CN110095613A - 一种快速检测转基因植物中cp4-epsps的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，尤其是一种快速检测转基因植物中CP4‑EPSPS的方法，包括以下步骤：S1、制备除草剂草甘膦溶液；S2、将转基因植物与非转基因植物进行混合栽种在温室箱内，然后用喷洒壶对植物进行均匀喷洒，待2‑3天后观察情况；S3、将植株生长良好，没有枯叶的植物进行挂牌；S4、将制备好的植物蛋白提出液，倒入烧杯中，加入水并进行搅拌，然后加入CP4‑EPSPS蛋白检测试纸条，反应2‑5min，取出CP4‑EPSPS蛋白检测试纸条，对CP4‑EPSPS蛋白检测试纸条进行观察，得到检测结果。本发明具有增强了检测结果的准确性，同时检测过程简单方便，也加快了检测的速度。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种快速检测转基因植物中CP4-EPSPS的方法。
背景技术
转基因技术的理论基础来源于进化论衍生来的分子生物学。基因片段的来源可以是提取特定生物体基因组中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的DNA片段。DNA片段被转入特定生物中，与其本身的基因组进行重组，再从重组体中进行数代的人工选育，从而获得具有稳定表现特定的遗传性状的个体。该技术可以使重组生物增加人们所期望的新性状，培育出新品种。CP4-EPSPS是从土壤农杆菌CP4菌株中分离得到的抗除草剂草甘膦基因，现有的检测方法缓慢，检测结果不准确，所以我们提出一种快速检测转基因植物中CP4-EPSPS的方法，来解决这一问题。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种快速检测转基因植物中CP4-EPSPS的方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
设计一种快速检测转基因植物中CP4-EPSPS的方法，包括以下步骤：包括以下步骤：
S1、制备除草剂草甘膦溶液，选取除草剂草甘膦，放置在喷洒壶中，然后加入水进行搅拌混合，其中除草剂草甘膦与水的重量比为3-5:100-120；
S2、将转基因植物与非转基因植物进行混合栽种在温室箱内，然后用喷洒壶对植物进行均匀喷洒，待2-3天后观察情况；
S3、将植株生长良好，没有枯叶的植物进行挂牌，然后分别采取植物的茎叶，将植物的茎叶进行剪碎，加单去污剂裂解液于匀浆器中，进行匀浆，3-5min后再置于冰上，重复碾3-5次使组织碾碎，裂解30-35min，将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5-7min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存；
S4、将制备好的植物蛋白提出液，倒入烧杯中，加入水并进行搅拌，然后加入CP4-EPSPS蛋白检测试纸条，反应2-5min，取出CP4-EPSPS蛋白检测试纸条，对CP4-EPSPS蛋白检测试纸条进行观察，得到检测结果。
优选的，在步骤S2时，对转基因植物与非转基因植物进栽种时，对非转基因植物进行标记。
优选的，在步骤S2时中，进行喷洒除草剂草甘膦时，将温室箱的温度调节为25-30℃，并检测土壤的湿度，确保土壤的湿度为20％-24％，通过土壤湿度仪对土壤的湿度进行检测，当湿度不满足要求时，通过喷加水，待一段时间后，再次进行检测，确保土壤的湿度处于规定范围内。
优选的，在步骤S3中，对植物的茎叶进行采取时，选取葱郁的完整的植物茎叶，在采摘后，并用采用清水进行冲洗，然后用毛刷进行刷拭，最后放置到清水中浸泡30-40min。
优选的，单去污剂裂解液由Tris-HCl缓冲液、氯化钠、叠氮钠、苯甲基磺酰氟、抗蛋白酶肽、Triton X-100组成。
优选的，其中叠氮钠浓度为0.02-0.03％。
优选的，在步骤S4中，反应的温度为32-35℃。
本发明提出的一种快速检测转基因植物中CP4-EPSPS的方法，有益效果在于：
1、通过草剂草甘膦溶液对植物中的CP4-EPSPS进行了初步的检测，同时与CP4-EPSPS蛋白检测试纸条检测相结合，增强了检测结果的准确性，同时检测过程简单方便，也加快了检测的速度；
2、对土壤的湿度与温度进行处理，便于药物的作用，便于植物对药效进行吸收，减少检测结果的误差，对茎叶的处理，便于对除草剂草甘膦的残留物进行去除，防止对检测结果的干扰。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1
一种快速检测转基因植物中CP4-EPSPS的方法，包括以下步骤：
S1、制备除草剂草甘膦溶液，选取除草剂草甘膦，放置在喷洒壶中，然后加入水进行搅拌混合，其中除草剂草甘膦与水的重量比为3:100；
S2、将转基因植物与非转基因植物进行混合栽种在温室箱内，然后用喷洒壶对植物进行均匀喷洒，待2天后观察情况，先通过除草剂草甘膦溶液对植物进行初步的筛选，将带有CP4-EPSPS的转基因植物选出；
S3、将植株生长良好，没有枯叶的植物进行挂牌，然后分别采取植物的茎叶，将植物的茎叶进行剪碎，加单去污剂裂解液于匀浆器中，进行匀浆，3min后再置于冰上，重复碾3次使组织碾碎，裂解30min，将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存，单去污剂裂解液由Tris-HCl缓冲液、氯化钠、叠氮钠、苯甲基磺酰氟、抗蛋白酶肽、Triton X-100组成，其中叠氮钠浓度为0.02％；
S4、将制备好的植物蛋白提出液，倒入烧杯中，加入水并进行搅拌，然后加入CP4-EPSPS蛋白检测试纸条，反应2min，取出CP4-EPSPS蛋白检测试纸条，对CP4-EPSPS蛋白检测试纸条进行观察，得到检测结果，通过双层进行检测增加了检测结果的准确性，同时通过除草剂草甘膦溶液进行初步的筛选，在进行大规模的检测时，节省了时间。
优选的，在步骤S2时，对转基因植物与非转基因植物进栽种时，对非转基因植物进行标记，便于对检测的结果进行验证，确保了检测结果的准确性。
优选的，在步骤S2时中，进行喷洒除草剂草甘膦时，将温室箱的温度调节为25℃，并检测土壤的湿度，确保土壤的湿度为20％，通过土壤湿度仪对土壤的湿度进行检测，当湿度不满足要求时，通过喷加水，待一段时间后，再次进行检测，确保土壤的湿度处于规定范围内，通过对温度的控制，加强了药效，对湿度的控制延长药液在植物表面的湿润时间，有利于药物的传导，防止植物因为吸收到药效，对检测结果造成干扰，减少检测结果的误差。
优选的，在步骤S3中，对植物的茎叶进行采取时，选取葱郁的完整的植物茎叶，在采摘后，并用采用清水进行冲洗，然后用毛刷进行刷拭，最后放置到清水中浸泡30min，对灰尘与除草剂草甘膦的残留物进行去除，防止对检测结果的干扰。
在步骤S4中，反应的温度为32℃。
实施例2
一种快速检测转基因植物中CP4-EPSPS的方法，包括以下步骤：
S1、制备除草剂草甘膦溶液，选取除草剂草甘膦，放置在喷洒壶中，然后加入水进行搅拌混合，其中除草剂草甘膦与水的重量比为4:110；
S2、将转基因植物与非转基因植物进行混合栽种在温室箱内，然后用喷洒壶对植物进行均匀喷洒，待2.5天后观察情况，先通过除草剂草甘膦溶液对植物进行初步的筛选，将带有CP4-EPSPS的转基因植物选出；
S3、将植株生长良好，没有枯叶的植物进行挂牌，然后分别采取植物的茎叶，将植物的茎叶进行剪碎，加单去污剂裂解液于匀浆器中，进行匀浆，4mi后再置于冰上，重复碾4次使组织碾碎，裂解37min，将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心6min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存，单去污剂裂解液由Tris-HCl缓冲液、氯化钠、叠氮钠、苯甲基磺酰氟、抗蛋白酶肽、Triton X-100组成，其中叠氮钠浓度为0.025％；
S4、将制备好的植物蛋白提出液，倒入烧杯中，加入水并进行搅拌，然后加入CP4-EPSPS蛋白检测试纸条，反应3.5min，取出CP4-EPSPS蛋白检测试纸条，对CP4-EPSPS蛋白检测试纸条进行观察，得到检测结果，通过双层进行检测增加了检测结果的准确性，同时通过除草剂草甘膦溶液进行初步的筛选，在进行大规模的检测时，节省了时间。
优选的，在步骤S2时，对转基因植物与非转基因植物进栽种时，对非转基因植物进行标记，便于对检测的结果进行验证，确保了检测结果的准确性。
优选的，在步骤S2时中，进行喷洒除草剂草甘膦时，将温室箱的温度调节为25℃，并检测土壤的湿度，确保土壤的湿度为22％，通过土壤湿度仪对土壤的湿度进行检测，当湿度不满足要求时，通过喷加水，待一段时间后，再次进行检测，确保土壤的湿度处于规定范围内，通过对温度的控制，加强了药效，对湿度的控制延长药液在植物表面的湿润时间，有利于药物的传导，防止植物因为吸收到药效，对检测结果造成干扰，减少检测结果的误差。
优选的，在步骤S3中，对植物的茎叶进行采取时，选取葱郁的完整的植物茎叶，在采摘后，并用采用清水进行冲洗，然后用毛刷进行刷拭，最后放置到清水中浸泡35min，对灰尘与除草剂草甘膦的残留物进行去除，防止对检测结果的干扰。
在步骤S4中，反应的温度为33.5℃
实施例3
一种快速检测转基因植物中CP4-EPSPS的方法，包括以下步骤：
S1、制备除草剂草甘膦溶液，选取除草剂草甘膦，放置在喷洒壶中，然后加入水进行搅拌混合，其中除草剂草甘膦与水的重量比为5:120；
S2、将转基因植物与非转基因植物进行混合栽种在温室箱内，然后用喷洒壶对植物进行均匀喷洒，待3天后观察情况，先通过除草剂草甘膦溶液对植物进行初步的筛选，将带有CP4-EPSPS的转基因植物选出；
S3、将植株生长良好，没有枯叶的植物进行挂牌，然后分别采取植物的茎叶，将植物的茎叶进行剪碎，加单去污剂裂解液于匀浆器中，进行匀浆，5min后再置于冰上，重复碾5次使组织碾碎，裂解35min，将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心7min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存，单去污剂裂解液由Tris-HCl缓冲液、氯化钠、叠氮钠、苯甲基磺酰氟、抗蛋白酶肽、Triton X-100组成，其中叠氮钠浓度为0.03％；
S4、将制备好的植物蛋白提出液，倒入烧杯中，加入水并进行搅拌，然后加入CP4-EPSPS蛋白检测试纸条，反应5min，取出CP4-EPSPS蛋白检测试纸条，对CP4-EPSPS蛋白检测试纸条进行观察，得到检测结果，通过双层进行检测增加了检测结果的准确性，同时通过除草剂草甘膦溶液进行初步的筛选，在进行大规模的检测时，节省了时间。
优选的，在步骤S2时，对转基因植物与非转基因植物进栽种时，对非转基因植物进行标记，便于对检测的结果进行验证，确保了检测结果的准确性。
优选的，在步骤S2时中，进行喷洒除草剂草甘膦时，将温室箱的温度调节为30℃，并检测土壤的湿度，确保土壤的湿度为24％，通过土壤湿度仪对土壤的湿度进行检测，当湿度不满足要求时，通过喷加水，待一段时间后，再次进行检测，确保土壤的湿度处于规定范围内，通过对温度的控制，加强了药效，对湿度的控制延长药液在植物表面的湿润时间，有利于药物的传导，防止植物因为吸收到药效，对检测结果造成干扰，减少检测结果的误差。
优选的，在步骤S3中，对植物的茎叶进行采取时，选取葱郁的完整的植物茎叶，在采摘后，并用采用清水进行冲洗，然后用毛刷进行刷拭，最后放置到清水中浸泡40min，对灰尘与除草剂草甘膦的残留物进行去除，防止对检测结果的干扰。
在步骤S4中，反应的温度为35℃。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种快速检测转基因植物中CP4-EPSPS的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、制备除草剂草甘膦溶液，选取除草剂草甘膦，放置在喷洒壶中，然后加入水进行搅拌混合，其中除草剂草甘膦与水的重量比为3-5:100-120；
S2、将转基因植物与非转基因植物进行混合栽种在温室箱内，然后用喷洒壶对植物进行均匀喷洒，待2-3天后观察情况；
S3、将植株生长良好，没有枯叶的植物进行挂牌，然后分别采取植物的茎叶，将植物的茎叶进行剪碎，加单去污剂裂解液于匀浆器中，进行匀浆，3-5min后再置于冰上，重复碾3-5次使组织碾碎，裂解30-35min，将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5-7min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存；
S4、将制备好的植物蛋白提出液，倒入烧杯中，加入水并进行搅拌，然后加入CP4-EPSPS蛋白检测试纸条，反应2-5min，取出CP4-EPSPS蛋白检测试纸条，对CP4-EPSPS蛋白检测试纸条进行观察，得到检测结果。
2.根据权利要求1所述的一种快速检测转基因植物中CP4-EPSPS的方法，其特征在于，在步骤S2时，对转基因植物与非转基因植物进栽种时，对非转基因植物进行标记。
3.根据权利要求1所述的一种快速检测转基因植物中CP4-EPSPS的方法，其特征在于,在步骤S2时中，进行喷洒除草剂草甘膦时，将温室箱的温度调节为25-30℃，并检测土壤的湿度，确保土壤的湿度为20％-24％，通过土壤湿度仪对土壤的湿度进行检测，当湿度不满足要求时，通过喷加水，待一段时间后，再次进行检测，确保土壤的湿度处于规定范围内。
4.根据权利要求1所述的一种快速检测转基因植物中CP4-EPSPS的方法，其特征在于，在步骤S3中，对植物的茎叶进行采取时，选取葱郁的完整的植物茎叶，在采摘后，并用采用清水进行冲洗，然后用毛刷进行刷拭，最后放置到清水中浸泡30-40min。
5.根据权利要求1所述的一种快速检测转基因植物中CP4-EPSP S的方法，其特征在于，单去污剂裂解液由Tris-HCl缓冲液、氯化钠、叠氮钠、苯甲基磺酰氟、抗蛋白酶肽、TritonX-100组成。
6.根据权利要求5所述的一种快速检测转基因植物中CP4-EPSP S的方法，其特征在于，其中叠氮钠浓度为0.02-0.03％。
7.根据权利要求1所述的一种快速检测转基因植物中CP4-EPSPS的方法，其特征在于，在步骤S4中，反应的温度为32-35℃。
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