CN103827132B - 大豆事件pDAB9582.814.19.1检测方法 - Google Patents

大豆事件pDAB9582.814.19.1检测方法 Download PDF

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Abstract

大豆事件pDAB9582.814.19.1包含编码Cry1F、Cry1Ac(synpro)和PAT的基因，为含有该事件的大豆作物提供昆虫抗性和除草剂耐受性，并使得能实现用于作物保护和储存产物保护的方法。本发明提供PCR事件检测方法。

Description

大豆事件pDAB9582.814.19.1检测方法
对相关申请的交叉引用
本申请要求2011年7月26日提交的临时申请No.61/511,658的优先权，其通过全文提述并入本文。
发明背景
编码Cry1F和Cry1Ac synpro(Cry1Ac)的基因能够向转基因植物赋予昆虫抗性，例如对鳞翅类昆虫的抗性；而编码PAT(膦丝菌素乙酰转移酶)的基因能够向转基因植物赋予对除草剂膦丝菌素(草铵膦(glufosinate))的耐受性。已在大豆中成功表达PAT用作产生昆虫抗性转基因作物中的选择性标志物，以及向转基因作物赋予对除草剂草铵膦的商业水平的耐受性。
已知外来基因在植物中的表达受到其在植物基因组中位置的影响，可能是由于整合位点附近的染色质结构(例如异染色质)或转录调控元件(例如增强子)的接近度(Weising等,Ann.Rev.Genet22:421-477,1988)。同时，转基因在基因组中不同位置处的存在会以不同方式影响植物的总体表型。为此，经常需要筛选大量事件以鉴定出一个事件，其特征为导入的感兴趣基因的最佳表达。例如，已在植物和其他生物中观察到在事件中导入基因的表达水平可能有很大变化。还可能在表达的空间或时间模式中有差异，例如转基因在多种植物组织中的相对表达差异，其可能不对应于从存在于导入的基因构建体的转录调控元件所预期的模式。为此，普遍产生数百到数千种不同事件，并从那些事件中筛选出具有期望的转基因表达水平和模式的单一事件以用于商业目的。具有期望的转基因表达水平或模式的事件可用于通过使用常规育种方法的有性异型杂交将该转基因基因渗入到其他遗传背景中。这类杂交的后代维持原始转化体的转基因表达特征。该策略用于确保在良好适应于当地生长条件的许多品种中有可靠的基因表达。
期望能检测特定事件的存在以确定有性杂交的后代是否含有感兴趣的转基因或转基因组。另外，用于检测特定事件的方法将有助于遵循要求例如源自重组作物植物的食物的上市前批准和标记的监管，或用于环境监测，监测田野中作物的性状，或监测源自作物收获的产品，以及用于确保监管或合约条款(regulatory or contractual term)下的多方的依从性。
可以通过本领域中已知的任何核酸检测方法来检测转基因事件的存在，所述方法包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)或使用核酸探针的DNA杂交。这些检测方法一般着眼于频繁使用的遗传元件如启动子、终止子、标志基因等，因为对许多DNA构建体而言，编码区是可交换的。因此，这类方法对于在不同事件之间，特别是使用相同DNA构建体或非常相似的构建体产生的事件之间区分可能无用，除非临近于插入的异源DNA的侧翼DNA的DNA序列是已知的。例如，一种事件特异性的PCR测定法记载于美国专利申请2006/0070139，其针对玉米事件DAS-59122-7。期望存在简单和有识别力的方法用于鉴定大豆事件pDAB9582.814.19.1。
发明概述
本发明涉及一种用于检测新的昆虫抗性和除草剂耐受性的转基因大豆转化事件，称为大豆事件pDAB9582.814.19.1的方法。作为本公开的一部分，包含大豆事件9582.814.19.1的大豆品系的至少2500个种子保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard，Manassas，VA，20110。该保藏物，ATCC专利保藏名PTA-12006，在2011年7月21日由ATCC接受。该保藏依照并遵循布达佩斯条约关于用于专利程序的种子保藏的条款进行并维持。
含有该事件的大豆植物的DNA包含本文中描述的接合(junction)/侧翼序列，其表征插入的DNA在大豆基因组中的位置。SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2对大豆事件pDAB9582.814.19.1具诊断性。更具体地，SEQ ID NO:1的bp1400/1401和bp1536/1537处以及SEQ ID NO:2的bp152/153处的接合周围的序列对大豆事件pDAB9582.814.19.1具诊断性。下文段[0009]描述了包含这些接合的序列的例子，所述接合是含有大豆事件pDAB9582.814.19.1的大豆DNA特征性的。
本发明提供一种在包含大豆DNA的样品中检测大豆事件pDAB9582.814.19.1的方法，所述方法包括：
(a)使所述样品与长度至少10bp的第一引物和长度至少10bp的第二引物接触，所述第一引物选择性结合SEQ ID NO:1的bp1-1400以内的侧翼序列或其互补物，所述第二引物选择性结合SEQ ID NO:1的bp1401-1836以内的插入序列或其互补物；和
(b)测定在所述引物之间生成的扩增子；或
使所述样品与长度至少10bp的第一引物和长度至少10bp的第二引物接触，所述第一引物选择性结合SEQ ID NO:2的bp1-152以内的插入序列或其互补物，所述第二引物选择性结合SEQ ID NO:2的bp153-1550以内的侧翼序列或其互补物；和
(c)测定在所述引物之间生成的扩增子。
在另一个实施方案中，本发明提供一种对大豆事件pDAB9582.814.19.1具诊断性的分离的DNA分子。除了SEQ ID NO:1和2以外，这类分子还包括，长度至少25bp的分子，其包含SEQ ID NO:1的bp1400-1401和从bp1400/1401接合处起每个方向至少10bp的SEQ ID NO:1；长度至少25bp的扩增子，其包含SEQ ID NO:2的152-153和从bp152/153接合处起每个方向至少10bp的SEQID NO:2。例子是SEQ ID NO:1的bp1385-1415；SEQ ID NO:1的bp1350-1450；SEQ ID NO:1的bp1300-1500；SEQ ID NO:1的bp1200-1600；SEQ ID NO:2的bp137-168；SEQ ID NO:2的bp103-203；和SEQ ID NO:2的bp3-303，及其互补物。
另外，本主题发明提供用于检测样品(例如大豆的)中主题事件的存在的测定法。所述测定法可基于插入大豆基因组的重组构建体的DNA序列和在插入位点侧翼的基因组序列。还提供可用于进行该测定法的试剂盒和条件。
本主题发明部分涉及对转基因大豆系中来自pDAB9582的T-DNA的插入所产生的边界区的DNA序列的克隆和分析。这些序列是独特的。基于插入和接合序列，可生成且已生成了事件特异性引物。PCR分析显示可通过对用这些事件特异性引物组生成的PCR扩增子的分析来鉴定这些事件。如此，这些和其他相关规程可用于独特地鉴定出包含本主题发明的事件的大豆系。
序列说明
SEQ ID NO:1是大豆事件9582.814.19.1的5’DNA侧翼边界序列。核苷酸1-1400是基因组序列。核苷酸1401-1535是来自pDAB9582的重排序列。核苷酸1536-1836是插入序列。
SEQ ID NO:2是大豆事件9582.814.19.1的3’DNA侧翼边界序列。核苷酸1-152是插入序列。核苷酸153-1550是基因组序列。
SEQ ID NO:3是pDAB9582的DNA序列，其注释在下表1中。
SEQ ID NO:4是用于确认5'边界基因组DNA的寡核苷酸引物81419_FW3。
SEQ ID NO:5是用于确认3'边界基因组DNA的寡核苷酸引物81419_RV1。
SEQ ID NO:6是用于确认3'边界基因组DNA的寡核苷酸引物81419_RV2。
SEQ ID NO:7是用于确认3'边界基因组DNA的寡核苷酸引物81419_RV3。
SEQ ID NO:8是用于确认5'边界基因组DNA的寡核苷酸引物5’IREnd-01。
SEQ ID NO:9是用于确认5'边界基因组DNA的寡核苷酸引物5’IREnd-02。
SEQ ID NO:10是用于确认5'边界基因组DNA的寡核苷酸引物AtUbi10RV1。
SEQ ID NO:11是用于确认5'边界基因组DNA的寡核苷酸引物AtUbi10RV2。
SEQ ID NO:12是用于确认3'边界基因组DNA的寡核苷酸引物3’PATEnd05。
SEQ ID NO:13是用于确认3'边界基因组DNA的寡核苷酸引物3’PATEnd06。
SEQ ID NO:14是确认的大豆事件9582.814.19.1的序列。包含5’基因组侧翼序列、pDAB9582T链插入和3’基因组侧翼序列。
SEQ ID NO:15是寡核苷酸引物81419_3’F，其用于TAQMAN测定以检测大豆事件9582.814.19.1的3’边界。
SEQ ID NO:16是寡核苷酸引物81419_3’R，其用于TAQMAN测定以检测大豆事件9582.814.19.1的3’边界。
SEQ ID NO:17是寡核苷酸探针81419_3’P，其用于TAQMAN测定以检测大豆事件9582.814.19.1的3’边界。该探针具有添加到5’端的FAM荧光模块和添加到3’端的MGB猝灭剂。
SEQ ID NO:18是寡核苷酸引物GMS116F，其用于TAQMAN测定以检测内源性参照基因GMFL01-25-J19(GenBank：AK286292.1)。
SEQ ID NO:19是寡核苷酸引物GMS116R，其用于TAQMAN测定以检测内源性参照基因GMFL01-25-J19(GenBank：AK286292.1)。
SEQ ID NO:20是寡核苷酸探针GMS116，其用于TAQMAN测定以检测内源性参照基因GMFL01-25-J19(GenBank：AK286292.1)。该探针具有添加到5’端的HEX荧光模块和添加到3’端的BHQ猝灭剂。
附图简述
图1是含有cry1F、cry1Ac和pat表达盒的pDAB9582的质粒图谱。
图2绘出了用于确认大豆事件pDAB9582.814.19.1的5’和3’边界序列的引物位置。
图3绘出了大豆事件pDAB9582.814.19.1中的基因组序列排列。
图4绘出了用于大豆事件pDAB9582.814.19.1的TAQMAN测定的引物和探针位置。
发明详述
已测序并表征了事件大豆事件9582.814.19.1插入的两端。开发了事件特异性测定法。还已将其映射到大豆基因组的染色体02上。可将该事件基因渗入到进一步的精选品系中。
如在上文背景部分暗指的，转基因导入和整合到植物基因组中牵涉一些随机事件(因此，名称“事件”指表达的某给定插入)。即，对于许多转化技术如土壤杆菌(Agrobacterium)转化、生物射弹(biolistic)转化(即基因枪)和碳化硅介导的转化(即WHISKERS)，不能预测到转基因将插入到基因组何处。如此，鉴定插入两侧的侧翼植物基因组DNA对于鉴定具有给定插入事件的植物可能是重要的。例如，PCR引物可设计为生成跨越插入与宿主基因组的接合区的PCR扩增子。此PCR扩增子可用于鉴定独特或不同类型的插入事件。
本文中提供了定义和例子来帮助描述本发明并指导本领域普通技术人员实践本发明。除非另外记载，术语应依照相关领域中普通技术人员的常规使用理解。使用如在37CFR§1.822列出的DNA碱基的命名法。
如本文中使用的，术语“后代”指包含大豆事件pDAB9582.814.19.1的亲本植物的任何世代的后代。
转基因“事件”是通过以下产生：用异源DNA，即含有感兴趣的转基因的核酸构建体转化植物细胞，将由所述转基因插入植物基因组所得的植物群体再生，并选择由插入特定基因组位置所表征的特定植物。术语“事件”指含有所述异源DNA的起始转化体和转化体后代。术语“事件”还指通过转化体和含有基因组/转基因DNA的另一品种之间的有性异型杂交产生的后代。即使在与回归(recurrent)亲本的反复回交之后，来自经转化亲本的插入的转基因DNA和侧翼基因组DNA(基因组/转基因DNA)仍存在于杂交后代的相同染色体位置处。术语“事件”还指来自包含插入的DNA和直接邻接插入的DNA的侧翼基因组序列的起始转化体及其后代的DNA，会预期其作为一个含有所述插入DNA的亲本系(例如起始转化体和其自交所得的后代)和不含有该插入DNA的亲本系有性杂交的结果转移至接受了含有感兴趣的转基因的插入DNA的后代中。
“接合序列”或“边界序列”跨越了插入基因组的DNA与来自插入点侧翼的大豆天然基因组的DNA连接的点，对植物遗传物质中一处或另一处接合序列的鉴定或检测足以对所述事件具诊断性。包括了跨越本文中所述的大豆事件中的插入和类似长度的侧翼DNA的DNA序列。本文中提供了此类诊断性序列的具体例子；然而，其他与插入的结合处、或插入和基因组序列的结合处重叠的序列也具诊断性，且可依照本主题发明使用。
本主题发明部分涉及使用此类侧翼、结合处和插入序列进行的事件鉴定。本发明包括相关的PCR引物和扩增子。根据本主题发明，使用跨越插入的DNA及其边界的扩增子的PCR分析方法可用于检测或鉴定商业化的转基因大豆品种或来源于本主题专有的转基因大豆品系的品系。
所述侧翼/接合序列对于大豆事件pDAB9582.814.19.1具诊断性。基于这些序列，生成了事件特异性引物。PCR分析显示可在不同大豆基因型中通过分析用这些事件特异性引物组生成的PCR扩增子鉴定这些大豆品系。如此，这些和其他相关规程可用于独特地鉴定这些大豆品系。本文中鉴定的序列是独特的。
本主题发明的检测技术尤其可与植物育种一同使用，以确定在将包含感兴趣事件的亲本植物与另一种植物品系杂交来赋予后代一种或多种另外的感兴趣性状之后，哪些后代植物包含给定事件。这些PCR分析方法有利于大豆育种项目以及质量控制，特别是对于商业化转基因大豆种子。现在亦可制备并使用用于这些转基因大豆品系的PCR检测试剂盒。这亦可有利于产品登记和产品管理(stewardship)。
此外，可使用侧翼大豆/基因组序列来特异性鉴定每个插入的基因组位置。该信息可用于制作特异于每一个事件的分子标志物系统。这些可用于加速育种策略和构建连锁数据。
仍进一步，可使用侧翼序列信息来研究和表征转基因整合过程，基因组整合位点特征，事件分选，转基因及其侧翼序列的稳定性和基因表达(特别涉及基因沉默、转基因甲基化样式、位置效应、和潜在的表达相关元件如MARS(基质附接区)等)。
根据所有主题公开内容，应清楚本主题发明包括在段落[0005]中鉴定的ATCC保藏号下可获得的种子。本主题发明还包括从在段落[0005]中鉴定的ATCC保藏号下保藏的种子培育的除草剂耐受性大豆植物。本主题发明进一步包括所述植物的部分，如叶、组织样品、由所述植物产生的种子、花粉等(其中包含cry1F、cry1Ac、pat和SEQ ID NO:1和2)。
如本文中使用的，术语“大豆”意指大豆(Glycine max)，并包括其所有可与大豆植物交配的品种。
本发明的DNA分子可作为分子标志物用于标志物协助育种(MAB)方法。本发明的DNA分子可用于鉴定遗传连锁的农艺学上可用的性状的方法(如AFLP标志物、RFLP标志物、RAPD标志物、SNP和SSR)，如本领域已知的。可使用MAB方法在与本主题发明的大豆植物(或其后代和任何其他大豆栽培种或品种)的杂交的后代中追踪昆虫抗性和除草剂耐受性性状。所述DNA分子为该性状的标志物，且本领域中公知的MAB方法可用于追踪大豆植物中的除草剂抗性性状，其中至少一种本主题发明的大豆品系或其后代为所述大豆植物的亲本或祖先。本发明的方法可用于鉴定具有本主题事件的任何大豆品种。
如本文中使用的，“品系”为一组对于至少一种性状在个体间显示很少或没有遗传差异的植物。此类品系可通过几个世代的自花授粉和选择，或从单个亲本使用组织或细胞培养技术进行的营养繁殖来构建。
如本文中使用的，术语“栽培种”和“品种”是同义词，并指用于商业生产的品系。
“稳定性”或“稳定的”意指对于给定组分，该组分在世代间且优选至少三个世代内保持。
“商业实用性”定义为具有良好的植物活力(vigor)和高可育性，使得该作物可由农民使用常规耕作设备来产生，且可使用常规压榨和提取设备从种子提取具有所述组分的油。
“农艺学上精选的”意指品系除了由于本主题事件所致的昆虫抗性和除草剂耐受性之外，还具有期望的农艺学特征如产率、成熟度、疾病抗性等。这些农艺学特征和数据点中的任何和全部可作为一系列用于鉴定这类植物的特征中的一个点或者作为其任一端或两端来鉴定这类植物，。
如本领域技术人员根据本公开可知，检测试剂盒的优选实施方案，例如，可含有针对和/或包含“接合序列”或“过渡序列”(在此大豆基因组侧翼序列连接插入序列)的引物和/或探针。举例而言，这包括设计用于鉴定一个或两个接合处序列(在此插入连接侧翼序列)的多核苷酸探针、引物和/或扩增子，如上表所示。一种常见设计是具有在侧翼区中杂交的一种引物和在插入中杂交的一种引物。此类引物通常每个的长度为约至少～15个残基。有了这种配置，所述引物可用于生成/扩增指示本主题发明的事件存在的可检测的扩增子。这些引物可用于生成跨越(并含有)如上所指示的接合处序列的扩增子。
在侧翼序列中“降落(touch down)”的引物通常不设计为超越距结合处多于约1200个碱基左右而杂交。因此，通常的侧翼引物应设计为包含从插入起始位置进入侧翼序列1200个碱基以内任一链的至少15个残基。即，包含来自(或杂交于)SEQ ID No:14的碱基对800至1400和/或SEQ ID No:14的碱基对13,897至14,497的合适大小的序列的引物落在本主题发明的范围内。同样，插入引物可设计为在插入上任何位置，但例如可将SEQ ID NO:14的碱基对1400至2000和/或SEQ ID No:14的碱基对13,297至13,896非排他性地用于此种引物设计。
本领域技术人员亦会认可可将引物和探针设计为在一定范围的标准杂交和/或PCR条件下杂交，其中所述引物或探针并不完美地与所例示的序列互补。即，可容忍一定程度的错配。对于大约20个核苷酸的引物，例如，若错配的碱基在引物的内部或与扩增子相反的引物末端，通常一个或两个左右的核苷酸并不需要与相反链结合。下面提供了多种适当的杂交条件。合成的核苷酸类似物，如次黄嘌呤核苷，亦可用于探针。亦可使用肽核酸(PNA)探针，以及DNA和RNA探针。重要的是此类探针和引物对于本主题发明的事件的存在是诊断性的(能够独一无二地鉴定和区分)。
应指出PCR扩增中可发生错误，其可例如导致微小的测序错误。即，除非另行指明，本文中列出的序列是通过从大豆基因组DNA生成长扩增子，然后克隆所述扩增子并对其测序而确定的。考虑到为了测序而从基因组DNA生成充足扩增子所需的多轮扩增，在以此方式生成和确定的序列中发现稍微不同和微小差异并非是不寻常的。本领域技术人员应认可并留意由于这些类型的常见测序错误或差异所需的任何调整落在本主题发明的范围内。
亦应指出一些基因组序列的缺失并非罕见，例如，当在构建事件过程中插入序列时。因此，例如可在本主题的侧翼序列和GENBANK中列出的基因组序列之间出现一些差异。
DNA序列“插入”的组分图示于附图，并在下文实施例中更加详细地讨论。这些组分的DNA多核苷酸序列或其片段，可在本发明的方法中用作DNA引物或探针。
在本发明的一些实施方案中，提供了在来自大豆植物的植物和种子等中用于检测转基因/基因组插入区的存在的组合物和方法。提供了包含本文中提供的本主题5’转基因/基因组插入区接合序列的DNA序列(SEQ ID NO:14的碱基对800-1400之间)、其区段、及例示序列的互补物及其任何区段。提供了包含本文中提供的本主题3’转基因/基因组插入区接合序列的DNA序列(SEQID NO:14的碱基对13,897-14,497之间)、其区段、及例示序列的互补物及其任何区段。该插入区接合序列跨越插入基因组的异源DNA和来自插入位点侧翼的大豆细胞的DNA之间的接合。此类序列对于给定事件是诊断性的。
基于这些插入和边界序列，可生成事件特异性引物。PCR分析阐明可通过分析用这些事件特异性引物组生成的PCR扩增子来在不同大豆基因组中鉴定本主题发明的大豆品系。这些和其他相关的规程可用于独特地鉴定这些大豆品系。如此，源自此类引物对的PCR扩增子是独特的，且可用于鉴定这些大豆品系。
在一些实施方案中，本发明的一个方面是包含新转基因/基因组插入区的连续片段的DNA序列。包括了下述DNA序列，其包含充足长度的转基因插入序列的多核苷酸和充足长度的来自三种前述大豆植物中的一种或多种的大豆基因组序列的多核苷酸和/或可用作引物序列以供产生对于一种或多种这些大豆植物特征性的扩增子产物的序列。
相关的实施方案涉及包含本文中鉴定的DNA序列的转基因部分(如SEQID No:1及其片段)至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸或其互补物，和来自这些序列的类似长度的侧翼大豆DNA序列或其互补物的DNA序列。此类序列可作为DNA引物用于DNA扩增方法。使用这些引物产生的扩增子对于本文中提及的任意大豆事件具有诊断性。因此，本发明还包括通过此类DNA引物和同源引物产生的扩增子。
本发明还包括在样品中检测对应于本文中提及的大豆事件的DNA存在的方法。此类方法可包括：(a)使包含DNA的样品与引物组相接触，所述引物组当与来自这些大豆事件至少之一的DNA用于核酸扩增反应时，产生对于所述事件具诊断性的扩增子；(b)进行核酸扩增反应，由此产生所述扩增子；和(c)检测所述扩增子。
本主题发明的进一步的检测方法包括在样品中检测对应于所述事件的DNA的存在的方法，其中所述方法包括：(a)将包含DNA的样品与在严格杂交条件下与来自至少一种所述大豆事件的DNA杂交，而不在严格杂交条件下与对照大豆植物(无感兴趣的事件的DNA)杂交的探针相接触；(b)对所述样品和探针施以严格杂交条件；和(c)检测所述探针对所述DNA的杂交。
可使用本文中公开的组合物和DNA检测领域公知的方法开发DNA检测试剂盒。所述试剂盒可用于在样品中鉴定本主题大豆事件DNA，并可应用于供培育含有该DNA的大豆植物的方法。所述试剂盒含有与所述扩增子同源或互补的DNA序列，所述扩增子例如本文中公开的扩增子，或含有与本主题事件的转基因遗传元件中所含DNA同源或互补的DNA序列。这些DNA序列可用于DNA扩增反应，或作为DNA杂交方法中的探针。所述试剂盒亦可含有进行检测方法所需的试剂和材料。
“探针”是附有常规的可检测标记或报道分子(如放射性同位素、配体，化学发光剂或酶)的分离的核酸分子。此种探针与靶核酸的链互补，且在本发明的情况下，与来自所述大豆事件之一的基因组DNA的链互补，无论其来自大豆植物或来自含有来自所述事件的DNA的样品。依照本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，且还包括聚酰胺和其他特异性结合于靶DNA序列并可用于检测所述靶DNA序列存在的探针物质。
“引物”为分离的/合成的核酸，其通过核酸杂交与互补靶DNA链退火以形成引物和靶DNA链之间的杂合体，然后由聚合酶例如DNA聚合酶沿所述靶DNA链延伸。本发明的引物对涉及其用于扩增靶核酸序列(例如通过聚合酶式反应(PCR))或其他常规核酸扩增方法的用途。
探针和引物的长度一般为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500个多核苷酸或更长。此类探针和引物在高严格杂交条件下与靶序列特异性杂交。优选地，依照本发明的探针和引物与靶序列具有完全的序列类似性，尽管可通过常规方法设计与靶序列不同并保留与靶序列杂交能力的探针。
用于制备和使用探针和引物的方法描述于例如Molecular Cloning:ALaboratory Manual,2nd ed.,vol.1-3,ed.Sambrook等,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989。PCR引物对可从已知序列，例如通过使用意图用于该目的的计算机程序来衍生。
基于本文中公开的侧翼DNA和插入序列的引物和探针可用于确认(且视需要，校正)通过常规方法，例如通过重新克隆和对此类序列测序而披露的序列。
本发明的核酸探针和引物在严格条件下与靶DNA序列杂交。可使用任何常规的核酸杂交或扩增方法来鉴定样品中来自转基因事件的DNA的存在。核酸分子或其片段能够在某些情况下特异性杂交于其他核酸分子。如本文中使用的，若两个核酸分子能够形成反平行双链核酸结构，则称这两个分子能够彼此特异性杂交。若两个核酸分子呈现完全互补性，则称一个核酸分子为另一个核酸分子的“互补物”。如本文中使用的，当一个分子的每一个核苷酸互补于另一个分子的核苷酸时，称这些分子呈现“完全互补性”。若两个分子可以以足够的稳定性相互杂交以允许其在至少常规的“低严格”条件下维持彼此粘合(anneal)，则称其为“最低限度互补的(minimally complementary)”。类似地，若两个分子可以以足够的稳定性相互杂交以允许其在常规的“高严格”条件下维持彼此粘合，则称其为“互补的”。常规的严格条件描述于Sambrook等,1989。因此，可允许与完全互补性偏离，只要这类偏离并不完全排除分子形成双链结构的能力。为了使核酸分子充当引物或探针，仅需其序列充分互补以能够在采用的特定溶剂和盐浓度下形成稳定的双链结构。
如本文中使用的，基本上同源的序列是会在高严格条件下与其进行比较的核酸序列的互补物特异性杂交的核酸序列。术语“严格条件”是对于核酸探针对靶核酸(即对感兴趣的特定核酸序列)通过Sambrook等,1989在9.52-9.55处讨论的特异性杂交规程的杂交进行的功能限定。还可参见Sambrook等1989，在9.47-9.52和9.56-9.58处。因此，本发明的核苷酸序列可就其与DNA片段的互补延伸选择性形成双链体分子的能力而使用。
取决于考虑到的应用，可使用多种杂交条件以获得探针对靶序列的不同程度的选择性。对于需要高选择性的应用，通常可采用相对严格的条件来形成杂合体，例如，会选择相对低的盐和/或高温度条件，如由约0.02M至约0.15M NaCl在约50℃至约70℃的温度提供的条件。例如，严格条件可涉及用高严格性洗涤缓冲液(0.2X SSC，0.1%SDS，65℃)洗涤杂交滤纸至少两次。促进DNA杂交的适当严格条件，例如在约45℃的6.0X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，接着在50℃用2.0X SSC洗涤，是本领域技术人员已知的。举例而言，洗涤步骤中的盐浓度可选自在约2.0X SSC于50℃的低严格度至约0.2X SSC于50℃的高严格度。此外，洗涤步骤中的温度可从室温约22℃的低严格条件增加至约65℃的高严格条件。温度和盐均可变化，或可将温度或盐浓度之一维持恒定的同时改变另一个变量。此类选择性条件容忍极小(若有的话)的探针与模板或靶链之间的错配。通过杂交检测DNA序列是本领域技术人员公知的，且美国专利No.4,965,188和5,176,995的教导例示杂交分析方法。
在一个特别优选的实施方案中，本发明的核酸会在高严格条件下特异性杂交于本文中例示或提出的一种或多种引物(或扩增子或其他序列)，包括其互补物和片段。在本发明的一个方面，本发明的标志物核酸分子具有本文例示性序列之一中列出的核酸序列，或其互补物和/或片段。
在本发明的另一个方面，本发明的标志物核酸分子与此类核酸序列分享80%至100%或90%至100%的序列同一性。在本发明的进一步的方面，本发明的标志物核酸分子与此种序列分享95%至100%的序列同一性。此类序列可用作植物育种方法中的标志物以鉴定遗传杂交的后代。探针对靶DNA分子的杂交可通过本领域技术人员已知的任何数目的方法来检测，这些可包括但不限于荧光标签、放射性标签、基于抗体的标签和化学发光标签。
对于使用特定扩增引物对进行的靶核酸序列的扩增(例如，通过PCR)，“严格条件”为允许引物对仅杂交于靶核酸序列的条件，所述靶核酸序列会被具有对应的野生型序列(或其互补物)的引物结合，并且优选允许产生独特的扩增产物即扩增子。
术语“特异于(靶序列)/对(靶序列)特异性的”表明探针或引物在严格杂交条件下仅与包含所述靶序列的样品中的靶序列杂交。
如本文中使用的，“扩增的DNA”或“扩增子”指作为核酸模板一部分的靶核酸序列的核酸扩增产物。举例而言，为了确定从有性杂交获得的大豆植物是否含有来自本发明的大豆植物的转基因事件基因组DNA，可对从大豆植物组织提取的DNA进行使用引物对的核酸扩增方法以产生对于所述事件DNA的存在为诊断性的扩增子，所述引物对包括来源于所述植物基因组中邻近插入的异源DNA插入位点的侧翼序列的引物，和来源于插入的异源DNA的第二引物。所述扩增子的长度和具有的序列使其亦对该事件具诊断性。所述扩增子的长度的范围可为引物对的合并长度加上一个核苷酸碱基对，和/或引物对的合并长度加上约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500、750、1000、1250、1500、1750、2000或更多个核苷酸碱基对(加上或减去任何上述列出的增量)。或者，引物对可来源于插入的DNA两侧的侧翼序列从而产生包含整个插入核苷酸序列的扩增子。来源于植物基因组序列的引物对的成员可位于距插入的DNA序列一定距离处。该距离的范围可从一个核苷酸碱基对至长达约两万个核苷酸碱基对。术语“扩增子”的使用特别排除了可能在DNA热扩增反应中形成的引物二聚体。
核酸扩增可通过本领域中已知的多种核酸扩增方法中的任一种，包括聚合酶链式反应(PCR)来实现。多种扩增方法在本领域是已知的，并描述于美国专利No.4,683,195和美国专利No.4,683,202等。已开发了PCR扩增方法以扩增长达22kb的基因组DNA。这些方法，以及本领域已知的其他DNA扩增的方法可用于本发明的实践。可通过使用来源于本文中提供的序列的引物从事件扩增此类序列，接着对PCR扩增子或克隆的DNA进行标准DNA测序来验证(视需要，可校正)来自主题玉米事件的异源转基因DNA插入的序列或侧翼基因组序列。
可通过多种技术检测由这些方法产生的扩增子。琼脂糖凝胶电泳和用溴化乙锭染色是检测DNA扩增子的常见公知方法。另一种此类方法是GeneticBit Analysis，其中设计了与邻接的侧翼基因组DNA序列和插入的DNA序列两者重叠的DNA寡核苷酸。将所述寡核苷酸固定于微孔板的孔中。在感兴趣区域的PCR(使用一个在插入序列中的引物和一个在邻接侧翼基因组序列中的引物)之后，可将单链PCR产物与固定化的寡核苷酸杂交，并充当模板用于单碱基延伸反应，所述反应使用DNA聚合酶和对预期的下一个碱基具有特异性的经标记ddNTP进行。读出可为荧光性的或基于ELISA的。信号指示由于成功的扩增、杂交和单碱基延伸所致的插入/侧翼序列的存在。
另一种方法是如Winge(Innov.Pharma.Tech.00:18-24,2000)所述的Pyrosequencing技术。在该方法中，设计了与邻近基因组DNA和插入DNA接合处重叠的寡核苷酸。将所述寡核苷酸杂交于来自感兴趣区域的单链PCR产物(一个引物在插入序列中，而一个在侧翼基因组序列中)，并在DNA聚合酶、ATP、硫酰酶(sulfurylase)、萤光素酶、腺苷三磷酸双磷酸酶(apyrase)、腺苷5’磷硫酸(adenosine5'phosphosulfate)和萤光素的存在下温育。单独添加DNTP，且掺入产生供测量的光信号。光信号表明由于成功的扩增、杂交和单碱基或多碱基延伸而导致的转基因插入/侧翼序列的存在。
荧光偏振是另一种可用于检测本发明的扩增子的方法。遵循该方法，设计了与基因组侧翼和插入的DNA接合处重叠的寡核苷酸。将寡核苷酸杂交于来自感兴趣的区的单链PCR产物(一个引物在插入的DNA中，一个在侧翼基因组DNA序列中)，并在DNA聚合酶和荧光标记的ddNTP的存在下温育。单碱基延伸导致ddNTP的掺入。掺入可使用荧光计作为偏振改变来测量。偏振中的改变表明由于成功的扩增、杂交和单碱基延伸所致的转基因插入/侧翼序列的存在。
TAQMAN(PE Applied Biosystems,Foster City,Calif.)是检测和量化DNA序列的存在的方法。简言之，设计了与基因组侧翼和插入DNA接合处重叠的FRET寡核苷酸探针。在热稳定性聚合酶和dNTP存在下循环FRET探针和PCR引物(一个引物在插入DNA序列中，一个在侧翼基因组序列中)。在特异性扩增期间，Taq DNA聚合酶将FRET探针上的荧光模块从淬灭模块清除并释放。荧光信号表明由于成功的扩增和杂交所致的侧翼/转基因插入序列的存在。
已描述了分子信标(Molecular Beacon)用于序列检测。简言之，设计了与侧翼基因组和插入DNA接合处重叠的FRET寡核苷酸探针。FRET探针的独特结构导致其含有保持荧光和淬灭模块彼此接近的二级结构。在热稳定性聚合酶和dNTP的存在下循环FRET探针和PCR引物(一个引物在插入DNA序列中，一个在侧翼基因组序列中)。在成功的PCR扩增之后，FRET探针对靶序列的杂交导致探针二级结构的去除和荧光和淬灭模块的空间上的分离。其结果为荧光信号。荧光信号表明由于成功的扩增和杂交所致的侧翼基因组/转基因插入序列的存在。
已经公开了对于插入适合的大豆基因组中的位置，本主题发明还包括在该基因组位置大致附近包含至少一个非大豆事件9582.814.19.1插入的大豆种子和/或大豆植物。一种选项是在本文中例示的大豆事件9582.814.19.1插入处用不同的插入取代。在此一般性考虑下，可根据本主题发明使用例如靶向同源重组。该类型的技术是例如WO03/080809A2及相应的公开的美国申请(US20030232410)的主题。因此，本主题发明包括包含异源插入(替换cry1F、cry1Ac或pat基因的或与其多拷贝一起)的植物和植物细胞，所述异源插入侧翼为本文中鉴定的侧翼序列的全部或可识别部分(SEQ ID NO:1的bp1-1400和SEQ ID NO:2的bp153-1550)。也可靶向cry1F、cry1Ac或pat的额外拷贝来以此方式进行插入。
本文中提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和公开以其不与本说明书的明确教导不一致的程度通过全文提述并入本文。
包括了下述实施例以说明供实践本发明的规程，和阐明本发明的某些优选实施方案。这些实施例不应视为限制性的。本领域技术人员应理解下述实施例中公开的技术代表用于说明供其实践的优选模式的具体方法。然而，本领域技术人员根据本公开，应理解可在这些具体实施方案中进行许多变化，而仍旧获得相似或类似的结果，而不背离本发明的精神和范围。除非另行指明，所有百分比按重量百分比，而除非另行指明，所有溶剂混合物比例按体积。
除非另行指明，使用下述缩写：
bp   碱基对
℃   摄氏度
DNA  脱氧核糖核酸
EDTA 乙二胺四乙酸
kb   千碱基
μg  微克
μL  微升
mL   毫升
M    摩尔质量
PCR  聚合酶链式反应
PTU  植物转录单元
SDS  十二烷基硫酸钠
SSC  含有氯化钠和柠檬酸钠的混合物，pH7.0的缓冲溶液
TBE  含有Tris碱、硼酸和EDTA的混合物，pH8.3的缓冲溶液
进一步在以下实施例中限定本发明的实施方案。应理解这些实施例仅出于例示而给出。从上文论述和这些实施例，本领域技术人员能确定本发明的基本特征，而且能在不背离其精神和范围的情况下，对本发明进行各种改变和修改以使其适应于各种使用和条件。如此，除了本文中所显示和描述的那些以外，本发明实施方案的各种修改对于本领域技术人员而言从前述描述将是明显的。这类修改还意图落入所附权利要求的范围内。
本文中列出的每份参考文献的公开内容通过全文提述并入本文。
实施例
实施例1：Cry1F和Cry1Ac大豆事件pDAB9582.814.19.1的转化和选择
经由土壤杆菌介导的对大豆子叶节(cotyledonary node)外植体的转化生成含有大豆事件pDAB9582.814.19.1的转基因大豆(Glycine max)。将去攻击的(disarmed)土壤杆菌菌株EHA101(Hood等,1993)用于启动转化，该菌株携带含有选择性标志物pat v6和在T链DNA区内的感兴趣基因cry1F v3和cry1Ac的二元载体pDAB9582(图1)。pDAB9582的DNA序列在SEQ ID NO:3中给出，其在下表1中注释。
表1.位于pDAB9582上的基因元件.
使用修改过的Zeng等(2004)的规程实施土壤杆菌介导的转化。简言之，使大豆种子(cv Maverick)在基础培养基上发芽，分离子叶节并用土壤杆菌感染。用头孢噻肟(cefotaxime)、特美汀(timentin)和万古霉素(vancomycin)补充芽引发、芽伸长和生根培养基以除去土壤杆菌。采用草铵膦选择来抑制未转化的芽的生长。将选定的芽转移到生根培养基中用于根形成，然后转移到土壤混合物中用于使小植株适应环境。
将选定的小植株的末端小叶用草铵膦涂叶来筛选推定的转化体。将筛选后的小植株转移到温室中，允许适应环境并用草铵膦涂叶以再次确认耐受且视为推定的转化体。对筛选后的植物取样并进行分子分析来确认选择性标志物基因和/或感兴趣基因。允许T0植物在温室中自花受精以产生T1种子。
从独立的转化后分离物生成该事件，大豆事件pDAB9582.814.19.1。将T1植物回交并在后续世代中基因渗入到精选品种中。基于其独特的特征如单插入位点、正常的孟德尔分离、稳定的表达和优越的功效组合(包括除草剂耐受性和农学表现)来选择该事件。以下例子含有用于表征大豆事件pDAB9582.814.19.1的数据。
实施例2：大豆事件pDAB9582.814.19.1中蛋白质表达的表征
对大豆事件9582.814.19.1中表达的重组Cry1F、Cry1Ac和PAT蛋白的生化特性进行表征。定量酶联免疫吸附测定法(ELISA)是一种本领域中已知的生化测定法，其可用于表征大豆事件9582.814.19.1中蛋白质的生化特性和确认这些蛋白质的表达。
实施例2.1：植物组织中PAT、Cry1F和Cry1Ac蛋白的表达
从测试植物分离大豆组织的样品并准备用于表达分析。从大豆植物组织用磷酸盐缓冲盐水溶液提取PAT蛋白，所述溶液含有去污剂Tween-20(PBST)和0.5%牛血清清蛋白(BSA)。将植物组织离心；收集水性上清液，如需要的用适宜的缓冲液稀释，并使用三明治形式的PAT ELISA试剂盒分析。依照制造商建议的方案(Envirologix,Portland,ME)使用该试剂盒。该测定法测量表达的PAT蛋白。
从大豆植物组织用含有去污剂Tween-20(PBST)的磷酸盐缓冲盐水溶液提取Cry1F蛋白。将植物组织离心；收集水性上清液，如需要用适宜的缓冲液稀释，并使用三明治形式的Cry1F ELISA试剂盒分析。依照制造商建议的方案(Strategic Diagnostics Inc.,Newark,DE)使用该试剂盒。该测定法测量表达的Cry1F蛋白。
从大豆植物组织用磷酸盐缓冲盐水溶液提取PAT蛋白，所述溶液含有去污剂Tween-20(PBST)和0.5%牛血清清蛋白(BSA)。将植物组织离心；收集水性上清液，如需要的用适宜的缓冲液稀释，并使用三明治形式的Cry1AcELISA试剂盒分析。依照制造商建议的方案(Strategic Diagnostics Inc.,Newark,DE)使用该试剂盒。该测定法测量表达的Cry1Ac蛋白。
实施检测分析来纵向(世代之间)和横向(在一代内的世系之间)研究大豆事件pDAB9582.814.19.1中的表达稳定性和可遗传性。
实施例2.2：植物组织中Cry1F、Cry1Ac和Pat蛋白的表达
确定大豆事件9582.814.19.1中Cry1F、Cry1Ac和PAT蛋白的水平。使用定量酶联免疫吸附测定(ELISA)方法，从大豆叶组织测量可溶的可提取蛋白。从T2至T6代大豆事件9582.814.19.1，表达在所有世系中稳定(未分离)且一致。表2列出了大豆事件9582.814.19.1中转基因蛋白质的均值表达水平。
表2.大豆事件pDAB9582.814.19.1中不同转基因蛋白质的均值表达水平。
实施例3：大豆事件pDAB9582.814.19.1的插入和侧翼边界区中DNA序列的克 隆和表征
为了表征和描述基因组插入位点，确定大豆事件pDAB9582.814.19.1侧翼基因组T-DNA边界区的序列。确认了大豆事件pDAB9582.814.19.1的基因组序列，其包含1400bp的5’侧翼边界序列(SEQ ID NO:1)和1398bp的3’侧翼边界序列(SEQ ID NO:2)。基于大豆事件pDAB9582.814.19.1边界序列的PCR扩增验证了边界区具有大豆起源而且接合区是大豆事件pDAB9582.814.19.1的独特序列。所述接合区可用于大豆事件pDAB9582.814.19.1的事件特异性鉴定。另外，T链插入位点通过从未经转化大豆的基因组扩增对应于鉴定的侧翼边界序列区域的基因组片段来表征。大豆事件pDAB9582.814.19.1与未经转化基因组序列的比较揭示在T链整合期间产生的距初始基因座约57bp的缺失。总之，对大豆事件pDAB9582.814.19.1插入和边界序列的表征指示在大豆基因组中存在来自pDAB9582的完整T链拷贝。
表3.在确认大豆事件pDAB9582.814.19.1的大豆基因组DNA中使用的引物及其序列的列表
表4.用于大豆事件pDAB9582.814.19.1中边界区和事件特异性序列的标准PCR扩增的条件.
表5.用于大豆事件pDAB9582.814.19.1中边界区和事件特异性序列的标准PCR扩增的PCR混合物
实施例3.1：确认大豆基因组序列
与染色体02的大豆全基因组鸟枪序列比对的5’和3’侧翼边界指示大豆事件pDAB9582.814.19.1的转基因插入到大豆基因组染色体02中。为了从大豆基因组确认大豆事件pDAB9582.814.19.1的插入位点，用不同引物对实施PCR(图2、表3、表4和表5)。使用来自大豆事件pDAB9582.814.19.1和其他转基因或非转基因大豆品系的基因组DNA作为模板。为了确认5’边界序列正确，将设计为结合At Ubi10启动子基因元件的引物(例如AtUbi10RV1)，和设计为结合大豆基因组染色体02上克隆的5’端边界的引物(引物称为81419_FW3)用于扩增跨越At Ubi10启动子基因元件到5’端边界序列的DNA区段。类似地，为了确认克隆的3’边界序列，将pat特异性引物例如3’PATEnd05，和依照克隆的3’端边界序列设计的3种引物(称为81419_RV1、81419_RV2和81419_RV3)用于扩增跨越pat基因到3’边界序列的DNA区段。仅从大豆事件pDAB9582.814.19.1的基因组DNA用每种引物对扩增出具有预期大小的DNA区段，而未从来自其他转基因大豆品系或非转基因对照的DNA样品扩增出。该结果指示克隆的5’和3’边界序列是大豆事件pDAB9582.814.19.1T链插入的侧翼边界序列。
为了进一步确认大豆基因组中的DNA插入，在不含大豆事件pDAB9582.814.19.1T链插入的基因组DNA上完成跨越大豆边界序列的PCR扩增。引物81419_FW3(依照5’端边界序列设计)和一种引物81419-RV3(依照3’端边界序列设计)用于扩增DNA区段，其含有其中整合pDAB9582T链的基因座。如预期的，用引物对81419_FW3和81419_RV3完成的PCR扩增从所有其他大豆对照品系但非pDAB9582.814.19.1产生约1.5kb DNA片段。将大豆事件pDAB9582.814.19.1的鉴定的5’和3’边界序列与染色体02的大豆全基因组鸟枪序列比对揭示了从起始基因座的约57bp缺失(图3)。这些结果证明大豆事件pDAB8294的转基因插入到大豆基因组染色体02的位点中。
实施例4：经由Southern印迹表征大豆事件pDAB9582.814.19.1
使用Southern印迹分析来建立大豆事件pDAB9582.814.19.1的整合模式。这些实验生成数据，其显示大豆基因组中cry1Ac和cry1F转基因的整合和完整性。大豆事件pDAB9582.814.19.1被表征为全长、简单的整合事件，其含有来自质粒pDAB9582的单拷贝的cry1Ac和cry1F PTU。
Southern印迹数据表明T链片段插入到大豆事件pDAB9582.814.19.1的基因组中。进行具体的Southern印迹分析，所述分析使用特异于pDAB9582.814.19.1的T链整合区中含有的cry1Ac和cry1F基因的探针，以及描述性限制性酶，其具有位于质粒内的切割位点并产生质粒内部的杂交片段或跨越质粒与大豆基因组DNA接合处的片段(边界片段)。从限制性酶和探针的组合Southern杂交所指示的分子量对于该事件是独特的，且建立了其鉴定模式。这些分析还显示质粒片段已插入大豆基因组DNA中且没有cry1Ac和cry1F PTU的重排。
实施例4.1：大豆叶样品收集和基因组DNA(gDNA)分离
基因组DNA从收获自含有大豆事件pDAB9582.814.19.1的各大豆植物的叶组织提取。另外，从常规大豆植物Maverick分离gDNA，其含有该物质品系代表性的遗传背景，不存在cry1Ac和cry1F基因。遵循标准CTAB方法从冻干的叶组织提取个别的基因组DNA(Sambrook等(1989))。提取后，使用PICOGREEN试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)对DNA荧光分光定量。然后使DNA在琼脂糖凝胶上显影以确认来自PICO GREEN分析的值并确定DNA品质。
实施例4.2：DNA消化和分离
对于大豆事件pDAB9582.814.19.1的Southern印迹分子学表征，消化10微克(10μg)的基因组DNA。将来自大豆pDAB9582.814.19.1和非转基因大豆品系Maverick的基因组DNA通过向每份DNA样品添加5单位选定的限制性酶每μg DNA和相应的反应缓冲液来消化。将每份样品在约37℃过夜温育。对于单一消化分别使用限制酶AseI、HindIII、NsiI和NdeI(New England Biolabs,Ipswich,MA)。对于双重消化一起使用限制性酶NotI和ApaLI(New EnglandBiolabs,Ipswich,MA)。另外，通过将质粒DNA，pDAB9582与来自非转基因大豆品种Maverick的基因组DNA组合来制备阳性杂交对照样品。质粒DNA/基因组DNA混合物使用与测试样品相同的规程和限制性酶进行消化。
在将消化液过夜温育后，添加25μL QUICK-PRECIP PLUS SOLUTION(Edge Biosystems,Gaithersburg,MD)并用异丙醇将消化的DNA样品沉淀。将沉淀的DNA团粒重悬于15μL的1X加载缓冲液(0.01%溴酚蓝、10.0mMEDTA、10.0%甘油、1.0mM Tris pH7.5)中。然后，将DNA样品和分子量标记经由0.85%琼脂糖凝胶电泳，其于35伏使用0.4X TAE缓冲液(FisherScientific,Pittsburgh,PA)达约18-22小时以实现片段分离。将凝胶用溴化乙锭(Invitrogen,Carlsbad,CA)染色并在紫外(UV)灯下使DNA显影。
实施例4.3：Southern转移和膜处理
基本如Memelink,等(1994)所述的实施Southern印迹分析。简言之，在电泳分离和DNA片段显影之后，将凝胶用0.25M HCl进行脱嘌呤约20分钟，然后暴露于变性溶液(0.4M NaOH，1.5M NaC1)达约30分钟，接着暴露于中性溶液(1.5M NaCl，0.5M Tris pH7.5)达至少30分钟。使用毛细作用(wicking)系统和10X SSC过夜实施Southern转移至尼龙膜上。转移后，通过UV交联使DNA结合至膜，接着用2X SSC溶液简短地洗涤膜。该过程产生准备好用于杂交的Southern印迹膜。
实施例4.4：DNA探针标记和杂交
使用经标记探针检测结合至尼龙膜的DNA片段(表6)。通过将用洋地黄毒苷(DIG)标记的核苷酸[DIG-11]-dUTP基于PCR掺入到从质粒pDAB9582使用特异于基因元件的引物扩增的DNA片段中来生成探针。依照制造商推荐的规程使用PCR DIG Probe Synthesis Kit(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)进行通过PCR合成的DNA探针生成。
通过琼脂糖凝胶电泳分析经标记的探针以确定其质量和数量。然后，将期望量的经标记探针用于对尼龙膜上靶DNA的杂交以检测特定片段，这使用基本如DIG EASY HYB SOLUTION(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)所述的规程进行。简言之，将含有固定DNA的尼龙膜印迹用2X SSC简单洗涤并与20-25mL预温的DIG EASY HYB SOLUTION在杂交炉中的杂交瓶中于约45-55℃预杂交约2小时。然后，倒出预杂交溶液并用～15mL预温的DIG EASYHYB SOLUTION替换，后者含有期望量的通过在水浴中煮沸约5分钟变性的特定探针。然后在约45-55℃在杂交炉中过夜进行杂交步骤。
在探针杂交结束时，将含有探针的DIG EASY HYB SOLUTION倒入干净的管中并储存于约-20℃。根据制造商的推荐规程，这些探针可再使用两次。将膜印迹简单漂洗，并在具有低严格性洗涤缓冲液(2X SSC，0.1%SDS)的干净塑料容器中于室温洗涤2次约5分钟，接着用高严格性清洗缓冲液(0.1XSSC,0.1%SDS)在约65℃清洗2次各15分钟。将膜印迹用来自DIG WASHAND BLOCK BUFFER SET(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)的1X马来酸缓冲液简短地洗涤约5分钟。这之后是在1X封闭缓冲液中封闭达2小时，并与抗DIG-AP(碱性磷酸酶)抗体(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)亦在1X封闭缓冲液中最少温育30分钟。在用1X洗涤缓冲液洗涤2-3次后，特定的DNA探针保持结合于膜印迹，并依照制造商推荐使用CDP-STARCHEMILUMINESCENT NUCLEIC ACID DETECTION SYSTEM(RocheDiagnostics,Indianapolis,IN)使得用DIG标记的DNA标准显影。将印迹在一个或多个时间点暴露于化学发光胶片以检测杂交片段并使得分子量标记显影。将胶片用ALL-PRO100PLUS胶片显像剂(Konica Minolta,Osaka,Japan)显像并扫描图像。对每个探针记录检测到的条带的数目和大小。使用在DIG检测后可见的用DIG标记的DNA分子量标记II(DIG MWM II)和DIG标记的DNA分子量标记VII(DIG MWM VII)来确定Southern印迹上的杂交片段大小。
表6.Southern分析中使用的探针的位置和长度
探针名 遗传元件 长度(bp)
Cry1Ac cry1Ac 1720
Cry1F cry1F 1746
specR 大观霉素抗性基因 750
OriRep Ori Rep 852
trfA 复制启动蛋白trfA 1119
实施例4.5：Southern印迹结果
基于cry1Ac和cry1F PTU的已知限制性酶位点，使用特定消化和探针预期和观察到的片段大小在表7给出。从这些消化和杂交鉴定出两种类型的片段：内部片段，其中已知酶位点侧接探针区且完全包含在cry1Ac和cry1F PTU的插入区中，和边界片段，其中已知的酶位点位于探针区一端而第二位点预期在大豆基因组中。边界片段大小随事件变化，因为在大多数情况中，DNA片段整合位点是每种事件独特的。边界片段提供一种将限制性酶相对于整合的DNA定位并评估DNA插入数的手段。在多世代的含事件pDAB9582.814.19.1的大豆上完成的Southern印迹分析产生的数据表明来自质粒pDAB9582的低拷贝的完整cry1Ac和cry1F PTU插入到大豆事件pDAB9582.814.19.1的大豆基因组中。
表7.Southern印迹分析中预测和观察到的杂交片段。1.预期的片段大小基于pDAB9582的质粒图谱。2.观察到的片段大小大致根据这些分析进行考虑并基于用DIG标记的DNA分子量标记II和标志VII片段的指示大小。
限制性酶AseI和NsiI结合并切割质粒pDAB9582中的独特限制位点。随后，选择这些酶来表征大豆事件pDAB9582.814.19.1中的cry1Ac基因插入。预测AseI和NsiI分别消化后>7286bp或>9479bp的边界片段与探针杂交(表7)。当分别使用AseI和NsiI消化时观察到约7400和>10000bp的单一cry1Ac杂交条带。探针对该大小条带的杂交表明在大豆事件pDAB9582.814.19.1的大豆基因组中对于cry1Ac基因的单插入位点的存在。选择限制酶NotI和ApaLI来实施双重消化并释放出含有cry1Ac植物转录单元(PTU；启动子/基因/终止子)的片段(表7)。在NotI和ApaLI双重消化后用探针观察到预测的4550bp片段。用对pDAB9582.814.19.1样品的酶消化继之以探针杂交获得的结果指示来自质粒pDAB9582的完整cry1Ac PTU插入到大豆事件pDAB9582.814.19.1的大豆基因组中。
限制性酶NdeI和NsiI结合并切割质粒pDAB9582中的限制位点。随后，选择这些酶来表征大豆事件pDAB9582.814.19.1中的cry1F基因插入。预测NdeI和NsiI分别消化后>5569bp和>9479的边界片段与探针杂交(表7)。当分别使用NdeI和NsiI消化时观察到～7500bp和>10000bp的单一cry1F杂交条带。探针对该大小条带的杂交表明在大豆事件pDAB9582.814.19.1的大豆基因组中对于cry1F基因的单插入位点的存在。选择限制酶HindIII来释放出含有cry1F植物转录单元(PTU；启动子/基因/终止子)的片段(表7)。在HindIII消化后用探针观察到预测的7732片段。用对pDAB9582.814.19.1样品的酶消化继之以探针杂交获得的结果指示来自质粒pDAB9582的完整cry1F PTU插入到大豆事件pDAB9582.814.19.1的大豆基因组中。
实施例4.6：骨架序列的不存在
还进行Southern印迹分析来验证大豆事件pDAB9582.814.19.1中不存在大观霉素抗性基因(specR)、Ori Rep元件和复制启动蛋白trfA(trf A元件)。当将适宜的阳性(pDAB9582加入Maverick基因组DNA)和阴性(Maverick基因组DNA)对照纳入Southern分析时，预期没有对大观霉素抗性、Ori Rep元件或trfA元件的特异性杂交。在NsiI消化和与specR特异性探针的杂交之后，在阳性对照样品(pDAB9582加入Maverick基因组DNA)中观察到一个15320bp的预期大小的条带。specR探针没有与阴性对照和大豆事件pDAB9582.814.19.1的样品杂交。类似地，在NsiI消化和与trfA探针杂交之后，在阳性对照样品(pDAB9582加maverick)中检测到一个15320bp的预期大小的条带，但不存在于阴性对照和大豆事件pDAB9582.814.19.1的样品中。在NdeI消化和与OriRep特异性探针杂交之后，在阳性对照样品(pDAB9582加入Maverick基因组DNA)中检测到另一个5329bp的预期大小的条带，但不存在于阴性对照和大豆事件pDAB9582.814.19.1的样品中。这些数据指示在大豆事件pDAB9582.814.19.1中不存在大观霉素抗性基因、Ori Rep元件和复制启动蛋白trfA。
实施例5：农学和产率田野试验以及除草剂耐受性
为了测试大豆事件pDAB9582.814.19.1的农学特征和功效，在2010年10月和2011年2月在功效试验中在Santa Isabel，Puerto Rico种植该事件。将初始转化以产生事件pDAB9582.814.19.1的栽培种Maverick种植于每块苗圃(nursery)并包含在实验中作为对照。T3苗圃的种子源自在T2阶段的单一植物选择，而T4苗圃的种子源自在T3阶段的单一植物选择。每世代测试该事件的4个世系。将每个世系种植于4行宽和7.5英尺长的样地中。行间距为30英寸。将样地在光照下种植约2.5周以弥补在Puerto Rico的短日长。将每块苗圃用草铵膦以411g ae/ha的比率喷洒。将对照植物Maverick的一块样地以相同比率用草铵膦喷洒，第二块样地不喷洒并用作该事件的对照比较。
收集关于发芽(emergence)、一般表观、活力、高度、倒伏和成熟度的数据。除草剂耐受性通过肉眼寻找缺绿症、叶坏死和植物死亡来评估(表8)。
对于大豆事件pDAB9582.814.19.1与Maverick的比较，仅使用来自Maverick不喷洒块的数据。对于喷洒与不喷洒处理的比较，将来自用给定处理喷洒的大豆事件pDAB9582.814.19.1块的数据与来自Maverick对照不喷洒块的数据比较。大豆事件pDAB9582.814.19.1显示对草铵膦除草剂应用的耐受性。相反，没有一株Maverick植物对该除草剂处理耐受。
表8.大豆事件pDAB9582.814.19.1与Maverick的比较。值为来自T3和T4苗圃的平均值。将大豆事件pDAB9582.814.19.1的每个苗圃在V3阶段用比率为411g ae/ha的草铵膦喷洒。
实施例6：对大豆事件9582.814.19.1杀昆虫活性的表征
进行田野和温室评估来表征大豆事件pDAB9582.814.19.1中Cry1Ac和Cry1F对实验室培养的大豆害虫的活性，所述大豆害虫包括黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)(绒毛豆毛虫)、大豆夜蛾(Pseudoplusia includens)(大豆尺蠖)和草地贪夜蛾(Spodoptera fugiperda)(秋粘虫)。将大豆事件pDAB9582.814.19.1与未转化的大豆品种Maverick进行比较以确定由Cry1F和Cry1Ac蛋白提供的植物保护水平。
在约4周龄植物上进行温室试验。将15株植物用于评估大豆事件pDAB9582.814.19.1和Maverick对照。对于测试的每种昆虫物种(黎豆夜蛾、大豆夜蛾和草地贪夜蛾)，从每株植物制备3个叶打孔，一共是45个叶盘/植物/昆虫种。将1.4cm(1.54cm2)的叶打孔置于2%水琼脂上的测试台中，滋生一只新生幼虫并用穿孔的塑料盖密封。在侵袭后4天对死亡率和叶消耗评级。对于温和探查不响应的幼虫视为死亡的。通过肉眼对由昆虫消耗的叶打孔百分数打分来评估叶损害。
田野评估通过从Santa Isabel，Puerto Rico的种子增加苗圃样地收集叶样品并将这些叶送至Indianapolis，IN测试来进行。大豆事件pDAB9582.814.19.1的育苗样地在2011年2月种植，其由排列于4行的约180株植物组成。每行为2.3m长且相隔76.2cm；每株植物在每行中相隔5.1cm。在2011年3月，从10株大豆事件pDAB9582.814.19.1植物和10株‘Maverick’植物切取位于分生组织之下约4个节的一片完全扩展的主干三叶叶(trifoliate leaf)。将叶置于标记的塑料袋中(一片每袋)并密封。将装袋的叶包装并转移到实验室。在实验室中，从每个三叶叶打孔得到1个或2个3.33cm(1.31英寸)直径的叶盘以提供总共16个叶盘。将每个叶盘置于2%琼脂上的测试台中，滋生一只新生草地贪夜蛾幼虫并用穿孔的塑料盖密封。将叶盘保持在受控环境室中达7天，其时对死亡率和叶消耗评级。对于温和探查不响应的幼虫视为死亡的。通过肉眼对由昆虫消耗的叶打孔百分数打分来评估叶损害。
从这些重复实验获得的结果指示对于所有测试的昆虫，大豆事件pDAB9582.814.19.1比Maverick对照植物经受显著更低的损害。如此，大豆事件pDAB9582.814.19.1在此广泛宿主范围中具有杀昆虫活性。
实施例7：大豆事件pDAB9582.814.19.1的序列
SEQ ID NO:14提供大豆事件pDAB9582.814.19.1的序列。该序列含有5'基因组侧翼序列、pDAB9582的T链插入和3'基因组侧翼序列。对于SEQ IDNO:14，残基1-1400是5'基因组侧翼序列，残基1401-1536是来自pDAB9582质粒的重排残基而1537-13896是pDAB9582T链插入的残基，残基13897-15294是3'侧翼序列。如此，对于插入5'端的接合处序列或过渡发生于SEQ ID NO:14的残基1400-1401。如此，对于插入3'端的接合处序列或过渡发生于SEQ ID NO:14的残基13896-13897。
应注意来自大豆事件pDAB9582.814.19.1的后代可能具有与SEQ IDNO:14稍微不同的序列。在将大豆事件pDAB9582.814.19.1导入植物细胞基因组的基因渗入和育种过程期间，发生插入的一些缺失或其他改变并非不常见的。而且，可能发生PCR扩增中的错误，其可能导致微小的序列错误。例如，本文中列出的侧翼序列通过从大豆基因组DNA生成扩增子，然后克隆并对扩增子测序来确定。鉴于从基因组DNA生成足够的扩增子用于测序所需的许多轮扩增，发现以此方式生成和测定的序列中有稍微不同和微小差异并非不寻常的。本领域技术人员应认可并留心，由于这些类型的常见测序错误或差异而需要的任何调整均在本主题发明的范围内。如此，本文中提供的质粒序列的相关区段可能包含一些微小变化。如此，包含与主题插入序列具有一定范围内同一性的多核苷酸的植物在本主题发明的范围内。与SEQ ID NO:14序列具同一性的可以是与本文中例示或描述的序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多核苷酸序列。如此，可鉴定出SEQ ID NO:14与大豆事件pDAB9582.814.19.1后代植物之间的一些不同并且其包含在本发明的范围内。
实施例8：事件特异性的TaqMan测定法
开发出一种事件特异性的TAQMAN测定法来检测大豆事件pDAB9582.814.19.1的存在并确定育种群体中植物的配型(zygosity)状态。大豆事件pDAB9582.814.19.1含有二元载体pDAB9582的T链(图1)。对于大豆事件pDAB9582.814.19.1的特异性检测，依照位于插入植物接合处5’(SEQ IDNO:1)或3’(SEQ ID NO:2)的DNA序列设计特异性TAQMAN引物和探针(图4)。将针对大豆事件pDAB9582.814.19.1的一个事件特异性测定设计为特异性检测跨越3’整合接合处的229bp DNA片段，所述检测使用两种引物和由Applied Biosystems(ABI)合成的靶物特异性MGB探针，该探针在其5’端含有FAM报告物。测试针对大豆事件pDAB9582.814.19.1的该TAQMAN检测方法针对双链体形式的具有大豆特异性的内源参照基因GMFL01-25-J19(大豆cDNA，GenBank：AK286292.1)的对照非转基因大豆品种(Maverick)和7种含有Cry1Ac和Cry1F PTU的不同事件的特异性。
实施例8.1：gDNA分离
在本研究中测试7种不同大豆事件和非转基因大豆品种的gDNA样品。使用改良的QIAGEN MAGATTRACT PLANT DNA KIT(Qiagen,Valencia,CA)来提取基因组DNA。将新鲜的大豆叶盘，8个每份样品，用于gDNA提取。将样品用无DNase的水稀释，产生约10ng/μL的浓度用于本研究目的。
实施例8.2：TaqMan测定和结果
对于大豆事件pDAB9582.814.19.1特异性TAQMAN测定法设计特异性TAQMAN引物和探针。这些试剂可与下文列出的条件一起使用以检测大豆事件pDAB9582.814.19.1内的转基因。表9列出了针对大豆事件pDAB9582.814.19.1的检测专门开发的引物和探针序列。
表9.TAQMAN PCR引物和探针.
用于扩增的多重PCR条件如下：1X Roche PCR缓冲液、0.4μM事件特异性的正向引物、0.4μM事件特异性的反向引物、0.4μM引物GMS116F、0.4μM引物GMS116R、0.2μM事件特异性的探针、0.2μM GMS116探针、0.1%PVP、6-20ng gDNA，总反应液为10μL。该混合物使用以下条件扩增：i)95℃达10分钟，ii)95℃达10秒，iii)60℃达40秒，iv)重复步骤ii-iii达40个循环，v)40℃保持。在ROCHE LIGHTCYCLER480上进行实时PCR。数据分析基于由LIGHTCYCLER480软件确定的交叉点(Cp值)的测量，其为其中荧光中变化速率达到最大值的PCR循环数。
将针对大豆事件pDAB9582.814.19.1的TAQMAN检测方法针对双链体形式的具有大豆特异性的内源参照基因GMFL01-25-J19(GenBank：AK286292.1)的对照非转基因大豆品种和7种含有Cry1Ac和Cry1F PTU的不同事件进行测试。该测定法特异性地检测大豆事件pDAB9582.814.19.1且未从对照(即含有Cry1Ac和Cry1F PTU的事件和非转基因大豆品种)产生或扩增任何假阳性结果。所述事件特异性的引物和探针可用于检测大豆事件pDAB9582.814.19.1，而且这些条件和试剂适用于接合性测定。
在例示和描述了本发明的原理之后，对于本领域技术人员明显的是可在排布和细节上对本发明进行修改而不背离这类原则。我们要求保护所有在所附权利要求的精神和范围内的修改。
本说明书中引用的所有公开内容和公开的专利文档均通过提述以如同指示每份单独的公开内容或专利申请具体且分别地通过提述并入的程度并入本文。

Claims (1)

1.一种在包含大豆DNA的样品中检测大豆事件pDAB9582.814.19.1的方法，所述方法包括：
(a)使所述样品与长度至少10bp的第一引物和长度至少10bp的第二引物接触，所述第一引物选择性结合SEQ ID NO:1的bp1-1400以内的侧翼序列或其互补物，所述第二引物选择性结合SEQ ID NO:1的bp1401-1836以内的插入序列或其互补物；和
测定在所述引物之间生成的扩增子；或
(b)使所述样品与长度至少10bp的第一引物和长度至少10bp的第二引物接触，所述第一引物选择性结合SEQ ID NO:2的bp1-152以内的插入序列或其互补物，所述第二引物选择性结合SEQ ID NO:2的bp153-1550以内的侧翼序列或其互补物；和
测定在所述引物之间生成的扩增子。
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