RU2582262C2 - КОМБИНАЦИИ, ВКЛЮЧАЮЩИЕ БЕЛКИ Cry34Ab/35Ab И Cry6Aa, ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ РАЗВИТИЯ УСТОЙЧИВОСТИ У КУКУРУЗНЫХ КОРНЕВЫХ ЖУКОВ (Diabrotica spp. ) - Google Patents
КОМБИНАЦИИ, ВКЛЮЧАЮЩИЕ БЕЛКИ Cry34Ab/35Ab И Cry6Aa, ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ РАЗВИТИЯ УСТОЙЧИВОСТИ У КУКУРУЗНЫХ КОРНЕВЫХ ЖУКОВ (Diabrotica spp. ) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2582262C2 RU2582262C2 RU2012149846/10A RU2012149846A RU2582262C2 RU 2582262 C2 RU2582262 C2 RU 2582262C2 RU 2012149846/10 A RU2012149846/10 A RU 2012149846/10A RU 2012149846 A RU2012149846 A RU 2012149846A RU 2582262 C2 RU2582262 C2 RU 2582262C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- plants
- cry6aa
- cry34ab
- plant
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 205
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 151
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 title claims abstract description 66
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 title claims abstract description 64
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 title claims abstract description 54
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 title claims abstract description 54
- 238000011161 development Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 241000489975 Diabrotica Species 0.000 title claims abstract description 10
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 129
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims abstract description 41
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 18
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 claims abstract description 12
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 claims abstract description 12
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 claims description 34
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 claims description 28
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 7
- 238000009331 sowing Methods 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 69
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 62
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 61
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 34
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 22
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 21
- 241000724266 Broad bean mottle virus Species 0.000 description 20
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 20
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 19
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 19
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 13
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 11
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 description 10
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 10
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 9
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 9
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 8
- 230000000361 pesticidal effect Effects 0.000 description 8
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 7
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 7
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 7
- 108700003918 Bacillus Thuringiensis insecticidal crystal Proteins 0.000 description 6
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 description 6
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 5
- 230000026045 iodination Effects 0.000 description 5
- 238000006192 iodination reaction Methods 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 5
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 5
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 5
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 4
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 4
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 4
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 4
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 3
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 3
- 241001147398 Ostrinia nubilalis Species 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 3
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 3
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 3
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 3
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 244000037666 field crops Species 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 3
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 3
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 3
- LWTDZKXXJRRKDG-KXBFYZLASA-N (-)-phaseollin Chemical compound C1OC2=CC(O)=CC=C2[C@H]2[C@@H]1C1=CC=C3OC(C)(C)C=CC3=C1O2 LWTDZKXXJRRKDG-KXBFYZLASA-N 0.000 description 2
- FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N (4r,7s,10s,13s,16r)-16-acetamido-13-(1h-imidazol-5-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15-tetraoxo-7-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14-tetrazacycloheptadecane-4-carboxamide Chemical compound N1C(=O)[C@@H](NC(C)=O)CSSC[C@@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN=CN1 FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N 0.000 description 2
- 108010020183 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 108010000700 Acetolactate synthase Proteins 0.000 description 2
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 102100034035 Alcohol dehydrogenase 1A Human genes 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000000832 Ayote Nutrition 0.000 description 2
- 102100027848 Cartilage-associated protein Human genes 0.000 description 2
- 241000123989 Crambidae Species 0.000 description 2
- 101150102464 Cry1 gene Proteins 0.000 description 2
- 235000009854 Cucurbita moschata Nutrition 0.000 description 2
- 235000009804 Cucurbita pepo subsp pepo Nutrition 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 241000489947 Diabrotica virgifera virgifera Species 0.000 description 2
- 241001057636 Dracaena deremensis Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 2
- 101000780443 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase 1A Proteins 0.000 description 2
- 101000859758 Homo sapiens Cartilage-associated protein Proteins 0.000 description 2
- 101000916686 Homo sapiens Cytohesin-interacting protein Proteins 0.000 description 2
- 101000726740 Homo sapiens Homeobox protein cut-like 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000761460 Homo sapiens Protein CASP Proteins 0.000 description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010042653 IgA receptor Proteins 0.000 description 2
- 101000761459 Mesocricetus auratus Calcium-dependent serine proteinase Proteins 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 241000255969 Pieris brassicae Species 0.000 description 2
- 102100034014 Prolyl 3-hydroxylase 3 Human genes 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 2
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 101150102059 cry3Aa gene Proteins 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 210000000110 microvilli Anatomy 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 125000000951 phenoxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(O*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 2
- 235000015136 pumpkin Nutrition 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 101150116440 pyrF gene Proteins 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 2
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- OOLBCHYXZDXLDS-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2,4-dichlorophenoxy)phenoxy]propanoic acid Chemical compound C1=CC(OC(C)C(O)=O)=CC=C1OC1=CC=C(Cl)C=C1Cl OOLBCHYXZDXLDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid Chemical compound CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CAAMSDWKXXPUJR-UHFFFAOYSA-N 3,5-dihydro-4H-imidazol-4-one Chemical class O=C1CNC=N1 CAAMSDWKXXPUJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000000452 Acetyl-CoA carboxylase Human genes 0.000 description 1
- 108010016219 Acetyl-CoA carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 101100114759 Bacillus thuringiensis subsp. tolworthi cry3Ba gene Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229940123779 Bacterial protease inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 description 1
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 1
- 240000000385 Brassica napus var. napus Species 0.000 description 1
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 239000008001 CAPS buffer Substances 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001515826 Cassava vein mosaic virus Species 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 108010061334 Cry toxin receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000219112 Cucumis Species 0.000 description 1
- 235000015510 Cucumis melo subsp melo Nutrition 0.000 description 1
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 1
- 235000009849 Cucumis sativus Nutrition 0.000 description 1
- 241000219122 Cucurbita Species 0.000 description 1
- 240000004244 Cucurbita moschata Species 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 241001529600 Diabrotica balteata Species 0.000 description 1
- 241000489972 Diabrotica barberi Species 0.000 description 1
- 241000916731 Diabrotica speciosa Species 0.000 description 1
- 241000489976 Diabrotica undecimpunctata howardi Species 0.000 description 1
- 241000381325 Diabrotica virgifera zeae Species 0.000 description 1
- 241000916730 Diabrotica viridula Species 0.000 description 1
- 239000005506 Diclofop Substances 0.000 description 1
- 239000003109 Disodium ethylene diamine tetraacetate Substances 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 239000005561 Glufosinate Substances 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108700037728 Glycine max beta-conglycinin Proteins 0.000 description 1
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 1
- 240000002024 Gossypium herbaceum Species 0.000 description 1
- 235000004341 Gossypium herbaceum Nutrition 0.000 description 1
- 241000208818 Helianthus Species 0.000 description 1
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 1
- 241000256244 Heliothis virescens Species 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- PWWVAXIEGOYWEE-UHFFFAOYSA-N Isophenergan Chemical compound C1=CC=C2N(CC(C)N(C)C)C3=CC=CC=C3SC2=C1 PWWVAXIEGOYWEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 239000012741 Laemmli sample buffer Substances 0.000 description 1
- 102000002704 Leucyl aminopeptidase Human genes 0.000 description 1
- 108010004098 Leucyl aminopeptidase Proteins 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001625930 Luria Species 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 1
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000005578 Mesotrione Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101710202365 Napin Proteins 0.000 description 1
- 101710089395 Oleosin Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 101710163504 Phaseolin Proteins 0.000 description 1
- 241000201976 Polycarpon Species 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000256626 Pterygota <winged insects> Species 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 description 1
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 1
- 229940100389 Sulfonylurea Drugs 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 235000007244 Zea mays Nutrition 0.000 description 1
- 229920002494 Zein Polymers 0.000 description 1
- 108010055615 Zein Proteins 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N bilanafos Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCP(C)(O)=O GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 229910002056 binary alloy Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011953 bioanalysis Methods 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000000853 biopesticidal effect Effects 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000013622 capto Q Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000000991 chicken egg Anatomy 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 229940089639 cornsilk Drugs 0.000 description 1
- 238000012272 crop production Methods 0.000 description 1
- 101150059219 cry3Ba gene Proteins 0.000 description 1
- 101150037230 cry6Ba gene Proteins 0.000 description 1
- 230000032459 dedifferentiation Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 235000019301 disodium ethylene diamine tetraacetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000000408 embryogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 235000012055 fruits and vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 102000054767 gene variant Human genes 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 description 1
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 1
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 108091005979 iodinated proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 230000001418 larval effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 230000001320 lysogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- KPUREKXXPHOJQT-UHFFFAOYSA-N mesotrione Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC(S(=O)(=O)C)=CC=C1C(=O)C1C(=O)CCCC1=O KPUREKXXPHOJQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- -1 pH 3.5 Substances 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 1
- LWTDZKXXJRRKDG-UHFFFAOYSA-N phaseollin Natural products C1OC2=CC(O)=CC=C2C2C1C1=CC=C3OC(C)(C)C=CC3=C1O2 LWTDZKXXJRRKDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005080 plant death Effects 0.000 description 1
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 1
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 231100000654 protein toxin Toxicity 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000763 radioactive isotope labeling Methods 0.000 description 1
- 238000001525 receptor binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 150000003852 triazoles Chemical class 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009452 underexpressoin Effects 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 239000001231 zea mays silk Substances 0.000 description 1
- 239000005019 zein Substances 0.000 description 1
- 229940093612 zein Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
- A01G7/00—Botany in general
- A01G7/06—Treatment of growing trees or plants, e.g. for preventing decay of wood, for tingeing flowers or wood, for prolonging the life of plants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N37/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids
- A01N37/18—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids containing the group —CO—N<, e.g. carboxylic acid amides or imides; Thio analogues thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
- A01N43/48—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
- A01N43/50—1,3-Diazoles; Hydrogenated 1,3-diazoles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
- A01N65/40—Liliopsida [monocotyledons]
- A01N65/44—Poaceae or Gramineae [Grass family], e.g. bamboo, lemon grass or citronella grass
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B32—LAYERED PRODUCTS
- B32B—LAYERED PRODUCTS, i.e. PRODUCTS BUILT-UP OF STRATA OF FLAT OR NON-FLAT, e.g. CELLULAR OR HONEYCOMB, FORM
- B32B1/00—Layered products having a non-planar shape
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B65—CONVEYING; PACKING; STORING; HANDLING THIN OR FILAMENTARY MATERIAL
- B65D—CONTAINERS FOR STORAGE OR TRANSPORT OF ARTICLES OR MATERIALS, e.g. BAGS, BARRELS, BOTTLES, BOXES, CANS, CARTONS, CRATES, DRUMS, JARS, TANKS, HOPPERS, FORWARDING CONTAINERS; ACCESSORIES, CLOSURES, OR FITTINGS THEREFOR; PACKAGING ELEMENTS; PACKAGES
- B65D85/00—Containers, packaging elements or packages, specially adapted for particular articles or materials
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
- C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8251—Amino acid content, e.g. synthetic storage proteins, altering amino acid biosynthesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/04—Plant cells or tissues
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T428/00—Stock material or miscellaneous articles
- Y10T428/13—Hollow or container type article [e.g., tube, vase, etc.]
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Botany (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Mechanical Engineering (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Ecology (AREA)
- Forests & Forestry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биохимии, в частности к трансгенному растению, которое имеет устойчивость к кукурузному корневому жуку (Diabrotica spp.), содержащему ДНК, кодирующую белок Cry34Ab, ДНК, кодирующую белок Cry35Ab, и ДНК, кодирующую белок Cry6Aa, его семени и клетке, а также к способу замедления развития устойчивости к белкам Cry34Ab, Cry35Ab и Cry6Aa у кукурузного корневого жука с его использованием. Также раскрыто множество растений на поле, содержащее множество вышеуказанных трансгенных растений и растения, не содержащие белки Bacillus thuringiensis (Bt) (non-Bt растения), и смесь семян, содержащая семена от non-Bt растений и множество вышеуказанных семян. Изобретение также относится к способу борьбы с кукурузным корневым жуком приведением в контакт указанного насекомого с белком Cry34Ab, белком Cry35Ab и белком Cry6Aa. Изобретение позволяет эффективно бороться c кукурузным корневым жуком. 7 н. и 14 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл., 12 пр.
Description
Предпосылки изобретения
Люди выращивают кукурузу для применения в пищу и в качестве источника энергии. Кукуруза представляет собой важную сельскохозяйственную культуру. Она является важным источником пищи, пищевых продуктов и корма для животных во многих регионах мира. Насекомые употребляют в пищу и повреждают растения и, таким образом, подрывают эти усилия людей. Ежегодно миллиарды долларов тратятся для борьбы с насекомыми-вредителями и еще миллиарды теряются вследствие причиняемого ими ущерба.
Вред, наносимый насекомыми-вредителями, является основным фактором потери урожаев кукурузы во всем мире, несмотря на использование защитных мер, таких как химические пестициды. В связи с этим, в сельскохозяйственные культуры, такие как кукуруза, методами генной инженерии были введены гены устойчивости к насекомым для борьбы с ущербом, наносимым насекомыми, и для снижения потребности в традиционных химических пестицидах.
Ежегодно, более 10 миллионов акров (более 4050000 га) кукурузных полей в США заражаются комплексом видов кукурузного корневого жука. Комплекс видов кукурузного корневого жука включает северного кукурузного корневого жука (Diabrotica barberi), южного кукурузного корневого жука (D. undecimpunctata howardi) и западного кукурузного корневого жука (D. virgifera virgifera). (Другие виды включают Diabrotica virgifera zeae (Мексиканский кукурузный корневой жук), Diabrotica balteata (Бразильский кукурузный корневой жук), и комплекс Бразильского кукурузного корневого жука (Diabrotica viridula и Diabrotica speciosa.)
Обитающие в почве личинки этих видов Diabrotica питаются корнями растений кукурузы, вызывая полегание. Полегание, в конечном счете, снижает урожайность и часто приводит к гибели растения. Употребляя в пищу пестичные столбики кукурузы, взрослые жуки уменьшают опыление и, поэтому, пагубно воздействуют на урожай зерна кукурузного растения. Кроме того, взрослые особи и личинки рода Diabrotica атакуют тыквенные культуры (огурцы, дыни, тыквы и т.д.) и многие овощные и полевые культуры в промышленном растениеводстве, а также такие, которые выращиваются в приусадебных огородах.
Синтетические органические химические инсектициды были первоочередными инструментами, используемыми для борьбы с насекомыми-вредителями, но биологические инсектициды, такие как инсектицидные белки, полученные из Bacillus thuringiensis (Bt), играли важную роль в некоторых регионах. Способность получения устойчивых к насекомым растений посредством трансформации генами инсектицидного белка Bt радикально изменила современное сельское хозяйство и повысила значение и ценность инсктицидных белков и их генов.
Инсектицидные кристаллические белки из некоторых штаммов Bacillus thuringiensis (B.t.) хорошо известны в данной области техники. См., например, Hofte et al, Microbial Reviews, Vol. 53, No. 2, pp. 242-255 (1989). Эти белки обычно продуцируются бактериями в виде протоксинов с молекулярной массой приблизительно 130 кДа, которые затем расщепляются протеазами в средней кишке насекомых после попадания в пищеварительную систему насекомого для продукции корового токсина с молекулярной массой приблизительно 60 кДа. Эти белки известны как кристаллические белки, потому что в некоторых штаммах B.t. могут наблюдаться отчетливые кристаллические включения со спорами. Эти кристаллические включения часто составлены из нескольких различных белков.
Одной группой генов, которые использовались для получения трансгенных, устойчивых к насекомым культур, являются дельта-эндотоксины из Bacillus thuringiensis (B.t.). Дельта-эндотоксины были успешно экспрессированы в таких сельскохозяйственных культурах как хлопок, картофель, рис, подсолнечник, а также кукуруза, и, как оказалось, обеспечивают превосходный контроль над насекомыми-вредителями. (Perlak, F.J et al. (1990) Bio/Technology 8, 939-943; Perlak, F.J. et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22: 313-321; Fujimoto H. et al. (1993) Bio/Technology 11: 1151-1155; Tu et al. (2000) Nature Biotechnology 18: 1101-1104; PCT публикация международной патентной заявки WO 01/13731; и Bing J W et al. (2000) Efficacy of Cry IF Transgenic Maize, 14th Biennial International Plant Resistance to Insects Workshop, Fort Collins, Colo.).
Несколько белков Bt использовались для создания устойчивых к насекомым трансгенных растений, которые были успешно зарегистрированы и в настоящее время запущены в серийное производство. Они включают Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1F, Cry1A.105, Cry2Ab, Cry3Aa, Cry3Bb и Cry34/35Ab в кукурузе, Cry1Ac и Cry2Ab в хлопке и Cry3A в картофеле.
Выпускаемые в промышленном масштабе продукты, экспрессирующие эти белки, экспрессируют один белок, за исключением случаев, где желателен комбинированный инсектицидный спектр из 2 белков (например, Cry1Ab и Cry3Bb в кукурузе, комбинированные для обеспечения устойчивости к чешуекрылым вредителям и блошке длинноусой, соответственно), или где независимое действие белков делает их полезными в качестве инструмента для задержки развития устойчивости у популяций восприимчивых насекомых (например, Cry1Ac и Cry2Ab в хлопке, комбинированные для обеспечения управления устойчивостью в отношении табачной совки).
Некоторые из качеств устойчивых к насекомым трансгенных растений, которые привели к быстрому и широко распространенному принятию этой технологии, также вызывают озабоченность, что у популяций вредителей разовьется устойчивость к инсектицидным белкам, продуцируемым этими растениями. Было предложено несколько стратегий для сохранения полезности признаков устойчивости к насекомым на основе Bt, которые включают размещение белков в высокой дозе в комбинации с резерватом, чередование с различными токсинами или совместное размещение с ними (McGaughey et al. (1998), "B.t. Resistance Management," Nature Biotechnol. 16: 144-146).
Белки, выбранные для использования в пакете Управления устойчивости к насекомым (IRM) должны быть активными с тем, чтобы устойчивость, развившаяся к одному белку, не придавала устойчивость ко второму белку (т.е. перекрестная устойчивость к белкам отсутствует). Если, например, популяция вредителей, выбранная для устойчивости к «белку A», чувствительна к «белку B», то можно сделать вывод, что нет перекрестной устойчивости, и что комбинация белка A и белка B будет эффективной в задержке устойчивости к одному белку A.
В отсутствие устойчивых к насекомым популяций, оценки могут осуществляться на основании других характеристик, считающихся связанными с потенциалом перекрестной устойчивости. При идентификации инсектицидных белков с вероятностью отсутствия проявления перекрестной устойчивости было предложено использование рецепторно опосредованного связывания (van Mellaert et al. 1999). Ключевым прогностическим показателем отсутствия перекрестной устойчивости, присущим такому подходу, является то, что инсектицидные белки не конкурируют за рецепторы у чувствительного вида насекомых.
В случае, когда токсины Bt конкурируют за один и тот же рецептор, то если этот рецептор мутирует в этом насекомом, так что один из токсинов больше не связывается с этим рецептором и, таким образом, больше не является инсектицидным против насекомого, то в этом случае насекомое будет также устойчиво ко второму токсину (который конкурентно связан с тем же рецептором). То есть, насекомое считается перекрестно устойчивым к обоим токсинам Bt. Однако если два токсина связываются с двумя различными рецепторами, то это может быть показателем того, что насекомое не будет одновременно устойчивым к этим двум токсинам.
Относительно более новая система инсектицидного белка была выявлена у Bacillus thuringiensis, как описано в международном патенте WO 97/40162. Эта система содержит два белка - один массой приблизительно 14-15 кДа, и другой массой приблизительно 44-45 кДа. См. также патенты США 6083499 и 6127180. Теперь эти белки были отнесены к их собственному классу и, соответственно, получили обозначение Cry соответственно Cry34 и Cry35. См. Crickmore et al. сайт интернета (biols.susx.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). В настоящее время обнаружены многие другие родственные белки этого типа системы. См., например, патент США 6372480; международные патенты WO 01/14417 и WO 00/66742. Были также описаны оптимизированные для растений гены, которые кодируют такие белки, где гены созданы методами генной инженерии для использования кодонов для оптимизированной экспрессии у растений. См., например, патент США 6218188.
Точный тип действия системы Cry34/35 еще предстоит определить, но полагают, что она образует поры в мембранах клеток кишечника насекомых. См. Moellenbeck et al, Nature Biotechnology, vol. 19, p. 668 (July 2001); Masson et al., Biochemistry, 43 (12349-12357) (2004). Точный механизм действия остается неясным, несмотря на трехмерные атомарные координаты и структуры кристаллов, известные для белка Cry34 и Cry35. См. патенты США 7524810 и 7309785. Например, неясно, один или оба из этих белков связываются с конкретным видом рецептора, такого как щелочная фосфатаза или аминопептидаза.
Кроме того, ввиду того, что существуют различные механизмы, посредством которых у насекомого может развиться устойчивость к белку Cry (такие как измененным гликозилированием рецептора [см. Jurat-Fuentes et al. (2002) 68 AEM 5711-5717], удалением рецепторного белка [см. Lee et al. (1995) 61 AEM 3836-3842], мутированием рецептора или другими механизмами [см. Heckel et al., J. Inv. Pathol. 95 (2007) 192-197]), было невозможно заведомо прогнозировать, будет ли существовать перекрестная устойчивость между Cry34/35 и другими Cry-белками. Lefko et al. обсуждают сложный феномен устойчивости у корневого жука. J. Appl. Entomol. 132 (2008) 189-204.
Прогнозирование конкурентного связывания для системы Cry34/35 также дополнительно осложняется тем, что два белка вовлечены в бинарную систему Cry34/35. Кроме того, неясно, связываются ли и насколько эффективно связываются эти белки с кишечником/клетками кишечника, и взаимодействуют ли они и как взаимодействуют или связываются друг с другом.
Другие варианты для борьбы с жесткокрылыми насекомыми включают токсины Cry3Bb, Cry3C, Cry6B, ET29, ET33 с ET34, TIC407, TIC435, TIC417, TIC901, TIC1201, ET29 с TIC810, ET70, ET76 с ET80, TIC851 и другие. Были также предложены подходы РНКi (интерференции РНК). См. например, Baum et al., Nature Biotechnology, vol. 25, no. 11 (Nov. 2007) pp. 1322-1326.
Meihls et al. предлагают использование резервных культур для управления устойчивостью к кукурузному корневому жуку. PNAS (2008) vol. 105, no. 49, 19177-19182.
Краткое описание сущности изобретения
Настоящее изобретение относится частично к Cry34Ab/35Ab в комбинации с Cry6Aa. Настоящее изобретение относится частично к удивительному открытию, что Cry34Ab/Cry35Ab и Cry6Aa могут использоваться для предотвращения развития устойчивости (к любой системе инсектицидного белка отдельно) у популяции кукурузного корневого жука (Diabrotica spp.). Как будет понятно специалисту в данной области после ознакомления с благоприятными аспектами раскрытого в настоящем описании изобретения, растения, продуцирующие эти инсектицидные Cry-белки, могут использоваться для уменьшения опасений того, что может развиться популяция кукурузного корневого жука, которая может быть устойчивой к любой из этих систем инсектицидного белка отдельно.
Настоящее изобретение частично подтверждается обнаружением того, что компоненты этих систем Cry-белка не конкурируют друг с другом за связывание с рецепторами кишечника кукурузного корневого жука.
Настоящее изобретение также частично относится к тройным пакетам или «пирамидам» из трех (или более) систем токсинов, причем парой оснований являются Cry34Ab/Cry35Ab и Cry6Aa. Таким образом, растения (и посевная площадь, засаженная такими растениями), которые продуцируют эти две системы инсектицидных белков, включены в объем настоящего изобретения.
Краткое описание фигур
Фиг.1. Связывание 125I-Cry35Ab1 (A) и 125I-Cry6Aa1 (B) как функция внесенных меченных радиоактивным изотопом Cry-токсинов в BBMV (мембранных пузырьках щеточной каемки), полученных из личинок западных кукурузных корневых жуков. Специфическое связывание=общее связывание-неспецифическое связывание, «усы»=SEM (стандартная ошибка средней).
Фиг.2. Связывание 125I-Cry35Ab1 с BBMV, полученными из личинок западного кукурузного корневого жука при различных концентрациях немеченого конкурента (log0,1=-1,0, log10=1,0, log100=2,0, log1000=3,0).
Краткое описание последовательностей
SEQ ID NO:1: Полная последовательность нативного белка Cry35Ab1
SEQ ID NO:2: Последовательность усеченного химотрипсином корового белка Cry35Ab1
SEQ ID NO:3: Полная последовательность нативного белка Cry34Ab1
SEQ ID NO:4: Полная последовательность нативного белка Cry6Aa1
Подробное описание изобретения
Последовательности белка Cry34Ab/35Ab могут быть получены, например, из изолята Bacillus thuringiensis PS149B1. Другие гены, белковые последовательности и изоляты-источники для использования в соответствии с настоящим изобретением описаны, например, Crickmore et al. на сайте интернета (lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/intro.html).
Настоящее изобретение включает использование инсектицидных белков Cry34Ab/35Ab в комбинации с токсином Cry6Aa для защиты кукурузы от повреждения и потери урожайности, вызванных поеданием популяциями кукурузного корневого жука, у которых может развиться устойчивость к любому из этих систем белков Cry по отдельности (без другого).
Таким образом, в настоящем изобретении речь идет о пакете Управления устойчивости насекомых (IRM) для предотвращения развития у кукурузного корневого жука устойчивости к Cry6Aa и/или Cry34Ab/35Ab.
Настоящее изобретение относится к композициям для борьбы с вредителями - корневыми жуками, содержащим клетки, которые продуцируют белок токсина Cry6Aa и систему токсина Cry34Ab/35Ab.
Изобретение дополнительно включает хозяина, трансформированного для продукции и белка Cry6Aa, и бинарного токсина Cry34Ab/35Ab, где указанный хозяин представляет собой микроорганизм или растительную клетку.
Дополнительно предполагается, что изобретение относится к способу борьбы с вредителями - корневыми жуками, включающему приведение в контакт указанных вредителей или среды обитания указанных вредителей с эффективным количеством композиции, которая содержит белок Cry6Aa, и дополнительно содержит бинарный токсин Cry34Ab/35Ab.
Вариант осуществления изобретения включает маис, содержащий экспрессируемый растением ген, кодирующий бинарный токсин Cry34Ab/35Ab, и экспрессируемый растением ген, кодирующий белок Cry6Aa, и семена такого растения.
Дополнительный вариант осуществления изобретения включает маис, где экспрессируемый растением ген, кодирующий бинарный токсин Cry34Ab/35Ab, и экспрессируемый растением ген, кодирующий белок Cry6Aa, были интрогрессированы в указанный маис, и семена такого растения.
Как описано в разделе «Примеры», исследования конкурентного связывания с рецепторами с использованием меченого радиоактивным изотопом корового токсинного белка Cry35Ab показывают, что коровый токсинный белок Cry6Aa не конкурирует за связывание в образцах ткани насекомых CRW (кукурузных корневых жуков), с которыми связывается Cry35Ab. См. фиг.2. Эти результаты указывают на то, что комбинация белков Cry6Aa и Cry34Ab/35Ab представляет собой эффективное средство для уменьшения развития устойчивости у популяций CRW к любой белковой системе отдельно.
Таким образом, частично на основании данных, описанных выше, и в других местах настоящего описания, белки Cry34Ab/35Ab и Cry6Aa могут быть использованы для получения комбинаций IRM для предотвращения и уменьшения развития устойчивости у CRW. Другие белки могут быть добавлены к этой комбинации, например, для расширения спектра борьбы с насекомыми. Рассматриваемая пара/комбинация также может быть использована в некоторых предпочтительных «тройных пакетах» или «пирамиде» в комбинации с еще одним белком для борьбы с корневыми жуками, таким как Cry3Ba и/или Cry3Aa. РНКi против корневых жуков представляет собой еще один вариант. См., например, Baum et al., Nature Biotechnology, vol. 25, no. 11 (Nov. 2007) pp. 1322-1326. Таким образом, рассматриваемые комбинации обеспечивают множественные типы действия против корневого жука.
В свете описания заявки USSN 61/327240 (поданной 23 апреля, 2010 г.), относящейся к комбинациям Cry34Ab/35Ab и Cry3Aa, заявки USSN 61/476005 (поданной 15 апреля, 2011 г.), относящейся к комбинации белков Cry34Ab/35Ab и Cry3Ba, и заявки USSN 61/477447 (поданной 20 апреля, 2011 г.), относящейся к комбинациям белков Cry3Aa и Cry6Aa, некоторые предпочтительные «тройные пакеты» настоящего изобретения включают белок Cry6Aa в комбинации с белками Cry34Ab/35Ab, и белками Cry3Aa и/или Cry3Ba. Трансгенные растения, включая кукурузу, содержащие ген cry6Ba, гены cry34Ab/35Ab и ген cry3Aa и/или cry3Ba, включены в объем настоящего изобретения. Таким образом, такие варианты осуществления нацелены на насекомое, по меньшей мере, тремя типами действия. Кроме того, в свете этих данных и положений, можно включить cry3Ba или cry3Aa вместо приведенного в настоящем описании в качестве примера Cry6Aa, в качестве комбинации оснований, спаривающейся с cry34A/35A.
Варианты размещения по настоящему изобретению включают использование белков Cry6Aa и Cry34Ab/35Ab в областях выращивания кукурузы, где Diabrotica spp. являются проблематичными. Другим вариантом размещения может быть использование одного или обоих белков Cry6Aa и Cry34Ab/35Ab в комбинации с другими признаками.
Специалисту в данной области будет понятно, что токсины Bt, даже в пределах определенного класса, такого как Cry6Aa и Cry34Ab/35Ab, могут в некоторой степени варьировать.
Гены и токсины. Термин «изолированный» относится к полинуклеотиду в не встречающемся в природных условиях конструкту или к белку в очищенном или иным образом не встречающемуся в природных условиях состоянию. Гены и токсины, используемые в соответствии с настоящим изобретением, включают не только полные описанные последовательности, но также фрагменты этих последовательностей, варианты, мутанты и слитые белки, которые сохраняют характерную пестицидную активность токсинов, конкретно проиллюстрированных в настоящем описании. Используемые в настоящем описании термины «варианты» или «изменения» генов относятся к нуклеотидным последовательностям, которые кодируют те же токсины, или которые кодируют эквивалентные токсины, обладающие пестицидной активностью. Используемый в настоящем описании термин «эквивалентные токсины» относится к токсинами, обладающим такой же или по существу такой же биологической активностью против вредителей-мишеней как заявленные токсины. Домены/субдомены этих белков могут быть обменены для получения химерных белков. См. например, патенты США 7309785 и 7524810, относящиеся к белкам Cry34/35. В патенте '785 речь также идет об усеченных белках Cry35. Усеченные токсины также проиллюстрированы в настоящем описании.
Используемый в настоящем описании термин «границы» представляет идентичность последовательностей приблизительно 95% (Cry6Aa и Cry34Ab и Cry35Ab), 78% (Cry6A и Cry34A и Cry35A) и 45% (Cry6 и Cry34 и Cry35) в соответствии с «Revision of Nomenclature for Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins» N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, и D.H. Dean. Microbiology и Molecular Biology Reviews (1998) Vol 62: 807-813. То же относится к Cry3 при использовании в тройных пакетах, например, в соответствии с настоящим изобретением.
Для специалиста в данной области будет очевидно, что гены, кодирующие активные токсины, могут быть идентифицированы и получены несколькими способами. Определенные гены или части генов, проиллюстрированные в настоящем описании, могут быть получены из изолятов, депонированных в депозитарии культур. Эти гены или их части или варианты, также могут быть сконструированы синтетически, например, путем использования генного синтезатора. Варианты генов могут быть легко сконструированы с использованием стандартных технологий получения точечных мутаций. Также, фрагменты этих генов могут быть получены с использованием коммерчески доступных экзонуклеаз или эндонуклеаз, в соответствии со стандартными методиками. Например, ферменты, такие как Bal31 или сайт-направленный мутагенез могут быть использованы для систематической отсечки нуклеотидов от концов этих генов. Гены, которые кодируют активные фрагменты, могут также быть получены с использованием разнообразных рестрикционных ферментов. Протеазы можно использовать для непосредственного получения активных фрагментов белковых токсинов.
Фрагменты и эквиваленты, которые сохраняют пестицидную активность проиллюстрированных токсинов, будут входить в объем настоящего изобретения. Также, ввиду избыточности генетического кода, разнообразие различных последовательностей ДНК может кодировать аминокислотные последовательности, раскрытые в настоящем описании. Специалист в данной области вполне может создать эти альтернативные последовательности ДНК, кодирующие одинаковые или по существу одинаковые токсины. Эти вариантные последовательности ДНК входят в объем настоящего изобретения. Используемая в настоящем описании ссылка на «по существу одинаковую» последовательность относится к последовательностям, которые имеют аминокислотные замещения, делеции, добавления или вставки, которые существенно не воздействуют на пестицидную активность. Фрагменты генов, кодирующих белки, которые сохраняют пестицидную активность, также включены в это определение. Фрагменты генов, кодирующих белки, которые сохраняют пестицидную активность, также включены в настоящее определение.
Дополнительный способ идентификации генов, кодирующих токсины, и частей генов, используемых в соответствии с настоящим изобретением, осуществляют путем использования олигонуклеотидных зондов. Эти зонды представляют собой детектируемые нуклеотидные последовательности. Эти последовательности могут быть выявлены посредством соответствующей метки или могут быть получены эндогенно флуоресцентными, как описано в международной патентной заявке № WO 93/16094. Как хорошо известно в данной области, молекула зонда и образец нуклеиновой кислоты гибридизуются образованием прочной связи между двумя молекулами, то можно резонно предположить, что зонд и образец имеют существенную гомологию. Предпочтительно, гибридизацию проводят в жестких условиях методиками, хорошо известными в данной области, как описано, например, в публикации Keller, G.H., M.M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., pp. 169-170. Некоторые примеры солевых концентраций и температурных комбинаций следующие (в порядке увеличения жесткости условий): 2X SSPE (0,18M NaCl, 10 мМ NaHPO4, 1 мМ EDTA, pH 7,0)) или SSC (15 мМ цитрата натрия, 150 мМ хлорида натрия, pH 7,0) при комнатной температуре; 1X SSPE или SSC при 42°C; 0,1X SSPE или SSC при 65°C. Выявление зонда обеспечивает средство для определения известным образом, произошла ли гибридизация. Такой зондовый анализ обеспечивает быстрый способ идентификации кодирующих токсин генов настоящего изобретения. Нуклеотидные сегменты, которые используются в качестве зондов в соответствии с изобретением, может быть синтезированы с использованием синтезатора ДНК и стандартных методик. Эти нуклеотидные последовательности также могут быть использованы в качестве затравок ПЦР для амплификации генов по настоящему изобретению.
Вариантные токсины. В настоящем описании были специально проиллюстрированы определенные токсины по настоящему изобретению. Поскольку эти токсины просто иллюстрируют токсины по настоящему изобретению, то будет вполне очевидно, что настоящее изобретение включает вариантные или эквивалентные токсины (и нуклеотидные последовательности, кодирующие эквивалентные токсины), обладающие такой же или подобной пестицидной активностью как иллюстрируемый токсин. Эквивалентные токсины имеют гомологию аминокислот с иллюстрируемым токсином. Эта аминокислотная идентичность обычно составляет более чем 75%, или, предпочтительно, более чем 85%, предпочтительно, более чем 90%, предпочтительно, более чем 95%, предпочтительно, более чем 96%, предпочтительно, более чем 97%, предпочтительно, более чем 98%, или в некоторых вариантах осуществления предпочтительно, более чем 99%. Аминокислотная идентичность обычно самая высокая в критических областях токсина, которые отвечают за биологическую активность или участвуют в определении трехмерной конфигурации, которая, в конечном счете, ответственна за биологическую активность. В этом отношении, приемлемы и могут ожидаться некоторые аминокислотные замещения, если эти замещения происходят в областях, которые не имеют решающего значения для активности или представляют собой консервативные аминокислотные замещения, которые не воздействуют на трехмерную конфигурацию молекулы. Например, аминокислоты могут быть размещены в следующие классы: неполярные, незаряженные полярные, основные и кислотные. Консервативные замещения, посредством которых аминокислота одного класса замещается другой аминокислотой того же типа, входит в объем настоящего изобретения, пока замещение существенно не изменяет биологическую активность соединения. В таблице 1 представлен список примеров аминокислот, относящихся к каждому классу.
Таблица 1 | |
Класс аминокислот | Примеры аминокислот |
Неполярные | Ala, Val, Leu, Ile, Pro Met, Phe, Trp |
Незаряженные полярные | Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln |
Кислотные | Asp, Glu |
Основные | Lys, Arg, His |
В некоторых случаях также могут быть осуществлены неконсервативные замещения. Решающим фактором является то, что эти замещения не должны значительно снижать биологическую активность токсина.
Рекомбинантные хозяева. Гены, кодирующие токсины настоящего изобретения, могут вводиться в широкое разнообразие микробных или растительных хозяев. Экспрессия гена токсина приводит, прямо или косвенно, к внутриклеточной продукции и поддержанию пестицида. Конъюгальный перенос и рекомбинантный перенос могут быть использованы для создания штамма Bt, который экспрессирует оба токсина настоящего изобретения. Другие организмы хозяев также могут быть трансформированы одним или более генами токсина, используемыми затем для оказания синергического эффекта. С подходящими микробными хозяевами, например, Pseudomonas, микробы могут наноситься на местонахождение вредителя, где они пролиферируют и употребляются в пищу. Результатом является контроль над вредителем. Альтернативно, микроб, несущий ген токсина, может быть подвергнут обработке в условиях, которые продлевают активность токсина и стабилизируют клетку. Обработанная клетка, которая сохраняет токсическую активность, затем может вноситься в среду обитания вредителя-мишени. В объем настоящего изобретения включены нерегенерируемые/нетотипотентные растительные клетки из растения по настоящему изобретению (содержащие, по меньшей мере, один из рассматриваемых генов IRM).
Трансформация растения. Предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является трансформация растений генами, кодирующими рассматриваемый инсектицидный белок или его варианты. Трансформированные растения устойчивы к атаке целевым насекомым-вредителем за счет присутствия контролирующих количеств рассматриваемого инсектицидного белка или его вариантов в клетках трансформированного растения. При включении генетического материала, который кодирует инсектицидные свойства инсектицидных токсинов B.t., в геном растения, употребляемого в пищу определенным насекомым-вредителем, взрослые особи или личинки погибнут после употребления в пищу растения. Были трансформированы многочисленные члены односемядольных и двудольных классификаций. Трансгенные агрономические культуры, а также фрукты и овощи представляют промышленный интерес. Такие культуры включают, но без ограничения, маис, рис, сою, канолу, подсолнечник, люцерну, сорго, пшеницу, хлопок, арахис, томаты, картофель и тому подобное. Существует несколько технологий введения инородного генетического материала в клетки растений и получения растений, которые стабильно поддерживают и экспрессируют введенный ген. Такие технологии включают акселерацию генетического материала, нанесенного на микрочастицы, непосредственно в клетки (патент США 4945050 и патент США 5141131). Растения могут быть трансформированы с использованием технологии Agrobacterium, см. патент США 5177010, патент США 5104310, Европейскую патентную заявку № 0131624B1, Европейскую патентную заявку № 120516, Европейскую патентную заявку № 159418B1, Европейскую патентную заявку № 176112, патент США 5149645, патент США 5469976, патент США 5464763, патент США 4940838, патент США 4693976, Европейскую патентную заявку № 116718, Европейскую патентную заявку № 290799, Европейскую патентную заявку № 320500, Европейскую патентную заявку № 604662, Европейскую патентную заявку № 627752, Европейскую патентную заявку № 0267159, Европейскую патентную заявку № 0292435, патент США 5231019, патент США 5463174, патент США 4762785, патент США 5004863 и патент США 5159135. Другая технология трансформации включает технологию WHISKERS™, см. патент США 5302523 и патент США 5464765. Технология электропорации также использовалась для трансформации растений, см. Международный патент WO 87/06614, патент США 5472869, патент США 5384253, Международный патент WO 9209696 и Международный патент WO 9321335. Все эти патенты и публикации, относящиеся к трансформации, включены в настоящее описание посредством ссылки. В дополнение к многочисленным технологиям трансформации растений, тип ткани, которая контактирует с инородными генами, также может изменяться. Такая ткань включает, но не ограничивается ими, эмбриогенную ткань, I и II типы каллюсной ткани, гипокотиль, меристему и тому подобное. Почти все растительные ткани могут быть трансформированы во время дедифференциации с использованием соответствующих технологий в пределах квалификации специалиста в данной области.
Гены, кодирующие любой из рассматриваемых токсинов, могут быть вставлены в клетки растения с использованием разнообразных технологий, которые хорошо известны в данной области, как описано выше. Например, доступно большое число векторов клонирования, содержащих маркер, который обеспечивает возможность отбора трансформированных микробных клеток, и репликационная система, функциональная у Escherichia coli, для получения и модификации инородных генов для вставки в высшие растения. Такие манипуляции могут включать, например, введение мутаций, усечений, добавлений или замещений, как желательно для предполагаемого использования. Векторы включают, например, pBR322, группу pUC, группу M13mp, pACYC184 и т.д. Соответственно, последовательность, кодирующая Cry-белок или варианты, может быть вставлена в вектор в подходящий сайт рестрикции. Полученная плазмида используется для трансформации клеток E. coli, клетки которых культивируют в подходящей питательной среде, затем собирают и лизируют с тем, чтобы были извлечены годные для обработки количества плазмиды. Анализ последовательности, анализ фрагментов рестрикции, электрофорез и другие биохимические-молекулярно-биологические способы обычно проводят в качестве способов анализа. После каждой манипуляции, используемая последовательность ДНК может быть расщеплена и соединена со следующей последовательностью ДНК. Каждая подвергнутая манипулированию последовательность ДНК может быть клонирована в ту же или другую плазмиду.
Использование содержащих T-ДНК векторов для трансформации клеток растений интенсивно исследовалось и достаточно описано в Европейском патенте EP 120516; публикациях Lee и Gelvin (2008), Fraley et al. (1986), и An et al. (1985), и достаточно общепринято в данной области.
Как только вставленная ДНК интегрируется в геном растения, она становится относительно устойчивой во всех последующих поколениях. Вектор, используемый для трансформации клетки растения, обычно содержит выбранный маркерный ген, кодирующий белок, который придает трансформированным клеткам растений устойчивость к гербициду или антибиотику, такому как, наряду с другими, биалафос, канамицин, G418, блеомицин или гигромицин. Соответственно, отдельно используемый выбранный маркерный ген должен обеспечить возможность выбора трансформированных клеток, в то время как рост клеток, которые не содержат вставленную ДНК, подавляется селекционным соединением.
Доступно большое число способов вставки ДНК в клетку растения-хозяина. Эти способы включают трансформацию T-DNA, доставленную Agrobacterium tumefaciens или Agrobacterium rhizogenes в качестве агента трансформации. Дополнительно, может быть использовано слияние протопластов растения с липосомами, содержащими подлежащую доставке ДНК, прямая инъекция ДНК, трансформация биологической баллистикой (бомбардировкой микрочастицами) или электропорация, а также другие возможные способы.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, растения трансформируются генами, где использование кодона кодирующей белок области было оптимизировано для растений. См., например, патент США 5380831, который включен в настоящее описание посредством ссылки. Также, преимущественно используются растения, кодирующие усеченный токсин. Усеченный токсин обычно кодирует примерно от 55% до примерно 80% токсина полной длины. Способы создания синтетических генов B.t. для использования в растениях известны в данной области (Stewart, 2007).
Независимо от методики трансформации, ген предпочтительно включают в вектор переноса гена, адаптированный для экспрессирования генов инсектицидного токсина B.t. и варианты в растительной клетке включением в вектор растительного промотора. В дополнение к растительным промоторам, в растительных клетках для экспрессирования чужеродных генов могут эффективно использоваться промоторы из разнообразных источников. Например, возможно использование промоторов бактериального происхождения, таких как промотор октопинсинтазы, промотор нопалинсинтазы и промотор маннопинсинтазы. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления могут использоваться промоторы, не связанные с Bacillus thuringiensis. Могут использоваться промоторы, происходящие из растительных вирусов, например, промоторы 35S и 19S вируса мозаики цветной капусты, промотор из вируса мозаики жилок кассавы и тому подобное. Растительные промоторы включают, но без ограничения, малую субъединицу (ssu), промотор бета-конглицинина, промотор фазеолина, промотор ADH (алкогольдегидрогеназы), промоторы теплового шока, промотор ADF (деполимеризации актина), промотор убиквитина, промотор актина и тканеспецифические промоторы. Промоторы могут также содержать определенные энхансерные элементы последовательности, которые могут повысить эффективность транскрипции. Конкретные энхансеры включают, но без ограничения, ADH1-интрон 1 и ADH1-интрон 6. Могут использоваться конститутивные промоторы. Конститутивные промоторы направляют непрерывную генную экспрессию почти во всех типах клеток и почти в любое время (например, актина, убиквитина, CaMV 35S). Тканеспецифические промоторы ответственны за генную экспрессию в определенных типах клеток или ткани, таких как листья или семена (например, промоторы зеина, олеозина, напина, ACP (ацил белка-носителя)), и эти промоторы также могут быть использованы. Могут также использоваться промоторы, которые активны во время определенной стадии развития растений, а также активны в определенных тканях и органах растений. Примеры таких промоторов включают, но без ограничения, промоторы, которые являются специфичными для корней, специфичными для пыльцы, специфичными для зародышей, специфичными для «шелка» кукурузы, специфичными для хлопковых волокон, специфичными для эндоспермы семян, специфичными для флоэмы, и тому подобное.
В определенных условиях может быть желательным использование индуцируемого промотора. Индуцируемый промотор ответствен за экспрессию генов в ответ на специфический сигнал, такой как физический стимул (например, гены теплового шока); свет (например, RUBP карбоксилаза); гормон (например, глюкокортикоид); антибиотик (например, тетрациклин); метаболиты; и стресс (например, засуху). Могут использоваться другие желательные транскрипционные и трансляционные элементы, которые функционируют в растениях, такие как 5' нетранслированные лидерные последовательности, РНК последовательности транскрипции терминации и сигнальные последовательности добавления полиаденилата. В данной области известны многочисленные специфичные для растений векторы переноса генов.
Трансгенные культуры, содержащие признаки устойчивости к насекомым (IR), являются преобладающими в растениях кукурузы и хлопка по всей Северной Америке, и использование этих признаков распространяется по всему миру. Промышленные трансгенные культуры, комбинирующие признаки IR и устойчивость к гербицидам (HT), были разработаны множеством семенных компаний. Они включают комбинации признаков IR, приданных инсектицидными белками B.t. и признаков HT, таких как устойчивость к ингибиторам ацетолактатсинтазы (ALS), таким как сульфонилмочевины, имидазолиноны, триазолпиримидин, сульфонанилиды и тому подобное, ингибиторам глутаминсинтетазы (GS), таким как биалафос, глюфосинат и тому подобное, ингибиторам 4-гидроксифенилпируватдиоксигеназы (HPPD), таким как мезотрион, изоксафлутол и тому подобное, ингибиторам 5-энолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазы (EPSPS), таким как глифосат и тому подобное, ингибиторам ацетилкоэнзим-A-карбоксилазы (ACCase), таким как галоксифоп, квилазофоп, диклофоп и тому подобное. Известны другие примеры, в которых трансгенно полученные белки обеспечивают устойчивость растений к химическим классам гербицидов, таким как гербициды на основе феноксикислот и гербициды на основе ауксинпиридилоксиацетатов (см. Международную патентную заявку WO 2007/053482 A2), или гербициды на основе феноксикислот и гербициды на основе арилоксифеноксипропионатов (см. Международную патентную заявку 2005107437 A2, A3). Способность контролировать множественные связанные с вредителями проблемы посредством признаков IR представляет собой ценную концепцию промышленного продукта, и удобство этой продуктовой концепции повышается, если признаки, обеспечивающие контроль над насекомыми, и признаки, обеспечивающие контроль над сорняками, комбинируются в одном растении. Дополнительно, повышенная значимость может быть получена посредством комбинаций в одном растении признаков IR, приданных инсектицидным белком B.t., таким как инсектицидный белок по настоящему изобретению, с одним или более дополнительными признаками HT, такими как указано выше, плюс один или более дополнительных вводимых признаков (например, устойчивости к другим насекомым, приданной происходящими из B.t. или из других инсектицидных белков, устойчивости к насекомым, приданной такими механизмами как РНКi и тому подобное, устойчивости к нематодам, устойчивости к заболеваниям, устойчивости к стрессу, улучшенной утилизации азота и тому подобных), или продуктивные признаки (например, высокое содержание масел, полезный для здоровья состав, улучшение питательной ценности и тому подобное). Такие комбинации могут быть получены или обычной селекцией (селекционный пакет), или совместно в виде нового явления трансформации, включающего одновременное введение множественных генов (молекулярный пакет). Благоприятные эффекты включают способность справляться с вредителями и улучшенную борьбу с сорняками культур растений, что обеспечивает вторичные выгоды для производителя и/или потребителя. Таким образом, настоящее изобретение может быть использовано в комбинации с другими признаками для обеспечения полного агрономического пакета улучшенного качества культуры со способностью гибко и экономически рентабельно регулировать любое число агрономических вопросов.
Трансформированные клетки растут внутри растений обычным образом. Они могут образовывать зародышевые клетки и передавать трансформированный признак(и) потомству растений.
Такие растения может быть выращены обычным образом и скрещены с растениями, которые имеют такие же трансформированные наследственные факторы или другие наследственные факторы. Полученные гибридные индивиды имеют соответствующие фенотипические свойства.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения растения трансформируются генами, где использование кодона было оптимизировано для растений. См., например, патент США 5380831. Кроме того, способы создания синтетических генов Bt для использования в растениях известны в данной области (Stewart и Burgin, 2007). Одним неограничивающим примером предпочтительного трансформированного растения является фертильное растение маиса, содержащее экспрессируемый растением ген, кодирующий белок Cry6Aa, и дополнительно содержащий второй набор экспрессируемых растением генов, кодирующих белки Cry34Ab/35Ab.
Перенос (или интрогрессия) определяемого(ых) белками Cry6Aa и Cry34Ab/35Ab признака(ов) в инбредные линии маиса может быть достигнут рекуррентным селекционным разведением, например, обратным скрещиванием. В этом случае, желательного рекуррентного родителя сначала скрещивают с инбредным донором (нерекуррентным родителем), который несет соответствующий(ие) ген(ы) для определяемых Cry признаков. Затем потомство этого однократного скрещивания снова спаривают с рекуррентным родителем с последующей селекцией в полученном потомстве для переноса желательного признака(ов) от нерекуррентного родителя. После трех, предпочтительно, четырех, более предпочтительно, пяти или более поколений обратного скрещивания с рекуррентным родителем с селекцией желательного признака(ов), потомство будет гетерозиготным в отношении локусов, контролирующих переносимый(ые) признак(и), но будет как рекуррентный родитель в отношении большинства или почти всех других генов (см., например, Poehlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4th Ed., 172-175; Fehr (1987) Principles of Cultivar Development, Vol. 1: Theory и Technique, 360-376).
Стратегии управления устойчивостью к насекомым (IRM). Roush et al., например, описывают «двухтоксинные» стратегии, также называемые «пирамидированием» или «пакетированием», для управления инсектицидными трансгенными культурами. (Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777-1786).
Агентство США по защите окружающей среды на своем сайте в интернете (epa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm) публикует следующие требования к обеспечению не трансгенных (т.е. не содержащих B.t. белки) резервных культур (блока культур, не содержащих Bt белки/кукурузы) для использования с трансгенными культурами, продуцирующими один белок Bt, активный против вредителей-мишеней.
«Специфические структурированные требования к защищенным от кукурузного мотылька Bt (Cry1 Ab или Cry 1F) кукурузным продуктам следующие:
Структурированные резерваты: 20% не защищенных от чешуекрылых Bt кукурузных резервных культур в Кукурузной полосе;
50% не защищенных от чешуекрылых Bt резервных культур в Хлопковой полосе.
Блоки
Внутренний (т.е. в пределах поля Bt).
Внешний (т.е. отдельные поля в пределах Ѕ мили (804 м) (если возможно, 1/4 мили (402 м)) от поля Bt для максимизации случайного спаривания).
Полосы внутри поля
Полосы должны быть шириной, по меньшей мере, 4 ряда (предпочтительно, 6 рядов) для уменьшения эффектов передвижения личинок».
Кроме того, Национальная Ассоциация фермеров, выращивающих кукурузу на своем сайте интернета:
(ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn)
также публикует аналогичное руководство в отношении требований к резервату. Например:
«Требования к IRM в отношении кукурузного мотылька:
- Засейте, по меньшей мере, 20% вашего кукурузного поля гибридами немодифицированных семян.
- В областях, продуцирующих хлопок, резерват должен составлять 50%.
- Должны быть засеяны в пределах 1/2 мили (804 м) от гибридов не модифицированных семян.
- Немодифицированные семена могут засеваться в виде полос в пределах поля Bt; полосы резервных культур должны иметь ширину, по меньшей мере, 4 ряда.
- Резервные культуры могут обрабатываться обычными пестицидами, только если для насекомого-мишени достигаются экономические пороги.
- Распыляемые инсектициды на основе Bt не могут использоваться на не модифицированной кукурузе.
- Соответствующая резервная культура должна высеваться на каждой ферме с Bt кукурузой».
Как указано Roush et al. (например, на стр. 1780 и 1784 в правой колонке), пакетирование или «пирамидирование» из двух различных белков, каждого эффективного против вредителей-мишеней и с небольшой или отсутствующей перекрестной устойчивостью может обеспечить возможность использования меньшего резервата. Roush предполагает, что для успешного пакета, размер резервата менее чем 10%, может обеспечить управление устойчивостью, сравнимое примерно с 50% резерватом для одного (не «пирамидированного») признака. Для доступных в настоящее время «пирамидированных» Bt кукурузных продуктов, Агентство США по защите окружающей среды требует засева значительно меньшего (как правило, 5%) структурированного резервата, не содержащего Bt белки, кукурузой, чем для продуктов с одним признаком (как правило, 20%).
Существуют различные пути обеспечения эффектов IRM резервата, включая различные геометрические типы посева на полях (как указано выше) и смеси семян в мешке, как дополнительно обсуждается Roush et al. (см. выше), и в патенте США 6551962.
Указанные выше процентные доли или подобные соотношения резервата могут использоваться для рассматриваемых двойных или тройных пакетов или пирамид.
Все патенты, патентные заявки, временные заявки и публикации, приведенные в виде ссылки или процитированные в настоящем описании, полностью включены посредством ссылки в той степени, в которой они не противоречат определенным положениям настоящего описания.
Ниже приведены примеры, которые иллюстрируют методы осуществления изобретения. Эти примеры не следует рассматривать как ограничивающие. Если не указано иное, все процентные доли представлены по массе, и все пропорции смесей в растворителе представлены по объему. Все величины температуры представлены в градусах Цельсия.
Если специально не указано иное или не подразумевается иное, единственное число означают используемый в настоящем описании термин «по меньшей мере, один».
ПРИМЕРЫ
Пример 1 Конструирование экспрессионных плазмид, кодирующих токсины полной длины Cry34Ab1, Cry35Ab1 и Cry6Aa1
Стандартные способы клонирования использовали при конструировании экспрессионных плазмид Pseudomonas fluorescens (Pf), сконструированные для продукции соответственно Cry-белков Cry34Ab1, Cry35Ab1 и Cry6Aa1. Рестрикционные эндонуклеазы из биологических лабораторий Новой Англии (NEB; Ipswich, MA) использовали для переваривания ДНК, и T4 ДНК лигазу от компании Invitrogen использовали для лигирования ДНК. Плазмиды получали с использованием набора Plasmid Midi (Qiagen), следуя инструкциям поставщика. Фрагменты ДНК очищали, используя картридж Millipore Ultrafree®-DA (Billerica, MA) после гель-электрофореза в агарозном геле с трис-ацетатным буфером. Основная стратегия клонирования предусматривала субклонирование кодирующих последовательностей (CDS) полной длины Cry-белков в pMYC1803 для Cry34Ab1 и Cry35Ab1 и в pDOW1169 для Cry6Aa1, в рестрикционные сайты SpeI и XhoI (или SalI, который совместим с XhoI), соответственно, посредством чего их помещали под экспрессионный контроль соответственно промотора Ptac и терминатора rrnBTlT2 или rrnBT2 из плазмиды pKK223-3 (PL Pharmacia, Milwaukee, WI). pMYC1803 представляет собой плазмиду со средним числом копий с происхождением репликации из RSF1010, гена устойчивости к тетрациклину, и сайтом связывания рибосомы, предшествующим сайтам распознавания рестрикционного фермента, в которые могут быть внесены фрагменты ДНК, содержащие кодирующие белок области (заявка на патент США № 20080193974).
Экспрессионную плазмиду как для Cry34Ab1, так и для Cry35Ab1 трансформировали электропорацией в штамм MB214 P. fluorescens, извлеченный в среде SOC-соевый гидролизат, и высевали на чашки с лизогенной бульонной средой Luria (LB), содержащей 20 мкг/мл тетрациклина. Экспрессионный вектор pDOWl169 аналогичен pMYC1803, но pDOWl169 несет ген pyrF, кодирующий урацил, который использовали в качестве маркера для скрининга трансформантов, когда ауксотрофный в отношении урацила штамм P. fluorescens (такой как DPflO) использовали для трансформации на чашке с минимальной средой M9, которая не содержала урацил (Schneider et al. 2005). Подробности микробиологических манипуляций доступны из заявки на патент США № 20060008877, заявки на патент США № 20080193974 и заявки на патент США № 20080058262, включенных в настоящее описание посредством ссылки. Проводили скрининг колоний рестрикционным расщеплением мини-препарата плазмидной ДНК. Последовательность плазмидной ДНК выбранных клонов, содержащих вставки, определяли по контракту с коммерческой организацией, проводящей определение последовательностей, такой как MWG Biotech (Huntsville, AL). Данные последовательностей собирали и анализировали, используя программное обеспечение Sequencher™ (Gene Codes Corp., Ann Arbor, MI).
Пример 2 - Рост и экспрессия
Анализ роста и экспрессии во встряхиваемых колбах и продукцию токсинов Cry34Ab1, Cry35Ab1 и Cry6Aa1 для характеристики, включая связывание рецептора Bt и биологический анализ насекомых, осуществляли содержащими экспрессионные конструкты штаммами P. fluorescens, выращенными во встряхиваемых колбах (например, клона pMYC2593 для Cry34Ab1, pMYC3122 для Cry35Ab1, и pDAB102018 для Cry6Aa1). Высеваемые культуры для Cry34Ab1 и Cry35Ab1, выращенные в течение ночи в среде P. fluorescens с добавкой 20 мкг/мл тетрациклина, использовали для инокуляции 200 мл той же среды с 20 мкг/мл тетрациклина. Однако посевную культуру для Cry6Aa1 выращивали в минимальном бульоне M9 в течение ночи и использовали для инокуляции 200 мл среды P. Fluorescens без антибиотика. Экспрессию токсинов Cry34Ab1, Cry35Ab1 и Cry6Aa1 посредством промотора Ptac вызывали добавлением изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) после первоначальной инкубации в течение 24 часов при 28-30°C при встряхивании при 300 обмин. Образцы культуры брали во время индукции и в различные временные точки после индукции. Плотность клеток измеряли по оптической плотности при 600 нм (OD600).
Пример 3 - Фракционирование клеток и анализ SDS-PAGE образцов из встряхиваемых колб
В каждую временную точку взятия проб плотность клеток образцов доводили до OD600=20 и аликвоты объемом по 1 мл центрифугировали при 14000×g в течение 5 минут. Клеточные осадки после центрифугирования замораживали при -80°C. Растворимые и нерастворимые фракции из замороженных образцов клеточных осадков после центрифугирования из встряхиваемых колб генерировали с использованием раствора для экстракции бактериального белка EasyLyse™ (EPICENTRE® Biotechnologies, Madison, WI). Каждый клеточный осадок ресуспендировали в 1 мл раствора EasyLyse™ и дополнительно разводили 1:4 в литическом буфере и инкубировали со встряхиванием при комнатной температуре в течение 30 минут. Лизат центрифугировали при 14000 об/мин в течение 20 минут при 4°C, и супернатант извлекали в виде растворимой фракции. Затем осадок после центрифугирования (нерастворимую фракцию) ресуспендировали в равном объеме забуференного фосфатом солевого раствора (PBS; 11,9 мМ Na2HPO4, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, pH 7,4). Образцы смешивали в соотношении 3:1 с буфером образца 4X Laemmli, содержащим β-меркаптоэтанол, и кипятили в течение 5 минут перед загрузкой на гели NuPAGE Novex 4-20% Bis-Tris (Invitrogen, Carlsbad, CA). Электрофорез выполняли в рекомендуемом буфере NuPAGE MOPS. Гели окрашивали безопасной краской SimplyBlue™ Safe Stain в соответствии с протоколом производителя (Invitrogen) и визуализировали с использованием визуализирующей системы Typhoon (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA).
Пример 4 - Получение телец включения
Препараты телец включения (IB) Cry-белка получали на клетках в результате ферментации P. Fluorescens, что обеспечивало продукцию нерастворимого инсектицидного белка B.t., как было продемонстрировано SDS-PAGE и MALDI-MS (лазерной десорбцией при содействии матрицы/ионизационной масс-спектрометрией). Клеточные осадки P. Fluorescens, созданные через 48 часов после индукции, оттаивали на водяной бане при 37°C. Клетки ресуспендировали до 25% масс./об. в литическом буфере (50 мМ Трис, pH 7,5, 200 мМ NaCl, 20 мМ динатриевой соли EDTA (этилендиаминтетрауксусной кислоты), 1% Triton X-100 и 5 мМ дитиотреитола (DTT); непосредственно перед использованием добавляли 5 мл/л коктейля ингибитора бактериальной протеазы (P8465 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) только для Cry34Ab1 и Cry35Ab1. Клетки суспендировали, используя гомогенизатор при установке на самый низкий режим (Tissue Tearor, BioSpec Products, Inc., Bartlesville, OK). 25 мг лизоцима (Sigma L7651 из белка куриного яйца) добавляли к клеточной суспензии смешиванием металлическим шпателем, и суспензию инкубировали при комнатной температуре в течение одного часа. Суспензию охлаждали на льду в течение 15 минут, затем обрабатывали ультразвуком, используя ультразвуковой генератор Branson Sonifier 250 (два 1-минутных сеанса, при 50% рабочем цикле, производительность 30%). Лизис клеток проверяли микроскопией. При необходимости, добавляли дополнительные 25 мг лизоцима и инкубацию и обработку ультразвуком повторяли. Когда лизис клеток подтверждался микроскопией, лизат центрифугировали при 11500×g в течение 25 минут (4°C) для образования осадка IB, и супернатант удаляли. Осадок IB ресуспендировали 100 мл литического буфера, гомогенизировали ручной мешалкой и центрифугировали, как указано выше. Осадок IB повторно промывали ресуспендированием (в 50 мл литического буфера), гомогенизацией, обработкой ультразвуком и центрифугированием до тех пор, пока супернатант не становился бесцветным, и осадок IB становился плотным и не совсем белым по цвету. Для конечного промывания, осадок IB ресуспендировали в подвергнутой стерилизационной фильтрации (через фильтр с размером пор 0,22 мкм) дистиллированной воде, содержащей 2 мМ EDTA, и центрифугировали. Конечный осадок ресуспендировали в подвергнутой стерилизационной фильтрации дистиллированной воде, содержащей 2 мМ EDTA, и хранили в 1 мл аликвотах при -80°C.
Пример 5 - Анализ SDS-PAGE и количественное определение
Анализ SDS-PAGE и количественное определение белка в препаратах IB проводили оттаиванием 1 мл аликвоты осадка IB и разведением 1:20 подвергнутой стерилизационной фильтрации дистиллированной водой. Затем разбавленный образец кипятили с 4X восстанавливающего буфера образца [250 мМ Трис, pH 6,8, 40% глицерин (об./об.), 0,4% бромфенол синий (масс./об.), 8% SDS (масс./об.) и 8% β-меркаптоэтанол (об./об.)] и загружали на Novex® 4-20% Трис-глицин, 12+2-луночный гель (Invitrogen), работающий с буфером IX Трис/глицин/SDS (Invitrogen). Гель задействовали в течение приблизительно 60 мин при 200 вольтах, затем окрашивали и обесцвечивали следующими процедурами с использованием безопасного красителя SimplyBlue™ Safe Stain (Invitrogen). Количественное определение целевых полос проводили сравнением денситометрических величин для полос, в сравнении с образцами бычьего сывороточного альбумина (BSA), обработанными на том же геле, для построения стандартной кривой, используя программное обеспечение Bio-Rad Quantity One.
Пример 6 - Солюбилизация телец включения
10 мл суспензий телец включения из клонов P. fluorescens MR1253, MR1636 и DPf13032 (содержащих соответственно 50-70 мг/мл белков Cry34Ab1, Cry35Ab1 и Cry6Aa1) центрифугировали при установке на самый высокий режим микроцентрифуги Eppendorf модели 5415C (приблизительно 14000×g) для осаждения включений. Супернатант буфера для хранения удаляли и заменяли 25 мл 100 мМ буфера ацетата натрия, pH 3,0, как для Cry34Ab1, так и для Cry35Ab1, и 50 мМ буфера CAPS [3-(циклогексамино)-1-пропансульфоновой кислоты], pH 10,5, для Cry6Aa1, в конической пробирке емкостью 50 мл. Включения ресуспендировали, используя пипетку, и перемешивали в вихревой мешалке для тщательного смешивания. Пробирки помещали на медленно вращающуюся платформу при 4°C в течение ночи для экстракции белков Cry34Ab1, Cry35Ab1 и Cry6Aa1 полной длины. Экстракты центрифугировали при 30000×g в течение 30 мин при 4°C, и сохраняли полученные супернатанты, содержащие солюбилизированные Cry-белки полной длины.
Пример 7 - Усечение протоксинов полной длины
Белок Cry35Ab1 полной длины был усечен или переварен химотрипсином для получения его химотрипсиновой сердцевины, которая представляют собой активную форму Cry-белка. В частности, солюбилизированный белок Cry35Ab1 полной длины инкубировали с химотрипсином (из бычьей поджелудочной железы) (Sigma, St. MO) при (50:1=Cry-белок:фермент, масс./масс.) в 100 мМ буфера ацетата натрия, pH 3,0, при 4°C при осторожном встряхивании в течение 2-3 дней. Полную активацию или усечение подтверждали анализом SDS-PAGE. Молекулярная масса Cry35Ab1 полной длины составила ≈44, и химотрипсиновая сердцевина составила ≈40 кДа. Аминокислотные последовательности белка полной длины и химотрипсиновой сердцевины представлены в виде SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2. Ни химотрипсиновая, ни трипсиновая сердцевина не были доступны для CryAb1, а также Cry6Aa1 был значительно более активен для нацеливания на кукурузного корневого жука, чем любая из его химотрипсиновой или трипсиновой сердцевины. Таким образом, Cry34Ab1 и Cry6Aa1 полной длины использовали для анализов связывания. Аминокислотные последовательности Cry34Ab1 и Cry6Aa1 представлены в виде SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4.
Пример 8 - Очистка Cry-токсинов
Затем очищали химотрипсинизированный Cry35Ab1 и Cry6Aa1 полной длины с использованием системы ионообменной хроматографии. Конкретно, расщепленный Cry35Ab1 центрифугировали при 30000×g в течение 30 мин при 4°C с последующем фильтрованием через фильтр с размером пор 0,22 мкм для удаления липидов и всех других частиц, и полученный раствор концентрировали в 5 раз, используя устройство с центрифужным фильтром из регенерированной целлюлозы Amicon Ultra-15 (отсечка молекулярной массы 10000; Millipore). Затем буферы образцов заменяли буфером 20 мМ ацетата натрия, pH 3,5, как для Cry34Ab1, так и для Cry35Ab1, используя одноразовые колонки PD-10 (GE Healthcare, Piscataway, NJ) или диализ. Их затем очищали, используя систему жидкостной хроматографии ATKA Explorer (Amersham Biosciences). Для Cry35Ab1, буфер A представлял собой буфер в виде 20 мМ ацетата натрия, pH 3,5, и буфер B представлял собой буфер A+1M NaCl, pH 3,5 тогда как для Cry6Aa1 буфер A представлял собой 50 мМ CASP, pH 10,5, 1M NaCl. Использовали колонку HiTrap SP (5 мл) (GE) для усеченного Cry35Ab1. После того как колонка была полностью уравновешена с использованием буфера A, раствор Cry35Ab1 инжектировали в колонку при скорости потока 5 мл/мин. Элюирование выполняли с использованием градиента 0-100% буфера B при 5 мл/мин с 1 мл/фракция.
Для Cry6Aa1 полной длины, использовали колонку Capto Q, 5 мл (5 мл) (GE), и все другие процедуры были аналогичны процедурам для Cry35Ab1. После анализа SDS-PAGE выбранных фракций для дополнительного выбора фракций, содержащих белок-мишень наилучшего качества, фракции объединяли. Буфер для очищенной химотрипсиновой сердцевины Cry35Ab1 заменяли 20 мМ Bist-Tris, pH 6,0, как описано выше. Для очищенного Cry6Aa1, соль удаляли посредством диализа против 10 мМ CASP, pH 10,5. Образцы хранили при 4°C для проводимого позднее анализа связывания после количественного определения с использованием SDS-PAGE и анализов системой визуализации Typhoon (GE) с BSA в качестве стандарта. Cry34Ab1 полной длины был уже чистым после солюбилизации в кислотном буфере, по данным анализа SDS-PAGE, и, таким образом, без дальнейшей очистки.
Пример 9 - Препараты BBMV
Препараты пузырьков мембраны щеточной каемки (BBMV) средней кишки насекомых широко используются для анализов связывания Cry-токсина с рецептором. Препараты BBMV, используемые в настоящем изобретении, получали из изолированных средних кишок третьей возрастной стадии западного кукурузного корневого жука (Diabrotica virgifera virgifera LeConte), используя способ, описанный Wolferberger et al. (1987). Лейцинаминопептидазу использовали в качестве маркера мембранных белков в препарате, и активность лейцинаминопептидазы неочищенного гомогената и препарата BBMV определяли, как описано ранее (Li et al. 2004a). Концентрацию белка в препарате BBMV измеряли, используя способ Bradford (1976).
Пример 10 - Мечение 125I
Очищенный Cry34Ab1 полной длины, химотрипсинизированный Cry35Ab1 и Cry6Aa1 полной длины метили, используя 125I, для анализов насыщающего и конкурентного связывания. Для удостоверения в том, мечение радиоактивным изотопом не устраняет биологическую активность Cry-токсинов, проводили йодирование в холодном виде, используя NaI, в соответствии с инструкциями по использованию гранул для йодирования Pierce® (Pierce Biotechnology, Thermo Scientific, Rockford IL). Результаты биоанализа показали, что как йодированная химотрипсиновая сердцевина Cry35Ab1, так и Cry6Aa1 полной длины оставались активными против личинок западного кукурузного корневого жука, но йодирование инактивировало Cry34Ab1. Как ожидалось, 125I-Cry34Ab1 специфически не связывался с BBMV насекомых, и, следовательно, Cry34Ab1 требует другого способа мечения для оценки связывания с мембранными рецепторами. Биоанализ с использованием йодированной трипсиновой сердцевины Cry3Aa продолжался, и результат был доступен через одну или две недели. 125I-Cry35Ab1 и 125I-Cry6Aa1 были получены йодированием гранулами для йодирования Pierce® (Pierce) и Na125I. Колонки для обессоливания по выбору Zeba™ (Pierce) использовали для удаления не включенного или свободного Na125I из йодированного белка. Величины удельной радиоактивности йодированных Cry-белков находились в диапазоне от 1 до 5 мкКи/мкг. Проводили множественные серии мечения и анализов связывания.
Пример 11 - Анализы насыщающего связывания
Анализы насыщающего связывания выполняли, используя меченые 125I Cry-токсины, как описано ранее (Li et al. 2004b). Для определения специфического связывания и оценки аффинности связывания (константы диссоциации, Kd) и концентрации сайтов связывания (количества токсина, специфически связанного с данным количеством BBMV, Bmax) Cry35Ab1 и Cry6Aa1 с BBMV насекомых, серии возрастающих концентраций или 125I-Cry35Ab1, или 125I-Cry6Aa1 инкубировали с данной концентрацией (0,1 мг/мл) BBMV насекомых соответственно в 150 мкл 20 мМ Bis-Tris, pH 6,0, 136,9 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl с добавлением 0,1% BSA при комнатной температуре в течение 60 мин при осторожном встряхивании. Токсин, связанный с BBMV, отделяли от свободных токсинов в суспензии центрифугированием при 20000×g при комнатной температуре в течение 60 мин при осторожном встряхивании. Токсин, связанный с BBMV, отделяли от свободного токсина в суспензии центрифугированием при 20000×g при комнатной температуре в течение 8 мин. Осадок после центрифугирования дважды промывали 900 мкл такого же ледяного буфера, содержащего 0,1% BSA. Радиоактивность, остающуюся в осадке после центрифугирования, измеряли автоматическим гамма-счетчиком COBRAII Auto-Gamma counter (Packard, компании Canberra) и учитывали общее связывание.
Параллельно проводили другую серию реакций связывания, и в каждую из реакций связывания включали 500-1000-кратный избыток немеченого соответствующего токсина для полного занятия всех сайтов специфического связывания на BBMV, которые использовали для определения неспецифического связывания. Специфическое связывание оценивали вычитанием неспецифического связывания из общего связывания. Величины Kd и Bmax токсинов оценивали, используя число молекул токсина (пкмоль), специфически связанных на микрограмм белка BBMV, в сравнении с концентрациями использованного меченого токсина, путем программного обеспечения GraphPad Prism 5.01 (GraphPad Software, San Diego, CA). Графики составляли с использованием программ или Microsoft Excel, или GraphPad Prism. Эксперименты повторяли, по меньшей мере, три раза. Эти эксперименты связывания продемонстрировали, что как 125I-Cry35Ab1, так и 125I-Cry6Aa1 были способны специфически связываться с BBMV (фиг.1A и 1B). 125I-Cry35Ab1 и 125I-Cry6Aa1 имели аффинность связывания Kd=11,66±11,35 и 7,99±4,89 (нМ), соответственно, и концентрацию участков связывания Bmax=5,19±3,02 и 2,71±0,90 (пкмоль/мкг BBMV), соответственно.
Пример 12 - Анализы конкурентного связывания
Анализы конкурентного связывания дополнительно проводили для определения того, разделяют ли Cry35Ab1 и Cry6Aa1 один и тот же набор рецепторов. Для анализов гомологичного конкурентного связывания Cry35Ab1, увеличивающиеся количества (0-5000 нМ) немеченого Cry35Ab1 сначала смешивали с 5 нМ меченого Cry35Ab1, и затем инкубировали с данной концентрацией (0,1 мг/мл) BBMV при комнатной температуре в течение 60 мин, соответственно. Процентные доли связанного 125I-Cry35Ab1 с BBMV определяли для каждой из реакций, по сравнению с первоначальным специфическим связыванием в отсутствие немеченого конкурента. Выполняли анализы гетерологичного конкурентного связывания соответственно между 125I-Cry35Ab1 и немеченым Cry6Aa1 для идентификации того, разделяют ли они один и тот же набор рецептора(ов). Это достигалось увеличением количества немеченого Cry6Aa1 в качестве конкурента, включенного в реакции, для конкуренции за предполагаемый рецептор(ры) на BBMV с меченым Cry35Ab1. Эксперименты повторяли, по меньшей мере, три раза.
Экспериментальные результаты продемонстрировали, что Cry35Ab1 был способен полностью вытесняться более чем на 50%, когда молярная концентрация увеличивалась приблизительно до 100 нМ (20-кратный избыток, по сравнению с 125I-Cry35Ab1). Остающиеся примерно 50% считали неспецифическим связыванием, которое не могло вытесняться на основании результатов насыщающего связывания, как описано выше. Это означает, что специфическое связывание полностью вытеснялось 20-кратным избытком немеченого Cry35Ab1 (фиг.2). Однако Cry6Aa1 был неспособен вытеснить 125I-Cry35Ab1. Эти данные указывают на то, что Cry35Ab1 не разделяет рецептор с Cry6Aa1. То, разделяют ли рецептор Cry34Ab1 и Cry6Aa1, остается протестировать, используя Cry34Ab1, для конкуренции за связывание с меченным радиоактивным изотопом Cry6Aa или немеченым Cry6Aa1 другим способом мечения.
Ссылки
Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem. 72, 248-254.
Li, H., Oppert, B., Higgins, R.., Huang, F., Zhu, K.Y., Buschman, L.L., 2004a. Comparative analysis of proteinase activities of Bacillus thuringiensis-resistant and -susceptible Ostrinia nubilalis (Lepidoptera: Crambidae). Insect Biochem. Mol. Biol. 34, 753-762.
Li, H., Oppert, B., Gonzalez-Cabrera, J., Ferre, J., Higgins, R.A., Buschman, L.L. и Zhu, K.Y. and Huang, F. 2004b. Binding analysis of Cry1 Ab и Cry 1 Ac with membrane vesicles from Bacillus thuringiensis-resistant and -susceptible Ostrinia nubilalis (Lepidoptera: Crambidae). Biochem. Biophys. Res. Commun. 323, 52-57.
Schneider, J.C. Jenings AF, Mun DM, McGovern PM, Chew LC. 2005. Auxotrophic markers pyrF and proC can replace antibiotic markers on protein production plasmids in high-cell-density Pseudomonas fluorescens fermentation. Biotechnology Progress 21, 343-348.
Wolfersberger, M.G., Luthy, P., Maurer, A., Parenti, P., Sacchi, F., Giordana, B., Hanozet, G.M., 1987. Preparation and partial characterization of amino acid transporting brush border membrane vesicles from the larval midgut of the cabbage butterfly (Pieris brassicae). Comp. Biochem. Physiol. 86A, 301-308.
US Patent Application No. 20080193974. 2008. BACTERIAL LEADER SEQUENCES FOR INCREASED EXPRESSION
US Patent Application No. 20060008877, 2006. Expression systems with sec-system secretion.
US Patent Application No. 20080058262, 2008. rPA optimization.
Claims (21)
1. Трансгенное растение, которое имеет устойчивость к кукурузному корневому жуку (Diabrotica spp.), содержащее ДНК, кодирующую белок Cry34Ab с последовательностью SEQ ID NO: 3, ДНК, кодирующую белок Cry35Ab с последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, и ДНК, кодирующую инсектицидный белок Cry6Aa с последовательностью SEQ ID NO: 4.
2. Трансгенное растение по п. 1, которое имеет устойчивость к кукурузному корневому жуку (Diabrotica spp.), где указанное растение дополнительно продуцирует четвертый инсектицидный белок, выбранный из группы, состоящей из Cry3B и Cry3A.
3. Семя растения по любому из пп. 1-2, где указанное семя содержит ДНК, кодирующую белок Cry34Ab с последовательностью SEQ ID NO: 3, ДНК, кодирующую белок Cry35Ab с последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, и ДНК, кодирующую инсектицидный белок Cry6Aa с последовательностью SEQ ID NO: 4, где указанное семя высевают для борьбы с развитием устойчивости кукурузного корневого жука к белку Cry34Ab, белку Cry35Ab и белку Cry6Aa.
4. Множество растений на поле, содержащее множество трансгенных растений по любому из пп. 1-2 и растения, не содержащие белки Bacillus thuringiensis (Bt) (non-Bt растения), которые не экспрессируют трансгенные инсектицидные белки, где указанное множество растений замедляет развитие устойчивости кукурузного корневого жука (Diabrotica spp.) к белку Cry34Ab, белку Cry35Ab и белку Cry6Aa.
5. Множество растений по п. 4, где указанные non-Bt растения составляют менее чем 40% всех культур из указанного множества растений, где указанное множество растений замедляет развитие устойчивости кукурузного корневого жука к белку Cry34Ab, белку Cry35Ab и белку Cry6Aa и где указанное множество растений содержит по крайней мере одно non-Bt растение.
6. Множество растений по п. 5, где указанные non-Bt растения составляют менее чем 30% всех культур из указанного множества растений.
7. Множество растений по п. 5, где указанные non-Bt растения составляют менее чем 20% всех культур из указанного множества растений.
8. Множество растений по п. 5, где non-Bt растения составляют менее чем 10% всех культур из указанного множества растений.
9. Множество растений по п. 5, где указанные non-Bt растения составляют менее чем 5% всех культур из указанного множества растений.
10. Множество растений по п. 5, где указанные non-Bt растения расположены блоками или полосами.
11. Смесь семян, содержащая семена от non-Bt растений и множество семян по п. 3, где указанные семена от non-Bt растений составляют менее чем 40% всех семян в смеси, где указанную смесь семян высевают для борьбы с развитием устойчивости кукурузного корневого жука к белку Cry34Ab, белку Cry35Ab и белку Cry6Aa и где указанная смесь семян содержит по крайней мере одно семя от non-Bt растений.
12. Смесь семян по п. 11, где указанные семена от non-Bt растений составляют менее чем 30% всех семян в смеси.
13. Смесь семян по п. 11, где указанные семена от non-Bt растений составляют менее чем 20% всех семян в смеси.
14. Смесь семян по п. 11, где указанные семена от non-Bt растений составляют менее чем 10% всех семян в смеси.
15. Смесь семян по п. 11, где указанные семена от non-Bt растений составляют менее чем 5% всех семян в смеси.
16. Способ замедления развития устойчивости к белку Cry34Ab, белку Cry35Ab и белку Cry6Aa кукурузного корневого жука, включающий посев семян для получения множества растений на поле растений, где множество растений содержит растения, не содержащие белки Bacillus thuringiensis (non-Bt растения), которые не экспрессируют трансгенные инсектицидные белки, и трансгенные растения, которые содержат ДНК, кодирующую белок Cry34Ab с последовательностью SEQ ID NO: 3, ДНК, кодирующую белок Cry35Ab с последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, и ДНК, кодирующую инсектицидный белок Cry6Aa с последовательностью SEQ ID NO: 4, и контактирование указанных насекомых с указанным множеством трансгенных растений.
17. Множество растений на поле по любому из пп. 5-10, где указанные растения занимают более чем 10 акров (40,5 га).
18. Растение по любому из пп. 1 и 2, где указанное растение представляет собой растение маиса.
19. Растительная клетка растения по любому из пп. 1 и 2, которая имеет устойчивость к кукурузному корневому жуку (Diabrotica spp.), где указанная растительная клетка содержит ДНК, кодирующую белок Cry34Ab с последовательностью SEQ ID NO: 3, ДНК, кодирующую белок Cry35Ab с последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, и ДНК, кодирующую инсектицидный белок Cry6Aa с последовательностью SEQ ID NO: 4.
20. Способ борьбы с кукурузным корневым жуком приведением в контакт указанного насекомого с белком Cry34Ab с последовательностью SEQ ID NO: 3, белком Cry35Ab с последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2 и инсектицидным белком Cry6Aa с последовательностью SEQ ID NO: 4.
21. Растение по п. 2, где указанный белок Cry3A представляет собой белок Cry3Aa и указанный белок Cry3B представляет собой белок Cry3Ba.
Applications Claiming Priority (9)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US32724010P | 2010-04-23 | 2010-04-23 | |
US61/327,240 | 2010-04-23 | ||
US38827310P | 2010-09-30 | 2010-09-30 | |
US61/388,273 | 2010-09-30 | ||
US201161476005P | 2011-04-15 | 2011-04-15 | |
US61/476,005 | 2011-04-15 | ||
US201161477447P | 2011-04-20 | 2011-04-20 | |
US61/477,447 | 2011-04-20 | ||
PCT/US2011/033621 WO2011133895A1 (en) | 2010-04-23 | 2011-04-22 | Combinations including cry34ab/35ab and cry6aaproteins to prevent development of resistance corn rootworms(diabrotica spp.) |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2012149846A RU2012149846A (ru) | 2014-05-27 |
RU2582262C2 true RU2582262C2 (ru) | 2016-04-20 |
Family
ID=44834532
Family Applications (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2012149845/10A RU2576005C2 (ru) | 2010-04-23 | 2011-04-22 | КОМБИНАЦИИ, ВКЛЮЧАЮЩИЕ БЕЛКИ Cry3Aa И Cry6Aa, ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ РАЗВИТИЯ УСТОЙЧИВОСТИ У КУКУРУЗНЫХ КОРНЕВЫХ ЖУКОВ (Diabrotica spp.) |
RU2012149849/10A RU2582249C2 (ru) | 2010-04-23 | 2011-04-22 | КОМБИНАЦИИ, ВКЛЮЧАЮЩИЕ БЕЛКИ Cry34Ab/35Ab И Cry3Aa, ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ РАЗВИТИЯ УСТОЙЧИВОСТИ У КУКУРУЗНЫХ КОРНЕВЫХ ЖУКОВ (Diabrotica spp.) |
RU2012149847/10A RU2591519C2 (ru) | 2010-04-23 | 2011-04-22 | КОМБИНАЦИИ, ВКЛЮЧАЮЩИЕ БЕЛКИ Cry34Ab/35Ab И Сry3Ba, ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ РАЗВИТИЯ УСТОЙЧИВОСТИ У КУКУРУЗНЫХ КОРНЕВЫХ ЖУКОВ (Diabrotica spp.) |
RU2012149846/10A RU2582262C2 (ru) | 2010-04-23 | 2011-04-22 | КОМБИНАЦИИ, ВКЛЮЧАЮЩИЕ БЕЛКИ Cry34Ab/35Ab И Cry6Aa, ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ РАЗВИТИЯ УСТОЙЧИВОСТИ У КУКУРУЗНЫХ КОРНЕВЫХ ЖУКОВ (Diabrotica spp. ) |
Family Applications Before (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2012149845/10A RU2576005C2 (ru) | 2010-04-23 | 2011-04-22 | КОМБИНАЦИИ, ВКЛЮЧАЮЩИЕ БЕЛКИ Cry3Aa И Cry6Aa, ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ РАЗВИТИЯ УСТОЙЧИВОСТИ У КУКУРУЗНЫХ КОРНЕВЫХ ЖУКОВ (Diabrotica spp.) |
RU2012149849/10A RU2582249C2 (ru) | 2010-04-23 | 2011-04-22 | КОМБИНАЦИИ, ВКЛЮЧАЮЩИЕ БЕЛКИ Cry34Ab/35Ab И Cry3Aa, ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ РАЗВИТИЯ УСТОЙЧИВОСТИ У КУКУРУЗНЫХ КОРНЕВЫХ ЖУКОВ (Diabrotica spp.) |
RU2012149847/10A RU2591519C2 (ru) | 2010-04-23 | 2011-04-22 | КОМБИНАЦИИ, ВКЛЮЧАЮЩИЕ БЕЛКИ Cry34Ab/35Ab И Сry3Ba, ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ РАЗВИТИЯ УСТОЙЧИВОСТИ У КУКУРУЗНЫХ КОРНЕВЫХ ЖУКОВ (Diabrotica spp.) |
Country Status (20)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US9796983B2 (ru) |
EP (5) | EP3366118A1 (ru) |
JP (4) | JP5922646B2 (ru) |
KR (4) | KR101842726B1 (ru) |
CN (5) | CN103108540A (ru) |
AR (4) | AR081334A1 (ru) |
AU (4) | AU2011242578B2 (ru) |
BR (4) | BR112012027208A2 (ru) |
CA (4) | CA2796727A1 (ru) |
CL (3) | CL2012002965A1 (ru) |
CO (4) | CO6592036A2 (ru) |
ES (1) | ES2665514T3 (ru) |
IL (4) | IL222584A (ru) |
MA (4) | MA34238B1 (ru) |
MX (3) | MX2012012369A (ru) |
NZ (4) | NZ603555A (ru) |
RU (4) | RU2576005C2 (ru) |
UA (3) | UA116612C2 (ru) |
WO (4) | WO2011133892A1 (ru) |
ZA (3) | ZA201208638B (ru) |
Families Citing this family (49)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103125516B (zh) * | 2011-11-24 | 2014-12-17 | 华中农业大学 | 对南方根结线虫具有杀虫增效作用的蛋白组合物Cry6Aa/Cry55Aa及应用 |
WO2014071182A1 (en) | 2012-11-01 | 2014-05-08 | Massachusetts Institute Of Technology | Directed evolution of synthetic gene cluster |
EA030896B1 (ru) | 2013-08-16 | 2018-10-31 | Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. | Инсектицидные белки и способы их применения |
BR122020001770B1 (pt) | 2013-09-13 | 2022-11-29 | Pioneer Hi-Bred International, Inc | Construto de dna, método de obtenção de planta transgênica, proteína de fusão, método para controlar uma população de praga de inseto, método para inibir o crescimento ou matar uma praga de inseto |
AR097995A1 (es) * | 2013-10-14 | 2016-04-27 | Syngenta Participations Ag | Método para sembrar filas de cultivos |
BR102014031844A2 (pt) | 2013-12-20 | 2015-10-06 | Dow Agrosciences Llc | ras oposto (rop) e moléculas de ácido nucleico relacionadas que conferem resistência a pragas de coleópteros e hemípteros |
KR20160093728A (ko) | 2013-12-20 | 2016-08-08 | 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 | 딱정벌레류 해충에 대한 저항성을 부여하는 rnapii-140 핵산 분자 |
US10227608B2 (en) | 2014-02-07 | 2019-03-12 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins from plants and methods for their use |
CN106232620B (zh) | 2014-02-07 | 2022-05-13 | 先锋国际良种公司 | 杀昆虫蛋白及其使用方法 |
MX2016014313A (es) | 2014-05-07 | 2017-06-30 | Dow Agrosciences Llc | Moleculas de acido nucleico dre4 que confieren resistencia a las plagas de coleopteros. |
WO2016000237A1 (en) | 2014-07-03 | 2016-01-07 | Pioneer Overseas Corporation | Plants having enhanced tolerance to insect pests and related constructs and methods involving insect tolerance genes |
US10435706B2 (en) | 2014-10-16 | 2019-10-08 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
WO2016086010A1 (en) | 2014-11-24 | 2016-06-02 | Poet Research, Inc. | Corn blends that include high oil corn and methods of making one or more biochemicals using high oil corn or corn blends that include high oil corn |
CN107529763B (zh) | 2015-03-11 | 2021-08-20 | 先锋国际良种公司 | Pip-72的杀昆虫组合及使用方法 |
CN108064233B (zh) | 2015-05-19 | 2022-07-15 | 先锋国际良种公司 | 杀昆虫蛋白及其使用方法 |
CA2986265A1 (en) | 2015-06-16 | 2016-12-22 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
MX2018000615A (es) | 2015-07-13 | 2018-08-01 | Pivot Bio Inc | Metodos y composiciones para mejorar atributos de plantas. |
US11840700B2 (en) * | 2015-07-23 | 2023-12-12 | Monsanto Technology Llc | Multi functional toxins |
CA2994676A1 (en) | 2015-08-06 | 2017-02-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Plant derived insecticidal proteins and methods for their use |
US10612036B2 (en) * | 2015-08-17 | 2020-04-07 | Dow Agrosciences Llc | Engineered Cry6A insecticidal proteins |
US11479516B2 (en) | 2015-10-05 | 2022-10-25 | Massachusetts Institute Of Technology | Nitrogen fixation using refactored NIF clusters |
CN108575091A (zh) | 2015-12-18 | 2018-09-25 | 先锋国际良种公司 | 杀昆虫蛋白及其使用方法 |
CN105483240A (zh) * | 2015-12-26 | 2016-04-13 | 吉林省农业科学院 | 转基因植物中cry34Ab基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法 |
CN105506081A (zh) * | 2015-12-26 | 2016-04-20 | 吉林省农业科学院 | 转基因植物中cry35Ab基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法 |
WO2017184673A1 (en) | 2016-04-19 | 2017-10-26 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal combinations of polypeptides having improved activity spectrum and uses thereof |
EA201892293A1 (ru) | 2016-05-04 | 2019-04-30 | Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. | Инсектицидные белки и способы их применения |
CN109312359A (zh) | 2016-06-16 | 2019-02-05 | 先锋国际良种公司 | 用以防治昆虫有害生物的组合物和方法 |
MX2018015900A (es) | 2016-06-24 | 2019-04-04 | Pioneer Hi Bred Int | Elementos reguladores de planta y metodos para usarlos. |
EP3954202A1 (en) | 2016-07-01 | 2022-02-16 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins from plants and methods for their use |
US20210292778A1 (en) | 2016-07-12 | 2021-09-23 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
CN110799474B (zh) | 2017-01-12 | 2022-07-26 | 皮沃特生物公司 | 用于改良植物性状的方法及组合物 |
MX2019009371A (es) | 2017-02-08 | 2019-09-23 | Pionner Hi Bred Int Inc | Combinaciones insecticidas de proteinas insecticidas derivadas de plantas y metodos para su uso. |
BR112019019892A2 (pt) | 2017-04-03 | 2020-04-22 | Monsanto Technology Llc | proteínas inibidoras de inseto". |
WO2019074598A1 (en) | 2017-10-13 | 2019-04-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | VIRUS-INDUCED GENETIC SILENCING TECHNOLOGY FOR THE CONTROL OF INSECTS IN MAIZE |
CA3079955A1 (en) | 2017-10-25 | 2019-05-02 | Pivot Bio, Inc. | Methods and compositions for improving engineered microbes that fix nitrogen |
EP3755797A1 (en) | 2018-02-22 | 2020-12-30 | Zymergen, Inc. | Method for creating a genomic library enriched for bacillus and identification of novel cry toxins |
CA3088011A1 (en) | 2018-03-02 | 2019-09-06 | Zymergen Inc. | Insecticidal protein discovery platform and insecticidal proteins discovered therefrom |
WO2019178042A1 (en) | 2018-03-14 | 2019-09-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins from plants and methods for their use |
CA3092075A1 (en) | 2018-03-14 | 2019-09-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins from plants and methods for their use |
US11702668B2 (en) | 2018-05-22 | 2023-07-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Plant regulatory elements and methods of use thereof |
CA3103977A1 (en) | 2018-06-27 | 2020-01-02 | Pivot Bio, Inc. | Agricultural compositions comprising remodeled nitrogen fixing microbes |
CN112438198A (zh) * | 2019-08-30 | 2021-03-05 | 中国农业大学 | 利用杂交不亲和基因在制备抗虫转基因玉米庇护所中的应用 |
WO2021221690A1 (en) | 2020-05-01 | 2021-11-04 | Pivot Bio, Inc. | Modified bacterial strains for improved fixation of nitrogen |
EP4143211A2 (en) | 2020-05-01 | 2023-03-08 | Pivot Bio, Inc. | Modified bacterial strains for improved fixation of nitrogen |
CN111574599B (zh) * | 2020-05-18 | 2022-10-28 | 福建农林大学 | 一种解决杀虫毒素被昆虫肠道消化酶过度酶解的毒素改造方法 |
US20230235352A1 (en) | 2020-07-14 | 2023-07-27 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
CN112063748A (zh) * | 2020-10-13 | 2020-12-11 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 用于检测转基因玉米g1105e-823c的rpa引物探针组合、试剂盒及检测方法 |
MX2024000026A (es) | 2021-07-02 | 2024-02-20 | Pivot Bio Inc | Cepas bacterianas dise?adas por ingenieria genetica para fijacion de nitrogeno mejorada. |
CN115029369B (zh) * | 2022-06-01 | 2023-04-21 | 中国林业科学研究院森林生态环境与自然保护研究所 | 一种防治松材线虫病的苏云金芽孢杆菌工程菌制备方法与应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2210593C2 (ru) * | 1993-09-02 | 2003-08-20 | Новартис Аг | ФРАГМЕНТ ГИБРИДНОГО ТОКСИНА Bacillus thuringiensis, ОБЛАДАЮЩИЙ ИНСЕКТИЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, КОДИРУЮЩАЯ ЕГО РЕКОМБИНАНТНАЯ ДНК, СПОСОБ БОРЬБЫ С НАСЕКОМЫМИ |
Family Cites Families (63)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US1558396A (en) * | 1923-11-08 | 1925-10-20 | Roehrs Rudolph Lienau | Grass-seed container |
US4762785A (en) | 1982-08-12 | 1988-08-09 | Calgene, Inc. | Novel method and compositions for introducting alien DNA in vivo |
EP0116718B2 (en) | 1983-01-13 | 1996-05-08 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Process for the introduction of expressible genes into plant cell genomes and agrobacterium strains carrying hybrid Ti plasmid vectors useful for this process |
JPS60500438A (ja) | 1983-01-17 | 1985-04-04 | モンサント カンパニ− | 植物細胞を形質転換するためのプラスミド |
NL8300699A (nl) | 1983-02-24 | 1984-09-17 | Univ Leiden | Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; werkwijze voor het produceren van agrobacterium tumefaciens bacterien; stabiele cointegraat plasmiden; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten. |
NL8300698A (nl) | 1983-02-24 | 1984-09-17 | Univ Leiden | Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten. |
US5380831A (en) | 1986-04-04 | 1995-01-10 | Mycogen Plant Science, Inc. | Synthetic insecticidal crystal protein gene |
NL8401048A (nl) | 1984-04-03 | 1985-11-01 | Rijksuniversiteit Leiden En Pr | Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van eenzaadlobbige planten. |
US5231019A (en) | 1984-05-11 | 1993-07-27 | Ciba-Geigy Corporation | Transformation of hereditary material of plants |
US5149645A (en) | 1984-06-04 | 1992-09-22 | Rijksuniversiteit Leiden | Process for introducing foreign DNA into the genome of plants |
NL8401780A (nl) | 1984-06-04 | 1986-01-02 | Rijksuniversiteit Leiden En Pr | Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van planten. |
US4945050A (en) | 1984-11-13 | 1990-07-31 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor |
EP0265502A1 (en) | 1986-04-30 | 1988-05-04 | Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. | Electric field mediated dna transformation of plant cells and organelles |
US5188958A (en) | 1986-05-29 | 1993-02-23 | Calgene, Inc. | Transformation and foreign gene expression in brassica species |
US5177010A (en) | 1986-06-30 | 1993-01-05 | University Of Toledo | Process for transforming corn and the products thereof |
EP0267159A3 (de) | 1986-11-07 | 1990-05-02 | Ciba-Geigy Ag | Verfahren zur genetischen Modifikation monokotyler Pflanzen |
SE455438B (sv) | 1986-11-24 | 1988-07-11 | Aga Ab | Sett att senka en brennares flamtemperatur samt brennare med munstycken for oxygen resp brensle |
US5004863B2 (en) | 1986-12-03 | 2000-10-17 | Agracetus | Genetic engineering of cotton plants and lines |
EP0846771A1 (en) | 1987-05-20 | 1998-06-10 | Novartis AG | Zea mays plants and transgenic zea mays plants regenerated from protoplasts or protoplast-derived cells |
US5753492A (en) * | 1987-08-12 | 1998-05-19 | Mycogen Corporation | Genes encoding nematode-active toxins from Bacillus thuringiensis strains |
US5302523A (en) | 1989-06-21 | 1994-04-12 | Zeneca Limited | Transformation of plant cells |
US5141131A (en) | 1989-06-30 | 1992-08-25 | Dowelanco | Method and apparatus for the acceleration of a propellable matter |
JP3234598B2 (ja) | 1990-11-23 | 2001-12-04 | プラント・ジエネテイツク・システムズ・エヌ・ベー | 単子葉植物の形質転換方法 |
US5384253A (en) | 1990-12-28 | 1995-01-24 | Dekalb Genetics Corporation | Genetic transformation of maize cells by electroporation of cells pretreated with pectin degrading enzymes |
DE69333073T2 (de) | 1992-02-12 | 2004-04-15 | Chromagen, Inc., San Diego | Verwendungen von fluoreszierenden n-nukleosiden und dessen analogen |
WO1993021335A2 (en) | 1992-04-15 | 1993-10-28 | Plant Genetic Systems, N.V. | Transformation of monocot cells |
DE69334225D1 (de) | 1992-07-07 | 2008-07-31 | Japan Tobacco Inc | Verfahren zur transformation einer monokotyledon pflanze |
US5469976A (en) | 1993-04-30 | 1995-11-28 | Burchell; James R. | Shelf allocation and management system |
ES2105415T3 (es) | 1993-06-04 | 1997-10-16 | Cavis Srl | Dispositivo de inercia para interrumpir el circuito electrico de un vehiculo con un motor de combustion interna. |
US6372480B1 (en) | 1996-04-19 | 2002-04-16 | Mycogen Corporation | Pesticidal proteins |
US6083499A (en) | 1996-04-19 | 2000-07-04 | Mycogen Corporation | Pesticidal toxins |
US5874288A (en) * | 1997-07-31 | 1999-02-23 | Mycogen Corporation | Bacillus thuringiensis toxins with improved activity |
US6218188B1 (en) | 1997-11-12 | 2001-04-17 | Mycogen Corporation | Plant-optimized genes encoding pesticidal toxins |
US6023013A (en) * | 1997-12-18 | 2000-02-08 | Monsanto Company | Insect-resistant transgenic plants |
US6060594A (en) * | 1997-12-18 | 2000-05-09 | Ecogen, Inc. | Nucleic acid segments encoding modified bacillus thuringiensis coleopteran-toxic crystal proteins |
DE19825333A1 (de) * | 1998-06-05 | 1999-12-09 | Hoechst Schering Agrevo Gmbh | Verfahren zur Kontrolle von Schadorganismen in Nutzpflanzen |
US6555655B1 (en) | 1999-05-04 | 2003-04-29 | Monsanto Technology, Llc | Coleopteran-toxic polypeptide compositions and insect-resistant transgenic plants |
US6501009B1 (en) * | 1999-08-19 | 2002-12-31 | Monsanto Technology Llc | Expression of Cry3B insecticidal protein in plants |
AR025349A1 (es) | 1999-08-23 | 2002-11-20 | Mycogen Corp | Metodos para controlar las plagas del gusano gris |
CN1338262A (zh) * | 2000-08-11 | 2002-03-06 | 张泽国 | 复方乌头膏及其制备方法 |
US6551962B1 (en) * | 2000-10-06 | 2003-04-22 | Monsanto Technology Llc | Method for deploying a transgenic refuge |
US7230167B2 (en) * | 2001-08-31 | 2007-06-12 | Syngenta Participations Ag | Modified Cry3A toxins and nucleic acid sequences coding therefor |
US20040210964A1 (en) * | 2003-02-20 | 2004-10-21 | Athenix Corporation | AXMI-009, a delta-endotoxin gene and methods for its use |
US20070011773A1 (en) * | 2003-04-04 | 2007-01-11 | Syngenta Limited | Method of resistance management for transgenic crops |
US7524810B1 (en) * | 2003-10-03 | 2009-04-28 | Dow Agrosciences Llc | Modified Cry34 proteins |
US7309785B1 (en) | 2003-10-03 | 2007-12-18 | Dow Agrosciences Llc | Modified chimeric Cry35 proteins |
US20050183161A1 (en) * | 2003-10-14 | 2005-08-18 | Athenix Corporation | AXMI-010, a delta-endotoxin gene and methods for its use |
PL2336153T3 (pl) | 2003-11-21 | 2016-08-31 | Pfenex Inc | Udoskonalone systemy ekspresji z układem wydzielania SEC |
WO2005094340A2 (en) * | 2004-03-29 | 2005-10-13 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Method of reducing insect resistant pests in transgenic crops |
JP5285906B2 (ja) | 2004-04-30 | 2013-09-11 | ダウ アグロサイエンシズ リミテッド ライアビリティー カンパニー | 除草剤抵抗性遺伝子 |
US7985892B1 (en) * | 2004-06-29 | 2011-07-26 | Dow Agrosciences Llc | Truncated Cry35 proteins |
EP1909559A4 (en) * | 2005-07-08 | 2009-01-21 | Hexima Ltd | COMBATING PLANT PEPPERS |
CN101505589A (zh) * | 2005-08-30 | 2009-08-12 | 菲龙有限责任公司 | 昆虫抗性转基因草坪草 |
DK1947926T3 (en) | 2005-10-28 | 2015-01-26 | Dow Agrosciences Llc | new herbicide resistant genes |
EP2363495B1 (en) | 2006-05-30 | 2019-07-24 | Pfenex Inc. | Anthrax vaccine |
CN200985135Y (zh) * | 2006-12-20 | 2007-12-05 | 贵州省烟草科学研究所 | 细粒种子袋 |
MX2009005286A (es) * | 2006-12-22 | 2009-05-28 | Pioneer Hi Bred Int | Estrategia de manejo de resistencia. |
CA2677179C (en) | 2007-01-31 | 2016-02-16 | Dow Global Technologies Inc. | Bacterial leader sequences for increased expression |
US8309516B2 (en) * | 2007-03-28 | 2012-11-13 | Syngenta Participations Ag | Insecticidal proteins |
WO2008130985A2 (en) * | 2007-04-16 | 2008-10-30 | Monsanto Technology, Llc | Plants with multiple transgenes on a chromosome |
AR068340A1 (es) * | 2007-08-10 | 2009-11-11 | Univ Georgia Res Found | MEJORA DE LAS TOXICIDADES DE LAS PROTEINAS CRY DE BACILUS THURINGINESIS PARA LOS COLEoPTEROS Y FRAGMENTOS DE CADERINA DE INSECTOS |
MX2010011925A (es) * | 2008-05-01 | 2010-11-30 | Bayer Bioscience Nv | Manejo en plantas transgenicas de la resistencia de la oruga militar tardia. |
US20090300980A1 (en) * | 2008-05-02 | 2009-12-10 | Dow Agrosciences Llc | Corn with transgenic insect protection traits utilized in combination with drought tolerance and/or reduced inputs particularly fertilizer |
-
2011
- 2011-04-22 MA MA35379A patent/MA34238B1/fr unknown
- 2011-04-22 US US13/643,052 patent/US9796983B2/en active Active
- 2011-04-22 CA CA2796727A patent/CA2796727A1/en not_active Abandoned
- 2011-04-22 AU AU2011242578A patent/AU2011242578B2/en not_active Ceased
- 2011-04-22 ES ES11772786.7T patent/ES2665514T3/es active Active
- 2011-04-22 US US13/643,050 patent/US20130167269A1/en not_active Abandoned
- 2011-04-22 CN CN2011800310549A patent/CN103108540A/zh active Pending
- 2011-04-22 AU AU2011242579A patent/AU2011242579B2/en not_active Ceased
- 2011-04-22 NZ NZ603555A patent/NZ603555A/en not_active IP Right Cessation
- 2011-04-22 RU RU2012149845/10A patent/RU2576005C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2011-04-22 CN CN2011800311715A patent/CN102946717A/zh active Pending
- 2011-04-22 JP JP2013506332A patent/JP5922646B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2011-04-22 CA CA2796728A patent/CA2796728A1/en active Pending
- 2011-04-22 UA UAA201213337A patent/UA116612C2/uk unknown
- 2011-04-22 MA MA35380A patent/MA34239B1/fr unknown
- 2011-04-22 UA UAA201213338A patent/UA112516C2/uk unknown
- 2011-04-22 CN CN201180031211.6A patent/CN102970862B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2011-04-22 BR BR112012027208A patent/BR112012027208A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2011-04-22 KR KR1020127030551A patent/KR101842726B1/ko active IP Right Grant
- 2011-04-22 EP EP18156446.9A patent/EP3366118A1/en not_active Withdrawn
- 2011-04-22 AU AU2011242582A patent/AU2011242582B2/en active Active
- 2011-04-22 CN CN201180031082.0A patent/CN102946716B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2011-04-22 CN CN201610187546.1A patent/CN105830932A/zh active Pending
- 2011-04-22 CA CA2796730A patent/CA2796730A1/en not_active Abandoned
- 2011-04-22 WO PCT/US2011/033618 patent/WO2011133892A1/en active Application Filing
- 2011-04-22 BR BR112012027140A patent/BR112012027140A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2011-04-22 RU RU2012149849/10A patent/RU2582249C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2011-04-22 NZ NZ603564A patent/NZ603564A/en not_active IP Right Cessation
- 2011-04-22 UA UAA201213336A patent/UA116081C2/uk unknown
- 2011-04-22 MA MA35381A patent/MA34240B1/fr unknown
- 2011-04-22 KR KR1020127030550A patent/KR101842725B1/ko active IP Right Grant
- 2011-04-22 MX MX2012012369A patent/MX2012012369A/es unknown
- 2011-04-22 EP EP11772789.1A patent/EP2560477B1/en not_active Not-in-force
- 2011-04-22 EP EP11772785.9A patent/EP2560475B1/en not_active Not-in-force
- 2011-04-22 JP JP2013506331A patent/JP5922098B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2011-04-22 EP EP11772786.7A patent/EP2560476B1/en not_active Not-in-force
- 2011-04-22 AU AU2011242490A patent/AU2011242490B2/en not_active Ceased
- 2011-04-22 JP JP2013506333A patent/JP5922099B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2011-04-22 WO PCT/US2011/033622 patent/WO2011133896A1/en active Application Filing
- 2011-04-22 JP JP2013506334A patent/JP5922100B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2011-04-22 US US13/643,048 patent/US20130180016A1/en not_active Abandoned
- 2011-04-22 US US13/643,047 patent/US20130167268A1/en not_active Abandoned
- 2011-04-22 WO PCT/US2011/033617 patent/WO2011133891A1/en active Application Filing
- 2011-04-22 EP EP11772790.9A patent/EP2560478B1/en not_active Not-in-force
- 2011-04-22 MA MA35384A patent/MA34242B1/fr unknown
- 2011-04-22 WO PCT/US2011/033621 patent/WO2011133895A1/en active Application Filing
- 2011-04-22 NZ NZ603561A patent/NZ603561A/en not_active IP Right Cessation
- 2011-04-22 MX MX2012012371A patent/MX2012012371A/es unknown
- 2011-04-22 MX MX2012012368A patent/MX2012012368A/es unknown
- 2011-04-22 CA CA2796758A patent/CA2796758A1/en not_active Abandoned
- 2011-04-22 NZ NZ603556A patent/NZ603556A/en not_active IP Right Cessation
- 2011-04-22 KR KR1020127030552A patent/KR101845097B1/ko active IP Right Grant
- 2011-04-22 BR BR112012027139A patent/BR112012027139A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2011-04-22 KR KR1020127030549A patent/KR101842724B1/ko active IP Right Grant
- 2011-04-22 BR BR112012027218A patent/BR112012027218A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2011-04-22 RU RU2012149847/10A patent/RU2591519C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2011-04-22 RU RU2012149846/10A patent/RU2582262C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2011-04-25 AR ARP110101416A patent/AR081334A1/es unknown
- 2011-04-25 AR ARP110101413A patent/AR081284A1/es unknown
- 2011-04-25 AR ARP110101414A patent/AR081136A1/es unknown
- 2011-04-25 AR ARP110101415A patent/AR081137A1/es unknown
-
2012
- 2012-10-21 IL IL222584A patent/IL222584A/en active IP Right Grant
- 2012-10-21 IL IL222582A patent/IL222582A/en active IP Right Grant
- 2012-10-21 IL IL222581A patent/IL222581A/en active IP Right Grant
- 2012-10-21 IL IL222583A patent/IL222583A/en active IP Right Grant
- 2012-10-23 CL CL2012002965A patent/CL2012002965A1/es unknown
- 2012-10-23 CL CL2012002962A patent/CL2012002962A1/es unknown
- 2012-10-23 CL CL2012002963A patent/CL2012002963A1/es unknown
- 2012-11-16 ZA ZA2012/08638A patent/ZA201208638B/en unknown
- 2012-11-16 ZA ZA2012/08640A patent/ZA201208640B/en unknown
- 2012-11-16 ZA ZA2012/08639A patent/ZA201208639B/en unknown
- 2012-11-23 CO CO12212404A patent/CO6592036A2/es not_active Application Discontinuation
- 2012-11-23 CO CO12212405A patent/CO6592014A2/es unknown
- 2012-11-23 CO CO12212391A patent/CO6592035A2/es not_active Application Discontinuation
- 2012-11-23 CO CO12212387A patent/CO6592013A2/es not_active Application Discontinuation
-
2019
- 2019-03-15 US US16/354,778 patent/US20190203224A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2210593C2 (ru) * | 1993-09-02 | 2003-08-20 | Новартис Аг | ФРАГМЕНТ ГИБРИДНОГО ТОКСИНА Bacillus thuringiensis, ОБЛАДАЮЩИЙ ИНСЕКТИЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, КОДИРУЮЩАЯ ЕГО РЕКОМБИНАНТНАЯ ДНК, СПОСОБ БОРЬБЫ С НАСЕКОМЫМИ |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
LI XQ et al., Resistance to root-knot nematode in tomato roots expressing a nematicidal Bacillus thuringiensis crystal protein, Plant Biotechnol J., 2007, vol.5, n.4, pp.455-464. BRAVO A. et al., How to cope with insect resistance to Bt toxins?, Trends in Biotechnology, 2008, Vol.26 No.10, pp.573-579;. ASLIHAN KURT, COLEOPTERA-SPECIFIC (CRY3Aa) DELTA-ENDOTOXIN BIOSYNTHESIS BY A LOCAL ISOLATE OF BT SUBSP. TENEBRIONIS, GENE CLONING AND CHARACTERIZATION, 2005, p.126. * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2582262C2 (ru) | КОМБИНАЦИИ, ВКЛЮЧАЮЩИЕ БЕЛКИ Cry34Ab/35Ab И Cry6Aa, ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ РАЗВИТИЯ УСТОЙЧИВОСТИ У КУКУРУЗНЫХ КОРНЕВЫХ ЖУКОВ (Diabrotica spp. ) | |
MX2012012370A (es) | Combinaciones que incluyen proteinas cry34ab/35ab y cry6aa para prevenir el desarrollo de resistencia en gusanos de la raiz de maiz (diabrotica spp.). |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190423 |