UA110925C2

UA110925C2 - Сконструйований білок cry1ba, активний щодо лускокрилих комах

Info

Publication number: UA110925C2
Application number: UAA201204964A
Authority: UA
Inventors: Янь ГАО; Джаред Конвіл; Жен Шон Чень
Original assignee: Сінгента Партісіпейшнс Аг
Priority date: 2009-10-02
Filing date: 2010-09-27
Publication date: 2016-03-10
Also published as: AU2010300850B2; ZA201202266B; US20160201083A1; CN102596988B; RU2012117576A; US9243262B2; MX342640B; US10167323B2; AU2010300850A1; CL2012000799A1; EP2482639B1; BR112012009381A2; US20160222374A1; US10934330B2; RU2613778C2; IN2012DN02413A; CN105753950B; MX2012003658A; WO2011041256A3; IL218798A0

Abstract

Представлений винахід забезпечує сконструйовані білки СгуlВа (еСгуlВа), які мають покращену розчинність і підвищену токсичність щодо лускокрилих комах-шкідників. Шляхом заміщення щонайменше однієї амінокислоти в домені І білка СгуlВа розроблений сконструйований білок СгуlВа, який має істотно змінені інсектицидні властивості. Додатково розкриті спосіб одержання сконструйованих білків СгуlВа і способи використання послідовностей нуклеїнових кислот еСгуlВа, наприклад, у трансгенних рослинах, для експресії білків еСгуlВ для надання захисту від ушкодження комахами. Розкриті композиції і способи боротьби зі шкідниками.

Description

ІНСЕКТИЦИДНІ БІЛКИ

ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ

ЇО0ОО1| Даний винахід відноситься до галузей білкової інженерії, молекулярної біології рослин і боротьби зі шкідниками. Більш конкретно, даний винахід відноситься до нових сконструйованих білків СгуїВа і послідовностей нуклеїнових кислот, чия експресія дає в результаті сконструйовані Сту!Ва білки, та способів одержання і способів застосування сконструйованих СгуїВа білків і відповідних послідовностей нуклеїнових кислот для боротьби з комахами.

ПЕРЕДУМОВИ

І0002| Васійи5 игіпдіепбіє (ВО білки Сгу (також іменовані б-ендотоксинами або Сгу- токсинами) являють собою білки, які утворюють кристалічний матрикс у Васійи5, що, як відомо, мають інсектицидну активність, коли поглинаються певними комахами. Більше 180 білків голотипу Стгу в 58 сімействах були визначені й одержали назву. Різні білки Сгу були класифіковані на підставі їхнього спектра активності і гомології послідовності. До 1990 року основні класи були визначені за допомогою їхнього спектра активності (Нойе апа Уупігеїу, 1989,

Місторіої. Вем. 53:242-255), але зовсім недавно була розроблена нова номенклатура, яка систематично класифікує білки Сту на основі гомології амінокислотної послідовності, а не цільових специфічностей стосовно комах (СтісКтоге еї а). 1998, Місгобіо!І. Моїес. Віо!. Кем. 62:807-813).

І000О3І| Більшість Сгу білків, активних проти лускокрилих комах, формуються в кристалічному матриксі як 130-140 кДа протоксину. У лускокрилих комах лужний рН кишки солюбілізує кристал і потім кишкові протеази обробляють протоксин до токсичних білків приблизно 60-70 кДа.

Процесинг протоксину до токсину, як повідомлялося, відбувається шляхом вилучення як М-, так і С-кінцевих амінокислот, причому точне положення процесингу залежить від специфічного Сту білка і відповідних специфічних кишкових соків комахи (Одімага еї аї., 1992, у. Іпмепі. Раїйої. 60:121-126). Протеолітична активація Сгу протоксину може відігравати істотну роль у визначенні його специфічності.

І0004| Була встановлена тривимірна структура для деяких Сгу білків. СтуЗзА білок, який активний стосовно твердокрилих комах, має три структурні домени: М-кінцевий домен | із залишків 58-290 складається з 7 альфа-спіралей, домен ІІ із залишків 291-500 містить три складчасті бета-шари в так названій конформації грецького ключа, і С-кінцевий домен ІІ із залишків 501-644 є бета-сендвічем у так названій конформації типу "|еПу гої". Була також установлена тривимірна структура для активного Сту1їАа токсину лускокрилих (сгоспиї5Кі еї аї., 1995, У. Мої. Віої. 254:447-464). СтуїАа токсин також має три домени: М-кінцевий домен | із залишків 33-253, домен ІІ із залишків 265-461 і домен ПП із залишків 463-609 з додатковим зовнішнім ланцюгом в одному з В-листів, сформованим залишками 254-264. Якщо СгузА і

СтуїАа структури спроекціювати на інші Сту! послідовності, то домен | локалізований від приблизно амінокислотного залишку 28 до 260, домен ІІ - із приблизно 260 до 460 і домен ПП - із приблизно 460 до 600. Див. Макатига еї аї., Адгіс. Віої. Спет. 54(3): 715-724 (1990); Ії єї аї.,

Маїшцге 353: 815-821 (1991); Се еї аї., 9. Віої. Снет. 266(27): 17954-17958 (1991); і Нопее еї аї.,

Мої. Містобріо!. 5(11): 2799-2806 (1991); кожна з яких включена в даний документ посиланням.

Таким чином, на даний момент відомо, що на основі гомології амінокислотної послідовності всі

Ві білки Сту мають подібну тривимірну структуру, яка містить три домени. 0005) На основі структури була сформульована гіпотеза, яка стосується взаємозв'язку структури/функції Сгу білків. У цілому, вважається, що домен І, найбільший М-кінцевий домен, у першу чергу відповідає за утворення пор у кишковій мембрані комахи (Салії 2 ЗНаї, 1993, Аррі.

Епмігоп. МісторіоІ. 57:2816-2820), домен ІІ у першу чергу відповідає за взаємодію з кишковим рецептором, таким чином, визначаючи специфічність токсину (бе еї аї., 1991, 9. ВіоЇ. Спет. 32:3429-3436) і домен ІІ, найбільший С-кінцевий домен, найбільш ймовірно зв'язаний з білковою стабільністю (Гі еї аі. 1991, вище), а також має регуляторний вплив на активність іонного каналу (Спеп еї аіІ., 1993, РМАБ 90:9041-9045). Домен ІШ також був залучений до визначення специфічності (Патент США Мо 6204246, включений у даний документ посиланням).

Обмін доменом ЇЇ між активними проти лускокрилих токсинами, наприклад, за допомогою іп мімо рекомбінації між кодуючими ділянками, може привести до змін у специфічній активності.

Експерименти по зв'язуванню з використанням таких гібридів показали, що домен І бере участь у зв'язуванні з передбачуваними рецепторами цільових комах, підтверджуючи, що домен

І може мати деякий вплив на специфічність, відіграючи роль у розпізнаванні рецептора.

ЇО00О6| Частини токсину Ві Сту білків також характеризуються наявністю п'яти консервативних блоків у їхній амінокислотній послідовності (НоПйе 8 МУУпйеїІєеу, вище). 60 Консервативний блок 1 (СВІ) містить приблизно 29 амінокислот. Консервативний блок 2 (СВ2)

містить приблизно 67 амінокислот. Консервативний блок 3 (СВ3) містить приблизно 48 амінокислот. Консервативний блок 4 (СВ4) містить приблизно 10 амінокислот. Консервативний блок 5 (СВ5) містить приблизно 12 амінокислот. Послідовності до і після цих п'яти консервативних блоків є високо варіабельними і, таким чином, позначаються як "варіабельні області " М1-М6. Домен І Ві Сгу білка типово містить С-кінцеву частину варіабельної області 1, повний консервативний блок 1, цілу варіабельну область 2, і 52 М-кінцеві амінокислоти консервативного блоку 2. Домен І типово містить приблизно 15 С-кінцевих амінокислот консервативного блоку 2, варіабельну область З і приблизно 10 М-кінцевих амінокислот консервативного блоку 3. Домен ІШ типово містить приблизно 38 С-кінцевих амінокислот консервативного блоку 3, варіабельну область 4, консервативний блок 4, варіабельну область 5 і консервативний блок 5. Активні щодо лускокрилих токсини Стгу!, серед інших білків Сгу, мають варіабельну область 6 із приблизно 1-3 амінокислотами, які лежать у домені ІП.

І0007| Деякі білки Сгу, наприклад, СтутАб, СтутАс, Стуї1Е і Сгту2Ва були експресовані в трансгенних сільськогосподарських рослинах і комерційно використані для боротьби з визначеними шкідниками-лускокрилими комахами. Наприклад, трансгенні гібриди кукурудзи, які експресують білок СтутАр, були комерційно доступні протягом 10 років. Білок СтутАб у цих гібридах кукурудзи націлений у першу чергу на європейського метелика кукурудзяного (Оз5ігіпіа пибріїаі|й5), основного лускокрилого шкідника в Кукурудзяному поясі США.

ЇО0О8| Одне питання, яке виникло щодо широкого використання трансгенних сільськогосподарських культур, що експресують білок Сту, полягає в тому, чи стануть комахи- шкідники стійкими до білка Сту. Комахи, як було доведено, здатні до розвитку стійкості до продуктів, що містять білок Сгу. Стійкість у молі капустяної (Рішеа хуїозіеїЇІа) й інших шкідників овочів до комерційних Ві-мікробних обприскувань, широко використовуваним в органічному землеробстві, розвинулася в декількох областях світу. Один недавній випадок польової стійкості в популяції совки трав'яної (5роадоріега Ігидірегаа), підданої дії трансгенної кукурудзи, яка експресує білок СтуїЕ, був зафіксований документально на острові Пуерто-Ріко (5огег еї аї. 2010. 9. Есоп. Епіотої. 103:1031-1038). Однак у Сполучених Штатах не було випадків невдач, пов'язаних зі стійкими польовими популяціями кукурудзяних або бавовняних шкідників, підданих дії трансгенних сільськогосподарських культур з 1996, коли були уперше впроваджені

Зо трансгенні сільськогосподарські культури, які експресують білки Сгу.

ІЇ0009| Промислове насінництво, університетські дослідники і Управління охорони навколишнього середовища США працювали разом над розробкою планів управління, щоб допомогти зменшити виникнення стійкості комах. Вони грунтуються, у першу чергу, на стратегії високої дози і стратегії заказників. Стратегія високої дози для європейського метелика кукурудзяного у кукурудзи, наприклад, полягає в застосуванні гібридів кукурудзи, які експресують досить високі рівні білка Сту, щоб знищити навіть частково стійких європейських метеликів кукурудзяних. Гіпотеза, яка лежить в основі цього, полягає в тому, що знищення частково стійких ЕСВ (європейських метеликів кукурудзяних) і попередження їхнього спарювання значно сповільнює розвиток стійкості. Успіх стратегії високої дози залежить частково від специфічної активності Сту-токсину по відношенню до європейського метелика кукурудзяного і того, як багато цього Сту-токсину може бути експресовано в трансгенній рослині кукурудзи. Наприклад, чим вища специфічна активність Сгу-токсину по відношенню до шкідника, тим менша кількість Сту-токсину повинна експресуватись в трансгенній рослині для досягнення стратегії високої дози. Завдяки тому, що СтутАБб є дуже токсичним для личинок європейського метелика кукурудзяного (тобто висока специфічна активність), рівні експресії СтутАбБ, які досягаються в трансгенних рослинах, легко поміщають такі гібриди кукурудзи в категорію високої дози. 0010) Інші можливі шляхи знизити розвиток стійкості включають поступове збільшення вмісту різних білків Сгу в тій самій трансгенній сільськогосподарській рослині або заміщення існуючих готових продуктів новими продуктами, які продукують різні білки Сту. Наприклад, як тільки старіє ринок існуючих кукурудзяних гібридів СтгутАБ, можуть бути введені нові продукти, які мають білки Сгу, відмінні від СтутАБ, або інші білки Сту на додаток до СтгутАб. Переважно білки, які заміщають СтутАр, будуть мати таку ж або подібну специфічну активність проти європейського метелика кукурудзяного, як і Стут АБ.

ІЇ0011| Одним можливим Сгу-токсином для заміщення СгутАб може бути Сгу1!Ва-токсин.

Голотипний Сту!Ва-токсин був вперше описаний Вгі27ага еї аїЇ. у 1988 (Мис. Асіай5 Кев5. 16:2723- 2724). Згодом, були визначені п'ять інших Стгу!Ва-токсинів, причому кожний має близько 99 95 ідентичність з голотипним токсином. Сту!Ва-токсини, як повідомлялося, мають активність по відношенню до визначених лускокрилих шкідників, таких як білявка капустяна (Ріеєгі5 ргавззісає), бо міль капустяна (Рішеїа хуїозіеПа), єгипетська совка бавовняна (5родоріега ІНогаїї5), совка мала

(Зродоріега ехідца) і європейський метелик кукурудзяний (Оз5ігіпіа пибіїаій5). Однак Сту1Ва, як повідомлялося, є більше ніж у 2 рази менш активним щодо кукурудзяного метелика, аніж

СтутАБ (Див., наприклад, патент США Мо 5628995), і повідомлялося, що він не має активності щодо інших основних кукурудзяних шкідників, наприклад, бавовняної совки (Неїїсомегра 7еа) (Див., наприклад, Кагіт еї а). 2000. Ревіїс. Віоспет. Рпузіої. 67: 198-216) ії МАЕТА-популяцій совки трав'яної (5родоріега Ігидірегаа) (Див., наприклад, Моппегаї еї аІ. 2006. Аррі. Епмігоп.

Місгобріо!. 72:7029-7035). Однією з причин того, що СтуїВа є не таким активним як СтутАб щодо щонайменше європейського кукурудзяного метелика, може бути його нижча розчинність. Таким чином, існує необхідність покращити специфічну активність СтуїВа щодо щонайменше європейського кукурудзяного метелика і, по можливості, розширити спектр його активності для підвищення його потенціалу в якості замісника СтуТтАБб у трансгенній кукурудзі. 0012) Спектр інсектицидної активності окремого Сгу-токсину з Ві може бути досить вузьким, при цьому даний Сгу-токсин є активним тільки щодо деяких видів у межах порядку. Наприклад, білок СтузА відомий як дуже токсичний для колорадського жука, І ерііпоїагха десетіїпеаїа, але має дуже низьку токсичність або взагалі не токсичний для споріднених жуків у роді Оіабгоїїса (Чопп5оп еї аї., 1993, 9). Есоп. Епіотої. 86:330-333). До того ж невеликі зміни в амінокислотній послідовності в межах класу білків Сту можуть вплинути на інсектицидну активність. Наприклад, моп Тегзсий еї а). (1991, Аррі. Епмігоп. МісгобіоЇ. 57:349-358) показав, що білки СгуТАс, варіабельні за сімома амінокислотам, показали істотні відмінності в їхньому спектрі інсектицидної активності. Хоча розглядаються в першу чергу активні щодо лускокрилих токсини,

Сту!Ва-токсини, як було також показано, є активними щодо визначених твердокрилих комах- шкідників, включаючи колорадського жука (І ерііпоїагза аесетіїпеага), листоїда тополиного (Спгузотеїа зстіріа) і жука кавового (Нуроїйепетизх патреї).

І0013| Специфічність білків Сгу є результатом ефективності різних етапів, залучених у виробництво активного білка токсину і його наступної взаємодії з епітеліальними клітинами в середній кишці комахи. Щоб бути інсектицидними, більшість відомих білків Сгу повинні спочатку бути поглиненими комахою і протеолітично активуватися для утворення активного токсину.

Активація інсектицидних кристалічних білків є багатоетапним процесом. Після потрапляння усередину кристали повинні спочатку бути солюбілізовані в кишці комахи. Після їх солюбілізації

Зо білки Стгу активуються специфічними протеолітичними відщепленнями. Протеази в кишці комахи можуть відігравати роль у специфічності за допомогою визначення, де піддається процесингу білок Стгу. Як тільки Стгу білок був солюбілізований і піддався процесингу, він зв'язується зі специфічними рецепторами на поверхні епітелію середньої кишки комахи і згодом інтегрується в ліпідний бішар мембрани щіткової облямівки. Потім утворюються іонні канали, порушуючи нормальну функцію середньої кишки, в результаті зумовлюючи смерть комахи.

Існують явні відмінності у властивостях розчинності частин токсину білків Сгу.

І0014| Визначені білки Стгу, активні щодо лускокрилих, були сконструйовані з метою поліпшити специфічну активність або розширити спектр інсектицидної активності. Наприклад, домен специфічності до шовкопряда шовковичного (Вотрух тогі) з СтуїАа поміщали на СтуТАс, таким чином, надаючи отриманому химерному білку нову інсектицидну активність (Се еї аї. 1989, РМАБ5 86: 4037-4041). Також Возсп еї аІ. 1998 (патент США Мо 5736131) створив новий активний щодо лускокрилих токсин шляхом заміщення домену І СтуїЕ доменом ІШ Сту1сС, таким чином, отримавши СтутЕ-Сту1С гібридний токсин з більш широким спектром активності щодо лускокрилих.

І0015| Залишається необхідність у розробці нових і ефективних засобів боротьби зі шкідниками, які забезпечують економічну користь фермерам і які прийнятні для навколишнього середовища. Необхідні білки з істотно зміненими властивостями, такі як сконструйовані білки

Сту1Ва даного винаходу, які мають більшу специфічну активність, аніж нативні СтуїВа білки щодо щонайменше європейського кукурудзяного метелика, основного шкідника кукурудзи в

Сполучених Штатах, який може стати стійким до існуючих засобів боротьби з комахами. Крім того, сконструйовані білки Сту!Ва, застосування яких за допомогою трансгенних рослин мінімізує шкоду навколишньому середовищу, являються бажаними.

І0016| При збільшенні специфічної активності СтуїВа щонайменше до європейського метелика кукурудзяного буде необхідно, щоб у рослині маїсу експресувалось менше білка

Сту1їВа, таким чином, знижуючи можливі негативні впливи Стгу!Ва на рослину. До того ж, збільшена специфічна активність дозволяє застосовувати сконструйований СгуїВа у стратегії високої дози для ЕСВ.

КОРОТКИЙ ОПИС

І0017| З урахуванням цих потреб, метою даного винаходу є забезпечити нові сконструйовані бо білки Сту!Ва (еСту1Ва), які мають по суті змінені властивості, що є поліпшеними у порівнянні з і відрізняються від нативних Сгу!Ва білків, особливо біохімічні властивості, пов'язані з інсектицидною активністю до лускокрилих шкідників кукурудзи, включаючи без обмеження, таких шкідників як європейський кукурудзяний метелик (ЕСВ; Об5ігіпіа пибіїіаіі5), бавовняна совка (СЕМУ; Неїїсомегра 7єеа), кукурудзяна південно-західна вогнівка (ЗМУСВ; Оіаїгаєа дгапаїйозейа), очеретяна вогнівка (5СВ; Оіангаєа засспагаїї5), соєва совка (5ВІ; Рзепцйдоріивзіа іпсісаепв), гусениця оксамитових бобів (УВС; Апіісагвіа деттагаїїв) і т. п. Шляхом заміщення амінокислот у ключових визначених положеннях у нативній Стгу!Ва білковій послідовності або СтуіВа білка дикого типу, як визначено в даному документі, відповідно до даного винаходу, розробляють білок еСту1Ва, який має по суті змінені властивості розчинності і/або інсектицидні властивості у порівнянні з нативним Стгу!Ва. Даний винахід додатково відноситься до послідовностей нуклеїнових кислот, які кодують білки еСту!Ва, і до композицій і складів, які містять білки есСту1Ва, здатні інгібувати здібність комах-шкідників виживати, рости і розмножуватися, або обмежувати пов'язане з комахами пошкодження або загибель сільськогосподарських рослин.

Даний винахід додатково відноситься до способу одержання білків еСту!Ва і способів застосування білків еСгу!Ва, наприклад, в трансгенних рослинах для забезпечення захисту від пошкодження комахами. Істотно змінені властивості білків еСту!Ва даного винаходу забезпечують їхнє застосування в стратегії високої дози щодо щонайменше ЕСВ, потребуючи при цьому рівнів експресії в рослинах кукурудзи, які є легко досяжними. 0018) Нові білки еСту1Ва, описані в даному документі, є високо активними щодо комах.

Наприклад, білки еСтгу!Ва даного винаходу можуть використовуватися для поліпшення боротьби з економічно важливими комахами-шкідниками, такими як ЕСВ або СЕМУ, без негативного впливу на активність щодо інших важливих шкідників кукурудзи, таких як ЗУУСВ і

ЗСВ. Білки еСгу!Ва даного винаходу можуть використовуватися окремо або в комбінації з іншими стратегіями боротьби з комахами для забезпечення максимальної ефективності боротьби зі шкідниками з мінімальним впливом на навколишнє середовище. Трансгенні рослини, що експресують білки еСтгу!Ва даного винаходу, забезпечують засіб, за допомогою якого рослинники можуть боротися з основними / лускокрилими шкідниками сільськогосподарських культур, наприклад, без обмеження, кукурудзи і цукрового очерету. 00191 Відповідно до одного аспекту даний винахід включає сконструйований білок Сту1Ва

Зо (еСту1Ва), який містить мутацію в одному або декількох положеннях амінокислот у домені І, за допомогою чого сконструйований білок Сту!Ва має підвищену розчинність і/або інсектицидну активність щодо щонайменше європейського кукурудзяного метелика (Оз5ігіпіа пибіа|йв5) у порівнянні з нативним або білком Сгу1Ва дикого типу.

І0020| В іншому аспекті мутація в одному або декількох положеннях амінокислот розташована в альфа-спіралі 4 або альфа-спіралі 5 домену Ї. 0021) У додатковому аспекті мутація має місце в положенні амінокислоти, яке відповідає положенню 150, 178, 189 або 199 у БЕО ІЮО МО: 2. 0022) У ще одному аспекті мутація має місце в положенні 150, 178, 189 або 199 у 5ЕО ІО

МО: 5. 0023) В іншому аспекті мутація має місце в положенні, яке відповідає амінокислотам 2 і 150; або амінокислотам 2, 150 і 178; або амінокислотам 2, 150 і 189; або амінокислотам 2, 150 і 199 у

ЗЕОІЮО МО: 5. 0024) У ще одному аспекті мутація має місце по амінокислотам 2 і 150; або амінокислотам 2,150 і 178; або амінокислотам 2, 150 і 189; або амінокислотам 2, 150 і 199 у БЕО ІЮО МО: 5.

І0025| В одному аспекті даний винахід включає сконструйований білок Стгу1!Ва (еСгуїВа), який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 6, де Х у положенні 2 являє собою будь- яку амінокислоту і а) Х у положенні 150 являє собою Рго, Ре, Тгр або ув, і Х у положенні 189 являє собою Іі еи і в положенні 199 являє собою 5ег; або Б) Х у положенні 189 являє собою 5ег, коли Х у положенні 150 являє собою І ув; або с) Х у положенні 199 являє собою ГГ ув, коли Х у положенні 150 являє собою І ув. (0026) В іншому аспекті білок еСгу1!Ва даного винаходу містить амінокислотну послідовність

ЗЕО ІЮ МО: 7, ЗЕО ІЮ МО: 8, ЗЕО ІЮ МО: 9 або ЗЕО ІЮ МО: 10.

І0027| У ще одному аспекті білок еСту1Ва даного винаходу має активність щодо лускокрилих або твердокрилих комах, зокрема лускокрилих комах. Приклади таких лускокрилих комах включають, але не обмежуючись ними, наступні: європейський кукурудзяний метелик, кукурудзяна південно-західна вогнівка, очеретяна вогнівка, бавовняна совка, соєва совка і гусениця оксамитових бобів. 0028) Даний винахід також включає інші варіантні білки Сту!Ва (у«Сту1Ва), де тирозин (Туг) або гістидин (Ніз) у положенні 150 (150 або Н150) заміщений амінокислотою, відмінною від Туг або Ні. В одному аспекті амінокислота, яка заміщена М150 або НІ150, являє собою І ух, Ре,

Тгр, Рго, ТНг, І еи, Аа, Маї, Зег, Агоу, СіІу або Азр. 0029) В іншому аспекті даний винахід включає білок уСгу1Ва, який містить ЗЕО ІЮ МО: 3. 0030) У ще одному аспекті даний винахід включає білок у«Сгу1Ва, де Туг або Ні у положенні 150 заміщений амінокислотою, відмінною від Туг або Ніз і також має валін (Маї) у положенні 81 (У81), заміщений амінокислотою, відмінною від Маї; або аланін (Аа) у положенні 155 (А155) і метіонін (Ме) у положенні 178 (М178), заміщені амінокислотами, відмінними від Аа або Меї, відповідно. В іншому аспекті Ма! у положенні 81 (У81) заміщений триптофаном (Тгр) (М81УМ). У ще одному аспекті варіантний білок Сгу1Ва даного винаходу містить ЗЕО ІЮО МО: 11.

І0031| В одному аспекті даний винахід включає білок мСгу!Ва з 150, заміщеним іншою амінокислотою і, де Аіа у положенні 155 (А155) заміщений аспарагіновою кислотою (Азр) (А1550) і Меї у положенні 178 (Мей/М78) заміщений серином (5ег) (М1785). В іншому аспекті варіантний білок Сту!Ва даного винаходу містить 5ЕО ІЮ МО: 12. 00321 Білки «Сгу1!Ва даного винаходу мають інсектицидну активність щодо лускокрилих або твердокрилих комах, зокрема лускокрилих комах. До таких лускокрилих комах відносяться без обмеження європейський метелик кукурудзяний, кукурудзяна південно-західна вогнівка, очеретяна вогнівка, бавовняна совка, соєва совка і гусениця оксамитових бобів. Однак такі білки мСгу1!Ва можуть не мати підвищеної активності у порівнянні з білюом Стгу1Ва дикого типу щодо таких шкідників.

ЇОО33| В іншому аспекті даний винахід включає нуклеїнову кислоту, яка кодує сконструйований білок СтуїВа (еСту!Ва) даного винаходу або варіантний білок Сгу1Ва (уСту1Ва) даного винаходу. 0034) Даний винахід також включає химерний ген, який містить гетерологічну промоторну послідовність, функціонально пов'язану з нуклеїновою кислотою, яка кодує білок еСгу1!Ва або білок мСгу!Ва. Даний винахід також включає рекомбінантний вектор, який містить такий химерний ген. Додатково, даний винахід включає трансгенну, яка не належить людині, клітину- хазяїна, яка містить такий химерний ген. Трансгенна клітина-хазяїн відповідно до цього аспекту даного винаходу включає без обмеження бактеріальну клітину або рослинну клітину. Така трансгенна рослинна клітина може бути клітиною маїсу або клітиною цукрового очерету.

Зо Ї0ООЗ5І| Даний винахід додатково забезпечує трансгенну рослину, яка містить таку рослинну клітину. Білки еСгу!Ва або білки уСгу!Ва є придатними для експресії в будь-якій трансгенній рослині, де чутливі комахи-шкідники являються проблемою. Інший аспект даного винаходу включає потомство рослини, яке містить нуклеїнову кислоту даного винаходу від будь-якого покоління трансгенної рослини і частину рослини для розмноження, яка містить нуклеїнову кислоту даного винаходу від будь-якого покоління трансгенної рослини. В іншому аспекті трансгенна рослина являє собою рослину маїсу або рослину цукрового очерету. У ще одному аспекті частина рослини для розмноження являє собою насіння, орган вегетативного розмноження або живець. 0036) Даний винахід також включає інсектицидну композицію, яка містить ефективну для боротьби з комахами кількість білка еСгу1Ва або білка у«Сгу1Ва за даним винаходом і додатково прийнятний сільськогосподарський носій. Такі сільськогосподарські носії можуть бути, наприклад, придатними для розбризкування сполука або трансгенна рослина.

І0037| В іншому аспекті даний винахід забезпечує спосіб одержання білка еСту1Ва або білка мСту1їВа, активного щодо комах, який включає: (а) одержання клітини-хазяїна, яка містить химерний ген, який сам по собі містить гетерологічну промоторну послідовність, функціонально пов'язану з нуклеїновою кислотою даного винаходу; і (б) експресію нуклеїнової кислоти в трансгенній клітині-хазяїні, яка дає в результаті щонайменше один білок, активний щодо комах. 0038) У додатковому аспекті даний винахід забезпечує спосіб одержання стійкої до комах трансгенної рослини, який включає введення нуклеїнової кислоти даного винаходу в рослину, таким чином створюючи трансгенну рослину, де нуклеїнова кислота спричиняє експресію білка еСту!Ва або білка мСгу!Ва у трансгенній рослині в ефективній кількості для боротьби з комахами. У ще одному аспекті комахи є лускокрилими або твердокрилими комахами. До таких лускокрилих комах відносяться без обмеження європейський кукурудзяний метелик, кукурудзяна південно-західна вогнівка, очеретяна вогнівка, бавовняна совка, соєва совка і гусениця оксамитових бобів. 0039) В іншому аспекті даний винахід включає спосіб одержання сконструйованого білка

Стгу1їВа (еСту1Ва), який включає а) визначення білка Стгу1Ва, який має домен І; 5) заміщення щонайменше однієї нативної амінокислоти на ділянці в домені | щонайменше однією іншою амінокислотою; і с) одержання білка еСгу!Ва, виробленого таким чином, що еСтуіВа має бо підвищену розчинність і/або інсектицидну активність щодо щонайменше європейського кукурудзяного метелика у порівнянні з нативним білком Стгу!Ва або Стгу!Ва дикого типу. У ще одному аспекті нативна амінокислота розташована в альфа-спіралі 4 або альфа-спіралі 5 домену І. 0040) У ще одному аспекті даний винахід включає спосіб боротьби з лускокрилою комахою, який включає приведення в контакт комахи з ефективною кількістю білка еСгу!Ва або білка мСту1Ва даного винаходу. Відповідно до іншого аспекту до таких лускокрилих комах відносяться без обмеження європейський кукурудзяний метелик, кукурудзяна південно-західна вогнівка, очеретяна вогнівка, бавовняна совка, соєва совка і гусениця оксамитових бобів. 0041) Переважно, білок еСту1Ва або білок уСгу!Ва доставляється комахам перорально. В одному аспекті білки доставляються перорально через трансгенну рослину, яка містить послідовність нуклеїнової кислоти, що експресує білок еСту1!Ва або у«Стгу1Ва даного винаходу.

І0042| Даний винахід додатково забезпечує спосіб боротьби з комахами, де трансгенна рослина, яка містить нуклеїнову кислоту, що кодує білок еСгту1Ва або білок «Сгту1Ва, додатково містить другу послідовність нуклеїнової кислоти або численні послідовності нуклеїнових кислот, які кодують щонайменше одну іншу пестицидну діючу речовину. В одному аспекті друга послідовність нуклеїнової кислоти кодує білок Сгу, відмінний від білків еСгуїВа або мСту1Ва даного винаходу, таких, які кодують вегетативний інсектицидний білок, таких як ті, котрі розкриті в патентах США МоМо 5849870 і 5877012, що включені в даний документ посиланням, або тих, котрі кодують шлях для продукції небілкової пестицидної діючої речовини. В іншому аспекті даного винаходу друга інсектицидна діюча речовина являє собою білок Мір3.

Ї0043| Ще один аспект даного винаходу являє собою забезпечення способу, який забезпечує рослинника поліпшеним засобом боротьби з європейським кукурудзяним метеликом, кукурудзяною південно-західною вогнівкою, вогнівкою очеретяною, бавовняною совкою, соєвою совкою і гусеницею оксамитових бобів, який включає доставку або продаж рослиннику трансгенних сіянців, що містять нуклеїнову кислоту, яка кодує білок еСгу1їВа, що має мутацію в одному або декількох положеннях амінокислот у домені І, де білок еСгту!Ва має підвищену розчинність або інсектицидну активність щодо щонайменше європейського кукурудзяного метелика у порівнянні з нативним білком Сгу!Ва. В іншому аспекті трансгенні сіянці являють собою насіння, органи вегетативного розмноження або живці.

Зо (0044) Інші аспекти і переваги даного винаходу стануть очевидними фахівцям даної галузі техніки після вивчення наступного опису даного винаходу і необмежуючих прикладів.

КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ

0045) Фіг. 1 показує вирівнювання амінокислотних послідовностей відомих нативних білків

СтгуїВа. Амінокислоти в положенні 150 виділені жирним шрифтом.

І0046| Фію. 2 показує вирівнювання амінокислотних послідовностей нативного повнорозмірного СтутАб і Сту1Ва. Домени | і ІІ і альфа-спіралі 4 і 5 домену І показані стрілками.

КОРОТКИЙ ОПИС ПОСЛІДОВНОСТЕЙ У ПЕРЕЛІКУ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

І0047| 5ЕО ІО МО: 1 являє собою кодуючу послідовність нативного повнорозмірного сгу1Ва. (0048) ЗЕО ІЮО МО: 2 являє собою амінокислотну послідовність нативного повнорозмірного білка Сгу1Ва.

І0049| БЕО ІО МО: З являє собою мутований повнорозмірний Сгу1Ва. 00509 5ЕО ІО МО: 4 являє собою сгу1Ва-Т25 кодуючу послідовність. 0051 БЕО ІО МО: 5 являє собою білок Сту!1Ва-Т25 дикого типу. 00521 5ЕО ІО МО: 6 являє собою білок еСту1!Ва-Х150. 0053) 5ЕО ІО МО: 7 являє собою білок еСту!Ва-Т2АМ15ОК. (0054) 5ЕО ІО МО: 8 являє собою білок еСтгу!Ва-Т2АМ15ОКМ1785. 00551) БЕО ІО МО: 9 являє собою білок еСту!Ва-Т2АМ15ОКІ 1895. 0056) 5ЕО ІО МО: 10 являє собою білок естгу!Ва-ТгАМ150К5199К.

І0057| БЕО ІО МО: 11 являє собою варіантний Стгу!Ва-ТМ21. (0058) 5ЕО ІО МО: 12 являє собою варіантний Сту!Ва-ТМО0.

ІЇ0059| ЗЕО ІЮ МО: 13 являє собою оптимізовану для маїсу послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує білок еСтгу1!Ва-Т2АХ150КІ 1895.

Ї0О60ОІ| 5ЕО ІО МО5:14-41 являють собою праймери, придатні в даному винаході. 00611 БЕО ІО МО: 42 являє собою процесований нативний Сгу1Ва. 00621 5ЕО ІО МО: 43 являє собою варіантний Стгу!Ва-ТМб69. 0063) 5ЕО ІЮО МО: 44 являє собою варіантний Сту1Ва-ТМ61.

ВИЗНАЧЕННЯ

ІЇ0064| Для ясності деяким висловам, використаним в описі, дані визначення, які представлені нижче:

0065) "Активність" білка еСту1Ва даного винаходу означає, що білки еСгу!Ва функціонують як перорально активні засоби боротьби з комахами, мають токсичний ефект або здатні порушувати або обмежувати харчування комахи, що може викликати або не викликати смерть комахи. Коли білок еСтгу1Ва даного винаходу доставляється комасі, це приводить, як правило, до смерті комахи, або комаха не харчується від джерела, яке робить білок еСгу1їВа доступним для комахи.

І0О6б| "Зв'язаний з / функціонально зв'язаний" відноситься до двох послідовностей нуклеїнових кислот, які зв'язані фізично або функціонально. Наприклад, зазначено, що промотор або регуляторна ДНК-послідовність є "зв'язаною з" ДНК-послідовністю, яка кодує РНК або білок, якщо дві послідовності функціонально зв'язані або розташовані так, що регуляторна

ДНК-послідовність буде впливати на рівень експресії кодуючої або структурної ДНК- послідовності.

І0067| "Химерний ген" або "химерний конструкт" являє собою рекомбінантну послідовність нуклеїновою кислоти, у якій промотор або регуляторна послідовність нуклеїнової кислоти функціонально зв'язана або асоційована з послідовністю нуклеїнової кислоти, яка кодує мРНК, або яка експресується як білок так, що регуляторна послідовність нуклеїнової кислоти здатна регулювати транскрипцію або експресію асоційованої нуклеїнової кислоти, яка кодує послідовність. Регуляторна послідовність нуклеїнової кислоти химерного гена в нормі не є функціонально пов'язаною з асоційованою послідовністю нуклеїнової кислоти, яка знаходиться в природі.

ІЇ0068| "Кодуюча послідовність" являє собою послідовність нуклеїнової кислоти, яка транскрибується в РНК, таку як мРНК, рРНК, тРНК, мяРНК, смислова РНК або антисмислова

РНК. Переважно РНК потім транслюється в організмі з продукуванням білка. 0069) "Боротися" з комахами означає інгібувати, за допомогою токсичного ефекту, здатність комах-шкідників виживати, рости, харчуватися і/або розмножуватися, або обмежувати пов'язане з комахами ушкодження або загибель сільськогосподарських рослин. "Боротися" з комахами може означати або не означати знищення комах, хоча переважно означає знищення комах. 0070) Як використовується в даному документі, вислів "кукурудза" означає 7еа тау5 або маїс і включає всі сорти рослин, які можна вивести з кукурудзою, включаючи вид дикого маїсу.

Ї0071| "Відповідний" у контексті даного винаходу означає, що коли амінокислотні послідовності білків Сту!В вирівнюються одна з одною, амінокислоти, які "відповідають" визначеним пронумерованим положенням у даному винаході, є тими, котрі збігаються з цими положеннями в нативному Сгу!Ва-токсині (ЗЕО ІЮ МО: 2), але які не обов'язково знаходяться в тих же пронумерованих положеннях щодо конкретної амінокислотної послідовності СтуїВа

З5 даного винаходу. Наприклад, метіонін у положенні 1 процесованого білка Сгту!Ва (ЗЕО ІО МО: 42) буде збігатися з метіоніном у положенні 22 повнорозмірного СтуїВа (ЗЕО ІЮО МО: 2). Отже, за даним винаходом, амінокислота 129 у БЕО ІЮО МО: 42 "відповідає" номеру амінокислоти 150 у

ЗЕО І МО: 2.

І0072| "Доставляти" токсин означає, що токсин приходить у контакт із комахою, даючи в результаті токсичний ефект та забезпечує боротьбу з комахою. Токсин може бути доставлений багатьма загальноприйнятими способами, наприклад, перорально, шляхом прийому усередину комахою, або шляхом контакту з комахою за допомогою експресії в трансгенній рослині, складеної білкової композиції(ій), придатної для розбризкування білкової композиціїй(ій), основи з принадою або будь-якою іншою визнаною в галузі техніки системою доставки токсину.

І0073| "Ефективна для боротьби з комахами кількість" означає, таку концентрацію токсину, яка інгібує за допомогою токсичного ефекту здатність комах виживати, рости, харчуватися і/або розмножуватися або обмежує пов'язане з комахами ушкодження або загибель сільськогосподарських рослин. "Ефективна для боротьби з комахами кількість" може знищувати або не знищувати комах, хоча переважно означає знищення комах.

І0074| "Сконструйований білок СтуїВа" (еСгу!Ва) даного винаходу відноситься до білка отриманого з СтуїВа, який має щонайменше одну мутацію в домені І, що, як відомо, не зустрічається в природі в Сгу1!Ва білку. Білок еСтуіВа не зустрічається в природі і, шляхом втручання людини, містить амінокислотну послідовність, яка не є ідентичною білку, для якого відомо, що він існує в ВасіШи5 ІПигіпдіепзіє. Білки Стгу1Ва, які були сконструйовані за даним винаходом, мають істотно змінені і поліпшені властивості у порівнянні з нативними білками

Стуї!Ва. Зокрема, білки еСту!Ва даного винаходу мають підвищену розчинність і/або інсектицидну активність щодо щонайменше європейського кукурудзяного метелика у порівнянні з нативним Стгу1Ва, Сту1Ва дикого типу або варіантними білками Сгу1!Ва даного винаходу.

0075) "Сконструйований ген сгу1!Ва" (есгу!Ва) відповідно до даного винаходу відноситься до нуклеїнової кислоти, яка містить кодуючу послідовність білка еСгу1!В. Сконструйований ген сгу1Ва може бути отриманий з нативного гена сгу1Ва або із синтетичного гена сгу1Ва. 0076) "Касета експресії", як використовується в даному документі, означає послідовність нуклеїнової кислоти, здатну управляти експресією конкретної послідовності нуклеїнової кислоти в прийнятній клітині-хазяїні, яка містить промотор, функціонально зв'язаний з послідовністю нуклеїнової кислоти інтересу, що функціонально зв'язана із сигналами термінації. Вона також типово містить послідовності, необхідні для правильної трансляції послідовності нуклеїнової кислоти. Касета експресії, яка містить послідовність нуклеїнової кислоти інтересу, може бути химерною, що означає, що щонайменше один з її компонентів є гетерологічним стосовно щонайменше одного з її інших компонентів. Касета експресії може також бути такою, котра зустрічається в природі, але яка була отримана в рекомбінантній формі, придатній для гетерологічної експресії. Однак, як правило, касета експресії є гетерологічною стосовно хазяїна, тобто, конкретна послідовність нуклеїнової кислоти касети експресії не зустрічається в природі в клітині-хазяїні і повинна була бути введена в клітину-хазяїна або попередник клітини-хазяїна за допомогою явища трансформації. Експресія послідовності нуклеїнової кислоти в касеті експресії може бути під контролем конститутивного промотора або індуцибельного промотора, який ініціює транскрипцію, тільки коли клітина-хазяїн піддається деякому конкретному зовнішньому стимулу. У випадку багатоклітинного організму, такого як рослина, промотор може також бути специфічним для конкретної тканини, або органа, або стадії розвитку.

І0077| "Ген" являє собою визначену ділянку, розташовану всередині геному і яка, крім вищезгаданої кодуючої послідовності нуклеїнової кислоти, містить інші, у першу чергу, регуляторні послідовності нуклеїнових кислот, відповідальні за контроль експресії, тобто транскрипції і трансляції кодуючої ділянки. Ген може також містити інші 5'ї 3' нетрансльовані послідовності і послідовності термінації. Додаткові елементи, які можуть бути присутніми, являють собою, наприклад, інтрони. 0078) "Ген інтересу" відноситься до будь-якого гена, який при перенесенні в рослину додає рослині необхідну характеристику, таку як стійкість до антибіотика, стійкість до вірусу, стійкість до комахи, стійкість до захворювання або стійкість до інших шкідників, гербіцидну стійкість,

Зо поліпшену харчову цінність, підвищену ефективність у виробничому процесі або змінену репродуктивну здатність. "Ген інтересу" може також бути геном, який переноситься до рослин для одержання комерційно коштовних ферментів або метаболітів у рослині.

І0079| Як використовується в даному документі, вислів "рослинник" означає фізичну або юридичну особу, яка зайнята сільським господарством, вирощуючи живі організми, такі як сільськогосподарські рослини для їжі або сировинних матеріалів. (0080) "Кишкова протеаза" являє собою протеазу, яка виявляється в природі в травному тракті комахи. Ця протеаза звичайно бере участь у перетравленні поглинених білків.

І0081| "Гетерологічна" послідовність нуклеїнової кислоти являє собою послідовність нуклеїнової кислоти, яка в природі не зв'язана з клітиною-хазяїном, у яку вона введена, включаючи множинні копії, які не зустрічаються в природі, послідовності нуклеїнової кислоти, яка зустрічається в природі.

І0082| "Гомологічна" послідовність нуклеїнової кислоти являє собою послідовність нуклеїнової кислоти, зв'язану в природі з клітиною-хазяїном, у яку її вводять. (0083) "Гомологічна рекомбінація" являє собою реципрокний обмін фрагментів нуклеїнової кислоти між гомологічними молекулами нуклеїнової кислоти. (0084) "Інсектицидна" визначається як токсична біологічна активність, здатна боротися з комахами, переважно шляхом їхнього знищення.

І0085| "Виділена" молекула нуклеїнової кислоти або "виділений" білок являє собою молекулу нуклеїнової кислоти або білок, який за допомогою втручання людини існує окремо від його нативного оточення і, отже, не є продуктом природи. Виділена молекула нуклеїнової кислоти або виділений білок можуть існувати в очищеній формі або можуть існувати в ненативному оточенні, такому як, наприклад, рекомбінантна клітина-хазяїн. Наприклад, нативний білок Сгу, який зустрічається в природі в Васійи5 (Пигіпдіепоі5, не є виділеним, але такий самий білок Сгту у трансгенному штамі Васійи5 Вигіпдіепзіє або трансгенній рослині є виділеним. (0086) "Нативний" білок Сту!Ва, як використовується в даному документі, відноситься до приблизно білка вагою 140 кДа Васійи5 ІПигіпдіепзіз (ВО, активного щодо твердокрилих або лускокрилих, наприклад ЗЕО ІО МО: 2, а також будь-якого процесованого низькомолекулярного білка, отриманого з нативного білка Сту!Ва, який має амінокислотну послідовність, яка бо виявляється в природі. Низькомолекулярний білок може бути отриманий за допомогою протеазного відщеплення сайтів розпізнавання протеази нативного білка СгуїіВа, які зустрічаються в природі, або за допомогою другого кодона ініціації трансляції в тій самій рамці, що і кодон ініціації трансляції, кодуючий нативний білок Сгу!Ва, наприклад М22 у ЗЕО ІЮ МО: 2.

Амінокислотна послідовність нативного білка Сгту1Ва і низькомолекулярних білків, отриманих з нього, може бути виявлена в білку, який зустрічається в природі в Ві. Наприклад, шість нативних білків Сту!Ва отримали назву і мають наступні інвентарні номери Сепрапк, Сту!Ва1-САА29898;

Сту!Ва2-СААб5003; Сту!ВаЗз-ААКбЗ3251; Сту!Ва4-ААК51084; Сту!Ва5-АВО20О894;

Сту1Ваб-АВІ 60921. Вирівнювання послідовностей шести нативних білків СтуїВа показано на

Фіг. 1. Нативний білок Сгу!Ва може кодуватися нативною нуклеотидною послідовністю Ві, як представлено в 5ЕБО ІО МО: 1 або синтетичною кодон-оптимізованою нуклеотидною послідовністю.

І0087| "Молекула нуклеїнової кислоти" або "послідовність нуклеїнової кислоти" являє собою лінійний сегмент одно- або дволанцюгової ДНК або РНК, який може бути виділений з будь-якого джерела. У контексті даного винаходу молекула нуклеїнової кислоти або послідовність нуклеїнової кислоти є переважно сегментом ДНК.

І0088| "Рослина" являє собою будь-яку рослину на будь-якій стадії розвитку, зокрема насіннєву рослину.

І0089| "Рослинна клітина" являє собою структурну і фізіологічну одиницю рослини, яка містить протопласт і клітинну стінку. Рослинна клітина може бути у формі виділеної окремої клітини або культивованої клітини, або як частина високо організованої одиниці, такої як, наприклад, тканина рослини, орган рослини або ціла рослина.

І0090| "Рослинна клітинна культура" означає культури рослинних одиниць, таких як, наприклад, протопласти, клітини клітинної культури, клітини тканин рослин, пилок, пилкові трубки, насіннєві зачатки, зародкові мішки, зиготи і зародки на різних стадіях розвитку. 0091) "Рослинний матеріал" відноситься до листя, стебел, коренів, квітів або частин квітки, фруктів, пилку, яйцеклітин, зигот, насіння, органів вегетативного розмноження, живців, клітинних або тканинних культур або будь-якої іншої частини або продукту рослини. (0092) "Орган рослини" являє собою окрему і візуально структуровану і диференційовану частину рослини, таку як корінь, стебло, листок, квіткову бруньку або зародок.

Зо 0093) "Тканина рослини", як використовується в даному документі, означає групу рослинних клітин, організованих у структурну і функціональну одиницю. Мається на увазі будь-яка тканина рослини іп ріапіа або в культурі. Цей вислів включає, але не обмежується ними, цілі рослини, органи рослини, насіння рослини, тканинну культуру і будь-яку групу рослинних клітин, організованих у структурні і/або функціональні одиниці. Застосування цього вислову відносно або за відсутності будь-якого специфічного типу тканини рослини, які наведені вище, або іншим способом включені в це визначення, не призначено виключати будь-який інший тип тканини рослини.

І0094| "Промотор" являє собою нетрансльовану ДНК-послідовність, розташовану вище кодуючої ділянки, яка містить сайт зв'язування для РНК-полімерази й ініціює транскрипцію ДНК.

Промоторна ділянка може також включати інші елементи, які діють як регулятори генної експресії. 00951 "Сіянець" являє собою будь-який рослинний матеріал, який використовується з метою розмноження рослини. Наприклад, без обмеження, насіння й живці або органи вегетативного розмноження, є сіянцями кукурудзи і цукрового очерету відповідно. 0096) "Протопласт" являє собою виділену рослинну клітину без клітинної стінки або лише з частиною клітинної стінки.

І0097| "Регуляторні елементи" відносяться до послідовностей, які беруть участь в управлінні експресією послідовності нуклеїнової кислоти. Регуляторні елементи включають промотор, функціонально зв'язаний з послідовністю нуклеїнової кислоти інтересу і сигналами термінації.

Вони також звичайно включають послідовності, необхідні для правильної трансляції послідовності нуклеїнової кислоти.

І0098| Як використовується в даному документі, "специфічна активність" відноситься до кількості білка, необхідного для одержання інсектицидного ефекту. Отже, якщо перший білок має більш високу специфічну активність, аніж другий білок, то це означає, що необхідна менша кількість першого білка в порівнянні з другим білком для одержання інсектицидного ефекту на таку ж частину комах. (0099) "Розчинність", як використовується в даному документі, відноситься до кількості нативного Сту1Ва-токсину, Сту!Ва дикого типу або еСту!Ва-токсину або мСтгу1!Ва-токсину, яка може розчинитися в конкретній рідині, наприклад, буфері, воді або кишковому соку комахи за 60 однакових навколишніх умов. Таким чином, як використовується в даному документі, те, що еСту!Ва-токсин має "підвищену розчинність" або "підвищення розчинності" у порівнянні з нативним або Сту!Ва-токсином дикого типу означає, що даний об'єм рідини може містити більшу кількість еСгу!Ва-токсину, аніж нативний Стгу!Ва-токсин або Сгу!Ва-токсин дикого типу за таких самих умов. Відповідно до даного винаходу нативні Стгу!Ва і Сту!їВа дикого типу токсини мають низьку розчинність і визначені еСгу!Ва-токсини мають високу розчинність відносно один одного. 00100) "Трансформація" являє собою процес введення гетерологічної нуклеїнової кислоти в клітину-хазяїна або організм. Зокрема, "трансформація" означає стійку інтеграцію ДНК- молекули в геном організму інтересу.

ІЇ00101| "Трансформований / трансгенний / рекомбінантний" відноситься до організму- хазяїна, такого як бактерія або рослина, до якого була введена гетерологічна молекула нуклеїнової кислоти. Молекула нуклеїнової кислоти може бути стійко інтегрована в геном хазяїна, або молекула нуклеїнової кислоти може також бути присутня як позахромосомна молекула. Така позахромосомна молекула може бути автореплікованою. Трансформовані клітини, тканини або рослини розуміються як такі, що включають не тільки кінцевий продукт процесу трансформації але також їх трансгенне потомство. "Нетрансформований", "нетрансгенний" або "нерекомбінантний" хазяїн відноситься до організму дикого типу, наприклад, бактерії або рослини, який не містить гетерологічну молекулу нуклеїнової кислоти.

І00102| "Варіантний білок Сту1Ва (уСту1Ва)" являє собою ненативний мутантний білок, який має більш низьку специфічну активність щодо щонайменше європейського кукурудзяного метелика у порівнянні з білком Сту1Ва дикого типу даного винаходу. 001031) Білок "Стуї!Ва дикого типу" являє собою ненативний мутований білок, який має подібні інсектицидні властивості, такі як специфічна активність, щодо таких комах, як кукурудзяна південно-західна вогнівка, очеретяна вогнівка або європейський кукурудзяний метелик, або біохімічні властивості, такі як розчинність, як у нативного Стгу1Ва.

І00104| Нуклеїнові кислоти позначаються їхніми основами за допомогою наступних стандартних скорочень: аденін (А), цитозин (С), тимін («Т) і гуанін (б). Амінокислоти позначаються аналогічним чином за допомогою наступних стандартних скорочень: аланін (Аїа;

А), аргінін (Аго; К), аспарагін (Азп; М), аспарагінова кислота (Азр; 0), цистеїн (Сув; С), глутамін

Зо (СіІп; С), глутамінова кислота (Сім; Е), гліцин (Су; с), гістидин (Нів; Н), ізолейцин (Пе; І), лейцин (Гени; У, лізин (Гуз; К), метіонін (Меї; М), фенілаланін (Ре; Е), пролін (Рго; Р), серин (Зег; 5), треонін (Тпг; Т), триптофан (Тгр; УМ), тирозин (Туг; У) і валін (маї; М).

ДОКЛАДНИЙ ОПИС

00105) Даний винахід відноситься до нових сконструйованих білків Сгу!Ва (еСту1Ва), які мають істотно змінені властивості, поліпшені у порівнянні з і відмінні від нативних білків Стгу1Ва, зокрема біохімічні властивості, пов'язані з інсектицидною активністю щодо лускокрилих шкідників кукурудзи, до яких відносяться, без обмежень, європейський кукурудзяний метелик (ЕСВ; Об5ігіпіа пибрііаії5), бавовняна совка (СЕМУ; Неїїсомегра 7еа), кукурудзяна південно-західна вогнівка (ЗМУСВ; Оіаїгаєа дгапаїозеїПа), очеретяна вогнівка (5СВ; Оіаїгаєа 5асспагаїїб), соєва совка (ЗВІ; Рзецйадорісивіа іпсіцдеп5), гусениця оксамитових бобів (МВС; Апіісагзіа деттаїйаїв) і т. п. Шляхом мутування амінокислот у ключових визначених положеннях у нативній послідовності білка Сгу!Ва відповідно до даного винаходу розроблений білок еСту!Ва, який має істотно змінену розчинність і/або інсектицидні властивості у порівнянні з нативним Сту1Ва або Стгу1їВа дикого типу, як визначено в даному документі. Послідовності нуклеїнових кислот, які кодують білки еСтуїВа, можуть використовуватися, наприклад, у трансгенних сільськогосподарських рослинах, щоб викликати експресію білків еСгу!Ва для боротьби з комахами-шкідниками, такими як європейський кукурудзяний метелик (ЕСВ; Оз5ігіпіа пибрііаій5), бавовняна совка (СЕМУ;

Неїїсомегра 7еа), кукурудзяна південно-західна вогнівка (БУУСВ; Оіаїгаєа дгапаїіозеїІа), очеретяна вогнівка (ЗСВ; Оіайгаєа засспагаїї5), соєва совка (5ВІ; Рбхтецйдоріизіа іпсішдеп5), гусениця оксамитових бобів (УВС; Апіісагзіа деттацаїїв) і т. п. 00106) В одному варіанті здійснення даний винахід включає сконструйований білок Сту1Ва (еСту1Ва), який містить мутацію в одному або декількох положеннях амінокислот у домені Ї, за допомогою чого білок еСту!Ва має підвищену розчинність і/або інсектицидну активність щодо щонайменше європейського кукурудзяного метелика у порівнянні з нативним білком або білком

Стгуї1Ва дикого типу.

ІЇ00107| В іншому варіанті здійснення мутація в одному або декількох положеннях амінокислот розташована в альфа-спіралі 4 або альфа-спіралі 5 домену І. Дослідження структурно-функціонального взаємозв'язку визначених білків Сту, таких як СтуїАа, СгутАБ, і

СтуТАс, включали мутагенез альфа-спіралей 4 і 5 домену І (ЗагазулаіІВу еї аї. 2004, ЕІесігоп. 5. бо Віотеси. 7: 178-188). Результати цих експериментів зв'язують альфа-спіралі 4 і 5 з утворенням іонного каналу і провідністю. Неясно, чи буде будь-яка мутація або комбінація мутацій у домені білка Стгу, зокрема Стгуї1Ва, впливати на розчинність і специфічну активність. Отже, на домен білка Сгу1Ва, зокрема, у положеннях в альфа-спіралі 4 або 5, був націлений мутаційний аналіз для визначення того, чи може буту підвищена розчинність і/або чи може бути збільшена специфічна активність нативного білка Сгу!Ва щодо цільової комахи, до якої відноситься європейський кукурудзяний метелик (ЕСВ), кукурудзяна південно-західна вогнівка (ЗУУСВ), очеретяна вогнівка (ЗСВ), бавовняна совка (СЕМ), соєва совка (ЗВІ) і гусениця оксамитових бобів (МВС), а також інші. На основі вирівнювання послідовностей альфа-спіраль 4 Сту1Ва містить амінокислоти 143-163 у 5ЕБО ІО МО: 2. Альфа-спіраль 5 створює основну частину консервативного блоку 1 і містить амінокислоти 176-199 у БЕО ІЮ МО: 2. Шість відомих нативних білків Сту!Ва відрізняються лише однією амінокислотою в альфа-спіралі 4 у положенні 150.

Чотири з шести мають тирозин (Туг; У) у положенні 150 та інші два мають гістидин (Нів; Н) у положенні 150. У даному винаході показано, що амінокислота в положенні 150 відіграє ключову роль у токсичності білка Сту!Ва, і що мутації в альфа-спіралі 4 і альфа-спіралі 5 можуть впливати на розчинність білка, специфічну активність щодо конкретного шкідника і збільшення в спектрі активності Сту1 Ва.

І00108| В іншому варіанті здійснення даний винахід включає мутації в положенні амінокислоти, яке відповідає положенню 150, 178, 189 або 199 у 5ЕО ІЮО МО: 2. У ще одному варіанті здійснення мутація має місце в положенні 150, 178, 189 або 199 у БЕО ІО МО: 5.

Ї00109| У ще одному варіанті здійснення даний винахід включає мутації в СгтуїВа у положенні, яке відповідає амінокислотам 2 і 150; або амінокислотам 2, 150 і 178; або амінокислотам 2, 150 їі 189; або амінокислотам 2, 150 і 199 у 5ЕО ІО МО: 5. В іншому варіанті здійснення мутація має місце на амінокислотах 2 і 150; або амінокислотах 2, 150 і 178; або амінокислотах 2, 150 і 189; або амінокислотах 2, 150 і 199 у БЕО ІО МО: 5. 00110) В одному варіанті здійснення даний винахід включає сконструйований білок Сгу1їВа (еСту1Ва), який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 6, де Хаа у положенні 2 являє собою будь-яку амінокислоту, і а) Хаа у положенні 150 являє собою Рго, Ре, Тгр або І ув, і Хаа у положенні 189 являє собою Іі еи і в положенні 199 являє собою 5ег; або Б) Хаа у положенні 189 являє собою 5Зег, якщо Хаа у положенні 150 являє собою І уз; або с) Хаа у положенні 199

Зо являє собою І у5, якщо Хаа у положенні 150 являє собою І ув. 00111) В іншому варіанті здійснення даний винахід включає білок еСту1!Ва, який містить амінокислотну послідовність зХЕО ІЮ МО: 7, ЗЕО ІЮ МО: 8, 5БЕО ІЮО МО: 9 або 5ЕО ІЮ МО: 10. 00112) У ще одному варіанті здійснення білок еСгу!Ва даного винаходу має активність щодо лускокрилих або твердокрилих комах, зокрема, щодо лускокрилих комах. Приклади таких лускокрилих комах включають, без обмежень, наступні: європейський кукурудзяний метелик, кукурудзяна південно-західна вогнівка, очеретяна вогнівка, бавовняна совка, соєва совка і гусениця оксамитових бобів. Сконструйовані білки СтуїВа даного винаходу також мають активність щодо гусениці бавовняної совки, комахи-шкідника, для якого нативний СтуїВа є неактивним. 00113) У ще одному варіанті здійснення даний винахід включає білок еСту!Ва, який має щонайменше в 3 рази вищу специфічну активність, аніж нативний білок Сту!Ва щодо щонайменше європейського кукурудзяного метелика. 00114) В іншому варіанті здійснення даний винахід також включає варіантні білки Сту!Ва (уСтгуіВа), де тирозин (Туг) або гістидин (Ні) у положенні 150 (150 або НІ150) заміщений амінокислотою, відмінною від Туг або Ні. В одному аспекті амінокислота, яка заміщена М150 або НІ150, являє собою | ух, Ре, Тгр, Рго, ТНг, І ем, Аа, Маї, бег, Аго, СіІу або Ар. 00115) В іншому варіанті здійснення даний винахід включає мутований білок Сту1Ва, який містить БЕО ІЮ МО: 3. 00116) У ще одному варіанті здійснення даний винахід включає білок уСгу1!Ва, де Туг або

Ні5 у положенні 150 (150 або НІ150) заміщений амінокислотою, відмінною від Туг або Ніз і також має валін (Маї) у положенні 81 (М81), заміщений амінокислотою, відмінною від Маї; або аланін (Аіа;) у положенні 155 (А155) і метіонін (Ме)Ю у положенні 178 (М178) заміщені амінокислотами, відмінними від Аіа або Меї, відповідно. В іншому варіанті здійснення Маї у положенні 81 (М81) заміщений триптофаном (Тгр) (М81МУ). У ще одному варіанті здійснення даний винахід включає варіантний білок Сту1Ва, який містить ХЕ ІЮ МО: 11.

І00117)| В одному варіанті здійснення даний винахід включає білок мСгу!Ва з Туг у 150 (У150), заміщеним будь-якою іншою амінокислотою, і де Аа у положенні 155 (А155) заміщений аспарагіновою кислотою (Авр) (А1550)), і Меї у положенні 178 (М178) заміщений серином (зЗег) (М1785). В іншому варіанті здійснення даний винахід включає білок «Сгу1Ва, який містить ХЕО (510) ІО МО: 12.

00118) Білки мСгу!Ва, включені в даний винахід, мають інсектицидну активність щодо лускокрилої або твердокрилої комахи. До таких лускокрилих комах відносяться без обмеження європейський кукурудзяний метелик, кукурудзяна південно-західна вогнівка, очеретяна вогнівка, бавовняна совка, соєва совка і гусениця оксамитових бобів. Активність білків мСгуїВа як правило менша, ніж у білка Сгу!Ва дикого типу даного винаходу. Одна перевага таких варіантних білків Сгтгу1!Ва полягає в їхній користі в ситуаціях, де не потрібна висока специфічна активність. Фахівець у даній галузі техніки установить інші застосування і переваги таких варіантних білків Сту1Ва.

І00119| Властивості для боротьби з комахами у білків еСтуіВа і білків мСгу!Ва даного винаходу додатково проілюстровані в Прикладах 2,4,5,6 і 9.

І00120) В одному варіанті здійснення даний винахід включає нуклеїнову кислоту, яка кодує білок еСтгу1!Ва даного винаходу або кодує білок мСгуіїВа даного винаходу. В іншому варіанті здійснення нуклеїнова кислота містить ЗЕО ІЮО МО: 13. 00121) Даний винахід також включає химерний ген, який містить гетерологічну промоторну послідовність, функціонально зв'язану з нуклеїновою кислотою, яка кодує білок еСгуіїВа або білок у«СгуіВа. В одному варіанті здійснення гетерологічний промотор вибирають із групи, яка включає промотор убіквітину маїсу, вірус цестрових (стр), ТгрА кукурудзи, актин рису, 5 ТЕ ген 9 бактеріофага Т3, »металотіонеїн (тії) маїсу, сахароза-синтетазу 1 кукурудзи, алкогольдегідрогеназу 1 кукурудзи, світлоуловлюючий комплекс кукурудзи, білок теплового шоку кукурудзи, малу субодиницю КиВР карбоксилази гороху, опінсинтази Ті плазміду, нопалін- синтази Ті плазміду, халкон-ізомеразу петунії, багатий гліцином білок 1 боба, пататин картоплі, лектин, 355 Саму і малу субодиницю 5-ЕЗ КивВР-карбоксилази.

І00122| Даний винахід також включає рекомбінантні вектори, які містять послідовності нуклеїнових кислот даного винаходу. Такі вектори включають, без обмеження, плазмідний, космідній, фагмідний вектор, вектор на основі штучної хромосоми, фага або вірусу. У таких векторах послідовності нуклеїнових кислот переважно включені в касети експресії, які містять регуляторні елементи для експресії послідовностей нуклеїнових кислот у клітині-хазяїні, здатній експресувати послідовності нуклеїнових кислот. Такі регуляторні елементи звичайно включають промотор і сигнали термінації і переважно також включають елементи, які дозволяють

Зо здійснюватися ефективній трансляції поліпептидів, що кодуються послідовностями нуклеїнових кислот даного винаходу. Вектори, які містять послідовності нуклеїнових кислот, звичайно здатні до реплікації в конкретних клітинах-хазяїнах, переважно як позахромосомні молекули, і отже, використовуються для ампліфікації послідовностей нуклеїнових кислот даного винаходу в клітинах-хазяїнах. В одному варіанті здійснення клітини-хазяїни для таких векторів являють собою мікроорганізми, такі як бактерії, включаючи без обмеження Е. соїї, Васійи5 (Пигіпдіепвів,

Васійив5 з!ибій5, Васійи5 тедаїегішт, Васійи5 сегеи5, Адгобасієгічт або Рзейдотопавх. В іншому варіанті здійснення клітини-хазяїни для таких рекомбінантних векторів являють собою ендофіти або епіфіти. В іншому варіанті здійснення клітина-хазяїн для таких векторів являє собою еукаріотичну клітину, таку як рослинна клітина. Приклади таких рослинних клітин, включених у даний винахід, включають, без обмеження, наступні: клітини сорго, пшениці, соняшника, томата, картоплі, капустяної культури, бавовнику, рису, сої, цукрового буряка, цукрового очерету, тютюну, ячменю, олійного рапсу або кукурудзи. (00123) В іншому варіанті здійснення такі вектори є вірусними векторами і придатні для реплікації послідовностей нуклеїнових кислот у конкретних клітинах-хазяїнах, наприклад, клітинах комах або рослинних клітинах. Рекомбінантні вектори також використовують для трансформації послідовностей нуклеїнових кислот даного винаходу в клітини-хазяїни, за допомогою чого послідовності нуклеїнових кислот стійко інтегруються в ДНК таких клітин- хазяїнів. В одному варіанті здійснення такі клітини-хазяїни являють собою прокаріотичні клітини.

В іншому варіанті здійснення такі клітини-хазяїни являють собою еукаріотичні клітини, такі як рослинні клітини. В іншому варіанті здійснення рослинні клітини являють собою клітини кукурудзи. 00124) В одному варіанті здійснення даний винахід включає трансгенні рослини, які містять нуклеїнову кислоту даного винаходу, що кодує білок еСту!Ва або білок мСгу!Ва за даним винаходом. Білки еСгту!Ва або білки мСгу!Ва придатні для експресії в будь-якій трансгенній рослині, де становлять проблему чутливі до нього комахи-шкідники. Такі трансгенні рослини включають, без обмеження, однодольні рослини і дводольні рослини. В одному варіанті здійснення однодольні рослини включають кукурудзу, пшеницю, овес, рис, ячмінь, цукровий очерет, сорго, газонну траву і пасовищні рослини. В іншому варіанті здійснення дводольні рослини включають сою й інші бобові, бавовник, соняшник, капустяні культури й інші овочі, бо цукровий буряк, тютюн і олійний рапс.

00125) В іншому варіанті здійснення даний винахід включає потомство рослини від будь- якого покоління трансгенної рослини, де потомство містить нуклеїнову кислоту даного винаходу.

І00126| У ще одному варіанті здійснення даний винахід включає частину рослини для розмноження від будь-якого покоління трансгенної рослини, де частина рослини для розмноження містить нуклеїнову кислоту даного винаходу. У ще одному варіанті здійснення частину рослини для розмноження даного винаходу вибирають із групи, яка включає насіння, орган вегетативного розмноження й живець.

І00127| В іншому варіанті здійснення даний винахід включає біологічний зразок із трансгенної рослини даного винаходу, де біологічний зразок містить білок еСтгуїВа даного винаходу, і білок еСгу!Ва здатний боротися з комахами-шкідниками. Приклади таких біологічних зразків включають без обмеження будь-яку похідну кукурудзи, яка містить білок, таку як кукурудзяне борошно або кукурудзяний крохмаль, який містить білок еСгу1Ва, де білок еСтгу1Ва продовжує виконувати інсектицидну функцію, яку він мав у трансгенній рослині кукурудзи, з якої був отриманий біологічний зразок. 00128) Даний винахід також включає інсектицидну композицію, яка містить білок еСгу1В або мСтуіВа за даним винаходом і прийнятний сільськогосподарський носій. В одному варіанті здійснення сільськогосподарський носій може бути рідиною, порошком або трансгенною рослиною, наприклад, без обмеження, рослиною кукурудзи або рослиною цукрового очерету. 00129) В іншому варіанті здійснення даний винахід включає спосіб одержання білка еСгу1В або білка м«Сгуі!Ва, який являється активним щодо комах та включає: (а) одержання клітини- хазяїна, яка містить химерний ген, що сам по собі містить гетерологічну промоторну послідовність, функціонально зв'язану з нуклеїновою кислотою даного винаходу; і (Б) експресію нуклеїнової кислоти в трансгенній клітині-хазяїні, яка дає в результаті щонайменше один білок даного винаходу, активний щодо комах. В іншому варіанті здійснення комахи являють собою лускокрилих комах або твердокрилих комах. У ще одному варіанті здійснення лускокрилих комах вибирають із групи, яка включає європейського кукурудзяного метелика, кукурудзяну південно-західну вогнівку, очеретяну вогнівку, бавовняну совку, соєву совку і гусеницю оксамитових бобів. 00130) У ще одному варіанті здійснення даний винахід включає спосіб одержання стійкої до комах трансгенної рослини, яка включає введення касети експресії, що містить нуклеїнову кислоту даного винаходу, у рослину з одержанням, таким чином, трансгенної рослини, де касета експресії викликає експресію білка даного винаходу в кількості, яка робить рослину стійкою до комах. В іншому варіанті здійснення комахи є лускокрилими або твердокрилими комахами. До таких лускокрилих комах, включених до даного винаходу, відносяться без обмеження європейський кукурудзяний метелик, кукурудзяна південно-західна вогнівка, очеретяна вогнівка, бавовняна совка, соєва совка і гусениця оксамитових бобів.

І00131| В іншому варіанті здійснення даний винахід включає спосіб одержання білка еСту!Ва, який включає а) визначення білка Сту!Ва, який має домен І; Б) заміщення щонайменше однієї нативної амінокислоти на ділянці в домені | щонайменше однією іншою амінокислотою; і с) одержання білка еСгу1!Ва, отриманого таким чином, в якому еСту!Ва має підвищену розчинність і/або інсектицидну активність щодо щонайменше європейського кукурудзяного метелика у порівнянні з нативним білком Сту1Ва. В іншому варіанті здійснення білок Сту!Ва являє собою Сгу1Ва!, який має інвентарний номер СепВапк САА29898, Стгу1!Ва2 (СААб5003), СтгуїВаЗз (ААКб3251), Сту!Ва4 (ААК51084), Сту!Ва5 (АВО20894) або Стгу!Ваб (АВІ 60921). У ще одному варіанті здійснення нативна амінокислота в Сту!Ва розташована в альфа-спіралі 4 або альфа-спіралі 5 домену І. У ще одному варіанті здійснення амінокислота знаходиться в положенні, яке відповідає положенню 150, 178, 189 або 199 у БЕО ІО МО: 2. У ще одному варіанті здійснення амінокислота знаходиться в положенні 150, 178, 189 або 199 у БЕО

ІО МО: 5. У ще одному варіанті здійснення амінокислота в Сгу1Ва знаходиться в положенні, яке відповідає амінокислотам 2 і 150; або амінокислотам 2, 150 і 178; або амінокислотам 2, 150 і 189; або амінокислотам 2, 150 і 199 у БЕО ІО МО: 5. В іншому варіанті здійснення амінокислота знаходиться в положеннях 2 і 150; або положеннях 2, 150 і 178; або в положеннях 2, 150 і 189; або в положеннях 2, 150 і 199 у БЕО ІЮ МО: 5.

ІЇ00132| У ще одному варіанті здійснення даний винахід включає спосіб боротьби з комахами, який включає доставку комахам або приведення в контакт комах з ефективною кількістю білка еСту!їВа або білка мСгу!їВа даного винаходу. Відповідно до цього варіанта здійснення комахи є лускокрилими комахами або твердокрилими комахами. До таких лускокрилих комах відносяться без обмеження європейський кукурудзяний метелик, 60 кукурудзяна південно-західна вогнівка, очеретяна вогнівка, бавовняна совка, соєва совка і гусениця оксамитових бобів. Переважно, білок еСтгуіВа або білок мСгу!Ва доставляється комахам перорально. В іншому варіанті здійснення білок доставляється перорально за допомогою трансгенної рослини, яка містить послідовність нуклеїнової кислоти, що експресує білок еСту1В або білок мСгу1Ва даного винаходу. 00133) Даний винахід додатково включає спосіб боротьби з комахами, в якому трансгенна рослина даного винаходу додатково містить другу послідовність нуклеїнової кислоти або групи послідовностей нуклеїнових кислот, які кодують другу пестицидну діючу речовину. В одному варіанті здійснення другі послідовності нуклеїнових кислот є послідовностями, які кодують білок

Сгу, відмінний від білка еСгу!Ва або білка мСгу!Ва даного винаходу, послідовностями, які кодують токсин-вегетативний інсектицидний білок, розкритий у патентах США МоМо 5849870 і 5877012, включених у даний документ посиланням, або послідовностями, які кодують шляхи для продукції небілкової діючої речовини. В іншому варіанті здійснення друга послідовність нуклеїнової кислоти кодує білок Мір3. Фахівець у даній галузі техніки встановить, що багато різних інсектицидних діючих речовин можуть використовуватися в комбінації з білком еСту1Ва або уСту1Ва даного винаходу.

ІЇ00134| В іншому варіанті здійснення даний винахід включає спосіб забезпечення рослинника поліпшеним засобом боротьби щонайменше з європейським кукурудзяним метеликом, який включає постачання або продаж рослиннику трансгенних сіянців, що містять нуклеїнову кислоту, яка кодує білок еСгу!Ва, що має мутацію в одному або декількох положеннях амінокислот у домені І, білок еСгуїВа, що має підвищену розчинність і/або інсектицидну активність щодо щонайменше європейського кукурудзяного метелика у порівнянні з нативним білком Сту!Ва. В іншому варіанті здійснення трансгенну частину рослини для розмноження вибирають із групи, яка включає насіння, орган вегетативного розмноження й живець.

Ї00135| У додаткових варіантах здійснення послідовності нуклеїнових кислот даного винаходу можуть бути додатково модифіковані за допомогою включення випадкових мутацій технікою, відомою як іп міго рекомбінація або ДНК-перестановка. Ця техніка описана в біеттег еї аїЇ., Маїште 370:389-391 (1994) і патенті США Мо 5605793, які включені в даний документ посиланням. Мільйони мутантних копій послідовності нуклеїнової кислоти одержують на основі вихідної послідовності нуклеїнової кислоти даного винаходу і відбирають варіанти з поліпшеними властивостями, такими як збільшена інсектицидна активність, посилена стійкість або інша специфічність, або діапазони цільових комах-шкідників. Спосіб включає утворення мутованої дволанцюгової полінуклеїнової кислоти з матричної дволанцюгової полінуклеїнової кислоти, яка містить послідовність нуклеїнової кислоти за даним винаходом, де матрична дволанцюгова полінуклеїнова кислота була розщеплена на дволанцюгові випадкові фрагменти необхідного розміру, і включає етапи додавання до отриманої популяції дволанцюгових випадкових фрагментів однієї або декількох одно- або дволанцюгових олігонуклеїнових кислот, де зазначені олігонуклеїнові кислоти містять область ідентичності й область гетерологічності з дволанцюговою матричною полінуклеїновою кислотою; денатурації отриманої суміші дволанцюгових випадкових фрагментів і олігонуклеїнових кислот в одноланцюгові фрагменти; інкубації отриманої популяції одноланцюгових фрагментів з полімеразою за умов, які приводять до відпалу зазначених одноланцюгових фрагментів на зазначених областях ідентичності з утворенням пар відпалених фрагментів, де зазначені ділянки ідентичності достатні для того, щоб один член пари затравлював реплікацію іншого, таким чином, формуючи мутовану дволанцюгову полінуклеїнову кислоту; і повторення другого і третього етапів протягом щонайменше двох додаткових циклів, де отримана суміш на другому етапі додаткового циклу включає мутовану дволанцюгову полінуклеїнову кислоту з третього етапу попереднього циклу, і додатковий цикл утворює додаткову мутовану дволанцюгову полінуклеїнову кислоту. У переважному варіанті здійснення концентрація окремого виду дволанцюгового випадкового фрагмента в популяції дволанцюгових випадкових фрагментів складає менше 1 95 за вагою загальної ДНК. У ще одному варіанті здійснення матрична дволанцюгова полінуклеїнова кислота містить щонайменше приблизно 100 видів полінуклеїнових кислот. В іншому переважному варіанті здійснення розмір дволанцюгових випадкових фрагментів складає від близько 5 п. н. до 5 т. п. н. У ще одному додатковому варіанті здійснення четвертий етап способу включає повторення другого і третього етапів протягом щонайменше 10 циклів.

Експресія послідовностей нуклеїнових кислот у гетерологічних мікробних хазяїнах 00136) Як біологічні засоби боротьби з комахами інсектицидні білки еСгу!Ва одержують шляхом експресії послідовностей нуклеїнових кислот у гетерологічних клітинах-хазяїнах, здатних експресувати послідовності нуклеїнових кислот. У першому варіанті здійснення бо одержують клітини В. (Пигіпдієпві5, які містять модифікації послідовності нуклеїнової кислоти відповідно до даного винаходу. Такі модифікації включають мутації або делеції існуючих регуляторних елементів, таким чином, приводячи до зміненої експресії послідовності нуклеїнової кислоти або включення нових регуляторних елементів, які контролюють експресію послідовності нуклеїнової кислоти. В іншому варіанті здійснення додаткові копії однієї або декількох послідовностей нуклеїнових кислот додають до клітин Васійи5 ІПигіпдіепбіє або шляхом вставки в хромосому, або шляхом введення позахромосомно реплікованих молекул, які містять послідовності нуклеїнових кислот.

І00137| В іншому варіанті здійснення щонайменше одну з послідовностей нуклеїнових кислот даного винаходу вводять у придатну касету експресії, яка містить промотор і сигнал термінації Експресія послідовності нуклеїнової кислоти є конститутивною, або використовується промотор, індуцибельний у відповідь на різні типи стимулів для ініціації транскрипції. У кращому варіанті здійснення клітина, у якій експресується білок, являє собою мікроорганізм, такий як вірус, бактерії або гриб. В одному варіанті здійснення вірус, такий як бакуловірус, містить послідовність нуклеїнової кислоти даного винаходу у своєму геномі і експресує великі кількості відповідного інсектицидного білка еСту!Ва або білка у«Сту1Ва після інфікування придатних еукаріотичних клітин, що придатні для реплікації вірусу й експресії послідовності нуклеїнової кислоти. Інсектицидний білок, отриманий таким чином, використовують як інсектицидний засіб. Альтернативно, бакуловіруси, сконструйовані з включенням послідовності нуклеїнової кислоти, використовують для інфікування комах іп мімо і знищення їх або шляхом експресії інсектицидного білка, або шляхом комбінації вірусної інфекції й експресії інсектицидного білка. 00138) Бактеріальні клітини є також хазяїнами для експресії послідовностей нуклеїнових кислот даного винаходу. У кращому варіанті здійснення використовуються непатогенні симбіотичні бактерії, які здатні жити і реплікуватися усередині тканин рослини, так звані ендофіти, або непатогенні симбіотичні бактерії, які здатні колонізувати філосферу або ризосферу, так звані епіфіти. Такі бактерії включають бактерії родів Адгобасіегішт, АїЇсаїїдепев,

А?о5ріпит, Агоїобасієг, Васіїйив5, Сіамірасієї, Епіегорасієг, Егміпіа, НРіаморасієг, КіервзівїІа,

Рзейдотопах, КПі2обішт, Зегтайа, бЗігеріотусе5 і Хапіпотопах. Симбіотичні гриби, такі як

Тпісподепта і «С(Посіадіит, також є можливими хазяїнами для експресії послідовностей

Зо нуклеїнових кислот за даним винаходом з тією ж метою.

ІЇ00139| Техніки для цих генетичних маніпуляцій є спеціальними для різних доступних хазяїнів і відомі в даному рівні техніки. Наприклад, вектори експресії ркКК223-3 і рккК223-2 можуть використовуватися для експресії гетерологічних генів у Е. соїї або в транскрипційному, або трансляційному злитті під дією їас або їгс промотора. Для експресії оперонів, які кодують множинні ОКЕ (відкриті рамки зчитування), найпростішою процедурою є вставка оперона у вектор, такий як ркКК223-3, при транскрипційному злитті, що дозволяє використовувати споріднений сайт зв'язування рибосоми гетерологічних генів. Техніки для надекспресії в грам- позитивному виді, такому як Васій5, також відомі в даному рівні техніки і можуть використовуватися в контексті даного винаходу (Оцах еї аї. В: Іпаивігіа! Місгоогдапізтв5:Вавіс апа Арріїєй Моїесшаг Сепеїїс5, Ед5. Ва єї аїІ., Атегісап Босієїу тог Місторіоіоду, УМавпіпдіоп (1993)). Альтернативні системи для надекспресії основані, наприклад, на дріжджових векторах і включають застосування Ріспіа, Засспаготусе5 і Кінумеготусе5 (ЗгеекКгізппа, В'Іпаизігіа! тістоогдапізтв равзіс апа арріїед тоїесшціаг депеїїйсв5, Вайе, Недетап, апа 5Каїма еав5., Атегісап зЗосієїу ог Містобіоіоду, УХазпіпоюп (1993); Оедиіп 5 Ваїте, Віотесппоіоду 1 2:173-177 (1994); мап деп Вега еї а!., ВіоїесппоІоду 8:135-139 (1990)).

Трансформація рослини 00140) В одному варіанті здійснення щонайменше один з інсектицидних білків еСгу1!В або білків мСгу!Ва даного винаходу експресується у вищому організмі, наприклад, рослині. У даному випадку трансгенні рослини, які експресують ефективні кількості білків еСтгу!Ва або мСту1Ва, захищають самі себе від комах-шкідників. Коли комаха починає харчуватися на такій трансгенній рослині, вона також ковтає експресований білок еСтгу!Ва або мСгуіВа. Це буде утримувати комаху від додаткового прокусування тканини рослини або може навіть завдавати шкоди або знищувати комаху. Послідовність нуклеїнової кислоти даного винаходу вводять у касету експресії, яка потім переважно стійко інтегрується в геном зазначеної рослини. В іншому варіанті здійснення послідовність нуклеїнової кислоти включена в непатогенний вірус, який самореплікується. Рослини, трансформовані відповідно до даного винаходу, можуть бути однодольними або дводольними і включають, але не обмежуючись ними, кукурудзу, пшеницю, ячмінь, жито, солодку картоплю, боби, горох, цикорій, салат-латук, качанову капусту, кольорову капусту, броколі, турнепс, редис, шпинат, спаржу, цибулю, часник, перець, селеру, гарбуз 60 великоплідний, гарбуз звичайний, коноплі, цукіні, яблуко, грушу, айву, диню, сливу, вишню,

персик, нектарин, абрикос, полуницю, виноград, малину, ожину, ананас, авокадо, папайю, манго, банан, сою, томат, сорго, цукровий очерет, цукровий буряк, соняшник, рапс, конюшину, тютюн, моркву, бавовник, люцерну, рис, картоплю, баклажан, огірок, арабідопсис і деревні рослини, такі як хвойні і листяні дерева.

ІЇ00141| Як тільки бажана послідовність нуклеїнової кислоти була трансформована в конкретний вид рослини, вона може розмножуватися в цьому виді або переноситися в інші сорти того ж виду, особливо, включаючи комерційні сорти, за допомогою традиційних методик селекції. 00142) Послідовність нуклеїнової кислоти за даним винаходом може бути експресована в трансгенних рослинах, таким чином, викликаючи біосинтез відповідного білка еСгу!Ва або мСгуї!Ва у трансгенних рослинах. Таким способом створюють трансгенні рослини з посиленою стійкістю до комах. Для їхньої експресії в трансгенних рослинах послідовності нуклеїнових кислот даного винаходу можуть потребувати інших модифікацій або оптимізації. Хоча в багатьох випадках гени з мікробних організмів можуть бути експресовані в рослинах при високих рівнях без модифікації, низький рівень експресії в трансгенних рослинах може бути результатом мікробних послідовностей нуклеїнових кислот, які мають кодони, що не є найбільш бажаними в рослинах. В галузі техніки відомо, що всі організми мають специфічні переваги для використання кодона, і кодони послідовностей нуклеїнових кислот, описаних у даному винаході, можуть бути змінені для відповідності уподобанням рослини, при збереженні амінокислот, які кодуються таким чином. Крім того, висока експресія в рослинах краще досягається від кодуючих послідовностей, які містять щонайменше приблизно 35 95 С, бажано більше ніж близько 45 95, більш бажано більше ніж близько 50 95, і найбільш бажано більше ніж близько 60 95. Мікробні послідовності нуклеїнових кислот, які мають низький вміст С, можуть слабо експресуватись в рослинах із-за існування АТТТА мотивів, які можуть дестабілізувати трансткрипти, і ААТААА мотивів, які можуть викликати неприйнятне поліаденілювання. Хоча переважні генні послідовності можуть бути належним чином експресовані як в однодольних, так і дводольних видах рослин, послідовності можуть бути модифіковані з урахуванням специфічних кодонових переваг і переваг вмісту ОС однодольних або дводольних, так як було показано, що ці переваги відрізняються (Миггау еї аїЇ. Мисі. Асій5 Кев5. 17:477-498 (1989)). До того ж послідовності

Зо нуклеїнових кислот піддаються скринінгу на існування неприйнятних сайтів сплайсингу, які можуть викликати процесинг транскрипта. Усі зміни, які необхідно зробити в послідовностях нуклеїнових кислот, такі як ті, які описані вище, здійснюють за допомогою добре відомих методик сайт-направленого мутагенезу, ПЦР ії конструювання штучних генів за допомогою способів, описаних в опублікованих патентних заявках ЕР 0 385 962 (для Мопзапіс), ЕР 0 359 472 (для І ибгі2ої) і УМО 93/07278 (для Сіра-сеїіду).

І00143| В одному варіанті здійснення даного винаходу кодуючу послідовність еСту1їВа одержують відповідно до процедури, розкритої в патенті США Ме 5625136, включеному в даний документ посиланням. У цій процедурі застосовують переважні для маїсу кодони, тобто один кодон, який найчастіше кодує таку амінокислоту в маїсі. Переважний для маїсу кодон для конкретної амінокислоти може бути отриманий, наприклад, із відомих генних послідовностей маїсу. Частота використання кодона в маїсі для 28 генів з рослин маїсу представлена в Мигтау еї аї.,, МисіІєїс Асідбє Незеатси 17:477-498 (1989), опис якого включено в даний документ посиланням. Синтетична послідовність, створена з кодонами, оптимізованими для маїсу, представлена в 5ЕО ІЮ МО: 13.

І00144| Таким способом послідовності нуклеїнових кислот можуть бути оптимізовані для експресії в будь-якій рослині. Установлено, що вся або будь-яка частина генної послідовності може бути оптимізованою або синтетичною. Тобто синтетичні або частково оптимізовані послідовності можуть також бути використані. 00145) Для ефективної ініціації трансляції послідовності, які прилягають до ініціюючого метіоніну, можуть вимагати модифікації. Наприклад, вони можуть бути модифіковані шляхом включення послідовностей, відомих як ефективні в рослинах. ЩУо5Ппі запропонував прийнятний консенсус для рослин (МАК 15:6643-6653 (1987)) і Сіопеїесп пропонує додатковий консенсусний ініціатор трансляції (каталог 1993/1994, сторінка 210). Ці консенсуси придатні для застосування з послідовностями нуклеїнових кислот даного винаходу. Послідовності вбудовуються в конструкції, які містять послідовності нуклеїнових кислот, до і включаючи АТО (у той самий час залишаючи другу амінокислоту немодифікованою) або альтернативно до і включаючи СТ, наступну за АТО (з можливістю модифікації другої амінокислоти трансгена). (00146) Експресія послідовностей нуклеїнових кислот у трансгенних рослинах управляється промоторами, які функціонують у рослинах. Вибір промотору буде змінюватися залежно від бо тимчасових і просторових потреб для експресії, а також у залежно від цільового виду. Таким чином, експресія послідовностей нуклеїнових кислот за даним винаходом в листках, у стеблах або стовбурах, у початках, у суцвіттях (наприклад, колосся, мітелки, стрижні початків кукурудзи і т. п.), у коренях і/або в сіянцях є переважною. У багатьох випадках, однак, необхідний захист від більше ніж одного типу комахи-шкідника, і таким чином, бажана експресія в ряді тканин. Хоча багато промоторів із дводольних, як було показано, є функціональними в однодольних і навпаки, в ідеалі вибирають промотори дводольних для експресії в дводольних, і промотори однодольних для експресії в однодольних. Однак немає обмеження щодо джерела походження промоторів: досить, щоб вони були функціональними при управлінні експресією послідовностей нуклеїнових кислот у необхідній клітині.

І00147| Промотори, які експресуються конститутивно, включають промотори з генів, які кодують актин або убіквітин, і 355 і 195 промотори Саму. Послідовності нуклеїнових кислот даного винаходу можуть також експресуватись під контролем промоторів, які є хімічно регульованими. Це дозволяє інсектицидним білкам еСтуіїВа або варіантним білкам Сгу1Ва синтезуватися тільки коли сільськогосподарські рослини обробляються індикуючими хімічними речовинами. Переважна технологія для хімічної індукції генної експресії докладно описана в опублікованій заявці ЕР 0 332 104 (для Сіра-Сеіду) і патенті США Мо 5614395. Переважний промотор для хімічної індукції являє собою промотор РЕ-1а тютюну. 00148) Іншою категорією промоторів є ті, які є індукованими пораненням. Були описані численні промотори, які експресуються в місцях поранення, а також у місцях фітопатогенної інфекції. В ідеалі, такий промотор повинен бути активний тільки локально в місцях інфекції, і, таким чином, інсектицидні білки еСту!В або варіантні білюи Сту!Ва накопичуються тільки в клітинах, які мають потребу в синтезі інсектицидних білків еСгу1Ва або варіантних білків Сту1Ва для знищення комахи-шкідника, який впроваджується. Промотори цього виду включають ті, які описані Зіапіога єї аЇ. Мої. Сеп. Сепеї. 215:200-208 (1989), Хи вї а. Ріапі Моїес. Віої. 22:573-588 (1993), одетапп еї аї. Ріапі Сеї! 1:151-158 (1989), ВоНпгтвеіег 8. І епіє, Ріапі Моїес. Віо!. 22:783- 792 (1993), Нікек єї а. Ріапії Мо!їес. Вісі. 22:129-142 (1993), і УМатег еї а. РіІапі 9. 3:191-201 (1993).

І00149| Специфічні для тканини або переважні для тканини промотори, придатні для експресії генів білка еСгу!Ва або варіантного білка Стгу!Ва у рослинах, зокрема, кукурудзі, є такими, які управляють експресією в корені, серцевині, листку або пилку, зокрема, корені. Такі промотори, наприклад, такі, які виділені з РЕРС або ігрА, розкриті в патенті США Мо 5625136 або МТІ, розкриті в патенті США Мо 5466785. Обидва патенти США включені в даний документ посиланням у їхньому повному обсязі. 00150) Додаткові переважні варіанти здійснення являють собою трансгенні рослини, які експресують послідовності нуклеїнових кислот способом індукції пораненням або індукції патогенною інфекцією.

Ї00151| На додаток до промоторів, різноманітні термінатори транскрипції є також доступними для застосування при конструюванні химерного гена за допомогою генів білка еСту1Ва або варіантного білка Стгу1!Ва даного винаходу. Термінатори транскрипції відповідають за термінацію транскрипції за межами трансгена і його правильне поліаденілювання. Прийнятні термінатори транскрипції і такі, відомі як функціонуючі в рослинах, включають термінатор 355

Саму, термінатор Іті, термінатор нопалін-синтази, термінатор гроз Е9 гороху й інші, відомі в рівні техніки. Вони можуть використовуватися як в однодольних, так і в дводольних. Будь-який доступний термінатор, відомий як функціонуючий в рослинах, може використовуватися в контексті даного винаходу. 001521 Різні інші послідовності, можуть бути введені в касети експресії, описані в даному винаході. Вони включають послідовності, які, як було показано, підсилюють експресію, такі як інтронні послідовності (наприклад, з АНІ ї Бгоп7еї) і вірусні лідерні послідовності (наприклад, з

ТМУ, МСММУ і АММУ).

І00153| Переважним є націлювання експресії послідовностей нуклеїнових кислот даного винаходу в різні клітинні локалізації в рослині. У деяких випадках локалізація в цитозолі може бути бажаною, тоді як в інших випадках, локалізація в деякій субклітинній органелі може бути переважною. Субклітинна локалізація кодованих трансгеном ферментів забезпечується за допомогою методик, добре відомих у даному рівні техніки. Як правило, ДНК, яка кодує цільовий пептид з відомого націленого на органелу генного продукту, піддається маніпуляції і зливається вище послідовності нуклеїнової кислоти. Багато таких послідовностей, що націлюють, відомі для хлоропласта, і показано їхнє функціонування в гетерологічних конструкціях. Експресія послідовностей нуклеїнових кислот даного винаходу також націлена на ендоплазматичний ретикулум або на вакуолі клітин-хазяїнів. Методики для досягнення цього добре відомі в даному рівні техніки.

00154) Вектори, придатні для трансформації рослин, описані в іншому місці в цьому описі.

Для опосередкованої Адгобасіегішт трансформації бінарні вектори або вектори, які несуть щонайменше одну Т-ДНК граничну послідовність, є придатними, тоді як для прямого переносу генів є придатним будь-який вектор, і лінійна ДНК, яка містить тільки конструкцію інтересу, може бути переважною. У випадку прямого переносу генів може використовуватися трансформація одним видом ДНК або котрансформація (5споснег еї аї. ВіоїесппоЇоду 4:1093-1096 (1986)). Як для прямого переносу генів, так і для опосередкованого Адгобасіегішт переносу, трансформацію звичайно (але не обов'язково) здійснюють із селективним маркером, який може забезпечувати стійкість до антибіотика (канаміцину, гігроміцину або метотрексату) або гербіциду (баста) Вектори трансформації рослин, які містять гени білка еСту!Ва або варіантного білка Стуї!Ва даного винаходу, можуть також містити гени, наприклад, фосфоманоза-ізомеразу (рті), яка забезпечує позитивну селекцію трансгенних рослин, як розкрито в патентах США МоМо 5767378 і 5994629, включених у даний документ посиланням, або фосфінотрицин-ацетилтрансферазу (ра), яка забезпечує стійкість до гербіциду фосфінотрицину (глюфозинату). Вибір селективного маркера, однак, не є ключовим для даного винаходу. 00155) В іншому варіанті здійснення послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує білок есСту1Ва або білок «Сгу!Ва даного винаходу, безпосередньо трансформують у геном пластиди.

Головна перевага пластидної трансформації полягає в тому, що пластиди, як правило, здатні експресувати бактеріальні гени без істотної оптимізації кодона, і пластиди здатні до експресії множинних відкритих рамок зчитування під контролем одного промотора. Технологія пластидної трансформації широко описана в патентах США МоМо 5451513, 5545817 і 5545818, у РСТ заявці

УМО 95/16783 і в МеВгіде еї а!. (1994) Ргос. Маїї. Асад. 5сі. ОБА 91, 7301-7305. Базова методика для трансформації хлоропластів включає введення ділянок клонованої пластидної ДНК, фланкуючої селективний маркер разом з геном інтересу, у придатну цільову тканину, наприклад, використовуючи біолістику або трансформацію протопласта (наприклад, трансформацію, опосередковану хлоридом кальцію, або ПЕГ -опосередковану трансформацію).

Фланкуючі ділянки 1-1,5 т. п. н., названі направляючими послідовностями, полегшують гомологічну рекомбінацію з пластидним геномом і, таким чином, забезпечують заміщення або

Зо модифікацію специфічних ділянок пластому. Спочатку, точкові мутації в генах 165 рРНК і гре12 хлоропласта, які забезпечують стійкість до спектиноміцину і/або стрептоміцину, використовують як селективні маркери для трансформації (5маб, 7., На|диківем'ісл, Р., і Маїїда, Р. (1990) Ргос.

Маїї. Асад. 5сі. ОБА 87, 8526-8530; аб, 9. М., і Маїїда, Р. (1992) Ріапі СеїІ 4, 39-45). Це приводило до стабільних гомопластидних трансформантів з частотою приблизно один на 100 бомбардувань цільових листків. Присутність сайтів клонування між цими маркерами забезпечувала створення націленого на пластиду вектора для введення чужорідних генів (щаиб, -. М., і Маїїда, Р. (1993) ЕМВО .). 12, 601-606). Істотні підвищення частоти трансформації одержують шляхом заміщення рецесивних генів рРНК або г-білка стійкості до антибіотика на домінантний селективний маркер, бактеріальний ген аадА, який кодує знешкоджуючий спектиноміцин фермент, аміноглікозид-3'- аденілтрансферазу (5маб, 2., і Маїїда, Р. (1993) Ргос.

Май. Асад. Зсі. ОБА 90, 913-917). Раніше цей маркер був успішно використаний для трансформації з високою частотою пластидного геному зеленої водорості Спіатудотопав геіпНнагайії (Соідб5сптіа!:СіІєнтопі, М. (1991) Мисі. Асідє ВНе5. 19:4083-4089). Інші селективні маркери, придатні для пластидної трансформації, відомі в даному рівні техніки і включені в обсяг даного винаходу. Як правило, необхідно приблизно 15-20 циклів клітинного поділу після трансформації для досягнення гомопластидного стану. Пластидна експресія, при якій гени вставляються за допомогою гомологічної рекомбінації в усі з декількох тисяч копій кільцевого пластидного геному, присутні у кожній рослинній клітині, користується перевагою аномальної кількості копій у порівнянні з генами, експресованими в ядрі, щоб забезпечити рівні експресії, які можуть легко перевищити 10 95 від загального розчинного білка рослин. У переважному варіанті здійснення послідовність нуклеїнової кислоти даного винаходу вставляють у націлений на пластиду вектор і трансформують у геном пластиди бажаної рослини-хазяїна. Одержують рослини гомопластичні щодо пластидних геномів, які містять послідовність нуклеїнової кислоти даного винаходу, і вони переважно здатні до високої експресії послідовності нуклеїнової кислоти.

Комбінації діючих речовин для боротьби з комахами (00156) Білки еСту1їВа або миСту1Ва даного винаходу можуть використовуватися в комбінації з іншими білками Стгу Ві або іншими пестицидними діючими речовинами для підвищення цільового спектра шкідників. Крім того, застосування білків еСгу!Ва або мСту!їВа даного бо винаходу в комбінації з іншими білками Сгу Ві або іншими пестицидними діючими речовинами іншої природи має особливу користь для запобігання і/або керування стійкістю комах. Інші інсектицидні діючі речовини включають, наприклад, лектини, а-амілазу, пероксидазу і холестерол-оксидазу. Гени Вегетативного Інсектицидного Білка, такі як міріА(а) і мрг2А(а) або міра, також придатні в даному винаході В одному варіанті здійснення білок есгуї1Ва, позначений еСту!Ва-Т2АМ150КІ 1895 (ЗЕО ІОМО: 9), комбінують з білком МірзА у трансгенній рослині. Трансгенна рослина проявляє комбінований спектр інсектицидної активності, зв'язаний як з еСгу1Ва, так і з Мір3. У ще одному варіанті здійснення трансгенна рослина являє собою рослину кукурудзи або рослину цукрового очерету.

І00157| Така коекспресія більше ніж однієї інсектицидної діючої речовини в одній трансгенній рослині може бути досягнута шляхом генетичного конструювання щодо рослини, щоб вона містила і експресувала всі необхідні гени в так званому молекулярному пакеті. Альтернативно, рослина, Батько 1, може бути генетично сконструйована для експресії генів даного винаходу.

Друга рослина, Батько 2, може бути генетично сконструйована для експресії додаткової діючої речовини для боротьби з комахою. Шляхом схрещування Батька 1 з Батьком 2 одержують потомство рослини, яке експресує усі гени, введені в Батьків 1 і 2. Наприклад, без обмеження,

Батько 1 може містити кодуючу послідовність еСгу!Ва, і Батько 2 може містити кодуючу послідовність МірзА. Деякий з нащадків схрещування Батька 1 з Батьком 2 буде містити як кодуючу послідовність еСту1Ва, так і кодуючу послідовність МірзА. 00158) Трансгенне насіння даного винаходу може також бути оброблене інсектицидним покриттям для насіння, як описано в патентах США МоМо 5849320 і 5876739, включених у даний документ посиланням. У випадку, коли інсектицидне покриття для насіння і трансгенне насіння даного винаходу є активними щодо однієї і тієї ж цільової комахи, комбінація є придатною (Її) у способі для підвищення активності білка еСгу1Ва даного винаходу щодо цільової комахи і (ії) у способі профілактики розвитку стійкості до білка еСтуіїВа даного винаходу шляхом забезпечення другого механізму дії щодо цільової комахи. Таким чином, даний винахід забезпечує спосіб підвищення активності щодо цільової комахи або профілактики розвитку стійкості в цільової комахи, наприклад, кукурудзяного жука, який включає нанесення інсектицидного покриття для насіння на трансгенне насіння, яке містить один або кілька білків еСту!Ва даного винаходу. Такі хімічні обробки можуть включати інсектициди, фунгіциди або нематоциди. Приклади таких інсектицидів включають, без обмеження, динотефуран, такий як тіаметоксам, імідаклоприд, ацетаміприд, нітенпірам, нідинотефуран, хлорфенапір, тебуфенпірад, тебуфенозид, метоксифенозид, галофенозид, триазамат, авермектин, спіносад, фіпринол, ацефат, фенаміфос, діазинон, хлорпірифос, хлорпірифон-метил, малатіон, карбарил, алдикарб, карбофуран, тіодикарб і оксаміл. Навіть якщо інсектицидне покриття для насіння є активним щодо іншої комахи, то інсектицидне покриття для насіння є придатним для розширення діапазону боротьби з комахами, наприклад, шляхом додавання інсектицидного покриття для насіння, яке має активність щодо лускокрилих комах, до трансгенного насіння даного винаходу, яке має активність щодо твердокрилих комах, при цьому покрите трансгенне насіння забезпечує боротьбу як з лускокрилими, так і з твердокрилими комахами-шкідниками.

ПРИКЛАДИ

00159) Даний винахід буде додатково описано з посиланням на наступні докладні приклади.

Ці приклади представлені лише для цілей ілюстрації, і не мається на увазі, що вони є обмежуючими, якщо інше не зазначено. Стандартні методики рекомбінантної ДНК і молекулярного клонування, використані в даному документі, є добре відомими в даному рівні техніки й описані в .). затюогоок, еї аЇ., Моїесшаг Сіопіпд: А Гарогаїгу Мапиаї, за Еа., Сода 5ргіпд

Нагбог, МУ: Соїа Зргіпу Нагброг І арогафогу Ргез5 (2001); Т. У. 5іІйпаму, М. І. Вегтанп, і С. МУ. Епдпіві,

Ехрегітепів м/йй Сепе ЕРивзіоп5, Соїй 5ргіпуд Нагброг Гарогаюгу, Соїй ргіпд Нагрог, МУ (1984) і

А!йзибеї, Е. М. еї аї., битепі Ргоїюсої!5 іп МоїІесшаг Віоіоду, Мем Моїк, доп У/іІеу апа 5опвз Іпс., (1988), Веїйег, єї а!., Меїйодвз іп Агарідорзіз Везевагсіи, УУопа Зсієпійіс Ргез5 (1992), і Зспи,ика еї аї.,

Ріапі МоІесшаг Віооду Мапиаї, Кіиуег Асадетіс Рибіїєпетгз (1998).

Приклад 1. Застосування ПЦР для мутування кодуючих послідовностей Сту1Ва

ЇО0160| Полімеразна ланцюгова реакція (ПЦР) являє собою повторюваний, ферментативний, який використовує затравку, синтез послідовності нуклеїнової кислоти. Ця процедура є добре відомою і широко використовуваною фахівцями в даній галузі техніки (Дивися Миїї5, патенти США МоМо 4683195, 4683202 і 4800159; ЗаїКкі, Капааїй! К., ерпеп Зепан,

Егедй Раіоопа, Кагу В. Миїйїв, Сівпп Т. Нопт, Непгу А. Епісн, Моптап АтнНеїт (1985) "Епгутаїіс

Атрійсайоп ої В-Сіобіп Сепотіс Зедиепсев апа Вевігісйоп 5йе Апаїузів Тог Оіадповів ої бісКкІє

СеїЇ Апетіа, " Зсієпсе 230:1350-1354.). ПЦР грунтується на ферментативній ампліфікації ДНК фрагмента інтересу, який фланкований двома праймерами олігонуклеїнової кислоти, що бо гіоридизуються з протилежними ланцюгами цільової послідовності. Праймери орієнтовані 3'

кінцями, спрямованими один до одного. Повторювання циклів температурної денатурації матриці, відпал праймерів до їхніх комплементарних послідовностей і подовження відпалених праймерів за допомогою ДНК полімерази приводять до ампліфікації сегмента, визначеного 5' кінцями ПЦР праймерів. Оскільки подовжений продукт кожного праймера може служити як матриця для інших праймерів, кожен цикл власне кажучи подвоює кількість ДНК фрагмента, отриманого в попередньому циклі. Це приводить до експоненціального нагромадження специфічного цільового фрагмента аж до декількох мільйонів разів за кілька годин. Шляхом використання термостабільної ДНК полімерази, такої як Тад полімераза, яку виділяють з термофільної бактерії Тпепти5 адиайсиє, процес ампліфікації може бути цілком автоматизований.

І00161| Кодуючі послідовності мутантного Сту!Ва, описані в наступних прикладах, були сконструйовані, використовуючи ОціскСпапде 5йе-Оігесієй Миїадепевзі5 Кії (набір ОціскСпапде для сайт-направленого мутагенезу) (Зігаїадепе, Ла-Хойя, Каліфорнія) відповідно до інструкцій виробника, і різні комбінації ілюстративних праймерів показані у Таблиці 1. Фахівець у даній галузі техніки установить на підставі даної заявки, що інші пари праймерів можуть використовуватися, щоб мутувати будь-яку кодуючу послідовність Сту1Ва.

Таблиця 1

Праймери, використані для створення мутованої кодованої послідовності, яка кодує білки еСтуїВа. праймера ннн""'ннНнНнИТШТИВЛЦООТОТООО ОТО Я ннн""'ннН Н ЯІТШТООИІСЛООВОИІЛМЛЬИІТИОТООООООИОИООТОТООЦВООВОВООВВВОВОВВВВВВВВВВОВОВОВОВОВОВОВО ОО нню"нін ІІШИШТЬККІІООЛОЛІИІВЦООЛОЛОЛОЛОЛОЛОЛЛОЛОЛОЛОЛВЛОЛВЛВТЛТЛОТОИВИЛИТОИТИОУ НИ

Приклад 2. Визначення токсичності мутантів СтуїВа

(00162) Активність мутантних білків Сгу!Ва (описаних нижче) щодо комах-шкідників, які включають європейського кукурудзяного метелика (Об5ігіпіа пибіїарйє), очеретяну вогнівку (Оіаїгаєа засспагаїїє), кукурудзяну південно-західну вогнівку (Оіаїгаєа дгапаїозеїІа), бавовняну совку (Неїїсомегра 7еа), соєву совку (Рзхешпдоріивіа іпсіцдеп5), гусеницю оксамитових бобів (Апіїсагзіа деттайїйа|й5) і колорадського жука (Іерііпоїагза аесептіїпеайа), визначають за допомогою способу зараження поверхні. Коротко, штучний раціон для конкретного виду наливають у 24-ямкові планшети для тканинної культури або малі чашки Петрі. Кожна лунка має площу поверхні приблизно 2 см2. Рідини, які містять мутантні білки Стгу1!Ва, наносять на поверхню раціону в кожній лунці. Після того, як рідина абсорбується і висихає, випробувані личинки поміщаються в кожну лунку, і потім планшет герметично закривають. Активність сконструйованого білка Сту!Ва порівнюють з нативним або Сту1!Ва дикого типу і записують у вигляді відсотка смертності або відносної активності.

Приклад 3. Мутації в положенні 150 у повнорозмірному Стгу1Ва. 00163) Оскільки шість нативних білків Сгу1!Ва відрізняються тільки однією амінокислотою в альфа-спіралі 4, наприклад, 4/6 мають тирозин (У150) і 2/6 мають гістидин (НІ150) (дивися Фігуру 1), то аналіз початкового мутагенезу досліджував вплив положення амінокислоти 150 в альфа- спіралі 4 на інсектицидну активність повнорозмірного Сту1Ва.

І00164| Нативну повнорозмірну кодуючу послідовність сгу!Ва (ЗЕО ІЮ МО: 1) клонували в рОС18-отриманий біфункціональний вектор ВЕ. соїї під контролем СгутїАс промотора.

Використовуючи цю повнорозмірну кодуючу послідовність як матрицю, мутантні білки СтуїВа створювали шляхом випадкового заміщення тирозину (Туг) у положенні 150 іншими амінокислотами, використовуючи ОцпіскСпапде 5йе-Оігесієй Мшиїадепезіз КИ (5ігаїадепе, Ла-

Хойя, Каліфорнія) відповідно до інструкцій виробника і праймери У5152-уУ05157 Таблиці 1. Усі мутантні білки Сту!Ва досліджували щодо ЕСВ, використовуючи спосіб, описаний у Прикладі 2. 00165) Дані, представлені в Таблиці 2, показують, що положення 150 у повнорозмірному білку СтуіВа відіграє важливу роль у модулюванні щонайменше токсичності ЕСВ. Деякі з мутацій знижували специфічну активність ЕСВ у порівнянні з нативним Сту1Ва. Стут АБ, білок з високою специфічною активністю щодо ЕСВ, має аргінін (Аго) у положенні, яке відповідає 150 послідовності Сту!Ва (положення 131 СтутАБб послідовності; див. Фігуру 2А). Цікаво, що М150К

Зо мутант СтуїВа мав тільки половину активності нативного білка Стгу!Ва, використаного в експерименті. Мутації, які зберігали або дещо збільшували активність у порівнянні з нативним

Сту1Ва, включали М150ОК, 150, У150УМ і М150Р. Мутантні білки Сгу1Ва, які мали більш низьку активність у порівнянні з нативним Стгуї1Ва, були позначені як варіантні білки Сту1Ва.

Таблиця 2

Результати біоаналізу ЕСВ Сту1Ва-у150Х мутанта. зопенннинння Знято оте

Позначення мутанта смертність ЕСВ

Мб //11111111111ССФР 111111111111111111111111няю

КТ ВН Ж ПОН ОО мг 11111161 (Порожнійвектор(контролю).д | (77777711

Приклад 4. Токсичність укороченого Стгу1Ва у порівнянні з повнорозмірним СтгуїВа

І00166| На підставі того, що відомо в даному рівні техніки, не ясно, на які точно протеолітичні сайти в СтуїВа спрямовані кишкові протеази комах. Отже, послідовність активного токсину залишається не ясною. Для цього прикладу сайти розщеплення для протоксину Сту1Ва передбачили на основі вирівнювання послідовностей з СтутАБ (див. Фігуру 2), чиї сайти розщеплення були встановлені. Використовуючи цю інформацію, були сконструйовані вектори, які експресують укорочені варіанти Сту1Ва.

І00167| Укорочений фрагмент сгу!Ва клонували за допомогою ПЦР у вектор рСІВ5634 або рЕТ28а, використовуючи повнорозмірну нативну кодуючу послідовність сгуїВа (ЗЕО ІЮ МО: 1) як матрицю і праймери Ус160 і у5162 або ус163 і ус166 відповідно. Отриманий за допомогою

ПЦР фрагмент кодує укорочений білок, який містить амінокислоти 1-647 у БЕО ІЮ МО: 2. Однак у ході початкового клонування укороченої кодуючої послідовності сгу!Ва у вектори вводили мутацію, за допомогою чого треонін у положенні 2 (12) заміщається аланіном (Аа; А) (12А мутація). Визначили, що ця Т2А мутація не має негативного впливу на інсектицидну активність у порівнянні з нативним Стгу1Ва і, отже, її використовували в усіх наступних експериментах з мутаціями. Цей Т2А мутант був позначений 125 Стгу1Ва дикого типу. (00168) Інший укорочений фрагмент сгу!Ва клонували за допомогою ПЦР у вектор рСІВ5634 або рЕТ28ва, використовуючи кодуючу послідовність 125 як матрицю і праймери Ус161 і У5162 або (164 і У(166 відповідно. Отриманий за допомогою ПЦР фрагмент кодує білок, укорочений на М-кінці ії С-кінці (ЗЕО ІЮ МО: 42), який містить амінокислоти 22-647 у БЕО ІЮ МО: 2 і був позначений 17. 00169) Результати вестерн-блоттинга показують, що укорочений Т25Сгу1іВа (який містить амінокислоти 1-647) як у рСІВ5634, так і рЕТ2ва векторах був більш стабільним, аніж укорочений Т7 Сту1Ва-токсин у будь-якому векторі. Результати біоаналізу (Таблиця 3) показали, що Т25-токсин дикого типу був у 15 разів більш активним, аніж Т7-конструкт і в З рази більш активним, аніж повнорозмірний білок Сгу!Ва. Отже, додаткові мутанти Сгу!Ва були сконструйовані з використанням укороченого Т25 Сту1Ва дикого типу.

Таблиця З

Активність укороченого стосовно повнорозмірного Сту!Ва щодо ЕСВ. оче |в 01

Клон Амінокислоти повнорозмірного СтгуїВа (Контрольнийвектор.ї | 7777777 - 77777777 ЇЇ 77771717171717171717100777сСсСс

Приклад 5. Ефекти мутування У150 в укороченому Стгу! Ва. 00170) Мутації в положенні амінокислоти 150, які не зменшували інсектицидну активність, включаючи М150К, М150Р, М150УМ ї М150Р, повнорозмірного білка Сту!Ва, випробували в

Зо укороченому Т25 Сту1Ва-токсині. У150ОК, 150, У150МУ ії У150Р мутації одержували, як описано вище, використовуючи праймери 152-157.

ІЇ00171| Створення цих мутацій в укороченому Т25 білку приводить до результатів, які відрізняються від повнорозмірного білка Сту1Ва. Наприклад, мутація У150Р в укороченому 125 токсині цілюом зводить нанівець активність ЕСВ. Однак така ж мутація в повнорозмірному

Сту1Ва не мала негативного впливу на активність ЕСВ (див. Приклад 3). Дивно, що всі мутації, крім мутації М150К, знижували активність Т25 щодо ЕСВ деякою мірою (Таблиця 4). Усі відомі нативні білки Сту!Ва мають або гістидин (Н), або тирозин (У) у положенні 150. Мутація М150К істотно змінювала біологічні властивості мутанта еСту!Ва-У150К у порівнянні як з нативним

СтуїВа "НІ5О-типу", так і з нативним Сту!Ва "у150-типу". Мутант У150К був у З рази більш активним, аніж білок Сту1Ва з гістидином (Ніз) у положенні 150.

Таблиця 4

Активність процесованих У150Х мутантів.

ПИ я і нь

Позначення мутанта 150 птмМе 11111111 77111111111111111111111111111116б001сСсС2С (Порожнійвектор(контролу.д ЇЇ 7777777 -111117111111Ї711717171711111000711с1с1 00172) Кожний з мутантних Т25 білків Сту!Ва був досліджений на предмет його розчинності.

Розчинність білків корелювала з інсектицидною активністю. Наприклад, білок еСту!Ва-У150К був більш розчинним, аніж Т25-Сту1Ва дикого типу і будь-які інші мутантні білки. Отже, ці дані показують, що зміна амінокислоти в положенні 150 має великий вплив на розчинність і інсектицидну активність укороченого білка Сгу!Ва. Наприклад, мутування тирозину (Туг) у положенні 150 до лізину (І уз) істотно підвищує розчинність і специфічну активність укороченого

Сту!Ва-токсину щодо ЕСВ у порівнянні з укороченим Стгу!Ва-токсином (Т25) дикого типу. Білок еСту1їВа-х150К (ТМ2) був використаний для додаткових експериментів по мутаційному аналізу.

Приклад 6. Конструювання та випробування додаткових мутантів еСтгу!Ва

І00173| СтулАр має високу специфічну активність щодо ЕСВ. Отже, вирівнювання послідовностей було проведено між СтутАб і Т25-білком Сту!Ва, щоб допомогти визначити ключові положення амінокислот в альфа-спіралі 4 або 5, які можуть бути важливими для активності або розчинності Сту1!Ва. Вирівнювання послідовностей між СтутАБ і Сту!Ва показано на Фігурі 2. Порівняння структурних ознак СтутАбБ і Сту1!Ва показано в Таблиці 8 у Прикладі 10 нижче. Додатковий мутаційний аналіз був проведений на визначених ключових положеннях амінокислот для визначення того, чи будуть мутації на додаток до Х150К мутації додатково підвищувати специфічну активність цього білка еСгу!Ва. ТМ2 кодуючу послідовність (ЗЕО ІЮ

МО: 4) використовували як матрицю для додаткового сайт-направленого мутагенезу. Мутації були створені, як описано вище, використовуючи У(171-у(3193 праймери, перераховані в

Таблиці 1.

І00174| Одинадцять мутантів досліджували на предмет активності щодо європейського кукурудзяного метелика. Таблиця 5 показує результати біоаналізів. З 11 досліджених мутантів, дві мутації, 1895 ії 5199К, підвищували специфічну активність мутанта ТМ2-У150К відносно

ЕСВ, специфічна активність якого підвищилася щонайменше в З рази в порівнянні з СтуїВа дикого типу (Т25). Вони були позначені як сконструйовані білки Сгу1!Ва (еСгуї1Ва). Дві мутації,

М81МУ ї М1785/А1555, мали таку ж активність, що і ТМ2, і два мутанти, М178Р ї К1705, мали меншу активність, аніж ТМ2. Ці мутанти класифікували як варіантні білки Сгу!Ва (уСгу1Ва).

Чотири мутації, М148Е/А1550, А155К, А163К і А163К//188Р, цілком зводили нанівець активність, указуючи на те, що ці положення є критичними для щонайменше активності щодо

ЕСВ.

Таблиця 5

Активність мутантів ТМ2-Сгту1Ва у порівнянні з Сту1Ва дикого типу. тмбо 0 ф|міБОКлЛ/ЛЯВЕЛАТЬО | 777777717100 11111111 тМм7о 0 фМміБоюАТЬВКС//777777777/ Ї7771717171717100 11111111 тМ78 0 ф|МміБоюАТВУАК77777777777717Ї777171717171100 11111111 лмва 0 ф|МіБОКлАТ6З3КЛІВВР/Ї777771711100 11111111

Спектр білка еСту1їВа

І00175| Мутант ТМ33 (еСту!Ва-Т2АМ150КІ 1895) був досліджений щодо деяких інших лускокрилих комах, включаючи очеретяну вогнівку (СВ; Оіамгаєа засспагаї5), кукурудзяну південно-західну вогнівку (ЗУМУСВ; Оіаїгаєа дгапаїозеМПа), бавовняну совку (СЕМУ, Неїїсомегра 7ва), гусеницю оксамитових бобів (УВС; Апіїсагзіа деттаїгаїїв) і соєву совку (ЗВІ., Рзецпйдоріивіа іпсіцдеп5, зараз іменована СпПгузодеїхіє іпсішдеп5) за допомогою біоаналізів синтетичного раціону на обробленій поверхні. Смертність личинок оцінювали через приблизно 4-6 днів у залежності від випробуваного виду комах.

І00176| Нативний Сгу!Ва, як повідомлялося, був активним щодо очеретяної вогнівки, вогнівки кукурудзяної південно-західної і соєвої совки і не мав активності щодо бавовняної совки. До того ж, деякі публікації дозволяють припустити, що штами Ві, які містять білок Сту1В- типу, мають активність щодо гусениці оксамитових бобів (Вобгом/єКі еї аІ. 2001. Вгалії. 9.

Місторої. 32:105-109), але з цієї публікації не ясно, чи обумовлена ця активність білком Сту1Ва, чи деякими іншими білками, експресованими у випробуваному штамі Ві. Інші публікації (наприклад, Моппегаї еї аї. 2007. Віоіодіса! Сопігої 41:291-295) показують, що Сту1В, присутній у штамах Ві, вносить невеликий вклад у токсичність таких штамів стосовно личинок УВС.

І00177| Результати біоаналізу мутанта еСтгу1Ва-Т2АХ150КІ 1895 показали, що цей білок, як і нативний білок Сту!Ва, є активним щодо очеретяної вогнівки, вогнівки кукурудзяної південно- західної і соєвої совки. На відміну від нативного білка Сгу1Ва, білок еСгу!Ва був дуже активним щодо гусениці оксамитових бобів. На диво, білок еСгту!Ва також мав деяку активність щодо бавовняної совки, комахи, до якої нативний Сгу1Ва не має активності. Активність білка еСгу1Ва щодо гусениці оксамитових бобів і бавовняної совки є іншим свідченням того, що еСту1Ва являється, власне кажучи, відмінним від нативного білка Сгу1Ва.

І00178| Оскільки нативний Сту!Ва, як відомо, є активним щодо як лускокрилих, так і твердокрилих комах, то білок еСгуї!Ва ТМ33 був досліджений щодо твердокрилої комахи, колорадського жука (СРВ; І ерііпоїагза десептіїпеага). Біоаналізи проводили з використанням новонароджених личинок СРВ і стандартного аналізу з використанням синтетичного раціону, як

Зо описано вище в Прикладі 2. Як уже відомо в даному рівні техніки, нативний білок Сту!Ва був активним щодо СРВ. Мутант Стгу1!Ва дикого типу, Т25, також був активним. На диво Т33 білок еСту!Ва не був активним щодо СРВ. Отже, хоча мутації в Т33 підвищують специфічну активність щодо щонайменше європейського кукурудзяного метелика, ці мутації виключали активність щодо твердокрилої комахи, колорадського жука, що являється ще одним свідченням того, що властивості білків еСту1!Ва є, власне кажучи, відмінними від нативних білків Сту1Ва і

Сту1Ва дикого типу. Використовуючи цей підхід, фахівцю в даній галузі техніки буде зрозуміло, що мутація амінокислот у домені І, зокрема, альфа-спіралі 4 і альфа-спіралі 5, забезпечує спосіб зміни спектра активності Сгу1Ва.

ІЇ00179| Мутанти, описані вище, були досліджені щодо відмінностей у властивостях розчинності з використанням стандартних способів, відомих у даному рівні техніки. Коротко, клітинний осад після центрифугування з індукованих культур Е. соїї, експресуючих мутанти

СтгуїВа і Сгу!Ва дикого типу, були оброблені в реагенті для екстракції білка ВидВиєтегтм (Момадеп, Іпс) інгібіторами протеази і лізоназою відповідно до інструкцій виробника. Клітинні лізати і розчинні фракції після центрифугування клітинних лізатів були проаналізовані на 505-

РАСЕ і вестерн-блоттингу з використанням антитіла кролика до СтуіВа і на вестерн-блоті кількісно визначили білок Сгу!Ва за допомогою АЇІрпаіІтадег (Сеї! Віозсіепсе5). Хоча мутант

СтгуїВа і Т25 дикого типу показали подібний рівень експресії білка в клітинних лізатах, кількість білка, присутнього у розчинних фракціях, на диво, дуже відрізнялася між мутантами і диким типом. Для порівняння розчинності мутантні білки Стгу1Ва, присутні у розчинних фракціях, були нормалізовані відносно Сту!Ва дикого типу. Результати в Таблиці б показують, що мутанти еСту!Ва мали в діапазоні від 1,5 до 2,1 разів білоше розчинного білка еСту1Ва, аніж білка

СтуїВа Т25 дикого типу в такій самій кількості рідини за таких самих умов навколишнього середовища. "ЗР" у Таблиці 6 означає розчинний білок; і "ТР" означає загальний білок.

Таблиця 6

Порівняння розчинності білків еСту1Ва і білка Сту1Ва Т25 дикого типу. же |оми | вет | МОМОЖ . порівнянні з диким

Клон Мутації Відсоток БРЛР типом (Т25) тМма 77777777 (тік |Ї7777771717178611111111111и1

Приклад 7. Побудова гена есгу1В, оптимізованого для маїсу

І00180| Оптимізована для маїсу нуклеотидна послідовність (тосгу!Ва-ТМ33), яка кодує мутантний білок Сту!Ва ТМ33 (еСтгу!Ва-Т2А:У150К:І 1895), була створена, як описано в патенті

США Мо 6051760, включеному в даний документ посиланням. Кодуюча послідовність тосгу! Ва-

ТМ33 представлена в ЗЕО ІЮ МО: 13. Амінокислотна послідовність еСсгу!Ва-Т2А:У150К:І 1895 представлена в 5ЕЮО ІЮ МО: 9.

Приклад 8. Трансгенний маїс і цукровий очерет, експресуючі білок еСгу1Ва

ІЇ00181| Два вектори трансформації рослин сконструйовані для введення кодуючої послідовності тосгу!Ва-ТМ3ЗЗ у маїс: (а) перший вектор (18320), який включає дві касети експресії, де перша касета експресії містить промотор убіквітину маїсу (2тОбіїп) (Спгієтепзеп еї а. 1992 РМВ 18: 675), функціонально зв'язаний з кодуючою послідовністю ТМ33, додатково функціонально зв'язаною з 3' кінцевою послідовністю термінації транскрипції і поліааденілювання

Зо нопалін-синтази, позначену як тирі: тосгу!Ва-ТМ33:МО5, і друга касета експресії містить з55:расмМмо5; і (Б) другий вектор (18319), який включає дві касети експресії, де перша касета експресії містить МТ промоторну послідовність (Патент США Мо 6018099), функціонально зв'язану з ТМ33 кодуючою послідовністю, додатково функціонально зв'язаною з 3' кінцевою послідовністю термінації транскрипції і поліаденілювання нопалін-синтази, позначену як

МТ тосту! Ва-ТМ33:МО5, і друга касета експресії містить 355:расМоО5. Усі вектори в цьому прикладі містять ген раї кодуючий фосфінотрицин-ацетилтрансферазу (РАТ), яка надає стійкість до гербіциду фосфінотрицину для добору трансгенних подій.

І00182| Обидва вектори окремо трансформують у маїс. Адгобасіегішт-трансформацію незрілих зародків маїсу проводять, головним чином, як описано в Медгойцо еї аї., 2000, Ріапі СеїЇ

Верогів 19: 798-803. Для цього прикладу усі компоненти середовищ є, головним чином, такими, як описано в Медгоцо еї а!І., вище. Однак, різні компоненти середовищ, відомі в даному рівні техніки, можуть бути замінені.

ІЇ00183| Коротко, штам Адгорасіегішт І18А4404 (рБ5В1!), який містить плазміду для трансформації рослин, вирощують на твердому середовищі МЕР (дріжджовий екстракт (5 г/л), пептон (10 г/л), Масі (5 г/л), 15 г/л агару, рН 6,8), протягом 2-4 днів при 28 "С. Приблизно 0,8 х 109 Адгорасіегішт суспендують у середовищах для інфікування І 5, доповнених 100 мкМ Ав (Медгойо еї аїЇ., вище). Бактерії попередньо індукують у цьому середовищі протягом 30-60 хвилин.

00184) Незрілі зародки з придатного генотипу вирізають з 8 - 12 денних початків у рідке середовище для інфікування / 555-100 мкМ Аб5. Зародки промивають один раз свіжим середовищем для інфікування. Потім додають розчин Адгобасіегішт і зародки перемішують на вортексі протягом 30 секунд і дозволяють осісти з бактеріями протягом 5 хвилин. Зародки потім переносять стороною щитка вгору на середовище І 5Аз і культивують у темряві протягом двох- трьох днів. Після цього, від 20 до 25 зародків на чашку Петрі переносять у середовище І 5Ос, доповнене цефотаксимом (250 мг/л) і нітратом срібла (1,6 мг/л) і культивують у темряві при 28 С протягом 10 днів. 00185) Незрілі зародки, що продукують ембріогенний калюс, переносять на середовище

Ї5О1МО. 55. Культури піддають добору на цьому середовищі протягом близько б тижнів з етапом пересіву через приблизно З тижні. Калюси, які вижили, переносять на середовище Кеод1, доповнене манозою. Після культивування при світлі (режим 16 годин світла / 8 годин темряви) зелені тканини переносять на середовище Кед2 без регуляторів росту і інкубують протягом приблизно 1-2 тижнів. Паростки переносять в ящики БА-7 Мадепіа (Мадепіа Согр, Чикаго,

Іллінойс), які містять середовище Кед3, і вирощують при світлі. Через приблизно 2-3 тижні рослини досліджують на присутність гена раї і кодуючої послідовності тосгу!Ва-ТМ33.

Позитивні за результатами ПЦР аналізу рослини переносять у теплицю і досліджують на стійкість щонайменше до європейського метелика кукурудзяного.

Трансформація цукрового очерету

І00186| Вектор для трансформації рослини (72581), який містить дві касети експресії, конструювали для введення кодуючої послідовності тосгу! Ва-ТМ33 у цукровий очерет. Перша касета експресії містить промотор ОБіЗ61 маїсу (РСТ/ОЗ10/37683), функціонально зв'язаний з кодуючою послідовністю ТМ33, додатково функціонально зв'язаною з 3' кінцевою послідовністю термінації транскрипції і поліаденілювання ШБіЗзб61 маїсу (РСТ/О510/37683), позначеною як ріитибріЗ61-3:тосту! Ва-"ТМ33127тИиБіЗз61. Друга касета експресії містить промотор убіквітину маїсу (2тИибіїпО (Спгієтепзеп еї а. 1992 РМВ 18: 675), функціонально зв'язаний з кодуючою послідовністю рті, додатково функціонально зв'язаною з 3' кінцевою послідовністю термінації транскрипції і поліаденілювання нопалін-синтази (по5). Кодуюча послідовність рті кодує фосфоманоза-ізомеразу (РМІ), яка дозволяє трансгенному цукровому очерету утилізувати

Зо манозу і функціонує як селективний маркер для трансформації. Вектор 72581 був трансформований у цукровий очерет із застосуванням Адгобасіегіит-трансформації. Трансгенні рослини цукрового очерету досліджували щодо новонародженої очеретяної вогнівки, як описано вище.

Приклад 9. Інсектицидна активність трансгенних рослин маїсу і цукрового очерету

І00187| Відбирали зразки рослин по мірі їхнього пересаджування із ящиків (зА-7 Мадепіа у грунт. Добір зразків полягав у відрізанні двох невеликих шматків листка (приблизно 2-4 см у довжину) і розміщенні кожного в невелику чашку Петрі або багатолункові планшети.

Негативними контролями були або трансгенні рослини, які являлися ПЦР-негативними щодо гена тосгу!Ва-ТМ33 із того ж експерименту, або з нетрансгенних рослин (розміру, подібного з випробуваними рослинами), які вирощували в теплиці або фітотроні. 00188) Зразки листя від кожної рослини заразили придатною цільовою комахою-шкідником шляхом розміщення приблизно 10 личинок першого віку на кожен шматочок листка. Чашки

Петрі або багатолункові планшети потім щільно закрили. (00189) Через приблизно 3-4 дні після зараження збирали дані. Відсоток смертності личинок розраховували разом з візуальною інтенсивністю ушкодження листка. Порушення харчування оцінювали як високе, помірне, низьке або було відсутнє, і присвоювали чисельне значення 3, 2, 1 або 0 відповідно. У таблицях нижче "-" указує на те, що смертність була » 80 95 і що ушкодження листка було 0-1. 00190) Результати, показані в Таблиці 7, указують на те, що трансгенні рослини маїсу, які містять ген тоТМ33 і експресують мутантний білок есСгу!Ва-Т2А:150К11895, є інсексицидними щонайменше до європейського метелика кукурудзяного. Хоча обидва конструкти давали трансгенні події, які були дуже активними щодо щонайменше ЕСВ, як правило, трансгенні рослини з промотором 72тИрі, управляючим експресією кодуючої послідовності ТМ33, давали більш високі рівні білка еСгу!Ва, аніж трансгенні рослини, які містять промотор МТ. Концентрація білка еСгуіїВа знаходилася в діапазоні від 460 до 681 мкг/мг розчинного білка для конструкта 18319 і від 509 до 2984 мкг/мг розчинного білка для конструкта 18320.

Таблиця 7

Активність трансгенного маїсу, який експресує білки еСгу1їВа

Й Активність Концентрація есту! Ва (мкг/мг

Конструкт Подія маїсу ЕСВ розчинного білка) 18319 1839 2818 2984 78320 1625 1010 00191) Результати, показані в Таблиці 8, указують на те, що трансгенні рослини цукрового очерету, які експресують мутантний білок еСту!Ва-Т2А:У150К:11895, є інсектицидними стосовно очеретяної вогнівки.

Таблиця 8

Активність трансгенного цукрового очерету, який експресує еСтгуїВа і Мірз 72581-4А 72581-2А 72581-ЗА 72581-4А 72581-БА ниж (Контроль./-/-/:/ (| - ККв/

Приклад 10. Структура білка Сту1Ва.

І00192| Таблиця 9 показує взаємовідношення між трьома доменами СгутАр і СтуіВа з їх відповідними варіабельними ділянками і консервативними блоками. Амінокислоти, які містяться в кожному домені, консервативному блоці і варіабельній ділянці, показані для обох білків.

Таблиця 9

Порівняння структури СтутАб і Сту1Ва.

СтутАЬ СтуїВа

ДОМЕН ДІЛЯНКА (Фігура 2) ЗЕОІЮ МО: 2 нин п ТУ ПО ПО М До 393-152 48-171 153-182 172-201 183-202 202-221 203-254 222-270

11111111 255269,.777 | 77271288. 11111111 |Протоссин///// | 611-155 | 6359-1228. .-:/К/ЩЗГ 00193) Варто розуміти, що приклади і варіанти здійснення, описані в даному документі, представлені лише з ілюстративними цілями, і що різні модифікації або зміни в їхньому висвітленні можуть бути запропоновані фахівцям у даній галузі техніки, і що вони включені в сутність і галузь дії даної заявки й обсяг прикладеної формули винаходу.

00194) Усі публікації і патентні заявки, згадані в даному описі, являються такими, які вказують на рівень кваліфікації фахівців у даній галузі техніки, до якої відноситься даний винахід.

Усі публікації і патентні заявки включені в даний документ посиланням у тому ступені, що передбачається, якби кожна окрема публікація або патентна заявка була зокрема й окремо зазначена як включена за допомогою посилання.

перелік послудевностей «17» Зупчепса рРакбістввсїіопа ло

Сас. тап

Спеп, Чеппо й.

Сотгоівіе; бпадей б, «Т20» інсектицидні біле -30оз тевБааЗМОВот «тла віИваз, на «-1415 2035-10-99 «ТЕБВ 44 «17595 БаревсІп уєтквісп 3.5 «210» 1 «її ЗяАТ «1й» ДНК «2135 Вастіїов сникітетїєв8іЗ «еВ» «гі мівс Євакика киева СР). (сет «же» Нативна познпорозмірна кодуюча полліпсовніств сеуїна «40» 4

ЕС Вс сав псацсавлав КЧачайосав ассабаався сьусасочна косвтсеенроєя аа свавзкачатс вБаствсосвуа Зесьсзваве Зедаввазсї саБакасаєс счводулаво авіацсзвкс савосбсагсяу саусаксавзся здссаваєза збаціазсво вас 180 акастачуєсч сгагтчассаЯє ассцттсусї удасайвстає сталева спаде

А чегччхЗзак СасадсссеЗ сапсачачає сеокзостава се осссаця зсасбатсува 305 сагсскасаа аксавсазях авсазвава" десапчавса судсвсвизи сспямтвожа збо че садчач вакгсстосвач азспсаусає седоспесмеУз паца бецесь зчапанаито «90 чвІяаасоцсаяз зазпазувзац бесгетесаї асссевсяха кБаздемисеча яп гезї. 41455 сппсоаасоасца спесоцсвкее сдевассада аассапомав сБобесвеуаво ово,

чехсавосоя сСайосссеася пса Збпачасвоп севесекох пачдопацоЯява ща підазстуа сагсосоааз авггсаасає састахдаус десзачеуча асодатуасна во зассасссся асозугасчс зЧазсаатах анбасвозсс сапахазьлик паоаааздаса тай заасчессспа стадами чсасадссав суссчсачач акссавосясє хачадравса

Іа засстачтврвр саставсссс заоссазсзвс зсісоасассх врссавіава сасанукосх 840 ладксваска задавався Басозасяса зстозадсав садцадеаав вабдопаває зло авсплактчч зказЕаакяа стпесасстссп сбпссітсеса садаадстоз спесбатесоа зво аасосесавкот гасісавсьс Тссауазсаз сстаспактст стапдосушокос агпаспаєсоо 580 авісаасаста Зодсвсовучас сассцасцЗ Зпосзсогссв сісааксссд сесвахацав 16859

Фдіссезаєсаз аБасстсоваає дсасаазасс апсаавтасть статівассс боатаасарта 1148 судстсасас сісдацасчє гсасвзучаєсє ззатсвьаео саецдоауєуст Ессабозчва 1298 акстасскка авсстастсвя соус аїссос астоврувосї буваєте увс саяасостсад 1760 І засагкжсся арацазосас стстазссве вуїсаассєо асдачеосвос баса ї320 боаазачаїє сачлазстча аїгассяста пдадсавсго пасопвссава пада хуст 1380 ївсзаксзса захстассгев сатазосака зоохасвах псададеоаве морси

Утас сабусроудо сосассочсад Косачаттоак асчавгасса ТЕ ассгвна газвавсате 158 саваїсссза гбЧппозавацо асссчаастс сстсвачага ссапозссч Сачачаасоа ї55О счабссасіч дісчадаваЕ сесссцвазта зсдаавізстя дрФазссач о ассувовада їпЕо суваскаксса зодоассовсб васасвнлаза батсстзивч пзовссюясем поастссвЗоу чтазевьсмв агстетуя апсалатода заіагіастд аазіза!:ї іст сцтасзазча всачезсача сзаисстааза сасячанаве бозсечаєся переве 1595 васассстссЕд сЕсЕбасаса загтсавазі всазтлєчЧав совесасост васала ї555 позаасдзуч зальотасаї вцдасавввкс здавав сс скастассає авсоібсцах ї525 дсзчавсасе вістабавва вусасвзазаа зоссувавайсст ссстіспестас гватассває тТ588. ссадовацає сдазвасасча сссЗасадас саїсасєвося аосвачтаєс свзаєстсаако оа чезчсавссвк саоввеззавс стастсозас чаааадачає авобвестсто дзазвасцава гій кабпсдазває засісацчрая їЧаввдадат всасіссСав аиссаваєти сесасссаєо 2150 ааізазсяає сасастссав всстасіває уачсватося арсосасвіш себсоваіщфає 2220 савкстлаає авсозсачея соцЗезоавчац азасастассосв бссадцансй йаабзчася а 2250 пеЕсавназяда агкасцпсає вствсопча» астттгааоо вогаггагсес деслуввигта пед 2350 бассазавав Запачавасо дчаассвова Зссграхтаєьє добассзаєє зачазчовсях 2405 вссузадатеа дксвазассх адасдвтамає бтчавксЯцї зваврослва воведавоса

АБО

Енсзавзссс сазссвссаа чссестакзчу ссусокесет ссзазазчепо пагсзавезо 252 хасучачавно суплвсстатиц сасвосвсає сссозватучве впесстаасосю аск сасазчззаца чЧачааанзасчя сасасаєтзає госсаксаєь ссхсеесача базсодвовв ва чазабосасає асттдсаєое девсстазиас пече яу, сасссвацаяє Савзасцєсад тоб сезодссаба савуастаза давіссоува зх гдазу адоваєссіі «і бедювава р)

Февскзссто ссасзлацас лосвузойае вазон бсевасцйст вазастасай сит ра їсбадзавсаа васчацбасе сасаздаписв азавзсвавасоя кащеєшьк акесокаца петсегвівіч встазаїтаєсв адсязаєвосг засассуоаса совоспласас Засвосасавя, -вао сшцастосаєт чдвасподзса засу»нисьс бсадзатває стассагостх «За обеават

З0по чЧесочввавиь ссчааслаєт ачазоугсас апозисаєся сватсвссесо аквсавооєу зап50 ачалесуєтст ставазакяЗ часі Езах загззнесяаз сао ачав. как ававаа 3120 свсдкадаєа басавсачач бсвесассяе сстеасовиУ севссссазча абоаззавосєв 3180 чавосассас аацєвухосч сесстасссо ЧУ ссх асесптосово песен 240

Бтасззачаєд часазосача задстулсотз асзаєссацо сзвахгсозсауав сватасавово зЗзах пзастаазатє сгтяваввос3 буавсазчач чавобутасс свасозаває азсавасех 3350 засуаєсаса стідсвосзссяа адозгасазсї ззакососау збосасовав сосссено 3420 дссздатако адчдасаєсвсяа тсеайтсаас астасацтає сечссавЕсв сзвасесдаст зав гацсцозалаас заасатаєвс адЧчасстваавн адвсасаато асійсовата сзвсачадас зач стасоагрсаасс віссвстзах зссазосуч сахсзсазсав аазвакоуаче веасбессся

БОС чвяаовуаєнвосвуївсппаї савзатєтоца Язаасудзай уаайзавсав тобававноє зба чедавассвс состсзиідза зчаахат

З

«10» а «2115 1928 «Ма» СЕВЖ 1» Васії1їч8в рдкЕхлпахвиавЕВ ве и

Межб тпг бек дви вх був Ави бій сАвВ Су ЇЇєе 318 АВ Ача Узі овеє 1 З 12 15

Азті нів яак Аа бів Меб двр Бей цей Рей вводів Ак тов біз ву

2 23 З бек цею Сув ліс біз біц сіу дай АЕо 118 дДвроБро рае Уаї дак діа 3 485 45 теж ОРик оМаі бій тТвЕОСсЛУу Ще Ап опіе дів бау Вк гТе Тер осб)3у Ууді за 5 бо їч Фу с таї ро Рпе Аів сіїу біл цей Аїа Зек йде Тук бек Бйє Пем й ту 75 ва

Маї біу зл о їви тТуо бхо дту б1у Аку дев бій трробам ті рів Цей 85 з0 5

Зі пів уа1ї біз я3й їен (Ме ддп о бій сі їЗе Таб для Ада дія Ах 100 ї05 Уа

Ав отв: Віз Гео Ада Ага ей обізп О1у їз 03у Авробеї РБе Акро від

З У ху ; : ч 115 159 їз тТух біп бій бес цем сій йвр о Тго без бій Двп йка Азр о Азроліа Аг 130 135 ї4о

Тпт о йка бек Маї Сев о бук тв біп Тут їіе Аза їем бів їси Аве Бе не 156 1:55 аб їжи взп віз Мер обхб без Рое ді 18 Ас два бій Біб ах во пед 155 170 175 пейпо Ме Уаї ТУує Ала іп йїа АТ дапогГец 5 Її без Гео рес Аг 155 ер Аїа пех без вБпе о сьу Шех Біл о впе біу ес отТБжх Вей осів сб ге 135 ой 205

Сіп о вйжа Тук Тук БЕ дра бтп ба1ї 510 дує ТЕ оАсу дер тує щехк вер

М 215 га

Тух Суз оУаї сі оТур ТУух Ап ох пім Пез Авпобеї Її ЕФ бІу ТПЕ й 230 й па вза ах о АхМа ес ТЕКроуаї Ах Тук дян сів вКе Ат3 вка Авроуги тк 24х свй 5

Ма о сіу чаї пев дер це Уві Віа Цей Ба его пек Тук дер бу вхо р 255 о

Твж Тук Бжо Т1і4 Аве Твгобек ВІВ бій Бей ТИ» Агу біо я Тух ТЙт

У 280 жу

Аз Вів Те Сіу діа Тахо біу Хні Азп оМеє Дія бе Ме Аза ТрОо тТух гу 235 395

А5подзп сАви віз Рко ЗзЕЖ Ре Зех діа тіє сх віз М1іа Віз те Ах 305 315 35 358 бек о бто йїя ев бем йвроббе пем фа цій Шев бат їїе Впє ер Аза зг5 ач 15

Зеї бесоАтЗ Тхю о бвх ви ТПї ВЖК Ну» Ме ТНк ту тірвовло шу КА

АТУ зах 50 тТвт о Ії1е бій бек дсе Рго ІТе біу бБіу біш рей АБ оТву бет Тк бів 155 35 пух

БЗіу аїа Тв оави Тех Беж її1е Вей Рго суді Твг Бе вагу вне Дій бе з7о та 380 дха айзр Ме! ТуХ Вго ті бій бет Тут діа сту Маї рей рес Тхо б1у 385 з8о 395 400

Гіе Тук їз сій Рез лів Мі о с1іу Уві вхо ТК УдІ де оРлЄ дви Ре 105 ЗО 215

ТВгоАвй Бо Зіб дви 1138 в АБвВ о АкУ БіУу тв Ала дв тух бах бут 425 125 а

Вхю ТуУухк Січ бет Без бЗажЖж ем бів Бей пу йвробек бім тва: бамо гей 455 440 ч45 вто Его біл; отих ЖлЛЕюЕ Бій Ака бо Аве Тут бій бет Тут ех нія АгО ак 5 ве пам оЗах НАВ їІ8о51у ІЗЛє Ті во сів бЗеє Аку Майї дпа Рко чаї 65 7 478 482 тує Вавтї тот нів Ашу вес Ала дер оАгу Так о Аво о тТБк о Тзе слу Ба

4855 435 155

Аа ойкУ тів ТК бій ї1е Бко мекв Уаї Бувсвоа пат бій їси Бк сій ге в) паз та що 53 БІ: біу жит тр уві Маї дк о б3ду Ехо Піу Браео лрс о біу Сім йвробіа ем

ЗА ЗХ пи вка Вго сих два тт Зі сту рве біу Бк хів вх Уаї ТЕ ЧУайї ВВЕ ває 555 Зо лу свко ем ТНК сій Аго Туїх АкЗ Іф с1у ББа Ару Тух та Зв їх за5 55 Бо БО

Уві дво вче др Рпа Ре уа1ї1 бе йга бі БіУу ТвЕ Так Уаї Ази лет

Зх УТ Вт бінбвжу Рае Тей о АтЯ таї Меї Авлпобек біу вве шій беш був Тук У

ВО 585 85

Ави впе Мах оАху ху Вів Вле тки ТВж о біт Бре Тих Ве тн ст рю 5835 БИ бО5

Сіп ВвБроїїе їів Ару Тйг о Зеб тїе бій біу їва бе ЗІіу АБ СКУ Яд

З У У ; 1 5 625

Маї Тут пїе дврозуз Т1е бій тів Т1Є Бо Уві Тахо й1іа ТБ рве осі

БЕ Б3О 55 е8Ю їв сто тег пзрорей шле Ага Аївосіпсооій віа Мах дя Ат жі БФ ва І ВО бах

Свт одвт о тдк Дело Рго Дга Ако пер дух Тахо дя оМаі Твт Авпотут Надя ако 55 ву 11їє Азросбіл Мах бек Ави пец чаї АТа Сувій бжтє аву обі СВО Су ть во 285 їем Ав БМ пу Ася бід їм Бей бів цув очах Вуз їУКк вла був лето

БО ба 70 цен о Жек Авробіза вхо Авпоцемв о Пеб біп АзроБло Аза Бпе ТаКобек їіе тов 716 пе та

Авп обу сій ко АВ оОвНе 13е Чех Тмж два бів сїп Зеройва ББе тп

ТІВ т) 35

Яек хтів Вів за піп беж біта нів Бі Тр оТгр о б1у Всу пів де Ті тар ТА5 ех ук ТТе о оха бли о1у Аза Авооуві Бе був БІ) АвпотТук Уаї срж де

Тк т а обл о1у Аа Авроуві Бе Туз и оАвпотук Уаї ЛІ з тЕВ Бо т55

Ргз Біу Бе рве Аяп Бій сув стук РЕ ТВт ТК оїеи тук ств пу їїє 770 Тт5 7859 сім бій дек сій пл огув Аза о тТук Тв о АКЯ Тук о біп без Аку сту ТУк

Тв5 та) та5 по ї1е біш азродех піп Аве бе» бій їїе тую бе іє Деу Тут Ав Аї зо5 з1іб 35

Пуз Ніз бі ТАЄ Пез Аво о МаїоБто зу Тис обі Бет Бей оТЕробне: пенх ли 25 зо

Зек баї сіл сек РЕО ї1іе Б)Зіу се Пуз С1у Бі БЖ Авп о Ай СувоАіє 85 вай 545

Ехо Ні5 Бпе Хв Ткр Аво Рго АБр обем Ар оСув бет був Ак Ав бу 850 855 Бо йт5 муз Суз Від Кіз Мівз бек піз Вів Бие Зв цеб йзр о Ті Авус Маї я СВ ат по зіу був Тахо дев за Віз Зі дя) зе блу Хві Ттв зай Уа пиє Хув вх зо ще їїв о мзув Тк в си Сім Ні Атїа Ахолопез бІ1у Аза ей сбім пов її

З Зб и з; аяїй пу вес пес Бей лу вія Але пжЕа бет вту хаії уз Ара Ах 315 зга вих

Ста був ку тТІр о Ася ВБромув АКщ сію Був Бей б1п пен осів ТЕ Був

З8 935 а ді Ууаї Тух ТреоБів Аїа пуз біс Аза узі дзр АТ їх ве маї Авр

250 55 зей зех піп стух Аїр Ат пйечз сої йі8а Ар оТнк Ап Ії ші Ме т11е нів за 70 ЗУ діа Віа Авробув цей МУ ів дта сів Ата біз о АЗа тує ов» Бек з

ЗИ ч85 ЗИ

Геча Бго Чаї Ті Всз Сіу УВІ Авло вха бо зл пле Ши бом їж Са и їо00о 1905 сіу Нв Їїе їла тТВу Віа лів бек без Тук АвроАїія дку дви Уві 1010 015 1020 чаї Був деп бі» Ав Ра Ави о АзпоБ1у зо тп був о Тур Авпоуві 1025 ї0зо5 1735

Кгуг біу нів Маїс Авр Уві ЗЧіб біг Бех НІВ о КкаЗ АБО Бей АБВ ОС) оо 1545 12559

Узі Ії Зго сіб Тер обіш Ала бі Уггі Бек 1 Аза Мах Акту Ма 1055 їсєо пу сСув Ртє обху су біу Тк тів бер дта Мі тако йта тує ма 1070 175 1055

Бі тжт пу БТ У Сув сві Тих кі Ніз зн сїіе зла Ав дав 185 чо по тео Авро сій Те: був Впе був о сйев Агу БУМ сін ша біз Ма оту 103 11955 11 то Тих Демо їпг обіу ХЕ Сук о Аво о двю о Тук тих Акта Ні оба о бДу 1115 1155 1155 тн Аза сту Суб вія Авровід був Авап овес Ак Авй Ата обіу тук і1ї53а 1135 КІЯВ іо до Аа Тух 5) Заї др тн тв доа бет Мазда отуко мул ї155 1159 1155 вхо ТЕ ту бів я см ту тут Тс Ар оуаії ву вхо Аг дев 1159 Т155 НЕК

Мі Сує сіл; Тук йзр о дта оку тую уді дап тую Ржа бто Мі его 1175 ті5О ТІ855

Аїа о 51у Жух МАХ таж був бій бер БІ: Те Бра Рхю бім Тв двр. 190 1195 жа

Тих Мак отжроїзе Біл тіесзми об отв 01о бі Буш обме гів і 1205 ІЛ) 1215

Аеробеє уаї сло Бей іо їв), Мвеобії» ЗУ 2270 їхІ5 саїо» З «8118 1298 «ВР ОХНУх «ті» Штучна послидовнУуєть «вих «ДО»? Мутований повиорлвмівний СгУїва «Ех «в» МІВ КЕАЛІНЕ ай й» ДІ501..1155 «и о Меж, Ж, Ж, В, Т, їй, В, М. З» В, 5 ожх В. «0 3 ме Твсобаех дп оАТЯ пуб Ав сім лбеп біо хів ТЗ дей вів уві дет 1 і) 18 їх

Авп нів ето Аза ша мех Авюб Ппеш рей Бо Азр Дія вка тів и Ар 75 а цяж цей су хе Аза сі су Аве Аа ті о дЕВ рій ве Уві с Зет Ага а ау

Бек Так мах ЗІіп фах ЗіУу сте Азп ї1е 8ів Сіу Абу тіє Вемошум Чай що 55 є

Іа біт УуУаї Рто РпЄ Аза сІіу с) Сем о АТа ет Кпєс о тут ех РА пед бух 79 ТУ ва чат бір сів лез тТкробко Аку о сіу АкУ АЕрОбІіп Ттробів ТМе вве бе 85 й З5.

Зіцд вів Маї бій обіп Пе їтє Взий бій біт бхе Тв ім дей лів АТЯ

159 йо 1хО

АвпотВк Аїз йею Аїз дю ей бій БіУ рез З1іУ Ворошек Бо дл Аза

МїЗ 2 125 тТух бій о біпо дек Гем оз Авротгробе) бі; деп о Ако АвроАвр о Аїя Ах 130 135 145

Твтх Ага бек уаї реч дай тах пав оту І116 АТа сво РИ Мез Аврорно 145 То ТУ; їв їни авп о АіЯ Меб Ву пей РЕ Ата тів Аг Авпобій бів МЕі вто рей

ІБ т 175 їзи Меєсє уві Тут Аза сів А1те Афіо о Аво Бе Нв Ту Бей Бей ге) дка щ39 385 130 вАБроАТа пек їм Рае 5Ру Зек сій ре осіу гей тк оВекх бів о бьд мує 155 255 То сіп Ага Тук Тух бій Асз біп оуаі бій дку Тих Вку дер о Тух бек Ар 210 ті 28о тук був тві бій Теротуї два тру біУу ви Ав Зетг Без Аг осі ТЕ шк 230 25 240

Ази діа Бін бек Тк Уві Яку Тук Азп сію ЕБе йку ха аАвр їм тах 245 25О 255

Без біу жі Пе) Аву Гео Уа оВів Тер Ре Рто бат тує Авр о Тпт Ата 250 255 27 тнрЕотух Рро і12 Взпотах дек Аза бід о ішвм Чт вка бів Майї срує ТЦ тт зна Яве дав ліз Т1е біу АТа тпг об1іу Уві Аво Мес Дів бе Мет йзпотТКвоОТук 230 235 о

Авпойяп Ази вла хо бат пе сбЗежт Аза сіє ЗУ ліз с АМа йіа Те Ата 305 Зхо Зо зай

Зек рхоз Нія цей Бей о Аврорке рей бій бій леза ТЯ тів Бпе бек Вів з2У 330 33 ек вшех вхо Ткробед Аа Тис Аху нів Мек тк чує Ттр о АкЯа слу Ні 340 ах 3539 вк о гзе Бій Бех дк рес ї168 сіб п3у пі їбй дапотНуж нат тах мів 355 Зх зб сту діа тк о азп Тех бек о І1е Азп»орко Ча1! Тв ой Ак3 ве овіа Бетг зо 373 зно

Ата Авромаї Тук дич Тр осі бес Тує Аха іу УЗ рей Тец Ткю бу з зно зЗче 40

Ті тує пеш 510 Бгто її нів бі Ма) Вко тпк о уві Ак Бра Авт. Ре гоп 419 ау

ТВЕ Ап Вк біп одйзи Ї1е бер Ав» одтс Сі ТВ вів оАви туг Зап бій 429 425 855

Рхс о Тук бій Бех овто у ев біпобей Був оАвровеж фа лек оби вені 435 440 45 ко Ркгеа бі Тк о твв о С1з Акту РІО Ап туго біз бЗет Тук ЗБК нів дк ях 55 ва ме» Зек нів Ті Сру Іїє т1є бевкобів бет Вк Уві дез Уаї Бк Уді 455 479 АВ 14432

Туш Весу Тко тв онхо Ака бек Аіа Ввр Ажо Тйх Аза ТВ ї1е б1у Бо зх 450 455

Азп Ак І1Те Тих бід о х1е во Мет Уаї бує Віа пеЕ Фів мі Бесбллл по Зо 51 сіу Тйс Тих Узі Уві все Сім Бто Зі Ре тп Сім піу Акро1 іє Ге

З15 520 за

Акчойку Тбнх ДвпоТьк бту СіУу Бе йіу Бго Хі Ас Маї тиж чаї дв 3 35 З) сіу ро ехо тв сів да Ту Ата тів о бСіу вра вх ТУК Аа веж ТЕ 545 50 З зей тУаї Авр рве АвроРне РБе Уаї пек Ах СІМ 51Уу ХВк жпх о Уах Авті Авп за 579 575 пе Ажо Ріє Її2ги дкЗ3 Тео Мет? Двє бах бі двройіз їй Кув Тук СТУ

ЗВО 55 БО

Еко ря Уві ліз ду Аза Рв о тТНЕ Тих бо вна тр овве твкобЗап тів

Ба ооо БОБ сіз вар о їзіє тіє Ак Тит Жек Іїе 51іп о біу дез Бесг 51у йвпобуУу ОД чо щі ва

Уаї бук тів бер пу Хі СІ Із т5е ВЕО Май тТБЕ ДІВ ТБ нє СТИ 28 235 535 бо

Кіа бій Ту двроГПева біб Арго Аїа сій бій Аіз Ма) Авпо Віа Пец, вне 645 Ехо ЗВ такодяк ТВО дао Ро Ак ага гей Був Твх вВбое о уаї ТБ АЕр тую ів еВ «5 ва ії Авробів мМаї век Ав пДей Ме» Аха Св Пец Бак пз оси пе сСув 575 БО 5 лиш Авробій пув Аж св Тез Пед оз пув аж муз Тук Ада спух АКЯ но 695 ти їеі бек йзрв обі Ат Авпотїен ци бів дер оБсо Ав о Бле ТНт бек оті то5 ту Ма 72

Авпорув опіп РЕО Аве вне ї1єе Бех Тахо АвпопМа іп Чек Ай гне Тл тех Ася 125 сет ї1їє Ніяє бій сій бек сш пів о біу Троротєб обі Бек оби Аа се 7433 145 та

То о тїіє біт та бі дело дзю Уаї рйе їув бій Ав Жук Ма о тьк йео 75 75 те вка озіу так вна дяй Ота Суд було ве Лрж тує Бей ожух іп Був хе т 775 тво з-іу біс Бек БІа Сей» зу Аїя Ту Тк оВку тух б рес Ака сбіу тує тя 790 ее вад

Іїе біб Авр бет Сіп Вврогву схо і1їе стук Меп тів Ажу тТухк Азподія вп ато І

Туз нів бій Тк Те Аврора)! Ба СУ ТвЕ бій бе орех Чер обо гдеу ев) 525 че

ЗеЗЕ Оу бій Бех БЕо їЩ48 01 Ак Сук біу Б КРго Авподга був діє ази 859 вах

Его Пів оВне бів Тлю Ат Ехо Дю Зб дво сук овВек сСув АкЧ йеросту. в 855 два січ оьув був Аза мів Ві Бек нів Мія ере цес ле» Аядотів Аво уд! 865 87о ятУ 350 бІУу Сув ТйгоАзробец нів біб Азп о беи біу Маї Тго Уаї маї вме рУув вах а а тів о був тах бія біз о с1у Пів о АТ Ак о беч о сіу Ави рез бій це ттє що Зп з15 підою цу ко Бей лей о бЗау пі Аа лем беї впа УМХ (у Ата ла 515 520 525 са пуз пує Тер о Аку аБр Був о Ато бі був Бе сїя Ббви бій Тк опУв 833 3450

Ак уМаї Туд ТвЕ БІ ліз був бій Віа Маї Аве дід пей РНе Мат дер

За5 а50 55 збо

Зет Зі Ту дар дк Пе б1в Аза двротвс Авт о Гуе с1у Ме те нів зе ал 75 дів Аза Авросбуя Тей Мві Нлв дтя тів одке ба» Аза тує гео Зв ооо зви зва зас

Іва Вко Ха1ї ХІїв Рго пу Маї Авпо Азе бів за Вреобій піл ей бе з 1895 1095 ту ів жішж ті Так Аза ІТ Бак Гей туго Авр Аза Ахд Ави мах ї1ото 1015 1020

Уаї тво Авт біу АБворйе дБ о ввпозіу Шем о Тмю був стсроАвВа Уві

1028 ТО395 1535 пув бі нів Уві Ав Уві СІ» біп обвах Нід Бі ка очах А єм 19153 1045 п

Чаї хів ко бій Тер осбіч Аїа січ ба) Бек 21 о Айва Ма дк чаї 1055 1063 165

Су Бгто біу був б1іу Тук ї1їе без Аку Уаї тик Ага о ожЖує Був бід 1070 1075 т285

Стіу Жук сі піз КУ був а тлт Т1є Ні1в Ма її Бім Ап деп тов оо го

Тит ар о бі пез із Вре пу Ап Аг бій біш о 5ій бій Уаї Тух м 1105 1

Рко тТИх Азр отр обіу Те Сух одач Авротує ТЕ Аїв о Бі о СтТпопіу 115 1179 х12х

ТвВк діа біу пув Ліза Аза обі бук ДЕ бек Ах двпо Аза о бту Тух 1159 1135 1110 зі: Ав Аза тух біз ві Аве о Тлу тТвЕ ліз бак уві АБИ Жух ТУ 1:45 ТЕО 1155 ко тк о Тук бі сб1р біц Твго Туї Тв дво Уві Ато Ахо дер вп 115 1165 1178

Нів Сув шій Тує Аз Акта пТу Тупоуяі авт тую скгО оБкєб Ма ко

ІТ 18 1185

Аїа Біу Тук о Ма1ї тек Пма б3ім о пен фій Тух Бе пгтбе бій Так одар іх туту 1700

ТВкоуаї ств о І11їе сіло лів біу Бім Тве а буу Був о ве вхе маї

Тап5 1515 1215

Ази оБжетк уві бій пев Бе) пев Ме Бі Зі ха 1225 «йїійх а «вт» 544 «1» ДНК

«13» Штучна саслідсвність «ад кгаї» теУ-скуївВа кодУуюча лосліловність «ах 4 віІбзсаісва втадипзаааз суасзаечва зстчсаввоа стахаєодав тлакрососа во саватасатс сассяссаоа сусксобагх зазсавацс соб зає сао 125 азасатсчатс сасесЧчоїва сасассайся бсссавасаз зкатаасах вочсьдусаа ї8о агасізозст тасбоодуєючь яоссчеЕкове сцасезство сіааосттвса адек 240 І чдЕвуєксовахє кабсоассссса сдасадазчає садбсауава БЕБІ стача аоасававае

Зоо сваесесасбаа втсавасзаае авнсадааанає зсбвоцавтя сзассосвече пеуатсатаде

Зо честтазчаз вексетрсац адоссвесва сацесасстд яасвіказеу аздазасєсці, ят завзасдсав заасоувовац асоссеса ассснзьаса овосвовада аєбуєве 48 сіїтвакслсча асо Ех сусзаєьада яассзачавау сгсесвссаєє сабо

Чоесовадста спавстсаса сставтавіза ГсЗачасвс ссвсстесетЕ сеабеоеотав

По тетадасьта сабсасаєтав ааушсвасзо Бажтасдчато уєсазобзЗа аспсазвосада

БО чавртаєсссу ассайтсзо всазозята вазаспазнус пазайвапує садив 770 чакЧосусва четчедтасу Зтаїаатова Ебосубацаз вессаачсоке ачодвосавта зву чассвазсовд сбестакоссс зацесаїовс астсвсассе вессявеана гасу аб сачксвасаг здадлееста свсауасзсвг всбуцдачсаа свуаузсава сабодеваяої

Зо аєзавутась втаасавхав беасвсссксЯ ЕХеєсіцсса сапзузссудо уусптабесева

ЗБ асттссусаїєє гестсаавоюК сосбяасвсаз сттвсваккт прачсаскво аглассатеЗ зпкватасса здпсакасдвс скаскузсау чадевсасяя бебсхжавосесу чдосявеета

МОВО часачасуза абасстсавс бдсавкуЗзадех зссадкаєту сідбєвавис Зпгдасасва 1140 пеазкосчсаь сісзвцзасує ссасзосайе давзусаєвов садуачкась собарзачуя 1790 асЕЕзссіка азссварсса сазцЕссся аседсуваяк беватмхс жало 1265 засасткста абацачадлас саствастат зоїтсавсоіс агочазтсассе счапстісава 1520 хааавзсаї ху саззвадскча зстапсапсова заззсвасву васцасстваз тів аву хво сасадесасе чо тазссса бакгяаоусава зссетатааь ссазообчва сабасосчатяа 1545 тассобштьчаа посавсосач габазассаї зсзазоасов сСтіачастяад бсазазтсасе 155 пвавісссав садтадавуєс вкосавасье собсвалаєа псасьастоас славачвоса 1555 чдчацсевазка сеча сав всСтТкссоаача абосватсасто чечЗвЕсаач ассзатваци їЄжо чоаасбаєта ассзасевех: васосвазаа сзссасарад чассесасса сСипсктсваєсс 168502 ахлззакуста аєстеврстас авсасоєцаа здуубассастя Завзсазвоїс свзоаскогта 1740 пусасзаєтавз зсацеосзуа падеставаа басодалать ссззавЗась асп ваши запо асапстсїтїе сіІгрЕасзвса забосвадес асзакосчва сскпблсста адпосхвац ївоо зазазесздозу зазсзтатстах задаєваавкї дазасєтаєсс сявастасоце васстхсдва 1550 чсацавтстаєч азетаачави вада раса «гій» 5 «Мі» 647 «1» ВКТ «ЕІ13ж фтузна послідовне «ВРи» «803» теБ-сСтуїВа поксин «3002 5 мет Аїва Вот Аве АКУ Був Аби сію Ав Фі сіб 11 Веп о АМа ві Хийє 1 З 10 х5 доп омівз бас вів зп Мет вве охеш реп орРсо Ар оВіз Аго ха Змі Двр 29 25 За бек Тез Су їїе Аів бій 5іу дей деп оТ1в Авб Еко Ре Уві беж Аза 35 о а дек ТЕ Уа1ї 5зіп То: су Тіє Авпохіє дія біу Ага їле фви облу уд 50 55 іч рено 1у чаї ро Ре Аїа сту іп овеча дів бек Ра ту Бех Блю Бей о 75 20

Уа біт ім Без Тто Яко Аква Пі Аг дв» обтй Тер бій ті Вс бо» 85 20 5 іш нія маї 125 Зал Бей Ттіє Абе обі сій дае тих бо АБИ бій дКкИ 106 105 116

АвпотТих діа Бей Аїа Ах Пе» Бій Ту їв Сіу Авр овес Вре Акоа ліз 115 хо їх тук біп Зіп Зако їем бій Або Теробео; біз АБпоАхЯ АвроАвродіа Ат 130 135 т43 тну Ата Зек о Ууаї рей Тук ТНу шуб Тутс т11є Вів тей бо Тей Азвовве ії45 150 155 їао цей) Аби іа мес Без Мед Бе Вів КіЄє Вес демо сія ім ві бе отао 155 я) Мо рено Месг уаї тук вза бЗіп вла йАіа Ав' ме» Нзя Пец тей їбц цем Акч ї89 185 8

МХвровія Бек Тез Бе осіу чех бій вне біу Бей Тож Бек Бжб Тр їіїв 155 о вх сіп вса тук тує Зі Ас бій Уа бій дго ЖТНХх о Ака Авротух веж АБе

У 215 ту

Тух сСуз Уві біш о Тхр туї Ап о ТвЕ сту ївц о АвпоБет Без Ат лу тТаг

225 236 235 241 дае Ата Аза бе тур УВІ Ахо тухХ Азп о бій вне сАгУ Ако Ав Гео тп 225 25 ваз пен оту Маї рей звро рей ні АТа Ппей вка Рргз бак тує Ав тТвх дуф 250 255 РАК

ТК о тТух о Вхо 1316 Авпотих Зелм А18 о Сій Сем отйжх др бій Маї тує вих 280 рано

АвроАза пе БіУ діа їтвпЕ сіу Мах вки Ме Аса вес Мек дви тир отух 250 295 Фа вай Ап одЕз АТа бто бек пе о бЗеї Азїя Ї1їе біз ла дув Аї8 ТХє Ага 305 10 За 320

Зех Ро Нів іщщу ем Авробйє Бемосьй бій Ува вЕЖ 119 сБнНе бек ойз и з 335 35

Зах пек дхя Тк бЗет Або отас Акад Нє Мес Ту тує Тр овго бІУ ПІВ 4 325 355

ТБх хів бів Бех о дку Вез і) біу ЗУ біу без вва тп сбек Тк КІЗ 585 засо зв бЗіу вів Тйх Ав ТВ яв тів два вгОо Мві ТцЕ Бей Аж КН Дія бег а 375 Во вкз АзроУаї Тужх Ах Так біл о бет Тує Віа Сіу Уві пес бес Тор об19 385 395 355 0 їїе Тує печу щі ко тів яв о БіУу маі рЕо тв Уві дру БЮ олялй Не 305 що ді

Твк дви оВко біп одЕп хіє Беж Авр Ажеа су тиж діа Аввстух ех Би ї7а 425 43

Бгто Тух бій Бех оБго сСіу Бецш біб пев оїпув Дяр беж ба тек ові бе за Се зах хо рко Бра тк ТЬЕ обі; вка вго Аа тує Шіб Беж Тук Бек нов лКу 450 455 465 пед; Бек Пів їіз8 01у Тіє їїз поло біл обБеї Аа Уа Ав Уві Бо Уві 465 Я 475 зва

Тук Бех Ткр тик нів АК Бек Віз Азов оджЧ Тих дві тТВЕ ї1Є пі БЕ ще «7о пах

Ава дка їіїе Три Сів 316 Еко Ме ав о ьув АВ Зах бі іі» Бхо БТп зоп 503 5УЙ зі так тцт Уві Уві Ага б5іУ Бго б1іу Ре Тагобіу б1у Аву Це Бей 815 ЗО 75

Аха Ата тах Ав Ту Бі ту Бін оїу БУВ Ів Ах Уві ТпУ МАї Авб 530 235 зад сіу Бо Бен так о біп Дт Тує Аку їїе Сіу Бе хо Тук Аїда Бех ТЕ зла 5ЗИ Зх пам таї Авр Ре Авр рле Пе уві бек вка с01у ш3іу ТНК тн Ма1ї лАвлпо Ап

Заз Зо З

Бпе йхо Ре їм Аха ТПж Мет Ази баг Сі йвр обід Меч був Тут ПІУ зво зав В дЕБ. РНе чаї Акб вга Аїда ББе хи ТЕ Ето пе Тр РМЧе ТП сіб. тів

Зо 50 595 бій вер їі Ііе Аєд ТМНх Зех (Тео біп бі цес бет б1ж Авпобіу ба

С віх б мало тук 1 ляр Був жів сіб Пе тів Ро Маї Тала ТвЕ Ре Ти 625 ко 235 24

Кіа бій туг Авропем сіб дтІФ ба5 «їй» Б «1» 57 «Ма» рат 213» Шкуцна послідовність «йо хе» тез есСутуїва 150 мутанти

«ух «ай1» МІБС БЕАТОВЕ «вий (20.48 «чаша Хе овпу айзпо ас «РЕМ» шлріх МЕБС ЕЗАТИЗЕ «ййЕз Бі 50.. СУ «ой» Хе В, Б, Ж ок й. «зро «85іх МІС ЕХАТОВЕ «ейхи 5199)... 85) «ше Хав в 18Оеї, Фу З «Раб кегі» МІС КАТОК -28шУ ТІК. (159У «8835 Жаз ар 13355 ст К «00» б

Мис хава сеї АБп о Аку БУ АБ опій Авпобіа її ЇІ1і8 Азп діа Майї БЕК 1 В та 15 двп Нів бек Дів Сіп Меє Авроїєо Бей обто АвроАта Ага ІХе 51 дер о 25 30 бех цей був ТІ віз Біш обі АвбоАзпоїів Азробхуо рдесуваії ЗекоАїа за КУ 45 пей тТпжшж Уві Чіп Танго біу їТ1е йвпоїле вів біу дка ї1іо ібєц Бі Уаї зб З БО цез зі Узі Бе ББе АТв слу сіб іа Алв Чех вне ТУук БЖ ОББе Ота 7 75 ва баї сьу сти Бей отір Бк соАке сту йка Авросапо тр біб Т1е вп о дец

Зі Нішж Уаї біц біпап Сей їїв ав бів обі; пі тах ді дво Аза Ах

НК) 155 1715 два ТЕ Аїа бей Аза Ак Ге зі о зїу їгед 051 АвроБет Бех Ак Дія їх 1250 125 тТук сіп бра Вех Бей біс Авротжр обєм сти Ази о АкуУ Ар АвБ АХ Ака 189 135 ї20

ТЕьт дк Бек маї Пем Хаа так бій Тук Ї145 дл пе) ШУМ; пев Авровре 145 1559 155 іс

Гез Ав Аза Меї бу пед о рце віа її вк дей сів ст баї ге це тех І7ТО ї115 пе Я Меї уаї тук да бій вла від дер от нія Бей Хда С Сей Ажх ї50 155 1535 дя Атїа Зек Мей пе віу Хда бійш вка ос1у єп) тво ес фі іш Ії 195 оо 205 біт джтЯ Тут Тує 513 Ахсо біп ах біз дкУ ЖхВКоАко дер оту Бек АК

ЗІ еї5 ра ту осСув хах сімя тТтротуко Ави че Сіу їв Ав бек еб дку 51У тах

З 235 я 2439 деп оАїа Аза Бек Тут» ах Акс о Тук Вап обіп Риж Аг Ву Вероцез; ТОК 725 г ха іа бі Уаї Бен оАвроїео Ма! Аїа дез бе Бко бек Тук БзроїбЕ йха

Хай Ба ло

Тип Тує Его ї16 дви твж бек АТа зід о їа ТВ Дт сіб оУяЬ ТУЮ ЛвЕ тв 28о З

АвргоАтТа ї1е бі Аза тпх сіу Маії Вп Мех АТ бех Мек Ази оТтю тує 290 295 00 дяк АВ Аза о АТа бко мет Бе бБег Віа іє біш Аїз йіз Алла ге АКу 305 31 ЗИ 120

ЗекоБко Ні їм: їх Дер де Мем БГа Зіп Пей Тпт ті гве Зет Дія зи25 33 355 ет пет обке Ткр цех Ази Тпх о Аку Ніз Мей ТПс отут Ттрозуа ші Нв

За 345 35

Тис ї1183 бій бек Ак РКО 112 бі» зу біу рей Аве тах бек Тбх Бів

Зх 35 355 біу Від Тйх йап о ТВу бст ЇТ1є Два Бра Уаз Тож СГез йгУ Бпе Ада чех

Зо 7. зо

АхЯа Авооуаї Тук Ага ТЗ сів Бек тує Діва біу Уві ей їй! ТтробБІх 385 зо за о

І18.Тух Мен Ота Рка їІе Ні біу Ма1 Бгто Тк о мУаї до Ре Авпо ре 505 10 15

ТНК АЗИ ко соип Аза ї1і6 БЕ Авродку бі ТЕ Аза Аза тую бек СТВ 170 323 30

Бко Тк бі Бек Бго 5Ііу ем Біт Бей гує Ав оЗек бі вчх біс рей 435 чо 445 то вес Бі Тахо тнг біс Ако бго Аве тую бі бег Тук Бех Нів йхп 455 А ї50

Без бах НЕБО Ті бТіу тлє Бі Пей сіп ех Ако Уві вва Ма3з вхо Мах 465 ї7о Се 18

Тук Бех Ткр о ТЗзх нів вбку Зах діа Авродку ТЕ Аво Тк ої1є СІу гКЕо 485 ра 455

АВК о дхв 51 Тле сів Г1е ро Меї Уві Тез від баеї ба Гей ка п 50 595 ЗІЗ сіу Ту ТтвЕ бані с Ууаї дху б01у Бтвобйту жде Тахо бБіу слу Дав о т18 ГИ

ВІВ ско шЕЙ

Ат Ат тах деп ТК озту спіу по б1іу Вко ї16 Ага Уві Так обаї Аяп зЗ5 Я

Є1У Бр цей Тк бій вту Тук вт ї18 біу Ва дід Тує Лід бжх Бу а Б Ух пед бе! Вврогле дзроРре вра уві Ббет Аква ФУ С1уУу Тс тб о) Депо АБИ

ЗО ЗТ рве вхш бзе ти да ТИЖ Меб лев Бек Б1у Авродіна їжі Був тут Є

ЗВО зи НО

Дап о Ейпе Уаї Агу Ата АІвВ Рре Ту Таг о Бго Бблє ТаАх ке стих сли їге 385 БО по ій авр о (1е тіе Ака ТВх Бех 118 СТО Сіу Пе беїо51у Азпощу Щи 519 515 52 чаї тТук тів Авр рук (Хе сіл ІХМе тха Бо о таї тис віз Тнх рве ото 525 53 бо 5

Аза біц Тук йзр їв дів Да 45. хрісз 7 2112 ба «їй» ТЕТ хаіі»М Штучна послідовність «Ва» «жо ессміва-теАхІБ5оК «т

Ме Аза 5еу д5п Акт вуз Авп сі: бБпа осІВа Іїе Ії АБп оАід уаї век ї З КЕ» ТВ за вій бе АТа бір Мес дар о бец Бео ро Авр оАТа Ако Тіз бій, АБр 2й З з0

Беж ореш бев ТІВ Ат ти спіу ви вбла їіе ВБроБто тле Уаї ех ВІя

ІЗ 40 45

Белл тик ува Сіл о ТЗх біу їтїе азп з1є діа Сіу дга їіс їси пі Чі вк, гук аб їви ЗІу маї БЕ вра вів бБІ1у ій йецп Аза бЧековре ТУ Бей би Бей ї53а о 75 во

Уаї сіу біц фей літр о Его Акч Сіу Вго Ар обібз ТтробТц ІТе Ре Бей

За 5 55 січ ів Хаї сіб а4по без; 118 Аза мліє Ма 13є Тек обіш дЗпо Атїа Дж зо 105 хо

Авап отих Ата ії; Аївз да Бслпозіп шіу пем шіУу Азропеі: Впе Ако Аа 115 150 125

Тук біп бів бВех їео 5іс Вр тур ей б5ім Аво Ах двр аЗЮ Аа Аху 13 125 140 тТпЕ Ага бет Хві Ббеиш Був ТвуУ білотукю тіє Віз Бпеш За ред Авро вме 145 150 КЗ ї5О

Тем Ввп о Ака Мес вка Бе: Ре сів тзе Ату Ав бік ізо маї боб ів 165 175 175 цей мес ущді Тух о Аха віп Аза Аів Аве їз мія пеп о їеи ем о їфа вод 180 Т85 ЧО

АвроАТа Щек ем Рае Сіу Бек бі РЦе Сіу сем тах бБех осів бан Те 155 Р: ях стіп Аг бук Тук со Ажко ші УВІ Сім АрУу грйпЄє Аку дви оТуг Бе АБО 215 218 ви

ЧЕ Су Хаї ів С тТЕр о Тук АвпотВвЕ зіу Беу дв оЗек шви Акт с4 у тну 28 23 235 28

Зп. Атїа Аза Бех Ткр Чаї ко Тук Ав сів Рре Ак Яка Ввробемй те 248 256 25 цезч зіМ тай без дерев уві діа ем оба РкФолех Тук МБротнту ку йо Же я

Та тук о Вко І1Те Аві Тв о бек Аа піз їй так одту Ота Уаї тухо лім: 28 З

Аза о Ата 118 сіхсАТа ТнНЕ сту Маї Ав МеЄ Ага бех Мец лк о ТЕротук 230 255 502 дайповва Зп ва рХО Зех Р бек Віа слів ЗІ Аза АтасАїа ТТїе де

Зп5 зго ЗІ. ЗО бек Рко Міє Бем цез дао ЕВе ре) ть біб беа так Ті Ру пек від

ЗБ зо 335 дек бак дез ТгроЗяхт вп Ті одта нів Мес ТЬг отут Тер АКУ ЗТУу Ну за Зх5 злу

Тк о тіє сІп Бек оАко РЕо Ті 0ІіУу бі ОБУ Пе дяйп Се Зах тп Мі 355 зе) Бк сіє Аїя Таж Аве тік бек Тіз дви реж узі ТБЕ зем Вкд Бре Ата зеї

З ТУ Зап вка Авроуві Тут га ТБх ст) деж ТукоАїа бу таї без уєдо тво оку 385 зас зах асо

Ті тук тей Під вхо їїє Нів піу уві орто ти о уаї дк РН депо ре ї35 Я 15

Тих зни ого біп Аво їїє беу Дер Ат шіу Тк о Аіїа ВепоТук бек біл го 473 32

Рко тут божа век вхо бІіу Бей озій бешспцув АвроЗет Та тах сій ву 435 чо 45

Бто Ро бі Та ТВ бід бу жо Авір Тук Сл дек бує бак опав о йКФ 455 ях 459 їєма его Ніз їіє бБ1у 1Т6 Тіз ей бій Звж Ак Уаї Авиоуаї руб ув 155 ато 415 185

Тук Бех Ттрр ТНЕОНів дп ер Віа йзЗр дра Тйх дви ТВЕ 116 о 51іу ко

АВА 30 135

Авподро ІМе тиж бів тів Вк Меї уяї Вуз Ата Бек бі цем ре Був з0с Зах зі сСіу тв ТЕ хв Уа Ахо бІіу ВКо боту Ре Тв С1іу біу Авроїзє Те 515 520 25 дгсовкч ТнхоАвп о тп Б1іу с31у вва о5ІіУу Ро тіж АкЯ Уві Та очаї ДВ

За зі5 хо

Пту Бо Тед Тлж Зіз Аке Тут Вха Ії бі Ре дк4 Ту Аза бер ТНЕ

ЗАВ ай 5 56)

Чаї дер оБае ВвроБне Рпе бі Пет вто б1у с сі ТВх Хе уві Лв о дяй вва У ЗТ5

РМиз дхоа рпе їм Ак ТвЕ Мет дяб зе слу ВБрБоБІіМ Ім бує тую Бу

УВО ЗВ зо два оББе уах Аа Ака вія Бе тн отТрх вка ре те роз ТЕ біб Тїє аз вод 05

М АБ 118 і о дго тп Зетх Ті біб шу ем оЗатє біу вел обі ПА 519 515 Ге)

Мву хух Тхе Аво Був Ге бію т1їе т12сржо МБі тн АТа твх Рів ох 625 5 215 жа

Віа сій Тук Авр Гей оз1ій Ах 515 «вій» 8 «а» Ба? «12» РТ «213» Штучна пвосліповністе

ЕН

«гаЗ» ескуїрна-ТРАХЕБОКМІТАВ каСопм 8 мес віз 5аЕ Аве дЕч бує дяж бі» Ап обра Те Тіз дямовіВв Заї квх ї г то 15

АБи Ніув бек діа біл МеВ дво дей їей Біо В5род1З Авс їзе біс дар о рах Кві

Беж Ган остув 116 діа біз Бі Аа АЗп її АвроБжо Бає Узі щек ВЕз

Зо с Е

Бек Тк Уді біпотйих біу їІе Авп оті Віз Ш1Уу Ак ті Бецш сту Уві зи 5 2 їм ЗІіУ УВІ) Рро Ре вія Су біб бем Ага Зат спе Тут Беї рпє зи

Ба 75 їх во

УвМ пі бій цей Тго БЕЗ Ако сіу Ата Авробіп Тер бій Т12ао Ба Бей 85 3 Ву іл: пів хаї бій брп о Пви ї1е дап обі) бів Т1іе Тих бій Ава Аза Ага

Мао ТОБ зії

Аве тих діа їей Аза Ако тжо біпоСту рерспію Аве ер обБпе люд Ада 155 ї2О 15

ТтТужх Бій бій беж рей сій двр їх оцей біб оАво Або АвроАвр Азя Аг ї30 135 145

Тиж Акад вет ах беа Був Такосів Тукх Ї118 Ала Перо Бей дярорве 115 56 У БО пен два Віа Меб Рус Хей Бе Ата 18 Ага Ап обід біз маї вто тех 155 І! УТ їва Бек оЗаі Тух Ві бів вата світа дай о бейо Нів Сеип гемо оба бе Ата тва 185 ї196

АвроМів хек Ген Ре ОТІУу бек 30 БЕ блу по) Так обет бій біц 12 1535 2 5 біп йку тує Тук о Зіа ВкЗ біп облі біз всо твтовеу дв о тУкК бах АВр 218 215 й тух Сув чаї Зам Ткр о Тує ВваствЕ Зіу лей двп дет зей вра піу ле пе5 ЗО 233 ша

Ази АТа А1їа бек ТЕ: Уаї ВхротухХ Ана бір рт Ак АсЧ Авробаи ТБЕ 245 5 55

Тез опіу аї Бей ойвр Беца Уві Аїз сві рРеБе Бтє бек Тухг Авр тої Ага 255 т

Тс отут вхо Т15 йдяб тот бек Афз бій Се) тис джч стіп уві тТух сне 278 ВО НУ

Авр Аза тів Б1ІУ Аа тих су Ма1ї1 АвопоМеж А1Та дек Мей Авп ок тує за ах ЗО

АвпоАзпОдДЕпПодЛід Рко беж гбпе дек діа Т1є бій ліва дк Аха Те Аг зав З1о ЗУ Я

Бах ру нів Бей Хем Дер бпЕ їеьо сім ій же Те оті ББЕ пет дія 32 30 35 ес беж АгУу Ттробех йвпо тат Вхч Нувк Ме ХУВх Кух тт вка бБіу нів 349 45 50 твх Ії сів бек одку Бко її о біу Сбіу бху пев одяв Жбну бек сме іх 355 зви З

ЗВУ Аїва тис дев отвжх Бех тає деп Рост Тахо орес йка ББе бі пек

З 375 зо

Ах с Аввоуві Тук Ак ТБт сій бек Тукойіа біУу Маї Без Пец Ткр оту 385 9 385. 00 ті тух зва 14 бко ІТїє Нів біу мМаф Бо Тпє УА оАжхаш Ррє Авпо вве: во ати Слне тах овВва Рко Зіп два Тфє Беї АзроАхоа ІМ Ток Аза Ав Тухє Щек бій 42О ЗБ 230 вк тТУкК Біб Зет Бро сту гей опій пев о цуз Ап о Зег бій тп ій се; аз 440 4

Рка Бго бів Те Тс осів дко Ро вва о ТУЮ бін дет ту Бех Мів оту чо 4-5 дез їецовенк нах ге сту Я фе хе Беїт сло Зекобха Маї АвБп о го Уві. 425 ато 375 ВО

ТУух век ТЕр Таж БІ Ду бег Аїа Авр оба ТЕБЕ Ава Тпг оОїІє С1Уу ро 485 во 135 дат Ате Із Так бій х18 вро Мас уві Буд с Аїв Зег обі па Без піп 500 5аБ вій

Су Тк тве таї Чаї дже бІ1у Бро піу бле ЖИ бу с)у Дав її рей 515 ЗО БИЙ вс ака ТІ ДЕПОТНКОсСуУ біу ББа бі РКО Ії лкЕб У«ВотВжЖ Уаі дви за За ЗО біу Вко їн) Тато біп'аку Тух Аа їі піу Бе дко Тух дія Зеї ВЕ 5ав зва з55 збо т7а1ї двр вве Аза спе БМ Маї Бетк о АтаЯа щіу ау Ж бл Уаї Авро ово бе іо У

Блє Ака ве рем о дкЯ тв Мес о деп Зевс о біу Авробкнопет ЗУ тую озіу

ЗВО БВ чо

АвпоБайє Маї ха Ак А1В Шве тпе Так Бо їде пвх ре тебк опи літе 585 «ба Бо сів Азроїслє т12е вхо тлі Бек тіє їв біб цви ЗвкобіМ Ап Сі Сі

ТВ 515 ВІ чаї тук 16 дЕр Бук ті із 11е Ті тро уві тт Аіа тТвсовив ог 542 63 535 о діа Ст Туг Вар Беш бій дк

Бах «віх З «її бЕ7 «12» ЕТ квІіЗ» Щеучна послідовність «що» «Ша» естуїБа-тоадуУт5ОоКБіЯВУ «ОО З

Мех йіа бек двпоАКко Був деп СВ Ав біб Жіе 118 Ай Аїа уві пек 1 о 15 15 авпоНжхВ бег Аза 515 Меї двр рей рей РО Ар Азя Ага Їїе б1іпосляю то 85 за двж о бец був їЗе Аз) біу АвБодяеп І1Та о АвроБко Бе ву ває Аа п5 407 по

Зсх Тв Уві бів тах біу Тіїе дво т11е Аїа бі ку ті беи обім чаї

Зо 55 «0 цей йпіу уві Бго Впе та Б1іу 51ів веб АТа цеж рле тТух Бех рпе тех

ТО 5 що чаї олу їв твій Тгрокіо Ах Бі Ака4 одаросій ТЕБОЗІН ті ре тях 5 т ЗО бі нтїв о Уді лю бій цей їЛе Дяв щі біб тала ТБу бфа АВЗ Ах Ат 159 105 во

Ав оТвЕ Кіа Бей Аза Ажха пес обіп біу їжа зіУу Авробек Бпе Аг Аа 115 т2й 1755

ТУЖ бій біп беїй Бе с3з Авр о Тгр ей сій дво Агу АвродЕв вів Ахя 150 5 16

Три Аха Зех Уві Фей Буш Таж бій отУуюк Іф Аа Гео Сі пйезх Авробле 1415 ї55 ї35 це

Мер Ав ВТ Мет вто Без ВБе Аля тІ16 дту дев ота бі ай ро Бем 155 17 175 йеш оМмеї уаф стук Аза Фіз Аза АЩі« дл Брец Ні без бек бе Мел Ал 185 185 ї90 ввроАка пех опцей, ме блду бек соц ве Єву Геї)» ТИХ бетг дув, 51 та 135. 250 ох біп о Ах Тую тує Бій Акч піт таі сзз5 Аго сих Ахо Азробух вх Азр 210 215 Ей тТужЖ Чув о маї сій Тур тую дзпотТнЕ біу Гей вяробеє беш ово Фіу Ті гт25 230 235 235

Ави оАтіа діа Бек Тур У! Акту Тух ДЕ 01 Риє Деу пк о дяр без тлЕ в 750 255 їєчи зіу Мав цен Авроцеп Ма1ї Ара Пец Рпе рес Чеї Тук Аврост зго бо дБ ЧО

ТвЕотТух Вго тів АвпотТбЕ о бет Лів біпобви Твс Дкз Зіб о Уві тує тот

ШТ 8 295

Ази о Аїа її: бі Аза Тк бІіу Маї дев МОЄ Віа Шеї Мес ода ТЕротух 290 255 5399 вАвпоАза вно оАта ро бех еце о Зетї ДІла тів біль АТ бія ААУ ТІВ ко

Зп 310 315 Зо пет РКО нів рез сей АвроБряе Пец осай суб осей тТвЕ те оре пег олій зи з 55

Зех Зєешк дДкоа Ттробає ді ТАТ Ат нія Мес стих Тут тер Ама с пію снів 340 за5 з5О

Тих ТІ біп бе Аг Бго Ті бІу з1у Ту це; оАва ТЕ бек ор оніз й55 ЗБ 355 іх А1їа Тато АзпотіпЕ Бей оТівє Авя Бго Маї Тв сец вх вБпе діа лек зт 315 зо

Ак одвро уві Тух Аго ТВ щіл ек тує Аіа зу Чаї їж» ей ТтЕрооі1у 385 з8о 35 Ак хіе Тув пев сід Бте 115 Бі Ппіу Маї Вго ТБ Уа1ї ДЗ ВЦе Ав РЕ

У з р

ТЕ Ам о вро ЗІБ дви ї18 Баг Авр вка ЗВУ Тек дів Аза Тук пет болі 4250 48 атх5

Бко Ттух іч бек Бо з51у ци бій о цез Був двровВеє 14 тв ззта Бе

Я час 445 вка вже сій Так тоб біз дія Бго Ав тує біо Беж Тухт Ес НІів дк зза 45 або їзи веконхя тів о сбКУу тів Т1іе Бей бів о бет Ага Уаі ва Маї з МА 455 3795 Т5 во

ТУук Бек Тр Так Ніз Ах дек діа Бзр о Ахо Тек оАви Жак тіе біу ку 85 ЗО як

АвпоВку Ті ТВІ ба оті го Ме Уа Вуз Аза Вак бів Бей Рео бій 500 зо5 БИ бі тк їнт Уаї Уаї дкЧ су Ро бі Рв Те сі БІіУ Авшо Те бен 815 ко 525

Ага вхо Тлж Ав отр біу сіу Впе БТу Бо ще Ака Уві Тпк Хаї АБ

ЗО 535 5 біу ск сБвю те пі АКо тує Ат хів ОрУу беж дк тує ДІ бек тд 5а5 550 555 о иаї АвО Ебе Вар вна РБбе уді3 ЗЕ оАко пі» шту Тйх твт Уа) далподЕв зе з7а НУ вне дха Ббе іє вхо Тих Меїб ДАЕ Бех О1У Авробів їни дув тух 01х 580 5 ЗО

Ав бар оуа1 дкб йо дів ВЕ Те ТАЖ Бра Раш ТМ ВБе Тнробпів. Ріє 95 щ-к ОБ дій АзЕ птіє Тіє джу Так бет сіе Сіп сіу еп обеє Зі» вза біу біса 519 віх г чаї тує пів дйшЮ Пув Тує змі Ті фл вхо Уаї ТОБ АЛЕ Тит Ре сб 225 що 615 Б

Ма бін Тек Авр о бец бі Аго 545 «82105 10 «211 БАТ хтійх ВЕТ «їй Штучзчва послідовність веве кох есууїВва-т2АУІБОКВІВОК «асп о

Мет А1із бек Авіа од бук дви бій вв обої їз тЗМе А» Аза Уа) Зет х 5 12 їх

Авпонув Бек АБРа біп Ма Авр оцей рем о Бхо Азр о Аіа бро ХІ1е бій Алр 7 У ЗО

Бек Іїен Суз Ії Аїа біс бі Ав Ап о ї12е АврорЕЗ Раб уві Бех Аїа 5. ех ТЕ Уаї бір ої Бі (їв о взпоїїе Ата Сіу Ав Рів опи тА хв о чВ 5 їв біу Уві рко рве Аза сте Стій їй Аїд Бех РБЄ Тух БЕК о бце тей 70 ТУ Во ат спі» Сто ви Тхвобуо дра біу ака АвробЗіп Тер обій тів ре деч вх чо 5 бій Низ уаї зЗій Бій дев тів дзп бів біт ї1е Твагобіч дви біз йхо 100 115 Мо деп Тек А1їа сей діа Вгу бе бій Су (ех Б1У АзроЗек рре бтФ лів 115 то 175 тую 1а біп Бех іє Сіц дво отТрроїец 510 Авп дро дароАхвовія лій ї3а 135 142

Жито Ака бек оуаї пев оБуя тТвБкобіп Тух тів діа бем січ Пей Авроврпе 145 1559 155 їй ме; Аа Аза мех вто Бец рле дія їїє йга Ав осів сім ді РЕо стей їба 176 ут пей Меб Чаї Тукойіа біз Дів АТїа Ап оте нів еп пам Тез Гео й 150 195 155

Вр овМіа Чекобецосвре сіє тую са РМе бі по те обає сить што БІ 95 250 255 сів Ахоа Тує стук зій Вка 5іп Уяї біц де ть о Ахо Азротух бех Авр 2716 пІЗ йти туУук був сві біда тер тує аби тиж яку тей АБ Зв цей вВху Зі тре йо 230 235 240

Авподйіа віа Зег ТЕр Чв1і Аку Тух Ап осій БНе йхо Ако Аврвогеа ТБ 245 25И 25

Бей обіу Уві це Ав опесй Маї АМа Бе; бле во бет Тух АвВротрг. Вк кв га ТО

ТвВг Туд Ро 116 двп о тТнЕ Лех Дів бій цей Те Аг бід Ві Шут Так й НИ гне

Аве віа лів сіу та Тпж Сіу Уді Авап Мет діа Бе Ме Ава тТЕБОотТух 295 Зп

Ави А два оАїа РКО Вех Епе бЗех А1а Т1з бін АЗча Аїя Дій ті Аго 05 10 їх5 ї2о

Зеж вко нів цей фей Авро блю бе База ої о Тйгоїія вве Ват Аза

За ЗО зи

Вази опагт Аку тлро бе айви Тпс Ага нів о Меє Сук Тут стер о вх су Ноя за 545 «5 тву тів бів ех Аку Бо Ії біу Сіу біу ії дшб Тих жек Тако нів 355 За зс5

Ту іш тат о Авпотнт беї тів Ав оБко уві тек Те вха Ре слів ех

За 75 зво

Акч Аза) ові тує Ага ТВ би беж Тук Вів бе уаї Сей сей тк оБлу з85 ав ща аа їїє Жук їей бім Рко Ііє ніз біуУу Уаі ро Так ухЗ Ажеа РЕ дало рана аО5 519 15

ТЕ Авп о БКо біп Аз ї1є Зеб йзр Аг Ту тн АтТя вази Тук о Вес ад 42 125 4

Бро Жук іш Зах рко біу Їжа бів іже дув Авробет зі ТАх шій Бей 435 256 45

Ехо Ркз бів ТОК Тих іп Ах Рто бо Ттук бій Бех Тухк Бек ниж АКу 53

Здбеш бех Бів ів сіу її ІТіс Без піп бек ода Узі Авір узі Его мді зе5 о пр 4585 тує ек Тр оту нів Ака Бек оАїВ Ар о АКО ТТ АвпотТвнх іє біу о вко 4 ач аа

АвпобЛжа тіе тре зіз тів гро Меб уаї Ппуз й1ія беї 51 їей ко бій

ОО 05 о сі ГВт їж Маї Уві Акту б1у Рто бу РИШЕ Ж ЗВУ біУ Аввотіє тео

ЧА В 2 525 дея вЕЄ Тас два отак о О1у Зіу Бйе біу Рго ІТє Агу мМаї Таж Маї Ап

ВО З 550 щі Во гейожит сало дія ТУК Ач ТІЄє ху ВОж готує ка при лих а ЗУЄ БВ за

Уаї двороБвБе Бар впе вве Уві ек Ак Сіу Бу Тйт о тТрЕ Уді дало дав 5е5 5лО ЗУ

Впе вАгу вла Бей Ахо Тек Ме Ав Зекосіу ЕЕ СІ бвробув о Тук 01у ав) 585 ває дац рве та дк Аке вів Бе Тк тв БуО Ре Тих ре Тих сій тує 5ЗО 505 біпоАврохіз 12 Ах Тйт Зек тів с1з 515 фей бер обіу дп о шіу БІ вій 515 о чаї Тух її Авр Був І13е сі Іїе Ії Бхо Майо срик йзів о тТвх ВБе під 525 еза З Я вів сі) тує овзр Пед 511 Ага 645 «іо 11 «11» 647 «219» РУ «213» Штучна послідовність «РО кро» стутва-тмої «йо0х 11

Меє діа бек дп Ага пуз Авпобів Авоа обід 116 І16 Ап дів та1 ех 1 5 то 15 бвпоНів шес йо бій Ме Авробеб» Сем о бко Ав ойіа Арч хХле бій о лур та 25 0

Яйек іївц о СУув Те біа и 51Уу дво дай їі Аву о Боо Ріє ЧУ! бет АТа 16 45 щеї тих Уві бій тих ЗруУу фТе Авп тТіє АХВ'рзУ дку ТІ їжи сру ма зо 5 20 ви обСіу баї РЕо рре вій спі1у 5іп цей да бек Бре ТУукє Вес Ре бей 5 то 7 30

Трвосву піч 1бЦ тер вхо Ак б1іу дк АброФшь Тер обла тхе рве бе бів нів Чаї сіб бїів ве Ті АБйп осСіпобіп Т12е тТвЕ сМи Ав АТ АХ 490 ї05 ї18

ВзпоТвІ Від гец йіз др оцей Біпосту цву сзуУу Авв о Бек Ре вка Аза 115 190 ТУ тмЕ сви сь бето Беи біб Аве ТтТв о Бемо Біб АБО до АБО Авр Ага лта ізо їв 148

Твс Ату ер Маї Тео Був Тве біп отує їїа Ал охец ло тво Авровпе 145 ї50 т55 є цей дей Аза МеЄ Бто бе тре Аза Тіє АбЧ два ЗІ 1 уаї вхо їм 155 што 1 пез Мем Маї Тут Ата іп Аз Аза Аа Бебо Бзв Тец стем пеб гей до 180 185 150

Ав ойіа Бек пе впб біу бер сь впе сСіу фебмо тво Щер бій бід Тіє 195 200 5 бід вху Тухк ТУх бліа Бо бій Маї 01 Бхо дп о дха взев Тут ех Авр

Мо т 22

Тук сув Маї біа тТгтр о Туї Ав Тк оЗіу Із; АвпобЗех рей Аг соту ТЕ жо ЗИ 235 о

Авт діа Аїа бЗвх тТтр Чаї Авто ТУх Авт біб Бпе Ат дея АвроПес Тах ай вай ЛЕМ, їв обіУ чаї реа двери Уві Аїа Бе РБе рто Бех Тух дар їнх Аг

Ей 55 ат

Ти оТує Роб Ті ДЕ ту дек Від сія Геп ть дку бі Уві Те уп 215 2815 Б вро Аха їі бху Бка ТБт бі Маї вздоМек Віа БТ Ме двп отв о тух 2во 235 05 йз:подва Авповів Рро о бст бпе о дву діа Ті бій діа діа да тїє АгЯ а5 319 З зга зас Вко мкВ ей ей йзу Вір опей сь шїеь ей тах гів ВБе о Беговій 325 332 за5

Зск Бех овку Тер беж Ави о ТвЕ о Акоп БівоМеЗЕ ТнІ Тує Тер Ага сту 5 345 325 385

Тих дів біз деї дка реко Лі Зіу 01у Бі Свга Аза так оЗек Те нів ха зас Зо пі Ала тах ДЕЙ Тих щек їїЗесваєж БтО о мвВі Так іє жу нє віє Бех 319 ля 350

Ага Авр оУаї Тух Дюц Тпх біз Бех Тут Аіа Ту Уаї цей цем отв сту 385 395 335 4210

ЖХі1в Тук ет оз бо ІТе Ні зву Маї Буо ТБ Узі да Вре Ава вра дв 410 т15 тик оАвлоБхо біп о йалй Тіз Зеу Дер о Агу піу ТБЕ Аза йзи ТУук бек бів

СВІ п25 БУВ

Его тук сія вет ро бі пем сій їв Був АзО дех Ле ТЕ са плей 335 1449 45

Бко Рго 51 Тих Так обіз Аху Ро Ави Тух бім бет Тух Бек Нв ду «80 У 455

Тен беж нів БТіє б19У ї116 Іїе цеза б5іп дек Ака Ууаі два Уа1ї ВКО Уві 1455 а 375 385

Туг бек Ттр Тс Нів Аку бек йіа Айр Ага Та ва Тл іїв Біу ке 485 о 5 дви Ага тліє Ти бій тІїе Рко Меї Уві пуз Ала бек зт ей вка пл ов ЗО 516 біу так отпе уаї хі Аз біу Вко бі пе Тс с1у 5іу Ар Тіє ТИ 515 БУКВІ З дкч Ат так Ан тв сту Бі ве СРу ро ї11ї16 Ак Уві чТлж о маї КБ 5ЗО 535 240 біу Рко цем тТлк біб йдхку Тут Ах Іїе Сту рпє Ак3 Тук Аза Бек тах.

ЗУ ЗЕ тат Авр вне Ази оБпе Ре Уві бетг Вк СУ піУ Тк отТвжЖ ові депо ди 583 ІЙ Б

РНе до вне іі Аг) ТЕЖ Мех ода дек сту Авробіз Кей Гуз тТух пу зво 585 550 вки Бе таї деп йху дів Ре так о тТвк ро Бе Тйк ве твж біп гае. 535 о БО сів ввр о ї1їе ї1ї6 лдеЕЯ тТБж век її стпобРБу Пцез бЗех б31у Азп 01уУ 1 о 515 ж

Уві Тук 1ле Аяв Був ті1е СТтТяч сіе ї1ї18 рЕО бай Тих Аза тв ре сів

БИ 536 535 з

Ака БІЛ отух авробем оспій втга ва «2105 17 «ее 647. «гі КЕ «2132 Штучна послідовність «Вих с«Ее3» бруутва-тиво «БО» 12

Ме Аїа зех Аве Агу Був Ай бій Аз сі ї1є її де Азномні Зев 1 5 ї9 ТУ дев оБів бвкодіа бЗіп Мес дво без сем Бго дво Аза дко її бій йвр що 5 зо чаї Ба; був Бі Аза ОЗ сі вва ВБ її Аврорко Бпе уві Бех ДІА з5 6 4

Зак Тат уві бій Тих біу т1іе ет (16 Аза біу Бка Їіїє Цей опіу Чві за 55 що беж си Уаї Бте Ре Аїіз у сій о їшо ТВ о ЗВи бле Тут ек німе та

ЗВ та то ЕВ чаї 5зіу біч Бей Тер о Рго Ак 1у Ато Авгробів Ткробм1їц Тіз Рпе Гей ве за у від нув Уаї зі БІіп Пец пів Зп біл обів гріє Ту Сім Дап вів Ах 109 тої вій

Ай ТЕ ВА єм Аз вкЗ тей біб сту ев опію авробах бе Ак Аа 115 о 125

Тук бСіп о бів Чех еп бій оАер о Тко Сем січ а5л вка Ар овБр о Ата с 135 34

Твг о вкру беж Маї реп був Тих бій тТрж дів Бех їцобім тей дзЗр вде 145 ї5б 155 152

Тез Аза Аза Мет РБко бец Бе біз ї16 Акуоввп обі» Зо Уві Бо Пец 185 175 175 рей овВет таї Ту діа сіб Аія Аїа депогбейа нів Бей Пе фезч Пез во 189 їв 150

Авр о Аза Бак о пем ББе слу Зак ші вве біу йцез Трх Ббсж шів бів ІТ 155 209 0х сів Аво Тух тую Бій Ак сСіп Уві б1Мм деЧ тру Ахо дво тух Бес дар 210 215 рені

Тут Сув уаї бій Тжротух Бзй о тТас сб1у бед деп бек о пей дто біу Тне аг "за 235 ами

Ав по Аїа Аїд Зетї Тер уві да Тк ви Бій Бе дкдФ Аго Аврогемотвх 2553 ве 255 цей обіу Мя1 Бен Акро їем чаї діва пец Бне РрРго бЗеє Тк Адзр о Тпс йго 285 й що

Тк отух рт Ге йзп ТНх дет йїв б ви Таж Ака Зі маї ТЕ ЖИг 275 250 285

Азр о Аіа ї1є біу Аїа ТПЕ 5З1Уу Уаї д5поМеаї Аза бе о Маї АвпоТго Тук 250 З КЕ)

АбпП Оля Авп Аза Рро бвежх Ре беїх Аїа ге січ вів Аї АТ її ле зав з1й 315 зво

Звї вхо Нів о іжцї Тс) дер оБМне без іч піп обец Того бів Бр о шег лій 325 5 ЗУ

Чет цек Аку Ттробет Азп о ТбЕ Аху Нає Меб ТБх Тк Тер овхш бі ків 345 345 каст) тНт о І11їе сій Бек ДЕ Ркб тів сіу сі БІТу пез Ап о ТптоЗах тпЕоОнНів 358 36 Зх б1іУ Аїа ТрІ дви Тпх беї д1іе дей Бко Узі Трт о фео АкооББе діа бег 370 375 ще

Ака Аве очаі жук оВкЯ ТБЕ сви бек тує йЗіа п3іу Маї Бецдоіїєа ТЕроБіЖш

ВЕ Зо 385 00 тла Тук Бей бій Бго Іїе Нав біу Уа) ЕТО ТАК ОУВЮ Аа вве авг Ве: сі 415 дз

Твї Авоп оБго сій АБла ї1Та Зак Азо Ага біу ТК Аїз дви Тук бек бі1п 120 425 435 вка отТук Іа дек орто бу Тева біп ев оьуя Авр Бех бі тик Бій пух т35 240 ч45 вро ржо сія тах тах біц одхус РЕ АвпотТувк сій вет туксвек нія Дт 350 ази че

Без» беж Нів тів о1у ХТе ТІТе їв; бів Бех Аку та1 Ази ув) реа до 455 ато а 5 850

Тукоаеахкт Тур тиж нів Ако Зех АТ ВБО Аг ТБ Аве Тйт пів сту Бо ав 450 щу ази Ато Ії Та біп ї18е Его Ме таї цув діжобеак бів цец Без бір 500 55 Іо сту тТдж ТтТЬї баї чаї дз 51у Бго бІт1у ває ТИЖ БІу Бі1у Ав ХГ Бей

Бо зей 55

Ага Ака тик деп Так бі З1у ве іч Бко Кіе до Маї ТЕ Ув' Авп 3 555 Ба жв птУу вко теп ТнНЕ бій Аха тує Ак І16е бі РН Акту Тук йіа БекотнЕ зай З50 вах 5ЕЙ маї Азо Ріє яр о рле РП Уві шеї АхЯ ОБУ ОТ1у ЧЕ сих чаз Авгподви 50 я

Ре Аху Бе пес дк вк Мет дви бек б1У дар Бін й був тТух Ту 5Во За БО ве о рпе хаї Ата йха АтТа вне тТінх спр овІо Ббаеотвх РвБе тля 532 Тл

За 5 вп сіпоАврохіє Та Аж тех бе ТІ біл обіу лей Бех б1Уу Авбосіу ОМ б10 615 І, чав тує І АзроБУуз хе бі ТІ 11 ВвКОУ УдА Тк АІі8а тре РНе бі 525. Ба 35 о діа біс ТУю Аво бе о щів Ака 55 «2102 13 «11 1544 «лий» ДЕК «РІ Шеучна посиьдовніссть

ВЕ

«дві» Сртимізовзна для маїсу послідовність, о кодує сиву тає т2ад,хі15ОоК,1595 муУутант «00» 13. атудестсса ассусавцав сузааводчад атовтсвату ссасдасєсва сова усе сацавсцасс сосссасозуда суссазчакс лазспасостю бзспсахсов слава тао засавксчесс сстссчкчво сетссаусасс: схосдассо чдсвосевсаЄ саспосповоо

Кк аБссерсацасЯ сустсчасов чЧесаегтосдеу соусваастая сшкссксста сусорсееса та чЕдоатсдчаво ЕЧЕоОчссвад зоусадцачат сасбссузчаза сксссгсцяа дсазстчова за садсучатса сссадсезає сасссасзає чессзсввса сслесосадс саоаоссосви зо ччасьооасч асадстессу ссостассая сабазуссссу вачастяЯуев созадавсата 42 часвзасаста зЗдастсдсас сЯакзсосваз асссадтзса Есспсстевсоа дивадасове 489 сіцвасцеса ассзстаєь суссатссає айссоациадач кпессдебасх чат тяе чессацассая ссавсплісся севсатссьоа сіцазусасо спадом одосвоту опа тЕсоапсссуа ссазссасца азабссвасзс пасовонує Фдесазаєчвеа сапу б чассасачся аствсолсах састусдтас аабасссдюео спватацелі зааячасас

Зал о:

азвзшцссдесв зебоЧЧецея ссасавасову Бсссцесуса асстовоуєи сус сста 7вО | І ласстацкод ссстчіссоо чдачекастає асосстовсяо вессазсста седсвасао ва) сачетаасся чсзазччсутв сассовсЗос аксуусдєся ссоуезтовнеа сбахосссвеє оо зссазвссЧує зсаатмаєва спссосчачс сесвасалса ббсозчаєсяс бапеваосног

Бо косссасат поастсоеаМс пспссачЧеваоа ссдвосявсв гтсацсдссву свассзссот хо2б ї02 їссавсасесс зосвсвсчас стассодачо сассасасся сссададчсва сессависаосс 1085

ЗчеЕчасессча асаєсацсес ссасзуєчсс авсансассв зсассеввпсо сасочасзета ї14 зачессвсса досувоасЗ чЧресстусасс чечачссвстят студе ас осаду їщоа зкптасстсов вассзчавбсса судесссдеса ассакусчсь бсазсіссво савсссоваш їз І засзісавчсщ есстрсачсас спесваскас всосадссає асаваачесс взозсстосац 139 стдаевоєчвсеа дсуазасіза асгостотсс чаодвсрасст дасусесзаа праспацдеє 158 тасачесасс сссточазсся папсоадсасє акостссадце цесочсоасЗва сусОссацка, 14340

Сасзостачв песасвазес сосодассЯу встаасаєся бпуфеелюая торгове 1505 стачаксосцча точЕсавутос сачетлчайскч ссасасйсоса стассчтое чазлоапареа і550 чзаскктсаств асадецасає спудсассцє всаавсвосо зозоасЕсовоу псосвавєсици 16295 чЕсассзЕда асчассподес чассспавац басачуаєся осо поаосіссасу 1580 чечааскротз ассретссче дацзсасочоас посевссвося ссвасвасво ссастесово їа0 стісассахєсзса асечсзосох счзусізава Тасудсваєв селтуласаз заесвЕсасо ївсо0 асссоцстїса сссесвсаса оатссводає авсасссосв ссавзсаєсоса Яаоусеечащо 3 вай асо дасвласоучса пові ссасас савнсваадаесо Задавсяєсо стасуаєсує сасегусаве

То чЧесоайє»вся ассесдчацея спа тиж кіп Ще «2112: 40 «гтй» дик «Іа» деична поспідшбввість «ох «вйЗ» хобі Прямий праймер «ах «ЕВіз тівс Тева каш 113),,113 сеиЗ» па, З, б або «й? «2215 щівс Жезбире татйм Х4р..4115 каш пна, ХХ, й ЗО с

Ей -йаї» штквс тевсмге келих 151.41 «Из вт вою с «0О0х 168 загаИсчккЄ глапазессса агасвіяяое Бгадавссід 45 «10 15 «її» за «гір» днк «13 шШтучвхк пОслідова гот «во «тиЗю ців зворотний праймер «ве» чеФх» туве Жеватика «ай 418)..113) «бах вн вд авоо сг» «2212 мщівс геакцте кагйх 415)..118) «жеЗУ хе в, 5, Ч або з «еоОх «2215 співсо вати «ийах 05... 1153 ей окт ов, с, З або с

«ОЗ 15 сазБаєвекос діБппаззаа сасутстовк пора

«10 ле

«и 4

«12 ДНЕ

«Ба? Штучна посліповність

«гдх

«228» х5153 премий праймер

«ЗО» 16 зчЧазвоваьс гузазассося азасасвостї стачзастіс хі» 47

«її» 8

«2125 ДВК

«вій» щЩтучна послідовніств

«вух

«Раз хс155. зворотний праймео ха її гатазастоо збсскаацав састьсвсзє бестусвато 38

«210» 18

«115 40

«212х ДНК с-13» Штучна посліІДОВИМОтТЬ

«и»

«иа» ахЗоО прямий праймер

«400» СТВ завацзсчьос ксосппассся абасатадцев веасавоцоу «й куї0з 15

«2115 За

«3122 ДНК

«2122 Штучий послідовна ств

«Ох й

«ти їчіЗ! зворотний сваймер

«ад» Со сбвкасавЕса сбьссааватаай саєссстсце ссвросато за

«ріст то

«ВТІМ 45

«2125 дик

«21 Штучна послідовність

«ех

«ги жЗ18о прямий. праймер

«4003 20 асгаїчсЕЕаа асасуасстс езатасовава азсзачваїа за 4 кам й

«211» ап

«о1ях ДН

«213 Штучна послідовна сть се»

хойиЗ» ЖС151 прямий праймер

«00» ді агат кЕка всакоцесою взсбассячає зсегсуваєка 4 кох й

-уїї5 4

«ві2х ДИиК

«2135. Штучна послідовність

«во

«ге» ЖсСІбо зворотний праймер

«005 Ой акгвсчусуєд сстаєеввтс тайвовасає сепчистсуа аа 43

«2105 75

«ії» Я ей ДНК

«23 Штучна послімевність

«ЗВО»

«223» сівба прямий праймер

«Фо З зайЕссаход сугсавдаєва Чазазатоза аясосазаєта бадаїуе 47

«віб» 74 ка 38 сеї ДНК

«2135 Шетусма лобпідеввіст»

тЕаюх

КРИ» ЯБЕБЯ прамий позймер «Оп» 24 зассссасуд віствобасс вузчзсточе аеи ках 5 «шу 34 «125 ДВК «213» Штучна послідовність «ше» «хво3» жЗіса праймер «ап» 25 аатіссасуч вабаєаассв зкатаваяосє зпадл 44 «ій» 86 «Рі й «Ей КВК ліз» Штучна послідовність «вИиО5 ки23» хсівБб праймер «ап дв азвссовашес сКасстскст ваассзсастє сстусоссзчав Зх 4 «ВІ й «вІ1їх 0 «219 ДНК «813» Штучна посліудовиість «СИР кршЗ» че праймер «Ох й вакжотсекс содасчвате асоаусстеве 35 «2102» 28 «іїз 35 «1» ДНК «піз» Шнична послідовно шть «ггОх хле3» хсї7о праймер «ар» 28 їадЕжстасос савацазавсо папваввась вах

БЖ

«210 из «киВТЕ за «2127 ДиК «віЯ» Штучна плосльдовність кар «ВЗ» у5175 праймер х«апОз о тгавз-азатаз асібоцавсї савЕпІвшЄ авт

За «Кіш 30 «2115 33 «їй» ик «213)х Штучна поспідсвність -8а0х ки» зів праймею хклОб» 30 зазЕїтстава гесахткакаєо пазбасаава вдос 38 чиїх кетї» З «ші?» ДНК «213» учна посбдідовеісте. «из «223» МсР7З праймер «ОЧІ гаслєстає сотсбавсоазч асвроссушї с 1 «І 32 «115 33 «дз ДНК «7139 Штучна послідовність ках «ий» ЖХБІНО праймею «00 87 бсрсзахзаач сдвсвачсУуста дасте с коп 33 кед З «11 5 «212» ДиК «із Шетувна послідовність

«Ех

«2232 УбІ1БО прямий праймер

«4005 83 аузассацаз ччсдзасттва ззсессавсві втадо

«1» 1

«ЕЩіВ.

З

«ій» дк

-г1ї1832: Штучна послідовність

«8

«ий» жа праймер

«сади За асоасвахаєвн Бачаїтсьнав невецвесКе спвакаса за

«и» ОЗ

«Р 35 хват ДНК

«шІйЗ Штучна поплідовність

«ой

«Ба» чхщійБ праймер.

«айс с:

цайцьсосар баксуєсєсаци зтесчсетгав чес 35

«10 36

«511 37 квїйх ДНК.

-214з Штучна послідовність»

ква»

«йо ЖІ прямий пюдимер чадо» ЗЕ піссхкавуа зуасЯссаск ст сасвако вуаваєи 37

«10

«ІЗ 47

«в1йх ДНЕ.

«Ел Штучна послідовність

«пох

«223» хбБ185 праймер

«Опя З зазсоачевіс Гтабсавзаз зассазосес басвоствів Сесбо свід» ЧИ «ві12 За «йхй ДНК «13х Штучна послідовність кИРШЬ «га 383 праймер кабпох 38 сеЕсЕтелцуса водаєсссоя воктасарся сєвВоЗ 34 «В1ійз З5

Каті З «8125 ДНК «13» Штучна послідовнасть «вах «зх хо131ї праймер «пох 38 стсавасссо сбсассвааав сазвазсавс єбссває 37 «810» 40 «дії» 50 «Рій? ДНК крІЗУ Штучна послідовність «Ха «ВЗ» ї0б195 праймер «ВН 40 ссакбаєсЗа зсссасавос ссавоцсоосва загбмвиаоо а ха1б» 41 «ту» 43 «Вій» ОДНЕ «13» Штучна посліловністі: крах «пе» січ зворстний праймер «бОх 1 ашсвсяабатсе сстсвайавсч завссЕсесЯ ЗесСуставує ап 3 «ших 4 «ВР» 6525

«Бій РЕТ «213» вашіїтиз свВикіпзотепвів кий» «22» МІЖО ЕКАТУВЕ «ши» 41),.: 626) сва3к скорочений Стуївачї? «арпх ай

Мет зр іейа їм вЕб ДБ о А1Та Аг тів біо АвроБех їв Сив ті Аїа 4 т не т й т

АХ ву 15 15 іш біу Аз АвпоТіе двровкхз Бпе Хаї Бек дія Бек отрх Мі сп СИХ

З У ЗО біу їзТе Авпот1в АТ сту Вуз Ті рев ОЇ мех по бі мет реє вла та А

Аїз біу бій реч Аза бек пе Тугк Бек ре рей о Увїі бік бій ревно отТкр зо 2 БО

РІЗ АБО 519 вхо Авросіл ЖХхробім Ті Ве ви буз ні чаї сю БІЙ

З ще ПЕ за пед 115 Авп о бій бів БГіє Тпропіз АвпоАЇв Ах Ав о Тнк АТа гГец АТа п зо 25

Аха Гео біп б5іу Бей Сьу АзО ошек ре АЛЕ Аїв тує БІй Зі оби сво їпо 165 1їп піс дБв о ткроїва с15 Вап Або Аврозвр о АтТа де о ТВЕ Ага чек уві Сей 115 15 їп5

Тус тв бій туго тІБТе оАіа ей бій лез с АвроБів Хей Авпп овіа мекв овке 13 Ух чо

Бен кке Аза тте дкУ два бі бій Мах овжє цей пеи Ме Уаї Тук діа 155 15 160 сіп іа Ала деп обюи Нівз їй пем о пем Тем Бус Авхойіа бек Пд, ВНе

ТУ 70 175 сіб дек ші р оСІу Пец ТЕ Ег оп Та зів іп вка тує пух БЕ 188 185 ї5О

Арка біпоуУві піз Ако Тахо Ахз Авр о Туг бех йвротує Суз Уві от ї85 2 215 тУуж двпотіх біу цей дяп ВегоБед дк 519 ТВЕСАви вів Аза дЗех Тер 2-13 215 шви чаї АкУу ТК Авп ость ве Ак Ато АврогемотТвнг о Мей Зі Ма1ї лез а5р ло не! 24о гей оуаї Віа бра Ре Вко бер Тут Авротак дич тех Тук Еко стів Ава 2 25 5

Тик Век Аіз бів пеш ТБтодта бій баз Жук ТНе Аво Ата бів біу АТа йо 265 та

Тк Сім Маї дзиа Мев Аза бек Мет Аби ТІ ТУуї Аа два Ав Мід вто пл ВО 23

Зет Бе Ябегх АТа ІТе бій вів діа Аза ї16 вВку Бех орто Ні їжи Бех 25 85 зо

Ази оБрз Бей; бзпобів Бо Тв отіе рле Бек Аза дес Зет АК СтТКо БО з05 315 хв 32

Авто оТтвВх ваго Ні Меї Тву Тук тХхродущ зіу Нв Тс ліве бій чЧежх вкє зев о ЗП їхо тізоціу Су сту щей АвпотвЕ Зех таж ще осху від ЖЖ лего тне зап зах 355

Зах Іі2 Аве о Бо Уаї Тахо їз дка вББе біз бек АксоДвро уві бух ДЕ за5 10 65 тах М ет Хух діа сту уатї рем бей Тв ос Кіа Тут цев оса вхо 379 75 зво ті КіІ5 біу маї вБко Тк о Ува) ДЯ Бе дев вве тує дво РБгбЯ біп Ав

Зн5 зай зах 455

Іїє бек Авр йхко б5іу ТП о Аіва йвпоТук бек боп Бо тук ха Зег рго 05 з1с в б1у бе» зій Бед оПув Ав пек біо тре Бій їейпоБго ро Ба отр Те

480 иа АЗО

З1з АкЯ Вко дат Тух бій бек тує Зех Піно дку бен бек НІВ ї3 Сі 415 4145 ч45

Іва ві цей бій Бек о дк чаї дет Маї Бгто сУуаї Ту Бек ТЕр тТНг нів 455 АБИ пхо ек Кіа взо Акч Тв Азот в їі бі Бо АгооАко Хі Ту бій 485 аа я75 48о

Іі Бгто мех Маї пу Аза оБвкопібї Пес Бко біб стїу ТУ тв Уув1)і Уаї 4н5. аа та дту зіу Бко Зі пе тік бі Му дяр о їІзе щей Ас ВЕ тах АБО ОТЬЕ

ЗО 205 їй біу бі ЕвБе біу Рто їв Дт уаї Тв хзл о Авап ЗТу Ркго Мей трх бій ве БИ: ЗЕ

Ака тус АтаЯ Ті сту Різ Ах Тук Ата Зек ТБ Уві Авр оре Авр оре

Зао ЗБ 54

Рпе уа1і вро Акаоп1іу СТУ вп о тВж МВ Ай дай ре Аху ие ев» ву

ЗАЗ 5 зей БО

Тих Меї А Бех Щіу Аввобпім їва Бу Тук пі дет вме Уві Ак вка 555 57О У іа Ре ТЕ ТЕ Роз Рпе ТЕ ББе тло б1п Ті біз дав Хіє Те Аг

Ууво за5 ЗВО

Тис бек 15 бій слу цец Чек СіУу Аве» сьу СІЧ Ха тув гіЄ дяр у

ЗНУ 6бо во

Тв бій тів Х1їв ро Уа! тре о ДІа Хр Бе Сім Ма хо ух вро опе 210 815 52 біз Ак вих «діб» 43 хвіїз БК «їж вит

«віх Штучна лоспідовихметь ках «ИЙ» Вазріантний Стуївв-ТМ5З «ах вх

Мет Аза зе Ап Ага бує АБИ біб Аз Бій Тіє Те Ав Дт уві Бех і: 5 т 15

АвпоНіз Бек діа 5іп Меб дзр о цез цей Его йероАїя Аа Ів б1а дер

У хе ях о Ки Зо зек во су ї11іа Аїв бій слу Адо о двп хі бер оБсо те а бтХ во 3и 20 ще

Зак Так о уаї Бій тТБбкобТу Тзе о Авпот11е Вів Сім Аа Ті ям БІ У Уа 50 55 5 ев сту мя) вро Бра Аза Бьу бій ЗЕМ Аза Беж вра Ту бжж ВК Бец то КБ Ва уай вку ва паб ТЕ ово Ату біу ака Аво Жійа тхро бів Ще вне їй 85 з 35 іа мів Уаї б» їй ви тів Авпобів бій тІ1е Тр о б51ро два лі АК о ав НН

АЗИ ТЕ АТа сії Аа дто Бей осі Ф1іу Ляйп сі Авровес Ве Ага діа її5 159 МЕ

ТУг Фів Зіпосбет цей БІС Явроттроїна 1 АвпоДтє Аве АБО АТ» ко

Ії 138 140

ТЕ Ак ВекоУуаї печ Бу Так обід Тух Т1е Аїа їем бій Бей оАБу бла 145 т5о 58 Бо

Те дяп о АтТа Меб Бко Беб Бе дія 118 дк дво 51 Бій ба1ї Рко Це ї55 Уа ї7З тедовко уді Тут Вій біо АТа діа дви опе Бів Сем зей бей рей ЛЯ їв 185 158

АвроАТа Зек цем Бе с1іу Зек б БЦ 03уУ беш Тит Бек біт суп те 135 2 іму

Зів о Ака Туг Тух сі Ахо бів о маї сіц АЕЧ Так АкЯ ОБ СТує Беж ву 210 215 й

Ту Су Маії сій тТкр отут: Авеб ТЕ б1іу їв Авпи беж без Аха біу тик 235 235 254

Аза Аів АТь Бех Тур уні Атху Ту ав бій вае Агу дк Авт Геї ТИХ ах 250 ЗЕ ей біу МВ) Її Аворобем мМаії Віа ей Бе Рето ЗегоТук Двротиг ока то те пу тТле Тут РКО ї1е Ав Тит Зеї Азія сій бейп БИК вс сій Уаі тур ТИ -5 290 вва

Азов діа ї1е піУу АБа тис слу Уаї Азп Меб за бек Ме Ав ТкЕротух 239 жо З

Аве» оАвп ве Арфа о вко дехж Ре Бех Вів їтесшьіи вів АТа вія ІТ Аку зо5 зро зі5 Зо

Ве рго Ні іп осбей дяр вне бец піч сСІй ї2го Тк ї1їе Бре ех Хі 325 Вес За

Зек Бах дка тТЕр Бек АВО Лех Ака снів Мет Тпх бе Ткр Ак бі КІ зай 345 до

Тис 112 бій Бех Ак БРкоа стле біу с1у сту без деп о ТТ бах ть» нт 325 50 з65 зіШМ йла тре дв такобБет 116 Ай срко узі ТвАх їв ле Рв ВІ ву 370 375 зно

Ах лЕр Уаї туї Ак ТНх 012 бек тух АТасоіу баї Бей Бей ТкрооБіу

Зо 125 ЗУ що

Х1е тут вач б1іа Ехо їїз вів Біу Уаї РЕ тв Уа1і Ак ее о Авпо вне 25 519 ах тих вай рЕО сбіпойви Т1і6 векоАЗи оАха Б1У тре Вія Ати Тут Явк ід аго я ЗО

Бкєс Тук пів бех Бу Сіу рец (Мій пес був о АЕв о5еЕ обі Те осів Се

255 зо 445 вхо вхо під тах отвкобім Ак Рко Вавпотук СІ бе Тут бек мів Др

АБО ав АВо пед обет Бі їзе біу жів Те бев і пер Але уі Абвй тах Бке мал тез о Ат. 80 тТук бек Тер ТЬж нів Бк Вег Аіа АЕєЮ Ася Трх вп УВІ 112 Бі Бгто

Авп о Ака їМе тих бій жів Бо Ме Хаї гу5 АЛІ ек боса педжосткКо сій 00 5О5 ВТО сіу Тпжх тах Узі Юаїз ба б5іу ко зіМ вас Ту Сіу бі1У Авротів ей 515 220 важ

Ах дтФЧ ТВх дат отТк біу 01у вве б1іу Бхо Їїіє Ако Чві ТтБух Уаї лев 535 5АО зі ргФ бе; тих Мб Аха ху аку її 51у бе джу тус Аля паї тТКЕ 545 556 БЕЗ БК

У«і ву» ри Аврора Бає Уа Бек дк біу 5іУ ТВ Твйхт о мві дало Воплі

ЗБ 5! п

Рае Ака Без сна дту Тек оМес авпо Бек Бу Вафшобій ви Був тТук Су

ЗО В УЗ

Ази ге узі АтЯ Ас Аза ие ТВІ Тл РКО БВ ТЕ рве твЕ біл І1Є ау бо ах сій дз» тів ї15 Ага ТМЕоБех ів бів б1у пеа ех слу беатоБфмМ и 616 віз и чаї тук жЖіє Вяр буз ї11е сто Т1і5 її Бро уві ТБЕ діа тав Ве їм бе ЗИ З 542

Але Бім тую Ав Пей сій ДЕФ 455 ша ой «В1ї1з 847 «ФВ? ОБНТ

«13» Штучна послідовцісті» хаво» «23» ВЗарзіантний Сгуїва-тМБ1 «ОО» а

Меп бів бдзк два Ага пуз Або сМа дап сій 118 ї11в Аза Аза ді Зех 1 ш ї9 кх

Зап оНів бек АТа біб Ме Аве без о їше Бу АвБроАтТа АХО дів БІ длр о 23 Зо

Зєт пед осПув ТІ Аза біз СТУ Ал Аве 1128 Або бко Ре Уві Бех Ат а 2 я. ві те уаї сів Тв слу тів о Азп оті Аза Бі» Аква 118 пе Бім Увї за 5 0

Бей: біу Уаі Ркз Рв дія біу Сів Бей Аіа 52ш бпе туї бах би рей 70 то Во чаї бу бій їез Тв Рго дкароїу вка Авробів Тер об51іц 118 Ве бе

З за ЗУ оф нів о уай сій Ме Фей отіє АвпоФУй бів тів тп бій Ай Аїа Аго 1 155 11 ви Тахо Аза Без АТа хо еп обіп Ту їешфоЗіу Азробеж ВО оАку дід 155 155 1955 тТук бій зіп бек бе) бі Аве о тЕр Бек осій Аза вату аБЮ завер одів Ар 150 І35 15а

Тьх Акту бак Маї Бе) їув Так обів Тух брав оАтя інш біз ям Вер обе 145 150 ї155 Т5у

Беип о вви одіа Ме рко пес вБе дід ТТє Бах дай щі 516 Майї Рто Бе 165 175 175

Беца Ме чаї тТусовів сій 8їв Аза Авп Бевз оНія Бей тей ої опем Ат тб 185 те йзводів бек тей Ріє Суу Бевобіц Епе об1у рез так жалобі см гі е 125 оо 205

Стій дку тТух Тук бій Аха бів Ма| 014 Ака ТОК Ато хв отух Взг. Аве 215 р и тТУк о Сув чаї 510 Тво Тух Азп о ТБЕ ЗТу ієйа дао Бех без ха сіу Тих дж ЗО 235 249

Двподів Аїа беж Ткр о Уа3А Ах Тух Двпосіз РВЕ Ак Ага Авр Пец ТЕ пав ва де ії: бі1у уаї зей Авроїзу Узі Аза їеи ББе Бко ває о тТух дар о тТпх дк 259 ге 270

Тк тую Вес Ті о АвнотнЕ бек діа бів пед Тв о дтяа бва Уа. Тух ТЕ

В во Но дкр вів Ті пі Ві тТпЕ ТУ Уаї Аве Месх Аів БЕт МеаЄ АБИ ТЕО ТУТ 295 зо

Авпо дви Ав Аіа Еко бек Бресбдеє да ті бій Ліа пра Аза І12 Аго 305 Зо їГ5 ї20 ек Вже кі їв По Аврора пеу ба біполеб» тах ті» Бае вет ка 30 355

Бег дек вгоа Тур бЗех Аяп ТТ оАка нів Ме ТНгоТме Тгтр око бі Нав зас 345 350

Бк оїїе щі Зв духу Ро ї1е біУ Ст Б1у цем одаий ТЕ бвк Ттржх вав 355 зо заз оіу Аїа ТЗЕ Ав ТБх дех ї16 делоБко Уаї о тдеЕ Пед бтяа Рбе дів бек

ЗО 35 зво вхо Азр ові Тукоаку тБх бів чех Туж Аїв біу Маї гем Ми Шев о ОТу

ЗВ 350 з 405 тів туУук пай обічсвко їІїє ніш обу тА бко ТтВвЕ Уві два РаЄ дЕВ БЦ

Зоо ЕКО 115

Тис взпобтб білоАво Її бек дзроАку біу ТВ оАТа йви тТук оцет пп 420 225 30

ВЕ жує с5ї1а Зек рос іїху Бей ошієб Її був авробеу лю о твт сіль без

435 348 гак вхо БКоссолі Тахо Тлх біб Ах вхо Авап о ТУує бін бвї Тує Бех ПбБ Ахц 450 455 4еВ

Тв Бех Нав ТЛе бі тзе гів Пец бій бех Ат ма1і Авт УВУ Вис У

Ав5 ло 455 185

Тук бек Тр Тих Ні оАкс Бек Кіа АвБроАгОо Те оАБа Тит о ЇТе с1у вка «85 90 435 дя о дко ті ТВЖ бій тів РЕБ Ме уаї Буя дта чех дім ту вхо Біл зов ех 510 сту Тих отв УЗ тав та зіуУ Вк БІУу Ве тв біу сіу Авзв 116 си 515 520 БЕ

Зх дк тих Ав отТдеЕ бі БКу Вбе б1іу Бго Іе вка Уаї Те уві Ав 530 535 54

О1іу жо Пед ток біг Ако Тух ко І1є Сі Ре Ага Тук Ага Зек тве 545 55 555 Вей та) АБО Рке Авр Ре Брє Маї бек Або сіу біу Твр отв Уві АБа Ав

У 570 575

Рпе АКо с Ейе ви дку ТЕ Ме АнпоЗех 01у Авросій ем пуУуз ТУ оту зай 385 590)

Авпобве уаї дк дей Аза Бце твх Тв Бсо Бе Таб ЗБе Тнж бій ї16 525 оо во сітАар 1їе тів Бха тп беж Ії біт біу Пес біу Ав о сіу був 515 52

Маї тТУх їіїе АзроБуш шле бій іє їїе Рхо УВУ ТІ Аба ТпховБа Зо 625 о в3о кі33 «о дів бій Ту Авр ої бій Ай вав

Claims

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Сконструйований білок Сту1Ва (еСгуї1Ва), який містить першу мутацію Туг на Гуз у положенні амінокислоти, яке відповідає амінокислоті 150 у 5ЕО ІЮО МО: 2 або 5ЕО ІО МО: 5 і додатково містить другу мутацію у положенні, що відповідає амінокислоті 2 або амінокислотам 2 і 178; або амінокислотам 2 і 189; або амінокислотам 2 і 199 у 5ЕО ІО МО: 2, або 5ЕО ІЮО МО: 5, де зазначений сконструйований білок має покращену розчинність або інсектицидну активність щодо щонайменше європейського кукурудзяного метелика (Ов5іг/ліа пибріа/в) у порівнянні з нативним білком Сту1Ва або білком Стгу1Ва дикого типу.

2. Білок еСту1Ва за п. 1, де амінокислота у положенні 150 є Гуз і друга мутація має місце по амінокислоті 2 або амінокислотам 2 і 178; або амінокислотам 2 і 189; або амінокислотам 2 і 199 у ЗЕО ІО МО: 2, або 5ЕО ІЮ МО: 5.

3. Білок еСтгуї1Ва за п. 2, де амінокислота у положенні 2 є будь-якою амінокислотою і а) амінокислота у положенні 178 є 5ег; або б) амінокислота у положенні 189 є 5ег; або в) амінокислота у положенні 199 є Гув.

4. Білок еСту1Ва за п. 3, де білок містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 7, ЗЕО ІЮ МО: 8, ЗЕО ІЮО МО: 9 або ЗЕО ІЮ МО: 10.

5. Білок еСтгу1!Ва за будь-яким з пп. 1-4, де білок має додатково активність щодо лускокрилих комах.

6. Білок еСтгу!Ва за п. 5, де лускокрилі комахи являють собою кукурудзяну південно-західну вогнівку, очеретяну вогнівку, бавовняну совку, соєву совку і гусеницю оксамитових бобів.

7. Білок еСту1Ва за п. 1, де специфічна активність зазначеного білка еСгу!Ва щонайменше в З рази вища, ніж у нативного білка Стгу1Ва.

8. Молекула нуклеїнової кислоти, яка містить послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує білок за будь-яким з пп. 1-7.

9. Химерний ген, який містить гетерологічну промоторну послідовність, функціонально зв'язану з молекулою нуклеїнової кислоти за п. 8.

10. Химерний ген за п. 9, де зазначений промотор є експресованим у рослині промотором.

11. Химерний ген за п. 10, де зазначений експресований у рослині промотор вибраний із групи, яка включає промотор убіквітину, стр, ТгтрА кукурудзи, тії, 5 ТЕ гена 9 бактеріофага Т3, сахароза-синтетази 1 кукурудзи, алкоголь-дегідрогенази 1 кукурудзи, світлоуловлюючого комплексу кукурудзи, білка теплового шоку кукурудзи, малої субодиниці карбоксилази КиВР гороху, опінсинтази Ті плазміди, нопалін-синтази Ті плазміди, халкон-ізомерази петунії, багатого гліцином білка 1 бобів, пататину картоплі, лектину, 355 Самм і малої субодиниці 5-Е9 ВивР карбоксилази.

12. Рекомбінантний вектор, який містить химерний ген за будь-яким з пп. 9-11.

13. Вектор за п. 12, додатково визначений як плазмідний, космідний, фагмідний вектор, вектор на основі штучної хромосоми, фага або вірусу.

14. Трансгенна клітина-хазяїн будь-якого організму за винятком людини, яка містить химерний ген за п. 9 або рекомбінантний вектор за п. 12.

15. Трансгенна клітина-хазяїн за п. 14, додатково визначена як бактеріальна клітина або рослинна клітина.

16. Клітина-хазяїн за п. 15, де бактеріальна клітина є клітиною Є. со/, Васшйив іПиппдіепвів, Васіпиз вирій, Васійи5 тедаїепит; Васійи5 сегеив, Адгобасіепит або Рзеидотопазв.

17. Клітина-хазяїн за п. 15, де рослинна клітина є клітиною сорго, пшениці, соняшника, томата, картоплі, капустяної культури, бавовнику, рису, сої, цукрового буряку, цукрового очерету, тютюну, ячменю, олійного рапсу або маїсу.

18. Трансгенна рослина, яка містить рослинну клітину за п. 17.

19. Трансгенна рослина за п. 18, додатково визначена як однодольна рослина.

20. Трансгенна рослина за п. 19, додатково визначена як рослина кукурудзи, пшениці, вівса, рису, ячменю, газонної трави, цукрового очерету або пасовищна рослина.

21. Трансгенна рослина за п. 20, де зазначена рослина є рослиною кукурудзи.

22. Потомство будь-якого покоління рослини за будь-яким з пп. 18-21, де потомство містить молекулу нуклеїнової кислоти за п. 8.

23. Насіння від будь-якого покоління трансгенної рослини за будь-яким з пп. 18-22, де насіння містить молекулу нуклеїнової кислоти за п. 8.

24. Інсектицидна композиція, яка містить сконструйований білок Сту1!Ва за будь-яким з пп. 1-7 і прийнятний сільськогосподарський носій.

25. Спосіб одержання стійкої до комах трансгенної рослини, який включає введення молекули нуклеїнової кислоти за п. 8 у рослину, таким чином, одержуючи трансгенну рослину, де молекула нуклеїнової кислоти викликає експресію білка в кількості, яка бореться з комахами.

26. Спосіб за п. 25, де комахи є лускокрилими комахами.

27. Спосіб за п. 26, де лускокрилих комах вибирають із групи, яка включає європейського кукурудзяного метелика, кукурудзяну південно-західну вогнівку, очеретяну вогнівку, бавовняну совку, соєву совку і гусеницю оксамитових бобів.

28. Спосіб боротьби з лускокрилою комахою, що включає приведення комахи в контакт з ефективною кількістю білка еСту1Ва за будь-яким з пп. 1-7.

29. Спосіб за п. 28, де лускокрилою комахою є європейський кукурудзяний метелик, кукурудзяна південно-західна вогнівка, очеретяна вогнівка, бавовняна совка, соєва совка і гусениця оксамитових бобів.

Лоложення чазва сту Бомер бепнави Початок Кінець Довжина Співкадівня 5 Ідехйтичність

Вих. 1 Сгуївзі сАдаЗзиЗВ 1 ілеМ ТетВ ва 2 сгу1Вз32 САдЕЗООЗ 1 17225 Кв ва ї227у ща з сЕу1БаЗ ВАКеазлаБі 1 ї9558 12885 ва їв 5 4 сСкуїВай дАкаІ1п84 1 1228 Т288 ав 1527 а сСкуТїВа5 вого 1 т??8 Тех ва 15755 ї15ї Є сСкутВає Аптерагі 1 То 1258 а- 1220 З і сгутваї ї всапуркпеапеііпауворвзчпаітравківазісіаесвпідврегувавсепіпівохізу»звтріватіявтувті ії сСсуївай ока нют ва жим юю кю жит хв юю ж ку их кю кА Я КІ в як дж ся муж тя кт кютю яти м бсуїіваз Ж сдалалал титани т нина ут чіт ля вич для є ютт і ви чн т ій хі пами юіяткхх ії сСткуїВаї Її іаддюжтяутяєи юю ут уч юуєі талія ітд литих юю ті я ул імя да тій я дині га ї дкуїва5 Я зятя тю и юичєтютивс юс туєтчта т ююа нати юки ютєєвюоютй ві шунт ютвкихх і семіВає Її із юуюиу ючи світу ую ючих юри им юку жі тю кю юювююхя : сСсеуївВаї і уцеїкргутаонеіієртуєоіівоцісепаспевіакіддісязскаузавіейнівсптадаттгвттуєчуцаївікія І СкуїВа? Ві сдіуютннуєючтиннютиют тт тютюн учи вт т ти пет мужі ху жан век Ви тю ії Жкуїваз В. алея ихічяа ин уююютея ваті юка єю і яю жа а юю юка єть іх єчуюювя хвата Скухвая Бі учяігтеютіуйюінювюєєх и ююєа ау тя ні яю юю ка ютаакі не ють оті ку Ватні є сСкуїВа; Ві калина ті ююаюєч тютюн є ют я ит ті юю єю і юю ня і юю юю схуїває Ві дихати юю юю тт иєич тич ут тя юю ююєтює ян ючи уч ти ютьяя сСууїВві їі 1йвтшрієЄвіхкацесріїіштуацнеанміві1З р 1ітдавівозетоісзЧеілтууєкууєкигаузаувчскульвіпвікУє скуїВд? 151 дахах устя ми авт ут учяттіуху ня кт кажи юю міх тям чт тя мм тиха СеуїВаз Вбі упшуєиюкчуч иа кута ха жа тт ут кут юю у ви ху тю жують юки тт ти ул чих сСеу1ї1Вай ЇБі сіла уста ючи уча а хіти і дує юкутули ух юю талі єкта уча тю уча женієта них сууївВай Мбі повіті яхата сах шик лю єрує их друк ююеху ті ух т юхутуєююєюхти її тю юн сЕХІВБО 1Ббі успі ажаіли юка житій юттітихучітт жити т юю хіт іт тях тяж ат юю я чив юю житя «Вігура 1А сгуївВаї ВАЗ пазкиугулчккиїхтоУіа1твіїгрвуйсстуріпізачікслечукйаїідардуплаввохутілпараєзахзеаавії ЄСкуїва? Як дае зяюисвт ючи юки ютті юю ар яю и жюрі ри кі юю ую жжніюи ки скгуїваз ЗХ путі та інт ючи тя тією в я па жа ват й пі юю я юю тв юю ях бСкуувах ЯЗ. бука ює их юю вав й яю юю юю юю юю ж т юю юю юю в ке юю вик яю юю юю юю кв сгуїВах ТЯ уки ююююеюта тю юю т юю юю т юю я ж жк юю тя ям юю юю тя пеуівае 41 сю Фиат єкта ти ютхувююти а вва тт а тюки ета тихих сСтуїваї 321 зрвіїбЕ1)іецз1ісіЇзаззгчазтсрпосуксховпсісехріцзаі цЕвепуаспузіпрукіхізвІйсуксезувохтіу СекутвВаз ЗУ пккужкюнититі ххх юю визна Тк юю жує і ую ую ут юю ююєюю ти кім юю юю Сгуївай В піпетки ка жиє на юр ютуюєюни ти їжи юю ню тюки іти і яка на втіх пкуїва5 З1 сусла ють юю а аа вий юютю тала ва аю ютєієюют кт юю ють я тю ут ють ж юка ва тня я СтУуїВваАВ ЗБ сх ежювуютя юю юю юю юютайя юю юю ють кВ Я я я ЖК ЮК жи юю ж ля сю юки СтуїВаї ЗП1 іуїеріпоурсугтпсспраупівотусапувзуруевроїдікавеує1рреєстіетрпуєву звірі їі чауохури сху1 83 АТ соусу юта юю юю ит т ухвали ма вия уд юі жа юувад юха юю юі за вв тю сСкухВаз ОХ кукюниантиі юю хват єю ка кави ує ючи юка і ють» сгуївВай 4ЙТ у... хат ючи ню тя ля я тю т с зок юю віх я я вто є ття я аю рю вжиті є тиж СеухБас за ча по р и и а п а м п м а п а в р м м р м и сСкуївах. чв1 усУйнузайеЕвсідрпсіспіртукавеірчцувєтстова сі гтеріссторітстітпорійдкугідксуавії сСемівВа?. ЯВ1 уч кухихали ники т тай юю ж та китів ут й ви ет юю хни жук ви юю ті СкуїВай ЗБ ши ютканиитк т юю юю юю я уж а кв юю жає за юю жа юю юю я сеуївай АВТ фут тая яю юю іі тя тт тя т я т В я кл юю юю жу я кю тях Скухваб ДВЗ дуги цея хх тт ит я я тт тт дю юю жи юю в юю я дя я міри юю тв вві СгуїВаб 451 сукнях уча т юєюєєюєю тю т ух ють я вія юю ха ка юю жа юю нят юю скуївБах в1 укр вгчасеупа Хв) ссипвоеікудпеугтатткрігхцічаікковідаів5зпавтуї акіесірусаєте СкуїВаї Зі салат дата юю тт ють чн юю юю т т юн нт т я лювання Сеу1їВаЗ ЗБЕ ухил мні тт лют ню юю юю юю ки яд і юю ню каз аж ння У ую я іа вия СкуївВай ЗБ пункти юют титул юю юю юю кю юю ую юку я юю юю» пеУ1иай Я гідів жюююви жі юю юю вих аю юю юю а житі ює кий жк у жк СхкухВаб ЗО. заз єаюваниє витка живіт жтжюютєка нює юті вк юю виє ють кт ін юктяи ки «рігура 18.

Скуіваї 54їі асуйісгацеахнпа с ЖтпуприпіктстсоаупісйцУєпічасіваетсідектге і 1ізктукуаккаівзугпізаорпгеві.

Скуівай БЯ1 указати юю юю жає юю ую юю тяж ти юю кю жі юю кю юю ву юю Ску1вВаз БЖ мах ирти юю юююти й юю и юю и юю і ія юю юю я ж юю юю юю жати ня юю и юкя СеЕуївава, Бі сіухуччлича ат я яти юю а ючи тю ють ють кт кю юю я кл жа жит кт ка ююткя схуївай БАХ ууєнтен житт юю юю юю юю юю єю ючи я кжиж ж юю и тюках життю юю тюки сСгуївав ЕАХМ ух кт жюютчаяж юю єт юю юю юю юн яя ку ж т ли юю хат юю тя юю юю СкуїВаї 751 пкчраєївспеавпісвіпецдвейцісцвепісідеспаУуєкепутсірцетпесурсуіУудкіцевеїкаускуєі ау. свруїВа? ТЕХ суд юх іл ивк ті ювухєть кіт юка тити ючи миля і ван юухюіуикєютуюя стуїВаи ТЕХ бій юиюти чит ють вуючи юю кт і юю юю кн ні юю тю ж ють Ста УА мужик тю яю юю тю юю юю я тю юю я юю юю ху юю кю нх СкуїВаз ВХ екран ю єть ююют я чі вт юю юю а юю юю юю юю я вих я жена юка у клюють сСскфіває ВЗ реження юю юю юю жи же жави юю юя ючи ня ка ж же юю нютих яю ють секуваї вО1 їейзайтемуіісупакпврідйтрактевічрівзуеврідлодверпксворатаивразасаскічексацввпоївійівх Сгуї вад ВО саюхзухутти ана вити ут ютєютю чує юю ую юку хи чі Акцію ють тютюн Скутваз ВОК ігра шиун ат іі фялі ит юкічтйуя тучює ті ху аа ж ти єю ія ті юка і нію сСеуївай ЗОЇ слави жна жеюти жа иа юю юю юю уд вають ік юю я юю ютя я юю Стгухрай ВШ суха ника юю я юю юю юю юю тя юю ж кю жк я ж тю юю юю ж ня кю стгузвве ЯОХ ууссляя хатка юю юти ки тт і юю юн юю ж кю кт юю юю хх сСку1їВваї Ві сві пепідумуУучекікічЧеовпасізпіссієекоіїаватасукхаеккитоктекідієскитусаакедула1тїЕуй СкуївВай ВВ уз. .чнічиютта юю уя ті аю юю кажи муж юю вия вію юю яю юю ються Скуївай ВВ уюліюеажютив кит июитття ні уж жи утік юю юю жу аю тка кі так Скуївай ВВЕ улюняжиена ктів ква юті ит ти юю и юю и жі юю юю юю юхєя юні ютюйюхєтізиюкх Слуна»в ВВЕ ухчяжжетуя ти юю т жітті жу в юю є ж рю й юю тю ко я у пою коки юю жк жів юю ж Скуїкав ЗВ юка ка є ююютихі жит юю т тая тю я юю юн юю а яю я юю кт юю я скуїваї Зб ачуйетдайспіспінадакіснгігевуізоіруїсоупаеіЄвнієчрііїсбазві1іуйакпУтКкрааЕвпо1ссяпУко сСтуїБаєт ЯбЬ зт нти т тю пк в тт кни ж я вн кт мн ж яю Сгуїізя ЧЕ уиаиюлжт юка юю жа юю т юю юю юю я кіт т юю кит кат нти» сСскуїВаз ЗБЕ угжи кад й юютіа юті ут тає утиліт юю дулі ті віках гтін єкт сСтуївЗав ЗВ стилю раю юю рю юю юю юю тю яю жк юю кютюв юю ж ж й во кю юю ж юія тю кю юр юю я я я «Фігура 1Є скуїВаї 1041 нтазсазгпбВІВЗОВ1УіремевечузцчачкУсрусзуїїкУусаукедуєсацсспеїівпоавікЕКпреееетуру Ето скуїва? ЗХ сумних ха халати ли ти юю ух ють юю юю юю ни кож ти в вия ня юю ж юних стуїВаЗ ЇОД фоні аюнт ня юя та юююу ють на юю ит юю т тютюн кв т інт дж тю юних сСсхуівай ЗОМ зала юю юю юю жи ж жи ж ж я ик кю кю вн пхуївВа: 181 плакати жа хижі кажан тиви сСтгуївВай 104Х ссхухнякиюиєютє хтів юка века вна кі куютихи юю жають сСУуУхВаї 11751 паукапоадовосайасовгпвоувівуечасЕвзупуКосуваакукаугкопнсвучечухпуррураауксксізухр СеуїВаз ЇЩВУ пази юже єю юю іт тюки єя я важити нюх ві юю жі є ва хіх ююти тю єквжвячх сСеуївал ЗБ суха юю юю юю юю юю юю ж ж и юю ж и юю іх юю и ж в ках скутназ 11 суд юю юю юю т юю кю юю юю кутю юю ж юю юю юю я і юн жити тя тя я сСгуївай 1121 сг віях юна я жк юю я я А ж ух ія я я ях тя я сиеуїВн 1201 екдсомієїчЧецезкЕїчавУуЄ1ТІ Мово ситівай 1503 удача юю тю юю

Сьуюназ ОТ сук юююєхюяя юю юю юююх я скуївай 1201 ул юююю тю юхюютх лю скупа ТЛ шию жи юю тю кю ха юю

СхуїВає 150 зн киян ія й ужиютькяя

Фігура Ір

Положення Послідсавність початок Кінець Довжина сСцізвнпадиння. 5 співпадіння

Вих. СХ Стуїваї Х 1225 12278 аз і стуїВБЗ 1 1155 тах ад 5 З4 скуїваї 1 шесБаскпоєпеїі- -цаузппваскїрсактвозісіледпдіЯрЕеЕувавтусчісіпідокізаузатркваціяввух сруївез 1 ша. люуї:.-сору. сі; -сереуву дв хни тоеугрівівзівіЄатЬ. ай, дк мі се брспіраль Я стуїваї ТВ Жісуеікру конс іЕісноетііпаціїеозинЕаіакідахоавЕгауаавзеаніепкакиквтуєдутаха СкутвоЗ ва які. діж.ре.-в.. і. ожувік.. Чо. в.оБрТуді. айв. Ккеувайрспряівежсі. Расти -4 соеспіраль й ія Скчіваї їв закл ка гидеур ттобувдевпи т недавйкочь гдісвавіцтуувкуєткукаузйустекувтціляї СгУТАвЗ із велек. 1... ДУМ нив Мамо сх. Кбааї пвиолазеріїдп.Б.ба.ти» ко вЕХ Й Доменні р «Домен ії скуїнаї 238 кхуїпаазчукупоєкиаісіЧУуїй1УахЕреийссоупаіптвацієсетутанідатссупастпиупппарвівлієза СхкуїльЗ 2ХЗ шерівто дб гівіжевии ів нів |В: К.М їй іти рив, аа вЕро. ВО сто скуївах 8 зікврвітат1і831бігяаззгезпорамеукнтцвгізвгрісачіпсвсвчаепезійрує- ---зктазкаууктезу сеУТАвА 290 в. етув.цВМ. Упав денну, В. .д.щав.Х. Зоре. гріус. лу. варачкічазідшу.--- 41.8 пкуївВаї 334 зутУуї1хоіуіерін-зчроткгвЕорупізахотапу заруєзрчісі кааетезірозссеквпуєзуєнуї вісті Стуї ль Зв шеннняяїкт.їпі.зіпкодівеиіаЧосетаучевво їв ам юка. її: Чалти рад ж... МВЩЕ Скуїваї 472 зіднен-т- Б ЕКУВХрУуУувнквпгваксптізроигісціртукасвірчекттУкоравсзаЗмікхсвечогчрікУєчи СсЕУТАБЗ 437 квотсвиваху дала. і. ев і рзаиу. 1.8.5. и Киг ик з ВросівЕї. пі Фігура 3А б/в пЕУухнал ЗІЗ брієдкукісітуавсуйкагтУузкадееупп в гтігетзойеікуапЕчктаєсерестгоічайіттвічоізапце сСгуїлиЗ БЕ; ов. УК ПІ. і. жрі.щоуп.ва. в... Че. в.г у.....й. впав» їт1,8пУХпвап, Скудїваї 625 туїйкісіірусастозсуйіекаовахнаієсвеприЕвіккиуУсвувійцевпіоасіянексійекгеіікукуаке СсКЕУТАвнІ ЗУ ми Мама юка я МВВ тити ню я В юн тн нн я Кк сруїваї 705 ївйехарзайрпхЕзівкоараєівспецвпеесвіпезвепаиновенпісідецпйккопускірадеяїпесурту1уцкІ СтуіїідвІ ВИ шина юку дю стиля Ко ііі і хаб ня скузваї 785 осззеїікаускучікоуїінізцівіуїігулакректічУруєевікрізусвріссссперпгсаритехпруїідаозсгат СгуїдеЗ ТЗ ікси італ юю тя жави яю і Мая рію Вуух кит тютюн няня нти ж тенет шкуїВаї 65 зксзпизпБІЗіЧічУусОосЯівепісичУухЕкікКсеспахідвієвівекріїдваїатукуааккисоактекіцівЕк СрУуТАвЗ пси им и нин о ко с та п А п А стуїваві1 ЗЯ5 куусевкеауівісуєйссУуйкідЧааклістівйавакітпхігедуівеірчірчулавіївеїсзпіїкєвівууйалих пхУуївві 873 їм вуха й чит юєоєвії ит Ківі Вас Вісі вісі В. Ж: сЕуївВаї Ж025 хХлобслниціїсчпуквУаУц чав гватірсясевеувсахткусрасоуіїгУсаукесудадеикінніенньаати СкУїАвЗ ЗОЗ уки юви на жаняєк ЗОМЙЦ, см ме вач жа єю ви юна а вив юаі ют на тують юю юю скУуївгї 1104 Єкнгесеетууріососспауєан-- паці здсяадаспзгпадуєйвуєеногсавупукріувавесуєауггаписеуде свЕУТАеЗ 1038 уЕ.СМ и. яз ЦО М хи» я ДеВує,. ит енную., Ж. у: впавирай:ава,... Ка. их ДЗ, сЕуївВаї 1180 суупуррурасучскетеукреєйтовівідетезкр ів ас схуїдо Ії пеают.ї нки у Кука ні ую «Фігура 2