CN105753955B - 一种大豆bHLH转录因子及其编码基因与应用 - Google Patents

一种大豆bHLH转录因子及其编码基因与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种bHLH转录因子及其编码基因与应用。该蛋白具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。当bHLH转录因子编码基因GmORG3过表达时表现出对Cd胁迫有抗性。因此，分离与克隆大豆中GmORG3基因，不仅有利于揭示大豆的抗Cd机制，还可通过基因操作的手段进行植物抗Cd分子育种以提高植物抗Cd性。

Description

一种大豆bHLH转录因子及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种大豆bHLH转录因子及其编码基因与应用。
背景技术
随着社会日益发展，非农业建设用地迅速扩张，废弃物排放以及农业化肥使用量的增加，土壤重金属污染日益成为一个世界性环境问题。2012年国土资源部统计表明，目前全国耕种土地面积的10%以上已受重金属污染。镉(Cd)是生物毒性很强的重金属之一，Cd的半衰期非常长，摄入过量的Cd会导致肾脏和骨骼的病变。上世纪70年代，日本曾出现“痛痛病”是镉对人类生活环境的污染而引起的，镉污染水稻是患者镉摄入的主要来源，影响面很广，受害者众多，被公认为是“公害病”。
大豆是农业生产上具有较高经济价值的农作物，不仅具有丰富的蛋白质和油脂，还是制作豆浆、豆腐、豆奶等豆制品及大豆油的主要原料，与人类的生活息息相关。但是大豆极易积累重金属，重金属在植物体内的大量积累，不仅严重影响植物的生长和发育，而且会通过食物链，危及人类的健康。Wolnik等（1983）研究发现大豆镉积累浓度远高于其它作物。一些生长在符合种植的土壤上的大豆品种，其积累的Cd浓度都会超过国际标准。
因此，如何减少大豆对Cd 的吸收以及缓解Cd对大豆的毒害成为亟需解决的问题。我们从栽培大豆根系中克隆了一个bHLH类转录因子GmORG3基因，该基因过表达时表现出对Cd胁迫有抗性。因此，分离与克隆大豆中GmORG3基因，不仅有利于揭示大豆的抗Cd机制，还可通过基因操作的手段进行植物抗Cd分子育种以提高植物抗Cd性。
发明内容
本发明的目的是提供一种大豆bHLH转录因子，名称为Glycine maxtranscription factor ORG3-like （GmORG3），来源于大豆遗传标准系，Williams 82。所述转录因子的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
本发明的目的之二是提供一种大豆bHLH转录因子的编码基因GmORG3，该编码基因具有下述核苷酸序列之一：
1) 序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；
2) 编码序列表中SEQ ID NO：2蛋白质序列的多核苷酸；
3) 在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为在0.1×SSPE或0.1×SSC，0.1％SDS的溶液中，在65℃条件下杂交并洗膜。
列表中的SEQ ID NO：1由726个脱氧核苷酸组成，编码具有序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列的蛋白质。
序列表中的SEQ ID NO：2由241个氨基酸残基组成，自氨基端（N端）第58位至第113位氨基酸残基为保守的bHLH保守结构域。
所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
含有本发明基因的表达载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
所述的GmORG3基因可通过含有强启动子的穿梭表达载体P424-GPD导入酵母中；使用本发明的GmORG3构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种组成型、组织特异型、诱导型或增强型启动子；为了便于对转基因菌株或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入具有抗性的抗生素标记（卡那霉素、潮霉素等）或抗化学试剂标记基因（如抗除草剂bar基因等）及可产生颜色变化的酶或蛋白等（GUS基因、GFP基因等）。
携带有GmORG3的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。上述通过转基因调控植物抗逆性的方法对所有植物均适用，既可适用于单子叶植物（小麦、水稻、玉米等），也可以适用双子叶植物（大豆、烟草、棉花等）。
本发明的目的之三是提供一种GmORG3在调控植物对Cd的耐受性中的应用。
本发明所提供的调控植物耐Cd性的应用，是将所述大豆GmORG3基因导入酵母或大豆复合植株中，提高了酵母的耐Cd性，以及降低Cd从大豆根系向叶片和种子转移的比率。
本发明提供的GmORG3基因来自大豆（Williams 82），半定量PCR检测结果表明GmORG3主要在大豆的根中表达，在Cd胁迫后，其表达量明显提高，表明该基因受Cd的诱导。在酵母中过表达GmORG3基因能提高酵母对Cd的耐受性；在大豆根系中过表达GmORG3基因可以降低Cd从根系向叶片转移的比率。
本发明的有益效果在于：GmORG3基因对培育抗Cd植物品种特别是抗Cd大豆品种具有重要的意义，能够有效降低植物的重金属积累，减少重金属对人类健康的危害。GmORG3作为目的基因导入植物（包括单子叶和双子叶植物），提高植物对Cd的耐受性，降低地上部分镉含量，具有较高的实际应用价值。
附图说明
图1为GmORG3的亚细胞定位图，Gfp为GmORG3与绿色荧光蛋白融合表达，Choloroplast细胞内叶绿体自发荧光，Light为白光下细胞，Meged为前三个图片叠加合成结果。
图2为GmORG3 mRNA在不同组织器官中表达丰度的半定量PCR检测结果，图中1、2、3：三叶期的根、茎和叶；4、5、6、7：开花期的根、茎、叶和花；8、9、10、11：结荚期的根、茎、叶和荚。
图3为100µM CdCl2处理大豆幼苗24h后对根系GmORG3表达量变化影响的实时定量PCR检测结果。
图4为 p424 GPD:: GmORG3载体物理图谱。
图5为 p424 GPD:: GmORG3转基因酵母的PCR验证照片；图中WT:带有空载体p424GPD的W303B菌株；1-9为带有p424 GPD:: GmORG3的W303B菌株；GmORG3为阳性质粒对照。
图6为转GmORG3基因酵母对Cd的耐受性影响。
图7为pCXSN:: GmORG3植物表达载体物理图谱。
图8为转GmORG3基因大豆复合植株在Cd胁迫下的影响。
图9为转GmORG3基因大豆复合植株Cd的根向叶的迁移率。
具体实施方式
下列实例中未注明的具体实验方法的，均可按照常规方法进行。如J.萨姆布鲁克（Sambrook J.）和D.W.拉塞尔（Russell D W.）著《分子克隆实验指南》（科学出版社，2005）中所述条件，或按照生物试剂生产厂商的使用说明。
实施例1：大豆GmORG3基因的克隆与亚细胞定位
利用生物信息学和常规聚合酶链式反应（PCR）相结合的方法克隆大豆GmORG3的DNA序列，具体方法为：
以大豆根系作为实验材料，采用SV Total RNA lysis 试剂盒（Promega公司，美国）提取总RNA。按照TaKaRa公司提供的方法（PrimeScriptTM Reverse Transcriptase）合成cDNA第一条链，并用其作模板进行PCR扩增。根据NCBI中已知的GmORG3序列设计一对引物（引物由上海Invitrogen公司合成）：
P1：5’- ATGGTTGCTTTGTTTTCCCCT-3’，
P2：5’- TTAGAAAATCCTTTGCTTCTC-3’。
通过RT-PCR方法扩增获得GmORG3基因完整的ORF片段。25μl的PCR反应体系：2.5μl含MgCl2的10×PCR缓冲液，正、反向10μM的引物各 1.0μl，1.0μl 10mM的dNTP（脱氧核苷酸混合物），2.0μl cDNA样品，0.25μl Ex-Taq酶（宝生物工程（大连）有限公司），17.5μl双蒸水。PCR反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，58℃复性45s，72℃延伸1 min，30 个循环后，72℃延伸10 min。将扩增得到的约800bp的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离后，用凝胶回收试剂盒（杭州爱思进生物技术有限公司）按试剂盒提供的方案进行回收并克隆到pEASY-T1（Clontech）载体上，进行测序分析，测序由上海invitrogen公司完成。测序结果和NCBI中和GmORG3基因序列完全相同。
利用拟南芥原生质体的亚细胞定位实验显示GmORG3定位于细胞核。具体步骤如下：合成含有内切酶SalI和保护碱基的正向引物SCL-ORG3-SalI（CGCgtcgacATGGTTGCTTTGTTTTCCCCT），并且合成含有XbaI和保护碱基的反向引物SCL-ORG3-XbaI（CGCtctagaGAAAATCCTTTGCTTCTCATAT），以测序完全正确的pEASY-T1-GmORG3克隆为模板，25μl的PCR反应体系从新扩增GmORG3片段。将扩增得到的约800bp的DNA片段用SalI和XbaI酶切，同时酶切亚细胞定位实验载体pJIT166-gfp，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，用凝胶回收试剂盒（杭州爱思进生物技术有限公司）按试剂盒提供的方案进行回收，上述两种回收片段用T4连接酶（Promega公司）连接（10ul反应体系含1×T4DNA连接酶缓冲液，pJIT166-gfp片段0.03pmol，GmORG3片段0.3pmol，20 U T4DNA连接酶），连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（转化方法参照《分子克隆实验指南》第二版，P55-56页，科学出版社，1992），转化后得大肠杆菌DH5α细胞悬液涂布含80mg/L氨苄青霉素的平板，对抗氨苄青霉素的阳性克隆进行扩增并提取质粒，利用PEG4000介导拟南芥原生质体转化方法，分析GmORG3的亚细胞定位。结果显示其定位在细胞核上（图1）。
实施例2：GmORG3转录本的时空分布与Cd胁迫对GmORG3基因表达的影响
用半定量PCR的方法检测GmORG3在大豆植株中的组织分布情况，并采取以下措施保证检测结果的可靠性：用扩增级别DNase I 消化提取的总RNA中可能存在的少量的基因组DNA的污染，为检测基因组DNA是否消除干净，可取出一部分用DNase I 消化的总RNA样品进行常规PCR反应，当发现没有扩增条带产生时，再进行反转录步骤，同时为了进一步验证实时定量PCR扩增的条带是否就是GmORG3，将PCR产物切胶回收进行测序。具体方法为：取大豆不同生长时期根、茎、叶、花和荚等材料提取总RNA为模板，半定量PCR的引物为P1和P2（引物由上海生物工程公司合成）：
P1：5’- ATGGTTGCTTTGTTTTCCCCT-3’，
P2：5’- TTAGAAAATCCTTTGCTTCTC-3’。
以大豆的actin（激动蛋白）cDNA为内参，半定量PCR引物为（引物由上海生物工程公司合成）：
actin-F（上游引物）： 5’-CGGTGGTTCTATCTTGGCATC-3’
actin-R（下游引物）： 5’-GTCTTTCGCTTCAATAACCCTA-3’
实验步骤如下：先取1μg总RNA加入扩增级别DNase I（Sigma, USA）室温放置30分钟来去除基因组DNA的污染，然后加入停止缓冲液（50mM EDTA），70℃加热10分钟变性DNaseI和RNA；然后采用宝生物工程（大连）有限公司的反转录试剂盒按照试剂盒说明书进行反转录，每个样品取1μg总RNA，在42℃下反应1小时，在70℃加热10分钟后取出，置于冰上，以使反转录酶使活；最后取1μl翻转录产物进行半定量PCR扩增。检测结果表明GmORG3主要在大豆根系表达（图2）。
为了研究GmORG3对Cd胁迫的响应，用实时定量PCR的方法检测GmORG3基因在Cd胁迫下的表达模式。将三叶期的大豆以100μM CdCl2处理24h，以未做任何处理的三叶期的大豆为对照，然后用与上述相同的方法检测大豆根系中GmORG3的表达情况，同样以大豆的actin（激动蛋白）cDNA为内参。
实时定量PCR引物：
P3：5’-ATGGTCAAAAAGCTTAGCCA-3’
P4：5’-CTGGAAATGCAAGTTGTAGAAGA-3’
用SYBR Green I 染料, 在荧光定量PCR仪Light Cycler 2.0（Roche 公司）上进行。数据处理采用Light Cycler 2.0中的2-ΔΔcp 方法进行基因相对表达量分析。PCR反应条件为：95 ℃ 5 s, 60 ℃ 10 s, 72℃ 20s，共40个循环。检测结果表明，Cd胁迫24h，根系中GmORG3的表达量明显上升（图3）。
实施例3：GmORG3的酵母表达载体的构建及转基因酵母对Cd的耐受性检测
（1）表达载体的构建
以GmORG3的cDNA全长序列为模板，在含有酶切位点的引物(上海生物工程公司合成)：P5：5′- TCCCCCGGGATGGTTGCTTTGTTTTCCCCT -3′（带下划线碱基为限制内切酶SmaI识别位点）和P6：5′- CGGAATTCTTAGAAAATCCTTTGCTTCTC -3′（带下划线碱基为限制内切酶EcoRI识别位点）的引导下，PCR扩增5’端添加SmaI识别位点、3’端添加EcoRI识别位点的GmORG3 cDNA全长序列。反应结束后，对PCR扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化约800bp的目的片段，将其用SmaI和EcoRI酶切后，与经相同酶双酶切的载体p424GPD（图4）用T4DNA连接酶4℃连接过夜（20ul反应体系含1×T4DNA连接酶缓冲液，p424GPD片段0.03pmol，GmORG3片段0.3pmol，350 U T4DNA连接酶），连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（转化方法参照《分子克隆实验指南》第二版，P55-56页，科学出版社，1992），转化后得大肠杆菌DH5α细胞悬液涂布含80mg/L氨苄青霉素的平板，对抗氨苄青霉素的阳性克隆进行扩增并提取质粒，采取酶切和测序的方法验证连接的正确性得到植物表达载体p424GPD::GmORG3（图4）。
（2）PEG-LiAc介导的酵母转化与筛选鉴定
用PEG-LiAc的方法转化酵母细胞W303B，涂布在缺色氨酸（Trp）的SD固体培养基上，30℃培养3天，从培养平板中挑取单克隆进行PCR检测，用引物P7和P8，25μl PCR反应体系含2.5μl含MgCl2的10×PCR缓冲液、正、反向10μM的引物各 1.0μl、1.0μl 10mM的dNTP（脱氧核苷酸混合物）、1.0μl 基因组DNA模板和18.5μl双蒸水，以及0.25μl rTaq酶（宝生物工程（大连）有限公司）。扩增反应条件为: 95℃预变性4分钟；95 ℃30秒，62 ℃50秒，72 ℃1分，35 次循环，72 ℃延伸10分钟。将扩增产物进行凝胶电泳，在鉴定的9个单克隆中有3个阳性转p424GPD:: GmORG3的单克隆，烟草扩增产物在预计的750bp左右有清晰的条带（图5），得到含有p424GPD:: GmORG3的酵母菌株。
PCR鉴定引物为：
P1：5’- ATGGTTGCTTTGTTTTCCCCT-3’，
P2：5’- TTAGAAAATCCTTTGCTTCTC-3’。
（3）基因功能分析
把含有p424GPD:: GmORG3的酵母及带有空载体p424GPD的酵母分别以1％的量接种于100ml 缺色氨酸（Trp）的SD液体培养基中培养过夜，直至OD600=1，用SD（-Trp）液体培养基进行稀释至OD600=0.1；0.01；0.001，分别滴在含有50µM CdCl2和不含有CdCl2的SD（-Trp）固体培养基上，30℃培养3天，观察菌落的生长情况。结果显示在含有50µM CdCl2培养基上，含有p424GPD:: GmORG3的酵母明显比带有空载体p424GPD的酵母生长的好，带空载体的酵母菌株在含有50µM CdCl2培养基上几乎不能生长（图6）。由此可见，GmORG3能提高酵母对Cd的耐受性。
实施例4：GmORG3的植物表达载体构建及转基因大豆复合植物对Cd的耐受性检测
（1）植物表达载体的构建
首先利用XcmI（购至NBI公司）内切酶酶切pCXSN质粒，制备线性植物过表达T载体pCXSN。50µl反应体系如下：2µg质粒pCXSN DNA；1µl XcmI内切酶；5µl酶切缓冲液（内切酶自带10X缓冲液）；加超纯水至50µl，37℃过夜酶切。再用1%琼脂糖凝胶电泳回收目标条带（约10Kb）。
以GmORG3的cDNA全长序列为模板，35sF：5’- ATGGTTGCTTTGTTTTCCCCT-3’和P2：5’-TTAGAAAATCCTTTGCTTCTC-3’的引导下，PCR扩增的GmORG3 cDNA全长序列。反应结束后，对PCR扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化约800bp的目的片段后，与线性化的pCXSN用T4DNA连接酶4℃连接过夜（20ul反应体系含1×T4DNA连接酶缓冲液，线性pCXSN片段0.03pmol，GmORG3片段0.3pmol，10 U T4DNA连接酶），连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（转化方法参照《分子克隆实验指南》第二版，P55-56页，科学出版社，1992），转化后得大肠杆菌DH5α细胞悬液涂布含80mg/L氨苄青霉素的平板，对抗氨苄青霉素的阳性克隆进行扩增并提取质粒，采取酶切和测序的方法验证连接的正确性得到植物表达载体pCXSN:: GmORG3（图7）。
（2）培养大豆发复合植株
根系为转基因的大豆幼苗可以鉴定基因在根系中的作用，并且也能测定叶片中多种生理反应，大豆复合植株已被广泛应用。具体方法如下：首先挑选大豆种子并进行消毒处理，之后播种于盆钵中，用2cm厚蛭石覆盖，浇足水；种子萌发初期，于子叶节处注射携带目标载体的发根农杆菌（K599），后用湿润蛭石覆盖接种部位。约一周左右，发状根开始从接种部位生长，此时从盆钵中取出幼苗，剪去自然生长根系，得到大豆复合植株，放入试管中进行液体培养。并用35sF：5’- ATGGTTGCTTTGTTTTCCCCT-3’和P2：5’-TTAGAAAATCCTTTGCTTCTC-3检测盐性复合植株根系。以携带空载体的K599注射得到的复合植株为对照。
（3）基因功能分析
将得到的阳性复合植株与对照，置放于盛有1/2Hogland液体培养的玻璃试管中，在人工光照培养箱中培养。等到复合植株根系长至试管低部，培养基中加入终浓度为20uM的CdCl2。培养一周后拍照（图8），并测定根系和叶片中Cd含量。结果显示，转化GmORG3的复合植株根系向叶片迁移的Cd明显低于对照。由此可见，GmORG3能降低植物叶片对Cd的吸收或积累（图9）。
以上各实施例不是对本发明的具体限制，本领域的普通技术人员结合本领域的惯用技术手段，借助本发明公开的氨基酸残基序列蛋白质及其编码基因对单子叶植物或双子叶植物进行植物耐Cd的调控，均落入本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种大豆bHLH转录因子及其编码基因与应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列（2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum）
<400> 1
atggttgctt tgttttcccc tccagtgttc tcaaccaagg gatggctctt agaagaggat 60
ccattaagct atgatgtgtc ctctgagtac tcatttccct atcaatttta ttcaccacag 120
acacagattg agcttgaaat tgaaaggtcc acttctccat cccctgaaga ccctgccatg 180
gtcaaaaagc ttagccacaa cgctagtgaa cgtgatcgcc gcaagaaggt caatcacttg 240
gtttcttcac ttcgttcact tcttccagtg gctgatcaaa cgaaaaaaat gagcattccg 300
actacagttt cgcgagtcat aaaatacata cccgagttac aacagcaagt ggaagcacta 360
tctaagaaaa aagaggatct tttgtgcaga atttctcggc aattgcaagg agatgcagtg 420
aacaaagatt ctcaaaggag aatttcccac cacaactctg attttgttgt ttcaacaagt 480
aggctcaacg attgtgaagc tgttgttcac atttcctctt atgaggctca caaggctcca 540
ctatccgaga tcttgcaatg tttagaaaat aatggccttc ttctgctaaa tgcttcttcc 600
tctgaaacct ttggaggaag ggtcttctac aacttgcatt tccaggtgga aaaaactcag 660
agattagagt ccgagattct aactgagaag cttttgtcaa tatatgagaa gcaaaggatt 720
ttctaa 726
<210> 2
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列（2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum）
<400> 2
Met Val Ala Leu Phe Ser Pro Pro Val Phe Ser Thr Lys Gly Trp Leu
1 5 10 15
Leu Glu Glu Asp Pro Leu Ser Tyr Asp Val Ser Ser Glu Tyr Ser Phe
20 25 30
Pro Tyr Gln Phe Tyr Ser Pro Gln Thr Gln Ile Glu Leu Glu Ile Glu
35 40 45
Arg Ser Thr Ser Pro Ser Pro Glu Asp Pro Ala Met Val Lys Lys Leu
50 55 60
Ser His Asn Ala Ser Glu Arg Asp Arg Arg Lys Lys Val Asn His Leu
65 70 75 80
Val Ser Ser Leu Arg Ser Leu Leu Pro Val Ala Asp Gln Thr Lys Lys
85 90 95
Met Ser Ile Pro Thr Thr Val Ser Arg Val Ile Lys Tyr Ile Pro Glu
100 105 110
Leu Gln Gln Gln Val Glu Ala Leu Ser Lys Lys Lys Glu Asp Leu Leu
115 120 125
Cys Arg Ile Ser Arg Gln Leu Gln Gly Asp Ala Val Asn Lys Asp Ser
130 135 140
Gln Arg Arg Ile Ser His His Asn Ser Asp Phe Val Val Ser Thr Ser
145 150 155 160
Arg Leu Asn Asp Cys Glu Ala Val Val His Ile Ser Ser Tyr Glu Ala
165 170 175
His Lys Ala Pro Leu Ser Glu Ile Leu Gln Cys Leu Glu Asn Asn Gly
180 185 190
Leu Leu Leu Leu Asn Ala Ser Ser Ser Glu Thr Phe Gly Gly Arg Val
195 200 205
Phe Tyr Asn Leu His Phe Gln Val Glu Lys Thr Gln Arg Leu Glu Ser
210 215 220
Glu Ile Leu Thr Glu Lys Leu Leu Ser Ile Tyr Glu Lys Gln Arg Ile
225 230 235 240
Phe

Claims (1)

1.一种大豆bHLH转录因子的编码基因在培育Cd耐受性植物中的应用，其特征在于，所述大豆bHLH转录因子其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，序列表中的SEQ ID NO：2由241个氨基酸残基组成，自氨基端第58位至第113位氨基酸残基为保守的bHLH保守结构域；
所述编码基因具有下述核苷酸序列之一：
1) 序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；
2) 编码序列表中SEQ ID NO：2蛋白质序列的多核苷酸；
3) 在严谨条件下与序列表中SEQ ID NO：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；
所述严谨条件为在0.1×SSPE或0.1×SSC，0.1％SDS的溶液中，在65℃条件下杂交并洗膜。
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Co-overexpression FIT with AtbHLH38 or AtbHLH39 in Arabidopsis enhanced cadmium tolerance via increased cadmium sequestration in roots and improved iron homeostasis of shoots;Huilan Wu等;《Plant Physiology Preview》;American Society of Plant Biologists;20111129;第158卷(第2期);摘要，引言部分 *
GenBank DataBase.PREDICTED: transcription factor ORG3-like[Glycine max].《GenBank DataBase》.GenBank DataBase,2015,Accession NO：XP_003521149. *
PREDICTED: transcription factor ORG3-like[Glycine max];GenBank DataBase;《GenBank DataBase》;GenBank DataBase;20151125;Accession NO：XP_003521149 *

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