CN102711444B - Aad-12事件416、相关的转基因大豆系及其事件特异性鉴定 - Google Patents

Abstract

本发明包括关于大豆植物中的除草剂耐受性的新的aad-12转化事件，在本文中称为pDAB4468-0416。本发明包括插入大豆细胞基因组内的特定位点中的异源多核苷酸。在一些实施方案中，所述事件/多核苷酸可以与其它性状，包括例如其它除草剂耐受性基因和/或昆虫抑制性蛋白“叠加”。另外，本发明提供了用于检测样品(例如大豆)中的主题事件的存在的测定法。该测定法可以基于插入大豆基因组中的重组构建体的DNA序列及在插入位点侧翼的基因组序列。还提供了可用于进行所述测定法的试剂盒和条件。

Description

AAD-12事件416、相关的转基因大豆系及其事件特异性鉴定

发明背景

aad-12基因(最初来自食酸戴尔福特菌(Delftia acidovorans))编码芳氧基链烷酸酯加双氧酶(aryloxyalkanoate dioxygenase,AAD-12)蛋白。该性状赋予对例如2,4-二氯苯氧基乙酸及对吡啶基氧基乙酸酯(pyridyloxyacetate)除草剂的耐受性。关于植物中的除草剂耐受性的aad-12基因自身在WO 2007/053482中第一次披露。

异源或外来基因在植物中的表达受到外来基因在何处插入染色体中影响。例如，这可以是由于染色质结构(例如，异染色质)或转录调节元件(例如，增强子)接近整合位点的接近性(Weising等,Ann.Rev.Genet 22:421-477,1988)。相同类型的转基因植物(或其它生物体)中的相等基因可以在不同事件间展现出表达水平的广泛变化。还可能存在着空间或时间表达样式的差异。例如，转基因在多个植物组织中的相对表达差异可以不对应于自存在于导入的基因构建体中的转录调节元件预期的样式。

如此，经常创建大量事件，并筛选以鉴定以对于给定的目的满意的水平表达导入的感兴趣基因的事件。对于商业目的，生成成百上千个不同事件，并对那些事件筛选具有期望的转基因表达水平和样式的单一事件是常见的。具有期望的转基因表达水平和/或样式的事件可用于使用常规的育种方法通过有性异型杂交(outcrossing)将转基因基因渗入(outcross)其它遗传背景中。此类杂交的后代维持初始转化体的转基因表达特征。使用此策略来确保充分适应于地方生长条件的许多品种(variety)中的可靠基因表达。

美国专利申请20090130071涉及大豆事件MON87701及检测方法。美国专利申请20090036308和20080051288涉及大豆事件3560.4.3.5及检测方法。美国专利申请20080312082涉及大豆事件DP-305423-1及检测方法。美国专利申请200602829 1 5涉及大豆事件MON89788及检测方法。

先前尚未披露具有本文中所公开的特定事件的AAD-12大豆。

发明概述

本发明涉及具有以保藏号PTA-10442保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的种子的称作DAS-68416-4的AAD-12大豆(Glycine max)事件，及其衍生的后代。本发明的其它方面包括大豆事件DAS-68416-4的后代植物、大豆、种子、和/或植物的可再生部分及种子和后代，以及自其任一种制成的食物或饲料产品。本发明还包括大豆事件DAS-68416-4的植物部分，其包括但不限于花粉、胚珠、花、枝条、根、和叶及营养细胞、花粉细胞、和卵细胞的细胞核。本发明进一步涉及对苯氧基生长素和/或芳氧基链烷酸酯除草剂(无论那些除草剂是否对大豆植物过多(over-the-top)应用，对邻近或附近的土壤、或对邻近或附近的杂草应用)具有耐受性的大豆植物、大豆事件DAS-68416-4的新遗传组成、和包含大豆事件DAS-68416-4的大豆植物的农艺学性能方面。

本发明部分涉及植物育种和除草剂耐受性植物。本发明包括大豆植物中的新的aad-12转化事件，其包含插入大豆细胞基因组内的特定位点中的多核苷酸序列，如本文中所描述的。

在一些实施方案中，所述事件/多核苷酸序列可以与其它性状，包括例如其它除草剂耐受性基因和/或昆虫抑制性蛋白“叠加”。然而，本发明包括具有单一事件的植物，如本文中所描述的。在本发明的一个具体的实施方案中，为了控制各种除草剂抗性杂草(例如，草甘膦抗性杂草)，将一种或多种除草剂耐受性性状与大豆事件DAS-68416-4叠加。

另外，本发明提供了用于检测(例如大豆)样品中的主题事件的存在的测定法。该测定法可以基于插入大豆基因组中的重组构建体的DNA序列及基于在插入位点侧翼的基因组序列。还提供了可用于进行该测定法的试剂盒和条件。

如此，本发明部分涉及整个aad-12插入物及其边界区(在转基因大豆系中)的DNA序列的克隆和分析。这些序列是独特的。基于这些插入和边界序列，生成事件特异性引物。PCR分析表明可以通过分析用这些事件特异性引物组生成的PCR扩增子来鉴定这些事件。如此，可以使用这些和其它相关规程来唯一地鉴定包含本发明的事件的大豆系。

附图简述

图1显示了pDAB4468的质粒图。

图2显示了大豆事件的基因组DNA的图，其中将DAS-68416-4用EcoRV或Pvu II消化，并用于生成相应的GENOMEWALKER^TM文库，其作为模板用于扩增靶DNA序列。

图3描绘了用于确认大豆事件DAS-68416-4从5’至3’边界的全长序列的引物位置。

图4描绘了用于确认大豆事件DAS-68416-4从5’至3’边界的全长序列的引物位置。

图5描绘了用于确认AAD-12大豆事件DAS-68416-4的插入位点序列的引物位置。

图6显示了遍及整个植物生命周期的表达水平。

表的简述

表1提供了就事件DAS-68416-4的插入和侧翼序列SEQ ID NO:1而言的残基编号方式。

表2提供了在Southern分析中使用的探针的位置和长度。

表3提供了在Southern印迹分析中预测的和观察到的杂交片段。

表4提供了用于对大豆事件DAS-68416-4进行基因组步行(walking)以扩增侧翼边界区的条件。

表5提供了用于大豆事件DAS-68416-4中的边界区和事件特异性序列的标准PCR扩增的条件。

表6提供了关于T链插入物的扩增子1-4的引物描述。

表7提供了用于大豆事件DAS-68416-4中的边界区和事件特异性序列的标准PCR扩增的PCR混合物。

表8提供了自美国和加拿大在2008年期间生成的大豆事件DAS-68416-4收集的组织中的AAD-12蛋白水平汇总。

表9提供了用于Southern分析的探针的位置和长度。

表10提供了Southern印迹分析中预测的和观察到的杂交片段。

表11提供了实验1中评估的农艺学参数。

表12提供了对来自实验1的工艺学特征的分析。

表13提供了在2009年的农艺学和田间试验中收集的数据。

表14提供了位置间的2009年农艺学特征结果的汇总。

表15提供了对来自实验1的发病率和昆虫损害的分析。

表16提供了在DAS-68416-4和常规大豆试验中观察到的疾病和昆虫应激源(stressor)。

表17提供了在温暖和寒冷条件下萌发大豆事件DAS-68416-4种子。

表18提供了对大豆饲料的近似、纤维和矿物分析的汇总。

表19提供了对大豆粒的近似和纤维分析的汇总。

表20提供了对大豆粒的矿物分析的汇总。

表21提供了对大豆粒的氨基酸分析的汇总。

表22提供了对大豆粒的脂肪酸分析的汇总。

表23提供了对大豆粒的维生素分析的汇总。

表24提供了对大豆粒(grain)的异黄酮分析的汇总。

表25提供了对大豆粒的抗营养物(抗营养物)分析的汇总。

表26提供了关于2,4-D出土前(preemergence)耐受性试验的位置和处理信息。

表27显示了对2,4-D的出土前应用的DAS-68416-4大豆耐受性。

序列简述

SEQ ID NO:1提供了主题大豆事件DAS-68416-4的插入物和侧翼序列。

SEQ ID NO:2-28是如本文中所描述的引物。

SEQ ID NO:29和30是侧翼SNP标志物BARC-019093-03299和BARC-044607-08736，如本文中所描述的。

发明详述

本发明部分涉及植物育种和除草剂耐受性植物。本发明包括大豆植物(大豆)的新转化事件，其包含插入大豆细胞基因组内的特定位点中的主题aad-12多核苷酸序列，如本文中所描述的。在一些实施方案中，例如，所述多核苷酸序列可以与其它性状(诸如其它除草剂耐受性基因和/或编码昆虫抑制性蛋白的基因)“叠加”。然而，本发明包括具有单一事件的植物，如本文中所描述的。

另外，本发明提供了用于检测样品中的主题事件的存在的测定法。本发明的各方面包括设计和/或生成本文中例示或提示的任何诊断核酸分子，特别是那些完全或部分基于主题侧翼序列的核酸分子的方法。

更具体地，本发明部分涉及转基因大豆事件DAS-68416-4、包含这些事件的植物系、和此插入物和/或其边界区的DNA序列的克隆和分析。可以使用本文中公开且提示的序列来检测本发明的植物系。

在一些实施方案中，本发明涉及除草剂耐受性大豆系及其鉴定。本发明部分涉及检测主题事件的存在以测定有性杂交的后代是否含有感兴趣的事件。另外，包括用于检测所述事件的方法，并且例如对于遵守要求上市前批准的规则及标记源自例如重组作物植物的食品是有帮助的。有可能通过任何公知的核酸检测方法诸如聚合酶链式反应(PCR)或使用核酸探针的DNA杂交来检测主题事件的存在。事件特异性PCR测定法例如由Windels等(Med.Fac.Landbouww，Univ.Gent 64/5b:459462,1999)讨论。这涉及使用跨越插入与侧翼DNA间的连接的引物组通过PCR来鉴定草甘膦耐受性大豆事件40-3-2。更具体地，一条引物包含来自插入物的序列，而第二条引物包含来自侧翼DNA的序列。

通过对编码芳氧基链烷酸酯加双氧酶(AAD-12)蛋白的aad-12基因(源自食酸戴尔福特菌)的插入来修饰大豆。该性状赋予对2,4-二氯苯氧基乙酸和吡啶基氧基乙酸酯除草剂的耐受性，并且可以在植物转化期间及在育种圃中作为选择标志物使用。

更具体地，本文中描述了AAD12事件pDAB4468-0416及其在世代间在全植物和分子水平的稳定性和表达方面的选择和表征。

依照本发明使用的主题合成基因(aad-12)源自食酸戴尔福特菌，并且编码能够使具有芳氧基链烷酸酯模块的几种除草剂，包括苯氧基生长素(例如2,4-D，MCPA)及吡啶基氧基生长素(例如氟草烟(fluroxypyr)、定草酯(triclopyr))灭活的酶。经由根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)技术来将aad-12基因(由atUbi10启动子驱动)导入大豆系Maverick中。将转基因T0植物自花传粉4-6代。平行地，还将aad-12基因基因渗入良种大豆品种中。在含有的且受调节的田间苗圃和实验室背景中对所有转基因事件表征4-5个世代。

已经对事件pDAB4468-0416插入物的两个末端测序并表征。开发出事件特异性测定法。还已经将其定位至大豆基因组(大豆染色体4)上；侧翼SNP标志物在本文中称为SEQ ID NO:29和30。将事件基因渗入别的良种系中。事件提供针对2,4-D和草丁磷(glufosinate)的耐受性。

由atUbi10启动子驱动，经由根癌土壤杆菌技术产生超过100个AAD12T1Maverick大豆事件。经由5个自花传粉世代和几次回交世代的单个谱系选择来选择事件pDAB4468-0416。它在形态学上是正常的，并且遍及每个自花传粉世代在V3时耐受2240g ae/ha 2,4-D喷雾。该事件以单一显性基因(dominated gene)遗传，并且在自花传粉世代和回交世代中也具有正常的孟德尔分离。

发现了事件pDAB4468-0416与全长植物转录单元(PTU)具有单一整合。自载体主链没有发现抗生素抗性基因序列，并且在aad-12基因纯合和半合子状态遍及几个世代没有检出基因沉默。aad-12基因以预期的水平表达，这导致2,4-D耐受性水平。所述事件遍及整个世代及在给定世代内的同胞谱系中稳定表达aad-12基因。

如上文在背景部分中暗示的，将转基因导入并整合入植物基因组中牵涉一些随机事件(因此，表述的给定插入的名称“事件”)。也就是说，凭借许多转化技术诸如土壤杆菌属(Agrobacterium)转化、“基因枪”和WHISKERS，无法预测转基因会在基因组中在何处被插入。如此，鉴定插入物两侧的侧翼植物基因组DNA对于鉴定具有给定插入事件的植物可以是重要的。例如，可以设计如下的PCR引物，其生成在遍及插入物与宿主基因组的连接区的PCR扩增子。可以使用此PCR扩增子来鉴定独特或不同类型的插入事件。

因为“事件”最初是随机事件，所以作为本公开内容的一部分，包含该事件的大豆系的至少2500个种子已经保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC),10801University Boulevard,Manassas,VA,20110，并且公众在没有限制的情况下(但是受限于专利权)可获得。保藏物已经称为ATCC保藏号PTA-10442。25个小瓶的大豆种子(AAD-12事件pDAB4468-0416)以DowAgroSciences LLC的名义于2009年10月22日保藏。保藏物在2009年11月2日进行测试，并且在该日期，种子是能活的。生成此保藏物，并且会依照布达佩斯条约为了专利规程的目的就种子保藏物而言的条款及在该条款下维持。保藏物会无限地在ATCC储藏所(其是一所公共储藏所)维持一段30年的时间或者最近请求后五年或本专利的有效使用期(取较长者)，并且如果保藏物在该期间变成无存活力，则会替换。

保藏的种子是本发明的一部分。明显地，可以自这些种子种植大豆植物，并且此类植物是本发明的一部分。本发明还涉及这些大豆植物中含有的DNA序列，其可用于检测这些植物及其后代。本发明的检测方法和试剂盒可以涉及根据测试的最终目的，鉴定这些中的任一种、两种、或甚至所有三种。

在本文中提供了定义和例子来帮助描述本发明，并且指导本领域普通技术人员实施本发明。除非另有记录，术语应当依照相关领域普通技术人员的常规用法理解。使用DNA碱基的命名，如于37CFR§1.822列出的。

如本文中所使用的，术语“后代”意指包含AAD-12大豆事件DAS-68416-4的亲本植物的任何世代的后代。

转基因“事件”如下产生，即用异源DNA，即包含感兴趣转基因的核酸构建体转化植物细胞、源自转基因插入植物基因组的植物群体的再生、并选择以插入特定的基因组位置中为特征的特定植物。术语“事件”指包含异源DNA的初始转化体和转化体的后代。术语“事件”也指通过转化体和包含基因组/转基因DNA的另一品种间的有性异型杂交产生的后代。即使在对回归亲本进行重复回交后，插入的转基因DNA和来自所转化亲本的侧翼基因组DNA(基因组/转基因DNA)在杂交后代中也存在于相同的染色体位置。术语“事件”也指来自初始转化体及其后代的DNA，该DNA包含插入的DNA和紧邻插入DNA的侧翼基因组序列，由于包含所插入DNA的亲本系(例如初始转化体和自交后代)和不含所插入DNA的亲本系间的有性杂交，可以预期该DNA会转移到接受包含感兴趣转基因在内的插入DNA的后代中。

“连接序列”跨越插入基因组中的DNA与在插入点侧翼的大豆天然基因组的DNA连接的点，在植物遗传物质中鉴定或检测出一个或另一个连接序列便足以诊断该事件。包括跨越本文中所描述的大豆事件中的插入物和类似长度的侧翼DNA的DNA序列。本文中提供了此类诊断序列的具体例子；然而，与各插入物的连接，或插入物与基因组序列的连接重叠的其它序列也是诊断性的，并且可以依照本发明使用。

本发明涉及此类侧翼、连接、和插入序列的鉴定。本发明中包括相关的PCR引物和扩增子。依照本发明，可以使用PCR分析方法来检测或鉴定源自主题专利转基因大豆系的商业化转基因大豆品种或系，所述PCR分析方法使用跨越整个插入DNA及其边界的扩增子。

在将插入物导入植物细胞的基因组中的方法期间，发生对插入和/或基因组侧翼序列的一些删除或其它改变不是罕见的。如此，本文中提供的质粒序列的相关区段可以包含一些微小的变异。这会适用于本文中提供的侧翼序列。如此，包含与主题侧翼和/或插入序列具有一定范围的同一性的多核苷酸的植物在本发明的范围内。本发明序列的身份可以是与本文中例示或描述的序列具有至少65%序列同一性，更优选地至少70%序列同一性，更优选地至少75%序列同一性，更优选地至少80%同一性，且更优选地至少85%86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%序列同一性的多核苷酸序列。也可以使用如本文中提供的杂交和杂交条件来限定本发明的此类植物和多核苷酸序列。可以就保藏种子而言确认侧翼序列加插入序列的序列。

这些插入物之每种的整个序列及相应侧翼序列的部分在本文中以SEQID NO:1提供。下文表1中印刷了就SEQ ID NO:1(总共10,212个碱基对)而言的此事件的插入和侧翼序列的坐标。例如，这在实施例3中更为详细地讨论。

表1：事件DAS-68416-4的插入和侧翼序列的残基编号方式(就SEQ IDNO:1而言)。

这些序列(尤其是侧翼序列)是独特的。基于这些插入和边界序列，产生事件特异性引物。PCR分析表明可以通过分析用这些事件特异性引物组生成的PCR扩增子在不同大豆基因型中鉴定这些大豆系。如此，可以使用这些和其它相关规程来独特地鉴定这些大豆系。本文中所鉴定的序列是独特的。

本发明的检测技术特别可用于与植物育种联合，以测定在将包含感兴趣事件的亲本植物与致力于在后代中赋予一种或多种额外的感兴趣性状的另一植物系杂交后，哪些后代植物包含给定的事件。这些PCR分析方法使大豆育种程序及质量控制(尤其对于商业化的转基因大豆种子)受益。现在也生成并使用用于这些转基因大豆系的PCR检测试剂盒。这也可以使产品注册和产物管理受益。

此外，可以使用侧翼大豆/基因组序列来特异性鉴定每个插入物的基因组位置。可以使用此信息来生成每个事件特异性的分子标志物系统。这些可以用于加速的育种策略及建立谱系数据。

此外，可以使用侧翼序列信息来研究并表征转基因整合过程、基因组整合位点特征、事件分选、转基因及其侧翼序列的稳定性、和基因表达(尤其是涉及基因沉默、转基因甲基化模式、位置效应和潜在的表达相关元件诸如MARS[基质附着区]等)。

根据全部的本公开内容，应当清楚的是，本发明包括以ATCC保藏号PTA-10442可获得的种子。本发明还包括自以保藏号PTA-10442保藏于ATCC的种子种植的除草剂抗性大豆植物。本发明进一步包括所述植物的一部分，诸如叶、组织样品、由所述植物生成的种子、花粉等。

此外，本发明包括自保藏的种子种植的植物，优选地除草剂抗性大豆植物的子代和/或后代植物，其中所述植物具有包括可检测野生型基因组DNA/插入DNA连接序列的基因组，如本文中所描述的。如本文中所使用的，术语“大豆”意指大豆，并且包括可以用大豆植物育种的其所有品种。

本发明进一步包括使用本发明的植物作为至少一个亲本进行杂交的方法。例如，本发明包括具有本文中例示的任何植物作为一个或两个亲本的F1杂种植物。通过本发明的此类F1杂种生成的种子也在本发明内。本发明包括一种用于生产F1杂种种子的方法，其通过将例示的植物与不同(例如，近交亲本)植物杂交，并收获所得的杂种种子来进行。本发明包括作为母本或父本的例示性植物。可以通过仔细考虑亲本植物来改善所得植物的特征。

可以如下育种除草剂耐受性大豆植物，即首先将由自本文中提及的任一种系的种子种植的大豆植物组成的第一亲本大豆植物与第二亲本大豆植物有性杂交，由此生成多个第一后代植物，然后选出对除草剂有抗性(或拥有本发明的至少一个事件)的第一后代植物；并自交第一后代植物，由此生成多个第二后代植物；然后自第二后代植物选出对除草剂有抗性(或拥有本发明的至少一个事件)的第二后代植物。这些步骤可以进一步包括第一后代植物或第二后代植物与第二亲本大豆植物或第三亲本大豆植物的回交。然后，可以种植包含本发明的大豆种子的大豆作物或其后代。

还应当理解，也可以将两种不同转基因植物杂交以生成含有两个独立分离的添加的外源基因的后代。合适后代的自交可以生成在这两种添加的外源基因方面纯合的植物。因为是无性繁殖，所以也涵盖与亲本植物回交和与非转基因植物的异型杂交。通常用于不同形状和作物的其它育种方法是本领域中已知的。已经使用回交育种来将简单遗传的、高度可遗传性状的基因转移入期望的纯合栽培种或近交系(其作为回归亲本)中。要转移的性状的来源称作供体亲本。预期所得的植物具有回归亲本(例如栽培种)的属性和自供体亲本转移的期望的性状。在初始杂交后，将拥有供体亲本表型的个体选出并与回归亲本重复杂交(回交)。预期所得的亲本具有回归亲本(例如栽培种)的属性和自供体亲本转移的期望的性状。

本发明的DNA分子可以在标志物辅助育种(MAB)方法中作为分子标志物使用。本发明的DNA分子可以在鉴定遗传连锁的农艺学有用的性状的方法(诸如AFLP标志物、RFLP标志物、RAPD标志物、SNP、和SSR)中使用，如本领域中已知的。可以使用MAB方法在与本发明大豆植物(或其后代及任何其它大豆栽培种或品种)的杂交后代中追踪除草剂抗性性状。DNA分子是此性状的标志物，并且可以使用本领域中公知的MAB方法来在大豆植物中追踪除草剂抗性性状，其中本发明的至少一种大豆系或其后代是亲本或祖先。可以使用本发明的方法来鉴定具有主题事件的任何大豆品种。

本发明的方法包括一种生成除草剂耐受性大豆植物的方法，其中所述方法包括用本发明的植物育种。更具体地，所述方法可以包括杂交本发明的两种植物，或本发明的一种植物和任何其它植物。优选的方法进一步包括通过分析依照本发明可检出的事件的所述后代来选择所述杂交的后代。例如，可以经由与包含其它期望的性状，诸如农艺学性状诸如那些在本文中在多个实施例中测试的性状的植物的育种循环使用本发明来追踪主题事件。例如，可以将包含主题事件和期望性状的植物检出，鉴定，选出，并在进一步的育种轮次中快速使用。也可以经由育种来组合主题事件/性状，并用昆虫抗性性状和/或用别的除草剂耐受性性状依照本发明追踪。后一种的一种优选的实施方案是包含与编码对除草剂麦草畏的抗性的基因组合的主题事件的植物。

如此，本发明可以与例如编码草甘膦抗性(例如，抗性植物或细菌EPSPS、GOX、GAT)、草丁磷抗性(例如，Pat、bar)、乙酰乳酸合酶(ALS)抑制性除草剂抗性(例如，咪唑啉酮[诸如咪草烟(imazethapyr)]、磺酰脲、三唑嘧啶磺酰苯胺、嘧啶基硫代苯甲酸(pyrmidinylthiobenzoate)、和其它化学品[Csr1,SurA,等])、溴草腈(bromoxynil)抗性(例如Bxn)、对HPPD(4-羟苯基-丙酮酸-加双氧酶)酶抑制剂的抗性、对八氢番茄红素去饱和酶(PDS)抑制剂的抗性、对光系统II抑制性除草剂(例如psbA)的抗性、对光系统I抑制性除草剂的抗性、对原卟啉原氧化酶IX(PPO)抑制性除草剂(例如PPO-1)的抗性、对苯基脲除草剂(例如，CYP76B1)的抗性、麦草畏降解酶(见例如US 20030135879)的性状组合，并且其它性状可以单独或以多种组合叠加以提供有效控制或预防杂草移动和/或对上述种类的任何除草剂的抗性的能力。

关于其它除草剂，一些其它优选的ALS(又称为AHAS)抑制剂包括三唑嘧啶磺酰苯胺(诸如氯酯磺草胺(cloransulam-methyl)、双氯磺草胺(diclosulam)、双氟磺草胺(florasulam)、唑嘧磺草胺(flumetsulam)、甲氧磺草胺(metosulam)、和五氟磺草胺(penoxsulam))、嘧啶基硫代苯甲酸(诸如双草醚(bispyribac)和嘧草硫醚(pyrithiobac))、和氟酮磺隆(flucarbazone)。一些优选的HPPD抑制剂包括甲基磺草酮(mesotrione)、异唑草酮(isoxaflutole)、和磺草酮(sulcotrione)。一些优选的PPO抑制剂包括氟烯草酸(flumiclorac)、丙炔氟草胺(flumioxazin)、哒嗪氟草酯(flufenpyr)、吡草醚(pyraflufen)、嗪草酸(fluthiacet)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、唑酮草酯(carfentrazone)、甲磺草胺(sulfentrazone)、和二苯醚(diphenylether)(诸如三氟羧草醚(acifluorfen)、氟磺胺草醚(fomesafen)、乳氟乐草灵(lactofen)、和乙氧氟草醚(oxyfluorfen))。

另外，单独的或与一种或多种其它HTC性状叠加的AAD-12可以与一种或多种其它输入(例如，昆虫抗性、真菌抗性、或应激耐受性等)或输出(例如，增加的产率、改善的油概况、改善的纤维质量等)性状叠加。如此，可以使用本发明来提供具有灵活地且成本有效地控制许多农艺学害虫的能力的改善的作物质量的完整农艺学包装。

主题AAD-12酶实现转基因表达，导致对会控制几乎所有阔叶和禾本科杂草的除草剂组合的耐受性。例如，AAD-12可以充当卓越的除草剂耐受性作物(HTC)性状以与其它HTC性状(例如，草甘膦抗性、草丁磷抗性、咪唑啉酮抗性、溴草腈抗性等)、和昆虫抗性性状(Cry1F、Cry1Ab、Cry 34/45等)叠加。另外，AAD-12可以充当选择标志来帮助选择用第二基因或基因的组遗传工程化改造的植物的初级转化体。

本发明的AAD-12基因还提供对转化为苯氧基乙酸酯生长素除草剂(例如2,4-DB、MCPB等)的化合物的抗性。经由β-氧化将存在于2,4-DB除草剂中的丁酸模块转化为植物毒性2,4-二氯苯氧基乙酸。同样地，经由β-氧化将MCPB转化为植物毒性MCPA。丁酸除草剂自身是非除草性的。它们在易感的植物内通过β-氧化被转化成其相应的酸形式，并且它是植物毒性的除草剂的乙酸形式。不能快速β-氧化的植物不受丁酸除草剂伤害。然而，随后通过AAD-12保护能够快速β-氧化并且可以将丁酸除草剂转化成乙酸形式的植物。

应用除草剂的方法是本领域中已知的。此类应用可以包括超过一种除草剂的罐混合物。依照本发明使用的一些优选的除草剂包括苯氧基生长素除草剂诸如2,4-D；2,4-DB；MCPA；MCPB。这些可以与一种或多种其它除草剂耐受性基因和相应的除草剂(例如草甘膦和/或草丁磷)叠加。可以以有利的组合使用1、2、3或更多种除草剂，这鉴于本公开内容的益处对于本领域技术人员会是显而易见的。可以将一种或多种主题除草剂应用于田间/区域，之后将其以本发明的种子种植。例如，此类应用可以在种植的14天内。也可以在种植时和/或在种植后但出土前应用一种或多种主题除草剂。也可以将一种或多种主题除草剂应用至地面(以控制杂草)或对杂草和/或本发明的转基因植物过多应用。可以将主题除草剂轮换或组合使用以例如，控制或预防可能耐受一种除草剂而不是另一种的杂草。可以以多种方式使用三类主题除草剂的各种应用时间，如本领域中会知道的。本发明还提供了用于控制AAD-12自生植物植物的方法。见同时提交的PCT申请，题目为“CONTROL OF AADDICOT VOLU NTEERS IN MONOCOT CROPS”。

本发明的HTC性状可以与其它HTC性状(包括但不限于草甘膦耐受性)以新的组合使用。这些性状组合产生控制杂草(等)物种的新方法，这是由于最近需要的对除草剂(例如草甘膦)的抗性或固有耐受性。如此，在HTC性状外，使用除草剂(对于该除草剂，通过转基因作物中的所述酶来创建除草剂耐受性)来控制杂草的新方法在本发明的范围内。

另外，全世界种植的草甘膦耐受性作物是普遍的。与其它草甘膦耐受性作物轮作多次，草甘膦抗性自生植物的控制在轮作作物中可能是困难的。如此，对作物个别叠加或转化的主题转基因性状的使用提供了一种用于控制其它HTC自生植物作物的工具。

本发明的优选的植物或种子包含在其基因组中的插入序列(如本文中鉴定的)以及在插入物两侧的至少20-500或更多个连续侧翼核苷酸(如本文中鉴定的)。除非另有指示，提及侧翼序列指那些就SEQ ID NO:1(见上文表1)而言鉴定的。此外，SEQ ID NO:1包括初始转化体中插入的异源DNA和刚好与插入DNA相邻的例示性侧翼基因组序列。可以预期所有或部分的这些侧翼序列被转移到由于包含该事件的亲本系的有性杂交而接受插入DNA的后代。

本发明包括本发明植物的可再生细胞的组织培养物。也包括从该组织培养物再生的植物，特别是在所述植物能够表达所例示的品种的所有形态学和生理学特征的情况中。本发明的优选植物具有自保藏种子种植的植物的所有生理学和形态学特征。本发明进一步包含此类种子的后代和拥有感兴趣的质量性状的种子。

对植物或种子或其部分的操作(诸如突变、进一步转染、和进一步育种)可以导致可称作“基本上衍生的”品种的事物的创建。植物新品种保护国际联盟(The International Union for the Protection of New Varieties of Plants(UPOV))已经提供了下列用于测定某个品种是否基本上源自受保护品种的准则：

在如下情况时，应当认为品系基本上源自另一品种(“初始品种”)：

(i)它主要源自初始品种，或者源自自身主要源自初始品种，同时保留源自初始品种的基因型或基因型组合的必要特征的表达的品种；

(ii)它与初始品种明显可区别；并且

(iii)除了源自衍生行为的差异外，它在源自初始品种的基因型或基因型组合的必要特征表达上与初始品种一致。

UPOV国家组织第六次会议(Sixth Meeting with InternationalOrganizations),1992年10月30日；文件由联盟办公室制备。

如本文中所使用的，“系”指一组在至少一种性状上个体之间展现出很少或没有遗传变异的植物。所述系可以通过几个世代的自花传粉和选择、或者使用组织或细胞培养技术自单一亲本进行营养繁殖来产生。

如本文中所使用的，术语“栽培种”和“品种”是同义的，指用于商业生产的系。

“稳定性”或“稳定的”就给定的组分而言意指组分在世代间且优选地至少三个世代以基本上相同的水平得到维持，例如优选地±15%，更优选地±10%，最优选地±5%。稳定性可以受到温度、位置、应激和种植时间影响。在田间条件下比较随后的世代应当以相似的方式生成组分。

“商业效用”定义为具有良好的植物活力和高能育性，使得农民可以使用常规的耕作设备生产作物，并且可以使用常规的破碎和提取设备自种子提取具有所描述组分的油。为了在商业上有用，产率(如通过每英亩生产的种子重量、油含量、和总油量测量的)在相同地区种植的没有优质价值性状的其它方面相当的商业芸苔(canola)品种的平均产率的15%内。

“农艺学良种”意指在由主题事件所致的昆虫抗性外，系具有期望的农艺学特征，诸如产率、成熟度、疾病抗性等。在包含本发明的事件的植物中个别或以任意组合采用的农艺学性状(如下文实施例中所列的)在本发明的范围内。可以使用任何和所有这些农艺学特征和数据点来作为用于限定此类植物的一系列特征的点或在该一系列特征的任一末端或两个末端鉴定此类植物。

如本领域技术人员根据本公开内容会认可，检测试剂盒的优选实施方案例如可以包含涉及和/或包含“连接序列”或“过渡序列”(在那里，大豆基因组侧翼序列与插入序列相遇)的探针和/或引物。例如，这包括为了鉴定一个或两个连接序列(在那里，插入物与侧翼序列相遇)而设计的多核苷酸探针、引物和/或扩增子，如上文表1中所指示的。一种常见的设计是具有在侧翼区中杂交的一种引物，和在插入物中杂交的一种引物。此类引物的长度经常各为约至少约15个残基。凭借此类排列，可以使用引物来生成/扩增可检出的扩增子，其指示本发明的事件的存在。可以使用这些引物来生成跨越(并包含)连接序列的扩增子，如上文所指示的。

在侧翼序列中“降落”的引物通常不设计为超出约200个碱基或超出连接杂交。如此，典型的侧翼引物会设计为包含进入侧翼序列中的距离插入物开始200个碱基内的任一条链的至少15个碱基。也就是说，包含自SEQ IDNO:1的残基约2530-2730和/或约9122-9322(或与其杂交)的合适大小的序列的引物在本发明的范围内。同样地，插入引物可以在插入物上的任何地方设计，但是例如可以不仅为此类引物设计使用残基约2731-2931和约8921-9121。

本领域技术人员还会认可，引物和探针可以设计为在一系列标准的杂交和/或PCR条件下与SEQ ID NO:1(或其互补物)的区段及其互补物杂交，其中引物或探针与例示的序列不完全互补。也就是说，可以容忍一定程度的错配。对于约20个核苷酸的引物，例如，若错配碱基是内部的或在扩增子相反的引物末端，则通常1或2个左右的核苷酸不需要与相反链结合。下文提供了各种合适的杂交条件。也可以在探针中使用合成的核苷酸类似物诸如肌苷。也可以使用肽核酸(PNA)探针及DNA和RNA探针。重要的是此类探针和引物诊断(能够独特地鉴定并区别)本发明事件的存在。

应当注意到，可以发生PCR扩增的错误，这例如可以导致微小的测序错误。也就是说，除非另有指示，如下测定本文中所列的序列，即自大豆基因组DNA生成长的扩增子，然后克隆并测序扩增子。鉴于对于自基因组DNA生成对于测序足够的扩增子必要的多个轮次的扩增，寻找以此方式生成并测定的序列上的略微差异和微小的差别不是罕见的。本领域技术人员应当认可并且注意到由于这些类型的常见测序错误或差别而需要的任何调节在本发明的范围内。

还应当注意，例如，在事件的创建期间插入序列时要删除一些基因组序列不是罕见的。如此，例如一些差异也可以出现在主题侧翼序列与GENBANK中所列的基因组序列间。

“插入物”的构件在图中显示，并且在下文在实施例中更为详细地讨论。这些构件的DNA多核苷酸序列或其片段可以作为DNA引物或探针在本发明的方法中使用。

在本发明的一些实施方案中，提供了用于在来自大豆植物的植物和种子等中检测转基因/基因组插入区的存在的组合物和方法。提供了如下的DNA序列，其包含本文中提供的主题转基因/基因组插入区连接序列(在SEQ IDNO:1的残基2730-2731和9121-9122间)、其区段、和例示序列的互补物及其任何区段。插入区连接序列跨越插入基因组中的异源DNA与来自在插入位点侧翼的来自大豆细胞的DNA间的连接。此类序列可以诊断给定的事件。

基于这些插入和边界序列，可以生成事件特异性引物。PCR分析表明，可以通过分析用这些事件特异性引物组生成的PCR扩增子来在不同大豆基因型中鉴定本发明的大豆系。可以使用这些和其它相关的规程来独特地鉴定这些大豆系。如此，源自此类引物组的PCR扩增子是独特的，并且可以用于鉴定这些大豆系。

在一些实施方案中，包含新的转基因/基因组插入区域的连续片段的DNA序列是本发明的一方面。包括包含足够长度的转基因插入序列多核苷酸和足够长度的来自一种或多种上述三种大豆植物的大豆基因组序列的多核苷酸的DNA序列，和/或用作生成对于这些大豆植物中的一种或多种诊断性的扩增子产物的引物序列的序列。

相关实施方案属于如下的DNA序列，其包含本文中鉴定的DNA序列(诸如SEQ ID NO:1及其区段)或其互补物的转基因部分的至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25或更多个连续核苷酸，和来自这些序列或其互补物的侧翼大豆DNA序列的相似长度。此类序列可用作DNA扩增方法中的DNA引物。使用这些引物生成的扩增子诊断本文中提及的任何大豆事件。因此，本发明还包括通过此类DNA引物和同源引物生成的扩增子。

本发明还包括检测样品中对应于本文中提及的大豆事件的DNA的存在的方法。此类方法可以包括：(a)使包含DNA的样品与引物组接触，所述引物组在与来自至少一个这些大豆事件的DNA的核酸扩增反应中使用时生成诊断所述事件的扩增子；(b)实施核酸扩增反应，由此生成扩增子；并(c)检测扩增子。

本发明的其它检测方法包括一种检测样品中对应于至少一个所述事件的DNA的存在的方法，其中所述方法包括：(a)使包含DNA的样品与探针接触，所述探针在严格杂交条件下与来自至少一个所述大豆事件的DNA杂交，并且其在严格杂交条件下不与对照大豆植物(非感兴趣事件DNA)杂交；(b)将样品和探针受到严格杂交条件处理；并(c)检测探针与DNA的杂交。

在又一些实施方案中，本发明包括生成包含本发明的AAD-12事件的大豆植物的方法，其中所述方法包括下列步骤：(a)将第一亲本大豆系(包含本发明的表达盒，其对所述系的植物赋予所述除草剂抗性性状)和第二亲本大豆系(其缺乏此除草剂耐受性性状)有性杂交，由此生成多个后代植物；并(b)通过使用分子标志物来选择后代植物。任选地，此类方法可以包括将后代植物与第二亲本大豆系回交以生成包含所述昆虫耐受性性状的真实育种大豆植物的进一步的步骤。

依照本发明的另一方面，提供了测定与所述三种事件中的任一种(或多种)杂交的后代的接合性的方法。所述方法可以包括使样品(包含大豆DNA)与本发明的引物组接触。所述引物在与来自至少一个所述大豆事件的基因组DNA的核酸扩增反应中使用时生成诊断至少一个所述大豆事件的第一扩增子。此类方法进一步包括实施核酸扩增反应，由此生成第一扩增子；检测第一扩增子；并使包含大豆DNA的样品与所述引物组(所述引物组在与来自大豆植物的基因组DNA的核酸扩增反应中使用时生成第二扩增子，其包含与大豆基因组区同源的天然大豆基因组DNA)接触；并实施核酸扩增反应，由此生成第二扩增子。该方法进一步包括检测第二扩增子，并比较样品中的第一和第二扩增子，其中这两种扩增子的存在指示样品在转基因插入物方面是杂合的。

可以使用本文中公开的组合物和本领域中公知的DNA检测方法来开发DNA检测试剂盒。试剂盒可用于鉴定样品中的主题大豆事件DNA，并且可以应用于育种含有此DNA的大豆植物的方法。试剂盒含有与例如本文中公开的扩增子或与主题事件的转基因遗传元件中含有的DNA同源或互补的DNA序列同源或互补的DNA序列。这些DNA序列可以在DNA扩增反应中使用或者作为引物在DNA杂交方法中使用。试剂盒还可以含有实施检测方法必需的试剂和材料。

“探针”是一种分离的核酸分子，其附接有常规的可检测标记物或报告物分子(诸如放射性同位素、配体、化学发光剂、或酶)。此类探针与靶核酸的链，在本发明的情况中，与来自所述大豆事件之一的基因组DNA的链(无论来自大豆植物还是来自包含来自所述事件的DNA的样品)互补。依照本发明的探针不仅包含脱氧核糖核酸或核糖核酸，而且还包含聚酰胺和其它探针材料，其特异性结合靶DNA序列，并且可以用于检测所述靶DNA序列的存在。

“引物”是通过核酸杂交与互补靶DNA链退火以形成引物与靶DNA链间的杂合物，然后通过聚合酶，例如DNA聚合酶沿着靶DNA链延伸的分离的/合成的核酸。本发明的引物对指其用于扩增靶核酸序列的用途，例如通过聚合酶链式反应(PCR)或其它常规的核酸扩增方法来实现。

一般地，探针和引物的长度为5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106,107,108,109,110,111,112,113,114,115,116,117,118,119,120,121,122,123,124,125,126,127,128,129,130,131,132,133,134,135,136,137,138,139,140,141,142,143,144,145,146,147,148,149,150,151,152,153,154,155,156,157,158,159,160,161,162,163,164,165,166,167,168,169,170,171,172,173,174,175,176,177,178,179,180,181,182,183,184,185,186,187,188,189,190,191,192,193,194,195,196,197,198,199,200,201,202,203,204,205,206,207,208,209,210,211,212,213,214,215,216,217,218,219,220,221,222,223,224,225,226,227,228,229,230,231,232,233,234,235,236,237,238,239,240,241,242,243,244,245,246,247,248,249,250,251,252,253,254,255,256,257,258,259,260,261,262,263,264,265,266,267,268,269,270,271,272,273,274,275,276,277,278,279,280,281,282,283,284,285,286,287,288,289,290,291,292,293,294,295,296,297,298,299,300,301,302,303,304,305,306,307,308,309,310,311,312,313,314,315,316,317,318,319,320,321,322,323,324,325,326,327,328,329,330,331,332,333,334,335,336,337,338,339,340,341,342,343,344,345,346,347,348,349,350,351,352,353,354,355,356,357,358,359,360,361,362,363,364,365,366,367,368,369,370,371,372,373,374,375,376,377,378,379,380,381,382,383,384,385,386,387,388,389,390,391,392,393,394,395,396,397,398,399,400,401,402,403,404,405,406,407,408,409,410,411,412,413,414,415,416,417,418,419,420,421,422,423,424,425,426,427,428,429,430,431,432,433,434,435,436,437,438,439,440,441,442,443,444,445,446,447,448,449,450,451,452,453,454,455,456,457,458,459,460,461,462,463,464,465,466,467,468,469,470,471,472,473,474,475,476,477,478,479,480,481,482,483,484,485,486,487,488,489,490,491,492,493,494,495,496,497,498,499或500个多核苷酸或更多。此类探针和引物在高严格性杂交条件下与靶序列特异性杂交。优选地，依照本发明的探针和引物与靶序列具有完全的序列相似性，尽管可以通过常规方法设计与靶序列不同，且保留与靶序列杂交的能力的探针。

用于制备和使用探针和引物的方法记载于例如，Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第2板,第1-3卷,Sambrook等编,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989。PCR引物对可以源自已知的序列，例如，通过使用意图出于所述目的的计算机程序来进行。

可以使用基于本文中所公开的侧翼DNA和插入序列的引物和探针来确认(且若必要的话，校正)公开的序列，其通过常规的方法，例如通过对此类序列再克隆和测序来进行。

本发明的核酸探针和引物在严格条件下与靶DNA序列杂交。可以使用任何常规的核酸杂交或扩增方法来鉴定样品中来自转基因事件的DNA的存在。核酸分子或其片段能够在某些情况下与其它核酸分子特异性杂交。如本文中所使用的，若两个分子能够形成反平行的、双链核酸结构，则所述两个核酸分子被说成能够彼此特异性杂交。一个核酸分子被说成是另一个核酸分子的“互补物”，若它们展现出完全的互补性。如本文中所使用的，在分子之一的每个核苷酸与另一个的核苷酸互补时，分子被说成展现出“完全的互补性”。若两个分子能以足以容许它们至少在常规的“低严格性”条件下保持彼此退火的稳定性彼此杂交，则它们被说成是“最小程度互补的”。类似地，若分子能以足以容许它们在常规的“高严格性”条件下保持彼此退火的稳定性彼此杂交，则它们被说成是“互补的”。常规的严格性条件由Sambrook等,1989描述。因此，偏离完全的互补性是可允许的，只要此类偏离不完全排除分子形成双链结构的性能。为了使核酸分子充当引物或探针，它仅需要在序列上足够互补，使得在所采用的特定溶剂和盐浓度下能够形成稳定的双链结构。

如本文中所使用的，基本上同源的序列是如下的核酸序列，其会在高严格性条件下与其比较的核酸序列的互补物特异性杂交。术语“严格条件”就通过Sambrook等,1989,于9.52-9.55讨论的特定杂交规程实现的核酸探针与靶核酸(即，与感兴趣的特定核酸序列)杂交而言进行功能限定。还可见Sambrook等,1989，于9.47-9.52和9.56-9.58。因而，可以使用本发明的核苷酸序列来实现其与DNA片段的互补区段选择性形成双链体分子的能力。

根据想象的应用，可以使用不同杂交条件来实现探针对靶序列的不同程度的选择性。对于需要高灵敏性的应用，通常会采用相对严格的条件来形成杂合物，例如会选择相对较低的盐和/或高温的条件，诸如通过约0.02M至约0.15M NaCl于约50°C至约70°C的温度提供。例如，严格条件可以牵涉用高严格性清洗缓冲液(0.2X SSC,0.1%SDS,65°C)将杂交滤膜清洗至少两次。促进DNA杂交的适当严格性条件，例如，6.0X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)于约45°C，接着于50°C用2.0X SSC清洗是本领域技术人员已知的。例如，可以自约2.0XSSC于50°C的低严格性至约0.2X SSC于50°C的高严格性选择清洗步骤中的盐浓度。另外，清洗步骤中的温度可以自室温(约22°C)的低严格性条件提高至约65°C的高严格性条件。温度和盐两者可以有所变化，或者温度或盐浓度可以保持恒定，而另一个变量是变化的。此类选择性条件耐受(tolerate)很少的(若有的话)探针与模板或靶链间的错配。经由杂交检测DNA序列是本领域普通技术人员公知的，并且美国专利Nos.4,965,188和5,176,995的教导是杂交分析方法例示性的。

在一个特别优选的实施方案中，本发明的核酸会在高严格性条件下与本文中例示或提示的一种或多种引物(或扩增子或其它序列)，包括其互补物和片段特异性杂交。在本发明的一方面，本发明的标志物核酸分子在例示序列之一或其互补物和/或片段中具有如本文中所列的核酸序列。

在本发明的另一方面，本发明的标志物核酸分子与此类核酸序列共享80%-100%或90%-100%序列同一性。在本发明的又一方面，本发明的标志物核酸分子与此类序列共享95%-100%序列同一性。可以在植物育种方法中使用此类序列作为标志物以鉴定遗传杂交的后代。可以通过本领域技术人员已知的许多方法来检测探针与靶DNA分子的杂交，这些可以包括但不限于荧光标签、放射性标签、基于抗体的标签、和化学发光标签。

关于使用特定扩增引物对来扩增靶核酸序列(例如通过PCR进行)，“严格条件”指容许引物对仅与如下的靶核酸序列杂交，并且优选地生成独特的扩增产物，即扩增子的条件，所述靶核酸序列会与具有相应的野生型序列(或其互补物)的引物结合。

术语“(靶序列)特异性”指示探针或引物在严格杂交条件下仅与包含靶序列的样品中的靶序列杂交。

如本文中所使用的，“扩增DNA”或“扩增子”指作为核酸模板一部分的靶核酸序列的核酸扩增产物。例如，为了测定源自有性杂交的大豆植物是否含有来自本发明大豆植物的转基因事件基因组DNA，可以使用引物对将自大豆植物组织样品提取的DNA进行核酸扩增方法，所述引物对包括源自植物基因组中在插入异源DNA的插入位点附近的侧翼序列的引物，和源自插入异源DNA的第二引物以生成诊断事件DNA存在的扩增子。扩增子具有一定的长度，并且具有也是事件诊断性的序列。扩增子的长度范围可以为引物对加一个核苷酸碱基对的组合长度和/或引物对加约2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106,107,108,109,110,111,112,113,114,115,116,117,118,119,120,121,122,123,124,125,126,127,128,129,130,131,132,133,134,135,136,137,138,139,140,141,142,143,144,145,146,147,148,149,150,151,152,153,154,155,156,157,158,159,160,161,162,163,164,165,166,167,168,169,170,171,172,173,174,175,176,177,178,179,180,181,182,183,184,185,186,187,188,189,190,191,192,193,194,195,196,197,198,199,200,201,202,203,204,205,206,207,208,209,210,211,212,213,214,215,216,217,218,219,220,221,222,223,224,225,226,227,228,229,230,231,232,233,234,235,236,237,238,239,240,241,242,243,244,245,246,247,248,249,250,251,252,253,254,255,256,257,258,259,260,261,262,263,264,265,266,267,268,269,270,271,272,273,274,275,276,277,278,279,280,281,282,283,284,285,286,287,288,289,290,291,292,293,294,295,296,297,298,299,300,301,302,303,304,305,306,307,308,309,310,311,312,313,314,315,316,317,318,319,320,321,322,323,324,325,326,327,328,329,330,331,332,333,334,335,336,337,338,339,340,341,342,343,344,345,346,347,348,349,350,351,352,353,354,355,356,357,358,359,360,361,362,363,364,365,366,367,368,369,370,371,372,373,374,375,376,377,378,379,380,381,382,383,384,385,386,387,388,389,390,391,392,393,394,395,396,397,398,399,400,401,402,403,404,405,406,407,408,409,410,411,412,413,414,415,416,417,418,419,420,421,422,423,424,425,426,427,428,429,430,431,432,433,434,435,436,437,438,439,440,441,442,443,444,445,446,447,448,449,450,451,452,453,454,455,456,457,458,459,460,461,462,463,464,465,466,467,468,469,470,471,472,473,474,475,476,477,478,479,480,481,482,483,484,485,486,487,488,489,490,491,492,493,494,495,496,497,498,499,or 500,750,1000,1250,1500,1750,2000或更多个核苷酸碱基对(加或减上文所列的任何增量)的组合长度。或者，引物对可以源自插入DNA两侧上的侧翼序列，从而生成包括整个插入核苷酸序列的扩增子。源自植物基因组序列的引物对成员可以位于离插入DNA序列一段距离。此距离范围可以为一个核苷酸碱基对多至约2万个核苷酸碱基对。术语“扩增子”的使用明确排除可以存在于DNA热扩增反应中的引物二聚体。

可以通过本领域中已知的多种核酸扩增方法，包括聚合酶链式反应(PCR)来实现核酸扩增。多种扩增方法是本领域中已知的，并且记载于美国专利No.4,683,195和美国专利No.4,683,202等。已经开发出PCR扩增方法来扩增出多至22kb的基因组DNA。这些方法及DNA扩增领域中已知的其它方法可以在本发明的实践中使用。可以通过使用源自本文中提供的序列的引物自所述事件扩增此类序列，接着对PCR扩增子或克隆的DNA进行标准的DNA测序来确认(若必要的话，校正)来自主题大豆事件的异源转基因DNA插入物或侧翼基因组序列的序列。

可以通过多种技术来检测通过这些方法生成的扩增子。琼脂糖凝胶电泳和用溴化乙锭染色是一种用于检测DNA扩增子的常见的公知方法。另一种此类方法是遗传比特分析(Genetic Bit Analysis)，其中设计如下的DNA寡核苷酸，其与相邻的侧翼基因组DNA序列和插入的DNA序列两者重叠。将寡核苷酸在多孔板的孔中固定化。在感兴趣区域的PCR后(使用插入序列中的一条引物和相邻侧翼基因组序列中的一条引物)，单链PCR产物可以与固定化的寡核苷酸杂交，并且充当使用DNA聚合酶和对预期的下一个碱基特异性的经标记ddNTP进行的单碱基延伸反应的模板。读出可以是荧光的或基于ELISA的。由于成功的扩增、杂交和单碱基延伸，信号指示插入物/侧翼序列的存在。

另一种方法是焦磷酸测序(pyrosequencing)技术，如由Winge(Innov.Pharma.Tech.00:18-24,2000)所描述的。在此方法中，设计如下的寡核苷酸，其与相邻的基因组DNA和插入物DNA连接重叠。将寡核苷酸与来自感兴趣区域的单链PCR产物(插入序列中的一条引物和侧翼基因组序列中的一条)杂交，并在存在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶、萤光素酶、腺苷三磷酸双磷酸酶、腺苷5’磷硫酸(phosphosulfate)和萤光素的情况中温育。个别添加DNTP，并且掺入导致测量的光信号。由于成功的扩增、杂交和单或多碱基延伸，光信号指示转基因插入物/侧翼序列的存在。

荧光极化是另一种可以用于检测本发明的扩增子的方法。遵循此方法，设计如下的寡核苷酸，其与基因组侧翼和插入DNA连接重叠。将寡核苷酸与来自感兴趣区域的单链PCR产物(插入DNA中的一条引物和侧翼基因组DNA序列中的一条)杂交，并在存在DNA聚合酶和经荧光标记的ddNTP的情况中温育。单碱基延伸导致ddNTP的掺入。可以使用荧光计来以极化变化测量掺入。由于成功的扩增、杂交和单碱基延伸，极化变化指示转基因插入物/侧翼序列的存在。

TAQMAN(PE Applied Biosystems,Foster City,Calif.)是一种检测并量化DNA序列的存在的方法。简言之，设计如下的FRET寡核苷酸探针，其与基因组侧翼和插入物DNA连接重叠。在存在耐热性聚合酶和dNTP的情况中循环FRET探针和PCR引物(插入DNA序列中的一条引物和侧翼基因组序列中的一条)。在特异性扩增期间，Taq DNA聚合酶清洁并释放荧光模块，使其离开FRET探针上的淬灭模块。由于成功的扩增和杂交，荧光信号指示侧翼/转基因插入物序列的存在。

已经描述了用于序列检测的分子信标(Molecular Beacons)。简言之，设计如下的FRET寡核苷酸探针，其与侧翼基因组和插入物DNA连接重叠。FRET探针的独特结构导致其含有将荧光和淬灭模块保持紧密接近的二级结构。在存在耐热性聚合酶和dNTP的情况中循环FRET探针和PCR引物(插入DNA序列中的一条引物和侧翼基因组序列中的一条)。在成功的PCR扩增后，FRET探针与靶序列的杂交导致探针二级结构的除去和荧光和淬灭模块的空间分离。荧光信号得到结果。由于成功的扩增和杂交，荧光信号指示侧翼基因组/转基因插入物序列的存在。

已经公开了大豆基因组中对于插入卓越的位置，本发明还包括大体在此基因组位置附近包含至少一个非aad12插入物的大豆种子和/或大豆植物。一个选项是用不同插入物替换本文中例示的aad-12插入物。一般在这些方面，例如可以依照本发明使用靶向性同源重组。此类技术是例如，WO 03/080809A2及相应的公布的美国专利(U.S.2003/0232410)的主题。如此，本发明包括如下的植物和植物细胞，其包含侧翼有所有或可识别部分的本文中所鉴定侧翼序列(例如SEQ ID NO:1的残基1-2730和9122-10,212)的异源插入物(替换或具有多个拷贝的aad-12)。也可以以此/这些方式靶向额外一个拷贝(或额外多个拷贝)的aad-12基因以实现插入。

经由同源重组在植物细胞的特定染色体位点内整合多核苷酸序列的方法在本领域内已经进行过描述。例如，如记载于美国专利申请公开文本No.2009/0111188A1的位点特异性整合描述了使用重组酶或整合酶来介导供体多核苷酸序列对染色体靶物的导入。另外，国际专利申请No.WO2008/021207描述了锌指介导的同源重组以在基因组的特定位置内整合一个或多个供体多核苷酸序列。可以利用重组酶诸如如记载于美国专利No.6,720,475的FLP/FRT或如记载于美国专利No.5,658,772的CRE/LOX的用途来将多核苷酸序列整合入特定的染色体位点中。最后，大范围核酸酶用于将供体多核苷酸靶向入特定染色体位置中的用途记载于Puchta等,PNAS USA 93(1996)第5055-5060页。

用于在植物细胞内的位点特异性整合的其它各种方法一般是已知的且可适用的(Kumar等,Trands in Plant Sci.6(4)(2001)第155-159页)。此外，已经在几种原核和低等真核生物体中鉴定的位点特异性重组系统可以适用于在植物中使用。此类系统的例子包括但不限于：来自酵母鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)的pSR1质粒的R/RS重组酶系统(Araki等(1985)J.Mol.Biol.182:191-203)、和噬菌体Mu的Gin/gix系统(Maeser和Kahlmann(1991)Mol.Gen.Genet.230:170-176)。

在本发明的一些实施方案中，可以期望在现有的转基因事件附近整合或叠加新的转基因。可以认为转基因事件是优选的基因组基因座，其基于独特的特征诸如单一插入位点、正常的孟德尔分离和稳定的表达、及卓越的功效组合，包括在多个环境位置中及在多个环境位置间的除草剂耐受性和农艺学性能来选择。新整合的转基因应当维持现有转化体的转基因表达特征。此外，会克服用于检测并确认新整合事件的测定法的开发，因为已经鉴定出新整合事件的基因组侧翼序列和染色体位置。最后，新转基因对与现有转基因连锁的特定染色体位置的整合会通过使用常规育种方法的有性异性杂交来加速转基因对其它遗传背景的基因渗入。

在本发明的一些实施方案中，可以期望自转基因事件切除多核苷酸序列。例如，如记载于美国临时专利申请No.61/297,628的转基因切除描述了使用锌指核酸酶自染色体整合的转基因事件除去由基因表达盒组成的多核苷酸序列。除去的多核苷酸序列可以是选择标志。在切除并除去多核苷酸序列后，可以通过插入多核苷酸序列来再靶向经修饰的转基因事件。切除多核苷酸序列，随后再靶向经修饰的转基因事件，这提供了如下的优点，诸如选择标志的再使用或克服对源自特定基因表达的植物转录物组(transcriptome)的无意改变的能力。

本发明在本文中公开了大豆基因组中的染色体4上对于插入异源核酸卓越的特定位点。还公开了5’分子标志物、3’分子标志物、5’侧翼序列、和3’侧翼序列，其可用于鉴定染色体4上的靶定位点的位置。如此，本发明提供了将感兴趣的异源核酸导入此预先建立的靶位点中或在此靶位点附近导入的方法。本发明还涵盖包含在公开的靶位点处或大体在此类位点附近插入的任何异源核苷酸序列的大豆种子和/或大豆植物。一个实现此类靶向性整合的选项是切除和/或替代不同插入物，替换本文中例示的pat表达盒。在此一般方面，可以依照本发明使用(例如但不限于)靶向性同源重组。

如本文中所使用的，基因、事件或性状“叠加”指将期望的性状组成入一个转基因系中。植物育种人员通过在各自具有期望的性状的亲本间进行杂交，然后鉴定具有这两个期望性状的后代来叠加转基因性状。另一种叠加基因的方式是通过在转化期间同时将两个或更多个基因转移入植物的细胞核中。另一种叠加基因的方式是通过用另一种感兴趣基因再转化转基因植物。例如，可以使用基因叠加来组合两种或更多种不同性状，包括例如，两种或更多种不同昆虫性状、昆虫抗性性状和疾病抗性性状、两种或更多种除草剂抗性性状、和/或昆虫抗性性状和除草剂抗性性状。在感兴趣的基因外使用选择标志也可以认为是基因叠加。

“同源重组”指在具有含有相似核苷酸序列的相应位点的任何核苷酸序列对间进行且两个核苷酸序列可以相互作用(重组)以形成新的重组DNA序列的反应。相似核苷酸序列的位点在本文中各自称为“同源性序列”。一般地，同源重组的频率随同源性序列长度增加而升高。如此，虽然可以在不相同的两个核苷酸序列间发生同源重组，重组频率(或效率)随两个序列间的趋异升高而下降。可以使用各在供体和靶分子上的一个同源性序列来实现重组，由此生成“单交换”重组产物。或者，可以各在靶物和供体核苷酸序列上放置两个同源性序列。供体上的两个同源性序列与靶物上的两个同源性序列间的重组生成“双交换”重组产物。若供体分子上的同源性序列在要操作的序列(例如，感兴趣的序列)侧翼，则与靶分子的双交换重组会生成如下的重组产物，其中感兴趣的序列替换最初在靶分子上的同源性序列间的DNA序列。经由双交换重组事件在靶物和供体间的DNA序列的交换称作“序列置换”。

通过提及而将本文中提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请、和出版物以它们不与本申请的明确教导矛盾的程度完整收入。

包括以下实施例以例示用于实施本发明的规程，并且表明本发明的某些优选的实施方案。这些实施例不应解释为限制性的。本领域技术人员应当领会，以下实施例中公开的技术代表用于例示其实施的优选模式的具体方法。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当领会，可以在不偏离本发明精神和范围的前提下对这些具体实施方案进行多种改变，而仍获得相同或相似的结果。除非另有指示，所有百分比按重量计，并且所有溶剂混合物比例按体积计，除非另有记录。

除非另有指示，使用下列缩写。

AAD-12芳氧基链烷酸酯加双氧酶-1

bp     碱基对

°C    摄氏度

DNA    脱氧核糖核酸

DIG    洋地黄毒苷

EDTA   乙二胺四乙酸

kb     千碱基

μg    微克

μL    微升

mL     毫升

M      分子量

OLP    重叠探针

PCR    聚合酶链式反应

PTU    植物转录单元

SDS    十二烷基硫酸钠

SOP    标准的操作规程

SSC    含有氯化钠和柠檬酸钠混合物的缓冲溶液，pH 7.0

TBE    含有Tris碱、硼酸和EDTA混合物的缓冲溶液，pH 8.3

V      伏特

实施例

实施例1：aad-12大豆事件DAS-68416-4的转化和选择

经由土壤杆菌属介导的大豆子叶节外植体转化生成转基因大豆(大豆)事件DAS-68416-4。使用携带在T链DNA区内具有选择标志(pat)和感兴趣基因(aad-12)的二元载体pDAB4468(图1)的解除的(disarmed)土壤杆菌菌株EHA101(Hood等,2006)来启动转化。

使用Zeng等(Zeng等,2004)的改良规程来实施土壤杆菌属介导的转化。简言之，在基础培养基上萌发大豆种子(栽培种Maverick)，并将子叶节分离，并用土壤杆菌感染。给枝条起始、枝条延长、和生根培养基补充头孢噻肟(cefotaxime)、特美汀(timentin)和万古霉素以除去土壤杆菌。采用草丁磷选择来抑制非转化枝条的生长。将选定的枝条转移至生根培养基以进行根发育，然后转移至土壤混合物以驯化小植物。

用草丁磷对选定小植物的顶生小叶进行涂叶(leaf paint)以筛选推定的转化体。将筛选的小植物转移至温室，容许驯化，然后用草丁磷涂叶以再次确认耐受性，并且视为推定的转化体。将筛选的植物取样，并实施分子分析，用于确认选择标志基因和/或感兴趣的基因。容许T₀植物在温室中自体受精以生成T₁种子。

将T₁植物回交，并基因渗入良种种质(Maverick)中。自独立的经转化隔离区(isolate)生成此事件，即大豆事件DAS-68416-4。该事件基于其独特的特征诸如单一插入位点、正常的孟德尔分离和稳定的表达、及卓越的功效组合，包括在宽基因型背景中及在多个环境位置间的除草剂耐受性和农艺学性能来选择。以下实施例含有用于表征大豆事件DAS-68416-4的数据。

实施例2：经由Southern印迹的大豆事件DAS-68416-4表征

使用Southern印迹分析来建立大豆事件DAS-68418-4的整合样式。这些实验产生如下的数据，其证明在大豆基因组内的aad-12转基因的整合和完整性。将大豆事件DAS-68418-4表征为全长的、简单的整合事件，其含有来自质粒pDAB4468的aad-12PTU的单一拷贝。

Southern印迹数据提示了插入大豆事件DAS-68418-4的基因组中的pDAB4468T链片段。使用对aad-12基因(其包含在pDAB4468的T链整合区中)特异性的探针和描述性的限制性酶来进行详细的Southern印迹分析，所述限制性酶具有位于质粒内的切割位点，并且生成在质粒内部的杂交片段或跨越质粒与大豆基因组DNA的连接的片段(边界片段)。自限制性酶和探针组合的Southern杂交指示的分子量对于事件而言是独特的，并且建立其鉴定样式。这些分析还显示了已经将质粒片段插入大豆基因组DNA中，而没有aad-12PTU的重排。

实施例2.1：大豆叶样品收集和基因组DNA(gDNA)分离

从自含有大豆事件DAS-68416-4的个别大豆植物收获的叶组织提取基因组DNA。另外，自常规的大豆植物Maverick(其含有代表主旨(substance)系的遗传背景，缺乏aad-12基因)分离gDNA。

遵循标准的CTAB方法，自冻干的叶组织提取个别基因组DNA。在提取后，使用Pico Green试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)用荧光分光光度法量化DNA。然后，在琼脂糖凝胶上显现DNA以确认来自Pico Green分析的数值并测定DNA质量。

实施例2.2：DNA消化和分离

对于大豆事件DAS-68416-4的Southern印迹分子表征，将十微克(10μg)基因组DNA消化。通过对每份DNA样品添加每μgDNA约5个单位的选定限制性酶和相应的反应缓冲液来消化来自大豆事件DAS-68416-4和非转基因大豆系Maverick的基因组DNA。将每份样品于约37°C温育过夜。个别使用限制性酶SpeI、KpnI、和PacI以进行消化(New England Biolabs,Ipswich,MA)。另外，通过组合质粒DNA，即pDAB4468与来自非转基因大豆品种Maverick的基因组DNA来制备阳性杂交对照样品。使用与测试样品相同的规程和限制性酶来消化质粒DNA/基因组DNA混合物(cocktail)。在将消化物温育过夜后，将NaCl添加至终浓度0.1M，并用异丙醇将经消化的DNA样品沉淀。将沉淀的DNA团粒在20ul 1X上样缓冲液(0.1%溴酚蓝、100mM EDTA、50%甘油、10mM Tris，pH 7.5)中重悬。然后，以35瓦特将DNA样品和分子大小标志物电泳通过具有0.4X TAE缓冲液(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)的0.85%琼脂糖凝胶达约18-22小时以实现片段分离。用溴化乙锭(Invitrogen,Carlsbad,CA)对凝胶染色，并在紫外(UV)光下显现DNA。

实施例2.3：Southern转移和膜处理

实施Southern印迹分析，如由Severson等(1997)所描述的。在电泳分离并在UV光下显现DNA片段后，将凝胶在变性溶液(150mM NaOH,3mMEDTA)中浸没约20分钟，然后转移至中和溶液(150mM NaPO₄，pH 7.8)达至少20分钟。使用具有转移缓冲液(25mM焦磷酸钠，pH 10)的芯吸(wicking)系统来将对尼龙膜(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)上的Southern转移实施过夜。在转移后，通过于65°C将膜烘烤约2小时来将DNA与膜结合。此过程导致准备好杂交的Southern印迹膜。

实施例2.4：DNA探针标记和杂交

使用经标记的探针来检测与尼龙膜结合的DNA片段。使用针对质粒pDAB4468的特定核苷酸区的引物通过PCR扩增来生成用于此实验的探针。将扩增的PCR片段分离，自琼脂糖凝胶纯化，并作为杂交探针的模板使用。使用GE Healthcare READY-TO-GO^TM DNA标记珠(GE Healthcare,Piscataway,NJ)遵循制造商的用法说明书通过随机引发用α³²P-特异性核苷酸标记Southern印迹杂交探针，并通过PROBEQUANT^TM G-50微柱(Amersham/Pharmacia,Piscataway,New Jersey,USA)来纯化。表2中描述了描述用于此实验的探针的表。使用杂交缓冲液(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)于65°C实施预杂交4小时。然后，倒掉预杂交溶液，并用含有期望量的特异性探针的杂交溶液更换，所述特异性探针通过在水中煮沸5分钟来预变性。将杂交/探针混合物与尼龙膜于65°C一起温育过夜。

在杂交后，将膜于65°C在清洗缓冲液(10mM磷酸钠、2.5mM焦磷酸钠、0.5mM EDTA、0.1%SDS，用磷酸将pH调节至7.8)中清洗20分钟(三次)。将清洗的滤膜暴露于Phosphorimager屏以进行放射自显影术，并扫描图像。对探针记录检测条带的数目和大小。另外，使用分子量标志物来测定Southern印迹上的杂交片段大小。

表2：Southern分析中使用的探针的位置和长度。

探针名称	遗传元件	pDAB4468(bp)上的位置	长度(bp)
				aad-12	aad-12	10118-10768	671

实施例2.5：Southern印迹结果

表3中给出了基于aad-12PTU的已知限制性酶位点的用特定的消化和探针得到的预期的和观察到的片段大小。预期的片段大小基于pDAB4468的质粒图(图1)，而观察到的片段大小通过这些分析估计，并且基于经α³²P-标记的DNA分子量标志物II片段的指示大小。

自这些消化和杂交鉴定两类片段：内部片段，其中已知酶位点在探针区侧翼，并且完全包含在aad-12PTU的插入区内，和边界片段，其中已知酶位点位于探针区的一端，并且预期第二个位点在大豆基因组中。边界片段大小随事件而变化，因为在大多数情况中，DNA片段整合位点对于每个事件而言是独特的。边界片段提供了一种相对于整合DNA定位限制性酶位点并评估DNA插入物的数目的手段。对含有事件DAS-68416-4的三个大豆世代完成的Southern印迹分析产生如下的数据，其提示了来自质粒pDAB4468的低拷贝、完整的aad-12PTU被插入大豆事件DAS-68416-4的大豆基因组中。

表3：Southern印迹分析中预测的和观察到的杂交片段。

限制性酶SpeI和KpnI在质粒pDAB4468中含有独特的限制性位点。随后，选择这些酶来表征大豆事件DAS-68416-4中的aad-12基因插入物。预测大于5,436bp或大于5,383bp的边界片段在SpeI和KpnI消化后分别与aad-12基因探针杂交(表3)。在使用SpeI和KpnI时分别观察到约12,000bp和约16,000bp的单一aad-12杂交条带。探针与此大小的条带的杂交提示了aad-12基因在大豆事件DAS-68416-4的大豆基因组中的单一插入位点的存在。选择限制性酶PacI以释放2,904bp的片段，其含有aad-12植物转录单位(PTU，启动子/基因/终止子)(表3)。在PacI消化后用aad-12基因探针观察到预测的2,904bp片段。用对DAS-68416-4样品的所有三种酶消化，接着进行aad-12基因探针杂交获得的结果指示来自质粒pDAB4468的完整aad-12PTU的单一拷贝被插入大豆事件DAS-68416-4的大豆基因组中。

实施例2.6：主链序列的缺乏

为了监测大豆事件DAS-68416-4中大观霉素抗性基因的存在或缺乏，实施多重PCR测定法。设计实验，用于检测大观霉素抗性基因编码序列的5个不同区域和内源大豆凝集素基因(GenBank ID No:K00821M30884)序列中的407bp区，作为内部对照。另外，包括下列对照：(i)用携带对非转化大豆基因组DNA添加的大观霉素抗性基因的质粒DNA的阳性对照；(ii)使用来自非转化大豆Maverick的基因组DNA的阴性对照；和(iii)没有基因组DNA的空白。

使用CTAB方法来分离来自大豆的基因组DNA，并使用Pico Green来量化。相对于100ng/ul标准化每份样品的DNA浓度。使用对大观霉素抗性基因编码序列和凝集素基因序列特异性的引物序列来实施PCR反应。通过在2%E-凝胶上加载每份样品20μl PCR产物来分析反应物。

在E-凝胶上的多种扩增子的存在(100bp、150bp、和407bp的条带)会指示大豆事件DAS-68416-4含有大观霉素抗性基因编码序列(对大观霉素抗性基因编码序列预期100bp和150bp的扩增条带)。若仅存在与内部对照凝集素基因序列对应的407bp扩增子，则这指示大豆事件DAS-68416-4不含大观霉素抗性编码序列。

来自大豆事件DAS-68416-4的DNA样品没有扩增出100bp或150bp的片段。仅扩增出407bp片段。然而，100bp、150bp、和407bp扩增片段存在于阳性对照中，其中将携带大观霉素抗性基因的质粒DNA添加至大豆基因组DNA。含有来自非转化大豆的DNA的阴性对照扩增出单一407bp片段。最后，不含任何基因组DNA的反应不生成任何扩增片段。因此，在大豆事件DAS-68416-4中没有检测出大观霉素抗性编码序列。

实施例3：大豆事件DAS-68416-4的插入物和侧翼边界区中的DNA序列的克隆和表征

为了表征并描述基因组插入位点，测定大豆事件DAS-68416-4的T-链DNA插入物和侧翼基因组DNA边界区的序列。总体上，确认10,212bp的大豆事件DAS-68416-4基因组序列，其包含2,730bp 5’侧翼边界序列、1,091bp 3’侧翼边界序列、和6,391bpT-链插入物(SEQ ID NO:1)。序列分析确认大豆事件DAS-68416-4含有单一拷贝的完整转基因，其含有MAR元件、aad-12表达盒、和pat表达盒，与预期的T-链插入物没有序列变化。

基于大豆事件DAS-68416-4插入物和边界序列的PCR扩增证实边界区是大豆起源的，而且连接区可以用于大豆事件DAS-68416-4的事件特异性鉴定。对跨越连接区(包括侧翼边界序列)的序列的分析没有鉴定源自T-链插入的任何新的可读框(ORF>=150个密码子)。另外，通过克隆如下的基因组片段来表征T-链插入位点，所述基因组片段对应于鉴定的来自非转基因大豆基因组的侧翼边界序列的区域。比较大豆事件DAS-68416-4与野生型基因组序列揭示自初始基因座的55bp缺失和在所述事件的3’整合连接处的9bp插入。总体上，大豆事件DAS-68416-4的插入物和边界序列的表征指示，单一的、完整的T链拷贝存在于大豆基因组中。

实施例3.1：基因组DNA提取和量化

使用改良的CTAB方法自冻干的或新鲜碾碎的叶组织提取基因组DNA。在基因组DNA提取后，将DNA样品在1X TE(10mM Tris pH8.0,1mM EDTA)(Fluka,Sigma,St.Louis,MO)中溶解，并使用Pico Green法依照制造商的用法说明书(Molecular Probes,Eugene,OR)来量化。对于PCR分析，用分子生物学级水(5PRIME,Gaithersburg,MD)将DNA样品稀释以产生10-100ng/μL的浓度。

实施例3.2：PCR引物

表4列出了用于克隆并确认大豆事件DAS-68416-4的DNA插入物和侧翼边界区的引物序列，其中图2中标记了位置和描述。所有引物由IntegratedDNA Technologies,Inc.(Coralville,IA)合成。将引物在水(5PRIME,Gaithersburg,MD)中以100μM的浓度(对于储备溶液)溶解，并用水稀释至10μM的浓度(对于工作溶液)。

表5：用于大豆事件DAS-68416-4中的边界区和事件特异性序列的标准PCR扩增的条件

表6：关于T-链插入物的扩增子1-4的引物描述

表7：用于大豆事件DAS-68416-4中的边界区和事件特异性序列的标准PCR扩增的PCR混合物。

实施例3.3：基因组步行

使用GENOMEWALKER^TM通用试剂盒(Clontech Laboratories,Inc.,Mountain View,CA)遵循制造商的用法说明书来克隆大豆事件DAS-68416-4的pDAB4468 T-链插入物的5’和3’侧翼边界区。将约2μg来自大豆事件DAS-68416-4的基因组DNA用EcoRV和PvuII消化过夜(图2)。使用DNACLEAN&CONCENTRATOR^TM-25(ZYMO Research,Orange,CA)来纯化DNA消化物，接着与GENOMEWALKER^TM衔接头连接以构建GENOMEWALKER^TM文库。使用每个GENOMEWALKER^TM文库作为DNA模板以用衔接头引物AP1(试剂盒中提供)和构建体特异性引物ES_LEnd03或ES_PATEnd03(表4)进行一级PCR扩增。然后，使用一微升(1μL)1:25稀释的一级PCR反应物作为模板以用试剂盒中提供的嵌套衔接头引物AP2和嵌套构建体特异性引物ES_LEnd04或ES_PATEnd04(表4、7、和图2)的二级PCR扩增。

实施例3.4：常规的PCR

使用标准PCR来克隆并确认大豆事件DAS-68416-4的插入物和边界序列。使用TaKaRa LA TAQ^TM(Takara Bio Inc,Shiga,Japan)、HOTSTARTAQ^TMDNA聚合酶(Qiagen,Valencia,CA)、HIGH FIDELITY^TM PCR试剂盒(RocheDiagnostics,Inc)、或EASY-A^TM高保真性聚合酶试剂盒(Stratagene,LaJolla,CA)依照制造商的推荐规程进行常规的PCR扩增。表5、6、和7中列出了特定的PCR条件和扩增子描述。

实施例3.5：PCR产物检测、纯化、PCR产物的亚克隆、和测序

使用1.2%或2%(Invitrogen,Carlsbad,CA)依照产品用法说明书通过电泳来检查PCR产物。通过与DNA标志物比较来评估片段大小。若必要的话，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)通过自用溴化乙锭染色的在1x TBE(89mM Tris-硼酸盐，2mM EDTA，pH 8.3)中的1%琼脂糖凝胶切出碎片来纯化PCR片段。

使用供测序用的TOPO TA试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)依照产品用法说明书来将PCR片段亚克隆入载体中。具体地，遵循制造商的用法说明书将2至5微升克隆反应物转化入One Shot化学感受态TOP10细胞中。通过微量制备质粒DNA(QIAprep旋转微量制备试剂盒,Qiagen,CA)，接着用EcoRI限制性消化或者通过使用T3和T7引物的直接菌落PCR来确认克隆片段。然后，将选定菌落的质粒DNA或甘油储液外包(outsource)测序。

在亚克隆后，最初对推定的靶PCR产物测序以确认已经克隆出预期的DNA片段。选出含有预期DNA片段的菌落以通过引物步行完成双链全长测序。所有测序由Cogenics(Houston,TX)实施。

使用软件(Gene Codes Corporation,Ann Arbor,MI)来完成插入物和边界序列的最终装配。使用Vector NTI(第10和11版,Invitrogen,Carlsbad,CA)来实施大豆事件DAS-68416-4的插入物及其侧翼边界序列的注释。

针对GenBank非冗余核苷酸数据库使用BLAST程序来实施同源性搜索。实施使用Vector NTI(第11版,Invitrogen)的可读框(ORF)分析以鉴定大豆事件DAS-68416-4的完整插入物和侧翼边界序列，和野生型Maverick大豆系的初始基因座中的ORF(>=150个密码子)。

实施例3.6：5’端边界序列

使用针对转基因5’端的特异性嵌套引物组自每个大豆事件DAS-68416-4GENOMEWALKER^TM文库扩增DNA片段。观察到来自EcoRVGENOMEWALKER^TM文库的约1.8kb片段和来自PvuIIGENOMEWALKER^TM文库的约3kb片段。将这些片段克隆入载体中。随机挑出每个文库的5个菌落以进行末端测序，从而产生核苷酸序列数据。选出含有这两种PCR引物的序列的菌落以通过引物步行获得完整的序列。序列分析揭示了自大豆事件DAS-68416-4EcoRVGENOMEWALKER^TM文库扩增的克隆含有1,744bp DNA片段，并且自大豆事件DAS-68416-4PvuIIGENOMEWALKER^TM文库扩增的克隆含有3,047bp DNA片段。序列分析揭示了自EcoRVGENOMEWALKER^TM文库获得的DNA片段与自PvuIIGENOMEWALKER^TM文库克隆获得的DNA片段在引物ES_LEnd04与EcoRV位点间的区域重叠。这些DNA片段都含有转基因中的T-链边界B的5’端连接，指示它们是自大豆事件DAS-68416-4中的5’端转基因插入物及其侧翼边界的同一区域扩增的。发现所得的2,730bp大豆基因组序列与GenBank中的序列没有显著同源性。

实施例3.7：3’端边界序列

使用针对转基因3’端的特异性嵌套引物组自大豆事件DAS-68416-4EcoRVGENOMEWALKER^TM文库扩增具有约1.3kb大小的DNA片段。然后，将DNA片段克隆入载体中。随机挑出5个菌落以进行末端测序。所有5个克隆含有引物AP2和引物ES_PATEnd04两者的序列。对这些克隆的完整测序生成1,359bp共有DNA片段。序列分析公开了1,359bp片段，其由来自T-链边界A的3’端区的268bp片段和来自大豆基因组DNA的1,091bp片段组成。BLAST搜索没有鉴定出此1,091bp大豆DNA序列与GenBank中的序列间的任何显著同源性。

实施例3.8：DNA插入物和连接序列

使用基于PCR的方法自大豆事件DAS-68416-4克隆DNA插入物和侧翼边界区，如先前所描述的。使用5’和3’侧翼边界序列和预期的转基因序列来设计表6中所列的PCR引物。总共将4个重叠的DNA片段(978bp的扩增子1、2,414bp的扩增子2、1,834bp的扩增子3、和1,705bp的扩增子4)克隆并测序(图3)。基于四个片段间的重叠序列装配整个插入物和侧翼边界序列。对最终装配序列的分析确认源自pDAB4468转基因的6,391bp片段的存在，并且在与来自质粒pDAB4468的预期序列比较时没有遇到插入DNA序列的碱基变化。

实施例3.9：大豆基因组序列的确认

为了确认大豆事件DAS-68416-4转基因在大豆基因组中的插入位点，用不同引物对(图4和表5)实施PCR。使用来自大豆事件DAS-68416-4和其它转基因或非转基因大豆系的基因组DNA作为模板。如此，为了确认获得的5’端边界序列是否正确，使用两个aad-12特异性引物，例如AIILEnd05和AIILEnd06，和依照5’端边界序列设计的两个引物(称作16LEndG01和16LEndG02)来扩增跨越aad-12基因至5’端边界序列的DNA区段。类似地，为了确认克隆的3’端边界序列，使用pat特异性引物，例如PAT-End06和依照3’端边界序列设计的两个引物(称作16PATG01和16PATG02)来扩增跨越pat基因至3’端边界序列的DNA区段。仅自大豆事件DAS-68416-4的基因组DNA用每个引物对(位于大豆事件DAS-68416-4的侧翼边界的一条引物和一条转基因特异性引物)，而非自来自其它转基因大豆系或非转基因对照的DNA样品扩增具有预测大小的DNA片段。结果指示克隆的5’和3’边界序列是大豆事件DAS-68416-4中T-链插入物的侧翼边界序列。

为了进一步确认大豆基因组中的DNA插入物，完成跨越两个大豆序列的PCR扩增。使用依照5’端边界序列设计的两个引物16LEndG03和16LEndG04，和用于3’端边界序列的两个引物16PATG03和16PATG04来扩增如下的DNA区段，其含有整个转基因、5’端边界序列、和3’边界序列。如预期的，用引物对16LEndG03和16PATG03的PCR扩增自大豆事件DAS-68416-4的基因组DNA扩增出约9kb DNA片段和自非转基因大豆对照和其它大豆转基因系扩增出2.7kb DNA片段。类似地，相应地用引物对16LEndG04和16PATG04完成的PCR反应生成来自大豆事件DAS-68416-4样品的约9kb DNA片段及来自所有其它大豆对照系的2.8kb DNA片段。注意到在使用这两种引物对进行PCR时在除了大豆事件DAS-68416-4外的所有大豆样品中，具有约6kb大小的微弱条带是可见的，提示了此微弱的条带源自在大豆基因组中用此引物对的非特异性扩增。

实施例3.10：大豆基因组序列的确认

将来自非转基因大豆系Maverick的2.7kb和2.8kb扩增DNA片段(使用引物对16LEndG03和16PATG03或引物对16LEndG04和16PATG04得到)克隆并测序。其序列彼此匹配，并且与来自大豆事件DAS-68416-4的克隆5’和3’边界序列比对。这表明克隆的DNA序列含有pDAB4468的T-链整合入大豆事件DAS-68416-4中的基因座。比对分析还揭示了自初始基因座的55bp缺失和3’整合连接处的9bp插入物(图5)。在克隆的初始基因座的大豆基因组区域中没有鉴定出可读框(>/=450bp,150个aa)。

实施例4：经由大豆事件DAS-68416-4的侧翼SNP标志物的基因组表征

为了表征并描述基因组插入位点，测定位于插入物附近的标志物序列。使用一组多态性单核苷酸多态性(SNP)标志物来鉴定并定位转基因位置。大豆事件DAS-68416-42位于染色体4上的119.6cM处。此位置在两个侧翼SNP标志物BARC-044607-08736和BARC-019093-03299之间。更具体地，将转基因的位置定位于距离SNP标志物BARC-019093-03299为1.3cM (480kb)。

实施例4.1：用侧翼边界区序列的BLAST

使用大豆事件DAS-68416-4的侧翼边界区序列(SEQ ID NO:1)来对大豆全基因组序列进行BLAST。BLAST结果显示了大豆事件DAS-68416-4的这两个边界序列都位于作为连锁群C1的染色体(Gm04)上。

实施例4.2：SNP定位和BLAST结果

基于来自用边界序列的BLAST和定位的结果，将事件归入染色体4。因此，自大豆遗传连锁图选出10种SNP标志物。从由Cregan博士(Beltsville农业研究中心)和USDA开发的SNP标志物选出SNP标志物。这些SNP标志物与对应于染色体4的连锁群C1有关。使用SNP序列来对大豆全基因组序列进行BLAST以测定大豆事件DAS-68416-4的T-链插入物的物理位置。

实施例4.3：SNP标志物结果

将大豆事件DAS-68416-4定位于染色体4上的119.6cM处。两个侧翼SNP标志物是BARC-044607-08736和BARC-019093-03299。转基因距离SNP标志物BARC-019093-03299为1.3cM(480kb)，在SNP标志物BARC-044607-08736和BARC-019093-03299间约119.6cM。

实施例5：大豆事件DAS-68416-4中的AAD-12蛋白的表征

表征源自转基因大豆事件DAS-68416-4的重组AAD-12蛋白的生物化学特性。使用定量酶联免疫吸附测定法(ELISA)、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE，用考马斯蓝和糖蛋白检测方法染色)、和Western印迹法来表征蛋白质的生物化学特性并确认AAD-12蛋白的表达。

实施例5.1：植物组织中的AAD-12蛋白的表达

在大豆事件DAS-68416-4中测定AAD-12蛋白水平。使用定量酶联免疫吸附测定法(ELISA)方法在大豆叶中测量可溶性、可提取的AAD-12蛋白。

将大豆组织样品自测试植物分离，并制备好进行表达分析。用含有0.5%牛血清清蛋白(BSA)的含有去污剂Tween-20的磷酸盐缓冲盐水溶液(PBST)自大豆植物组织提取AAD-12蛋白。将植物组织离心；将水性上清液收集，若必要的话，用合适的缓冲液稀释，并以三明治式形式使用AAD-12ELISA试剂盒来分析。遵循制造商提示的方案来使用试剂盒。

实施检测分析以在大豆事件DAS-68416-4中在纵向(在世代间)和横向(在谱系间)两者上调查表达稳定性和可遗传性。在T5世代，大豆事件DAS-68416-4表达是稳定(不分离)且在所有谱系间一致(图6)。

在V3前、V3后、R2前、和R2后对大豆事件DAS-68416-4实施多个植物阶段的田间表达水平研究。表达数值对于所有喷雾处理以及对于用2,4-D除草剂喷雾和未喷雾的样地是相似的。应用2X喷雾率(2,240gm ae/ha 2,4-D)，并且在任何研究点时没有对植物观察到损伤。在v3前植物阶段中在所有谱系间的平均表达是300ug/cm²。在喷雾2,4-D后，表达保持稳定，谱系间平均值为400ug/cm²。当大豆达到R2前时，平均表达已经略微下降至200ug/cm²的平均值。在喷雾2,4-D后，R2后的表达已经回到400ug/cm²的先前平均值。见图6。实施例5.2：植物组织中的AAD-12蛋白的表达

在2008年期间在美国和加拿大的六个地方进行额外的田间表达研究。测试大豆事件DAS-68416-4的4个处理(未喷雾、用2,4-D喷雾、用草丁磷喷雾、或用2,4-D和草丁磷两者喷雾)。取样的植物组织包括叶、颗粒(grain)、根、和饲料(forage)。在V5和V10阶段时收集叶组织，并在发育的R3阶段时收集根和饲料。在发育的R8阶段时收集颗粒(Gaska,2006)。使用证实的酶联免疫吸附测定法(ELISA)方法来测量可溶性、可提取的AAD-12蛋白，如先前记载于实施例5.1的。按ng/mg干重计算所有组织类型的AAD-12蛋白水平。

表8中显示了多个大豆基质中的AAD-12蛋白浓度(位置间取平均值)的汇总。平均表达数值范围为R3阶段根中的15.5ng/mg干重至V5阶段叶组织中的66.1ng/mg。表达数值对于所有喷雾处理以及对于用2,4-D和草丁磷除草剂喷雾和未喷雾的样地是相似的。在六个位置间在对照组织中没有检测到AAD-12蛋白。

表8：自在2008年期间在美国和加拿大生成的大豆事件DAS-68416-4收集的组织中的AAD-12蛋白水平的汇总

实施例5.3：对AAD-12蛋白的SDS PAGE和Western印迹分析

在具有添加的稳定剂的基于PBST(具有0.05%Tween 20的磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4)的缓冲液中自大豆事件DAS-68416-4的冻干的叶组织提取AAD-12蛋白，并通过离心来收集可溶性蛋白质。将上清液过滤，并容许可溶性蛋白质结合苯基Sepharose(PS)珠(GE Healthcare,Piscataway,NJ)。在温育1小时后，将PS珠用PBST清洗，并将结合的蛋白质用Milli-Q水洗脱。添加氯化钠以提高电导率，并将经PS纯化的蛋白质加载到抗AAD-12免疫亲和柱上，所述抗AAD-12免疫亲和柱已经与AAD-12特异性多克隆抗体缀合。自该柱收集未结合的蛋白质，并用预冷却的PBS(磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4)广泛清洗该柱。用3.5M NaSCN,50mM Tris,pH 8.0缓冲液自该柱洗脱结合的蛋白质，并通过SDS-PAGE和Western印迹检查。使用相同的方案来自对照大豆系Maverick的叶组织分离蛋白质。Maverick不含aad-12基因，但是具有代表大豆事件DAS-68416-4植物的遗传背景。

将来自大豆事件DAS-68416-4和Maverick的冻干叶组织与含有约2.0%蛋白酶抑制剂混合物(Sigma,St.Louis,MO)的PBST缓冲液混合，并通过在Geno研磨机中用球轴承研磨来提取蛋白质。将样品离心，并将上清液与Laemmli样品缓冲液混合，加热，并短暂离心。将样品直接加载到Bio-Rad规范SDS-PAGE凝胶上。还将阳性参照标准品，即微生物衍生的AAD-12蛋白与样品缓冲液混合，并加载到凝胶上。用Tris/甘氨酸/SDS缓冲液(Bio-Rad,Hercules,CA)进行电泳。在电泳后，将凝胶切成两半，一半用Pierce GelCode Blue蛋白质染料染色，而将另一半凝胶电印迹到硝酸纤维素膜上。然后，用AAD-12特异性多克隆兔抗体探查硝酸纤维素膜。使用化学发光底物来显现免疫反应性条带。在微生物衍生的AAD-12中，如在考马斯染色的SDS-PAGE凝胶上显现的主要蛋白质条带是约32kDa。如预期的，相应的植物衍生的AAD-12蛋白在大小上与微生物衍生的蛋白质相同。可预测地，在AAD-12蛋白外，植物纯化的级分含有微量的非免疫反应性杂质。共纯化的蛋白质有可能通过与柱基质的弱相互作用而保留于柱上(Williams等,2006,Kennedy和Barnes,1983及Holroyde等,1976)。

微生物衍生的AAD-12和DAS-68416-4植物组织提取物显示了使用抗AAD-12多克隆抗体在Western印迹上的预期大小的阳性信号。在AAD-12Western印迹分析中，在对照Maverick提取物中没有观察到免疫反应性蛋白质，并且在来自转基因植物的样品中没有看到交替大小的蛋白质(聚集体或降解产物)。单克隆抗体确实在微生物衍生的蛋白质中检出少量AAD-12二聚体。这些结果增加如下的证据，即AAD-12蛋白在大豆中表达。

实施例6：经由Southern印迹对大豆事件DAS-68416-4的甲基化检测分析

导入的转基因在整合入植物基因组中后可以经历沉默。转基因表达可以在转录水平和/或转录后水平受到抑制。已经报告了转录基因沉默与转基因、其启动子和其它相关序列的甲基化有关(Stem等,1997)。为了检测特定序列中的甲基化，一种方法利用甲基化敏感性限制性酶来消化DNA，接着对DNA产物进行Southern印迹分析。在特定的限制性酶位点被甲基化时，酶不会切割DNA。限制性位点的甲基化导致更高的分子量DNA片段，其在Southern印迹上可检出。实施基于Southern印迹的甲基化分析来测定大豆事件DAS-68416-4的T链插入物的甲基化状态。使用对aad-12基因及其启动子特异性的探针和两种甲基化敏感性限制性酶进行此测定法。未检出aad-12表达盒的甲基化。

6.1.大豆叶样品收集和基因组DNA(gDNA)分离

自大豆事件DAS-68416-4和非转基因大豆系Maverick的个体植物的叶制备基因组DNA。使用传统的CTAB法自冻干的叶组织分离基因组DNA。在提取后，使用Pico Green试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)来量化DNA。

6.2.DNA消化和分离

对于DNA的分子表征，通过将每μgDNA约5个单位的选定的限制性酶和相应的反应缓冲液添加至每份DNA样品来消化十微克(10μg)来自大豆事件DAS-68416-4和非转基因大豆系Maverick的基因组DNA。将每份样品于约37°C温育过夜。使用限制性酶AciI和Hyp188III来进行消化(New EnglandBiolabs,Ipswich,MA)。使用与测试样品相同的规程和限制性酶来消化来自非转基因大豆Maverick的DNA以充当阴性对照。将经消化的DNA样品在将NaCl添加至终浓度0.1M后用异丙醇沉淀，并在20ul 1X加样缓冲液(0.1%溴酚蓝、100mM EDTA、50%甘油、10mM Tris pH 7.5)中重悬。然后，以35瓦特将DNA样品和分子大小标志物电泳通过具有0.4X TAE缓冲液(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)的0.85%琼脂糖凝胶达约18-22小时以实现片段分离。用溴化乙锭(Invitrogen,Carlsbad,CA)染色凝胶，并在紫外(UV)光下显现DNA。

6.3.Southern转移和膜处理

实施Southern印迹分析，如由Severson等,(1997)所描述的。简言之，在电泳分离和在UV光下显现DNA片段后，将凝胶暴露于变性溶液(150mMNaOH,3mM EDTA)达约20分钟，接着是中和溶液(150mM NaPO₄,pH 7.8)达至少20分钟。使用具有转移缓冲液(25mM焦磷酸钠，pH 10)的芯吸系统对尼龙膜(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)实施Southern转移过夜。在转移后，将膜于65°C烘烤约2小时。此过程导致准备好杂交的Southern印迹膜。

6.4.DNA探针标记和杂交

使用经标记的探针来检测与尼龙膜结合的DNA片段。将探针作为用特异性引物自质粒pDAB4468扩增的PCR片段生成。自琼脂糖凝胶切出并纯化这些PCR扩增片段。使用纯化的DNA片段作为生成杂交探针的模板。使用GEHealthcare READY-TO-GO^TM DNA标记珠(GE Healthcare,Piscataway,NJ)遵循制造商的用法说明书通过随机引发用α³²P特异性的核苷酸标记杂交探针，并通过PROBEQUANTTM G-50微柱(Amersham/Pharmacia,Piscataway,NewJersey,USA)纯化。表9中描述了用于该研究的探针列表。

使用杂交缓冲液(Sigma,St.Louis,MO)，分别将预杂交和杂交于65°C实施4小时和过夜。在杂交后，将膜于65°C在清洗缓冲液(10mM磷酸钠、2.5mM焦磷酸钠、0.5mM EDTA、0.1%SDS，用磷酸将pH调节至7.8)清洗三次，达20分钟。将清洗的滤膜暴露于Phosphorimager屏以进行放射自显影术，并扫描图像。

表9：用于Southern分析的探针的位置和长度。

探针名称	遗传元件	在pDAB4468(bp)上的位置	长度(bp)
				ProAU10-a	泛素启动子(AtUbi10)	10827-11905	1100
ProAU10-b	泛素启动子(AtUbi10)	10942-12020	1100
				aad-12	aad-12	10118-10768	671

6.5探针剥离

在获得Southern杂交数据后将DNA探针剥离膜印迹，并可以挽救膜印迹以与不同DNA探针进行杂交。简言之，在暴露后，将膜印迹在再生溶液1(30mM NaOH,1mM Na2EDTA)中于室温清洗10分钟，并在再生溶液2(5mMNaPO4,1mM Na2EDTA,0.1%SDS)中于65°C清洗30分钟。然后，将膜印迹在2X SSC中短暂清洗，并准备好与另一个DNA探针杂交。将膜印迹暴露于Phosphorimager屏以进行放射自显影术，从而确保在进行下一次杂交前剥离所有DNA探针。

6.6.Southern印迹结果

在此研究中使用甲基化敏感性限制性酶AciI和Hyp188III以测定aad-12基因及其启动子AtUbi10的甲基化状态。表10中给出了基于pDAB4468的T链DNA的已知限制性酶位点的用特定消化和探针得到的预期片段大小。在Southern印迹上检出更高分子量片段会指示AciI和Hyp188III限制性酶位点的识别序列中的胞嘧啶的甲基化。因此，甲基化会导致限制性酶不能消化基因组DNA。

使用限制性酶AciI和Hyp188III来检查aad-12基因甲基化状态。使用aad-12探针来观察具有预期大小的杂交条带。此数据提示了在大豆事件DAS-68416-4中在AciI和Hyp188III的识别位点中没有发生甲基化。类似地，使用AtUbi10探针在用Hyp188III消化的大豆事件DAS-68416-4的DNA样品中检测出预测分子量的条带。此数据指示识别位点在aad-12启动子序列中没有被甲基化。

表10：Southern印迹分析中预测的和观察到的杂交片段。

实施例7：农艺学数据

用大豆事件DAS-68416-4进行农艺学试验作为美国和加拿大的6个位置的2008组成研究的一部分，而且还在分开的研究中在2009年在美国和加拿大的8个位置进行。这些研究比较事件DAS-68416-4大豆(有和没有2,4-D和/或草丁磷除草剂应用)与其非转基因近等基因对照(Maverick)。这两项研究间的结果显示了农艺学参数在对常规大豆系获得的范围内。

实施例7.1：2008农艺学数据的产生

用事件DAS-68416-4大豆和非转基因对照(品种Maverick)的农艺学研究在2008年在位于爱荷华州(Iowa)、伊利诺斯州(Illinois)、印地安那州(Indiana)、内布拉斯加州(Nebraska)和加拿大安大略省(2个位置)的6个位置进行。评估农艺学决定因素，包括群落地段(stand)/种群计数(population count)、幼苗/植物活力、植物高度、倒伏、发病率、昆虫损害、和开花前天数，以调查与对照系Maverick相比大豆事件DAS-68416-4(具有和没有除草剂处理)的等同。本研究称为实验1。

以每25ft行约112个种子的播种率种植测试和对照大豆种子，其中行间距为约30英寸(75cm)。在每个位置，建立每个处理的三个重复样地，其中每个样地由2-25ft行组成。样品以随机化完全区组(RCB)设计排列，每个位置具有独特的随机化。每个大豆样地以两行类似成熟度的非转基因大豆为边界。整个试验位置以最小10ft的类似相对成熟度的非转基因大豆围绕。

以每英亩(187L/ha)约20加仑的喷雾体积应用除草剂处理。这些应用设计为重复最大标签率(label rate)商业实践。以三次撒施过多应用方式应用2,4-D，季节性总共为3lb ae/A。在出土前和约V4和R2生长阶段时进行1.0lb ae A(1,120g/ha)的个别应用。以两次撒施过多应用方式应用草丁磷，季节性总共为0.74lb ai/A(828g ai/ha)。在约V6和R1生长阶段时进行0.33lb ai/A和0.41lbai/A(374和454g ai/ha)的个别应用。

使用混合模型(SAS第8版;SAS研究所1999)在田间位置间对农艺学数据进行方差分析。认为输入(Entry)是固定效果，而位置、位置内的区组、按输入的位置(location-by-entry)、和按位置内区组的输入(entry-by-block withinlocation)称为随机效果。使用F-检验来评估总体处理效果的显著性。使用t-检验在对照与未喷雾的大豆事件DAS-68416-4(未喷雾)、用草丁磷喷雾的大豆事件DAS-68416-4(大豆事件DAS-68416-4+草丁磷)、用2,4-D喷雾的大豆事件DAS-68416-4(大豆事件DAS-68416-4+2,4D)和用草丁磷和2,4-D两者喷雾的大豆事件DAS-68416-4(大豆事件DAS-68416-4+这两者)转基因输入间进行配对对比。还使用假发现率(False Discovery Rate，FDR)来计算校正过的P-值以控制多重性(Benjamini和Hochberg,1995)。

表11：实验1中评估的农艺学参数。

进行对自对照、未喷雾的大豆事件DAS-68416-4、大豆事件DAS-68416-4+2,4-D、大豆事件DAS-68416-4+草丁磷、和大豆事件DAS-68416-4+两种除草剂收集的农艺学数据的分析。对群落地段计数、早期群体、幼苗活力、应用后损伤、倒伏、最终的群落地段计数或开花前天数没有观察到统计学显著性差异(表12)。对于高度，在对照与大豆事件DAS-68416-4+2,4-D喷雾之间观察到显著的配对t-检验。然而，没有观察到显著的总体处理效果，差异在大豆事件DAS-68416-4处理与对照之间非常小，并且差异在不同大豆事件DAS-68416-4处理间不是共享的。基于这些结果，大豆事件DAS-68416-4与近等基因非转基因对照是农艺学上等同的。

表12：对来自实验1的农艺学特征的分析。

a使用F-检验评估的总体处理效果。

b使用t-检验比较喷雾的和未喷雾的处理与对照。

c使用假发现率(FDR)规程校正的P-值。

d 0-100%量表；(用群落地段计数除以种植的种子的数目)*100。

e按1-10量表的视觉评估；10=与非转化植物等同的生长。

f按0-100%量表的视觉评估；0%=无损伤。

f从种植时直到开花的天数。

粗体的P-值是显著的(<0.05)。

实施例7.2：2009农艺学数据的产生

在2009年在位于阿肯色州(Arkansas)、爱荷华州、伊利诺斯州、印地安那州、密苏里州(Missouri)、和内布拉斯加州(Nebraska)的8个位置进行用大豆事件DAS-68416-4和非转基因对照(品种Maverick)的农艺学研究。农艺学决定因素，包括群落地段/种群计数、幼苗/植物活力、植物高度、发病率、昆虫损害、和开花前天数，以调查大豆事件DAS-68416-4大豆(具有和没有除草剂处理)与对照的等同(表13)。

表13：在农艺学和产率试验(2009)中收集的数据。

*B–喷雾和未喷雾测试，S–仅喷雾测试

对试验使用随机化完全区组设计。输入是大豆事件DAS-68416-4、Maverick对照系、和商品化的非转基因大豆系。以每行约112个种子的播种率种植测试、对照和参照大豆种子，其中行间距为约30英寸(75cm)。在每个位置，建立每个处理的4个重复样地，其中每块样地由2-25ft行组成。每个大豆样地以2行非转基因大豆(Maverick)为边界。整个试验位置以最小4行(或10ft)的非转基因大豆围绕。应用合适的昆虫、杂草、和疾病控制实践来生成农艺学可接受的作物。

应用除草剂处理以重复最大标签率商业实践。处理由非喷雾对照和在规定的生长阶段应用的2,4-D、草丁磷、2,4-D/草丁磷的除草剂应用组成。对于2,4-D应用，在V4和R2生长阶段以1.0lb ae/A(1,120g ae/ha)的比率应用除草剂。对于草丁磷处理，在V4和V6-R2生长阶段对植物进行应用。对于这两种应用，对于V4和V6-R2应用分别以0.33lb ai/A(374g ai/ha)和0.41lb ai/A(454g ai/ha)的比率应用草丁磷。这两种除草剂应用的输入是大豆事件DAS-68416-4和对照，包括非转基因Maverick。预期Maverick样地在除草剂应用后死亡。

使用混合模型(SAS第8版;SAS研究所1999)在田间位置间对农艺学数据进行方差分析。认为输入是固定效果，而位置、位置内的区组、按输入的位置、和按位置内区组的输入称为随机效果。以类似的方式用输入作为固定效果及区组和按区组的输入作为随机效果来完成个别位置的分析。为了统计学分析，数据没有四舍五入。在95%置信水平宣称显著性差异，并且使用F-检验来评估总体处理效果的显著性。使用T-检验在未喷雾的AAD-12(未喷雾)、用草丁磷喷雾的AAD-12(AAD-12+草丁磷)、用2,4-D喷雾的AAD-12(AAD-12+2,4-D)和用草丁磷和2,4-D两者喷雾的AAD-12(AAD-12+2,4-D+草丁磷)转基因输入与对照输入间进行配对对比。

由于此研究中进行的大量对比，多重性是一个问题。在单一研究中进行大量比较以寻找意料不到的效果时，多重性是一个问题。在这些条件下，基于比较方式的(comparison-wise)p-值来错误宣称差异的可能性是非常高的(1-0.95^比较数目)。在此研究中，每个分析物(16种对农艺学分析的观察类型)有4次比较，导致在农艺学方面的64次比较。因此，基于未校正的p-值来宣称一个或多个假差异的可能性为对于农艺学的99%(1-0.95⁶⁴)。

进行自对照、未喷雾的AAD-12、AAD-12+草丁磷、AAD-12+2,4-D、和AAD-12+2,4-D+草丁磷输入收集的农艺学数据的分析。对于位置间分析(表14)，对幼苗活力、最终群体、植物活力/损伤(V4,R1)、倒伏、发病率、昆虫损害、开花前天数、成熟前天数、豆荚数目、种子数目、产率、和植物高度没有观察到统计学显著性差异。对于群落地段计数和早期群体，在对照与AAD-12+草丁磷输入间观察到显著的配对t-检验，但是不伴随显著的总体处理效果或经FDR校正的p-值。对于植物活力/损伤(R2)，在对照与AAD-12+草丁磷和AAD-12+2,4-D+草丁磷输入两者间观察到显著的配对t-检验和显著的总体处理效果，但是不伴随显著的经FDR校正的p-值。所有这些变量的均值结果也在对此研究中测试的参照系找到的范围内。

表14：位置间2009农艺学特征结果的汇总

a在分析前不转化测量单位。

b使用F-检验评估的总体处理效果。

c使用t-检验(P-值)来与对照比较；使用假发现率(FDR)规程来校正P-值(校正过的p)；认为P-值<0.05是显著的。

实施例7.3：生态学评估

大豆事件DAS-68416-4田间试验由熟悉大豆栽培实践的人员(育种人员、野外站(field station)管理者、田间农学家、田间合作人(associate))监测并观察。进行田间测试的人员视觉监测与相同试验中的常规大豆品种相比，大豆事件DAS-68416-4植物上的植物疾病和有害生物的发生率。作为实施例7.1中描述的实验1的一部分，按0-100%的数字量表评定疾病和昆虫损害，其中0%代表由于发病率或昆虫抗性而没有损伤。表15显示了实验1中所描述的6个位置间的结果。

表15：对来自实验1(实施例7.1)的发病率和昆虫损害的分析。

a使用F-检验评估的总体处理效果。

b使用t-检验来比较喷雾的和未喷雾的处理与对照。

c使用假发现率(FDR)规程校正的P-值。

e按0-100%量表的视觉评估；0%=无损伤。

对发病率没有观察到统计学显著性差异。对于昆虫损害，在对照与大豆事件DAS-68416-4+两种除草剂间观察到显著的配对t-检验。然而，没有观察到显著的总体处理效果，大豆事件DAS-68416-4处理与对照间的差异较小，并且差异不是不同大豆事件DAS-68416-4处理间共享的。

还从2006-2008年进行的所有USDA APHIS通报的田间试验进行生态学观察。记录大豆事件DAS-68416-4植物试验中的发病率和昆虫存在，并检查与常规的对照相比大豆事件DAS-68416-4植物的发病率或响应的差异。在所有情况中，与常规的对照相比，没有在任何大豆事件DAS-68416-4植物试验中看到差异。表16中描述了大豆事件DAS-68416-4和常规大豆试验中观察到的疾病和昆虫应激源。这些观察结果支持如下的结论，即大豆事件DAS-68416-4对生态学应激源的响应与常规大豆的响应没有差异。

表16：在DAS-68416-4和常规大豆试验中观察到的疾病和昆虫应激源。

实施例7.4：萌发性(Germancy)和休眠评估

通过与温暖和寒冷条件下近等基因比较物相比查看大豆事件DAS-68416-4种子的萌发来评估种子休眠特征的变化。

对于温暖萌发测试，将大豆事件DAS-68416-4和对照大豆种子以25个/板放入含有用水饱和的萌发垫的培养皿中，并排出过量的水。将板于25°C放置，并在这些条件下保持5天。每个系制备16块板(400个种子)。在5天后，记录未萌发种子的数目。

对于寒冷萌发测试，以装有盆栽土壤的每半浅苗床(half-flat)100个种子种植种子。使浅苗床在水下，并于10°C保持7天，接着暴露于25°C达5天，之后记录非萌发种子的数目。

使用完全随机化设计以每个重复100个种子的四个重复通过方差分析(ANOVA)分析来自每个测试的数据。为了统计学分析，使用萌发种子数目除以100的平方根的反正弦来转化数据。表17中汇总了百分比萌发。

表17：在温暖和寒冷条件下的大豆事件DAS-68416-4种子的萌发。

在温暖或寒冷萌发实验中在大豆事件DAS-68416-4与对照大豆种子间在萌发方面没有显著差异(分别为Pr>F=1.0和0.13)。这些结果提示了种子休眠特征在大豆事件DAS-68416-4中尚未改变。

实施例7.5：农艺学、疾病、有害生物、和萌发性特征的汇总

遍及整个生长季节评估植物生长特征的农艺学数据表明大豆事件DAS-68416-4与常规非转基因大豆的等同。植物生长和表型特征、如通过对疾病和昆虫压力的易感性指示的对生态学应激源的响应、以及萌发和休眠特征在多种多样环境间在大豆事件DAS-68416-4植物和常规大豆间没有变化。因此，这些数据支持如下的结论，即大豆事件DAS-68416-4的农艺学、疾病、和有害生物特征与常规大豆的农艺学、疾病、和有害生物特征没有显著差异，并且没有指示大豆事件DAS-68416-4大豆会显示(post)升高的植物有害生物风险。

Benjamini,Y.,Hochberg,Y.(1995)Controlling the false discovery rate:Apractical and powerful approach to multiple testing.J.Royal Statistical Soc.B,57:289-300.

实施例8：颗粒和饲料组成

对大豆饲料和颗粒实施组成分析以调查大豆事件DAS-68416-4(用2,4-D、草丁磷、2,4-D+草丁磷喷雾，或未用2,4-D或草丁磷喷雾)与常规大豆间的等同。使用具有和没有大豆事件DAS-68416-4的种子系在位于美国和加拿大的主要大豆生产区内的6个测试位置进行试验。测试位置代表多种多样的农艺学实践和环境条件的区域，并且是用于实施例7.1中所描述的蛋白质表达分析和农艺学实验1的相同位置。试验位于爱荷华州、伊利诺斯州、印地安那州、内布拉斯加州、和加拿大安大略省(2个位置)。

用多种测试对大豆饲料和颗粒的样品分析营养物含量。对饲料实施的分析包括蛋白质、脂肪、灰分(ash)、湿度(moisture)、碳水化合物、酸性去污纤维(ADF)、中性去污纤维(NDF)、钙和磷。对颗粒实施的分析包括近似值(proximate)(灰分、总脂肪、湿度、蛋白质、胆固醇、碳水化合物)、纤维、矿物质、氨基酸、脂肪酸、维生素、抗营养物。

将对大豆饲料和颗粒的营养分析的结构与文献中报告的数值比较。还使用混合模型在田间位置间进行方差分析。认为输入是固定效果，而位置、位置内的区组、和按输入的位置称为随机效果。使用F-检验来评估总体处理效果的显著性。使用t-检验在大豆事件DAS-68416-4(未喷雾的AAD-12；未用2,4-D或草丁磷喷雾)、用草丁磷喷雾的大豆事件DAS-68416-4(大豆事件DAS-68416-4+草丁磷)、用2,4-D喷雾的大豆事件DAS-68416-4(大豆事件DAS-68416-4+2,4-D)和用草丁磷和2,4-D两者喷雾的大豆事件DAS-68416-4转基因输入(大豆事件DAS-68416-4+这两者)与对照输入间进行配对对比。

由于此研究中进行的大量对比，多重性是一个问题。在单一研究中进行大量比较以寻找意料不到的效果时，多重性是一个问题。在这些条件下，基于比较方式p-值来错误宣称差异的可能性是非常高的(1-0.95^比较数目)。在此研究中，每个分析物(75种定量分析物)有4次比较，导致在位置间组成分析上进行的300次比较。因此，基于未校正的p-值来宣称一个或多个假差异的可能性大于99.99%。

一种解决多重性的方法是校正p-值以控制实验方式的(experiment-wise)错误率(所有宣称的差异是显著的可能性)，但是当在研究中进行许多比较时，可显著降低用于检测特定效果的能力。一种具有大得多的能力的备选是校正p-值以控制每个宣称的差异是显著的可能性。这可以使用假发现率(FDR)规程(Benjamini和Hochberg,1995)来完成。因此，可以使用FDR来校正p-值以改善处理间的实际差异与随机效果(假阳性)的区分。

实施例8.1：对大豆饲料的组成分析

实施对来自对照、未喷雾的大豆事件DAS-68416-4、大豆事件DAS-68416-4+草丁磷、大豆事件DAS-68416-4+2,4-D和大豆事件DAS-68416-4+两种除草剂的大豆饲料样品中的蛋白质、脂肪、灰分、湿度、碳水化合物、酸性去污纤维(ADF)、中性去污纤维(NDF)、钙和磷的分析。表18中显示了所有位置间的结果的汇总。

在位置间分析中在对照与转基因输入间在蛋白质、脂肪、灰分、湿度、碳水化合物、ADF、NDF、钙或磷方面没有观察到统计学差异。大豆事件DAS-68416-4+草丁磷和大豆事件DAS-68416-4+这两种除草剂的位置间均值灰分数值在文献范围外部，对于大豆事件DAS-68416-4+草丁磷和大豆事件DAS-68416-4+2,4-D，NDF数值亦然。所有处理(包括非转基因对照)的ADF数值也在文献数值外部。均值数值在非转基因对照与任何转基因输入间在饲料中的任何近似值、纤维类型、或矿物方面没有显著差异。基于这些组成成分，来自大豆事件DAS-68416-4大豆的饲料与近等基因非转基因对照的饲料基本上等同。

表18：对大豆饲料的近似值、纤维和矿物分析的汇总(%干重)。

a组合的范围。

b使用F-检验评估的总体处理效果。

c使用t-检验比较转基因处理与对照。

d使用假发现率(FDR)规程校正的P-值。

NR=未报告

粗体指数值在报告的文献范围外部。

粗体P-值是显著的(<0.05)。

实施例8.2：对大豆粒的组成分析

实施例8.2.1：近似值和纤维

实施对来自对照、未喷雾的大豆事件DAS-68416-4、大豆事件DAS-68416-4+草丁磷、大豆事件DAS-68416-4+2,4-D和大豆事件DAS-68416-4+两种除草剂的大豆粒样品中的蛋白质、脂肪、灰分、湿度、胆固醇、碳水化合物、ADF、NDF和总膳食纤维的分析。表19中显示了所有位置间的结果的汇总。

在位置间分析中在对照与转基因输入间在脂肪、ADF或总膳食纤维方面没有观察到统计学差异。然而，对于大豆事件DAS-68416-4+2,4-D输入，ADF比文献范围略高。

基于未校正的p值，与对照相比，蛋白质水平对于未喷雾的、大豆事件DAS-68416-4+2,4-D、和大豆事件DAS-68416-4+两种除草剂在位置间分析中显著不同。然而，在FDR校正后，仅大豆事件DAS-68416-4+2,4-D的p-值是显著的，并且所有处理的总体均值蛋白质数值在报告的文献数值内，指示差异没有生物学意义。

在对照与2,4-D喷雾的大豆事件DAS-68416-4处理间在灰分的位置间分析中观察到显著的未校正p-值，但是没有观察到总体处理效果或校正的p值。灰分数值也在报告的文献数值内，指示差异没有生物学意义。

基于未校正的p值，与对照相比，湿度水平对于未喷雾的、大豆事件DAS-68416-4+2,4-D、和大豆事件DAS-68416-4+两种除草剂在位置间分析中显著不同。然而，总体处理效果对于湿度不是显著的，仅大豆事件DAS-68416-4+2,4-D处理具有显著的经FDR-校正的p-值，并且所有处理的均值湿度水平在文献范围内。这指示差异没有生物学意义。

胆固醇数值均小于定量限度(<LOQ)，并且没有报告文献数值。

基于未校正的p值，与对照相比，碳水化合物水平对于未喷雾的、大豆事件DAS-68416-4+草丁磷、和大豆事件DAS-68416-4+2,4-D在位置间分析中显著不同。然而，基于经FDR校正的p-值，仅大豆事件DAS-68416-4+2,4D处理与对照显著不同，并且所有处理均值在报告的文献数值内，指示与非转基因大豆的等同。

基于未校正的p值，与对照相比，NDF水平对于大豆事件DAS-68416-4+草丁磷在位置间分析中显著不同，但是这没有伴随显著的经校正的p-值或总体处理效果。NDF位置间数值比大豆事件DAS-68416-4+草丁磷和大豆事件DAS-68416-4+2,4-D输入的报告文献数值略高，但是与非转基因近等基因对照相比，差异为小于9%。

基于这些组成成分，来自大豆事件DAS-68416-4的颗粒基本上等同非转基因大豆的。

表19：大豆粒的近似值和纤维分析(％干重)的汇总。

a组合的范围。

b使用F-检验评估的总体处理效果。

c使用t-检验比较转基因处理与对照。

d使用假发现率(FDR)规程校正的P-值。

NA=未显示统计学分析，因为大部分数据小于LOQ。

NR=未报告

粗体指数值在报告的文献范围外部。

粗体P-值是显著的(<0.05)。

实施例8.2.2：矿物

实施对来自对照、未喷雾的大豆事件DAS-68416-4、大豆事件DAS-68416-4+草丁磷、大豆事件DAS-68416-4+2,4-D和大豆事件DAS-68416-4+这两种除草剂的大豆粒样品中的钙、铬、铜、碘、铁、镁、锰、钼、磷、钾、硒、钠和锌的分析。表20中显示了所有位置间的结果的汇总。

基于未校正的p-值，在对照与转基因输入间在铬、铜、碘、铁、锰、钼、磷、硒和钠(未检出)方面没有观察到统计学差异。

基于未校正的p-值，对于大豆事件DAS-68416-4+2,4-D，钙在位置间分析中具有显著差异，但是这与显著的经FDR校正的p-值或总体处理效果无关，并且所有处理均值落入文献范围内，指示差异没有生物学意义。

分别基于未校正的和校正的p-值，与对照相比，镁水平对于大豆事件DAS-68416-4+两种除草剂和大豆事件DAS-68416-4+草丁磷在位置间分析中显著不同，但是总体处理效果不是显著的。镁位置间均值数值比报告的文献数值略低，但是与对照相比，差异较小(<3%)，并且与对照相比，所有大豆事件DAS-68416-4输入更接近文献数值。

所有大豆事件DAS-68416-4输入在位置间分析中比对照具有显著更高的钾数值。然而，与对照相比，差异较小(<5%)，并且与对照相比，所有大豆事件DAS-68416-4输入更接近文献数值。

基于未校正的p-值，锌水平的差异对于大豆事件DAS-68416-4+两种除草剂在位置间分析中是显著的，然而，这没有伴随显著的经FDR-校正的p-值或总体处理效果，并且差异较小(<4%)。

基于这些组成成分，来自大豆事件DAS-68416-4的颗粒基本上等同非转基因大豆的。

表20：大豆粒的矿物分析(mg/100g干重)的汇总。

a组合的范围。

b使用F-检验评估的总体处理效果。

c使用t-检验比较转基因处理与对照。

d使用假发现率(FDR)规程校正的P-值。

NR=未报告

NA=未显示统计学分析，因为大部分数据小于LOQ。

粗体指数值在报告的文献范围外部。

粗体P-值是显著的(<0.05)。

实施例8.2.3：氨基酸

实施对来自对照、未喷雾的大豆事件DAS-68416-4、大豆事件DAS-68416-4+草丁磷、大豆事件DAS-68416-4+2,4-D和大豆事件DAS-68416-4+两种除草剂的大豆粒样品中的下列氨基酸的分析：丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、和缬氨酸。表21中显示了所有位置间的结果的汇总。

在对照与转基因输入间在胱氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、酪氨酸或色氨酸方面没有观察到统计学差异。基于未校正的p-值，大豆事件DAS-68416-4+2,4-D的异亮氨酸水平与对照显著不同，但是这没有伴随显著的经FDR-校正的p-值或显著的总体处理效果。与对照相比，剩余的12种氨基酸的水平对于两个或更多个大豆事件DAS-68416-4输入略低(<7%)，但是均落入非转基因大豆的文献范围内。所有输入的所有氨基酸均在文献范围内，指示差异没有生物学意义。基于这些组成成分，来自大豆事件DAS-68416-4的颗粒基本上等同非转基因大豆的。

表21：大豆粒的氨基酸分析(%干重)的汇总。

a组合的范围。

b使用F-检验评估的总体处理效果。

c使用t-检验比较转基因处理与对照。

d使用假发现率(FDR)规程校正的P-值。

粗体指数值在报告的文献范围外部。

粗体P-值是显著的(<0.05)。

实施例8.2.4：脂肪酸

实施对来自对照、未喷雾的大豆事件DAS-68416-4、大豆事件DAS-68416-4+草丁磷、大豆事件DAS-68416-4+2,4-D和大豆事件DAS-68416-4+这两种除草剂的大豆粒样品中的22种脂肪酸。表22中显示了所有位置间的结果的汇总。

分析脂肪酸10:0癸酸、15:0十五烷酸、15:1十五碳烯酸、20:3二十碳三烯酸、20:4花生四烯酸、8:0辛酸、12:0月桂酸、14:0豆蔻酸、14:1肉豆蔻烯酸、17:1十七烯酸、18:3gamma亚麻酸、和20:2二十碳二烯酸，并且结果小于LOQ。脂肪酸16:0棕榈酸、17:0十七烷酸、和20:1二十烯酸在对照与AAD-12输入间没有显著不同，尽管20:1二十烯酸数值低于AAD-12+草丁磷和AAD-12+两种除草剂的报告文献数值。然而，与对照相比，差异较低(<5%)。

基于未校正的p-值，16:1棕榈油酸的水平在对照与未喷雾的大豆事件DAS-68416-4、大豆事件DAS-68416-4+草丁磷、大豆事件DAS-68416-4+2,4-D、和大豆事件DAS-68416-4+两种除草剂间显著不同。然而，仅未喷雾的大豆事件DAS-68416-4输入具有对于16:1棕榈油酸显著的经FDR-校正的p-值。与报告的文献数值相比，16:1棕榈油酸位置间数值对于此处理更低，但是与近等基因对照相比，差异较小(<13%)。

基于未校正的p-值，18:0硬脂酸的水平在对照与未喷雾的和大豆事件DAS-68416-4+草丁磷间显著不同。然而，基于经校正的p-值或总体处理效果，没有观察到显著差异，并且所有输入在报告的文献范围内，指示与非转基因大豆的等同。

18:1油酸的水平在对照与未喷雾的大豆事件DAS-68416-4、大豆事件DAS-68416-4+草丁磷、大豆事件DAS-68416-4+2,4-D、和大豆事件DAS-68416-4+两种除草剂间显著不同。然而，18:1油酸水平对于所有处理在报告的文献数值内，指示与非转基因大豆的等同。

基于未校正的p-值，18:2亚油酸的水平在对照与未喷雾的和大豆事件DAS-68416-4+2,4-D间显著不同。然而，在经校正的p-值或总体处理效果中没有观察到显著差异，并且18:2亚油酸水平对于所有处理在报告的文献数值内，指示与非转基因大豆的等同。

基于未校正的p-值，18:3亚麻酸的水平在每个大豆事件DAS-68416-4输入与对照间显著不同，并且与对照相比，经校正的p-值在未喷雾的大豆事件DAS-68416-4与大豆事件DAS-68416-4+两种除草剂处理间也是显著的。对于18:3亚麻酸不可获得文献数值，然而，大豆事件DAS-68416-4与对照处理间的差异较小(<6%)。

基于未校正的p-值，20:0花生酸的水平在对照与未喷雾的大豆事件DAS-68416-4、大豆事件DAS-68416-4+草丁磷、大豆事件DAS-68416-4+2,4-D、和大豆事件DAS-68416-4+两种除草剂间显著不同，并且20:0花生酸对于未喷雾的和大豆事件DAS-68416-4+草丁磷处理在经校正的p-值中在位置间分析中也具有显著的差异。然而，20:0花生酸水平对于所有处理在报告的文献数值内，指示与非转基因大豆的等同。

基于未校正的p-值，22:0山酸的水平在对照与未喷雾的、大豆事件DAS-68416-4+草丁磷、大豆事件DAS-68416-4+2,4-D、和大豆事件DAS-68416-4+两种除草剂间显著不同，并且22:0山酸的水平对于大豆事件DAS-68416-4+草丁磷在经校正的p-值中在位置间分析中也具有显著的差异。然而，没有显著的总体处理效果，并且22:0山酸水平对于所有处理在报告的文献数值内，指示与非转基因大豆的等同。

在调查的22种脂肪酸中，所有四种大豆事件DAS-68416-4输入或是与对照在统计学上不能区别或是在21种脂肪酸的文献数值内。在一种情况(未喷雾的大豆事件DAS-68416-4；16:1棕榈油酸)中，数值略低于最小文献数值，并且与对照显著不同(低小于13%)，然而，所有三种喷雾的处理在文献范围内。基于这些组成成分，来自大豆事件DAS-68416-4的颗粒基本上等同于非转基因大豆的。

表22：大豆粒的脂肪酸分析(%总脂肪酸)的汇总。

a组合的范围。

b使用F-检验评估的总体处理效果。

c使用t-检验比较转基因处理与对照。

d使用假发现率(FDR)规程校正的P-值。

NA=未显示统计学分析，因为大部分数据小于LOQ。

NR=未报告

粗体指数值在报告的文献范围外部。

粗体P-值是显著的(<0.05)。

实施例8.2.5：维生素

实施对来自对照、未喷雾的大豆事件DAS-68416-4、大豆事件DAS-68416-4+草丁磷、大豆事件DAS-68416-4+2,4-D和大豆事件DAS-68416-4+两种除草剂的大豆粒样品中的维生素的分析。表23中显示了所有位置间的结果的汇总。

在大豆粒中没有在beta-生育酚、delta-生育酚、gamma-生育酚、维生素A、维生素B5、维生素B6、维生素B12、维生素C、维生素D和尼克酸(niacin)方面找到文献数值。beta生育酚、维生素A、维生素B12和维生素D均小于LOQ。在对照、未喷雾的AAD-12和经处理的AAD-12间在维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素C、维生素E或尼克酸方面没有观察到差异。在那些具有可获得的文献范围的维生素中，除了维生素B2(其中数值对于包括近等基因对照的所有处理超过所述范围)外，所有处理均落入这些范围内。

基于未校正的p-值，delta-生育酚水平在对照与大豆事件DAS-68416-4+草丁磷和大豆事件DAS-68416-4+2,4-D输入间显著不同。然而，这没有伴随显著的经校正的p-值或总体处理效果。基于未校正的和经校正的p-值，gamma-生育酚在对照与未喷雾的和大豆事件DAS-68416-4+2,4-D输入间显著不同。然而，与近等基因对照相比，gamma生育酚对于大豆事件DAS-68416-4处理高小于11%。

基于经校正的p-值，维生素B5水平在对照与大豆事件DAS-68416-4+草丁磷输入间显著不同。然而，这没有伴随显著的总体处理效果。

基于未校正的p-值，叶酸在对照与未喷雾的、大豆事件DAS-68416-4+2,4-D和大豆事件DAS-68416-4+两种除草剂间显著不同。与对照相比，叶酸对于两个大豆事件DAS-68416-4输入在经校正的p-值中也具有显著的差异。然而，叶酸水平对于所有处理在报告的文献数值内，并且大豆事件DAS-68416-4输入与近等基因对照相差<9%，指示与非转基因大豆的等同。

基于这些组成成分，来自大豆事件DAS-68416-4的颗粒基本上等同于非转基因大豆的。

表23：大豆粒的维生素分析(mg/kg干重)的汇总

a组合的范围。

b使用F-检验评估的总体处理效果。

c使用t-检验比较转基因处理与对照。

d使用假发现率(FDR)规程校正的P-值。

NR=未报告

NA=未显示统计学分析，因为大部分数据小于LOQ。

粗体指数值在报告的文献范围外部。

粗体P-值是显著的(<0.05)。

实施例8.2.5：异黄酮

实施对来自对照、未喷雾的大豆事件DAS-68416-4、大豆事件DAS-68416-4+草丁磷、大豆事件DAS-68416-4+2,4-D和大豆事件DAS-68416-4+两种除草剂的大豆粒样品中的异黄酮的分析。表24中显示了所有位置间的结果的汇总。

染料木黄酮和黄豆黄素结果低于测试样品的LOQ。基于未校正的和经校正的p-值，大豆苷水平在对照与大豆事件DAS-68416-4+两种除草剂输入间显著不同。然而，总体处理效果不是显著的。虽然没有报告的文献数值，但是大豆事件DAS-68416-4+两种除草剂处理与近等基因对照相差<9%。基于未校正的和经校正的p-值，染料木苷水平在对照与大豆事件DAS-68416-4+两种除草剂输入间显著不同。然而，总体处理效果不是显著的。所有处理的染料木苷数值高于报告的文献数值，但是与近等基因对照相比，大豆事件DAS-68416-4处理是小于9%不同的。基于未校正的和经校正的p-值，黄豆黄素数值在对照与大豆事件DAS-68416-4+两种除草剂间显著不同。虽然没有黄豆黄苷的报告文献数值，但是与近等基因输入相比，所有大豆事件DAS-68416-4输入是小于13%不同的。

基于这些组成成分，来自大豆事件DAS-68416-4大豆的颗粒基本上等同于非转基因大豆的。

表24：大豆粒的异黄酮分析(μg/g)的汇总。

a组合的范围。

b使用F-检验评估的总体处理效果。

c使用t-检验比较转基因处理与对照。

d使用假发现率(FDR)规程校正的P-值。

NA=未显示统计学分析，因为大部分数据小于LOQ。

NR=未报告

粗体指数(mean)值在报告的文献范围外部。

粗体P-值是显著的(<0.05)。

实施例8.2.5：抗营养物

实施对来自对照、未喷雾的大豆事件DAS-68416-4、大豆事件DAS-68416-4+草丁磷、大豆事件DAS-68416-4+2,4-D和大豆事件DAS-68416-4+两种除草剂的大豆粒样品中的抗营养物的分析。表25中显示了所有位置间的结果的汇总。

在对照与转基因输入间在凝集素、肌醇六磷酸、或胰蛋白酶抑制剂方面没有观察到统计学差异。这三种抗营养物也都在文献范围内，指示与非转基因大豆的等同。

基于未校正的p-值，与对照相比，棉子糖对于大豆事件DAS-68416-4+草丁磷处理显著更低(<10%)。基于经校正的p-值或总体处理效果，棉子糖在位置间分析中不是显著差异的。棉子糖水平对于所有处理也在报告的文献数值内，指示与非转基因大豆的等同。

基于未校正的p-值，水苏糖在对照与大豆事件DAS-68416-4+草丁磷输入间显著不同。基于经校正的p-值或总体处理效果，水苏糖水平在位置间分析中不是显著差异的。水苏糖水平对于所有处理也在报告的文献数值内，指示与非转基因大豆的等同。

对凝集素、肌醇六磷酸、棉子糖、水苏糖和胰蛋白酶抑制剂的抗营养物分析均在报告的文献数值内，并且与对照相比，基于未校正的p-值的两个显著差异对于大豆事件DAS-68416-4处理具有更低的抗营养物水平。

基于这些组成成分，来自大豆事件DAS-68416-4大豆的颗粒基本上等同于非转基因大豆的。

表25：大豆粒的抗营养物分析(%干重)的汇总。

a组合的范围。

b使用F-检验评估的总体处理效果。

c使用t-检验比较转基因处理与对照。

d使用假发现率(FDR)规程校正的P-值。

粗体指数值在报告的文献范围外部。

粗体P-值是显著的(<0.05)。

实施例8.3：颗粒和饲料组成的汇总

大豆事件DAS-68416-4的组成与近等基因系统计学不能区别，与近等基因系相差小于13%，或在非转基因大豆的文献范围内。如此，发现大豆事件DAS-68416-4基本上等同于非转基因大豆。组成结果的样品在未喷雾的大豆事件DAS-68416-4、大豆事件DAS-68416-4+草丁磷、大豆事件DAS-68416-4+2,4-D和大豆事件DAS-68416-4+大豆和对照大豆系两者间没有指示任何生物学上有意义的处理相关组成差异。总之，未喷雾的大豆事件DAS-68416-4、大豆事件DAS-68416-4+草丁磷、大豆事件DAS-68416-4+2,4-D和大豆事件DAS-68416-4+这两个组成结构确认大豆事件DAS-68416-4和常规大豆的等同。

实施例9：种植前烧毁应用和出土前试验

此实施例描述了本发明使之成为可能的种植大豆作物和使用除草剂的新方法。

种植前烧毁除草剂应用意图杀死已经在种植给定作物前在冬季或早春里出现的杂草。通常，这些应用在不整地种植(no-till)或减少耕作管理系统(其中在种植前未完成对杂草的物理除去)中应用。因此，与不整地种植或减少耕作大豆结合使用的除草剂项目必须控制一大批种植时间前存在的阔叶和禾本科杂草。

草甘膦、对草快(gramoxone)、和草丁磷是广泛用于种植前烧毁除草剂应用的非选择性、非残留除草剂的例子。然而，一些杂草由于下列一项或多项因素而难以用此类除草剂控制：杂草物种或生物型对除草剂的固有不敏感性、冬性一年生杂草相对较大的尺寸、和限制除草剂吸收和活性的冷气候条件。对于具有这些除草剂的罐混合物可用几个除草剂选项，以提高对杂草(其中非选择性除草剂是不充分的)的谱和活性。一个例子是使用2,4-D+草甘膦罐混合物应用以帮助控制小白酒草(Conyza Canadensis)(加拿大飞蓬(horseweed))。对于种植前烧毁控制大多数存在的杂草，可以使用420至1680gae/ha，更典型地，560至840g ae/ha的草甘膦；然而，可以应用280-1120g ae/ha2,4-D以帮助控制许多阔叶杂草物种(例如加拿大飞蓬)。

2,4-D是一种选择的种植前除草剂，因为它对于一大批阔叶杂草是有效的(甚至于相对较低的温度)，并且极其便宜。然而，若烧毁应用后种植的作物对2,4-D敏感(例如，大多数双子叶作物)，则土壤中的2,4-D残留(尽管短暂)可以使植物损伤。对于与大豆一起使用，许多2,4-D酯除草剂标签限制新植物的种植，直至在1lb ai/acre的烧毁应用后至少15天。在2,4-D低挥发性酯配制剂的情况中，用于烧毁的多至0.5lb ai/英亩的比率通常需要在应用后7天种植，而1.0lb ai/英亩的比率通常需要应用后30天种植。在2,4-D胺产品(其是水溶性的)的情况中的一项额外的忧虑是除草剂可以浸入种子区中。然而，含有aad-12基因的作物耐受2,4-D，并且不受土壤中2,4-D残留负影响。由于此耐受性，可以在没有持续损伤的烧毁后比不含aad-12基因的植物更早种植含有aad-12基因的植物。此外，2,4-D除草剂及罐混合物(或商业预混合物)配偶物的灵活性升高和成本降低会改善杂草控制选项，并且在重要的不整地种植和减少耕作情况中提高烧毁应用的稳健性。

在种植前7天、15天或30天对含有aad-12基因的大豆(事件DAS-68416-4)和对照大豆以1120、2240、4480g ae/ha的比率应用2,4-D胺的出土前应用。使用本领域公认的规程对位于地理上独特地点的田间样地应用出土前应用。将经除草剂处理的样地与未处理的样地配对以提供出土和早期季节生长的精确评估。在种植和种植前7、15或30天的2,4-D应用后；测量含有aad-12基因的大豆(事件DAS-68416-4)和对照大豆的损伤。田间测试的结果指示含有aad-12基因的大豆(事件DAS-68416-4)对种植前7、15或30天的2,4-D除草剂的出土前处理提供稳健的耐受性。

这些例子是可用的许多选项中的几个。杂草控制领域的技术人员会注意到例如通过利用联邦除草剂标签(CPR,2003)中所描述的产品和Agriliance作物保护指南(Crop Protection Guide)(2003)中所描述的用途实现的许多其它应用，包括但不限于对草快+2,4-D或草丁磷+2,4-D。本领域技术人员还会认可，上述例子可以适用于任何2,4-D-敏感性(或其它苯氧基生长素除草剂)作物，其会受到AAD-12基因保护(若稳定转化的话)。

DAS-68416-4大豆耐受除草剂2,4-D。本实施例报告了在田间条件下表征DAS-68416-4大豆的除草剂耐受性。在美国进行的田间试验中对DAS-68416-4大豆评估对除草剂2,4-D的耐受性。对于DAS-68416-4大豆，提出的最大应用比率对于2,4-D会是1120g ae/ha。下文讨论的数据指示DAS-68416-4大豆提供了为这些提出的最大使用比率至少4倍的比率的可接受耐受性。

在田间研究中表征DAS-68416-4大豆解毒2,4-D及随后提供保护免于由此化合物引起的损伤的功效。将试验设计为评估对2,4-D的出土前耐受性。以随机化完全区组设计进行出土前试验。实验单元由用于出土前试验的两行样地(长度为约3m)组成，并且所有试验含有三个重复。用投递约140–190l/ha喷雾体积的气体加压小样地喷雾设备进行所有除草剂应用。所使用的2,4-D配制剂是456g ae/升二甲基铵盐。在植物出现后约7天采取视觉损伤评级。按0至100量表采取评级，其反映在样地中的所有植物间观察到的所有损伤症状的视觉合成(visual composite)，其中0=与未处理的样地相比没有损伤，且100=所有植物死亡。

出土前试验由种植后但在作物出现前应用的1120、2240、和4480g ae/ha组成。表26中呈现了关于出土前试验的信息。

表26：关于2,4-D出土前耐受性试验的位置和处理信息。

总之，进行2,4-D耐受性的田间评估。在密西西比、印地安那州、和明尼苏达州的位置进行检查DAS-68416-4大豆和未转化的Maverick大豆对2,4-D胺出土前应用的响应的研究。在三个位置间取平均值，2,4-D胺对DAS-68416-4的出土前应用导致≤2%损伤，而不管应用比率(表27)。相同处理对未转化的Maverick引起34至60%损伤。来自出土前应用2,4-D的损伤由群落地段损失和生长降低组成。

表27：DAS-68416-4大豆对出土前应用2,4-D的耐受性。

a ae/ha=酸性等同物/公顷

b就大豆植物生长发育而言的应用阶段。

c后面有相同字母的每栏内的均值不是显著不同的，如通过用于混合模型和图基(Tukey)的限制性最大似然法(restricted maximum likelihood method)或对于未平衡的数据，Tukey-Kramer HSD检验(0.05)测定的。ns标示没有显著差异。

实施例10：组合使用草甘膦耐受性基因+大豆事件DAS-68416-4来控制草甘膦抗性杂草的方法

广泛使用草甘膦，因为它控制一大批阔叶和禾本科杂草物种。然而，草甘膦在GTC中及在非作物应用中的重复使用已经，并且将继续选择向天然地更耐受的物种或草甘膦抗性生物型的杂草转变。以提供对相同物种的控制的有效率使用但具有不同作物模式的罐混合物除草剂配偶物被大多数除草剂抗性管理策略规定为一种延迟抗性杂草出现的方法。叠加416AAD-12事件与草甘膦耐受性性状(和/或与其它除草剂耐受性性状)可以提供容许控制GTC中的草甘膦抗性双子叶杂草物种的机制，其通过使草甘膦、苯氧基生长素(例如，2,4-D)和吡啶基氧基乙酸酯生长素除草剂(例如定草酯)能够在相同作物中选择性使用来进行。这些除草剂的应用可以同时在包含两种或更多种不同作用模式的除草剂的罐混合物中；在序贯应用中以种植前、出土前、或出土后和分开的应用时机(范围为约2小时至约3个月)单独应用单一除草剂组分；或者，备选地，可以在种植作物的约7个月直到收获作物(或个别除草剂的收获前时间间隔，以最短者为准)内的任何时机应用代表每种化学类别的大量除草剂的任何组合。

重要的是，就应用时机、个别除草剂的比率、和控制困难的或抗性的杂草的能力而言在控制广谱的禾本科和阔叶杂草中具有灵活性。在具有草甘膦抗性基因/AAD-12416事件叠加的作物中的草甘膦应用的范围可以为约250-2500g ae/ha；苯氧基生长素除草剂(一种或多种)可以应用约25-4000gae/ha；且吡啶基氧基乙酸酯生长素除草剂(一种或多种)可以应用25-2000gae/ha。这些应用的最佳组合和时机会取决于特定的情况、物种、和环境，并且杂草控制领域中的且具有本公开内容益处的技术人员会最好地确定。

北美洲种植的大多数棉、芸苔、玉米、和大豆耕地含有草甘膦耐受性(GT)性状，并且GT玉米的采用在增加。其它GT作物(例如，小麦、稻、甜菜、和草地)已经在开发中，但是至今尚未商业推广。许多其它草甘膦抗性物种处于实验到开发阶段(例如，苜蓿、甘蔗、向日葵、甜菜、豌豆、胡萝卜、黄瓜、莴苣、洋葱、草莓、番茄、和烟草；林业物种，如杨树和香枫；和园艺物种，如金盏花、矮牵牛、和秋海棠；isb.vt.edu/cfdocs/fieldtests1.cfm，2005年于万维网)。GTC是用于由此系统控制的杂草的绝对宽度和由此系统提供的便利和成本有效性的有价值的工具。然而，草甘膦作为新标准基本处理的效用选出草甘膦抗性杂草。此外，草甘膦本质上对之不太有效的杂草转变成正实施仅有草甘膦的化学项目的田间的主要物种。通过叠加AAD-12事件416与GT性状(或是经由常规的育种或共同地作为新的转化事件进行)，可以改善杂草控制功效、灵活性和管理杂草转变和除草剂抗性形成的能力。通过用AAD-12事件416转化作物，单子叶作物会具有更高的苯氧基或吡啶基氧基生长素安全性限度，并且可以在双子叶作物中选择性应用苯氧基生长素。可以设想用于改善的杂草控制选项的几种情况，其中将AAD-12事件416和GT性状在任何单子叶或双子叶作物物种中叠加：

a)可以以标准的出土后应用率(420至2160g ae/ha，优选地560至840gae/ha)应用草甘膦以控制大多数禾本科和阔叶杂草物种。为了控制草甘膦抗性阔叶杂草，如小白酒草或本质上难以用草甘膦控制的杂草(例如，跖草(Commelina spp)、番薯(Ipomoea spp)等)，可以与草甘膦序贯、罐混合地、或作为预混合物应用280-2240g ae/ha(优选地，560-1120g ae/ha)2,4-D以提供有效控制。对于定草酯，应用率的范围通常会为70-1120g ae/ha，更通常为140-420g ae/ha。对于氟草烟，应用率的范围通常为35-560g ae/ha，更通常为70-280ae/ha。

b)目前，GTC中应用的草甘膦比率的范围一般为每个应用时机560至2240g ae/ha。草甘膦对禾本科物种远比对阔叶杂草物种更有效。AAD-12事件416+GT叠加的性状会容许草甘膦的禾本科有效率(105-840g ae/ha，更优选地，210-420g ae/ha)。然后，可以与禾本科有效率的草甘膦序贯、罐混合地、或作为预混合物应用2,4-D(为280-2240g ae/ha，更优选地560-1120gae/ha)以提供必要的阔叶杂草控制。上文提及比率的定草酯和氟草烟在处理方案中会是可接受的组分。低比率的草甘膦还会对阔叶杂草控制提供一些优点；然而，主要的控制会来自2,4-D、定草酯、或氟草烟。

杂草控制领域中的技术人员会认可，通过对作物的AAD-12事件416转化实现单独或组合(连续或独立地)使用一种或多种商业芳氧基生长素除草剂。代表这些化学品的其它除草剂的比率(Specific rate)可以由在CPR(作物保护参考(Crop Protection Reference))书籍或类似的汇编物中汇编的除草剂标签、在线汇编的标签(例如cdms.net/manuf/manuf.asp)，或任何商业或学术作物保护指南诸如来自Agriliance的植物保护指南(2005)确定。认为通过AAD-12事件416对在HTC中使用实现的每种备选的除草剂(无论是单独、罐混合、或序贯使用)在本发明的范围内。

参考文献

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Claims (22)

1.一种由SEQ ID NO:1组成的多核苷酸。

2.一种生成权利要求1的多核苷酸的方法。

3.一种将转基因插入大豆基因组的DNA区段中的方法，所述DNA区段包含由SEQ ID NO:1的残基1-2730组成的5’端和由SEQ ID NO:1的残基9122-10,212组成的3’端。

4.一种育种大豆植物的方法，所述方法包括将包含SEQ ID NO:1的第一大豆植物与第二大豆植物杂交以生成包含基因组的第三大豆植物，并对所述第三大豆植物测定所述基因组中的SEQ ID NO:1的存在。

5.一种将除草剂耐受性性状基因渗入大豆植物中的方法，所述方法包括将包含SEQ ID NO:1的第一大豆植物与第二大豆植物杂交以生成包含基因组的第三大豆植物，并对所述第三大豆植物测定所述基因组中的SEQ ID NO:1的存在。

6.一种控制杂草的方法，所述方法包括对田间施用芳氧基链烷酸酯除草剂，所述田间包含植物，所述植物包含SEQ ID NO:1。

7.一种DNA检测试剂盒，其包含第一引物和第二引物，所述第一引物结合选自下组的侧翼序列：SEQ ID NO:1的残基1-2730、SEQ ID NO:1的残基9122-10,212及其互补物，所述第二引物结合包含SEQ ID NO:1的残基2731-9121或其互补物的插入序列。

8.权利要求7的DNA检测试剂盒，所述引物选自下组：SEQ ID NO:2-7。

9.一种DNA检测试剂盒，其用于实施在包含大豆DNA的样品中检测大豆事件的方法，其中所述方法包括使所述样品与在AAD-12事件pDAB4468-0416方面诊断性的至少一种SEQ ID NO:1的多核苷酸接触。

10.权利要求9的DNA检测试剂盒，其中所述方法包括使所述样品与下列各项接触

a.第一引物，其结合选自下组的侧翼序列：SEQ ID NO:1的残基1-2730、SEQ ID NO:1的残基9122-10,212及其互补物；和

b.第二引物，其结合包含SEQ ID NO:1的残基2731-9121或其互补物的插入序列；

将所述样品进行聚合酶链式反应；并测定所述引物间生成的扩增子。

11.权利要求10的DNA检测试剂盒，所述引物选自下组：SEQ ID NO:2-7。

12.一种包含多核苷酸的DNA检测试剂盒，其中所述多核苷酸包含至少30个核苷酸，并且在严格条件下与选自下组的序列杂交：SEQ ID NO:1的残基2720至2740、SEQ ID NO:1的残基9112至9132及其互补物。

13.权利要求6的方法，其中使用所述方法来处理或预防除草剂抗性杂草。

14.权利要求6的方法，其中在种植所述植物前施用所述除草剂。

15.一种在包含至少一种含有SEQ ID NO:1的植物的地区控制草甘膦抗性杂草的方法，其中所述植物进一步包含草甘膦耐受性性状，且所述方法包括对所述地区的至少一部分施用芳氧基链烷酸酯除草剂。

16.权利要求15的方法，其中所述除草剂是苯氧基生长素。

17.权利要求15的方法，其中自具有草甘膦的罐混合物施用所述除草剂。

18.权利要求6的方法，其中至少一种所述杂草是与所述植物不同种的草甘膦抗性自生植物。

19.一种种植包含SEQ ID NO:1的AAD-12事件pDAB4468-0416A的植物的方法，包括对植物施用芳氧基链烷酸酯除草剂。

20.权利要求19的方法，其中所述除草剂选自下组：2,4-D；2,4-DB；MCPA；和MCPB。

21.权利要求19的方法，其中所述方法包括对所述植物施用第二除草剂。

22.权利要求21的方法，其中所述第二除草剂选自下组：草丁磷，草甘膦和麦草畏。