RU2012110253A - Детекция aad-1 объекта das-40278-9 - Google Patents

Abstract

1. Способ определения зиготности растения кукурузы, содержащего объект DAS-40278-9 AAD-1 кукурузы, где указанный объект содержит трансгенную конструкцию, содержащую ген AAD-1, где указанная трансгенная конструкция фланкирована 5'-фланкирующей геномной ДНК кукурузы и 3'-фланкирующей геномной ДНК кукурузы, где указанный способ включает:получение образца геномной ДНК от указанного растения кукурузы;получение приведенного в контакт образца посредством контактирования указанного образца ДНК сa. первым праймером объекта и вторым праймером объекта, где указанный первый праймер объекта специфически связывается с указанной трансгенной конструкцией, а указанный второй праймер объекта специфически связывается с указанной 5'-фланкирующей геномной ДНК кукурузы или указанной 3'-фланкирующей геномной ДНК кукурузы и где указанный первый праймер объекта и указанный второй праймер объекта продуцируют ампликон объекта в условиях TAQMAN ПЦР,b. референтным прямым праймером и референтным обратным праймером, которые продуцируют ампликон эндогенного референтного гена кукурузы в условиях TAQMAN ПЦР,c. флуоресцентным зондом κ объекта, который гибридизуется с указанным ампликоном объекта,d. флуоресцентным референтным зондом, который гибридизуется с указанным референтным ампликоном;предоставление указанного приведенного в контакт образца условиям основанного на флуоресценции TAQMAN ПЦР по конечной точке;количественный анализ указанного флуоресцентного зонда объекта, гибридизованного с указанным ампликоном объекта;количественный анализ указанного флуоресцентного референтного зонда, гибридизованного с указанным ампликоном референтно�

Claims (23)

1. Способ определения зиготности растения кукурузы, содержащего объект DAS-40278-9 AAD-1 кукурузы, где указанный объект содержит трансгенную конструкцию, содержащую ген AAD-1, где указанная трансгенная конструкция фланкирована 5'-фланкирующей геномной ДНК кукурузы и 3'-фланкирующей геномной ДНК кукурузы, где указанный способ включает:

получение образца геномной ДНК от указанного растения кукурузы;

получение приведенного в контакт образца посредством контактирования указанного образца ДНК с

a. первым праймером объекта и вторым праймером объекта, где указанный первый праймер объекта специфически связывается с указанной трансгенной конструкцией, а указанный второй праймер объекта специфически связывается с указанной 5'-фланкирующей геномной ДНК кукурузы или указанной 3'-фланкирующей геномной ДНК кукурузы и где указанный первый праймер объекта и указанный второй праймер объекта продуцируют ампликон объекта в условиях TAQMAN ПЦР,

b. референтным прямым праймером и референтным обратным праймером, которые продуцируют ампликон эндогенного референтного гена кукурузы в условиях TAQMAN ПЦР,

c. флуоресцентным зондом κ объекта, который гибридизуется с указанным ампликоном объекта,

d. флуоресцентным референтным зондом, который гибридизуется с указанным референтным ампликоном;

предоставление указанного приведенного в контакт образца условиям основанного на флуоресценции TAQMAN ПЦР по конечной точке;

количественный анализ указанного флуоресцентного зонда объекта, гибридизованного с указанным ампликоном объекта;

количественный анализ указанного флуоресцентного референтного зонда, гибридизованного с указанным ампликоном референтного гена;

сравнение количества гибридизованного флуоресцентного зонда объекта с количеством гибридизованного флуоресцентного референтного зонда и

определение зиготности DAS-40278-9 посредством сравнения уровней флуоресценции гибридизованного флуоресцентного зонда κ объекта и гибридизованного флуоресцентного референтного зонда.

2. Способ по п.1, где указанные ампликоны состоят из 50-100 остатков.

3. Способ по п.1, где указанная 5'-фланкирующая ДНК содержит остатки 1-1873 из SEQ ID NO:29, а указанная 3'-фланкирующая ДНК содержит остатки 6690-8557 из SEQ ID NO:29.

4. Способ по п.1, где указанная трансгенная конструкция состоит из остатков 1874-6689 из SEQ ID NO:29.

5. Способ по п.1, где указанный референтный ген представляет собой эндогенный ген инвертазы Zea mays.

6. Способ по п.1, где указанный второй праймер объекта связывается с остатками 1673-1873 из SEQ ID NO:29 или комплементарной ей последовательностью.

7. Способ по п.1, где второй праймер объекта связывается с остатками 6690-6890 из SEQ ID NO:29.

8. Способ по п.1, где указанный способ применяют для интрогрессии объекта в целях селекции в другую линию кукурузы.

9. Способ по п.8, где указанная другая линия кукурузы лишена указанного объекта.

10. Способ по п.1, где указанный ампликон варианта состоит из 73 пар оснований.

11. Способ по п.1, где указанный референтный ген гибридизуется с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 и SEQ ID NO:7, или содержит ее.

12. Способ по п.1, где указанные референтные праймеры содержат SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:6 и указанный референтный зонд содержит SEQ ID NO:7.

13. Способ по п.1, где указанные зонды мечены флуоресцентным красителем и гасителем.

14. Способ по п.13, где указанный зонд объекта содержит FAM в качестве указанного флуоресцентного красителя на 5'-конце указанного зонда объекта и гаситель MGB на 3'-конце указанного зонда объекта.

15. Способ по п.1, где указанный референтный ампликон представляет собой фрагмент длиной в 79 пар оснований, амплифицированный с применением указанных праймеров.

16. Способ по п.13, где указанный референтный зонд помечен HEX на 5'-конце указанного референтного зонда и гасителем Black Hole 2 (BHQ2) на 3'-конце указанного референтного зонда.

17. Способ по п.1, где указанный ампликон объекта состоит из SEQ ID NO:8, а указанный референтный ампликон состоит из SEQ ID NO:9.

18. Способ по п.1, где указанный зонд объекта содержит SEQ ID NO:4.

19. Способ по п.1, где указанные праймеры объекта выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3.

20. Способ по п.1, где результаты указанного способа считывают непосредственно в спектрофотометре для чтения планшетов.

21. Способ по п.1, где указанный образец ДНК получают из растения кукурузы в поле.

22. Набор для осуществления способа по п.1, где указанный набор включает указанный первый праймер объекта, указанный второй праймер объекта, указанный референтный прямой праймер, указанный референтный обратный праймер, указанный зонд объекта и указанный референтный зонд.

23. Набор по п.22, где указанные праймеры объекта состоят из SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3, указанные референтные праймеры состоят из SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:6, указанный зонд объекта состоит из SEQ ID NO:4 и указанный референтный зонд состоит из SEQ ID NO:7.