CN103826442A

CN103826442A - 牵涉aad-1植物及种植前和/或出土前除草剂应用的杂草控制方法

Info

Publication number: CN103826442A
Application number: CN201280019765.9A
Authority: CN
Inventors: L.B.布拉克斯顿; M.皮特森; S.麦克马斯特; T.赖特
Original assignee: Dow AgroSciences LLC
Current assignee: Kedihua Agricultural Technology Co ltd
Priority date: 2011-02-22
Filing date: 2012-02-21
Publication date: 2014-05-28
Anticipated expiration: 2032-02-21
Also published as: BR112013021371A2; KR101899619B1; JP2014514251A; UY33918A; ZA201306749B; CA2827906A1; NZ615200A; RU2013142921A; MX2013009691A; EP2677859A4; CL2013002415A1; AU2012220780B2; AU2012220780A1; US20140256548A1; MX345254B; RU2610664C2; JP6057920B2; AP2013007113A0; AP3980A; KR20140026385A

Abstract

本发明包括对种植有包含AAD-1事件的种子的区域或田地在种植前和/或出土前应用除草剂。在一些优选的实施方案中，种子包含玉米事件DAS-40278-9。在一些优选的实施方案中，除草剂可以是包含2,4-D活性成分的配制剂。也可以在种植前应用中使用此类除草剂和配制剂。可以组合使用别的除草剂，诸如草甘膦，包括在种植前应用中。

Description

牵涉AAD-1植物及种植前和/或出土前除草剂应用的杂草控制方法

发明背景

aad-1基因(最初来自Sphingobium herbicidovorans)编码芳氧基链烷酸酯双加氧酶(AAD-1)蛋白。该性状赋予对2,4-二氯苯氧基乙酸和芳氧苯氧基丙酸酯(通常称为“fop”除草剂诸如喹禾灵(quizalofop))除草剂的耐受性，并且可以在植物转化期间及育种苗圃中作为选择标志物使用。在植物中实现除草剂耐受性的aad-1基因自身第一次披露于WO2005/107437(还可见US2009-0093366)。

异源或外来基因在植物中的表达受到外来基因在何处插入染色体中影响。例如，这可以是由于染色质结构(例如，异染色质)或转录调节元件(例如，增强子)接近整合位点的接近性(Weising等,Ann.Rev.Genet22:421-477,1988)。相同类型的转基因植物(或其它生物体)中的相等基因可以在不同事件间展现出表达水平的广泛变化。还可能存在着空间或时间表达样式的差异。例如，转基因在多个植物组织中的相对表达差异可以不对应于自存在于导入的基因构建体中的转录调节元件预期的样式。

如此，经常创建大量事件，并筛选以鉴定以对于给定的目的满意的水平表达导入的感兴趣基因的事件。对于商业目的，生成成百上千个不同事件，并对那些事件筛选具有期望的转基因表达水平和样式的单一事件是常见的。具有期望的转基因表达水平和/或样式的事件可用于使用常规的育种方法通过有性异型杂交(outcrossing)将转基因渐渗入(introgress)其它遗传背景中。此类杂交的后代维持初始转化体的转基因表达特征。使用此策略来确保充分适应于地方生长条件的许多品种(variety)中的可靠基因表达。

美国专利申请20020120964A1和20040009504A1涉及棉事件PV-GHGT07(1445)及其组成和检测方法。WO02/100163涉及棉事件MONI5985及其组成和检测方法。WO2004/011601涉及棉事件MON863植物及其组成和检测方法。WO2004/072235涉及棉事件MON88913及其组成和检测方法。

WO2006/098952涉及玉米事件3272。WO2007/142840涉及玉米事件MIR162。

美国专利No.7,179,965涉及具有cry1F事件和cry1Ac事件的棉。

具有本文中公开的特定事件的AAD-1玉米先前尚未得到披露。

发明概述

附图简述

图1显示了pDAS1740的质粒图。

图2显示了用于DAS-40278-9(pDAS1740)的插入物组件。

图3显示了用于DAS-40278-9(pDAS1740)的插入物的限制性图谱和组件。

图4显示了用于DAS-40278-9的DNA插入物和边界的扩增子、引物、和克隆策略。

图5显示了就DAS-40278-9插入物和边界而言的引物定位。

图6显示了DAS-40278-9的交接区和插入。

图7是实施例7中提及的育种图。

序列简述

SEQ ID NO:1-28是如本文中描述的引物。

SEQ ID NO:29提供了主题事件DAS-40278-9的插入物和侧翼序列。

SEQ ID NO:30-33是针对侧翼标志物的引物，如实施例4中描述的。

发明详述

本发明包括对后来种植有包含AAD-1事件的种子的区域或田地在种植前和/或出土前(pre-emergence)应用除草剂。在一些优选的实施方案中，种子包含玉米事件DAS-40278-9。在一些优选的实施方案中，除草剂可以是包含2,4-D活性成分的配制剂。也可以在种植前应用中使用此类除草剂和配制剂。可以组合使用别的除草剂，诸如草甘膦，包括在种植前应用中。本发明不限于玉米，而且可以包括例如包含aad-1基因的棉和/或大豆的用途。

本文中包括的例子部分涉及除草剂的种植前和/或出土前应用。此类用途不限于“278”事件。可以就缩短的回种(plant-back)时间间隔而言进一步详述由主题AAD-1基因提供的耐受性的效用。这给予种植者以在相对于烧毁安排其种植中的更大量的灵活性。在不使用本发明的情况下，在种植前在烧毁后等待7-30天左右可以引起显著的产量损失。如此，本发明在此方面提供了优点。参见例如实施例13。可以依照本发明使用任何种植/除草剂应用时间间隔，和本文中例示或提示的除草剂的任何浓度范围/使用比率。

如此，本发明包括应用除草剂的新方法。此类应用可以包括超过一种除草剂的罐(tank)混合物。依照本发明使用的一些优选的除草剂包括苯氧基生长素除草剂诸如2,4-D;2,4-DB;MCPA;MCPB。这些可以与一种或多种别的除草剂耐受性基因和相应的除草剂(例如草甘膦和/或草丁磷)叠加。可以在有利的组合中使用1、2、3或更多种除草剂，这对于具有本公开内容益处的本领域技术人员会是显而易见的。可以在给田地/区域种植本发明的种子前对该田地/区域应用一种或多种主题除草剂。此类应用可以在例如种植的14天内。也可以在种植时和/或种子后但出土前应用一种或多种主题除草剂。也可以对地面(用于控制杂草)或在杂草和/或本发明的转基因植物顶部上方应用一种或多种主题除草剂。可以轮种或组合使用三种主题除草剂以例如控制或防止可以耐受一种除草剂而不是另一种的杂草。三类主题除草剂的各种应用时间可以以多种方式使用，如本领域中会知道的。

如此，本发明还包括对后来种植有包含AAD-1事件的种子的区域或田地在种植前应用除草剂。在一些优选的实施方案中，种子包含玉米事件DAS-40278-9。在一些优选的实施方案中，除草剂可以是包含2,4-D活性成分的配制剂。也可以在种植前应用中使用此类除草剂和配制剂。可以在种植前应用中组合使用别的除草剂，诸如草甘膦。任何此类实施方案中可以使用例如玉米、棉和大豆。

aad-1基因可以与例如以下性状组合以提供有效控制或防止杂草转移和/或对前述类别的任何除草剂的抗性的能力，所述性状编码草甘膦抗性(例如抗性植物或细菌EPSPS,GOX,GAT)、草丁磷抗性(例如Pat,bar)、乙酰乳酸合酶(ALS)抑制除草剂抗性(例如咪唑啉酮[诸如咪草烟(imazethapyr)]、磺酰脲、三唑嘧啶磺酰苯胺(triazolopyrimidine sulfonanilide)、嘧啶基硫代苯甲酸(pyrmidinylthiobenzoate)、和其它化学品[Csr1,SurA等])、溴草腈(bromoxynil)抗性(例如Bxn)、对HPPD(4-羟苯基-丙酮酸-加双氧酶)酶抑制剂的抗性、对八氢番茄红素去饱和酶(PDS)抑制剂的抗性、对光系统II抑制性除草剂的抗性(例如psbA)、对光系统I抑制性除草剂的抗性、对原卟啉原氧化酶IX(PPO)抑制性除草剂的抗性(例如PPO-1)、和对苯基脲除草剂的抗性(例如，CYP76B1)、麦草畏降解酶(见例如US20030135879)、和可以单独或在多种组合中叠加的其它抗性。

关于别的除草剂，一些别的优选的ALS(又称为AHAS)抑制剂包括三唑嘧啶磺酰苯胺(诸如氯酯磺草胺(cloransulam-methyl)、双氯磺草胺(diclosulam)、双氟磺草胺(florasulam)、唑嘧磺草胺(flumetsulam)、磺草唑胺(metosulam)、和五氟磺草胺(penoxsulam)、嘧啶硫代苯甲酸酯(pyrimidinylthiobenzoates)(诸如双草醚(bispyribac)和嘧草硫醚(pyrithiobac))、和氟唑磺隆(flucarbazone)。一些优选的HPPD抑制剂包括硝磺草酮(mesotrione)、异恶唑草酮(isoxaflutole)、和磺草酮(sulcotrione)。一些优选的PPO抑制剂包括酰亚胺苯氧乙酸(flumiclorac)、丙炔氟草胺(flumioxazin)、氟哒嗪草酮(flufenpyr)、吡草醚(pyraflufen)、氟噻草酯(fluthiacet)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、唑酮草酯(carfentrazone)、磺酰唑草酮(sulfentrazone)、和二苯醚(diphenylether)(诸如三氟羧草醚(acifluorfen)、氟磺胺草醚(fomesafen)、乳氟草灵(lactofen)、和氧氟草醚(oxyfluorfen))。

依照本发明使用的AAD-1基因也可以提供对转化为苯氧基乙酸生长素除草剂(例如2,4-DB,MCPB等)的化合物的抗性。经由β-氧化将2,4-DB除草剂中存在的丁酸模块转化为植物毒性2,4-二氯苯氧基乙酸。同样地，经由β-氧化将MCPB转化成植物毒性MCPA。丁酸除草剂自身是非除草剂的。它们在易感性植物内通过β-氧化转化成其相应的酸，并且它是植物毒性的乙酸形式的除草剂。不能快速β-氧化的植物不受丁酸除草剂阻碍。然而，随后，AAD-1保护能够快速β-氧化并且将丁酸除草剂转化成乙酸形式的植物。

本公开内容中包括具有以登录号PTA-10244保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的种子的称作DAS-40278-9的AAD-1玉米事件及其衍生的后代。其它方面包括玉米事件DAS-40278-9的后代植物、种子和谷粒或植物的可再生部分及种子和后代，及自其中任一项生成的食物或饲料产品。本公开内容还包括玉米事件DAS-40278-9的植物部分，其包括但不限于花粉、胚珠、花、枝条、根、和叶，以及营养细胞、花粉细胞、和卵细胞的核。进一步公开了具有对苯氧基生长素和/或芳氧基链烷酸酯除草剂的耐受性的玉米植物、玉米事件DAS-40278-9的新遗传组成、和包含玉米事件DAS-40278-9的玉米植物的农艺学性能的方面。

本文中包括植物育种的方法和除草剂耐受性植物，其包含玉米植物中的aad-1转化事件，该转化事件包含插入玉米细胞基因组内的特定位点中的如本文中描述的多核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述事件/多核苷酸序列可以与其它性状“叠加”，所述其它性状包括例如其它除草剂耐受性基因和/或昆虫抑制蛋白。本文中还描述了具有单一事件的植物。

别的性状可以经由植物育种、含有玉米事件DAS-40278-9的转基因植物的再转化、或经由同源重组经由靶向整合添加新性状叠加入植物基因组中。

其它实施方案包括切出多核苷酸序列，该多核苷酸序列包含玉米事件DAS-40278-9，其包含例如pat基因表达盒。在切出多核苷酸序列后，可以在特定染色体位点处再靶向经修饰的事件，其中别的多核苷酸序列与玉米事件DAS-40278-9叠加。

在一个实施方案中是位于染色体2上在约20cM处2008DAS玉米连锁图谱上在约20cM处SSR标志物UMC1265(见SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31)和MMC0111(见SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33)之间的玉米染色体靶位点，其中靶位点包含异源核酸。在另一个实施方案中是如本文中描述的包含SEQID NO:29中或以SEQ ID NO:29限定的位置及其残基的玉米染色体靶位点，如本领域技术人员会认可的。

在一个实施方案中是生成转基因玉米植物的方法，其包括在位于染色体2上在约20cM处2008DAS玉米连锁图谱上在约20cM处SSR标志物UMC1265(见SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31)和MMC0111(见SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33)之间的位置处插入异源核酸。在又一个实施方案中，插入的异源核酸5’侧翼有整个或部分的在本文中参考SEQ ID NO:29限定的5’侧翼序列，且3’侧翼由有整个或部分的在本文中参考SEQ ID NO:29限定的5’侧翼序列。

另外，本文中公开了用于检测(例如玉米粒)样品中主题事件的存在的测定法。该测定法可以基于重组构建体中插入玉米基因组中且在基因组序列上在插入位点侧翼的DNA序列。还提供了可用于进行测定法的试剂盒和条件。

本文中还公开了整个AAD-1插入物的DNA序列，及其边界区(在转基因植物系中)的克隆和分析。这些序列是独特的。基于这些插入物和边界序列，生成事件特异性引物。PCR分析表明可以通过分析用这些事件特异性引物组生成的PCR扩增子鉴定这些事件。如此，这些和其它相关规程可以用于独特鉴定包含此事件的玉米系。

本公开内容包括植物育种和除草剂耐受性植物的用途。本发明包括玉米植物(玉蜀黍)的转化事件的新用途，所述玉米植物包含插入玉米细胞基因组内的特定位点中的如本文中描述的主题aad-1多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸序列可以与其它性状(诸如例如其它除草剂耐受性基因和/或编码昆虫抑制蛋白的基因)“叠加”。在一些实施方案中，可以将所述多核苷酸序列切出，随后，与别的多核苷酸序列一起再靶向。然而，本发明包括具有单一事件的植物，如本文中描述的。

另外，本公开内容提供了用于检测样品中主题事件的存在的测定法。方面包括设计和/或生成本文中例示或提示的任何诊断性核酸分子，特别是那些完全或部分基于主题侧翼序列的核酸分子的方法。

更具体地，本发明部分涉及转基因玉米事件DAS-40278-9(又称为pDAS1740-278)、包含这些事件的植物系的用途、和此插入物的DNA序列和/或其边界区的克隆和分析。可以使用本文中公开并提示的序列检测依照本发明使用的植物系。在一些实施方案中，本发明涉及除草剂耐受性玉米系及其鉴定。本发明部分涉及检测主题事件的存在以测定有性杂交的后代是否含有感兴趣的事件。另外，例如，包括用于检测所述事件的方法，并且其有助于例如遵守要求源自重组作物植物的食物的上市前批准和标记的规则。通过任何公知的核酸检测方法诸如聚合酶链式反应(PCR)或使用核酸探针的DNA杂交有可能检测主题事件的存在。例如，Windels等(Med.Fac.Landbouww,Univ.Gent64/5b:459462,1999)讨论了事件特异性PCR测定法。这涉及使用使用跨越插入物和侧翼DNA之间的交接的引物组通过PCR鉴定草甘膦耐受性大豆事件40-3-2。更具体而言，一种引物包含来自插入物的序列，而第二种引物包含来自侧翼DNA的序列。

通过插入编码芳氧基链烷酸酯双加氧酶(AAD-1)蛋白的来自Sphingobium herbicidovorans的aad-1基因修饰玉米。该性状赋予对2,4-二氯苯氧基乙酸和芳氧苯氧基丙酸酯(通常称为“fop”除草剂诸如喹禾灵)除草剂的抗性，并且可以在植物转化期间及育种苗圃中作为选择标志物使用。经由育种进行用来自质粒pDAS1740的DNA片段转化玉米，以生成事件DAS-40278-9。

选择自20个源自事件DAS-40278-9的5个世代且每个世代为4个植物的个别玉米植物提取的基因组DNA样品进行AAD-1玉米事件DAS-40278-9的分子表征。使用AAD-1特异性快速测试条试剂盒测试AAD-1蛋白表达。仅选择在AAD-1蛋白表达方面测试呈阳性的植物，用于随后的分子表征。Southern杂交确认aad-1基因存在于在AAD-1蛋白表达方面测试呈阳性的玉米植物中，并且在与aad-1基因探针杂交时，aad-1基因以这些植物中的单一完整拷贝插入。

本文中还描述了AAD-1玉米事件DAS-40278-9中插入的DNA的分子表征。经由Whiskers转化用质粒pDAS1740的Fsp I片段产生事件。使用Southern印迹分析来建立插入的DNA片段的整合方式并测定事件DAS-40278-9中aad-1基因的插入物/拷贝数目。产生数据以证明插入玉米基因组中的aad-1转基因的整合和完整性。对非编码区(设计为调节编码区)，诸如启动子和终止子、基质附着区RB7Mar v3和RB7Mar v4的整合的表征，及世代间转基因插入物的稳定性进行评估。在5个不同植物世代间证明插入DNA的稳定性。此外，通过探针证明包含氨苄青霉素抗性基因(Ap^r)区的转化质粒主链序列的缺乏，所述探针几乎涵盖在质粒pDAS1740的限制性片段(Fsp I)侧翼的整个主链区。基于事件DAS-40278-9的这些Southern印迹分析绘出插入的详细物理图谱。

在玉米组织中测定AAD-1蛋白水平。另外，对玉米草料和谷粒实施组成分析以调查同基因非转化玉米系和转基因玉米系DAS-40278-9(未喷雾的、用2,4-D喷雾的、用喹禾灵喷雾的、及用2,4-D和喹禾灵喷雾的)之间的等同性。还与DAS-40278-9玉米比较同基因非转化玉米系的农艺学特征。

在同一年在爱荷华州(Iowa)、伊利诺斯州(Illinois)(2个位置)、印地安那州(Indiana)、内布拉斯加州(Nebraska)和加拿大安大略省的六个位置进行非转基因对照和含有芳氧基链烷酸酯双加氧酶-1(AAD-1)的杂种玉米系的田间表达、营养物组成、和农艺学性状。本文中汇总了叶、花粉、根、草料、全植物、和谷粒中的AAD-1蛋白表达水平、农艺学测定结果、和对来自对照和DAS-40278-9AAD-1玉米的草料和谷粒样品的成分分析。

在玉米叶、花粉、根、草料、全植物、和谷粒中使用定量酶联免疫吸附测定法(ELISA)方法测量可溶性可提取AAD-1蛋白。在根和花粉组织中观察到良好的平均表达数值，如本文中更为详细讨论的。表达数值对于所有喷雾的处理及对于以2,4-D和喹禾灵除草剂喷雾的和未喷雾的样地是相似的。

进行组成分析，包括近端、矿物、氨基酸、脂肪酸、维生素、抗营养物、和次生代谢物以调查DAS-40278-9AAD-1玉米(具有或没有除草剂处理)与对照的等同性。基于对照系和/或常规玉米，即对自对照和DAS-40278-9AAD-1玉米样品收集的农艺学数据的分析，DAS-40278-9AAD-1组成样品的结果是一样好的，或者是更好的(在生物学和农艺学上)。

如上文在背景部分中提到的，将转基因导入和整合入植物基因组中牵涉一些随机事件(因此名称“事件”代表表达的给定插入物)。也就是说，凭借许多转化技术诸如土壤杆菌转化、“基因枪”、和WHISKERS，不可预测在基因组中何处会插入转基因。如此，鉴定插入物两侧的侧翼植物基因组DNA对于鉴定具有给定插入事件的植物可以是重要的。例如，可以设计PCR引物，其在插入物和宿主基因组的交接区间生成PCR扩增子。此PCR扩增子可以用于鉴定独特或不同类型的插入物事件。

由于“事件”最初是随机事件，作为本公开内容的一部分，包含事件的玉米系的至少2500个种子已经保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC),10801University Boulevard,Manassas,VA,20110，并且公众在没有限制的情况下(但是服从专利权)可获得。保藏物已经由ATCC称为ATCC保藏号PTA-10244(黄色马齿形玉米杂种种子(玉蜀黍):DAS-40278-9；以Dow AgroSciences LLC名义保藏；ATTC的种子/菌株的收到日期：2009年7月10日；2009年8月17日确认存活力)。为了专利手续的目的，生成此保藏物，并且会依照布达佩斯条约关于种子保藏物的条款并在该条款下维持。保藏物会在不受限制的情况下在ATCC保藏中心(其是一所公共保藏中心)维持一段30年的时间或者最近一次请求后维持五年或持续本专利的有效使用期(取较长者)，并且如果其在该期间变成无存活力，则会替换。

保藏的种子是本发明的一部分。明显地，可以自这些种子种植玉米植物，并且此类植物是本发明的一部分。本发明还涉及这些玉米植物中含有的DNA序列，其可用于检测这些植物及其后代。本发明的检测方法和试剂盒可以涉及根据测试的最终目的，鉴定这些中的任一种、两种、或甚至所有三种事件。

在本文中提供了定义和例子来帮助描述本发明，并且指导本领域普通技术人员实施本发明。除非另有记录，术语应当依照相关领域普通技术人员的常规用法理解。使用DNA碱基的命名，如于37CFR§1.822列出的。

如本文中所使用的，术语“后代”意指包含AAD-1玉米事件DAS-40278-9.的亲本植物的任何世代的后代。

转基因“事件”如下产生，即用异源DNA，即包含感兴趣转基因的核酸构建体转化植物细胞、源自转基因插入植物基因组的植物群体的再生、并选择以插入特定的基因组位置中为特征的特定植物。术语“事件”指包含异源DNA的初始转化体和转化体的后代。术语“事件”也指通过转化体和包含基因组/转基因DNA的另一品种间的有性异型杂交产生的后代。即使在对回归亲本进行重复回交后，来自所转化亲本的插入的转基因DNA和侧翼基因组DNA(基因组/转基因DNA)在杂交后代中也存在于相同的染色体位置。术语“事件”也指来自初始转化体及其后代的DNA，该DNA包含插入的DNA和紧邻插入DNA的侧翼基因组序列，由于包含所插入DNA的一个亲本系(例如初始转化体和源自自交的后代)和不含所插入DNA的亲本系的有性杂交，可以预期该DNA会转移到接受包含感兴趣转基因在内的插入DNA的后代中。

“交接序列”跨越插入基因组中的DNA与在插入点侧翼的玉米天然基因组的DNA连接的点，在植物遗传物质中鉴定或检测出一个或另一个交接序列便足以诊断该事件。包括跨越本文中所描述的大豆事件中的插入物和类似长度的侧翼DNA的DNA序列。本文中提供了此类诊断序列的具体例子；然而，与各插入物的交接，或插入物与基因组序列的交接重叠的其它序列也是诊断性的，并且可以依照本发明使用。

本公开内容包括此类侧翼、交接、和插入物序列的鉴定。包括相关的PCR引物和扩增子。依照本发明，可以使用PCR分析方法来检测或鉴定源自主题专有转基因玉米系的商业化转基因玉米品种或系，所述PCR分析方法使用跨越整个插入DNA及其边界的扩增子进行。

本文中以SEQ ID NO:29提供这些中每个插入物的整个序列及相应侧翼序列的部分。下文印出就SEQ ID NO:29(总共8557个碱基对)而言此事件的插入物和侧翼序列的坐标。这在例如实施例3.8中更为详细讨论。本发明的种植前实施方案包括使用由SEQ ID NO:29的残基1874-6689编码的AAD-1蛋白。

在图1和2中进一步显示了此插入事件及其别的组件。这些序列(特别是侧翼序列)是独特的。基于这些插入物和边界序列，产生事件特异性引物。PCR分析表明可以通过分析用这些事件特异性引物组生成的PCR扩增子在不同玉米基因型中鉴定这些大豆系。如此，可以使用这些和其它相关规程来独特地鉴定这些玉米系。本文中所鉴定的序列是独特的。例如，针对GENBANK数据库的BLAST搜索没有揭示克隆边界序列和数据库中的序列之间的任何显著同源性。

检测技术特别可用于与植物育种联合，从而在为了在后代中赋予一种或多种额外的感兴趣性状将包含感兴趣事件的亲本植物与另一植物系杂交后，测定哪些后代植物包含给定的事件。这些PCR分析方法使玉米育种程序及质量控制(尤其对于商业化的转基因玉米种子)受益。现在也生成并使用用于这些转基因玉米系的PCR检测试剂盒。这也可以使产品注册和产物管理受益。这也可以使产品注册和产品管理受益。

此外，可以使用侧翼大豆/基因组序列来特异性鉴定每个插入物的基因组位置。可以使用此信息来生成每个事件特异性的分子标志物系统。这些可以用于加速的育种策略及建立连锁数据。

此外，可以使用侧翼序列信息来研究并表征转基因整合过程、基因组整合位点特征、事件分选、转基因及其侧翼序列的稳定性、和基因表达(尤其是涉及基因沉默、转基因甲基化模式、位置效应和潜在的表达相关元件诸如MARS[基质附着区]等)。

本公开内容包括以ATCC保藏号PTA-10244可获得的种子。本发明还包括自以登录号PTA-10244保藏于ATCC的种子种植的除草剂抗性玉米植物的用途。本发明进一步包括所述植物的一部分，诸如叶、组织样品、由所述植物生成的种子、花粉等的用途。

此外，本发明包括自保藏的种子种植的植物，优选地除草剂抗性玉米植物的子代和/或后代植物的用途，其中所述植物具有包括可检测野生型基因组DNA/插入物DNA交接序列的基因组，如本文中所描述的。如本文中所使用的，术语“玉米”意指玉蜀黍，并且包括可以用玉米植物育种的其所有品种。

本发明可以进一步包括使用本发明的植物作为至少一个亲本进行杂交的方法。例如，本发明包括具有本文中例示的任何植物作为一个或两个亲本的F₁杂种植物的用途。通过本发明的此类F₁杂种生成的种子的用途也在本发明内。本发明包括一种用于生产F₁杂种种子的方法，其通过将例示的植物与不同(例如，近交亲本)植物杂交，并收获所得的杂种种子来进行。本发明包括作为母本或父本的例示性植物。可以通过仔细考虑亲本植物来改善所得植物的特征。

可以如下育种除草剂耐受性玉米植物，即首先将由自本文中提及的任一种系的种子种植的玉米植物组成的第一亲本玉米植物与第二亲本玉米植物有性杂交，由此生成多个第一后代植物，然后选出对除草剂有抗性(或拥有本发明的至少一个事件)的第一后代植物；并自交第一后代植物，由此生成多个第二后代植物；然后自第二后代植物选出对除草剂有抗性(或拥有本发明的至少一个事件)的植物。这些步骤可以进一步包括第一后代植物或第二后代植物与第二亲本玉米植物或第三亲本玉米植物的回交。然后，可以种植包含本发明的玉米种子的玉米作物或其后代。

还应当理解，也可以将两种不同转基因植物杂交以生成含有两个独立分离的添加的外源基因的后代。合适后代的自交可以生成在这两种添加的外源基因方面纯合的植物。也涵盖与亲本植物回交和与非转基因植物的异型杂交，无性繁殖亦然。通常用于不同性状和作物的其它育种方法是本领域中已知的。已经使用回交育种来将简单遗传的、高度可遗传性状的基因转移入期望的纯合栽培种或近交系(其作为回归亲本)中。要转移的性状的来源称作供体亲本。预期所得的植物具有回归亲本(例如栽培种)的属性和自供体亲本转移的期望的性状。在初始杂交后，将拥有供体亲本表型的个体选出并与回归亲本重复杂交(回交)。预期所得的亲本具有回归亲本(例如栽培种)的属性和自供体亲本转移的期望的性状。

本文中公开的DNA分子可以在标志物辅助育种(MAB)方法中作为分子标志物使用。本发明的DNA分子可以在鉴定遗传连锁的农艺学有用的性状的方法(诸如AFLP标志物、RFLP标志物、RAPD标志物、SNP、和SSR)中使用，如本领域中已知的。可以使用MAB方法在与本发明玉米植物(或其后代及任何其它玉米栽培种或品种)的杂交后代中追踪除草剂抗性性状。DNA分子是此性状的标志物，并且可以使用本领域中公知的MAB方法来在玉米植物中追踪除草剂抗性性状，其中本发明的至少一种玉米系或其后代是亲本或祖先。可以使用本发明的方法来鉴定具有主题事件的任何玉米品种。

本发明的方法包括一种生成除草剂耐受性玉米植物的方法，其中所述方法包括育种与本发明一起使用的植物。更具体地，所述方法可以包括杂交本发明的两种植物，或本发明的一种植物和任何其它植物。优选的方法进一步包括通过对所述后代分析依照本发明可检出的事件来选择所述杂交的后代。例如，本发明可以包括可以经由与包含其它期望的性状，诸如农艺学性状诸如那些在本文中在多个实施例中测试的性状的植物的育种循环使用本发明来追踪主题事件。例如，可以将包含主题事件和期望性状的植物检出，鉴定，选出，并在进一步的育种轮次中快速使用。也可以经由育种来组合主题事件/性状，并用昆虫抗性性状和/或用别的除草剂耐受性性状依照本发明追踪。后一种的一个优选实施方案是包含与编码对除草剂麦草畏的抗性的基因组合的主题事件的植物。

另外，单独的或与一种或多种别的HTC性状叠加的AAD-1可以与一种或多种其它输入(例如，昆虫抗性、真菌抗性、或应激耐受性等)或输出(例如，增加的产量、改善的油概况(profile)、改善的纤维质量等)性状叠加。如此，可以使用本发明来提供具有灵活地且成本有效地控制许多农艺学有害生物的能力的改善的作物质量的完整农艺学包装。

经由同源重组在植物细胞的特定染色体位点内整合多核苷酸序列的方法在本领域内已经进行过描述。例如，如记载于美国专利申请公开文本No.2009/0111188A1的位点特异性整合描述了使用重组酶或整合酶来介导供体多核苷酸序列对染色体靶物的导入。另外，国际专利申请No.WO2008/021207描述了锌指介导的同源重组以在基因组的特定位置内整合一个或多个供体多核苷酸序列。可以利用重组酶诸如如记载于美国专利No.6,720,475的FLP/FRT或如记载于美国专利No.5,658,772的CRE/LOX的用途来将多核苷酸序列整合入特定的染色体位点中。最后，大范围核酸酶用于将供体多核苷酸靶向入特定染色体位置中的用途记载于Puchta等,PNAS USA93(1996)第5055页-第5060页)。

用于在植物细胞内的位点特异性整合的其它各种方法一般是已知的且可适用的(Kumar等,Trends in Plant Sci.6(4)(2001)第155页-第159页)。此外，已经在几种原核和低等真核生物体中鉴定的位点特异性重组系统可以适用于在植物中使用。此类系统的例子包括但不限于：来自酵母鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)的pSR1质粒的R/RS重组酶系统(Araki等(1985)J.Mol.Biol.182:191-203)、和噬菌体Mu的Gin/gix系统(Maeser和Kahlmann(1991)Mol.Gen.Genet.230:170-176)。

在本发明的一些实施方案中，可以期望在现有的转基因事件附近整合或叠加新的转基因。可以认为转基因事件是优选的基因组基因座，其基于独特的特征诸如单一插入位点、正常的孟德尔分离和稳定的表达、及卓越的功效组合，包括在多个环境位置中及在多个环境位置间的除草剂耐受性和农艺学性能来选择。新整合的转基因应当维持现有转化体的转基因表达特征。此外，会克服用于检测并确认新整合事件的测定法的开发，因为已经鉴定出新整合事件的基因组侧翼序列和染色体位置。最后，新转基因对与现有转基因连锁的特定染色体位置的整合会通过使用常规育种方法的有性异性杂交来加速转基因对其它遗传背景的基因渗入。

在一些实施方案中，可以期望自转基因事件切除多核苷酸序列。例如，如记载于美国临时专利申请61/297,628的转基因切除描述了使用锌指核酸酶自染色体整合的转基因事件除去由基因表达盒组成的多核苷酸序列。除去的多核苷酸序列可以是选择标志物。在切除并除去多核苷酸序列后，可以通过插入多核苷酸序列来再靶向经修饰的转基因事件。切除多核苷酸序列，随后再靶向经修饰的转基因事件，这提供了如下的优点，诸如选择标志物的再使用或克服对源自特定基因表达的植物转录物组(transcriptome)的非故意改变的能力。

本文公开了玉米基因组中的染色体2上对于插入异源核酸卓越的特定位点。还公开了5’分子标志物、3’分子标志物、5’侧翼序列和3’侧翼序列，其可用于鉴定染色体2上靶定位点的位置。如此，本公开内容提供了将感兴趣的异源核酸导入此预先建立的靶位点中或在此靶位点附近导入的方法。本发明还涵盖包含在公开的靶位点处或大体在此类位点附近插入的任何异源核苷酸序列的玉米种子和/或玉米植物的用途。一个实现此类靶向性整合的选项是替换本文中例示的pat表达盒切除和/或替代不同插入物。在此一般方面，可以依照本发明使用(例如但不限于)靶向性同源重组。

如本文中所使用的，基因、事件或性状“叠加”指将期望的性状组成入一个转基因系中。植物育种人员通过在各自具有期望的性状的亲本间进行杂交，然后鉴定具有这两个期望性状的后代来叠加转基因性状。另一种叠加基因的方式是通过在转化期间同时将两个或更多个基因转移入植物的细胞核中。另一种叠加基因的方式是通过用另一种感兴趣基因再转化转基因植物。例如，可以使用基因叠加来组合两种或更多种不同性状，包括例如，两种或更多种不同昆虫性状、昆虫抗性性状和疾病抗性性状、两种或更多种除草剂抗性性状、和/或昆虫抗性性状和除草剂抗性性状。在感兴趣的基因外使用选择标志物也可以认为是基因叠加。

“同源重组”指在具有含有相似核苷酸序列的相应位点的任何核苷酸序列对间进行且两个核苷酸序列可以相互作用(重组)以形成新的重组DNA序列的反应。相似核苷酸序列的位点在本文中各自称为“同源性序列”。一般地，同源重组的频率随同源性序列长度增加而升高。如此，虽然可以在不相同的两个核苷酸序列间发生同源重组，重组频率(或效率)随两个序列间的趋异升高而下降。可以使用各在供体和靶分子上的一个同源性序列来实现重组，由此生成“单交换”重组产物。或者，可以各在靶物和供体核苷酸序列上放置两个同源性序列。供体上的两个同源性序列与靶物上的两个同源性序列间的重组生成“双交换”重组产物。若供体分子上的同源性序列在要操作的序列(例如，感兴趣的序列)侧翼，则与靶分子的双交换重组会生成如下的重组产物，其中感兴趣的序列替换最初在靶分子上的同源性序列间的DNA序列。经由双交换重组事件在靶物和供体间的DNA序列的交换称作“序列置换”。

主题事件AAD-1酶实现转基因表达，导致对会控制几乎所有阔叶和禾本科杂草的除草剂组合的耐受性。例如，AAD-1可以充当卓越的除草剂耐受性作物(HTC)性状以与其它HTC性状(例如草甘膦抗性、草丁磷抗性、咪唑啉酮抗性、溴草腈抗性等)、和昆虫抗性性状(Cry1F,Cry1Ab,Cry34/45，等等))叠加。另外，AAD-1可以充当选择标志物来帮助选择用第二基因或基因的组遗传工程化改造的植物的初级转化体。

可以在与其它HTC性状(包括但不限于草甘膦耐受性)的新颖组合中使用本发明的HTC性状。这些性状组合产生控制杂草(等)物种的新方法，这是由于新需要的对除草剂(例如草甘膦)的抗性或固有耐受性。如此，在HTC性状外，使用除草剂控制杂草的新颖方法在本发明的范围内，对此通过转基因作物中的所述酶产生除草剂耐受性。

另外，全世界种植的草甘膦耐受性作物是普遍的。与其它草甘膦耐受性植物轮种多次，草甘膦抗性自生植物的控制在轮种作物中可以是困难的。如此，个别叠加或转化入作物中的主题转基因性状的使用提供一种用于控制其它HTC自生植物作物的工具。

与本发明一起使用的优选的植物或种子包含在其基因组中的插入序列(如本文中鉴定的)以及在插入物两侧的至少20-500或更多个连续侧翼核苷酸(如本文中鉴定的)。除非另有指示，提及侧翼序列指那些就SEQ ID NO:29(见上表)而言鉴定的。此外，SEQ ID NO:29包括初始转化体中插入的异源DNA和刚好与插入DNA相邻的例示性侧翼基因组序列。可以预期所有或部分的这些侧翼序列被转移到由于包含该事件的亲本系的有性杂交而接受插入DNA的后代。

本发明包括本发明植物的可再生细胞的组织培养物的用途。也包括从该组织培养物再生的植物的用途，特别是在所述植物能够表达所例示的品种的所有形态学和生理学特征的情况中。与本发明一起使用的优选植物可以具有自保藏种子种植的植物的所有生理学和形态学特征。本发明进一步包含此类种子的后代和拥有感兴趣的质量性状的种子的用途。

对植物或种子或其部分的操作(诸如突变、进一步转染、和进一步育种)可以导致可称作“基本上衍生的”品种的事物的创建。植物新品种保护国际联盟(The International Union for the Protection of New Varieties of Plants(UPOV))已经提供了下列用于测定某个品种是否基本上源自受保护品种的准则：

[A]在如下情况时，应当认为品系基本上源自另一品种(“初始品种”)：

(i)它主要源自初始品种，或者源自自身主要源自初始品种，同时保留源自初始品种的基因型或基因型组合的必要特征的表达的品种；

(ii)它与初始品种明显可区别；并且

(iii)除了源自衍生行为的差异外，它在源自初始品种的基因型或基因型组合的必要特征表达上与初始品种一致。

UPOV国际组织第六次会议(Sixth Meeting with InternationalOrganizations),1992年10月30日；文件由联盟办公室准备。

如本文中所使用的，“系”指一组在至少一种性状上在个体间展现出很少或没有遗传变异的植物。所述系可以通过几个世代的自花传粉和选择、或者使用组织或细胞培养技术自单一亲本进行营养繁殖来产生。

如本文中所使用的，术语“栽培种”和“品种”是同义的，指用于商业生产的系。

“稳定性”或“稳定的”就给定的组分而言意指组分在世代间且优选地至少三个世代以基本上相同的水平(例如优选地±15%，更优选地±10%，最优选地±5%)得到维持。稳定性可以受到温度、位置、应激和种植时间影响。在田间条件下比较随后的世代应当以相似的方式生成组分。

“商业效用”定义为具有良好的植物活力和高能育性，使得农民可以使用常规的耕作设备生产作物，并且可以使用常规的破碎和提取设备自种子提取具有所描述组分的油。为了在商业上有用，产率(如通过每英亩生产的种子重量、油含量、和总油测量的)在相同地区种植的没有优质价值性状的其它方面相当的商业芸苔(canola)品种的平均产率的15%内。

“农艺学良种”意指在由主题事件所致的昆虫抗性外，品系具有期望的农艺学特征，诸如产率、成熟度、疾病抗性等。在包含本发明的事件的植物中个别或以任意组合采用的农艺学性状(如下文实施例中所列的)在本发明的范围内。可以使用任何和所有这些农艺学特征和数据点来作为用于限定此类植物的一系列特征的点或在该一系列特征的任一末端或两个末端鉴定此类植物。

如本领域技术人员根据本公开内容会认可，检测试剂盒的优选实施方案例如可以包含涉及和/或包含“交接序列”或“过渡序列”(在那里，玉米基因组侧翼序列与插入序列相遇)的探针和/或引物。例如，这包括为了鉴定一个或两个交接序列(在那里，插入物与侧翼序列相遇)而设计的多核苷酸探针、引物和/或扩增子，如上文表1中所指示的。一种常见的设计是具有在侧翼区中杂交的一种引物，和在插入物中杂交的一种引物。此类引物的长度经常各为约至少约15个残基。凭借此类排列，可以使用引物来生成/扩增可检出的扩增子，其指示本发明的事件的存在。可以使用这些引物来生成跨越(并包含)交接序列的扩增子，如上文所指示的。

在侧翼序列中“降落”(touching down)的引物通常不设计为超出约200个碱基或超出交接杂交。如此，典型的侧翼引物会设计为包含进入侧翼序列中的距离插入物开始200个碱基内的任一条链的至少15个碱基。也就是说，包含SEQ ID NO:29的残基约1674-1873和/或约6690-6890中的合适大小的序列的引物在本发明的范围内。同样地，插入物引物可以在插入物上的任何地方设计，但是例如可以不专门为此类引物设计使用残基约1874-2074和约6489-6689。

本领域技术人员还会认可，引物和探针可以设计为在一系列标准的杂交和/或PCR条件下与SEQ ID NO:29(或其互补物)的区段及其互补物杂交，其中引物或探针与例示的序列不完全互补。也就是说，可以容忍一定程度的错配。对于约20个核苷酸的引物，例如，若错配碱基是内部的或在扩增子相反的引物末端，则通常1或2个左右的核苷酸不需要与相反链结合。下文提供了各种合适的杂交条件。也可以在探针中使用合成的核苷酸类似物诸如肌苷。也可以使用肽核酸(PNA)探针及DNA和RNA探针。重要的是此类探针和引物诊断(能够独特地鉴定并区别)本发明事件的存在。

应当注意到，可以发生PCR扩增的错误，这例如可以导致微小的测序错误。也就是说，除非另有指示，如下测定本文中所列的序列，即自玉米基因组DNA生成长的扩增子，然后克隆并测序扩增子。鉴于对于自基因组DNA生成对于测序足够的扩增子必要的多个轮次的扩增，寻找以此方式生成并测定的序列上的略微差异和次要差别不是罕见的。本领域技术人员应当认可并且注意到由于这些类型的常见测序错误或差别而需要的任何调节在本发明的范围内。

还应当注意，例如，在事件的创建期间插入序列时要删除一些基因组序列不是罕见的。如此，例如一些差异也可以出现在主题侧翼序列与GENBANK中所列的基因组序列间。下文在实施例部分中讨论了这些中的一些差异。可以相应地做出对探针和引物的调节。

每种“插入物”的构件在图1和2中显示，并且在下文在实施例中更为详细地讨论。这些构件的DNA多核苷酸序列或其片段可以作为DNA引物或探针在本发明的方法中使用。

在一些实施方案中，提供了用于在来自玉米植物的植物和种子等中检测转基因/基因组插入区的存在的组合物和方法。提供了如下的DNA序列，其包含本文中提供的主题转基因/基因组插入区交接序列(SEQ ID NO:29的残基1873-1874和残基6689-6690之间)、其区段、和例示序列的互补物及其任何区段。插入区交接序列跨越插入基因组中的异源DNA与在插入位点侧翼的来自玉米细胞的DNA之间的交接。此类序列可以诊断给定的事件。

基于这些插入物和边界序列，可以生成事件特异性引物。PCR分析表明，可以通过分析用这些事件特异性引物组生成的PCR扩增子来在不同玉米基因型中鉴定本发明的玉米系。可以使用这些和其它相关的规程来独特地鉴定这些玉米系。如此，源自此类引物组的PCR扩增子是独特的，并且可以用于鉴定这些玉米系。

在一些实施方案中，包含新的转基因/基因组插入区域的连续片段的DNA序列是本发明的一方面。包括包含足够长度的转基因插入序列多核苷酸和足够长度的来自一种或多种上述玉米植物的玉米基因组序列的多核苷酸的DNA序列，和/或用作生成对于一种或多种这些玉米植物诊断性的扩增子产物的引物序列的序列。

相关实施方案属于如下的DNA序列，其包含本文中鉴定的DNA序列(诸如SEQ ID NO:29及其区段)的转基因部分的至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25或更多个连续核苷酸或其互补物，和相似长度的来自这些序列的侧翼玉米DNA序列或其互补物。此类序列可用作DNA扩增方法中的DNA引物。使用这些引物生成的扩增子诊断本文中提及的任何玉米事件。因此，本发明还包括通过此类DNA引物和同源引物生成的扩增子。

本发明还包括检测样品中对应于本文中提及的玉米事件的DNA的存在的方法。此类方法可以包括：(a)使包含DNA的样品与引物组接触，所述引物组在与来自至少一个这些玉米事件的DNA的核酸扩增反应中使用时生成诊断所述事件的扩增子；(b)实施核酸扩增反应，由此生成扩增子；并(c)检测扩增子。

其它检测方法可以包括一种检测样品中对应于至少一个所述事件的DNA的存在的方法，其中所述方法包括：(a)使包含DNA的样品与探针接触，所述探针在严格杂交条件下与来自至少一个所述玉米事件的DNA杂交，并且其在严格杂交条件下不与对照玉米植物(非感兴趣事件DNA)杂交；(b)将样品和探针受到严格杂交条件处理；并(c)检测探针与DNA的杂交。

一些实施方案包括生成包含本发明的aad-1事件的玉米植物的方法，其中所述方法包括下列步骤：(a)将第一亲本玉米系(包含本发明的表达盒，其对所述系的植物赋予所述除草剂抗性性状)和第二亲本玉米系(其缺乏此除草剂耐受性性状)有性杂交，由此生成多个后代植物；并(b)通过使用分子标志物来选择后代植物。任选地，此类方法可以包括将后代植物与第二亲本玉米系回交以生成包含所述昆虫耐受性性状的真实育种玉米植物的进一步的步骤。

依照本发明的另一方面，提供了测定与所述三种事件之任一种(或多种)杂交的后代的接合性的方法。所述方法可以包括使样品(包含玉米DNA)与本发明的引物组接触。所述引物在与来自至少一个所述玉米事件的基因组DNA的核酸扩增反应中使用时生成诊断至少一个所述玉米事件的第一扩增子。此类方法进一步包括实施核酸扩增反应，由此生成第一扩增子；检测第一扩增子；并使包含玉米DNA的样品与所述引物组(所述引物组在与来自玉米植物的基因组DNA的核酸扩增反应中使用时生成第二扩增子，其包含与玉米基因组区同源的天然玉米基因组DNA)接触；并实施核酸扩增反应，由此生成第二扩增子。该方法进一步包括检测第二扩增子，并比较样品中的第一和第二扩增子，其中这两种扩增子的存在指示样品在转基因插入物方面是杂合的。

可以使用本文中公开的组合物和本领域中公知的DNA检测方法来开发DNA检测试剂盒。试剂盒可用于鉴定样品中的主题玉米事件DNA，并且可以应用于育种含有此DNA的玉米植物的方法。试剂盒含有与例如本文中公开的扩增子或与主题事件的转基因遗传元件中含有的DNA同源或互补的DNA序列同源或互补的DNA序列。这些DNA序列可以在DNA扩增反应中使用或者作为探针在DNA杂交方法中使用。试剂盒还可以含有实施检测方法必需的试剂和材料。

“探针”是一种分离的核酸分子，其附接有常规的可检测标记物或报告物分子(诸如放射性同位素、配体、化学发光剂、或酶)。此类探针与靶核酸的链，在本发明的情况中，与来自所述玉米事件之一的基因组DNA的链(无论来自玉米植物还是来自包含来自所述事件的DNA的样品)互补。依照本发明的探针不仅包含脱氧核糖核酸或核糖核酸，而且还包含聚酰胺和其它探针材料，其特异性结合靶DNA序列，并且可以用于检测所述靶DNA序列的存在。

“引物”是通过核酸杂交与互补靶DNA链退火以形成引物与靶DNA链间的杂合物，然后通过聚合酶，例如DNA聚合酶沿着靶DNA链延伸的分离的/合成的核酸。本发明的引物对指其用于扩增靶核酸序列的用途，例如通过聚合酶链式反应(PCR)或其它常规的核酸扩增方法来实现。

一般地，探针和引物的长度为5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106,107,108,109,110,111,112,113,114,115,116,117,118,119,120,121,122,123,124,125,126,127,128,129,130,131,132,133,134,135,136,137,138,139,140,141,142,143,144,145,146,147,148,149,150,151,152,153,154,155,156,157,158,159,160,161,162,163,164,165,166,167,168,169,170,171,172,173,174,175,176,177,178,179,180,181,182,183,184,185,186,187,188,189,190,191,192,193,194,195,196,197,198,199,200,201,202,203,204,205,206,207,208,209,210,211,212,213,214,215,216,217,218,219,220,221,222,223,224,225,226,227,228,229,230,231,232,233,234,235,236,237,238,239,240,241,242,243,244,245,246,247,248,249,250,251,252,253,254,255,256,257,258,259,260,261,262,263,264,265,266,267,268,269,270,271,272,273,274,275,276,277,278,279,280,281,282,283,284,285,286,287,288,289,290,291,292,293,294,295,296,297,298,299,300,301,302,303,304,305,306,307,308,309,310,311,312,313,314,315,316,317,318,319,320,321,322,323,324,325,326,327,328,329,330,331,332,333,334,335,336,337,338,339,340,341,342,343,344,345,346,347,348,349,350,351,352,353,354,355,356,357,358,359,360,361,362,363,364,365,366,367,368,369,370,371,372,373,374,375,376,377,378,379,380,381,382,383,384,385,386,387,388,389,390,391,392,393,394,395,396,397,398,399,400,401,402,403,404,405,406,407,408,409,410,411,412,413,414,415,416,417,418,419,420,421,422,423,424,425,426,427,428,429,430,431,432,433,434,435,436,437,438,439,440,441,442,443,444,445,446,447,448,449,450,451,452,453,454,455,456,457,458,459,460,461,462,463,464,465,466,467,468,469,470,471,472,473,474,475,476,477,478,479,480,481,482,483,484,485,486,487,488,489,490,491,492,493,494,495,496,497,498,499,或500个多核苷酸或更多。此类探针和引物在高严格性杂交条件下与靶序列特异性杂交。优选地，依照本发明的探针和引物与靶序列具有完全的序列相似性，尽管可以通过常规方法设计与靶序列不同，且保留与靶序列杂交的能力的探针。

用于制备和使用探针和引物的方法记载于例如，Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第2版,第1卷-第3卷,Sambrook等编,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989。PCR引物对可以源自已知的序列，例如，通过使用意图出于所述目的的计算机程序来进行。

可以使用基于本文中所公开的侧翼DNA和插入序列的引物和探针来确认(且若必要的话，校正)公开的序列，其通过常规的方法，例如通过对此类序列再克隆和测序来进行。

本发明的核酸探针和引物在严格条件下与靶DNA序列杂交。可以使用任何常规的核酸杂交或扩增方法来鉴定样品中来自转基因事件的DNA的存在。核酸分子或其片段能够在某些情况下与其它核酸分子特异性杂交。如本文中所使用的，若两个分子能够形成反平行的、双链核酸结构，则所述两个核酸分子被说成能够彼此特异性杂交。一个核酸分子被说成是另一个核酸分子的“互补物”，若它们展现出完全的互补性。如本文中所使用的，在分子之一的每个核苷酸与另一个的核苷酸互补时，分子被说成展现出“完全的互补性”。若两个分子能以足以容许它们至少在常规的“低严格性”条件下保持彼此退火的稳定性彼此杂交，则它们被说成是“最小程度互补的”。类似地，若分子能以足以容许它们在常规的“高严格性”条件下保持彼此退火的稳定性彼此杂交，则它们被说成是“互补的”。常规的严格性条件由Sambrook等,1989描述。因此，偏离完全的互补性是可允许的，只要此类偏离不完全排除分子形成双链结构的性能。为了使核酸分子充当引物或探针，它仅需要在序列上足够互补，使得在所采用的特定溶剂和盐浓度下能够形成稳定的双链结构。

如本文中所使用的，基本上同源的序列是如下的核酸序列，其会在高严格性条件下与同其比较的核酸序列的互补物特异性杂交。术语“严格条件”就通过Sambrook等,1989,于9.52-9.55讨论的特定杂交规程实现的核酸探针与靶核酸(即，与感兴趣的特定核酸序列)杂交而言进行功能限定。还可见Sambrook等,1989，于9.47-9.52和9.56-9.58。因而，可以使用本发明的核苷酸序列来实现其与DNA片段的互补区段选择性形成双链体分子的能力。

根据想象的应用，可以使用不同杂交条件来实现探针对靶序列的不同程度的选择性。对于需要高灵敏性的应用，通常会采用相对严格的条件来形成杂合物，例如，会选择相对较低的盐和/或高温的条件，诸如通过约0.02M至约0.15M NaCl于约50℃至约70℃的温度提供。例如，严格条件可以牵涉用高严格性清洗缓冲液(0.2X SSC,0.1%SDS,65℃)将杂交滤膜清洗至少两次。促进DNA杂交的适当严格性条件，例如，6.0倍氯化钠/柠檬酸钠(SSC)于约45℃，接着于50℃用2.0倍SSC清洗是本领域技术人员已知的，6.3.1-6.3.6。例如，可以自约2.0倍SSC于50℃的低严格性至约0.2倍SSC于50℃的高严格性选择清洗步骤中的盐浓度。另外，清洗步骤中的温度可以自室温(约22℃)的低严格性条件提高至约65℃的高严格性条件。温度和盐两者可以有所变化，或者温度或盐浓度可以保持恒定，而另一个变量是变化的。此类选择性条件容许(tolerate)很少的(若有的话)探针与模板或靶链间的错配。经由杂交检测DNA序列是本领域普通技术人员公知的，并且美国专利Nos.4,965,188和5,176,995的教导是杂交分析方法例示性的。

在一些实施方案中，与本发明一起使用的核酸会在高严格性条件下与本文中例示或提示的一种或多种引物(或扩增子或其它序列)，包括其互补物和片段特异性杂交。在一方面，本发明的标志物核酸分子具有SEQ ID NOS:3-14中列出的核酸序列或其互补物和/或片段。

在另一方面，本发明的标志物核酸分子与此类核酸序列共享80%-100%或90%-100%序列同一性。在本发明的又一方面，与本发明一起使用的标志物核酸分子与此类序列共享95%-100%序列同一性。可以在植物育种方法中使用此类序列作为标志物以鉴定遗传杂交的后代。可以通过本领域技术人员已知的许多方法来检测探针与靶DNA分子的杂交，这些可以包括但不限于荧光标签、放射性标签、基于抗体的标签、和化学发光标签。

关于使用特定扩增引物对来扩增靶核酸序列(例如通过PCR进行)，“严格条件”指容许引物对仅与如下的靶核酸序列杂交，并且优选地生成独特的扩增产物扩增子的条件，所述靶核酸序列会与具有相应的野生型序列(或其互补物)的引物结合。

术语“(靶序列)特异性”指示探针或引物在严格杂交条件下仅与包含靶序列的样品中的靶序列杂交。

如本文中所使用的，“扩增DNA”或“扩增子”指作为核酸模板一部分的靶核酸序列的核酸扩增产物。例如，为了测定源自有性杂交的玉米植物是否含有来自本发明玉米植物的转基因事件基因组DNA，可以使用引物对将自玉米植物组织样品提取的DNA进行核酸扩增方法以生成诊断事件DNA存在的扩增子，所述引物对包括源自植物基因组中在插入异源DNA的插入位点附近的侧翼序列的引物，和源自插入异源DNA的第二引物。扩增子具有一定的长度，并且具有也是事件诊断性的序列。扩增子的长度范围可以为引物对加一个核苷酸碱基对的组合长度和/或引物对加约2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106,107,108,109,110,111,112,113,114,115,116,117,118,119,120,121,122,123,124,125,126,127,128,129,130,131,132,133,134,135,136,137,138,139,140,141,142,143,144,145,146,147,148,149,150,151,152,153,154,155,156,157,158,159,160,161,162,163,164,165,166,167,168,169,170,171,172,173,174,175,176,177,178,179,180,181,182,183,184,185,186,187,188,189,190,191,192,193,194,195,196,197,198,199,200,201,202,203,204,205,206,207,208,209,210,211,212,213,214,215,216,217,218,219,220,221,222,223,224,225,226,227,228,229,230,231,232,233,234,235,236,237,238,239,240,241,242,243,244,245,246,247,248,249,250,251,252,253,254,255,256,257,258,259,260,261,262,263,264,265,266,267,268,269,270,271,272,273,274,275,276,277,278,279,280,281,282,283,284,285,286,287,288,289,290,291,292,293,294,295,296,297,298,299,300,301,302,303,304,305,306,307,308,309,310,311,312,313,314,315,316,317,318,319,320,321,322,323,324,325,326,327,328,329,330,331,332,333,334,335,336,337,338,339,340,341,342,343,344,345,346,347,348,349,350,351,352,353,354,355,356,357,358,359,360,361,362,363,364,365,366,367,368,369,370,371,372,373,374,375,376,377,378,379,380,381,382,383,384,385,386,387,388,389,390,391,392,393,394,395,396,397,398,399,400,401,402,403,404,405,406,407,408,409,410,411,412,413,414,415,416,417,418,419,420,421,422,423,424,425,426,427,428,429,430,431,432,433,434,435,436,437,438,439,440,441,442,443,444,445,446,447,448,449,450,451,452,453,454,455,456,457,458,459,460,461,462,463,464,465,466,467,468,469,470,471,472,473,474,475,476,477,478,479,480,481,482,483,484,485,486,487,488,489,490,491,492,493,494,495,496,497,498,499,或500,750,1000,1250,1500,1750,2000或更多个核苷酸碱基对(加或减上文所列的任何增量)的组合长度。或者，引物对可以源自插入DNA两侧上的侧翼序列，从而生成包括整个插入物核苷酸序列的扩增子。源自植物基因组序列的引物对成员可以位于离插入DNA序列一段距离。此距离范围可以为一个核苷酸碱基对多至约2万个核苷酸碱基对。术语“扩增子”的使用明确排除可以存在于DNA热扩增反应中的引物二聚体。

可以通过本领域中已知的多种核酸扩增方法，包括聚合酶链式反应(PCR)来实现核酸扩增。多种扩增方法是本领域中已知的，并且记载于美国专利No.4,683,195和美国专利No.4,683,202等。已经开发出PCR扩增方法来扩增出多至22kb的基因组DNA。这些方法及DNA扩增领域中已知的其它方法可以在本发明的实践中使用。可以通过使用源自本文中提供的序列的引物自所述事件扩增此类序列，接着对PCR扩增子或克隆的DNA进行标准的DNA测序来确认(若必要的话，校正)来自主题玉米事件的异源转基因DNA插入物或侧翼基因组序列的序列。

可以通过多种技术来检测通过这些方法生成的扩增子。琼脂糖凝胶电泳和用溴化乙锭染色是一种用于检测DNA扩增子的常见的公知方法。另一种此类方法是遗传比特分析(Genetic Bit Analysis)，其中设计如下的DNA寡核苷酸，其与相邻的侧翼基因组DNA序列和插入的DNA序列两者重叠。将寡核苷酸在多孔板的孔中固定化。在感兴趣区域的PCR后(使用插入序列中的一条引物和相邻侧翼基因组序列中的一条引物)，单链PCR产物可以与固定化的寡核苷酸杂交，并且充当使用DNA聚合酶和对预期的下一个碱基特异性的经标记ddNTP进行的单碱基延伸反应的模板。读出可以是荧光的或基于ELISA的。由于成功的扩增、杂交和单碱基延伸，信号指示插入物/侧翼序列的存在。

另一种方法是焦磷酸测序(pyrosequencing)技术，如由Winge(Innov.Pharma.Tech.00:18-24,2000)所描述的。在此方法中，设计如下的寡核苷酸，其与相邻的基因组DNA和插入物DNA交接重叠。将寡核苷酸与来自感兴趣区域的单链PCR产物(插入序列中的一条引物和侧翼基因组序列中的一条)杂交，并在存在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶、萤光素酶、腺苷三磷酸双磷酸酶、腺苷5’磷硫酸(phosphosulfate)和萤光素的情况中温育。个别添加DNTP，并且掺入导致测量的光信号。由于成功的扩增、杂交和单或多碱基延伸，光信号指示转基因插入物/侧翼序列的存在。

荧光极化是另一种可以用于检测本发明的扩增子的方法。遵循此方法，设计如下的寡核苷酸，其与基因组侧翼和插入DNA连接重叠。将寡核苷酸与来自感兴趣区域的单链PCR产物(插入DNA中的一条引物和侧翼基因组DNA序列中的一条)杂交，并在存在DNA聚合酶和经荧光标记的ddNTP的情况中温育。单碱基延伸导致ddNTP的掺入。可以使用荧光计来以极化变化测量掺入。由于成功的扩增、杂交和单碱基延伸，极化变化指示转基因插入物/侧翼序列的存在。

TAQMAN(PE Applied Biosystems,Foster City,Calif.)是一种检测并量化DNA序列的存在的方法。简言之，设计如下的FRET寡核苷酸探针，其与基因组侧翼和插入物DNA交接重叠。在存在热稳定性聚合酶和dNTP的情况中循环FRET探针和PCR引物(插入DNA序列中的一条引物和侧翼基因组序列中的一条)。在特异性扩增期间，Taq DNA聚合酶清洁并释放荧光模块，使其离开FRET探针上的淬灭模块。由于成功的扩增和杂交，荧光信号指示侧翼/转基因插入物序列的存在。

已经描述了用于序列检测的分子信标(Molecular Beacons)。简言之，设计如下的FRET寡核苷酸探针，其与侧翼基因组和插入物DNA交接重叠。FRET探针的独特结构导致其含有将荧光和淬灭模块保持紧密接近的二级结构。在存在热稳定性聚合酶和dNTP的情况中循环FRET探针和PCR引物(插入物DNA序列中的一条引物和侧翼基因组序列中的一条)。在成功的PCR扩增后，FRET探针与靶序列的杂交导致探针二级结构的除去和荧光和淬灭模块的空间分离。荧光信号得到结果。由于成功的扩增和杂交，荧光信号指示侧翼基因组/转基因插入物序列的存在。

已经公开了玉米基因组中对于插入卓越的位置，本发明还包括大体在此基因组位置附近包含至少一个非aad1插入物的玉米种子和/或玉米植物的用途。一个选项是用不同插入物替换本文中例示的aad1插入物。在一般这些方面，例如可以依照本发明使用靶向性同源重组。此类技术是例如，WO03/080809A2及相应的公布的美国专利(U.S.20030232410)的主题。如此，本发明包括使用如下的植物和植物细胞，其包含侧翼有整个或可识别部分的侧翼序列(例如，SEQ ID NO:29的残基1-1873和6690-8557)的异源插入物(替换或具有多个拷贝的aad1)。也可以以此/这些方式靶向额外一个拷贝(或额外多个拷贝)的例示的插入物以实现插入。

以下是可以依照本发明的一些实施方案使用的植物、种子、多核苷酸、和检测方法的一些项/实施方案：

1.一种包含基因组的转基因玉米植物，所述基因组包含SEQ ID NO:29。

2.一种包含基因组的玉米种子，所述基因组包含以登录号PTA-10244保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的种子中存在的AAD-1事件DAS-40278-9。

3.项2的玉米种子，所述种子包含基因组，所述基因组包含SEQ IDNO:29。

4.通过种植项2的种子生成的玉米植物，所述植物包含SEQ ID NO:29。

5.项4的玉米植物的后代植物，所述后代植物包含AAD-1事件DAS-40278-9。

6.项1的玉米植物的除草剂耐受性后代植物，所述后代植物包含SEQ IDNO:29。

7.一种转基因玉米植物，其包含位于染色体2上的玉米染色体靶位点中在约20cM处在通过SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31部分可扩增的SSR标志物UMC1265和通过SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33部分可扩增的MMC0111之间的转基因插入物，其中所述靶位点包含异源核酸。

8.生成项7的转基因玉米植物的方法，所述方法包括在染色体2上在约20cM处在通过SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31部分可扩增的SSR标志物UMC1265和通过SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33部分可扩增的MMC0111之间的位置处插入异源核酸。

9.项4的植物的部分，其中所述部分选自下组：花粉、胚珠、花、圆荚(boll)、棉花(lint)、枝条、根、和叶，所述部分包含SEQ ID NO:29。

10.项7的转基因玉米植物，所述植物包含选自下组的基因组序列中或侧翼有选自下组的基因组序列的转基因插入物：SEQ ID NO:29的残基1-1873和SEQ ID NO:29的残基6690-8557。

11.一种分离的多核苷酸分子，其中所述分子

包含至少15个核苷酸，并且在严格清洗条件下与选自下组的核酸序列维持杂交：SEQ ID NO:29的残基1-1873、SEQ ID NO:29的残基6690-8557、及其互补物；

包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1-33；和/或

在严格清洗条件下与选自下组的核苷酸序列杂交：SEQ ID NO:29的残基1863至1875、SEQ ID NO:29的残基6679至6700、及其互补物。

12.项11的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1-33。

13.项11的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸在严格清洗条件下与选自下组的核苷酸序列杂交：SEQ ID NO:29的残基1863至1875、SEQ ID NO:29的残基6679至6700、及其互补物。

14.项13的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸是通过聚合酶链式反应生成的扩增子。

15.一种检测包含玉米DNA的样品中的玉米事件的方法，其中所述方法包括使样品与至少一种多核苷酸接触，所述多核苷酸诊断以登录号PTA-10244保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的种子中存在的AAD-1玉米事件DAS-40278-9。

16.项15的方法，其中所述方法包括使所述样品与a.第一引物和b.第二引物接触，所述第一引物结合选自下组的侧翼序列：SEQ ID NO:29的残基1-1873、SEQ ID NO:29的残基6690-8557及其互补物；所述第二引物结合包含SEQ ID NO:29的残基1874-6689或其互补物的插入物序列；

将所述样品进行聚合酶链式反应；评估所述引物间生成的扩增子。

17.项16的方法，其中所述引物选自下组SEQ ID NOs:1-28。

18.项15的方法，其中所述多核苷酸包含至少30个核苷酸并在严格条件下与选自下组的序列杂交：SEQ ID NO:29的残基1863至1875、SEQ ID NO:29的残基6679至6700及其互补物；其中所述方法进一步包括将所述样品和所述多核苷酸进行严格杂交条件；并对所述样品测定所述多核苷酸与所述DNA的杂交。

19.一种DNA检测试剂盒，其包含依照项17的第一引物和第二引物。

20.一种DNA检测试剂盒，用于实施项18的方法。

21.一种DNA检测试剂盒，其包含如项13中限定的多核苷酸。

22.项12的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:29。

23.一种生成项22的多核苷酸的方法。

24.一种生成项10的转基因植物的方法，所述方法包括将转基因插入玉米基因组的DNA区段中，所述DNA区段含有包含SEQ ID NO:29的核苷酸残基1-1873的5’端和包含SEQ ID NO:29的核苷酸残基6690-8557的3’端。

25.一种方法，其包括将包含SEQ ID NO:29的第一玉米植物与第二玉米植物杂交以生成包含基因组的第三玉米植物，并对所述第三玉米植物测定所述基因组中SEQ ID NO:29的存在。

26.项25的方法，其中所述方法用于育种玉米植物和/或将除草剂耐受性性状渐渗入玉米植物中。

通过提及而将本文中提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请、和出版物以它们不与本说明书的明确教导矛盾的程度完整收入。

包括以下实施例以例示用于实施本发明的规程，并且表明本发明的某些优选的实施方案。这些实施例不应解释为限制性的。本领域技术人员应当领会，以下实施例中公开的技术代表用于例示其实施的优选模式的具体方法。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当领会，可以在不偏离本发明精神和范围的前提下对这些具体实施方案进行多种改变，而仍获得相同或相似的结果。除非另有指示，所有百分比按重量计，并且所有溶剂混合物比例按体积计，除非另有记录。

以下实施例包括种植前和/或出土前使用。此类用途不限于“278”事件。可以就缩短的回种(plant-back)时间间隔而言进一步详述由主题AAD-1基因提供的耐受性的效用。这给予种植者以在相对于烧毁安排其种植中的更大量的灵活性。在不使用本发明的情况下，在种植前在烧毁后等待7-30天左右可以引起显著的产量损失。如此，本发明在此方面提供了优点。参见例如实施例13。可以依照本发明使用任何种植/除草剂应用时间间隔，和本文中例示或提示的除草剂的任何浓度范围/使用比率。

可以依照本发明使用本文中例示或提示的任何种植/除草剂应用间隔，和除草剂的任何浓度范围/使用率。

除非另有指示，使用下列缩写。

AAD-1 芳氧基链烷酸酯双加氧酶-1

bp 碱基对

℃ 摄氏度

DNA 脱氧核糖核酸

DIG 洋地黄毒苷

EDTA 乙二胺四乙酸

kb 千碱基

μg 微克

μL 微升

mL 毫升

M 分子量

OLP 重叠探针

PCR 聚合酶链式反应

PTU 植物转录单元

SDS 十二烷基硫酸钠

SOP 标准的操作规程

SSC 含有氯化钠和柠檬酸钠混合物的缓冲溶液，pH7.0

TBE 含有Tris碱、硼酸和EDTA混合物的缓冲溶液，pH8.3

V 伏特

实施例

实施例1：AAD1事件pDAS1740-278的转化和选择

通过WHISKER介导的玉米系Hi-II转化生成AAD1事件pDAS1740-278。使用的转化方法记载于美国专利申请#20090093366。将质粒pDAS1740的FspI片段(又称为pDAB3812)(图1)转化到玉米系中。此质粒构建体含有植物表达盒，该植物表达盒含有RB7MARv3::玉蜀黍泛素1启动子v2//AAD1v3//玉蜀黍PER53’UTR::RB7MARv4植物转化单元(PTU)。

生成许多事件。将那些存活并且生成健康的吡氟氯禾灵(haloxyfop)抗性愈伤组织的事件分配代表推定转化事件的独特标识码，并且连续转移至新鲜的选择培养基。从源自每个独特事件的组织再生植物，并将其转移至温室。

采集叶组织以进行分子分析，以通过Southern印迹、DNA边界确认、和基因组标志物辅助确认证实AAD-1转基因的存在。用近交系给阳性T0植物传粉以获得T1种子。选择事件pDAS1470-278-9(DAS-40278-9)的T1植物，将其自花传粉，并表征五个世代。同时，将T1植物回交，并经由标志物辅助选择几个世代来渐渗入良种种质(XHH13)中。从独立的转化隔离群生成此事件。事件给予其独特的特征诸如单一插入位点、正常的孟德尔分离和稳定的表达、和效力的卓越组合，包括在宽基因型背景中及在多个环境位置间的除草剂耐受性和农艺学性能选择。以下实施例含有用于表征事件pDAS-1740-278-9的数据。

实施例2：经由Southern印迹的pDAS1740-278-9事件表征

使用Southern印迹分析来建立插入的DNA片段的整合样式，并测定事件pDAS-1740-278-9(DAS-40278-9)中aad-1基因的插入物/拷贝数目。产生数据以证明插入玉米基因组中的aad-1转基因的整合和完整性。

Southern印迹数据提示了玉米事件DAS-40278-9中的pDAS1740/Fsp I片段插入物以单一的完整拷贝的来自质粒pDAS1740的aad-1PTU的简单整合存在。使用对基因、启动子、终止子、和质粒区中含有的其它调节元件特异性的探针和描述性限制酶进行详细的Southern印迹分析，所述描述性限制酶具有位于质粒内的切割位点，并且生成质粒内部的杂交片段或跨越质粒与玉米基因组DNA交接的片段(边界片段)。在限制酶和探针组合方面自Southern杂交指示的分子量对于所述事件是独特的，并且建立其鉴定样式。这些分析还显示已经在没有aad-1PTU重排的情况下将质粒片段插入玉米基因组DNA中。在转基因玉米事件DAS-40278-9的5个独特世代中观察到相同的杂交片段，指示世代间aad-1PTU插入的遗传力稳定性。与位于质粒pDAS1740上FspI的限制性位点外部的三个主链探针的混合物杂交没有检出任何特异性DNA/基因片段，指示氨苄青霉素抗性基因的缺乏和与转基因玉米事件DAS-40278-9中质粒pDAS1740的Fsp I限制性位点紧密相邻的其它载体主链区的缺乏。图2-3中呈现了aad-1玉米事件DAS-40278-9中插入物的例示图谱。

实施例2.1：玉米叶样品收集和基因组DNA(gDNA)分离

从aad-1玉米事件DAS-40278-9的个别植物的叶制备的gDNA。从自携带aad-1玉米事件DAS-40278-9的个别植物收获的组织提取gDNA。使用来自事件DAS-40278-9的5个不同世代的转基因玉米种子。选择事件DAS-40278-9的20个个别玉米植物(源自每个世代的4个植物)。另外，从没有aad-1基因的常规玉米植物XHH13(其含有代表主题品系的遗传背景)分离gDNA。

在分离gDNA前，从每个植物采集叶冲孔以使用快速测试条试剂盒(American Bionostica,Swedesboro,NJ)依照制造商的推荐方法测试aad-1蛋白表达。对每个叶冲孔样品给予分别代表存在或缺乏aad-1的得分+或–。仅将来自事件DAS-40278-9的5个世代的阳性植物进行进一步表征。

自事件DAS-40278-9和常规对照XHH13的个别植物收集玉米叶样品。将叶样品在液氮中快速冷冻，并与约-80℃贮存，直到使用。

遵循标准CTAB法从冷冻的玉米叶组织提取个别基因组DNA。在必要是，用Qiagen Genomic-Tip(Qiagen,Valencia,CA)遵循制造商推荐的方法进一步纯化一些基因组DNA。在提取后，使用Pico Green试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)以荧光分光术量化DNA。然后，在琼脂糖凝胶上显现DNA以确认来自Pico Green分析的数值并且测定DNA量。

实施例2.2：DNA消化和分离

对于DNA的分子表征，通过将每μg DNA约5至11个单位的选定限制酶和相应反应缓冲液添加至每份DNA样品消化九微克(9μg)来自玉米事件DAS-40278-9DNA样品和常规玉米的基因组DNA。将每份样品于约37℃温育过夜。使用限制酶EcoR I,Nco I,Sac I,Fse I,和Hind III以得到消化物(NewEngland Biolabs,Ipswich,MA)。通过以大致等同于每个玉米基因组1个拷贝的转基因的比率组合质粒DNA，即pDAS1740(pDAB3812)与来自常规对照的基因组DNA，并使用与测试样品相同的方法和限制酶消化制备阳性杂交对照样品。使用与测试样品相同的方法和限制酶消化制备来自常规玉米对照(XHH13)的DNA以充当阴性对照。

将消化的DNA样品用Quick-Precip(Edge BioSystems,Gaithersburg,MD)沉淀，并在1倍蓝汁(Blue Juice)(Invitrogen,Carlsbad,CA)中重悬以实现对于凝胶加载期望的体积。然后，将DNA样品和分子大小标志物以55-65伏特电泳通过具有1倍TBE缓冲液(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)的0.8%琼脂糖凝胶达约18-22小时以实现片段分开。用溴化乙啶(Invitrogen,Carlsbad,CA)染色凝胶，并在紫外(UV)光下显现DNA。

实施例2.3：Southern转移和膜处理

实施Southern印迹分析，基本上如由Memelink等(1994)Southern,Northern,and Western Blot Analysis.Plant Mol.Biol.Manual F1:1-23描述的。简言之，在电泳分离和显现DNA片段后，将凝胶用0.25N HCl(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)进行脱嘌呤约15分钟，然后暴露于变性溶液(AccuGENE,Sigma,St.Louis,MO)约30分钟，接着是中和溶液(AccuGENE,Sigma,St.Louis,MO)至少30分钟。使用具有10倍SSC(Sigma,St.Louis,MO)的芯吸系统将对尼龙膜(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)的Southern转移实施过夜。在转移后，将膜在2倍SSC溶液中清洗，并通过UV交联将DNA与膜结合。此过程导致准备好杂交的Southern印迹膜。

实施例2.4：DNA探针标记和杂交

使用经标记的探针检测与尼龙膜结合的DNA片段。从通过对基因元件和质粒pDAS1740的其它区域特异性的引物生成的片段通过经地高辛(digoxigenin，DIG)标记的核苷酸[DIG-11]-dUTP的基于PCR的掺入生成用于研究的探针。使用PCR DIG探针合成试剂盒(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)遵循制造商的推荐方法实施通过PCR合成的DNA探针生成。表1中描述了用于研究的一批探针。

表1：Southern分析中使用的探针的位置和长度

通过琼脂糖凝胶电泳分析经标记的探针以测定其质量和数量。然后，使用期望量的经标记探针来与尼龙膜上的靶DNA杂交，从而使用对DIG EasyHyb溶液(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)描述的方法检测特定片段。简言之，将具有固定的DNA的尼龙膜印迹在2倍SSC中短暂清洗，并在杂交炉中于约50℃与杂交瓶中20-25mL预加热DIG Easy Hyb溶液预杂交最少30分钟。然后，将预杂交溶液弃去，并用20mL预加热DIG Easy Hyb溶液更换，所述DIG Easy Hyb溶液含有期望量的通过在水中煮沸5分钟预变性的特异性探针。然后，在杂交炉中于约40-60℃将杂交步骤进行过夜。

实施例2.5：检测

在探针杂交结束时，将含有探针的DIG Easy Hyb溶液弃入干净的管中，并于-20℃贮存。可以依照制造商的推荐方案将这些探针再使用2-3次。将膜印迹短暂漂洗并在干净塑料容器中于室温用低严格性清洗缓冲液(2倍SSC,0.1%SDS)清洗两次，持续约5分钟，接着于约65℃用高严格性清洗缓冲液(0.1倍SSC,0.1%SDS)清洗两次，各15分钟。然后，将膜印迹转移至其它干净的塑料容器，并来自DIG清洗和封闭缓冲液组(Wash and Block Buffer Set)(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)的1倍清洗缓冲液短暂清洗约2分钟，在1倍封闭缓冲液中进行封闭最少30分钟，接着与1倍封闭缓冲液中的抗DIG-AP(碱性磷酸酶)抗体(1:5,000稀释,Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)一起温育最少30分钟。用1倍清洗缓冲液清洗2-3次后，特异性DNA探针与膜印迹保持结合，并使用CDP-Star化学发光核酸检测系统(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)遵循制造商的推荐显现经DIG标记的DNA标准品。将印迹暴露于化学发光膜(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)达一个或多个时间点以检测杂交片段并显现分子大小标准品。然后，用All-Pro100Plus胶片显影剂(KonicaSRX-101)显现胶片，并扫描图像以进行报告。对每个探针记录可检测条带的数目和大小。使用经DIG标记的DNA分子量标志物II(MWM DIG II)(在DIG检测后可见，如描述的)来测定Southern印迹上的杂交片段大小。

实施例2.6：探针剥离

在获得Southern杂交数据后将DNA探针脱离膜印迹，并且可以再使用膜印迹，用于依照制造商推荐的方法(DIG Application Manual for FilterHybridization,(2003).Roche Diagnostics)与不同DNA探针杂交。简言之，在信号检测和胶片暴露后，将膜印迹用Milli-Q水彻底漂洗，接着在剥离缓冲液中于室温或于37℃清洗两次达约15分钟。然后，将膜印迹在2倍SSC中短暂清洗，并准备好与另一种DNA探针的预杂交和杂交。将膜印迹暴露于新的化学发光胶片以确保在进行下一次杂交前剥离所有DNA探针。与记录用研究文件中的先前杂交数据包一起保留再暴露的胶片。

实施例2.7：Southern印迹结果

表2中给出了基于pDAS1740/Fsp I片段的已知限制酶位点用特定消化物和探针的预期的和观察到的片段大小。从这些消化物和杂交鉴定两类片段：内部片段，其中已知的酶位点在探针区侧翼，并且完全包含在pDAS1740/FspI片段内，和边界片段，其中已知的酶位点位于探针区的一个末端，而预期第二位点在玉米基因组中。边界片段大小随事件而变化，因为在大多数情况中，DNA片段整合位点对于每种事件而言是独特的。边界片段提供了相对于整合DNA定位限制酶位点及评估DNA插入数目的手段。基于此研究中完成的Southern印迹分析，推断单一拷贝的完整的来自质粒pDAS1740/Fsp I的aad-1PTU插入事件DAS-40278-9的玉米基因组中，如插入物图谱中详述的(图2-3)。

表2：Southern印迹分析中预测的和观察到的杂交片段。

注意：*观察到的片段大小后的星号标示在所有样品(包括阴性对照)间检出的内源序列杂交。

#常规对照、BC3S1、和一些BC3S2样品中的双联体

1.预期的片段大小基于pDAS1740(pDAB3812)的质粒图谱，如图1中显示的。

2.认为观察到的片段大小大致来自这些分析物，并且其基于经DIG标记的DNA分子重量标志物II片段的指示大小。由于掺入DIG分子进行显现，标志物片段通常比其实际指示分子量大大约5-10%运行。

选择在质粒pDAS1740中具有独特限制性位点的限制酶EcoR I,Nco I,Sac I,Fse I/Hind III来表征事件DAS-40278-9中的aad-1基因插入物。预测>3382bp,>2764bp,>4389bp的边界片段分别在EcoR I,Nco I,和Sac I消化后与aad-1基因探针杂交(表2)。在分别使用EcoR I、Nco I、和Sac I时观察到约12000bp,约4000bp,和约16000bp的单一aad-1杂交条带，指示事件DAS-40278-9的玉米基因组中aad-1基因插入的单一位点。选择用Fse I和HindIII的双重消化来释放3361bp的片段，其含有aad-1植物转录单元(PTU,启动子/基因/终止子)(见2)。在Fse I/Hind III消化后用aad-1基因探针观察到预测的3361bp片段。用对DAS-40278-9样品的所有4种酶/酶组合消化，接着用aad-1基因探针杂交获得的结果指示单一拷贝的完整的来自质粒pDAS1740的aad-1PTU插入事件DAS-40278-9的玉米基因组中。

选择限制酶Nco I、Sac I和Fse I/Hind III来表征事件DAS-40278-9中aad-1的启动子(ZmUbi1)区。预期Nco I和Sac I消化物在与特异性针对ZmUbi1启动子区的DNA探针杂交时分别生成>3472bp和>4389bp的边界区片段(表2)。在Nco I消化后用ZmUbi1启动子探针检出约6300bp和约3600bp的两个杂交条带。然而，约3600bp条带在包括常规对照的所有样品道间存在，提示约3600bp条带是源自玉米衍生的泛素启动子(ZmUbi1)探针与玉米内源ubi基因的同源结合的非特异性信号条带。相反，在测试的DAS-40278-9样品中而非在常规对照中检出约6300bp信号条带，指示约6300bp条带对来自质粒pDAS1740的ZmUbi1启动子是特异性的，因此，它是表2中指示的预期Nco I/ZmUbi1条带。类似地，在Sac I消化后用ZmUbi1启动子探针检出约3800bp和约16000bp的两种杂交条带。约3800bp条带在包括常规对照的所有样品道中出现，如此认为是ZmUbi1启动子探针对玉米内源ubi基因的的非特异性杂交。认为仅存在于DAS-40278-9样品中的约16000bp杂交条带是预期的Sac I/ZmUbi1条带。预期用Fse I/Hind III的双重消化释放3361bp aad-1PTU片段，其与ZmUbi1启动子探针杂交(表2)。在Fse I/Hind III消化后通过ZmUbi1启动子探针检出此3361bp条带和约6400bp非特异性杂交条带。认为约6400bp条带是ZmUbi1启动子探针对玉米内源ubi基因的非特异性结合，因为此条带存在于包括常规对照的所有样品道中。另外，在常规对照、BC3S1和一些BC3S2样品中观察到非常接近约6400bp的另一条带。此非常接近约6400bp的额外条带也认为是非特异性的，因为它存在于常规对照XHH13样品道中，并且最可能与XHH13的遗传背景相关联。

选择相同的限制酶/酶组合Nco I、Sac I和Fse I/Hind III来表征事件DAS-40278-9中aad-1的终止子(ZmPer5)区。预期Nco I消化物在与特异性针对ZmPer5终止子区的DNA探针杂交时生成>2764bp的边界区片段(表2)。在NcoI消化后用ZmPer5终止子探针检出约4000bp和约3900bp的两个杂交条带。约3900bp条带在包括常规对照的所有样品道间存在，提示约3900bp条带是可能由玉米衍生的过氧化物酶基因终止子(ZmPer5)探针与玉米内源per基因的同源结合所致的非特异性信号条带。相反，在测试的DAS-40278-9样品中而非在常规对照中检出约4000bp信号条带，指示约4000bp条带对来自质粒pDAS1740的ZmPer5终止子是特异性的，因此，它是表2中指示的预期NcoI/ZmPer5条带。预期>1847bp边界片段在Sac I消化后与ZmPer5终止子探针杂交。在Sac I消化后用ZmPer5终止子探针检出约约1900bp和约9000bp的两种杂交条带。约9000bp条带在包括常规对照的所有样品道中出现，如此认为是ZmPer5终止子探针对玉米内源per基因的的非特异性杂交。认为仅存在于DAS-40278-9样品中的约1900bp杂交条带是预期的Sac I/ZmPer5条带。预期用Fse I/Hind III的双重消化释放3361bp aad-1PTU片段，其与ZmPer5终止子探针杂交(表2)。在Fse I/Hind III消化后通过ZmPer5终止子探针检出此3361bp条带和约2100bp的额外的非特异性杂交条带。认为额外的约2100bp条带是ZmPer5终止子探针对玉米内源基因的非特异性结合，因为此条带存在于包括常规对照的所有样品道中。用对DAS-40278-9样品的这些消化，接着用ZmUbi1启动子和ZmPer5终止子探针杂交获得的结果进一步确认单一拷贝的完整的来自质粒pDAS1740的aad-1PTU插入事件DAS-40278-9的玉米基因组中。

选择限制酶Nco I和Sac I来表征来自AAD-1玉米事件DAS-40278-9中pDAS1740/Fsp I片段的组件的剩余部分(表2)。组件RB7Mar v3和RB7Mar v4的DNA序列具有超过99.7%同一性，因此，预期对RB7Mar v3或RB7Mar v4特异性的DNA探针与含有任一型式的RB7Mar的DNA片段杂交。预期>2764bp和>3472bp的两个边界片段在Nco I消化后与RB7Mar v4和RB7Mar v3探针杂交(表2)。在DAS-40278-9样品中在Nco I消化后用RB7Mar v4或RB7Marv3探针观察到约4000bp和约6300bp的两个杂交条带。类似地，在Sac I消化后用RB7Mar v4和RB7Mar v3探针预测>1847bp和>4389bp的两个边界片段(表2)。在Sac I消化后用RB7Mar v4或RB7Mar v3探针在DAS-40278-9样品中检出约1900bp和约16000bp的杂交条带。

总之，用这些元件探针获得的Southern杂交结果指示玉米事件DAS-40278-9中插入的DNA含有完整的aad-1PTU以及分别在插入物5’和3’端的基质附着区RB7Mar v3和RB7Mar v4。

实施例2.8：主链序列的缺乏

使用几乎涵盖质粒pDAS1740的整个Fsp I主链区(质粒pDAS1740中的4867-7143bp)三个DNA片段(表1)的等摩尔比率组合作为主链探针以表征AAD-1玉米事件DAS-40278-9。使用质粒pDAS1740/Fsp I片段来生成事件DAS-40278-9，因此，在任何限制酶消化后用主链探针组合(表2)预期没有特异性杂交信号。确认在Nco I或Sac I消化后在所有DAS-40278-9样品中用主链探针没有检出特异性杂交信号。阳性对照道含有预期的杂交条带，证明探针能够与任何同源DNA片段(若存在于样品中的话)杂交。数据提示了玉米事件DAS-40278-9中的插入不包括在来自质粒pDAS1740的Fsp I区外部的任何载体主链序列。

使用来自事件DAS-40278-9的5个独立世代的叶样品来进行Southern印迹分析，用于分子表征。使用选择的识别酶消化物和探针组合来调查整合样式以表征插入的基因aad-1，及非编码区，包括启动子、基因表达终止子、和基质附着区。

对插入事件DAS-40278-9中的DNA的Southern印迹表征指示单一完整拷贝的aad-1PTU已经整合入事件DAS-40278-9中。通过限制酶和探针的组合的Southern杂交指示的分子量对于事件而言是独特的，并且建立其鉴定样式。杂交样式在所有5个世代间是相同的，指示插入物在玉米基因组中是稳定的。与探针的杂交确认载体主链序列尚未掺入事件DAS-40278-9中，所述探针涵盖超出来自质粒pDAS1740的pDAS1740/Fsp I转化片段的主链区。

实施例3：玉米事件DAS-40278-9的插入物和侧翼边界区中的DNA序列的克隆和表征

为了表征插入的DNA并描述基因组插入位点，测定事件DAS-40278-9的插入物和边界区的DNA序列。总共确认8557bp事件DAS-40278-9基因组序列，其包含1873bp5’侧翼边界序列、1868bp3’侧翼边界序列、和4816bpDNA插入物。4816bp DNA插入物含有完整的aad-1表达盒、5’端的259bp部分MAR v3、和3’端的1096bp部分MAR v4。序列分析揭示5’整合交接处的21bp插入和自玉米基因组的插入基因座的两个碱基对缺失。一个碱基对插入存在于玉米基因组和DAS-40278-9插入物之间的3’整合交接。还有，在3’UTR的非编码区中的第5212位插入物中找到单一碱基变化(T至C)。这些变化无一影响aad-1表达盒的可读框组成。

基于事件DAS-40278-9插入物和边界序列的PCR扩增确认边界区是玉米起源的，并且交接区可以用于DAS-40278-9的事件特异性鉴定。对跨越交接区的序列的分析指示没有新的可读框(ORF>=200个密码子)源自事件DAS-40278-9中的DNA插入，并且也没有基因组可读框由于天然玉米基因组中的DAS-40278-9整合中断。总体上，AAD-1玉米事件DAS-40278-9的插入物和边界序列的表征指示单一完整拷贝的aad-1表达盒整合入天然玉米基因组中。

实施例3.1：基因组DNA提取和量化

使用经修改的CTAB方法从冻干的或新鲜研磨的叶组织提取基因组DNA。将DNA样品在1倍TE(10mM Tris pH8.0,1mM EDTA)(Fluka,Sigma,St.Louis,MO)中溶解，并用Pico Green法依照制造商的说明书(Molecular Probes,Eugene,OR)量化。对于PCR分析，将DNA样品用分子生物学级水(5PRIME,Gaithersburg,MD)稀释以产生10-100ng/μL的浓度。

实施例3.2：PCR引物

表3列出用于克隆事件DAS-40278-9的DNA插入物和侧翼边界区的引物序列，图4中标记了位置和描述。表4列出用于确认插入物和边界序列的引物序列。图4和5中标记引物位置。所有引物由Integrated DNA Technologies,Inc.(Coralville,IA)合成。将引物在水(5PRIME,Gaithersburg,MD)中溶解至100μM的浓度(对于储备溶液)，并用水稀释至10μM的浓度(对于工作溶液)。

表3：玉米事件DAS-40278-9中的插入物和侧翼边界序列的克隆中使用的引物序列列表

(+)：直接序列；

(-)：互补序列；

表4：确认玉米基因组DNA中使用的引物序列列表

(+)：直接序列；

(-)：互补序列；

实施例3.3：基因组步行(Walking)

使用GenomeWalker^TM通用试剂盒(Clontech Laboratories,Inc.,MountainView,CA)来克隆玉米事件DAS-40278-9的5’和3’侧翼边界序列。依照制造商的说明书，用EcoR V、Stu I(均由试剂盒提供)或Sca I(New England Biolabs,Ipswich,MA)将约2.5μg来自AAD-1玉米事件DAS-40278-9的基因组DNA消化过夜。使用DNA Clean&Concentrator^TM-25(ZYMO Research,Orange,CA)纯化经消化的DNA，接着与GenomeWalker^TM衔接头连接以构建GenomeWalker^TM文库。使用每个GenomeWalker^TM文库作为DNA模板，用于用试剂盒中提供的衔接头引物AP1和每个构建体特异性引物5End3812_A和3End3812_C的初级PCR扩增。然后，使用1微升1:25稀释的初级PCR反应作为模板，用于用巢式衔接头引物AP2和每个巢式构建体特异性引物5End3812_B和3End3812_D的次级PCR扩增。在PCR扩增中使用TaKaRa LATaq^TMHS(Takara Bio Inc.,Shiga,Japan)。在50μL PCR反应中，使用1μL DNA模板、8μL2.5mM dNTP混合物、0.2μM每种引物、2.5个单位的TaKaRa LATaq^TMHS DNA聚合酶、5μl10倍LA PCR缓冲液II(加Mg2+)、和1.5μL25mMMgCl₂。表5中列出特异性PCR条件。

实施例3.4：常规PCR

使用标准PCR来克隆并确认玉米事件DAS-40278-9中的DNA插入物和边界序列。使用TaKaRa LA Taq^TM(Takara Bio Inc.,Shiga,Japan)、HotStarTaqDNA聚合酶(Qiagen,Valencia,CA)、扩充高保真性PCR系统(Expand HighFidelity PCR System)(Roche Diagnostics,Inc.,Indianapolis,IN)、或

高保真性PCR克隆酶和主混合物(Stratagene,LaJolla,CA)依照制造商推荐的方法进行常规PCR扩增。表6中列出了特异性PCR条件和扩增子描述。

表6：用于玉米事件DAS-40278-9中边界区的标准PCR扩增的条件

实施例3.5：PCR产物检测、纯化、PCR产物的亚克隆、和测序

使用1.2%或2%E-凝胶(Invitrogen,Carlsbad,CA)依照产品说明书通过电泳检查PCR产物。通过与DNA标志物比较评估片段大小。在必要时，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen,Carlsbad,CA)通过从用溴化乙啶染色的1倍TBE中的1%琼脂糖凝胶切出碎片纯化PCR片段。

使用测序用的TOPO TA

试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)依照产品说明书将PCR片段亚克隆入

中。具体地，遵循制造商的说明书将2至5微升克隆反应转化到One Shot化学感受态TOP10细胞中。通过微量制备质粒DNA(QIAprep Spin Miniprep Kit,Qiagen,Carlsbad,CA)，接着用EcoR I限制性消化或者通过使用试剂盒中提供的T3和T7引物进行的直接菌落PCR确认克隆的片段。然后，送出选定菌落的质粒DNA或甘油储液进行测序。

亚克隆后，最初对推定的靶PCR产物测序以确认已经克隆预期的DNA片段。选择含有合适DNA序列的菌落进行引物步行以测定完整的DNA序列。测序由Cogenics(Houston,TX)实施。

使用Sequencher软件(Version4.8Gene Codes Corporation,Ann Arbor,MI)完成插入物和边界序列的最终装配。使用Vector NTI(Version10and11,Invitrogen,Carlsbad,CA)实施玉米事件DAS-40278-9的插入物和边界序列的注释。

针对GenBank数据库使用BLAST程序完成同源性搜索。使用Vector NTI(第11版,Invitrogen)实施可读框(ORF)分析以鉴定整个插入物和侧翼边界序列中的ORFs(>=200个密码子)。

实施例3.6：5’端边界序列

使用针对转基因5’端的特异性巢式引物组从每个玉米事件DAS-40278-9GenomeWalker^TM文库扩增DNA片段。从事件AS-40278-9EcoR V和Stu IGenomeWalker^TM文库两者观察到约800bp PCR产物。Sca I GenomeWalker^TM文库生成2kb左右的产物。将片段克隆入

中，并将来自每个文库的6个菌落随机挑出进行末端测序仪确认插入物含有预期的序列。通过插入物的引物步行进行的完整测序揭示自玉米事件DAS-40278-9Stu I、EcoRV、和Sca I GenomeWalker^TM文库扩增的片段分别是793、822、和2132bp。自Stu I和EcoR V GenomeWalker^TM文库生成的DNA片段与从Sca IGenomeWalker^TM文库生成的DNA片段是100%匹配的，提示了从转基因插入物的5’区扩增这些DNA片段。所得1873bp玉米基因组序列的BLAST搜索指示与玉米BAC克隆序列的高度相似性。此外，对插入物交接的序列分析指示与质粒pDAS1740/Fsp I片段相比其5’端区的917bp MAR v3是截短的，留下aad-1表达盒5’区的259bp部分MAR v3。

实施例3.7：3’端边界序列

使用针对转基因3’端的特异性巢式引物组从玉米事件DAS-40278-9Stu IGenomeWalker^TM文库扩增具有约3kb的大小的DNA片段。将DNA片段克隆入

中，并随机挑出10个菌落进行末端测序以确认预期序列的插入。对具有预期插入物的三个克隆完全测序，生成2997bp DNA片段。对此DNA片段的序列分析揭示部分MAR v4元件(缺少其其5’区的70bp)和1867bp玉米基因组序列。BLAST搜索显示了1867bp基因组DNA序列与相同玉米BAC克隆中的序列是100%匹配的，如用5’边界序列鉴定的。

实施例3.8：DNA插入物和交接序列

使用基于PCR的方法从玉米事件DAS-40278-9克隆DNA插入物和交接区，如先前描述的。基于5’和3’侧翼边界序列和预期的转基因序列涉及5对引物。总共，将5种交叠DNA片段(1767bp的扩增子1、1703bp的扩增子2、1700bp的扩增子3、1984bp的扩增子4、和1484bp的扩增子5)克隆并测序(图4)。基于5种片段间的交叠序列装配整个插入物和侧翼边界序列。最终的序列确认源自pDAS1740/Fsp I的4816bp DNA插入物、1873bp5’侧翼边界序列、和1868bp3’侧翼边界序列的存在。4816bp DNA插入物含有完整的aad-1表达盒、5’端的259bp部分MAR v3、和3’端的1096bp部分MAR v4(Seq ID No:29)。

使用至少两个供每个引物对用的克隆进行引物步行以获得关于DNA插入物和及边界序列的完整序列信息。序列分析指示玉米基因组DNA和来自pDAS1740/Fsp I的整合部分MAR v3之间的5’整合交接的21bp插入。BLAST搜索和Vector NTI分析结果指示21bp插入物DNA没有证明与任何植物物种DNA或pDAS1740质粒DNA的同源性。单一碱基对插入存在于玉米基因组DNA和来自pDAS1740/Fsp I的部分MAR v4之间的3’交接处。DNA整合还在玉米基因组的插入基因座处产生2个碱基对缺失(图6)。另外，DNA插入物的非翻译3’UTR区(Seq ID No:29)中观察到5212bp位置处的一处核苷酸差异(T至C)。然而，这些变化无一表现为对于aad-1表达或创建穿过DAS-40278-9插入物中的交接的任何新ORF(>=200个密码子)是至关重要的。

实施例3.9：玉米基因组序列的确认

为了确认玉米基因组中事件DAS-40278-9转基因的插入位点，用不同引物对实施PCR扩增(图4)。使用来自事件DAS-40278-9和其他转基因或非转基因玉米系的基因组DNA作为模板。使用两种aad-1特异性引物AI5End01和AI5End02，及依照5’端边界序列设计的两种引物1F5End01和1F5End02来扩增DNA片段，其跨越aad-1基因至5’端边界序列。类似地，为了扩增跨越aad-1至3’端边界序列的DNA片段，使用源自3’端边界序列的1F3End05引物和aad-1特异性AI3End01引物。用每个引物对仅从AAD-1玉米事件DAS-40278-9的基因组DNA扩增具有预期大小的DNA片段，所述引物对由一个在AAD-1玉米事件DAS-40278-9的侧翼边界定位的引物和一个aad-1特异性引物组成。对照DNA样品用相同引物对没有产生PCR产物，指示克隆的5’和3’端边界序列确实分别是插入的aad-1基因构建体的上游和下游序列。注意到在使用1F5End01和AI5End01引物对进行PCR扩增时，在包括AAD-1玉米事件DAS-40278-9、AAD-1玉米事件DAS-40474和非转基因玉米系XHH13的所有玉米样品中观察到具有约8kb大小的微弱条带。观察到的微弱条带(在制备的凝胶上)可以是用此对引物在玉米基因组中非特异性扩增的结果。

为了进一步确认玉米基因组中的DNA插入，使用两个在5’端边界序列定位的引物1F5End03和1F5End04，及两个在3’端边界序列定位的引物1F3End03和1F3End04来扩增跨越插入基因座的DNA片段。用引物对1F5End03/1F3End03或引物对1F5End04/1F3End04的PCR扩增从AAD-1玉米事件DAS-40278-9的基因组DNA生成具有约8kb的预期大小的片段。比较而言，没有PCR产物源自AAD-1玉米事件DAS-40474-7或非转基因玉米系XHH13的基因组DNA。鉴于AAD-1玉米事件DAS-40278-9和事件DAS-40474-7通过转化HiII，接着将初始转基因事件与玉米系XHH13回交生成，这两个事件之每个中的大部分基因组在理论上来自玉米系XHH13。非常有可能的是，仅从初始基因组DNA遗传接近aad-1转基因的侧翼边界序列，并且在AAD-1事件渐渗过程期间得到保留，而已经可以通过XHH13的基因组序列替换基因组序列的其他区域。因此，不令人惊讶的是，用引物对1F5End03/1F3End03或引物对1F5End04/1F3End04没有从AAD-1玉米事件DAS-40474-7和XHH13的基因组DNA扩增片段。在玉米系HiII和B73而非玉米系A188的基因组DNA中用引物对1F5End03/1F3End03和1F5End04/1F3End04分别扩增约3.1和3.3kb片段。结果指示边界序列源自玉米系B73基因组。

自B73/HiII实施玉米基因组DNA的别的克隆以确保侧翼边界序列的有效性。对PCR扩增片段测序以证明插入物DNA区整合入B73/HiII基因组DNA的特定位置中。基于获得的序列设计引物。使用引物组Amp1F/Amp5R来扩增2212bp片段，其跨越没有插入物DNA的天然B73/HiII基因组的5’至3’交接。序列分析揭示了转基因插入基因组中有2个碱基对的缺失。对来自克隆的天然B73基因组片段的DNA序列的分析鉴定位于3’整合交接区下游的1个ORF(>=200个密码子)。另外，没有穿过AAD-1玉米事件DAS-40278-9整合的初始基因座的其它ORF。BLAST搜索还确认来自事件DAS40278-9的5’端和3’端边界序列两者在同一玉米BAC克隆并排(side by side)定位。

鉴于AAD-1玉米事件DAS-40278-9的5’整合交接的独特性(uniqueness)，设计两对特异性PCR引物1F5EndT1F/1F5EndT1R和玉米278-F/Corn278-R以扩增此插入物与植物基因组交接。如预测的，仅在AAD-1玉米事件DAS-40278-9而非任何其它转基因或非转基因玉米系的基因组DNA中生成期望的DNA片段。因此，可以使用那两个引物对作为AAD-1玉米事件DAS-40278-9事件特异性鉴定物。

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实施例4：经由DAS-40278-9的侧翼SSR标志物的基因组表征

为了表征并描述基因组插入位点，测定在插入物附近定位的标志物序列。使用一组多态性SSR标志物来鉴定并定位转基因位置。事件pDAS1740-278在2008DAS玉米连锁图谱上在约20cM处在SSR标志物UMC1265和MMC0111之间约20cM处在染色体2上定位。表6汇总了发现极其接近转基因pDAS1740-278的这两种标志物的引物信息。

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表6：引物名称、染料标记物、基因座位置、正向和反向引物序列、和与事件pDAS1740-278有关的侧翼标志物的重要注释。

实施例4.1：gDNA分离

使用DNEasy96植物测试试剂盒(Qiagen,Valencia,California)从叶冲孔提取gDNA。对方案做出修改以适应自动化。使用来自Molecular Probes,Inc.(Eugene,OR)的

染料量化分离的gDNA。对于所有样品使用无菌去离子水将gDNA的浓度稀释至5ng/μl。

实施例4.2：用标志物筛选gDNA

对简单序列重复(SSR)标志物的亚组对稀释的DNA测定基因型。SSR标志物由Applied Biosystems(Foster City,California)合成，正向引物用6-FAM,HEX/VIC,或NED(分别是蓝色、绿色和黄色)荧光标签标记。将标志物基于其荧光标签和扩增子大小分成群或组以便于PCR后的多重化(multiplexing)和分析。

在384孔测定板中实施PCR，每个反应含有5ng基因组DNA、1.25倍PCR缓冲液(Qiagen,Valencia,California)、0.20μM每种正向和反向引物、1.25mMMgCl₂、0.015mM每种dNTP、和0.3个单位的HotStart Taq DNA聚合酶(Qiagen,Valencia,California)。在具有384双重头部模块(Applied Biosystems,FosterCity,California)的GeneAmp PCR系统9700中实施扩增。扩增程序如下：(1)于95℃使Taq初始活化12分钟；(2)于94℃持续30秒；(3)于55℃持续30秒；(4)于72℃持续30秒；(5)重复步骤2-4达40个循环；及(6)于72℃最终延伸30分钟。通过将2μl来自相同植物的每种PCR产物添加至无菌去离子水达总体积60μl将每个SSR标志物组的PCR产物多重化在一起。多重化PCR产物中，将0.5ul分配(stamp)到含有5μl加载缓冲液的384孔加载板中，所述加载缓冲液由1:100比率的GeneScan500碱基对LIZ大小标准品和ABI HiDi甲酰胺(Formamide)(Applied Biosystems,Foster City,California)组成。然后，将样品加载到ABI Prism3730xl DNA分析仪(Applied Biosystems,Foster City,California)上，以使用制造商的推荐进行毛细管电泳，总共运行时间为36分钟。将标志物数据通过ABI Prism3730xl自动化测序仪数据收集软件第4.0版收集，并经由GeneMapper4.0软件(Applied Biosystems)提取，用于等位基因表征和片段大小标记。

实施例4.3：SSR标志物结果

表6中列出在转基因的最接近附近中鉴定的侧翼标志物的引物数据。两种最接近的关联标志物UMC1265和MMC0111位于染色体2上距离转基因插入物约20cM。

实施例5：事件DAS-40278-9中aad-1蛋白的表征

表征源自转基因玉米事件DAS-40278-9的重组aad-1蛋白的生物化学特性。使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE,用考马斯蓝染色和糖蛋白检测方法)、Western印迹、免疫诊断测试条测定法、基质辅助激光吸收/例子化飞行时间质谱术(MALDI-TOF MS)和串联MS的蛋白质测序分析来表征蛋白质的生物化学特性。

实施例5.1：免疫诊断条测定法

使用来自American Bionostica的商业制备的免疫诊断测试条确认DAS-40278-9的叶组织中aad-1蛋白的存在。所述条能够通过测试粗制叶提取物区分转基因和非转基因植物(数据未显示)。非转基因提取物(XHH13)不含可检测量的免疫反应性蛋白质。此结果也得到Western印迹分析确认。

为了测试aad-1蛋白表达，实施免疫诊断条分析。通过个别标记的1.5mL微量离心管的Snap-Cap盖间捏压组织从XHH13(对照植物)和事件DAS-40278-9的每个植物收集5个叶冲孔。在实验室接受后，将0.5mL aad-1提取缓冲液(American Bionostica,Swedesboro,NJ)添加至每管，并使用一次性杵棒，接着将样品摇动约10秒将组织均质化。在均质化后，将测试条在管中放置，并容许显现约5分钟。基于免疫诊断条上测试线的出现(或缺乏出现)确认植物提取物中aad-1蛋白的存在或缺乏。一旦对转基因事件确认aad-1蛋白表达，将玉米茎组织收获并冻干，并于约–80℃贮存，直到使用。

实施例5.2：从玉米纯化aad-1蛋白

制备经免疫纯化的、玉米衍生的aad-1蛋白(分子量：约33kDa)或来自玉米茎组织的粗制水性提取物。如下将所有叶和茎组织收获，并运输到实验室：将叶用剪刀从植物切割，并且布袋中放置，并于约-20℃贮存，供未来使用。分开地，将茎刚好在土壤线上切去，在布袋中放置，并立即于约-80℃冷冻约6小时。然后，将茎在冻干仪中放置5天以除去水。一旦将组织完全干燥，将它们在干冰情况下研磨成细粉末，并于约-80℃贮存，直到需要。

通过称出约30克冻干组织到冷却的1000mL玻璃混合器，并添加500mL提取缓冲液在基于磷酸盐的缓冲液(关于缓冲液组分，见表7)中从冻干的茎组织提取玉米衍生的aad-1蛋白。将组织在高上混合60秒，并通过以30,000×g将样品离心20分钟收获可溶性蛋白质。如描述的那样再提取团粒，并将上清液组合并过滤通过0.45μ滤器。将过滤的上清液于约+4℃加载到抗aad-1免疫亲和柱上，该免疫亲和柱与由Strategic Biosolution Inc.制备的单克隆抗体(MAb473F185.1;蛋白A纯化的;批次#:609.03C-2-4;6.5mg/mL(总共约35.2mg))(Windham,ME)(其与经CNBr活化的Sepharose4B(GE Healthcare,Piscataway,NJ)缀合)缀合。收集未结合的蛋白质，并将该柱用预冷冻的20mM碳酸氢铵缓冲液,pH8.0广泛清洗。用3.5M NaSCN,(Sigma,St.Louis,MO),50mM Tris(Sigma,St.Louis,MO)pH8.0缓冲液洗脱结合的蛋白质。收集7个5-mL级分，并将级分号2→7于+4℃针对10mM Tris,pH8.0缓冲液透析过夜。通过SDS-PAGE和Western印迹检查级分，并将剩余的样品于约+4℃贮存，直到用于后续分析。

表7：下表中列出本研究中使用的商品化参照物质：

通过SDSPAGE检查与免疫亲和柱结合的蛋白质，并且结果显示了洗脱级分含有大致分子量33kDa的aad-1蛋白。另外，还实施Western印迹，并在aad-1蛋白方面呈阳性。从约30g冻干茎材料分离玉米衍生的aad-1蛋白。

实施例5.3：SDS-PAGE和Western印迹

将来自事件DAS-40278-9和XHH13茎的冻干组织(约100mg)在2-mL微量离心管中称出，并用约1mL含有10%植物蛋白酶抑制剂混合物(Sigma,St.Louis,MO)的PBST(Sigma,St.Louis,MO)提取。通过添加4个小球轴承，并用Geno研磨样品1分钟促进提取。在研磨后，将样品以20,000xg离心5分钟，并将上清液与5倍Laemmli样品缓冲液(2%SDS,50mM Tris pH6.8,0.2mg/mL溴酚蓝,50%(w/w)含有10%新鲜添加的2-巯基乙醇的甘油)以4:1混合，并于约100℃加热5分钟。在短暂的离心后，将45μL上清液直接加载到Criterion细胞凝胶模块中装备的Bio-Rad Criterion SDS-PAGE凝胶(Bio-Rad,Hercules,CA)上。将微生物衍生的aad-1的阳性参照标准品以1mg/mL在PBST pH7.4中重悬，并用PBST进一步稀释。然后，将样品与具有5%2-巯基乙醇的Bio-Rad Laemmli缓冲液混合，并加工，如较早描述的。用Tris/glycine/SDS缓冲液(Bio-Rad,Hercules,CA)以电压150-200V进行电泳，直到染料前沿逼近凝胶末端。在分离后，将凝胶对半切割，并且将一个半份用Pierce GelCode Blue蛋白质染料染色，并在微型Trans-blot电泳转移室(Minitrans-blot electrophoretic transfer cell)(Bio-Rad,Hercules,CA)的情况中在恒定电压100伏特下将另一个半份电印迹到硝酸纤维素膜(Bio-Rad,Hercules,CA)达60分钟。转移缓冲液含有20%甲醇和来自Bio-Rad的Tris/甘氨酸缓冲液。对于免疫检测，用aad-1特异性多克隆兔抗体(Strategic Biosolution Inc.,Newark,DE,蛋白A纯化的兔多克隆抗体批次#:DAS F1197-151,1.6mg/mL)探查膜。使用山羊抗兔IgG(H+L)和碱性磷酸酶(Pierce Chemical,Rockford,IL)的缀合物作为二抗。使用SigmaFast BCIP/NBT底物来显色并显现免疫反应性蛋白质条带。将膜用水广泛清洗以停止反应，并用数字扫描仪(Hewlett Packard,Palo Alto,CA)捕捉结果的记录。

在荧光假单胞菌生成的aad-1中，主要的蛋白质条带(如在考马斯染色的SDS-PAGE凝胶上显现的)是约33kDa。如预期的，相应的玉米衍生的aad-1蛋白(事件DAS-40278-9)与微生物表达的蛋白质是大小相同的。可预测地，在aad-1蛋白外，植物纯化的级分含有少量的非免疫反应性杂质。共纯化的蛋白质有可能通过与柱基质的弱相互作用或者在严格洗脱条件下柱浸出单克隆抗体在柱上得到保留。其他研究人员还已经报告了溴化氰活化的Sepharose4B免疫吸附剂(Kennedy and Barnes,1983;Holroyde et al.,1976;Podlaski and Stern,2008)上肽和氨基酸的非特异性吸附。

假单胞菌衍生的aad-1蛋白根据多克隆抗体western印迹分析显示预期大小的阳性信号。这也在DAS-40278-9转基因玉米茎提取物中观察到。在aad-1western印迹分析中，在对照XHH13提取物中没有观察到免疫反应性蛋白质，并且在转基因样品中没有看到交替大小的蛋白质(聚集物或降解产物)。

实施例5.4：翻译后糖基化的检测

将经免疫亲和层析纯化的、玉米衍生的aad-1蛋白(级分#3)以4:1与5倍Laemmli缓冲液混合。将微生物衍生的aad-1、大豆胰蛋白酶抑制剂、牛血清清蛋白和辣根过氧化物酶用Milli-Q水稀释至植物衍生的aad-1的适当浓度，并与Bio-Rad Laemmli缓冲液混合。然后，将蛋白质于约95℃加热5分钟，并以20000×g离心2分钟以获得澄清的上清液。将所得的上清液直接应用到Bio-RadCriterion凝胶，并用XT MES运行缓冲液(Bio-Rad,Hercules,CA)电泳，基本上如上文描述的，只是电泳于170V运行约60分钟。电泳后，将凝胶对半切开，并用GelCode Blue染料依照制造商的方案对一个半份染色以得到总体蛋白质。在完成染色后，用Molecular Dynamics密度计扫描凝胶以获得凝胶的永久视觉记录。将凝胶的另一个半份用GelCode糖蛋白染色试剂盒(Pierce Chemical,Rockford,IL)依照制造商的方案染色以显现糖蛋白。在淡粉红色背景上以品红条带显现糖蛋白(具有低到每个条带0.625ng的检测限)。在完成糖蛋白染色后，将凝胶用Hewlett Packard数字扫描仪扫描以得到凝胶的永久视觉记录。在捕捉糖基化染色图像后，将凝胶用GelCode Blue染色以确认非糖基化蛋白质的存在。结果显示了玉米和微生物衍生的aad-1蛋白两者都没有可检出的共价连接的碳水化合物。此结果也得到肽质谱指纹术确认。

实施例5.5：玉米和假单胞菌衍生的aad-1的质谱术肽质量指纹术和测序

对假单胞菌和玉米衍生的aad-1进行质谱术分析。将源自转基因玉米茎(事件DAS-40278-9)的aad-1蛋白进行胰蛋白酶的溶液中消化，接着是MALDI-TOF MS和ESI-LC/MS。将检测肽的质量与那些基于在玉米衍生的aad-1蛋白序列中的潜在蛋白酶切割位点导出的质量比较。使用来自Proteometrics LLC的Protein Analysis Worksheet(PAWS)免费软件在计算机(insilico)中产生理论切割。aad-1蛋白(一旦变性)容易被消化酶消化，并且会生成许多肽峰。

在转基因玉米衍生的aad-1蛋白(事件DAS-40278-9)的胰蛋白酶消化物中，检测的肽片段几乎涵盖整个蛋白质序列，其仅缺乏在蛋白质的C端末端的一个小的胰蛋白酶消化(tryptic)片段F²⁴⁸至R²⁵³和一个短的(2个氨基酸)肽片段。此分析确认玉米衍生的蛋白质氨基酸序列与微生物衍生的aad-1蛋白的氨基酸序列匹配。这些分析的结果指示玉米衍生的aad-1蛋白的氨基酸序列与荧光假单胞菌表达的蛋白质等同。

实施例5.5.1：胰蛋白酶消化肽片段测序

在肽质谱指纹术外，将玉米衍生的aad-1蛋白(从玉米事件DAS-40278-9免疫亲和纯化)的N和C端的氨基酸残基测序，并与微生物衍生的蛋白质的序列比较。通过串联质谱术对微生物和玉米衍生的蛋白质的前11个残基获得蛋白质序列(表8)。这两种蛋白质的氨基酸序列是A'H A A L S P L S Q R''(SEQID NO:30)，显示N端甲硫氨酸已经通过氨肽酶除去(表8)。预期N端aad-1蛋白序列是M'A H A A L S P L S Q R^'2.(SEQ ID NO:31)。这些结果提示在玉米和荧光假单胞菌中翻译期间或之后，N端甲硫氨酸被甲硫氨酸氨肽酶(MAP)切割。MAP在蛋白质上的第二个残基较小，诸如Gly,Ala,Ser,Cys,Thr,Pro,和Val时快速切割甲硫氨酰基(methionyl)残基(Walsh,2006)。在除去的甲硫氨酸外，已经显示了aad-1蛋白的N端肽的小部分在切割N端甲硫氨酸后乙酰化(表8)。此结果经常在真核(植物)表达的蛋白质的情况下遇到，因为约80-90%N端残基是经修饰的(Polevoda and Sherman,2003)。还有，已经显示了在N端具有丝氨酸和丙氨酸的蛋白质最常是乙酰化的(Polevoda and Sherman,2002)。两个共翻译过程，即N端甲硫氨酸残基的切割和N端乙酰化是至今最常见的修饰，并且在大多数(约85%)真核蛋白上发生(Polevoda and Sherman,2002)。然而，证明与N端乙酰化有关的生物学意义的例子是罕见的(Polevodaand Sherman,2000)。

表8：玉米和微生物衍生的AAD-1蛋白的N端序列数据的汇总

¹荧光假单胞菌和玉米衍生的AAD-1的前12个氨基酸残基的预期N端序列。

²荧光假单胞菌和玉米衍生的AAD-1的检测的N端序列。

³关于N端肽的串联MS数据揭示AHAALSPLSQR(乙酰化)和N-乙酰基-AHAALSPLSQR(乙酰化)的混合物。也检出“不齐的(Ragged)N端末端”(对应于氨基酸序列HAALSPLSQR,AALSPLSQR,和ALSPLSQR的肽)。基于214nm测量的相应LC峰面积产生相对丰度，级相对肽片段量的估值。

注意：

上标中的数字(R^x)指示序列中氨基酸残基的编号。

氨基酸残基缩写：

在N-乙酰化外，还有略微的N端截短，其在玉米衍生的aad-1蛋白的纯化过程中出现(表8)。这些“不齐的末端”导致从玉米衍生的蛋白质损失氨基酸A²、H3和A4(以不同形式和量)。认为在纯化aad-1蛋白期间已经发生此截短，因为粗制叶提取物的Western印迹探针在与微生物衍生的aad-1蛋白相同的MW处含有单一易碎条带。用于Western印迹样品的提取缓冲液含有过量的蛋白酶抑制剂混合物，其含有具有抑制丝氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和金属蛋白酶和氨肽酶的宽特异性的蛋白酶抑制剂混合物。

如上文描述的，测定玉米和微生物衍生的aad-1蛋白的C端序列，并与预期的氨基酸序列比较(表9)。结果指示测量的序列与预期的序列相同，并且玉米和微生物衍生的aad-1蛋白两者是相同的，并且在C端是未改变的。

表9：玉米和微生物衍生的AAD-1蛋白的C端序列数据的汇总

¹荧光假单胞菌和玉米衍生的AAD-1的后10个氨基酸残基的预期C端序列。

²荧光假单胞菌和玉米衍生的AAD-1的检测的C端序列

注意：

上标中的数字(R^x)指示序列中氨基酸残基的编号。

氨基酸残基缩写：

A: 丙氨酸 G:甘氨酸

P: 脯氨酸 R:精氨酸

T: 苏氨酸 V:缬氨酸

实施例6：含有事件DAS-40278-9的杂种玉米系的田间表达、营养物组成分析和农艺学特征

本研究的目的是测定存在于玉米组织中的AAD-1蛋白水平。另外，对玉米材料和谷粒进行组成分析以调查同基因非转化玉米系和转基因玉米系DAS-40278-9(未喷雾的、用2,4-D喷雾的、用喹禾灵喷雾的、和用2,4-D和喹禾灵喷雾的)之间的等同性。还与DAS-40278-9玉米比较同基因非转化玉米系的农艺学特征。在位于美国和加拿大的主要玉米生产区内六个测试位置进行田间表达、组成、和农艺学试验。这些位置代表多种多样农艺学实践和环境条件的区域。试验位于爱荷华州(Iowa)、伊利诺斯州(Illinois)(2个位置)、印地安那州(Indiana)、内布拉斯加州(Nebraska)和加拿大安大略省。

对照、未喷雾的AAD-1、AAD-1+喹禾灵、AAD-1+2,4-D和AAD-1+这两种进入样品的所有位置均值数值在玉米的文献范围内。观察到未喷雾的AAD-1、AAD-1+喹禾灵、AAD-1+2,4-D或AAD-1+玉米和对照两者之间的有限数目的显著差异，但是认为差异不是有生物学意义的，因为它们是小的，并且结果在对商业玉米找到的范围内。组成结果的样地没有指示未喷雾的AAD-1、AAD-1+喹禾灵、AAD-1+2,4-D或AAD-1+玉米和对照玉米系两者之间的任何生物学有意义的处理相关组成差异。总之，未喷雾的AAD-1、AAD-1+喹禾灵、AAD-1+2,4-D或AAD-1+这两种玉米组成结果确认AAD-1(事件DAS40278-9)玉米与常规玉米系的等同性。

实施例6.1：测试的玉米系

表10中列出了含有DAS-40278-9事件的杂种种子和对照植物，该对照植物是与测试物质系相同遗传背景，但是不含DAS-40278-9事件的常规杂种种子。

表10：

测试进入	描述
		1	非aad-1对照
2	aad-1未喷雾的
		3	aad-1喷雾的w/喹禾灵
4	aad-1喷雾的w/2,4-D
		5	aad-1喷雾的w/2,4-D和喹禾灵

将上文描述的玉米植物在美国和加拿大的主要玉米生产区内的位置种植。六个田间测试机构，即Richland,IA;Carlyle,IL;Wyoming,IL;Rockville,IN;York,NE;和Branchton,Ontario,Canada(称为IA,IL1,IL2,IN,NE和ON)代表玉米的多种多样农艺学实践和环境条件的区域。

将测试和对照玉米种子以每行约24个种子的播种率种植，每行内的种子间隔约10英寸(25cm)。在每个位置，建立每个处理的4个重复样地，每个样地由2-25英尺行组成。将样品以随机化完全区组(RCB)设计排列，在每个位置具有独特的随机化。每个玉米样地以2行相似成熟度的非转基因玉米杂种为界。整个试验位置围绕有最少12行(或30英尺)相似相对成熟度的非转基因玉米杂种。

应用合适的昆虫、杂草、和疾病控制实践以生成农艺学可接受作物。对于所述位置，将每月最大值和最小值温度及降雨量和灌溉取平均值。这些范围通常是玉米生产中遇到的。

实施例6.2：除草剂应用

以每英亩约20加仑(187L/ha)的喷雾体积应用除草剂处理。这些应用设计为重复最大标签率(label rate)商业实践。表11列出使用的除草剂。

表11.

除草剂	TSN	浓度
			Weedar64	026491-0006	39%,3.76lb ae^a/gal,451g ae/l
Assure II	106155	10.2%,0.87lb ai^b/gal,104g ai/l

a ae=酸等同物。

b ai=活性成分。

将2,4-D(Weedar64)以3次撒施顶部上方应用对测试条目(Test Entry)4和5应用(季节总计3lb ae/A)。各次应用在出土前和约V4和V8–V8.5阶段。各次目标应用率是1.0lb ae/A(对于Weedar64)、或1120g ae/ha。实际应用率范围为1096–1231g ae/A。

将喹禾灵(Assure II)以单次撒施顶部上方应用对测试条目3和5应用。应用时机在约V6生长阶段。目标应用率是0.0825lb ai/A(对于Assure II)，或92gai/ha。实际应用率范围为90.8–103g ai/ha。

实施例6.3：农艺学数据收集和结果

在每个位置在区组2、3、和4内的所有测试条目记录农艺学特征。表12列出了测量的下列特征。

表12

注意：热单位=((最大温度+最小温度)/2)–50°F

对自对照、aad-1未喷雾、aad-1+2,4-D、aad-1+喹禾灵、和aad-1+两个条目收集的农艺学数据进行分析。对于位置间分析，在位置间汇总分析中对早期群体(V1和V4)、活力、最终群体、作物损伤、抽穗丝前时间、花费脱落前时间、茎倒伏、根倒伏、疾病发生率、昆虫损伤、成熟前时间、植物高度、和花粉存活力(形状和颜色)值没有观察到统计学显著差异(图13)。对于保持绿色和穗高度，在对照和aad-1+喹禾灵条目之间观察到显著的配对t检验，但是并不伴随显著的总体处理效果或假发现率(False Discovery Rate,FDR)校正的p值(表13)。

表13：DAS-40278-9aad-1玉米(喷雾的和未喷雾的)和对照的位置间农艺学特征结果的汇总分析

^a使用F检验评估总体处理效应。

^b使用t检验比较喷雾的和未喷雾的处理与对照。

^c使用假发现率(FDR)规程校正P值。

^d按1-9量表的视觉评估；9=具有较大的茁壮叶的较高植物。

^e0-100%量表；其中0=无损伤，且100=死亡植物。

^f从种植时已经积累的热单位数目。

^g0-100%量表；其中%具有皱缩壁的花粉粒。

^h0-100%量表；其中%具有强烈黄色颜色的花粉粒。

ⁱ按1-9量表的视觉评估，其中1没有可见绿色组织。

^j按1-9量表的视觉评估，其中1是较差的疾病抗性。

^k按1-9量表的视觉评估，其中1是较差的昆虫抗性。

^l NA=没有实施统计学分析，因为重复或处理间没有变化性。

^m以P值<0.05指示统计学差异。

实施例6.4：样品收集

收集用于表达和组成分析的样品，如表14中列出的。

表14.

实施例6.5：测定玉米样品中的aad-1蛋白

对玉米样品分析aad-1蛋白量。使用购自Beacon Analytical System,Inc.(Portland,ME)的酶联免疫吸附测定法(ELISA)试剂盒量化可溶性可提取性aad-1蛋白。

将玉米组织的样品从测试植物分离，并准备好通过粗磨、冻干并用Geno/研磨机(Certiprep,Metuchen,New Jersey)精细研磨(在必时)进行表达分析。花粉不需要额外制备。用含有含0.5%牛血清清蛋白(BSA)的去污剂Tween-20(PBST)的磷酸盐缓冲盐水溶液自玉米组织提取aad-1蛋白。对于花粉，用含有1mg/mL抗坏血酸钠和2%蛋白酶抑制剂混合物的0.5%PBST/BSA缓冲液提取蛋白质。将植物组织和花粉提取物离心；将水性上清液收集，在必要时用合适的缓冲液稀释，并使用aad-1ELISA试剂盒以三明治形式分析。试剂盒使用下列步骤。将稀释样品的等分试样和生物素化的抗aad-1单克隆抗体在用固定化抗aad-1单克隆抗体包被的微量滴定板的孔中温育。这些抗体与孔中的aad-1蛋白结合，并且与可溶性和固定化抗体之间结合的aad-1蛋白形成“三明治”。然后，通过用PBST清洗从板除去未结合的样品和缀合物。将过量的链霉抗生物素蛋白-酶(碱性磷酸酶)缀合物添加至孔以进行温育。在温育期结束时，通过清洗从板除去未结合的试剂。随后添加酶底物生成有色的产物。由于aad-1在抗体三明治物中结合，颜色显现的水平与样品中的aad-1浓度相关(即，较低的残留浓度导致较低的颜色显现)。使用Molecular Devices V-max或Spectra Max190读板仪测量405nm的吸光度。测试校准曲线，并使用与读板仪相容的Soft-MAX Pro^TM软件从多项式回归方程计算未知样品中的aad-1浓度。在一式两份孔中分析样品，其中报告一式两份孔的平均浓度。

表15中显示了多个玉米基质中aad-1蛋白浓度(位置间取平均值)的汇总。aad-1平均蛋白质浓度范围为R1阶段根中的2.87ng/mg干重至花粉中的127ng/mg。未喷雾的和喷雾的样品的表达结果是相似的。除了来自印地安那州位置的一个对照根样品外，在任何对照样品中没有检出aad-1蛋白。

表15：玉米组织中aad-1未喷雾、aad-1+喹禾灵、aad-1+2,4-D及aad-1+喹禾灵和2,4-D中测量的aad-1蛋白的均值浓度水平的汇总

^a ND=限于方法检测限(LOD)的数值。

^b圆括号中的数值在方法LOD和定量限(LOQ)之间。

实施例6.6：组成分析

用多种测试对玉米草料和谷粒的样品分析营养物含量。对草料实施的分析包括灰分、总脂肪、湿度、蛋白质、碳水化合物、粗纤维、酸性去污剂纤维、中性去污剂纤维、钙和磷。对谷粒实施的分析包括近似值(灰分、总脂肪、湿度、蛋白质、碳水化合物、粗纤维、酸性去污剂纤维)、中性去污剂纤维(NDF)、矿物、氨基酸、脂肪酸、维生素、次生代谢物和抗营养物。与文献(参见Watson,1982(4);Watson,1984(5);ILSI Crop Composition Database,2006(6);OECD Consensus Document on Compositional Considerations formaize,2002(7);and Codex Alimentarius Commission2001(8))中报告的数目比较对玉米草料和谷粒的营养物分析的结果。

实施例6.6.1：对草料的近似值、纤维和矿物分析

对来自对照、未喷雾的aad-1、aad-1+喹禾灵、aad-1+2,4-D和aad-1+两种条目的玉米草料样品中的蛋白质、脂肪、灰分、湿度、碳水化合物、ADF、NDF、钙和磷实施分析。表16中显示了所有位置间的结果的汇总。对于位置间和个别位置分析，所有近似值、纤维和矿物均值数值都在文献范围内。在对照和转基因条目之间在湿度、ADF、NDF、钙和磷方面在位置间分析中没有观察到统计学差异。对于蛋白质和灰分，对未喷雾的AAD-1(蛋白质)、aad-1+喹禾灵(蛋白质)、和aad-1+both(灰分)观察到显著的配对t检验，但是并不伴随显著的总体处理效果或FDR校正的p值。对于脂肪，与对照相比，对aad-1+喹禾灵观察到显著的配对t检验和校正的p值两者，但是没有观察到显著的总体处理效果。对于碳水化合物，在aad-1+喹禾灵和对照之间观察到统计学显著的总体处理效果、配对t检验和FDR校正的p值。还对于碳水化合物，观察到未喷雾的aad-1条目的显著配对t检验，但是没有显著的FDR校正的p值。这些差异没有生物学意义，因为这些分析物的所有位置间结果在对玉米报告的文献范围内，并且与对照的差异是小的(<23%)。

表16：对来自所有位置的玉米草料的近似值、纤维和矿物分析的汇总。

纤维

(%干重)

矿物

(%干重)

^a组合的范围。

^b使用F检验评估总体处理效果。

^c使用t检验比较转基因处理与对照。

^d使用假发现率(FDR)规程校正P值。

^e以P值<0.05标示统计学差异。

实施例6.6.2：谷粒的近似值和纤维分析

表17中显示了所有位置间玉米粒中近似值(蛋白质、脂肪、灰分、湿度、胆固醇和碳水化合物)和纤维(ADF、NDF和总膳食纤维)的结果汇总。近似值和纤维的所有结果在文献范围内，并且在对照和转基因条目之间在脂肪、灰分、NDF和总膳食纤维方面没有观察到位置间分析中的显著差异。对于湿度，观察到显著的总体处理效果，但是并不伴随显著的配对t检验或FDR校正的p值。对于ADF，对aad-1+所述两者观察到显著的配对t检验，但是没有看到显著的总体处理效果或FDR校正的p值。对于蛋白质和碳水化合物两者，对未喷雾的aad-1、aad-1+喹禾灵、和ad-1+所述两者发现显著的配对检验(pair-test)、校正的p值和总体处理效果。由于这些差异是较小的(<12%)，并且所有数值在文献数值内，认为差异没有生物学意义。

表17：来自所有位置的玉米粒的近似值和纤维分析的汇总。

纤维

(%干重)

^a组合的范围。

^b使用F检验评估总体处理效果。

^c使用t检验比较转基因处理与对照。

^d使用假发现率(FDR)规程校正P值。

^e以P值<0.05标示统计学差异。

^f NR=未报告

^g NA=没有实施统计学分析，因为大部分数据<LOQ。

实施例6.6.3：对谷粒的矿物分析

实施对玉米粒样品分析矿物钙、铬、铜、碘、铁、镁、锰、钼、磷、钾、硒、钠、和锌。表18中显示了所有位置间的结果汇总。所有结果在报告的文献范围内。对于位置间分析，对钙、铜、铁和钾没有观察到显著差异。铬、碘、硒和钠的均值结果低于方法的定量限。对于镁和磷，对未喷雾的aad-1和aad-1+喹禾灵条目观察到显著的配对t检验，但是不伴随显著的总体处理效果或FDR校正的p值。对于锰和钼，对未喷雾的aad-1观察到显著的配对t检验，但是没有找到显著的FDR校正的p值和总体处理效果。对于aad-1+这两种条目，对锌观察到显著的配对t检验，但是不存在显著的FDR校正的p值或总体处理效果。另外，来自对照的这些差异是较小的(<13%)，并且所有数值在文献范围(在可用时)内。

表18：来自所有位置的玉米粒的矿物分析的汇总

^a组合的范围。

^b使用F检验评估总体处理效果。

^c使用t检验比较转基因处理与对照。

^d使用假发现率(FDR)规程校正P值。

^e NA=没有实施统计学分析，因为大部分数据<LOQ。

^f以P值<0.05标示统计学差异。

实施例6.6.4：对谷粒的氨基酸分析

在对照、未喷雾的aad-1、aad-1+喹禾灵、aad-1+2,4-D和aad-1+两种玉米中对玉米样品分析氨基酸含量，并且表19中显示了在所有位置里及根据个别田间位置的结果汇总。所有氨基酸水平在报告的文献范围内，并且对精氨酸、赖氨酸和酪氨酸没有观察到位置间分析的显著差异。在位置间分析中对几种氨基酸观察到显著差异。在这些例子中，对照的氨基酸含量低于aad-1转基因系，其可以与aad-1系相比与对照谷粒中的总体更低的蛋白质含量相关。对于未喷雾的aad-1条目，对除了精氨酸、甘氨酸、赖氨酸、色氨酸和酪氨酸外的所有氨基酸找到显著的总体处理效果以及显著的配对t检验和FDR校正的p值。对于aad-1+喹禾灵条目，对除了精氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、赖氨酸、色氨酸和酪氨酸外的所有氨基酸找到显著的总体处理效果以及显著的配对t检验和FDR校正的p值。对于aad-1+2,4-D条目，对除了精氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、色氨酸和缬氨酸外的所有氨基酸找到显著的总体处理效果以及显著的配对t检验(及显著的FDR校正的p值)。对于aad-1+这两种条目，对除了精氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、色氨酸和酪氨酸外的所有氨基酸找到显著的总体处理效果以及显著的配对t检验和FDR校正的p值。虽然存在有对氨基酸观察到的许多差异，但是差异是较小的(<15%)，没有在所有位置间观察到，并且所有均值数值在报告的文献范围内。

表19：来自所有位置的玉米粒的氨基酸分析的汇总

^a组合的范围。

^b使用F检验评估总体处理效果。

^c使用t检验比较转基因处理与对照。

^d使用假发现率(FDR)规程校正P值。

^e以P值<0.05标示统计学差异。

实施例6.6.5：对谷粒的脂肪酸分析

实施对玉米粒样品分析脂肪酸。表20中显示了所有位置间的结果汇总。分析这些脂肪酸的对照、未喷雾的aad-1、aad-1+喹禾灵、aad-1+2,4-D和aad-1+两种玉米粒样品的所有结果在发表的文献范围内。辛酸(8:0)、癸酸(10:0)、月桂酸(12:0)、肉豆蔻酸(14:0)、肉豆蔻脑酸(myristoleic)(14:1)、十五烷酸(15:0)、十五碳烯酸(pentadecenoic)(15:1)、十七酸(heptadecanoic)(17:0)、十七碳烯酸(heptadecenoic)(17:1)、gamma亚麻酸(18:3)、二十碳二烯酸(20:2)、二十碳三烯酸(eicosatrienoic)(20:3)、和花生四烯酸(20:4)的结果低于方法定量限(LOQ)。在位置间分析中，对16:0棕榈酸、16:1棕榈油酸、18:0硬脂酸、18:2亚油酸、18:3亚麻酸、和20:0花生酸没有观察到显著差异。对于18:1油酸和20:1二十碳烯酸，对未喷雾的aad-1(18:1)和aad-1+2,4-D(18:1和20:1)条目观察到显著的配对t检验，但是并不伴随显著的总体处理效果或FDR校正的p值。对于22:0山酸(behenic)，对aad-1+2,4-D和aad-1+所述两者找到显著的总体处理效果和显著的配对t检验，但是不存在显著的FDR校正的p值。

表20：来自所有位置的玉米粒的脂肪酸分析的汇总

^a从单元%干重转化成%脂肪酸的结果。

^b组合的范围。

^c使用F检验评估总体处理效果。

^d使用t检验比较转基因处理与对照。

^e使用假发现率(FDR)规程校正P值。

^f NA=没有实施统计学分析，因为大部分数据<LOQ。

^g以P值<0.05标示统计学差异。

实施例6.6.6：对谷粒的维生素分析

测定来自对照、未喷雾的aad-1、aad-1+喹禾灵、aad-1+2,4-D和aad-1+两种玉米条目的玉米粒样品中的维生素A,B1,B2,B5,B6,B12,C,D,E,烟酸和叶酸水平。表21中显示了所有位置间的结果汇总。维生素B12、D和E通过使用的分析方法不可量化。对维生素报告的所有均值结果与报告的文献数值(在可用时)相似。没有报告的文献范围的维生素(维生素B5和C)的结果与获得的对照数值相似(与对照相差小于22%)。对于位置间分析，除了维生素B1、C和烟酸外，没有观察到统计学差异。在对照和未喷雾的aad-1、aad-1+喹禾灵、和aad-1+所述两者之间观察到维生素B1的显著配对t检验，但是并不伴随显著的总体处理效果或FDR校正的p值。对于维生素C，对aad-1+喹禾灵和aad-1+2,4-D观察到显著的总体处理效果以及显著的配对t检验和FDR校正的p值。对于烟酸类似地，对aad-1+喹禾灵和aad-1+所述两者观察到显著的总体处理效果以及显著的配对t检验和FDR校正的p值。对于aad-1+2,4-D条目也对烟酸找到aad-1+2,4-D的显著配对t检验，但是并不伴随显著的总体处理效果或FDR校正的p值。由于在位置间没有观察到差异并且数值在文献范围(在可用时)内，认为差异没有生物学意义。

表21：来自所有位置的玉米粒的维生素分析的汇总。

^a组合的范围。

^b使用F检验评估总体处理效果。

^c使用t检验比较转基因处理与对照。

^d使用假发现率(FDR)规程校正P值。

^e以P值<0.05标示统计学差异。

^f NR=未报告

^g NA=没有实施统计学分析，因为大部分数据<LOQ。

实施例6.6.7：对谷粒的抗营养物和次生代谢物分析

测定来自对照、未喷雾的aad-1、aad-1+喹禾灵、aad-1+2,4-D和aad-1+两种玉米条目的玉米粒样品中的次生代谢物(香豆酸、阿魏酸、糠醛和肌醇)和抗营养物(肌醇六磷酸、棉子糖、和胰蛋白酶抑制剂)水平。表22和23中显示了所有位置间的结果汇总。对于位置间分析，所有数值在文献范围内。对于肌醇和胰蛋白酶抑制剂在位置间分析中没有观察到aad-1条目和对照条目结果之间的显著差异。糠醛和棉子糖的结果低于方法的定量限。对于香豆酸(未喷雾的aad-1、aad-1+2,4-D和aad-1+所述两者)、和阿魏酸(aad-1+喹禾灵和aad-1+所述两者)观察到显著的配对t检验。这些差异并不伴随显著总体处理效应或FDR校正的p值，并且与对照相似(小于10%差异)。对肌醇六磷酸(未喷雾的aad-1)找到显著总体处理效应、配对t检验、和FDR校正的p值。由于所有结果在文献范围内并且与对照相似(小于11%差异)，认为这些差异没有生物学意义。

表22：来自所有位置的玉米粒的次生代谢物分析的汇总

^a组合的范围。

^b使用F检验评估总体处理效果。

^c使用t检验比较转基因处理与对照。

^d使用假发现率(FDR)规程校正P值。

^e以P值<0.05标示统计学差异。

^f NA=没有实施统计学分析，因为大部分数据<LOQ。

表23：来自所有位置的玉米粒的抗营养物分析的汇总

^a组合的范围。

^b使用F检验评估总体处理效果。

^c使用t检验比较转基因处理与对照。

^d使用假发现率(FDR)规程校正P值。

^e以P值<0.05标示统计学差异。

^f NA=没有实施统计学分析，因为大部分数据<LOQ。

实施例7：别的农艺学性状

在多种多样的环境间评估与近等值线(near-isoline)玉米系相比玉米系40278的农艺学特征。处理包括总共21个位置间测试的4个遗传独特的杂种及其合适的近等值线杂种。

4种测试杂种是范围为99至113天相对成熟度的中等至晚期成熟杂种。实验A在遗传背景近交系C x BC3S1转化中测试事件DAS-40278-9。此杂种具有109天的相对成熟度，并且在16个位置测试(表24)。实验B测试杂种背景近交系E x BC3S1转化，即113天相对成熟度杂种。使用与实验A略有不同的位置组在14个位置测试此杂种(表24)。实验C和D分别测试杂种背景BC2S1转化x近交系D和BC2S1转化x近交系F。这些杂种都具有99天相对成熟度，并且在相同的10个位置测试。

表24：农艺学性状的位置

对于每个试验，使用随机化完全区组设计，每个位置两个重组和两个行式样地。行长度是20英尺，并且以每行34个种子播种每行。在试验管理中使用标准的区域农艺学实践。

将数据收集，并分析8种农艺学特征；植物高度、穗高度、茎倒伏、根倒伏、最终群体、谷粒湿度、测试重量、和产率。参数植物高度和穗高度提供关于杂种外观的信息。百分比茎倒伏和根导入的农艺学特征决定杂种的可收获性。最终群体计数测量种子质量和影响产率的季节生长条件。收获时的百分比谷粒湿度限定杂种的成熟度、和产率(针对湿度校正的蒲式耳/英亩)和测试重量(1蒲式耳校正至15.5%湿度的玉米的以磅计的重量)描述杂种的繁殖能力。

使用线性模型在田间位置间进行方差分析。模型中包括条目和位置作为固定效应。探索包括位置和按条目的位置作为随机效应的固定模型，但是按条目的位置仅解释方差的小部分，并且其方差分量与0经常没有显著不同。对于杆(stock)和根倒伏，使用对数转化来稳定化方差，然而，按初始等级报告均值和范围。以95%置信水平声称显著性差异。使用t检验评估总体处理效果的显著性。

来自这些农艺学表征实验的结果可参见表2。对于穗高度、茎倒伏、根倒伏、谷粒湿度、测试高度、和产率的参数，与等值线对照相比对4种40278杂种之任一没有找到统计学显著差异(在p<0.05时)。最终群体计数和植物高度分别在实验A和B中在统计学上是不同的，但是与测试的其它40278杂种相比没有看到相似的差异。看到的一些变化可以是由于通过将DAS-40278-9事件回交到良种近交系中保留的低水平遗传变异性所致。测量参数的总体数值范围均在对传统玉米杂种获得的数值范围内，并且不会得出升高的杂草性(weediness)的结论。总之，农艺学表征数据指示40278玉米与常规玉米是生物学等同的。

表25:对农艺学特征的分析

实验A

实验B

表25：对农艺学特征的分析

实验C

实验D

实施例8：玉米事件DAS-40278-9插入位点用于靶向整合的用途

在田间条件下在几个世代里玉米事件DAS-40278-9转基因的一致的农艺学表现提示了玉米事件DAS-40278-9插入位点周围的这些鉴定的区域为感兴趣的其它转基因基因的靶向整合提供良好的基因组位置。此类靶向整合克服关于所谓“位置效应”的问题，及在转基因整合入宿主中后在基因组中创建突变的风险。此类靶向整合的其它优点包括但不限于降低在获得展现出期望水平的转基因表达的转基因植物前必须筛选并测试的转化事件的较大数目，而且还不展现出源自转基因对宿主基因组中重要基因座中的无意插入的异常。此外，此类靶向整合容许叠加转基因，使具有两种基因的良种植物系的育种更有效。

使用公开的教导，技术人员能够将感兴趣的多核酸靶向至染色体2上与玉米事件DAS-40278-9中的插入位点相同的插入位点或者靶向至与玉米事件DAS-40278-9中的插入位点极其接近的位点。一种此类方法披露于国际专利申请No.WO2008/021207，其通过提及完整并入本文。

简言之，使用多至20Kb在插入位点5′侧翼的基因组序列和多至20Kb在插入位点3’侧翼的基因组序列(其各部分参照SEQ ID NO:29鉴定)以在感兴趣的一种或多种基因侧翼，所述感兴趣的基因意图经由同源重组插入染色体2上的基因组位置中。感兴趣的一种或多种基因可以完全如在玉米事件DAS-40278-9插入位点中那样放置或者可以玉米事件DAS-40278-9插入位点周围的20Kb区内的任何地方放置以赋予一致的转基因表达水平，而对植物没有有害影响。可以经由本领域技术人员已知的几种方法之一将含有感兴趣的一种或多种基因和侧翼序列的DNA载体投递至植物细胞中，所述方法包括但不限于土壤杆菌介导的转化。可以通过几种方法之一进一步增强供体DNA载体对玉米事件DAS-40278-9靶位点的插入，所述方法包括但不限于共表达或上调重组增强基因或下调内源重组阻抑基因。此外，本领域中已知可以使用基因组中特定序列的双链切割来提高同源重组频率，因此可以通过表达天然的或设计的序列特异性内切核酸酶以切割这些序列来增强对玉米事件DAS-40278-9插入位点及其侧翼区的插入。如此，使用本文中提供的教导，可以将任何异源核酸在玉米染色体2上在位于实施例4中讨论的5’分子标志物和实施例4中讨论的3’分子标志物之间的靶位点处(优选地在SEQ IDNO:29内)和/或其区域处插入，如本文中别处讨论的。

实施例9：从玉米事件DAS-40278-9切除pat基因表达盒

除去选择标志物基因表达盒对靶向插入玉米事件DAS-40278-9的基因组基因座中是有利的。从玉米事件DAS-40278-9除去pat选择标志物容许在将多核苷酸靶向整合入后续玉米世代中的染色体4中再使用pat选择标志物。

使用公开的教导，技术人员能够从玉米事件DAS-40278-9切除感兴趣的多核酸。一种此类方法披露于临时美国专利申请No.61/297,628，其通过提及完整并入本文。

简言之，设计序列特异性内切核酸酶诸如锌指核酸酶，其识别、结合并切割在基因表达盒侧翼的特定DNA序列。通过将含有转基因锌指核酸酶表达盒的亲本植物与含有玉米事件DAS-40278-9的第二亲本植物杂交将性质核酸酶投递至植物细胞中。将所得的后代培养至成熟，并经由用含有草丁磷的除草剂的叶涂覆来分析pat表达盒的丧失。将对除草剂没有抗性的后代植物分子确认，并推进进行自花受精。在从自花受精获得的后代中分子确认pat表达盒的切除和除去。使用本文中提供的教导，可以将任何异源核酸在玉米染色体2上在位于如实施例4中讨论的5’分子标志物和3’分子标志物之间的靶位点处(优选地在SEQ ID NO:29内)和/或其指定区域处切除。

实施例10：对脆断(brittlesnap)的抗性

脆断指通常在快速生长期期间在应用生长调节除草剂后疾风对玉米茎的破坏。对含有事件DAS-40278-9的杂种玉米和不含事件DAS-40278-9的对照玉米实施机械“推动(push)”测试(其使用棒来物理推动玉米以模拟由于疾风所致的损害)。在4个不同地理位置完成处理，并且重复四次(除了一个仅重复三次的试验外)。样地由8行组成：4个各两个杂种的行，两个含有事件DAS-40278-9的行和两个没有事件的行。每行的长度是20个英尺。将玉米植物培养至V4发育阶段，并以1120g ae/ha、2240g ae/ha和4480g ae/ha率应用含有2,4-D(Weedar64,Nufarm Inc.,Burr Ridge,IL)的商业除草剂。应用除草剂后7天，实施机械推动测试。用于脆断的机械推动测试由用4英尺棒向下推动两行玉米以模拟风损害组成。棒的高度和行进速度设置为给未处理的植物提供低水平的茎断裂(10%或更小)以确保测试足够严重以证明处理间差异的。面向倾斜玉米应用脆断处理的方向性。

两个试验位置在应用2,4-D除草剂后2-3天经历疾风和雷暴。在连续两天，雷暴在Huxley IA开始。在田间样地位置报告风速为2至17m s^-1，高速度为33m s^-1。风向是变化的。在一天时，在Lanesboro MN报告雷暴。在此田间样地位置报告高速的风。另外，这两个风暴都下雨。雨和风的组合促成报告的脆断损伤。

通过对损伤百分比视觉分级进行源自机械推动测试(及严酷天气)的脆断损害的评估。在机械脆断棒处理前，对含有事件DAS-40278-9的杂种玉米和对照进行植物竖立计数(plant stand count)。脆断棒处理后几天，再评估样地竖立计数。测定样地内倾斜百分比和降低竖立的百分比(表26)。来自试验的数据表明在应用2,4-D后与空植物相比，含有事件DAS-40278-9的杂种玉米不太具有脆断倾向。

表26：DAS-40278-9玉米对2,4-D胺的V4应用的脆断耐受性。对含有事件DAS-40278-9的杂种玉米植物计算脆断百分比，并与不含事件的对照植物比较。

¹在两个试验中在应用后2-3天发生雷暴和疾风

²处理在随机化完全区组设计中重复四次(仅一个实验完成三次重复)

³针对在未处理中的发生校正的均值(未处理意味着迫使为0)

实施例11：对谷粒的蛋白质分析

与不含事件的对照植物相比，从含有事件DAS-40278-9的杂种玉米生成具有增加的总蛋白质含量的谷粒。进行两个连续多位置田间试验，其包含未喷雾和用三种不同除草剂组合的除草剂处理。在8个统计学比较之7中，DAS-40278-9事件生成具有显著较高的总蛋白质含量的谷粒(表27)。通过分析个别氨基酸确证此数据。

表27：来自多位置田间试验的谷粒的蛋白质含量

实施例12：别的农艺学性状

在生长季的多种多样的地理环境间从多个田间试验收集与近等值线玉米相比含有事件DAS-40278-9的杂种玉米的农艺学特征。将数据收集，并分析农艺学特征，如实施例7中描述的。表28中列出了与空植物相比含有事件DAS-40278-9的杂种玉米系的结果。另外，表29中描述了在发育的V3阶段用除草剂喹禾灵(280g ae/ha)喷雾且在发育的V6阶段喷雾2,4-D(2,240g ae/ha)的含有事件DAS-40278-9的杂种玉米系和空植物的农艺学特征。

表28：与近等值线对照相比含有事件DAS-40278-9的杂种玉米的产率、百分比湿度、和最终群体结果。

表29：与近等值线对照相比含有事件DAS-40278-9的杂种玉米系的产率、百分比湿度、百分比杆倒伏、百分比根倒伏和总体群体。

实施例13：种植前和/或出土前应用

种植前烧毁除草剂应用意图在种植给定作物前杀死在冬季或春季早期里出现的杂草。通常，在不整地种植(no-till)或降低的耕种管理系统(其中在种植前不完成杂草的物理除去)中应用这些应用。因此，除草剂项目必须控制在种植时存在的非常宽范围的阔叶和禾本科杂草。草甘膦、对草快(gramoxone)、和草丁磷是广泛用于种植前烧毁除草剂应用的非选择性、非残留除草剂的例子。

然而，一些杂草在此季节时由于下列一项或多项而难以控制：杂草物种或生物型对除草剂的固有不敏感性、冬季一年生杂草的相对较大尺寸、和限制除草剂摄取和活性的冷气候。几种除草剂选项可用于具有这些除草剂的罐混合物以提高范围和对杂草的活性，其中非选择性除草剂是较弱的。例子会是具有草甘膦的2,4-D罐混合物应用以帮助控制小白酒草(Conyza canadensis)(加拿大蓬(horseweed))。为了种植前烧毁控制存在的大多数杂草，可以使用420至1680g ae/ha，更通常560至840g ae/ha的草甘膦；然而，可以应用280-1120g ae/ha2,4-D以帮助控制许多阔叶杂草物种(例如加拿大蓬)。

2,4-D是一种选择的除草剂，因为它对非常宽范围的阔叶杂草是有效的，即使在较低的温度时有效的，且非常便宜。然而，若后续作物是敏感性双子叶作物，则土壤中的2,4-D残留物(尽管短暂)可以负面影响作物。含有aad-1基因的作物对2,4-D是耐受性的，并且不受土壤中的2,4-D残留物负面影响。罐混合物(或商业预混合物)配偶体的升高的灵活性和降低的成本会改善杂草控制选项，并且在重要的不整地种植和降低的耕种情况中提高烧毁应用的稳健性(robustness)。

aad-1玉米(corn)

在田间对含有编码芳氧基链烷酸酯加双氧酶(AAD-1)蛋白的aad-1基因的转基因杂种玉米(pDAS1740-278)评估对2,4-D的出土前应用的耐受性。使用随机化完全区组设计在密西西比、印地安那州和明尼苏达州的多个位置进行试验，所述随机化完全区组设计在每个位置具有两行样地的三次重复，长度约6m。将经除草剂处理的样地与未处理的样地配对以提供出土和早期季节生长的精确评估。在种植后不久但在作物出土前(种植后0-2天)应用1120,2240,and4480g ae/ha2,4-D胺的除草剂处理。表30中含有这些试验的土壤和降水量信息。

表30：用于评估pDAS1740-278杂种对出土前除草剂应用的耐受性的土壤和降雨信息。

种植和应用2,4-D后约16-21天，在比率从1120增加至4480g ae/ha2,4-D胺时，常规对照杂种的损伤平均值为12至31%。对含有pDAS1740-278的杂种玉米的损伤在相同等级范围间范围为3至9%。对含有aad-1基因的转基因杂种玉米(pDAS1740-278)目前提出的2,4-D目标应用率处于或低于1,120g ae/ha(对于2,4-D)。田间测试结果指示含有pDAS1740-278的杂种玉米在最小损害的情况下在提出的目标使用率2至4倍的比率时提供强力的对2,4-D除草剂处理的耐受性(表31)。

表31：pDAS1740-278杂种对出土前应用2,4-D的耐受性。

^aae=酸当量,ha=公顷

^b在种植后0-2天，即在作物出土前应用

^c在应用后16-21天进行评估

在种植前7天、15天、或30天时对含有aad-1基因的杂种玉米和常规对照杂种以1120、2240、4480g ae/ha的比率应用2,4-D胺的出土前应用。使用本领域公认的规程对位于地理上独特地点的田间样地应用出土前应用。将经除草剂处理的样地与未处理的样地配对以提供对出土和早期季节生长的精确评估。种植后约16-21天且种植前7、15或30天的2,4-D应用；测量常规玉米杂种和含有aad-1的杂种玉米的损伤。田间测试结果指示含有aad-1的杂种玉米提供对种植前7、15或30天时2,4-D除草剂的出土前处理的强力耐受性。

aad-1棉

在田间对含有编码芳氧基链烷酸酯加双氧酶(AAD-1)蛋白的aad-1基因的转基因棉评估对2,4-D的出土前应用的耐受性。试验由三个重复组成，并且在密西西比、乔治亚州、田纳西州、和阿肯色州的多个位置进行。使用长度约10英尺(对于密西西比试验为20英尺)的以保护行分开的单行的随机化完全区组设计。每英尺使用8个种子种植种子，然后，将植物用手变稀至3.5个植物/英尺行。将经除草剂处理的样地与未处理的样地配对以提供出土和早期季节生长的精确评估。所有样地在应用24小时内接受至少1/2英寸雨水或灌溉水。在种植后不久但在作物出土前应用560、1120、2240、和4480g ae/ha2,4-D胺(WEEDAR64,Nufarm,Burr Ridge,Il)的除草剂处理。表32中含有这些试验的土壤和降雨信息。

表32：用于评估含有aad-1的棉的土壤和降雨信息。

与未处理的样地相比，以560、1120和2240gm ae/ha的2,4-D出土前应用没有显著影响含有aad-1基因的转基因棉的植物竖立。

种植后约7至8天且以560、1120、2240和4480gm ae/ha浓度出土前应用2,4-D，与未处理对照的竖立降低相比对含有aad-1的棉分别报告3%、无降低、19%、和34%的竖立降低。在种植后11至14天且以浓度560、1120、2240、和4480gm ae/ha应用2,4-D，与未处理对照的竖立降低相比对含有aad-1的棉分别报告5%,2%,14%,和25%的竖立降低。

以浓度560,1120,2240和4480gm ae/ha出土前应用2,4-D没有引起偏上性。对于2240和4480gm ae/ha处理在应用后7-8天以<5%视觉评级观察到缺绿症。在应用后7至8天时对560和1120gm ae/ha处理没有检出缺绿症。此外，对于该季节的剩余部分，在用浓度560,1120,2240和4480gm ae/ha处理的任何含有aad-1的棉中没有检出缺绿症(chlorosis)。

以浓度560和1120gm ae/ha出土前应用2,4-D导致小于2%的最小生长抑制(其与未处理的对照样地是统计学不显著的)。这些结果贯穿整个实验是一致的：应用后7至8；11至14；27至30；及52至57天。以浓度2240gm ae/ha出土前应用2,4-D导致<10%的生长抑制。以浓度4480gm ae/ha出土前应用2,4-D在应用后7至8、11至14、27至30、和52至57天评级时导致27%,28%,17%和8.3%的生长抑制。

由以浓度560和1120gm ae/ha出土前应用2,4-D引起的损伤与未处理的对照样地不是显著不同的。对用浓度2240gm ae/ha的2,4-D处理的aad-1棉植物的损伤评级在试验过程里范围为3%至15%。对用浓度4480gm ae/ha的2,4-D处理的aad-1棉植物的损伤评级在试验过程里范围为8%至34%。

在已经以浓度560,1120,2240和4480gm ae/ha用2,4-D的出土前应用处理的aad-1棉中没有检出植物高度、结实(fruiting)方式、和产率的差异。

在种植前7天、15天或30天时以比率560,1120,2240,4480g ae/ha对含有aad-1基因的棉和对照棉应用2,4-D胺的出土前应用。使用本领域公认的规程对位于地理上独特位置的田间样地应用出土前应用。将经除草剂处理的样地与未处理的样地配对以提供出土和早期季节生长的精确评估。在种植后且在种植前7,15或30天的2,4-D应用；测量含有aad-1基因的棉和对照的损伤。田间测试结果指示含有aad-1基因的棉提供对种植前7,15或30天时2,4-D除草剂出土前处理的耐受性。

本实施例讨论了可用的许多选项中的一些。举例而言，杂草控制领域技术人员通过利用联邦除草剂标签(CPR,2003)中描述的产品和Agriliance CropProtection Guide(2003)中描述的用途会注意到多种其它应用，包括但不限于对草快(gramoxone)+2,4-D或草丁磷+2,4-D。本领域技术人员还会认可上述例子可以应用于任何2,4-D敏感性(或其它苯氧基生长素除草剂)作物，其会得到AAD-1(v3)基因(在稳定转化时)保护。

Claims

1.一种控制杂草的方法，所述方法包括在某个区域中种植种子，并在所述区域中种植种子前30天内或者在自所述区域中种植的所述种子出现作物前30天内对所述区域应用芳氧基链烷酸酯除草剂，所述种子包含编码AAD-1蛋白的多核苷酸，所述AAD-1蛋白与由SEQ ID NO:29编码的AAD-1蛋白具有至少75%同一性。

2.权利要求1的方法，其中所述除草剂选自下组：2,4-D；2,4-DB；MCPA；MCPB；和芳氧苯氧基丙酸酯。

3.权利要求1的方法，其中所述方法包括对所述区域应用第二种除草剂。

4.权利要求3的方法，其中所述第二种除草剂选自下组：草丁磷(glufosinate)、草甘膦(glyphosate)、和麦草畏(dicamba)。

5.权利要求1的方法，其中所述区域是田地，且在应用所述除草剂的7天、11天、14天或15天内应用所述除草剂。

6.权利要求1的方法，其中使用所述方法来控制所述区域中的草甘膦抗性杂草，其中将所述种子培养成进一步包含草甘膦耐受性性状的植物，且所述方法包括对所述区域的至少一部分应用芳氧基链烷酸酯除草剂。

7.权利要求1的方法，其中所述除草剂是苯氧基生长素。

8.权利要求6的方法，其中从具有草甘膦的罐混合物应用所述除草剂。

9.权利要求6的方法，其中至少一种所述杂草是与所述植物不同的物种的草甘膦抗性自生植物。

10.权利要求1的方法，其中所述杂草在栽培下的区域中，所述区域包含多个自所述种子种植的植物，所述方法包括在植物顶部上方应用芳氧基链烷酸酯除草剂。

11.权利要求10的方法，所述方法包括在出土前、出土后、或出土前和出土后对所述植物、所述植物的部分、和/或所述栽培下的区域应用所述除草剂。

12.权利要求10的方法，所述方法包括与第二除草剂联合或分开应用所述除草剂。

13.权利要求11的方法，所述方法包括与第二除草剂联合或分开应用所述除草剂。

14.权利要求1的方法，其中所述芳氧基链烷酸酯除草剂是2,4-D胺，且以选自下组的范围内的比率应用所述2,4-D胺：560、1120、2240、和4480gae/ha。

15.权利要求4的方法，其中以420至1680g ae/ha的比率应用所述草甘膦。

16.权利要求15的方法，其中以560至840g ae/ha的比率应用所述草甘膦。

17.权利要求1的方法，其中所述芳氧基链烷酸酯除草剂是2,4-D胺，且以280-1120g ae/ha的比率应用所述2,4-D胺。

18.权利要求1的方法，其中所述种子来自选自下组的植物：玉米植物、棉植物、稻植物、和大豆植物。

19.权利要求1的方法，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO:29。

20.权利要求1的方法，其中所述种子包含基因组，该基因组包含以登录号PTA-10244保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的种子中存在的AAD-1事件DAS-40278-9。

21.权利要求1的方法，其中应用所述除草剂在种植所述种子前。

22.权利要求1的方法，其中种植所述种子在应用所述除草剂前。

23.权利要求22的方法，其中在种植后0-2天应用所述除草剂。