TWI568851B - 用於檢測大豆品件ｐｄａｂ９５８２.８１４.１９.１的方法 - Google Patents

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Description

用於檢測大豆品件PDAB9582.814.19.1的方法
本發明係有關於一種用於檢測大豆品件PDAB9582.814.19.1的方法。
發明背景
編碼Cry1F和Cry1Ac synpro(Cry1Ac)的基因能夠給予抗蟲性(insect resistance)[例如，對鱗翅目昆蟲(lepidopteran insects)的抗性]給基因轉殖植物；以及編碼PAT[磷絲菌素乙醯轉移酶(phosphinothricin acetyltransferase)]的基因能夠給予對除草劑磷絲菌素(phoshpinothricin)[固殺草(glufosinate)]的耐受性給基因轉殖植物。PAT已成功地被表現在大豆中供使用作為一選擇性標記(selectable marker)在生產抗蟲性基因轉殖作物中，以及在基因轉殖作物中給予對除草劑固殺草的商業位準的耐受性這兩者。
在植物中外來基因的表現被知曉由它們在該植物基因組的位置而被影響，也許起因於染色質結構(chromatin structure)[例如，異染色質(heterochromatin)]或者轉錄調節要素(transcriptional regulation elements)[例如，增強子(enhancers)]的附近鄰近整合位址(Weising et al.,Ann.Rev.genet 22：421-477,1988)。在相同時間下，轉殖基因(transgene)在基因組的不同位置的存在將以不同的方式影響植物的所有表現型(phenotype)。由於這個原因，為了鑑定一由最佳化表現一被導入的感興趣的基因而被特徵化的 品件，通常需要篩選許多品件。例如，在植物和其他生物中已被觀察到：在品件中有一廣大的變異在一被導入的基因的表現位準上。亦可有差異在表現的空間和時間圖譜上，例如，一轉殖基因在各種不同的植物組織的相關表現的差異可不對應於從存在於被導入的基因建構物中的轉錄調節要素所預期的。由於這個原因，為了商業的目的，產生數百至數千個不同品件並且篩選那些品件用於一具有所欲的轉殖基因表現位準和圖譜的單一品件是常見的。一具有轉殖基因表現的所欲位準或圖譜的品件對於藉由有性雜交使用慣常的育種方法基因移入該轉殖基因至其他基因背景內是有用的。此等雜交的後代維持原始轉形體(transformant)的轉殖基因表現特徵。這個策略被使用以確保可靠的基因表現在許多非常適應於當地生長條件的品種(varieties)中。
為了測定一有性雜交的後代是否含有一轉殖基因或感興趣的轉殖基因的群組，所欲的是能夠偵測一特殊品件的存在。此外，一種用於偵測一特殊品件的方法將是有用的，例如，供遵從要求上市前許可(pre-market approval)以及標定衍生自重組作物植物的食物的規則，或者供使用在環境監測、監測在田野的作物的性狀(traits)或監測衍生自一作物收獲的產物，以及供使用在確保受到管理或契約條例(contractual terms)約束的當事人的承諾。
藉由本技藝所知曉的任何核酸偵測方法[包括，但不限於，聚合酶鏈反應(PCR)或使用核酸探針的DNA雜合] 偵測一基因轉殖品件的存在是可能的。這些偵測方法一般而言聚焦在被頻繁地使用的基因要素[諸如啟動子(promoters)、終止子(terminators)、標記(marker)等等]，因為對於許多DNA建構物，編碼區域是可互換的。因此，此等方法對於在不同的品件(特別地使用相同的DNA建構物或非常相似的建構物所產生的那些)之間區別可能不是有用的，除非鄰接被插入的異源DNA的毗鄰DNA的DNA序列被知曉。例如，一用於玉米品件DAS-59122-7的品件-專一性PCR分析被描述在美國專利申請案2006/0070139。所欲的是具有一種用於鑑定大豆品件pDAB9582.814.19.1的簡單和有區別的方法。
發明概要
本發明是有關於一種用於偵測一新的抗蟲性和除草劑耐受性基因轉殖大豆轉形品件(被命名為大豆品件pDAB9582.814.19.1)的方法。一包含有大豆品件9582.814.19.1的大豆品系的至少2500顆種子作為這個揭示的部分被寄存在美國類型培養物收集中心(ATCC)，10801University Boulevard,Manassas,VA,20110。該寄存物(ATCC專利寄存命名PTA-12006)在西元2011年7月21日由該ATCC所接收。為了專利程序的目的，這個寄存物被做出並且將依照和根據關於種子寄存的布達佩斯條約的條款而被維持。
含有這個品件的大豆植物的DNA包括特徵化在 該大豆基因組內的被插入的DNA的位置的在此所描述的接合(junction)/毗鄰序列(flanking sequences)。序列辨識編號：1和序列辨識編號：2用於診斷大豆品件pDAB9582.814.19.1。更特別地，圍繞該等接合(在序列辨識編號：1的bp 1400/1401和bp 1536/1537，以及序列辨識編號：2的bp 152/153)的序列是用於診斷大豆品件pDAB9582.814.19.1。下面的第[0009]段描述包含有這些接合(它們是含有大豆品件pDAB9582.814.19.1的大豆的DNA的特徵)的序列的實例。
本發明提供一種在一包含有大豆DNA的樣品中偵測大豆品件pDAB9582.814.19.1的方法，該方法包含有：(a)令該樣品與一選擇性地結合至一在序列辨識編號：1的bp 1-1400或它的互補物(complement)內的毗鄰序列的在長度上至少10 bp的第一引子，和一選擇性地結合至一在序列辨識編號：1的bp 1401-1836或它的互補物內的插入序列的在長度上至少10 bp的第二引子接觸；以及(b)分析一在該等引子之間所產生的擴增子；或者令該樣品與一選擇性地結合至一在序列辨識編號：2的bp 1-152或它的互補物內的插入序列的在長度上至少10 bp的第一引子，和一選擇性地結合至在序列辨識編號：2的bp 153-1550或它的互補物內的毗鄰序列的在長度上至少10 bp的第二引子接觸；以及(c)分析一在該等引子之間所產生的擴增子。
在另一個具體例中，本發明提供一種偵測大豆品件 pDAB9582.814.19.1的方法，其包含有：a)令該樣品與一選擇性地結合至一選自於由序列辨識編號：1的bp 1-1400和序列辨識編號：2的bp 153-1550以及它們的互補物所構成的群組的毗鄰序列的第一引子；和一選擇性地結合至序列辨識編號：3或它的互補物的第二引子接觸；b)令該樣品進行聚合酶鏈反應；以及c)分析一在該等引子之間所產生的擴增子。
在另一個具體例中，本發明提供一用於診斷大豆品件pDAB9582.814.19.1的經分離的DNA分子。此等分子除了序列辨識編號：1和2以外，包括含有序列辨識編號：1的bp 1400-1401和序列辨識編號：1的至少10 bp在自bp 1400/1401接合的各個方向的在長度上至少25 bp的分子；含有序列辨識編號：2的152-153和序列辨識編號：2的至少10 bp在自bp 152/153接合的各個方向的在長度上至少25 bp的擴增子。實例是序列辨識編號：1的bp 1385-1415；序列辨識編號：1的bp 1350-1450；序列辨識編號：1的bp 1300-1500；辨識編號：1的bp 1200-1600；序列辨識編號：2的bp 137-168；序列辨識編號：2的bp 103-203；和序列辨識編號：2的bp 3-303，以及它們的互補物。
此外，本發明提供用於偵測在(例如大豆的)一樣品中該標的品件的存在的分析。該分析可根據該被插入至該大豆基因組內的重組建構物的DNA序列，以及毗鄰該插入位址的基因組序列。在實施該等分析有用的套組和條件 亦被提供。
本發明部分地有關於選殖和分析起因於插入來自pDAB9582的T-DNA在基因轉殖大豆品系(transgenic soybean lines)的邊界區域(border regions)的DNA序列。這些序列是獨特的。根據該等插入和接合序列(junction sequences)，品件-專一性引子可以被產生。PCR分析證明：這些品件可藉由分析以這些品件-專一性引子對所產生的PCR擴增子而被鑑定。因此，這些和其他相關的操作程序可被使用以獨特地鑑定包含有本發明的品件的大豆品系。
序列簡單說明
序列辨識編號：1是用於大豆品件9582.814.19.1的5’DNA毗鄰邊界序列。核苷酸1-1400是基因組序列。核苷酸1401-1535是一來自pDAB9582的重排序列。核苷酸1536-1836是插入序列。
序列辨識編號：2是用於大豆品件9582.814.19.1的3’DNA毗鄰邊界序列。核苷酸1-152是插入序列。核苷酸153-1550是基因組序列。
序列辨識編號：3是被註釋在下面表1的pDAB9582的DNA序列。
序列辨識編號：4是用於確認5’邊界基因組DNA的寡核苷酸引子81419_FW3。
序列辨識編號：5是用於確認3’邊界基因組DNA的寡核苷酸引子81419_RV1。
序列辨識編號：6是用於確認3’邊界基因組DNA 的寡核苷酸引子81419_RV2。
序列辨識編號：7是用於確認3’邊界基因組DNA的寡核苷酸引子81419_RV3。
序列辨識編號：8是用於確認5’邊界基因組DNA的寡核苷酸引子5’IREnd-01。
序列辨識編號：9是用於確認5’邊界基因組DNA的寡核苷酸引子5’IREnd-02。
序列辨識編號：10是用於確認5’邊界基因組DNA的寡核苷酸引子AtUbi10RV1。
序列辨識編號：11是用於確認5’邊界基因組DNA的寡核苷酸引子AtUbi10RV2。
序列辨識編號：12是用於確認3’邊界基因組DNA的寡核苷酸引子3’PATEnd05。
序列辨識編號：13是用於確認3’邊界基因組DNA的寡核苷酸引子3’PATEnd06。
序列辨識編號：14是大豆品件9582.814.19.1的經確認的序列。包括5’基因組毗鄰序列、pDAB9582 T-股插入以及3’基因組毗鄰序列。
序列辨識編號：15是被使用於TAQMAN分析以偵測大豆品件9582.814.19.1的3’邊界的寡核苷酸引子81419_3’F。
序列辨識編號：16是被使用於TAQMAN分析以偵測3’邊界大豆品件9582.814.19.1的的寡核苷酸引子81419_3’R。
序列辨識編號：17是被使用於TAQMAN分析以偵測3’邊界大豆品件9582.814.19.1的寡核苷酸探針81419_3’P。這個探針具有一被添加至5’端的FAM螢光部分以及一被添加至3’端的MGB粹滅體(quencher)。
序列辨識編號：18是被使用於TAQMAN分析以偵測內生參考基因GMFL01-25-J19(GenBank：AK286292.1)的寡核苷酸引子GMS116F。
序列辨識編號：19是被使用於TAQMAN分析以偵測內生參考基因GMFL01-25-J19(GenBank：AK286292.1)的寡核苷酸引子GMS116R。
序列辨識編號：20是被使用於TAQMAN分析以偵測內生參考基因GMFL01-25-J19(GenBank：AK286292.1)的寡核苷酸探針GMS116。這個探針具有一被添加至5’端的HEX螢光部分以及一被添加至3’端的BHQ粹滅體。
圖式簡單說明
第1圖是一含有cry1F、cry1Ac和pat表現卡匣的pDAB9582的質體圖譜。
第2圖描繪用於確認大豆品件pDAB9582.814.19.1的5’和3’邊界序列的引子位置。
第3圖描繪在大豆品件pDAB9582.814.19.1的基因組序列排列。
第4圖描繪用於TAQMAN分析大豆品件pDAB9582.814.19.1的引子和探針位置。
較佳實施例之詳細說明
品件大豆品件9582.814.19.1插入的兩端已被定序以及特徵化。品件專一性分析被發展。它亦已被圖譜化在大豆基因組的染色體02上。該品件可被基因移入至進一步的精英品系(elite lines)內。
如上面在背景一節所略微提到的，導入和整合(integration)一轉殖基因至一植物基因組內涉及一些隨機品件(因此名稱“品件”用於一被表現的特定插入)。那是，使用許多轉形技術[諸如農桿菌轉形(Agrobacterium transformation)、生物導彈轉形(biolistic transformation)(亦即基因槍)，以及碳化矽調節的轉形(silicon carbide mediated transformation)(亦即WHISKERS)]，不可預期一轉殖基因將變成插入在基因組的哪裡。因此，鑑定在該插入的兩側上的毗鄰植物基因組DNA可以是重要的對於鑑定一具有一特定插入品件的植物。例如，PCR引子可被設計產生一橫跨該插入和宿主基因組的接合區域的PCR擴增子(amplicon)。這個PCR擴增子可被使用以鑑定一獨特或不同類型的插入品件。
定義和實施例在此被提供以幫助描述本發明以及指導那些熟習此技藝者實施本發明。除非另有註釋，術語要依據由那些熟習相關技藝者的慣常使用而被瞭解。如在37 CFR §1.822所提出的DNA鹼基的命名被使用。
如此處所用的，術語“後代(progeny)”表示一包含有大豆品件pDAB9582.814.19.1的親代植物的任何世代的 子孫。
一基因轉殖“品件”藉由以異源DNA(亦即，一包括一感興趣的轉殖基因的核酸建構物)轉形植物細胞、再產生一起因於插入該轉殖基因至植物的基因組內的植物的族群，以及選擇一藉由插入至一特別的基因組位置內所特徵化的特別植物而被產生。術語“品件”意指包括該異源DNA的原始轉形體和該轉形體的後代。術語“品件”亦意指由一在該轉形體和另一個包括該基因組的/轉殖基因DNA的品種(variety)之間的有性遠系雜交(sexual outcross)所產生的後代。甚至在重複回交(back-crossing)至一輪迴親代(recurrent parent)之後，來自該被轉形的親代的該被插入的轉殖基因DNA和毗鄰基因組DNA(基因組的/轉殖基因DNA)是存在於該雜交的後代在相同的染色體位置。術語“品件”亦意指由於一包括該被插入的DNA[例如，該原始轉形體和起因於自花授粉(selfing)的後代]的親代品系和一不含有該被插入的DNA的親代品系的一有性雜交，來自包含有該被插入的DNA以及立即鄰接該被預期要被轉移至一接受包括該感興趣的轉殖基因的被插入的DNA的後代的被插入的DNA的毗鄰基因組序列之原始轉形體和它的後代的DNA。
一“接合序列”或“邊界序列”橫跨被插入至該基因組內的DNA被連結至來自毗鄰該插入點的大豆天然基因組的DNA的點，鑑定或偵測在一植物的基因材料中的一或其他接合序列是足以診斷該品件。被包括的是該等跨越在此所描述的大豆品件的該等插入以及相似長度的毗鄰DNA 的DNA序列。此等診斷序列的特別實例在此被提供；然而，部分重疊該等插入的接合或者該等插入和該基因組序列的接合的其它序列亦是診斷性的並且可依據本發明被使用。
本發明部分地有關於使用此等毗鄰、接合和插入序列的品件鑑定。相關的PCR引子和擴增子被包括在本發明。依據本發明，使用橫跨過被插入的DNA和它的邊界的擴增子的PCR分析方法可被使用以偵測或鑑定商業化的基因轉殖大豆品種或衍生自該等標的專有的基因轉殖大豆品系的品系。
該等毗鄰/接合序列用於診斷大豆品件pDAB9582.814.19.1。根據這些序列，品件-專一性引子被產生。PCR分析證明：這些大豆品系可藉由分析以這些品件-專一性引子對所產生的PCR擴增子而被鑑定在不同的大豆基因型(genotypes)。因此，這些和其他相關的操作程序可被使用以獨特地鑑定這些大豆品系。在此被鑑定的序列是獨特的。
本發明的偵測技術是特別地有用的在連結植物育種，俾以在一包含有一感興趣的品件的親代植物被雜交以另一種植物品系設法給予一或更多感興趣的額外性狀在後代之後，測定哪些後代植物包含有一特定品件。這些PCR分析方法有益大豆育種程序以及品質控制，特別地用於商業化的基因轉殖大豆種子。用於這些基因轉殖大豆品系的PCR偵測套組現在亦可被製造和使用。這個亦可有益產物登記和產物管理。
再者，毗鄰大豆/基因組序列可被使用以專一性地鑑定各個插入的基因組位置。這個資訊可被使用以使分子標記系統(molecular marker systems)對各個品件專一性。這些可被使用於加速育種策略並且建立連結數據。
又進一步，該毗鄰序列資訊可被使用以研究和特徵化轉殖基因整合過程，基因組整合位址特徵、品件分類、轉殖基因和它們的毗鄰序列的安定性，以及基因表現{特別地有關於基因默化(gene silencing)、轉殖基因甲基化圖譜、位置效用，和可能的表現-相關要素(諸如MARS[基質附著區域(matrix attachment regions)])，以及類似之物}。
按照所有本揭示，應該清楚的是：本發明包括根據在第[0005]段所定義的ATCC寄存編號而可獲得的種子。本發明亦包括從一以在第[0005]段所定義的ATCC寄存編號而被寄存的種子所生長的除草劑-耐受性大豆植物。本發明進一步包括該植物的部分，諸如葉、組織樣品、由該植物所產生的種子、花粉以及類似之物(其中它們包含有cry1F、cry1Ac、pat以及序列辨識編號：1和2)。
如此處所用的，術語“大豆(soybean)”意指大豆(Glycine max)並且包括可與一大豆植物而被育種的它的所有品種。
本發明的DNA分子可被使用作為分子標記在一標記協助的育種(MAB)方法。本發明的DNA分子可在如本技藝所知曉的鑑定一般被連結的農藝學上有用的性狀的方法(諸如，AFLP標記、RFLP標記、RAPD標記、SNP和SSR) 中被使用。該等抗蟲性和除草劑-耐受性性狀可使用該等MAB方法在一與本發明的一大豆植物(或它的後代以及任何其他大豆栽培品種或品種)的雜交的後代中被追蹤。該等DNA分子是用於這個性狀的標記，並且本技藝所熟知的MAB方法可被使用以追蹤在大豆植物中的該除草劑-抗性性狀(們)，其中本發明的至少一大豆品系或它們的後代是一親代或祖先。本發明的方法可被使用以鑑定具有該標的品件的任何大豆品種。
如此處所用的，一“品系(line)”是一對於至少一性狀展示少的或沒有遺傳變異在個體之間的植物族群。此等品系可藉由自花授粉(self-pollination)和選擇或者使用組織或細胞培養技術來自一單一親代的營養繁殖的數個世代所產生。
如此處所用的，術語“栽培品種”和“品種”是同義的並且意指一被使用於商業生產的品系。
“安定性(Stability)”或“安定(stable)”意指關於該特定組份，該組份被世世代代維持，並且較佳地至少3個世代。
商業利用性(commercial utility)”被定義為具有好的植物活力和高生育力，藉此該作物可藉由農夫使用慣常的工作設備而被生產，並且具有所描述的組份的油可使用慣常的壓碎和萃取設備而被萃取自該種子。
“農藝精華(Agronomically elite)”意指一具有除了起因於該標的品件(們)的抗蟲性和除草劑耐受性之外，所 欲的農藝特徵(諸如產量、成熟度、疾病抗性以及類似之物)的品系。任何以及所有這些農藝特徵以及數據點可被使用以鑑定此等植物，如一點或在一範圍的被使用以鑑定此等植物的特徵的任一端或兩端。
如一熟習此技藝者按照這個揭示將確認，偵測套組的較佳具體例，例如，可包括針對和/或包含有“接合序列”或“轉移序列”(其中該大豆基因組毗鄰序列與該插入序列相遇)的探針和/或引子。例如，如在下表所指示的，這個包括被設計以鑑定一或這兩個接合序列(其中該插入與該毗鄰序列相遇)的聚核苷酸探針、引子和/或擴增子。一常見的設計是具有一在該毗鄰區域雜合的引子，以及一在該插入雜合的引子。此等引子各個經常是大約至少~15個殘基在長度上。由於這個安排，該等引子可被使用以產生/擴增一指示本發明的一品件的存在的可偵測的擴增子。這些引子可被使用以產生一橫跨(和包括)一如上面所指示的接合序列的擴增子。
降落”在該毗鄰序列的該引子(們)典型地不被設計以雜合超過大約1200個鹼基或如此超過該接合。因此，典型的毗鄰引子應該被設計以包含有在離該插入的開始的該毗鄰序列的1200個鹼基內的任一股的至少15個殘基。那是，包含有一具有一自(或雜合至)序列辨識編號：14的鹼基對800至1400和/或序列辨識編號：14的鹼基對13,897至14,497的適當大小的序列的引子是在本發明的範疇內。插入引子同樣地可被設計在該插入的任何地方，但是序列 辨識編號：14的鹼基對1400至2000和/或序列辨識編號：14的鹼基對13,297至13,896可被使用，例如，非專有地用於此引子設計。
一熟習此技藝者亦將承認引子和探針可被設計以在一範圍的標準雜合和/或PCR條件下雜合，其中該引子或探針不是完美地互補於該被例示的序列。那是，一些程度的錯配可被容忍。例如，關於一大概20個核苷酸的引子，典型地一或二或如此的核苷酸不需要與相對股結合，若該被錯配的鹼基是內部的或在該擴增子的對面的引子的末端上。各種不同的適當的雜合條件被提供如下。合成的核苷酸類似物[諸如肌苷(inosine)]亦可被使用在探針。胜肽核酸(PNA)探針以及DNA和RNA探針亦可被使用。重要的是此等探針和引子用於診斷(能夠獨特地鑑定和區別)一本發明的品件的存在。
應該被注意的是：在PCR擴增的錯誤可發生，這可導致例如少數的定序錯誤。那是，除非另有指示，在此所列出的序列藉由從大豆基因組DNA產生長的擴增子，並且接著選殖和定序該等擴增子而被測定。發現些微差異和較少的不一致在以這個方式所產生和測定的序列不是罕見的，提供對於從基因組DNA產生足夠的擴增子用於定序必須的許多循環的擴增。一熟習此技藝者應該承認並且放注意在：起因於這些類型的常見定序錯誤或差異所需的任何調節是在本發明的範疇內。
亦應該被注意的是：一些基因組序列要被刪除不 是罕見的，例如，當一序列被插入在產生一品件的期間。因此，一些差異亦可出現在例如該等標的毗鄰序列與被列在GENBANK的基因組序列之間。
該DNA序列“插入”的組份被例示在圖式中並且在下面的實施例中被更詳細的討論。這些組份的DNA聚核苷酸序列或它們的片段可在本發明的方法中被使用作為DNA引子或探針。
在本發明的一些具體例中，組成物和方法被提供用於在來自一大豆植物的植物和種子以及類似之物中偵測該轉殖基因/基因組插入區域的存在。DNA序列被提供包含有在此所提供的該標的5’轉殖基因/基因組插入區域接合序列(在序列辨識編號：14的鹼基對800-1400之間)、它們的節段，以及該等被例示的序列和它們的任何節段的互補物。DNA序列被提供包含有在此所提供的該標的3’轉殖基因/基因組插入區域接合序列(在序列辨識編號：14的鹼基對13,897-14,497之間)、它們的節段，以及該等被例示的序列和它們的任何節段的互補物。該插入區域接合序列橫跨在被插入至該基因組內的異源DNA和毗鄰該插入位址的來自大豆細胞的DNA之間的接合。此等序列可被用於診斷該特定品件。
根據這些插入和邊界序列，品件-專一性引子可被產生。PCR分析證明：本發明的大豆品系可藉由分析以這些品件-專一性引子對所產生的PCR擴增子而在不同的大豆基因型中被鑑定。這些和其他相關的操作程序可被使用 以獨特地鑑定這些大豆品系。因此，衍生自此等引子對的PCR擴增子是獨特的並且可被使用以鑑定這些大豆品系。
在一些具體例中，包含有該新穎的轉殖基因/基因組插入區域的一連接片段的DNA序列是這個發明的一方面。被包括的是包含有轉殖基因插入序列的一足夠長度的聚核苷酸以及來自一或多個的3種上述大豆植物的大豆基因組序列的一足夠長度的聚核苷酸的DNA序列和/或作為用於產生一用於診斷一或多種的這些大豆植物的擴增子產物的引子序列有用的序列。
相關具體例關於包含有一在此所鑑定的DNA序列(諸如序列辨識編號：1和它的節段)或它的互補物的一轉殖基因部分的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多個連接核苷酸的DNA序列，以及來自這些序列或它們的互補物的一相似長度的毗鄰大豆DNA序列。此等序列是有用的在DNA擴增方法中作為DNA引子。使用這些引子所產生的擴增子用於診斷在此所意指的大豆品件的任一者。因此，本發明亦包括藉由此等DNA引子和同源引子所產生的擴增子。
這個發明亦包括偵測在一樣品(對應於在此所意指的大豆品件)中DNA的存在的方法。此等方法可包含有：(a)令該包含有DNA的樣品與一引子對接觸，當該引子對與來自這些大豆品件的至少一者的DNA被使用在一核酸擴增反應時，產生一用於診斷該品件(們)的擴增子；(b)執行一核酸擴增反應，藉此產生該擴增子；以及(c)偵測該擴增子。
本發明的進一步偵測方法包括一種偵測在一樣品(對應於該品件)中一DNA的存在的方法，其中該方法包含有：(a)令該包含有DNA的樣品與一在嚴苛的雜合條件下與來自該等大豆品件的至少一者的DNA雜合並且在嚴苛的雜合條件下不與一對照大豆植物(非感興趣的品件的DNA)雜合的探針接觸；(b)令該樣品和探針進行嚴苛的雜合條件；以及(c)偵測該探針與該DNA的雜合。
DNA偵測套組可使用在此所揭示的組成物和在DNA偵測的技藝中所熟知的方法而被發展。該等套組對於鑑定在一樣品中的該標的大豆品件DNA是有用的，並且可被應用至用於育種含有這個DNA的大豆植物的方法。該等套組含有同源或互補於例如在此所揭示的該等擴增子的DNA序列，或者同源或互補於被包含在該等標的品件的轉殖基因基因要素中的DNA的DNA序列。這些DNA序列可被使用在DNA擴增反應或者在一DNA雜合方法中作為探針。該等套組亦可含有用於執行該偵測方法所需的試劑和材料。
一“探針”是一被附加一慣常可偵測的標記或報導分子(reporter molecule)[諸如一放射性同位素(radioactive isotope)、配位子(ligand)、化學發光試劑(chemiluminescent agent)或酵素]的經分離的核酸分子。此一探針互補於一標靶核酸的一股，至於本發明，互補於來自該等大豆品件(不管來自一大豆植物或來自一包括來自該品件的DNA的樣品)的一者的基因組DNA的一股。依據本發明的探針不僅包括 去氧核醣核酸或核醣核酸而且聚醯胺(polyamides)以及專一性地結合至一標靶DNA序列且可被使用以偵測那個標靶DNA序列的存在的其他探針材料。
“引子”是藉由核酸雜合被黏合至一互補的標靶DNA股以在該引子和該標靶DNA股之間形成一雜合物(hybrid)，接著藉由一聚合酶(例如，一DNA聚合酶)沿著該標靶DNA股而被延長的經分離的/合成的核酸。本發明的引子對意指它們用於例如藉由聚合酶鏈反應(PCR)或其他慣常的核酸擴增方法擴增一標靶核酸序列的用途。
探針和引子一般而言在長度上是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、 172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、 412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500個聚核苷酸或更多。此等探針和引子在高度嚴苛的雜合條件下專一性地雜合至一標靶序列。較佳地，雖然探針與該標靶序列不同並且維持雜合至標靶序列的能力可藉由慣常方法而被設計，依據本發明的探針和引子具有與該標靶序列完整的序列相似性。
用於製備以及使用探針和引子的方法被描述，例如，在Molecular Cloning：A Laboratory Manual,2nd ed.,vol.1-3,ed.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989。PCR-引子對可例如藉由使用意欲那個目的的電腦程式而被衍生自一已知的序列。
根據在此所揭示的毗鄰DNA和插入序列的引子和探針可藉由慣常的方法(例如，藉由再選殖和定序此等序列)而被使用以確認(並且，若必要的話，校正)該等被揭示的序列。
本發明的核酸探針和引子在嚴苛的條件下雜合至一標靶DNA序列。任何慣常的核酸雜合或擴增方法可被使用以鑑定在一樣品中來自一基因轉殖品件的DNA的存在。核酸分子或它們的片段能夠在某些情況下專一性地雜合至其他核酸分子。如此處所用的，2個核酸分子被說是能夠互相專一性地雜合，若該等2個分子能夠形成一反向平行(anti-parallel)、雙股的核酸結構。一核酸分子被說是另一個核酸分子的“互補物”，若它們展現出完全的互補。如此處所用的，分子被說是展現出“完全互補”，當該等分子的一者的每個核苷酸互補於另一者的一核苷酸。2個分子被說是“最低地互補”，若它們可以足夠的安定性彼此雜合以允許它們在至少慣常的“低嚴苛”條件下維持彼此黏合。相似地，該等分子被說是“互補”，若它們可以足夠的安定性彼此雜合以允許它們在慣常的“高嚴苛”條件下維持彼此黏合。慣常的嚴苛條件由Sambrook et al.,1989所描述。背離完全互補因此是可允許的，只要此等背離不完全地排除該等分子形成一雙股結構的能力。為了一核酸分子作為一引子或探針，它僅需要足夠的互補在序列中以能夠在所採用的特別溶劑和鹽類濃度下形成一安定的雙股結構。
如此處所用的，一實質上同源的序列是一將專一性地雜合至該核酸序列的互補物的核酸序列，其中它在嚴苛條件下被比較。術語“嚴苛條件”被功能地定義關於藉由在Sambrook et al.,1989,at 9.52-9.55中所討論的專一性雜合操作程序雜合一核酸探針至一標靶核酸(亦即，至一感興 趣的特別核酸序列)。亦參見，Sambrook et al.,1989 at 9.47-9.52和9.56-9.58。因此，本發明的核苷酸序列可被使用關於它們選擇性地形成具有DNA片段的互補延伸的雙分子的能力。
視被想像的應用而定，吾人可使用雜合的變化條件以達到變化程度的探針對標靶序列的選擇性。關於需要高選擇性的應用，吾人將典型地採用相對地嚴苛的條件以形成雜合物(hybrids)，例如，吾人將選擇相對低鹽和/或高溫度條件(諸如由大約0.02 M至大約0.15 M NaCl在大約50℃至大約75℃的溫度下所提供)。例如，嚴苛條件可涉及以高嚴苛清洗緩衝液(0.2X SSC,0.1% SDS,65℃)清洗該雜合濾膜至少2次。促進DNA雜合的適當嚴苛條件[例如，在大約45℃下6.0X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)，繼而在50℃下一為2.0X SSC的清洗]是那些熟習此技藝者所知曉的。例如，在清洗步驟的鹽濃度可被選擇從一在50℃下大約2.0X SSC的低嚴苛至一在50℃下大約0.2X SSC的高嚴苛。此外，在該清洗步驟的溫度可從低嚴苛條件(在室溫，大約22℃)被增加至高嚴苛條件(在大約65℃)。溫度和鹽類這兩者可被變化，或者溫度或鹽濃度可被維持固定而其他變數被改變。此等選擇條件容忍小的錯配(若有的話)在該探針和該模板或標靶股之間。經由雜合偵測DNA序列是那些熟習此技藝者所熟知的，並且美國專利第4,965,188號和第5,176,995號的教示是雜合分析的方法的示範。
在一特別的較佳具體例中，本發明的一核酸將在 高嚴苛條件下專一性地雜合至一或多個該等在此所例示或建議的引子(或擴增子或其他序列)(包括它們的互補物和片段)。在本發明的一方面，本發明的一標記核酸分子具有如在該等被例示的序例或互補物和/或它們的片段的一者的在此所提出的核酸序列。
在本發明的另一個方面，本發明的一標記核酸分子與此等核酸序列分享在80%與100%之間或者90%與100%之間的序列相同性。在本發明的一進一步方面，本發明的一標記核酸分子與此序列分享在95%與100%之間的序列相同性。此等序列在植物育種方法中可被使用作為標記以鑑定遺傳雜交的後代。該探針至該標靶DNA分子的雜合可藉由那些熟習此技藝者所知曉的任何數目的方法(這些可包括，但不限於，螢光標籤、放射性標籤、抗體為基礎的標籤以及化學發光標籤)而被偵測。
關於使用一特別的擴增引子對擴增一標靶核酸序列(例如，藉由PCR)，“嚴苛條件”是允許該引子對僅雜合至該標靶核酸序列的條件，其中一具有對應的野生型序列(或它的互補物)的引子將結合以及較佳地產生一獨特的擴增產物(擴增子)。
術語“對(一標靶序列)專一性”指示一探針或引子在嚴苛雜合條件下在一包含有標靶序列的樣品中僅雜合至該標靶序列。
如此處所用的，“經擴增的DNA”或“擴增子”意指一為一核酸模板的部分的標靶核酸序列的核酸擴增的產 物。例如，為了測定該起因於一有性雜交的大豆植物是否含有來自本發明的大豆植物的基因轉殖品件基因組DNA，萃取自一大豆植物組織樣品的DNA可使用一引子對(包括一衍生自在與被插入的異源DNA的插入位址相鄰的在該植物的基因組的毗鄰序列的引子，以及一衍生自該被插入的異源DNA的第二引子)而被進行核酸擴增方法，以產生一用於診斷該品件DNA的存在的擴增子。該擴增子具有一長度並且具有一亦用於診斷該品件的序列。該擴增子在長度上可在自該等引子對加上一核苷酸鹼基對的組合長度；和/或該等引子對加上大約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、 173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、 413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500、750、1000、1250、1500、1750、2000個或更多個核苷酸鹼基對(加上或減去上面所例示的任何增加)的組合長度的範圍。另擇地，一引子對可被衍生自在該被插入的DNA的兩側上的毗鄰序列，藉此產生一包括全部的插入核苷酸序列的擴增子。許多一衍生自該植物基因組序列的引子對可被位在離該被插入的DNA序列一距離。這個距離可在自一核苷酸鹼基對上達大約兩萬個核苷酸鹼基對的範圍。術語“擴增子”的使用特別地排除可在DNA熱擴增反應中被形成的引子二聚體。
核酸擴增可藉由本技藝所知曉的任何各種不同的核酸擴增方法[包括聚合酶鏈反應(PCR)]而被完成。各種不同的擴增方法在本技藝被知曉，並且尤其被描述在美國專利第4,683,195號和美國專利第4,683,202號。PCR擴增方法已被發展以擴增上達22 kb的基因組DNA。DNA擴增的這些方法以及本技藝已知的其他方法可被使用在實施本發明。該異源轉殖基因DNA插入的序列或來自一標的大豆品 件的毗鄰基因組序列可藉由使用衍生自該等在此所提供的序列的引子擴增此等來自該品件的序列，繼而標準的DNA定序該PCR擴增子或該被選殖的DNA而被證明(以及校正，若需要的話)。
由這些方法所產生的擴增子可藉由複數種技術而被偵測。瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel electrophoresis)並且以溴化乙啶(ethidium bromide)染色是一偵測DNA擴增子的常見熟知方法。另一個此方法是基因位元分析(Genetic Bit Analysis)，其中一DNA寡核苷酸被設計部分重疊該相鄰的毗鄰基因組DNA序列和該被插入的DNA序列這兩者。該寡核苷酸被固定在一微井盤的井中。在感興趣的區域的PCR(使用一引子在該被插入的序列以及一者在該相鄰的毗鄰基因組序列)之後，一單股PCR產物可被雜合至該被固定化的寡核苷酸並且作為一模板使用一DNA聚合酶和對被預期的下個鹼基專一性的被標定的ddNTP用於一單一鹼基延長反應。讀出可以是螢光或ELISA-為基礎的。一信號指示該起因於成功擴增、雜合和單一鹼基延長的插入/毗鄰序列的存在。
另一種方法是如由Winge(Innov.Pharma.Tech.00：18-24,2000)所描述的焦磷酸定序(Pyrosequencing)技術。在這個方法中，一寡核苷酸被設計部分重疊該相鄰的基因組DNA和插入DNA接合。該寡核苷酸被雜合至來自該感興趣的區域的單股PCR產物(一引子在該被插入的序列以及一者在該毗鄰基因組序列)，並且在一DNA聚合酶、ATP、 硫酸化酶(sulfurylase)、螢光素酶(luciferase)、三磷酸腺苷雙磷酸酶(apyrase)、腺苷5’磷醯硫酸(adenosine 5' phosphosulfate)和螢光素(luciferin)的存在下被培育。DNTP被個別地添加，並且併入導致一被測量的光信號。一光信號指示該起因於成功的擴增、雜合以及單一或多鹼基延長的轉殖基因插入/毗鄰序列的存在。
螢光極化(fluorescence polarization)是可被使用以偵測本發明的一擴增子的另一種方法。跟隨這個方法，一寡核苷酸被設計部分重疊該基因組毗鄰和被插入的DNA接合。該寡核苷酸被雜合至來自該感興趣的區域的單股PCR產物(一引子在該被插入的DNA和一者在該毗鄰基因組DNA序列)，並且在一DNA聚合酶和一螢光-標定的ddNTP的存在下被培育。單一鹼基延長導致該ddNTP的併入。併入可使用一螢光計(fluorometer)而被測量有如一在極化的變化。一在極化的變化指示該起因於成功的擴增、雜合和單一鹼基延長的轉殖基因插入/毗鄰序列的存在。
TAQMAN(PE Applied Biosystems,Foster City,Calif.)是一種偵測和定量一DNA序列的存在的方法。簡言之，一FRET寡核苷酸探針被設計部分重疊該基因組毗鄰和插入DNA接合。該FRET探針和PCR引子(一引子在該插入DNA序列和一者在該毗鄰基因組序列)在一熱安定性聚合酶和dNTP的存在下被循環。在專一性擴增的期間，Taq DNA聚合酶清除並且釋放螢光部分遠離在該FRET探針上的粹滅部分(quenching moiety)。一螢光信號指示該起因於成功 擴增和雜合的毗鄰/轉殖基因插入序列的存在。
分子信標(molecular beacons)已被描述供使用在序列偵測。簡言之，一FRET寡核苷酸探針被設計部分重疊該毗鄰基因組的和插入DNA接合。該FRET探針的獨特節構導致它含有維持螢光和粹滅部分呈緊密接近的二級結構。該FRET探針和PCR引子(一引子在該插入DNA序列和一者在該毗鄰基因組序列)在一熱安定的聚合酶和dNTP的存在下被循環。在成功的PCR擴增後，該FRET探針至該標靶序列的雜合導致移除該探針二級結構和空間分離該等螢光和粹滅部分。一螢光信號產生。一螢光信號指示該起因於成功的擴增和雜合的毗鄰基因組的/轉殖基因插入序列的存在。
已揭示一對於一插入是傑出的在該大豆基因組的位置，本發明亦包含有含有至少一非大豆品件9582.814.19.1插入在這個基因組位置的一般附近的一大豆種子和/或一大豆植物。一選擇是取代一不同的插入代替來自在此所例示的pDAB9582.814.19.1的一者。在這些一般方面，被標靶的同源重組，例如，可依據本發明而被使用。這個類型的技術是例如，WO 03/080809 A2和對應的公開的美國申請案(U.S.2003/0232410)的標的。因此，本發明包括含有一由在此所鑑定的毗鄰序列(序列辨識編號：1的bp 1-1400和序列辨識編號：2的bp 153-1550)的所有或一可辨認的部分所毗鄰的異源插入(代替或以多-拷貝的cry1F、cry1Ac或pat基因)的植物和植物細胞。一額外拷貝(或額外 的拷貝)的一cry1F、cry1Ac或pat亦可以這個/這些方式(們)被標靶用於插入。
在此所意指或引述的所有專利、專利申請案、臨時申請案以及刊物以它們的整體至它們沒有與這個說明書的明確教示不一致的程度被併入本案以作為參考資料。
下列實施例被包括以例示用於實施本發明的操作程序並且證明本發明的某些較佳具體例。這些實施例不應該被解釋為限制。那些熟習此技藝者所領會的是：在下列實施例中所揭示的技術代表被使用以例示用於它的實施的較佳模式的特別方法。然而，鑒於本揭示，那些熟習此技藝者應該領會：許多改變可在這些特別的具體例中被做出，同時仍然獲得相同或相似的結果而沒有背離本發明的精神和範疇。除非另有指示，所有百分比是以重量計並且所有溶劑混合物比例是以體積計，除非另有註釋。
除非另有指示，下列縮寫被使用。
bp 鹼基對
℃ 攝氏度
DNA 去氧核醣核酸
EDTA 乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid)
kb 千鹼基
μg 微克
μL 微升
mL 毫升
M 莫耳質量(molar mass)
PCR 聚合酶鏈反應
PTU 植物轉錄單位
SDS 十二基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate)
SSC 一含有一氯化鈉和檸檬酸鈉的混合物的緩衝溶液，pH 7.0
TBE 一含有一Tris鹼、硼酸(boric acid)和EDTA的混合物的緩衝溶液，pH 8.3
本發明的具體例被進一步定義在下列實施例中。應該被瞭解的是：這些實施例僅藉由例示而被提供。從上面的討論以及這些實施例，一熟習此技藝者可確定這個發明的必要特徵，並且沒有背離它的精神和範疇可做出本發明的具體例的各種不同的變化和修飾以使它適應各種不同的使用和條件。因此，除了在此所顯示和描述的那些，那些熟習此技藝者從上面的描述將顯而易見本發明的具體例的各種不同的修飾。此等修飾亦被意欲落在隨文檢附的申請專利範圍的範疇內。
在此所提出的各個參考文獻的揭示在此以它的整體被併入本案以做為參考資料。
實施例 實施例1：轉形以及選擇Cry1F和Cry1Ac大豆品件pDAB9582.814.19.1
含有大豆品件pDAB9582.814.19.1的基因轉殖大豆(大豆)經由農桿菌-調節的轉形大豆子葉結(cotyledonary node)培植體(explants)而被產生。該攜帶含有選擇性標記、 pat v6以及感興趣的基因cry1F v3和cry1Ac在T-股DNA區域內的二元載體pDAB9582(第1圖)的無害農桿菌菌株EHA101(Hood et al.,1993)被使用以起始轉形。關於pDAB9582的DNA序列被提供在被註釋在下面表1的序列辨識編號：3。
農桿菌-調節的轉形使用Zeng等人(2004)的一經修飾的操作程序被進行。簡言之，大豆種子(cv Maverick)在基礎培養基上發芽，並且子葉結被分離以及以農桿菌予以感染。芽誘導(shoot initiation)、芽抽長(shoot elongation)以及發根培養基(rooting media)被補充以頭孢子菌素(cefotaxime)、泰門汀(timentin)和萬古黴素(vancomycin)用 於移除農桿菌。固殺草選擇被採用以抑制未被轉形的芽的生長。被選擇的芽被轉移至發根培養基用於根發展並且接著被轉移至用於適應小苗(plantlets)的土壤混合物。
被選擇的小苗的末端小葉(leaflets)以固殺草而被塗葉以篩選推定的轉形體。該等被篩選的小苗被轉移至溫室，容許適應並且接著以固殺草予以塗葉以再確認耐受性和被認為是推定的轉形體。該等被篩選的植物被取樣並且用於確認該可選擇的標記基因和/或該感興趣的基因的分子分析被進行。T0植物被容許在溫室中自花授粉(self fertilize)以造成T1種子。
這個品件(大豆品件pDAB9582.814.19.1)從一獨立的轉形分離株被產生。T1植物在隨後的世代被回交並且被基因移入至精華品種內。該品件根據它的獨特特徵[諸如單一插入位址、正常的孟德爾分離、安定的表現，以及一效力的優等組合(包括除草劑耐受性以及農藝性能)]而被選擇。下列實施例含有被使用以特徵化大豆品件pDAB9582.814.19.1的數據。
實施例2：在大豆品件pDAB9582.814.19.1中的蛋白質表現的特徵化
被表現在大豆品件9582.814.19.1的重組Cry1F、Cry1Ac和PAT蛋白質的生化性質被特徵化。定量酵素-連結的免疫吸附分析(quantitative enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是一種可被使用以特徵化該等蛋白質的生化性質和確認這些蛋白質在大豆品件 9582.814.19.1的表現的本技藝所知曉的生化分析。
實施例2.1：在植物組織中表現PAT、Cry1F和Cry1Ac蛋白質
大豆組織的樣品從該等被測試的植物中被分離並且被製備用於表現分析。PAT蛋白質以一含有洗潔劑Tween-20的磷酸鹽緩衝的生理食鹽水溶液(PBST)[含有0.5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)]被萃取自大豆植物組織。該植物組織被離心；水性上澄液(aqueous supernatant)被收集，如必要的話以適當的緩衝液予以稀釋，並且使用一呈一種三明治格式的PAT ELISA套組而被分析。該套組跟隨製造商的建議規程(Envirologix,Portland,ME)而被使用。這個分析測量被表現的PAT蛋白質。
Cry1F蛋白質以一含有洗潔劑Tween-20的磷酸鹽緩衝的生理食鹽水溶液(PBST)被萃取自大豆植物組織。該植物組織被離心；水性上澄液被收集，如必要的話以適當的緩衝液予以稀釋，並且使用一呈一種三明治格式的Cry1F ELISA套組而被分析。該套組跟隨製造商的建議規程(Strategic Diagnostics Inc.,Newark,DE)而被使用。這個分析測量被表現的Cry1F蛋白質。
Cry1Ac蛋白質以一含有洗潔劑Tween-20的磷酸鹽緩衝的生理食鹽水溶液(PBST)[含有0.5%牛血清白蛋白(BSA)]被萃取自大豆植物組織。該植物組織被離心；水性上澄液被收集，如必要的話以適當的緩衝液予以稀釋，並且使用一呈一種三明治格式的Cry1Ac ELISA套組而被分析。該套組跟隨製造商的建議規程(Strategic Diagnostics Inc.,Newark,DE)而被使用。這個分析測量被表現的Cry1Ac蛋白質。
偵測分析被執行以垂直地(在世代間)和水平地[在一世代內的譜系(lineages)之間]調查在大豆品件pDAB9582.814.19.1中的表現安定性和遺傳性(inheritability)這兩者。
實施例2.2：在植物組織中表現Cry1F、Cry1Ac和PAT蛋白質
Cry1F、Cry1Ac和PAT蛋白質的位準在大豆品件9582.814.19.1中被測定。該等可溶的、可萃取的蛋白質使用一定量酵素-連結的免疫吸附分析(ELISA)方法而從大豆葉組織被測量。自T2至T6世代大豆品件9582.814.19.1，表現是安定的(沒有分離)並且穿過所有的譜系是一致的。表2列出在大豆品件9582.814.19.1中基因轉殖蛋白質的平均表現位準。
實施例3：選殖和特徵化在大豆品件pDAB9582.814.19.1的插入和毗鄰邊界區域中的DNA序列
為了特徵化和描述基因組插入位址，大豆品件pDAB9582.814.19.1的毗鄰基因組的T-DNA邊界區域的序 列被測定。大豆品件pDAB9582.814.19.1的基因組序列被確認，包含有1,400 bp的5’毗鄰邊界序列(序列辨識編號：1)以及1398 bp的3’毗鄰邊界序列(序列辨識編號：2)。根據該大豆品件pDAB9582.814.19.1邊界序列的PCR擴增證實：該等邊界區域是具有大豆源點(origin)以及該等接合區域是大豆品件pDAB9582.814.19.1的獨特序列。該等接合區域可被使用於大豆品件pDAB9582.814.19.1的品件-專一性鑑定。此外，T-股插入位址藉由擴增一對應於來自未被轉形的大豆的基因組的經鑑定的毗鄰邊界序列的區域的基因組片段而被特徵化。比較大豆品件pDAB9582.814.19.1與該未被轉形的基因組序列顯現出：在T-股整合的期間所形成的一來自原始基因座的大約57 bp的刪除。總結，大豆品件pDAB9582.814.19.1的該插入和邊界序列的特徵化指示：來自pDAB9582的T-股的一完整拷貝存在於該大豆基因組。
實施例3.1：大豆基因組序列的確認
該等5’和3’毗鄰邊界與一來自染色體02的大豆全基因組槍式序列(shotgun sequence)比對，指示：大豆品 件pDAB9582.814.19.1的轉殖基因被插入在大豆基因組染色體02。為了確認來自該大豆基因組的大豆品件pDAB9582.814.19.1的插入位址，PCR以不同的引子對(第2圖、表3、表4和表5)被進行。來自大豆品件pDAB9582.814.19.1和其他基因轉殖或非-基因轉殖大豆品系的基因組DNA被使用作為一模板。為了確認該等5’邊界序列是正確的，一被設計以結合至At Ubi10啟動子基因要素的引子(例如AtUbi10RV1)以及一被設計以結合至在大豆基因組染色體02上的被選殖的5’端邊界的引子(被命名為81419_FW3的引子)被使用於擴增橫跨該At Ubi10啟動子基因要素至5’端邊界序列的DNA節段。相似地，為了確認該被選殖的3’邊界序列，一pat專一性引子(例如3’PATEnd05)以及依據該被選殖的3’端邊界序列而被設計的3種引子(被命名為81419_RV1、81419_RV2和81419_RV3)被使用於擴增橫跨pat基因至3’邊界序列的DNA節段。具有被預期大小的DNA片段僅從大豆品件pDAB9582.814.19.1的基因組DNA以各個引子對而被擴增，但是沒有從來自其他基因轉殖大豆品系或非-基因轉殖對照的DNA樣品。結果指示：該等被選殖的5’和3’邊界序列是用於大豆品件pDAB9582.814.19.1的T-股插入的毗鄰邊界序列。
為了進一步確認在該大豆基因組的該DNA插入，一橫跨該大豆邊界序列的PCR擴增在不含有用於大豆品件pDAB9582.814.19.1的T股插入的基因組DNA上被完成。依據該5’端邊界序列而被設計的引子81419_FW3以及 一關於該3’端邊界序列而被設計的引子81419-RV3被使用以擴增含有pDAB9582 T-股被整合的基因座的DNA節段。如所預期的，以81419_FW3和81419_RV3的引子對所完成的PCR擴增產生一來自所有其他大豆對照品系但不是pDAB9582.814.19.1的大概1.5 kb DNA片段。比對大豆品件pDAB9582.814.19.1的該等被鑑定的5’和3’邊界序列與一來自染色體02的大豆全基因組槍式序列顯示來自原始基因座的57 bp刪除。(第3圖)。這些結果證明：大豆品件pDAB8294的轉殖基因被插入至大豆基因組染色體02的位址內。
實施例4：經由南方墨點法(Southern Blot)的大豆品件pDAB9582.814.19.1特徵化
南方墨點分析被使用以建立大豆品件pDAB9582.814.19.1的整合圖譜。這些實驗產生證明該等cry1Ac和cry1F轉殖基因在大豆基因組內的整合和完整性的數據。大豆品件pDAB9582.814.19.1被特徵化有如一含有一單一拷貝的來自質體pDAB9582的cry1Ac和cry1F PTU的全長、簡單的整合品件。
南方墨點數據暗示：一T-股片段插入至大豆品件pDAB9582.814.19.1的基因組內。詳細的南方墨點分析使用對該被包含在pDAB9582.814.19.1的T-股整合區域的cry1Ac和cry1F基因專一性的探針以及具有位在該質體內的切割位址並且產生對橫跨該質體與大豆基因組DNA(邊界片段)的接合的質體或片段內部的雜合片段的描述性限制酵素而被實施。來自南方雜合的分子量指示：該限制酵素和該探 針的組合對於該品件是獨特的，並且建立它的鑑定圖譜。這些分析亦顯示：該質體片段已被插入至大豆基因組DNA內而沒有重新排列該cry1Ac和cry1F PTU。
實施例4.1：大豆葉樣品收集和基因組DNA(gDNA)分離
基因組DNA被萃取自從含有大豆品件pDAB9582.814.19.1的個別大豆植物所收穫的葉組織。此外，gDNA從一含有代表實質品系的基因背景(缺乏該等cry1Ac和cry1F基因)的慣常大豆植物Maverick而被分離。個別的基因組DNA跟隨標準的CTAB方法(Sambrook et al(1989))被萃取自凍乾的葉組織。在萃取之後，該DNA使用PICO GREEN試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA)而被光譜螢光地定量。該DNA接著在一瓊脂糖凝膠上被看見以確認來自該PICO GREEN分析的數值並且測定DNA品質。
實施例4.2：DNA消化和分離
關於南方墨點分子特徵化大豆品件pDAB9582.814.19.1，10微克(10 μg)的基因組DNA被消化。來自大豆pDAB9582.814.19.1和非-基因轉殖大豆品系Maverick的基因組DNA藉由添加每μg的DNA大概5單位的經選擇的限制酵素和對應的反應緩衝液至各個DNA樣品而被消化。各個樣品在大概37℃下被培育過夜。限制酵素AseI、HindIII、NsiI和NdeI(New England Biolabs,Ipswich,MA)被個別地用於消化。限制酵素NotI和ApaLI被一起使用於一雙消化(double digestion)(New England Biolabs,Ipswich,MA)。此外，一正雜合對照樣品藉由組合質體 DNA、pDAB9582與來自非-基因轉殖大豆品種Maverick的基因組DNA而被製備。質體DNA/基因組DNA雞尾酒使用如該等被測試的樣品相同的操作程序和限制酵素而被消化。
在該等消化被培育過夜之後，25μL QUIK-PRECIP PLUS SOLUTION(Edge Biosystems,Gaithersburg,MD)被添加並且該等被消化的DNA樣品以異丙醇予以沉澱。被沉澱的DNA丸粒(pellet)被再懸浮在15 μL的1X裝載緩衝液[0.01%溴酚藍(bromophenol blue)、10.0 mM EDTA、10.0%甘油、1.0 mM Tris pH 7.5)。該等DNA樣品和分子大小標記接著經由0.85%瓊脂糖凝膠以0.4X TAE緩衝液(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)在35伏特下被電泳歷時大概18-22小時以達到片段分離。該等凝膠以溴化乙啶(Invitrogen,Carlsbad,CA)而被染色並且該DNA在紫外線(UV)光下被看見。
實施例4.3：南方轉移和膜處理
南方墨點分析如由Memelink等人(1994)所描述的實質上被執行。簡言之，在電泳分離和看見該等DNA片段之後，該等凝膠以0.25M HCl被淨化歷時大概20分鐘，並且接著被暴露至一變性溶液(0.4 M NaOH、1.5 M NaCl)歷時大概30分鐘繼而中和溶液(1.5 M NaCl、0.5 M Tris pH 7.5)歷時至少30分鐘。南方轉移使用一具有10X SSC的芯系統(wicking system)在尼龍膜上被執行過夜。在轉移之後，該DNA藉由UV交聯而被結合至該膜，繼而以一為2X SSC溶液簡潔地清洗膜。這個方法產生預備用於雜合的南方墨點膜。
實施例4.4：DNA探針標定和雜合
結合至該尼龍膜的DNA片段使用一被標定的探針(表6)而被偵測。探針藉由一PCR-為基礎的合併一毛地黃素(digoxigenin)(DIG)標定的核苷酸[DIG-11]-dUTP至使用對基因要素專一性的引子而從質體pDAB9582被擴增的DNA片段內而被產生。藉由PCR合成產生DNA探針使用一PCR DIG探針合成套組(PCR DIG PROBE SYNTHESIS KIT)(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)跟隨製造商所建議的操作程序而被進行。
被標定的探針藉由瓊脂糖凝膠電泳被分析以測定它們的品質和數量。一所欲數量的被標定的探針接著使用實質上如用於DIG EASY HYB SOLUTION(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)所描述的操作程序而被使用於雜合至在該等尼龍膜上的標靶DNA用於偵測該等專一性片段。簡言之，含有被固定的DNA的尼龍膜墨點以2X SSC而被簡潔地清洗，並且在一雜合烘箱中在大概45-55℃下在雜合瓶中與20-25 mL的預熱的DIG EASY HYB SOLUTION被預雜合歷時大約2小時。該預-雜合溶液接著被倒出並且被替換以~15 mL的預熱的DIG EASY HYB SOLUTION(含有一所欲數量的藉由在一水浴中煮沸歷時大概5分鐘所變性的專一性探針)。該雜合步驟接著在雜合烘箱中在大概45-55℃下被實施過夜。
在探針雜合的最後，含有該等探針的DIG EASY HYB SOLUTIONS被倒出至乾淨的管子中並且被儲存在大 概-20℃。這些探針根據製造商所建議的操作程序可被再使用2次。該等膜墨點被簡潔地沖洗，並且在乾淨的塑膠容器中在室溫下以低嚴苛的清洗緩衝液(2X SSC，0.1% SDS)清洗2次歷時大概5分鐘，繼而在大概65℃下以高嚴苛的清洗緩衝液(0.1X SSC，0.1% SDS)清洗2次各個歷時15分鐘。該等膜墨點以來自DIG清洗和阻斷緩衝液組(DIG WASH AND BLOCK BUFFER SET)(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)的1X順丁烯二酸(maleic acid)緩衝液而被簡潔地清洗歷時大概5分鐘。這個繼而在一1X阻斷緩衝液中阻斷歷時2小時，以及一與抗-DIG-AP[鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)]抗體(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)在1X阻斷緩衝液的培育亦歷時一最少30分鐘。在以1X清洗緩衝液的2-3次清洗之後，專一性DNA探針仍然結合至該等膜墨點，以及DIG-標定的DNA標準品使用CDP-STAR化學發光核酸偵測系統(CDP-STAR CHEMILUMINESCENT NUCLEIC ACID DETECTION SYSTEM)(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)跟隨製造商的建議而被看見。墨點被暴露至化學發光薄膜(hemiluminescent film)歷時一或更多的時間點以偵測雜合片段以及看見分子大小標準品。薄膜以一ALL-PRO 100 PLUS薄膜顯影劑(Konica Minolta,Osaka,Japan)而被顯影並且影像被掃描。被偵測的條帶的數目和大小被文件證明用於各個探針。在如所描述的DIG偵測之後可見的DIG-標定的DNA分子量標記II(DIG-LABELED DNA MOLECULAR WEIGHT MARKER II)(DIG MWM II)和 DIG-標定的DNA分子量標記VII(DIG MWM VII)被使用以測定在該等南方墨點中的雜合片段大小。
實施例4.5：南方墨點結果
根據cry1Ac和cry1F PTU被知曉的限制酵素位址，以一特別的消化和探針而被預期和觀察到的片段大小被提供在表7。2種類型的片段從這些消化和雜合被鑑定：內部片段，其中已知的酵素位址毗鄰該探針區域並且被完全地包含在該cry1Ac和cry1F PTU的插入區域，以及邊界片段，其中一已知的酵素位址位於該探針區域的一端以及一第二位址被預期在該大豆基因組。邊界片段大小藉由品件而變化，因為在多數例子中，DNA片段整合位址對於各個品件是獨特的。該等邊界片段提供一定位一相對於該被整合的DNA的限制酵素位址以及評估DNA插入的數目的工具。在含有品件pDAB9582.814.19.1的大豆的多世代上所完成的南方墨點分析產生暗示一來自質體pDAB9582的低拷貝、完整的cry1Ac和cry1F PTU被插入至大豆品件pDAB9582.814.19.1的大豆基因組內的數據。
限制酵素AseI和NsiI結合和切割在質體pDAB9582的獨特限制位址。接著，這些酵素被選擇以特徵化在大豆品件pDAB9582.814.19.1的cry1Ac基因插入。在分別地AseI和NsiI消化後，>7286 bp或>9479 bp的邊界片段被預期與探針雜合(表7)。當AseI和NsiI消化被分別地使用時，大約7400和>10000 bp的單一cry1Ac雜合條帶被觀察到。探針至這個大小的條帶的雜合暗示：關於該cry1Ac基因在大豆品件pDAB9582.814.19.1的大豆基因組的一單一位址的插入的存在。限制酵素NotI和ApaLI被選擇以執行一雙消化並且釋放一含有該cry1Ac植物轉錄單位(PTU；啟動子/基因/終止子)的片段(表7)。在NotI和ApaLI雙消化之後，被預期的4550 bp片段以探針而被觀察到。以酵素消化該等pDAB9582.814.19.1樣品繼而探針雜合所獲得的結果指示：一來自質體pDAB9582的完整cry1Ac PTU被插入至大豆品件pDAB9582.814.19.1的大豆基因組內。
該等限制酵素NdeI和NsiI結合並且切割在質體pDAB9582的限制位址。接著，這些酵素被選擇以特徵化在大豆品件pDAB9582.814.19.1的cry1F基因插入。在分別地HindIII、NcoI和NsiI消化之後，>5569 bp和>9479 bp的邊界片段被預期與探針雜合(表7)。當HindIII、NcoI和NsiI分別被使用時，~7500 bp和>10000 bp的單一cry1F雜合條帶被觀察到。探針至這個大小的條帶的雜合暗示：關於該cry1F基因在大豆品件pDAB9582.814.19.1的基因組的一單一位址的插入的存在。限制酵素HindIII被選擇以釋放一含有cry1F 植物轉錄單位(PTU；啟動子/基因/終止子)的片段(表7)。在該HindIII消化之後，被預測的7732 bp片段以探針被觀察到。以酵素消化該大豆品件pDAB9582.814.19.1樣品繼而探針雜合所獲得的結果指示：一來自質體pDAB952的完整cry1F PTU被插入至大豆品件pDAB9582.814.19.1的大豆基因組內。
實施例4.6：骨架序列的缺乏
南方墨點分析亦被實施以證明缺乏觀黴素抗性基因(specR)、Ori Rep要素和複製起始蛋白質trfA(trfA要素)在大豆品件pDAB9582.814.19.1中。當適當的正(pDAB9582被添加至Maverick基因組DNA)和負(Maverick基因組DNA)對照被包括用於南方分析時，沒有對觀黴素抗性、Ori Rep要素或trfA要素的專一性雜合被預期。在NsiI消化和以specR專一性探針雜合之後，吾人預期15320 bp的大小條帶在該正對照樣品(pDAB9582被添加至Maverick基因組DNA)被觀察到。該specR探針不雜合至該負對照和大豆品件pDAB9582.814.19.1的樣品。相似地，在NsiI消化和以trfA探針雜合後，吾人預期15320 bp的大小條帶在該正對照樣品(pDAB9582加上Maverick)被偵測，但是在該負對照和大豆品件pDAB9582.814.19.1的樣品中缺乏。在NdeI消化和以OriRep專一性探針雜合之後，5329 bp的另一個被預期的大小條帶在該正對照樣品(pDAB9582被添加至Maverick基因組DNA)被偵測，但是在該負對照和大豆品件pDAB9582.814.19.1的樣品中缺乏。這些數據指示：缺乏觀 黴素抗性基因、Ori Rep要素和複製起始蛋白質trfA在大豆品件pDAB9582.814.19.1。
實施例5：農藝的和產量田間試驗(field trial)以及除草劑耐受性
為了測試大豆品件pDAB9582.814.19.1的農藝特徵和效力，該品件在西元2010年10月和西元2011年2月被種植在波多黎各，聖依莎貝爾的一效力試驗(efficacy trial)。起初被轉形以產生品件pDAB9582.814.19.1的栽培品種Maverick被種植在各個苗圃並且被包括作為一在實驗的對照。用於T3苗圃的種子被衍生自在T2階段的單一植物選擇，以及用於T4苗圃的種子被衍生自在T3階段的單一植物選擇。該品件的4個譜系被測試各個世代。各個譜系被種植在一為4列寬和7.5呎長的小區(plot)。在列之間的間隔是30英吋。小區在光下生長歷時大概2.5週以補償在波多黎各的短日長度。各個苗圃被噴灑以固殺草(在一為411 g ae/ha的比率)。對照植物Maverick的一小區被噴灑以相同比例的固殺草，以及一第二小區未被噴灑並且被使用作為用於該品件的對照比較。
數據在萌芽(emergence)、一般外觀(general appearance)、活力(vigor)、高度(height)、倒伏(lodging)以及成熟(maturity)上被收集。除草劑耐受性藉由視覺上觀看萎黃病(chlorosis)、葉壞死(leaf necrosis)以及植物死亡(表8)而被評估。
關於大豆品件pDAB9582.814.19.1與Maverick的比較，僅來自Maverick的未被噴灑的區塊的數據被使用。 關於被噴灑和未被噴灑的處理的比較，來自被噴灑以一特定處理的大豆品件pDAB9582.814.19.1區塊的數據與來自Maverick對照未被噴灑的區塊的數據被比較。大豆品件pDAB9582.814.19.1顯示對固殺草除草劑施加的耐受性。相反的，沒有Maverick植物對該等除草劑處理有耐受性。
實施例6：特徵化關於大豆品件9582.814.19.1的殺蟲活性
田間和溫室評估被實施以特徵化Cry1Ac和Cry1F在大豆品件pDAB9582.814.19.1中對抗實驗室培養的大豆害蟲{包括黎豆夜蛾(黎豆毛蟲)、大豆夜蛾(大豆尺蠖)以及草地夜蛾[秋夜盜蛾(fall armyworm)]}的活性。大豆品件pDAB9582.814.19.1與未被轉形的大豆品種Maverick被比較以測定由Cry1F和Cry1 Ac蛋白質所提供的植物保護的位準。
溫室試驗在大概4週大的植物上被實施。15株植物被使用以評估該大豆品件pDAB9582.814.19.1和該Maverick對照。對於各個被測試的昆蟲物種(黎豆夜蛾、大豆夜蛾和草地夜蛾)，3個葉衝模(leaf punches)從各個植物被 做出用於一總計45個葉盤/植物/昆蟲物種。1.4 cm(1.54 cm2)葉衝模被放置在一被感染以一新生幼蟲(larvae)並且以一多孔的塑膠蓋所密封的2%水瓊脂(water agar)的頂部上的測試場(test arena)。死亡率(mortality)和葉的消耗在感染(infestation)之後4天被評估。未對溫合的探查反應的幼蟲被認為死亡。葉損傷藉由視覺上評分由昆蟲所消耗的葉衝模的百分比而被評估。
田間評估藉由收集來自在波多黎各，聖依莎貝爾的種子增加苗圃小區的葉樣品並且發送這些葉子至印第安納波利斯用於測試而被實施。用於大豆品件pDAB9582.814.19.1的苗圃小區在西元2011年2月被種植並且由被安排在4列的大概180株植物所構成。各列是2.3 m長以及76.2 cm被間隔開；個別的植物在各列內被5.1 cm間隔開。在西元2011年3月，一位在分生組織(meristem)下面大概4結節(nodes)的完全展開、主莖三葉的葉子(mainstem trifoliate leaf)從10株大豆品件pDAB9582.814.19.1植物和10株‘Maverick’植物被切除。該等葉子被放置在經標定的塑膠袋中(一袋一個)並且被密封。該等被裝袋的葉子被包裝並且被轉移至實驗室。在實驗室中，1或2個3.33 cm(1.31 in)直徑的葉盤從各個三葉的葉子被衝模以提供一總計16個葉盤。各個葉盤被放置在一在被感染以一新生的草地夜蛾幼蟲並且以一多孔的塑膠蓋所密封的2%瓊脂的頂部上的測試場。該等葉盤被保持在一經控制的環境室歷時7天，其中時間死亡率和葉消耗被評估。沒有對溫和探查反應的幼蟲 被認為死亡。葉損傷藉由視覺上評分由昆蟲所消耗的葉衝模的百分比而被評估。
從這些被重複的實驗所獲得的結果指示：該大豆品件pDAB9582.814.19.1要比Maverick對照植物對於所有被測試的昆蟲維持顯著較低的損傷。因此，該大豆品件pDAB9582.814.19.1具有殺蟲活性在這個廣大的宿主範圍上。
實施例7：大豆品件pDAB9582.814.19.1的序列
序列辨識編號：14提供大豆品件pDAB9582.814.19.1的序列。這個序列含有5’基因組毗鄰序列、pDAB9582的T-股插入以及3’基因組毗鄰序列。關於序列辨識編號：14，殘基1-1400是5’基因組毗鄰序列，殘基1401-1536是一來自該pDAB9582質體的重排(rearrangement)的殘基，和1537-13896是pDAB9582 T-股插入的殘基，以及殘基13897-15294是3’毗鄰序列。關於該插入的5’端的接合序列或轉移(transition)因此發生在序列辨識編號：14的殘基1400-1401。關於該插入的3’端的接合序列或轉移因此發生在序列辨識編號：14的殘基13896-13897。
應該被注意的是：來自大豆品件pDAB9582.814.19.1的後代可具有稍微地脫離序列辨識編號：14的序列。在導入大豆品件pDAB9582.814.19.1至植物細胞的基因移入和育種過程的期間，對於該插入的一些刪除或其他改變發生不是罕見的。再者，在PCR擴增的錯誤可發生，這可導致較小的定序錯誤。例如，在此所列出的 毗鄰序列藉由從大豆基因組DNA產生擴增子，並且接著選殖和定序該等擴增子而被測定。在以這個方式所產生和測定的序列中發現輕微的差異和較小的不一致不是罕見的，提供產生用於從基因組DNA定序的足夠擴增子所需的許多循環的擴增。一熟習此技藝者將承認並且放注意在：起因於這些類型的常見的定序錯誤或不一致所需的任何調節是在本發明的範疇內。因此，在此所提供的質體序列的相關節段可包含有一些較小的變異。因此，一包含有一具有與該標的插入序列一些範圍的相同性的聚核苷酸的植物是在本發明的範疇內。與序列辨識編號：14的序列的相同性可以是一具有與一在此所例示或描述的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列相同性的聚核苷酸序列。因此，在序列辨識編號：14與大豆品件pDAB9582.814.19.1後代植物之間的一些差異可被鑑定並且是在本發明的範疇內。
實施例8：品件專一性TaqMan分析
一品件專一性TAQMAN分析被發展以偵測大豆品件pDAB9582.814.19.1的存在並且測定在育種族群中植物的接合性狀態。大豆品件pDAB9582.814.19.1含有二元載體pDAB9582的T-股(第1圖)。為了專一性偵測大豆品件pDAB9582.814.19.1，專一性TAQMAN引子和探針依據位在5’(序列辨識編號：1)或3’(序列辨識編號：2)插入-至-植物接合的DNA序列而被設計(第4圖)。一用於大豆品件pDAB9582.814.19.1的品件專一性分析被設計使用2個引子 和一由Applied Biosystems(ABI)所合成的含有FAM報導子(reporter)在它的5’端的標靶-專一性MGB探針以專一性地偵測一橫跨該3’整合接合的229 bp DNA片段。這個TAQMAN偵測方法用於大豆品件pDAB9582.814.19.1的專一性被測試對於含有Cry1Ac和Cry1F PTU的7個不同的品件以及一具有大豆專一性內生參考基因GMFL01-25-J19(大豆cDNA，GenBank：AK286292.1)的呈雙重格式的對照非-基因轉殖大豆品種(Maverick)。
實施例8.1：gDNA分離
7個不同的大豆品件和非-基因轉殖大豆品種的gDNA樣品在這個研究中被測試。基因組DNA使用經修飾的QIAGEN MAGATTRACT PLANT DNA KIT(Qiagen,Valencia,CA)而被萃取。每個樣品8個新鮮的大豆葉盤被使用於gDNA萃取。為了這個研究的目的，樣品以無DNase水而被稀釋，導致一大概10 ng/μL的濃度。
實施例8.2：TaqMan分析和結果
專一性TAQMAN引子和探針被設計用於一大豆品件pDAB9582.814.19.1專一性TAQMAN分析。這些試劑可以下面所列出的條件而被使用以偵測在大豆品件pDAB9582.814.19.1內的轉殖基因。表9列出被專一性地發展用於偵測大豆品件pDAB9582.814.19.1的引子和探針序列。
用於擴增的多套式PCR(multiplex PCR)條件如下：1X Roche PCR緩衝液、0.4 μM品件專一性前向引子、0.4 μM品件專一性反向引子、0.4 μM引子GMS116 F、0.4 μM引子GMS116 R、0.2 μM品件專一性探針、0.2 μM GMS116探針、0.1% PVP、6-20 ng gDNA在一為10 μL的總反應。雞尾酒使用下列條件而被擴增：i)95℃歷時10分鐘，ii)95℃歷時10秒，iii)60℃歷時40秒，iv)重複步驟ii-iii歷時40個循環，v)保持40℃。即時PCR在ROCHE LIGHTCYCLER 480上被進行。數據分析是根據測量由LIGHTCYCLER 480軟體所測定的交叉點(crossing point)(Cp值)(它是在螢光的變化的比率達到它的最大值的PCR循環數目)。
用於大豆品件pDAB9582.814.19.1的TAQMAN偵測方法被測試對於7個含有Cry1Ac和Cry1F PTU的不同品件以及一具有大豆專一性內生參考基因GMFL01-25-J19(GenBank：AK286292.1)的呈雙重格式的非-基因轉殖大豆品種。該分析專一性地偵測該大豆品件pDAB9582.814.19.1並且不產生或擴增任何來自該等對照(亦即該等含有Cry1Ac和Cry1F PTU的品件以及一非-基因轉殖大豆品種)的偽陽性結果。該等品件專一性引子和探針可被使用於偵測該大豆品件pDAB9582.814.19.1，並且這些條件和試劑可應用於接合性分析。
已例示和描述本發明的原理，對熟習此技藝者應該顯而易見的是：本發明可被安排和詳細的修改而沒有背離此等原理。吾人請求在隨文檢附的申請專利範圍的精神和範疇內的所有修改。
在這個說明書中所引述的所有公開案和公開的專利文件在此被併入本案以作為參考資料至猶如各個個別的公開案或專利申請案被明確地或個別地指示要被併入本案以作為參考資料的相同程度。
第1圖是一含有cry1F、cry1Ac和pat表現卡匣的pDAB9582的質體圖譜。
第2圖描繪用於確認大豆品件pDAB9582.814.19.1的5’和3’邊界序列的引子位置。
第3圖描繪在大豆品件pDAB9582.814.19.1的基因組序 列排列。
第4圖描繪用於TAQMAN分析大豆品件pDAB9582.814.19.1的引子和探針位置。
<110> 陶氏農業科學公司(Dow Agrosciences LLC)
<120> 用於檢測大豆品件pDAB9582.814.19.1的方法
<130> 71235
<160> 20
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1836
<212> DNA
<213> 大豆
<400> 1
<210> 2
<211> 1550
<212> DNA
<213> 大豆
<400> 2
<210> 3
<211> 12381
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pDAB9582的質體序列
<400> 3
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 81419_FW3引子
<400> 4
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 81419_RV1引子
<400> 5
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 81419_RV2引子
<400> 6
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 81419_RV3引子
<400> 7
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'IREnd-01引子
<400> 8
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'IREnd-02引子
<400> 9
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AtUbi10RV1引子
<400> 10
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AtUbi10RV2引子
<400> 11
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3'PATEnd05引子
<400> 12
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3'PATEnd06引子
<400> 13
<210> 14
<211> 15294
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大豆品件9582.814.19.1的序列
<400> 14
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 81419_3'F引子
<400> 15
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 81419_3'R引子
<400> 16
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 81419_3'P探針
<400> 17
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GMS116 F引子
<400> 18
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GMS116 R引子
<400> 19
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GMS116探針
<400> 20

Claims (1)

  1. 一種在一包含有大豆DNA的樣品中偵測大豆品件pDAB9582.814.19.1的方法，該方法包含有：(a)令該樣品與一選擇性地結合至一序列辨識編號：1的bp 1-1400或它的互補物內的側翼序列之在長度上至少10 bp的第一引子，和一選擇性地結合至一序列辨識編號：1的bp 1401-1836或它的互補物的插入序列之在長度上至少10 bp的第二引子接觸；以及分析一在該等引子之間所產生的擴增子；或者(b)令該樣品與一選擇性地結合至一序列辨識編號：2的bp 1-152或它的互補物的插入序列之在長度上至少10 bp的第一引子，和一選擇性地結合至序列辨識編號：2的bp 153-1550或它的互補物的側翼序列之在長度上至少10 bp的第二引子接觸；以及分析一在該等引子之間所產生的擴增子。
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