JP5771208B2 - Ａａｄ−１事象ｄａｓ−４０２７８−９の検出 - Google Patents

Description

ａａｄ−１遺伝子（スフィンゴビウム・ハービシドボランス（Sphingobium herbicidovorans）に由来する）は、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ−１）タンパク質をコードする。この形質は２，４−ジクロロフェノキシ酢酸及びアリールオキシフェノキシプロピオネート（一般には「ホップ」除草剤と呼ばれており、例えばジクロホップ及びキザロホップなど）除草剤に対する耐性を付与し、植物形質転換中及び育種圃場において選択可能なマーカーとして使用できる。植物における除草剤耐性に対するａａｄ−１遺伝子自体については、国際公開第２００５／１０７４３７号パンフレットに最初に開示された（米国特許出願第２００９−００９３３６６号も参照）。

事象を検出する様々な方法は公知である。しかし、それらには各々問題がある。１つの方法は、Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000)によって記載されたパイロシーケンシング技法である。この方法では、隣接するゲノムＤＮＡと挿入ＤＮＡの接合部に重複するオリゴヌクレオチドが設計される。このオリゴヌクレオチドは、関心領域由来の一本鎖ＰＣＲ産物にハイブリダイズさせられ（挿入配列内の１つのプライマー及びフランキングゲノム配列内の１つのプライマー）、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン５’ホスホスルフェート及びルシフェリンの存在下でインキュベートされる。ＤＮＴＰは個別に加えられ、この組み込みは光シグナルを生じさせ、光シグナルは測定される。光シグナルは、成功した増幅、ハイブリダイゼーション、及び一塩基又は多塩基伸長に起因する導入遺伝子挿入／フランキング配列の存在を指示する。

蛍光偏光は、本発明のアンプリコンを検出するために使用できる又別の方法である。この方法に従うと、ゲノムフランキングＤＮＡと挿入ＤＮＡとの接合部に重複するオリゴヌクレオチドが設計される。このオリゴヌクレオチドは、関心領域由来の一本鎖ＰＣＲ産物にハイブリダイズさせられ（挿入ＤＮＡ内の１つのプライマー及びフランキングゲノムＤＮＡ配列内の１つのプライマー）、ＤＮＡポリメラーゼ及び蛍光標識ｄｄＮＴＰの存在下でインキュベートされる。一塩基伸長は、ｄｄＮＴＰの組み込みを生じさせる。組み込みは、蛍光光度計を使用して偏光における変化として測定できる。偏光における変化は、成功した増幅、ハイブリダイゼーション、及び一塩基伸長に起因する導入遺伝子挿入／フランキング配列の存在を指示する。

分子ビーコン（Molecular Beacons）は、配列検出において使用するために記載されている。手短には、フランキングゲノムと挿入ＤＮＡの接合部に重複するＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）オリゴヌクレオチドプローブが設計される。ＦＲＥＴプローブの固有の構造は、蛍光成分及び消光成分を極めて近接させて保持する二次構造を含有する構造を生じさせる。ＦＲＥＴプローブ及びＰＣＲプライマー（挿入ＤＮＡ配列内の１つのプライマー及びフランキングゲノム配列内の１つのプライマー）は、熱安定性ポリメラーゼ及びｄＮＴＰの存在下でサイクリングさせられる。成功したＰＣＲ増幅後、ＦＲＥＴプローブの標的配列へのハイブリダイゼーションは、結果としてプローブ二次構造の除去並びに蛍光成分及び消光成分の空間的隔離を生じさせる。蛍光シグナルが結果として生じる。蛍光シグナルは、成功した増幅及びハイブリダイゼーションに起因するフランキングゲノム／導入遺伝子挿入配列の存在を指示する。

加水分解プローブアッセイは、他にはＴＡＱＭＡＮ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州フォスターシティ）として公知であり、ＤＮＡ配列の存在を検出及び定量する方法である。手短には、ゲノムフランキングＤＮＡと挿入ＤＮＡの接合部に重複するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが設計される。ＦＲＥＴプローブ及びＰＣＲプライマー（挿入ＤＮＡ配列内の１つのプライマー及びフランキングゲノム配列内の１つのプライマー）は、熱安定性ポリメラーゼ及びｄＮＴＰの存在下でサイクリングさせられる。特異的増幅後、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼは、ＦＲＥＴプローブ上の消光成分から蛍光成分を浄化して放出する。蛍光シグナルは、成功した増幅及びハイブリダイゼーションに起因するフランキング／導入遺伝子挿入配列の存在を指示する。

又別の挑戦課題は、特に、所定の試験のために適合する参照遺伝子を見いだすことである。例えば、Ｃｚｅｃｈｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．の要約では次のように記載されている「Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＡＴＨ１全ゲノムＧｅｎｅＣｈｉｐ試験からの極めて大きなデータセットは、モデル植物種であるアラビドプシス（Arabidopsis）（シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））において極めて安定性発現レベルを示す新世代の参照遺伝子を同定するための手段を提供した。発達を通してある範囲の環境条件下で発現安定性に関して伝統的参照遺伝子より機能が優れている、数百個のアラビドプシス遺伝子が見いだされた。」(Czechowski et al. (2005) Genome-wide identification and testing of superior reference genes for transcript normalization in Arabidopsis. Plant Physiol. 139, 5-17.)

Brodmann et al. (2002)は、欧州連合において承認された４種のトウモロコシ（maize）品種について食品中のトランスジェニックトウモロコシ含量のリアルタイム定量的ＰＣＲ検出に関する。

Brodmann, P.D., P.D., Ilg E.C., Berthoud H., and Herrmann, A. Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction Methods for Four Genetically Modified Maize Varieties and Maize DNA Content in Food. J. of AOAC international 2002 85(3).

Hernandez et al. (2004)は、リアルタイムＰＣＲとともに使用するための４種の可能性のある遺伝子について言及している。Hernandez, M., Duplan, M.-N., Berthier, G., Vaitilingom, M., Hauser, W., Freyer, R., Pla, M., and Bertheau, Y. Development and comparison of four real-time polymerase chain reaction systems for specific detection and quantification of Zea mays L. J.Agric. Food Chem. 2004, 52, 4632-4637.

Costa et al. (2007)は、（同様にリアルタイムＰＣＲ状況において）これらの４つの遺伝子に目を向け、アルコールデヒドロゲナーゼ及びゼイン遺伝子がトランスジェニック飼料混入問題のためにサンプル「事象」（レクチン遺伝子）を検出するための最善の参照遺伝子であると結論付けた。Costa, L.D., and Martinelli L. Development of a Real-Time PCR Method Based on Duplo Target Plasmids for Determining an Unexpected Genetically Modified Soybean Intermix with Feed Components. J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 1264-1273.

Huang et al. (2004)は、トウモロコシにおいてＭＯＮ８１０及びＮＫ６０３導入遺伝子を検出するための参照分子としてプラスミドｐＭｕｌＭ２を使用した。Huang and Pan, 「Detection of Genetically Modified Maize MON810 and NK603 by Multiplex and Real-Time Polymerase Chain Reaction Methods,」 J. Agric. Food Chem., 2004, 52 (11), pp 3264-3268.

Gasparic et al. (2008)は、トウモロコシ事象（例えば、ＭＯＮ８１０）を定量的に分析するために、サイクリングプローブテクノロジー、ＴａｑＭａｎ、及び様々なリアルタイムＰＣＲ化学との比較からＬＮＡテクノロジーを提案している。Gasparic,Cankar, Zel, and Gruden, 「Comparison of different real-time PCR chemistries and their suitability for detection and quantification of genetically modified organisms,」 BMC Biotechnol. 2008; 8: 26.

米国特許第２００７０１４８６４６号は、組み込まれたヌクレオチドの量によって検出及び定量できる個別ヌクレオチドの制御された分配を必要とする定量のためのプライマー伸長法に関する。これは、内部参照遺伝子を使用するＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法とは相違する。

ＴＣ１５０７のホモ接合生殖性及びヘミ接合生殖性遺伝子型を識別するために、この事象に対してＩｎｖａｄｅｒアッセイが使用されて成功している。Gupta, M., Nirunsuksiri, W., Schulenberg, G., Hartl, T., Novak, S., Bryan, J., Vanopdorp, N., Bing, J. and Thompson, S. A non-PCR-based Invader Assay Quantitatively Detects Single-Copy Genes in Complex Plant Genomes. Mol. Breeding 2008, 21, 173-181.

Huabang (2009)は、トランスジェニックトウモロコシのＰＣＲに基づく接合生殖性試験に関する。しかし、参照遺伝子は使用されていないと思われる。Huabang, 「An Accurate and Rapid PCR-Based Zygosity Testing Method for Genetically Modified Maize,」 Molecular Plant Breeding, 2009, Vol.7, No.3, 619-623.

米国特許第２００７０１４８６４６号

Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000) Czechowski et al. (2005) Genome-wide identification and testing of superior reference genes for transcript normalization in Arabidopsis. Plant Physiol. 139, 5-17. Brodmann, P.D., P.D., Ilg E.C., Berthoud H., and Herrmann, A. Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction Methods for Four Genetically Modified Maize Varieties and Maize DNA Content in Food. J. of AOAC international 2002 85(3). Hernandez, M., Duplan, M.-N., Berthier, G., Vaitilingom, M., Hauser, W., Freyer, R., Pla, M., and Bertheau, Y. Development and comparison of four real-time polymerase chain reaction systems for specific detection and quantification of Zea mays L. J.Agric. Food Chem. 2004, 52, 4632-4637. Costa, L.D., and Martinelli L. Development of a Real-Time PCR Method Based on Duplo Target Plasmids for Determining an Unexpected Genetically Modified Soybean Intermix with Feed Components. J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 1264-1273. Huang and Pan, 「Detection of Genetically Modified Maize MON810 and NK603 by Multiplex and Real-Time Polymerase Chain Reaction Methods,」 J. Agric. Food Chem., 2004, 52 (11), pp 3264-3268. Huang and Pan, 「Detection of Genetically Modified Maize MON810 and NK603 by Multiplex and Real-Time Polymerase Chain Reaction Methods,」 J. Agric. Food Chem., 2004, 52 (11), pp 3264-3268. Gasparic,Cankar, Zel, and Gruden, 「Comparison of different real-time PCR chemistries and their suitability for detection and quantification of genetically modified organisms,」 BMC Biotechnol. 2008; 8: 26. Gupta, M., Nirunsuksiri, W., Schulenberg, G., Hartl, T., Novak, S., Bryan, J., Vanopdorp, N., Bing, J. and Thompson, S. A non-PCR-based Invader Assay Quantitatively Detects Single-Copy Genes in Complex Plant Genomes. Mol. Breeding 2008, 21, 173-181. Huabang, 「An Accurate and Rapid PCR-Based Zygosity Testing Method for Genetically Modified Maize,」 Molecular Plant Breeding, 2009, Vol.7, No.3, 619-623.

本発明は、サンプル（例えば、コーン（corn）穀粒）中のＤＡＳ−４０２７８−９と指名されたＡＡＤ−１コーン事象の存在を検出するためのアッセイを提供する（代表的な種子は、アクセッション番号ＰＴＡ−１０２４４を付してアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に預託された（イエローデントトウモロコシハイブリット種子（Yellow Dent maize hybrid seed）（Zea Mays L.）；ＤＡＳ−４０２７８−９; Ｄｏｗ ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ ＬＬＣ社のためにブダペスト条約を順守して預託された；ＡＴＴＣによる種子／菌株の受領日：２００９年７月１０日；生存性確認日、２００９年８月１７日）。アッセイを実施する際に有用なキット及び条件も又提供される。

より詳細には、本発明は、一部にはトウモロコシ内因性参照遺伝子を利用するコーンにおけるＡＡＤ−１事象についてのエンドポイントＴａｑＭａｎ ＰＣＲアッセイに関する。一部の実施形態は、高スループット接合生殖性分析が可能なアッセイに向けられる。本発明は、さらに、一部には、接合生殖性を決定する際に使用するための好ましいインベルターゼ参照遺伝子の発見に関する。

したがって、本発明は、また、一部には、本検出法のいずれかを組み込んでいる植物育種に関する。一部の実施形態では、前記事象は、例えば、その他の除草剤耐性遺伝子及び／又は昆虫阻害性タンパク質を含む他の形質と「積み重ねる」ことができる。本方法は、本発明の事象を含むコーン系を一意的に同定するために使用できる。

コーン事象ＤＡＳ−４０２７８−９におけるＤＮＡインサートに対するクローニング戦略を示す図である。

コーン事象ＤＡＳ−４０２７８−９のフランキング境界領域を確認するためのＰＣＲ増幅に使用されるプライマーの図である。この略図は、ＡＡＤ−１コーン事象ＤＡＳ−４０２７８−９の５’〜３’境界の全長シーケンシングを確認するためのプライマーの位置を示す図である。

コーン事象ＤＡＳ−４０２７８−９からのフランキング境界配列についてのクローニング戦略を示す図である。コーン事象ＤＡＳ−４０２７８−９のゲノムＤＮＡはＥｃｏＲ Ｖ、Ｓｔｕ Ｉ、又はＳｃａ Ｉを用いて消化し、対応するＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）ライブラリーを生成し、これらを標的ＤＮＡ配列を増幅させるための鋳型として使用した。

配列の簡単な説明
配列番号１は、コーン事象ＤＡＳ−４０２７８−９についてのインサートを含むＡＡＤ−１挿入のどちらかの側での５’及び３’ゲノムフランキング配列の配列を提供する。
配列番号２〜７は、本発明に従って使用するためのプライマー及びプローブである。
配列番号８は、実証された事象アンプリコンである。
配列番号９は、実証された参照アンプリコンである。

トランスジェニックＡＡＤ−１（除草剤耐性を提供する）コーン事象ＤＡＳ−４０２７８−９は、Ｗｈｉｓｋｅｒ媒介形質転換によって生成させた。このＡＡＤ−１導入遺伝子インサートの両方の５’及び３’末端フランキング配列は、ＵＳＳＮ６１／２３５，２４８（２００９年８月１９日に出願）に詳述されたようにクローニングし、シーケンシングし、特性解析した。

特異的ＴＡＱＭＡＮプライマー及びプローブは、本明細書に詳述したように、一部には５’挿入−植物接合部に位置するＤＮＡ配列に従って設計された。プライマー及びプローブの事象特異性は、１６種のＡＡＤ−１コーン事象に対するリアルタイムＰＣＲにおける参照遺伝子としてのコーンインベルターゼ及び２種の非トランスジェニックコーン品種を用いて二重フォーマットで試験して成功が得られた。ＡＡＤ−１コーン事象ＤＡＳ−４０２７８−９についてのエンドポイント事象特異的ＴＡＱＭＡＮアッセイのための方法は、本明細書に詳述したように開発された。

このＡＡＤ−１コーンにおける宿主植物ＤＮＡと統合遺伝子構築物との間の統合接合部の領域に渡る配列は、固有の配列である。この配列は、ＧＭＯ試験のためのＡＡＤ−１コーンＤＡＳ−４０２７８−９の存在を検出し、育種集団における植物の接合生殖性状態を決定する目的で事象特異的アッセイ（従来型ＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲ）を開発するために使用された。本明細書に報告した事象特異的ＴＡＱＭＡＮアッセイは、両方の適用のために使用することができる。

本発明は、サンプル中の本トランスジェニックコーン事象ＤＡＳ−４０２７８−９（ｐＤＡＳ１７４０−２７８としても公知である）の存在を検出するためのアッセイを提供する。本発明の態様には、本明細書で実証又は提案した任意の診断的核酸分子を設計及び／又は生成する方法が含まれる。

本発明は、一部には、これらの方法のいずれかを組み込んでいる植物育種にさらに関する。一部の実施形態では、本事象は、例えば他の形質（例えばその他の除草剤耐性遺伝子及び／又は昆虫阻害性タンパク質をコードする遺伝子）と「積み重ねる」ことができる。本事象を含む植物系は、本明細書に開示及び提案した配列を使用して検出することができる。

一部の実施形態では、本発明は、除草剤耐性コーン系の同定に関する。本発明は、一部には、性的交配の子孫が関心事象を含有するかどうかを決定する目的で本事象の存在を検出することに関する。さらに、本事象を検出するための方法が含まれ、本方法は、例えば、リコンビナント作物に由来する食品の市場導入前承認及びラベル表示を必要とする規制に従うために有用である。

本発明は、一部には、ＡＡＤ−１トウモロコシ事象の高スループット接合生殖性分析のための参照（コピー数）コントロールとしての内因性遺伝子を利用する蛍光に基づくエンドポイントＴａｑＭａｎ ＰＣＲアッセイに関する。本発明は、一部には、好ましい参照遺伝子であるインベルターゼの発見にさらに関する。幾つかの参照遺伝子が可能性のある選択肢として同定された。

本発明は、一部には、ＡＡＤ−１事象特異的接合生殖性分析のためのバイプレックスエンドポイントＴａｑＭａｎ ＰＣＲの開発にさらに関する。さらに、本発明は、一部には、ＡＡＤ−１育種試験キットの開発に関する。

エンドポイントＴａｑＭａｎ アッセイは、「プラス」がサンプルがアッセイされた遺伝子に対して陽性であり、「マイナス」がサンプルがアッセイされた遺伝子に対して陰性であることを明示するプラス／マイナス戦略に基づいている。これらのアッセイは、典型的にはＡＡＤ−１導入遺伝子配列及び野生型遺伝子配列各々を同定するために２セットのオリゴヌクレオチド、並びに導入遺伝子及び野生型配列の含量を測定するための二重標識プローブを利用する。

Ｉｎｖａｄｅｒアッセイは事象を特性解析するための堅固な技術であったが、このアッセイは、ＤＮＡの品質に対して極めて影響を受けやすい。さらに、このアッセイは、多量のＤＮＡを必要とする。Ｉｎｖａｄｅｒアッセイは、さらに又適正に取り扱われないとＩｎｖａｄｅｒアッセイの結果を失敗に終わらせる可能性がある追加の変性工程を必要とする。さらに、Ｉｎｖａｄｅｒアッセイの長いアッセイ時間は、商業的環境において分析するために多数のＡＡＤ−１サンプルを効率的に取り扱う柔軟性を制限される。本発明の１つの主要な利点は、時間の節約と変性する工程の排除である。

ＡＡＤ−１事象を検出するための本エンドポイントＴａｑＭａｎ分析は、Ｉｎｖａｄｅｒ法に比較して、特に多数のサンプルを分析する際に驚くべき利点を提供する。

本発明は、コーン、大豆、及び綿を含む作物におけるＡＡＤ−１除草剤耐性形質の開発及び特性解析に影響を及ぼすことができる。

用語の定義及び実施例は、本発明を説明するのに役立つために、及び当業者が本発明を実施できるように導くために本明細書に提供されている。他に明記されない限り、用語は関連分野における当業者の慣例的用法に従うと理解されたい。３７ＣＦＲ（米連邦規則集）§１．８２２に規定されたＤＮＡ塩基についての術語が使用される。本明細書で使用する用語「子孫」は、ＡＡＤ−１コーン事象ＤＡＳ−４０２７８−９を含む親植物のいずれかの世代の子を意味する。

トランスジェニック「事象」は、異種ＤＮＡ、すなわち関心導入遺伝子を含む核酸構築物を備える植物細胞の形質転換、該植物のゲノム内への導入遺伝子の挿入の結果として生じる植物集団の再生、及び特定ゲノム位置内への挿入を特徴とする特定植物の選択によって生成される。用語「事象」は、原形質転換体及び異種ＤＮＡを含む形質転換体の子孫を意味する。用語「事象」は、形質転換体とゲノム／導入遺伝子ＤＮＡを含む又別の種との性的異種交配によって生成される子孫も又意味する。反復親への繰り返し戻し交配後でさえ、形質転換された親からの挿入された導入遺伝子ＤＮＡ及びフランキングゲノムＤＮＡ（ゲノム／導入遺伝子ＤＮＡ）は、交配の子孫中に同一染色体位置で存在する。用語「事象」は、挿入されたＤＮＡ配列、並びに該挿入されたＤＮＡ（例えば、原形質転換体及び自植の結果として生じる子孫）を含む１つの親系と該挿入されたＤＮＡを含有しない親系との性的交配の結果としての関心導入遺伝子を含む挿入されたＤＮＡ受け入れる子孫へ転移させられると予測される該挿入されたＤＮＡに直接隣接するフランキングゲノム配列を含む原形質転換体及びその子孫由来のＤＮＡも意味する。

「接合部配列」は、ゲノム内に挿入されたＤＮＡが挿入点に隣接するコーン天然ゲノム由来のＤＮＡに連結する地点に広がっている。本明細書に記載したコーン事象における挿入と類似の長さのフランキングＤＮＡとに渡るＤＮＡ配列が含まれる。

本発明は、本事象の同定に関する。本発明には、関連するＰＣＲプライマー及びアンプリコンが含まれる。これらの分子を使用すると、本トランスジェニックコーン系に由来する商業化されたトランスジェニックコーン品種又は系を検出又は同定することができる。

挿入の全配列は、各フランキング配列の部分と一緒に、本明細書では配列番号１として提供されている。配列番号１（計８，５５７塩基対）に関する本事象についての挿入及びフランキング配列の配位は、下記に表示した。

本事象についてのＡＡＤ−１挿入及びフランキング配列の構成要素は、図１〜３にさらに例示した。

本発明の検出技術は、植物育種と結び付けて使用すると、子孫に１つ又はそれ以上の追加の関心形質を付与する努力において関心事象を含む親植物が他の植物系と交配させられた後に、どの子孫植物が所定の事象を含むかを決定することができる。本方法は、例えば、コーン育種プログラム並びに特に商業化トランスジェニックコーン種子についての品質管理において有用である。これはさらに、製品規制及びプロダクト・スチュワードシップにも利益を与えることができる。これらの方法は、育種戦略を加速するために使用できる。

一部の実施形態では、接合生殖性分析のための蛍光に基づくエンドポイントＴａｑＭａｎアッセイは、コーン及び参照遺伝子におけるＡＡＤ−１事象を同定するためにプレートリーダーにおいて結果を直接的に読み取ることを可能にする。

本発明は、育種用途、例えば他のコーン系内へのＡＡＤ−１事象の遺伝子移入の試験を含む。

本発明の検出法及びキットは、本発明による事象を同定するために使用できる。本発明の検出法及びキットは、育種戦略を加速するため、及び連鎖データを確立するために使用できる。

本発明の検出技術は、植物育種と結び付けて使用すると、子孫に１つ又はそれ以上の追加の関心形質を付与する努力において関心事象を含む親植物が他の植物系と交配させられた後に、どの子孫植物が所定の事象を含むかを決定する際に特に有用である。これらのＴａｑｍａｎ ＰＣＲ分析法は、トウモロコシ育種プログラム、並びに特に商業化されたトランスジェニックトウモロコシ種子についての品質管理にとって利益がある。今では、これらのトランスジェニックトウモロコシ系のためのＴａｑｍａｎ ＰＣＲ検出キットも又作成及び使用することができる。これはさらに、製品規制及びプロダクト・スチュワードシップにも利益を与えることができる。

さらになお、本方法は、導入遺伝子統合プロセス、ゲノム統合部位特性、事象ソーティング、導入遺伝子及びそれらのフランキング配列の安定性、並びに遺伝子発現（特に遺伝子サイレンシング、導入遺伝子メチル化パターン、位置効果、及び潜在的発現関連エレメント、例えばＭＡＲＳ（マトリックス付着領域［matrix attachment regions］）などに関連する）を試験及び特性解析するために使用できる。

本明細書において使用する用語「コーン」はトウモロコシ（Zea mays）を意味し、コーンとともに栽培できるそれらの全品種を含む。

本発明はさらに、交配種を作成し、及び本発明の方法を使用するプロセスを含む。例えば、本発明は、Ｆ_１ハイブリッド種子を生成する方法であって、例示した植物を相違する（例、同系親）植物と交配させる工程と、結果として生じたハイブリッド種子を収穫する工程と、及び本事象を検出する工程とによる方法を含む。結果として生じる植物の特性は、本発明の方法を組み込むことによっても改良することができる。

除草剤耐性コーン植物は、本明細書で言及した系の種子から栽培したコーン植物からなる第１親コーン植物及び第２親コーン植物を最初に性的に交配させる工程と、それにより複数の第１子孫植物を生成する工程と、次に除草剤に耐性である（又は本事象を有する）第１子孫植物を選択する工程と、該第１子孫植物を自植させ、それにより複数の第２子孫植物を生成する工程と、次に該第２子孫植物から除草剤に耐性である（又は該事象の内の少なくとも１つを有する）植物を選択する工程によって栽培することができる。これらの工程は、第１子孫植物又は第２子孫植物を第２親コーン植物又は第３親コーン植物へ戻し交配する工程をさらに含むことができる。本発明のコーン種子を含むコーン作物、又はそれらの子孫を次に植えることができる。

さらに、２種の相違するトランスジェニック植物は、２つの独立して分離して加えられる、外来遺伝子を含有する子孫を生成するためにさらに対合させられると理解されたい。適切な子孫の自植は、両方の加えられた外来遺伝子に対してホモ接合生殖性である植物を生成することができる。親植物への戻し交配及び非トランスジェニック植物との異系交配も又、栄養繁殖と同様に企図されている。様々な形質及び作物のために一般に使用されるその他の育種方法は、当分野において公知である。戻し交配育種は、反復親である、望ましいホモ接合生殖性の栽培品種系若しくは近交系内への単純に遺伝で受け継いだ、高度の遺伝性の形質のための遺伝子を転移させるために使用されてきた。転移対象の形質の起源は、ドナー親と呼ばれる。結果として生じる植物は、反復親（例、栽培品種）の属性及びドナー親から転移した望ましい形質を有すると予期される。初期交配後、ドナー親の表現型を有する個体が選択され、反復親へ繰り返し交配（戻し交配）される。結果として生じる親は、反復親（例、栽培品種）の属性及びドナー親から転移した望ましい形質を有すると予期される。

本発明は、マーカー支援育種（ＭＡＢ）法と結び付けて使用できる。同様に、本発明のＤＮＡ分子は、遺伝的に連結している農学的に有用な形質を同定する他の方法（例えばＡＦＬＰマーカー、ＲＦＬＰマーカー、ＲＡＰＤマーカー、ＳＮＰ、及びＳＳＲ）とともに使用することができる。除草剤耐性形質は、ＭＡＢ法を使用すると交配の子孫（又はそれらの子孫及び任意の他のコーン栽培品種若しくは品種）において追跡することができる。本発明の方法は、本事象を有する任意のコーン品種を同定するために使用できる。

本発明の方法は、除草剤耐性コーン植物を作成する方法であって、前記方法は本事象を有する植物を用いて育種する工程を含む方法を含む。好ましい方法は、本発明によって検出可能な事象について前記子孫を分析する工程によって前記交配種の子孫を選択する工程をさらに含む。例えば、本発明を使用すると、他の望ましい形質、例えば農業形質を含む植物を用いた育種サイクルを通して本事象を追跡することができる。本事象及び所望の形質を含む植物は、検出し、同定し、選択し、及び例えばその後の一連の育種において迅速に使用することができる。本事象／形質はさらに又、育種を通して結合し、そして昆虫耐性形質及び／又はさらになる除草剤耐性形質を用いて、本発明によって追跡することができる。後者の１つの好ましい実施形態は、イミダゾリノン系除草剤、グリホセート、及び／又はグルホシネートに対する耐性をコードする遺伝子と結合された本事象を含む植物である。一部の実施形態では、ジカンバ耐性遺伝子を使用できる。

そこで本発明は、例えば、グリホセート耐性（例、耐性植物若しくは細菌ＥＰＳＰＳ、ＧＯＸ、ＧＡＴ）、グルホシネート耐性（例、Ｐａｔ、ｂａｒ）、アセトラクテートシンターゼ（ＡＬＳ）−阻害性除草剤耐性（例、イミダゾリノン類［例えば、イマゼタピル］、
スルホニルウレア類、チリアゾロピリミジンスルホンアニリド、ピルミジニルチオベンゾエート類、及びその他の化学薬品［Ｃｓｒ１、ＳｕｒＡなど］）、
ブロモキシニル耐性（例、Ｂｘｎ）、ＨＰＰＤ（４−ヒドロキシルフェニル−ピルベート−ジオキシゲナーゼ）酵素の阻害剤に対する耐性、フィトエンデサチュラーゼ（ＰＤＳ）の阻害剤に対する耐性、光化学系ＩＩ阻害性除草剤（例、ｐｓｂＡ）に対する耐性、光化学系Ｉ阻害性除草剤に対する耐性、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼＩＸ（ＰＰＯ）−阻害性除草剤（例、ＰＰＯ−１）に対する耐性、フェニルウレア系除草剤（例、ＣＹＰ７６Ｂ１）に対する耐性、ジカンバ分解酵素（例、例えば、米国特許出願第２００３０１３５８７９号を参照されたい）をコードする形質と結合することができ、その他の形質は、雑草シフト及び／又は上述したクラスの任意の除草剤への耐性を効果的に制御若しくは防止する能力を提供するために、単独で、又は複数の組み合わせで積み重ねることができよう。

追加の除草剤に関して、一部の追加の好ましいＡＬＳ（ＡＨＡＳとしても公知である）阻害剤には、トリアゾロピリミジンスルホンアニリド類（例えば、クロランスラム−メチル、ジクロスラム、フロラスラム、フルメトスラム、メトスラム、及びペノキススラム）、ピリミジニルチオベンゾエート類（例えば、ビスピリバック及びピリチオバック）、並びにフルカルバゾンが含まれる。一部の好ましいＨＰＰＤ阻害剤には、メソトリオン、イソキサフルトール、及びスルコトリオンが含まれる。一部の好ましいＰＰＯ阻害剤には、フルミクロラック、フルミオキサジン、フルフェンピル、ピラフルフェン、フルチアセット、ブタフェナシル、カルフェントラゾン、スルフェントラゾン、及びジフェニルエーテル類（例えば、アシフルオルフェン、フォメサフェン、ラクトフェン、及びオキシフルオルフェン）が含まれる。

さらに、単独又は１つ又はそれ以上の追加のＨＴＣ形質と積み重ねられたＡＡＤ−１には、１つ又はそれ以上の追加のインプット（例、昆虫耐性、真菌耐性、又はストレス耐性その他）又はアウトプット（例、増加した収率、改良された油プロファイル、改良された繊維品質その他）形質を積み重ねることができる。そこで、本発明を使用すると、任意の数の農業害虫を柔軟に及び費用効果的に制御する能力を備える改良された作物品質の完全農業パッケージを提供することができる。

本明細書で使用する「系」は、少なくとも１つの形質についての個体間の遺伝的変異をほとんど又は全く示さない植物の群である。そのような系は、数世代の自家受粉及び選択、又は組織若しくは細胞培養技術を使用して単一親からの栄養繁殖によって作り出すことができる。

本明細書で使用する用語「栽培品種」及び「品種」は、同義語であり、商業的生産のために使用される系を意味する。

「安定性」又は「安定した」は、所定の構成要素に関して、該構成要素が世代から世代に、及び好ましくは、少なくとも３世代に渡って実質的に同一レベルで、例えば好ましくは±１５％、より好ましくは±１０％、最も好ましくは±５％で維持されることを意味する。安定性は、植え付けの温度、位置、ストレス及び時間によって影響される可能性がある。現場条件下でのその後の世代の比較は、類似方法で該構成要素を生成するはずである。

「商業的有用性」は、作物を従来型工作機械を使用して農業従事者が生産することができ、本明細書に記載した構成成分を備える油を従来型破砕及び抽出装置を使用して種子から抽出できるように、優れた植物活力及び高繁殖力を有すると規定されている。商業的に有用であるためには、種子重量、油含量、及び１エーカー（４，４０４６．８６ｍ^２）当たりに生産される全油によって測定される収量は、同一領域内で栽培されたプレミアム価値形質を備えていない、他の点では匹敵する商業的トウモロコシ品種の平均収率の１５％以内である。

「農学的精鋭」は、１つの系が望ましい農業的特性、例えば収率、成熟度、疾患耐性などを本事象に起因する昆虫耐性に加えて有することを意味する。個別又は任意の組み合わせで取り入れられた農学的形質。

当業者であれば本開示に照らして理解できるように、検出キットの好ましい実施形態は、例えばプローブ及び／又はプライマーを含むことができる。例えば、これは本明細書に示したポリヌクレオチドプローブ、プライマー、及び／又はアンプリコンを含む。

当業者であれば、又プライマー及びプローブがある範囲の標準ハイブリダイゼーション及び／又はＰＣＲ条件下で配列番号１（又はその相補体）、及びそれらの相補体のセグメントにハイブリダイズするように設計することができることを認識できるであろうが、このとき該プライマー又はプローブは、例示した配列に対して完全に相補的ではない。つまり、ある程度のミスマッチは忍容することができる。およそ２０ヌクレオチドプライマーについては、例えば、典型的には１つ又は２つ又はその位のヌクレオチドは、ミスマッチ塩基がアンプリコンとは反対のプライマーの内部若しくは末端にある場合は逆鎖と結合する必要はない。様々な適切なハイブリダイゼーション条件を下記に提供する。合成ヌクレオチドアナログ、例えばイノシンも又プローブ内で使用することができる。ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブ、並びにＤＮＡ及びＲＮＡプローブも又使用できる。重要であるのは、そのようなプローブ及びプライマーが本発明の事象の存在について診断的である（一意的に同定及び識別することができる）点である。

「インサート」の各々の構成要素は、図１〜３に例示した。これらの構成要素、又はそれらのフラグメントのＤＮＡポリヌクレオチド配列は、本発明の方法におけるＤＮＡプライマー又はプローブとして使用できる。

本発明の一部の実施形態では、コーン植物由来の植物及び種子などにおける導入遺伝子／ゲノム挿入領域の存在を検出するための組成物及び方法が提供される。

一部の実施形態では、新規導入遺伝子／ゲノム挿入領域の隣接フラグメントを含むＤＮＡ配列が本発明の１つの態様である。導入遺伝子挿入配列の十分な長さのポリヌクレオチド並びにコーンゲノム配列及び／又はこれらのコーン植物の１つ又はそれ以上に対して診断的であるアンプリコン産物を生成するためのプライマー配列として有用である配列の十分な長さのポリヌクレオチドを含むＤＮＡ配列が含まれる。

関連実施形態は、本明細書で同定したＤＮＡ配列、又はそれらの相補体の導入遺伝子部分の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又はそれ以上の隣接ヌクレオチドを含むＤＮＡ配列に関する。そのような配列は、ＤＮＡ増幅法におけるＤＮＡプライマーとして有用な可能性がある。これらのプライマーを使用して生成されたアンプリコンは、本明細書で言及したコーン事象に対して診断的である。このため、本発明は、アンプリコン並びにそのようなＤＮＡプライマー及び相同プライマーによって生成されたアンプリコンも又含む。

本発明は、サンプル中における本明細書で言及したコーン事象に対応するＤＮＡの存在を検出する方法を含む。そのような方法は、（ａ）ＤＮＡを含むサンプルを、これらのコーン事象の内の少なくとも１つ由来のＤＮＡを用いる核酸増幅反応において使用した場合に前記事象に対して診断的であるアンプリコンを生成するプライマーセットと接触させる工程と、（ｂ）核酸増幅反応を実施し、それにより該アンプリコンを生成する工程と、（ｃ）該アンプリコンを検出する工程とを含むことができる。

本発明の又別の検出方法は、サンプル中における前記事象の少なくとも１つに対応するＤＮＡの存在を検出する方法であって、前記方法は、（ａ）ＤＮＡを含む該サンプルをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、前記コーン事象の内の少なくとも１つ由来のＤＮＡとはハイブリダイズするが、該ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でコントロールコーン植物（非関心事象ＤＮＡ）とはハイブリダイズしないプローブと接触させる工程と、（ｂ）該サンプル及びプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供する工程と、（ｃ）該プローブの該ＤＮＡへのハイブリダイゼーションを検出する工程とを含む方法を含む。

本発明は、サンプル中において、本明細書で言及したトウモロコシ植物の内の少なくとも１つ由来のＤＮＡの存在を検出する方法を含む。そのような方法は、（ａ）ＤＮＡを含む該サンプルを、これらのトウモロコシ事象の内の少なくとも１つを由来とするＤＮＡを用いる本発明の核酸増幅反応において使用した場合に、プライマーセットと接触させる工程と、（ｂ）本明細書に同定した参照遺伝子を使用してＴＡＱＭＡＮ ＰＣＲ増幅反応を実施する工程と、（ｃ）結果を分析する工程とを含むことができる。

さらに又別の実施形態では、本発明は、本発明のＡＡＤ−１事象を含むコーン植物を生成する方法であって、前記方法が、（ａ）第１親コーン系（前記除草剤耐性形質を前記系の植物に付与する、本発明の発現カセットを含む）及び第２親コーン系（この除草剤耐性形質が欠如する）を性的交配させ、それにより複数の子孫植物を生成する工程と、（ｂ）分子マーカーの使用によって子孫植物を選択する工程とを含む方法を含む。そのような方法は任意で、前記除草剤耐性形質を含む何世代にも渡って同じ特徴を示すコーン植物を生成するために該子孫植物を該第２親コーン系へ戻し交配する又別の工程を含むことができる。

本発明の又別の態様によると、本事象を含む交配種の子孫の接合生殖性を決定する方法が提供される。前記方法は、コーンＤＮＡを含むサンプルを本発明のプライマーセットと接触させる工程を含むことができる。前記プライマーは、前記コーン事象の内の少なくとも１つ由来のゲノムＤＮＡを用いる核酸増幅反応において使用されると、前記コーン事象の内の少なくとも１つに対して診断的である第１アンプリコンを生成する。そのような方法は、核酸増幅反応を実施し、それにより第１アンプリコンを生成する工程と、該第１アンプリコンを検出する工程と、コーンＤＮＡを含む該サンプルを、コーン植物からのゲノムＤＮＡを用いた核酸増幅反応において使用されると該コーンゲノム領域と相同である天然コーンゲノムＤＮＡを含む第２アンプリコンを生成する前記プライマーセットと接触させる工程と、核酸増幅反応を実施し、それにより第２アンプリコンを生成する工程とをさらに含んでいる。本方法は、第２アンプリコンを検出する工程と、及びサンプル中の第１及び第２アンプリコンを比較する工程とをさらに含み、このとき両方のアンプリコンの存在は該サンプルが導入遺伝子挿入に対してヘテロ接合生殖性であることを示す。

ＤＮＡ検出キットは、本明細書に開示した組成物及びＤＮＡ検出の分野において周知である方法を使用して開発することができる。本キットは、サンプル中の本コーン事象ＤＮＡを同定するために有用であり、このＤＮＡを含有するコーン植物を育種するための方法に適用することができる。本キットは、例えば本明細書に開示したアンプリコン、又は本事象の導入遺伝子エレメントに含有されたＤＮＡと相同又は相補的であるＤＮＡ配列に相同又は相補的であるＤＮＡ配列を含有する。これらのＤＮＡ配列はＤＮＡ増幅反応において、又はＤＮＡハイブリダイゼーション法におけるプローブとして使用できる。本キットは、検出法を実施するために必要な試薬及び材料も又含有することができる。

「プローブ」は、従来型の検出可能な標識又はレポーター分子（例えば、放射性同位体、リガンド、化学発光剤、又は酵素）に付着している単離された核酸分子である。そのようなプローブは、標的核酸の鎖に対して、本発明の場合には、コーン植物由来であろうと、又は該事象由来のＤＮＡを含むサンプル由来であろうと、前記コーン事象の内の１つ由来のゲノムＤＮＡの鎖に対して相補的である。本発明によるプローブには、デオキシリボ核酸若しくはリボ核酸だけではなくポリアミド類及び標的ＤＮＡ配列に特異的に結合する他のプローブ材料も又含まれ、その標的ＤＮＡ配列の存在を検出するために使用できる。

「プライマー」は、該プライマーと標的ＤＮＡ鎖との間のハイブリッドを形成し、その後にポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼによって該ＤＮＡ鎖に沿って伸長させるために、核酸ハイブリダイゼーションによって相補的標的ＤＮＡ鎖にアニーリングされる単離／合成された核酸である。本発明のプライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又はその他の従来型核酸増幅法によって標的核酸配列を増幅させるためのそれらの使用について述べられる。

プローブ及びプライマーは、一般には長さが５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、または５００ポリヌクレオチド又はそれ以上である。そのようなプローブ及びプライマーは、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で標的配列へ特異的にハイブリダイズする。好ましくは、本発明によるプローブ及びプライマーは標的配列との完全な配列類似性を有するが、標的配列とは相違して標的配列にハイブリダイズする能力を保持するプローブは、従来型方法によって設計することができる。

プローブ及びプライマーを調製及び使用するための方法は、例えば、Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd ed., vol.1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989に記載されている。 ＰＣＲプライマー対は、公知の配列から、例えばその目的に合うことが意図されたコンピュータプログラムを使用して引き出すことができる。

本明細書に開示したフランキングＤＮＡ及び挿入配列に基づくプライマー及びプローブを使用すると、従来法、例えばそのような配列を再クローニング及びシーケンシングする工程によって開示された配列を確認する（及び、必要であれば修正する）ことができる。

本発明の核酸プローブ及びプライマーは、標的ＤＮＡ配列へストリンジェント条件下でハイブリダイズする。サンプル中のトランスジェニック事象からＤＮＡの存在を同定するためには、任意の従来型核酸ハイブリダイゼーション又は増幅法を使用することができる。核酸分子又はそれらのフラグメントは、所定の状況下で他の核酸分子へ特異的にハイブリダイズすることができる。本明細書で使用する２つの核酸分子は、該２つの分子が逆平行二本鎖核酸構造を形成できる場合は、相互へ特異的にハイブリダイズすることができると言われる。核酸分子は、それらが完全相補性を示す場合は又別の核酸分子の「相補体」であると言われる。本明細書で使用する「分子」は、該分子の１つの各ヌクレオチドが他のヌクレオチドに相補性である場合に「完全相補性」を示すと言われる。２つの分子は、それらが少なくとも従来型「低ストリンジェンシー」条件下で相互にアニーリングしたままとなることを許容する十分な安定性で相互にハイブリダイズすることができれば「最小相補的」であると言われる。同様に、分子は、それらが従来型「高ストリンジェンシー」条件下で相互にアニーリングしたままとなることを許容する十分な安定性で相互にハイブリダイズすることができれば「相補的」であると言われる。従来型ストリンジェンシー条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９によって記載されている。このため完全相補性からの逸脱は、そのような逸脱が分子が二本鎖構造を形成する能力を完全には除外しない限り容認できる。核酸分子がプライマー又はプローブとして機能するためには、使用される特定の溶媒及び塩濃度下で安定性二本鎖構造を形成できるために配列において十分に相補性であることだけが必要とされる。

本明細書で使用する「実質的に相同の配列」は、高ストリンジェンシー条件下での比較対象の核酸配列の相補体へ特異的にハイブリダイズする核酸配列である。用語「ストリンジェント条件」は、Sambrook et al., 1989, at 9.52-9.55において考察された特異的ハイブリダイゼーション法による標的核酸（すなわち、特定の関心核酸配列）への核酸プローブのハイブリダイゼーションに関して機能的に規定される。さらに、Sambrook et al., 1989 at 9.47-9.52 and 9.56-9.58も参照されたい。従って、本発明のヌクレオチド配列は、ＤＮＡフラグメントの相補的伸長を備える二重鎖分子を選択的に形成するそれらの能力に対しても使用されることがある。

想定された適用に依存して、標的配列に関するプローブの様々な程度の選択性を達成するために様々なハイブリダイゼーション条件を使用することができる。高選択性を必要とする適用のためには、典型的にはハイブリッドを形成するための相当にストリンジェントな条件を使用するが、例えば、約５０℃〜約７０℃の温度で約０．０２Ｍ〜約０．１５Ｍ ＮａＣｌのような、例えば相当に低い塩及び／又は高い温度条件を選択することになる。ストリンジェント条件は、例えば、高ストリンジェンシー洗浄バッファー（０．２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、６５℃）を用いてハイブリダイゼーションフィルターを少なくとも２回洗浄する工程を含むことができよう。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェント条件、例えば、約４５℃で６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、その後の５０℃で２．０×ＳＳＣの洗浄は、当業者には公知である。例えば、洗浄工程における塩濃度は、５０℃での低ストリンジェンシーの約２．０×ＳＳＣから５０℃での高ストリンジェンシーの約０．２×ＳＳＣまでから選択することができる。さらに、洗浄工程における温度は、低ストリンジェンシー条件での約２２℃の室温から高ストリンジェンシー条件での約６５℃まで増加させることができる。温度及び塩はどちらも変化させることができる、又は温度若しくは塩濃度のいずれかは他方の変量を変化させながら一定に保持することができる。そのような選択条件は、プローブと鋳型若しくは標的鎖との間のミスマッチが万一あっても、ほとんど許容しない。ハイブリダイゼーションによるＤＮＡ配列の検出は当業者には周知であり、米国特許第４，９６５，１８８号及び第５，１７６，９９５号の教示は、ハイブリダイゼーション分析法の典型例である。

特に好ましい実施形態では、本発明の核酸は、高ストリンジェンシー条件下で、相補体及びそれらのフラグメントを含む、本明細書で例示又は提案した１つ又はそれ以上のプライマー（又はアンプリコン若しくはその他の配列）へ特異的にハイブリダイズすることになる。本発明の１つの態様では、本発明の核酸分子は、配列番号２〜７に規定した核酸配列、又はそれらの相補体及び／又はフラグメントを有する。

本発明の又別の態様では、本発明のマーカー核酸分子は、そのような核酸配列との８０％〜１００％又は９０％〜１００％の配列同一性を共有する。本発明のさらに別の態様では、本発明のマーカー核酸分子は、そのような配列との９５％〜１００％の配列同一性を共有する。そのような配列は、遺伝的交配の子孫を同定するための植物育種法においてマーカーとして使用できる。プローブの標的ＤＮＡ分子へのハイブリダイゼーションは、当業者に公知の任意の数の方法によって検出でき、これらには蛍光タグ、放射性タグ、抗体に基づくタグ、及び化学発光タグが含まれるがそれらに限定されない。

特定増幅プライマー対を使用した標的核酸配列の増幅（例、ＰＣＲによる）に関しては、「ストリンジェント条件」は、プライマー対がそれに対応する野生型配列（若しくはその相補体）を有するプライマーが結合し、及び好ましくは固有の増幅産物であるアンプリコンを生成する標的核酸配列にのみハイブリダイズすることを許容する条件である。

用語「（標的配列）に対して特異的」は、プローブ又はプライマーがストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で標的配列を含むサンプル中で該標的配列にしかハイブリダイズしないことを意味する。

本明細書で使用する用語「増幅したＤＮＡ」若しくは「アンプリコン」は、核酸鋳型の一部である標的核酸配列の核酸増幅の産物を意味する。例えば、性的交配の結果として生じるコーン植物が本発明のコーン植物由来のトランスジェニック事象ゲノムＤＮＡを含有するかどうかを決定するために、コーン植物組織サンプルから抽出されたＤＮＡは、該事象ＤＮＡの存在に対して診断的であるアンプリコンを生成するために、挿入された異種ＤＮＡの挿入部位に隣接する植物のゲノム内のフランキング配列に由来するプライマー、及び挿入された異種ＤＮＡに由来する第２プライマーを含む１つのプライマー対を使用する核酸増幅法に供することができる。アンプリコンは、ある長さを有し、本事象に対して診断的である配列を有する。アンプリコンは、プライマー対＋１ヌクレオチド塩基対の結合長及び／又はプライマー対＋約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、または５００、７５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００又はそれ以上のヌクレオチド塩基対（±上記に列挙した増分のいずれか）の結合長の長さの範囲内であってよい。或いは、プライマー対は、全挿入ヌクレオチド配列を含むアンプリコンを生成できるように挿入されたＤＮＡの両方の部位上のフランキング配列から引き出すことができる。本植物ゲノム配列から引き出されたプライマー対のメンバーは、挿入されたＤＮＡ配列から間隔をあけて位置してよい。この間隔は、１ヌクレオチド塩基対から約２０，０００ヌクレオチド塩基対の範囲に及んでよい。用語「アンプリコン」の使用は、詳細にはＤＮＡ熱増幅反応において形成できるプライマー二量体を除外する。

核酸増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む、当分野において公知の様々な核酸増幅法によって遂行できる。様々な増幅法は当分野において公知であり、特に、米国特許第４，６８３，１９５号及び同第４，６８３，２０２号に記載されている。ＰＣＲ増幅法は、ゲノムＤＮＡを２２ｋｂまで増幅させるために開発されている。ＤＮＡ増幅の分野において公知のこれらの方法並びに他の方法は、本発明の実施において使用できる。本コーン事象由来の異種導入遺伝子ＤＮＡインサート若しくはフランキングゲノム配列は、本明細書に提供した配列に由来するプライマーを使用して本事象からそのような配列を増幅させ、その後にＰＣＲアンプリコン若しくはクローニングされたＤＮＡの標準ＤＮＡシーケンシングを行うことで確証する（及び必要であれば修正する）ことができる。

これらの方法によって生成されたアンプリコンは、複数の技法によって検出することができる。アガロースゲル電気泳動法及びエチジウムブロミド染色は、ＤＮＡアンプリコンを検出する一般的に周知の方法である。又別のそのような方法は、隣接フランキングゲノムＤＮＡ配列及び挿入されたＤＮＡ配列の両方に重複するＤＮＡオリゴヌクレオチドが設計されるＧｅｎｅｔｉｃ Ｂｉｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ法である。オリゴヌクレオチドは、マイクロウエルプレートのウエル内で固定化される。関心領域のＰＣＲ（挿入された配列内の１つのプライマー及び隣接フランキングゲノム配列内の１つのプライマーを使用する）後、一本鎖ＰＣＲ産物は固定化されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができ、ＤＮＡポリメラーゼ及び予想される次の塩基に対して特異的な標識されたｄｄＮＴＰを使用する一塩基伸長反応のための鋳型として機能することができる。読出しは、蛍光又はＥＬＩＳＡに基づいてよい。シグナルは、上首尾の増幅、ハイブリダイゼーション、及び一塩基伸長に起因する挿入／フランキング配列の存在を指示する。

本明細書で参照又は言及する全特許、特許出願、仮出願、及び刊行物は、それらが本明細書の明示的教示と矛盾しない程度まで全体として参照により組み込まれる。

他に指示されない限り、以下の略語を使用する。
ＡＡＤ−１ アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ−１
ｂｐ 塩基対
℃ 摂氏温度
ＤＮＡ デオキシリボ核酸
ＤＩＧ ジゴキシゲニン
ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸
ｋｂ キロベース
μｇ マイクログラム
μＬ マイクロリットル
ｍＬ ミリリットル
Ｍ モル質量
ＯＬＰ 重複プローブ
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＴＵ 植物転写単位
ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＯＰ 標準操作手順書
ＳＳＣ 塩化ナトリウム及びクエン酸ナトリウムの混合液を含有するバッファー溶液（ｐＨ７．０）
ＴＢＥ Ｔｒｉｓ塩基、ホウ酸及びＥＤＴＡの混合液を含有するバッファー溶液（ｐＨ８．３）
Ｖ ボルト

実施例１．事象特異的Ｔａｑｍａｎアッセイ
事象特異的Ｔａｑｍａｎアッセイは、トウモロコシ事象ＤＡＳ−４０２７８−９の存在を検出するため、及び育種集団における植物の接合生殖性状態を決定するために開発した。事象特異的アッセイを開発するために、特異的Ｔａｑｍａｎプライマー及びプローブは、５’挿入−植物接合部に位置するＤＮＡ配列に従って設計した。ＤＡＳ−４０２７８−９の特異的検出のために、この５’−統合接合部に渡る７３ｂｐのＤＮＡフラグメントは、２つの特異的プライマーを使用して増幅させた。このＰＣＲ産物の増幅は、その５’末端でＦＡＭレポーターを含有するＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社によって合成された標的特異的ＭＧＢプローブによって測定した。ＡＡＤ−１コーン事象ＤＡＳ−４０２７８−９に対するこのＴａｑｍａｎ検出法の特異性は、１６種の相違するＡＡＤ−１コーン事象及び非トランスジェニックコーン品種に対してコーン特異的内因性参照遺伝子であるインベルターゼを用いた二重フォーマットにおいて試験した。

実施例１．１．ｇＤＮＡの単離
この試験では１６種の相違するＡＡＤ−１コーン事象及び非トランスジェニックコーン品種のｇＤＮＡサンプルについて試験した。ｇＤＮＡは、２つのアプローチ、Ｑｉａｇｅｎキット又はＣＴＡＢを用いて抽出した。Ｑｉａｇｅｎキットを用いて抽出したｇＤＮＡサンプルに対しては、修正Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ ９６植物キットプロトコールに従ってｇＤＮＡ抽出のために８枚のコーン新鮮葉片を使用した。ＣＴＡＢ手順を使用することによって抽出したｇＤＮＡサンプルに対しては、約０．３ｇの凍結乾燥葉組織をＰｅｒｍｉｎｇｅａｔ ｅｔ ａｌ．， １９９８からのプロトコールに従って使用した。ｇＤＮＡは、販売業者の取扱説明書（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、オレゴン州ユージーン）に従ってＰｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ法を用いて定量した。ｇＤＮＡサンプルは、この試験のためにＤＮａｓｅ無含有水で希釈して１０ｎｇ／μＬの濃度を生じさせた。

実施例１．２．Ｔａｑｍａｎアッセイ及び結果
特異的Ｔａｑｍａｎプライマー及びプローブは、ＤＡＳ−４０２７８−９事象特異的Ｔａｑｍａｎアッセイのために設計した。これらの試薬は、ＡＡＤ−１コーン事象ＤＡＳ−４０２７８−９を検出するために下記に列挙した条件を用いて使用できる。表１は、事象ＤＡＳ−４０２７８−９を検出するために特異的に開発されたプライマー及びプローブ配列を列挙している。

増幅についての多重ＰＣＲ条件は、以下の通りである：総反応液２５μＬ中で１×ＰＣＲバッファー、０．５〜２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．２μＭプライマー Ｃｏｒｎ−２７８−Ｆ、０．２μＭプライマー Ｃｏｒｎ−２７８−Ｒ、０．２μＭプライマー＿ＩＶ−Ｆ、０．２μＭプライマー＿ＩＶ−Ｒ、０．０８μＭプローブ＿Ｃｏｒｎ−２７８−プローブ、０．０８μＭプローブ＿ＩＶ−プローブ、４０Ｕ／ｍＬ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｔａｑ、０．６〜２．４μｇ／ｍＬ ＤＮＡ。様々な濃度のＭｇＣｌ_２及びＤＮＡを試験した。０．５ｍＭ、１．０ｍＭ、１．８ｍＭ、及び２．５ｍＭの濃度のＭｇＣｌ_２を使用した。カクテルは、以下の条件を使用して増幅させた：ｉ）１５分間に渡り９５℃、ｉｉ）２０秒間に渡り９５℃、ｉｉｉ）６０秒間に渡り６０℃、ｉｖ）５０サイクルに渡り工程ｉｉ〜ｉｉｉを繰り返す、ｖ）４℃を保持する。リアルタイムＰＣＲは、Ｂｉｏ−ｒａｄ ｉＣｙｃｌｅｒ（商標）システム上で実施した。データ分析は、蛍光測定値が設定値に到達した時点のＰＣＲサイクル数であるサイクル閾値（ＣＴ）の測定に基づいていた。ＣＴ値は、ｉＣｙｃｌｅｒソフトウエアによって自動的に計算した。

上記のプライマーを使用して生成したアンプリコン配列は、以下の通りであった：
２７８Ｆ及び２７８Ｒ：
ｔｔａｃａａｔｃａａｃａｇｃａｃｃｇｔａｃｃｔｔｇａａｇｃｇｇａａｔａｃａａｔｇａａｇｇｔｔａｇｃｔａｃｇａｔｔｔａｃａｇｃａａａｇｃｃａｇａａｔ
（配列番号８）
ＩＶＦ及びＩＶＲ：
ｔｇｇｃｇｇａｃｇａｃｇａｃｔｔｇｔｃｃｇａｇｃａｇａｃｃｇｃｃｇｔｇｔａｃｔｔｃｔａｃｃｔｇｃｔｃａａｇｇｇｃａｃｇｇａｃｇｇｃａｇｃｃｔｃｃａａａｃｔｔｔ
（配列番号９）

ＡＡＤ−１コーン事象ＤＡＳ−４０２７８−９に対するこのＴａｑｍａｎ検出法は、１６種の相違するＡＡＤ−１コーン事象及び非トランスジェニックコーン品種に対して参照遺伝子としてのコーン特異的内因性インベルターゼを用いた二重フォーマットにおいて試験した。このアッセイはＡＡＤ−１コーン事象ＤＡＳ−４０２７８−９を特異的に検出し、コントロールからは偽陽性結果（即ち、１６種の相違するＡＡＤ−１コーン事象及び非トランスジェニックコーン品種）を生成も増幅もさせなかった。事象特異的プライマー及びプローブは、ＡＡＤ−１コーン事象ＤＡＳ−４０２７８−９を検出するために使用することができ、これらの条件及び試薬は接合生殖性アッセイのために適用できる。

Claims (20)

1. ＡＡＤ−１コーン事象ＤＡＳ−４０２７８−９を含むコーン植物の接合生殖性を決定するための方法であって、前記事象はＡＡＤ−１遺伝子を含む導入遺伝子構築物を含み、前記導入遺伝子構築物は５’フランキングコーンゲノムＤＮＡ及び３’フランキングコーンゲノムＤＮＡに隣接しており、前記方法は、
   前記コーン植物からゲノムＤＮＡのＤＮＡサンプルを得る工程と、
   前記ＤＮＡサンプルを
   ａ．第１事象プライマー及び第２事象プライマーであって、前記第１事象プライマーは前記導入遺伝子構築物へ特異的に結合し、前記第２事象プライマーは前記５’コーンゲノムフランキングＤＮＡ若しくは前記３’コーンゲノムフランキングＤＮＡに特異的に結合し、そして前記第１事象プライマー及び前記第２事象プライマーはＴＡＱＭＡＮＰＣＲ条件に供されると事象アンプリコンを生成する第１事象プライマー及び第２事象プライマーと、
   ｂ．ＴＡＱＭＡＮ ＰＣＲ条件に供されると内因性コーン参照遺伝子から参照アンプリコンを生成する参照フォーワードプライマー及び参照リバースプライマーと、
   ｃ．前記事象アンプリコンとハイブリダイズする蛍光事象プローブと、
   ｄ．前記事象アンプリコンとハイブリダイズする蛍光参照プローブと接触させることにより接触したサンプルを生成する工程と、
   前記接触したサンプルを蛍光に基づくエンドポイントＴＡＱＭＡＮＰＣＲ条件に供する工程と、
   前記事象アンプリコンとハイブリダイズした前記蛍光事象プローブを定量する工程と、
   前記参照アンプリコンとハイブリダイズした前記蛍光参照プローブを定量する工程と、
   ハイブリダイズした蛍光事象プローブとハイブリダイズした蛍光参照プローブとの量を比較する工程と、
   ハイブリダイズした蛍光事象プローブとハイブリダイズした蛍光参照プローブの蛍光比率を比較することによってＤＡＳ−４０２７８−９の接合生殖性を決定する工程とを含み、
   前記５’フランキングコーンゲノムＤＮＡは配列番号１の残基１〜１８７３を含み、前記３’フランキングコーンゲノムＤＮＡは配列番号１の残基６６９０〜８５５７を含み、
   前記導入遺伝子構築物は、配列番号１の残基１８７４〜６６８９からなり、
   前記アンプリコンは、５０〜１００残基からなる、
   方法。
2. 前記参照遺伝子は、内因性トウモロコシ（Zea mays）インベルターゼ遺伝子である、請求項１に記載の方法。
3. 前記第２事象プライマーは、配列番号１の残基１６７３〜１８７３又はそれらの相補体に結合する、請求項１に記載の方法。
4. 前記第２事象プライマーは、配列番号１の残基６６９０〜６８９０に結合する、請求項１に記載の方法。
5. 前記方法は、前記事象の又別のコーン系内への育種遺伝子移入のために使用される、請求項１に記載の方法。
6. 前記又別のコーン系には前記事象が欠如する、請求項５に記載の方法。
7. 前記事象アンプリコンは、７３塩基対である、請求項１に記載の方法。
8. 前記参照遺伝子は、配列番号５、配列番号６、及び配列番号７からなる群から選択される配列を含む、又はそれにハイブリダイズする、請求項１に記載の方法。
9. 前記参照プライマーは配列番号５及び配列番号６を含み、前記参照プローブは配列番号７を含む、請求項１に記載の方法。
10. 前記プローブは、蛍光色素及びクエンチャーを用いて標識される、請求項１に記載の方法。
11. 前記事象プローブは、前記事象プローブの５’末端で前記蛍光色素としてのＦＡＭ及び前記事象プローブの３’末端でＭＧＢクエンチャーを含む、請求項１０に記載の方法。
12. 前記参照アンプリコンは、前記プライマーによって増幅させた７９塩基対フラグメントである、請求項１に記載の方法。
13. 前記参照プローブは、前記参照プローブの５’末端でＨＥＸ、及び前記参照プローブの３’末端でＢｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ２（ＢＨＱ２）を用いて標識される、請求項１０に記載の方法。
14. 前記事象アンプリコンは配列番号８からなり、前記参照アンプリコンは配列番号９からなる、請求項１に記載の方法。
15. 前記事象プローブは、配列番号４を含む、請求項１に記載の方法。
16. 前記事象プライマーは、配列番号２及び配列番号３からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
17. 前記方法の結果は、プレートリーダーで直接的に読み取られる、請求項１に記載の方法。
18. 前記ＤＮＡサンプルは、農場内のコーン植物から得られる、請求項１に記載の方法。
19. 請求項１に記載の方法を実施するためのキットであって、前記キットは、前記第１事象プライマー、前記第２事象プライマー、前記参照フォーワードプライマー、前記参照リバースプライマー、前記事象プローブ、及び前記参照プローブを含むキット。
20. 前記事象プライマーは、配列番号２及び配列番号３からなり、前記参照プライマーは配列番号５及び配列番号６からなり、前記事象プローブは配列番号４からなり、及び前記参照プローブは配列番号７からなる、請求項１９に記載のキット。