UA116612C2 - ТРАНСГЕННА РОСЛИНА КУКУРУДЗИ, ЯКА ПРОДУКУЄ БІЛКИ Cry34Ab1, Cry35Ab1 І Cry6Aa1 ДЛЯ ЗАПОБІГАННЯ РОЗВИТКУ СТІЙКОСТІ У КУКУРУДЗЯНОГО КОРЕНЕВОГО ЖУКА (Diabrotica spp.) - Google Patents

ТРАНСГЕННА РОСЛИНА КУКУРУДЗИ, ЯКА ПРОДУКУЄ БІЛКИ Cry34Ab1, Cry35Ab1 І Cry6Aa1 ДЛЯ ЗАПОБІГАННЯ РОЗВИТКУ СТІЙКОСТІ У КУКУРУДЗЯНОГО КОРЕНЕВОГО ЖУКА (Diabrotica spp.) Download PDF

Info

Publication number
UA116612C2
UA116612C2 UAA201213337A UAA201213337A UA116612C2 UA 116612 C2 UA116612 C2 UA 116612C2 UA A201213337 A UAA201213337 A UA A201213337A UA A201213337 A UAA201213337 A UA A201213337A UA 116612 C2 UA116612 C2 UA 116612C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
protein
plants
corn
transgenic corn
reserve
Prior art date
Application number
UAA201213337A
Other languages
English (en)
Inventor
Кеннет Е. Нарва
Томас Мід
Крістін Дж. Фенсіл
Хуажун Лі
Тімоті Д. Хей
Аарон Т. Вуслі
Моніка Брітт Олсон
Original Assignee
ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі filed Critical ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі
Publication of UA116612C2 publication Critical patent/UA116612C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G7/00—Botany in general
    • A01G7/06—Treatment of growing trees or plants, e.g. for preventing decay of wood, for tingeing flowers or wood, for prolonging the life of plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N37/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids
    • A01N37/18—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids containing the group —CO—N<, e.g. carboxylic acid amides or imides; Thio analogues thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/48—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • A01N43/50—1,3-Diazoles; Hydrogenated 1,3-diazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
    • A01N65/40—Liliopsida [monocotyledons]
    • A01N65/44—Poaceae or Gramineae [Grass family], e.g. bamboo, lemon grass or citronella grass
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B32—LAYERED PRODUCTS
    • B32B—LAYERED PRODUCTS, i.e. PRODUCTS BUILT-UP OF STRATA OF FLAT OR NON-FLAT, e.g. CELLULAR OR HONEYCOMB, FORM
    • B32B1/00—Layered products having a non-planar shape
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B65—CONVEYING; PACKING; STORING; HANDLING THIN OR FILAMENTARY MATERIAL
    • B65D—CONTAINERS FOR STORAGE OR TRANSPORT OF ARTICLES OR MATERIALS, e.g. BAGS, BARRELS, BOTTLES, BOXES, CANS, CARTONS, CRATES, DRUMS, JARS, TANKS, HOPPERS, FORWARDING CONTAINERS; ACCESSORIES, CLOSURES, OR FITTINGS THEREFOR; PACKAGING ELEMENTS; PACKAGES
    • B65D85/00—Containers, packaging elements or packages, specially adapted for particular articles or materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8251—Amino acid content, e.g. synthetic storage proteins, altering amino acid biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/04—Plant cells or tissues
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T428/00—Stock material or miscellaneous articles
    • Y10T428/13—Hollow or container type article [e.g., tube, vase, etc.]

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Ecology (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Forests & Forestry (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

Винахід стосується трансгенної рослини кукурудзи, яка продукує білок Cry34Ab1, білок Cry35Ab1 і інсектицидний білок Cry6Aa1, де зазначений білок Cry35Ab1 має послідовність, яка складається з SEQ ID NO:1, і зазначений інсектицидний білок Cry6Aa1 має послідовність, яка складається з SEQ ID NO:4, і зазначений білок Cry34Ab1 має послідовність, яка складається з SEQ ID NO:3, і де зазначений білок Cry35Ab1 та зазначений інсектицидний білок Cry6Aa1 мають різні сайти зв’язування у кишечнику кукурудзяного кореневого жука. Вказана комбінація Cry34Ab1, Cry35Ab1 і Cry6Аа1 використовується для запобігання розвитку стійкості у популяції кукурудзяного кореневого жука (Diabrotica spp.).

Description

(57) Реферат:
Винахід стосується трансгенної рослини кукурудзи, яка продукує білок СтуЗ34АБІ, білок
Стуз5БАБІ і інсектицидний білок СтгубАа!1, де зазначений білок СтуЗз5АБбІ1 має послідовність, яка складається з 5ЕО ІЮ МО/:1, і зазначений інсектицидний білок СгубАа! має послідовність, яка складається з 5ЕО ІЮО МО:4, і зазначений білок Сту34АБІ1 має послідовність, яка складається з
ЗЕБЕО ІЮ МО:3, і де зазначений білок Сгуз5БАБІ та зазначений інсектицидний білок СгубАа!1 мають різні сайти зв'язування у кишечнику кукурудзяного кореневого жука. Вказана комбінація
СтуЗзаАБІ, СтузбАБІ і СтубАа1 використовується для запобігання розвитку стійкості у популяції кукурудзяного кореневого жука (Оіабгоїїса 5рр.).
Передумови винаходу
Люди вирощують кукурудзу для застосування в їжу і як джерело енергії. Кукурудза являє собою важливу сільськогосподарську культуру. Вона є важливим джерелом їжі, харчових продуктів і корму для тварин у багатьох регіонах світу. Комахи вживають у їжу й ушкоджують рослини і, таким чином, підривають ці зусилля людей. Щорічно мільярди доларів витрачаються для боротьби з комахами-шкідниками, і ще мільярди втрачаються внаслідок заподіюваного ними збитку.
Шкода, нанесена комахами-шкідниками, є основним чинником втрати врожаїв кукурудзи в усьому світі, незважаючи на використання захисних мір, таких як хімічні пестициди. У зв'язку з цим, у сільськогосподарські культури, такі як кукурудза, методами генної інженерії були введені гени стійкості до комах для боротьби зі збитком, нанесеним комахами, і для зниження потреби в традиційних хімічних пестицидах.
Щорічно, більше 10 мільйонів акрів (більше 4050000 га) кукурудзяних полів у США заражаються комплексом видів кукурудзяного кореневого жука. Комплекс видів кукурудзяного кореневого жука включає північного кукурудзяного кореневого жука (Оіаргоїїса бБагрегі), південного кукурудзяного кореневого жука (0. ипаесітрипсіага помагаї), і західного кукурудзяного кореневого жука (0. мігдітега мігдітега). (Інші види включають Оіарбгоїїйса мігдітега 7еае (Мексиканський кукурудзяний кореневий жук), ОЮіабгоїїса бБайеайа (Бразильський кукурудзяний кореневий жук), і комплекс Бразильського кукурудзяного кореневого жука (Оіаргоїїса мігідша і Оіабгоїїса 5ресіоза).
Личинки цих видів які живуть у грунті Оіабгоїїса харчуються корінням рослин кукурудзи, викликаючи полягання. Полягання, у кінцевому рахунку, знижує врожайність і часто приводить до загибелі рослини. Споживаючи в їжу маточкові стовпчики кукурудзи, дорослі жуки зменшують запилення і, тому, згубно впливають на врожай зерна кукурудзяної рослини. Крім того, дорослі особини і личинки роду Оіабгоїїса атакують гарбузові культури (огірки, дині, гарбузи і т.д.) і багато овочевих і польових культур у промисловому рослинництві, а також такі, які вирощуються на присадибних ділянках.
Синтетичні органічні хімічні інсектициди були першочерговими інструментами, використовуваними для боротьби з комахами-шкідниками, але біологічні інсектициди, такі як
Зо інсектицидні білки, отримані з Васійи5 (пигіпдіепзіє (ВО, відігравали важливу роль у деяких регіонах. Здатність одержання стійких до комах рослин за допомогою трансформації генами інсектицидного білка Ві радикально змінила сучасне сільське господарство і підвищила значення і цінність інсектицидних білків і їхніх генів.
Інсектицидні кристалічні білки з деяких штамів Васійи5 ІПигіпдіепвів (В.1.) добре відомі в даній галузі техніки. Див., наприклад, Нопе еї аї, Місгобіа! Кеміему5, Мої. 53, Мо. 2, рр. 242-255 (1989).
Ці білки звичайно продукуються бактеріями у вигляді протоксинів з молекулярною масою приблизно 130 кДа, які потім розщеплюються протеазами в середній кишці комах після потрапляння в травну систему комахи для продукції корового токсину з молекулярною масою приблизно 60 кДа. Ці білки відомі як кристалічні білки, тому що в деяких штамах ВІ. можуть спостерігатися виразні кристалічні включення із суперечками. Ці кристалічні включення часто складені з декількох різних білків.
Однією групою генів, які використовувалися для одержання трансгенних, стійких до комах культур, є дельта-ендотоксини з Васійи5 ІПигіпудіеп5і5 (84). Дельта-ендотоксини були успішно експресовані в таких сільськогосподарських культурах як бавовна, картопля, рис, соняшник, а також кукурудза, і, як виявилося, забезпечують чудову боротьбу з комахами-шкідниками. (Репак, Р. єї а. (1990) Віо/Тесппоіоду 8, 939-943; Репак, КЕ... еї а. (1993) Ріапі Мої. Віої. 22: 313- 321; Еціїтоїо Н. еї аї. (1993) Віо/Тесппоіоду 11: 1151-1155; Ти єї аї. (2000) Майте ВіоїесппоЇоду 18: 1101-1104; РСТ публікація міжнародної патентної заявки МУМО 01/13731; і Віпд У) УМ еї аї. (2000) Енісасу ої Сту ІЄ Тгтапздепіс Маїге, 14" Віеппіа! Іпієгпайопа! Ріапі Невівіапсе ю Іпвесів
Моік5Пор, Роп Соїйїпв, Со1о.).
Декілька білків ВІ використовувалися для створення стійких до комах трансгенних рослин, які були успішно зареєстровані і в даний час запущені в серійне виробництво. Вони включають
СтутАБ, СтутАс, СтуїЕ, СтутА.105, Стгу2АБ, СтузАа, СгузЗВЬ і Сту34/35АБ у кукурудзі, СтгутАс і
СтгугАБ у бавовні і СгтузЗА у картоплі.
Продукти, які випускаються в промисловому масштабі, експресуючі ці білки, експресують один білок, за винятком випадків, де бажаний комбінований інсектицидний спектр із 2 білків (наприклад, СтуТтАбБ і СтузЗВЬ у кукурудзі, комбіновані для забезпечення стійкості до лускокрилих шкідників і блішки довговусої, відповідно), або де незалежна дія білків робить їх корисними як інструмент для затримки розвитку стійкості у популяцій сприйнятливих комах (наприклад,
Сту1Ас і Стгу2АБ у бавовні, комбіновані для забезпечення боротьби зі стійкістю у тютюнової совки).
Деякі з якостей стійких до комах трансгенних рослин, які привели до швидкого і широко розповсюдженому прийняттю цієї технології, також викликають заклопотаність, що в популяцій шкідників розвинеться стійкість до інсектицидних білків, продукованих цими рослинами. Було запропоновано декілька стратегій для збереження корисності ознак стійкості до комах на основі
Ві, які включають розміщення білків у високій дозі в комбінації з резерватом, чергування з різними токсинами або спільне розміщення з ними (МеСацйднеу еї аї. (1998), "ВІ. Кезічтапсе
Мападетепі, " Машге Віоїесппої!. 16: 144-146).
Білки, вибрані для використання в пакеті Боротьба зі стійкістю у комах (ІКМ) повинні бути активними для того, щоб стійкість, яка розвилася до одного білка, не додавала стійкість до другого білка (тобто перехресна стійкість до білків відсутня). Якщо, наприклад, популяція шкідників, обрана для стійкості до "білка А", чуттєва до "білка В", то можна зробити висновок, що немає перехресної стійкості, ії що комбінація білка А і білка В буде ефективною в затримці стійкості до одного білка А.
Під час відсутності стійких до комах популяцій, оцінки можуть здійснюватися на підставі інших характеристик, які вважаються зв'язаними з потенціалом перехресної стійкості. При ідентифікації інсектицидних білків з імовірністю відсутності прояву перехресної стійкості було запропоноване використання рецепторно опосередкованого зв'язування (мап Мейаєг еї аї. 1999). Ключовим прогностичним показником відсутності перехресної стійкості, властивому такому підходу, є те, що інсектицидні білки не конкурують за рецептори в чуттєвого виду комах.
У випадку, коли токсини Ві конкурують за той самий рецептор, те якщо цей рецептор мутує у цій комасі, так що один з токсинів більше не зв'язується з цим рецептором і, таким чином, більше не є інсектицидним проти комахи, то в цьому випадку комаха буде також стійкою до другого токсину (який конкурентно зв'язаний з тим же рецептором). Тобто, комаха вважається перехресно стійкою до обох токсинів Ві. Однак якщо два токсини зв'язуються з двома різними рецепторами, то це може бути показником того, що комаха не буде одночасно стійкою до цих двох токсинів.
Відносно більш нова система інсектицидного білка була виявлена в Васійи5 ІПигіпдіепвів, як описано в міжнародному патенті УМО 97/40162. Ця система містить два білки - один масою приблизно 14-15 кДа, і інший масою приблизно 44-45 кДа. Див. також патенти США 6083499 і 6127180. Тепер ці білки були віднесені до їх власного класу і, відповідно, одержали позначення
Сту відповідно Стгуз4 і Стгуз5. Див. Стісктоге еї а. сайт інтернету (ріоі5.5изх.ас.икК/поте/Меї! СтісКтоге/ВІ/). В даний час виявлені багато інших родинних білків цього типу системи. Див., наприклад, патент США 6372480; міжнародні патенти УМО 01/14417 і
МО 00/66742. Були також описані оптимізовані для рослин гени, які кодують такі білки, де гени створені методами генної інженерії для використання кодонів для оптимізованої експресії в рослин. Див., наприклад, патент США 6218188.
Точний тип дії системи Сту34/35 ще має бути визначеним, але вважають, що вона утворює пори в мембранах клітин кишечнику комах. Див. МоейПепбеск еї аї, Маїиге Віогїесппоїіоду, мої. 19, р. 668 (ушу 2001); Маззоп еї аї., Віоспетівігу, 43 (12349-12357) (2004). Точний механізм дії залишається незрозумілим, незважаючи на тривимірні атомарні координати і структури кристалів, відомі для білка Стгу34 і Сту35. Див. патенти США 7524810 і 7309785. Наприклад, незрозуміло, один або обидва з цих білків зв'язуються з конкретним видом рецептора, такого як лужна фосфатаза або амінопептидаза.
Крім того, через те, що існують різні механізми, за допомогою яких у комахи може розвинутися стійкість до білка Сгу (такі як зміненим глікозилуванням рецептора |див. дигаї-
Епепієз вї аї. (2002) 68 АЕМ 5711-5717), видаленням рецепторного білка |див. Г еє еї аї. (1995) 61 АЕЄМ 3836-3842), мутацією рецептора або іншими механізмами |див. Нескеї еї аї., У. Іпм.
Раїної!. 95 (2007) 192-197), було неможливо свідомо прогнозувати, чи буде існувати перехресна стійкість між Сту34/35 і іншими Стгу-білками. Гежо еї аі. обговорюють складний феномен стійкості в кореневого жука. у. Аррі. Епіотої. 132 (2008) 189-204.
Прогнозування конкурентного зв'язування для системи Сгу34/35 також додатково ускладнюється тим, що два білки втягнені в бінарну систему Сту34/35. Крім того, незрозуміло, чи зв'язуються і наскільки ефективно зв'язуються ці білки з кишечником/клітинами кишечнику, і чи взаємодіють вони і як взаємодіють або зв'язуються один з одним.
Інші варіанти для боротьби з твердокрилими комахами включають токсини СтуЗВЬ, Стузс,
СтубвВ, ЕТ29, ЕТЗ33 з ЕТ34, ТІС407, ТІС435, ТІС417, ТІС9О1, ТІС1201, ЕТ29 з ТІС810, ЕТ70О, ЕТ76 з ЕТ80, ТІС851 і інші. Були також запропоновані підходи РНКІі (інтерференції РНК). Див. бо наприклад, Вашт еї аї., Маїиге Віотесппоіоду, мої. 25, по. 11 (Мом. 2007) рр. 1322-1326.
Меїпі5 еї ам. пропонують використання резервних культур для боротьби зі стійкістю у кукурудзяного кореневого жука. РМАЗ (2008) мої. 105, по. 49, 19177-19182.
Короткий опис суті винаходу
Даний винахід стосується частково СтуЗ4АБ/З35АБ у комбінації з СтгубАа. Даний винахід стосується частково дивного відкриття, що СтуЗз4АБ/Стуз5АВ ії СтубАа можуть використовуватися для запобігання розвитку стійкості (до будь-якої системи інсектицидного білка окремо) у популяції кукурудзяного кореневого жука (Оіабгоїїса 5рр.). Як буде зрозуміло фахівцю в даній галузі після ознайомлення зі сприятливими аспектами розкритого в даному описі винаходу, рослини, продукуючі ці інсектицидні Сту-білки, можуть використовуватися для зменшення побоювань того, що може розвинутися популяція кукурудзяного кореневого жука, який може бути стійким до кожної з цих систем інсектицидного білка окремо.
Даний винахід частково підтверджується виявленням того, що компоненти цих систем Сгу- білка не конкурують один з одним за зв'язування з рецепторами кишечнику кукурудзяного кореневого жука.
Даний винахід також частково стосується потрійних пакетів або "пірамід" із трьох (або більше) систем токсинів, причому парою основ є СтуЗз4Ар/Стуз5АБ і СтубАа. Таким чином, рослини (і посівна площа, засаджена такими рослинами), які продукують ці дві системи інсектицидних білків, включені в обсяг даного винаходу.
Короткий опис фігур
Фіг.1. Зв'язування 25І-СгузБАБІ (А) і 725І-СтгубАа1! (В) як функція внесених мічених радіоактивним ізотопом Стгу-токсинів у ВВММ (мембранних пухирцях щіткової облямівки), отриманих з личинок західних кукурудзяних кореневих жуків. Специфічне зв'язування-загальне зв'язування-неспецифічне зв'язування, "вуса»-2ЕМ (стандартна помилка середньої).
Фіг.2. Зв'язування 7"25І-СгузБАрІ з ВВМУ, отриманими з личинок західного кукурудзяного кореневого жука при різних концентраціях неміченого конкурента (1090,1--1,0, Іод10-1,0,
Іосд9100-2,0, Іс41000-3,0).
Короткий опис послідовностей
ЗЕО ІЮ МО:1: Повна послідовність нативного білка Стуз5АбБІ1
ЗЕО ІЮ МО:2: Послідовність зрізаного хімотрипсином корового білка СтузБАБІ1
Ко) ЗЕО ІЮ МО:3: Повна послідовність нативного білка Стуз4а АБ1
ЗЕО ІЮ МО:4: Повна послідовність нативного білка СтубАа!
Докладний опис винаходу
Послідовності білка СтуЗз4АБ/З5БАБ можуть бути отримані, наприклад, з ізоляту Васійи5
ІШигіпдіепоізї РОІ149В1. Інші гени, білкові послідовності і ізоляти-джерела для використання стосовно даного винаходу описані, наприклад, СгісКктоге еї а). на сайті інтернету (Іезсі.виззех.ас.ик/поте/Меї! Стісктоге/Ви/іпіго.піті).
Даний винахід включає використання інсектицидних білків СтуЗз4АБ/35АБ у комбінації з токсином СтубАа для захисту кукурудзи від ушкодження і втрати врожайності, викликаних поїданням популяціями кукурудзяного кореневого жука, у яких може розвинутися стійкість до кожної з цих систем білків Сту окремо (без іншого).
Таким чином, у даному винаході мова йде про пакет Боротьба зі стійкістю у комах (ІЕМ) для запобігання розвитку в кукурудзяного кореневого жука стійкості до СгубАа і/або СгузаАбБр/З5АБ.
Даний винахід стосується композицій для боротьби зі шкідниками-кореневими жуками, яка містить клітини, які продукують білок токсину СтублАа і систему токсину Сгтгуз4Абр/З5АБ.
Винахід додатково включає хазяїна, трансформованого для продукції і білка Сгубда, і бінарного токсину СтгуЗз4АБ/З5АБ, де зазначений хазяїн являє собою мікроорганізм або рослинну клітину.
Додатково передбачається, що винахід стосується способу боротьби зі шкідниками- кореневими жуками, який включає приведення в контакт вказаних шкідників або середовища проживання вказаних шкідників з ефективною кількістю композиції, яка містить білок Стублда, і додатково містить бінарний токсин СтуЗз4АБ/З5АБ.
Варіант здійснення винаходу включає маїс, який містить експресований рослиною ген, який кодує бінарний токсин СтуЗ4АБ/З5АБ, і експресований рослиною ген, який кодує білок Стубда, і насіння такої рослини.
Додатковий варіант здійснення винаходу включає маїс, де експресований рослиною ген, який кодує бінарний токсин СтуЗ4АБ/З5АБ, і експресований рослиною ген, який кодує білок
СгубдАа, були інтрогресовані у вказаний маїс, і насіння такої рослини.
Як описано в розділі "Приклади", дослідження конкурентного зв'язування з рецепторами з використанням міченого радіоактивним ізотопом корового токсинного білка Стгуз5АБ показують, бо що коровий токсинний білок СтубАа не конкурує за зв'язування в зразках тканини комах СЕУУ
(кукурудзяних кореневих жуків), з якими зв'язується Стгуз5АБ. Див. фіг.2. Ці результати вказують на те, що комбінація білків СтгубАа і Стгу34АБ/35АБ являє собою ефективний засіб для зменшення розвитку стійкості в популяцій СКУМ до будь-якої білкової системи окремо.
Таким чином, частково на підставі даних, описаних вище, і в інших місцях даного опису, білки СгуЗз4АБ/З5АБ і СгтублАа можуть бути використані для одержання комбінацій ІЕМ для запобігання і зменшення розвитку стійкості в СЕМУ. Інші білки можуть бути додані до цієї комбінації, наприклад, для розширення спектра боротьби 3 комахами. Розглянута пара/комбінація також може бути використана в деяких переважних "потрійних пакетах" або "пірамідах" у комбінації з ще одним білком для боротьби з кореневими жуками, таким як СгуЗзВа ілабо СтуЗАа. РНКІ проти кореневих жуків являє собою ще один варіант. Див., наприклад, Вайт еї аї., Маїште Віоїесппоіоду, мої. 25, по. 11 (Мом. 2007) рр. 1322-1326. Таким чином, розглянуті комбінації забезпечують множинні типи дії проти кореневого жука.
У світлі опису заявки О55М 61/327240 (поданої 23 квітня, 2010 р.), яка стосується комбінацій
Стуз4аАБ/З5АБ і СтузАа, заявки О5ЗМ 61/476005 (поданої 15 квітня, 2011 р.), яка стосується комбінації білків Сгуз4АБ/З5АБЬ і СтгуЗВа, і заявки О5ЗМ 61/477447 (поданої 20 квітня, 2011 р.), яка стосується комбінацій білків СтузАа і СтубАа, деякі переважні "потрійні пакети" даного винаходу включають білок СгтубАа у комбінації з білками СтгуЗз4АБ/З5АБ, і білками СгузЗАа і/або
СтузВа. Трансгенні рослини, включаючи кукурудзу, які містять ген сгубВа, гени сгуЗз4АБ/З5АБ і ген сгузАа і/або сгузВа, включені в обсяг даного винаходу. Таким чином, такі варіанти здійснення націлені на комаху щонайменше трьома типами дії. Крім того, у світлі цих даних і положень, можна включити сгуЗзВа або сгузАа замість приведеного в даному описі як приклад
СгубАа, як комбінацію основ, яка спаровується з сгуз4А/З5А.
Варіанти розміщення за даним винаходом включають використання білків СгубАа і
Стуз4АБ/З5АБЬ у місцях вирощування кукурудзи, де Оіабгоїїса 5рр. є проблематичними. Іншим варіантом розміщення може бути використання одного або обох білків СгублЛа і СтузаАБ/З5АБ у комбінації з іншими ознаками.
Фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що токсини Ві, навіть у межах визначеного класу, такі як СтубАа і Стуз4АБ/З5АБ, можуть до деякої міри варіюватися.
Гени і токсини. Термін "ізольований" стосується полінуклеотиду який не зустрічається в
Зо природних умовах конструкту або до білка в очищеному або іншим способом який не зустрічається в природних умовах стану. Гени і токсини, використовувані стосовно даного винаходу, включають не тільки повні описані послідовності, але також фрагменти цих послідовностей, варіанти, мутанти і злиті білки, які зберігають характерну пестицидну активність токсинів, конкретно проілюстрованих у даному описі. Використовувані в даному описі терміни "варіанти" або "зміни" генів стосуються нуклеотидних послідовностей, які кодують ті ж токсини, або які кодують еквівалентні токсини, які володіють пестицидною активністю. Використовуваний у даному описі термін "еквівалентні токсини" стосується токсинів, які мають таку ж або власне кажучи володіють такою ж біологічною активністю проти шкідників-мішеней як заявлені токсини.
Домени/субдомени цих білків можуть бути замінені для одержання химерних білків. Див. наприклад, патенти США 7309785 і 7524810, що відносяться до білок Сгу34/35. У патенті "785 мова також йде про зрізані білки СтуЗ5. Зрізані токсини також проілюстровані в даному описі.
Використовуваний у даному описі термін "кордони" представляє ідентичність послідовностей приблизно 95 95 (СтубАа і СтуЗз4АБ і СтузбАБ), 78 95 (СтубА і СгуЗ4А і Стгуз5А) і 905 (Сгуб і СтуЗ34 і Стуз5) стосовно "Кемізіоп ої Мотепсіайшге Тог ВасшШиз (пПигіпдіепвіз Резіїсідаї 45 Стгувіа!Ї Ргоїєїпв" М. СтісКтоге, О.В. 2еїдіеєг, У. Рейеібвоп, Е. ЗсАпері, у). Мап Віє, 0. І егесісшв, «у.
Вайт, і О.Н. Оеєап. Місгоріоюду і МоїІесшаг Віооду Кеміем5 (1998) Мо! 62: 807-813. Те ж стосується СтуЗ при використанні в потрійних пакетах, наприклад, стосовно даного винаходу.
Для фахівця в даній галузі буде очевидно, що гени, які кодують активні токсини, можуть бути ідентифіковані й отримані декількома способами. Визначені гени або частини генів, проілюстровані в даному описі, можуть бути отримані з ізолятів, депонованих у депозитарії культур. Ці гени або їхні частини або варіанти, також можуть бути сконструйовані синтетично, наприклад, шляхом використання генного синтезатора. Варіанти генів можуть бути легко сконструйовані з використанням стандартних технологій одержання крапкових мутацій. Також, фрагменти цих генів можуть бути отримані з використанням комерційно доступних екзонуклеаз або ендонуклеаз, відповідно до стандартних методик. Наприклад, ферменти, такі як ВаЇЗ1 або сайт-направлений мутагенез можуть бути використані для систематичного відсічення нуклеотидів від кінців цих генів. Гени, які кодують активні фрагменти, можуть також бути отримані з використанням різноманітних рестрикційних ферментів. Протеази можна використовувати для безпосереднього одержання активних фрагментів білкових токсинів.
Фрагменти й еквіваленти, які зберігають пестицидну активність проілюстрованих токсинів, будуть входити в обсяг даного винаходу. Також, через надмірність генетичного коду, розмаїтість різних послідовностей ДНК може кодувати амінокислотні послідовності, розкриті в даному описі.
Фахівець у даній галузі цілком може створити ці альтернативні послідовності ДНК, які кодують однакові або власне кажучи однакові токсини. Ці варіантні послідовності ДНК входять в обсяг даного винаходу. Використовуване в даному описі посилання на "власне кажучи однакову" послідовність стосується послідовностей, які мають амінокислотні заміщення, делеції, або додавання вставки, які істотно не впливають на пестицидну активність. Фрагменти генів, які кодують білки, які зберігають пестицидну активність, також включені в це визначення.
Фрагменти генів, які кодують білки, які зберігають пестицидну активність, також включені в даний винахід.
Додатковий спосіб ідентифікації генів, які кодують токсини, і частин генів, використовуваних стосовно даного винаходу, здійснюють шляхом використання олігонуклеотидних зондів. Ці зонди являють собою детектовані нуклеотидні послідовності. Ці послідовності можуть бути виявлені за допомогою відповідної мітки або можуть бути отримані ендогенно флуоресцентними, як описано в міжнародній патентній заявці Мо МО 93/16094. Як добре відомо в даній галузі, молекула зонда і зразок нуклеїнової кислоти гібридизуються утворенням міцного зв'язку між двома молекулами, то можна резонно припустити, що зонд і зразок мають істотну гомологію. Переважно, гібридизацію проводять у жорстких умовах методиками, добре відомими в даній галузі, як описано, наприклад, у публікації КеПег, с.Н., М.М. Мапак (1987) ОМА Ргобев,
ЗіосКкіоп о Ргеб5, Мем/ МоїК, М.М., рр. 169-170. Деякі приклади сольових концентрацій і температурних комбінацій наступні (у порядку збільшення жорсткості умов): 2Х 55РЕ (0,18М масі, 10 мМ МанНгРо», 1 мм ЕОТА, р 7,0)) або 55Х (15 мМ цитрату натрію, 150 мМ хлориду натрію, р 7,0) при кімнатній температурі; 1Х 55РЕ або 55С при 422С; 0,1Х 55РЕ або 55ХТ при 65С. Виявлення зонда забезпечує засіб для визначення відомим чином, чи відбулася гібридизація. Такий зондовий аналіз забезпечує швидкий спосіб ідентифікації генів даного винаходу, які кодують токсин. Нуклеотидні сегменти, які використовуються як зонди стосовно винаходу, можуть бути синтезовані з використанням синтезатора ДНК і стандартних методик. Ці нуклеотидні послідовності також можуть бути використані як затравки ПЦР для ампліфікації
Зо генів за даним винаходом.
Варіантні токсини. У даному описі були спеціально проілюстровані визначені токсини за даним винаходом. Оскільки ці токсини просто ілюструють токсини за даним винаходом, то буде цілком очевидно, що даний винахід включає варіантні або еквівалентні токсини (і нуклеотидні послідовності, які кодують еквівалентні токсини), які володіють такою ж або подібною пестицидною активністю як ілюстрований токсин. Еквівалентні токсини мають гомологію амінокислот з ілюстрованим токсином. Ця амінокислотна ідентичність звичайно складає більше ніж 75 95, або, переважно, більше ніж 85 95, переважно, більше ніж 90 95, переважно, більше ніж 95 95, переважно, більше ніж 96 95, переважно, більше ніж 97 95, переважно, більше ніж 98 95, або в деяких варіантах здійснення переважно, більше ніж 99 95. Амінокислотна ідентичність звичайно найвища в критичних ділянках токсину, які відповідають за біологічну активність або беруть участь у визначенні тривимірної конфігурації, яка, у кінцевому рахунку, відповідальна за біологічну активність. У цьомвідносно, прийнятні і можуть очікуватися деякі амінокислотні заміщення, якщо ці заміщення відбуваються в ділянках, які не мають вирішального значення для активності або являють собою консервативні амінокислотні заміщення, які не впливають на тривимірну конфігурацію молекули. Наприклад, амінокислоти можуть бути розміщені в наступні класи: неполярні, незаряджені полярні, основні і кислотні. Консервативні заміщення, за допомогою яких амінокислота одного класу заміщається іншою амінокислотою того ж типу, входять в обсяг даного винаходу, доки заміщення істотно не змінює біологічну активність сполуки. У таблиці 1 представлений список прикладів амінокислот, які стосуються кожного класу.
Таблиця 1
У деяких випадках також можуть бути здійснені неконсервативні заміщення. Вирішальним фактором є те, що ці заміщення не повинні значно знижувати біологічну активність токсину.
Рекомбінантні хазяї. Гени, які кодують токсини даного винаходу, можуть бути введені в широку розмаїтість мікробних або рослинних хазяїнів. Експресія гена токсину приводить, або прямо побічно, до внутрішньоклітинної продукції і підтримки пестициду. Кон'югальне перенесення і рекомбінантне перенесення можуть бути використані для створення штаму Ві, який експресують обидва токсини даного винаходу. Інші організми хазяїнів також можуть бути трансформовані одним або більше генами токсину, використовуваними потім для надання синергічного ефекту. З придатними мікробними хазяїнами, наприклад, Рхейдотопав, мікроби можуть наноситися на місцезнаходження шкідника, де вони проліферують і вживаються в їжу.
Результатом є боротьба зі шкідником. Альтернативно, мікроб, який несе ген токсину, може бути підданим обробці в умовах, які продовжують активність токсину і стабілізують клітину.
Оброблена клітина, яка зберігає токсичну активність, потім може вноситися в середовище проживання шкідника-мішені. В обсяг даного винаходу включені нерегенеровані/нетотипотентні рослинні клітини з рослини за даним винаходом (утримуючі щонайменше один з розглянутих генів ІКМ).
Трансформація рослини. Переважним варіантом здійснення даного винаходу є трансформація рослин генами, які кодують розглянутий інсектицидний білок або його варіанти.
Трансформовані рослини стійкі до атаки цільовою комахою-шкідником за рахунок присутності забезпечуючих боротьбу кількостей розглянутого інсектицидного білка або його варіантів у клітинах трансформованої рослини. При включенні генетичного матеріалу, який кодує інсектицидні властивості інсектицидних токсинів В.1., у гені рослини, вживаного в їжу визначеним комахою-шкідником, дорослі особини або личинки загинуть після вживання в їжу рослини. Були трансформовані численні члени односім'ядольних і двочасткових класифікацій. Трансгенні агрономічні культури, а також фрукти й овочі становлять промисловий інтерес. Такі культури включають, але без обмеження, маїс, рис, сою, канолу, соняшник, люцерну, сорго, пшеницю, бавовну, арахіс, томати, картоплю тощо. Існує кілька технологій введення стороннього генетичного матеріалу в клітини рослин і одержання рослин, які стабільно підтримують і експресують введений ген. Такі технології включають акселерацію генетичного матеріалу,
Зо нанесеного на мікрочастинки, безпосередньо в клітини (патент США 4945050 і патент США 5141131). Рослини можуть бути трансформовані з використанням технології Адгобасіегішт, див. патент США 5177010, патент США 5104310, Європейську патентну заявку Мо 01316248В1,
Європейську патентну заявку Мо 120516, Європейську патентну заявку Мо 15941881,
Європейську патентну заявку Мо 176112, патент США 5149645, патент США 5469976, патент
США 5464763, патент США 4940838, патент США 4693976, Європейську патентну заявку Мо 116718, Європейську патентну заявку Мо 290799, Європейську патентну заявку Мо 320500,
Європейську патентну заявку Мо 604662, Європейську патентну заявку Мо 627752, Європейську патентну заявку Ме 0267159, Європейську патентну заявку Мо 0292435, патент США 5231019, патент США 5463174, патент США 4762785, патент США 5004863 і патент США 5159135. Інша технологія трансформації включає технологію М/НІЗКЕК5З "М, див. патент США 5302523 і патент
США 5464765. Технологія електропорації також використовувалася для трансформації рослин, див. Міжнародний патент МО 87/06614, патент США 5472869, патент США 5384253,
Міжнародний патент УМО 9209696 і Міжнародний патент МО 9321335. Усі ці патенти і публікації, які стосуються трансформації, включені в даний опис за допомогою посилання. На додаток до численних технологій трансформації рослин, тип тканини, яка контактує зі сторонніми генами, також може змінюватися. Така тканина включає, але не обмежується ними, ембріогенну тканину, І і ІЇ типи калюсної тканини, гіпокотиль, меристему тощо. Майже всі рослинні тканини можуть бути трансформовані під час дедиференціації з використанням відповідних технологій у межах кваліфікації фахівця в даній галузі.
Гени, які кодують кожен з розглянутих токсинів, можуть бути вставлені в клітини рослини з використанням різноманітних технологій, які добре відомі в даній галузі, як описано вище.
Наприклад, доступно велике число векторів клонування, які містять маркер, який забезпечує можливість добору трансформованих мікробних клітин, і реплікаційна система, функціональна в
ЕзспПегіспіа соїї, для одержання і модифікації сторонніх генів для вставки у вищі рослини. Такі маніпуляції можуть включати, наприклад, введення мутацій, зрізань, або додавань заміщень, як бажано для передбачуваного використання. Вектори включають, наприклад, рВК322, групу рис, групу МІ1Зітр, рАСУст184 і т.д. Відповідно, послідовність, яка кодує Сгу-білок або варіанти, може бути вставлена у вектор у придатний сайт рестрикції. Отримана плазміда використовується для трансформації клітин Е. соїї, клітини яких культивують у придатному бо поживному середовищі потім збирають і лізують для того, щоб були витягнуті придатні для обробки кількості плазміди. Аналіз послідовності, аналіз фрагментів рестрикції, електрофорез і інші біохімічні-молекулярно-біологічні способи звичайно проводять як способи аналізу. Після кожної маніпуляції, використовувана послідовність ДНК може бути розщеплена і з'єднана з наступною послідовністю ДНК. Кожна піддана маніпулюванню послідовність ДНК може бути клонована в ту ж або іншу плазміду.
Використання утримуючих Т-ДНК векторів для трансформації клітин рослин інтенсивно досліджувалося і досить описане в Європейському патенті ЕР 120516; публікаціях ГІ ее і Семіп (2008), ЕгаїІеу еї а). (1986), і Ап еї аї. (1985), і досить загальноприйняте в даній галузі.
Як тільки вставлена ДНК інтегрується в ген рослини, вона стає стійкої у всіх наступних поколіннях. Вектор, використовуваний для трансформації клітини рослини, звичайно містить обраний маркерний ген, який кодує білок, який додає трансформованим клітинам рослин стійкість до гербіциду або антибіотику, такому як, поряд з іншими, біалафос, канаміцин, 5418, блеоміцин або гігроміцин. Відповідно, окремо використовуваний обраний маркерний ген повинен забезпечити можливість вибору трансформованих клітин, у той час як ріст клітин, які не містять вставлену ДНК, придушується селекційною сполукою.
Доступне велике число способів вставки ДНК у клітину рослини-хазяїна. Ці способи включають трансформацію Т-ОМА, доставлену Адгобасіегішт шптеїасіеп5 або Адгобасіегійт гпідгодепе5 як агента трансформації. Додатково, може бути використане злиття протопластів рослини з ліпосомами, які містять підлягаючу доставці ДНК, пряма ін'єкція ДНК, трансформація біологічною балістикою (бомбардуванням мікрочастинками) або електропорація, а також інші можливі способи.
У кращому варіанті здійснення даного винаходу, рослини трансформуються генами, де використання кодона ділянки, яка кодує білок, було оптимізовано для рослин. Див., наприклад, патент США 5380831, який включений у даний опис за допомогою посилання. Також, переважно використовуються рослини, які кодують зрізаний токсин. Зрізаний токсин звичайно кодує приблизно від 55595 до приблизно 8095 токсину повної довжини. Способи створення синтетичних генів В.І. для використання в рослинах відомі в даній галузі (еїеугагі, 2007).
Незалежно від методики трансформації, ген переважно включають у вектор переносу гена, адаптований для експресування генів інсектицидного токсину В.ї. і варіанти в рослинній клітині
Зо включенням у вектор рослинного промотору. На додаток до рослинних промоторів, у рослинних клітинах для експресування чужорідних генів можуть ефективно використовуватися промотори з різноманітних джерел. Наприклад, можливе використання промоторів бактеріального походження, таких як промотор октопінсинтази, промотор нопалінсинтази і промотор манопінсинтази. У деяких переважних варіантах здійснення можуть використовуватися промотори, не зв'язані з Васійи5 ІПигіпдіеп5із. Можуть використовуватися промотори, які виходять з рослинних вірусів, наприклад, промотори 355 і 195 вірусу мозаїки кольорової капусти, промотор з вірусу мозаїки жилок касаві тощо. Рослинні промотори включають, але без обмеження, малу субодиницю (551), промотор бета-конгліциніну, промотор фазеоліну, промотор
АОН (алкогольдегідрогенази), промотори теплового шоку, промотор АОЕ (деполімеризації актину), промотор убіквітину, промотор актину і тканеспецифічні промотори. Промотори можуть також містити визначені енхансерні елементи послідовності, які можуть підвищити ефективність транскрипції. Конкретні енхансери включають, але без обмеження, АОНІ1-інтрон 1 і АОНІ-інтрон 6. Можуть використовуватися конститутивні промотори. Конститутивні промотори направляють безупинну генну експресію майже у всіх типах клітин і майже в будь-який час (наприклад, актину, убіквітину, Самм 355). Тканиноспецифічні промотори відповідальні за генну експресію у визначених типах або клітин тканини, таких як листя або насіння (наприклад, промотори зеїну, олеозину, напіну, АСР (ацил білка-носія)), і ці промотори також можуть бути використані.
Можуть також використовуватися промотори, які активні під час визначеної стадії розвитку рослин, а також активні у визначених тканинах і органах рослин. Приклади таких промоторів включають, але без обмеження, промотори, які є специфічними для коренів, специфічними для пилка, специфічними для зародків, специфічними для "шовку" кукурудзи, специфічними для бавовняних волокон, специфічними для ендосперми насіння, специфічними для флоеми, тощо.
У визначених умовах може бути бажаним використання індукованого промотору.
Індукований промотор відповідальний за експресію генів у відповідь на специфічний сигнал, такий як фізичний стимул (наприклад, гени теплового шоку); світло (наприклад, КОВР карбоксилазу); гормон (наприклад, глюкокортикоїд); антибіотик (наприклад, тетрациклін); метаболіти; і стрес (наприклад, посуху). Можуть використовуватися інші бажані транскрипційні і трансляційні елементи, які функціонують у рослинах, такі як 5' нетрансльовані лідерні послідовності, РНК послідовності транскрипції термінації і сигнальні послідовності додавання бо поліаденілату. У даній галузі відомі численні специфічні для рослин вектори переносу генів.
Трансгенні культури, які містять ознаки стійкості до комах (ІК), є переважними в рослинах кукурудзи і бавовни по всій Північній Америці, і використання цих ознак поширюється по усьому світі. Промислові трансгенні культури, які комбінують ознаки ІК і стійкість до гербіцидів (НТ), були розроблені безліччю насінневих компаній. Вони включають комбінації ознак ІК, доданих інсектицидними білками В.ї. і ознак НТ, таких як стійкість до інгібіторів ацетолактатсинтази (АІ 5), таких як сульфонілсечовини, імідазолінони, триазолпіримідин, сульфонаніліди тощо, інгібіторів глутамінсинтетази (055), таких як біалафос, глюфосинат тощо, інгібіторів 4- гідроксифенілпіруватдіоксигенази (НРРОБ), таких як мезотріон, ізоксафлутол тощо, інгібіторів 5- енолпірувілшикімат-З-фосфатсинтази (ЕРБР5), таких як гліфосат тощо, інгібіторів ацетилкоензим-А-карбоксилази (АССазе), таких як галоксифоп, квілазофоп, диклофоп тощо.
Відомі інші приклади, у яких трансгенно отримані білки забезпечують стійкість рослин до хімічних класів гербіцидів, таких як гербіциди на основі феноксікислот і гербіциди на основі ауксинпірідилоксіацетатів (див. міжнародну патентну заявку УМО 2007/053482 А2), або гербіциди на основі феноксікислот і гербіциди на основі арилоксіфеноксіпропіонатів (див. міжнародну патентну заявку 2005107437 А2, АЗ). Здатність боротися з множинними зв'язаними зі шкідниками проблемами за допомогою ознак ІК являє собою цінну концепцію промислового продукту, і зручність цієї продуктової концепції підвищується, якщо ознаки, які забезпечують боротьбу з комахами, і ознаки, які забезпечують боротьбу з бур'янами, комбінуються в одній рослині. Додатково, підвищена значимість може бути отримана за допомогою комбінацій в одній рослині ознак ІК, доданих інсектицидним білком ВІ., таким як інсектицидний білок за даним винаходом, з однією або більше додатковими ознаками НТ, такими як зазначено вище, плюс одна або більше додаткових ознак, які вводяться, (наприклад, стійкість до інших комах, яка походить з В.І. або з інших інсектицидних білків, стійкості до комах, доданої такими механізмами як РНКІ тощо, стійкості до нематодів, стійкості до захворювань, стійкості до стресу, поліпшеної утилізації азоту і тому подібних), або продуктивні ознаки (наприклад, високий вміст олій, корисна для здоров'я сполука, поліпшення поживної цінності тощо). Такі комбінації можуть бути отримані або звичайною селекцією (селекційний пакет), або спільно у вигляді нового явища трансформації яке включає одночасне введення множинних генів (молекулярний пакет).
Сприятливі ефекти включають здатність справлятися зі шкідниками і поліпшеною боротьбою з
Зо бур'янами культур рослин, які забезпечують вторинні переваги для виробника і/або споживача.
Таким чином, винахід може бути використаний в комбінації з іншими ознаками для забезпечення повного агрономічного пакета поліпшеної якості культури зі здатністю гнучко й економічно рентабельно регулювати будь-яке число агрономічних питань.
Трансформовані клітини ростуть всередині рослин звичайним чином. Вони можуть утворювати зародкові клітини і передавати трансформовану ознаку(и) популяції рослин.
Такі рослини можна вирощувати звичайним чином і схрещувати з рослинами, які мають такі ж трансформовані спадкоємні фактори або інші спадкоємні фактори. Отримані гібридні індивіди мають відповідні фенотипічні властивості.
У переважному варіанті здійснення даного винаходу рослини трансформуються генами, де використання кодона було оптимізовано для рослин. Див., наприклад, патент США 5380831.
Крім того, способи створення синтетичних генів Ві для використання в рослинах відомі в даній галузі (Зіеумлаг і Вигдіїй, 2007). Одним необмежувальним прикладом переважної трансформованої рослини є фертильна рослина маїсу, яка містить експресований рослиною ген, який кодує білок СтубАа, і що додатково містить другий набір експресованих рослиною генів, які кодують білки СтузаАБ/З5АБ.
Перенесення (або інтрогресія) обумовленої(их) білками СтубАа і Сгуз4АБ/35АБ ознаки(ознак) в інбредні лінії маїсу може бути досягнута рекурентним селекційним розведенням, наприклад, зворотним схрещуванням. У цьому випадку, бажаного рекурентного батька спочатку схрещують з інбредним донором (нерекурентним батьком), який несе відповідний(ні) ген(и) для обумовлених Стгу ознак. Потім потомство цього однократного схрещування знову спаровують з рекурентним батьком з наступною селекцією в отриманому потомстві для переносу бажаної ознаки(ознак) від нерекурентного батька. Після трьох, переважно, чотирьох, більше переважно, п'яти або більше поколінь зворотного схрещування з рекурентним батьком із селекцією бажаної ознаки(ознак), потомство буде гетерозиготним відносно локусів, які контролюють стерпну(ні) ознаку(ки), але буде як рекурентний батько відносно більшості або майже всіх інших генів (див., наприклад, Роепітап 8 5іІерег (1995) Вгеедіпуд Рій Сгор5, 4 Еа., 172-175; Еепг (1987)
Ргіпсірієз ої Сийімаг ОемеІортепі, Мої. 1: Тпеогу і Тесппідие, 360-376).
Стратегії боротьби зі стійкістю у комах (ІЕМ). Кои5п сеї аї., наприклад, описують "двотоксинні" стратегії також називані "побудовою піраміди" або "пакетуванням", для вирощування інсектицидних трансгенних культур. (Коуа! Босіеїу. РАЙ. Тгапе. К. Зоб. І опа. В. (1998) 353, 1777-1786).
Агентство США по захисту навколишнього середовища на своєму сайті в інтернеті (ерагдом/оррбрраї/ріоревіісідев/рір5/рі согп гейіде 2006.піт) публікує наступні вимоги до забезпечення не трансгенних (тобто що не містять В.І. білки) резервних культур (блоку культур, які не містять ВІ білки/кукурудзи) для використання з трансгенними культурами, продукуючими один білок Ві, активний проти шкідників-мішеней. "Специфічні структуровані вимоги до захищеного від кукурудзяного метелика ВІ (Сгу! АБ або Сгу 1Е) кукурудзяним продуктам наступні:
Структуровані резервати: 20 96 не захищених від лускокрилих ВІ кукурудзяних резервних культур у Кукурудзяній смузі; 50 95 не захищених від лускокрилих ВІ резервних культур у Бавовняній смузі.
Блоки
Внутрішній (тобто в межах поля ВО).
Зовнішній (тобто окремі поля в межах 72 милі (804 м) (якщо можливо, 1/4 милі (402 м)) від поля ВІ для максимізації випадкового спарювання).
Смуги всередині поля
Смуги повинні бути шириною щонайменше 4 ряди (переважно, б рядів) для зменшення ефектів пересування личинок".
Крім того, Національна Асоціація фермерів, які вирощують кукурудзу на своєму сайті інтернеті: (псда.сот/іпзесі-гебізтапсе-тападетепі-Ттасі-5певі-Бі-сотт) також публікує аналогічний посібник відносно вимог до резервату. Наприклад: "Вимоги до ІКМ відносно кукурудзяного метелика: - Засійте щонайменше 2095 вашого кукурудзяного поля гібридами не модифікованого насіння. - В ділянках, продукуючих бавовну, резерват повинен складати 50 95. - Повинні бути засіяні в межах 1/2 милі (804 м) від гібридів не модифікованого насіння. - Не модифіковане насіння може засіватися у вигляді смуг у межах поля ВЕ смуги резервних
Зо культур повинні мати ширину, щонайменше, 4 ряди. - Резервні культури можуть оброблятися звичайними пестицидами, тільки якщо для комахи- мішені досягаються економічні пороги. - Інсектициди, які розпиляються, на основі Ві не можуть використовуватися на не модифікованій кукурудзі. - Відповідна резервна культура повинна висіватися на кожній фермі з Ві кукурудзою".
Як зазначено Кои5Пп еї аі. (наприклад, на стор. 1780 ії 1784 у правому стовпчику), пакетування або "пірамідування" із двох різних білків, кожного ефективного проти шкідників - мішеней і з невеликою або відсутньою перехресною стійкістю може забезпечити можливість використання меншого резервату. Кои5п припускає, що для успішного пакета, розмір резервату менше ніж 1095, може забезпечити боротьбу із стійкістю, порівняну приблизно з 50 95 резерватом для однієї (не "пірамідованої") ознаки. Для доступних у даний час "пірамідованих" Ві кукурудзяних продуктів, Агентство США по захисту навколишнього середовища вимагає засіву значно меншого (як правило, 5 95) структурованого резервату, кукурудзою, яка не містить Ві білки, ніж для продуктів з однією ознакою (як правило, 20 9).
Існують різні шляхи забезпечення ефектів ІЕМ резервату, включаючи різні геометричні типи посіву на полях (як зазначено вище) і суміші насіння у мішку, як додатково обговорюється Кои5п егаї. (див. вище), і в патенті США 6551962.
Зазначені вище відсоткові частки або подібні співвідношення резервату можуть використовуватися для розглянутих подвійних або потрійних пакетів або пірамід.
Усі патенти, патентні заявки, тимчасові заявки і публікації, приведені у вигляді посилання або процитовані в даному описі, повністю включені за допомогою посилання в тій степені, у якій вони не суперечать визначеним положенням даного опису.
Нижче приведені приклади, які ілюструють методи здійснення винаходу. Ці приклади не слід розглядати як обмежуючі. Якщо не зазначене інше, усі відсоткові частки представлені за масою, і всі пропорції сумішей у розчиннику представлені за об'ємом. Усі величини температури представлені в градусах Цельсія.
Якщо спеціально не зазначене інше або не є на увазі інше, одиничне число означає використовуваний у даному описі термін "щонайменше один".
ПРИКЛАДИ Приклад 1 Конструювання експресійних плазмід, які кодують токсини повної бо довжини Стуз4АБІ1, Стуз5АБІ і СтубАа!
Стандартні способи клонування використовували при конструюванні експресійних плазмід
Рзейдотопах Пиогезсеп5 (РО), сконструйовані для продукції відповідно Стгу-білків СтгуЗз4АБІ1,
СтуЗ5АБІ і СгтубАа1. Рестрикційні ендонуклеази з біологічних лабораторій Нової Англії (МЕВ;
Ірзу'ісп, МА) використовували для переварювання ДНК, і Т4 ДНК лігазу від компанії Іпмігодеп використовували для лігування ДНК. Плазміди одержували з використанням набору Ріахтіа
Міді (Сіадеп) дотримуючись інструкцій постачальника. Фрагменти ДНК очищали, використовуючи картридж МіПроге ОКгаїйтее?-ОА (ВіПегіса, МА) після гель-електрофорезу в агарозному гелі з тріс-ацетатним буфером. Основна стратегія клонування передбачала субклонування послідовностей, які кодують, (СО5) повної довжини Сгу-білків у РМУС1803 для
СтузаАБІ і СтузбБАБІ і в ррОУМ1169 для СтублАа!, у рестрикційні сайти 5реї і Хпої (або заї|, який споріднений з Хо), відповідно, за допомогою чого їх поміщали під експресійний контроль відповідно промотору Ріас і термінатора ІгпВТІТ2 або гппВТ2 із плазміди рКК223-3 (РІ
Рпагтасіа, МіїмжашКеє, УМ). рМУС1803 являє собою плазміду із середнім числом копій з походженням реплікації з К5ЗЕ1010, гена стійкості до тетрацикліну, і сайтом зв'язування рибосоми, який передує сайтам розпізнавання рестрикційного ферменту, у які можуть бути внесені фрагменти ДНК, які містять білок ділянки, яку кодують, (заявка на патент США Мо 20080193974).
Експресійну плазміду як для Сту3З4АБІ, так і для СтузБАБІ трансформували електропорацією у штам МВ214 Р. Пиогезсеп5, витягнутий у середовищі 5ОС-соєвий гідролізат, і висівали на чашки з лізогенним бульйонним середовищем І ишгіа (І В), який містить 20 мкг/мл тетрацикліну. Експресійний вектор ррОУМ169 аналогічний РМУС1803, але рроОУМІ169 несе ген ругР, який кодує урацил, який використовували як маркер для скринінгу трансформантів, коли ауксотрофний відносно урацилу штам Р. Ппогезсеп5 (такий як ОРПО) використовували для трансформації на чашці з мінімальним середовищем МО, яке не містило урацил (Зсппеїдег еї аї. 2005). Подробиці мікробіологічних маніпуляцій доступні з заявки на патент США Мо 20060008877, заявки на патент США Мо 20080193974 і заявки на патент США Мо 20080058262, включених у даний опис за допомогою посилання. Проводили скринінг колоній рестрикційним розщепленням міні-препарату плазмідної ДНК. Послідовність плазмідної ДНК обраних клонів, які містять вставки, визначали за контрактом з комерційною організацією, яка проводить визначення послідовностей, такої як ММС Віоїесй (НипівхміПе, АГ). Дані послідовностей збирали й аналізували, використовуючи програмне забезпечення бедиепспег"м (Сепе Содев Согр., Апп
Атбог, МІ).
Приклад 2 - Ріст і експресія
Аналіз росту й експресії в струшуваних колбах, і продукцію токсинів СгуЗз4АБІ, Стуз5АБІ і
СтубАа1 для характеристики, включаючи зв'язування рецептора Ві і біологічний аналіз комах, здійснювали штамами Р. РіІпогезсеп5, що містять експресійні конструкти, вирощеними в струшуваних колбах, (наприклад, клону РМУС2593 для Сту3з4АБ1, рМУсС3122 для СгузЗ5БАБІ, їі рОрАВІ102018 для СтубАа1). Культури, які висіваються, для Сту3З4АрІі і СтуЗзБАБІ, вирощені протягом ночі в середовищі Р. Пцогезсеп5 з добавкою 20 мкг/мл тетрацикліну, використовували для інокуляції 200 мл того ж середовища з 20 мкг/мл тетрацикліну. Однак посівну культуру для
СтубАа!ї вирощували в мінімальному бульйоні МУ протягом ночі і використовували для інокуляції 200 мл середовища Р. РіІшогех5сеп5 без антибіотика. Експресію токсинів СтгуЗз4АбІ1,
СтузБАБІ і СтубАаї за допомогою промотору Ріас викликали додаванням ізопропіл-В-О0-1- тіогалактопіранозіду (ІРТО) після початкової інкубації протягом 24 годин при 28-302С при струшуванні при 300 об/хв. Зразки культури брали під час індукції й у різні часові точки після індукції. Густину клітин вимірювали за оптичною густиною при 600 нм (ОЮвоо).
Приклад З - Фракціонування клітин і аналіз ХО5-РАСЕ зразків зі струшуваних колб
У кожну часову точку взяття проб густину клітин зразків доводили до ОЮвоо-20 і аліквоти об'ємом по 1 мл центрифугували при 14000х9д протягом 5 хвилин. Клітинні осади після центрифугування заморожували при -802С. Розчинні і нерозчинні фракції з заморожених зразків клітинних осадів після центрифугування зі струшуваних колб, генерували з використанням розчину для екстракції бактеріального білка ЕазуЇ узе М (ЕРІСЕМТКЕФ Віоїесппоїодієх, Мадіхоп,
ММ). Кожен клітинний осад ресуспендували в 1 мл розчину ЕазуїЇ узе"м і додатково розводили 1:4 у літичному буфері і інкубували зі струшуванням при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. Лізат центрифугували при 14000 об/хв протягом 20 хвилин при 42С, і супернатант витягали у вигляді розчинної фракції. Потім осад після центрифугування (нерозчинну фракцію) ресуспендували в рівному об'ємі забуференого фосфатом сольового розчину (РВ5; 11,9 мМ
МагНРО», 137 мМ Масі, 2,7 мМ КС, р 7,4). Зразки змішували в співвідношенні 3:1 з буфером зразка 4Х Іаеттії, який містить В-меркаптоетанол, і кип'ятили протягом 5 хвилин перед бо завантаженням на гелі МИРАСЕ Момех 4-20 9о Віб5-Тгіз (Іпмігодеп, Сагізрай, СА). Електрофорез виконували в буфері, який рекомендується, МИРАСЕ МОР5. Гелі фарбували безпечною фарбою 5ЗітріуВіце"М Зате Зіаіїп стосовно протоколу виробника (Іпмігодеп) і візуалізували з використанням візуалізуючої системи Турпооп (СЕ Неаїсаге І їе Зсіепсе5, РІНЗригой, РА).
Приклад 4 - Отримання тілець включення
Препарати тілець включення (ІВ) Сгу-білка одержували на клітинах у результаті ферментації
Р. Ріногех5сеп5, що забезпечувало продукцію нерозчинного інсектицидного білка ВІ., як було продемонстровано 5ЮО5-РАСОЕ і МАГОІ-М5 (лазерною десорбцією при сприянні матриці/онізаційною мас-спектрометрією). Клітинні осади Р. РіІсогезсеп5, створені через 48 годин після індукції, відтавали на водяній лазні при 372С. Клітини ресуспендували до 25 95 мас./об. у літичному буфері (50 мМ Тріс, р 7,5, 200 мМ Масі, 20 мМ динатріевої солі ЕОТА (етилендиамінтетраоцтової кислоти), 190 ТиИйоп о Х-100 і 5 мМ дитіотреїтолу (ОТ); безпосередньо перед використанням додавали 5 мл/л коктейлю |інгібітору бактеріальної протеази (Р8465 Зідпта-АїЇйгісРп, ЇЇ. І оці5, МО) тільки для СтуЗз4АБІ і СтузБАБІ1. Клітини суспендували, використовуючи гомогенізатор при установці на найнижчий режим (Тіз5це Теагог,
Віозрес Ргодисів, Іпс., Вапіевзмійе, ОК). 25 мг лізоциму (Зідта І 7651 з білка курячого яйця) додавали до клітинної суспензії змішуванням металевим шпателем, і суспензію інкубували при кімнатній температурі протягом однієї години. Суспензію прохолоджували на льоді протягом 15 хвилин, потім обробляли ультразвуком, використовуючи ультразвуковий генератор Вгапзоп
Бопійег 250 (два 1-хвилинні сеанси, при 50 95 робочому циклі, продуктивність 30 95). Лізис клітин перевіряли мікроскопією. При необхідності, додавали додаткові 25 мг лізоциму й інкубацію й обробку ультразвуком повторювали. Коли лізис клітин підтверджувався мікроскопією, лізат центрифугували при 11500х49 протягом 25 хвилин (4 "С) для утворення осаду ІВ, і супернатант видаляли. Осад ІВ ресуспендували 100 мл літичного буфера, гомогенізували ручною мішалкою і центрифугували, як зазначено вище. Осад ІВ повторно промивали ресуспендуванням (у 50 мл літичного буфера), гомогенізацією, обробкою ультразвуком і центрифугуванням доти, поки супернатант не ставав безбарвним, і осад ІВ ставав щільним і не зовсім білим за кольором. Для кінцевого промивання, осад ІВ ресуспендували в підданій стерилізаційній фільтрації (через фільтр із розміром пір 0,22 мкм) дистильованій воді, яка містить 2 мМ ЕОТА, і центрифугували.
Кінцевий осад ресуспендували в підданій стерилізаційній фільтрації дистильованій воді, яка
Зо містить 2 мМ ЕОТА, і зберігали в 1 мл аліквотах при -8026.
Приклад 5 - Аналіз БХО5-РАСЕ і кількісне визначення
Аналіз 505-РАСЕ і кількісне визначення білка в препаратах ІВ проводили відтаванням 1 мл аліквоти осаду ІВ і розведенням 1:20 підданій стерилізаційній фільтрації дистильованою водою.
Потім розведений зразок кип'ятили з 4Х буфера зразка, який відновлює, (250 мм Тріс, рН 6,8, 95 гліцерин (об./06.), 0,495 бромфенол синій (мас./об.), 895 505 (мас/об.) і 895 р- меркаптоетанол (об6./06.)| і завантажували на Момех? 4-20 95 Тріс-гліцин, 1242-ямковий гель (Іпмігодеп), який працює з буфером ІХ Тріс/гліцин/505 (Іпмігодеп). Гель задіяли протягом приблизно 60 хв при 200 вольтах, потім фарбували і знебарвлювали наступними процедурами з використанням безпечного барвника 5ітріуВіце"М Заїе 5(аїп (Іпмігодеп). Кількісне визначення 40 цільових смуг проводили порівнянням денситометричних величин для смуг, у порівнянні зі зразками бичачого сироваткового альбуміну (В5А), обробленими на тім же гелі, для побудови стандартної кривої, використовуючи програмне забезпечення Віо-НКай Оцапійу Опе.
Приклад 6 - Солюбілізація тілець включення 10 мл суспензій тілець включення з клонів Р. Пиогезсеп5 МК1253, МК1636 і ОРИЗ3032 (які містять відповідно 50-70 мг/мл білків СтуЗз4АБІ, СтуЗзБАрІ ії СтгубАа!) центрифугували при установці на найвищий режим мікроцентрифуги Еррепадогі моделі 5415С (приблизно 14000ха) для осадження включень. Супернатант буфера для збереження видаляли і заміняли 25 мл 100 мм буфера ацетату натрію, рН 3,0, як для СтгуЗ4АБТ, так і для Стуз5АбБІ, і 50 мм буфера САРЗ
ІЗ-(циклогексаміно)-1-пропансульфонової кислоти), рН 10,5, для СтубАа!, у конічній пробірці ємністю 50 мл. Включення ресуспендували, використовуючи піпетку, і перемішували у вихровій мішалці для ретельного змішування. Пробірки поміщали на повільно обертову платформу при 42С протягом ночі для екстракції білків Стуз4АБІ, Стуз5АБІ і СтубАа1 повної довжини. Екстракти центрифугували при 30000хд протягом 30 хв при 42С, і зберігали отримані супернатанти, які містять солюбілізовані Сгу-білки повної довжини.
Приклад 7 - Зрізання протоксинів повної довжини
Білок СтузБАрІ повної довжини був зрізаний або переварений хімотрипсином для одержання його хімотрипсинової серцевини, яка являє собою активну форму Сгу-білка.
Зокрема, солюбілізований білок Стгуз5БАБі повної довжини інкубували з хімотрипсином (з бичачої підшлункової залози) (бЗідта, 5. МО) при (50:1-Сгу-білок:фермент, об./06.) у 100 мМ бо буфера ацетату натрію, рН 3,0, при 4 "С при обережному струшуванні протягом 2-3 днів. Повну активацію або зрізання підтверджували аналізом 505-РАСЕ. Молекулярна маса Сгуз5БАБІ1 повної довжини склала 44, і хімотрипсинова серцевина склала 40 кДа. Амінокислотні послідовності білка повної довжини і хімотрипсинової серцевини представлені у вигляді ЗЕО ІЮ
МО-1 і ЗЕО ІЮ МО:2. Ні хімотрипсинова, ні трипсинова серцевина не були доступні для СтуАБІ, а також СгтублАа! був значно більш активний для націлювання на кукурудзяного кореневого жука, ніж кожна з його хімотрипсинової або трипсинової серцевини. Таким чином, СгтуЗ4АБІ і СтубАа! повної довжини використовували для аналізів зв'язування. Амінокислотні послідовності
СтузаАБІ і Стубла! представлені у вигляді 5ЕО ІЮ МО:З і БЕО ІЮО МО 4.
Приклад 8 - Очищення Сгу-токсинів
Потім очищали хімотрипсинізований СтуЗз5АБІ1 і СтубАа! повної довжини з використанням системи іонозамінної хроматографії. Конкретно, розщеплений СтузБАб1 центрифугували при з0000хд протягом 30 хв при 4 "С з подальшим фільтруванням через фільтр з розміром пор 0,22 мкм для видалення ліпідів і всіх інших частинок, і отриманий розчин концентрували в 5 разів, використовуючи пристрій з центрифужним фільтром з регенерованої целюлози Атісоп Шйга-15 (відсічення молекулярної маси 10000; МійПіроге). Потім буфери зразків заміняли буфером 20 мМ ацетату натрію, рН 3,5, як для Сту3З4АБІ, так і для СтуЗзБАБІ, використовуючи одноразові стовпчики РО-10 (СЕ Неайсаге, Різсаїаулау, МУ) або діаліз. Їх потім очищали, використовуючи систему рідинної хроматографії АТКА Ехріогег (Атегепат Віозсіепсе5). Для Стгуз5АБІ1, буфер А являв собою буфер у вигляді 20 мМ ацетату натрію, рН 3,5, і буфер В являв собою буфер Ам масі, рН 3,5 тоді як для Стубла! буфер А являв собою 50 мМ СА5БР, рн 10,5, 1М Масі.
Використовували колонку НіТгар 5Р (5 мл) (СЕ) для зрізаного Стуз5АБІ1. Після того як колонка була цілком врівноважена з використанням буфера А, розчин СтуЗ5АБІ1 інжектували в стовпчик при швидкості потоку 5 мл/хв. Елюювання виконували з використанням градієнта 0-100 95 буфера В при 5 мл/хв із 1 мл/фракція.
Для СтубАа1 повної довжини, використовували колонку Саріо с), 5 мл (5 мл) (СЕ), і всі інші процедури були аналогічні процедурам для СгуЗзБАБІ. Після аналізу 50О5-РАСЕ обраних фракцій для додаткового вибору фракцій, які містять білок-мішень найкращої якості, фракції поєднували. Буфер для очищеної хімотрипсинової серцевини СтуЗз5АрІ1 заміняли 20 мМ Візві-
Тгі5, рН 6,0, як описано вище. Для очищеного СтгубАа!, сіль видаляли за допомогою діалізу
Зо проти 10 мМ САЗР, рН 10,5. Зразки зберігали при 49С для проведеного пізніше аналізу зв'язування після кількісного визначення з використанням 505-РАСЕ і аналізів системою візуалізації Турпооп (СЕ) з ВБА як стандарт. СтгуЗз4АрІ повної довжини був уже чистим після солюбілізації в кислотному буфері, за даними аналізу 5ЗО5-РАСЕ, і, таким чином, без подальшого очищення.
Приклад 9 - Препарати ВВММ
Препарати пухирців мембрани щіткової облямівки (ВВММУ) середньої кишки комах широко використовуються для аналізів зв'язування Сгу-токсину з рецептором. Препарати ВВМУ, використовувані в даному винаході, одержували з ізольованих середніх кишок третьої вікової стадії західного кукурудзяного кореневого жука (Оіабгоїїса мігуйїега мігуїєга есСопіє), використовуючи спосіб, описаний УмМоМегрегдег ей аїЇ (1987). Лейцинамінопептидазу використовували як маркер мембранних білків у препараті, і активність лейцинамінопептидази неочищеного гомогенату і препарату ВВММ визначали, як описано раніше (Гі еї аї. 2004а).
Концентрацію білка в препараті ВВММУ вимірювали, використовуючи спосіб Вгаса'тога (1976).
Приклад 10 - Мічення "25
Очищений Сгуз4АБІ повної довжини, хімотрипсинізований СтуЗз5АБІ і СтубАаї1ї повної довжини мітили, використовуючи "25І, для аналізів який насичує і конкурентного зв'язування. Для достовірності в тому, що мічення радіоактивним ізотопом не усуває біологічну активність Сгу- токсинів, проводили йодування в холодному вигляді, використовуючи Маї, стосовно інструкцій з використання гранул для йодування Ріегсе? (Рієгсе Віотесппоіоду, ТНегто Зсієпійіс, Воскога І).
Результати біоаналізу показали, що як йодована хімотрипсинова серцевина Сгуз5АБІ, так і
СтгубАаї повної довжини залишалися активними проти личинок західного кукурудзяного кореневого жука, але йодування інактивувало Сгу3з4АБІ. Як очікувалося, 725І1-СтузаАрІ1 специфічно не зв'язувався з ВВММУ комах, і, отже, СгуЗз4АБІ1 вимагає іншого способу мічення для оцінки зв'язування з мембранними рецепторами. Біоаналіз з використанням йодованої трипсинової серцевини СтуЗАа продовжувався, і результат був доступний через один або два тижні. 125|-СтуЗз5АБІ1 і 125І-СтубАа1 були отримані йодуванням гранулами для йодування Ріегсе? (Ріегсе) і Ма"25Ї. Стовпчика для знесолення на вибір 7ера"м (Ріегсе) використовували для видалення не включеного або вільного Ма'25| з йодованого білка. Величини питомої радіоактивності йодованих Сгу-білків знаходилися в діапазоні від 1 до 5 мкКі/мкг. Проводили бо множинні серії мічення й аналізів зв'язування.
Приклад 11 - Аналізи насичувального зв'язування
Аналізи насичу вального зв'язування виконували, використовуючи мічені 125| Сту-токсини, як описано раніше (Гі еї аІ. 2004р). Для визначення специфічного зв'язування й оцінки афінності зв'язування (константи дисоціації, Ка) і концентрації сайтів зв'язування (кількості токсину, специфічно зв'язаного з даною кількістю ВВМУ, Вітах) Стуз5АБІ і СтубАа! з ВВММУ комах, серії зростаючих концентрацій або 7"25І-СтгуЗз5АБІ1, або 125І-СтубАа!1 інкубували з даною концентрацією (01 мг/мл) ВВММ комах відповідно в 150 мкл 20 мМ Вів-Ттгі5, рН 6,0, 136,9 мМ масі, 2,7 мМ КСІ з додаванням 0,1 95 ВБ5А при кімнатній температурі протягом 60 хв при обережному струшуванні.
Токсин, зв'язаний з ВВМУ, відокремлювали від вільних токсинів у суспензії центрифугуванням при 20000х9 при кімнатній температурі протягом 60 хв при обережному струшуванні. Токсин, зв'язаний з ВВМУ, відокремлювали від вільного токсину в суспензії центрифугуванням при 20000х9 при кімнатній температурі протягом 8 хв. Осад після центрифугування двічі промивали 900 мл такого ж крижаного буфера, який містить 0,1 95 В5А. Радіоактивність, яка залишається в осаді після центрифугування, вимірювали автоматичним гамма-лічильником СОВКАЇ Ашо-
Сбатта сошпіег (РаскКага, компанії Сапбрегїта) і враховували загальне зв'язування.
Паралельно проводили іншу серію реакцій зв'язування, і в кожну з реакцій зв'язування включали 500-1000-кратний надлишок неміченого відповідного токсину для повного заняття всіх сайтів специфічного зв'язування на ВВМУ, які використовували для визначення неспецифічного зв'язування. Специфічне зв'язування оцінювали вираховуванням неспецифічного зв'язування з загального зв'язування. Величини Ка і Втах токсинів оцінювали, використовуючи число молекул токсину (пкмоль), специфічно зв'язаних на мікрограм білка ВВМУ, у порівнянні з концентраціями використаного міченого токсину, шляхом програмного забезпечення сСгарпРай
Ргівт 5.01 (сгарпРайд Зоймаге, Зап Оіедо, СА). Графіки складали з використанням програм або
Місгозой Ехсе!, або сСгарпРай Ргізт. Експерименти повторювали щонайменше три рази. Ці експерименти зв'язування продемонстрували, що як 125І1-Стуз5АБІ, так і 125І-СтубАа! були здатні специфічно зв'язуватися з ВВММ (фіглА і 18). 125І-СтуЗз5АБІ і 7125І-СтубАаї мали афіність зв'язування Ка-11,66211,35 і 7,99:4,89 (НМ), відповідно, і концентрацію ділянок зв'язування
Втах-5,19:23,02 і 2,71:2-0,90 (пкмоль/мкг ВВМУ), відповідно.
Приклад 12 - Аналізи конкурентного зв'язування
Зо Аналізи конкурентного зв'язування додатково проводили для визначення того, чи розділяють СтуЗзБАБІ і СтубАа1! той самий набір рецепторів. Для аналізів гомологічного конкурентного зв'язування СгтуЗз5АбІ, яке збільшує кількості (0-5000 нМ) неміченого Стуз5АБІ1 спочатку змішували з 5 нМ міченого Стгуз5АБІ, і потім інкубували з даною концентрацією (0,1 мг/мл) ВВММ при кімнатній температурі протягом 60 хв, відповідно. Відсоткові частки зв'язаного 125|-СтузБАБІ з ВВММ визначали для кожної з реакцій, у порівнянні з початковим специфічним зв'язуванням під час відсутності неміченого конкурента. Виконували аналізи гетерологічного конкурентного зв'язування відповідно між 7"25І1-СтуЗз5БАБІ1 і неміченим СгубАаї1 для ідентифікації того, чи розділяють вони той самий набір рецептора(ів). Це досягалося збільшенням кількості неміченого СтубАа!1 як конкурента, включеного в реакції, для конкуренції за передбачуваний рецептор(ри) на ВВММУ з міченим Стуз5АБрІ1. Експерименти повторювали щонайменше три рази.
Експериментальні результати продемонстрували, що СтгтуЗзБАБІ!І був здатний цілком витіснятися більше ніж на 50 95, коли молярна концентрація збільшувалася приблизно до 100
НМ (20-кратний надлишок, у порівнянні з 725І-СтузБАБІ). Приблизно 50 95, які залишились, вважали неспецифічним зв'язуванням, яке не могло витіснятися на підставі результатів зв'язування, яке насичує, як описано вище. Це означає, що специфічне зв'язування цілком витіснялося 20-кратним надлишком неміченого Стгуз5АБІ1 (фіг.2). Однак СтгубАа!1 був нездатний витиснути 725І-СтуЗз5АБІ1. Ці дані вказують на те, що СтуЗ5АБІ1 не розділяє рецептор з СтубАа!1.
То, чи розділяють рецептор СтуЗ4АБІ1 ії СтубАа!, залишається протестувати, використовуючи
СтузаАрІ, для конкуренції за зв'язування з міченим радіоактивним ізотопом СтубАа або неміченим СгубАа! іншим способом мічення.
Посилання:
Вгадтога, М.М. 1976. А гаріа апа вепвійїме теїпоа ог Ше доапійайоп ої тісгодгат доапійіев ої ргооївїп шйігіпу Пе ргіпсіріє ої ргоївіп-дує Біпаїіпа, Апаї. Віоспет. 72, 248-254.
Її, Н., Орренп, В., Ніддіп5, К..., Ниапо, Е., 2пи, К.У., Визсптап, Г.Г., 2004а. Сотрагайме апаїувів ої ргоївїпазе асіїмйев ої Васіїи5 Іпигпдіепвів-тезізіапі апа-зивсеріїбіе Овійпіа пибііайїв (І ерідорієга: Статрбрідає). Іпзесі Віоспет. Мо!. Віої. 34, 753-762.
Ії, Н., Оррен, В., СоплаІє:-Саньгега, 9., Гете, у., Ніддіп5, К.А., Визсптап, І.Г. і 7пи, К.У. апа
Ниапо, РЕ. 20046. Віпаїпуд апаїузіз ої Сту! АБ ї Сту 1 Ас м/ййп тетюгапе мезісіез їот Васійив5
Іигіпдієпвів-гтевівїапі апа-зивсеріїбіе О5інпіа пибіїаїїв (І ерідорієега: Статрідає). Віоспет. Віорпув.
Вез. боттип. 323, 52-57. зЗеппеїдетг, уУ.б. депіпдз АЕ, Мип ОМ, МеСомет РМ, Спем І С. 2005. Аихоїгорпіс таїКег5 ругЕ апа роб сап геріасе апіїбіоїїс тагКег5 оп ргоївїпй ргодисіоп ріавтідв іп Ніднп-сеїІ-депейу
Реєидотопаз Пиогезсепз Тептепіайоп. Віотесппоіоду Ргодгезз 21, 343-348.
Муогег5регодег, М.С, І щу, Р., Маштгег, А., Рагепії, Р., Засепі, Е., Сіогдапа, В., Напогеї, С.М., 1987. Ргерагайоп апа рапйіа! сНагасієгігайоп ої атіпо асіа іап5ропіпа Ббги5п рогаєгї тетбгапе мевісіез їїот пе Іагуа! тіддиї ої Те сарбаде Бицепіу (Рієгів Бгаззісає). Сотр. Віоспет. Рпузіо!. 86А, 301-308. 5 Раїєпі Арріїсайоп Мо. 20080193974. 2008. ВАСТЕВІАЇ ГЕАОЕВ 5ЕООЕМСЕВ ГОВ
ІМСВЕА5ЗЕО ЕХРАЕЗБІОМ
И5 Раїепі Арріїсайоп Мо. 20060008877, 2006. Ехргезвіоп зузієт5 м/йй зес-з5узіет 5естеїййоп.
И5 Раїепі Арріїсайоп Мо. 20080058262, 2008. ТРА оріїтігайоп.

Claims (18)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Трансгенна рослина кукурудзи, яка продукує білок СтуЗ4АБІ, білок СтуЗ5АБІ і інсектицидний білок СгтубАа!, де зазначений білок Сгуз5АрІ має послідовність, яка складається з 5ЕО ІЮ МО:1, і зазначений інсектицидний білок СтгубАа1 має послідовність, яка складається з 5ЗЕО ІЮ МО:4, і зазначений білок СтгуЗз4АБІ має послідовність, яка складається з 5ЕО ІЮ МО:3, Її де зазначений білок СтуЗз5БАБі та зазначений інсектицидний білок СгубАа1! мають різні сайти зв'язування у кишечнику кукурудзяного кореневого жука.
2. Насінина трансгенної рослини кукурудзи за п. 1, де зазначена насінина містить ДНК, яка кодує зазначений білок СтуЗ4АБІ1, білок Стгуз5АБІ і білок СтубАа!.
3. Множина трансгенних рослин кукурудзи за п. 1, яка додатково містить резервні рослини, що не містять білки Ві, де зазначені резервні рослини складають менше ніж 40 95 зазначеної множини рослин.
4. Множина трансгенних рослин кукурудзи за п. 3, де зазначені резервні рослини складають менше ніж 30 95 всіх культур зазначеної множини рослин. Зо
5. Множина трансгенних рослин кукурудзи за п. 3, де зазначені резервні рослини складають менше ніж 20 95 всіх культур зазначеної множини рослин.
6. Множина трансгенних рослин кукурудзи за п. 3, де зазначені резервні рослини складають менше ніж 10 95 всіх культур зазначеної множини рослин.
7. Множина трансгенних рослин кукурудзи за п. З, де зазначені резервні рослини складають менше ніж 5 9о всіх культур зазначеної множини рослин.
8. Множина трансгенних рослин кукурудзи за п. 3, де зазначені резервні рослини розташовані блоками або смугами.
9. Суміш трансгенного насіння кукурудзи, яка містить резервне насіння від резервних рослин, які не містять Ві-білки, і множину насіння за п. 2, де зазначене насіння містить ДНК, що кодує білок СтузЗ4АБІ, білок СгуЗ5БАБІ і зазначений білок СтубАа!, де зазначене резервне насіння складає менше ніж 40 95 усього насіння у суміші.
10. Суміш трансгенного насіння кукурудзи за п. 9, де зазначене резервне насіння складає менше ніж 30 95 усього насіння у суміші.
11. Суміш трансгенного насіння кукурудзи за п. 9, де зазначене резервне насіння складає менше ніж 20 95 усього насіння у суміші.
12. Суміш трансгенного насіння кукурудзи за п. 9, де зазначене резервне насіння складає менше ніж 10 95 усього насіння у суміші.
13. Суміш трансгенного насіння кукурудзи за п. 9, де зазначене резервне насіння складає менше ніж 5 95 усього насіння у суміші.
14. Спосіб керування розвитком стійкості до Стгу-білка в кукурудзяного коренеревого жука, який включає висівання насіння за будь-яким з пп. 9-13 для одержання множини рослин за будь-яким з пп. 3-7 і контактування зазначеного кукурудзяного кореневого жука із зазначеною множиною трансгенних рослин кукурудзи.
15. Множина трансгенних рослин кукурудзи за будь-яким з пп. 3-8, де зазначені рослини займають більше ніж 10 акрів (40,5 га).
16. Рослинна клітина трансгенної рослини кукурудзи за п. 1, де зазначений білок СтуЗз5АБІ1 має послідовність, яка складається з 5ЕО ІЮ МО:1, зазначений інсектицидний білок СгубАа!1! має послідовність, яка складається з 5ЕО ІЮО МО:4, і зазначений білок СтуЗз4АБбІ1 має послідовність, яка складається з БЕО ІЮ МО:3.
17. Спосіб одержання рослинної клітини трансгенної рослини кукурудзи за п. 16, який включає трансформацію рослинної клітини трансгенної рослини кукурудзи ДНК, що кодує інсектицидний білок СтубАа!1, ДНК, що кодує білок СтуЗ4АБТ, і ДНК, що кодує білок Стуз5АБІ1.
18. Спосіб боротьби з кукурудзяним кореневим жуком приведенням у контакт зазначеного кукурудзяного кореневого жука з білком СтуЗ4АБІ, білком СтуЗз5АБІ і інсектицидним білком СтубАа1, охарактеризованими в п. 1, де зазначений білок СтуЗзБАБі та зазначений інсектицидний білок СтубАа! мають різні сайти зв'язування у кишечнику кукурудзяного кореневого жука. Е « . В зер ЗрКОМКЕ ТЕ ВУВАННЯ 2 А ; уки й ка Тк: ЗВУ ВаВИХ м ь | в ГРАФІКИ ЦКМ: ЗВ'ЯЗУВОНия Ба х ще нн а Клен іхНи зн яЗуНиНИиВ ік т Е я ши Й но ї ях
М. є не й ї і Б т -4 о - Кк в шк ЩА ой нн щк х: ШЕ " ДОВ скекоермнноюоююя ен нн ни Я Х 5 5 В СЕ Брю туУаВАВІ з в ме НН : «фе ЛнгалМ МК ЖВИННХ пжиИ кожен в. хід Мене зе иквання ще М З бе садкх КОЦДЕКВІ На БИК ВННВУ щих Фк . й де З з я й п ши а ЩЕ Б ко З т ВЕ ; щи не ДИ кіууискннноЯВ ГОДЕх Я й : Де ння щі 8 в нн п п вн в ня 8 З Я В 8 зх буду уйлаї їм) Зкяочання СЗЗ АВН АР УВА У як бенквій мічених падіювктвнним темне м Ску-техенвів, які ввалямея У ВВА ГУ, сувимані з печинок захивго яжкУВУ ВО кореневого щука. Спецнфнне ЗВ яЗУНВиНЯ : МН вНЄ ЗВ 'ЯЗУВаННЯ неененифо хв язевавя, сиусаю ся ВЕ г ехвн ав юча: пожнока середньо «Фіг. 1 дока ЗВ ЗУ ВнННх Меспемчною меуккакня уж КНН ЗВ еНаННа МОУ ОК г М мо А І Мой и гзозкАВІ й Ми, ММ М М СУА МОМ ОО ММ МУ і; Мо М Кн Он що М ОО мо о ЗК ення Оле ОН І, ПММ КО ОМ М М 3 М ЕКО ня 5 МО ох ОО З З ЕХО ОК с ОО ОМ М М В В ВО Дю М ск ос Ух х о сх ме Н май щи же ШЕ Не и С Я ЗЕ З т: НАННЯ ТК ут В СТУ КЕВЮ І осотчяхех уко ма сзухожоУхіх «утаий кк аку.
Хибна ху У Знжзування СТАВ з НМУ, стриманими звизянак захіаного кУкУВУДОКУ кореневого жуки ре рзнх коннентриціях неміченого конкурентя ові о то т ов, Те НЯ Чнг, З
UAA201213337A 2010-04-23 2011-04-22 ТРАНСГЕННА РОСЛИНА КУКУРУДЗИ, ЯКА ПРОДУКУЄ БІЛКИ Cry34Ab1, Cry35Ab1 І Cry6Aa1 ДЛЯ ЗАПОБІГАННЯ РОЗВИТКУ СТІЙКОСТІ У КУКУРУДЗЯНОГО КОРЕНЕВОГО ЖУКА (Diabrotica spp.) UA116612C2 (uk)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US32724010P 2010-04-23 2010-04-23
US38827310P 2010-09-30 2010-09-30
US201161476005P 2011-04-15 2011-04-15
US201161477447P 2011-04-20 2011-04-20
PCT/US2011/033621 WO2011133895A1 (en) 2010-04-23 2011-04-22 Combinations including cry34ab/35ab and cry6aaproteins to prevent development of resistance corn rootworms(diabrotica spp.)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA116612C2 true UA116612C2 (uk) 2018-04-25

Family

ID=44834532

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201213336A UA116081C2 (uk) 2010-04-23 2011-04-22 ТРАНСГЕННА РОСЛИНА КУКУРУДЗИ, ЯКА ПРОДУКУЄ БІЛКИ Cry34Ab1, Cry35Ab1 і Cry3Aa ДЛЯ ЗАПОБІГАННЯ РОЗВИТКУ СТІЙКОСТІ У КУКУРУДЗЯНОГО КОРЕНЕВОГО ЖУКА
UAA201213337A UA116612C2 (uk) 2010-04-23 2011-04-22 ТРАНСГЕННА РОСЛИНА КУКУРУДЗИ, ЯКА ПРОДУКУЄ БІЛКИ Cry34Ab1, Cry35Ab1 І Cry6Aa1 ДЛЯ ЗАПОБІГАННЯ РОЗВИТКУ СТІЙКОСТІ У КУКУРУДЗЯНОГО КОРЕНЕВОГО ЖУКА (Diabrotica spp.)
UAA201213338A UA112516C2 (uk) 2010-04-23 2011-04-22 ТРАНСГЕННА РОСЛИНА, ЯКА ПРОДУКУЄ БІЛОК Сry34Ab1, БІЛОК Сry35Ab1 І ІНСЕКТИЦИДНИЙ БІЛОК Сry3Ba1, ДЛЯ ЗАПОБІГАННЯ РОЗВИТКУ СТІЙКОСТІ В КУКУРУДЗЯНИХ КОРЕНЕВИХ ЖУКІВ (Diabrotica spp.)

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201213336A UA116081C2 (uk) 2010-04-23 2011-04-22 ТРАНСГЕННА РОСЛИНА КУКУРУДЗИ, ЯКА ПРОДУКУЄ БІЛКИ Cry34Ab1, Cry35Ab1 і Cry3Aa ДЛЯ ЗАПОБІГАННЯ РОЗВИТКУ СТІЙКОСТІ У КУКУРУДЗЯНОГО КОРЕНЕВОГО ЖУКА

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201213338A UA112516C2 (uk) 2010-04-23 2011-04-22 ТРАНСГЕННА РОСЛИНА, ЯКА ПРОДУКУЄ БІЛОК Сry34Ab1, БІЛОК Сry35Ab1 І ІНСЕКТИЦИДНИЙ БІЛОК Сry3Ba1, ДЛЯ ЗАПОБІГАННЯ РОЗВИТКУ СТІЙКОСТІ В КУКУРУДЗЯНИХ КОРЕНЕВИХ ЖУКІВ (Diabrotica spp.)

Country Status (20)

Country Link
US (5) US9796983B2 (uk)
EP (5) EP3366118A1 (uk)
JP (4) JP5922098B2 (uk)
KR (4) KR101842724B1 (uk)
CN (5) CN102946717A (uk)
AR (4) AR081284A1 (uk)
AU (4) AU2011242579B2 (uk)
BR (4) BR112012027208A2 (uk)
CA (4) CA2796728A1 (uk)
CL (3) CL2012002965A1 (uk)
CO (4) CO6592036A2 (uk)
ES (1) ES2665514T3 (uk)
IL (4) IL222583A (uk)
MA (4) MA34242B1 (uk)
MX (3) MX2012012369A (uk)
NZ (4) NZ603564A (uk)
RU (4) RU2576005C2 (uk)
UA (3) UA116081C2 (uk)
WO (4) WO2011133892A1 (uk)
ZA (3) ZA201208639B (uk)

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103125516B (zh) * 2011-11-24 2014-12-17 华中农业大学 对南方根结线虫具有杀虫增效作用的蛋白组合物Cry6Aa/Cry55Aa及应用
WO2014071182A1 (en) 2012-11-01 2014-05-08 Massachusetts Institute Of Technology Directed evolution of synthetic gene cluster
MX359026B (es) 2013-08-16 2018-09-12 Pioneer Hi Bred Int Proteinas insecticidas y metodos de uso.
BR122021005579B1 (pt) 2013-09-13 2022-11-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc Construto de dna, método de obtenção de planta transgênica, proteína de fusão, método para controlar uma população de praga de inseto, método para inibir o crescimento ou matar uma praga de inseto
AR097995A1 (es) * 2013-10-14 2016-04-27 Syngenta Participations Ag Método para sembrar filas de cultivos
EP3082469B1 (en) 2013-12-20 2023-09-06 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Rnapii-140 nucleic acid molecules that confer resistance to coleopteran pests
BR102014031844A2 (pt) 2013-12-20 2015-10-06 Dow Agrosciences Llc ras oposto (rop) e moléculas de ácido nucleico relacionadas que conferem resistência a pragas de coleópteros e hemípteros
BR112016018103B1 (pt) 2014-02-07 2024-01-16 E.I. Du Pont De Nemours And Company Polipeptídeo e seu uso, polinucleotídeo, composição, proteína de fusão, método para controlar uma população, método para inibir o crescimento, método para controlar a infestação, método para obtenção de uma planta ou célula vegetal, construto
ES2806473T3 (es) 2014-02-07 2021-02-17 Pioneer Hi Bred Int Proteínas insecticidas y métodos para su uso
UY36113A (es) 2014-05-07 2015-10-30 Dow Agrosciences Llc Moléculas de ácido nucleico dre4 que confieren resistencia a plagas de coleópteros
WO2016000237A1 (en) 2014-07-03 2016-01-07 Pioneer Overseas Corporation Plants having enhanced tolerance to insect pests and related constructs and methods involving insect tolerance genes
BR112017007932A2 (pt) 2014-10-16 2018-01-23 Du Pont proteínas inseticidas e métodos para uso das mesmas
WO2016086010A1 (en) 2014-11-24 2016-06-02 Poet Research, Inc. Corn blends that include high oil corn and methods of making one or more biochemicals using high oil corn or corn blends that include high oil corn
CA2977026A1 (en) 2015-03-11 2016-09-15 E.I. Du Pont De Nemours And Company Insecticidal combinations of pip-72 and methods of use
RU2017144238A (ru) 2015-05-19 2019-06-19 Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. Инсектицидные белки и способы их применения
CA2986265A1 (en) 2015-06-16 2016-12-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
RU2769873C2 (ru) 2015-07-13 2022-04-07 Пивот Байо, Инк. Способы и композиции для улучшения признаков растений
CN107846897A (zh) * 2015-07-23 2018-03-27 孟山都技术公司 多功能毒素
UA124495C2 (uk) 2015-08-06 2021-09-29 Піонір Хай-Бред Інтернешнл, Інк. Інсектицидний білок рослинного походження та спосіб його застосування
CN108026149B (zh) * 2015-08-17 2022-04-29 美国陶氏益农公司 工程化的cry6a杀虫蛋白
CN108291219B (zh) 2015-10-05 2023-02-17 麻省理工学院 使用重构nif簇的氮固定
EP3390431A1 (en) 2015-12-18 2018-10-24 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
CN105483240A (zh) * 2015-12-26 2016-04-13 吉林省农业科学院 转基因植物中cry34Ab基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法
CN105506081A (zh) * 2015-12-26 2016-04-20 吉林省农业科学院 转基因植物中cry35Ab基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法
US11028407B2 (en) 2016-04-19 2021-06-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal combinations of polypeptides having improved activity spectrum and uses thereof
US11008585B2 (en) 2016-05-04 2021-05-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
CN109312359A (zh) 2016-06-16 2019-02-05 先锋国际良种公司 用以防治昆虫有害生物的组合物和方法
CN109642237B (zh) 2016-06-24 2022-09-30 先锋国际良种公司 植物调节元件及其使用方法
EP3954202A1 (en) 2016-07-01 2022-02-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins from plants and methods for their use
WO2018013333A1 (en) 2016-07-12 2018-01-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
CA3049258A1 (en) 2017-01-12 2018-07-19 Pivot Bio, Inc. Methods and compositions for improving plant traits
US20190390219A1 (en) 2017-02-08 2019-12-26 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal combinations of plant derived insecticidal proteins and methods for their use
CA3057145A1 (en) * 2017-04-03 2018-10-11 Monsanto Technology Llc Novel insect inhibitory proteins
US20200165626A1 (en) 2017-10-13 2020-05-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Virus-induced gene silencing technology for insect control in maize
CN111587287A (zh) 2017-10-25 2020-08-25 皮沃特生物股份有限公司 用于改良固氮的工程微生物的方法和组合物
WO2019165245A1 (en) 2018-02-22 2019-08-29 Zymergen Inc. Method for creating a genomic library enriched for bacillus and identification of novel cry toxins
KR20200127180A (ko) 2018-03-02 2020-11-10 지머젠 인코포레이티드 살충 단백질 발견 플랫폼 및 이로부터 발견된 살충 단백질
WO2019226508A1 (en) 2018-05-22 2019-11-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant regulatory elements and methods of use thereof
US11963530B2 (en) 2018-06-27 2024-04-23 Pivot Bio, Inc. Agricultural compositions comprising remodeled nitrogen fixing microbes
CN112438198A (zh) * 2019-08-30 2021-03-05 中国农业大学 利用杂交不亲和基因在制备抗虫转基因玉米庇护所中的应用
WO2021221690A1 (en) 2020-05-01 2021-11-04 Pivot Bio, Inc. Modified bacterial strains for improved fixation of nitrogen
WO2021222567A2 (en) 2020-05-01 2021-11-04 Pivot Bio, Inc. Modified bacterial strains for improved fixation of nitrogen
CN111574599B (zh) * 2020-05-18 2022-10-28 福建农林大学 一种解决杀虫毒素被昆虫肠道消化酶过度酶解的毒素改造方法
WO2022015619A2 (en) 2020-07-14 2022-01-20 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
CN112063748A (zh) * 2020-10-13 2020-12-11 中国农业科学院生物技术研究所 用于检测转基因玉米g1105e-823c的rpa引物探针组合、试剂盒及检测方法
CA3218556A1 (en) 2021-07-02 2023-01-05 Pivot Bio, Inc. Genetically-engineered bacterial strains for improved fixation of nitrogen
CN115029369B (zh) * 2022-06-01 2023-04-21 中国林业科学研究院森林生态环境与自然保护研究所 一种防治松材线虫病的苏云金芽孢杆菌工程菌制备方法与应用

Family Cites Families (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1558396A (en) * 1923-11-08 1925-10-20 Roehrs Rudolph Lienau Grass-seed container
US4762785A (en) 1982-08-12 1988-08-09 Calgene, Inc. Novel method and compositions for introducting alien DNA in vivo
EP0320500B1 (en) 1983-01-13 2004-11-17 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Non-oncogenic ti plasmid vector system and recombinant DNA molecules for the introduction of expressible genes into plant cell genomes
WO1984002919A1 (en) 1983-01-17 1984-08-02 Monsanto Co Plasmids for transforming plant cells
NL8300698A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
NL8300699A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; werkwijze voor het produceren van agrobacterium tumefaciens bacterien; stabiele cointegraat plasmiden; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
US5380831A (en) 1986-04-04 1995-01-10 Mycogen Plant Science, Inc. Synthetic insecticidal crystal protein gene
NL8401048A (nl) 1984-04-03 1985-11-01 Rijksuniversiteit Leiden En Pr Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van eenzaadlobbige planten.
US5231019A (en) 1984-05-11 1993-07-27 Ciba-Geigy Corporation Transformation of hereditary material of plants
NL8401780A (nl) 1984-06-04 1986-01-02 Rijksuniversiteit Leiden En Pr Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van planten.
US5149645A (en) 1984-06-04 1992-09-22 Rijksuniversiteit Leiden Process for introducing foreign DNA into the genome of plants
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
EP0265502A1 (en) 1986-04-30 1988-05-04 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Electric field mediated dna transformation of plant cells and organelles
US5188958A (en) 1986-05-29 1993-02-23 Calgene, Inc. Transformation and foreign gene expression in brassica species
US5177010A (en) 1986-06-30 1993-01-05 University Of Toledo Process for transforming corn and the products thereof
EP0267159A3 (de) 1986-11-07 1990-05-02 Ciba-Geigy Ag Verfahren zur genetischen Modifikation monokotyler Pflanzen
SE455438B (sv) 1986-11-24 1988-07-11 Aga Ab Sett att senka en brennares flamtemperatur samt brennare med munstycken for oxygen resp brensle
US5004863B2 (en) 1986-12-03 2000-10-17 Agracetus Genetic engineering of cotton plants and lines
EP0513849B1 (en) 1987-05-20 1998-08-19 Novartis AG Method of preparing transgenic Zea mays plants regenerated from protoplasts or protoplast-derived cells
US5753492A (en) * 1987-08-12 1998-05-19 Mycogen Corporation Genes encoding nematode-active toxins from Bacillus thuringiensis strains
US5302523A (en) 1989-06-21 1994-04-12 Zeneca Limited Transformation of plant cells
US5141131A (en) 1989-06-30 1992-08-25 Dowelanco Method and apparatus for the acceleration of a propellable matter
WO1992009696A1 (en) 1990-11-23 1992-06-11 Plant Genetic Systems, N.V. Process for transforming monocotyledonous plants
US5384253A (en) 1990-12-28 1995-01-24 Dekalb Genetics Corporation Genetic transformation of maize cells by electroporation of cells pretreated with pectin degrading enzymes
JPH07504087A (ja) 1992-02-12 1995-05-11 クロマジェン　インク 蛍光性ｎ−ヌクレオシド及び蛍光性ｎ−ヌクレオシド構造類似体の応用
WO1993021335A2 (en) 1992-04-15 1993-10-28 Plant Genetic Systems, N.V. Transformation of monocot cells
ATE398679T1 (de) 1992-07-07 2008-07-15 Japan Tobacco Inc Verfahren zur transformation einer monokotyledon pflanze
US5469976A (en) 1993-04-30 1995-11-28 Burchell; James R. Shelf allocation and management system
EP0627752B1 (en) 1993-06-04 1997-07-23 CAVIS S.r.l. An inertia device for interrupting the electrical circuit of a vehicle with an internal combustion engine
GB9318207D0 (en) * 1993-09-02 1993-10-20 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
US6372480B1 (en) 1996-04-19 2002-04-16 Mycogen Corporation Pesticidal proteins
US6083499A (en) 1996-04-19 2000-07-04 Mycogen Corporation Pesticidal toxins
US5874288A (en) * 1997-07-31 1999-02-23 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis toxins with improved activity
US6218188B1 (en) 1997-11-12 2001-04-17 Mycogen Corporation Plant-optimized genes encoding pesticidal toxins
US6060594A (en) * 1997-12-18 2000-05-09 Ecogen, Inc. Nucleic acid segments encoding modified bacillus thuringiensis coleopteran-toxic crystal proteins
US6023013A (en) * 1997-12-18 2000-02-08 Monsanto Company Insect-resistant transgenic plants
DE19825333A1 (de) * 1998-06-05 1999-12-09 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Verfahren zur Kontrolle von Schadorganismen in Nutzpflanzen
CN1360632A (zh) 1999-05-04 2002-07-24 孟山都技术有限公司 鞘翅目毒性多肽组合物和抗虫转基因植物
US6501009B1 (en) * 1999-08-19 2002-12-31 Monsanto Technology Llc Expression of Cry3B insecticidal protein in plants
AR025349A1 (es) 1999-08-23 2002-11-20 Mycogen Corp Metodos para controlar las plagas del gusano gris
CN1338262A (zh) * 2000-08-11 2002-03-06 张泽国 复方乌头膏及其制备方法
US6551962B1 (en) 2000-10-06 2003-04-22 Monsanto Technology Llc Method for deploying a transgenic refuge
US7230167B2 (en) * 2001-08-31 2007-06-12 Syngenta Participations Ag Modified Cry3A toxins and nucleic acid sequences coding therefor
US20040210964A1 (en) * 2003-02-20 2004-10-21 Athenix Corporation AXMI-009, a delta-endotoxin gene and methods for its use
BRPI0409161A (pt) * 2003-04-04 2006-04-11 Syngenta Ltd método melhorado de controle da resistência para lavouras transgênicas
US7524810B1 (en) 2003-10-03 2009-04-28 Dow Agrosciences Llc Modified Cry34 proteins
US7309785B1 (en) 2003-10-03 2007-12-18 Dow Agrosciences Llc Modified chimeric Cry35 proteins
US20050183161A1 (en) * 2003-10-14 2005-08-18 Athenix Corporation AXMI-010, a delta-endotoxin gene and methods for its use
EP2336153B1 (en) 2003-11-21 2016-03-30 Pfenex Inc. Improved expression systems with SEC-system secretion
US20080226753A1 (en) * 2004-03-29 2008-09-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method of Reducing Insect Resistant Pests in Transgenic Crops
CA2897475C (en) 2004-04-30 2018-07-10 Dow Agrosciences Llc Novel herbicide resistance genes
US7985892B1 (en) * 2004-06-29 2011-07-26 Dow Agrosciences Llc Truncated Cry35 proteins
CA2614353A1 (en) * 2005-07-08 2007-01-18 Hexima Limited Management of plant pathogens
EP1957653A4 (en) * 2005-08-30 2009-12-30 Phyllom Llc TRANSGENIC PLASTIC LAYER RESISTANT TO INSECTS
AU2006308959B2 (en) 2005-10-28 2012-09-06 Corteva Agriscience Llc Novel herbicide resistance genes
EP2363495B1 (en) 2006-05-30 2019-07-24 Pfenex Inc. Anthrax vaccine
CN200985135Y (zh) * 2006-12-20 2007-12-05 贵州省烟草科学研究所 细粒种子袋
CA2672762A1 (en) * 2006-12-22 2008-07-03 Daniel J. Cosgrove Resistance management strategies
PL2468869T3 (pl) 2007-01-31 2015-08-31 Pfenex Inc Bakteryjna sekwencja wiodąca dla zwiększonej ekspresji
MX2009010062A (es) * 2007-03-28 2009-10-13 Syngenta Participations Ag Proteinas insecticidas.
US20080256669A1 (en) * 2007-04-16 2008-10-16 Monsanto Company Plants with Multiple Transgenes on a Chromosome
US8486887B2 (en) * 2007-08-10 2013-07-16 The University Of Georgia Research Foundation, Inc. Enhancement of Bacillus thuringiensis Cry protein toxicities to coleopterans, and novel insect cadherin fragments
MX2010011925A (es) * 2008-05-01 2010-11-30 Bayer Bioscience Nv Manejo en plantas transgenicas de la resistencia de la oruga militar tardia.
US20090300980A1 (en) * 2008-05-02 2009-12-10 Dow Agrosciences Llc Corn with transgenic insect protection traits utilized in combination with drought tolerance and/or reduced inputs particularly fertilizer

Also Published As

Publication number Publication date
ES2665514T3 (es) 2018-04-26
JP5922646B2 (ja) 2016-05-24
ZA201208640B (en) 2014-01-29
AU2011242578A1 (en) 2012-12-06
ZA201208638B (en) 2014-01-29
JP5922100B2 (ja) 2016-05-24
IL222581A0 (en) 2012-12-31
CN105830932A (zh) 2016-08-10
BR112012027140A2 (pt) 2015-09-22
JP5922098B2 (ja) 2016-05-24
BR112012027208A2 (pt) 2015-09-15
EP2560476B1 (en) 2017-12-13
MX2012012368A (es) 2013-03-05
EP2560477B1 (en) 2018-01-24
EP2560475A4 (en) 2013-10-23
CN102946716A (zh) 2013-02-27
MA34242B1 (fr) 2013-05-02
KR20130051952A (ko) 2013-05-21
EP2560478A1 (en) 2013-02-27
CO6592035A2 (es) 2013-01-02
CN102946717A (zh) 2013-02-27
AU2011242579A1 (en) 2012-12-06
US9796983B2 (en) 2017-10-24
CN102970862A (zh) 2013-03-13
US20130167268A1 (en) 2013-06-27
AR081334A1 (es) 2012-08-08
US20130167269A1 (en) 2013-06-27
KR20130089147A (ko) 2013-08-09
BR112012027139A2 (pt) 2015-09-22
CO6592014A2 (es) 2013-01-02
US20130263331A1 (en) 2013-10-03
RU2582262C2 (ru) 2016-04-20
WO2011133895A1 (en) 2011-10-27
UA116081C2 (uk) 2018-02-12
NZ603555A (en) 2014-11-28
NZ603564A (en) 2014-12-24
RU2012149847A (ru) 2014-05-27
AR081137A1 (es) 2012-06-27
EP2560475A1 (en) 2013-02-27
JP2013531972A (ja) 2013-08-15
EP2560477A1 (en) 2013-02-27
AU2011242490A1 (en) 2012-12-06
EP3366118A1 (en) 2018-08-29
CL2012002963A1 (es) 2013-03-08
CA2796728A1 (en) 2011-10-27
CO6592036A2 (es) 2013-01-02
CN103108540A (zh) 2013-05-15
AU2011242490B2 (en) 2014-11-06
AU2011242582A1 (en) 2012-12-06
RU2012149846A (ru) 2014-05-27
EP2560475B1 (en) 2018-02-14
EP2560478A4 (en) 2013-12-04
US20190203224A1 (en) 2019-07-04
IL222583A (en) 2016-07-31
IL222584A0 (en) 2012-12-31
JP2013540418A (ja) 2013-11-07
KR101842726B1 (ko) 2018-03-27
CN102970862B (zh) 2016-03-30
AR081284A1 (es) 2012-08-01
RU2582249C2 (ru) 2016-04-20
EP2560478B1 (en) 2018-02-14
EP2560476A1 (en) 2013-02-27
JP2013533730A (ja) 2013-08-29
KR101845097B1 (ko) 2018-05-18
US20130180016A1 (en) 2013-07-11
KR101842724B1 (ko) 2018-03-27
IL222582A (en) 2016-07-31
MX2012012371A (es) 2014-02-27
MA34238B1 (fr) 2013-05-02
IL222581A (en) 2017-03-30
AU2011242582B2 (en) 2015-09-17
CL2012002962A1 (es) 2013-01-25
IL222584A (en) 2016-11-30
WO2011133892A1 (en) 2011-10-27
RU2012149845A (ru) 2014-05-27
RU2591519C2 (ru) 2016-07-20
RU2012149849A (ru) 2014-05-27
MX2012012369A (es) 2013-03-05
WO2011133896A1 (en) 2011-10-27
NZ603561A (en) 2015-06-26
CO6592013A2 (es) 2013-01-02
KR101842725B1 (ko) 2018-03-27
CL2012002965A1 (es) 2013-04-01
KR20130051953A (ko) 2013-05-21
AU2011242579B2 (en) 2016-04-21
UA112516C2 (uk) 2016-09-26
CA2796730A1 (en) 2011-10-27
CN102946716B (zh) 2015-09-16
CA2796758A1 (en) 2011-10-27
EP2560476A4 (en) 2013-10-23
AU2011242578B2 (en) 2016-04-21
EP2560477A4 (en) 2013-10-16
WO2011133891A1 (en) 2011-10-27
JP5922099B2 (ja) 2016-05-24
IL222583A0 (en) 2012-12-31
IL222582A0 (en) 2012-12-31
JP2013528365A (ja) 2013-07-11
BR112012027218A2 (pt) 2015-09-15
MA34239B1 (fr) 2013-05-02
MA34240B1 (fr) 2013-05-02
RU2576005C2 (ru) 2016-02-27
AR081136A1 (es) 2012-06-27
NZ603556A (en) 2014-11-28
ZA201208639B (en) 2014-01-29
CA2796727A1 (en) 2011-10-27
KR20130089146A (ko) 2013-08-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA116612C2 (uk) ТРАНСГЕННА РОСЛИНА КУКУРУДЗИ, ЯКА ПРОДУКУЄ БІЛКИ Cry34Ab1, Cry35Ab1 І Cry6Aa1 ДЛЯ ЗАПОБІГАННЯ РОЗВИТКУ СТІЙКОСТІ У КУКУРУДЗЯНОГО КОРЕНЕВОГО ЖУКА (Diabrotica spp.)
CN107635396B (zh) 杀昆虫蛋白及其使用方法
CN106413390B (zh) 用于控制虫害的组合物和方法
CN107108705B (zh) 杀昆虫蛋白及其使用方法
CN109475096B (zh) 植物来源的杀昆虫蛋白及其使用方法
KR101841295B1 (ko) 곤충 내성 관리를 위한 ＣＲＹ１Ｃａ 및 ＣＲＹ１Ｆａ 단백질의 조합 용도
UA120608C2 (uk) Очищений поліпептид ptip-83 та спосіб його застосування
UA120598C2 (uk) Днк-конструкція та спосіб її застосування
CN108064233B (zh) 杀昆虫蛋白及其使用方法
CN105473605A (zh) Phi-4多肽及其使用方法
CN101300353A (zh) 用于制备抗虫转基因植物的杀虫组合物和方法
US20160230186A1 (en) Compositions and methods for controlling diabrotica
UA125683C2 (uk) Інсектицидний білок, який є токсичним для лускокрилого шкідника, та спосіб контролю шкідників рослин
KR102624543B1 (ko) 인시류에 대하여 활성인 살충 독소 단백질
CN111032683A (zh) 来自植物的杀昆虫蛋白及其使用方法
CN110087471B (zh) 来自植物的杀昆虫蛋白及其使用方法
CN112020302B (zh) 来自植物的杀昆虫蛋白及其使用方法
KR20180038561A (ko) 신규한 곤충 저해 단백질
EA032560B1 (ru) Инсектицидные полипептиды с широким спектром активности и их применения
RU2685927C2 (ru) Cry1d для борьбы с хлопковой совкой
CN111867377A (zh) 来自植物的杀昆虫蛋白及其使用方法
CN110582508A (zh) 杀昆虫蛋白及其使用方法
BR112020008931A2 (pt) proteína inseticida ativa para hemípteros
CN116769803A (zh) 新型昆虫抑制蛋白
CN112867796A (zh) 杀昆虫蛋白及其使用方法