CN102575299A - Aad-1事件das-40278-9的检测 - Google Patents

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Abstract

本发明部分涉及检测除草剂耐受性植物——更具体而言，玉米植物中的aad-1转化事件。本主题发明还提供了用于在样品(例如，玉米粒)中检测本主题事件的存在的测定法。还提供了可用于进行所述测定法的试剂盒和条件。本主题发明还部分涉及使用本主题方法的植物育种。在一些实施方案中，所述事件/多核苷酸序列可与其他性状“层叠”。更具体而言，本发明部分涉及用于AAD-1玉米事件40278-9的终点TaqMan PCR测定法。一些实施方案涉及能够进行高通量接合性分析的测定法。本主题发明进一步部分涉及优选的参照基因用于确定接合性的用途。

Description

AAD-1事件DAS-40278-9的检测
发明背景
aad-1基因(最初来自Sphingobium herbicidovorans)编码芳氧基链烷酸酯二加氧酶(aryloxyalkanoate dioxygenase，AAD-1)蛋白。该性状赋予针对2，4-二氯苯氧基乙酸和芳氧基苯氧基丙酸酯(一般称作“fop”除草剂，如氯甲草(diclofop)和喹禾灵(quizalofop))除草剂的耐受性，并可在植物转化过程中和育种苗圃中用作选择性标记。aad-1基因自身，首先在WO 2005/107437(亦参见US 2009-0093366)中公开其涉及植物中的除草剂耐受性。
已知多种事件检测的方法。然而，其均存在问题。一种方法是如Winge(Innov.Pharma.Tech.00：18-24，2000)描述的Pyrosequencing技术。在该方法中，设计了与邻近基因组DNA和插入DNA接点(junction)重叠的寡核苷酸。将所述寡核苷酸杂交于来自感兴趣的区的单链PCR产物(一个引物在插入的序列中，一个在侧翼基因组序列中)，并在DNA聚合酶、ATP、硫酰酶(sulfurylase)、萤光素酶、腺苷三磷酸双磷酸酶(apyrase)、腺苷5’磷硫酸(adenosine 5′phosphosulfate)和萤光素的存在下温育。单独添加DNTP，且其组入导致可测量的光信号。光信号表明由于成功的扩增、杂交和单碱基或多碱基延伸而导致的转基因插入/侧翼序列的存在。
荧光偏振是另一种可用于检测本发明的扩增子的方法。遵循该方法，设计了与基因组侧翼和插入的DNA接点重叠的寡核苷酸。将寡核苷酸杂交于来自感兴趣的区的单链PCR产物(一个引物在插入的DNA中，一个在侧翼基因组DNA序列中)，并在DNA聚合酶和荧光标记的ddNTP的存在下温育。单碱基延伸导致ddNTP的组入。组入可使用荧光计作为偏振改变来测量。偏振中的改变表明由于成功的扩增、杂交和单碱基延伸所致的转基因插入/侧翼序列的存在。
已描述了分子灯塔(Molecular Beacon)用于序列检测。简言之，设计了与侧翼基因组和插入DNA接点重叠的FRET寡核苷酸探针。FRET探针的独特结构导致其含有保持荧光和淬灭模块彼此接近的二级结构。在热稳定性聚合酶和dNTP的存在下循环FRET探针和PCR引物(一个引物在插入DNA序列中，一个在侧翼基因组序列中)。在成功的PCR扩增之后，FRET探针对靶序列的杂交导致探针二级结构的去除和荧光和淬灭模块的空间上的分离。其结果为荧光信号。荧光信号表明由于成功的扩增和杂交所致的侧翼基因组/转基因插入序列的存在。
水解探针测定法，亦称作TAQMAN(PE Applied Biosystems，Foster City，Calif.)，是检测和量化DNA序列的存在的方法。简言之，设计了与基因组侧翼和插入DNA接点重叠的FRET寡核苷酸探针。在热稳定性聚合酶和dNTP存在下循环FRET探针和PCR引物(一个引物在插入DNA序列中，一个在侧翼基因组序列中)。在特异性扩增过程中，Taq DNA聚合酶将FRET探针上的荧光模块从淬灭模块清除并释放。荧光信号表明由于成功的扩增和杂交所致的侧翼/转基因插入序列的存在。
许多挑战中的另一种是对于给定测试寻找合适的参照基因。举例而言，如Czechowski等的摘要中陈述，“来自Affymetrix ATH1全基因组GeneChip研究的特别庞大的数据组提供了鉴定在模式植物物种拟南芥(Arabidopsisthaliana)中具有非常稳定的表达水平的新一代参照基因的手段。发现了数百种在整个发育过程中并在多种环境条件下在表达稳定性方面超越传统参照基因的拟南芥基因”(Czechowski等(2005)Genome-wide identification and testing ofsuperior reference genes for transcript normalization in Arabidopsis.Plant Physiol.139，5-17)。
Brodmann等(2002)涉及对于四种在欧盟(European Union)中批准的玉米品种，食物中转基因玉米成分的实时定量PCR检测。Brodmann，P.D.，P.D.，IlgE.C.，Berthoud H.，and Herrmann，A.Real-Time Quantitative Polymerase ChainReaction Methods for Four Genetically Modified Maize Varieties and Maize DNAContent in Food.J.of AOAC international 2002 85(3)。
Hernandez等(2004)提及了供用于实时PCR的四种可能基因。Hernandez，M.，Duplan，M.-N.，Berthier，G.，Vaitilingom，M.，Hauser，W.，Freyer，R.，Pla，M.，and Bertheau，Y.Development and comparison of four real-time polymerasechain reaction systems for specific detection and quantification of Zea mays L.J.Agric.Food Chem.2004，52，4632-4637。
Costa等(2007)考虑了这四种基因(亦在实时PCR的背景下)，并得出结论：醇脱氢酶和玉米醇溶蛋白(zein)基因对于转基因饲料混合物问题(intermixissue)，是用于检测样品“事件”(植物凝集素基因)的最佳参照基因。Costa，L.D.，and Martinelli L.Development of a Real-Time PCR Method Based on DuploTarget Plasmids for Determining an Unexpected Genetically Modified SoybeanIntermix with Feed Components.J.Agric.Food Chem.2007，55，1264-1273。
Huang等(2004)使用质粒pMulM2作为供在玉米中检测MON810和NK603转基因的参照分子。Huang and Pan，″Detection of Genetically ModifiedMaize MON810 and NK603 by Multiplex and Real-Time Polymerase ChainReaction Methods，″J.Agric.Food Chem.，2004，52(11)，pp 3264-3268。
Gasparic等(2008)对于定量分析玉米事件(如MON810)，根据环化探针技术，TaqMan和多种实时PCR化学的比较，建议了LNA技术。
Figure BDA0000154937660000031
Cankar，and Gruden，″Comparison of different real-time PCR chemistries and theirsuitability for detection and quantification of genetically modified organisms，″BMC Biotechnol.2008；8：26。
US 20070148646涉及用于定量的引物延伸技术，其需要可由组入的核苷酸的量定量和检测的单个核苷酸的受控分配。这与使用内部参照基因的TaqMan PCR方法不同。
为了区分TC1507的纯合和半合基因型，对于该事件成功地使用了Invader测定。Gupta，M.，Nirunsuksiri，W.，Schulenberg，G.，Hartl，T.，Novak，S.，Bryan，J.，Vanopdorp，N.，Bing，J.and Thompson，S.A non-PCR-based Invader AssayQuantitatively Detects Single-Copy Genes in Complex Plant Genomes.Mol.Breeding 2008，21，173-181。
Huabang(2009)涉及基于PCR接合性(zygosity)的转基因玉米测试。然而，未显示使用参照基因。Huabang，″An Accurate and Rapid PCR-Based ZygosityTesting Method for Genetically Modified Maize，″Molecular Plant Breeding，2009，Vol.7，No.3，619-623。
发明内容
本主题发明提供了用于检测样品(例如，玉米粒的)中命名为DAS-40278-9的AAD-1玉米事件的存在的测定法。(代表性种子以登录号PTA-10244保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)(黄色马齿型玉米(Yellow Dent maize)杂交种子(Zea Mays L)：DAS-40278-9；根据布达佩斯条约以Dow AgroSciences LLC的名义保藏；ATTC收到种子/株的日期为：2009年7月10日；2009年8月17日确认存活))。亦提供了可用于进行该测定的试剂盒和条件。
更具体而言，本发明部分涉及在利用玉米内源参照基因的玉米中对于AAD-1事件的终点TaqMan PCR测定。一些实施方案涉及能够进行高通量接合性分析的测定。本主题发明进一步部分涉及供用于确定接合性的优选转化酶参照基因的发现。
因此，本发明还部分涉及包括本主题检测方法的植物育种。在一些实施方案中，所述事件可与其他性状“层叠(stack)”，所述性状包括例如其他除草剂耐受基因和/或昆虫抑制蛋白。本主题方法可用于独特地鉴定包含本主题发明的事件的玉米品系。
附图说明
图1显示用于在玉米事件DAS-40278-9中用于DNA插入的克隆策略。
图2是在用于确证玉米事件DAS-40278-9的侧翼边界区的PCR扩增中使用的引物的图。该概略图描述了用于从5’至3’边界确证AAD-1玉米事件DAS-40278-9的全长测序的引物位置。
图3显示了用于来自玉米事件DAS-40278-9的侧翼边界序列的克隆策略。用EcoR V、Stu I或Sca I消化玉米事件DAS-40278-9的基因组DNA，并生成了相应的GenomeWalkerTM文库，将其用作扩增靶DNA序列的模板。
序列简述
SEQ ID NO：1提供了对于玉米事件DAS-40278-9，AAD-1插入两侧的5’和3’基因组侧翼序列的序列(包含该插入)。
SEQ ID NO：2-7是供依照本主题发明的使用的引物和探针。
SEQ ID NO：8是例示的事件扩增子。
SEQ ID NO：9是例示的参照扩增子。
具体实施方式
通过Whisker介导的转化生成了转基因AAD-1(提供除草剂耐受性)玉米事件DAS-40278-9。如USSN 61/235,248(2009年8月19日提交)中详述，克隆、测序并表征了该AAD-1转基因插入的5’和3’端侧翼序列。
如本文中所述，部分地根据位于5’插入至植物接点的DNA序列，设计了具体的TAQMAN引物和探针。在针对16种不同AAD-1玉米事件和两种非转基因玉米品种的实时PCR中用玉米转化酶作为参照基因以双链体形式成功地测试了引物和探针的事件特异性。如本文中详述，开发了用于AAD-1玉米DAS-40278-9的终点事件特异性TAQMAN测定法的流程。
在该AAD-1玉米中跨越宿主植物DNA和整合基因构建体之间的整合接点的区的序列是独特序列。用其开发了检测AAD-1玉米DAS-40278-9的存在的事件特异性测定法(常规PCR或实时PCR)以供GMO测试，并确定了育种群体中植物的接合性状态。本文中报道的事件特异性TAQMAN测定法可用于这两种应用。
本主题发明提供了在样品中检测主题转基因玉米事件DAS-40278-9(亦称作pDAS1740-278)的存在的测定法。本主题发明的诸方面包括设计和/或产生任何本文中例示或建议的诊断性核酸分子的方法。
本发明还部分涉及包括任何这些方法的植物育种。在一些实施方案中，本主题事件可与其他性状(如例如其他除草剂耐受基因和/或编码昆虫抑制蛋白的基因)“层叠”。包含本主题事件的植物品系可使用本文中公开和建议的序列来检测。
在一些实施方案中，本发明涉及除草剂耐受性玉米品系的鉴定。本主题发明部分涉及检测本主题事件的存在以确定有性杂交的后代是否含有感兴趣的事件。此外，包括了用于检测该事件的方法，并且其有助于，例如，遵守要求来源于重组作物植物的食物的上市前批准和标记的规定。
本主题发明部分涉及利用内源基因作为参照(拷贝数)对照的供AAD-1玉米事件的高通量接合性分析的基于荧光的终点TaqMAN PCR测定法。本主题发明进一步部分涉及优选的参照基因即转化酶的发现。鉴定了几种参照基因作为可能的选项。
本主题发明还部分涉及用于AAD-1事件特异性接合性分析的二通路(biplex)终点TaqMAN PCR的开发。此外，本发明部分涉及AAD-1育种测试试剂盒的开发。
终点TaqMan测定基于加/减策略(plus/minus strategy)，其中“加”表明样品就测定的基因而言是阳性的，而“减”表明样品就测定的基因而言是阴性的。这些测定通常利用两组分别用于鉴定AAD-1转基因序列和野生型基因序列的寡核苷酸，以及测量转基因和野生型序列含量的双标记探针。
尽管Invader测定在表征事件方面是鲁棒的技术，但其对DNA品质非常敏感。此外，该测定需要大量DNA。Invader亦需要附加的变性步骤，若操作不当，其可导致Invader测定不成功。此外，Invader测定的较长测定时间限制了其在商业环境下的分析中有效地处理大量AAD-1样品的灵活性。本主题发明的一个主要优点是节约时间和变性步骤的消除。
用于检测AAD-1事件的本主题终点TaqMAN分析相对于Invader提供了令人惊讶的优点，特别是在分析大量样品方面。
本发明可影响在作物包括玉米、大豆和棉花中AAD-1除草剂耐受性性状的开发和表征。
本文中提供了定义和实例以帮助描述本发明，并指导本领域一般技术人员实践本发明。除非另行指出，术语应根据相关领域一般技术人员的常规用法来理解。使用列举于37 CFR§1.822的DNA碱基的命名法。如用于本文，术语“后代”指亲本植物包含AAD-1玉米事件DAS-40278-9的任一世代的后代。
转基因“事件”是通过用异源DNA，即含有感兴趣的转基因的核酸构建体转化植物细胞，重新产生由将所述转基因插入植物基因组所得的植物群体，并选择由插入特定基因组位置所表征的特定植物来产生。术语“事件”指起始转化体和转化体含有所述异源DNA的后代。术语“事件”还指通过转化体和含有基因组/转基因DNA的另一品种之间的有性异型杂交(outcross)产生的后代。即使在与回归(recurrent)亲本的反复回交之后，插入的转基因DNA和来自转化的植物的侧翼基因组DNA(基因组/转基因DNA)仍存在于杂交后代的相同染色体位置处。术语“事件”还指来自起始转化体及其包含插入的DNA和直接邻接插入的DNA的侧翼基因组序列的后代的DNA，期待其会转移至下述后代，所述后代作为一个含有插入的DNA的亲本系(例如起始转化体和其自交所得的后代)和不含有该插入的DNA的亲本系有性杂交的结果而接受了含有感兴趣的转基因的插入的DNA。
“接点序列”跨越了插入基因组的DNA与来自插入点侧翼的玉米天然基因组的DNA的连接点。其包括跨越本文中所述的玉米事件中的插入和类似长度的侧翼DNA的DNA序列。
本主题发明涉及本主题事件的鉴定。本发明包括相关的PCR引物和扩增子。这些分子可用于检测或鉴定商业化的转基因玉米品种或来源于本主题转基因玉米品系的品系。
插入的整个序列，以及相应的侧翼序列的部分，在本文中提供为SEQ IDNo：1。相对于SEQ ID No：1(总共8557碱基对)的本事件的插入和侧翼序列的坐标列于下表。
Figure BDA0000154937660000071
对于该事件的AAD-1插入和侧翼序列的组分进一步图示于图1至图3。
本主题发明的检测技术可与植物育种一同使用，以确定在为了将一种或多种其他感兴趣的性状赋予后代，将包含感兴趣的事件的亲本植物与另一植物品系杂交之后，何种后代植物包含给定事件。本主题发明可用于例如玉米育种项目以及质量控制，特别是对于商业化转基因玉米种子。这亦可帮助产品登记和产品管理。这些方法可用于加速育种策略。
在一些实施方案中，用于接合性分析的基于荧光的终点TaqMAN测定允许在读板器中直接读取结果以供鉴定参照基因和玉米中的AAD-1事件。
本主题发明包括育种应用，如测试AAD-1事件对其他玉米品系的渐渗(introgression)。
本主题发明的检测方法和试剂盒可用于鉴定本主题发明的事件。本主题发明的方法和试剂盒可用于加速育种策略和建立连锁数据。
本主题发明的检测技术特别可用于与植物育种一同确定在为了将一种或多种其他感兴趣的性状赋予后代，将包含感兴趣的事件的亲本植物与另一植物品系杂交之后，何种后代植物包含给定事件。这些Taqman PCR分析方法有助于玉米育种项目以及质量控制，特别是对于商业化转基因玉米种子。现亦可制备并使用供这些转基因玉米品系的Taqman PCR检测试剂盒。此亦可有助于产品登记和产品管理。
此外，还可将目标方法用于研究和表征转基因整合过程，基因组整合位点特征，事件分选，转基因和及其侧翼序列的稳定性，和基因表达(特别涉及基因沉默，转基因甲基化样式，位置效应，和潜在的表达相关元件，如MARS(基质结合区)等)。
如用于本文，术语“玉米”意指玉米(Zea mays)，并包括所有其可与玉米繁殖(breed)的品种。
本发明进一步包括进行杂交和使用本主题发明的方法的过程。举例而言，本主题发明包括用于产生F1杂交种子的方法，即通过将例示的植物与不同(例如，近交的亲本)植物杂交，收获所得的杂交种子，和检测本主题事件。所得的植物的特征亦可通过包括本主题发明的方法来改善。
可培育除草剂耐受性玉米植物，即首先将由从本文中提及品系的种子生长出的玉米植物组成的第一亲本玉米植物和第二亲本植物有性杂交，由此产生多株第一后代植物，然后选择对除草剂有抗性的(或拥有主题事件的)第一后代植物；并将所述第一后代植物自交，由此产生多株第二后代植物，然后选择对除草剂有抗性的(或拥有至少所述事件之一)第二后代植物。这些步骤可进一步包括将第一后代植物或第二后代植物与第二亲本玉米植物或第三亲本玉米植物回交。然后可种植包含本主题发明的玉米种子的玉米作物或其后代。
亦可理解的是，亦可使两种转基因植物交配以产生含有两种独立分离添加的外源基因的后代。合适后代的自交可产生对于两种添加的外源基因为同源的植物。亦考虑了与亲本植物回交和与非转基因植物的异型杂交，以及营养繁殖。其他常用于不同性状和作物的育种方法在本领域是已知的。使用了回交育种以将简单遗传的、高度可遗传性状的基因转移至期望的纯合栽培种或近交系，其为回归亲本。待转移的性状的来源称为供体亲本。期待所得的植物具有回归亲本(例如栽培种)的特征和从供体亲本转移的期望的性状。在最初的杂交之后，选择了拥有供体亲本的表型的个体，并将其反复与回归亲本杂交(回交)。预期所得的亲本具有回归亲本(例如栽培种)的特征，和从供体亲本转移的期望的性状。
本发明可与标志物协助育种(MAB)方法一同使用。同样，本发明的DNA分子可与其他鉴定遗传连锁的农艺学上有用的性状的方法(如AFLP标志物，RFLP标志物，RAPD标志物，SNP和SSR)一起使用。可使用MAB方法在杂交(或其后代和任何其他玉米栽培种或品种)的后代中追踪除草剂抗性性状。本发明的方法可用于鉴定具有本主题事件的任何玉米品种。
本主题发明的方法包括产生除草剂耐受玉米植物的方法，其中所述方法包括用具有目标事件的植物育种。优选的方法进一步包括通过就根据本主题发明可检测的事件分析所述后代来选择所述杂交的后代。举例而言，本主题发明可用于通过与包含其他期望的性状如农艺学性状的植物的育种循环来追踪本主题事件。例如，可检测、鉴定、选择包含本主题事件和期望的性状的植物，并在进一步的育种轮次中快速使用。本主题事件/性状亦可通过育种来与昆虫抗性性状和/或其他的除草剂耐受性状组合，并根据本主题发明进行追踪。后者的一种优选实施方案为包含与编码咪唑啉酮除草剂，草甘膦和/或草铵膦的基因组合的本主题事件的植物。在一些实施方案中可使用麦草畏(dicamba)耐受基因。
因此，本主题发明可与，例如编码草甘膦抗性(例如，抗性植物或细菌EPSPS，GOX，GAT)，草铵膦抗性(例如，Pat，bar)，乙酰乳酸合酶(ALS)抑制性除草剂抗性(例如，咪唑啉酮[如咪草烟(imazethapyr)]、磺酰脲、三唑并嘧啶磺酰苯胺、嘧啶基硫代苯甲酸类(pyrmidinylthiobenzoates)和其他化学物[Csr1，SurA等])，溴苯腈(bromoxynil)抗性(例如Bxn)，对HPPD酶(4-羟基苯基丙酮酸二加氧酶)抑制剂的抗性，对八氢番茄红素去饱和酶(phytoenedesaturase)(PDS)的抑制剂的抗性，对光系统II抑制性除草剂(例如psbA)的抗性，对光系统I抑制性除草剂的抗性，对原卟啉原氧化酶(protoporphyrinogenoxidase IX(PPO))抑制性除草剂(例如PPO-1)的抗性，对苯基脲除草剂(例如CYP76B1)的抗性，麦草畏降解酶(dicamba-degrading enzyme)(参见，例如US20030135879)，和其他可单独或以多种组合层叠的性状相组合，以提供有效控制或预防杂草演替(weed shift)的能力和/或对于任何前述类型的除草剂的抗性。
考虑其他除草剂，一些其他的优选ALS(亦称作AHAS)抑制剂包括三唑并嘧啶磺酰苯胺(如氯酯磺草胺(cloransulam-methyl)，双氯磺草胺(diclosulam)，双氟磺草胺(florasulam)，氟唑啶草(flumetsulam)，磺草唑胺(metosulam)和五氟磺草胺(penoxsulam))，嘧啶基硫代苯甲酸类(如双嘧草醚(bispyribac)和嘧草硫醚(pyrithiobac))，和氟酮磺隆(flucarbazone)。一些优选的HPPD抑制剂包括甲基磺草酮(mesotrione)，异氟草(isoxaflutole)和磺草酮(sulcotrione)。一些优选的PPO抑制剂包括氟烯草酸(flumiclorac)，丙炔氟草胺(flumioxazin)，氟哒嗪草酯(flufenpyr)，吡草醚(pyraflufen)，哒草氟(fluthiacet)，氟丙嘧草酯(butafenacil)，氟酮唑草(carfentrazone)，磺酰唑草酮(sulfentrazone)和二苯基醚类(diphenylethers)(如三氟羧草醚(acifluorfen)，氟磺胺草醚(fomesafen)，乳氟禾草灵(lactofen)和乙氧氟草醚(oxyfluorfen))。
此外，AAD-1自身或与一种或多种其他HTC性状层叠的AAD-1，可与一种或多种其他输入(例如，昆虫抗性，真菌抗性，或应激耐受性等)或输出(例如增加的产量，改善的油分布(profile)，改善的纤维品质等)性状层叠。因此本主题发明可用于提供改善的作物品质与灵活且合算地控制任何数量的农艺学病虫害的能力的完整农艺学套组(package)。
如用于本文，“品系”为一组对于至少一种性状在个体间显示很少或不显示遗传差异的植物。此类品系可通过几个世代的自花授粉和选择，或从单个亲本使用组织或细胞培养技术进行的营养繁殖来构建。
如用于本文，术语“栽培种”和“品种”是同义词，并指用于商业生产的品系。
“稳定性”或“稳定的”意指对于给定组分，该组分在世代间，且优选至少三个世代保持在基本上相同的水平，例如优选±15％，更优选±10％，最优选±5％。稳定性可受温度、位置、应激和种植时间影响。在田间条件下后续世代的比较应以类似方式产生所述组分。
“商业实用性”定义为具有良好的植物活力(vigor)和高可育性，使得该作物可由农民使用常规耕作设备来产生，且可使用常规压榨和提取设备从种子提取具有所述组分的油。为了具有商业实用性，如通过种子重量、油含量和每英亩产生的全部的油测量的产率在其他方面相同的在相同区域种植的不具有优等价值性状的商业性玉米品种的平均产率的15％以内。
“农艺学上优秀的”意指品系除了由于本主题事件的昆虫抗性之外，还具有期望的农艺学特征如产率、成熟性、疾病抗性等。农艺学性状可单独或以任何组合采用。
如本领域技术人员在本公开基础上会认识到的，检测试剂盒的优选实施方案可例如包括探针和/或引物。举例而言，这包括如本文中指出的多核苷酸探针、引物和/或扩增子。
本领域技术人员亦会认识到可设计引物和探针以在多种标准杂交和/或PCR条件下，与SEQ ID No：1(或其互补物)的片段，及其互补物相杂交，其中所述引物或探针并不完美地与例示的序列互补。即，可容忍一定程度的错配。例如，对于大约20个核苷酸的引物，若错配的碱基在引物的内部或与扩增子相反的末端，通常一个或两个左右的核苷酸并不需要与相反链结合。下面提供了多种适当的杂交条件。合成的核苷酸类似物，如次黄嘌呤核苷，亦可用于探针中。亦可使用肽核酸(PNA)探针，以及DNA和RNA探针。重要的是此类探针和引物对于本主题发明的事件的存在是诊断性的(能够独一无二地鉴定和区分)。
每种“插入”的组分图示于图1至3。这些组分，或其片段的DNA多核苷酸序列，可在本发明的方法中用作DNA引物或探针。
在本发明的一些实施方案中，提供了用于在来自玉米植物的植物和种子等中检测转基因/基因组插入区的存在的组合物和方法。
在一些实施方案中，本发明的一个方面是包含新转基因/基因组插入区的连续片段的DNA序列。包括了下述DNA序列，其包含充足长度的转基因插入序列的多核苷酸和充足长度的玉米基因组序列的多核苷酸和/或可用作引物序列的序列以供产生对于一种或多种这种玉米植物具有诊断性的扩增子产物。
相关的实施方案涉及本文中鉴定的DNA序列的转基因部分包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸或其互补物的DNA序列。这些序列可用作DNA扩增方法中的DNA引物。使用这些引物产生的扩增子对于本文中提及的玉米事件具有诊断性。因此，本发明还包括通过此类DNA引物和同源引物产生的扩增子和扩增子。
本发明包括在样品中检测对应于本文中提及的玉米事件的DNA的存在的方法。此类方法可包括：(a)将包含DNA的样品与引物组相接触，所述引物组当用于用来自这些玉米事件至少之一的DNA进行的核酸扩增反应时，产生对于所述事件具诊断性的扩增子；(b)进行核酸扩增反应，由此产生所述扩增子；和(c)检测所述扩增子。
本主题发明的进一步的检测方法包括在样品中检测对应于至少一种所述事件的DNA的存在的方法，其中所述方法包括：(a)将包含DNA的样品与在严格杂交条件下与来自所述玉米事件至少之一的DNA杂交，而不在严格杂交条件下与对照玉米植物(非感兴趣的事件的DNA)杂交的探针相接触；(b)对样品和探针施以严格杂交条件；和(c)检测所述探针对所述DNA的杂交。
本发明包括检测样品中来自至少一种本文中提及的玉米植物的DNA的存在的方法。此方法可包括：(a)将包含DNA的样品与本主题发明的引物组相接触，所述引物组当用于核酸扩增反应时，与来自这些玉米事件至少之一的DNA(杂交)；(b)使用本文中鉴定的参照基因进行TAQMAN PCR扩增反应；和(c)分析结果。
仍在进一步的实施方案中，本主题发明包括产生玉米植物的方法，所述玉米植物包括本发明的AAD-1事件，其中所述方法包括下述步骤：(a)将第一亲本玉米品系(包含本发明的表达盒，其赋予所述品系的植物以所述除草剂抗性性状)与第二亲本玉米品系(其缺乏该除草剂耐受性性状)有性杂交，由此产生多株后代植物；和(b)通过使用分子标志物选择后代植物。此方法可任选地包括将所述后代植物与第二亲本玉米品系回交以产生包含所述除草剂耐受性状的真育种(true-breeding)玉米植物的进一步步骤。
根据本发明的另一个方面，提供了确定涉及本主题事件的杂交的后代的接合性的方法。所述方法可包括将包含玉米DNA的样品与本主题的引物组相接触。此种引物，当用于使用来自所述玉米事件至少之一的基因组DNA的核酸扩增时，产生对于所述玉米事件至少之一具诊断性的第一扩增子。此方法进一步包括进行核酸扩增反应，由此产生第一扩增子；检测所述第一扩增子，并将包含玉米DNA的样品与所述引物组相接触，当将所述引物组用于使用来自玉米植物的基因组DNA的核酸扩增反应中时，产生包含与所述玉米基因组区同源的天然玉米基因组DNA的第二扩增子；并进行核酸扩增反应，由此产生第二扩增子。所述方法进一步包括检测所述第二扩增子，和在样品中比较所述第一和第二扩增子，其中两种扩增子的存在表明该样品对于所述转基因插入是杂合的。
可使用本文中公开的组合物和DNA检测领域公知的方法开发DNA检测试剂盒。所述试剂盒可用于在样品中鉴定本主题玉米事件DNA，并可应用于供育种含有该DNA的玉米植物的方法。所述制剂盒含有与所述扩增子同源或互补的DNA序列，所述扩增子例如本文中公开的扩增子，或同与本主题事件的转基因遗传元件中所含DNA同源或互补的DNA序列同源或互补的DNA序列。这些DNA序列可用于DNA扩增反应，或作为DNA杂交方法中的探针。所述试剂盒亦可含有进行检测方法所需的试剂和材料。
“探针”是附于常规的可检测标记或报道分子(如放射性同位素、配体，化学发光剂或酶)的分离的核酸分子。此种探针与靶核酸的链互补，在本发明的情况下，与来自所述玉米事件之一的基因组DNA的链互补，无论所述其来自玉米植物或来自含有由所述事件所得的DNA的样品。本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，且还包括聚酰胺和其他特异性结合于靶DNA序列并可用于检测所述靶DNA序列存在的探针物质。
“引物”为通过核酸杂交与互补靶DNA链退火以形成引物和靶DNA链之间的杂合体，然后由聚合酶例如DNA聚合酶沿所述靶DNA链延伸的分离的/合成的核酸。本发明的引物对涉及其用于扩增靶核酸序列(例如通过聚合酶式反应(PCR)或其他常规核酸扩增方法)的用途。
探针和引物的长度一般为5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，266，267，268，269，270，271，272，273，274，275，276，277，278，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291，292，293，294，295，296，297，298，299，300，301，302，303，304，305，306，307，308，309，310，311，312，313，314，315，316，317，318，319，320，321，322，323，324，325，326，327，328，329，330，331，332，333，334，335，336，337，338，339，340，341，342，343，344，345，346，347，348，349，350，351，352，353，354，355，356，357，358，359，360，361，362，363，364，365，366，367，368，369，370，371，372，373，374，375，376，377，378，379，380，381，382，383，384，385，386，387，388，389，390，391，392，393，394，395，396，397，398，399，400，401，402，403，404，405，406，407，408，409，410，411，412，413，414，415，416，417，418，419，420，421，422，423，424，425，426，427，428，429，430，431，432，433，434，435，436，437，438，439，440，441，442，443，444，445，446，447，448，449，450，451，452，453，454，455，456，457，458，459，460，461，462，463，464，465，466，467，468，469，470，471，472，473，474，475，476，477，478，479，480，481，482，483，484，485，486，487，488，489，490，491，492，493，494，495，496，497，498，499或500个核苷酸或更长。此类探针和引物在高严格杂交条件下与靶序列特异性杂交。优选地，本发明的探针和引物与靶序列具有完全的序列类似性，尽管可通过常规方法设计与靶序列不同并保留与靶序列杂交能力的探针。
用于制备和使用探针和引物的方法描述于例如Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2nd ed.，vol.1-3，ed.Sambrook等，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989。PCR-引物对可从已知序列，例如通过使用为此目的的计算机程序来衍生。
基于本文中公开的侧翼DNA和插入序列的引物和探针可用于确证(且视需要，改正)通过常规方法，例如通过重新克隆此类序列和对此类序列测序而披露的序列。
本发明的核酸探针和引物在严格条件下与靶DNA序列杂交。可使用任何常规核酸杂交或扩增方法以鉴定样品中来自转基因事件的DNA的存在。核酸分子或其片段能够在某些情况下特异性杂交于其他核酸分子。如用于本文，若两个核酸分子能够形成反平行双链核酸结构，则称该两个分子能够彼此特异性杂交。若两个核酸分子呈现完全互补性，则称一个核酸分子为另一个核酸分子的“互补物”。如用于本文，当一个分子的每一个核苷酸互补于另一个分子的核苷酸时，称这些分子呈现“完全互补性”。若两个分子可以以足够的稳定性相互杂交以允许其在至少常规的“低严格”条件下维持彼此粘合(anneal)，则称其为“最低限度互补的(minimally complementary)”。类似地，若两个分子可以以足够的稳定性相互杂交以允许其在常规的“高严格”条件下维持彼此粘合，则称其为“互补的”。常规的严格条件描述于Sambrook等，1989。因此，可允许与完全互补的偏离，只要该偏离并不完全排除分子形成双链结构的能力。为了使核酸分子充当引物或探针，仅需其序列充分互补以能够在采用的特定溶剂和盐浓度下形成稳定的双联结构。
如用于本文，基本上同源的序列是会与其在高严格条件下进行比较的核酸序列的互补物特异性杂交的核酸序列。术语“严格条件”是对于核酸探针对靶核酸通过Sambrook等，1989在9.52-9.55处讨论的特异性杂交步骤而杂交进行的功能限定(还可见于Sambrook等，1989，9.47-9.52和9.56-9.58)。相应地，本发明的核苷酸序列可就其与DNA片段的互补段选择性低形成双链体分子的能力而使用。
取决于考虑到的应用，可使用多种杂交条件以获得探针对靶序列的不同程度的选择性。对于需要高选择性的应用，可通常采用相对严格的条件来形成杂合体，例如，会选择相对低盐和/或高温度的条件，如由约0.02M至约0.15M NaCl在约50℃至约70℃的温度提供的条件。严格条件，例如，可涉及用高严格性洗涤缓冲液(0.2X SSC，0.1％SDS，65℃)洗涤杂交滤纸至少两次。促进DNA杂交的适当严格条件，例如在约45℃的6.0X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，接着在50℃用2.0X SSC的洗涤，对于本领域技术人员是已知的。举例而言，洗涤步骤中的盐浓度可选自在50℃的约2.0X SSC的低严格度至在50℃的约0.2X SSC的高严格度。此外，洗涤步骤中的温度可从室温约22℃的低严格条件增加至约65℃的高严格条件。温度和盐均可变化，或可将温度或盐浓度之一维持恒定的同时改变另一个变量。此类选择性条件几乎不容忍探针和模板或靶链之间的错配(若有的话)。通过杂交检测DNA序列对于本领域技术人员是公知的，且美国专利号4,965,188和5,176,995的教导是杂交分析方法的实例。
在一个特别优选的实施方案中，本发明的核酸会在高严格条件下特异性杂交于本文中例示或提出的一种或多种引物(或扩增子或其他序列)，包括其互补物和片段。在本发明的一个方面，本发明的核酸分子具有SEQ ID NO：2-7中列出的核酸序列，或其互补物和/或片段。
在本发明的另一个方面，本发明的标志物核酸分子与此类核酸序列分享80％至100％或90％至100％的序列同一性。在本发明的进一步的方面，本发明的标志物核酸分子与此种序列分享95％至100％的序列同一性。此类序列可用作植物育种方法中的标志物以鉴定遗传杂交的后代。探针对靶DNA分子的杂交可通过任何本领域技术人员已知的数种方法来检测，其可包括但不限于荧光标记，放射性标记，基于抗体的标记和化学发光标记。
对于使用特定扩增引物对扩增靶核酸序列(例如，通过PCR)，“严格条件”为允许引物对仅杂交于会与具有对应的野生型序列(或其互补物)的引物结合并优选产生独特扩增产物即扩增子的靶核酸序列的条件。
术语“特异于(靶序列)/对(靶序列)特异性的”表明探针或引物在严格杂交条件下仅与包含所述靶序列的样品中的靶序列杂交。
如用于本文，“扩增的DNA”或“扩增子”指作为核酸模板一部分的靶核酸序列的核酸扩增产物。举例而言，为了确定从有性杂交获得的玉米植物是否含有来自本发明的玉米植物的转基因事件基因组DNA，可对从玉米植物组织提取的DNA进行使用引物对的核酸扩增方法以产生对于所述事件DNA的存在为诊断性的扩增子，所述引物对包括来源于所述植物基因组中邻近插入的异源DNA插入位点的侧翼序列的引物，和来源于插入的异源DNA的第二引物。所述扩增子的长度和具有的序列使其亦对该事件具诊断性。所述扩增子的长度的范围可为引物对的合并长度加上一个核苷酸碱基对，和/或引物对的合并长度加上约2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，266，267，268，269，270，271，272，273，274，275，276，277，278，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291，292，293，294，295，296，297，298，299，300，301，302，303，304，305，306，307，308，309，310，311，312，313，314，315，316，317，318，319，320，321，322，323，324，325，326，327，328，329，330，331，332，333，334，335，336，337，338，339，340，341，342，343，344，345，346，347，348，349，350，351，352，353，354，355，356，357，358，359，360，361，362，363，364，365，366，367，368，369，370，371，372，373，374，375，376，377，378，379，380，381，382，383，384，385，386，387，388，389，390，391，392，393，394，395，396，397，398，399，400，401，402，403，404，405，406，407，408，409，410，411，412，413，414，415，416，417，418，419，420，421，422，423，424，425，426，427，428，429，430，431，432，433，434，435，436，437，438，439，440，441，442，443，444，445，446，447，448，449，450，451，452，453，454，455，456，457，458，459，460，461，462，463，464，465，466，467，468，469，470，471，472，473，474，475，476，477，478，479，480，481，482，483，484，485，486，487，488，489，490，491，492，493，494，495，496，497，498，499，或500，750，1000，1250，1500，1750，2000或更多个核苷酸碱基对(加上或减去任何上述列出的增量)。或者，引物对可来源于插入的DNA两侧的侧翼序列从而产生包括整个插入核苷酸序列的扩增子。来源于植物基因组序列的引物对的成员可位于距插入的DNA序列一定距离处。该距离的范围可为一个核苷酸碱基对至约两万个核苷酸碱基对。术语“扩增子”的使用特别排除了可在DNA热扩增反应中形成的引物二聚体。
核酸扩增可通过任何本领域中已知的多种核酸扩增方法，包括聚合酶链式反应(PCR)来实现。多种扩增方法在本领域是已知的，并描述于除其他之外，美国专利号4,683,195和美国专利号4,683,202。开发了PCR扩增方法以扩增高至22kb的基因组DNA。这些方法，以及本领域已知的其他DNA扩增的方法可用于本发明的实践。可验证(视需要，可校正)来自主题玉米事件的异源转基因DNA插入的序列或侧翼基因组序列，即使用来源于本文中提供的序列的引物来扩增此类序列，接着对PCR扩增子或克隆的DNA进行标准DNA测序。
可通过多种技术检测由这些方法产生的扩增子。琼脂糖凝胶电泳和用溴乙锭的染色是检测DNA扩增子的常见公知方法。另一此类方法是Genetic BitAnalysis，其中设计了与邻接的侧翼基因组DNA序列和插入的DNA序列两者重叠的DNA寡核苷酸。将所述寡核苷酸固定于微孔板的孔中。在对感兴趣的区域的PCR(使用一个在插入序列中的引物和一个在邻接侧翼基因组序列中的引物)之后，可将单链PCR产物与固定的寡核苷酸杂交，并充当模板用于单碱基延伸反应，所述反应使用DNA聚合酶和对预期的接下来的碱基具有特异性的标记的ddNTP。读数可为荧光性的或基于ELISA的。信号表明由于成功的扩增、杂交和单碱基延伸所致的插入/侧翼序列的存在。
本文中提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和公开以其不与本说明书的明确教导不一致的程度通过全文提述并入本文。
除非临行指明，使用下述缩写：
Figure BDA0000154937660000181
Figure BDA0000154937660000191
实施例
实施例1：事件特异性Taqman测定法
开发了事件特异性Taqman测定法以检测玉米事件DAS-40278-9的存在和确定育种群体中植物的接合性状态。为了开发事件特异性测定法，根据位于5’插入植物的接点处的DNA序列设计特异性Taqman引物和探针。对于DAS-40278-9的特异性检测，使用两种特异性引物扩增跨越该5’整合接点的73-bp DNA片段。通过由Applied Biosystems合成的、在其5’端含有FAM报道子的靶特异性MGB探针测量该PCR产物的扩增。针对16种不同AAD-1玉米事件和双链形式的非转基因玉米品种用玉米特异性内源参照基因即转化酶来测试对于AAD-1玉米事件DAS-40278-9的该Taqman检测方法的特异性。
实施例1.1：gDNA分离
在该研究中测试16个不同AAD-1玉米事件和非转基因玉米品种的gDNA样品。用两种方法，Qiagen试剂盒或CTAB，来提取gDNA。对于用Qiagen制剂盒提取gDNA样品，根据修饰的Qiagen DNeasy 96Plant Kit的实验方案，使用八片玉米新鲜叶片用于gDNA提取。对于使用CTAB步骤提取的gDNA样品，遵循来自Permingeat等，1998的实验方案使用约0.3g冻干的叶组织。根据销售商的指示(Molecular Probes，Eugene，OR)，用Pico Green方法对gDNA进行定量。用不含DNase的水稀释gDNA样品，得到10ng/μL的浓度以供本研究的目的。
实施例1.2：Taqman测定法和结果
对于DAS-40278-9事件特异性Taqman测定法来设计具体Taqman引物和探针。可用下表所列的条件来使用这些试剂以检测AAD-1玉米事件DAS-40278-9。表1列出了特别对于事件DAS-40278-9的检测来开发的引物和探针序列。
表1：PCR引物和探针
用于扩增的多通路PCR条件如下所述：1X PCR缓冲液，.5-2.5mMMgCl2，.2mM dNTP，0.2μM Primer Corn-278-F，0.2μM Primer Corn-278-R，0.2μM Primer_IV-F，0.2μM Primer_IV-R，0.08μM Probe_Corn-278-Probe，0.08uM Probe_IV-Probe，40U/mL HotStart Taq，0.6至2.4ug/mL DNA，总反应为25μl。测试了多种浓度的MgCl2和DNA。使用下述条件扩增混合物：i)95℃进行15分钟，ii)95℃进行20秒，iii)60℃进行60秒，iv)重复步骤ii-iii 50个循环，v)4℃维持。在Bio-rad iCyclerTM系统上进行实时PCR。数据分析基于循环阈值(CT)的测量，其为当荧光测量值达到设定值时的PCR循环数。CT值通过iCycler软件自动计算。
使用上述引物生成的扩增子序列如下所述：
278F和278R：
ttacaatcaacagcaccgtaccttgaagcggaatacaatgaaggttagctacgatttacagcaaagccagaat
(SEQ ID NO：8)
IVF和IVR：
tggcggacgacgacttgtccgagcagaccgccgtgtacttctacctgctcaagggcacggacggcagcctccaaacttt
(SEQ ID NO：9)
针对16种不同的AAD-1玉米事件和双链形式的非转基因玉米品种用玉米特异性内源转化酶作为参照基因来测试用于AAD-1玉米事件DAS-40278-9的Taqman检测方法。该测定法特异性检测AAD-1玉米事件DAS-40278-9，且并不从对照(即，16种不同的AAD-1玉米事件和非转基因玉米品种)产生或扩增任何假阳性结果。事件特异性引物和探针可用于检测AAD-1玉米事件DAS-40278-9，且这些条件和试剂适用于接合性测定。
Figure IDA0000154937710000021
Figure IDA0000154937710000031
Figure IDA0000154937710000061

Claims (23)

1.一种用于确定玉米植物的接合性的方法，所述植物包含AAD-1玉米事件DAS-40278-9，所述事件包含转基因构建体，所述转基因构建体包含AAD-1基因，所述转基因构建体的侧翼为5’侧翼玉米基因组DNA和3’侧翼玉米基因组DNA，所述方法包括：
获得来自所述玉米植物的基因组DNA的DNA样品；
通过将所述DNA样品与下述接触来产生接触的样品：
a.第一事件引物和第二事件引物，其中所述第一事件引物特异性结合所述转基因构建体，所述第二事件引物特异性结合所述5’玉米基因组侧翼DNA或所述3’玉米基因组侧翼DNA，且其中所述第一事件引物和所述第二事件引物，当置于TAQMAN PCR条件下时，产生事件扩增子
b.参照正向引物和参照反向引物，其当置于TAQMAN PCR条件下时，产生来自内源玉米参照基因的参照扩增子
c.荧光事件探针，其与所述事件扩增子杂交
d.荧光参照探针，其与所述参照扩增子杂交；
将所述接触的样品置于基于荧光的终点TAQMAN PCR条件下；
对杂交于所述事件扩增子的所述荧光事件探针进行定量；
对杂交于所述参照扩增子的所述荧光参照探针进行定量；
将杂交的荧光事件探针的量与杂交的荧光参照探针的量相比较；和
通过比较杂交的荧光事件探针和杂交的荧光参照探针的荧光比来确定DAS-40278-9的接合性。
2.权利要求1的方法，其中所述扩增子由50-100个残基组成。
3.权利要求1的方法，其中所述5’侧翼DNA包含SEQ ID No：29的残基1-1873，并且所述3’侧翼DNA包含SEQ ID No：29的残基6690-8557。
4.权利要求1的方法，其中所述转基因构建体由SEQ ID No：29的残基1874-6689组成。
5.权利要求1的方法，其中所述参照基因是内源玉米(Zea mays)转化酶基因。
6.权利要求1的方法，其中所述第二事件引物结合SEQ ID No：29的残基1673-1873或其互补物。
7.权利要求1的方法，其中所述第二事件引物结合SEQ ID No：29的残基6690-6890。
8.权利要求1的方法，其中所述方法用于将所述事件育种渐渗入另一玉米品系。
9.权利要求8的方法，其中所述另一玉米品系缺乏所述事件。
10.权利要求1的方法，其中所述事件扩增子为73个碱基对。
11.权利要求1的方法，其中所述参照基因包含选自下组的序列或与选自下组的序列杂交：SEQ ID No：5，SEQ ID No：6和SEQ ID No：7。
12.权利要求1的方法，其中所述参照引物包含SEQ ID No：5和SEQ IDNo：6，并且所述参照探针包含SEQ ID No：7。
13.权利要求1的方法，其中所述探针用荧光染料和淬灭剂标记。
14.权利要求13的方法，其中所述事件探针包含在所述事件探针5’端处的作为所述荧光染料的FAM，和在所述事件探针3’端的MGB淬灭剂。
15.权利要求1的方法，其中所述参照扩增子是由所述引物扩增的79个碱基对片段。
16.权利要求13的方法，其中所述参照探针用HEX在所述参照探针的5’端并用Black Hole Quencher 2(BHQ2)在所述参照探针的3’端标记。
17.权利要求1的方法，其中所述事件扩增子由SEQ ID No：8组成，并且所述参照扩增子由SEQ ID No：9组成。
18.权利要求1的方法，其中所述事件探针包含SEQ ID No：4。
19.权利要求1的方法，其中所述事件引物选自下组：SEQ ID No：2和SEQ ID No：3。
20.权利要求1的方法，其中所述方法的结果直接在读板器中读取。
21.权利要求1的方法，其中所述DNA样品从田间的玉米植物获得。
22.一种进行权利要求1的方法的试剂盒，所述试剂盒包含所述第一事件引物，所述第二事件引物，所述参照正向引物，所述参照反向引物，所述事件探针和所述参照探针。
23.权利要求22的试剂盒，其中所述事件引物由SEQ ID No：2和SEQ IDNo：3组成，所述参照引物由SEQ ID No：5和SEQ ID No：6组成，所述事件探针由SEQ ID No：4组成，并且所述参照引物由SEQ ID No：7组成。
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