레오티드 염기 쌍의 조합 길이, 및/또는 프라이머 쌍 + 약 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 51개, 52개, 53개, 54개, 55개, 56개, 57개, 58개, 59개, 60개, 61개, 62개, 63개, 64개, 65개, 66개, 67개, 68개, 69개, 70개, 71개, 72개, 73개, 74개, 75개, 76개, 77개, 78개, 79개, 80개, 81개, 82개, 83개, 84개, 85개, 86개, 87개, 88개, 89개, 90개, 91개, 92개, 93개, 94개, 95개, 96개, 97개, 98개, 99개, 100개, 101개, 102개, 103개, 104개, 105개, 106개, 107개, 108개, 109개, 110개, 111개, 112개, 113개, 114개, 115개, 116개, 117개, 118개, 119개, 120개, 121개, 122개, 123개, 124개, 125개, 126개, 127개, 128개, 129개, 130개, 131개, 132개, 133개, 134개, 135개, 136개, 137개, 138개, 139개, 140개, 141개, 142개, 143개, 144개, 145개, 146개, 147개, 148개, 149개, 150개, 151개, 152개, 153개, 154개, 155개, 156개, 157개, 158개, 159개, 160개, 161개, 162개, 163개, 164개, 165개, 166개, 167개, 168개, 169개, 170개, 171개, 172개, 173개, 174개, 175개, 176개, 177개, 178개, 179개, 180개, 181개, 182개, 183개, 184개, 185개, 186개, 187개, 188개, 189개, 190개, 191개, 192개, 193개, 194개, 195개, 196개, 197개, 198개, 199개, 200개, 201개, 202개, 203개, 204개, 205개, 206개, 207개, 208개, 209개, 210개, 211개, 212개, 213개, 214개, 215개, 216개, 217개, 218개, 219개, 220개, 221개, 222개, 223개, 224개, 225개, 226개, 227개, 228개, 229개, 230개, 231개, 232개, 233개, 234개, 235개, 236개, 237개, 238개, 239개, 240개, 241개, 242개, 243개, 244개, 245개, 246개, 247개, 248개, 249개, 250개, 251개, 252개, 253개, 254개, 255개, 256개, 257개, 258개, 259개, 260개, 261개, 262개, 263개, 264개, 265개, 266개, 267개, 268개, 269개, 270개, 271개, 272개, 273개, 274개, 275개, 276개, 277개, 278개, 279개, 280개, 281개, 282개, 283개, 284개, 285개, 286개, 287개, 288개, 289개, 290개, 291개, 292개, 293개, 294개, 295개, 296개, 297개, 298개, 299개, 300개, 301개, 302개, 303개, 304개, 305개, 306개, 307개, 308개, 309개, 310개, 311개, 312개, 313개, 314개, 315개, 316개, 317개, 318개, 319개, 320개, 321개, 322개, 323개, 324개, 325개, 326개, 327개, 328개, 329개, 330개, 331개, 332개, 333개, 334개, 335개, 336개, 337개, 338개, 339개, 340개, 341개, 342개, 343개, 344개, 345개, 346개, 347개, 348개, 349개, 350개, 351개, 352개, 353개, 354개, 355개, 356개, 357개, 358개, 359개, 360개, 361개, 362개, 363개, 364개, 365개, 366개, 367개, 368개, 369개, 370개, 371개, 372개, 373개, 374개, 375개, 376개, 377개, 378개, 379개, 380개, 381개, 382개, 383개, 384개, 385개, 386개, 387개, 388개, 389개, 390개, 391개, 392개, 393개, 394개, 395개, 396개, 397개, 398개, 399개, 400개, 401개, 402개, 403개, 404개, 405개, 406개, 407개, 408개, 409개, 410개, 411개, 412개, 413개, 414개, 415개, 416개, 417개, 418개, 419개, 420개, 421개, 422개, 423개, 424개, 425개, 426개, 427개, 428개, 429개, 430개, 431개, 432개, 433개, 434개, 435개, 436개, 437개, 438개, 439개, 440개, 441개, 442개, 443개, 444개, 445개, 446개, 447개, 448개, 449개, 450개, 451개, 452개, 453개, 454개, 455개, 456개, 457개, 458개, 459개, 460개, 461개, 462개, 463개, 464개, 465개, 466개, 467개, 468개, 469개, 470개, 471개, 472개, 473개, 474개, 475개, 476개, 477개, 478개, 479개, 480개, 481개, 482개, 483개, 484개, 485개, 486개, 487개, 488개, 489개, 490개, 491개, 492개, 493개, 494개, 495개, 496개, 497개, 498개, 499개, 또는 500개, 750개, 1000개, 1250개, 1500개, 1750개, 2000개, 또는 이를 초과하는 개수의 뉴클레오티드 염기 쌍의 조합 길이 (± 임의의 상기 열거된 증분) 범위일 수 있다. 별법적으로, 삽입된 DNA의 양쪽 측면 상의 플랭킹 서열로부터 프라이머 쌍이 유래되어, 삽입물 뉴클레오티드 서열 전체를 포함하는 앰플리콘이 생산될 수 있다. 식물 게놈 서열로부터 유래된 프라이머 쌍의 구성원은 삽입된 DNA 서열로부터 간격을 두고 위치할 수 있다. 이러한 거리는 1개의 뉴클레오티드 염기 쌍 내지 약 20000개의 뉴클레오티드 염기 쌍 범위일 수 있다. 용어 "앰플리콘"의 사용은 DNA 열 증폭 반응에서 형성될 수 있는 프라이머 이량체를 명확하게 배제한다.

핵산 증폭은 중합효소 연쇄 반응 (PCR)이 포함되는, 임의의 당업계에 공지된 다양한 핵산 증폭 방법에 의해 달성될 수 있다. 다양한 증폭 방법이 당업계에 공지되어 있고, 특히, 미국 특허 번호 4,683,195 및 미국 특허 번호 4,683,202에 기술되어 있다. 22 kb까지의 게놈 DNA를 증폭하도록 PCR 증폭 방법들이 개발되었다. 이러한 방법들, 뿐만 아니라 DNA 증폭 분야에 공지된 기타 방법들이 본 발명의 실행에서 사용될 수 있다. 대상 콘 이벤트로부터의 이종성 트랜스진 DNA 삽입물 또는 플랭킹 게놈 서열의 서열이 본원에서 제공된 서열로부터 유래된 프라이머를 사용하여 이벤트로부터 이같은 서열을 증폭시키는 것에 이어지는 PCR 앰플리콘 또는 클로닝된 DNA의 표준 DNA 시퀀싱에 의해 확인될 수 있다 (그리고, 필요하다면 수정될 수 있다).

이러한 방법에 의해 생산된 앰플리콘을 다수의 기술에 의해 검출할 수 있다. 아가로스 젤 전기영동 및 에티듐 브로마이드로의 염색은 통상적으로 주지된 DNA 앰플리콘 검출 방법이다. 또 다른 이같은 방법은 제네틱 비트(Genetic Bit) 분석이고, 이때 인접한 플랭킹 게놈 DNA 서열과 삽입된 DNA 서열 양쪽 모두에 중첩되는 DNA 올리고뉴클레오티드가 디자인된다. 이러한 올리고뉴클레오티드가 마이크로웰 플레이트의 웰에 고정된다. 관심 영역의 PCR 후 (삽입된 서열에서의 프라이머 1개 및 인접한 플랭킹 게놈 서열에서의 프라이머 1개를 사용함), 단일 가닥 PCR 생성물이 이러한 고정된 올리고뉴클레오티드에 혼성화되고, DNA 중합효소 및 예상되는 다음 염기에 대해 특이적인 표지된 ddNTP를 사용하는 단일 염기 확장 반응을 위한 주형으로서의 역할을 할 수 있다. 판독은 형광 또는 ELISA-기반일 수 있다. 신호는 성공적인 증폭, 혼성화, 및 단일 염기 확장에 기인하는 삽입물/플랭킹 서열의 존재를 가리킨다.

본원에서 언급 또는 인용된 모든 특허, 특허 출원, 가출원 및 간행물은 본 명세서의 명백한 교시 내용과 상반되지 않는 정도로 전문이 참고로 본원에 포함된다.

달리 지시되지 않는 한 하기의 약어들이 사용된다.

AAD-1 아릴옥시알카노에이트 다이옥시저네이스-1

bp 염기쌍

℃ 섭씨 온도

DNA 디옥시리보핵산

DIG 디곡시제닌

EDTA 에틸렌디아민테트라아세트산

kb 킬로베이스

㎍ 마이크로그람

㎕ 마이크로리터

㎖ 밀리리터

M 몰 질량

OLP 중첩 프로브

PCR 중합효소 연쇄 반응

PTU 식물 전사 유닛

SDS 소듐 도데실 술페이트

SOP 표준 작업 절차

SSC 염화나트륨 및 시트르산나트륨의 혼합물을 함유하는 완충제 용액 (pH 7.0)

TBE 트리스(Tris) 염기, 붕산 및 EDTA의 혼합물를 함유하는 완충제 용액 (pH 8.3)

V 볼트

실시예

실시예 1. 이벤트 특이적 택맨 분석법

옥수수 이벤트 DAS-40278-9의 존재를 검출하고 육종 집단 내의 식물의 접합성 상태를 결정하기 위해 이벤트 특이적 택맨 분석법이 개발되었다. 이벤트 특이적 분석법을 개발하기 위해, 특이적 택맨 프라이머 및 프로브를 5' 삽입물-대- 식물 접합부 내에 위치하는 DNA 서열에 따라 디자인하였다. DAS-40278-9의 특이적 검출을 위해, 이러한 5'-통합 접합부에 스패닝되는 73-bp DNA 단편을 2개의 특이적 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 이러한 PCR 생성물의 증폭을 5' 말단에 FAM 리포터를 함유하는 어플라이드 바이오시스템즈에 의해 합성된 표적-특이적 MGB 프로브에 의해 측정하였다. AAD-1 콘 이벤트 DAS-40278-9에 대한 이러한 택맨 검출 방법의 특이성을 콘 특이적 내인성 기준 유전자인 인버테이스로 이중 양식으로 16가지 상이한 AAD-1 콘 이벤트 및 비-트랜스제닉 콘 품종에 대해 테스트하였다.

실시예 1.1. gDNA 단리

16가지 상이한 AAD-1 콘 이벤트 및 비-트랜스제닉 콘 품종의 gDNA 샘플을 이러한 연구에서 테스트하였다. 퀴아젠(Qiagen) 키트 또는 CTAB의 2가지 접근법으로 gDNA를 추출하였다. 퀴아젠 키트로부터 추출된 gDNA 샘플에 대해, 8개의 신선한 콘 잎 조각을 변형된 퀴아젠의 디엔이지 96 플랜트 키트(DNeasy 96 Plant Kit) 프로토콜에 따라 gDNA 추출에 사용하였다. CTAB 절차를 사용하여 추출된 gDNA 샘플에 대해서는, 약 0.3 g의 동결건조된 잎 조직을 문헌 [Permingeat et al., 1998]으로부터의 프로토콜에 따라 사용하였다. gDNA를 판매자의 설명서 (몰레큘라 프로브즈(Molecular Probes), 오리건주 유진)에 따라 피코 그린(Pico Green) 방법으로 정량하였다. 이러한 연구의 목적을 위해 10 ng/㎕의 농도를 초래하도록 gDNA 샘플을 DNase가 없는 물로 희석하였다.

실시예 1.2. 택맨 분석법 및 결과

DAS-40278-9 이벤트 특이적 택맨 분석법을 위해 특이적 택맨 프라이머 및 프로브가 디자인되었다. 이러한 시약들을 하기에 열거된 조건과 함께 사용하여 AAD-1 콘 이벤트 DAS-40278-9를 검출할 수 있었다. 표 1은 이벤트 DAS-40278-9의 검출을 위해 특이적으로 개발된 프라이머 및 프로브 서열을 열거한다.

증폭을 위한 멀티플렉스 PCR 조건은 하기와 같았다: 1X PCR 완충제, 0.5 - 2.5 mM MgCl₂, 0.2 mM dNTP, 0.2 μM 프라이머 콘-278-F, 0.2 μM 프라이머 콘-278-R, 0.2 μM 프라이머_IV-F, 0.2 μM 프라이머_IV-R, 0.08 μM 프로브_콘-278-프로브, 0.08 uM 프로브_IV-프로브, 40 U/㎖ 핫스타트 택(HotStart Taq), 0.6 내지 2.4 ug/㎖ DNA (전체 반응 25 ㎕). 다양한 농도의 MgCl₂ 및 DNA를 테스트하였다. 0.5 mM, 1.0 mM, 1.8 mM 및 2.5 mM의 MgCl₂ 농도를 사용하였다. 하기의 조건을 사용하여 칵테일을 증폭시켰다: i) 15분 동안 95℃, ii) 20초 동안 95℃, iii) 60초 동안 60℃, iv) 단계 ii-iii을 50 사이클 반복, v) 4℃에서 유지. 바이오-래드(Bio-rad)의 아이사이클러(iCycler)™ 시스템 상에서 실시간 PCR을 수행하였다. 데이터 분석은 사이클 역치 (CT)의 측정치를 기초로 하였고, 이는 형광 측정치가 설정값에 도달했을 때의 PCR 사이클 횟수이다. 아이사이클러 소프트웨어에 의해 CT 값이 자동으로 계산되었다.

상기 프라이머들을 사용하여 생성된 앰플리콘 서열은 하기와 같았다:

278F 및 278R:

(서열 8)

IVF 및 IVR:

(서열 9)

AAD-1 콘 이벤트 DAS-40278-9에 대한 택맨 검출 방법을 16가지 상이한 AAD-1 콘 이벤트 및 비-트랜스제닉 콘 품종에 대해 콘 특이적 내인성 인버테이스를 기준 유전자로 하여 2중 양식으로 테스트하였다. 이러한 분석법은 AAD-1 콘 이벤트 DAS-40278-9를 특이적으로 검출하였고, 대조군 (즉, 16가지 상이한 AAD-1 콘 이벤트 및 비-트랜스제닉 콘 품종)으로부터 어떠한 거짓-양성 결과도 일으키거나 증폭시키지 않았다. 이러한 이벤트 특이적 프라이머 및 프로브가 AAD-1 콘 이벤트 DAS-40278-9의 검출에 사용될 수 있었고, 이러한 조건 및 시약들이 접합성 분석법에 적용가능하였다.

SEQUENCE LISTING <110> Dow AgroSciences LLC <120> DETECTION OF AAD-1 EVENT DAS-40278-9 <130> DAS-P0169-01 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8557 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAD-1 insert and flanking sequences <400> 1 actggtattt aatatacttt aataaatatt attagattcc tcgtcaaaga actttttaca 60 atatatctat ttagaatcat atatgtcata gttttttttc taagagtcta gtttactagt 120 aaaatccgac tcacattttt cgaacttggg atgcaacact taaatagtac aaaaccttgg 180 tatgcagtat tttacattgt aagattcaaa atttctaaag cagtatatat atgtttccag 240 aaacttatag atatagaaaa aacagagaga cgtatgcgaa aattcgataa aggtgtacat 300 tggattcgca aggctaaata catatttatc gtggatccat gcagagtttg ggtaataaaa 360 ttagatactt ccaatcatgt gccacataat cacgtaacat tagtaattta aatgacatta 420 ccatgtccaa ctgatttaaa acacaaactc ttcttgaacc atatagtttg acaaaccaaa 480 tatatataac tggagctact agttatgaat caattaaaaa ttactttgaa gattcaacgt 540 agtgccagtt tggctctagc acatctaacc agaagggcta aggctggctt caacaggaac 600 agccaaatcc gagatcgagc catttgccat ttttgggtag 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gatgcatata 4020 catgatggca tatgcagcat ctattcatat gctctaacct tgagtaccta tctattataa 4080 taaacaagta tgttttataa ttatttcgat cttgatatac ttggatgatg gcatatgcag 4140 cagctatatg tggatttttt tagccctgcc ttcatacgct atttatttgc ttggtactgt 4200 ttcttttgtc gatgctcacc ctgttgtttg gtgttacttc tgcagggtac ccccggggtc 4260 gaccatggct catgctgccc tcagccctct ctcccaacgc tttgagagaa tagctgtcca 4320 gccactcact ggtgtccttg gtgctgagat cactggagtg gacttgaggg aaccacttga 4380 tgacagcacc tggaatgaga tattggatgc cttccacact taccaagtca tctactttcc 4440 tggccaagca atcaccaatg agcagcacat tgcattctca agaaggtttg gaccagttga 4500 tccagtgcct cttctcaaga gcattgaagg ctatccagag gttcagatga tccgcagaga 4560 agccaatgag tctggaaggg tgattggtga tgactggcac acagactcca ctttccttga 4620 tgcacctcca gctgctgttg tgatgagggc catagatgtt cctgagcatg gcggagacac 4680 tgggttcctt tcaatgtaca cagcttggga gaccttgtct ccaaccatgc aagccaccat 4740 cgaagggctc aacgttgtgc actctgccac acgtgtgttc ggttccctct accaagcaca 4800 gaaccgtcgc ttcagcaaca cctcagtcaa ggtgatggat gttgatgctg gtgacagaga 4860 gacagtccat cccttggttg tgactcatcc tggctctgga aggaaaggcc tttatgtgaa 4920 tcaagtctac tgtcagagaa ttgagggcat gacagatgca gaatcaaagc cattgcttca 4980 gttcctctat gagcatgcca ccagatttga cttcacttgc cgtgtgaggt ggaagaaaga 5040 ccaagtcctt gtctgggaca acttgtgcac catgcaccgt gctgttcctg actatgctgg 5100 caagttcaga tacttgactc gcaccacagt tggtggagtt aggcctgccc gctgagtagt 5160 tagcttaatc acctagagct cgtttaaact gagggcactg aagtcgcttg acgtgctgaa 5220 ttgtttgtga tgttggtggc gtattttgtt taaataagta agcatggctg tgattttatc 5280 atatgatcga tctttggggt tttatttaac acattgtaaa atgtgtatct attaataact 5340 caatgtataa gatgtgttca ttcttcggtt gccatagatc tgcttatttg acctgtgatg 5400 ttttgactcc aaaaaccaaa atcacaactc aataaactca tggaatatgt ccacctgttt 5460 cttgaagagt tcatctacca ttccagttgg catttatcag tgttgcagcg gcgctgtgct 5520 ttgtaacata acaattgtta cggcatatat ccaatagcgg ccggcctcct gcagggttta 5580 aacttgccgt ggcctatttt cagaagaagt tcccaatagt agtccaaaat ttttgtaacg 5640 aagggagcat aatagttaca tgcaaaggaa aactgccatt ctttagaggg gatgcttgtt 5700 taagaacaaa aaatatatca ctttcttttg ttccaagtca ttgcgtattt ttttaaaaat 5760 atttgttcct tcgtatattt cgagcttcaa tcactttatg gttctttgta ttctggcttt 5820 gctgtaaatc gtagctaacc ttcttcctag cagaaattat taatacttgg gatatttttt 5880 tagaatcaag taaattacat attaccacca catcgagctg cttttaaatt catattacag 5940 ccatataggc ttgattcatt ttgcaaaatt tccaggatat tgacaacgtt aacttaataa 6000 tatcttgaaa tattaaagct attatgatta ggggtgcaaa tggaccgagt tggttcggtt 6060 tatatcaaaa tcaaaccaaa ccaactatat cggtttggat tggttcggtt ttgccgggtt 6120 ttcagcattt tctggttttt tttttgttag atgaatatta ttttaatctt actttgtcaa 6180 atttttgata agtaaatata tgtgttagta aaaattaatt ttttttacaa acatatgatc 6240 tattaaaata ttcttatagg agaattttct taataacaca tgatatttat ttattttagt 6300 cgtttgacta atttttcgtt gatgtacact ttcaaagtta accaaattta gtaattaagt 6360 ataaaaatca atatgatacc taaataatga tatgttctat ttaattttaa attatcgaaa 6420 tttcacttca aattcgaaaa agatatataa gaattttgat agattttgac atatgaatat 6480 ggaagaacaa agagattgac gcattttagt aacacttgat aagaaagtga 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cgtatcccgg 7380 gacgaagctt tagaagtagg aaaaactccc gacgagtggg tacaccgaga aaggcggaac 7440 tctcgccgcc gtgatcgccg acaagcttag gaccgagaac gagagcaagc cgagcaaggt 7500 gcaaggctgc gccgagagaa tgctctcttt gctcggaacc tgtaccccga cttcgctcgt 7560 gcaatgaaca cgccgagtga agtcggaggg gtactggccc agatagctga cggcctcccg 7620 cgaaccctag acacggaagg ctaccggcgg ctgcttactc gagcagttaa tcaccttcta 7680 cccatcacta atcctccaag cgacctacgc catgccatca acagccggcg agacacgcgg 7740 agctccatca acgcttcgcg cgaccgatga cacgaaagtg agatagggaa ccgagaggag 7800 tatgtccgag atcatgccat cctggcatga agtcatgcca cccgagctga gtcggttgcg 7860 gcctcgacca gtgtcccgtt ccagggacga tcaagatgac acacaactgg ctcccctcct 7920 tgggaccgac ctcacgaacg ccgacatgaa gacacgtgcg gagtcttcgc acttactccg 7980 tgtctccggg ccatccagtg gcccctaact tcaaggtctc caacgtcagc aagtatgagc 8040 gcaagcagga cctgggtggc tggttagcca tctacacgat tgtcacatgg gccgccggag 8100 cgacggagga cgtgatgaca gtgtattttc ccattgtcct agggcaagac gcaatgcagt 8160 ggctccgaca tctaccccaa cattgcatag acaattggag cgacttcagt tggtgcttca 8220 tcgccaactt ccagtccctc tttgacaagc cggcgcagcc atgggaccta aaatccattg 8280 ggcatcaggg cgatgaaacg ctccggttgt acctcaagag gttttagacc atgaggaacc 8340 acacccccga agtcgccgag gcgggggtga ttgaagactt ctaccgagga tccaatgact 8400 cggctttcgt ccgagccata ctccagaaaa gcgtcggcca cctccgaaca cttgttccgg 8460 gaggcagacc tctacatcac cacggattaa cgggcccagg acctcatcgg aggcacgaaa 8520 gccgcgccac acgcgccacg gtgtgacacg aaccagc 8557 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward event primer <400> 2 attctggctt tgctgtaaat cgt 23 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> event reverse primer <400> 3 ttacaatcaa cagcaccgta cctt 24 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> event probe <400> 4 ctaaccttca ttgtattcc 19 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reference forward primer <400> 5 tggcggacga cgacttgt 18 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reference reverse primer <400> 6 aaagtttgga ggctgccgt 19 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reference probe <400> 7 cgagcagacc gccgtgtact tctacc 26 <210> 8 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> event amplicon <400> 8 ttacaatcaa cagcaccgta ccttgaagcg gaatacaatg aaggttagct acgatttaca 60 gcaaagccag aat 73 <210> 9 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reference amplicon <400> 9 tggcggacga cgacttgtcc gagcagaccg ccgtgtactt ctacctgctc aagggcacgg 60 acggcagcct ccaaacttt 79

Claims

콘(corn) 이벤트 DAS-40278-9에서 발견되는 아릴옥시알카노에이트 다이옥시저네이스(AAD-1) 트랜스진(transgene)을 포함하는 콘 식물의 접합성을 결정하는 방법으로서, 상기 이벤트는 서열 1을 포함하고, 상기 방법은
상기 콘 식물로부터 게놈 DNA의 DNA 샘플을 수득하는 단계;
상기 DNA 샘플을
a. 서열 1의 잔기 1874-6689로 정의되는 상기 AAD-1 트랜스진에 특이적으로 결합하는 제1 이벤트 프라이머 및 서열 1의 잔기 1-1873로 정의되는 5' 콘 게놈 플랭킹 DNA 또는 서열 1의 잔기 6690-8557로 정의되는 3' 콘 게놈 플랭킹 DNA에 특이적으로 결합하는 제2 이벤트 프라이머 - 상기 제1 이벤트 프라이머 및 제2 이벤트 프라이머는 PCR 조건에 적용되는 경우 이벤트 앰플리콘(amplicon)을 생산함 -
b. PCR 조건에 적용되는 경우 내인성 콘 기준 유전자로부터 기준 앰플리콘을 생산하는 기준 전방향 프라이머 및 기준 역방향 프라이머
c. 상기 이벤트 앰플리콘과 혼성화하는 형광 이벤트 프로브
d. 상기 기준 앰플리콘과 혼성화하는 형광 기준 프로브
와 접촉시킴으로써 접촉 샘플을 생산하는 단계;
상기 접촉 샘플을 형광-기반 종점 PCR 조건에 적용하는 단계;
상기 이벤트 앰플리콘에 혼성화된 상기 형광 이벤트 프로브를 정량하는 단계;
상기 기준 앰플리콘에 혼성화된 상기 형광 기준 프로브를 정량하는 단계;
혼성화된 형광 이벤트 프로브 대 혼성화된 형광 기준 프로브의 양을 비교하는 단계; 및
혼성화된 형광 이벤트 프로브와 혼성화된 형광 기준 프로브의 형광 비율을 비교함으로써 DAS-40278-9의 접합성을 결정하는 단계
를 포함하는 것인 방법.
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제1항에 있어서, 상기 기준 유전자가 내인성 지아 메이스(Zea mays) 인버테이스(invertase) 유전자인 방법.
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제1항에 있어서, 이벤트의 또 다른 콘 계통 내로의 육종 유전자침투(introgression)에 사용되는 방법.
제8항에 있어서, 상기 또 다른 콘 계통에 상기 이벤트가 없는 방법.
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제1항에 있어서, 상기 기준 전방향 프라이머가 서열 5이고, 상기 기준 역방향 프라이머가 서열 6이며, 상기 기준 프로브가 서열 7인 방법.
제1항에 있어서, 상기 이벤트 프로브 및 기준 프로브가 형광 염료 및 켄처(quencher)로 표지된 방법.
제13항에 있어서, 상기 이벤트 프로브가 상기 이벤트 프로브의 5' 말단의 상기 형광 염료로서의 FAM 및 상기 이벤트 프로브의 3' 말단의 MGB 켄처를 포함하는 방법.
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제13항에 있어서, 상기 기준 프로브가 상기 기준 프로브의 5' 말단에서 HEX로 표지되고, 상기 기준 프로브의 3' 말단에서 블랙 홀 켄처(Black Hole Quencher) 2 (BHQ2)로 표지된 방법.
제1항에 있어서, 상기 이벤트 앰플리콘이 서열 8로 구성되고, 상기 기준 앰플리콘이 서열 9로 구성된 방법.
제1항에 있어서, 상기 이벤트 프로브가 서열 4로 구성된 방법.
제1항에 있어서, 상기 제1 이벤트 프라이머가 서열 2이고 상기 제2 이벤트 프라이머가 서열 3인 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법의 결과가 플레이트 판독기 상에서 직접적으로 판독되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 DNA 샘플이 야외(field)의 콘 식물로부터 수득되는 방법.
제1항의 상기 제1 이벤트 프라이머, 상기 제2 이벤트 프라이머, 상기 기준 전방향 프라이머, 상기 기준 역방향 프라이머, 상기 이벤트 프로브, 및 상기 기준 프로브를 포함하는, 제1항의 방법을 수행하기 위한 키트.
제22항에 있어서, 상기 제1 이벤트 프라이머가 서열 2로 구성되고, 상기 제2 이벤트 프라이머가 서열 3으로 구성되고, 상기 기준 전방향 프라이머가 서열 5로 구성되고, 상기 기준 역방향 프라이머가 서열 6으로 구성되며, 상기 이벤트 프로브가 서열 4로 구성되고, 상기 기준 프로브가 서열 7로 구성되는 키트.