UA116081C2 - ТРАНСГЕННА РОСЛИНА КУКУРУДЗИ, ЯКА ПРОДУКУЄ БІЛКИ Cry34Ab1, Cry35Ab1 і Cry3Aa ДЛЯ ЗАПОБІГАННЯ РОЗВИТКУ СТІЙКОСТІ У КУКУРУДЗЯНОГО КОРЕНЕВОГО ЖУКА - Google Patents

ТРАНСГЕННА РОСЛИНА КУКУРУДЗИ, ЯКА ПРОДУКУЄ БІЛКИ Cry34Ab1, Cry35Ab1 і Cry3Aa ДЛЯ ЗАПОБІГАННЯ РОЗВИТКУ СТІЙКОСТІ У КУКУРУДЗЯНОГО КОРЕНЕВОГО ЖУКА Download PDF

Info

Publication number
UA116081C2
UA116081C2 UAA201213336A UAA201213336A UA116081C2 UA 116081 C2 UA116081 C2 UA 116081C2 UA A201213336 A UAA201213336 A UA A201213336A UA A201213336 A UAA201213336 A UA A201213336A UA 116081 C2 UA116081 C2 UA 116081C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
protein
plants
specified
reserve
transgenic corn
Prior art date
Application number
UAA201213336A
Other languages
English (en)
Inventor
Кеннет Е. Нарва
Томас Мід
Крістін Дж. Фенсіл
Хуажун Лі
Тімоті Д. Хей
Аарон Т. Вуслі
Моніка Брітт Олсон
Original Assignee
ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі filed Critical ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі
Publication of UA116081C2 publication Critical patent/UA116081C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G7/00—Botany in general
    • A01G7/06—Treatment of growing trees or plants, e.g. for preventing decay of wood, for tingeing flowers or wood, for prolonging the life of plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N37/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids
    • A01N37/18—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids containing the group —CO—N<, e.g. carboxylic acid amides or imides; Thio analogues thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/48—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • A01N43/50—1,3-Diazoles; Hydrogenated 1,3-diazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
    • A01N65/40—Liliopsida [monocotyledons]
    • A01N65/44—Poaceae or Gramineae [Grass family], e.g. bamboo, lemon grass or citronella grass
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B32—LAYERED PRODUCTS
    • B32B—LAYERED PRODUCTS, i.e. PRODUCTS BUILT-UP OF STRATA OF FLAT OR NON-FLAT, e.g. CELLULAR OR HONEYCOMB, FORM
    • B32B1/00—Layered products having a non-planar shape
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B65—CONVEYING; PACKING; STORING; HANDLING THIN OR FILAMENTARY MATERIAL
    • B65D—CONTAINERS FOR STORAGE OR TRANSPORT OF ARTICLES OR MATERIALS, e.g. BAGS, BARRELS, BOTTLES, BOXES, CANS, CARTONS, CRATES, DRUMS, JARS, TANKS, HOPPERS, FORWARDING CONTAINERS; ACCESSORIES, CLOSURES, OR FITTINGS THEREFOR; PACKAGING ELEMENTS; PACKAGES
    • B65D85/00—Containers, packaging elements or packages, specially adapted for particular articles or materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8251—Amino acid content, e.g. synthetic storage proteins, altering amino acid biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/04—Plant cells or tissues
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T428/00—Stock material or miscellaneous articles
    • Y10T428/13—Hollow or container type article [e.g., tube, vase, etc.]

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Ecology (AREA)
  • Forests & Forestry (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

Винахід належить до трансгенної рослини, яка продукує білок Cry34Ab1, білок Cry35Ab1 і інсектицидний білок Cry3Aa, де зазначені білки Cry34Ab1, Cry35Ab1 і Cry3Aa мають різні сайти зв'язування рецепторів в кишечнику кукурудзяного кореневого жука. Комбінації білків Cry34Ab1, Cry35Ab1 і Cry3Aa можуть використовуватися для запобігання розвитку стійкості (до будь-якої системи інсектицидного білка окремо) у популяції кукурудзяного кореневого жука (Diabrotica spp.).

Description

(57) Реферат:
Винахід належить до трансгенної рослини, яка продукує білок Сту34АБІ, білок СтузЗ5АБІ і інсектицидний білок СтузАа, де зазначені білки СтуЗ4АБІ, Стуз5АБІ і СтгузАа мають різні сайти зв'язування рецепторів в кишечнику кукурудзяного кореневого жука. Комбінації білків Стуз4АБІ,
СтгузБАБІ1 ії СтузАа можуть використовуватися для запобігання розвитку стійкості (до будь-якої системи інсектицидного білка окремо) у популяції кукурудзяного кореневого жука (Піабгоїса 5рр.). се В м вовк пок ЩО 4 ж . : с | х лю СВуУВАВНОУМА с. й 0395 160 32 10 35 300 320 1000
Конкурент (НІМІ
ФК
Опис
Передумови створення винаходу
Люди вирощують кукурудзу для застосування в їжу і як джерела енергії. Кукурудза являє собою важливу сільськогосподарську культуру. Вона є важливим джерелом їжі, харчових продуктів і корму для тварин у багатьох регіонах світу. Комахи поїдають і ушкоджують рослини і, таким чином, підривають ці зусилля людей. Щорічно мільярди доларів витрачаються для боротьби з комахами-шкідниками, і ще мільярди втрачаються внаслідок заподіюваного ними збитку.
Шкода, заподіювана комахами-шкідниками, є основним фактором втрати врожаю кукурудзи в усьому світі, незважаючи на використання захисних заходів, таких як хімічні пестициди. У зв'язку з цим, у сільськогосподарські культури, такі як кукурудза, методами генної інженерії були введені гени стійкості до комах для боротьби зі збитком, заподіюваним комахами, і для зниження потреби в традиційних хімічних пестицидах.
Щорічно, більше 10 мільйонів акрів (більше 4050000 га) кукурудзяних полів у США заражаються комплексом видів кукурудзяного кореневого жука. Комплекс видів кукурудзяного кореневого жука включає північного кукурудзяного кореневого жука (Оіаргоїїса бБагтегі), південного кукурудзяного кореневого жука (0. ипаесітрипсіаїФа Ппоугагаї) і західного кукурудзяного кореневого жука (0. мігдіїега мігуіїтега) (інші види включають Оіабгоїїса мігдітега 7еае (Мексиканський кукурудзяний кореневий жук), ОЮіабгоїїса бБайеайа (Бразильський кукурудзяний кореневий жук) і комплекс Бразильського кукурудзяного кореневого жука (Оіабгоїіса мігідиа і Оіабгоїїса зресіоза)).
Личинки цих видів Оіабгоїїса, що живуть у грунті, харчуються коренями рослин кукурудзи, викликаючи вилягання. Вилягання, у кінцевому рахунку, знижує врожайність і часто приводить до загибелі рослини. Поїдаючи маточкові стовпчики кукурудзи, дорослі жуки зменшують запилення і, тому, згубно впливають на врожай зерна кукурудзяної рослини. Крім того, дорослі особини і личинки роду Оіабгоїїса атакують гарбузові культури (огірки, дині, гарбузи і т. д.) і багато овочевих і польових культур у промисловому рослинництві, а також культури, що вирощуються в городах на присадибних ділянках.
Синтетичні органічні хімічні інсектициди були першочерговими інструментами, використовуваними для боротьби з комахами-шкідниками, але біологічні інсектициди, такі як інсектицидні білки, одержані з Васійи5 (Пигіпдіепвіз (В.І), відігравали важливу роль у деяких регіонах. Можливість одержання стійких до комах рослин за допомогою трансформації генами інсектицидного білка В.ї. радикально змінила сучасне сільське господарство і підвищила значення і цінність інсектицидних білків і їх генів.
Інсектицидні кристалічні білки з деяких штамів Васійи5 (пигіпдіепвів (В) добре відомі в даній галузі техніки. Див., наприклад, Нопйе еї аї. Місгобіа! Кеміему5, Мої. 53, Мо 2, рр. 242-255 (1989). Ці білки звичайно продукуються бактеріями у вигляді протоксинів з молекулярною масою приблизно 130 кДа, які потім розщеплюються протеазами в середній кишці комах після потрапляння в травну систему комахи для продукції корового токсину з молекулярною масою приблизно 60 кДа. Ці білки відомі як кристалічні білки, тому що в деяких штамах ВІ. можуть спостерігатися виразні кристалічні включення зі спорами. Ці кристалічні включення часто складені з декількох різних білків.
Однією групою генів, що були використані для одержання трансгенних, стійких до комах культур, є дельта-ендотоксини з Васійи5 ІПигіпудіеп5і5 (84). Дельта-ендотоксини були успішно експресовані в таких сільськогосподарських культурах як бавовна, картопля, рис, соняшник, а також кукурудза, і, як виявилося, забезпечують чудовий контроль над комахами-шкідниками (Репак Р.У еї аї. (1990), Віо/Тесппоіоду 8, 939-943; Репак Р... єї аї. (1993), Ріапі Мої. Віої. 22:313- 321; Еціітоїо Н. еї а. (1993), Віо/Тесппоіоду, 11:1151-1155; Ти еї а. (2000), Маїшге Віоїтесппоіоду, 18:1101-1104; РСТ публікація заявки на Міжнародний патент УМО 01/13731; і Віпу 9. МУ. еї аї. (2000), Енісасу ої Сту ІЄ Тгтапздепіс Маї2е, 14" Віеппіа! Іпіегпаййопа! Ріапі Везівіапсе 0 Іпзесів
Мої кзПпор, Рог Соїйп5, Со1о.).
Декілька білків В.І. були використані для створення стійких до комах трансгенних рослин, що були успішно зареєстровані і в даний час запущені в серійне виробництво. Вони включають
СтутАБ, СтутАс, СтуїР, СтуЗАа і СтуЗВЬ у кукурудзі, Сту1Ас і Сгу2АБ у бавовні і СгуЗА у картоплі.
Мається також 5МАКТ 5ТАХ у кукурудзі, що містить СгтутА.105 і Сту2АБ.
Продукти, що випускаються в промисловому масштабі, експресуючі ці білки, експресують один білок, за винятком випадків, де бажаний комбінований інсектицидний спектр із 2 білків (наприклад, СтутАБ і СтузЗВЬ у кукурудзі, комбіновані для забезпечення стійкості відповідно до лускокрилих шкідників і блішки довговусої), або де незалежна дія білків робить їх корисними як бо інструмент для затримки розвитку стійкості у популяцій сприйнятливих комах (наприклад,
СтутлАс і Сту2АБ у бавовні, комбіновані для забезпечення керування стійкістю відносно тютюнової совки).
Деякі з якостей стійких до комах трансгенних рослин, що привели до швидкого і широко розповсюдженого прийняття цієї технології, також викликають занепокоєність, що у популяцій шкідників розів'ється стійкість до інсектицидних білків, продукованих цими рослинами. Було запропоновано декілька стратегій для збереження корисності ознак стійкості до комах на основі
ВІ, що включають розміщення білків у високій дозі в комбінації з резерватом, чергування з різними токсинами або спільне розміщення з ними (МсеСацопеу еї аї. (1998), "Ві. Кезілтапсе
Мападетепі", Мате Віоїтесппої. 16:144-146).
Білки, вибрані для використання в пакеті Керування стійкості до комах (ІКМ), повинні бути активними для того, щоб стійкість, що розвилася до одного білка, не надавала стійкості до другого білка (тобто перехресна стійкість до білків відсутня). Якщо, наприклад, популяція шкідників, вибрана для стійкості до "білка А", чутлива до "білка В", то можна зробити висновок, що немає перехресної стійкості і що комбінація білка А і білка В буде ефективною в затримці стійкості до одного білка А.
За відсутності стійких до комах популяцій, оцінки можуть здійснюватися на основі інших характеристик, що вважаються пов'язаними з потенціалом перехресної стійкості. При ідентифікації інсектицидних білків з імовірністю відсутності прояву перехресної стійкості було запропоноване використання рецепторно-опосередкованого зв'язування (мап Мейает еї аї. 1999). Ключовим прогностичним показником відсутності перехресної стійкості, властивим цьому підходу, є те, що інсектицидні білки не конкурують за рецептори у чутливого виду комах.
У випадку, коли токсини В.І. конкурують за один і той же рецептор, то, якщо цей рецептор мутує у цій комасі, так що один з токсинів більше не зв'язується з цим рецептором і, таким чином, більше не є інсектицидним проти комахи, то в цьому випадку комаха буде також стійкою до другого токсину (який конкурентно зв'язаний з тим же рецептором). Тобто, комаха вважається перехресно стійкою до обох токсинів Ві. Однак, якщо два токсини зв'язуються з двома різними рецепторами, то це може бути показником того, що комаха не буде одночасно стійкою до цих двох токсинів.
Відносно більш нова система інсектицидного білка була виявлена в Васійи5 ІПигіпдієпвів, як описано в міжнародному патенті УМО 97/40162. Ця система містить два білки - один масою приблизно 15 кДа і інший масою приблизно 45 кДа. Див. також патенти США 6083499 і 6127180.
Тепер ці білки були віднесені до їх власного класу і, відповідно, одержали позначення Сгу, відповідно Стгуз4 і Сгуз5. Див. Стісктоге еї а. сайт Інтернету (ріоі5.5изх.ас.икК/поте/Меї! СтісКтоге/Ві/). На даний час виявлені багато інших споріднених білків цього типу системи. Див., наприклад, патент США 6372480; міжнародні патенти МО 01/14417 ї МО 00/66742. Були також описані оптимізовані для рослин гени, що кодують такі білки, де гени створені методами генної інженерії для використання кодонів для оптимізованої експресії у рослин. Див. наприклад патент США 6218188.
Точний тип дії системи Сту34/35 ще має бути визначений, але вважають, що вона утворює пори в мембранах клітин кишечнику комах. Див. МоейПепбеск еї аї. Маїиге Віотесппоїіоду, мої. 19, р. 668 (Ошу 2001); Мав5оп еї аї. Віоспетівігу, 43 (12349-12357) (2004). Точний механізм дії залишається неясним, незважаючи на тривимірні атомарні координати і структури кристалів, відомі для білка Сгу34 і Сту35. Див. патенти США 7524810 і 7309785. Наприклад, неясно, один чи обидва з цих білків зв'язуються з конкретним видом рецептора, таким як лужна фосфатаза або амінопептидаза. Крім того, через те, що існують різні механізми, за допомогою яких у комахи може розвитися стійкість до білка Сгу (такі як зміна глікозилуванням рецептора (див.
Уигаї-Ецепієз сеї аї. (2002) 68 АЕМ 5711-5717), видалення рецепторного білка |див. І еє еї аї. (1995) 61 АЕМ 3836-3842, мутування рецептора або іншими механізмами (див. Нескеї еї аї...
Іпу. Раїйої. 95 (2007) 192-197)), було неможливо свідомо прогнозувати, чи буде існувати перехресна стійкість між Сгу34/35 і іншими білками Сгу. Прогнозування конкурентного зв'язування для системи СтгуЗ34/35 також додатково ускладнюється тим, що два білки залучені в бінарну систему Сгу34/35. Крім того, неясно, чи зв'язуються і наскільки ефективно зв'язуються ці білки з кишечником/клітинами кишечнику, і чи взаємодіють вони і як взаємодіють або зв'язуються один з одним.
Інші варіанти для боротьби з твердокрилими комахами включають токсини СтуЗВЬ, Стузс,
СтубВ, ЕТ29, ЕТЗ33З з ЕТЗ4, ТІС407, ТІС435, ТІСА17, ТІС9О1, ТІС1201, ЕТ29 з ТІС810, ЕТ70, ЕТ76 з ЕТ80, ТІС851 і інші. Були також запропоновані підходи РНКІі (інтерференція РНК). Див. наприклад, Ват еї аІ. Майиге ВіосїесппоїІоду, мої. 25, Мо 11 (Мом. 2007), рр. 1322-1326.
Короткий опис сутності винаходу
Даний винахід стосується частково СтуЗ4АБ/З35АБ у комбінації з СтгузАа. Даний винахід стосується частково відкриття, що СтуЗз4Ар/Стуз5АБ і СтузАа можуть використовуватися для запобігання розвитку стійкості (до будь-якої системи інсектицидного білка окремо) у популяції кукурудзяного кореневого жука (Оіаргоїїса 5рр.). Як буде зрозуміло фахівцю в даній галузі після ознайомлення з переважними аспектами розкритого в даному описі винаходу, рослини, продукуючі ці інсектицидні білки Сгу, можуть використовуватися для зниження побоювань того, що може розвитися популяція кукурудзяного кореневого жука, яка може бути стійкою до будь- якої з цих систем інсектицидного білка окремо.
Даний винахід частково підтверджується виявленням того, що компоненти цих систем білка
Сту не конкурують один з одним за зв'язування з рецепторами кишечнику кукурудзяного кореневого жука.
Даний винахід також частково стосується потрійних пакетів або "пірамід" із трьох (або більше) систем токсинів, з Стуз4АБ/Стуз5АБ і СтузАа, що є парою основ. Таким чином, рослини (і посівна площа, засаджена такими рослинами), які продукують дві системи інсектицидних білків, включені в обсяг даного винаходу.
Короткий опис фігур
Докладний опис фігур, зокрема, стосується супровідних фігур, на яких:
Фіг. 1. Зв'язування '22І-СгуЗзБАБІ (А) і 7125І-СтузАа (В) як функція внесених мічених радіоактивним ізотопом Стгу-токсинів у ВВММ (мембранних пузирчиках щіткової облямівки), одержаних з личинок західних кукурудзяних кореневих жуків. Специфічне зв'язування-загальне зв'язування-неспецифічне зв'язування, помилка "вуса"-5ЕМ (стандартна помилка середньої).
Експерименти зв'язування продемонстрували, що і 125І1-Стуз5АБІ, і 125І-СтгузАа були здатні специфічно зв'язуватися з ВВММ (фіг. ТА і 18). 125І-СтгуЗзБ5БАБІ і 125|-СтузАа мали афінітет зв'язування Ка-2,315-41,26, 24,0-59,7 (НМ), відповідно, і концентрацію сайтів зв'язування
Втах-31,6926,38, 146,32539,9 (пкмоль/мкг ВВММУ), відповідно.
Фіг. 2. Зв'язування "22І-СгузАа з ВВМУ, одержаними з личинок західного кукурудзяного кореневого жука в різних концентраціях неміченого конкурента. "Вуса" для гомологічного конкурентного зв'язування представляють стандартне відхилення, а "вуса" для гетерологічної конкуренції не показані.
Зо Експериментальні результати продемонстрували, що СтуЗАа здатний повністю зміститися, коли молярна концентрація збільшувалася до 500 нМ (100-кратний надлишок 722І-СтгуЗАа) (фіг. 2). Однак Стуз5БАБІ окремо або суміш СтгузБАБр1жСтуЗз4АБІ (1:3) були нездатні змістити 1251-
СтгузАа. Ці дані вказують на те, що СтгтузБАБІ окремо або СтузБАБІнСтуз4АрІ (1:3) не розділяють рецептор з Стузда.
Короткий опис послідовностей
ЗЕО ІЮ МО:1: повна послідовність нативного білка СтузЗдАа;
ЗЕО ІЮ МО:2: послідовність усіченого трипсином корового білка СтузЗдАа;
ЗЕО ІЮ МО:3: повна послідовність нативного білка Стгуз4АбБІ1;
ЗЕО ІЮ МО:4: повна послідовність нативного білка Сгуз5АБІ1;
ЗЕО ІЮ МО:5 послідовність усіченого хімотрипсином корового білка СтузБАбБІ1;
ЗЕО Ір МО:6: ДНК Стуза АБ;
ЗЕО ІЮ МО:7: ДНК Стуз5БАБ;
ЗЕО ІЮ МО:8: ДНК СтузлАа.
Докладний опис
Послідовності білка СтгуЗз4АБ/З3БАБ можуть бути одержані, наприклад, з ізоляту ВасшШив
ІШигіпдіепоізї РОІ149В1. Інші гени, білкові послідовності і ізоляти-джерела для використання відповідно до даного винаходу описані, наприклад, СтгісКтоге еї а). на сайті Інтернету (Іезсі.виззех.ас.ик/поте/Меї! Стісктоге /Ві/іпіго. літі).
Даний винахід включає використання інсектицидних білків СтуЗз4АБ/35АБ у комбінації з токсином СтузАа для захисту кукурудзи від ушкодження і втрати врожайності, викликаних поїданням популяціями кукурудзяних кореневих жуків, у яких може розвитися стійкість до будь- якого із системи білків Сту окремо (без іншого).
Таким чином, у даному винаході мова йде про пакет Керування стійкості комах (КМ) для запобігання розвитку у кукурудзяного кореневого жука стійкості до СтузЗАа і/або СтуЗз4АБ/З5АБ.
Даний винахід стосується композицій для боротьби зі шкідниками-кореневими жуками, які містять клітини, що продукують білок токсину СтгузЗдАа і систему токсину Стуз4Абр/З5АБ.
Винахід додатково включає хазяїна, трансформованого для продукції і білка Сгузда, і бінарного токсину СтгуЗз4АБ/З5АБ, де зазначений хазяїн являє собою мікроорганізм або рослинну клітину.
Додатково передбачається, що винахід стосується способу боротьби зі шкідниками- кореневими жуками, який включає приведення в контакт зазначених шкідників або середовища мешкання зазначених шкідників з ефективною кількістю композиції, що містить білок СтузЗАа і додатково містить бінарний токсин Стгуз4АБ/З5АБ.
Варіант здійснення винаходу включає маїс, що містить експресований рослиною ген, який кодує бінарний токсин СтуЗ4АБ/З5АБ, і експресований рослиною ген, який кодує білок Стузда, і насіння такої рослини.
Додатковий варіант здійснення винаходу включає маїс, де експресований рослиною ген, який кодує бінарний токсин СтуЗ4АБ/З5АБ, і експресований рослиною ген, який кодує білок
СтузлАа, були інтрогресовані в зазначений маїс, і насіння такої рослини.
Як описано в розділі "Приклади", дослідження конкурентного зв'язування з рецепторами з використанням міченого радіоактивним ізотопом корового токсинного білка Стгуз5АБ показують, що коровий токсинний білок СтгузАа не конкурує за зв'язування в зразках тканини комах СКЕУУ (кукурудзяних кореневих жуків), з якими зв'язується Стуз5АБ. Див. Фіг. 2. Ці результати вказують на те, що комбінація білків СтузАа і СтуЗз4АБ/35Ар являє собою ефективний засіб для зменшення розвитку стійкості у популяцій СКМУМ до будь-якої білкової системи окремо.
Таким чином, частково на основі даних, описаних вище і в інших місцях даного опису, білки
СтуЗз4АБ/З35АБ і СтузАа можуть використовуватися для одержання комбінацій ІКМ для запобігання і зменшення розвитку стійкості у СЕМУ. Можуть бути додані інші білки до цієї комбінації, наприклад, для розширення спектра боротьби з комахами. Пара/комбінація, що розглядається, може також використовуватися в деяких переважних "потрійних пакетах" або "піраміді" у комбінації з ще одним білком для боротьби з кореневими жуками, таким як СгуЗВа і/або СтубАа. РНКІ проти кореневих жуків являє собою ще один варіант. Див., наприклад, Вайт еї аІ. Маїшге ВіотесппоїЇоду, мої. 25, Мо 11 (Мом. 2007), рр. 1322-1326. Крім того, у світлі даних і представлених у даному описі положень, можна замінити СтуЗАа білком СгуЗВа і/або СтгубАа, що проілюстровано в даному описі у вигляді спарювання комбінації основ з СтуЗз4А/35А. Таким чином, розглянуті комбінації забезпечують множинні типи дії проти кореневого жука.
Варіанти здійснення даного винаходу включають використання білків СгузАа і СтузаАр/35АБ у місцях вирощування кукурудзи, де Юіаргоїїса 5рр. є проблематичними. Іншим варіантом
Зо здійснення може бути використання одного або обох з білків СтузЗАа і СтузААБ/З5АБ у комбінації з іншими ознаками.
У світлі опису заявки БОМ 61/388273 (поданої 30 вересня, 2010 р.), що стосується комбінацій СтуЗз4АБ/З35АБ і СтубАа, заявки О55М 61/476005 (поданої 15 квітня, 2011 р.), що стосується комбінації білків Стуз4АБ/З5АБ і СтузЗВа, і заявки ОЗ5М 61/477447 (поданої 20 квітня, 2011 ру), що стосується комбінацій білків СтуЗАа і Сгубла, деякі переважні "потрійні пакети" або "множинні типи пакетів дії" даного винаходу включають білок СгуЗАа у комбінації з білками
Стуз4АБ/З5АБ, разом з білком СтубАа і/або білком СгуЗзВа. Трансгенні рослини, включаючи кукурудзу, що містять ген СтуЗВа, гени СтуЗз4АБ/З5АБ і третю або четверту систему токсинів (наприклад, ген(и) СтузАа і/або СтгубАа), включені в обсяг даного винаходу. Таким чином, такі варіанти здійснення націлені на комаху щонайменше трьома типами дії.
Фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що токсини В.ї., навіть у межах визначеного класу, такого як СтуЗАа і СтузА АБ/З5АБ, можуть до деякої міри варіювати.
Гени і токсини. Термін "ізольований" стосується полінуклеотиду в конструкті, що не зустрічається в природних умовах, або білка в очищеному стані або в стані, що іншим чином не зустрічається в природних умовах. Гени і токсини, використовувані відповідно до даного винаходу, включають не тільки повні описані послідовності, але також фрагменти цих послідовностей, варіанти, мутанти і злиті білки, що зберігають характерну пестицидну активність токсинів, конкретно проілюстрованих у даному описі. Використовувані в даному описі терміни "варіанти" або "зміни" генів стосуються нуклеотидних послідовностей, які кодують ті ж токсини, або які кодують еквівалентні токсини, які мають пестицидну активність.
Використовуваний у даному описі термін "еквівалентні токсини" стосується токсинів, що мають таку ж або по суті таку ж біологічну активність проти шкідників-мішеней, як заявлені токсини.
Домени/субдомени цих білків можуть бути переставлені для одержання химерних білків. Див. наприклад, патенти США 7309785 і 7524810. У патенті "785 мова також йде про усічені білки
Стгуз35. Усічені токсини також ілюструються в даному описі.
Використовуваний у даному описі термін "границі" представляє приблизно 95 95 (СтузЗАа і
Стуз4АЬ і СтузбБАБ), 78 95 (СтуЗА і СтуЗ4А і СтгуЗз5) і 45 95 (СтуЗ і Сгу34 і Стгуз35) ідентичність послідовностей відповідно до "Кемізіоп ої Мотепсіатге тог Васійи5 (пигіпдіепвів Резіїсіда! Стувіа!
Ргоїєїпє" (Перегляд номенклатури пестицидних кристалічних білків Васійи5 ІПигіпдіепвів) М. бо СтісКтоге, О.А. 7еїідіег, у. Рейеїбоп, Е. ЗсНпері, У. Мап Віє, 0. І егесіи5, У. Вайт, О.Н. Оевап.
Містобіоїюду апа Моїіесшаг Віоїоду Немієме (1998), Мої! 62:807-813. Те ж стосується Стуб при використанні в потрійних пакетах, наприклад, відповідно до даного винаходу.
Для фахівця в даній галузі повинно бути очевидно, що гени, які кодують активні токсини, можуть бути ідентифіковані й одержані декількома способами. Визначені гени або частини генів, проілюстровані в даному описі, можуть бути одержані з ізолятів, депонованих у депозитарії культур. Ці гени або їх частини або варіанти також можуть бути сконструйовані синтетично, наприклад, шляхом використання генного синтезатора. Варіанти генів можуть бути легко сконструйовані з використанням стандартних технологій одержання точкових мутацій. Також, фрагменти цих генів можуть бути одержані з використанням комерційно доступних екзонуклеаз або ендонуклеаз, згідно зі стандартними методиками. Наприклад, ферменти, такі як ВаІ31, або сайт-направлений мутагенез можуть використовуватися для систематичного відсічення нуклеотидів від кінців цих генів. Гени, які кодують активні фрагменти, можуть також бути одержані з використанням різноманітних рестрикційних ферментів. Протеази можуть використовуватися для безпосереднього одержання активних фрагментів цих білкових токсинів.
Фрагменти й еквіваленти, що зберігають пестицидну активність проілюстрованих токсинів, входять в обсяг даного винаходу. Також, через надмірність генетичного коду, різноманітність різних послідовностей ДНК може кодувати амінокислотні послідовності, розкриті в даному описі.
Фахівець у даній галузі цілюоюом може створити альтернативні послідовності ДНК, які кодують однакові або по суті однакові токсини. Такі варіантні послідовності ДНК входять в обсяг даного винаходу. Використовуване в даному описі посилання на "по суті однакову" послідовність стосується послідовностей, що мають амінокислотні заміщення, делеції, додавання або вставки, які суттєво не впливають на пестицидну активність. Фрагменти генів, які кодують білки, що зберігають пестицидну активність, також включені в це визначення. Фрагменти генів, які кодують білки, що зберігають пестицидну активність, також включені в це визначення.
Додатковий спосіб ідентифікації генів, які кодують токсини, і частин генів, використовуваних відповідно до даного винаходу, здійснюється шляхом використання олігонуклеотидних зондів.
Ці зонди являють собою детектовані нуклеотидні послідовності. Ці послідовності можуть бути детектовані за допомогою відповідної мітки або можуть бути одержані ендогенно флуоресцентними, як описано в Міжнародній патентній заявці Мо МУМО 93/16094. Як добре відомо
Зо в даній галузі, якщо молекула зонда і зразок нуклеїнової кислоти гібридизуються з утворенням міцного зв'язку між двома молекулами, то можна резонно припустити, що зонд і зразок мають суттєву гомологію. Переважно, гібридизацію проводять у жорстких умовах методиками, добре відомими в даній галузі, як описано, наприклад, у публікації КеїПег .Н., Мапак М.М. (1987), ОМА
Ргобез, БіосКіоп Ргеб5, Мем мок, М.У., рр. 169-170. Деякі приклади сольових концентрацій і температурних комбінацій наступні (у порядку збільшення жорсткості умов): 2Х З5РЕ (0,18М масі, 10 мм МанНРОо», 1 мМ ЕОТА, рН 7,0) або 55Х (15 мМ цитрату натрію, 150 мМ хлориду натрію, рН 7,0) при 422С; 01Х З5РЕ або 55С при 422С; 01хХ 55РЕ або 55С при 6520.
Виявлення зонда забезпечує засіб для визначення відомим чином, чи відбулася гібридизація.
Такий зондовий аналіз забезпечує швидкий спосіб ідентифікації генів даного винаходу, які кодують токсин. Нуклеотидні сегменти, використовувані як зонди відповідно до винаходу, можуть синтезуватися з використанням синтезатора ДНК і стандартних методик. Ці нуклеотидні послідовності можуть також використовуватися як затравки ПЛР для ампліфікації генів за даним винаходом.
Варіантні токсини. У даному описі були спеціально проілюстровані визначені токсини за даним винаходом. Оскільки ці токсини просто ілюструють токсини за даним винаходом, то повинно бути цілком очевидно, що даний винахід включає варіантні або еквівалентні токсини (і нуклеотидні послідовності, що кодують еквівалентні токсини), які мають таку ж або подібну пестицидну активність, як ілюстрований токсин. Еквівалентні токсини мають гомологію амінокислот з ілюстрованим токсином. Ця амінокислотна ідентичність звичайно складає більше ніж 75 95 або переважно більше ніж 85 95, переважно більше ніж 90 95, переважно більше ніж 95 95, переважно більше ніж 96 95, переважно більше ніж 97 95, переважно більше ніж 98 95 або в деяких варіантах здійснення переважно більше ніж 9995. Амінокислотна ідентичність звичайно найвища в критичних областях токсину, що відповідають за біологічну активність або беруть участь у визначенні тривимірної конфігурації, яка, у кінцевому рахунку, відповідальна за біологічну активність. У цьому відношенні, прийнятні і можуть очікуватися деякі амінокислотні заміщення, якщо ці заміщення відбуваються в областях, що не мають вирішального значення для активності або являють собою консервативні амінокислотні заміщення, що не впливають на тривимірну конфігурацію молекули. Наприклад, амінокислоти можуть бути розміщені в наступні класи: неполярні, незаряджені полярні, основні і кислотні. Консервативні заміщення, за 60 допомогою яких амінокислота одного класу заміщається іншою амінокислотою того ж типу,
входять в обсяг даного винаходу, поки заміщення суттєво не змінює біологічну активність сполуки. У таблиці 1 представлений список прикладів амінокислот, що належать до кожного класу.
Таблиця 1 й Аа, Маї, І еи, Пе, Рго Меї, полярні Азп, Сп
У деяких випадках, можуть також здійснюватися неконсервативні заміщення. Вирішальним фактором є те, що ці заміщення не повинні значно знижувати біологічну активність токсину.
Рекомбінантні хазяїни. Гени, які кодують токсини даного винаходу, можуть вводитися в широку різноманітність мікробних або рослинних хазяїнів. Експресія гена токсину приводить, прямо або побічно, до внутрішньоклітинної продукції і підтримання пестициду. Кон'югальне перенесення і рекомбінантне перенесення можуть використовуватися для створення штаму В.ї., що експресує обидва токсини даного винаходу. Інші організми хазяїнів можуть також трансформуватися одним або більше генами токсину, використовуваними потім для надання синергічного ефекту. З придатними мікробними хазяїнами, наприклад Рхейдотопав, мікроби можуть наноситися на місцезнаходження шкідників, де вони проліферують і споживаються.
Результатом є контроль над шкідником. Альтернативно, мікроб, що несе ген токсину, може піддаватися обробці в умовах, що продовжують активність токсину і стабілізують клітину.
Оброблена клітина, що зберігає токсичну активність, потім може вноситися в середовище мешкання шкідника-мішені. В обсяг даного винаходу включені нерегенеровані/нетотипотентні рослинні клітини з рослини за даним винаходом (що містять щонайменше один з розглянутих генів ІКМ).
Трансформація рослини. Переважним варіантом здійснення даного винаходу є трансформація рослин генами, що кодують розглянутий інсектицидний білок або його варіанти.
Трансформовані рослини стійкі до атаки цільовою комахою-шкідником за рахунок присутності контролюючих кількостей розглянутого інсектицидного білка або його варіантів у клітинах трансформованої рослини. При включенні генетичного матеріалу, що кодує інсектицидні властивості інсектицидних токсинів В.ї., у геном рослини, споживаної в їжу визначеною комахою-шкідником, дорослі особини або личинки загинуть після вживання в їжу рослини. Були трансформовані численні члени односім'ядольних і дводольних класифікацій. Трансгенні
Зо агрономічні культури, а також фрукти й овочі становлять промисловий інтерес. Такі культури включають, але без обмеження, маїс, рис, сою, канолу, соняшник, люцерну, сорго, пшеницю, бавовну, арахіс, томати, картоплю і подібні. Існує декілька технологій введення стороннього генетичного матеріалу в клітини рослин і для одержання рослин, що стабільно підтримують і експресують введений ген. Такі технології включають акселерацію генетичного матеріалу, нанесеного на мікрочастинки, безпосередньо в клітини (патент США 4945050 і патент США 5141131). Рослини можуть бути трансформовані з використанням технології Адгорасієгішт, див. патент США 5177010, патент США 5104310, заявку на Європейський патент 0131624В81, заявку на Європейський патент 120516, заявку на Європейський патент Мо 15941881, заявку на
Європейський патент Мо 176112, патент США 5149645, патент США 5469976, патент США 5464763, патент США 4940838, патент США 4693976, заявку на Європейський патент Мо 116718, заявку на Європейський патент Мо 290799, заявку на Європейський патент Мо 320500, заявку на Європейський патент Мо 604662, заявку на Європейський патент Мо 627752, заявку на
Європейський патент Мо 0267159, заявку на Європейський патент Мо 0292435, патент США 5231019, патент США 5463174, патент США 4762785, патент США 5004863 і патент США 5159135. Інша технологія трансформації включає технологію МУНІЗКЕКЗ "М, див. патент США 5302523 і патент США 5464765. Технологія електропорації також використовувалася для трансформації рослин, див. Міжнародний патент М/О 87/06614, патент США 5472869, патент
США 5384253, Міжнародний патент МУЛО 9209696 і Міжнародний патент УУО 9321335. Усі ці патенти і публікації, що стосуються трансформації, включені в даний опис за допомогою посилання. На доповнення до численних технологій трансформації рослин, тип тканини, що контактує зі сторонніми генами, також може змінюватися. Така тканина включає, але не обмежується ними, ембріональну тканину, І і ЇЇ типи калюсної тканини, гіпокотиль, меристему і подібні. Майже всі рослинні тканини можуть бути трансформовані під час дедиференціювання з використанням відповідних технологій у межах кваліфікації фахівця в даній галузі.
Гени, які кодують будь-який з розглянутих токсинів, можуть бути вставлені в клітини рослини з використанням різноманітних технологій, що добре відомі в даній галузі, як описано вище.
Наприклад, доступне велике число векторів клонування, що містять маркер, який забезпечує можливість відбору трансформованих мікробних клітин, і реплікаційна система, функціональна в ЕзсПегіснпіа соїї, для одержання і модифікації сторонніх генів для вставки у вищі рослини. Такі маніпуляції можуть включати, наприклад, введення мутацій, усічень, додавань або заміщень, як бажано для передбачуваного використання. Вектори включають, наприклад, рВК322, групу рис, групу М1Зтр, рАСУСт184 і т. д. Відповідно, послідовність, що кодує білок Сгу або варіанти, може бути вставлена у вектор у придатний сайт рестрикції. Одержана плазміда використовується для трансформації клітин Е. соїї, які культивують у придатному живильному середовищі, потім збирають і лізують для того, щоб була витягнута придатна для обробки кількість плазміди. Аналіз послідовності, аналіз фрагментів рестрикції, електрофорез і інші біохімічні-молекулярно-біологічні способи, як правило, здійснюють як способи аналізу. Після кожної маніпуляції, використовувана послідовність ДНК може бути розщеплена і з'єднана з наступною послідовністю ДНК. Кожна піддана маніпулюванню послідовність ДНК може бути клонована в ту ж або іншу плазміду.
Використання векторів, що містять Т-ДНК, для трансформації клітин рослин інтенсивно досліджувалося і достатньо описане в Європейському патенті ЕР 120516; публікаціях І ее і
Семіп (2008), ЕгаіІєу еї а. (1986), і Ап еї аї. (1985), і достатньо загальноприйняте в даній галузі.
Як тільки вставлена ДНК інтегрується в геном рослини, вона стає відносно стійкою у всіх наступних поколіннях. Вектор, використовуваний для трансформації клітини рослини, звичайно містить вибраний маркерний ген, який кодує білок, що надає трансформованим клітинам рослин стійкість до гербіциду або антибіотика, такого як, поряд з іншими, біалафос, канаміцин, 418, блеоміцин або гігроміцин. Відповідно, окремо використовуваний вибраний маркерний ген повинен забезпечити можливість вибору трансформованих клітин, у той час як ріст клітин, що не містять вставлену ДНК, пригнічується селекційною сполукою.
Зо Доступне велике число способів вставлення ДНК у клітину рослини-хазяїна. Ці способи включають трансформацію Т-ОМА, доставлену Адгобасіегішт шптеїасіеп5 або Адгобасіегійт гпідодепе5 як агентом трансформації. Додатково, може бути використане злиття протопластів рослини з ліпосомами, що містять підлягаючу доставці ДНК, пряма ін'єкція ДНК, трансформація біологічною балістикою (бомбардуванням мікрочастинками) або електропорація, а також інші можливі способи.
У переважному варіанті здійснення даного винаходу рослини будуть трансформуватися генами, де використання кодону області, що кодує білок, було оптимізоване для рослин. Див., наприклад, патент США 5380831, що включений у даний опис за допомогою посилання. Також, переважно будуть використовуватися рослини, що кодують усічений токсин. Усічений токсин звичайно кодує приблизно від 5595 до приблизно 80 95 токсину повної довжини. Способи створення синтетичних генів В.ї. для використання в рослинах відомі в даній галузі ((емагі, 2007).
Незалежно від методики трансформації, ген переважно включають у вектор перенесення гена, адаптований для експресування генів інсектицидного токсину В.ї., ії варіанти в рослинній клітині включенням у вектор рослинного промотору. На доповнення до рослинних промоторів, у рослинних клітинах для експресування чужорідних генів можуть ефективно використовуватися промотори з різноманітних джерел. Наприклад, можуть бути використані промотори бактеріального походження, такі як промотор октопінсинтази, промотор нопалінсинтази і промотор манопінсинтази. У деяких переважних варіантах здійснення можуть використовуватися промотори, не зв'язані з ВасшШив5 (Пигіпдіепзіз. Можна використовувати промотори, що походять з рослинних вірусів, наприклад промотори 355 і 195 вірусу мозаїки цвітної капусти, промотор з вірусу мозаїки жилок касави і подібні. Рослинні промотори включають, але без обмеження, малу субодиницю (551), промотор бета-конгліциніну, промотор фазеоліну, промотор АОСН (алкогольдегідрогенази), промотори теплового шоку, промотор АОЕ (деполімеризації актину), промотор убіквітину, промотор актину і тканиноспецифічні промотори.
Промотори можуть також містити визначені енхансерні елементи послідовності, які можуть підвищити ефективність транскрипції. Конкретні енхансери включають, але без обмеження,
АОНІ-інтрон 1 і АОНІ-інтрон 6. Можуть використовуватися конститутивні промотори.
Конститутивні промотори направляють безупинну генну експресію майже у всіх типах клітин і бо майже в будь-який час (наприклад, актину, убіквітину, Самм 355). Тканиноспецифічні промотори відповідальні за генну експресію у певних типах клітин або тканини, таких як листи або насіння (наприклад, промотори зеїну, олеозину, напіну, АСР (ацил білка-носія)), і ці промотори також можуть використовуватися. Можна також використовувати промотори, які активні під час певної стадії розвитку рослин, а також активні у певних тканинах і органах рослин. Приклади таких промоторів включають, але без обмеження, промотори, що є специфічними для коренів, специфічними для пилка, специфічними для зародків, специфічними для "шовку" кукурудзи, специфічними для бавовняних волокон, специфічними для ендосперми насіння, специфічними для флоеми тощо.
У певних умовах може бути бажаним використання індукованого промотору. Індукований промотор відповідальний за експресію генів у відповідь на специфічний сигнал, такий як фізичний стимул (наприклад, гени теплового шоку); світло (наприклад, КОВР карбоксилаза); гормон (наприклад, глюкокортикоїд); антибіотик (наприклад, тетрациклін); метаболіти; і стрес (наприклад, посуху). Можна використовувати інші бажані транскрипційні і трансляційні елементи, що функціонують у рослинах, такі як 5'-четрансльовані лідерні послідовності, РНК послідовності транскрипції термінації і сигнальні послідовності додавання поліаденілату. У даній галузі відомі численні специфічні для рослин вектори перенесення генів.
Трансгенні культури, що містять ознаки стійкості до комах (ІК), є переважними в рослинах кукурудзи і бавовни по всій Північній Америці, і використання цих ознак поширюється по усьому світі. Промислові трансгенні культури, що комбінують ознаки ІК і стійкість до гербіцидів (НТ), були розроблені множиною насіннєвих компаній. Вони включають комбінації ознак ІК, наданих інсектицидними білками В.ї., ії ознак НТ, таких як стійкість до інгібіторів ацетолактатсинтази (АІ 5), таких як сульфонілсечовини, імідазолінони, триазолпіримідин, сульфонаніліди тощо, інгібіторів глутамінсинтетази (055), таких як біалафос, глюфосинат тощо, інгібіторів 4- гідроксифенілпіруватдіоксигенази (НРРОБ), таких як мезотріон, ізоксафлутол тощо, інгібіторів 5- енолпірувілшикімат-З-фосфатсинтази (ЕРБР5), таких як гліфосат тощо, інгібіторів ацетилкоензим-А-карбоксилази (АССазе), таких як галоксифоп, квілазофоп, диклофоп тощо.
Відомі інші приклади, у яких трансгенно одержані білки забезпечують стійкість рослин до хімічних класів гербіцидів, таких як гербіциди на основі феноксикислот і гербіциди на основі ауксинпіридилоксіацетатів (див. міжнародну патентну заявку УМО 2007/053482 Аг) або гербіциди
Зо на основі феноксикислот і гербіциди на основі арилоксифеноксипропіонатів (див. міжнародну патентну заявку 2005107437 А2, АЗ). Здатність контролювати множинні, пов'язані зі шкідниками проблеми за допомогою ознак ІК являє собою цінну концепцію промислового продукту, і зручність цієї продуктової концепції підвищується, якщо ознаки, що забезпечують контроль над комахами, і ознаки, що забезпечують контроль над бур'янами, комбінуються в одній рослині.
Додатково, підвищена значимість може бути одержана за допомогою комбінацій в одній рослині ознак ІК, що надаються інсектицидним білком В.ї., таким як інсектицидний білок за даним винаходом, з однією або більше додатковими ознаками НТ, такими, як зазначено вище, плюс одна або більше додаткових ознак, що вводяться (наприклад, стійкості до інших комах, наданої білками, що походять з ВІЇ. або з інших інсектицидних білків, стійкості до комах, що надається такими механізмами, як РНКІ, тощо, стійкості до нематодів, стійкості до захворювань, стійкості до стресу, поліпшеної утилізації азоту тощо), або продуктивні ознаки (наприклад, високий вміст олій, корисний для здоров'я склад, поліпшення живильної цінності тощо). Такі комбінації можуть бути одержані або звичайною селекцією (селекційний пакет), або спільно у вигляді нового явища трансформації, що включає одночасне введення множинних генів (молекулярний пакет).
Сприятливі ефекти включають здатність справлятися зі шкідниками і поліпшену боротьбу з бур'янами культур рослин, що забезпечує вторинні вигоди для виробника і/або споживача.
Таким чином, даний винахід може бути використаний в комбінації з іншими ознаками для забезпечення повного агрономічного пакета поліпшеної якості культури зі здатністю гнучко й економічно рентабельно регулювати будь-яке число агрономічних питань.
Трансформовані клітини ростуть усередині рослин звичайним чином. Вони можуть утворювати зародкові клітини і передавати трансформовану ознаку(и) потомству рослин.
Такі рослини можуть бути вирощені звичайним чином і схрещені з рослинами, що мають такі ж трансформовані спадкові фактори або інші спадкові фактори. Одержані гібридні індивіди мають відповідні фенотипічні властивості.
У переважному варіанті здійснення даного винаходу рослини будуть трансформуватися генами, де використання кодону було оптимізоване для рослин. Див., наприклад, патент США 5380831. Крім того, способи створення синтетичних генів В.ї. для використання в рослинах відомі в даній галузі (5іемаг і Вигдіп, 2007). Одним необмежувальним прикладом переважної трансформованої рослини є фертильна рослина маїсу, що містить експресований рослиною ген, що кодує білок СтуЗВа, і додатково містить другий набір експресованих рослиною генів, що кодують білки СтуЗз4АБ/З5АБ.
Перенесення (або інтрогресія) обумовленої(их) білками СтуЗВа і СтгуЗз4АБ/35АБ ознаки (ознак) в інбредні лінії маїсу може бути досягнуте рекурентним селекційним розведенням, наприклад зворотним схрещуванням. У цьому випадку, бажаного рекурентного батька спочатку схрещують з інбредним донором (нерекурентним батьком), що несе відповідний(і) ген(и) для обумовлених Сгу ознак. Потім потомство такого однократного схрещування знову спарюють з рекурентним батьком з наступною селекцією в одержаному потомстві для перенесення бажаної ознаки (ознак) від нерекурентного батька. Після трьох, переважно чотирьох, більш переважно п'яти або більше поколінь зворотного схрещування з рекурентним батьком із селекцією бажаної ознаки (ознак), потомство буде гетерозиготним відносно локусів, що контролюють ознаку(и), що переноситься(яться), але буде як рекурентний батько відносно більшості або майже всіх інших генів (див., наприклад, Роепітап 45 5іІерег (1995), Вгеєедіпуд Рієїй Стгор5, 4 Еа., 172-175; Еенг (1987), Ргіпсірієз ої Сийімаг ОємеІортенпі, Мої. 1: Тнеогу апа Тесппідие, 360-376).
Стратегії керування стійкістю до комах (КМ). Кои5п еї аїЇ., наприклад, описують "двотоксинні" стратегії, також називані "пірамідуванням" або "пакетуванням", для керування інсектицидними трансгенними культурами (Коуаї! Зосієїу. РП. Тгап5. К. 5ос. І опа. В. (1998), 353, 1777-1786).
Агентство США по захисту навколишнього середовища на своєму сайті в Інтернеті (ера.дом/оррбрраї/Біоревіїсідев/рір5/рі согп гегиде 2006.йіт) публікує наступні вимоги до забезпечення нетрансгенних (тобто, які не містять В..-білки) резервних культур (блока культур, що не містять білки Ві/кукурудзи) для використання з трансгенними культурами, продукуючими один білок В.ї., активний проти шкідників-мішеней. "Специфічні структуровані вимоги до захищеного від кукурудзяного метелика ВІ. (СтулАБ або Стуї1Е) кукурудзяним продуктам наступні: структуровані резервати: 20 96 не захищених від лускокрилих ВІ. кукурудзяних резервних культур у Кукурудзяній смузі; 50 95 не захищених від лускокрилих ВІ. резервних культур у Бавовняній смузі.
Блоки
Зо внутрішній (тобто в межах поля В.І.); зовнішній (тобто окремі поля в межах 72 милі (804 м) (якщо можливо "/4л милі (402 м)) від поля В.І. для максимізації випадкового спарювання).
Смуги усередині поля смуги повинні бути шириною щонайменше 4 ряди (переважно б рядів) для зменшення ефектів пересування личинок".
Крім того, Національна Асоціація фермерів, що вирощують кукурудзу, на своєму сайті
Інтернету (псда.сот/іпзесі-гезізтапсе-тападетепі-Тасі-5пееї-рі-согп) також публікує аналогічне керівництво відносно вимог до резервату. Наприклад: "Вимоги до ІКМ відносно кукурудзяного метелика: - Засійте щонайменше 2095 вашого кукурудзяного поля гібридами немодифікованого насіння. - В областях, продукуючих бавовну, резерват повинний складати 50 95. - Повинні бути засіяні в межах "/» милі (804 м) від гібридів немодифікованого насіння. - Немодифіковане насіння може засіватися у вигляді смуг у межах поля В.І. смуги резервних культур повинні мати ширину щонайменше 4 ряди. - Резервні культури можуть оброблятися звичайними пестицидами, тільки якщо для комахи- мішені досягаються економічні пороги. - Розпилювані інсектициди на основі В... не можуть використовуватися на немодифікованій кукурудзі. - Відповідна резервна культура повинна висіватися на кожній фермі з В.І.-кукурудзою".
Як зазначено Кои5Пп еї аі. (наприклад, на стор. 1780 ії 1784 у правому стовпчику), пакетування або "пірамідування" із двох різних білків, кожного ефективного проти шкідників - мішеней і з невеликою або відсутньою перехресною стійкістю, може забезпечити можливість використання меншого резервату. Кои5п припускає, що для успішного пакета, розмір резервату менше ніж 1095 може забезпечити керування стійкістю, порівнянне приблизно з 50 95 резерватом для однієї ("непірамідованої") ознаки. Для доступних у даний час "пірамідованих"
Вл. кукурудзяних продуктів, Агентство США по захисту навколишнього середовища вимагає засівання значно меншого (як правило 5 95) структурованого резервату не В.І. кукурудзою, ніж для продуктів з однією ознакою (як правило 20 9б).
Існують різні шляхи забезпечення ефектів ІЕМ резервату, включаючи різні геометричні типи посіву на полях (як зазначено вище) і суміші насіння у мішку, як додатково обговорюється Кои5п еїг а. (див. вище) і в патенті США 6551962.
Зазначені вище процентні частки або подібні співвідношення резервату можуть використовуватися для розглянутих подвійних або потрійних пакетів або пірамід. Оскільки даний винахід стосується множинних, неконкурентних типів дії проти комахи-мішені кореневого жука, даний винахід може забезпечити одержання "нульового резервату", тобто поля, де відсутні немодифіковані рослини (оскільки вони не вимагаються). Дозвіл звичайно вимагається для конкретних В. трансгенних полів, більше приблизно 10 акрів (40,4 га). Таким чином, даний винахід включає поле 10 акрів (40,4 га) або більше з "нульовим резерватом" або без ВІ.- рослин; поля даного розміру раніше були потрібні для одержання значного резервату, що не містить білка ВІ.
Усі патенти, патентні заявки, тимчасові заявки і публікації, наведені у вигляді посилання або процитовані в даному описі, повністю включені за допомогою посилання в тій мірі, у якій вони не суперечать визначеним положенням даного опису.
Нижче наведені приклади, що ілюструють методи здійснення винаходу. Ці приклади не слід розглядати як обмежувальні. Якщо не зазначене інше, усі процентні частки представлені по масі, і всі пропорції сумішей у розчиннику представлені по об'єму. Усі величини температури представлені в градусах Цельсія.
Якщо спеціально не зазначене інше або не мається на увазі інше, однина означає використовуваний у даному описі термін "щонайменше один".
ПРИКЛАДИ
Приклад 1 - Експресія й очищення
Конструювання експресійних плазмід, що кодують токсини повної довжини СгузЗ4АбБ1,
СтузБАБІ і СтузАа. Стандартні способи клонування використовували при конструюванні експресійних плазмід Рзхендотопах Пиогезсеп5 (РІ), сконструйованих для продукції відповідно
Сту-білків Стуз4АБІ, СтузбБАБІ і СтузАа1. Рестрикційні ендонуклеази з біологічних лабораторій
Нової Англії (МЕВ; Ірхж/ісй, МА) використовували для розщеплення ДНК, і Т4 ДНК лігазу від компанії Іпмігодеп використовували для лігування ДНК. Плазміди одержували з використанням
Зо набору Ріахзтій Міаі (Оіадеп), додержуючись інструкцій постачальника. Фрагменти ДНК очищали, використовуючи картридж МійПроге ОКгаїйеет-ОА (ВіПйегіса, МА), після гель- електрофорезу в агарозному гелі з тріс-ацетатним буфером. Основна стратегія клонування передбачала субклонування кодуючих послідовностей (СО5) Стгу-білків Стгу3з4АБІ, СтузЗ5АБІ і
СтузАа!1 повної довжини в РМУС1803, наприклад, відповідно в рестрикційні сайти 5реї ї Хної (або Хбраї, або Ніпаї!), за допомогою чого їх поміщали під контроль промотору Ріас і термінатора ггпВТІ2 із плазміди рКК223-3, відповідно (РІ. Ріагтасіа, МімаиКее, УМ). РМУС1803 являє собою середню копію плазміди з походженням реплікації з КЗЕ1010, гена стійкості до тетрацикліну, і сайтом зв'язування рибосоми, що передує сайтам розпізнавання рестрикційного ферменту, у які можуть бути внесені фрагменти ДНК, що містять кодуючі білок області (заявка на патент США Мо 20080193974). Експресійну плазміду трансформували електропорацією у штам МВ214 Р. Пиогезсеп5, витягнутий у середовищі БОС-соєвий гідролізат, і висівали на чашки з бульйонним середовищем іишгіа (8), що містить 20 мкг/мл тетрацикліну. Подробиці мікробіологічних маніпуляцій доступні в заявці на патент США Мо 20060008877, заявці на патент
США Мо 20080193974 і заявці на патент США Мо 20080058262, включених у даний опис за допомогою посилання. Проводили скринінг колоній рестрикційним розщепленням міні- препарату плазмідної ДНК. Послідовність плазмідної ДНК вибраних клонів, що містять вставки, визначали за контрактом з комерційною організацією, що проводить визначення послідовностей, такою як ММУУС Віоїесп (НипібзміШе, АЇ). Дані послідовностей збирали й аналізували, використовуючи програмне забезпечення Зедпепспег"м (Сепе Соде5 Согр., Апп
Аібог, МІ).
Ріст і експресія. Аналіз росту й експресії в струшуваних колбах і продукцію токсинів
Стуз4аАБІ, СтузбБАБІ і СтузАа! для характеристики, включаючи зв'язування рецептора ВІ. і біологічний аналіз комах, здійснювали штамами Р. Йциогехзсеп5, що містять експресійні конструкти, вирощеними в струшуваних колбах (наприклад, клону РМУС2593 для Сгуз4АБІ1, рМУСЗ3122 для СгтузБАБІ, і рМуУсС1334 для СгузАа1). Культури, що висіваються, вирощені в середовищі І В з добавкою 20 мкг/мл тетрацикліну, використовували для інокуляції 200 мл того ж середовища з 20 мкг/мл тетрацикліну. Експресію токсинів Стгуз4АБІ, Стуз5АБІ і СтузАа1 за допомогою промотору Ріас індукували додаванням ізопропіл-В-О-1-тіогалактопіранозиду (ІРТО) після початкової інкубації протягом 24 годин при 302С при струшуванні. Зразки культури брали під час індукції й у різні часові точки після індукції. Густину клітин вимірювали по оптичній густині при 600 нм (ОЮвоо).
Фракціонування клітин і аналіз 505-РАСЕ (електрофорез у поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію) зразків зі струшуваних колб. У кожну часову точку узяття проб густину клітин зразків доводили до ОЮвоос-20 і аліквоти об'ємом по 1 мл центрифугували при 14000х9д протягом 5 хвилин. Клітинні осади після центрифугування заморожували при -8020.
Розчинні і нерозчинні Фракції з заморожених зразків клітинних осадів після центрифугування зі струшуваних колб генерували з використанням розчину для екстракції бактеріального білка
ЕазуГ узе "м (ЕРІСЕМТКЕФ ВіотесппоїЇодіез, Мадіхоп, УМ). Кожен клітинний осад ресуспендували в 1 мл розчину ЕазуЇ ухе"м і додатково розводили 1:4 у літичному буфері і інкубували при струшуванні при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. Лізат центрифугували при 14000 об./хв. протягом 20 хвилин при 42С, і супернатант витягали у вигляді розчинної фракції. Потім осад після центрифугування (нерозчинну фракцію) ресуспендували в рівному об'ємі забуференого фосфатом сольового розчину (РВ5; 11,9 мМ МагНРО», 137 мМ Масі, 2,7 мМ КСІ, рН 7,4). Зразки змішували у співвідношенні 1:11 буфером зразка 2Х Іаеттії, що містить |Д- меркаптоетанол, і кип'ятили протягом 5 хвилин перед завантаженням на гелі МИРАСЕ Момех 4- 90 Вів-Тгів (Іпмігодеп, Сагізрадй, СА). Електрофорез виконували в рекомендованому буфері
ХТ МОРБ. Гелі забарвлювали безпечною фарбою бітріуВіце"М Заїе 5(аіїп відповідно до протоколу виробника (Іпмігодеп) і візуалізували з використанням візуалізуючої системи Турпооп 20 (СЕ Неайнсаге І Ге 5сіепсез, Рінгригой, РА).
Одержання тілець включення. Препарати тілець включення (ІВ) білка Сгту одержували на клітинах у результаті ферментації Р. Япогехсеп5, що забезпечувало продукцію нерозчинного інсектицидного білка В.І, як продемонстровано 505-РАСЕ і МАГ0І-М5 (лазерною десорбцією при сприянні матриці/онізаційною мас-спектрометрією). Ферментаційні осади Р. Пиогезсепв розморожували на водяній бані при 372С. Клітини ресуспендували до 25 95 мас./об. у літичному буфері (50 мМ Тріс, рН 7,5, 200 мМ МасСі, 20 мМ динатрієвої солі ЕОТА (етилендіамінтетраоцтової кислоти), 1905 ТИйоп о Х-100 і 5 мМ дитіотреїтолу (О17Т)); безпосередньо перед використанням додавали 5 мл/л коктейлю |інгібітору бактеріальної протеази (Р8465 б5Бідпта-Аїагісй, ЇЇ. Гоці5, МО). Клітини суспендували, використовуючи
Зо гомогенізатор при установленні на найнижчий режим (Тіззце Теагог, Віоз5рес Ргодисів, Іпс.,
Вапіезуйе, ОК). До клітинної суспензії додавали лізоцим (25 мг Зідта І 7651 з білка курячого яйця), змішуванням металевим шпателем, і суспензію інкубували при кімнатній температурі протягом однієї години. Суспензію охолоджували на льоду протягом 15 хвилин, потім обробляли ультразвуком, використовуючи ультразвуковий генератор Вгапзоп Зопійег 250 (два 1-хвилинних сеанси, при 50 95 робочому циклі, продуктивність 30 95). Лізис клітин перевіряли мікроскопією. За необхідності, додавали додаткові 25 мг лізоциму й інкубацію й обробку ультразвуком повторювали. Коли лізис клітин підтверджувався мікроскопією, то лізат центрифугували при 11500х49 протягом 25 хвилин (4 "С) для утворення осаду ІВ, і супернатант видаляли. Осад ІВ ресуспендували 100 мл літичного буфера, гомогенізували ручною мішалкою і центрифугували, як зазначено вище. Осад ІВ повторно промивали ресуспендуванням (у 50 мл літичного буфера), гомогенізацією, обробкою ультразвуком і центрифугуванням доти, поки супернатант не ставав безбарвним, і осад ІВ ставав щільним і не зовсім білим за кольором. Для кінцевого промивання, осад ІВ ресуспендували в підданій стерилізаційній фільтрації (через фільтр із розміром пор 0,22 мкм) дистильованій воді, що містить 2 мМ ЕОТА, і центрифугували.
Кінцевий осад ресуспендували в підданій стерилізаційній фільтрації дистильованій воді, що містить 2 мМ ЕОТА, і зберігали в 1 мл аліквотах при -8026.
Аналіз 5О5-РАСЕ і кількісне визначення. Аналіз 5О5-РАСЕ і кількісне визначення білка в препаратах ІВ проводили розморожуванням 1 мл аліквоти осаду ІВ і розведенням 1:20 підданою стерилізаційній фільтрації дистильованою водою. Потім розведений зразок кип'ятили з 4Х відновлювального буфера зразка |250 мМ Тріс, рН 6,8, 4095 гліцерин (об./06.), 0,4 95 бромфенол синій (мас./об.), 8956 505 (мас/об) і 895 ВД-меркаптоетанол (об./06.)| і завантажували на МомехФ 4-20 95 Тріс-гліцин, 12н2-ямковий гель (Іпмігодеп), що працює з буфером ІХ Тріс/гліцин/505 (Іпмігодеп). Гель задіювали протягом приблизно 60 хв. при 200 вольтах, потім забарвлювали і знебарвлювали, додержуючись методик з використанням безпечного барвника ЗітріуВіне"М Зате 5(аїіп (Іпмйгодеп). Кількісне визначення цільових смуг проводили порівнянням денситометричних величин для смуг, у порівнянні зі зразками бичачого сироваткового альбуміну (В5А), обробленими на тому ж гелі, для побудови стандартної кривої, використовуючи програмне забезпечення Віо-Вай Оцапійу Опе.
Солюбілізація тілець включення. 10 мл суспензій тілець включення з клонів Р. Пиоге5сепьо 60 МК1253, МК1636 і МА832 (що містять, відповідно, 50-70 мг/мл білків СтуЗз4АбБІ1, СтузЗ5БАБІ і
СтузАа!1) центрифугували при установленні на найвищий режим мікроцентрифуги Еррепадогі моделі 5415С (приблизно 14000х9) для осадження включень. Супернатант буфера для зберігання видаляли і заміняли 25 мл 100 мМ буфера ацетату натрію, рН 3,0, і відповідно для
Стуза4АБІ і Стуз5АБТ, і 100 мМ буфера карбонату натрію, рН 11 для СгузАаї!, у конічній пробірці ємністю 50 мл. Включення ресуспендували, використовуючи піпетку, і перемішували у вихровій мішалці для ретельного змішування. Пробірки поміщали на платформу, що повільно обертається, при 42С протягом ночі для екстракції білків Стуз4АбІт, Стуз5АБІ і СтузАа!1 повної довжини. Екстракти центрифугували при 30000х9 протягом 30 хв. при 42С, і зберігали одержані супернатанти, що містять солюбілізовані білки Сгу повної довжини.
Усічення протоксинів повної довжини. Білки Сгуз5БАБІ і СтузАа! повної довжини були усічені або перетравлені хімотрипсином або трипсином для одержання їх хімотрипсинової або трипсинової серцевини, що являють собою активну форму білків. Зокрема, солюбілізований білок СтузБАрІ повної довжини інкубували з хімотрипсином (з бичачої підшлункової залози) (Зідта, 5. МО) (при 50:1-білок Сту:фермент, мас./мас.) у 100 мМ буфера ацетату натрію, рн 3,0, при 4 "С при обережному струшуванні протягом 2-3 днів, у той час як білок СтузЗАа! повної довжини інкубували з трипсином (з бичачої підшлункової залози) (Зідта, 5. МО) (при 20:1-білок Сту:фермент, мас./мас.) у 100 мМ буфера карбонату натрію, рН 11, при кімнатній температурі протягом 1-3 годин. Повну активацію або усічення підтверджували аналізом 505-
РАСЕ. Молекулярна маса СтуЗзБАБІ і СтгузАаї повної довжини склала «44 і 573 кДа, і їх хімотрипсинової або трипсинової серцевини склала відповідно «40 і «55 кДа. Амінокислотна послідовність хімотрипсинової серцевини СтузБАр представлена у вигляді ЗЕ ІЮ МО:5.
Амінокислотна послідовність трипсинової серцевини СтузАа представлена у вигляді 52Е0 ІЮ
МО:2. Ні хімотрипсинова, ні трипсинова серцевина не доступна для СтгуЗ4АБІ1; таким чином, для аналізів зв'язування використовували СтуЗз4АБІ повної довжини. Амінокислотна послідовність
Стгуз4АБІ1 повної довжини представлена у вигляді ЗЕО ІЮ МО:3.
Очищення усічених токсинів. Очищали хімотрипсинізований СтуЗз5БАБрІ і трипсинізований
СтузАа1. Зокрема, перетравлені матеріали центрифугували при 30000хд протягом 30 хв. при 4 "С для видалення ліпідів, і одержаний супернатант концентрували 5 разів, використовуючи пристрій з центрифужним фільтром з регенерованої целюлози Атісоп ШКга-15 (відсікання
Зо молекулярної маси 10000; МійПроге). Потім буфери зразків заміняли буфером 20 мМ ацетату натрію, рН 3,5, і для СтуЗ4АБІ, і для СтуЗзБАБІ, і на 10 мМ САРБ І|З-(циклогексаміно)-1- пропансульфонову кислоту), рН 10,5, для СгузАа!, використовуючи одноразові колонки РО-10 (СЕ Неайнсаге, Різсаїамжау, МУ). Кінцеві об'єми доводили до 15 мл, використовуючи відповідний буфер для очищення з використанням системи рідинної хроматографії АТКА Емхріогег (Атегзпат Віозсіепсе5). Для СгузБАБІ, буфер А являв собою буфер у вигляді 20 мМ ацетату натрію, рН 3,5, і буфер В являв собою буфер Ан1М Масі, рН 3,5. Використовували колонку
НіТгар 5Р (5 мл) (СЕ). Після того, як колонка була повністю зрівноважена з використанням буфера А, розчин Сгтуз5БАБІ інжектували в колонку при швидкості потоку 5 мл/хв. Елюювання виконували з використанням градієнта 0-100 95 буфера В при 5 мл/хв. із 1 мл/фракцію. Для
СтузАа1 буфер А являв собою буфер у вигляді 10 мМ САР5, рН 10,5, і буфер В являв собою буфер у вигляді 10 мМ САР5Б, рН 10,5-41М Масі. Використовували колонку Саріо О (5 мл) (СЕ), і всі інші процедури були аналогічні процедурам для СтуЗзБАБІ. Після аналізу 505-РАСЕ вибраних фракцій для додаткового вибору фракцій, що містять білок-мішень найкращої якості, фракції об'єднували. Буфер для очищеної хімотрипсинової серцевини СтуЗз5АБбІ1 заміняли 20 мМ
Віві-Тгі5, рН 6,0, як описано вище. Для очищеної трипсинової серцевини СгуздАа! сіль видаляли, використовуючи одноразові колонки РО-10 (СЕ Неакрсаге, Різсаїажшау, МУ). Зразки зберігали при 42С для проведення пізніше аналізу зв'язування після кількісного визначення з використанням 50О5-РАСЕ і аналізів системою візуалізації Турпооп (СЕ) з ВЗА як стандартом.
Приклад 2 - Аналізи зв'язування
Препарати ВВМУ. Препарати пузирчиків мембрани щіткової облямівки (ВВМУ) середньої кишки комах широко використовували для аналізів зв'язування Сгу-токсину з рецептором.
Препарати ВВМУ, використовувані в даному винаході, одержували з ізольованих середніх кишок третьої вікової стадії західного кукурудзяного кореневого жука (Оіабгоїїса мігодітега мігдітега
ІеСопіє), використовуючи спосіб, описаний УмоМегрегдег еї аІ. (1987). Лейцинамінопептидазу використовували як маркер мембранних білків у препараті, і активність лейцинамінопептидази неочищеного гомогенату і препарату ВВММ визначали, як описано раніше (Гі еї аї. 2004а).
Концентрацію білка в препараті ВВММУ вимірювали, використовуючи спосіб Вгастога (1976).
Мічення 725І. Очищений Сгу3з4АБІ повної довжини, хімотрипсинізований СгузЗ5АбІ1 і трипсинізований СгузЗАа мітили, використовуючи "2ч| для аналізів гомологічного і конкурентного бо зв'язування. Для пересвідчення в тому, що мічення радіоактивним ізотопом не усуває біологічну активність Стгу-токсинів, проводили йодування в холодному вигляді, використовуючи Маї, відповідно до інструкцій з використання гранул для йодування Ріегсеф (Рієгсе Віоїтесппоіоду,
Тпепто Зсіепійіс, Косктога І). Результати біоаналізу показали, що йодована хімотрипсинова серцевина Стуз5АБІ залишалася активною проти личинок західного кукурудзяного кореневого жука, але йодування інактивувало Сту34АБІ. Мічений радіоактивним ізотопом 725І-СтузаАрІ1 специфічно не зв'язувався з ВВММ комах, і Сту3з4АБ1 вимагає іншого способу мічення для оцінки зв'язування з мембранними рецепторами. Біоаналіз з використанням йодованої трипсинової серцевини СтузЗАа продовжували, і результат був доступний через один або два тижні. Радіоактивно мічені 725І1-Стуз5АБІ1 і 125І-СтузАа1! одержували йодуванням гранулами для йодування РіегсеФ (Ріегсе) і Ма!'25Ї. Колонки для знесолення на вибір 7ебра"м (Ріегсе) використовували для видалення не включеного або вільного Ма'25| з йодованого білка.
Величини питомої радіоактивності йодованих Сгу-білків знаходилися в діапазоні від 1 до 5 мкКі/мкг. Проводили множинні серії мічення й аналізів зв'язування.
Аналізи специфічного зв'язування. Аналізи специфічного зв'язування виконували, використовуючи мічені 125 Сту-токсини, як описано раніше (Гі еї а. 20045). Для визначення специфічного зв'язування й оцінки афінності зв'язування (константи дисоціації, Ка) і концентрації сайтів зв'язування (Вітах) СтуЗз5БАБІ і СтузАа з ВВММ комах, серії зростаючих концентрацій або 125І-СтуЗз5АБІ1, або 125І-СтузАа інкубували з даною концентрацією (0,05 мг/мл)
ВВМУМ комах відповідно в 150 мкл 20 мМ Вівб-Ттгі5, рН 6,0, 136,9 мМ Масі, 2,7 мМ КСІ з додаванням 0,1 95 ВЗА при кімнатній температурі протягом 60 хв. при обережному струшуванні.
Токсин, зв'язаний з ВВМУ, відділяли від вільних токсинів у суспензії центрифугуванням при 20000х9 при кімнатній температурі протягом 8 хв. Осад після центрифугування двічі промивали 900 мкл льодяного такого ж буфера, що містить 0,1 95 В5А. Радіоактивність, що залишається в осаді після центрифугування, вимірювали автоматично гамма-лічильником СОВКАЇ!Ї Ащшо-
Сатта (РасКага, Сапрегта сотрапу) і враховували загальне зв'язування. Паралельно проводили іншу серію реакцій зв'язування, і 500-1000-кратний надлишок неміченого відповідного токсину включали в кожну з реакцій зв'язування для того, щоб він повністю зайняв усі ділянки специфічного зв'язування неміченого відповідного токсину на ВВМУМ, що використовували для визначення неспецифічного зв'язування. Специфічне зв'язування
Зо оцінювали відніманням неспецифічного зв'язування з загального зв'язування. Величини Ка і
Втах цих токсинів оцінювали, використовуючи специфічне зв'язування, у порівнянні з концентраціями використаного міченого токсину, використовуючи програмне забезпечення
СгарпРай Ргізт 5.01 (СгарпРай Зоймаге, зап Оіедо, СА). Графіки складали з використанням програм або Місгозой Ехсеї, або сгарпРаа Ргізхт. Експерименти повторювали щонайменше три рази. Ці експерименти зв'язування продемонстрували, що як 125І-СтуЗ5АБІ, так і 125І-СтузАа були здатні специфічно зв'язуватися з ВВММ (фіг. ТА ії 18). 125І-Стуз5АБІ1 і 125І-СтузАа мали афінність зв'язування Ка-2,31-1,26 і 24,0-9,7 (нМ), відповідно, і концентрацію ділянок зв'язування
Втах-31,6926,38, 146,32539,9 (пкмоль/мкг ВВММУ), відповідно.
Аналізи конкурентного зв'язування. Аналізи конкурентного зв'язування додатково проводили для визначення того, чи розділяють СтуЗз5БАБІ і СтуЗАа один і той же набір рецепторів. Для аналізів гомологічного конкурентного зв'язування СгузАа, збільшувані кількості (0-5000 нм) неміченого СтузАа спочатку змішували з 5 нМ міченого СгузЗАа, і потім інкубували з даною концентрацією (0,05 мг/мл) ВВММ при кімнатній температурі протягом 60 хв., відповідно.
Процентні частки зв'язаного "25І-СтузАа з ВВММ визначали для кожної з реакцій, у порівнянні з початковим специфічним зв'язуванням за відсутності неміченого конкурента. Також проводили аналізи гетерологічного конкурентного зв'язування між 125І-СтгуЗАа і неміченим Стгуз5АБІ1 окремо або неміченими Сгуз5БАБІ1ІжСтуЗз4АБІ (у молярному співвідношенні 1:3), відповідно, для ідентифікації того, чи розділяють вони один і той же набір рецептора(ів). Це досягалося збільшенням кількості неміченого Стуз5АбБ1 окремо або суміші СтуЗз5АБ1СтуЗз4АБІ як одного або двох конкурентів, включених у реакції, для конкуренції за передбачуваний рецептор(и) на
ВВМУ з міченим СтузАа. Експерименти повторювали щонайменше три рази. Експериментальні результати продемонстрували, що СтузЗАа був здатний повністю витіснятися, коли молярна концентрація збільшувалася до 500 нМ (100-кратний надлишок 722І-СтгуЗАа) (фіг. 2). Однак або
СтузБАБІ окремо, або суміш Стгтуз5БАБіжСтуЗз4Арі (у співвідношенні 1:3) не була здатна витіснити 725І-СтгуЗАа. Ці дані вказують на те, що СтузБАБІ окремо або СтгузБАБ1Стуз4АБВІ1 (у співвідношенні 1:3) не розділяє рецептор з Стгузда.
Посилання
Вгадтога М.М. 1976. А гарій и взепвйїме теїпоай ог Ше диапійайоп ої тістодгат диапійіев ої ргооївїп шйігіпу Пе ргіпсіріє ої ргоївїіп-дує Біпаїіпа, Апаї. Віоспет. 72, 248-254.
Її Н., Оррет В., Ніддіпе В.А., Ниапа РЕ., 7пи К.У., Визсптап Г.Г., 2004а. Сотрагаїме апаїувів ої ргоївїпазе асіїмцез ої Васйив5 Шигіпдіепвіз-ХОзвівіапі апа-зивсеріїіє Об5ііпіа пибііаїЇїв (І ерідорієга: Статрбрідає). Іпзесі Віоспет. Мо!/. Віо!. 34, 753-762.
Її Н., Орреп В., СопгаІє2-Сабгега ., Ееїте 9., Ніддіп5 В.А., Визсптап І... апа 2пи К.М. апа
Ниапд Р. 2004р. Віпаїпуд апаїувів ої СтутАбБ и СтутАс м/йй тетбргапе мезісієз їйїот Васіїи5
Іишгіпдієпвів-тевівїапі апа-зивсеріїбіе О5інпіа пибіїаїї5 (І ерідорієга: Статбрідає). Віоспет. Віорпув.
Вевз. Соттип. 323, 52-57.
Муогегзрегдег М.С., І шу Р., Машгег А., Рагепії Р., Зассні Е., Сіогдапа В., Напогеї С.М., 1987.
Ргерагайоп апа рапйіа! спагасієгігайноп ої атіпо асій (ап5ропіпа бги5п Богаег тетбгапе мевісіе5 їот Ше Іагуа! тідаці ої Те сабраде биоНепіу (Рієгів Бгаззісає). Сотр. Віоспет. РНузіо!. 86А, 301- 308. 5 Раїепі Арріїсайоп Мо 20080193974. 2008. ВАСТЕВІАЇ ГЕЄАОЕВ 5ООСООЄЕМСЕВ БОВ
ІМСВЕА5ЗЕО ЕХРАЕБЗ5ІОМ.
И5 Раїепі Арріїсайоп Мо 20060008877, 2006. Ехргезвіоп зувівтв м/йп зес-зузієт зестеїоп.
И5 Раїепі Арріїсайоп Мо 20080058262, 2008. тРА оріїтігайоп. й сОСЕ пос як «лих т ПМВЖАЖЕК, Ко невже ВИК УЯ ТАБУ їх ЖЕ Ме. ях ПАПОЗАГАННЯ хай об КжхообивовВшк Дюдобато сім нав ОЛлЛю Тако Те Був п Бик ПпХе х ще І ЦО 1: ап дви Фі Мах Вк ства АВ НшЕ тах іє тус їси те щі
ТтшодВй БЖО тв Бий Осі зро сеи А Тух БупО ВА Ви Бе КЕу Мих тик Ма Звробет бЕй Ол віх мів поем обер ще Зак ТЕ те уз дю
ВА Тш шою буш Фу їх Зшк о щі Бу Бар пеніса, шими У пд Биу ТЕ й ам Ва ма уві ще Ева охує ТБлОлЯЙ вне ка
Вийти тую виз ше ІМ век вит фжроїхи Ввасрнє Метт г
БЕ дів іа мах як зів ух БІшЖ АТа Ми Тух Аізофв мно бив діти Да днуп Там: ДМ» Бу іш: (ми ЕМ ОФОУТ т Ши бюро уМ о Же і пів'озшк ло Еф В Ве ІЗ їш-и ие пат опе йпішлО о Зах МІ:
пи у да сш ваша і ж ПЕК Да В А СО ж Крик и КАСИ СМ
ТУШ ВАХ ЖІ лВя ОХМЕКИ З ЖЕО МК ТКБЖ САВА ММК УЖ ко ша са те ох
ЖК МИХ Кл, па Фк п ки АЛЬО у их шк А І дух ФУ у тк ж
Містер стю Тако Жук АЛ ТЮ М Аза ФМ СПТУ зашиті ТНе Ко НХ по туда) теку, . ше й 5 и том й шу М пт сток мак ок т у пу та ую ПИ у В
МЕ уХ Мод о юлЬ ДОпЖ ОК КД іни Д ЖУКА КМ ЕЕ ОХ СА ЖУВЮ що ВІВ ша тор чит Ед см ав АК садив р пд: пір ю кр и вам ню . іш осям Кат х су лий бянр Буш ли фл Еда роси ух ТД лев век) кВ Я ев нин о он вн в А НН Нео КН НН НЯ НН НКЮ пшона юю маховик о муть ММ шу ін АЖ Буш вна свькХ Мін у. пед : сл я - пал : и Я и В а В ре ра Нв і они
ДОМ ХМАТО ОК КК МАТОМ дО Ж ТЮ ЗИМ КТ АКТИ МОЖ УК ВИК тн МЕ с Я ї аг
Кк ІК шОЮ піки та пт ДЦ і Дон Кк ко ик ІМ ому ж жує МиуМисю В,
ХІІ одн х ЛУК СМ ж ву ИНА ВК Бостан бу и ОХ тр се ок : хо ж ХУТЕ Н хут Тпу хто м ик ду рон у фл Жим пу и ши Лв ша а бе БЖ пе дос Був ж см би. пк вк Ашд ую ам
Ух Я їЗО тр вом ве гу ик Еріх ев ро мих ду Мі Амет фут моду тк и дотекіх
Тнжх ато хо бле мап ше У их Ат нем Лк шу пови и вх деле пра А ця реаня
БІ ДЕК З Б із аю уж ле ли тиви пряжа кит хх іш Ма тд ЛУ Ви пора ожЖасо пзи між був овавйсореУю ців вн тво Боез кіт ла оАео бух їх 230 ЗВ тм ЗМ год док; рю у ІМ ЖЕ рани ніч пиву им АВ ОСЛрКЩ КИ там КК ТАКИ ОМВК КЕ НІВ Ха В иа Ор У шо АУД ил І я поши вд ну Ки пня ум пр пи ки хі СпуррКюиі ан Я дмню Фе
Б жМжЕМ шмз оЕЛатю Лю УАОСЕТЮ жЖЕЖ се МллО Ук Уж ШКОЛУ 0 Бл
З З Ол ух с
ОК ни нн он НН Не ие но ново Ні АН НН Зв я пек кісок ша тро гасі ле лек Бто сте Ук юки Би Боже
Ж І С ; ЗЕ спиш сф ти я чик КИ оту жа бу хв Ж и КАХ ПК а хе
ШИ УМУЖ дю А МИХ СОЖОКЛЮ с ККЯх смт ЗМИТАД омела ж КТ уй о лих ЗІКу ЯМ УМ п Му
Ух ща Б й щує що ХА лю вух Мр рух до и Су Лю шок дО туя ло до мА М ВИ СД АЮ Кий ЛАД Ж АС МЖК ШУ ШЕ ФВ МБО М - ях тт ща КА дод ікру от рено тот ху тку Уа шо ФІ Су сл Що пМлту вія дру зако У КМ Іісус В МО Кл ОІМЕЖ САТ ТУДИ плр ля щ АКОТ й ди дл дочїу веж я лю хт. - пк ожини о ВО «тире а. ери Во ик ж аж
МИЛО Бл ЖИМ МТУ ЮО МФРАЛМО ОКТВКО СКД ИМИ лБЕХИ АМС ЖАБИ КВК Ми АКММ ОМ НОО Я
КК й ад Ах
УМ Ся ДТ
При і да ак о кот ту тро І1МКІЖ Ішов ЮЛ псІ МИ ОБ ЛУЩІ ХО ик о Жука ть ПЕ ДУ ГЕ АДМ ОЛІЮ СКК ба. п пи полу хх во ПИ бота ж кю т пу ам ВЕ та ж Ку ри Дещо: ен син ню ач ХО лІ. ТУ КРД СрО СЕ ЖК УЖКУ ЖЕК Сн фл слЕмя АВ Бу мя кожна Ту Кк М фл ї7Е . Ек ди
ТЕ СиКеНа АТ 28: вно нан нена не нн в ни КН нн и вир НН : Мат пф шу Баки ци у шо іш БЕ Жак зицР ТУ ТЕО ТВЕН мУЄ а щих Уч : рез ЗІ: Бе а нн на НК зн ни р НН НК НН НВ НН о Я і шФА ж АОС ЗКІМЛ АЛЕ АЖ МИС ОБУ Я Ле АХ МИ Оу МАЛИ МК ЕМ ОФКХ
ІЗ І Ах . ен зл Же о Нут кох йелости я пам КМУ іо у п Ед п шланг милу ху ЖК ної мом Мем Зах ху ЖК ІВКК Вовк Кк и
УМ : БАЧ ТУ
Кан Ше и пе и уки ПЕК ПВ яю тт ік а і ших ря
ХК шт тА КТ СІМ ЗШ АЮМ. мІЮ КИМ А ОМАВО АТ АЮ АТАК ОСУКМИ ЕМКТ ЗУ нон Но. ЯМ
Фо до ру им Кор ду рда ні ота кр и пр ше ПКУ Худ
Голо ЖнхкО ЗБ ей ТА В ЕК НЕО Ка пал Вау да Беж Бук ши т МВ щи проку тут й т по чІхх ума ТИ зем довж о дн р шо ши ру М що арк и поши ТЕ ЕК МИ дру
ТОЖ УМ Тулі МЕ ХОМ ІД ШВУ СКК КИТ, смол их ЖЕО ЕТУХ . як ЗЕ ПІКУ това мим с Жіхуу ри ЕЛ ел Крани КИ ума ДИ ко кю раю УКІ р ут тру їм садом МАХ КІХ МОХ АСКО ЖЖ дит УЖЕ КАЖУ КММО МУК п УКюВЕУ ПМ ХМ У
ВИЙ УВУ ПО
Ко ак о ил Мод пух аж ряди пн жу, их МИ ве гію і де дом ЖУТЬ ММ Ж ЕК В НЕ КИ Ку КУ ДМК КТ СТАЖУ дея КВК
М шк ти шУЕтию. Миюи фу ко фути, ФК сирі прощ дини ши я ши жу т шу КМ Ж ни у тю т ша пии дм Х ЄМ шо МИ ЖУЮТЬ А КТ КОМ КУ ММ, шо З шок дике я раку пи дер Ку я тд пли р тр да ки щи кут ду дю ту ж дні У і Ту
Хнтощиу ліве виш ау Ав Бум ай тую ВЕ Моутю ДЛ ЯМКИ ЖТИХ реднеан БУ Аа ко
Т.О ММ ХА ЖДКМу «Ду, тах и Й
ТЕКА х : века: па : «ди ОМА мон нн НК НН я
ХИТ. Каши МВСУ ДИ АНННея ле ї пт -х «МІН ОСОЮ фея зи да дини шт Етики ПДК ук ТИ ру ок Ця пис ТЕ
Же дю МЛК АТ А УК МОЮ ЛИ ху лалІЗ и юхЯ ЕТНО ЕК ЯК В КИ : х ст шк Я х во і її демо плоху УК нИи с іму дує ктжю ПМ ія Шу фе па дк лю ІК ОСИ МК
КОРЖ ДІБ ОККО ОМ УЮ ХК ОМ ОК ЖУК ДЛ Ех Кіш леву М АК ММ с ї : тих. т нн Кн в На НН в и НО НН В Но щодо мигрю дж АМФ САТИН СТИК СЮ АХ хо ХК ЛАГ О М ІТК ОМ АЛІ СОТИХ ли С ха вен но Не но но ни НН о о о ОН Но Не
ПІІ Д АН ТИЙ РКК ОА Ж НИХ ї ОХ: в ти ДО ЗЕ ТА 0 ХАТУ СКД УМО ОХ ща с. п І ож нини и НН и НН нич нон Но нн Но В в мимо они шт Мам шишок мушу тм шаль омяХ мих ШМК КМ лам ші БК и р хх и їх ТУ по пера прю ув Мод пет од леж тку дит А. ик у тою кт птутокми мам онаносСуко ні ший ЗО ех А мВ мА МЕМО СУМІ» мумії
Ту т Зх
М щи У о но о во Но о КН Но нн В НН шо ХК Мам У КОМ ЖМаТО СК ХК Марі АБУ сптит МК омлюр вушок ана хи с хе ях
АСХТТХ Вид : ках пра каш им о паю у дя оду Тая тах ху, Ом Щи тортур шіш ме НЕ пе тако У лоб ОАВТІ Тех бТає до о венові БЕ Мем оте
Ах ха ЗЕ їв Плов Му п ких одер АТ ох мен ТРЕК Тая пови в Ах о дтт иа СУ Дер ша уд ЕМ ша ше жк зу Кп шАМ о мае ЛК ТК УТ
Ж. пту : іл я и ГБН ше
ЖЕ о жали Мк юю М Ух жав ис ик їх пок од авт кн Та у ря хаос. КРТ ТТ; БХЖК БАК мак мА а Довж діт тлу М ЖК ку
ТО гу 15 ти
НН А АСУ вина АЛМИМИ ме жі пе ув Сто Мшриц Е у жжих Ж3 ку ии Токши о Уют М З Лі ДУ
ТП ЕД СМ ою ЖК, ВЖИ с КА МКС У КО МАУМ АЖ МЕ ПЕОМ ЗПЛОМОЛИЖХ ри їх ще На я ща е г - и ня під м п з ек сх т тт пожеж пМипю ШІ юю лому ру ти вет рено дя тує кі г гу жу ад спи
Ваш тмЕ сш омУВ Ер Кл КО меж ніш тод рт іхіле Ме Ко ТЕ : УВО ї155 5 біди рух Маха М Жан у ул. даже жу кл ПИ у Ман дет руде УК Ж
ШмЕіКю мате Кор маю лу В ЖЖ МКК леву МО ЖУВУ ОК СУШУ МЕЖ ЖЕКу тлу : бут БУ
В ІЗ й МІУ ек Ду пу ди щу жди. лю КО и тіж дис. тр МІХ п у
Кетле ке маш БЖ шМтУ схил МЕТУ ШО ІЛИЙ ОО КМ КОМ КЕ ГІ МК ху склу калу Дак в яІ лий жх че НН чо рн кн о НН В о нн ай Но ННЯ
Тато зу ек шк моль ява МІК ну им МАШІ Зах Масу ОМ оп ух пк щоне, ех кат
Ох и п ШК
БИ дО кон ЖК пи пи Ту ТІ МГ, Дах» НАША Хо За сим З жжух, По сюзих, Шимко їн ши АЖ МЕЖ ТИ У МІК ОСВЮАТКОЗІММИ ОМИБОЮ ША ля ОЖИНИ уМ ж УМ КАТЕ
Е тих суші КОХ,
КАТ я «ІМ я чани сежрея КД Хо ж жх тота щі ДК В и дмо щих КЛ уж Ми ж прі Од щи муж шим хе ю. Жов ТКА ТЕКУ ШО М КО МІСТ СЕБТО КОЮ ТА ТюДИО ВЖК би сх ох п с пий КОТИ ик. дин ОКУ ов а он о и НК пф бод Лрини ошужю ДТЬ ФТЛІх
МТМО ЛОВ КАМ ОО Ж О Ж ХО САСАМ ОСТІ РЬ ОМТИКО СК м ОУН ЛИН ому АУП ТАМ ОО ЖЖЬ бу
Ід, : ВО Не ни а ник нн и о нн и НН на о ни Не їмло УМ лек о Зултж люуу доза і ха ЛАДИ ЇЗ3ИХ БМ Ба шля ХМК ХВО УмЕІХ . ех СдВ ЗЖухтх
Ве МОТО. Ями
ШЕЕтр вет ел КІ гум таж пики и Я що лу шрам п ау щ Мо ут
ПА отих мм А ДО АСДИМ СК ю Дуо МЕ МД хи НІ СОЛО СМ СЬО РАВ ТУ сю пло кх ик й лу км Шо хя вже лк
Шити дик СИЛ І ожен н вУ ни НоК ям мі ВИ МТК АМКУ ОКЕКУ, Бо Фо Кл ОМАш ОККО ЖАХ БЮ КМ КЖН МЕ
ЕХ тих Зоух пло стхщо ще КЕ ов М Ин ОД нн НН НК НН НК
НМівомУую БиЖ М дЕШОБЕЕОКІШК ОА МНЕ пі є спав ле М МУ БІ ІВХ ах Я пол, пр «ВЕК У! я ХМ поши дж ин ж ато пд Дом тут бохо тиж тт шу ми ою іх дк
БТ Мо Ку МЕ Мах су УХА ІМК Му од с ОКОМ ВК МЖК Му звик зудту ст перш, ККУ ПАВОХ лиш о до В хе кю на м НАМ ЖІ у и До 1 ж 1 ІІ ТАЖ СИТО Кі
МІВ СУМІ Ж ТК ЛАД ТАМ АК ІК КИ ЗАМ СІ ЖИЖО Мао ОМ ГІС Тих
МК, Ка м дош: за дк о т щі Ж хе А фе тні Вакула жду Ж ВХ АК ФІ КЛІ БЕК МАО АЖ ДІЮ АК Я СЮМАО АТАК МИХ
За ач : ВУ КУН
Го о нн Я Но не нн нн НН НН ННЯ пай ому ую вид ля Б дл НЯ Кух Ал ЛАК ЖЕ МЕНЕ ЗІ М ОХ
АК СЯ З ж
Бе а ЖАХ. суки тру тидії жі Жим ою (І АК рт; ЗТ ту ШЛЕ пу та МЕ ух
МЕ СД Ле МА лива ЛІЖКА МОМ МТ УМО МЛ зхЯЛК ж уж у шо ле жк Я БУ а
Зокич клея СБ віх дршм З п хи мой ям Мову сему Та Кр пихи мо пов х птн ОВ ДОШОК пут ля ХА МА му оса люВІ ІК Сл ДТЕК ШИК Ко ДК БЛОЖО ФАЖИ Уж ах ля за5
Ток ки вшир пи ЕЕ Іа тим ун Ману шо та шт
Удома Мт ши АЮ ОКА АТІКА ОК ТК ДОМУ дл кут шен
Кеннне нн На КОМ мі дао мим Підіть шоу ЖЕК КЕ НАУ ВЖК й МАМ УМО ОХЧА СХ МУ 0 фот ВК ВТ ЗИ ТК КОМ
М п о ТЕ ди що УНН Ах яИУМ дім Мк і жу в ЛХ
ПА ОЖИМШ А Б ДЖЖК ШКО АХ, дя, :
Су т шу
Ж ЖК ЦЙ.
СЕК їж
ТАМ п - исктІх модний різу скік т щиті хх плей ХИЖАК СОМИ КУ ВІХИ ЕНО МА М
ВНИЗ н ну пд пк. КН де о й. щі нм пошепки, пл х и. ме, т ло
С ве ва и В НН НН МН сло дж док ефе арх МЕ ха СМОЛИ Стас тТЖЛЕ МК СК ЛІ Коси ОМВК ОВУ ВІ лм му хм МАУ ТЕКИ т ря ЕІ мл и о М но и НА ня и НО ва и КН о ЗИ
КМТ ших аль ом САЛА у пу Арт Тита РИБур; шле лу ЛЯ КЕКВ ОБ
ШІ ХХ їй
Пуер у КК чи ту ви і то дов ко ри тд
Кк сяФК опи ТЕ ояюдх М АХА В АЖ Пл Іво МТ ВДВОХ дл я пт ще Я
ХУ БУ Б
ПУ шо пода тт рід, мода ті ПІР ОТОВІМ ТЛ вд ру т ін ху и пхгКЕ ОМА АТ ЮТ мМ МЕ ІДС МЛК ЗІДКОШшУ о ДТКХ лю СУХУ ЄЕК щих
БК у по ху ту и бло фе Де Тл ть ВД КЕ ММ а Ем ФМ АЛІ ДЖ Му Кл Кл В а ФОаМі спеку АДАМ ОКАЖО ШИК МОМ КЕ ВОЮ АЖ ОККО я . з ние то
У Б б : по скан не р нн НН и нн Нв кН НН НН НН о нн о НА Я з ДН МІК Бу ААУ На ОХ КИ А МД. й ТК ЖУК ТК в ця : Зк яд дети геї ня Кк пд Кт пе г -тх я кр Ву т
Ох Пи ок чньхя о ща Ежен ик З ОБО гю ТлКии ху. Ох
МАНВ ОСУД ДІВО Ву ану шу и пед мтах ва левА СУМЗЖОЖУКО МУ АВ їй пе іду
Мт МИ тафти ЩЕ о Ки дю в ї мам оби тиж ек оре Е пл им ПУ ля ру ех
ННЯ З К
М іш ши Кир я верх «кт кт З
БИК е ек .
КВ» те пу Лю ВХ ше текло души Оля и ати жали ЯНИЛИ ОМ ММ ЛІЖОК шою ї
ТОКІО 5
Му їдемо ок фу о в чик і Те Кк облі НИ Від одну мех іш зв тах опзи хво хаБОтук мл тіеолаломии Нав оМх патчиху вч 5 : Кн; 15 гі вір АЛЬО ЛУ рю я ди Ми У ку ве а ПИ КК Ко У мамо хут душ ВІ ОтвК оте ФО к зви ЕД ОІВ Олл М о МУК сВЖКЕ БИ
ХМ о ТМ
Мішин жк ЗМ Вт вно ЗА йЮД ОТЕ ли В ІК К АЖМЕ Биши и ЖК КЕ алу АТ 5 г. о дит до ші мі ж аю Ж ді Ук но му пи Мі Ду
ПМ МІЖ Ж ЕЛ ОД ЕМВ ОН ОКУ УХ и АЖ ЖЕ С ФО ПТО ИМВНУС СД шеАЛК ОНКО щі гом Ії с
БІВ пе М сон в нн нн т НН А В В ИН ВО НН НН див
ІХЖИ МО МИЛЬ СТЮ бю Ж МЕС МКМ УВА ТУШІ УХИЛУ ому ої ФММ діа ту оду жю ВУХО дн ду уд и ри тату Кто, Кл туші Се одн,
По жуж Ех пшона шо сіл пуд куМ іт Бо му ях Тоде фо 7. Та ТУ. й МУ в ке сідотю ім піс би АВК юн Дно вени ді СК ж вні Ох
Фу м чо Мю Ж омш ПЕМя жим ви пи Ж МАСЛИН ХВ ДЕ В тр : : типу : зи
МО Тл ОМЛЯ М лак рю и ку ки р ж ад У уж Ки хх пек дош ТЯ алею ую поож УК я ил Уки ля БІО БЕ КАЖЕ ТММ ТЕМ. КВЖ ОАЕ ЛЗ МА ТМУИ чув ТИХ я
Ах КА хе дже Ва Фен Ди Пи лужок М еюо сдухч КИ сти Му м Ку
ПАН ВЖИ. КЕШДОЗ ЕІ ХИ УК илтя КДУ СКИЖІХ МЕН АЖ СУТ сті ПМК. АДАМ МЛК ХЛ
Ми Ух її й типа пику прі жу тяж Де ТЛ Кох пу ЛО Жує пди т: Ти жо Ммх Сгяук дерти
ХЖАДО ЖОБЛМ ХЖОЛІ ЗАВ ЕКО АКВА АЖ ТУВ ОКХ му о шш МмУЖС ФК ОБУ ШОУ под ох Ул ха ем М. рана НЯ пак шт Ли мив МІ, В трак А шо дуюти ЙТЛЬХИ МИ 2рю. лев фу МТ Ж ток САКЕ муто лах ЖЖ ХВЄ пд у ояди З ВХ ІМЖМ Лія У Стик днаю Бко си жид МИ пов З А їжте
ХУ я У у ших зм Ж пеетету и яти до ди СТА ди У хх У хе
ТУ. Ж, ря Се Хо. Ма Тед; Ми У ГК, ЗІ С ЖУдлУ их У а ІЕЕ
Пі отор АК опо оМеО Бо Су фе БНО Уа веб овли БЕо АВ отже АБО пит ах хх
НЕОН НЕО КО селі ом. ОО и я дум т у АК р Кк тая пудів М
Ту шт Тк сл ші меш Те тах о Буше ТЕЖ СтУхо БІ ем Буш опев Тех хтхуц ВИ путух,
МІК ХХ «КМУ порі бхют мишу три. що ул щи силу шко йод ЩО рр дк луки ДК ін Кук зрост ХЛ мая Мп ІД ле ЖАТЬ Усі Їх Кичз БЖ Бхо пак
Бан сх х, тих я яОМУ пк уві слот то ев смзіш стру ук ТУ ун ТЛ дя пд житя жо суду Кути пелустюя дж Ок ЖУК СКЛО КУуКо мА ТЖдУ ЗМ УВУ ЛУК ДІР Ов силь БУЖ шах шо ми пай «зляюю с шекяори УДО, плеври Пе М гм ми Ох КЛ С фо ЛК цу ВК же
УК СЕРЕ с ДОАЖК ФК КО АТІКА МАК МІУ ЕТНЖ са Ж ДЖ ОУЕН ро вМЖТл ПК хх у пи м лу молі, Ж, : ХА дотят. охєи ХНН од Ж ию пн Ж у Шлапак
МЕ МС ІЙНЛ Ж дома Мж и Ми жк Криму хм РК КМ СК МК АК МИ сю дит пежеу
КО й ЖЖ ХО тизую слі тиву Ко т Ії Подло тах Кв ші ря о р ТЕ ію КО Ат
УТ пи ті ВМ АОС ЛА КЕ сум Ж МАК ВУД очко МАа В МАМО Х мує й СВО ХЕЇУ ни мс. а Ся ви и Ж МЛ жи шоп зи Мопиє х. 5 Ялта, пе ника ї й ОХ НЕК іме ЕХ ШетИм. п Сг жит їі "ша ЩІ ТАКОМУ «ут їх рен я киш лу Ку ст ХМІЩЕ КН ОСІ КАФ они Ка о Меи КдЖ жав потрея кое соч
Ко МІК лХ АТ паж умо Міо до КЕ а ші м Би пошту мм А ЖК ЕХ жид ОТ ДМ
ММ КТ «ШИТИ ТК КК шу ДМК п са ло МТУ ЛУМО лІшеА МТ ока ги па пе КЗ
Зп Ка й іх . ЗИ
Одно о Нв вв НИ С НН НА НН Ва но ня
ТШХ МАЮ пед МАХ ОУКЮ І ок АЖ МАТИ КЛХОИХ кл Ок ПМ, х мне пш сдодяу Жуу ШУ Му ЖЕ Мф си кг руки Ух Фж ем сжл їм и лом
Ат АЖІ ВИНО УМО СТО ЕТ ОМА СМ пт бю КУТ АПУ БЕ с АТУ АМКУ не й лУй п зам за Лео «Ох
Тож Ж то дю Мн щи Вуд Ек Дю я дж КТ х он ка они и НН Не
ЕМ леж ВЗЕМА ли ЕЕ МЕ МТ МЕ ЖИ КМ М УВА КА КВ СІК ХХ т яд ХВ: нин ни в в А НН НН в НН Я
ІУШТАЗ УЖ МІ КИМ КМКФ ТРшО ВА УМІВ дер ДОН МО ММ КМ КЕ ОК
Ах подекх яра
І І х ск шо режи А. сао по й -
ВН -3
ІМ й с
ВК вари »
Укус рий пс
Вч па . саме хни но не З я ПВ АТАК ДИ УЯВИ ЛКСЛЮТ, ау т, й ше 2 ее нин ни Кн ШЕ и На НН НН и НН На
МАТОМ сш ЛАМКОСТІ ду. МІК СК МО хі М ВКА Ух МВ ОК КА КУ ; шо вк ща х е ІВ їх тлше: фмжи о Ка дО ду Кім хода од дя Машу ин ака рю ДЖ о м
Ти АЮ КО ями ха СУК МТ Как МО ик БІ мих юку СЯ СУТ І
ХУ й КІ СК
Жага уки Томи ПТУ ни і НК НН и НО и пеню ДУ:
Масове ув пам ож де да ТК дз бер ої еу Аа тУмні муж вже вне ст др щ . КЕ 50) ре:
Чон ЖК пжии Ж в фу С Ж ду ян в ЖЕО Ко пак вм ВК я
МмЕшщО МІ КЕ ЗО КВ АНІ ух І РЕК Те Тік т МК ОСХиЖАК ти ме і В й т 3 кеш З и ба пт лм З м В пи єту уро ув Довж о Дршжж ТЕ СБ Ав УМ Ка «мн РдЬ Клуше му Ж А СЮ ТАК Ку КН Я ЕОМ ДУМИ ХА и шо ТІ І цл
ТКУ АХ У ти
Т ту Ми тя ту ОА ан х Кигуже Сльня а пою оте тлі се. Д ие РАНО ТЕ. пф мк ру ду хе му их Тофрже жтт філуєі скку Туак х о хо шжу ск ММК РОКОМ сим з АГ му А М У Ху КК ОС МВ ока СТАЖ що З 5 і у сх ери пил у в Не НЯ ке я ве АВ
Мбш чих шко У А НАМ ШКО ЕМ Мило МВ сш Б ЛЕК до пове пок вх
М Ух КЕ
При НК т хи ВХ Аа тм лу ти о доючю ти пу Дому р в КК,
МЕЖ упо АЛ АВТ ТУЮ С му М КОЛЬ АЖ ММ ТЮЛЮ ЮА ДИВ КОХ
БЕХ М Ти - он но о Не НН НН А в НА НК НН ни он
ФУ ТИМ КМ ФА КАЛУ СМТ КМ ЖІ МЕ СТЮ К ХК у и МК и М й як д хо сх З чо ток км му Ку Кв Ми При Ж и вика кн у и а С В дл ках дм атм Ли АБ Бод ВИМ ФІКК БУу ЛАЖИМ Труну: СКМ ТЖУМ ЛЮ п Оу АОУК АТХ Пл бід Прі юю м уява ВХ ни на А ди М моно ує Пк ТУ Ж сія Пе ар о ев В еко и НК в НК З НВ НА НО СНО ОН ШТ ІН МІХ, прод ТЕТ чл
ТО ие МТ я хм ке Мі ЕК Тука М Ко Ми хи щи В ке Жохуех. М Ли кА
УК Ме ху пе іа ем ОК ше Мах ит зе: й ух зе ТД шим ДО ду ВЕ жд БК В Я шк ТИМ ЗЕ КН ЯН МЕМ ОЛИВ ДК ЕМО
ЛА о : ЗИ рН в в НМ он в о НАННЯ тло фік кн
Му ом мл їли тіж Св пл и Бр мк туМ Км ем ЗУ ІдНЕ тує
Зх, Кт. ТЕ - тах У.О ХЛ п она нин и а и но о Не а НЕ ННЯ 1ТЮК Ку О рК бКтТЄ ТУК р А Ж МО МІХ ІМЛІ ОЖшЖ МООМЮ ХАЖМО ЛУК УК ДОН ОТ
Я ххх я тех кій ОЙ ххх уряди ру фо и птркуєт ЗВМ, ою нн нео НН ооо НН «Ліза млре лж ок ПЖи Бе тую ша БЕ шу Ж Па гонофжн хек Дод ли рани В : аг пхати ху люди у дк Пи ку с же ри Др пи божі Му ТТ
М Квт тик а А Ка Кр МИ ІД КЕ ДЯ тд ША ЖК ПИ
З ПКУ шує ж ди о дих де тіше Фр тт лящ жу и я уж мо А у ТТ Ку точити
Мис мито гіма МЕ бла тк хр сулюк КАСУ СА Му. КК СААВТІ АБИУЮ МАЛИ ЛЄЙВ
У КІ хо вхури Па: мо мл и кра му дин Ж прак ую р ДО Но тю
Я ХТкЕЖ они У ах ск МЛ ди Буші пам ую діжа д жияк Ох
КО и - тях тд дико ет тв Км ДИ у віт ше от дн о жи о Кі жк
МІшМК бум ву шЖУ АТ МЛМ пап оваК са АЮ бур мар оптю І Бо тусуту се Кк, - М ХОМТу Й КІаН тлом о зав вв кю т ВК фі иИ кля пд щи ку Кт іх - ти ги ви Мт. ДЖ ще та тт чи аж рун вм В, у тити ші МНЕ МОЮ еко ліш и Буме цем сш А в сиВу аку ШИ мом шх ле веж пли
За Б дл я
Ту До Мекку лю и г, ен ЛЬ вн КН нен о НН
Пуховик КУ дви шву ак піц зовн пІФ Ме пл шо МИХ
Рея про МЕ
УМ Кс пом рен нова о Не Нв Во нн и о нон ни На
ІМ ОН пу ЛІ ск уд КАМЕНІ Ж СИ КО ТК МІК ОМП СЕ ЛЬИ КІх Лад а - тац ех па ви жи
ММА ЗИ, «1 ту я Аа шли ПВ
ТОМИ АМЗИК й ем вий сиМає бр юлтку лено й й Й «алу й пе З оно о и м ПІК ооо оо че п СК в В и М ЕК и ан о ИН ШК да зашити палку умах спимо смю ЗИМІ Деу М АТЗ о пику а коу ох ле сх х ся Ко пек : м Ка печу тк ма в со мод плн лІю мк сх вд ТУ
Ед сі ХИТ ВВ МВ с ов ше ла ЕІ А КЕ КІ В в скла докт мова зримо и пов МОВО Ж новм ІК М КІ ЖІ итіик попа р дону ал завахавтасмл юкапавицМ. плечах пал уюиианй Км Бу рела или зе фо шли я Ми или ори болт код там КМ спи оси КВК ТТ
Б ЛУблхття Дб Ем: ЕЛ лати ЮК ТЕКА ВАЛА В ЗШ ОМий ШМК Мом липу кот бно плеютт шен сиди ацаа лм хашк Мети пит, МИ дах ПК ОсЕ Ех ув вв ор ПУХКИХ СТИ с КМТ ОМ УЛУХ ШМККОСЯ КИ СМОХДКУМТТЬММО КН аж дод мини них у грат Ел ужив Що ге Кк джу. с МА АК Молю п рі лив, СН
ПТМ ДК и ОКО КОД В ка Тл м ложа МІК ЦИ ДУМА М КИТ. чк
ПДК ЦК З шу сю Ту .
ЗІ, т
Ви НН : . вини я ЩЕ й и Ка хх УТІМ ли Ох тю туди З и ву мо птн шик,
УМХ ЕЛ Б ОКХ МТК ОІВ
ДОМ. Що
ТАЗ ї : ие и нь ну па о Ти а Кона о ви Я поки йе опа а нах не оо ов вн а ан ще сшспослао споваславии с севсдашахи бспозассвосз сова скаут ацихх шу п нн НН и НКИ У зисвласимт соки лесная пола саден тм их, АЛкМ се у нт Кк ж ил ту жу міх де м дв мо тво
ІКАО МІК у и шо мів пуд С МХ же ен и нн в и НН НН НН ит
ПІК ОАТОМВ Я МА пла С петлі сира емо тля я и ин вв ОН ИН и прим дич мо сигарета смт цса вистава Косик МУ сті Моз иук ди о м Кия т жи и мо ліри ху лк дз пт и кри Кр Уди
ПОЛ АЛЛЮМААХ ІС А В МІК ЕМ КІ МОДНА МЛИН ЕК КІЛІЯ ЛЕ п нн в В НН ННЯ Али
МЕТА ТИ АКТИ КУ ФЛ Ви Іов ІНК ВИ ПТ У пи и ми ЖИ смугу пшениці утри рин и ит подо алла «нНфихолиМи ча ионх дИхщлавиви апиканайяии ІСІ пи яд що «МКМ ще пащі що СЕ итж шк ВЕЖ Мам дити уки ЕМ ме р вити и поВлі
МЕКСИКИ ТАХУВЮ СЛІДИ УА тки Сонати СЕ У ДИКУ спо
ЕТИКИ я ІВ в КІ С ВОК М дик т пра дя кн пу ме пи доми, ща
ОЕМ В ММ У КЕ ПЛАТИВ ав МИСАК ЗОМ ХІВАІА І ЗОМ ННИД ТА ВИХ ти
Ул ати хи ур ежи суді ха р ери фе КК В п й пацан Тим ой парта слище сера цим сама же етжсудті дути нед ІК дили др кв А хи сут В ЕК у и др Ех
ИН о ОТО Ж КА ВЕН ОДУ ЗОБІ Ор КО ОХ ДІКА т
Б на но А А шити у Ж ри Ки зику В р мину ши пимунвеМІАнОВО КОЛІ жлНуух см Алея ар М ТІЛА МВ СКК юки уми Мох ро ки тик т ди с п мови ІМ дм си МЕ хоп У ашичвовов Болі лечш спамазаксва «сла атом здана сля запаска два ее п ЕК ви фа и поточ Куй іме ВИМОВІ вишки купу и ВАК, сиг паща лю КУЛЕМЕТА ДЕК СЛУ ПОЛІ ТОМ ИСТУ СТИ КИМ МИ ККД, ПА поуМмтІмуці ВІ оса суду уч са им гм МК щи мури СЕ пастила ся пса висах суавеосанеа пет лена ую х ПАМ зей Кора ОБО и жи рову кизил ит ІА тасашасяша пуп гуютн. со Клео хо ВЗ КІ Я ПУЕ ІВ ШИЛО Ал
МКМ аиЛ МД ЛІД ЛИ ММ ШАХТ МЛ МТУ БД ВАРКИ о и «ОЗ ІКи ВЕ пиж ов КА
ХУ Ж
ОК НЄ шк шик уки опи ких тк В ее пали опишу лоти ре То
Іти й - и он НН я ши
ЕМ КИ ВІ ТКА КО, МІНА ЛЮ В ЕІ ХУ. МІК ІК КОЛА МЕ ЕМЕ ККУ по котик покохав пад папи пи Кісь цовщих г у пед валом сивина ших лша ОВК ЛИХ СМТ ЗЕ ІЛ шк он в и НН НН КН НИ ів
ОЦТУ Дж Ни ик ЕК ІМ ПОЛІВТИ Й УМЕІЛОТЛІУЛИШІДІВ ОПЛОТ ТММ ПЕС АЖ КІ Ж ШОК тою усу сук Авт Метки Ж молю КО В КЕ МК шк
Шпік Доу ІІ Вас Ма ТОМА СХІВ ДВ М ОТ ТЛ ТИ: ЗУ мо в НА НН труд паж хр Е КЕ ХІІ ШИХ ХО ИН ОК КИ КОМУ ТМИ ОСТУХАМТ В АТО
Мини нн о і НН в НИ Я чи попе Ковазе досто стаз авцв поса шпора плоттю ду пе папойоанва хвЦеКкОвття оохдавивих вваетстов СБ Я рез слу зе и ди д ще шлю В М КТК вин ий
ШИМИ МН Же ТК МЖК СУТ МТК КТК ЖЕ ЗМК МКК ЕЕ м МИ С МАК КК КК М МУК М. СМ ЖЕ КОКО КК, тка спи В или и сим ша ши ит а ВА печу сумки Зпаспосадшо постава липи сов осаа ТК дзчгсВитй п сопнах кое петаавнех зажили Меси ши здєзисиках позна лошата спеки нА певлазавея соипандлоха Б пору вача диван твоя СВКТВОВаий: дили ст на ТИЙ асптжецтла шавтанасюсу вссавсрє севжхсясах авХЄеае патрюмтатві ях ЩЕ лав вима ТООТКТАНХ пЕпивах «итлаатсь шашок Ву аг звлялшахт трап утьачтт пишеш Ж ккуєак пса як слава За зшишвивнис Завсквасах пазами заоазаксиа пеки кована Іо плслсплиств заплави ши совасвт слава волос са иМ и ми їпхЗ
Зеделискяь хдвасавосо веесеварв «ваза вес ЗИ еКї ку пост с сясзаваней авт євсає опа смаз паза виє акодавахоа ее птаство ев аКоєс паля спосо та сват дакосвантита їт12о лаквакстиа пакшейснох дсосивакав зипесалуаа сист ашкиалАл Ушло
ПЕ дних аз пава садили велася авх виклик пит їх5х п А НН НН ня тах
ХТО ЮХКМ КО КЕ ОЦ КОН. КК а КЕНІЯ ЩО, ДАК ТАНКА ШЕ СНАУ КО авоакеалелав скине падав оувая капи чис во їжа
Еш МУОМЕ скостневя спатафсаасссстасававоу занесли воеавеистй Бе я бува свеу пек Еккрва косвочакач саоаасанеа Вксставечк спав ВашО всатнвавою ЗВоашиОх сувесакцве слакхкстана ваавиов ак вав ВЖИ ща аспосаадцох сесазуекис квесонунсс есе с совзуденсиа чен свопош кеш падала ато пиподЗощов пазтаваєсо заеоосося аск етею копа ТЕВО сакдеснияе песгованиау шхисовосювоа авековомвзе. лота мо шара 1725 вів вою малят прали савимавтонх МЛ СЕК Вал р Я ЕК ВБІК кону ве шт пил т шкі у Вих шт пари ро ЕЕ ШИ Кох под
УМА пи КО ТОН З АЗІАТКИ БЕК ТИ С КД КАК МО СТИКУ НІК зіеатесвоо вавечаситл вазон салати заклейте юка пи
Кисасасавоа пекан Есе Кава сиа шли на Зоя ІТНЕ вплвистнит Вонупвитев вжудесезах завбуанскх ахазавеуая ккал кяня : шик ння пли пвчоиниві шийна вп вопо шоп уства ж апа вснитлишнт сипати в у: радян прогинання ХАЙ шале ЛВ МАУ Ж ДИВ рми МІД ТІ КОДИ. МОДНКО МКУ ПУ ТИХ А ЛЖУ зле ко писк вавВсцЕ ксвашноєтй сиатасаси зпзатосвееа аляменакнх шко зпечЧазоскУє Зір сствЕс бачка оссекггеаєе «сеузпенанйяенва волалвлєое ОЗ о сСвллітео ягавічасуа чісвлеки гази ва косвичаноо сопе ша0о

Claims (19)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Трансгенна рослина кукурудзи, що продукує білок СтуЗз4АБІ1, білок Стуз5АБІ і інсектицидний білок СгтузАа, де зазначений білок Стгуз5АбБІ1 має послідовність, що складається з ЗЕО ІЮ МО: 4, зазначений інсектицидний білок СтузАа має послідовність, що складається з 5ЕО ІЮО МО: 1, і зазначений білок Сту3З4АБІ має послідовність, що складається з ЗЕО ІЮ МО: 3, де комбінація білка Стгу34АБІ, білка СгузБАБІ і інсектицидного білка СтузАа є ефективною проти кукурудзяного кореневого жука в кишечнику кукурудзяного кореневого жука, і де білок СтузБАбБІ1 і білок СтузАа мають різні сайти зв'язування в кишечнику кукурудзяного кореневого жука.
2. Насінина зазначеної рослини кукурудзи за п. 1, де зазначена насінина містить зазначену ДНК, яка кодує зазначений білок СгуЗ4АБІ, зазначений білок СтузЗз5АбБІ1 і зазначений інсектицидний білок СгузАа.
3. Множина трансгенних рослин кукурудзи за п. 1, яка додатково містить резервні рослини, які не містять білки Ві., де зазначені резервні рослини складають менше ніж 40 95 зазначеної множини рослин.
4. Множина трансгенних рослин кукурудзи за п. 3, де зазначені резервні рослини складають менше ніж 30 95 всіх сільськогосподарських рослин зазначеної множини рослин.
5. Множина трансгенних рослин кукурудзи за п. 3, де зазначені резервні рослини складають менше ніж 20 95 всіх сільськогосподарських рослин зазначеної множини рослин.
6. Множина трансгенних рослин кукурудзи за п. 3, де зазначені резервні рослини складають менше ніж 10 95 всіх сільськогосподарських рослин зазначеної множини рослин.
7. Множина трансгенних рослин кукурудзи за п. З, де зазначені резервні рослини складають менше ніж 5 9о всіх сільськогосподарських рослин зазначеної множини рослин.
8. Множина трансгенних рослин кукурудзи за п. 3, де зазначені резервні рослини розташовані блоками або смугами.
9. Суміш трансгенного насіння кукурудзи, яка містить резервне насіння від резервних рослин, що не містять білки В.Ї., і множину насіння за п. 2, де зазначене насіння містить зазначену ДНК, Зо яка кодує зазначений білок СтуЗ4АБІ1, зазначений білок Стуз5АБІ і зазначений інсектицидний білок СтузАа, де зазначене резервне насіння складає менше ніж 40 95 усього насіння у суміші.
10. Суміш трансгенного насіння кукурудзи за п. 9, де зазначене резервне насіння складає менше ніж 30 95 усього насіння у суміші.
11. Суміш трансгенного насіння кукурудзи за п. 9, де зазначене резервне насіння складає менше ніж 20 95 усього насіння у суміші.
12. Суміш трансгенного насіння за п. 9, де зазначене резервне насіння складає менше ніж 10 90 усього насіння у суміші.
13. Суміш трансгенного насіння кукурудзи за п. 9, де зазначене резервне насіння складає менше ніж 5 95 усього насіння у суміші.
14. Множина насіння трансгенної рослини кукурудзи за п. 2, де вказана множина міститься в мішку або контейнері насіння і не містить резервного насіння, де зазначене насіння містить вказану ДНК, яка кодує вказаний білок Стгту34АБІ, указаний білок СтузБАрі і вказаний інсектицидний білок Стузда.
15. Спосіб керування розвитком стійкості до білка Сгу у кукурудзяного кореневого жука, який включає стадію, на якій висівають насіння за будь-яким з пунктів 9-13 для одержання множини рослин за пп. 3-7, і стадію, на якій контактують кукурудзяного кореневого жука із зазначеною множиною трансгенних рослин кукурудзи.
16. Множина трансгенних рослин кукурудзи за будь-яким з пп. 3-8, де зазначені трансгенні рослини кукурудзи займають більше ніж 10 акрів (40,5 га).
17. Трансгенна рослина кукурудзи за п. 1, де зазначена трансгенна рослина кукурудзи являє собою рослину маїсу.
18. Рослинна клітина трансгенної рослини кукурудзи за п. 1, де зазначений білок Стуз5АБІ1 щонайменше на 95 95 ідентичний послідовності, яка складається з БЕО ІЮО МО: 4, зазначений інсектицидний білок СтузАа щонайменше на 95 95 ідентичний послідовності, що складається з ЗЕО ІЮ МО: 1, і зазначений білок Стуз4АБ1 щонайменше на 95 95 ідентичний 5ЕО ІЮ МО: 3.
19. Спосіб одержання рослинної клітини трансгенної рослини кукурудзи за п. 18, який включає трансформацію рослинної клітини трансгенної рослини кукурудзи ДНК, яка кодує інсектицидний білок СтузАа, ДНК, яка кодує білок СтуЗ4АБТ, і ДНК, яка кодує білок Стуз5АБІ1. З ав у ! о г : днк «о ЗНИКНЕ зи МиаННя БЖ зв - 8 ; ан ск З Х ле НеСПЕЦеФУВІО З Язунання я ня (ве ії скаже по тд х ех . с ї що ци фІчН ни кЗуВантяь З 3 4 я З : Ол лев жиуаАВЯ ін) : в Ї В р з ве і і х їх й те Зауалюве лі яЗунання « д ва т Шин «ве респезвфниве пе лука вя в, в 35 вв т тю ВрІНе ЗИ ЯЗуНЕННЯ тн п й ЕС х дом ВВ Я ВК стВосяВ й п : т рдтухда (МІ вне фік яз по яю и, - шо А (З в а нн об шо вх кю ХА
Е У. ви КТ ненннсь о син ! й пе о Е У ОМ УМИ то й ВО ак що | пд у А ОА . В в Пе м х - йо 5 ож 03 10 3210 ЗЕ 400 до: чюб Конкурене (НМ : Фіг З
UAA201213336A 2010-04-23 2011-04-22 ТРАНСГЕННА РОСЛИНА КУКУРУДЗИ, ЯКА ПРОДУКУЄ БІЛКИ Cry34Ab1, Cry35Ab1 і Cry3Aa ДЛЯ ЗАПОБІГАННЯ РОЗВИТКУ СТІЙКОСТІ У КУКУРУДЗЯНОГО КОРЕНЕВОГО ЖУКА UA116081C2 (uk)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US32724010P 2010-04-23 2010-04-23
US38827310P 2010-09-30 2010-09-30
US201161476005P 2011-04-15 2011-04-15
US201161477447P 2011-04-20 2011-04-20
PCT/US2011/033617 WO2011133891A1 (en) 2010-04-23 2011-04-22 Combinations including cry34ab/35ab and cry3aa proteins to prevent development of resistance in corn rootworms (diabrotica spp.)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA116081C2 true UA116081C2 (uk) 2018-02-12

Family

ID=44834532

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201213338A UA112516C2 (uk) 2010-04-23 2011-04-22 ТРАНСГЕННА РОСЛИНА, ЯКА ПРОДУКУЄ БІЛОК Сry34Ab1, БІЛОК Сry35Ab1 І ІНСЕКТИЦИДНИЙ БІЛОК Сry3Ba1, ДЛЯ ЗАПОБІГАННЯ РОЗВИТКУ СТІЙКОСТІ В КУКУРУДЗЯНИХ КОРЕНЕВИХ ЖУКІВ (Diabrotica spp.)
UAA201213337A UA116612C2 (uk) 2010-04-23 2011-04-22 ТРАНСГЕННА РОСЛИНА КУКУРУДЗИ, ЯКА ПРОДУКУЄ БІЛКИ Cry34Ab1, Cry35Ab1 І Cry6Aa1 ДЛЯ ЗАПОБІГАННЯ РОЗВИТКУ СТІЙКОСТІ У КУКУРУДЗЯНОГО КОРЕНЕВОГО ЖУКА (Diabrotica spp.)
UAA201213336A UA116081C2 (uk) 2010-04-23 2011-04-22 ТРАНСГЕННА РОСЛИНА КУКУРУДЗИ, ЯКА ПРОДУКУЄ БІЛКИ Cry34Ab1, Cry35Ab1 і Cry3Aa ДЛЯ ЗАПОБІГАННЯ РОЗВИТКУ СТІЙКОСТІ У КУКУРУДЗЯНОГО КОРЕНЕВОГО ЖУКА

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201213338A UA112516C2 (uk) 2010-04-23 2011-04-22 ТРАНСГЕННА РОСЛИНА, ЯКА ПРОДУКУЄ БІЛОК Сry34Ab1, БІЛОК Сry35Ab1 І ІНСЕКТИЦИДНИЙ БІЛОК Сry3Ba1, ДЛЯ ЗАПОБІГАННЯ РОЗВИТКУ СТІЙКОСТІ В КУКУРУДЗЯНИХ КОРЕНЕВИХ ЖУКІВ (Diabrotica spp.)
UAA201213337A UA116612C2 (uk) 2010-04-23 2011-04-22 ТРАНСГЕННА РОСЛИНА КУКУРУДЗИ, ЯКА ПРОДУКУЄ БІЛКИ Cry34Ab1, Cry35Ab1 І Cry6Aa1 ДЛЯ ЗАПОБІГАННЯ РОЗВИТКУ СТІЙКОСТІ У КУКУРУДЗЯНОГО КОРЕНЕВОГО ЖУКА (Diabrotica spp.)

Country Status (20)

Country Link
US (5) US20130180016A1 (uk)
EP (5) EP2560476B1 (uk)
JP (4) JP5922099B2 (uk)
KR (4) KR101842726B1 (uk)
CN (5) CN105830932A (uk)
AR (4) AR081284A1 (uk)
AU (4) AU2011242578B2 (uk)
BR (4) BR112012027218A2 (uk)
CA (4) CA2796758A1 (uk)
CL (3) CL2012002963A1 (uk)
CO (4) CO6592036A2 (uk)
ES (1) ES2665514T3 (uk)
IL (4) IL222583A (uk)
MA (4) MA34239B1 (uk)
MX (3) MX2012012368A (uk)
NZ (4) NZ603564A (uk)
RU (4) RU2582262C2 (uk)
UA (3) UA112516C2 (uk)
WO (4) WO2011133896A1 (uk)
ZA (3) ZA201208639B (uk)

Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103125516B (zh) * 2011-11-24 2014-12-17 华中农业大学 对南方根结线虫具有杀虫增效作用的蛋白组合物Cry6Aa/Cry55Aa及应用
US10968446B2 (en) 2012-11-01 2021-04-06 Massachusetts Institute Of Technology Directed evolution of synthetic gene cluster
CN106232820A (zh) 2013-08-16 2016-12-14 先锋国际良种公司 杀昆虫蛋白及其使用方法
ES2937045T3 (es) 2013-09-13 2023-03-23 Pioneer Hi Bred Int Proteínas insecticidas y métodos para su uso
AR097995A1 (es) * 2013-10-14 2016-04-27 Syngenta Participations Ag Método para sembrar filas de cultivos
BR102014031844A2 (pt) 2013-12-20 2015-10-06 Dow Agrosciences Llc ras oposto (rop) e moléculas de ácido nucleico relacionadas que conferem resistência a pragas de coleópteros e hemípteros
RU2016129435A (ru) 2013-12-20 2018-01-25 ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи Молекулы нуклеиновой кислоты phkп ii-140, которые придают устойчивость к жестококрылым насекомым-вредителям
RU2021113662A (ru) 2014-02-07 2021-05-31 Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. Инсектицидные белки и способы их применения
US10480007B2 (en) 2014-02-07 2019-11-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins from plants
UY36113A (es) 2014-05-07 2015-10-30 Dow Agrosciences Llc Moléculas de ácido nucleico dre4 que confieren resistencia a plagas de coleópteros
WO2016000237A1 (en) 2014-07-03 2016-01-07 Pioneer Overseas Corporation Plants having enhanced tolerance to insect pests and related constructs and methods involving insect tolerance genes
UA126192C2 (uk) 2014-10-16 2022-08-31 Піонір Хай-Бред Інтернешнл, Інк. Інсектицидний білок та спосіб його застосування
US10889837B2 (en) 2014-11-24 2021-01-12 Poet Research, Inc. Corn blends that include high oil corn and methods of making one or more biochemicals using high oil corn or corn blends that include high oil corn
MX2017011525A (es) 2015-03-11 2018-01-30 Pioneer Hi Bred Int Combinaciones insecticidas de pip-72 y metodos de uso.
CA2985198A1 (en) 2015-05-19 2016-11-24 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
CA2986265A1 (en) 2015-06-16 2016-12-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
EP3322679A4 (en) 2015-07-13 2019-07-10 Pivot Bio, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR IMPROVING THE CHARACTERISTICS OF A PLANT
AU2016297195A1 (en) * 2015-07-23 2018-02-01 Monsanto Technology Llc Multi functional toxins
CA2994676A1 (en) 2015-08-06 2017-02-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant derived insecticidal proteins and methods for their use
WO2017030843A1 (en) 2015-08-17 2017-02-23 Dow Agrosciences Llc Engineered cry6a insecticidal proteins
US11479516B2 (en) 2015-10-05 2022-10-25 Massachusetts Institute Of Technology Nitrogen fixation using refactored NIF clusters
CA3002995A1 (en) 2015-12-18 2017-06-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
CN105506081A (zh) * 2015-12-26 2016-04-20 吉林省农业科学院 转基因植物中cry35Ab基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法
CN105483240A (zh) * 2015-12-26 2016-04-13 吉林省农业科学院 转基因植物中cry34Ab基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法
CA3021391A1 (en) 2016-04-19 2017-10-26 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal combinations of polypeptides having improved activity spectrum and uses thereof
EP3960863A1 (en) 2016-05-04 2022-03-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
US20190185867A1 (en) 2016-06-16 2019-06-20 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
EP3475430B1 (en) 2016-06-24 2022-06-01 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant regulatory elements and methods of use thereof
EP3954202A1 (en) 2016-07-01 2022-02-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins from plants and methods for their use
US20210292778A1 (en) 2016-07-12 2021-09-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
JP7234116B2 (ja) 2017-01-12 2023-03-07 ピボット バイオ， インコーポレイテッド 植物形質を改善するための方法および組成物
WO2018148001A1 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Pioneer Hi-Bred International Inc Insecticidal combinations of plant derived insecticidal proteins and methods for their use
BR112019019892A2 (pt) * 2017-04-03 2020-04-22 Monsanto Technology Llc proteínas inibidoras de inseto".
US20200165626A1 (en) 2017-10-13 2020-05-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Virus-induced gene silencing technology for insect control in maize
WO2019084059A2 (en) 2017-10-25 2019-05-02 Pivot Bio, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR ENHANCING GENETICALLY MODIFIED MICROBES THAT FIX NITROGEN
WO2019165245A1 (en) 2018-02-22 2019-08-29 Zymergen Inc. Method for creating a genomic library enriched for bacillus and identification of novel cry toxins
CN111770995A (zh) 2018-03-02 2020-10-13 齐默尔根公司 杀昆虫蛋白发现平台和自其发现的杀昆虫蛋白
WO2019178042A1 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins from plants and methods for their use
EP3764796A4 (en) 2018-03-14 2021-12-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. INSECTICIDAL PROTEINS FROM PLANTS AND METHOD OF USING THEM
CA3096516A1 (en) 2018-05-22 2019-11-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant regulatory elements and methods of use thereof
BR112020026771A2 (pt) 2018-06-27 2021-03-30 Pivot Bio, Inc. Composições agrícolas que compreendem micróbios de fixação de nitrogênio remodelados
CN112438198A (zh) * 2019-08-30 2021-03-05 中国农业大学 利用杂交不亲和基因在制备抗虫转基因玉米庇护所中的应用
WO2021221690A1 (en) 2020-05-01 2021-11-04 Pivot Bio, Inc. Modified bacterial strains for improved fixation of nitrogen
CA3172322A1 (en) 2020-05-01 2021-11-04 Karsten TEMME Modified bacterial strains for improved fixation of nitrogen
CN111574599B (zh) * 2020-05-18 2022-10-28 福建农林大学 一种解决杀虫毒素被昆虫肠道消化酶过度酶解的毒素改造方法
US20230235352A1 (en) 2020-07-14 2023-07-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
CN112063748A (zh) * 2020-10-13 2020-12-11 中国农业科学院生物技术研究所 用于检测转基因玉米g1105e-823c的rpa引物探针组合、试剂盒及检测方法
MX2024000026A (es) 2021-07-02 2024-02-20 Pivot Bio Inc Cepas bacterianas dise?adas por ingenieria genetica para fijacion de nitrogeno mejorada.
CN115029369B (zh) * 2022-06-01 2023-04-21 中国林业科学研究院森林生态环境与自然保护研究所 一种防治松材线虫病的苏云金芽孢杆菌工程菌制备方法与应用

Family Cites Families (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1558396A (en) * 1923-11-08 1925-10-20 Roehrs Rudolph Lienau Grass-seed container
US4762785A (en) 1982-08-12 1988-08-09 Calgene, Inc. Novel method and compositions for introducting alien DNA in vivo
ATE52800T1 (de) 1983-01-13 1990-06-15 Max Planck Gesellschaft Verfahren zum einbringen von expressionsfaehigen genen in pflanzenzellgenome und hybride ti plasmidvektoren enthaltende agrobacterium-staemme verwendbar in diesem verfahren.
WO1984002919A1 (en) 1983-01-17 1984-08-02 Monsanto Co Plasmids for transforming plant cells
NL8300698A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
NL8300699A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; werkwijze voor het produceren van agrobacterium tumefaciens bacterien; stabiele cointegraat plasmiden; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
US5380831A (en) 1986-04-04 1995-01-10 Mycogen Plant Science, Inc. Synthetic insecticidal crystal protein gene
NL8401048A (nl) 1984-04-03 1985-11-01 Rijksuniversiteit Leiden En Pr Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van eenzaadlobbige planten.
US5231019A (en) 1984-05-11 1993-07-27 Ciba-Geigy Corporation Transformation of hereditary material of plants
US5149645A (en) 1984-06-04 1992-09-22 Rijksuniversiteit Leiden Process for introducing foreign DNA into the genome of plants
NL8401780A (nl) 1984-06-04 1986-01-02 Rijksuniversiteit Leiden En Pr Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van planten.
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
EP0265502A1 (en) 1986-04-30 1988-05-04 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Electric field mediated dna transformation of plant cells and organelles
US5188958A (en) 1986-05-29 1993-02-23 Calgene, Inc. Transformation and foreign gene expression in brassica species
US5177010A (en) 1986-06-30 1993-01-05 University Of Toledo Process for transforming corn and the products thereof
EP0267159A3 (de) 1986-11-07 1990-05-02 Ciba-Geigy Ag Verfahren zur genetischen Modifikation monokotyler Pflanzen
SE455438B (sv) 1986-11-24 1988-07-11 Aga Ab Sett att senka en brennares flamtemperatur samt brennare med munstycken for oxygen resp brensle
US5004863B2 (en) 1986-12-03 2000-10-17 Agracetus Genetic engineering of cotton plants and lines
ES2074999T3 (es) 1987-05-20 1995-10-01 Ciba Geigy Ag Plantas de zea mays y plantas de zea mays transgenicas regeneradas de protoplastos o celulas derivadas de protoplastos.
US5753492A (en) * 1987-08-12 1998-05-19 Mycogen Corporation Genes encoding nematode-active toxins from Bacillus thuringiensis strains
US5302523A (en) 1989-06-21 1994-04-12 Zeneca Limited Transformation of plant cells
US5141131A (en) 1989-06-30 1992-08-25 Dowelanco Method and apparatus for the acceleration of a propellable matter
CA2096843C (en) 1990-11-23 2007-08-07 Kathleen D'halluin Process for transforming monocotyledonous plants
US5384253A (en) 1990-12-28 1995-01-24 Dekalb Genetics Corporation Genetic transformation of maize cells by electroporation of cells pretreated with pectin degrading enzymes
WO1993016094A2 (en) 1992-02-12 1993-08-19 Chromagen, Inc. Applications of fluorescent n-nucleosides and fluorescent structural analogs of n-nucleosides
JPH07505531A (ja) 1992-04-15 1995-06-22 プラント・ジェネティック・システムズ・エヌ・ブイ 単子葉植物細胞の形質転換法
WO1994000977A1 (en) 1992-07-07 1994-01-20 Japan Tobacco Inc. Method of transforming monocotyledon
US5469976A (en) 1993-04-30 1995-11-28 Burchell; James R. Shelf allocation and management system
EP0627752B1 (en) 1993-06-04 1997-07-23 CAVIS S.r.l. An inertia device for interrupting the electrical circuit of a vehicle with an internal combustion engine
GB9318207D0 (en) * 1993-09-02 1993-10-20 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
US6372480B1 (en) 1996-04-19 2002-04-16 Mycogen Corporation Pesticidal proteins
US6083499A (en) 1996-04-19 2000-07-04 Mycogen Corporation Pesticidal toxins
US5874288A (en) * 1997-07-31 1999-02-23 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis toxins with improved activity
US6218188B1 (en) 1997-11-12 2001-04-17 Mycogen Corporation Plant-optimized genes encoding pesticidal toxins
US6060594A (en) * 1997-12-18 2000-05-09 Ecogen, Inc. Nucleic acid segments encoding modified bacillus thuringiensis coleopteran-toxic crystal proteins
US6023013A (en) * 1997-12-18 2000-02-08 Monsanto Company Insect-resistant transgenic plants
DE19825333A1 (de) * 1998-06-05 1999-12-09 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Verfahren zur Kontrolle von Schadorganismen in Nutzpflanzen
CZ20013894A3 (cs) 1999-05-04 2002-04-17 Monsanto Technology Llc Polypeptidové kompozice toxické pro hmyz z řádu Coleoptera a transgenní rostliny rezistentní proti hmyzu
US6501009B1 (en) * 1999-08-19 2002-12-31 Monsanto Technology Llc Expression of Cry3B insecticidal protein in plants
AR025349A1 (es) 1999-08-23 2002-11-20 Mycogen Corp Metodos para controlar las plagas del gusano gris
CN1338262A (zh) * 2000-08-11 2002-03-06 张泽国 复方乌头膏及其制备方法
US6551962B1 (en) * 2000-10-06 2003-04-22 Monsanto Technology Llc Method for deploying a transgenic refuge
US7230167B2 (en) * 2001-08-31 2007-06-12 Syngenta Participations Ag Modified Cry3A toxins and nucleic acid sequences coding therefor
US20040210964A1 (en) * 2003-02-20 2004-10-21 Athenix Corporation AXMI-009, a delta-endotoxin gene and methods for its use
CA2521235A1 (en) * 2003-04-04 2004-10-14 Syngenta Limited Improved method of resistance management for transgenic crops
US7524810B1 (en) 2003-10-03 2009-04-28 Dow Agrosciences Llc Modified Cry34 proteins
US7309785B1 (en) 2003-10-03 2007-12-18 Dow Agrosciences Llc Modified chimeric Cry35 proteins
US20050183161A1 (en) * 2003-10-14 2005-08-18 Athenix Corporation AXMI-010, a delta-endotoxin gene and methods for its use
JP5028551B2 (ja) 2003-11-21 2012-09-19 フェネックス インコーポレイテッド Ｓｅｃ系分泌によって改良された発現系
WO2005094340A2 (en) * 2004-03-29 2005-10-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method of reducing insect resistant pests in transgenic crops
ES2435247T5 (es) 2004-04-30 2017-04-25 Dow Agrosciences, Llc Nuevo gen de resistencia a los herbicidas
US7985892B1 (en) * 2004-06-29 2011-07-26 Dow Agrosciences Llc Truncated Cry35 proteins
CN101257792A (zh) * 2005-07-08 2008-09-03 赫希玛有限公司 植物病原体的管理
CA2620862A1 (en) * 2005-08-30 2007-03-08 Phyllom Llc Insect resistant transgenic turf grass
JP5155869B2 (ja) 2005-10-28 2013-03-06 ダウ アグロサイエンシズ リミテッド ライアビリティー カンパニー 除草剤抵抗性遺伝子
US8569015B2 (en) 2006-05-30 2013-10-29 Pfenex Inc. RPA optimization
CN200985135Y (zh) * 2006-12-20 2007-12-05 贵州省烟草科学研究所 细粒种子袋
US20100022390A1 (en) * 2006-12-22 2010-01-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Resistance management strategy
KR101491867B1 (ko) 2007-01-31 2015-02-10 피페넥스 인크. 증가된 발현을 위한 박테리아 리더 서열
CA2682227C (en) * 2007-03-28 2017-09-05 Syngenta Participations Ag Insecticidal proteins
US20080256669A1 (en) * 2007-04-16 2008-10-16 Monsanto Company Plants with Multiple Transgenes on a Chromosome
MX2010001669A (es) * 2007-08-10 2010-03-15 Univ Georgia Fragmentos novedosos de caderina de insectos.
WO2009132850A1 (en) * 2008-05-01 2009-11-05 Bayer Bioscience N.V. Armyworm insect resistance management in transgenic plants
US20090300980A1 (en) * 2008-05-02 2009-12-10 Dow Agrosciences Llc Corn with transgenic insect protection traits utilized in combination with drought tolerance and/or reduced inputs particularly fertilizer

Also Published As

Publication number Publication date
CN102970862A (zh) 2013-03-13
EP2560476A1 (en) 2013-02-27
BR112012027140A2 (pt) 2015-09-22
EP2560475A4 (en) 2013-10-23
MX2012012371A (es) 2014-02-27
BR112012027139A2 (pt) 2015-09-22
NZ603556A (en) 2014-11-28
RU2582262C2 (ru) 2016-04-20
JP2013533730A (ja) 2013-08-29
ZA201208640B (en) 2014-01-29
RU2012149847A (ru) 2014-05-27
IL222581A0 (en) 2012-12-31
NZ603564A (en) 2014-12-24
IL222582A0 (en) 2012-12-31
WO2011133895A1 (en) 2011-10-27
CO6592014A2 (es) 2013-01-02
EP2560476A4 (en) 2013-10-23
CO6592035A2 (es) 2013-01-02
AU2011242579A1 (en) 2012-12-06
US20130167269A1 (en) 2013-06-27
CN102970862B (zh) 2016-03-30
ES2665514T3 (es) 2018-04-26
UA112516C2 (uk) 2016-09-26
CL2012002963A1 (es) 2013-03-08
JP2013531972A (ja) 2013-08-15
KR20130089147A (ko) 2013-08-09
CA2796728A1 (en) 2011-10-27
EP2560478A1 (en) 2013-02-27
AU2011242578B2 (en) 2016-04-21
NZ603561A (en) 2015-06-26
MA34240B1 (fr) 2013-05-02
IL222583A (en) 2016-07-31
MX2012012369A (es) 2013-03-05
US20130263331A1 (en) 2013-10-03
CA2796727A1 (en) 2011-10-27
JP5922099B2 (ja) 2016-05-24
CA2796758A1 (en) 2011-10-27
US20130167268A1 (en) 2013-06-27
ZA201208638B (en) 2014-01-29
EP2560475A1 (en) 2013-02-27
KR101842725B1 (ko) 2018-03-27
RU2012149845A (ru) 2014-05-27
MX2012012368A (es) 2013-03-05
KR20130089146A (ko) 2013-08-09
WO2011133891A1 (en) 2011-10-27
CN103108540A (zh) 2013-05-15
CN102946717A (zh) 2013-02-27
KR101845097B1 (ko) 2018-05-18
IL222582A (en) 2016-07-31
EP2560477B1 (en) 2018-01-24
AU2011242490A1 (en) 2012-12-06
EP2560476B1 (en) 2017-12-13
MA34238B1 (fr) 2013-05-02
AU2011242579B2 (en) 2016-04-21
EP2560477A1 (en) 2013-02-27
CL2012002962A1 (es) 2013-01-25
UA116612C2 (uk) 2018-04-25
US20190203224A1 (en) 2019-07-04
AU2011242582B2 (en) 2015-09-17
JP2013540418A (ja) 2013-11-07
AU2011242582A1 (en) 2012-12-06
MA34242B1 (fr) 2013-05-02
IL222584A0 (en) 2012-12-31
KR20130051953A (ko) 2013-05-21
IL222583A0 (en) 2012-12-31
JP5922100B2 (ja) 2016-05-24
RU2591519C2 (ru) 2016-07-20
EP2560475B1 (en) 2018-02-14
CO6592036A2 (es) 2013-01-02
US20130180016A1 (en) 2013-07-11
BR112012027208A2 (pt) 2015-09-15
EP2560478A4 (en) 2013-12-04
AU2011242578A1 (en) 2012-12-06
RU2576005C2 (ru) 2016-02-27
AU2011242490B2 (en) 2014-11-06
AR081334A1 (es) 2012-08-08
KR20130051952A (ko) 2013-05-21
CN102946716B (zh) 2015-09-16
AR081284A1 (es) 2012-08-01
CO6592013A2 (es) 2013-01-02
US9796983B2 (en) 2017-10-24
JP2013528365A (ja) 2013-07-11
RU2012149849A (ru) 2014-05-27
AR081137A1 (es) 2012-06-27
IL222584A (en) 2016-11-30
JP5922646B2 (ja) 2016-05-24
NZ603555A (en) 2014-11-28
WO2011133892A1 (en) 2011-10-27
MA34239B1 (fr) 2013-05-02
ZA201208639B (en) 2014-01-29
CN102946716A (zh) 2013-02-27
WO2011133896A1 (en) 2011-10-27
RU2582249C2 (ru) 2016-04-20
EP2560478B1 (en) 2018-02-14
RU2012149846A (ru) 2014-05-27
CL2012002965A1 (es) 2013-04-01
CN105830932A (zh) 2016-08-10
IL222581A (en) 2017-03-30
AR081136A1 (es) 2012-06-27
EP3366118A1 (en) 2018-08-29
EP2560477A4 (en) 2013-10-16
CA2796730A1 (en) 2011-10-27
KR101842724B1 (ko) 2018-03-27
KR101842726B1 (ko) 2018-03-27
JP5922098B2 (ja) 2016-05-24
BR112012027218A2 (pt) 2015-09-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA116081C2 (uk) ТРАНСГЕННА РОСЛИНА КУКУРУДЗИ, ЯКА ПРОДУКУЄ БІЛКИ Cry34Ab1, Cry35Ab1 і Cry3Aa ДЛЯ ЗАПОБІГАННЯ РОЗВИТКУ СТІЙКОСТІ У КУКУРУДЗЯНОГО КОРЕНЕВОГО ЖУКА
UA120608C2 (uk) Очищений поліпептид ptip-83 та спосіб його застосування
UA126544C2 (uk) Рекомбінантний полінуклеотид, що кодує інсектицидний поліпептид, та спосіб його застосування
UA120598C2 (uk) Днк-конструкція та спосіб її застосування
UA111710C2 (uk) ЗАСТОСУВАННЯ Cry1Da В СПОЛУЧЕННІ З Cry1Be ДЛЯ ЗАПОБІГАННЯ РОЗВИТКУ СТІЙКОСТІ В КОМАХ
UA111935C2 (uk) ТРАНСГЕННА РОСЛИНА, ЯКА МІСТИТЬ ДНК, ЩО КОДУЄ ІНСЕКТИЦИДНИЙ БІЛОК Cry1Ab, І ДНК, ЩО КОДУЄ ІНСЕКТИЦИДНИЙ БІЛОК Cry1Be, ДЛЯ КЕРУВАННЯ РЕЗИСТЕНТНІСТЮ КОМАХ
UA126192C2 (uk) Інсектицидний білок та спосіб його застосування
UA125683C2 (uk) Інсектицидний білок, який є токсичним для лускокрилого шкідника, та спосіб контролю шкідників рослин
UA127408C2 (uk) Сконструйовані пестицидні білки та способи контролю шкідників рослин
CN106413390A (zh) 用于控制虫害的组合物和方法
HU228699B1 (hu) Fedelesszárnyúak elleni peszticid aktivitású fehérjéket kódoló gének
EA029279B1 (ru) Композиции и способы контроля насекомых-вредителей
UA118082C2 (uk) Конструкція, що містить ген, що кодує білок, який має пестицидну активність проти лускокрилого шкідника, та спосіб її застосування
UA113493C2 (xx) Спосіб видалення ділянки днк в рослині
UA110925C2 (uk) Сконструйований білок cry1ba, активний щодо лускокрилих комах
US20230115696A1 (en) Bacterial genes and isolates for conferring insect resistance
EA032560B1 (ru) Инсектицидные полипептиды с широким спектром активности и их применения
UA126807C2 (uk) Інсектицидний білок і спосіб його застосування
CN106497966A (zh) 杀虫蛋白的用途
TW201629222A (zh) 以駝背基因之親代ＲＮＡ干擾（ＲＮＡｉ）抑制作用來控制半翅目害蟲之技術
UA120584C2 (uk) Варіантний інсектицидний ген axmi115 та способи його застосування
CA3087291A1 (en) Plant microbial preparations, compositions and formulations comprising same and uses thereof
UA124050C2 (uk) Химерний ген, який кодує білок, токсичний для кукурудзяного метелика, та спосіб його застосування
CN110582508A (zh) 杀昆虫蛋白及其使用方法
CN104886111B (zh) 杀虫蛋白的用途