CN117210598A

CN117210598A - 玉米事件caf0327的核酸分子及其检测方法

Info

Publication number: CN117210598A
Application number: CN202311192387.0A
Authority: CN
Inventors: 铁健雄
Original assignee: Guangzhou Harvey Seed Industry Co ltd
Current assignee: Guangzhou Harvey Seed Industry Co ltd
Priority date: 2023-09-14
Filing date: 2023-09-14
Publication date: 2023-12-12

Abstract

本发明涉及玉米事件CAF0327的核酸分子及其检测方法，用于检测该核酸分子的引物组、探针及试剂盒，以及产生自玉米事件CAF0327的玉米制品。本发明的玉米事件CAF0327可稳定表达目的基因，且表达量强，对亚洲玉米螟和草地贪夜蛾等主要害虫的抗虫性效果非常优秀；达到了全生育期全植株持久性免疫级别的高抗水平，世代间遗传稳定，且具有良好的安全性。

Description

玉米事件CAF0327的核酸分子及其检测方法

技术领域

本发明涉及植物分子生物学、植物转化、以及植物育种领域，具体涉及玉米事件CAF0327的核酸分子及其检测方法。

背景技术

玉米(拉丁学名：Zea mays L.)在世界上很多地区都是主要的粮食作物。通过生物技术改善玉米的农艺性状和品质已有广泛研究。其中，如何在玉米中产生昆虫抗性，例如对玉米螟虫、草地贪夜蛾、棉铃虫、黏虫等的抗性，同时对环境不产生有害作用，是一个重要的研究方向。一种实现的方法是通过转基因方式将特定的昆虫抗性基因在玉米植物中表达从而使玉米植物获得相应的昆虫抗性。例如国际公开号为WO2005059103A1、WO2013169923A1等专利申请公开的技术。目前国内外应用中最主要的昆虫抗性基因包括cry1A、cry1F、cry2Ab、cry1C、cry34Ab、vip3A等。

然而，外源基因在植物中的表达以及是否能实现抗虫效果受到该基因在植物染色体中的具体位置的影响。具体而言，外源基因在染色体上的位置不同，会对该外源基因是否表达以及相应的表达量造成很大差异，在表达的空间和时间模式上也可能存在差异，例如不同植物组织之间转基因的相对表达存在差异，这种差异表现在实际的表达模式可能与根据导入的基因构建体中的转录调节元件所预期的表达模式不一致。其原因可能是由于染色质结构(如异染色质)或转录调节元件(如增强子)接近整合位点。因此，为了得到最优的表达，通常需要筛选大量的玉米事件，如此才可能鉴定出可以商业化的事件，即以商业化为目的从大量的事件中筛选出具有预期的目标基因表达量和表达模式的单一事件。具有预期转基因表达量和表达模式的事件可以采用常规的育种方法通过有性异型杂交将转基因渗入到其他遗传背景中，通过杂交的方式产生的后代可以保持原始转化体的转基因表达特征。应用这种策略模式可以确保品种中具有可靠的基因表达，而这些品种能很好地适应当地的生长条件。

因此，鉴定外源基因在基因组中的整合位点对转基因作物的应用具有重要意义。能够检测特定事件的存在以确定有性杂交的后代是否包含目的基因将是有益的。在转基因安全评价中，外源基因在基因组中的整合位点是必须提供的信息。整合位点是通过与插入的转基因DNA相邻的染色体DNA(或基因组DNA)的序列(即，侧翼DNA序列)来表征的。

目前，主要通过PCR技术鉴定分析外源基因的整合位点，包括质粒拯救法、反向PCR(IPCR)法、TAIL-PCR(热不对称交错PCR)法、PCR-Walking法等。TAIL-PCR技术简单易行，反应高效灵敏，产物特异性好，重复性好，应用较为广泛。例如Xu等通过TAIL-PCR方法分离了水稻转基因事件Bt-ZJ22中外源基因整合位点3'端旁侧序列，并根据旁侧序列建立了TaqMan实时定量PCR鉴定方法(Xu J等，Qualitative detection and quantification ofa Cry1A(b)transgene present in rice cv.Zhejing 22,European food research andtechnology,2011,233:259-266)。

对于有性杂交的后代以及用其制备的产品，需要检测其是否包含特定的玉米事件的存在，以便确定有性杂交的后代是否包含目的基因。例如来源于基因重组农作物的食物在投放入市场前需要获得正式批准和进行标记。可以通过多种现有的多核苷酸的检测方法来检测植物中转基因的存在，例如通过聚合酶链式反应(PCR)或者利用多核苷酸探针的DNA杂交。

本发明人已获得一种含有Bt抗虫基因M1Cry1ab的玉米事件的专利。该专利提供了包含来自于苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的Bt编码基因Cry1Ab的玉米事件，该玉米事件中含有的基因Cry1Ab经过本发明人改造后，在作物中表达稳定，抗虫效果优异。然而目前为止，尚未见将M1Cry1ab与其他基因进行融合表达的报道，原因在于，含有多基因片段的人工构建体在植株体内存在表达不稳定，易丢失或沉默的问题，不同基因在染色体上的不同位置对表达量也会造成不可预估的影响。而且由于缺乏不同抗虫基因在染色体上不同位置对玉米抗虫能力影响的有效评估手段，使得该方面研究的推进存在诸多困难。

为了解决上述技术问题，本申请人申请了一种编码杀虫蛋白的抗虫融合基因m1Cry1Ab-mgCry1F的专利申请(CN202310781118.1)，将两种苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的Bt编码基因Cry1Ab和Cry1F进行融合设计改造合成，强强融合，合成了融合基因m1Cry1Ab-mgCry1F，具有最强的抗虫性表现，抗性强度提升，抗虫谱拓宽，避免抗性害虫的产生，在玉米生产上具有节本增效、稳产高产的重大生产价值和经济价值，和广阔的产业化前景。该融合基因在作物中可以稳定表达，抗虫效果好。但是该专利申请并未对该抗虫基因m1Cry1Ab-mgCry1F在染色体上的不同位置对表达量所造成的影响进行研究，因此缺乏该抗虫基因在染色体上的不同位置对玉米抗虫能力影响的评估。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明人继续开展对m1Cry1Ab-mgCry1F基因的大量研究，得到具有单拷贝转基因玉米转化体，具有良好的遗传稳定性、高抗亚洲玉米螟、双丙胺磷除草剂耐受性等优秀特性的玉米事件CAF0327。因此，本发明的目的是提供一种玉米事件CAF0327的核酸分子及其检测方法，其可以准确快速的鉴定生物样品中是否包含特定转基因玉米事件CAF0327的DNA分子。

为实现上述目的，本发明提供了如下方面的技术方案。

本发明提供了一种玉米事件CAF0327的核酸分子，所述核酸分子包括：SEQ ID NO:1或其反向互补序列、和/或SEQ ID NO:2或其反向互补序列；其中，所述玉米事件CAF0327中包括异源DNA分子，所述异源DNA分子包括m1Cry1Ab-mgCry1F基因表达盒和bar基因表达盒；所述m1Cry1Ab-mgCry1F基因表达盒包括：用作m1Cry1Ab-mgCry1F基因启动子的CaMV35S启动子、m1Cry1Ab-mgCry1F基因编码框、用作m1Cry1Ab-mgCry1F基因终止子的T-Nos终止子；所述bar基因表达盒包括：用作bar基因启动子的CaMV35S启动子、bar基因编码框、作为bar基因终止子的CaMV poly(A)信号；所述玉米事件CAF0327以保藏号CGMCC No.45597保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2023年06月26日，分类命名为玉米Zea mays。

本发明所述的SEQ ID NO:1为转基因玉米事件CAF0327中在插入序列RB T-DNA一端的5'末端位于插入接合部位附近的一个长度为20个核苷酸的序列，依次包括10个来自玉米插入位点的RB T-DNA侧翼基因组的核苷酸和10个来自于插入序列RB T-DNA一端5'末端的核苷酸。所述SEQ ID NO:1跨越了玉米插入位点的RB T-DNA侧翼基因组DNA序列和插入序列RB T-DNA一端5'末端的DNA序列，包含所述SEQ ID NO:1或其反向互补序列即可鉴定为转基因玉米事件CAF0327的存在。

类似地，本发明所述的SEQ ID NO:2为转基因玉米事件CAF0327中在插入序列LBT-DNA一端的3'末端位于插入接合部位附近的一个长度为20个核苷酸的序列，SEQ ID NO:2依次包括10个来自插入序列的LB T-DNA一端3'末端的核苷酸和10个来自于玉米插入位点的LB T-DNA一端侧翼基因组的核苷酸。所述SEQ ID NO:2跨越了插入序列的LB T-DNA一端3'末端的DNA序列和玉米插入位点的LB T-DNA一端侧翼基因组DNA序列，包含所述SEQ IDNO:2或其反向互补序列即可鉴定为转基因玉米事件CAF0327的存在。

本发明的核酸分子进一步包括SEQ ID NO:3或其反向互补序列、和SEQ ID NO:4或其反向互补序列。

本发明所述的SEQ ID NO:3为转基因玉米事件CAF0327中在插入序列RB T-DNA一端的5'末端位于插入接合部位附近的一个长度为1289个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO:3由1001个核苷酸的玉米插入位点的RB T-DNA侧翼基因组DNA序列，即SEQ ID NO:3的核苷酸1-1001，和288个核苷酸的插入序列RB T-DNA一端的5'末端DNA序列，即SEQ ID NO:3的核苷酸1002-1289组成。包含所述SEQ ID NO:3或其反向互补序列即可鉴定为转基因玉米事件CAF0327的存在。

本发明中，所述核酸序列可以为所述SEQ ID NO:3或其反向互补序列中转基因插入序列的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第一核酸序列)，或者为所述SEQ IDNO:3或其反向互补序列中玉米插入位点的RB T-DNA侧翼基因组DNA区域的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第二核酸序列)。所述核酸序列进一步可以为同源于或反向互补于包含完整的所述SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:9反向互补序列的所述SEQ ID NO:3的一部分。当第一核酸序列和第二核酸序列一起使用时，这些核酸序列在产生扩增产物的DNA扩增方法中包括DNA引物对。使用DNA引物对在DNA扩增方法中产生的扩增产物是包括SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:9或其反向互补序列的扩增产物时，可以诊断转基因玉米事件CAF0327或其后代的存在。

类似地，本发明所述的SEQ ID NO:4为转基因玉米事件CAF0327中在插入序列LBT-DNA一端的3'末端位于插入接合部位附近的一个长度为931个核苷酸的序列，所述SEQ IDNO:4由232个核苷酸的插入序列LB T-DNA一端的3'末端DNA序列，即SEQ ID NO:4的核苷酸1-232，和699个核苷酸的玉米插入位点的LB T-DNA侧翼基因组DNA序列，即SEQ ID NO:4的核苷酸233-931组成，包含所述SEQ ID NO:4或其反向互补序列即可鉴定为转基因玉米事件CAF0327的存在。

本发明所述的核酸序列可以为所述SEQ ID NO:4或其反向互补序列中转基因插入序列的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第三核酸序列)，或者为所述SEQ IDNO:4或其反向互补序列中玉米插入位点的LB T-DNA侧翼玉米基因组DNA区域的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第四核酸序列)。所述核酸序列进一步可以为同源于或反向互补于包含完整的所述SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6反向互补序列的所述SEQ ID NO:4的一部分。当第三核酸序列和第四核酸序列一起使用时，这些核酸序列在产生扩增产物的DNA扩增方法中包括DNA引物组。使用DNA引物对在DNA扩增方法中产生的扩增产物是包括SEQID NO:2或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6或其反向互补序列的扩增产物时，可以诊断转基因玉米事件CAF0327或其后代的存在。

本发明所述的核酸分子进一步包括SEQ ID NO:5或其反向互补序列。本发明所述的SEQ ID NO:5为表征转基因玉米事件CAF0327的序列，长度为8673个核苷酸。包含所述SEQID NO:5或其反向互补序列即可鉴定为转基因玉米事件CAF0327的存在。

本发明所述的SEQ ID NO:5序列全长为8673bp，按照玉米插入序列的RB T-DNA侧翼基因组到LB T-DNA侧翼基因组的顺序，也即插入序列中m1Cry1aB-mgcry1F和bar基因的编码顺序，依次包括：1-1001bp为RB T-DNA侧翼玉米基因组；1002-1029bp为RB T-DNArepeat；1670-2106bp为m1Cry1aB-mgcry1F基因启动子CaMV 35S promoter；2120-5848bp为m1Cry1aB-mgcry1F基因编码框；5865-6117bp为m1Cry1aB-mgcry1F基因终止子T-NOSterminator；6440-7117bp为bar基因启动子CaMV 35S promoter(enhanced)；7162-7713bp为bar基因编码框；7720-7894bp为bar基因终止子CaMV poly(A)signal；7971-7974为LB T-DNA repeat；7975-8673bp为LB T-DNA侧翼玉米基因组。

本发明提供的玉米事件CAF0327所特有的连续核苷酸序列可用于表征玉米事件CAF0327，从而可用于检测样品中是否存在玉米事件CAF0327。具体而言，样品中SEQ ID NO:1-5或其反向互补序列中的一者或多者所示的核酸分子的存在表明该样品中存在玉米事件CAF0327。优选地，样品中SEQ ID NO:1或其反向互补序列，和SEQ ID NO:2或其反向互补序列所示的核酸分子的存在表明该样品中存在玉米事件CAF0327。更优选地，样品中SEQ IDNO:3或其反向互补序列，和SEQ ID NO:4或其反向互补序列所示的核酸分子的存在表明该样品中存在玉米事件CAF0327。最优选地，样品中SEQ ID NO:5或其反向互补序列所示的核酸分子的存在表明该样品中存在玉米事件CAF0327。本领域技术人员容易理解的是，与上述方案类似，样品中SEQ ID NO:1或其反向互补序列，和SEQ ID NO:4或其反向互补序列所示的核酸分子的存在也可以表明该样品中存在玉米事件CAF0327，或者样品中SEQ ID NO:2或其反向互补序列，和SEQ ID NO:3或其反向互补序列所示的核酸分子的存在也可以表明该样品中存在玉米事件CAF0327。

本发明还提供了一种用于检测样品中存在玉米事件CAF0327的核酸分子的方法，该方法包括如下步骤：(1)使所述样品与第一引物组和第二引物组接触，并进行核酸扩增反应；(2)检测核酸扩增所得到的扩增子中是否含有SEQ ID NO:1或其反向互补序列，和/或SEQ ID NO:2或其反向互补序列所示的核酸分子；其中所述第一引物组包含引物1F和引物1R，第二引物组包含引物2F和引物2R，并且同时满足下列条件：(1)所述引物1F为SEQ IDNO:3的碱基1-1001中连续的11-30个碱基，优选连续的15-30个碱基，更优选连续的18-27个碱基，并且所述引物1R为SEQ ID NO:3的碱基1002-1289中连续的11-30个碱基，优选连续的15-30个碱基，更优选连续的18-27个碱基的反向互补序列，并且所述第一引物组扩增的扩增子中包含SEQ ID NO:1或其反向互补序列；以及(2)所述引物2F为SEQ ID NO:4的碱基1-232中连续的11-30个碱基，优选连续的15-30个碱基，更优选连续的18-27个碱基，并且所述引物2R为SEQ ID NO:4的碱基233-931中连续的11-30个碱基，优选连续的15-30个碱基，更优选连续的18-27个碱基的反向互补序列，并且所述第二引物组扩增的扩增子中包含SEQID NO:2或其反向互补序列。

进一步地，本发明提供了用于上述方法的引物组，其结构满足上段内容所描述的条件。

引物设计的方法属于本领域技术人员所熟知的技术，例如可以通过Oligo6、BLAST、Primer Premier等工具完成并进行验证。例如通过Elizabeth van Pelt-Verkuil等所著的《Principles and Technical Aspects of PCR Amplification》的第64-74页(Springer Science&Business Media,2008年3月14日)中所介绍的方法完成，该文献公开的内容通过引用并入本文。

因此，本发明也提供了一种扩增子，其包括SEQ ID NO:1-5或其反向互补序列中的一者或多者。优选地，其包括SEQ ID NO:1或其反向互补序列，和/或SEQ ID NO:2或其反向互补序列。

本发明还提供了一种用于检测样品中存在玉米事件CAF0327的核酸分子的方法，所述方法包括：(1)使所述样品与第一探针和第二探针接触；(2)使所述样品和所述第一探针以及第二探针在严格杂交条件下杂交；(3)检测所述样品和所述探针的杂交情况；其中所述第一探针和第二探针的长度均为11-30个核苷酸，所述第一探针包含SEQ ID NO:1或其反向互补序列中任意的11-20个连续核苷酸，并且所述第二探针包含SEQ ID NO:2或其反向互补序列中任意的11-20个连续核苷酸，并且所述第一探针和第二探针各自用至少一种荧光基团标记；优选地，所述第一探针包含SEQ ID NO:1或其反向互补序列，并且所述第二探针包含SEQ ID NO:2或其反向互补序列，并且所述第一探针和第二探针各自用至少一种荧光基团标记。

进一步地，本发明提供了用于上述方法的探针组，该探针组包括如上段所述的第一探针和第二探针，其各自的结构满足上段内容所描述的条件。

本发明所述的严格条件例如可以是在6×SSC(柠檬酸钠)、0.5％SDS(十二烷基硫酸钠)溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜1次。

本发明还提供了一种用于检测样品中存在玉米事件CAF0327的核酸分子的试剂盒，其中该试剂盒包括本发明所述的引物组或者本发明所述的探针。

本发明所述的样品选自：(1)玉米植株的整体或包含玉米遗传物质的任何组成部分，或(2)玉米制品；其中所述包含玉米遗传物质的任何组成部分选自玉米根、玉米茎、玉米叶、玉米雌花、玉米雄花、玉米种子、玉米胚；所述玉米制品为包含玉米成分的食品、化妆品、填充剂或辅料，例如药物辅料，以及由玉米的任何组成部分制备的其他制品。

本发明还提供了一种产生自玉米事件CAF0327的玉米制品，并且所述玉米制品为玉米粉、玉米面、玉米油、玉米淀粉、玉米面筋、玉米饼、含玉米成分的化妆品、填充剂、或含玉米成分的辅料。

另一方面，本发明还提供了一种产生对靶昆虫具有抗性和/或双丙胺磷除草剂耐受性的玉米植株的方法，其特征在于，所述方法包括将玉米事件CAF0327与缺少靶昆虫抗性和/或双丙胺磷除草剂耐受性的玉米植株进行有性杂交，从而产生大量子代植株，选择存在如权利要求1-3任一项所述玉米事件CAF0327的核酸分子的所述子代植株；用靶昆虫侵袭和/或双丙胺磷除草剂处理所述子代植株；选择出对靶昆虫具有抗性和/或双丙胺磷除草剂耐受性的所述子代植株。可以使用前述用于检测样品中存在玉米事件CAF0327的核酸分子的方法选择存在如权利要求1-3任一项所述玉米事件CAF0327的核酸分子的所述子代植株。

本领域技术人员熟知的，第一和第二核酸序列或第三和第四核酸序列不必仅仅由DNA组成，也可包括RNA、DNA和RNA的混合物，或者DNA、RNA或其它不作为一种或多种聚合酶模板的核苷酸或其类似物的组合。此外，本发明中所述探针或引物应该是至少大约11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个连续核苷酸的长度，其可以选自SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16中所述的核苷酸或其反向互补序列。当选自SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5所示的核苷酸或其反向互补序列时，所述引物可以为长度是至少大约21个到大约50个或更多的连续核苷酸。

本发明还提供了一种保护玉米植物免于昆虫侵袭的方法，其特征在于，包括在靶昆虫的膳食中提供至少一种转基因玉米植物细胞，所述转基因玉米植物细胞来自玉米事件CAF0327，或在该玉米植物细胞的基因组中依次包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5第1670-7894位核酸序列和SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:2的反向互补序列、SEQ ID NO:5第1670-7894位核酸序列的反向互补序列和SEQ ID NO:1的反向互补序列；优选地，所述转基因玉米植物细胞的基因组中包含SEQ ID NO:5或其反向互补序列，摄食所述转基因玉米植物细胞的靶昆虫被抑制进一步摄食所述玉米植物。

本发明通过将杀虫效果最好的Cry1Ab和Cry1F两个单基因进行融合设计改进，强强联合，改造合成的融合基因m1Cry1ab-mgCry1F具有显著增强的抗虫性表现，能够使得玉米植株抗性强度明显提升，抗虫谱拓宽，避免抗性害虫的产生，在玉米生产上具有节本增效、稳产高产的重大生产价值和经济价值和广阔的产业化前景。

本发明的玉米事件CAF0327及含有该事件的玉米植物相对于现有技术具有明显的优势：1)不同世代的转基因材料抗虫性方面，经过连续三代分析，目的基因整合及遗传、目的基因表达、目标性状在不同世代间均表现非常稳定；经过检测定位，可发现该融合基因稳定存在于玉米事件CAF0327的第6号染色体并成功表达；2)目的基因m1Cry1Ab-mgCry1F的目标蛋白在玉米叶片、花丝、穗部等器官表达量非常强；3)该玉米事件在全生育期抗玉米螟效果极好，均表现为高抗性。

附图说明

图1为pCAMBIA3300+35S-m1Cry1Ab-mgCry1F载体结构示意图。

图2为异源基因插入玉米基因组后插入位点的结构示意图，其中示意性的标注了本发明中SEQ ID NO:1-5的序列的相对位置。

图3为TAIL-PCR扩增产物的电泳图。

图4为CAF0327玉米转化体叶片免疫试纸条检测图；其中，CK为非转基因植株对照；1、2和3为转化体，即转基因植株。

4-a：为T₀代CAF0327玉米转化体叶片目的蛋白Cry1Ab的免疫学检测；

4-b：为T₀代CAF0327玉米转化体叶片目的蛋白Cry1F的免疫学检测；

4-c：为T₀代CAF0327玉米转化体叶片目的蛋白筛选标记蛋白bar的免疫学检测。

图5为CAF0327玉米转化体苗期叶片抗虫性室内生测鉴定；其中1、3和5为转化体，即转基因植株，2、4和6为非转基因植株对照。

5-a：为CAF0327玉米转化体苗期叶片对亚洲玉米螟抗虫性室内生测鉴定；

5-b：为CAF0327玉米转化体苗期叶片对草地贪夜蛾抗虫性室内生测鉴定。

图6为CAF0327玉米转化体花丝抗虫性室内生测鉴定。

6-a：为CAF0327玉米转化体田间花丝对亚洲玉米螟抗虫性室内生测鉴定；

6-b：为CAF0327玉米转化体田间花丝对草地贪夜蛾抗虫性室内生测鉴定。

图7为CAF0327玉米转化T₃代体叶片田间抗虫性鉴定；其中左侧为非转基因植株对照，右侧为转化体，即转基因植株。

7-a：为CAF0327转化体T₃代叶片人工接种亚洲玉米螟田间抗虫性鉴定：

7-b：为CAF0327转化体T₃代叶片人工接种草地贪夜蛾田间抗性鉴定。

图8为CAF0327玉米转化体茎秆田间抗虫性鉴定，

8-a：为CAF0327玉米转化体茎秆人工接种亚洲玉米螟田间抗性鉴定；

8-b：为CAF0327玉米转化体茎秆人工接种草地贪夜蛾田间抗性鉴定。

图9为CAF0327玉米转化体果穗田间抗虫性鉴定。

9-a：为CAF0327转化体果穗人工接种对亚洲玉米螟田间抗虫性鉴定；9-b：为CAF0327转化体果穗人工接种对草地贪夜蛾田间抗虫性鉴定。

具体实施方式

以下将参照附图更完整地描述本发明，其中显示了本发明部分但并非全部的实施方案。实际上，可以以许多不同的形式实施本发明，而不应当理解为限制至本文所列出的实施方案。下列定义和方法将更好地定义本发明并且指导本领域的普通技术人员实施本发明。本发明所属领域的技术人员可根据本文的描述和相关附图中的信息的教导提出的本发明的许多修改和其它实施方案。因此，应当理解，本发明不限于所公开的特定实施方案，基于本发明的教导所提出的修改方案和其它实施方案也包括在所附权利要求的范围之内。

除非另作说明，此处所使用的术语应根据相关领域的普通技术人员的常规用法来理解。

如本文所用，术语“玉米”指玉蜀黍(Zea mays)并且包括可以用玉米培育的所有植物品种，包含野生玉蜀黍种类。

如本文所用，术语“包含”与“包括”、“含有”、“含”同义，并且均意味着“包括但不限于”。

如本文所用，术语“事件”(event)与“转化体”在本文中可互换使用，均指通过用异源DNA(例如，包括相关基因的表达盒)转化和再生植物细胞或组织而产生的重组植物。术语“事件”是指包含异源DNA的原始转化体和/或该转化体的子代。术语“事件”也指在转化体与另一玉米系之间通过有性异型杂交而产生的子代。即使在重复与回归亲本回交后，来自该转化的亲本的插入DNA和侧翼DNA存在于在该杂交子代的同样的染色体位置。术语“事件”也指来自原始转化体的DNA，包含该插入DNA以及直接邻近该插入DNA的侧翼基因组序列，其预期将被转移至子代中，该子代作为包含该插入DNA(例如，该原始转化体及由自交产生的子代)的亲本品系与不含该插入DNA的亲本品系的有性杂交的结果而接收了包含相关转基因的插入DNA。通常，植物组织的转化产生多个事件，每个事件代表DNA构建体插入至植物细胞的基因组的不同位置上。基于该转基因的表达或其他希望的特征，选择特定的事件。因此，“事件CAF0327”、“CAF0327”或者“CAF0327事件”可以互换地使用。

术语“转基因”包括任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，以上的基因型由于异源核酸的存在而改变，所述“转基因”包括最初被这样改变的转基因体以及由最初的转基因体通过有性杂交或无性繁殖生成的子代个体。在本发明中，术语“转基因”不包括通过常规植物育种方法或天然发生事件的基因组的(染色体的或染色体外的)改变，所述天然发生事件例如随机异体受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变。

本发明中“异源的”(在本文中可与“外源的”互换使用)是指自然界中第一分子通常不被发现与第二分子组合。例如，分子可以源自第一物种并插入到第二物种的基因组中。因此这种分子对于宿主是异源的并被人工引入宿主细胞的基因组中。

“侧翼DNA”可以包含天然存在于例如植物的生物体中的基因组或通过转化过程引入的异源DNA(在本文中可与“外源DNA”互换使用)，例如与转化事件相关的片段。因此，侧翼DNA可以包括天然和外源DNA的组合。在本发明中，“侧翼区”或“侧翼序列”或“基因组边界区”或“基因组边界序列”是指至少3、5、10、11、15、20、50、100、200、300、400、1000、1500、2000、2500或5000碱基对或更长的序列，其位于最初外源插入DNA分子的直接上游或下游并且与最初外源插入DNA分子相邻。

引起外源DNA的随机整合的转化程序会导致含有不同侧翼区的转化体，所述不同侧翼区是每个转化体所特异性含有的。当重组DNA通过传统杂交被引入植物时，其侧翼区通常不会改变。转化体也会含有异源插入物DNA和基因组DNA的段之间或两段基因组DNA之间或两段异源DNA之间的独特的接合。“接合”是两个具体的DNA片段连接的点。例如，接合存在于插入DNA连接侧翼DNA的位置。接合点还存在于转化的生物体中，其中两个DNA片段以修饰自天然生物体中发现的方式连接在一起。“接合DNA”是指包含接合点的DNA。

术语“探针”是一段分离的核酸分子，其上面结合有常规的可检测标记或报告分子，例如，放射性同位素、配体、化学发光剂或酶类，优选为荧光基团。这种探针与目标核酸的一条链是互补的，在本发明中，探针与来自转基因玉米事件CAF0327基因组的一条DNA链互补，不论该基因组DNA是来自转基因玉米事件CAF0327或种子还是来源于转基因玉米事件CAF0327的植物或种子或提取物。本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，还包括特异性地与目标DNA序列结合并可用于检测该目标DNA序列的存在的聚酰胺及其他探针材料。

术语“引物”是一段分离的核酸分子，其通过核酸杂交，退火结合到互补的目标DNA链上，在引物和目标DNA链之间形成杂合体，然后在聚合酶(例如DNA聚合酶)的作用下，沿目标DNA链延伸。本发明的引物对涉及其在目标核酸序列扩增中的应用，例如，通过聚合酶链式反应(PCR)或其他常规的核酸扩增方法。

探针和引物的长度一般是11个多核苷酸或更多，优选的是15个多核苷酸或更多，优选的是18个多核苷酸或更多，更优选的是24个多核苷酸或更多，最优选的是30个多核苷酸或更多。这种探针和引物在高度严格杂交条件下与目标序列特异性地杂交。尽管不同于目标DNA序列且对目标DNA序列保持杂交能力的探针是可以通过常规方法设计出来的，但是，优选的，本发明中的探针和引物与目标序列的连续核酸具有完全的DNA序列同一性。

基于本发明的侧翼基因组DNA和插入序列的引物和探针可以通过常规方法确定，例如，通过从来源于转基因玉米事件CAF0327的植物材料中分离相应的DNA分子，并确定该DNA分子的核酸序列。所述DNA分子包含转基因插入序列和玉米基因组侧翼区域，所述DNA分子的片段可以用作引物或探针。

热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR，简称TAIL-PCR)是一种建立在PCR反应基础上，用来分离与已知序列邻近的未知DNA序列的分子生物学技术。该技术以基因组DNA为模板，使用高退火温度的长特异性引物和短的低退火温度的简并引物，通过特殊的热不对称(高严谨性PCR和低严谨性PCR)循环程序，有效扩增特异产物。该方法已被研究者广泛应用，成为分子生物学研究中常用的克隆基因侧翼序列的技术，其原理为：以基因组DNA作为模板，利用依照目标序列旁的已知序列设计的3个较高退火温度的嵌套特异性引物(special primer，SP)和一个较短且Tm值较低的随机简并(arbitrary degenerate，AD)引物组合，通过3轮具热不对称的温度循环的分级反应来进行PCR扩增，获得已知序列的侧翼序列。

如本发明使用的，“经过扩增的DNA”或“扩增子”是指作为核酸模板一部分的目标核酸序列的核酸扩增产物。例如，为了确定玉米植物是否由含有本发明转基因玉米事件CAF0327通过有性杂交方式产生，或采集自田地的玉米样品是否包含转基因玉米事件CAF0327，或玉米提取物，例如粗粉、粉或油是否包含转基因玉米事件CAF0327，从玉米植物组织样品或提取物提取的DNA可以通过使用引物对的核酸扩增方法以产生对于转基因玉米事件CAF0327的DNA的存在是诊断性的扩增子。所述引物对包括一个来源于植物基因组中与插入的外源DNA插入位点相邻的侧翼序列的第一引物，和来源于插入的外源DNA的第二引物。扩增子具有一定长度和序列，所述序列对所述转基因玉米事件CAF0327也是诊断性的。扩增子的长度范围可以是引物对的结合长度加上一个核苷酸碱基对，优选加上约五十个核苷酸碱基对，更优选加上约两百五十个核苷酸碱基对，最优选加上约四百五十个核苷酸碱基对或更多。

目的基因m1Cry1Ab-mgCry1F已记载在申请人的专利申请CN202310781118.1中，可以显著提高杀虫蛋白的表达量，能够在玉米中稳定表达；大大增强了转化作物的抗虫、杀虫效果，扩大了杀虫谱，获得除抗螟虫外兼抗其他鳞翅目害虫或鞘翅目害虫，如草地贪夜蛾、粘虫、地老虎等的抗虫转基因玉米新品种。

目的基因Bar的CDS区为570bp，可编码一个含189个氨基酸的蛋白。该基因来源于吸水链霉菌(Streptomyces Hygroscopicus)，它编码草铵膦乙酰转移酶PAT(phosphinothricin acetyltransferase)，PAT通过催化乙酰辅酶A与草铵膦游离氨基结合，使草铵膦失去活性。

DNA构建体是DNA分子互相连接起来的组合，该组合提供了一个或多个表达盒。DNA构建体优选地是能够在细菌细胞内自我复制，而且含有不同的限制性内切酶位点的质粒，所含的限制性内切酶位点用于导入提供功能性基因元件，即启动子、内含子、前导序列、编码序列、3'终止子区域和其他序列的DNA分子。DNA构建体中所含有的表达盒包括提供信使RNA的转录所必需的基因元件，所述表达盒可以设计为在原核细胞或真核细胞中表达。本发明的表达盒被设计为最优选地在植物细胞内表达。

以下通过具体实施例进一步说明本发明的技术方案。

实施例1pCAMBIA3300+35S-m1Cry1Ab-mgCry1F表达载体以及农杆菌重组表达菌的构建

采用标准基因克隆技术，构建重组表达载体(如图1所示)。具体步骤如下：

步骤1：将人工改造合成的抗虫基因m1Cry1Ab-mgCry1F设计XbaI、SacI酶切位点(5'端加XbaI酶切位点、3'端加SacI酶切位点)(由生工生物工程(上海)公司合成)，其中所述的抗虫基因采用专利申请CN202310781118.1中记载的人工合成Bt抗虫基因m1Cry1Ab-mgCry1F，核苷酸序列如CN202310781118.1中记载的SEQ ID NO:6所示，该专列申请文件通过引用视为全部并入本文。

步骤2：用XbaI和SacI双酶切合成m1Cry1Ab-mgCry1F基因，然后回收载体片段，连入用同样的限制酶(XbaI、SacI)双酶切的用于遗传转化的高效植物表达载体pCAMBIA3300+35S+MCS+TNos+35S+bar+Nos PolyA上，形成pCAMBIA3300+35S+m1Cry1Ab-mgCry1F+TNos+35S+bar+Nos PolyA，称为pCAMBIA3300+35S-m1Cry1Ab-mgCry1F。其中，pCAMBIA3300作为基础载体，其T-DNA来源于Ti质粒pti37的T-DNA区，但已去除了致瘤基因和与T-DNA转移无关的序列，只保留了T-DNA转移所必须的右边界序列(RB)和左边界序列(LB)。pCAMBIA3300+35S-m1Cry1Ab-mgCry1F为用于遗传转化的表达载体，其在pCAMBIA3300质粒基础上构建并包含两个串联转基因表达盒：目的基因m1Cry1Ab-mgCry1F基因表达盒(CaMV35S启动子-M1Cry1ab-mg Cry1F基因-“T-Nos”)，以及标记基因bar基因表达盒(CaMV35S启动子-bar基因-CaMV poly(A))。T-DNA以外的质粒骨架包括质粒在大肠杆菌中复制和保持的复制起点OR-ori和质粒骨架序列等没有被整合入基因组。

步骤3：重组质粒pCAMBIA3300+35S-m1Cry1Ab-mgCry1F经过XbaI和SacI双酶切验证后转化至农杆菌EHA105中，筛选阳性菌株，得m1Cry1Ab-mgCry1F基因的重组表达菌，低温保藏，用于后续试验。

实施例2采用农杆菌侵染法进行玉米植物的转化

采用农杆菌侵染法将插入序列导入受体植株的幼胚，经除草剂双丙胺磷筛选后获得转基因植株。具体方法如下：

步骤1：剥离玉米幼胚：去除苞叶。切除果穗顶端约1cm左右，用镊子从顶端插入果穗，这样可以以镊子当作把手，有利于操作，然后把果穗放入含有消毒液的烧杯里，根据实际需要，在同一个烧杯里放4-6个果穗；向烧杯里加约700mL的消毒液(50％的漂白剂或5.25％的次氯酸钠，并加入一滴Tween20)用来浸泡果穗，在消毒20分钟过程当中，不时旋转果穗同时轻轻拍打烧杯以驱除籽粒表面的气泡，从而达到最佳的消毒效果，消毒结束后，取出果穗并放入盛满灭菌水的烧杯里，在水里洗3次，然后准备剥胚；把消毒过果穗的一端放在一个大的培养皿上，用大的手术刀削掉籽粒的顶部(1.5-1.8mm)，在这过程当中，要勤消毒所用的工具，如：手术刀片、培养皿、剥胚刀等；用剥胚刀的刀尖插在胚和胚乳之间，然后轻轻向上撬出幼胚，用小的手术刀尖轻轻托起幼胚，确保幼胚不受到任何的损伤，把幼胚的胚轴面紧贴放有滤纸的N6E培养基，胚的密度大约是2×2cm(30个/皿)；封口膜封住培养皿，28℃暗培养2-3天。

步骤2：农杆菌浸染：取实施例1中构建的重组农杆菌在YEP(含Kan50mg/L和Str100mg/L抗生素)培养基上提前一周培养，并在4℃冰箱保存一个月左右，长期保存要在-80℃甘油保存；农杆菌在YEP培养基上在19℃培养3天，同时加Kan(50mg/L)，Str(50mg/L)；3天后，挑取农杆菌放入含有5mL浸染培养基的50mL离心管中，同时加100μL MAS(inf+AS)，在室温(25℃)转速75rpm摇菌2-4个小时；浸染幼胚，把刚剥离的幼胚放入含有inf+AS液体培养基(2mL)的离心管中，每管约20-100个幼胚，用这样的培养基洗涤2次，然后加入1-1.5mL特定浓度(OD₅₅₀＝0.3-0.4)的农杆菌，轻轻颠倒离心管20次，然后直立放置在暗箱里5分钟，确保幼胚全部浸泡在农杆菌液体里，整个过程避免旋涡振荡。

步骤3：共培养：浸染后，把浸染过的幼胚转移到共培养培养基(co-cultivationmedium)，使幼胚的胚轴接触培养基表面，同时驱除培养基表面多余的农杆菌；用封口膜封住培养皿，在20℃条件下暗培养3天。

步骤4：静息：共培养3天后，把幼胚转移到静息培养基上面，同时用封口膜封住培养皿，放在28℃条件下暗培养7天。

步骤5：选择：7天后，把所有的幼胚转移到选择培养基上面(35个每皿)，培养两周，选择培养基含有双丙胺磷1.5mg/L，两周后再进行亚培养，双丙胺磷的浓度可以上升到3mg/L，浸染大约5周左右，含有转化子的细胞会长成可以看见的II型愈伤。

步骤6：转基因植株的再生：在再生培养基I上面长3周，然后在再生培养基II上面发芽(在光照培养室)；待再生苗生长出3-4片叶时，将其转移到温室，并进行检查，阳性植株保留，待其生长至吐丝散粉期时，对其进行授粉。

实施例3转基因事件的鉴定和筛选

共计获得的独立转化事件256个。在温室下对各个转化体的表达量进行检测，从中筛选叶片、茎秆、花丝、果穗中m1Cry1Ab-mgCry1F杀虫毒蛋白均高表达的8个转化体，同时将这些转化体通过同季回交和自交快速转育到郑单958的亲本自交郑58和昌7-2中，并对其后代进行遗传稳定性检测，包括三代DNA水平、蛋白水平检测。根据目的基因的拷贝数、良好的昆虫抗性、双丙胺磷除草剂耐受性、以及农艺性状表现，最终选定事件CAF0327是优异的，其具有单拷贝转基因、良好的遗传稳定性、高抗亚洲玉米螟、双丙胺磷除草剂耐受性、对非靶标生物无影响，以及具有良好的农艺性状表现。

实施例4通过Southern杂交检测外源插入片段整合进植物基因组的拷贝数

通过Southern杂交对目标基因m1Cry1Ab-mgCry1F、选择标记基因bar进行拷贝数分析。根据Southern杂交分析确定了玉米转化体CAF0327株系中插入序列均为单拷贝。实验材料为转基因玉米CAF0327，同时以郑58鲜嫩叶片作为阴性对照。

采用CTAB法提取玉米转化体CAF0327和相应对照玉米基因组DNA，考虑到T-DNA插入序列含有限制性内切酶KpnI和HindIII的一个酶切位点，而另一位点在插入序列旁侧的玉米基因组中。本研究分别使用KpnI和HindIII限制性内切酶消化各个转化体基因组DNA，通过彻底酶切和电泳、转膜、分子杂交、呈色反应而准确确定插入基因拷贝数；用m1Cry1Ab-mgCry1F的基因内部引物扩增转化体玉米基因组DNA，将扩增得到的阳性PCR产物制成m1Cry1Ab-mgCry1F探针；将阳性植株用HindIII、KpnI分别进行单酶切，电泳后转移至尼龙膜上，利用地高辛(罗氏地高辛II(发光))标记转化体目标基因m1Cry1ab-mg Cry1F，进行Southern杂交检测。同理，用bar基因内部引物扩增玉米基因组DNA，将扩增得到的阳性PCR产物制成bar探针；酶切后的DNA片段电泳后转移至尼龙膜，利用地高辛(罗氏地高辛II(发光))标记转化体标记基因bar，然后进行杂交检测。其中探针的制备是利用Roche公司生产的引物试剂盒进行标记，方法参照Roche公司的使用说明书。为了证明插入片段的稳定性，选择了玉米转化体CAF0327高世代植株T₂、T₃、T₄三个世代进行了Southern印迹杂交分析。

结果显示，转化体CAF0327三个世代的Southern杂交均有杂交信号，且均只有一个杂交条带，对照非转基因植株没有显示出杂交信号。证明外源基因m1Cry1Ab-mgCry1F和bar已稳定地整合到玉米基因组中，且都是单拷贝插入。

实施例5转基因玉米事件CAF0327的检测

5.1基因组DNA的提取

按照如下方法提取DNA：(1)取CTAB溶液，预先65℃水浴；(2)取约0.1g新鲜玉米叶片，剪成碎块，放在预冷的研钵当中，在液氮中迅速研磨成粉末状并立即转入预冷的2mL EP管中(一般不超过1/2管体积)；(3)迅速向EP管中加入0.8mL 65℃温浴的CTAB缓冲液，轻轻摇荡均匀，65℃水浴30min，并不时轻摇；(4)放置于通风橱约15min，冷却至室温；(5)加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，混匀，轻微振荡15min；(6)室温下，12000rpm离心8min；(7)吸取上清液至新的1.5mL EP管；(8)加入等体积预冷的异丙醇(4℃预冷)；(9)室温下，12000rpm离心8min；(10)弃上清，用力加入75％乙醇1mL，混匀，弃上清(乙醇沉淀)；(11)在通风橱放置直至乙醇完全挥发(1～2h)；(12)用300μL的TE Buffer溶解DNA，4℃过夜备用。

5.2侧翼DNA序列的分析及外源T-DNA在玉米基因组的插入位点确定。

采用TAIL-PCR的方法克隆异源基因侧翼DNA序列并进行测序。其中所采用的特异性引物和通用引物如表1所示。其中GW060-LB-F1、

GW060-LB-F2、GW060-LB-F3为测定LB T-DNA侧翼的特异性引物，GW060-RB-R5、GW060-RB-R6、GW060-RB-R7为测定RB T-DNA侧翼的特异性引物，AC1为通用引物。

表1TAIL-PCR中所采用的引物

采用实施例5.1中提取的基因组DNA，按照表2中的反应体系和表3中的循环条件进行PCR反应。

表2TAIL-PCR的反应体系

表3 TAIL-PCR的循环条件

产物的电泳图如图3所示，其中1为1-RB扩增结果；2为5-RB扩增结果；3为7-RB扩增结果；4为11-RB扩增结果；5为13-RB扩增结果；6为MA5-RB扩增结果；7为MA6-RB扩增结果；8为MA7-RB扩增结果；9为MA8-RB扩增结果；10为1-LB扩增结果；11为2-LB扩增结果；12为5-LB扩增结果；13为7-LB扩增结果；14为8-LB扩增结果；15为9-LB扩增结果；16为10-LB扩增结果；17为11-LB扩增结果；18为12-LB扩增结果；19为14-LB扩增结果；20为15-LB扩增结果；21为16-LB扩增结果；22为17-LB扩增结果；23为18-LB扩增结果；24为19-LB扩增结果；25为21-LB扩增结果；26为22-LB扩增结果；27为MA1-LB扩增结果；28为MA3-LB扩增结果；29为MA6-LB扩增结果。

连接产物转化：制备感受态细胞(SK2301)，转化步骤如下：1)100μl感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮。2)加入10μl连接液，轻轻混匀。冰上放置30分钟。3)42℃水浴热激60秒。冰上放置10～15分钟。4)加400μL LB培养基，37℃200～250rpm振荡培养1小时。5)室温下4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉400μL上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮。6)将细菌涂布在预先用20μL 100mM IPTG和100μl 20mg/ml X-gal涂布的氨苄青霉素平板上，倒置培养过夜。

菌落PCR及测序：以pMD18-T载体上的通用引物进行PCR，并对PCR产物进行克隆测序。

利用TAIL-PCR和同源比对方法，确定了外源T-DNA序列在玉米基因组中的插入位置。利用T-DNA左边界(即LB-T DNA一侧)的三对特异引物和简并引物进行PCR，将PCR产物进行测序，得到了左边界的侧翼序列。再根据插入位点上下游基因组序列与T-DNA左右边界序列设计引物，进行PCR扩增，对扩增产物测序验证。将得到的基因组序列在MaizeGDB数据库(https://www.maizegdb.org/blast)中用BLASTN工具将侧翼序列与玉米基因组序列(以B73为参考序列)进行同源比对分析，分析表明，外源序列T-DNA插入位点的RB-T DNA侧翼玉米基因组DNA序列1001bp，同源对比，位于Zea mays cultivar B73 chromosome 6:94001290-94002290bp；外源T-DNA序列6973bp插入位点为chromosome6:94002290-94002291bp之间；外源序列T-DNA插入位点的LB-T DNA侧翼玉米基因组DNA序列699bp，同源对比，位于Zea mays cultivar B73chromosome 6:94002291-94002989bp。

经鉴定，玉米事件CAF0327作为异源基因插入玉米基因组后的RB-TDNA侧翼序列以及与其接合的部分异源基因序列如SEQ ID NO:3所示，玉米事件CAF0327作为异源基因插入玉米基因组后的LB-T DNA侧翼序列以及与其接合的部分异源基因序列如SEQ ID NO:4所示，玉米事件CAF0327作为异源基因插入玉米基因组后整个T-DNA序列以及两侧翼玉米基因组序列的序列如SEQ ID NO:5所示。

本发明所述的SEQ ID NO:5序列全长为8673bp，按照插入位点的玉米基因组5’到3’序列顺序，也即插入序列中m1Cry1aB-mgcry1F和bar基因的编码顺序，依次包括：1-1001bp为插入序列RB T-DNA侧翼玉米基因组；1002-1029bp为RB T-DNA repeat；1670-2106bp为m1Cry1aB-mgcry1F基因启动子CaMV 35S promoter；2120-5848bp为m1Cry1aB-mgcry1F基因编码框；5865-6117bp为m1Cry1aB-mgcry1F基因终止子T-NOS terminator；6440-7117bp为bar基因启动子CaMV 35S promoter(enhanced)；7162-7713bp为bar基因编码框；7720-7894bp为bar基因终止子CaMV poly(A)signal；7971-7974为LB T-DNA repeat；7975-8673bp为插入序列LB T-DNA侧翼玉米基因组。

实施例6利用免疫试纸测试插入序列表达蛋白的稳定性

对转基因材料CAF0327从T2～T4代三个世代叶片中抗虫蛋白m1Cry1Ab-mgCry1F和抗除草剂草铵膦蛋白PAT的表达进行了鉴定，以验证玉米转化体CAF0327多世代间两种蛋白表达的稳定性。

同时利用Bt-Cry1Ab/Ac、Bt-Cry1F两种免疫试纸条对融合基因的抗虫蛋白m1Cry1Ab-mgCry1F对同1个转化体连续三个世代的植物个体进行测试。用抗除草剂草铵膦蛋白PAT免疫试纸条对同1个转化体连续三个世代的植物个体进行测试。

从图4可以看出：利用Bt-Cry1Ab/Ac、Bt-Cry1F、PAT共3种免疫试纸条对玉米转化体CAF0327中抗虫蛋白m1Cry1Ab-mgCry1F和选择标记PAT的表达进行连续三代检测。评估抗虫基因m1Cry1Ab-mgCry1F和选择标记蛋白PAT编码基因bar的遗传稳定性和表达稳定性。用抗虫蛋白m1Cry1Ab-mgCry1F和选择标记蛋白PAT试纸条进行检测，玉米转化体CAF0327连续三代植株均在质控线的下方很快出现红色的检测线，而相应的对照非转基因植株仅出现一条红色质控线。

检测结果表明：M1Cry1Ab-mgCry1F和bar基因的目的蛋白在玉米转化体CAF0327连续三代的各1个单株均有高水平表达，在世代之间表现高度稳定性，而对照非转基因植株未表达。结果证明外源基因m1Cry1Ab-mgCry1F和bar已整合到玉米基因组，并稳定表达(图4)。

实施例7转化体目标性状抗虫性鉴定

分别鉴定转m1Cry1Ab-mgCry1F抗虫基因转化体玉米叶片、花丝、茎秆及果穗对亚洲玉米螟、草地贪夜蛾抗性鉴定。转基因玉米抗虫目标性状表现的遗传稳定性通过测定不同世代的抗虫能力进行了评估。结果显示不同世代的转基因玉米的抗虫水平能力稳定，说明转基因玉米中外源基因目标性状表现稳定。分别对T₁、T₂、T₃玉米转化体CAF0327的叶片、花丝、茎秆和穗部抗虫目标性状进行了鉴定和稳定性分析，结果表明，转基因材料都表现出高抗亚洲玉米螟虫和草地贪夜蛾抗性，表现出免疫级别高抗水平，而常规对照玉米没有抗虫能力，玉米转化体CAF0327的抗虫能力在叶片、花丝、茎秆、穗部等在不同世代稳定遗传。参照农业农村部953号公告-10.1-2007进行测定。

7.1.CAF0327玉米转化体苗期叶片抗虫性室内生测鉴定

(1)玉米苗期叶片对亚洲玉米螟抗性室内生测鉴定,

取转化体植株幼苗生长至5～8叶期玉米植株地上部分带回室内，取未展开的幼嫩心叶，用消毒剪刀剪成2～3cm大小，放在24孔细胞培养板中，每孔接3头初孵幼虫。观察玉米苗期叶片分别在亚洲玉米螟接虫0、12、24小时后3个时间段叶片被幼虫取食情况，结果如图5-a所示，CAF0327玉米转化体叶片没有被取食，叶片基本完好，抗虫性特别强。而非转基因玉米苗期叶片对亚洲玉米螟没有抗虫性，在24小时叶片被幼虫取食干净。转化体CAF0327表现为高抗，达到免疫级别。

(2)玉米苗期叶片对草地贪夜蛾抗性室内生测鉴定

取转化体植株幼苗生长至5～8叶期玉米植株地上部分带回室内，取未展开的幼嫩心叶，用消毒剪刀剪成2～3cm大小，放在24孔细胞培养板中，每孔接3头初孵幼虫。观察玉米苗期叶片分别在接虫草地贪夜蛾0、12、24小时后3个时间段叶片被幼虫取食情况，结果如图5-b所示，转化体CAF0327叶片没有被取食，叶片基本完好，抗虫性特别强。而非转基因玉米苗期叶片对草地贪夜蛾没有抗虫性，在24小时叶片被幼虫取食干净。转化体CAF0327表现为高抗，达到免疫级别。

7.2.CAF0327玉米转化体花丝抗虫性室内生测鉴定

分别检测CAF0327转化体和非转基因玉米花丝对亚洲玉米螟和草地贪夜蛾的抗性，在接虫0天、3天、5天后3个时间段观察花丝被幼虫取食情况。

T₁-T₃三个连续世代花丝抗虫鉴定结果表明：非转基因对照玉米(郑58)，玉米螟或草地贪夜蛾生长状态良好，花丝到第4天或第5天已全部吃光，只剩深褐色的粪便和废屑，花丝虫食严重，表现为感虫；而转基因玉米CAF0327三代转化体的花丝没有被取食，接虫3天以后玉米螟或草地贪夜蛾死亡率在80％以上，5天以后大部分转基因玉米花丝上玉米螟或草地贪夜蛾死亡率达到100％，花丝抗虫效果明显，均达到免疫的高抗水平，转基因玉米的花丝抗虫能力在不同世代稳定遗传。

室内花丝玉米螟抗虫鉴定结果显示：非转基因对照材料郑58花丝没有抗性，虫食严重，在第5天花丝基本被幼虫取食干净，表现为高感；而转化体CAF0327花丝未被取食，花丝基本完好，抗虫效果明显，均达到免疫高抗水平，抗虫性特别强，结果如图6-a所示。

室内花丝草地贪夜蛾抗虫鉴定结果显示：非转基因对照材料郑58花丝虫食严重，在第5天花丝基本被幼虫取食干净，表现为高感；而转化体CAF0327花丝基本完好，抗虫效果明显，达到高抗水平，抗虫性表现稳定，结果如图6-b所示。

7.3.CAF0327玉米转化体T₁、T₂、T₃叶片人工接种亚洲玉米螟田间抗性鉴定

分别对CAF0327转化体和非转基因玉米叶片田间人工接种亚洲玉米螟和草地贪夜蛾抗性鉴定，在玉米6-7片叶接虫30头2龄幼虫，10天后观察田间危害情况。

T₁、T₂、T₃三个连续世代叶片抗虫鉴定结果表明：非转基因对照材料郑58虫食严重，转化体CAF0327抗虫效果显著，进一步对该转化体进行抗虫性比较，分析转化体CAF0327及其相应对照食叶级别和虫害级别，并对转化体抗虫性进行抗性评价，分析结果如下表4、表5所示：对照材料郑58的虫害级别达到7级，其食叶级别在0.05水平上显著高于相应的转基因材料，转基因玉米的叶片抗虫能力均达到高抗水平，在不同世代稳定遗传。表4CAF0327转化体T1、T2、T3三个连续世代叶片对亚洲玉米螟田间抗性鉴定

表中不同小写字母间5％水平上差异显著，表中数值为Mean±SE。

CAF0327转化体T₁-T₃代叶片人工接种亚洲玉米螟田间抗性鉴定：非转基因对照材料郑58虫食严重，虫害级别达到7-9级，其食叶级别在0.05水平上显著高于相应的转基因材料，转化体CAF0327抗虫效果显著，基本没有危害，转基因玉米的叶片抗虫能力均达到免疫级别的高抗水平，田间抗虫性表现稳定，结果如图7-a所示。

表5 CAF0327转化体三个连续世代叶片对草地贪夜蛾田间抗性鉴定

CAF0327转化体T₃代叶片人工接种草地贪夜蛾田间抗性鉴定：非转基因对照材料郑58虫食严重，虫害级别达到7-9级，其食叶级别在0.05水平上显著高于相应的转基因材料，转化体CAF0327抗虫效果显著，基本没有危害，转基因玉米的叶片抗虫能力均达到免疫级别的高抗水平，田间抗虫性表现稳定，结果如上表5和图7-b所示。

7.4.CAF0327玉米转化体T₁、T₂、T₃茎秆和穗部田间抗性鉴定

T₁-T₃三个连续世代茎秆和穗部抗虫鉴定结果表明：郑58非转基因对照材料茎杆和果穗虫食严重，表现为高感；而转化体CAF0327抗虫性明显高于对照材料，蛀虫数、虫蛀隧道长度及活虫数量均在0.05水平上显著低于对照材料，果穗及茎杆危害程度也均小于对照材料，抗虫效果明显，均达到免疫级别高抗水平，转基因玉米的茎秆和穗部抗虫能力在不同世代稳定遗传，参照农业农村部953号公告-10.1-2007进行鉴定。

7.4.1CAF0327转化体T₁-T₃三个连续世代茎秆田间抗性鉴定

(1)CAF0327转化体茎秆对亚洲玉米螟田间抗性鉴定

表6CAF0327转化体茎秆对亚洲玉米螟抗虫性田间抗性鉴定

CAF0327玉米转化体茎秆人工接种亚洲玉米螟田间抗性鉴定，转化体CAF0327，抗虫性明显高于对照材料，蛀虫数、虫蛀隧道长度及活虫数量均在0.05水平上显著低于对照材料，茎秆无虫蛀现象，能够正常结穗结实。抗虫性达到免疫级别高抗水平。转基因玉米的茎秆和穗部抗虫能力在不同世代稳定遗传。郑58非转基因对照材料茎杆虫食严重，茎秆被虫蛀发黑腐烂，不能成穗，表现为极高感。结果如上表6和图8-a所示。

(2)CAF0327转化体茎秆对草地贪夜蛾田间抗性鉴定

表7CAF0327转化体茎秆对草地贪夜蛾田间抗性鉴定

CAF0327玉米转化体茎秆人工接种草地贪夜蛾田间抗性鉴定，转化体CAF0327，抗虫性明显高于对照材料，蛀虫数、虫蛀隧道长度及活虫数量均在0.05水平上显著低于对照材料，茎秆无虫蛀现象，能够正常结穗结实。抗虫性达到免疫级别高抗水平。转基因玉米的茎秆抗虫能力在不同世代稳定遗传。郑58非转基因对照材料茎杆虫食严重，茎秆被虫蛀发黑腐烂，不能成穗，表现为极高感。结果如上表7和图8-b所示。

7.4.2CAF0327转化体T₁-T₃三个连续世代果穗抗虫性鉴定

(1)CAF0327转化体果穗对亚洲玉米螟田间抗性鉴定

表8CAF0327转化体果穗对亚洲玉米螟田间抗性鉴定

CAF0327转化体果穗对亚洲玉米螟田间抗性鉴定，转化体CAF0327，抗虫性明显高于对照材料，穗轴和穗籽粒无虫蛀现象，能够正常结穗结实。抗虫性达到免疫级别高抗水平。转基因玉米的茎秆和穗部抗虫能力在不同世代稳定遗传。郑58非转基因对照材料穗轴和穗籽粒虫蛀严重，发黑腐烂，有大部分不能结实，有部分为穗轴和穗籽粒腐烂，没有商品价值，表现为极高感。结果如上表8和图9-a所示。

表9 CAF0327转化体T1-T3三个连续世代果穗对草地贪夜蛾田间抗性鉴定

CAF0327转化体果穗对草地贪夜蛾田间抗性鉴定，转化体CAF0327，抗虫性明显高于对照材料，穗轴和穗籽粒无虫蛀现象，能够正常结穗结实。抗虫性达到免疫级别高抗水平。转基因玉米的茎秆和穗部抗虫能力在不同世代稳定遗传。郑58非转基因对照材料穗轴和穗籽粒虫蛀严重，发黑腐烂，有大部分不能结实，有部分为穗轴和穗籽粒腐烂，没有商品价值，表现为极高感。结果如上表9和图9-b所示。

7.5CAF0327转化体抗虫目标性状正向叠加效应

如下表10所示，玉米事件CAF0327的室内生测显示，叶片被取食面积为0％，室内花丝被取食0％(重量)，大量接虫(50头田间接种穗部)穗轴、穗籽粒未被危害，完好无损。接虫测试实验结果表明：玉米事件CAF0327比单基因转化体具有更强更持久的杀虫性，(1)植株系统抗虫性特别强，在叶片花丝穗部等不同器官均不被危害，达到了免疫级别抗虫性；(2)花丝期花丝抗性特别好，每株接50头二龄幼虫的大量接虫花丝不受害，完好无损，这是其它基因没有达到的；(3)后期灌浆成熟期抗虫性特别强，能够在虫严重发生时转化体籽粒完好无损，这更是其它基因不能达到的；(4)具有全生育期持久性免疫级别的高水平抗性，抗虫性全生育期维持，抗虫性时期长，强度高，全生育期达到了免疫级别抗虫性，是极为难得的转化体，具有重大经济价值。而改造的m1cry1ab和mgcry1f的单基因转化体的叶片、花丝、穗部等虽对亚洲玉米螟和草地贪夜蛾具有很好的杀虫效果，但是在花丝期和后期的灌浆成熟期的抗虫性表现并不十分理想，没有达到免疫级别。

表10转化体CAF0327杀虫试验结果

结果显示，设计改造合成的m1cry1ab-mgcry1f抗虫融合基因的转化体玉米事件CAF0327对亚洲玉米螟和草地贪夜蛾田间抗虫性表现出的正效应叠加显著，呈现全生育期持久性免疫级别的高水平抗性，达到免疫级别的抗虫性。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims

1.一种玉米事件CAF0327的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括：SEQ ID NO:1或其反向互补序列、和/或SEQ ID NO:2或其反向互补序列；

其中，所述玉米事件CAF0327中包括异源DNA分子，所述异源DNA分子包括m1Cry1Ab-mgCry1F基因表达盒和bar基因表达盒；

所述m1Cry1Ab-mgCry1F基因表达盒包括：用作m1Cry1Ab-mgCry1F因启动子的CaMV35S启动子、m1Cry1Ab-mgCry1F基因编码框、用作m1Cry1Ab-mgCry1F基因终止子的T-Nos终止子；所述bar基因表达盒包括：用作bar基因启动子的CaMV35S启动子、bar基因编码框、作为bar基因终止子的CaMV poly(A)信号；

所述玉米事件CAF0327以保藏号CGMCC NO.45597，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.如权利要求1所述的玉米事件CAF0327的核酸分子，其包括：SEQ ID NO:3或其反向互补序列、和/或SEQ ID NO:4或其反向互补序列。

3.如权利要求1所述玉米事件CAF0327的核酸分子，其包括SEQ ID NO:5或其反向互补序列。

4.一种用于扩增玉米事件CAF0327的核酸分子的引物组，所述引物组包括第一引物组和第二引物组，其中所述第一引物组包含引物1F和引物1R，所述第二引物组包含引物2F和引物2R，并且同时满足下列条件：

(i)所述引物1F为SEQ ID NO:3的碱基1-1001中连续的11-30个碱基，优选15-30个碱基，更优选18-27个碱基，并且所述引物1R为SEQ ID NO:3的碱基1002-1289中连续的11-30个碱基的反向互补序列，优选15-30个碱基，更优选18-27个碱基，并且所述第一引物组扩增的扩增子中包含SEQ ID NO:1或其反向互补序列；以及

(ii)所述引物2F为SEQ ID NO:4的碱基1-232中连续的11-30个碱基，优选15-30个碱基，更优选18-27个碱基，并且所述引物2R为SEQ ID NO:4的碱基233-931中连续的11-30个碱基的反向互补序列，优选15-30个碱基，更优选18-27个碱基，并且所述第二引物组扩增的扩增子中包含SEQ ID NO:2或其反向互补序列。

5.一种用于检测样品中是否存在如权利要求1-3中任一项所述玉米事件CAF0327的核酸分子的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)使所述样品与权利要求4所述的引物组接触，并进行核酸扩增反应；

(2)检测核酸扩增所得到的扩增子中是否含有SEQ ID NO:1或其反向互补序列，和/或SEQ ID NO:2或其反向互补序列所示的核酸分子。

6.一种用于检测样品中是否存在如权利要求1-3中任一项所述玉米事件CAF0327的核酸分子的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)使所述样品与第一探针和第二探针接触；

(2)使所述样品和所述第一探针以及第二探针在严格杂交条件下杂交；

(3)检测所述样品和所述探针的杂交情况；

其中，所述第一探针和第二探针的长度均为11-30个核苷酸，所述第一探针和第二探针各自用至少一种荧光基团标记，并且同时满足下列条件：

(i)所述第一探针包含SEQ ID NO:1或其反向互补序列中任意的11-20个连续核苷酸；

(ii)所述第二探针包含SEQ ID NO:2或其反向互补序列中任意的11-20个连续核苷酸。

7.一种用于如权利要求6所述方法的探针组，所述探针组包括第一探针和第二探针；

(i)所述第一探针包含SEQ ID NO:1或其反向互补序列中任意11-20个连续核苷酸；

(ii)所述第二探针包含SEQ ID NO:2或其反向互补序列中任意11-20个连续核苷酸，

所述第一探针和第二探针均能够与来自转基因玉米事件CAF0327基因组的一条DNA链互补。

8.如权利要求5或6所述的方法，其中所述的样品选自：(1)玉米植株的整体或包含玉米遗传物质的任何组成部分，或(2)玉米制品；其中所述包含玉米遗传物质的任何组成部分选自玉米根、玉米茎、玉米叶、玉米雌花、玉米雄花、玉米种子、玉米胚；所述玉米制品为包含玉米成分的食品、化妆品、辅料。

9.一种用于检测样品中是否存在如权利要求1-3中任一项所述玉米事件CAF0327的核酸分子的DNA检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求4所述的引物组和/或如权利要求7所述的探针组。

10.一种产生自玉米事件CAF0327的玉米制品，其中所述玉米制品为存在玉米事件CAF0327的玉米粗粉、玉米面、玉米油、玉米淀粉、玉米面筋、玉米饼、化妆品、填充剂、或辅料。

11.一种产生对靶昆虫具有抗性和/或双丙胺磷除草剂耐受性的玉米植株的方法，其特征在于，所述方法包括将玉米事件CAF0327与缺少靶昆虫抗性和/或双丙胺磷除草剂耐受性的玉米植株进行有性杂交，从而产生大量子代植株，选择存在如权利要求1-3任一项所述玉米事件CAF0327的核酸分子的所述子代植株；用靶昆虫侵袭和/或双丙胺磷除草剂处理所述子代植株；选择出对靶昆虫具有抗性和/或双丙胺磷除草剂耐受性的所述子代植株。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，使用权利要求5或6所述的方法选择存在如权利要求1-3任一项所述玉米事件CAF0327的核酸分子的所述子代植株。

13.一种保护玉米植物免于昆虫侵袭的方法，其特征在于，包括在靶昆虫的膳食中提供来自玉米事件CAF0327的玉米植物细胞；摄食所述玉米植物细胞的靶昆虫被抑制进一步摄食所述玉米植物。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述玉米植物细胞在其基因组中依次包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5第1670-7894位核酸序列和SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:2的反向互补序列、SEQ ID NO:5第1670-7894位核酸序列的反向互补序列和SEQ ID NO:2的反向互补序列；优选地，所述玉米植物细胞的基因组中包含SEQ ID NO:5核酸序列，或SEQ IDNO:5核酸序列的反向互补序列。