UA112516C2 - ТРАНСГЕННА РОСЛИНА, ЯКА ПРОДУКУЄ БІЛОК Сry34Ab1, БІЛОК Сry35Ab1 І ІНСЕКТИЦИДНИЙ БІЛОК Сry3Ba1, ДЛЯ ЗАПОБІГАННЯ РОЗВИТКУ СТІЙКОСТІ В КУКУРУДЗЯНИХ КОРЕНЕВИХ ЖУКІВ (Diabrotica spp.) - Google Patents

ТРАНСГЕННА РОСЛИНА, ЯКА ПРОДУКУЄ БІЛОК Сry34Ab1, БІЛОК Сry35Ab1 І ІНСЕКТИЦИДНИЙ БІЛОК Сry3Ba1, ДЛЯ ЗАПОБІГАННЯ РОЗВИТКУ СТІЙКОСТІ В КУКУРУДЗЯНИХ КОРЕНЕВИХ ЖУКІВ (Diabrotica spp.) Download PDF

Info

Publication number
UA112516C2
UA112516C2 UAA201213338A UAA201213338A UA112516C2 UA 112516 C2 UA112516 C2 UA 112516C2 UA A201213338 A UAA201213338 A UA A201213338A UA A201213338 A UAA201213338 A UA A201213338A UA 112516 C2 UA112516 C2 UA 112516C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
protein
plants
binding
reserve
seed
Prior art date
Application number
UAA201213338A
Other languages
English (en)
Inventor
Кенет Е. Нарва
Томас Мід
Кристин Дж. Фенсил
Хуажун Лі
Тимоті Д. Гей
Ерон Т. Вуслі
Моніка Брит Олсон
Original Assignee
Дау Аґросаєнсиз Елелсі
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Дау Аґросаєнсиз Елелсі filed Critical Дау Аґросаєнсиз Елелсі
Publication of UA112516C2 publication Critical patent/UA112516C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G7/00—Botany in general
    • A01G7/06—Treatment of growing trees or plants, e.g. for preventing decay of wood, for tingeing flowers or wood, for prolonging the life of plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N37/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids
    • A01N37/18—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids containing the group —CO—N<, e.g. carboxylic acid amides or imides; Thio analogues thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/48—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • A01N43/50—1,3-Diazoles; Hydrogenated 1,3-diazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
    • A01N65/40—Liliopsida [monocotyledons]
    • A01N65/44—Poaceae or Gramineae [Grass family], e.g. bamboo, lemon grass or citronella grass
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B32—LAYERED PRODUCTS
    • B32B—LAYERED PRODUCTS, i.e. PRODUCTS BUILT-UP OF STRATA OF FLAT OR NON-FLAT, e.g. CELLULAR OR HONEYCOMB, FORM
    • B32B1/00—Layered products having a non-planar shape
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B65—CONVEYING; PACKING; STORING; HANDLING THIN OR FILAMENTARY MATERIAL
    • B65D—CONTAINERS FOR STORAGE OR TRANSPORT OF ARTICLES OR MATERIALS, e.g. BAGS, BARRELS, BOTTLES, BOXES, CANS, CARTONS, CRATES, DRUMS, JARS, TANKS, HOPPERS, FORWARDING CONTAINERS; ACCESSORIES, CLOSURES, OR FITTINGS THEREFOR; PACKAGING ELEMENTS; PACKAGES
    • B65D85/00—Containers, packaging elements or packages, specially adapted for particular articles or materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8251—Amino acid content, e.g. synthetic storage proteins, altering amino acid biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/04—Plant cells or tissues
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T428/00—Stock material or miscellaneous articles
    • Y10T428/13—Hollow or container type article [e.g., tube, vase, etc.]

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Ecology (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Forests & Forestry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

Даний винахід стосується трансгенних рослин, які продукують білок Cry34Ab1, білок Cry35Ab1 і інсектицидний білок Cry3Ba1. Білок Cry35Ab1 і інсектицидний білок Cry3Ba1 зв'язуються з різними рецепторними сайтами зв'язування в кишечнику кукурудзяного кореневого жука (. Дану властивість використано для запобігання розвитку популяції кукурудзяного кореневого жука, яка може бути стійкою до будь-якого з цих інсектицидних білків окремо. Таким чином, рослини (і посівна площа, засіяна такими рослинами), які продукують білок Cry34Ab1, білок Cry35Ab1 і інсектицидний білок Cry3Ba1, включені в обсяг даного винаходу.

Description

Даний винахід стосується трансгенних рослин, які продукують білок Сгуз4АБІ, білок Стуз5АБІ і інсектицидний білок СтгуЗзВа!1. Білок СтузБАБІ і інсектицидний білок СгуЗзВа! зв'язуються з різними рецепторними сайтами зв'язування в кишечнику кукурудзяного кореневого жука (ОЮіабгойса 5рр.). Дану властивість використано для запобігання розвитку популяції кукурудзяного кореневого жука, яка може бути стійкою до будь-якого з цих інсектицидних білків окремо.
Таким чином, рослини (і посівна площа, засіяна такими рослинами), які продукують білок Стгу34АБІ, білок СтгуЗзБАБрІ і інсектицидний білок СтузВа!, включені в обсяг даного винаходу.
Опис
Передумови створення винаходу
Люди вирощують кукурудзу для застосування в їжу і як джерело енергії. Кукурудза являє собою важливу сільськогосподарську культуру. Вона є важливим джерелом їжі, харчових продуктів і корму для тварин у багатьох регіонах світу. Комахи вживають у їжу й ушкоджують рослини і, таким чином, підривають ці зусилля людей. Щорічно мільярди доларів витрачаються для боротьби з комахами-шкідниками, і ще мільярди втрачаються внаслідок заподіюваного ними збитку.
Шкода, нанесена комахами-шкідниками, є основним чинником втрати врожаїв кукурудзи в усьому світі, незважаючи на використання захисних мір, таких як хімічні пестициди. У зв'язку з цим, у сільськогосподарські культури, такі як кукурудза, методами генної інженерії були введені гени стійкості до комах для боротьби зі збитком, нанесеним комахами, і для зниження потреби в традиційних хімічних пестицидах.
Щорічно, більше 10 мільйонів акрів (більше 4050000 га) кукурудзяних полів у США заражаються комплексом видів кукурудзяного кореневого жука. Комплекс видів кукурудзяного кореневого жука включає північного кукурудзяного кореневого жука (Оіабгоїїса бБагрегі), південного кукурудзяного кореневого жука (0. ипаесітрипсіаба Ппожагаї) і західного кукурудзяного кореневого жука (0. мігдітега мігдітега). (Інші види включають Оіарбгоїїйса мігдітега 7еае (Мексиканський кукурудзяний кореневий жук), Оіабгоїїса бБакКеага (Бразильський кукурудзяний кореневий жук), і комплекс Бразильського кукурудзяного кореневого жука (ріабгоїіса мігідиа і Оіабгоїїса з5ресіоза).
Личинки цих видів Оіабгоїїса, які живуть у грунті, харчуються корінням рослин кукурудзи, викликаючи полягання. Полягання, у кінцевому рахунку, знижує врожайність і часто приводить до загибелі рослини. Споживаючи в їжу маточкові колонки кукурудзи, дорослі жуки зменшують запилення і, тому, згубно впливають на зерно кукурудзяної рослини. Крім того, дорослі особини і личинки роду Оіабгоїїса атакують гарбузові культури (огірки, дині, гарбузи і т.д.) і багато овочевих і польових культур у промисловому рослинництві, а також такі, які вирощуються на присадибних ділянках.
Синтетичні органічні хімічні інсектициди були першочерговими інструментами, використовуваними для боротьби з комахами-шкідниками, але біологічні інсектициди, такі як інсектицидні білки, отримані з Васійи5 «пигіпдіепоіз (ВО, відігравали важливу роль у деяких регіонах. Здатність одержання стійких до комах рослин за допомогою трансформації генами інсектицидного білка Ві радикально змінила сучасне сільське господарство і підвищила значення і цінність інсектицидних білків і їхніх генів.
Інсектицидні кристалічні білки з деяких штамів Васіїйи5 (игіпдіепві5 (В.І) добре відомі в даній галузі техніки. Див., наприклад, Нопе еї аї, Місгобіа! Кеміему5, Мої. 53, Мо. 2, рр. 242-255 (1989).
Ці білки звичайно продукуються бактеріями у вигляді протоксинів з молекулярною масою приблизно 130 кДа, які потім розщеплюються протеазами в середній кишці комах після потрапляння в травну систему комахи для продукції корового токсину з молекулярною масою приблизно 60 кДа. Ці білки відомі як кристалічні білки, тому що в деяких штамах ВІ. можуть спостерігатися виразні кристалічні включення із суперечками. Ці кристалічні включення часто складені з декількох різних білків.
Однією групою генів, які використовувалися для одержання трансгенних, стійких до комах культур, є дельта-ендотоксини з Васійи5 ІПигіпудіепоі5 (ВА). Дельта-ендотоксини були успішно експресовані в таких сільськогосподарських культурах як бавовна, картопля, рис, соняшник, а також кукурудза, і, як виявилося, забезпечують чудовий контроль над комахами-шкідниками. (Репак, Р. єї а. (1990) Віо/Тесппоіоду 8, 939-943; Репак, КЕ... еї а. (1993) Ріапі Мої. Віої. 22: 313- 321; Еціїтоїо Н. еї аї. (1993) Віо/Тесппоіоду 11: 1151-1155; Ти єї аї. (2000) Майте ВіоїесппоЇоду 18: 1101-1104; РСТ публікація міжнародної патентної заявки МУО 01/13731; і Віпд .) М/ еї аї. (2000) Енісасу ої Стгу ІЄ Тгапздепіс Маї2е, 14" Віеппіа! Іпіетаїйопаї! Ріапі Везівіапсе іо Інзесів
Мої кзПпор, Рог Соїйп5, Со1о.).
Декілька білків ВІ використовувалися для створення стійких до комах трансгенних рослин, які були успішно зареєстровані і в даний час запущені в серійне виробництво. Вони включають
СтутАБ, Стут Ас, СтуїЕ, СтузЗАа і СтузВЬ у кукурудзі, СтуТАс і Сту2АБ у бавовні і СтузА у картоплі.
Є також БМАКТ 5ТАХ у кукурудзі, який містить СгутА.105 і Сту2АБ.
Продукти, які випускаються в промисловому масштабі, експресуючі ці білки, експресують один білок, за винятком випадків, де бажаний комбінований інсектицидний спектр із 2 білків (наприклад, СгтуТтАбБ їі СтузЗВЬ у кукурудзі, комбіновані для забезпечення стійкості до лускокрилих шкідників і блішки довговусої? відповідно), або де незалежна дія білків робить їх корисними як бо інструмент для затримки розвитку стійкості в популяцій сприйнятливих комах (наприклад,
Сту1Ас і Сту2АБ у бавовні, комбіновані для забезпечення керування стійкістю у відношенні тютюнової совки).
Деякі з якостей стійких до комах трансгенних рослин, які привели до швидкого і широко розповсюдженому прийняттю цієї технології, також викликають заклопотаність, що в популяцій шкідників розвинеться стійкість до інсектицидних білків, продукованих цими рослинами. Було запропоновано декілька стратегій для збереження корисності ознак стійкості до комах на основі
Ві, які включають розміщення білків у високій дозі в комбінації з резерватом, чергування з різними токсинами або спільне розміщення з ними (МеСацодпеу еї аї. (1998), "Ві. Кезісапсе
Мападетепі, " Машге Віоїесппої!. 16: 144-146).
Білки, вибрані для використання в пакеті Керування стійкості до комах (ІЕМ) повинні бути активними для того, щоб стійкість, яка розвилася до одного білка, не додавала стійкість до другого білка (тобто перехресна стійкість до білків відсутня). Якщо, наприклад, популяція шкідників, вибрана для стійкості до "білка А", чуттєва до "білка В", то можна зробити висновок, що немає перехресної стійкості, ії що комбінація білка А і білка В буде ефективною в затримці стійкості до одного білка А.
Під час відсутності стійких до комах популяцій, оцінки можуть здійснюватися на підставі інших характеристик, які вважаються зв'язаними з потенціалом перехресної стійкості. При ідентифікації інсектицидних білків з імовірністю відсутності прояву перехресної стійкості було запропоноване використання рецепторно опосередкованого зв'язування (мап Меїаєгі еї аї. 1999). Ключовим прогностичним показником відсутності перехресної стійкості, властивому цьому підходу, є те, що інсектицидні білки не конкурують за рецептори в чуттєвого виду комах.
У випадку, коли токсини Ві конкурують за той самий рецептор, то якщо цей рецептор мутує у цій комасі, так що один з токсинів більше не зв'язується з цим рецептором і, таким чином, більше не є інсектицидним проти комахи, то в цьому випадку, комаха буде також стійкою до другого токсину (який конкурентно зв'язаний з тим же рецептором). Тобто, комаха вважається перехресно стійкою до обох токсинів Ві. Однак якщо два токсини зв'язуються з двома різними рецепторами, то це може бути показником того, що комаха не буде одночасно стійкою до цих двох токсинів.
Відносно більш нова система інсектицидного білка була виявлена в Васійи5 ІПигіпдієпвів, як описано в міжнародному патенті УМО 97/40162. Ця система містить два білки - один масою приблизно 15 кдДа, і інший масою приблизно 45 кДа. Див. також патенти США 6083499 і 6127180.
Тепер ці білки були віднесені до їх власного класу і, відповідно, одержали позначення Сгу відповідно Стгуз4 і Сгуз5. Див. Стісктоге еї а. сайт інтернету (ріоі5.5изх.ас.икК/поте/Меї! СтісКтоге/ВІ/). В даний час виявлені багато інших споріднених білків цього типу системи. Див., наприклад, патент США 6372480; міжнародні патенти УМО 01/14417 і
МО 00/66742. Були також описані оптимізовані для рослин гени, які кодують такі білки, де гени створені методами генної інженерії для використання кодонів для оптимізованої експресії в рослин. Див. наприклад патент США 6218188.
Точний тип дії системи Сту34/35 ще має бути визначеним, але вважають, що вона утворює пори в мембранах клітин кишечнику комах. Див. МоейПепбеск еї аї, Маїиге Віогїесппоїіоду, мої. 19, р. 668 (ушу 2001); Маззоп еї аї., Віоспетівігу, 43 (12349-12357) (2004). Точний механізм дії залишається незрозумілим, незважаючи на тривимірні атомарні координати і структури кристалів, відомі для білка Стгу34 і Сту35. Див. патенти США 7524810 і 7309785. Наприклад, незрозуміло, один або обидва з цих білків зв'язуються з конкретним видом рецептора, такого як лужна фосфатаза або аміопептидаза.
Крім того, через те, що існують різні механізми, за допомогою яких у комахи може розвинутися стійкість до білка Сгу (такі як зміненим глікозилуванням рецептора Ідив. Чигаї-
Епепієз вї а. (2002) 68 АЕМ 5711-5717), видаленням рецепторного білка |див. ГІ ее еї а. (1995) 61 АЕЄМ 3836-3842), мутацією рецептора або іншими механізмами |див. Нескеї еї аї., У. Іпм.
Раїної. 95 (2007) 192-1971Ї), було неможливо свідомо прогнозувати, чи буде існувати перехресна стійкість між Сту34/35 і іншими білками Сгу. Прогнозування конкурентного зв'язування для системи Сгу34/35 також додатково ускладнюється тим, що два білки втягнені в бінарну систему
СтгуЗ34/35. Крім того, незрозуміло, чи зв'язуються і наскільки ефективно зв'язуються ці білки з кишечником/клітинами кишечнику, і чи взаємодіють вони і як взаємодіють або зв'язуються один з одним.
Інші варіанти для боротьби з твердокрилими комахами включають наступні білки: СтузВБ,
СтузсС, СтубВ, ЕТ29, ЕТЗ3З3 з ЕТ34, ТІС407, ТІС435, ТІС417, ТІС90О1, ТІС1201, ЕТ29 з ТІС810,
ЕТ70, ЕТ76 з ЕТ80, ТІС851 і інші. Були також запропоновані підходи РНКІ (інтерференції РНК).
Див. наприклад, Вашт еї аї., Маїиге Віоїтесппо!оду, мої. 25, по. 11 (Мом. 2007) рр. 1322-1326. бо Короткий опис суті винаходу
Даний винахід стосується частково СтуЗз4АБ/35Ар у комбінації з СтуЗВа. Даний винахід стосується частково дивного відкриття, що СтуЗз4АБ/СтузБАБ ії СтузВа можуть використовуватися для запобігання розвитку стійкості (до будь-якої системи інсектицидного білка окремо) у популяції кукурудзяного кореневого жука (Оіабгоїїса 5рр.). Як буде зрозуміло фахівцю в даній галузі після ознайомлення зі сприятливими аспектами розкритого в даному описі винаходу, рослини, продукуючі ці інсектицидні Сту-білки, можуть використовуватися для зменшення побоювань того, що може розвитися популяція кукурудзяного кореневого жука, який може бути стійким до кожної з цих систем інсектицидного білка окремо.
Даний винахід частково підтверджується виявленням того, що компоненти цих систем білка
Сту не конкурують один з одним за зв'язування з рецепторами кишечнику кукурудзяного кореневого жука.
Даний винахід також частково стосується потрійних пакетів або "пірамід" із трьох (або більше) систем токсинів, причому парою основ є СтуЗз4Ар/Стуз5АБ і СтуЗзВа. Таким чином, рослини (і посівна площа, засаджена такими рослинами), які продукують ці дві системи інсектицидних білків, включені в обсяг даного винаходу.
Короткий опис фігур
Докладний опис фігур зокрема стосується супровідних фігур, на яких:
Фіг. 1А. Зв'язування 12тІ-СтгуЗз5АБІ1 як функція внесених мічених радіоактивним ізотопом Сгу- токсинів у ВВММ (мембранних пухирцях щіткової облямівки), отриманих з личинок західних кукурудзяних кореневих жуків. Специфічне зв'язування-загальне зв'язування-неспецифічне зв'язування, "вуса»-5ЕМ (стандартна помилка середньої).
Фіг. 18. Зв'язування "25І-СтуЗз5Ва! як функція внесених мічених радіоактивним ізотопом Сгу- токсинів у ВВММУ, отриманих з личинок західних кукурудзяних кореневих жуків. Специфічне зв'язування-загальне зв'язування-неспецифічне зв'язування, "вуса»-5ЕМ (стандартна помилка середньої).
Фіг. 2. Зв'язування "22І-Стуз5АБІ з ВВМУ, отриманими з личинок західних кукурудзяних кореневих жуків, при різних концентраціях неміченого конкурента (09 0,1--1,0, 109 10-1,0,
Іосд9100-2,0, Іс41000-3,0).
Фіг. ЗА. Зв'язування у відсотках "22І-Сгуз5АБІ з ВВМУ, отриманими з личинок західних
Зо кукурудзяних кореневих жуків, під час відсутності Стгуз4АбБІ1.
Фіг. ЗВ. Зв'язування у відсотках 7"22І-Сгуз5АБІ з ВВМУ, отриманими з личинок західних кукурудзяних кореневих жуків, у присутності Стуз4АБІ1.
Фіг. 4. Зв'язування у відсотках 725І-СгузЗВаї з ВВМУ, отриманими з личинок західних кукурудзяних кореневих жуків, у присутності різних концентрацій немічених конкурентів, які варіюються.
Короткий опис послідовностей
ЗЕО ІЮ МО:1: Повна послідовність нативного білка Стуз5АбБІ1.
ЗЕО ІЮ МО:2: Зрізана хімотрипсином послідовність корового білка СгузБАБІ1.
ЗЕО ІЮ МО:3: Повна послідовність нативного білка СтузВа!1.
ЗЕО ІЮ МО:4: Послідовність корового білка СтгузВа! трипсину.
ЗЕО ІЮ МО:5: Повна послідовність нативного білка СтуЗз4АбБІ1.
Докладний опис
Послідовності білка СтуЗз4АБ/З5БАБ можуть бути отримані, наприклад, з ізоляту Васійи5
ІШигіпдіепоізї РОІ149В1. Інші гени, білкові послідовності і ізоляти-джерела для використання стосовно даного винаходу описані, наприклад, СгісКтоге ей а). на сайті інтернету (Іезсі.виззех.ас.ик/поте/Меї! Стісктоге/Ви/іпіго.піті).
Даний винахід включає використання інсектицидних білків СтуЗз4АБ/35АБ у комбінації з токсином СтузВа для захисту кукурудзи від ушкодження і втрати врожайності, викликаних поїданням кукурудзяним кореневим жуком, популяціями кукурудзяних листоїдів, у яких може розвитися стійкість до кожної з цих систем білків Сту окремо (без іншого).
Таким чином, у даному винаході мова йде про пакети Керування стійкості комах (ІКМ) для запобігання розвитку в кукурудзяного кореневого жука стійкості до СгуЗВа і/або СгузаАбБр/З5АБ.
Даний винахід стосується композицій для боротьби зі шкідниками-кореневими жуками, яка містить клітини, які продукують білок токсину СтуЗВа і систему токсину Сгтгуз4Абр/З5АБ.
Винахід додатково включає хазяїна, трансформованого для продукції і білка СгузВа, і бінарного токсину СгуЗз4АБ/З35АБ, де вказаний хазяїн являє собою мікроорганізм або рослинну клітину.
Додатково передбачається, що винахід стосується способу боротьби зі шкідниками- кореневими жуками, який включає приведення в контакт вказаних шкідників або середовища проживання вказаних шкідників з ефективною кількістю композиції, яка містить білок СгузВа, і додатково містить бінарний токсин СтуЗз4АБ/З5АБ.
Варіант здійснення винаходу включає маїс, який містить експресований рослиною ген, який кодує бінарний токсин СтуЗ4АБ/З5АБ, і експресований рослиною ген, який кодує білок СтуЗВа, і насіння такої рослини.
Додатковий варіант здійснення винаходу включає маїс, де експресований рослиною ген, який кодує бінарний токсин СтуЗ4АБ/З5АБ, і експресований рослиною ген, який кодує білок
СтгузВа, були інтрогресовані в вказаний магїс, і насіння такої рослини.
Як описано в розділі "Приклади", дослідження конкурентного зв'язування з рецепторами з використанням міченого радіоактивним ізотопом корового токсинного білка Стуз5АБ показують, що коровий токсинний білок СтгуЗзВа не конкурує за зв'язування в зразках тканини комах СКЕУУ (кукурудзяних кореневих жуків), з якими зв'язується Стуз5АБ. Див. Фіг. 2. Ці результати вказують на те, що комбінація білків СтгуЗзВа і Сту3з4АБ/35АБ являє собою ефективний засіб для зменшення розвитку стійкості в популяцій СКУМ до будь-якої білкової системи окремо.
Таким чином, частково на підставі даних, описаних вище, і в інших місцях даного опису, білки СгуЗз4АБ/З5АБ і СтузВа можуть використовуватися для одержання комбінацій ІЕМ для запобігання і зменшення розвитку стійкості в СЕМУ. Інші білки можуть додаватися до цієї комбінації, наприклад, для розширення спектра боротьби з комахами. Розглянута комбінація (білків Стуз4АБ/З5АБ і СтузВа) може також використовуватися в деяких переважних "потрійних пакетах" або "пірамідах" у комбінації з ще одним білком для боротьби з кореневими жуками, таким як СтузЗАа і/або СгубАа; отже, такі додаткові комбінації будуть забезпечувати множинні типи дії проти кореневого жука. РНКІ проти кореневих жуків являє собою ще один варіант. Див., наприклад, Вашт еї аї., Маїиге Віотесппоіоду, мої. 25, по. 11 (Мом. 2007) рр. 1322-1326.
У світлі опису заявки О55М 61/327240 (поданої 23 квітня 2010 р.), яка стосується комбінацій білків Стуз4АБ/З5АБ і СтузАа, ОЗЗМ 61/388273 (поданої 30 вересня 2010 р.), яка стосується комбінацій білків СтуЗз4АБ/З5АБ і СтубАа, і О55М 61/477447 (поданої 20 вересня 2011 р.), яка стосується комбінацій білків СтузЗАа і СгубАа, деякі переважні "потрійні пакети" або "множинні типи пакетів дії" даного винаходу включають білок СтгуЗВа у комбінації з білками СгуЗз4АБ/З5АБ, разом з білком СгублАа і/або білком СтузЗВа. Трансгені рослини, включаючи кукурудзу, які містять
Зо ген сгуЗВа, гени сгуз4АБ/З5АБ і третю або четверту систему токсинів (наприклад, ген(и) сгузАа і/або сгубАа), включені в обсяг даного винаходу. Таким чином, такі варіанти здійснення націлені на комаху щонайменше трьома типами дії.
Варіанти розміщення за даним винаходом включають використання білків СгуЗВа і
Стуз4АБ/З5АБЬ у місцях вирощування кукурудзи, де Оіабгоїїса 5рр. є проблематичними. Іншим варіантом розміщення може бути використання одного або обох білків СгуЗВа і Стгуз4АБ/З5АБ у комбінації з іншими ознаками.
Фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що токсини Ві, навіть у межах визначеного класу, такі як СтуЗВа і Стуз4АБ/З5АБ, можуть до деякої міри варіюватися.
Гени і токсини. Термін "ізольований" стосується полінуклеотиду який не зустрічається в природних умовах конструкту або до білка в очищеному або іншим способом не зустрічається в природних умовах стану. Гени і токсини, використовувані стосовно даного винаходу, включають не тільки повні описані послідовності, але також фрагменти цих послідовностей, варіанти, мутанти і злиті білки, які зберігають характерну пестицидну активність токсинів, конкретно проілюстрованих у даному описі. Використовувані в даному описі терміни "варіанти" або "зміни" генів стосуються нуклеотидних послідовностей, які кодують ті ж токсини, або які кодують еквівалентні токсини, які володіють пестицидною активністю. Використовуваний у даному описі термін "еквівалентні токсини" стосується токсинів, які мають таку ж або власне кажучи володіють такою ж біологічною активністю проти шкідників-мішеней як заявлені токсини. Це стосується СтуЗ і Стгу34/35, а також Стуб (при використанні в потрійних/умножинних пакетах) стосовно даного винаходу. Домени/субдомени цих білків можуть бути замінені для одержання химерних білків. Див. наприклад, патенти США 7309785 і 7524810 у відношенні білків Сту34/35.
У патенті "785 мова також йде про зрізані білки СтуЗ35. Зрізані токсини також проілюстровані в даному описі.
Використовуваний у даному описі термін "кордони" представляє ідентичність послідовностей приблизно 95 95 (СтуЗВа і СтуЗз4АбБ і СтузбБАБ), 78 95 (СгуЗВ і Сту З34А і Сгуз5А) і 45 905 (Сгуб і СтуЗ34 і Стуз5) стосовно "Кемізіоп ої Мотепсіайшге Тог ВасшШиз (пПигіпдіепвіз Резіїсідаї
Стувіа! Ргоївіпв" М. Стісктоге, О.А. 7еїідіег, У. Рейеїбоп, Е. ЗеНпері, У. Мап Віеє, 0. І егесімв, 9.
Вайт, і О.Н. ЮОеап. Місгоріоїюсду і Моїесціаг Віоюду Кемієем5 (1998) Мо! 62: 807-813. Те ж стосується СтузЗА і/або Стуб при використанні в потрійних пакетах/умножинних пакетах, 60 наприклад, стосовно даного винаходу.
Для фахівця в даній галузі буде очевидно, що гени, які кодують активні токсини, можуть бути ідентифіковані й отримані декількома способами. Визначені гени або частини генів, проілюстровані в даному описі, можуть бути отримані з ізолятів, депонованих у депозитарії культур. Ці гени або їхні частини або варіанти, також можуть бути конструйовані синтетично, наприклад, шляхом використання генного синтезатора. Варіанти генів можуть бути легко сконструйовані з використанням стандартних технологій одержання крапкових мутацій. Також, фрагменти цих генів можуть бути отримані з використанням комерційно доступних екзонуклеаз або ендонуклеаз, відповідно до стандартних методик. Наприклад, ферменти, такі як ВаІ31, або сайт-направлений мутагенез можуть використовуватися для систематичного відсічення нуклеотидів від кінців цих генів. Гени, які кодують активні фрагменти, можуть також бути отримані з використанням різноманітних рестрикційних ферментів. Протеази можуть використовуватися для безпосереднього одержання активних фрагментів білкових токсинів.
Фрагменти й еквіваленти, які зберігають пестицидну активність ілюстративних токсинів, будуть входити в обсяг даного винаходу. Також, через надмірність генетичного коду, розмаїтість різних послідовностей ДНК може кодувати амінокислотні послідовності, розкриті в даному описі.
Фахівець у даній галузі повністю може створити ці альтернативні послідовності ДНК, які кодують однакові або власне кажучи однакові токсини. Ці варіантні послідовності ДНК входять в обсяг даного винаходу. Використовуване в даному описі посилання на "власне кажучи однакову" послідовність стосується послідовностей, які мають амінокислотні заміщення, делеції, або додавання вставки, які істотно не впливають на пестицидну активність. Фрагменти генів, які кодують білки, які зберігають пестицидну активність, також включені в це визначення.
Фрагменти генів, які кодують білки, які зберігають пестицидну активність, також включені в даний винахід.
Додатковий спосіб ідентифікації генів, які кодують токсини, і частин генів, використовуваних стосовно даного винаходу, здійснюють шляхом використання олігонуклеотидних зондів. Ці зонди являють собою детектовані нуклеотидні послідовності. Ці послідовності можуть бути детектовані за допомогою відповідної мітки або можуть бути отримані ендогенно флуоресцентними, як описано в міжнародній патентній заявці Мо МО 93/16094. Як добре відомо в даній галузі, молекула зонда і зразок нуклеїнової кислоти гібридизуються з утворенням
Зо міцного зв'язку між двома молекулами, то можна резонно припустити, що зонд і зразок мають істотну гомологію. Переважно, гібридизацію проводять у жорстких умовах методиками, добре відомими в даній галузі, як описано, наприклад, у публікації КеїПег, с.Н., М.М. Мапак (1987) ОМА
Ргобез, БіосКіоп Ргеб5, Мем мок, М.У., рр. 169-170. Деякі приклади сольових концентрацій і температурних комбінацій наступні (у порядку збільшення твердості умов): 2Х 55РЕ або 55Х при кімнатній температурі; 1Х ЗЗРЕ або 55С при 422С; 0,1Х 55РЕ або 55С при 42"С: 01Хх
ЗЗРЕ або 555С2 при 652С. Виявлення зонда забезпечує засіб для визначення відомим чином, чи відбулася гібридизація. Такий зондовий аналіз забезпечує швидкий спосіб ідентифікації генів даного винаходу, які кодують токсин. Нуклеотидні сегменти, які використовуються як зонди стосовно винаходу, можуть бути синтезовані з використанням синтезатора ДНК і стандартних методик. Ці нуклеотидні послідовності можуть також використовуватися як затравки ПЛР для ампліфікації генів за даним винаходом.
Варіантні токсини. У даному описі були спеціально проілюстровані визначені токсини за даним винаходом. Оскільки ці токсини просто ілюструють токсини за даним винаходом, то повинно бути повністю очевидно, що даний винахід включає варіантні або еквівалентні токсини (і нуклеотидні послідовності, які кодують еквівалентні токсини), які володіють такою ж або подібною пестицидною активністю як ілюстрований токсин. Еквівалентні токсини мають гомологію амінокислот з ілюстрованим токсином. Ця амінокислотна ідентичність звичайно складає більше ніж 75 95, або, переважно, більше ніж 8595, переважно, більше ніж 90 95, переважно, більше ніж 9595, переважно, більше ніж 9695, переважно, більше ніж 97 95,
БО переважно, більше ніж 98 95, або в деяких варіантах здійснення, переважно, більше ніж 99 9.
Амінокислотна ідентичність звичайно найвища в критичних ділянках токсину, які відповідають за біологічну активність або беруть участь у визначенні тривимірної конфігурації, яка, у кінцевому рахунку, відповідальна за біологічну активність. У цьому відношенні, прийнятні і можуть очікуватися деякі амінокислотні заміщення, якщо ці заміщення відбуваються в ділянках, які не мають вирішального значення для активності або являють собою консервативні амінокислотні заміщення, які не впливають на тривимірну конфігурацію молекули. Наприклад, амінокислоти можуть бути розміщені в наступні класи: неполярні, незаряджені полярні, основні і кислотні.
Консервативні заміщення, за допомогою яких амінокислота одного класу заміщається іншою амінокислотою того ж типу, входять в обсяг даного винаходу, поки заміщення істотно не змінює біологічну активність сполуки. У таблиці 1 представлений список прикладів амінокислот, які стосуються кожного класу.
Таблиця 1
Класи амінокислот із прикладами амінокислот, які стосуються кожного класу
У деяких випадках можуть також здійснюватися неконсервативні заміщення. Вирішальним фактором є те, що ці заміщення не повинні значно знижувати біологічну активність токсину.
Рекомбінантні хазяї. Гени, які кодують токсини даного винаходу, можуть бути введені в широку розмаїтість мікробних або рослинних хазяїнів. Експресія гена токсину приводить, або прямо побічно, до внутрішньоклітинної продукції і підтримки пестициду. Кон'югальне перенесення і рекомбінантне перенесення можна використовувати для створення штаму Ві, який експресують обидва токсини даного винаходу. Інші організми хазяїнів можуть також трансформуватися одним або більше генами токсину, використовуваним потім для надання синергічного ефекту. З придатними мікробними хазяїнами, наприклад, Рхендотопав, мікроби можуть наноситися на місцезнаходження шкідника, де вони проліферують і вживаються в їжу.
Результатом є контроль над шкідником. Альтернативно, мікроб, який несе ген токсину, може бути підданим обробці в умовах, які продовжують активність токсину і стабілізують клітину.
Оброблена клітина, яка зберігає токсичну активність, потім може вноситися в середовище проживання шкідника-мішені. У предмет даного винаходу включені нерегенеровані/нетотипотентні рослинні клітини з рослини за даним винаходом (утримуючі, щонайменше, один з розглянутих генів ІКМ).
Трансформація рослини. Переважним варіантом здійснення даного винаходу є трансформація рослин генами, які кодують розглянутий інсектицидний білок або його варіанти.
Трансформовані рослини стійкі до атаки цільовою комахою-шкідником за рахунок присутності контролюючих кількостей розглянутого інсектицидного білка або його варіантів у клітинах трансформованої рослини. При включенні генетичного матеріалу, який кодує інсектицидні властивості інсектицидних токсинів В.1І., у геном рослини, вживаного в їжу визначеним комахою- шкідником, дорослі особини або личинки загинуть після вживання в їжу рослини. Були трансформовані численні члени односім'ядольних і двочасткових класифікацій. Трансгенні агрономічні культури, а також фрукти й овочі становлять промисловий інтерес. Такі культури
Зо включають, але без обмеження, маїс, рис, сою, канолу, соняшник, люцерну, сорго, пшеницю, бавовну, арахіс, томати, картоплю тощо. Існує декілька технологій введення стороннього генетичного матеріалу в клітини рослин і для одержання рослин, які стабільно підтримують і експресують введений ген. Такі технології включають акселерацію генетичного матеріалу, нанесеного на мікрочастинки, безпосередньо в клітини (патент США 4945050 і патент США 5141131). Рослини можуть бути трансформовані з використанням технології Адгобасіегішт, див. патент США 5177010, патент США 5104310, Європейську патентну заявку Мо 013162481,
Європейську патентну заявку Мо 120516, Європейську патентну заявку Мо 15941881,
Європейську патентну заявку Мо 176112, патент США 5149645, патент США 5469976, патент
США 5464763, патент США 4940838, патент США 4693976, Європейську патентну заявку Мо 116718, Європейську патентну заявку Мо 290799, Європейську патентну заявку Мо 320500,
Європейську патентну заявку Мо 604662, Європейську патентну заявку Мо 627752, Європейську патентну заявку Ме 0267159, Європейську патентну заявку Мо 0292435, патент США 5231019, патент США 5463174, патент США 4762785, патент США 5004863 і патент США 5159135. Інша технологія трансформації включає технологію М/НІЗКЕКЗ М, див. патент США 5302523 і патент
США 5464765. Технологія електропорації також використовувалася для трансформації рослин, див. Міжнародний патент МО 87/06614, патент США 5472869, патент США 5384253,
Міжнародний патент УМО 9209696 і Міжнародний патент МО 9321335. Усі ці патенти і публікації, які стосуються трансформації, включені в даний опис за допомогою посилання. На додаток до численних технологій трансформації рослин, тип тканини, яка контактує зі сторонніми генами, також може змінюватися. Така тканина включає, але не обмежується ними, ембріогенну тканину, І і ІЇ типи калюсної тканини, гіпокотиль, меристему тощо. Майже всі рослинні тканини можуть бути трансформовані під час дедиференціації з використанням відповідних технологій у межах кваліфікації фахівця в даній галузі.
Гени, які кодують кожен з розглянутих токсинів, можуть бути вставлені в клітини рослини з використанням різноманітних способів, які добре відомі в даній галузі, як описано вище.
Наприклад, доступно велике число векторів клонування, які містять маркер, який забезпечує можливість добору трансформованих мікробних клітин, і реплікаційна система, функціональна в
ЕзсПегіспіа соїї, для одержання і модифікації сторонніх генів для вставки у вищі рослини. Такі маніпуляції можуть включати, наприклад, введення мутацій, усікань, або додавань заміщень, як бажано для передбачуваного використання. Вектори включають, наприклад, рВК322, групу рис, групу МІ1Зітр, рАСУст184 і т.д. Відповідно, послідовність, яка кодує Сгу-білок або варіанти, може бути вставлена у вектор у придатний сайт рестрикції. Отримана плазміда використовується для трансформації клітин Е. соїї, клітини яких культивують у придатному поживному середовищі потім збирають і лізують для того, щоб була витягнута придатна для обробки кількість плазміди. Аналіз послідовності, аналіз фрагментів рестрикції, електрофорез і інші біохімічні-молекулярно-біологічні способи в цілому проводять як способи аналізу. Після кожної маніпуляції, використовувана послідовність ДНК може бути розщеплена і з'єднана з наступною послідовністю ДНК. Кожна піддана маніпулюванню послідовність ДНК може бути клонована в ту саму або інші плазміду.
Використання утримуючих Т-ДНК векторів для трансформації клітин рослин інтенсивно досліджувалося і досить описане в Європейському патенті ЕР 120516; публікаціях І ее і Сеїміп (2008), ЕгаІеу єї а). (1986), і Ап еї аї. (1985), і досить встановлено в даній галузі.
Як тільки вставлена ДНК інтегрується в ген рослини, вона стає стійкою у всіх наступних поколіннях. Вектор, використовуваний для трансформації клітини рослини, звичайно містить вибраний маркерний ген, який кодує білок, який додає трансформованим клітинам рослин стійкість до гербіциду або антибіотику, такому як, поряд з іншими, біалафос, канаміцин, 5418, блеоміцин або гігроміцин. Відповідно, окремо використовуваний вибраний маркерний ген повинен забезпечити можливість вибору трансформованих клітин, у той час як ріст клітин, які не містять вставлену ДНК, придушується селекційною сполукою.
Доступне велике число способів вставки ДНК у клітину рослини-хазяїна. Ці способи
Зо включають трансформацію Т-ОМА, доставлену Адгобасіегішт Шшптегасієп5 або Адгобасієгійт гпігодепе5 як агента трансформації. Додатково, можна використовувати злиття протопластів рослини з ліпосомами, які містять підлягаючу доставці ДНК, пряму ін'єкцію ДНК, трансформацію біологічною балістикою (бомбардуванням мікрочастинками) або електропорацію, а також інші можливі способи.
У переважному варіанті здійснення даного винаходу рослини трансформуються генами, де використання кодона ділянки, яка кодує білок, було оптимізовано для рослин. Див., наприклад, патент США 5380831, який включений у даний опис за допомогою посилання. Також, переважно використовуються рослини, які кодують зрізаний токсин. Зрізаний токсин звичайно кодує приблизно від 55595 до приблизно 8095 токсину повної довжини. Способи створення синтетичних генів В.І. для використання в рослинах відомі в даній галузі (5ієулагі, 2007).
Незалежно від методики трансформації, ген переважно включають у вектор переносу гена, адаптований для експресування генів інсектицидного токсину В.1, і варіанти в рослинної клітини включенням у вектор рослинного промотору. На додаток до рослинних промоторів, у рослинних клітинах для експресування чужорідних генів можна ефективно використовувати промотори з різноманітних джерел. Наприклад, можливе використання промоторів бактеріального походження, таких як промотор октопінсинтази, промотор нопалінсинтази і промотор манопінсинтази. У деяких переважних варіантах здійснення можуть використовуватися промотори, не зв'язані з Васійи5 ІВигіпдіепбіз. Можуть використовуватися промотори, які виходять з рослинних вірусів, наприклад, промотори 355 і 195 вірусу мозаїки кольорової капусти, промотор з вірусу мозаїки жилок касаві тощо. Рослинні промотори включають, але без обмеження, малу субодиницю (551), промотор бета-конгліциніну, промотор фазеоліну, промотор
АОН (алкогольдегідрогенази), промотори теплового шоку, промотор АОЕ (деполімеризації актину), промотор убіквітину, промотор актину і тканиноспецифічні промотори. Промотори можуть також містити визначені енхансерні елементи послідовності, які можуть підвищити ефективність транскрипції. Конкретні енхансери включають, але без обмеження, АНІ -інтрон 1 і АОНТІ-інтрон 6. Можуть використовуватися конститутивні промотори. Конститутивні промотори направляють безупинну генну експресію майже у всіх типах клітин і майже в будь-який час (наприклад, актину, убіквітину, Самм 355). Тканиноспецифічні промотори відповідальні за генну експресію у визначених типах або клітин тканини, таких як листи або насіння (наприклад, бо промотори зеїну, олеозину, напіну, АСР (ацил білка-носія)), і ці промотори також можуть використовуватися. Можуть також використовуватися промотори, які активні під час визначеної стадії розвитку рослин, а також активні у визначених тканинах і органах рослин. Приклади таких промоторів включають, але без обмеження, промотори, які є специфічними для коренів, специфічними для пилка, специфічними для зародків, специфічними для "шовку" кукурудзи, специфічними для бавовняних волокон, специфічними для ендосперми насіння, специфічними для флоеми, тощо.
У визначених умовах може бути бажаним використання індукованого промотору.
Індукований промотор відповідальний за експресію генів у відповідь на специфічний сигнал, такий як фізичний стимул (наприклад, гени теплового шоку); світло (наприклад, КОВР карбоксилазу); гормон (наприклад, глюкокортикоїд); антибіотик (наприклад, тетрациклін); метаболіти; і стрес (наприклад, посуху). Можуть використовуватися інші бажані транскрипційні і трансляційні елементи, які функціонують у рослинах, такі як 5' нетрансльовані лідерні послідовності, РНК послідовності транскрипції термінації і сигнальні послідовності додавання поліаденілату. У даній галузі відомі численні специфічні для рослин вектори переносу генів.
Трансгенні культури, які містять ознаки стійкості до комах (ІК), є переважними в рослинах кукурудзи і бавовни по всій Північній Америці, і використання цих ознак поширюється по усьому світі. Промислові трансгенні культури, які комбінують ознаки ІК і стійкість до гербіцидів (НТ), були розроблені множиною насінних компаній. Вони включають комбінації ознак І, доданих інсектицидними білками В.ї. і ознак НТ, таких як стійкість до інгібіторів ацетолактатсинтази (АГ 5), таких як сульфонілсечовини, імідазолінони, триазолпіримідин, сульфонаніліди тощо, інгібіторів глутамінсинтетази (055), таких як біалафос, глюфосинат тощо, інгібіторів 4- гідроксифенілпіруватдіоксігенази (НРРБО)), таких як мезотрион, ізоксафлутол тощо, інгібіторів 5- енолпірувілшикімат-З-фосфатсинтази (ЕРБР5), таких як гліфосат тощо, інгібіторів ацетилкоензим-А-карбоксилази (АССазе), таких як галоксифоп, квілазофоп, діклофоп тощо.
Відомі інші приклади, у яких трансгенно отримані білки забезпечують стійкість рослин до хімічних класів гербіцидів, таким як гербіциди на основі феноксікислот і гербіциди на основі ауксинпірідилоксіацетатів (див. міжнародну патентну заявку УМО 2007/053482 А2), або гербіциди на основі феноксікислот і гербіциди на основі арилоксіфеноксіпропіонатів (див. міжнародну патентну заявку 2005107437 А2, АЗ). Здатність контролювати множинні зв'язані зі шкідниками
Зо проблеми за допомогою ознак ІК являє собою цінну концепцію промислового продукту, і зручність цієї продуктової концепції підвищується, якщо ознаки, які забезпечують контроль над комахами, і ознаки, які забезпечують контроль над бур'янами, комбінуються в одній рослині.
Додатково, підвищена значимість може бути отримана за допомогою комбінацій в одній рослині ознак ІК, наданих інсектицидним білком В.1., таким як інсектицидний білок за даним винаходом, з однією або більше додатковими ознаками НТ, такими як вказано вище, плюс одна або більше додаткових ознак, які вводяться (наприклад, стійкість до інших комах, яка походить з В.І. або з інших інсектицидних білків, стійкості до комах, доданої такими механізмами як РНКІі тощо, стійкості до нематодів, стійкості до захворювань, стійкості до стресу, поліпшеної утилізації азоту і тому подібних), або продуктивні ознаки (наприклад, високий вміст олій, корисна для здоров'я сполука, поліпшення поживної цінності тощо). Такі комбінації можуть бути отримані або звичайною селекцією (селекційний пакет), або спільно у вигляді нового явища трансформації, яке включає одночасне введення множинних генів (молекулярний пакет). Сприятливі ефекти включають здатність справлятися зі шкідниками і поліпшеною боротьбою з бур'янами культур рослин, які забезпечують вторинні переваги для виробника і/або споживача. Таким чином, винахід може бути використаний в комбінації з іншими ознаками для забезпечення повного агрономічного пакета поліпшеної якості культури зі здатністю гнучко й економічно рентабельно регулювати будь-яке число агрономічних питань.
Трансформовані клітини ростуть всередині рослин звичайним чином. Вони можуть утворювати зародкові клітини і передавати трансформовану ознаку(и) популяції рослин.
Такі рослини можна вирощувати звичайним чином і схрещувати з рослинами, які мають такі ж трансформовані спадкоємні фактори або інші спадкоємні фактори. Отримані гібридні індивіди мають відповідні фенотипічні властивості.
У переважному варіанті здійснення даного винаходу рослини трансформуються генами, де використання кодона було оптимізоване для рослин. Див., наприклад, патент США 5380831.
Крім того, способи створення синтетичних генів Ві для використання в рослинах відомі в даній галузі (Зіемагі і Вигдіп, 2007). Одним необмежувальним прикладом кращої трансформованої рослини є фертильна рослина маїсу, яка містить експресований рослиною ген, який кодує білок
СтгузВа, і додатково утримуючий другий експресований рослиною ген, який кодує білок
СтузаАБ/ЗБАБ.
Перенос (або інтрогресія) обумовленого(их) білками СтузЗАа і Стуз4АБ/35АБ ознаки(ознак) в інбредні лінії маїсу може бути досягнута рекурентним селекційним розведенням, наприклад, зворотним схрещуванням. У цьому випадку, бажаного рекурентного батька спочатку схрещують з інбредним донором (нерекурентним батьком), який несе відповідний(ні) ген(и) для обумовлених Сгу ознак. Потім потомство цього однократного схрещування знову спаровують з рекурентним батьком з наступною селекцією в отриманому потомстві для переносу бажаної ознаки(ознак) від нерекурентного батька. Після трьох, переважно, чотирьох, більше переважно, п'яти або більше поколінь зворотного схрещування з рекурентним батьком із селекцією бажаної ознаки(ознак), потомство буде гетерозиготним у відношенні локусів, які контролюють стерпну(ні) ознаку(ки), але буде як рекурентний батько у відношенні або більшості майже всіх інших генів (див., наприклад, РоепіІтап 5 5іерег (1995) Вгеєдіпу Ріеій Стор5, 4 Еа., 172-175; Ренг (1987)
Ргіпсірієз ої Сийімаг ОемеІортепі, Мої. 1: Тпеогу і Тесппідце, 360-376).
Стратегії керування стійкістю до комах (ІМ). Коиб5п еї аї., наприклад, описують "двотоксинні" стратегії, також називані "побудовою піраміди" або "пакетуванням", для керування інсектицидними трансгенними культурами. (Коуа! босіеїу. РНИЇї. Ттапе. АВ. бос. І опа. В. (1998) 353, 1777-1786).
Агентство США по захисту навколишнього середовища на своєму сайті в інтернеті (ерагдом/оррбрраї/ріоревіісідев/рір5/рі согп гейіде 2006.піт) публікує наступні вимоги до забезпечення не трансгенних (тобто не-В.І.) резервних культур (блоку не-ВІ культур/кукурудзи) для використання з трансгенними культурами, продукуючими один білок Ві, активний проти шкідників-мішеней. "Специфічні структуровані вимоги до захищеного від кукурудзяного метелика ВІ (СтутАБ або
СтуїтЕ) кукурудзяним продуктам наступні:
Структуровані резервати: 20 95 нелускокрилий ВІ кукурудзяний резерват у Кукурудзяній смузі; 50 95 нелускокрилий ВІ резерват у Бавовняній смузі.
Блоки
Внутрішній (тобто, у межах поля ВО);
Зовнішній (тобто, окремі поля в межах 7» милі (804 м) (якщо можливо, 1/4 милі (402 м)) від
Зо поля ВІ для максимізації випадкового спарювання).
Смуги всередині поля
Смуги повинні бути шириною, щонайменше, 4 ряди (переважно, б рядів) для зменшення ефектів пересування личинок".
Крім того, Національна Асоціація фермерів, які вирощують кукурудзу на своєму сайті інтернету: (псда.сот/іпзесі-гебізтапсе-тападетепі-Ттасі-5певі-Бі-сотт) також публікує аналогічне керівництво у відношенні вимог до резервату. Наприклад: "Вимоги до ІКМ у відношенні кукурудзяного метелика: - Засійте щонайменше 20 95 вашого кукурудзяного поля гібридами резервного насіння. - В ділянках, продукуючих бавовну, резерват повинен складати 50 95. - Повинні бути засіяні в межах 1/2 милі (804 м) від гібридів резервної культури. - Резервне насіння можуть засівати у вигляді смуг у межах поля ВГ смуги резервної культури повинні мати ширину щонайменше 4 ряди. - Резервна культура може оброблятися звичайними пестицидами, тільки якщо для комахи- мішені досягаються економічні пороги. - Інсектициди, які розпорошуються, на основі Ві не можуть використовуватися на резервній кукурудзі. - Відповідні резервні культури повинні висіватися на кожній фермі з Ві кукурудзою".
Як вказано Коизі еї аї. (наприклад, на стор. 1780 і 1784 у правому стовпчику), пакетування або "пірамідування" із двох різних білків, кожного ефективного проти шкідників-мішеней і з невеликою або відсутньою перехресною стійкістю може забезпечити можливість використання меншого резервату. Кои5п припускає, що для успішного пакета, розмір резервату менше ніж 10 95 може забезпечити керування стійкістю, порівняне приблизно з 50 95 резерватом для однієї (не "пірамідованої") ознаки. Для доступних у даний час "пірамідованих" Ві кукурудзяних продуктів, Агентство США по захисту навколишнього середовища вимагає засіву значно меншого (у цілому, 5 95) структурованого резервату, не утримуючі білки Ві кукурудзи, ніж для продуктів з однією ознакою (у цілому, 20 95).
Існують різні шляхи забезпечення ефектів ІЕМ резервату, включаючи різні геометричні типи посіву на полях (як вказано вище) і суміші насіння у мішку, як додатково обговорюється Коив5п еї бо а. (див. вище), і в патенті США 6551962.
Вказані вище процентні частки або подібні співвідношення резервату можуть використовуватися для розглянутих подвійних або потрійних пакетів або пірамід. Через те, що даний винахід забезпечує множинні, неконкурентні типи дії проти комахи-мішені кореневого жука, даний винахід може забезпечити "нульовий резерв", тобто поле, позбавлене резервних рослин (тому що вони не вимагаються). Звичайно потрібен дозвіл для засівання полів розміром більше приблизно 10 акрів (40,5 га) конкретними трансгенними рослинами ВІ. Таким чином, даний винахід включає поле розміром більше 10 акрів (40,5 га) або більше з "нульовим резервом" або рослин, які не містять білки Ві; поля такого розміру раніше забажали б значного резерву, який не містить білки ВІ.
Усі патенти, патентні заявки, тимчасові заявки і публікації, приведені у виді посилання або процитовані в даному описі, повністю включені за допомогою посилання в тій степені, у якій вони не суперечать визначеним положенням даного опису.
Нижче приведені приклади, які ілюструють методи здійснення винаходу. Ці приклади не слід розглядати як обмежуючі. Якщо не вказане інше, усі процентні частки представлені за масою, і всі пропорції сумішей у розчиннику представлені за об'ємом. Усі величини температури представлені в градусах Цельсія.
Якщо спеціально не вказане інше або не є на увазі інше, одиничне число означає використовуваний у даному описі термін "щонайменше один".
ПРИКЛАДИ
Приклад 1 - Конструювання експресійних плазмід, які кодують токсини повної довжини
Стуз4аАБІ1, СтузбБАБІ і СтузВа!
Стандартні способи клонування використовували при конструюванні експресійних плазмід
Рзейдотопах Пиогезсеп5 (РО), сконструйовані для продукції відповідно Стгу-білків СтгуЗз4АБІ1,
СтуЗ5АБІ і СтгузВа!1. Рестрикційні ендонуклеази з біологічних лабораторій Нової Англії (МЕВ;
Ірзулісп, МА) використовували для переварювання ДНК, і Т4 ДНК лігазу від компанії Іпмігодеп використовували для лігування ДНК. Плазміди одержували з використанням набору Ріазтіа
Міді (Сіадеп) дотримуючись інструкцій постачальника. Фрагменти ДНК очищали, використовуючи картридж МійШроге ШОПгаїтее?-БА (ВШегіса, МА) після гель-електрофорезу в агарозному гелі з тріс-ацетатним буфером. Основна стратегія клонування передбачала
Зо субклонування послідовностей, які кодують, (СО) білків СтуЗз4АБІ ії СтузБАБІ повної довжини в рмМУсС1803 у рестрикційні сайти ре і Хпо (або Хра) і СО5 білка СтузВа! повні довжини в рМУС1050 у рестрикційні сайти Крп і Хба, відповідно, за допомогою чого їх поміщали під контроль експресії відповідно промотору Ріас і термінатора ІппВтТ1т2 із плазміди рРКК223-3 (РІ.
РПагтасіа, Міїм"аикеє, УМ). РМУС1803 являє собою середню копію плазміди з походженням реплікації з КЕ5Е1010, гена стійкості до тетрацикліну, і сайтом зв'язування рибосоми, який передує сайти розпізнавання рестрикційного ферменту, у які можуть бути внесені фрагменти
ДНК, які містять білок ділянки, яку кодують, (заявка на патент США 2008/0193974). Експресійну плазміду трансформували електропорацією у штам МВ214 Р. Пиогезсеп5, витягнутий у середовищі 5ОС-соєвий гідролізат і висівали на чашки з лізогенним бульйонним середовищем
Ї игіа (І. В), який містить 20 мкг/мл тетрацикліну. Подробиці мікробіологічних маніпуляцій доступні в заявці на патент США Мо 2006/0008877, заявці на патент США Мо 2008/0193974, і заявці на патент США Мо 2008/0058262, включених у даний опис за допомогою посилання. Проводили скринінг колоній рестрикційним переварюванням міні-препарату плазмідної ДНК. Послідовність плазмідної ДНК вибраних клонів, які містять вставки, визначали за контрактом з комерційною організацією, яка проводить визначення послідовностей, такої як ММС Віоїесп (НипівміПе, АГ).
Дані послідовностей збирали й аналізували, використовуючи програмне забезпечення зедцепспег "м ((зепе Содез Согр., Апп Агбог, МІ).
Приклад 2 - Ріст і експресія
Аналіз росту й експресії у струшуваних посудинах, і продукцію токсинів СтуЗз4АбрІ1, Стуз5АБІ і
СтузВа1! для характеристики, включаючи зв'язування рецептора Ві і біологічний аналіз комах, здійснювали штамами Р. Ріпогезсеп5, що містять експресійні конструкти, вирощеними у струшуваних посудинах (наприклад, клону РМУС2593 для СтуЗз4Ар1, рМуУсС3122 для СтуЗ5АБІ, і рМУсС1177 для СтгузЗВаї). Культури, які висіваються, вирощені в середовищі І В з добавкою 20 мкг/мл тетрацикліну, використовували для інокуляції 200 мл того ж середовища з 20 мкг/мл тетрацикліну. Експресію токсинів СтгуЗз4АБІ, Стуз5АБІ і СтуЗВа1 за допомогою промотору Ріас індукували додаванням ізопропіл-В-О-1-тіогалактопіранозіду (ІРТО) після початкової інкубації протягом 24 годин при 302С при струшуванні. Зразки культури брали під час індукції й у різні часові точки після індукції. Густину клітин вимірювали за оптичною густиною при 600 нм (ОЮбвоо).
Приклад З - Фракціонування клітин і аналіз 505-РАСЕ (електрофорезом уУуУ бо поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію) зразків зі струшуваних колб
У кожну часову точку взяття проб густину клітин зразків доводили до ОЮвоо-20 і аліквоти об'ємом по 1 мл центрифугували при 14000х9 протягом 5 хвилин. Клітинні осади після центрифугування заморожували при -802С. Розчинні і нерозчинні фракції з заморожених зразків клітинних осадів після центрифугування зі струшуваних колб генерували з використанням розчину для екстракції бактеріального білка Еазуї узе "М (ЕРІСЕМТКЕФ Віоїесппоїодіеє5, Мадіхоп,
М). Кожен клітинний осад ресуспендували в 1 мл розчину Еазуї узе мМ і додатково розбавляли 1:4 у літичному буфері і інкубували зі струшуванням при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. Лізат центрифугували при 14000 об/хв протягом 20 хвилин при 42С, і супернатант витягали у вигляді розчинної Фракції. Потім осад після центрифугування (нерозчинну фракцію) ресуспендували в рівному об'ємі забуференого фосфатом сольового розчину (РВ5; 11,9 мМ
МагНРО», 137 мМ Масі, 2,7 мМ КСІ, рН 7,4). Зразки змішували в співвідношенні 1:11 буфером зразка 2Х Іаетютії, який містить В-меркаптоетанол, і кип'ятили протягом 5 хвилин перед завантаженням на гелі МИРАСЕ Момех 4-20 95 Вів-Ттів (Іпмйгодеп, Сагізрайд, СА). Електрофорез виконували в буфері, який рекомендується, ХТ МОР5. Гелі фарбували безпечною фарбою
ЗітріуВічетм Заїе Зіаїйпй стосовно протоколу виробника (Іпмйгодеп) і візуалізували з використанням візуалізуючої системи Турпооп (СЕ Неаїйсаге Ге Зсіепсев, Рінбзригоп, РА).
Приклад 4 - Отримання тілець включення
Препарати тілець включення (ІВ) білка Сгу отримували на клітинах у результаті ферментації
Р. БРіногех5сеп5, що забезпечувало продукцію інсектицидного білка Ві, як було продемонстровано ЗЮО5-РАСЕ і МАГОІ-М5 (лазерною десорбцією при сприянні матриці/онізаційною мас-спектрометрією). Ферментаційні осади Р. Поогезсеп5 відморожували на водяній бані при 372С. Клітини ресуспендували до 25 95 мас./об. у літичному буфері (50 мМ
Тріс, рН 7,5, 200 мМ Масі, 20 мм динатріевої солі ЕОТА (етилендиамінтетраоцтової кислоти), 195 Топ Х-100 ї 5 мМ дитіотреїтолу (01Т)); безпосередньо перед використанням додавали 5 мл/л коктейлю інгібітору бактеріальної протеази (Р8465 Зідта-Аїдгісй, 51. І оці5, МО). Клітини суспендували, використовуючи гомогенізатор при установці на найнижчий режим (Тіз5це Теагог,
Віозрес Ргодисів, Іпс., Вапевзмійе, ОК). До клітинної суспензії додавали лізоцим (25 мг Зідта
Ї7651 з білка курячого яйця) змішуванням металевим шпателем і суспензію інкубували при кімнатній температурі протягом однієї години. Суспензію прохолоджували на льоді протягом 15 хвилин, потім обробляли ультразвуком, використовуючи ультразвуковий генератор Вгапзоп
Бопійег 250 (два 1-хвилинних сеанси, при 50 95 робочому циклі, продуктивність 30 95). Лізис клітин перевіряли мікроскопією. При необхідності, додавали додаткові 25 мг лізоциму й інкубацію й обробку ультразвуком повторювали. Коли лізис клітин підтверджувався мікроскопією, лізат центрифугували при 11500х9 протягом 25 хвилин (4 "С) з утворенням осаду
ІВ, ї супернатант видаляли. Осад ІВ ресуспендували 100 мл літичного буфера, гомогенізували ручною мішалкою і центрифугували, як вказано вище. Осад ІВ повторно промивали ресуспендуванням (у 50 мл літичного буфера), гомогенізацією, обробкою ультразвуком і центрифугуванням доти, доки супернатант не ставав безбарвним, і осад ІВ ставав щільним і не зовсім білим за кольором. Для кінцевого промивання, осад ІВ ресуспендували в підданій стерилізаційній фільтрації (через фільтр із розміром пор 0,22 мкм) дистильованій воді, яка містить 2 ММ ЕОТА, і центрифугували. Кінцевий осад ресуспендували в підданій стерилізаційній фільтрації дистильованій воді, яка містить 2 мМ ЕОТА, і зберігали в 1 мл аліквотах при -8020.
Приклад 5 - Аналіз БХО5-РАСЕ і кількісне визначення
Аналіз 505-РАСЕ і кількісне визначення білка в препаратах ІВ проводили відтаванням 1 мл аліквоти осаду ІВ і розведенням 1:20 підданій стерилізаційній фільтрації дистильованою водою.
Потім розведений зразок кип'ятили з 4Х буфера зразка, який відновлює, (250 мм Тріс, рН 6,8, 40 95 гліцерол (об./06.), 0,495 бромфенол синій (мас./06.), 895 5О5 (мас/об.) і 895 вД- меркаптоетанол (об./06.)| і завантажували на Момех? 4-20 95 Тріс-гліцин, 1242-ямковий гель (Іпмігодеп), який працює з буфером ІХ Тріс/гліцин/505 (Іпмігодеп). Гель задіяли протягом приблизно 60 хв при 200 вольтах, потім фарбували і знебарвлювали наступними процедурами з використанням безпечного барвника 5ітріуВіце"М Заїе 5(аїп (Іпмігодеп). Кількісне визначення цільових смуг проводили порівнянням денситометричних величин для смуг, у порівнянні зі зразками бичачого сироваткового альбуміну (В5А), обробленими на тім же гелі, для побудови стандартної кривої, використовуючи програмне забезпечення Віо-НКай Оцапійу Опе.
Приклад 6 - Солюбілізація тілець включення 10 мл суспензій тілець включення з клонів Р. Пиогезсеп5 МК1253, МК1636 і МК832 (які містять 50-70 мг/мл білків Стгу3з4АБІ, Стуз5АБІ ії СтузВа!, відповідно) центрифугували при установці на найвищий режим мікроцентрифуги Еррепоадогі моделі 5415С (приблизно 14000ха) для осадження включень. Супернатант буфера для збереження видаляли і заміняли 25 мл 100 бо мм буфера ацетату натрію, рН 3,0, і відповідно для СтуЗ4АБІ, і для Стуз5АБІ, і 100 мм буфера карбонату натрію, рН 11, для СгуЗзВаї1, у конічній пробірці ємністю 50 мл. Включення ресуспендували, використовуючи піпетку, і перемішували у вихровій мішалці для ретельного змішування. Пробірки поміщали на повільно обертову платформу при 42С протягом ночі для екстракції білків СтуЗз4АБІ, Стуз5АБІ1 і СтузВа1 повні довжини. Екстракти центрифугували при
З0000ху протягом 30 хв при 42С і зберігали отримані супернатанти (які містять солюбілізовані
Сту-білки повної довжини).
Приклад 7 - Усікання протоксинів повної довжини
Білки СтуЗз5АБІ їі СтуЗзВа! повної довжини були зрізані або розщеплені хімотрипсином або трипсином для отримання хімотрипсинових або трипсинових фрагментів їхньої серцевини, які являють собою активну форму білків. Зокрема, солюбілізований білок СтузБАБІ повної довжини інкубували з хімотрипсином (з бичачої підшлункової залози) (бідта, 5. МО) при (50:1-Сгу- білок:фермент, мас./мас.) у 100 мМ буфера ацетату натрію, рН 3,0 (приклад 6), при 4 "С при обережному струшуванні протягом 2-3 днів, у той час як білок СгузВаї! повної довжини інкубували з трипсином (з бичачої підшлункової залози) (бЗідта, 5. МО) при (20:1-Сгу- білок:фермент, мас./мас.) у 100 мМ буфера карбонату натрію, рН 11 (приклад б), при кімнатній температурі протягом 1-3 годин. Повну протеолітичну переробку підтверджували аналізом 505-
РАСЕ. Молекулярна маса СтузБАБІ і СтгузЗВа!1! повної довжини дорівнює приблизно 44 і приблизно дорівнює 73 кДа, і їх хімотрипсинової або трипсинової серцевини дорівнює приблизно 40 і приблизно дорівнює 55 кДа, відповідно. Амінокислотні послідовності повної довжини і хімотрипсинової серцевини Стгуз5АбБ1 представлена у виді ЗЕО ІЮ МО 1 ії 5ЕО І
МО:2, і амінокислотні послідовності повної довжини і трипсинової серцевини СгузЗВа! представлені у виді ХЕО ІЮО МО:З і БЕО ІЮО МО:4. Ні хімотрипсинова, ні трипсинова серцевина не доступна для СгуЗ4АБІ, і таким чином, для аналізів зв'язування використовували Стгуз4АБ1 повної довжини. Амінокислотна послідовність Стуз4АБІ повної довжини представлена у вигляді
ЗЕО ІЮ МО:5.
Приклад 8 - Очищення зрізаних токсинів
Очищали серцевинні фрагменти хімотрипсинізованого СтуЗзБАБрІ!І і трипсинізованого
СтузВа!1. Зокрема, розщеплені матеріали центрифугували при 30000х9 протягом 30 хв при 47С для видалення ліпідів, і отриманий супернатант концентрували в 5 разів, використовуючи
Зо пристрій з центрифуговим фільтром з регенерованої целюлози Атісоп ОКга-15 (відсічення молекулярної маси 10000; Мійроге). Потім буфери зразків заміняли буфером 20 мМ ацетату натрію, рН 3,5, як для СтуЗ4АБІ, так і для СтузБАБІ, і 10 мм САРБ І|З-(циклогексаміно)-1- пропансульфонову кислоту), рН 10,5, для СтуЗВа1, використовуючи одноразові колонки РО-10 (СЕ НеашШсаге, Різсагамжау, МУ) або діаліз. Кінцеві об'єми доводили до 15 мл, використовуючи відповідний буфер для очищення з використанням системи рідинної хроматографії АТКА
Ехріогег (Атегзнат Віозсіепсе5). Для Стгуз5АБІ, буфер А являв собою буфер у вигляді 20 мМ ацетату натрію, рН 3,5, і буфер В являв собою буфер А-1М Масі, рН 3,5. Використовували колонку НіТтар ЗР (5 мл) (СЕ). Після того як колонка була повністю урівноважена з використанням буфера А, розчин Сгтуз5АБІ інжектували в колонку при швидкості потоку 5 мл/хв.
Елюювання виконували з використанням градієнта 0-100 95 буфера В при 5 мл/хв із 1 мл/фракцію. Для СтузВа1, буфер А являв собою буфер у вигляді 10 мм САРБ5, рН 10,5, і буфер
В являв собою буфер у вигляді 10 мм САРБ, рН 10,5-41М Масі. Використовували колонку Саріо
О, 5 мл (5 мл) (СЕ), і всі інші процедури були аналогічні процедурам для СтузБАБІ1. Після аналізу 5О5-РАСЕ вибраних фракцій для додаткового вибору фракцій, які містять білок-мішень найкращої якості, фракції об'єднували. Буфер для очищеної хімотрипсинової серцевини
СтузБАБІ заміняли 20 мМ Віві-Тгі5, рН 6,0, як описано вище. Для очищеної трипсинової серцевини СгуЗВаї!, сіль видаляли, використовуючи одноразові колонки РО-10 (СЕ Неайнсаге,
Різсаїаулау, МУ) або діаліз. Зразки зберігали при 49С для пізніше проведеного аналізів зв'язування після кількісного визначення з використанням 505-РАСЕ і аналізів системою візуалізації Турпооп (СЕ) з В5А як стандартом.
Приклад 9 - Препарат ВВММ
Препарати пухирців мембрани щіткової облямівки (ВВММУ) середньої кишки комах широко використовуються для аналізів зв'язування Сгу-токсину з рецептором. Препарати ВВМУ, використовувані в даному винаході, одержували з ізольованих середніх кишок третьої вікової стадії західного кукурудзяного кореневого жука (Оіаргоїїса мігдіїега мігуїєга І есопівє), використовуючи спосіб, описаний МУоМегрегдег ей аІ. (1987). Лейцинамінопептидазу використовували як маркер мембранних білків у препараті, і активність лейцинамінопептидази неочищеного гомогенату і препаратів ВВММ визначали, як описано раніше (Гі еї аї. 2004а).
Концентрацію білка в препаратах ВВММ вимірювали, використовуючи спосіб Вгайатога (1976). 60 Приклад 10 - Мічення 7251
Очищений СгуЗз4АБІ повної довжини, хімотрипсинізований СтуЗзБАБІ і трипсинізований
СтгузЗВа мітили, використовуючи !2чіІ, для аналізів гомологічного і конкурентного зв'язування. Для впевнення в тому, мічення радіоактивним ізотопом не усуває біологічну активність Сгу-токсинів, проводили йодування в холодному вигляді, використовуючи Ма, стосовно інструкцій з використання гранул для йодування Ріегсе? (Рієгсе Віоїтесппоіоду, Тегто 5сієпійіс, Восктога І).
Результати біоаналізу показали, що йодована хімотрипсинова серцевина Стуз5АБ1 залишалася активною проти личинок західного кукурудзяного кореневого жука, але йодування інактивувало
Сту34АБ1. Специфічне зв'язування міченого радіоактивним ізотопом 722І-Сгуз4АбІ з ВВМУ комах було неможливо виявити і, таким чином, був потрібний інший спосіб мічення для оцінки зв'язування Сту3з4АБІ з мембранними рецепторами. Оскільки трипсинізований СтуЗВаї! мав обмежену активність проти західного кукурудзяного кореневого жука, то, отже, вважалося, що біоаналізом з кукурудзяним кореневим жуком при використанні йодованої трипсинової серцевини СтузЗзВа! у холодному стані важко оцінити зміну активності. Крім того, специфічне зв'язування 7"25І-СгузВа! з ВВММУ виявляли, навіть хоча рівень був низьким. Йодування СгузВа! у холодному стані й аналіз його токсичності ігнорували. Мічені радіоактивним ізотопом 725І-
СтуЗ5БАБІ і 125І1-СтгузВа!1 отримували за допомогою йодування гранулами для йодування Ріегсе? (Ріегсе) і Ма"'25І. Колонки для знесолення на вибір 7ера"м (Ріегсе) використовували для видалення не включеного або вільного Ма'25| з йодованого білка. Величини питомої радіоактивності йодованих Сгу-білків знаходилися в діапазоні від 1 до 5 мкКі/мкг. Проводили множинні серії мічення й аналізів зв'язування.
Приклад 11 - Аналізи насичувального зв'язування
Аналізи специфічного або насичувального зв'язування виконували, використовуючи мічені 125| Сту-токсини, як описано раніше (І і еї аі. 20045). Для визначення специфічного зв'язування й оцінки афінності зв'язування (константи дисоціації, Ка) і концентрації сайтів зв'язування (Втах)
СтуЗБАБІ і СтузЗВа з ВВММУ комах, серії зростаючих концентрацій або 725І1-СтузБАБІ, або 7251|-
СтузВа! інкубували з даною концентрацією (0,1 мг/мл) ВВММ комах відповідно в 150 мкл 20 мМ
Ві5-Тгі5, рН 6,0, 150 мм КСїІ з додаванням 0,1 95 В5БА при кімнатній температурі протягом 1 години при обережному струшуванні. Токсин, зв'язаний з ВВМУ, відділяли від вільного токсину в суспензії центрифугуванням при 20000х9 при кімнатній температурі протягом 8 хв. Осад після
Зо центрифугування двічі промивали 900 мкл (крижаного) такого ж буфера, який містить 0,1 95
ВЗА. Радіоактивність, яка залишається в осаді після центрифугування, вимірювали автоматично гамма-лічильником СОВКАЇ Ашо-сСатюта (РасКага, Сапрегта сотрапу) і враховували загальне зв'язування. Паралельно проводили іншу серію реакцій зв'язування, і 500-1000-кратний надлишок неміченого відповідного токсину включали в кожну з реакцій зв'язування для того, щоб він повністю зайняв усі ділянки специфічного зв'язування неміченого відповідного токсину на ВВМУ, який використовували для визначення неспецифічного зв'язування. Специфічне зв'язування оцінювали вирахуванням неспецифічного зв'язування з загального зв'язування. Величини Ка і Втах цих токсинів оцінювали, використовуючи специфічне зв'язування, у порівнянні з концентраціями міченого токсину, використовуючи програмне забезпечення СгарпРай Ргізт 5.01 (СгарпРай Зоїмаге, Зап Оіедо, СА). Графіки складали з використанням програм або Місгозой Ехсеї, або сгарпРай Ргізт. Експерименти повторювали щонайменше чотири рази і результати наносили на графіки, показані на Фіг. ТА (зв'язування 725І-СтуЗз5АБІ1 з ВВММУ) і Фіг. 18 (зв'язування "25І-СтузВа! з ВВММ). Ці експерименти зв'язування продемонстрували, що як 125І-Стуз5АБІ1, так і 125І-СтузВа1 були здатні специфічно зв'язуватися з ВВМУМ (Фіг. ТА ії 18). 125І-СтуЗзБАБІ і 1251-СтузВа! мали афінність зв'язування
Ка-11,66:211,44, 7,35:23,81 (НМ), відповідно, і концентрацію сайтів зв'язування Вітах-0,78:20,46, 0,55:2-0,13 (пкмоль/мг ВВММУ), відповідно.
Специфічне зв'язування 725 І-СгузБАБі проводили в присутності неміченого СтуЗз4АБІ1 (молярне відношення 1:50-125І-Стгуз5АБІ1:СтуЗз4АБІ). Параметри зв'язування (Ка і Вітах) не були отримані, тому що специфічне зв'язування "22І-Стгуз5АБІ1 не було насичуваним (Фіг. 2). Однак на специфічне зв'язування 7"22І-Стгуз5БАВБ1 приходилося приблизно 90 95 загального зв'язування в присутності неміченого Стуз4АБІ1.
Приклад 12 - Аналізи конкурентного зв'язування
Аналізи конкурентного зв'язування проводили для визначення того, чи розділяють Сгуз4аАбр1 і СтузБАБІ окремо плюс їхня суміш як бінарний токсин той самий набір сайтів зв'язування з
СтузВа1. Для аналізів гомологічного конкурентного зв'язування СтуЗзВа!, який збільшуються кількості (0-2500 нМ) неміченого СгузВа! спочатку змішували з 5 ніМ 725І-СтузВаї, і потім інкубували з ВВММУ комах у концентрації 0,1 мг/мл при кімнатній температурі протягом 1 години відповідно для забезпечення їх можливості конкурувати за передбачувані рецептор(и) на ВВМУ. 60 Аналогічним чином, гомологічну конкуренцію СтгуЗз5АБрІ завершували 5 нМ 7"25І-СтуЗз5АБІ1 під час відсутності або в присутності неміченого СтузБАріІ (у молярному відношенні /1251І-
СтузБАБІ: СтуЗз4АрІ 1:50) і з ВВММ у концентрації 0,03 мг/мл, відповідно. Відсоткові частки зв'язаного з 125І-СтузВа! або 725І1-СгуЗз5АБІ з ВВМУ визначали для кожної з реакцій, у порівнянні з висхідним загальним (або специфічним) зв'язуванням під час відсутності неміченого конкурента.
Аналізи гетерогенного конкурентного зв'язування між 125І-Стуз5АБрІ і неміченим СгузЗВа! проводили під час відсутності або в присутності неміченого СтуЗ4АБІ для ідентифікації того, чи розділяють вони той самий набір сайту(ів) зв'язування. Це було досягнуто збільшенням кількості неміченого СтуЗВа! як конкурента для конкуренції за зв'язування з одним 7"22І1-Стуз5АБІ1 або 125І-
СтузБАБ1яСтуЗз4АЬІ (молярне відношення 7"25І-СгузБАБІ1:СтуЗз4АБІ 1:50). Аналогічним чином, також проводили аналізи реципрокного гетерогенного конкурентного зв'язування, яке досягалося збільшенням кількості неміченого СтузБАБіІ і Сту3з4АБіІ або окремо суміші
Стуз5АБІ1яСтуЗ34АВІ (молярне відношення Сгуз5АБІ:СтуЗ34АБІ 1:50) у якості одного або двох конкурентів, включених у реакції, для конкуренції за зв'язування з міченим СтгуЗВа!, відповідно.
Експерименти повторювали щонайменше три рази, і результати наносили на графіки, показані на Фіг. ЗА (зв'язування у відсотках одного 122І-СтуЗз5АБ) і Фіг. ЗВ (зв'язування у відсотках "251І-
Стузб5АБІ1 у присутності СтуЗз4АБІ1).
Результати експериментів продемонстрували, що СтузБАБІіІ був здатний перевершити в конкурентному специфічному зв'язуванні 725І1-СтгуЗз5АБІ1, незалежно від відсутності (Фіг. ЗА) або присутності (Фіг. ЗВ) Стгу3з4АБІ. Однак СгузВаї був не здатний конкурувати за специфічне зв'язування з 125І-СтгуЗз5АБІ1 як під час відсутності, так і в присутності Стгу3з4АБІ1. В аналізах реципрокного конкурентного зв'язування СтгузЗВа також був здатний зміститися вище 20 95 загального зв'язування, яке відбиває те, що він повністю перевершив у конкуренції за його специфічне зв'язування, тому що специфічне зв'язування складає тільки невелику фракцію (див. Фіг. 18). Однак ні СтуЗ4АБ'І, ні Стуз5БАБІ окремо, ні суміш Стуз5БАБ1жСтуз4 АБ (1:10) не була здатна витиснути 7"22І-СгузВа!. Ці дані вказують на те, що один СтуЗз5АБІ або суміш
СтузБАБІ1-СтузаАБІ не розділяють рецепторний сайт зв'язування з СтузВа!1.
Посилання:
Вгаадтога, М.М. 1976. А гарій і зепзйіме теїйоа ог (Ше диапійайноп ої тісгодгат диапійіе5 ої
Зо ргооївїп шйігіпу Пе ргіпсіріє ої ргоївїіп-дує Біпаїіпа, Апаї. Віоспет. 72, 248-254.
Ії, Н., Орреп, В., Ніддіп5, В.А., Ниапо, Р., 7пи, К.М., Визсптап, І. Г., 2004а. Сотрагаїме апаїувів ої ргоївїпазе асіїмйев ої Васіїи5 Іпигпдіепвів-тезізіапі апа-зивсеріїбіе Озігіпіа пибрііайіїв (І ерідорієга: Статрбрідає). Іпзесі Віоспет. Мо!/. Віої. 34, 753-762.
Її, Н., Орреп, В., СсопгаІє:-Саньгега, 9., Рете, «., Ніддіп5, Е..., Визсптап, ГІ... апа 2пи, К.М. і
Ниапо, Р. 2004р. Віпаїпу апаїузіз ої Сту! АБ апа Стгу 1 Ас м/ййп тетьгапе мезісіеєв їот Васйив5
Іигіпдієпвів-тевівїапі апа-зивсеріїбіе О5інпіа пибіїаїїв (І ерідорієега: Статрідає). Віоспет. Віорпув.
Вез. боттип. 323, 52-57.
Муогег5регодег, М.С, І щу, Р., Маштгег, А., Рагепії, Р., Засепі, Е., Сіогдапа, В., Напогеї, С.М., 1987. Ргерагайоп апа рапіа! сНагасієгігайоп ої атіпо асій і апб5ропіпа бги5п Богаег тетрбгапемевісіев їот пе Іагуа! тіддиї ої їе сарраде рбиценйіу (Рієгів Бгазвзісає). Сотр. Віоспет.
Рпузіої. 86А, 301-308. 5 Раїєпі Арріїсайоп Мо. 20080193974. 2008. ВАСТЕВІАЇ І ЕАРЕВ 5ЕООЕМСЕВ БОВ
ІМСВЕА5ЗЕО ЕХРАЕЗБІОМ
И5 Раїепі Арріїсайоп Мо. 20060008877, 2006. Ехргезвіоп зузієт5 м/йй зес-з5узіет 5естеїййоп.
И5 Раїепі Арріїсайоп Мо. 20080058262, 2008. ТРА оріїтігайоп.
список ПОСЛІДОВНОСТЕЙ «Вьба ро АСВОЗСТЕМСЕВ «ТИ КОМБІ БАНТК, ЯКІ аКЛюЮчЧАЮТЬ ВБЛЛКМ пкУЗЯААБІ,ЗБАВІ т СбтуЗнаї, ллЛЯ
ЗАПОБІГАННЯ РОЗВИТКУ СТІЙКОСТІ В ОКУКУРУДІЯНИХ КОРЕНЕНИХ ЖУКІВ сБізрковзсх вор.) «а АВ ЕХ ЦБ «1505 «К7йе Ваєвастй Ууєкніовп 3.5 спі ії «2115 ЗНЗ «кій БВ «їз» Басівійв спюхідціепвІв -400» х
Ме грец АБО ТЕ Авп опуБ туаї тую ші Їі65 бек АБоп нія Аза дя ос1у
Ії 5 13 15 їжа Тух Аїа віз ТпЕ о Тух їду; Бех бен АБр о йно бек сту уаї Бек це до 25 430
Ммеє Аби був вай Дер оАво Аво її Авр о Ав ТУух Авип ої Був тТкрорце 15 40 45
Без Вде рео Х18 дер АБр одврозій тТух Ті хів твг Бех тує вій АТа 0 за І 6
Аква дви Сув Був Уа) Те Ави оУаї АвлоАНп о дво Був ї1є АБ Зав вех 655 75 та що трі Тук Бех бек тих Ап бек 12 біп бує Тур бід Ї1е Був Віз дав зо З піт Бех Бек Тух уаї хів б1їіпобек дар овво біу пув Уві безпо тв дія 100 105 115 сіУ Тв біу шій діа їва бЗіу без її йха їек ТБх Авробій бек Вех 5 Що тав
Ав» вва вкОо Авпосід сіб Ткб оабвпи огелй СВе бет тав осапо тих іа 1
ТАЗ ІЗ5 х5 цей вто біп ув о вхо їі іє двроТбх Був оцей їжа ВЕБО бух Вхе Пух 145 й ї585 Ії , тук Бак руш Твж Сіу два ї1є Авр о Ави сту ТвК беж РКО Сі Ппемо МЕ х5Б5 170 175 сіу ТЕ тах цеп уаіїі Ро Сув ті Мек уві Зві Вер Ро АБИ ТТ Дер ї89 185 аз уз дО ТНК сій ї3Зе Був Таж ТК рЕО ТУЮ ТУЮ Ті рем обув Цує ТУК їз 255 285 сеї тує Тер бій Яка Вів Уаї З1у бек Ав Уаї Ат ївЗ Аха ро нХВ гії0 2У5 Во
Зіш був Був бек Тук Тк Тук ба Ттросіу ТВж біб тів Ав» бів цув й 3235 735 за
ТЕ тТВу жі Ті1е АвпоїВХ рез бт1у Ре бій ї1іє Ав о ї1їє АвроБек сту 245 250 255
Мет пу Біє Ав» о ї3із Бк Бій Уаї сбіу 21у б1у тих Авробів Тіе ув або 255 270 тиж бій Бей АввобЗіф сім рей о їуж ї1в 81) Тук ех Нів СЄтй ту Був 275 25 285 їїе Ммеб сіц був Тут бів обім бів бек бій Іі Авр деп ро Тих Або 290 255 зай сій Беї Мес Авповек ТієЄє бі рпе Бей тик Хі твж беж ей сій цей заБ зо З 3260 тТук'Ажу Тух Аа обіу Бек бІш ї1е вро ті Мебє сій ї1ле біб твЖ бек 355 330 за
Авр о Авап АбролвК о Тух Ав охаї ТИЖ бех Тує Ро Ана нів сій підоАїа 145 45 350 цем їшиа Бей оїцео ТИ Аший Нів Ббеє тТух бій сх Ууаї Зам бій тів тВх з55 зб зЕБ:
Авпотів Вкго Пуш бек Жак їбей Був був їм о Пуз о ПувотТух тТух вве 370 37 280. «каМож я «віх 54 «ій РТ «аа» Васііїсцв спагіроієсвів «УП
Меж Ге Авр отак Авпобув Уаї Тух біц Ііє Бех Двп нів Ала ДвпосТу ї 5 10 5
Гео тТук о Аіа Ата ТБх тує пец бех ей йшр о двробек ПТУ Маїф беж лем кі 25 30 мес оАвнп був АБ дер АвроАве ї1іе АБО дЕЮ Гук Ай Ццез Ммуд Тв оСвНе 35 0 45 грец о впе рхт Ті Авр дво Аво обіп Тук Хї18 Ії їх бек тує діа діа
БО 5 50
АвпоАБп о Сув Ббуз Уві Тк об аз Аа АБи АвроБув ї4е Ап оУулаА бБевЕ 55 70 75 і:
ТІ ТтТук беж бек Тк Авпошеж Тіє бій Був ТЕр сів ї31е Був Аїв дав в 90 5 зЗіу Бек бек Тук Уа дів пу беж Азро Аза біо Був маї без отвЕ дія 159 жо їх білу твх су ші Ада Без сту Бей тів дк беб ТВ дна ілі бек Вех 120 125 ана Ава Рко Ав оЗзінв сій Тхр Ав) Перо оту бек чаї Зійп отвж тфе Ба 15 ІВ 14
Бец Рка сій Був о бге Ті тів АврожНЕ Був оре) руд Авеотрю вус: Був 155 і55 155 186
Тут Бек Рто ТЛх Зі Авп огіе Авродйвао о1їу Тк дей Руб Зі гвц оМеб тав што 75
ЗіУ То тах це ча) Его Сув тіе мес Уяі ВВ дерорЕо АБпотіє Аве 180 їя5 199 пув Авт ТР обіа ї1є Пуз ТВ ТвВх о Бко Ту Тую Ті цец був Буз Тук 95 оо 295 іс ТукотЕр осів Ако Аїа уві біу Бех деп Мав Аза пес; бу вко нів іо з4і5 па
Зіч Був пу бетк тух тако оїух аа откр о біу ти оплаті дер сїй Був за ЗО 235 Зк тТВжОТВЕ тТіє Ті Авп отв Бей у вве бів ої1їє Ат Т1е Аве бек 015 зав 250 каз:
Мек Був ве Авр тів Ртгз сї10 уаї сту сіу СБу ТпЕ Ар обі 1І1є Був зво 265 270
Тк біпоїви Аа біш бій Бей був Тіз біб Тух бер Нів сіб ТВ Був
В на) ДЕ
Іів Мек бім цув Тух бід біц бій Бех піп ІЗе Авр вва Руб ХХ дер аа 5 з
Отпобек Меє Бей бек їїе СБУ Рпе беч Три т14 твк бек іїєц та Та ха5 я З15 зо тТук Ага ТУуЖ Ап обіу шек січ Гі Дре тів о Меб сій хз лій ЖК одех жах 3535 заБ
Квр Ави ввр отак тТУух вв оУуді Те шек ТУж ко Ай Вів о піш та дів же 345 350
Яви Пеб «дО ої «її» 655 вій» ВИТ «ва» Ватііїцпвев Єпахівуієрдвія «0» З
Ме їЇї2е Ака Ме Зїу біу йо Пув Меб Ав) Рго два Ап о АкЯ дек ді 1 сі 10 15
Тух Авр о Тпж їі Буш Ууал Тк орКОо АвпоБекж бій сфе вро Тр АБИ ній ме, 25 30 два осі тут Ко рем Аїа Двр одн РКО Ав Бех отак Бев січ бір ей а 5 авпоїух Був сім впе рес АкУу Мес Тех йїа дер осв бек Тат біц ді
Ек 55 5
Тем Аврошех Бех ТВх Уаї пуб б5роАЇїв Мав ос1у Та опіу тіє бек уві ак та те чо чаї біт сів тів без» сзу Уві ба сіу ді вБео сне Ат с1у АТа гео 85 Зо 95
Тпж Бех рпе ТУуХ БМ Бех Бе еп совза АТа 318 Тур око БК Ар о Ат
Тс їп5 То дер РКО Ткробув діа Рке: має Аїа Сів Уві Ха Уаї цей їте Авроцув
115 шва ї25
Був їі дій бій тую Ліз цу бек Пув Аїа Бей діа пд їец біл 1у. 36 35 155 тей сію Ав Ввопорне сій АвроТут маї Вао вій ей Абр Бех откр о цув 145 150 155 їв
Буш Аза РІо Уві ДЕ їец Ахо век Ак Аха бек біб Ар ке ї1є Аку ї65 їто Мі сій о бец Рие бек йівй АТа сій беж Ні РБе дра АБп Чек Меб Буо Зет зво їн 89
Впре Віа Уві Бех Ммув Бе ОБи Маї ем Ре ї-о бо Тк Тук Аза сів 155 200 205 діа Віа Авп о Твх Нів цец йем Пец еп Зуб Авр дів іп Маї Вбе бі о 218 р ім ЗБи Тк бїу Тух бек Беє 51з Ар її Аза бі Ре Тут біп бо аа ЗО. 5 а) сіп Без пу ва їх Сід бія Тук Тбк Авробів Сув Заї двпотТтро тут 245 2Б5О 255
Ави Чаї бі Ппез Авпобеє їм ке біу бек Так оту бер Дія Тюо хУА1 280 йеБ ло
Бу Бі ЗБв Аку Рпе Ага Аха бім Меб ТЕХ боб Ту уаї пей др цей 275 850 25
Її Уві бен Бе Рко Бе Тує Б5в Ма) дхч їву Тукобахк пув біу аз 230 295 369 їув Тс обіц рем ТЕк оАКЯ Авротів Рне Таж АвроБхо ї1є рРає Тих рей 05 31 345 зай
Авп о АЕа цеч бапобзіп о тух 015 Вко ЖНу впе Бек Бек оІїле бак Авт бе за Зхо зї5
І11е вжЯ цув РО нія іжа Не вар отут цей те біб тів сій Бйе нів за 345 150
Тіт Акя Те вВгч го піу Тух бек обі Був зво бек Бе Ап отТук ТЕ 355 50 Зе5
Беж СВУ Ап Жут Чаї лій ТБ душ ро Бех т1іе Сіу Бек вл о дДрр ТВхЕ 37 5 зво т1е тТНУу Зак орЕо Ре Тук фу Аврв обу Беж оліє бїіш Вб Її Фі мук зво 325 335 «оо рем Бех РБе Авр осзіу бій му Уаії тух Ак тру 12 Аїв деп тлк ВЗдо 405 Зо ах її Аіз Аїа Ре Бко Авр о Зіу був тіє тую Ре З1іУ чаю Тех ув ув жо 425 43
Авр рце Зах сій тує двр дер Зій рубБ Ав с1й Тв обес Тих біб тТвЕ 43 пай «45
Тук Авр о зек пу Аха Тук дві осту Тух пвй біу діа сій дер Бек тів по ач «о
АЮ сій це Бк Ре б) ТЕ оту АББ обі руб реч 013 пув АТ тую 45 47 Аль во дек Нів біп Ппез дві Тух діа сій Сув Бе деп Мек ба Ар Аа Ага щнЕ же 85
Фіу ТвжЖ тів рко Рде ре тиж тТхр о тТвЕ Нів Ате Бех Уаї Ар ВНе оне
В 5 БІС
Авп Твк те Авр.Ата бій Був сті ТОЖ Сай реш ржоО суаї уяі був дія з вай БЕ тТук піз Бей Бех Беж біу діа бек 11їе їі су: б1у рро біу Рів ТЕ
ВЛ вах БЕ зі шху Ава реч Бей Бце рез Був с цЯвк Бех Авт век тів Кра Був:
ЗЕ БА вЕВ во
Бре Був Уаі Тих оїей Ава бек Аза Аза дез бец бій лк тТук о Вжит уві ва то вла
Ах тів ва ТУух Аза бех Тбх тЬх йди їв) ДЯ їем Бе уаї бів АБп
ЗВО -вв5 ко ех Ав обБ) дар оРре без Заї тіе Ту Її Аяп оГув Тйх Мебс Авпої1е вах об 5О5 дер обіу йвроїец Тож Тукобій Так Рпє ДвЮю Біве діа тах Бек Авп Бас вий еїк 30
Ав! оМес б1у вде бек сту Абвр ТВ ВЗ о АвроЕве хів їіе СІу вла біч во 35 40 бек Різ уаї Беж Явп січ був їТе Тут 11е АвроМмув ТІїв піч БРде 112
БУ 550 655
Рис таї сій «ам ох «діїз яча «вій» ВКЕ «віз» ВасітїїйЕ СБигісдівивів «кій Я
Бех Сів Ар о Ака І118 Ак біс бас Пе чех біп дія біг бек нів Ра: ї 5 10 р лха дпа Бек Меб рко Бех Рпе Аїа Чаї Бек пу РБе біч Маї рем рве до ша 30 їевовко тіж ТтТух Аіл Сів біа Зія дев Тв оНів ївм тез бей Бей Був 0 45 дяр дій сів чаї Ре бі спи бій Тїр о біу Тух бек бек бій йдвр отіє во 5 БО іа іч Бе тух бір Вуш біп т) Ілбя їз Тпк бі сти Ту Тн: Дер 7У 75 во
Нів Сув Уві Авл Тр о Тує Вяз Уаї біу їй йвп Зв Шев дху сту Вех 85 Б 5-5 тв тТух Авр одів Тр Уві му ре Ал Ага впе дро дта спйл Меї тих
У У ; У З 5 : 190 305 я їм Так чаї Тез дер без Ї1є Уаї цем Ра Бо Бе Тук Ави чаї ка 115 128 ї75 їши ТУужЖ Бек пу чіт Уві був Ук біб Бей тн Акч вдо ті рНе ТЕ 0 тЗ5 ка
Во Еко ЇЗе вне ТВу Бей Двп о діа Тер бій бі Тук 21 ру Тк орве їх МВ: 155 5
Зак бек тіє сій АєлоБеї іє дк Був рхо Нів бе) Бке Агро тую тем й ї65 Її РЕ вВжа лу їз біз впе Ніє ТЕ Ак без АкФ ро сіу Туюк Бех шіу Цув т8б ха їв
Ар обеат Ба Ав о тТУХ Тхр бек сіу Ав) Тук Уві біц тТвк вка Рус бек ха 205 ах
Те СІУ бек Аа Аво Ту Ті Твк одех реко РпесотТук п1іу дДяр о йпуюд Бек о ІВ 28 т.е пика Бека їїе спід Був Гей йеж Ре АвБробіу бЗіп Бов о таї Тух АКУ лях ази 2135 40
Тих її діа Ав тн Авроліє Вій Ата Бе РЕо дврозіу ух Тів тТух 255 У див ре сіу Уаї Тв був уаї дер бе беж бів тую АвродЕр бів їде дей. ей Ба 27В зи тв Бей так бів тТвх тує двр Беж зу Ак тТук дп іо тух о пец ат 2 зв іт Аза біп дер бек Ті АБ обі Пе ро РЕб с16 тв Ту АБО Щи зо 95 зао
Ехо Бей сій; уув Аза Тухк Бех Ні бій без Ав Тук Атв бім був вне зо 30 315 зво їц мас біз АБроАкКчЧ оАКЯ ЗКУ ЖВг те Бко ве РБе їн ткв ТЕ о Бів 325 335 3135 вха Бех уай Авор о Рце Рпе Анп отих Ті дер Азїйа біз пуб Тіє ТВт бій 341 34 350
Мей рко уві Узі Бук діа Тук Віз їв бек Бежосту Аза Шек їл1е Ті зв 365 зЕе5 ді піу Рко білу Ре Теж обіу біу двп о йву їем о Рає їжа був білі ех зо Зв зва
Зех Авд Бех 218 Аза був Рре пуй Уві Трх Бей Аяп бек Аїя Віа тей 385 250 155 0
Бен озіп вх Тек Аа Уві Акеа Ііє Аха Тук дія Бех Тдхо тах Ав цей
В я 315 ; З
Вуха пе) ре Уві біп йеп Бех дБ дей Аве Ве Гец уаї їі тух її 80 425. Яр дви Був Тих Мей Ав ї1іе Авр біу АБр оце) тах Ту ар ТпЕ оае Авр 435 449 445
Ева діа т Беж Авц бек дп Ме; сіу РНе нех Блу АБО тТИкК Аді Ао
Я 58 зо ве Ії ї1е с біу Ата сій бек гео уаї Чек Ави піц пу їїє Тук ЩІ1Є ав 47о 475 з80 дво» о їв о їів зі ЕБе іє бЕб5 Уа БІ 85 «Іі 5 -2її 183 «8182 РЕЖ «пла» Васіїїїсв српихідаіеавів «аййх Б мех Бех віз дхяЯ біз Уаї нів лів АБр уві Авип АБи бує Тк сту нів ї В Ід 15
ТЕЖ Бе сій деп ЗТ АБроПпув Таж Був бе) дев ЗіУ ху вка ТжЮ да 20 25 зо таж Векоруо Тр дея узі Аза дай Авр ОПІВ Іїе Був ТрБх Ре Заї Аїа 35 40 45 іа Бех Азвпобіу врне Мек тах біу Таж сх с1у ЖБт хів оТук тук век що 55. ва тіе Авй зі бМі Аїя біо тів Яех фей Тук Рпе двр дет рис рве АТа 7 75 во сіу Бек Ав їув Тук двр сіу НІВ Бек йвюп їв Зах пів Тухк щі Хе їтїе ве Я1в сіу йіу щех Я1У Ав вій бек опівз Уді ле тТуУуж Ттиж Ще 106 то5 116 сій Три Тв обех бек о дха тує біу нів Буг Яех

Claims (25)

115 159 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Трансгенна рослина, яка продукує білок СтуЗ4АБІ, білок СтуЗз5АБІ1 і інсектицидний білок СтгузВа!1, причому білок СтуЗзБАБІі і інсектицидний білок СтуЗзВа! зв'язуються з різними рецепторними сайтами зв'язування в кишечнику кукурудзяного кореневого жука.
2. Трансгенна рослина за п. 1, причому вказана рослина додатково продукує четвертий інсектицидний білок, вибраний із групи, яка складається з СгузЗАа і СгубАа.
3. Насінина трансгенної рослини за п. 1 або 2, де вказана насінина містить ДНК, яка кодує білок Стуза4АБІ, білок Стгуз5АБІ і інсектицидний білок СтгузВа1.
4. Множина рослин, яка містить множину трансгенних рослин за п. 1 або 2.
5. Множина рослин за п. 4, де вказана множина рослин додатково містить резервні рослини, які не містять Ві-білки, де вказані резервні рослини складають менше ніж 40 95 усіх культур у вказаній множині рослин.
6. Множина рослин за п. 5, де вказані резервні рослини складають менше ніж 30 95 усіх культур у вказаній множині рослин.
7. Множина рослин за п. 5, де вказані резервні рослини складають менше ніж 20 95 усіх культур у вказаній множині рослин.
8. Множина рослин за п. 5, де вказані резервні рослини складають менше ніж 10 95 усіх культур у вказаній множині рослин.
9. Множина рослин за п. 5, де вказані резервні рослини складають менше ніж 595 усіх культур у вказаній множині рослин.
10. Множина рослин за п. 4, де у вказаній множині рослин відсутні резервні рослини.
11. Множина рослин за п. 5, де вказані резервні рослини розташовані блоками або смугами.
12. Суміш насіння, яка відтворює трансгенні рослини, що мають стійкість до кукурудзяного кореневого жука, яка містить резервне насіння від резервних рослин, які не містять Ві-білки, і множину насіння за п. 3, де вказане резервне насіння складає менше ніж 40 95 усього насіння у суміші.
13. Суміш насіння за п. 12, де вказане резервне насіння складає менше ніж 30 95 усього насіння у суміші.
14. Суміш насіння за п. 12, де вказане резервне насіння складає менше ніж 20 95 усього насіння у суміші.
15. Суміш насіння за п. 12, де вказане резервне насіння складає менше ніж 10 95 усього насіння у суміші.
16. Суміш насіння за п. 12, де вказане резервне насіння складає менше ніж 5 95 усього насіння у суміші.
17. Множина насіння за п. 3, яка міститься у мішку або контейнері, причому вказаний мішок або контейнер не містить резервного насіння.
18. Спосіб боротьби з розвитком стійкості до Сгу-білка в комахи, згідно з яким висівають насіння за будь-яким з пп. З або 12-16 для одержання множини рослин за будь-яким з пп. 4-11, і контактують вказану комаху із вказаною множиною рослин.
19. Множина рослин за будь-яким з пп. 4-11, де вказані рослини займають більше ніж 10 акрів (40,5 га). Зо
20. Трансгенна рослина за п. 1 або 2, де вказана рослина являє собою рослину маїсу.
21. Рослинна клітина трансгенної рослини за п. 1, де вказаний білок СтгузбБАб1 щонайменше на 95 95 ідентичний послідовності, вибраній з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО:1 і 5БЕО ІЮ МО:2, вказаний інсектицидний білок СтузВа!1 щонайменше на 95 95 ідентичний послідовності, вибраній з групи, яка складається з БЕО ІЮ МОЗ і ЗЕО ІЮО МО:4, і вказаний білок Стуз4АВ1 щонайменше на 95 95 ідентичний 5ЕО ІЮ МО:5.
22. Трансгенна рослина за п. 1, де вказаний білок Сгуз5АБІ1 містить послідовність, вибрану з групи, яка складається з БЕО ІЮ МО:1 і 5ЕО ІО МО:2, вказаний інсектицидний білок СтгуЗзВа! містить послідовність, вибрану з групи, яка складається з БЕО ІЮ МО:З і БЕО ІО МО 4, і вказаний білок Сту3З4АБІ містить ЗЕО ІЮ МО:5.
23. Спосіб одержання рослинної клітини за п. 21, за яким клітину трансформують ДНК, що кодує білок СтуЗ4АБІ, білок СтуЗ5АБІ і інсектицидний білок СтгузВа!1.
24. Спосіб боротьби з кукурудзяним кореневим жуком, за яким приводять у контакт вказану комаху з білком СтгуЗ4АБІ1, білком Сгтуз5АБІ1 і інсектицидним білком СтуЗзВа!, причому білок СтузБАБІ і інсектицидний білок СтгуЗзВаї! зв'язуються з різними рецепторними сайтами зв'язування в кишечнику кукурудзяного кореневого жука.
ча Я 45 -«е Загальне зв'язування ІН : Од , я Неспецифічне зв'язування ве 10 7 ко ; «як Специфічне зв'язування до ов - ру де Е ; - ; оф і роя . - 02 Не и во о 2 а 6 8 ж в б5роувам ТЯ ОК жу Вях «а- Затальне зв'язування в ; й Сх З зе Песпенифічне зв'язування -еВ і пе бпецифічнезв'язування - У -8 « ее кот, Кова і що і ж - а 5 16 15 20 125 скузвн Е Во хо: вк из - . - ЗВ'ЯЗУВаВНЯ з Ч-Стуз5АВі (АНТ СТУЗНаї (8) як функці внесевух мічених радіоактивним зетопом сСту-токсиців (им) у ВВМУ (мембранних пухирпцях щіткової облямівки) у концентрації 0,1 мг/мл, отримамих з лизинок західних кукурудзяних кореневих жуків. Специфічне зв'язування «загальне зв'язування «песпецифічне зв'язування, «вуса» є ЗЕМ (стандартна помилка середньої СгУЗ5АВІ: хіметрипсинізована серцевий (40 кДах і СеуЗВаї: трийсинізована серценина (35 кДа). «Фіг і шо ре. Ме ва - п 12 ба в ш ж Заг альнезвизування. т 36 | «вн Неспецифічне зв'язування ща и же Специфічне зв'язування - В ри й - 7 й ; ме : -к В У в 4 А в в 12 5:4 556789 терстузвАн Зв'язування Р СеЗаАВІ в присутності СеуЗЯА ВІ (50 мівлярне відношення СтуЗЗАВЕСТУЗЯАЬІ) як функція пнесеного міченого радіовктинним ізотопом сСтузЗАВІ (нмуу ВВМУ у концентрації 0.03 мглал, отриманих з личинок західних кукубулзяних коренених жуків. Специфічне зв'язування Загальне зв'язування - неспенифнне Зв'язування; «вуса» 5 ЗЕМ (стандартна помилка середньої). СУУЗЗАВІ: жімотриненнізовава серцевина(40 кДа) Фіг; 2
А тиви нер отуЗо г 129. соки сикатнжьжнкькьим, г о оминннн м и енока УМД х я й вогкість х к. СА удеюжрст тк ТВ КК КТС Ж, тн нткжАТНСКК КК ділєтія та - сни подо СУ ЗБАБА : ЖЕ 5 фр и «Я Б КУЗЯ 000 ; ш 43 полички ВВ вними нн нн нн й Я 5 со НЕЗ їх 15 20 25 зо в Стузалеч стуЗа (БОГ) ше Тр ч ж ок нин нн ни нн У АДФ рення куріння кт нкню ня тт тт тт тя Ов фрннннюнниннх БАЧ я я йо; фонннннннтнттттнтт ЕН сплю СХуАКНІ й Ме и АННИ ЗУ Зешції Е 5 боутннюня Кнннниі я 19 Гоа 05о 98 12 15 У 25 за 38 «0 Конкурент (нм, логарифмічна їнкала) Процентна застка позвукового спепифічного зв'язування 5 сС»а5Авіз ВИМ у ховцептрації 01 мг/мл (пепель А) аба в ковцевтранії 0,03 мг/мл (пансль В), осзримазими з лизинок західних кукурудзяних кореневих жуків, при різних г є я к -. іх ж 1. концентраціях немічених конкурензів, інкубованих
25. НМ р СТУЗ5АВІ окремо (панель А) або з 250 м СтуЗЯАВІ т нм СХУЗУАЬІ (павель В). СУ 34АВІ: повної. довжини (14 кДа); СтуЗ5АВЕ, хімотрипсинізовава серцевина (Я хДаї і Стузваї: трипсинізована ссрневина (55 кдак Текд,15-19, 81-90, То810-1,0, ні 00е2,0; 1о51000-30. . Фів. З я 13 ; я , а т ДО120 фнекннннннснттнстнннюєтіяню ектіутюння птн тютюн яріня хання нка тт сне ен Но м по м м п МК Ж й ц х шк, і со ом, ; зоб ще бен» еще пер дуття о Ваня сові нн : 80 нини хо іде ведення 2004. сенсу пес» СтуЗБАВІ пев 5 СтузеАві пні СУ ЗАВ АЮТУ ЗАВ СО й ва : - - 405 -а ба 05 10 1.5 269 35 30 3 99 Коккурект (нм, логарифмічна пвкала) Пропентна частка початкового специфічного зв'язування з рсезваї з ВВМУ у концентричії 0,1 37, отриманими з личинок західних кукурудзяних кореневих жуків. при зізних концентраціях немічених конкурентів, нкусованих з 5 вм щі СтузВа). Сстуза АБ: повної лояжини (14 кДаї; СтузВаї: хімотрийсинізована серцевина (40 кДа);ї СтузВаї: трипсинізована серцевина (53 кДах ою (01 -4,0, 10 150, То210-0, 105100-72.0; Гое109030.
Фіг. 4
UAA201213338A 2010-04-23 2011-04-22 ТРАНСГЕННА РОСЛИНА, ЯКА ПРОДУКУЄ БІЛОК Сry34Ab1, БІЛОК Сry35Ab1 І ІНСЕКТИЦИДНИЙ БІЛОК Сry3Ba1, ДЛЯ ЗАПОБІГАННЯ РОЗВИТКУ СТІЙКОСТІ В КУКУРУДЗЯНИХ КОРЕНЕВИХ ЖУКІВ (Diabrotica spp.) UA112516C2 (uk)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US32724010P 2010-04-23 2010-04-23
US38827310P 2010-09-30 2010-09-30
US201161476005P 2011-04-15 2011-04-15
US201161477447P 2011-04-20 2011-04-20
PCT/US2011/033622 WO2011133896A1 (en) 2010-04-23 2011-04-22 Combinations including cry3aa and cry6aa proteins to prevent development of resistance in corn rootworms (diabrotica spp.)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA112516C2 true UA112516C2 (uk) 2016-09-26

Family

ID=44834532

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201213336A UA116081C2 (uk) 2010-04-23 2011-04-22 ТРАНСГЕННА РОСЛИНА КУКУРУДЗИ, ЯКА ПРОДУКУЄ БІЛКИ Cry34Ab1, Cry35Ab1 і Cry3Aa ДЛЯ ЗАПОБІГАННЯ РОЗВИТКУ СТІЙКОСТІ У КУКУРУДЗЯНОГО КОРЕНЕВОГО ЖУКА
UAA201213338A UA112516C2 (uk) 2010-04-23 2011-04-22 ТРАНСГЕННА РОСЛИНА, ЯКА ПРОДУКУЄ БІЛОК Сry34Ab1, БІЛОК Сry35Ab1 І ІНСЕКТИЦИДНИЙ БІЛОК Сry3Ba1, ДЛЯ ЗАПОБІГАННЯ РОЗВИТКУ СТІЙКОСТІ В КУКУРУДЗЯНИХ КОРЕНЕВИХ ЖУКІВ (Diabrotica spp.)
UAA201213337A UA116612C2 (uk) 2010-04-23 2011-04-22 ТРАНСГЕННА РОСЛИНА КУКУРУДЗИ, ЯКА ПРОДУКУЄ БІЛКИ Cry34Ab1, Cry35Ab1 І Cry6Aa1 ДЛЯ ЗАПОБІГАННЯ РОЗВИТКУ СТІЙКОСТІ У КУКУРУДЗЯНОГО КОРЕНЕВОГО ЖУКА (Diabrotica spp.)

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201213336A UA116081C2 (uk) 2010-04-23 2011-04-22 ТРАНСГЕННА РОСЛИНА КУКУРУДЗИ, ЯКА ПРОДУКУЄ БІЛКИ Cry34Ab1, Cry35Ab1 і Cry3Aa ДЛЯ ЗАПОБІГАННЯ РОЗВИТКУ СТІЙКОСТІ У КУКУРУДЗЯНОГО КОРЕНЕВОГО ЖУКА

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201213337A UA116612C2 (uk) 2010-04-23 2011-04-22 ТРАНСГЕННА РОСЛИНА КУКУРУДЗИ, ЯКА ПРОДУКУЄ БІЛКИ Cry34Ab1, Cry35Ab1 І Cry6Aa1 ДЛЯ ЗАПОБІГАННЯ РОЗВИТКУ СТІЙКОСТІ У КУКУРУДЗЯНОГО КОРЕНЕВОГО ЖУКА (Diabrotica spp.)

Country Status (20)

Country Link
US (5) US20130167269A1 (uk)
EP (5) EP2560475B1 (uk)
JP (4) JP5922098B2 (uk)
KR (4) KR101842725B1 (uk)
CN (5) CN102970862B (uk)
AR (4) AR081136A1 (uk)
AU (4) AU2011242490B2 (uk)
BR (4) BR112012027208A2 (uk)
CA (4) CA2796730A1 (uk)
CL (3) CL2012002965A1 (uk)
CO (4) CO6592036A2 (uk)
ES (1) ES2665514T3 (uk)
IL (4) IL222582A (uk)
MA (4) MA34239B1 (uk)
MX (3) MX2012012368A (uk)
NZ (4) NZ603564A (uk)
RU (4) RU2591519C2 (uk)
UA (3) UA116081C2 (uk)
WO (4) WO2011133896A1 (uk)
ZA (3) ZA201208638B (uk)

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103125516B (zh) * 2011-11-24 2014-12-17 华中农业大学 对南方根结线虫具有杀虫增效作用的蛋白组合物Cry6Aa/Cry55Aa及应用
WO2014071182A1 (en) 2012-11-01 2014-05-08 Massachusetts Institute Of Technology Directed evolution of synthetic gene cluster
EP3032942B1 (en) 2013-08-16 2020-03-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
EP3043635B1 (en) 2013-09-13 2020-02-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
AR097995A1 (es) * 2013-10-14 2016-04-27 Syngenta Participations Ag Método para sembrar filas de cultivos
KR20160093728A (ko) 2013-12-20 2016-08-08 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 딱정벌레류 해충에 대한 저항성을 부여하는 rnapii-140 핵산 분자
BR102014031844A2 (pt) 2013-12-20 2015-10-06 Dow Agrosciences Llc ras oposto (rop) e moléculas de ácido nucleico relacionadas que conferem resistência a pragas de coleópteros e hemípteros
EP3102684B1 (en) 2014-02-07 2020-05-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
WO2015120276A1 (en) 2014-02-07 2015-08-13 Pioneer Hi Bred International Inc Insecticidal proteins and methods for their use
AU2015255995B2 (en) 2014-05-07 2018-05-10 Dow Agrosciences Llc Dre4 nucleic acid molecules that confer resistance to coleopteran pests
WO2016000237A1 (en) 2014-07-03 2016-01-07 Pioneer Overseas Corporation Plants having enhanced tolerance to insect pests and related constructs and methods involving insect tolerance genes
US10435706B2 (en) 2014-10-16 2019-10-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
WO2016086010A1 (en) 2014-11-24 2016-06-02 Poet Research, Inc. Corn blends that include high oil corn and methods of making one or more biochemicals using high oil corn or corn blends that include high oil corn
EA038923B1 (ru) 2015-03-11 2021-11-10 Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. Инсектицидная днк-конструкция и способы её применения
RU2017144238A (ru) 2015-05-19 2019-06-19 Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. Инсектицидные белки и способы их применения
AU2016278142A1 (en) 2015-06-16 2017-11-30 E. I. Du Pont De Nemours And Company Compositions and methods to control insect pests
MX2018000615A (es) 2015-07-13 2018-08-01 Pivot Bio Inc Metodos y composiciones para mejorar atributos de plantas.
AU2016297195A1 (en) * 2015-07-23 2018-02-01 Monsanto Technology Llc Multi functional toxins
MX2018001523A (es) 2015-08-06 2018-03-15 Pioneer Hi Bred Int Proteinas insecticidas derivadas de plantas y metodos para su uso.
WO2017030843A1 (en) 2015-08-17 2017-02-23 Dow Agrosciences Llc Engineered cry6a insecticidal proteins
WO2017062412A1 (en) 2015-10-05 2017-04-13 Massachusetts Institute Of Technology Nitrogen fixation using refactored nif clusters
US20180325119A1 (en) 2015-12-18 2018-11-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
CN105483240A (zh) * 2015-12-26 2016-04-13 吉林省农业科学院 转基因植物中cry34Ab基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法
CN105506081A (zh) * 2015-12-26 2016-04-20 吉林省农业科学院 转基因植物中cry35Ab基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法
US11028407B2 (en) 2016-04-19 2021-06-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal combinations of polypeptides having improved activity spectrum and uses thereof
EP3960863A1 (en) 2016-05-04 2022-03-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
US20190185867A1 (en) 2016-06-16 2019-06-20 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
US20190194676A1 (en) 2016-06-24 2019-06-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant regulatory elements and methods of use thereof
EP3954202A1 (en) 2016-07-01 2022-02-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins from plants and methods for their use
US20210292778A1 (en) 2016-07-12 2021-09-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
CN110799474B (zh) 2017-01-12 2022-07-26 皮沃特生物公司 用于改良植物性状的方法及组合物
WO2018148001A1 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Pioneer Hi-Bred International Inc Insecticidal combinations of plant derived insecticidal proteins and methods for their use
CR20190476A (es) 2017-04-03 2020-01-06 Monsanto Technology Llc Proteínas inhibidoras de insectos novedosas
US20200165626A1 (en) 2017-10-13 2020-05-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Virus-induced gene silencing technology for insect control in maize
US11993778B2 (en) 2017-10-25 2024-05-28 Pivot Bio, Inc. Methods and compositions for improving engineered microbes that fix nitrogen
EP3755797A1 (en) 2018-02-22 2020-12-30 Zymergen, Inc. Method for creating a genomic library enriched for bacillus and identification of novel cry toxins
WO2019169227A1 (en) 2018-03-02 2019-09-06 Zymergen Inc. Insecticidal protein discovery platform and insecticidal proteins discovered therefrom
CA3096516A1 (en) 2018-05-22 2019-11-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant regulatory elements and methods of use thereof
US11963530B2 (en) 2018-06-27 2024-04-23 Pivot Bio, Inc. Agricultural compositions comprising remodeled nitrogen fixing microbes
CN112438198A (zh) * 2019-08-30 2021-03-05 中国农业大学 利用杂交不亲和基因在制备抗虫转基因玉米庇护所中的应用
WO2021221690A1 (en) 2020-05-01 2021-11-04 Pivot Bio, Inc. Modified bacterial strains for improved fixation of nitrogen
CA3172322A1 (en) 2020-05-01 2021-11-04 Karsten TEMME Modified bacterial strains for improved fixation of nitrogen
CN111574599B (zh) * 2020-05-18 2022-10-28 福建农林大学 一种解决杀虫毒素被昆虫肠道消化酶过度酶解的毒素改造方法
US20230235352A1 (en) 2020-07-14 2023-07-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
CN112063748A (zh) * 2020-10-13 2020-12-11 中国农业科学院生物技术研究所 用于检测转基因玉米g1105e-823c的rpa引物探针组合、试剂盒及检测方法
WO2023278804A1 (en) 2021-07-02 2023-01-05 Pivot Bio, Inc. Genetically-engineered bacterial strains for improved fixation of nitrogen
CN115029369B (zh) * 2022-06-01 2023-04-21 中国林业科学研究院森林生态环境与自然保护研究所 一种防治松材线虫病的苏云金芽孢杆菌工程菌制备方法与应用

Family Cites Families (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1558396A (en) * 1923-11-08 1925-10-20 Roehrs Rudolph Lienau Grass-seed container
US4762785A (en) 1982-08-12 1988-08-09 Calgene, Inc. Novel method and compositions for introducting alien DNA in vivo
EP0116718B2 (en) 1983-01-13 1996-05-08 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Process for the introduction of expressible genes into plant cell genomes and agrobacterium strains carrying hybrid Ti plasmid vectors useful for this process
WO1984002919A1 (en) 1983-01-17 1984-08-02 Monsanto Co Plasmids for transforming plant cells
NL8300699A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; werkwijze voor het produceren van agrobacterium tumefaciens bacterien; stabiele cointegraat plasmiden; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
NL8300698A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
US5380831A (en) 1986-04-04 1995-01-10 Mycogen Plant Science, Inc. Synthetic insecticidal crystal protein gene
NL8401048A (nl) 1984-04-03 1985-11-01 Rijksuniversiteit Leiden En Pr Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van eenzaadlobbige planten.
US5231019A (en) 1984-05-11 1993-07-27 Ciba-Geigy Corporation Transformation of hereditary material of plants
US5149645A (en) 1984-06-04 1992-09-22 Rijksuniversiteit Leiden Process for introducing foreign DNA into the genome of plants
NL8401780A (nl) 1984-06-04 1986-01-02 Rijksuniversiteit Leiden En Pr Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van planten.
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
AU7360087A (en) 1986-04-30 1987-11-24 Boyce Thompson Institute For Plant Research Inc. Electric field mediated dna transformation of plant cells and organelles
US5188958A (en) 1986-05-29 1993-02-23 Calgene, Inc. Transformation and foreign gene expression in brassica species
US5177010A (en) 1986-06-30 1993-01-05 University Of Toledo Process for transforming corn and the products thereof
EP0267159A3 (de) 1986-11-07 1990-05-02 Ciba-Geigy Ag Verfahren zur genetischen Modifikation monokotyler Pflanzen
SE455438B (sv) 1986-11-24 1988-07-11 Aga Ab Sett att senka en brennares flamtemperatur samt brennare med munstycken for oxygen resp brensle
US5004863B2 (en) 1986-12-03 2000-10-17 Agracetus Genetic engineering of cotton plants and lines
ES2074999T3 (es) 1987-05-20 1995-10-01 Ciba Geigy Ag Plantas de zea mays y plantas de zea mays transgenicas regeneradas de protoplastos o celulas derivadas de protoplastos.
US5753492A (en) * 1987-08-12 1998-05-19 Mycogen Corporation Genes encoding nematode-active toxins from Bacillus thuringiensis strains
US5302523A (en) 1989-06-21 1994-04-12 Zeneca Limited Transformation of plant cells
US5141131A (en) 1989-06-30 1992-08-25 Dowelanco Method and apparatus for the acceleration of a propellable matter
WO1992009696A1 (en) 1990-11-23 1992-06-11 Plant Genetic Systems, N.V. Process for transforming monocotyledonous plants
US5384253A (en) 1990-12-28 1995-01-24 Dekalb Genetics Corporation Genetic transformation of maize cells by electroporation of cells pretreated with pectin degrading enzymes
EP0628051B1 (en) 1992-02-12 2003-07-02 Chromagen, Inc. Applications of fluorescent n-nucleosides and fluorescent structural analogs of n-nucleosides
US5679558A (en) 1992-04-15 1997-10-21 Plant Genetic Systems, N.V. Transformation of monocot cells
US5591616A (en) 1992-07-07 1997-01-07 Japan Tobacco, Inc. Method for transforming monocotyledons
US5469976A (en) 1993-04-30 1995-11-28 Burchell; James R. Shelf allocation and management system
EP0627752B1 (en) 1993-06-04 1997-07-23 CAVIS S.r.l. An inertia device for interrupting the electrical circuit of a vehicle with an internal combustion engine
GB9318207D0 (en) * 1993-09-02 1993-10-20 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
US6372480B1 (en) 1996-04-19 2002-04-16 Mycogen Corporation Pesticidal proteins
US6083499A (en) 1996-04-19 2000-07-04 Mycogen Corporation Pesticidal toxins
US5874288A (en) * 1997-07-31 1999-02-23 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis toxins with improved activity
US6218188B1 (en) 1997-11-12 2001-04-17 Mycogen Corporation Plant-optimized genes encoding pesticidal toxins
US6060594A (en) * 1997-12-18 2000-05-09 Ecogen, Inc. Nucleic acid segments encoding modified bacillus thuringiensis coleopteran-toxic crystal proteins
US6023013A (en) * 1997-12-18 2000-02-08 Monsanto Company Insect-resistant transgenic plants
DE19825333A1 (de) * 1998-06-05 1999-12-09 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Verfahren zur Kontrolle von Schadorganismen in Nutzpflanzen
CN1360632A (zh) 1999-05-04 2002-07-24 孟山都技术有限公司 鞘翅目毒性多肽组合物和抗虫转基因植物
US6501009B1 (en) * 1999-08-19 2002-12-31 Monsanto Technology Llc Expression of Cry3B insecticidal protein in plants
AR025349A1 (es) 1999-08-23 2002-11-20 Mycogen Corp Metodos para controlar las plagas del gusano gris
CN1338262A (zh) * 2000-08-11 2002-03-06 张泽国 复方乌头膏及其制备方法
US6551962B1 (en) * 2000-10-06 2003-04-22 Monsanto Technology Llc Method for deploying a transgenic refuge
US7230167B2 (en) * 2001-08-31 2007-06-12 Syngenta Participations Ag Modified Cry3A toxins and nucleic acid sequences coding therefor
US20040210964A1 (en) * 2003-02-20 2004-10-21 Athenix Corporation AXMI-009, a delta-endotoxin gene and methods for its use
EP1613161A1 (en) * 2003-04-04 2006-01-11 Syngenta Limited Improved method of resistance management for transgenic crops
US7309785B1 (en) 2003-10-03 2007-12-18 Dow Agrosciences Llc Modified chimeric Cry35 proteins
US7524810B1 (en) * 2003-10-03 2009-04-28 Dow Agrosciences Llc Modified Cry34 proteins
US20050183161A1 (en) * 2003-10-14 2005-08-18 Athenix Corporation AXMI-010, a delta-endotoxin gene and methods for its use
CA2546157C (en) 2003-11-21 2014-07-22 Dow Global Technolgies Inc. Improved expression systems with sec-system secretion
US20080226753A1 (en) * 2004-03-29 2008-09-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method of Reducing Insect Resistant Pests in Transgenic Crops
EP2308977B2 (en) 2004-04-30 2017-04-26 Dow AgroSciences LLC Novel herbicide resistance gene
US7985892B1 (en) * 2004-06-29 2011-07-26 Dow Agrosciences Llc Truncated Cry35 proteins
CA2614353A1 (en) * 2005-07-08 2007-01-18 Hexima Limited Management of plant pathogens
US20090070896A1 (en) * 2005-08-30 2009-03-12 Phyllom Llc Insect resistant transgenic turf grass
CN103361316B (zh) 2005-10-28 2017-05-17 美国陶氏益农公司 新除草剂抗性基因
US8569015B2 (en) 2006-05-30 2013-10-29 Pfenex Inc. RPA optimization
CN200985135Y (zh) * 2006-12-20 2007-12-05 贵州省烟草科学研究所 细粒种子袋
WO2008085729A2 (en) * 2006-12-22 2008-07-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Resistance management strategies for transgenic crops
EP2468869B1 (en) 2007-01-31 2015-03-18 Pfenex Inc. Bacterial leader sequences for increased expression
CN101679491B (zh) * 2007-03-28 2013-11-06 先正达参股股份有限公司 杀虫的蛋白质
US20080256669A1 (en) * 2007-04-16 2008-10-16 Monsanto Company Plants with Multiple Transgenes on a Chromosome
WO2009023636A1 (en) * 2007-08-10 2009-02-19 The University Of Georgia Research Foundation, Inc. Novel insect cadherin fragments
WO2009132850A1 (en) * 2008-05-01 2009-11-05 Bayer Bioscience N.V. Armyworm insect resistance management in transgenic plants
US20090300980A1 (en) * 2008-05-02 2009-12-10 Dow Agrosciences Llc Corn with transgenic insect protection traits utilized in combination with drought tolerance and/or reduced inputs particularly fertilizer

Also Published As

Publication number Publication date
JP5922098B2 (ja) 2016-05-24
AU2011242578B2 (en) 2016-04-21
US9796983B2 (en) 2017-10-24
AU2011242490A1 (en) 2012-12-06
RU2582249C2 (ru) 2016-04-20
EP2560475B1 (en) 2018-02-14
KR101842725B1 (ko) 2018-03-27
JP2013540418A (ja) 2013-11-07
NZ603564A (en) 2014-12-24
IL222584A (en) 2016-11-30
CN102970862A (zh) 2013-03-13
BR112012027139A2 (pt) 2015-09-22
WO2011133895A1 (en) 2011-10-27
CO6592036A2 (es) 2013-01-02
IL222583A (en) 2016-07-31
CN102946716A (zh) 2013-02-27
CA2796758A1 (en) 2011-10-27
BR112012027218A2 (pt) 2015-09-15
ZA201208639B (en) 2014-01-29
MX2012012368A (es) 2013-03-05
CO6592035A2 (es) 2013-01-02
UA116081C2 (uk) 2018-02-12
MX2012012371A (es) 2014-02-27
CL2012002965A1 (es) 2013-04-01
IL222581A0 (en) 2012-12-31
NZ603555A (en) 2014-11-28
NZ603561A (en) 2015-06-26
AR081137A1 (es) 2012-06-27
JP2013528365A (ja) 2013-07-11
RU2012149846A (ru) 2014-05-27
US20190203224A1 (en) 2019-07-04
AU2011242579B2 (en) 2016-04-21
CN102970862B (zh) 2016-03-30
KR101842724B1 (ko) 2018-03-27
IL222582A (en) 2016-07-31
EP2560476B1 (en) 2017-12-13
AR081334A1 (es) 2012-08-08
MA34242B1 (fr) 2013-05-02
AU2011242578A1 (en) 2012-12-06
EP2560477A1 (en) 2013-02-27
AR081284A1 (es) 2012-08-01
AU2011242579A1 (en) 2012-12-06
AU2011242490B2 (en) 2014-11-06
ES2665514T3 (es) 2018-04-26
KR20130089147A (ko) 2013-08-09
JP2013533730A (ja) 2013-08-29
AR081136A1 (es) 2012-06-27
WO2011133891A1 (en) 2011-10-27
IL222583A0 (en) 2012-12-31
US20130167268A1 (en) 2013-06-27
US20130263331A1 (en) 2013-10-03
MA34239B1 (fr) 2013-05-02
WO2011133896A1 (en) 2011-10-27
CA2796728A1 (en) 2011-10-27
EP2560478A1 (en) 2013-02-27
JP5922099B2 (ja) 2016-05-24
CO6592013A2 (es) 2013-01-02
MA34240B1 (fr) 2013-05-02
US20130180016A1 (en) 2013-07-11
CA2796730A1 (en) 2011-10-27
MA34238B1 (fr) 2013-05-02
RU2591519C2 (ru) 2016-07-20
RU2012149849A (ru) 2014-05-27
WO2011133892A1 (en) 2011-10-27
RU2012149845A (ru) 2014-05-27
IL222584A0 (en) 2012-12-31
JP5922100B2 (ja) 2016-05-24
CN105830932A (zh) 2016-08-10
RU2582262C2 (ru) 2016-04-20
UA116612C2 (uk) 2018-04-25
AU2011242582B2 (en) 2015-09-17
BR112012027140A2 (pt) 2015-09-22
US20130167269A1 (en) 2013-06-27
BR112012027208A2 (pt) 2015-09-15
KR20130051952A (ko) 2013-05-21
RU2012149847A (ru) 2014-05-27
EP2560477B1 (en) 2018-01-24
NZ603556A (en) 2014-11-28
KR101842726B1 (ko) 2018-03-27
IL222581A (en) 2017-03-30
JP2013531972A (ja) 2013-08-15
RU2576005C2 (ru) 2016-02-27
EP2560476A4 (en) 2013-10-23
CO6592014A2 (es) 2013-01-02
EP2560478A4 (en) 2013-12-04
KR101845097B1 (ko) 2018-05-18
EP3366118A1 (en) 2018-08-29
CN102946716B (zh) 2015-09-16
EP2560477A4 (en) 2013-10-16
AU2011242582A1 (en) 2012-12-06
MX2012012369A (es) 2013-03-05
KR20130051953A (ko) 2013-05-21
EP2560476A1 (en) 2013-02-27
CL2012002962A1 (es) 2013-01-25
KR20130089146A (ko) 2013-08-09
EP2560475A4 (en) 2013-10-23
JP5922646B2 (ja) 2016-05-24
ZA201208640B (en) 2014-01-29
CL2012002963A1 (es) 2013-03-08
EP2560478B1 (en) 2018-02-14
IL222582A0 (en) 2012-12-31
CN103108540A (zh) 2013-05-15
ZA201208638B (en) 2014-01-29
EP2560475A1 (en) 2013-02-27
CN102946717A (zh) 2013-02-27
CA2796727A1 (en) 2011-10-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA112516C2 (uk) ТРАНСГЕННА РОСЛИНА, ЯКА ПРОДУКУЄ БІЛОК Сry34Ab1, БІЛОК Сry35Ab1 І ІНСЕКТИЦИДНИЙ БІЛОК Сry3Ba1, ДЛЯ ЗАПОБІГАННЯ РОЗВИТКУ СТІЙКОСТІ В КУКУРУДЗЯНИХ КОРЕНЕВИХ ЖУКІВ (Diabrotica spp.)
CN106413390B (zh) 用于控制虫害的组合物和方法
CN101686705B (zh) 来自Bacillus thuringiensis的半翅目和鞘翅目活性的毒素蛋白
UA120598C2 (uk) Днк-конструкція та спосіб її застосування
UA126544C2 (uk) Рекомбінантний полінуклеотид, що кодує інсектицидний поліпептид, та спосіб його застосування
JP6957583B2 (ja) 毒素遺伝子及びその使用方法
UA124495C2 (uk) Інсектицидний білок рослинного походження та спосіб його застосування
UA120608C2 (uk) Очищений поліпептид ptip-83 та спосіб його застосування
UA111710C2 (uk) ЗАСТОСУВАННЯ Cry1Da В СПОЛУЧЕННІ З Cry1Be ДЛЯ ЗАПОБІГАННЯ РОЗВИТКУ СТІЙКОСТІ В КОМАХ
CN111263810A (zh) 使用多核苷酸指导的核酸内切酶的细胞器基因组修饰
UA125683C2 (uk) Інсектицидний білок, який є токсичним для лускокрилого шкідника, та спосіб контролю шкідників рослин
EA020327B1 (ru) Гены токсинов и способы их применения
CN101300353A (zh) 用于制备抗虫转基因植物的杀虫组合物和方法
US20160230186A1 (en) Compositions and methods for controlling diabrotica
EA019574B1 (ru) Дельта-эндотоксиновый ген axmi-150 и способы его применения
EA029279B1 (ru) Композиции и способы контроля насекомых-вредителей
KR102624543B1 (ko) 인시류에 대하여 활성인 살충 독소 단백질
UA110925C2 (uk) Сконструйований білок cry1ba, активний щодо лускокрилих комах
KR20180038561A (ko) 신규한 곤충 저해 단백질
UA126906C2 (uk) Інсектицидний білок
EA032560B1 (ru) Инсектицидные полипептиды с широким спектром активности и их применения
EP3849563A1 (en) Control of plant pests using rna molecules
CN116769803A (zh) 新型昆虫抑制蛋白
UA124050C2 (uk) Химерний ген, який кодує білок, токсичний для кукурудзяного метелика, та спосіб його застосування
CN117025637A (zh) 新型昆虫抑制蛋白