KR20130089147A - 옥수수 뿌리벌레 (디아브로티카 종)에서의 내성 발달 방지를 위한 Cry3Aa 및 Cry6Aa 단백질을 포함하는 조합물 - Google Patents

옥수수 뿌리벌레 (디아브로티카 종)에서의 내성 발달 방지를 위한 Cry3Aa 및 Cry6Aa 단백질을 포함하는 조합물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 Cry6Aa와 조합된 Cry3Aa에 관한 것이다. 본 발명은 놀랍게도 Cry3Aa와 Cry6Aa의 조합이 옥수수 뿌리벌레 (디아브로티카 종(Diabrotica spp.)) 집단에 의한 (단독의 살곤충성 단백질 시스템 중 하나에 대한) 내성 발달을 저해하는데에 유용하다는 발견에 관한 것이다. 옥수수 뿌리벌레 집단이 단독의 이들 살곤충성 단백질 시스템 중 하나에 대한 내성을 발달시킬 수 있다는 염려를 경감시키는데에 유용한 상기 살곤충성 Cry 단백질들을 생성하는 옥수수 식물이 본 발명에 포함된다. 이들 2종의 살곤충성 단백질 시스템을 생성하는 식물 (및 상기 식물이 재배되는 경작지)도 본 발명의 범주 내에 포함된다. 본 발명은 또한 부분적으로, Cry6Aa 단백질 또는 2원 Cry34/35 단백질과 같은 다른 살곤충성 단백질(들)과 "3중 스택" 또는 "다중 스택"을 형성하는 Cry3Aa 및 Cry6Aa 단백질의 조합에 관한 것이다. 따라서, 그러한 실시양태는 3가지 작용 방식으로 뿌리벌레를 표적화한다. cry6Aa 유전자 및 cry3Aa 유전자를 포함하는, 옥수수를 비롯한 유전자이식 식물이 본 발명의 범주내에 포함된다.

Description

옥수수 뿌리벌레 (디아브로티카 종)에서의 내성 발달 방지를 위한 Cry3Aa 및 Cry6Aa 단백질을 포함하는 조합물 {COMBINATIONS INCLUDING CRY3AA AND CRY6AA PROTEINS TO PREVENT DEVELOPMENT OF RESISTANCE IN CORN ROOTWORMS (DIABROTICA SPP.)}
인간은 식량용 및 에너지용으로 옥수수를 재배한다. 옥수수는 중요한 작물이다. 이는 세계 많은 지역에서 식량, 식료품 및 동물 사료의 중요한 공급원이다. 곤충은 식물을 먹어서 손상시킴으로써 이러한 인간의 수고를 훼손시킨다. 곤충 해충의 방제에 매년 수십억 달러가 지출되며 해충이 주는 피해 때문에 추가로 수십억 달러의 손해를 입고 있다.
화학적 살충제와 같은 보호 수단의 사용에도 불구하고, 곤충 해충에 의해 야기되는 피해는 세계 옥수수 작물의 손해에 있어서 주된 요인이다. 이러한 관점에서, 곤충 피해를 방제하고 전통적인 화학적 살충제에 대한 필요를 감소시키기 위해, 옥수수와 같은 작물에 유전 공학적으로 곤충 내성을 부여하고 있다.
해마다 천만 에이커가 넘는 미국 지역의 옥수수에 옥수수 뿌리벌레 종 복합체가 창궐하고 있다. 옥수수 뿌리벌레 종 복합체로는, 북부 옥수수 뿌리벌레 (디아브로티카 바르베리(Diabrotica barberi), 남부 옥수수 뿌리벌레 (디. 운데심펑크타타 호와르디(D. undecimpunctata howardi) 및 서양 옥수수 뿌리벌레 (디. 비르기페라 비르기페라(D. virgifera virgifera)를 들 수 있다. (다른 종으로는, 디아브로티카 비르기페라 제아에(Diabrotica virgifera zeae) (멕시코 옥수수 뿌리벌레), 디아브로티카 발테아타(Diabrotica balteata) (브라질 옥수수 뿌리벌레) 및 브라질 옥수수 뿌리벌레 복합체 (디아브로티카 비리둘라(Diabrotica viridula) 및 디아브로티카 스페시오사(Diabrotica speciosa)를 들 수 있다.)
이들 디아브로티카 종의 토양-서식 유충은 옥수수 식물의 뿌리를 먹기 때문에 거기에 기거한다. 기거는 결국 옥수수 수율을 감소시키며 때로는 식물을 죽게 한다. 딱정벌레 성충은 옥수수 수염을 먹음으로써 수분(pollination)을 감소시키기 때문에, 식물 당 옥수수의 수율에 악영향을 미친다. 또한, 디아브로티카 속의 성충 및 유충은 박과 작물 (오이, 멜론, 호박 등)과 많은 채소 및 농작물을 상업적 생산에서 뿐만 아니라 가정의 정원에서 자라는 것들까지 공격한다.
합성 유기 화학적 살곤충제가 곤충 해충의 방제에 사용되는 주요 수단이었지만, 생물학적 살곤충제, 예컨대 바실러스 투링기엔시스 (Bacillus thuringiensis) (Bt)로부터 유래된 살곤충 단백질도 일부 영역에서 중요한 역할을 해왔다. Bt 살곤충 단백질 유전자를 이용한 형질전환을 통해 곤충 내성 식물을 생산하는 능력은 현대 농업에 혁신을 가져왔고 살곤충 단백질 및 그의 유전자의 중요성과 가치를 높였다.
바실러스 투링기엔시스 (B.t.)의 일부 균주로부터의 살곤충 결정 단백질은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Hofte et al., Microbial Reviews, Vol. 53, No. 2, pp. 242-255 (1989)]을 참조한다. 이들 단백질은 전형적으로 박테리아에 의해 대략 130 kDa 프로톡신으로서 생성되고, 그 후 곤충에 의해 섭취된 후 곤충 중장에서 프로테아제에 의해 절단되어, 거의 60 kDa 코어 독소를 생성한다. 이들 단백질은, B.t.의 일부 균주에서는 포자와는 구별되는 결정성 함유물을 관찰할 수 있기 때문에 결정 단백질로 알려져 있다. 이들 결정성 함유물은 대개 수 종의 특유한 단백질로 구성된다.
유전자이식 곤충 내성 작물의 생산에 이용되고 있는 유전자의 한 군은 바실러스 투링기엔시스 (B.t.)로부터의 델타-엔도톡신이다. 델타-엔도톡신은 옥수수 뿐만 아니라 면화, 감자, 벼, 해바라기 등의 작물 식물에서 성공적으로 발현되었으며, 곤충 해충에 대한 우수한 방제를 제공하는 것으로 입증되었다. (문헌 [Perlak, F. J et al. (1990) Bio/Technology 8, 939-943]; [Perlak, F. J. et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22: 313-321]; [Fujimoto H. et al. (1993) Bio/Technology 11: 1151-1155]; [Tu et al. (2000) Nature Biotechnology 18: 1101-1104]; PCT 공개공보 제WO 01/13731호; 및 문헌 [Bing J W et al. (2000) Efficacy of Cry1F Transgenic Maize, 14th Biennial International Plant Resistance to Insects Workshop, Fort Collins, Colo.])
지금까지 성공적으로 등록되어 상업화된 곤충 내성 유전자이식 식물의 생산에 수 종의 Bt 단백질이 사용되고 있다. 여기에는 옥수수에서의 Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1F, Cry1A.105, Cry2Ab, Cry3Aa, Cry3Bb 및 Cry34/35Ab, 면화에서의 Cry1Ac 및 Cry2Ab, 및 감자에서의 Cry3A가 포함된다.
이들 단백질을 발현하는 상품은, 단백질 2종의 조합된 살곤충 스펙트럼이 바람직한 경우 (예를 들어, 각각 인시목 해충 및 뿌리벌레에 대한 내성을 제공하도록 조합된 옥수수에서의 Cry1Ab 및 Cry3Bb) 또는 단백질의 독립적인 작용으로 인해 그들 단백질이 감수성 곤충 개체군에서의 내성 발달을 지연시키는 수단으로서 유용하게 되는 경우 (예를 들어, 담배 나방에 대한 내성 관리를 제공하도록 조합된 면화에서의 Cry1Ac 및 Cry2Ab)를 제외하고는, 단일 단백질을 발현한다.
이러한 기술이 신속하게 널리 채택되도록 한 곤충 내성 유전자이식 식물의 특징 중 어떤 것은, 해충 개체군이 이들 식물에 의해 생성된 살곤충 단백질에 대한 내성을 발달시킬 것이라는 우려를 제기하기도 한다. 단백질을 피난처(refuge)와 조합으로 고농도로 이용하는 것, 및 상이한 독소와의 교호 이용 또는 동시 이용을 포함하는, Bt-기반 곤충 내성 형질의 유용성을 보존하기 위한 다수의 전략이 제안되었다 (문헌 [McGaughey et al. (1998), "B.t. Resistance Management," Nature Biotechnol. 16: 144-146]).
곤충 내성 관리 (IRM) 스택(stack)에 사용하기 위해 선택되는 단백질은, 하나의 단백질에 대해 발달된 내성이 제2의 단백질에 대해 내성을 부여하지 않도록 (즉, 단백질에 대한 교차 내성을 갖지 않도록) 작용해야 한다. 예를 들어, "단백질 A"에 대한 내성을 위해 선택된 해충 개체군이 "단백질 B"에 대해 감수성을 갖는다면, 교차 내성이 없고, 단백질 A와 단백질 B의 조합은 단독의 단백질 A에 대한 내성을 지연시키는 데 유효할 것이라는 결론에 이를 것이다.
내성 곤충 개체군이 없을 때에는, 교차 내성 잠재성과 관련될 것으로 추정되는 다른 특징을 토대로 평가할 수 있다. 교차 내성을 나타내지 않을 것으로 예상되는 살곤충 단백질의 동정에 수용체 매개성 결합을 이용하는 것이 제안되었다 (van Mellaert et al. 1999). 이러한 접근법에 고유한 교차 내성 결여에 대한 핵심 예측변수는, 살곤충 단백질이 감수성 곤충 종에서 수용체에 대해 경쟁하지 않는 것이다.
2종의 Bt 독소가 동일한 수용체에 대해 경쟁하는 경우, 그 곤충에서 그 수용체가 돌연변이되어서, 독소 중 하나가 그 수용체에 더 이상 결합하지 않아 더 이상 그 곤충에 대해 살곤충성을 나타내지 않는다면, 그 곤충은 (동일한 수용체에 경쟁적으로 결합한) 제2의 독소에 대해서도 내성을 갖게 되는 경우일 것이다. 즉, 곤충은 Bt 독소 양자 모두에 대해 교차 내성이라고 한다. 그러나, 2종의 독소가 2개의 상이한 수용체에 결합한다면, 이는 곤충이 그 2종의 독소에 대해 동시에 내성을 갖지는 않을 것임을 의미할 수 있다.
WO 97/40162에 개시된 바와 같이, 상대적으로 새로운 살곤충 단백질 시스템이 바실러스 투링기엔시스에서 발견되었다. 이 시스템은, 2종의 단백질을 포함하는데, 그 중 하나는 대략 14-15 kDa이고, 다른 하나는 약 44-45 kDa이다. 또한, 미국 특허 제6,083,499호 및 동 제6,127,180호를 참조한다. 이들 단백질은 현재 그 자체의 과로 지정되어 있고, 그에 따라 각각 Cry34 및 Cry35의 Cry 명칭을 부여받았다. 크릭모어(Crickmore) 등의 웹사이트 (biols.susx.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)를 참조한다. 현재 이러한 유형의 시스템의 다른 관련 단백질이 상당수 개시되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,372,480호; WO 01/14417; 및 WO 00/66742를 참조한다. 또한, 이러한 단백질을 코딩하는 식물-최적화 유전자 (상기 유전자를 조작하여 식물에서의 최적 발현을 위한 코돈을 이용함)가 개시되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,218,188호를 참조한다.
Cry34/35 시스템의 정확한 작용 방식은 아직 결정되어 있지 않지만, 곤충 장 세포의 막에 기공을 형성하는 것으로 보인다. 예를 들어, 문헌 [Moellenbeck et al., Nature Biotechnology, vol. 19, p. 668 (July 2001)]; [Masson et al., Biochemistry, 43 (12349-12357) (2004)]을 참조한다. Cry34 및 Cry35 단백질에 대해 알려진 3D 원자 좌표 및 결정 구조에도 불구하고, 정확한 작용 메커니즘은 여전히 불명확하다. 미국 특허 제7,524,810호 및 동 제7,309,785호를 참조한다. 예를 들어, 이들 단백질 중 하나 또는 양자 모두가 알칼리성 포스파타제 또는 아미노펩티다제와 같은 전형적인 유형의 수용체에 결합할지는 불명확하다.
더욱이, 곤충이 Cry 단백질에 대한 내성을 발달시킬 수 있는 메커니즘은 여러가지가 있기 때문에 (예를 들어, 수용체의 변경된 글리코실화에 의해 (문헌 [Jurat-Fuentes et al. (2002) 68 AEM 5711-5717] 참조), 수용체 단백질의 제거에 의해 (문헌 [Lee et al. (1995) 61 AEM 3836-3842] 참조), 수용체의 돌연변이 또는 다른 메커니즘에 의해 (문헌 [Heckel et al., J. Inv. Pathol. 95 (2007) 192-197] 참조), Cry34/35 및 다른 Cry 단백질 사이에 교차 내성이 있을 것인지 여부를 선험적으로 예측하는 것은 불가능하였다. 레프코 (Lefko) 등은 뿌리벌레에서의 복합 내성 현상을 논의하였다 [J. Appl. Entomol. 132 (2008) 189-204].
Cry34/35 시스템에 대한 경쟁적 결합을 예측하는 것은, 또한 2종의 단백질이 Cry34/35 2원 시스템에 관여한다는 사실 때문에 더욱 복잡해진다. 즉, 이들 단백질이 곤충 장/장 세포에 유효하게 결합하는지 여부와 그 방법, 및 이들이 서로 상호작용 또는 결합하는지 여부와 그 방법은 불명확하다.
딱정벌레목의 방제를 위한 다른 선택안으로는, Cry3Bb 독소, Cry3C, Cry6B, ET29, ET33과 ET34, TIC407, TIC435, TIC417, TIC901, TIC1201, ET29와 TIC810, ET70, ET76과 ET80, TIC851 등을 들 수 있다. 또한, RNAi 접근법이 제안되었다. 예를 들어, 문헌 [Baum et al., Nature Biotechnology, vol. 25, no. 11 (Nov. 2007) pp. 1322-1326]을 참조한다.
마이흘스(Meihls) 등은 옥수수 뿌리벌레에서의 내성 관리를 위한 피난처의 사용을 제안하였다 [PNAS (2008) vol. 105, no. 49, 19177-19182].
간단한 요약
본 발명은 부분적으로, Cry6Aa와 조합된 Cry3Aa에 관한 것이다. 본 발명은 부분적으로, Cry3Aa와 Cry6Aa가 옥수수 뿌리벌레 (디아브로티카 종) 개체군에 의한 (단독의 살곤충 단백질 시스템 중 어느 하나에 대한) 내성의 발달을 방지하는 데 유용하다는 놀라운 발견에 관한 것이다. 당업자라면, 이들 살곤충 Cry 단백질을 생성하는 식물이, 옥수수 뿌리벌레 개체군이 이들 단독의 살곤충 단백질 시스템 중 어느 하나에 대한 내성을 발달시킬 수 있을 것이라는 우려를 경감시키는 데 유용할 것이라는 본 개시내용의 이점을 인식할 것이다.
본 발명은 부분적으로, 이들 Cry 단백질 시스템의 성분이 옥수수 뿌리벌레 장 수용체의 결합에 대해 서로 경쟁하지 않는다는 발견에 의해 지지된다.
또한, 본 발명은 부분적으로, Cry3Aa와 Cry6Aa가 염기쌍을 이루는 3종 (또는 그 이상)의 독소 시스템의 3중 스택 또는 "피라미드"에 관한 것이다. 따라서, 이들 2종의 살곤충 단백질 시스템을 생성하는 식물 (및 이러한 식물이 재배되는 경작지)도 본 발명의 범주 내에 포함된다.
도 1. 서양 옥수수 뿌리벌레 유충으로부터 제작된 BBMV에 대한 방사성표지된 Cry 독소 투입량의 함수로서 125I-Cry3Aa (도 1A)와 125I-Cry6Aa1 (전장) (도 1B)의 결합. 특이적 결합 = 총 결합 ― 비-특이적 결합, 오차 구간 = SEM (평균의 표준 오차).
도 2. 서양 옥수수 뿌리벌레 유충으로부터 제작된 BBMV에 대한 여러가지 농도의 비표지화 경쟁자에서의 125I-Cry3Aa의 결합 (log 0.1 = -0.1, log 10 = 1.0, log 100 = 2.0, log 1000 = 3.0).
서열의 간단한 설명
서열 1: 전장 Cry3Aa 단백질 서열
서열 2: Cry3Aa 트립신 코어 단백질 서열
서열 3: 전장 Cry6Aa1 단백질 서열
Cry3Aa 및 Cry6Aa 단백질에 대한 서열은, 크릭모어 등의 웹사이트 (lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/ Bt/intro.html)에 일람된 바실러스 투링기엔시스 단리체로부터 수득가능하다.
본 발명은, 이들 단독의 Cry 단백질 시스템 (다른 것이 없음) 중 어느 하나에 대한 내성을 발달시킬 수 있는 옥수수 뿌리벌레 개체군에 의한 옥수수 뿌리벌레 섭식에 의해 야기되는 피해와 수율 손실로부터 옥수수를 보호하기 위한, Cry6Aa 독소와 조합된 Cry3Aa 살곤충 단백질의 사용을 포함한다.
따라서, 본 발명은 옥수수 뿌리벌레에 의한 Cry6Aa 및/또는 Cry3Aa에 대한 내성의 발달을 방지하는 곤충 내성 관리 (IRM) 스택을 교시한다.
본 발명은 Cry6Aa 살곤충성 단백질 및 Cry3Aa 살곤충성 단백질을 생성하는 세포를 포함하는, 뿌리벌레 해충의 방제용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 Cry6Aa 단백질 및 Cry3Aa 살곤충성 단백질 양자 모두를 생성하도록 형질전환된 숙주를 포함하며, 상기 숙주는 미생물 또는 식물 세포이다.
본 발명은 뿌리벌레 해충 또는 상기 해충의 환경을, Cry6Aa 단백질을 함유하고 Cry3Aa 살곤충성 단백질을 추가로 함유하는 조성물의 유효량과 접촉시키는 것을 포함하는, 뿌리벌레 해충의 방제 방법을 제공하는 것을 추가로 의도한다.
본 발명의 일 실시양태는 Cry3Aa 살곤충성 단백질을 코딩하는 식물-발현성 유전자 및 Cry6Aa 단백질을 코딩하는 식물-발현성 유전자를 포함하는 메이즈(maize) 식물, 및 이러한 식물의 종자를 포함한다.
본 발명의 추가의 실시양태는 Cry3Aa 살곤충성 단백질을 코딩하는 식물-발현성 유전자 및 Cry6Aa 단백질을 코딩하는 식물-발현성 유전자가 이입된 메이즈 식물, 및 이러한 식물의 종자를 포함한다.
실시예에 기재된 바와 같이, 방사성표지된 Cry3Aa 코어 독소 단백질을 사용한 경쟁적 수용체 결합 연구는, Cry6Aa 코어 독소 단백질이, Cry3Aa가 결합하는 CRW 곤충 조직 샘플에서의 결합에 대해 경쟁하지 않음을 나타낸다. 도 2를 참조한다. 이들 결과는, Cry6Aa와 Cry3Aa 단백질의 조합이 CRW 개체군에서 단독의 단백질 시스템 중 어느 하나에 대한 내성의 발달을 경감시키는 데 유효한 수단임을 나타낸다.
즉, 상기 및 본원의 다른 부분에 기재된 데이터에 부분적으로 근거하여, Cry3Aa 및 Cry6Aa 단백질을 사용하여, CRW에 의한 내성 발달의 방지 또는 경감용 IRM 조성물을 제조할 수 있다. 이 조성물에는 예를 들어 곤충-방제 스펙트럼을 확장시키기 위해 다른 단백질이 첨가될 수 있다. 또한, 해당 조합은, Cry3Ba 또는 2원 Cry34/35 단백질과 같은 뿌리벌레 방제용의 또다른 단백질과 조합으로 일부 바람직한 "3중 스택" 또는 "피라미드"에 사용될 수 있다. 따라서, 그러한 추가의 조합은 뿌리벌레에 대해 다중 작용 방식을 제공할 것이다. 뿌리벌레에 대한 RNAi는 다른 추가의 선택안이다. 예를 들어, 문헌 [Baum et al., Nature Biotechnology, vol. 25, no. 11 (Nov. 2007) pp. 1322-1326]을 참조한다.
Cry34Ab/35Ab와 Cry3Aa 단백질의 조합에 관한 USSN 61/327,240 (2010년 4월 23일에 출원됨), Cry34Ab/35Ab와 Cry6Aa 단백질의 조합에 관한 USSN 61/388,273 (2010년 9월 30일에 출원됨), 및 Cry34Ab/35Ab와 Cry3Ba 단백질의 조합에 관한 USSN 61/476,005 (2011년 4월 15일에 출원됨)의 개시내용의 관점에서, 본 발명의 일부 바람직한 "3중 스택" 또는 "다중 작용 방식 스택"은, Cry3Aa 단백질과 조합된 Cry6Aa 단백질을 Cry3Ba 단백질 또는 2원 Cry34/35 단백질과 함께 포함한다. cry6Aa 유전자 및 cry3Aa 유전자 (임의로는 제3 또는 제4의 독소 시스템, 예를 들어, Cry3B 및/또는 Cry34/35)를 포함하는 옥수수를 비롯한 유전자이식 식물은 본 발명의 범주 내에 포함된다. 따라서, 이러한 실시양태는 적어도 3가지 작용 방식으로 곤충을 표적화한다.
본 발명의 이용 선택안은 디아브로티카 종이 문제되는 옥수수 재배 지역에 Cry6Aa 및 Cry3Aa 단백질을 사용하는 것을 포함한다. 또다른 이용 선택안은 Cry6Aa 및 Cry3Aa 단백질 중 하나 또는 양자 모두를 다른 형질과 조합으로 사용하는 것이 될 것이다.
당업자는 Cry6Aa 및 Cry3Aa와 같은 특정 과 내에서도 Bt 독소는 어느 정도 다양할 수 있음을 이해할 것이다.
유전자 및 독소. 용어 "단리된"은 비-자연적으로 발생한 작제물로의 폴리뉴클레오티드, 또는 정제되거나 아니면 비-자연적으로 발생한 상태로의 단백질을 말한다. 본 발명에 따라 유용한 유전자 및 독소에는, 개시된 전장 서열 뿐만 아니라, 본원에서 구체적으로 예시된 독소의 특징적인 살해충 활성을 보유하는 이들 서열의 단편, 변이체, 돌연변이체 및 융합 단백질도 포함된다. 본원에서 사용된 용어 유전자의 "변이체" 또는 "변이물"은 동일한 독소를 코딩하거나 또는 살해충 활성을 갖는 등가의 독소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 말한다. 본원에서 사용된 용어 "등가의 독소"는 표적 해충에 대해 청구된 독소와 동일한 또는 본질적으로 동일한 생물학적 활성을 갖는 독소를 말한다. 이는 본 발명에 따른 3중/다중 스택에 사용될 경우 Cry3B 및 Cry34/35에도 동일하게 적용된다. 예를 들어, 이들 단백질의 도메인/서브도메인을 교환하여 키메라 단백질을 제조할 수 있다. 예를 들어, Cry34/35 단백질에 대해서는, 미국 특허 제7,309,785호 및 동 제7,524,810호를 참조한다. 미국 특허 제7,309,785호에는 또한 말단절단된 Cry35 단백질이 교시되어 있다. 말단절단된 독소는 본원에도 예시되어 있다.
본원에서 사용된 경계선은 문헌 ["Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins," N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, and D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol 62: 807-813]에 따라, 대략 95％ (Cry6Aa 및 Cry3Aa), 78％ (Cry6A 및 Cry3A), 및 45％ (Cry6 및 Cry3)의 서열 동일성을 나타낸다. 본 발명에 따라 예를 들어 3중/다중 스택이 사용되는 경우에는, Cry3B 및 Cry34/35 (예를 들어, Cry34Ab/Cry35Ab)에도 동일하게 적용된다.
활성 독소를 코딩하는 유전자가 다수의 수단을 통해 동정 및 수득가능하다는 점은 당업자에게 자명할 것이다. 본원에서 예시된 특정 유전자 또는 유전자 부분은 배양물 기탁소에 기탁된 단리체로부터 수득할 수 있다. 이들 유전자, 또는 이들의 부분 또는 변이체는 또한, 예를 들어 유전자 합성장치를 사용하여 인공적으로 작제할 수 있다. 유전자의 변이물은 점돌연변이를 일으키는 표준 기법을 사용하여 용이하게 작제할 수 있다. 또한, 이들 유전자의 단편은 표준 절차에 따라 시판 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제를 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, Bal31과 같은 효소 또는 부위-지정 돌연변이유발법을 이용하여 이들 유전자의 말단부로부터 뉴클레오티드를 체계적으로 절단할 수 있다. 또한, 활성 단편을 코딩하는 유전자는 다양한 제한 효소를 사용하여 수득할 수 있다. 프로테아제를 사용하여 이들 단백질 독소의 활성 단편을 직접적으로 수득할 수 있다.
예시된 독소의 살해충 활성을 보유하는 단편 및 등가물은 본 발명의 범주내에 있을 것이다. 또한, 유전 암호의 중복성 때문에, 여러가지의 다양한 DNA 서열이 본원에 개시된 아미노산 서열을 코딩할 수 있다. 동일한 또는 본질적으로 동일한 독소를 코딩하는 이러한 대체 DNA 서열을 생성하는 것은 당업계 숙련인의 기술 내에서 충분히 가능하다. 이들 변이체 DNA 서열은 본 발명의 범주내에 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "본질적으로 동일한" 서열을 언급할 때는 살해충 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 아미노산 치환, 결실, 부가 또는 삽입이 일어난 서열을 말한다. 살해충 활성을 보유하는 단백질을 코딩하는 유전자의 단편도 상기 정의에 포함된다.
본 발명에 따라 유용한 독소를 코딩하는 유전자 및 유전자 부분을 동정하는 추가의 방법은 올리고뉴클레오티드 프로브의 사용을 통해서이다. 이들 프로브는 검출가능한 뉴클레오티드 서열이다. 이들 서열은 국제 출원 제WO 93/16094호에 개시된 바와 같이 적절한 표지에 의해 검출가능하거나 또는 고유의 형광을 나타낼 수 있다. 당업계에 널리 공지된 바와 같이, 프로브 분자와 핵산 샘플이 두 분자 사이에 강력한 결합을 형성함으로써 혼성화된다면, 프로브와 샘플은 실질적인 상동성을 갖는 것으로 합리적으로 추정할 수 있다. 바람직하게는, 혼성화는 예를 들어 문헌 [Keller, G.H., M.M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., pp. 169-170]에 기재된 바와 같이 당업계에 널리 공지된 기법에 의해 엄격한 조건하에 수행된다. 염 농도 및 온도 조합의 일부 예는 하기와 같다 (엄격함이 증가하는 순서): 2X SSPE 또는 SSC, 및 실온; 1X SSPE 또는 SSC, 및 42℃; 0.1X SSPE 또는 SSC, 및 42℃; 0.1X SSPE 또는 SSC, 및 65℃. 프로브의 검출은 혼성화가 일어났는지를 공지된 방식으로 결정하기 위한 수단을 제공한다. 이러한 프로브 분석은 본 발명의 독소-코딩 유전자의 신속한 동정 방법을 제공한다. 본 발명에 따라 프로브로서 사용되는 뉴클레오티드 절편은 DNA 합성장치 및 표준 절차를 사용하여 합성할 수 있다. 이들 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 유전자를 증폭시키는 PCR 프라이머로서도 사용될 수 있다.
변이체 독소. 본 발명의 특정한 독소는 본원에서 구체적으로 예시되었다. 이들 독소는 단지 본 발명의 독소의 예시일 뿐이므로, 본 발명은 예시된 독소의 동일한 또는 유사한 살해충 활성을 갖는 변이체 또는 등가의 독소 (및 등가의 독소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열)를 포함함은 자명할 것이다. 등가의 독소는 예시된 독소와 아미노산 상동성을 가질 것이다. 이러한 아미노산 상동성은 일부 실시양태에서 통상적으로 75％를 초과, 바람직하게는 85％를 초과, 바람직하게는 90％를 초과, 바람직하게는 95％를 초과, 바람직하게는 96％를 초과, 바람직하게는 97％를 초과, 바람직하게는 98％를 초과, 바람직하게는 99％를 초과할 것이다. 아미노산 상동성은 생물학적 활성을 설명해주거나 또는 궁극적으로 생물학적 활성을 좌우하는 3차원 구조의 결정과 관련있는 독소의 주요 영역에서 최고일 것이다. 이와 관련하여, 아미노산 치환이 활성에 중요하지 않는 영역에서 일어나거나 분자의 3차원 구조에 영향을 미치지 않는 보존적 아미노산 치환이라면 이러한 특정 아미노산 치환은 허용되고 예측될 수 있다. 예를 들어, 아미노산은 하기 부류에 속할 수 있다: 비극성, 비하전 극성, 염기성 및 산성. 한 부류의 아미노산이 동일한 유형의 또 다른 아미노산으로 대체되는 보존적 치환은, 치환이 화합물의 생물학적 활성을 실질적으로 변화시키지 않는 한 본 발명의 범주내에 포함된다. 표 1은 각각의 부류에 속하는 아미노산의 예의 일람을 제공한다.
Figure pct00001
일부 예에서, 비보존적 치환 또한 있을 수 있다. 중요한 점은 이들 치환이 독소의 생물학적 활성을 유의하게 손상시켜서는 안 된다는 사실이다.
재조합 숙주. 본 발명의 독소를 코딩하는 유전자는 광범위한 미생물 또는 식물 숙주로 도입될 수 있다. 독소 유전자의 발현은, 직접적으로 또는 간접적으로, 살해충제의 세포내 생성 및 유지를 초래한다. 접합 전달 및 재조합 전달이 본 발명의 두 독소를 모두 발현하는 Bt 균주를 생성하는 데에 사용될 수 있다. 기타 숙주 유기체 또한 독소 유전자 중 하나 또는 둘 모두로 형질전환된 후에 사용되어 상승 효과를 달성할 수 있다. 적합한 미생물 숙주, 예를 들어 슈도모나스(Pseudomonas)에 의해, 미생물은 해충의 위치에 적용될 수 있고, 여기서 이들은 증식하고 섭취될 것이다. 그 결과는 해충의 방제이다. 별법으로, 독소 유전자의 숙주인 미생물은 독소의 활성을 연장시키고 세포를 안정화하는 조건 하에서 처리될 수 있다. 그 후에, 독성 활성을 보유하는 처리된 세포는 표적 해충의 환경에 적용될 수 있다. 본 발명의 식물(본 발명의 IRM 유전자 중 하나 이상을 포함함)로부터의 비재생성/비전능성 식물 세포는 본 발명 내에 포함된다.
식물 형질전환. 본 발명의 바람직한 실시양태는 본 발명의 살곤충 단백질 또는 그의 변형체를 코딩하는 유전자로 식물의 형질전환이다. 형질전환된 식물은 형질전환된 식물의 세포에서 본 발명의 살곤충 단백질 또는 그의 변형체의 방제량의 존재에 의해 목표 곤충 해충에 의한 공격에 대해 내성이 있다. B.t. 살곤충 독소의 살곤충 특성을 코딩하는 유전 물질을 특정 곤충 해충에 의해 섭취된 식물의 게놈에 도입함으로써, 성충 또는 유충은 먹이 식물을 소비한 후 사망할 것이다. 단자엽 식물 및 쌍자엽 식물 부류의 다수 개체가 형질전환되었다. 유전자이식 작물학적 곡물 뿐만 아니라 과일 및 채소도 상업적으로 중요하다. 이러한 곡물은 메이즈(maize), 벼, 대두, 카놀라, 해바라기, 알팔파, 수수, 밀, 목화, 땅콩, 토마토, 감자 등을 포함하되, 이에 제한되지는 않는다. 외래 유전 물질을 식물 세포에 도입하고, 도입된 유전자를 안정하게 유지하고 발현시키는 식물을 얻기 위한 다수의 기술이 존재한다. 이러한 기술은 미립자 상에 코팅된 유전 물질의 세포에 직접 가속하는 것을 포함한다 (미국 특허 제4945050호 및 미국 특허 제5141131호 참조). 식물은 아그로박테리움 기술을 사용하여 형질전환될 수 있다. 미국 특허 제5177010호, 동 제5104310호, 유럽 특허 출원 제0131624B1호, 동 제120516호, 동 제159418B1호, 동 제176112호, 미국 특허 제5149645호, 동 제5469976, 동 제5464763호, 동 제4940838호, 동 제4693976호, 유럽 특허 출원 제116718호, 동 제290799호, 동 제320500호, 동 제604662호, 동 제627752호, 동 제0267159호, 동 제0292435호, 미국 특허 제5231019호, 동 제5463174호, 동 제4762785호, 동 제5004863호 및 동 제5159135호를 참조한다. 다른 형질전환 기술은 WHISKERS™ 기술을 포함한다. 미국 특허 제5302523호 및 동 제5464765호를 참조한다. 전기천공 기술이 또한 식물을 형질전환하기 위해 사용될 수 있다. WO 87/06614호, 미국 특허 제5472869호, 동 제5384253호, WO 9209696호 및 WO 9321335호를 참조한다. 이들 형질전환 특허 및 공보는 모두 참조로 삽입된다. 식물을 형질전환시키기 위한 다수의 기술 이외에, 외래 유전자와 접촉된 조직 유형이 또한 변할 수 있다. 이러한 조직은 배아 조직, 캘러스 유형 I 및 II, 배축(hypocotyl), 분열 조직 등을 포함할 것이지만, 이에 제한되지는 않는다. 거의 모든 식물 조직은 당업자 기술 내에서 적절한 기술을 사용하여 탈분화 동안 형질전환될 수 있다.
본 발명의 임의의 독소를 코딩하는 유전자는 상기한 바와 같이 당업계에 널리 공지된 다양한 기법을 사용하여 식물 세포에 삽입될 수 있다. 예를 들어, 대장균(Escherichia coli)에서 기능하는 복제 시스템 및 형질전환된 미생물 세포의 선택을 허용하는 마커(marker)를 포함하는 다수의 클로닝 벡터가 고등 식물로 삽입을 위한 외래 유전자의 준비 및 개질에 이용가능하다. 이러한 조작은 예를 들어 의도하는 용도에 따라 돌연변이의 삽입, 말단절단, 첨가 또는 치환을 포함할 수 있다. 벡터는 예를 들어, pBR322, pUC 시리즈, M13mp 시리즈, pACYC184 등을 포함한다. 따라서, Cry 단백질 또는 변형체를 코딩하는 서열을 적합한 제한 부위에서 벡터에 삽입할 수 있다. 생성된 플라스미드는 대장균 세포의 형질전환을 위해 사용되고, 이러한 대장균 세포는 적합한 영양 배지에서 배양한 후에, 수거하고 용해시켜 작업가능한 양의 플라스미드를 회수한다. 서열 분석, 제한단편 분석, 전기영동, 및 기타 생화학-분자 생물학적 방법이 일반적으로 분석 방법으로서 수행된다. 각각의 조작 후에, 사용된 DNA 서열을 절단하고 그 다음 DNA 서열에 연결할 수 있다. 각각의 조작된 DNA 서열을 동일한 또는 다른 플라스미드에서 클로닝할 수 있다.
식물 세포의 형질전환을 위해 T-DNA 함유 백터를 사용하는 것은 광범위하게 연구되어 왔고 EP 120516호; 리(Lee) 및 겔빈(Gelvin) (2008), 프랄리(Fraley) 등 (1986), 및 안(An) 등 (1985)에 의해 충분히 개시되었고, 또한 당업계에서 잘 확립되어 있다.
삽입된 DNA가 식물 게놈에 통합되면, 이것은 후속 세대에 걸쳐 비교적 안정하다. 식물 세포를 형질전환하기 위해 사용되는 벡터는 보통 형질전환된 식물 세포에 제초제 또는 항생제, 예컨대 특히 비아라포스(bialaphos), 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(bleomycin), 또는 하이그로마이신(hygromycin)에 대한 내성을 부여하는 단백질을 코딩하는 선택가능한 마커 유전자를 함유한다. 따라서 개별적으로 사용되는 선택가능한 마커 유전자는 삽입된 DNA를 함유하지 않는 세포의 성장이 선택적인 화합물에 의해 억제되는 동안 형질전환된 세포의 선택을 허용해야 한다.
DNA를 숙주 식물 세포로 삽입하기 위한 다수의 기법이 이용가능하다. 이러한 기법에는 형질전환제로서 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 또는 아그로박테리움 리조제네스(Agrobacterium rhizogenes)에 의해 전달되는 T-DNA에 의한 형질전환을 들 수 있다. 또한, 전달되는 DNA를 함유한 리포솜과 식물 원형질체의 융합, DNA의 직접 주입, 유전자총 (biolistics) 형질전환(미립자 충격), 또는 전기천공뿐만 아니라, 기타 가능한 방법이 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 식물은 유전자로 형질전환될 것이고, 여기서 단백질 코딩 영역의 코돈 사용은 식물에 대하여 최적화된다. 예를 들어, 본원에 참조로 삽입되는 미국 특허 제5380831호를 참조한다. 또한, 유리하게는 말단절단된 독소를 코딩하는 식물이 사용될 것이다. 말단절단된 독소는 전형적으로 전장 독소의 약 55％ 내지 약 80％를 코딩할 것이다. 식물에 사용하기 위한 합성 B.t. 유전자의 생산 방법은 당업계에 공지되어 있다 (Stewart, 2007).
형질전환 기술에도 불구하고, 유전자는 바람직하게는 벡터 내에 식물 프로모터를 포함함으로써 식물 세포에서 B.t. 살곤충 독소 유전자 및 변이체를 발현시키도록 구성된 유전자 전달 벡터에 도입된다. 식물 프로모터 이외에, 다양한 공급원으로부터의 프로모터가 외래 유전자를 발현시키기 위해 효과적으로 식물 세포 내에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 박테리아 기원의 프로모터, 예를 들어 옥토파인 신타아제 프로모터, 노팔린 신타아제 프로모터 및 만노파인 신타아제 프로모터를 사용할 수 있다. 비-바실러스-투링기엔시스 프로모터가 일부 바람직한 실시양태에서 사용될 수 있다. 식물 바이러스 기원의 프로모터, 예를 들어 콜리플라워 모자이크 바이러스로부터의 35S 및 19S 프로모터, 카사바 잎맥 모자이크 바이러스로부터의 프로모터 등이 사용될 수 있다. 식물 프로모터는 리불로오스-1,6-비스포스페이트(RUBP) 카르복실라아제 소단위체(small subunit, ssu), 베타-콘글리시닌 프로모터, 파세올린 프로모터, ADH(알코올 탈수소 효소) 프로모터, 열-충격(heat-shock) 프로모터, ADF(액틴 해중합 인자) 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, 액틴 프로모터 및 조직 특이적 프로모터를 포함하되, 이에 제한되지는 않는다. 프로모터는 또한 전사 효율을 향상시킬 수 있는 특정 인핸서 서열 요소를 함유할 수 있다. 전형적인 인핸서는 ADH1-인트론 1 및 ADH1-인트론 6을 포함하되, 이에 제한되지는 않는다. 전신발현 프로모터(constitutive promoter)가 사용될 수 있다. 전신발현 프로모터는 거의 모든 세포 유형에서 거의 항상 연속적인 유전자 발현을 안내한다 (예를 들어, 액틴, 유비퀴딘, CaMV 35S). 조직 특이적 프로모터는 특이적 세포 또는 조직 유형, 예를 들어 잎 또는 종자(예를 들어, 제인, 올레오신, 나핀, ACP(아실 캐리어 단백질) 프로모터)에서 유전자 발현을 책임지고, 이들 프로모터들도 또한 사용될 수 있다. 또한, 식물의 생장의 특정 단계 동안 활성일 뿐만 아니라 특이적 식물 조직 및 기관에서 활성인 프로모터도 사용될 수 있다. 이러한 프로모터의 예로는 뿌리 특이적, 화분 특이적, 배아 특이적, 옥수수 수염 특이적, 면섬유(cotton fiber) 특이적, 종자 내배유(seed endosperm) 특이적, 체관부 특이적인 프로모터를 들 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
특정 환경 하에서, 유도성 프로모터를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 유도성 프로모터는 특정 신호, 예를 들어 물리적 자극(예를 들어 열 충격 유전자); 광(예를 들어 RUBP 카르복실라아제); 호르몬(예를 들어 글루코코르티코이드); 항생물질(예를 들어, 테트라시클린); 대사물질; 및 스트레스(예를 들어 가뭄)에 대응하여 유전자의 발현을 책임진다. 식물에서 기능하는 다른 바람직한 전사 및 번역 요소, 예를 들어 5'-미번역 선도 서열, RNA 전사 종결 서열 및 폴리-아데닐레이트 부가 신호 서열이 사용될 수 있다. 다수의 식물 특이적 유전자 전달 벡터가 당업계에 공지되어 있다.
내곤충성(IR) 형질을 함유한 유전자이식 곡물은 북미 전역에 걸쳐 옥수수 및 면화 식물에서 일반적이고, 이들 형질의 사용은 전세계적으로 확장되고 있다. IR과 살충제 내성(HT) 형질을 조합한 상업적인 유전자이식 곡물이 다수의 종자 회사에서 개발되었다. 이들은 B.t. 살곤충 단백질에 의해 부여된 IR 형질과 HT 형질, 예를 들어 아세토락테이트 신타아제(ALS) 억제제, 예를 들어 술포닐우레아, 이미다졸리논, 트리아졸로피리미딘, 술폰아닐리드 등, 글루타민 합성 효소(GS) 억제제, 예를 들어 비알라포스, 글루포시네이트 등, 4-히드록시페닐피루베이트 디옥시게나아제(HPPD) 억제제, 예를 들어 메소트리온, 이속사플루톨 등, 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타아제(EPSPS) 억제제, 예를 들어 글리포세이트 등, 및 아세틸 보조효소 A 카르복실라아제(ACCase) 억제제, 예를 들어 할록시포프, 퀴잘로포프, 디클로포프 등에 대한 내성의 조합을 포함한다. 유전자이식에 의해 제공된 단백질이 제초제 화학물질 부류, 예를 들어 페녹시산 제초제 및 피리딜옥시아세테이트 옥신 제초제 (WO 2007/053482 A2 참조), 또는 페녹시산 제초제 및 아릴옥시페녹시프로피오네이트 제초제(WO 2005107437 A2, A3 참조)에 대한 식물 내성을 제공하는 다른 예가 공지되어 있다. IR 형질을 통한 복합 해충 문제를 방제하는 능력은 가치있는 상업용 제품 개념이고, 이러한 제품 개념의 편의성은 동일한 식물에 곤충 방제 형질 및 잡초 방제 형질이 조합되는 경우 향상된다. 또한, 개선된 가치는 본 발명의 것과 같은 B.t. 살곤충 단백질에 의해 부여된 IR 형질과 상기 언급된 것과 같은 하나 이상의 추가 HT 형질에 하나 이상의 추가 1세대 형질(input trait)(예를 들어 B.t.-유래 또는 다른 살곤충 단백질에 의해 부여된 다른 내곤충성, RNAi 등과 같은 메카니즘에 의해 부여된 내곤충성, 내선충성, 병저항성, 스트레스 내성, 개선된 질소 활용 등), 또는 2세대 형질(output trait)(예를 들어, 높은 유지 함량, 건강 오일 조성, 영양 개선 등)을 더한 단일 식물 조합을 통해 얻어질 수 있다. 이러한 조합은 복합 유전자(분자 스택)의 동시 도입을 포함하는 신규한 형질전환 작업으로서 통상적인 육종(스택 육종)을 통해 또는 공동으로 얻어질 수 있다. 이점으로는 생산자 및/또는 소비자에 2차적인 이점을 제공하는 곡물 식물에서 곤충 해충 및 개선된 잡초 방제를 관리하는 능력을 들 수 있다. 따라서, 본 발명은 다른 형질과 조합하여 사용하여 유연하고 비용 효과적으로 다수의 작물학적 문제를 제어할 수 있는 개선된 곡물 품질의 완벽한 작물학적 패키지를 제공할 수 있다.
형질전환된 세포를 통상의 방식으로 식물 내부에서 성장시킨다. 이들은 생식 세포를 형성할 수 있고 형질전환된 형질(들)을 자손 식물로 전달할 수 있다.
이러한 식물은 일상적인 방식으로 재배할 수 있고 동일한 형질전환된 유전 요인 또는 다른 유전 요인을 갖는 식물과 교배할 수 있다. 생산된 잡종 개체는 상응하는 표현형 성질을 갖는다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 식물은 유전자로 형질전환될 것이고, 여기서 코돈 사용은 식물에 대하여 최적화된다. 예를 들어, 미국 특허 제5,380,831호를 참조한다. 또한, 식물에 사용하기 위한 합성 Bt 유전자의 생산 방법은 당업계에 공지되어 있다 (Stewart and Burgin, 2007). 바람직한 형질전환된 식물의 비제한적 일 예는 Cry6Aa 단백질을 코딩하는 식물-발현성 유전자를 포함하고, 또한 Cry3Aa 단백질을 코딩하는 제2 세트의 식물-발현성 유전자를 추가로 포함하는 생식가능한 메이즈 식물이다.
Cry6Aa- 및 Cry3Aa-결정 형질(들)의 근친교배된 메이즈 계통으로의 전달 (또는 유전자이입(introgression))은 반복적인 선발 육종, 예를 들어 역교배에 의해 달성가능하다. 이 경우에, 바람직한 반복친을 먼저 Cry-결정 형질을 위한 적절한 유전자(들)를 갖고 있는 공여 근친교배종 (1회친)과 교배한다. 이어서, 상기 교배의 자손을 다시 반복친과 교배한 후에, 생산된 자손 중에서 1회친으로부터 전달되는 목적하는 형질(들)에 대하여 선택한다. 반복친과의 3세대, 바람직하게는 4세대, 보다 바람직하게는 5세대 이상의 역교배 및 목적하는 형질(들)의 선택 후에, 자손은 전달되는 형질(들)을 조절하는 좌위에 대하여 이형접합성일 것이지만, 대부분의 또는 거의 모든 다른 유전자에 대해서는 반복친과 같을 것이다 (예를 들어, 문헌 [Poehlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4th Ed., 172-175]; [Fehr (1987) Principles of Cultivar Development, Vol. 1: Theory and Technique, 360-376] 참조).
곤충 내성 관리 (IRM) 전략. 루쉬(Roush) 등은, 예를 들어 살곤충 유전자이식 작물의 관리를 위한, "피라미딩(pyramiding)" 또는 "스태킹"이라고도 하는 2 독소 전략을 약술하였다 (문헌 [The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777-1786]).
미국 환경 보호청은 그들의 웹사이트 (epa.gov/oppbppd1/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm)에서, 유전자이식 작물과 함께 사용되는 비-유전자이식(즉, 비-B.t.) 피난처 (비-Bt 작물/옥수수 블록)의 제공에 대한 하기 요건을 게시한다.
"옥수수 천공충-보호된 Bt (Cry1Ab 또는 Cry1F) 옥수수 제품을 위한 구체적인 구조적 요건은 하기와 같다:
구조적 피난처: 콘 벨트(Corn Belt)에서는 20％ 비-인시목 Bt 옥수수 피난처;
코튼 벨트(Cotton Belt)에서는 50％ 비-인시목 Bt 피난처
블록
내부 (즉, Bt 경작지 내부)
외부 (즉, 무작위 교배를 최대화하기 위해 Bt 경작지의 ½ 마일 (가능하면 ¼ 마일) 이내의 별도의 경작지)
경작지내 구간(strip)
구간은 유충 이동의 영향을 줄이기 위해 4열 이상 (바람직하게는 6열)의 너비이어야 한다."
또한, 미국 옥수수 생산자 협회도 그들의 웹사이트 (ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn)에서, 피난처 요건에 관한 유사한 지침을 제공한다. 예를 들면 하기와 같다:
"옥수수 천공충 IRM 요건:
- 생산자의 옥수수 경작지의 20％ 이상에 피난처 하이브리드를 재식해야 함
- 목화 생산지에서는, 피난처가 50％이어야 함
- 피난처 하이브리드의 1/2 마일 이내에 재식해야 함
- 피난처는 Bt 경작지 내의 구간으로서 재식될 수 있고; 피난처 구간은 4열 이상의 너비이어야 함
- 피난처는 표적 해충에 대하여 경제적 한계선에 이르는 경우에만 통상의 살해충제로 처리할 수 있음
- Bt-기반 분무성 살곤충제는 피난처 옥수수에 사용할 수 없음
- Bt 옥수수의 모든 농장에는 적절한 피난처가 재식되어야 함"
루쉬 등에 의해 기술된 바와 같이 (예를 들어, 1780쪽 및 1784쪽의 우측 컬럼), 각각 표적 해충에 대해 효과적이고 교배 내성이 거의 없는 2개의 상이한 단백질의 스태킹 또는 피라미딩은 보다 축소된 피난처의 사용을 허용할 수 있다. 루쉬는 성공적인 스택을 위해 10％ 미만의 피난처의 피난처 크기가 단일(비-피라미딩화) 형질에 대해 약 50％의 피난처에 필적하는 내성 관리를 제공할 수 있다고 제안한다. 미국 환경 보호청은 현행의 이용가능한 피리미딩된 Bt 옥수수 제품의 경우 단일 형질 제품(일반적으로 20％)에 대한 것보다 유의하게 적은 (약 5％ 미만) 비-Bt 옥수수의 구조화된 피난처를 요구한다.
루쉬 등 (상기) 및 미국 특허 제6,551,962호에서 추가로 논의된 바와 같이, 자루내(in-bag) 종자 혼합물 및 경작지에서의 다양한 기하학적 재식 양식 (상기 언급된 바와 같은 것)을 포함하여, 피난처의 IRM 효과를 제공하는 다양한 방법이 있다.
상기 백분율, 또는 유사 피난처 비는 대상이 되는 2중 또는 3중 적층 또는 피라미드에 사용될 수 있다.
본원에서 언급되었거나 인용된 모든 특허, 특허 출원, 가출원 및 공보는 본 명세서의 명확한 교시내용과 모순되지 않는 정도까지 그 전문이 참조로 삽입된다.
하기는 본 발명을 실시하기 위한 절차를 설명하는 실시예이다. 이 실시예들은 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 달리 지시되지 않는 한 모든 백분율은 중량 기준이고, 모든 용매 혼합물의 비율은 부피 기준이다. 모든 온도는 섭씨 온도이다.
달리 구체적으로 명시되거나 암시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 부정관사 (a, an) 및 정관사(the)라는 용어는 "적어도 하나의"라는 것을 의미한다.
실시예
실시예 1 - Cry3Aa 및 Cry6Aa 전장 독소를 코딩하는 발현 플라스미드의 구성. 전장 Cry3Aa 및 Cry6Aa Cry 단백질을 각각 생성하도록 조작된 슈도모나스 플루오레센스 (Pf) 발현 플라스미드의 구성에 표준 클로닝 방법을 사용하였다. DNA 소화에는 뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England BioLabs) (NEB; 미국 매사추세츠주 입스위치)로부터의 제한 엔도뉴클레아제를 사용하고 DNA 리게이션에는 인비트로겐 (Invitrogen)으로부터의 T4 DNA 연결효소를 사용하였다. 플라스미드 미니 키트 (Plasmid Mini Kit) (퀴아젠 (Qiagen), 미국 캘리포니아주 발렌시아)를 사용하고 공급자의 설명서에 따라서 플라스미드 제조를 행하였다. 아가로스 트리스-아세테이트 겔 전기영동 후에 밀리포어 울트라프리 (Millipore Ultrafree)®-DA 카트리지 (미국 매사추세츠주 빌레리카)를 사용하여 DNA 단편을 정제하였다. 기본 클로닝 방법은 Cry 단백질의 전장의 코딩 서열 (CDS)을 Cry3Aa의 경우 pMYC1803 내로, 및 SpeI 및 XhoI (또는 XhoI와 상용성인 SalI) 제한 부위의 Cry6Aa의 경우 pDOW1169 내로 각각 서브클로닝하는 것을 수반하였으며, 그에 의해 이들은 각각 플라스미드 pKK223-3 (피엘 파마시아 (PL Pharmacia; 미국 위스콘신주 밀워키)) 유래의 Ptac 프로모터 및 rrnBT1T2 또는 rrnBT2 종결자의 발현 제어 하에 위치하게 된다. pMYC1803은 단백질 코딩 영역을 포함하는 DNA 단편이 내부에 도입될 수 있는 제한 효소 인식 부위 앞의 리보솜 결합 부위, 테트라사이클린 내성 유전자 및 RSF1010 복제 기원을 갖는 중위 카피 넘버의 플라스미드이다 (미국 특허 출원 제20080193974호). Cry3Aa (재조합 pMYC1803) 대한 상기 발현 플라스미드를 전기천공에 의해 피. 플루오레센스 균주 MB214 내로 형질전환시키고, 이를 SOC-대두 가수분해물 배지에서 회수하고, 20 μg/ml의 테트라사이클린을 포함하는 라이소제니 브로쓰 (Lysogeny broth) (LB) 배지에 플레이팅하였다. 발현 벡터 pDOW1169는 pMYC1803과 유사하나, pDOW1169는 우라실을 코딩하는 pyrF 유전자를 지니며, 피. 플루오레센스 우라실 영양요구성 균주 (예를 들어, DPf10)를 우라실이 결핍된 M9 최소 배지 플레이트 상에서의 형질전환에 사용될 경우, 형질전환주의 스크리닝을 위한 마커로서 사용되었다 (슈나이더(Schneider) 등, 2005). 미생물학적 조작에 대한 상세사항은 본원에 참고로 포함된 미국 특허 출원 제20060008877호, 미국 특허 출원 제 20080193974호, 및 미국 특허 출원 제20080058262호로부터 입수가능하다. 콜로니를 미니프렙 (miniprep) 플라스미드 DNA의 제한 소화에 의해 추가로 스크리닝하였다. 삽입체를 포함하는 선별된 클론의 플라스미드 DNA를 상업적 서열결정 판매 회사, 예컨대 유로핀스 엠더블유지 오페론 (Eurofins MWG Operon; 미국 앨라배마주 헌츠빌))과의 계약에 의해 서열결정하였다. 서열 데이터를 시켄처 (Sequencher)TM 소프트웨어 (진 코즈 코포레이션 (Gene Codes Corp.; 미국 미시건주 앤 아버))를 사용하여 어셈블링 및 분석하였다.
실시예 2 - 성장 및 발현. Bt 수용체 결합을 포함한 특성화 및 곤충 생물분석을 위한 Cry3Aa 및 Cry6Aa 독소의 진탕 플라스크 생성에서의 성장 및 발현 분석은, 진탕 플라스크에서 성장시킨 발현 구성체를 함유한 피. 플루오레센스 균주 (예를 들어, Cry3Aa의 경우 클론 pMYC1334, Cry6Aa의 경우 pDAB102018)에 의해 수행하였다. 20 μg/ml의 테트라사이클린이 보충된 피. 플루오레센스 배지에서 밤새 성장한 Cry3Aa에 대한 씨드 배양액을 사용하여 20 μg/ml의 테트라사이클린을 포함한 동일 배지 200 mL에 접종하였다. 그러나, Cry6Aa에 대한 씨드 배양액은 M9 최소 브로쓰에서 밤새 성장하였고, 이를 사용하여 항생제 없이 피. 플루오레센스 배지 200 mL에 접종하였다. Ptac 프로모터에 의한 Cry3Aa 및 Cry6Aa 독소의 발현은 300 rpm으로 진탕하면서 28-30℃에서 24시간 초기 배양한 후 이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노사이드 (IPTG)를 첨가함으로써 유도하였다. 유도시에 그리고 유도 후 다양한 시점에서 배양물을 샘플링하였다. 세포 밀도를 600 nm에서의 광학 밀도 (OD600)로 측정하였다.
실시예 3 - 진탕 플라스크 샘플의 세포 분획화 및 SDS-PAGE 분석. 각각의 샘플링 시점에서, 샘플의 세포 밀도를 OD600 = 20으로 조정하고, 1 mL의 분취액을 14,000 x g에서 5분 동안 원심분리하였다. 세포 펠렛을 -80℃에서 동결시켰다. 동결시킨 세포 펠렛 샘플로부터의 용해성 및 불용성 분획물을 이지라이즈 (EasyLyse)TM 박테리아 단백질 추출 용액 (에피센트레 (EPICENTRE)® 바이오테크놀로지즈 (Biotechnologies), 미국 위스콘신주 매디슨)을 이용하여 생성하였다. 각각의 세포 펠렛을 1 mL의 이지라이즈TM 용액에 재현탁시키고, 용해 완충액 중에 1:4로 추가로 희석시키고, 실온에서 30분 동안 진탕하면서 배양하였다. 용해물을 14,000 rpm에서 20분 동안 4℃에서 원심분리하고, 상청액을 용해성 분획물로서 회수하였다. 그 후 펠렛 (불용성 분획물)을 동일한 부피의 인산염 완충 염수 (PBS; 11.9 mM Na2HPO4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, pH7.4)에 재현탁시켰다. 샘플을 β-메르캅토에탄올을 함유하는 4X 램믈리 (Laemmli) 샘플 완충액과 3:1로 혼합하고, 5분 동안 비등시킨 후 누파게 노벡스 (NuPAGE Novex) 4-20％ 비스-트리스 겔 (인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드) 상에 로딩하였다. 전기영동을 권고된 NuPAGE MOPS 완충액에서 수행하였다. 겔을 제조업자 (인비트로겐)의 프로토콜에 따라서 심플리블루 (SimplyBlue)™ 세이프 스테인 (Safe Stain)으로 염색시키고, 타이푼(Typhoon) 이미징 시스템 (지이 헬스케어 라이프 사이언즈 (GE Healthcare Life Sciences, 미국 팬실베니아주 피츠버그)을 사용하여 이미징화하였다.
실시예 4 - 봉입체 (inclusion body) 제조. Cry 단백질 봉입체 (IB) 제조는, SDS-PAGE 및 MALDI-MS (매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 질량 분광법 (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry))에 의해 입증되는 바의 불용성 B.t. 살곤충 단백질을 생성하는 피. 플루오레센스 발효액으로부터 수행하였다. 48시간의 후 유도 (post induction)로부터 생성된 피. 플루오레센스 세포 펠렛을 37℃ 수조에서 해동시켰다. 세포를 용해 완충액 [50 mM 트리스, pH 7.5, 200 mM NaCl, 20 mM EDTA 2나트륨 염 (에틸렌디아민테트라아세트산), 1％ 트리톤 X-100, 및 5 mM 디티오트레이톨 (DTT)]에 25％ (w/v)로 재현탁하고; 5 mL/L의 박테리아 프로테아제 저해제 칵테일 (P8465; 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich; 미국 미주리주 세인트 루이스))을 Cry3Aa의 경우에만 사용 직전에 첨가하였다. 세포를 균질화기 (티슈 테어러 (Tissue Tearor), 바이오스펙 프로덕츠, 인크. (BioSpec Products, Inc.; 미국 오클라호마주 바틀레스빌))를 이용하여 최저 설정치에서 현탁시켰다. 라이소자임 25 mg (시그마 L7651, 계란 흰자 유래)을 금속 스패튤라를 이용하여 혼합함으로써 세포 현탁액에 첨가하고, 상기 현탁액을 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 현탁액을 얼음 상에서 15분 동안 냉각시키고, 그 후 브랜슨 (Branson) 초음파 처리기 250 (2회의 1분의 기간, 50％의 듀티 사이클, 30％의 출력)을 이용하여 초음파 처리하였다. 세포 용해를 현미경법으로 체크하였다. 필요할 경우 추가의 25 mg의 라이소자임을 첨가하고, 배양 및 초음파 처리를 반복하였다. 현미경법을 통해 세포 용해가 확증되면, 용해물을 11,500 x g에서 25분 동안 (4℃) 원심분리하여 IB 펠렛을 형성하고, 상청액을 버렸다. IB 펠렛을 100 mL 용해 완충액으로 재현탁시키고, 핸드-헬드 혼합기로 균질화하고, 상기와 같이 원심분리하였다. 상청액이 무색으로 되고 IB 펠렛이 안정된 회백색으로 될 때까지 IB 펠렛을 재현탁 (50 mL의 용해 완충액 중에), 균질화, 초음파 처리 및 원심분리에 의해 반복적으로 세척하였다. 마지막 세척에 있어서, IB 펠렛을 2 mM EDTA를 함유하는 살균 여과(0.22 ㎛) 증류수에 재현탁시키고, 원심분리하였다. 최종 펠렛을 2 mM EDTA를 함유하는 살균 여과 증류수에 재현탁시키고, 1 mL의 분취물로 -80℃에서 보관하였다.
실시예 5 - SDS-PAGE 분석 및 정량화. IB 제제 중 단백질의 SDS-PAGE 분석 및 정량화는 1 mL의 IB 펠렛 분취물을 해동시키고 살균 여과 증류수로 1:20으로 희석시킴으로써 행하였다. 그 후 희석된 샘플을 4X 환원 샘플 완충액 [250 mM 트리스, pH 6.8, 40％ 글리세롤 (v/v), 0.4％의 브로모페놀 블루 (Bromophenol Blue) (w/v), 8％ SDS (w/v) 및 8％ β-메르캅토-에탄올 (v/v)]을 이용하여 비등시키고, 노벡스® 4-20％ 트리스-글리신 상에 로딩하고, 12+2 웰 겔 (인비트로겐)을 1X 트리스/글리신/SDS 완충액 (인비트로겐)으로 러닝시켰다. 겔을 약 60분 동안 200 볼트에서 러닝시키고, 그 후 이하의 심플리블루™ 세이프 스트레인 (인비트로겐) 절차에 따라서 염색 및 탈염색하였다. 표적 밴드의 정량화는 동일 겔 상에서 러닝시킨 소 혈청 알부민 (BSA) 표준 샘플에 대비하여 상기 밴드마다의 농도계 값들을 비교함으로써 바이오-래드 퀀티티 원 소프트웨어 (Bio-Rad Quantity One software)를 사용하여 표준 곡선을 생성함으로써 행하였다.
실시예 6 - 봉입체의 가용화. 피. 플루오레센스 클론 MR832 및 DPf13032 (각각 50-70 mg/mL의 Cry3Aa 및 Cry6Aa 단백질을 포함함)로부터의 봉입체 현탁액 10 mL를 에펜도르프 (Eppendorf) 모델 5415C 마이크로퓨지 (microfuge)의 최고 설정치에서 (대략 14,000 x g) 원심분리하여 봉입체를 펠렛화하였다. 보관 완충액 상청액을 제거하고, 50 mL의 원추형 튜브에서 Cry3Aa 및 Cry6Aa 양자의 경우 25 mL의 50 mM CAPS [3-(시클로헥사미노)1-프로판술폰산] 완충액 (pH 10.5)로 각각 대체하였다. 봉입체를 피펫을 이용하여 재현탁시키고, 와동시켜 철저히 혼합하였다. 튜브를 4℃에서 하룻밤 온화하게 흔들리는 플랫폼 상에 두어서 전장 Cry3Aa 및 Cry6Aa 단백질을 추출하였다. 추출물을 4℃에서 30분 동안 30,000 x g에서 원심분리하고, 가용화 전장 Cry 단백질을 포함하는 생성된 상청액을 구하였다.
실시예 7 - 전장 전독소의 밀단절단 (truncation). 전장 Cry3Aa를 트립신으로 소화시켜, 추가의 트립신 소화에 대해 내성을 갖는 Cry 단백질의 활성형을 생성하였다. 구체적으로, 가용화 전장 Cry3Aa를 100 mM 탄산나트륨 완충액 (pH 11) 중에서 트립신 (소 췌장) (시그마, 미국 미주리주 세인트 루이스)과 (20:1 = Cry 단백질:효소, w/w)으로 실온에서 1-3시간 동안 배양하였다. 완전 활성화 또는 말단절단을 SDS-PAGE 분석에 의해 확인하였다. 전장 Cry3Aa의 분자 질량은
Figure pct00002
73 kDa이고, 트립신 코어는 각각
Figure pct00003
55 kDa이었다. Cry3Aa의 전장 및 키모트립신 코어의 아미노산 서열은 서열 1 및 서열 2로 제공된다. 전장 Cry6Aa는 그의 키모트립신 또는 트립신 코어보다 표적 곤충 옥수수 뿌리벌레에 대해 상당히 더 활성이다. 따라서, 전장 Cry6Aa를 결합 분석에 사용하였다. 전장 Cry6Aa의 아미노산 서열은 서열 3으로 제공된다.
실시예 8 - Cry 독소의 정제. 트립신 처리된 Cry3Aa 및 전장 Cry6Aa를 이온 교환 크로마토그래피 시스템을 사용하여 추가로 정제하였다. 구체적으로, 이들을 아트카 익스플로러 (ATKA Explorer) 액체 크로마토그래피 시스템 (아머샴 바이오사이언즈 (Amersham Biosciences))을 사용하여 추가로 정제하였다. Cry3Aa 및 Cry6Aa 양자 모두의 경우, 완충액 A는 10 mM CAPS 완충액 (pH 10.5)이고, 완충액 B는 10 mM CAPS 완충액 (pH 10.5) + 1 M NaCl이었다. 캡토(Capto) Q (5 ml) 컬럼 (GE)을 사용하였다. 완충액 A를 사용하여 컬럼을 완전히 평형 상태로 한 후에, Cry 독소 용액을 컬럼 내로 5 ml/분의 유속으로 주입하였다. 구배 0 내지 100％의 완충액 B를 사용하여 1 ml/분획으로 5 ml/분에서 용리를 행하였다. 선별된 분획을 SDS-PAGE 분석하여 최고 품질의 표적 단백질을 포함하는 분획을 추가로 선택한 후에, 이들 분획을 모았다. 정제된 Cry3Aa 트립신 코어 및 전장 Cry6Aa 양자 모두의 경우, 완충액을 투석을 통해 10 mM CAPS (pH 10.5)로 변경하였다. 샘플을 SDS-PAGE를 사용하여 정량한 이후의 후속 결합 분석 및 표준으로서 BSA를 이용한 타이푼 이미징 시스템 (GE) 분석을 위하여 4℃에 두었다.
실시예 9 - BBMV 제제. Cry 독소 수용체 결합 분석에는 곤충 중장의 솔 가장자리 막 소포체 (BBMV) 제제가 널리 사용되고 있다. 본 발명에서 사용된 BBMV 제제는 문헌[Wolferberger et al. (1987)]에 기재된 방법을 사용하여 서양 옥수수 뿌리 벌레 (디아브로티카 비르기페라 비르기페라 (Diabrotica virgifera virgifera) 르콩테 LeConte))의 제3령 유충의 단리된 중장으로부터 제조하였다. 제조시 류신 아미노펩티다제를 막 단백질의 마커로서 사용하고, 조 균질액 및 BBMV 제제의 류신 아미노펩티다제 활성을 앞서 기재된 문헌[(Li et al. 2004a)]에서와 같이 측정하였다. 브래드포드 (Bradford) 방법 (1976)을 사용하여 BBMV 제제의 단백질 농도를 측정하였다.
실시예 10 - 125 I 표지화(Labeling). 정제된 Cry3Aa 트립신 코어 및 전장 Cry6Aa는 포화 및 경쟁 결합 분석을 위해 125I를 사용하여 표지화하였다. 방사성-표지화가 Cry 독소의 생물학적 활성을 파괴하지 않도록 하기 위해서, NaI를 사용하고 피어스 (Pierce)® 요오디네이션 비즈 (Iodination Beads) (피어스 바이오테크놀로지, 써모 사이언티픽 (Pierce Biotechnology, Thermo Scientific), 미국 일리노이주 록포드)의 설명서에 따라서 냉 요오드화를 수행하였다. 생물분석 결과로서 요오드화 Cry3Aa 트립신 코어 및 전장 Cry6Aa는 양자 모두 서양 옥수수 뿌리 벌레의 유충에 대해 활성을 유지하였다. 피어스® 요오디네이션 비즈 (피어스) 및 Na125I를 사용하여 125I-Cry3Aa 및 125I-Cry6Aa를 얻었다. 제바 (Zeba)TM 데솔트 스핀 컬럼즈 (Desalt Spin Columns) (피어스)를 사용하여 요오드화 단백질로부터 비혼입 또는 유리 (free) Na125I를 제거하였다. 요오드화 Cry 단백질의 비방사능 (specific radio-activity)은 1-5 uCi/ug의 범위였다. 다중 복제물의 표지화 및 결합 분석을 수행하였다.
실시예 11 - 포화 결합 분석. 앞서 기재된 문헌[(Li et al. 2004b)]와 같이, 125I-표지화 Cry 독소를 사용하여 포화 결합 분석을 행하였다. 특이적 결합을 측정하고 곤충 BBMV에 대한 Cry3Aa 및 Cry6Aa의 결합 친화성 (해리 상수, Kd) 및 결합 부위 농도 (주어진 양의 BBMV에 특이적으로 결합되는 독소의 최대량, Bmax)를 추정하기 위해서, 125I-Cry3Aa 또는 125I-Cry6Aa의 단계적으로 증가하는 농축물을 0.1％의 BSA가 보충된 150 ul의 20 mM 비스-트리스 (pH 6.0), 150 mM KCl 중에서 실온에서 60분 동안 제시된 농도 (0.1 mg/ml)의 곤충 BBMV와 함께 온화하게 진탕하면서 각각 배양하였다. 실온에서 8분 동안 20,000 x g에서 원심분리함으로써 현탁액 중의 유리 독소로부터 BBMV에 결합된 독소를 분리하였다. 펠렛을 0.1％ BSA를 포함한 900 ul의 동일한 빙냉 완충액으로 2회 세척하였다. 펠렛에 잔류하는 방사능을 코브라이 오토-감마 카운터(COBRAII Auto-Gamma counter) (패커드, 캔베라 컴퍼니 (Packard, a Canberra company))로 측정하고 총 결합 (total binding)으로 간주하였다. 다른 일련의 결합 반응물을 나란히 설정하고, 500-1,000배의 과량 비표지화 상응 독소를 각각의 결합 반응물에 포함시켜 BBMV 상의 모든 특이적 결합 부위를 완전히 점유시키고, 이들을 사용하여 비-특이적 결합을 측정하였다. 총 결합으로부터 비-특이적 결합을 차감함으로써 특이적 결합을 추정하였다. 그래프패드 프리즘 (GraphPad Prism) 5.01 (그래프패드 소프트웨어 (GraphPad Software), 미국 캘리포니아주 샌 디에고)을 러닝시킴으로써, 사용된 표지화 독소의 농축물에 대해 BBMV 단백질 마이크로그램 당 특이적으로 결합되는 독소 분자 수 (pmole)를 사용하여 이들 독소의 Kd 및 Bmax 값을 추정하였다. 마이크로소프트 엑셀 또는 그래프패드 프리즘 프로그램을 사용하여 차트를 만들었다. 실험은 적어도 3회 반복하였다. 이들 결합 실험은 125I-Cry3Aa 및 125I-Cry6Aa 양자 모두가 BBMV에 특이적으로 결합할 수 있다는 것을 증명하였다 (도 1A 및 1B). 125I-Cry3Aa 및 125I-Cry6Aa는 결합 친화성이 Kd=24.0±9.76, 10.14±8.29 (nM)이고, 결합 부위 농도는 각각 Bmax=21.97±5.99 pmole/mg, 0.66±0.33 (pmole/mg BBMV)이었다.
실시예 12 - 경쟁 결합 분석. 경쟁 결합 분석을 추가로 수행하여 Cry3Aa 트립신 코어 및 전장 Cry6Aa가 BBMV 결합 부위를 공유하는지 여부를 측정하였다. Cry3Aa 동종 경쟁 결합 분석의 경우, 증가하는 양 (0-2500 nM)의 비표지화 Cry3Aa를 우선 5 nM 표지화 Cry3Aa와 혼합하고, 그 후 각각 실온에서 60분 동안 제시된 농도 (0.1 mg/ml)의 BBMV와 함께 배양하였다. BBMV와 결합된 125I-Cry3Aa의 비율은 비표지화 경쟁자의 부재 하의 초기 특이적 결합과 비교하여 각각의 반응물에 대해 측정하였다. 또한, 125I-Cry3Aa와 비표지화 Cry6Aa 사이의 이종 경쟁 결합 분석을 수행하여 이들이 동일 세트의 수용체(들)을 공유하는지 여부를 확인하였다. 반응물 중에 포함되는 경쟁자로서의 비표지화 Cry6Aa의 양을 증가시키면서 BBMV 상의 추정상 수용체(들)에 대해 표지화 Cry3Aa와 경쟁시킴으로써 수행하였다. 적어도 3회 실험을 반복하였다. 실험 결과는 몰 농도가 약 2500 nM로 증가된 때 (5 nM 125I-Cry3Aa에 비해 500배 과량)에, Cry3Aa가 그 자체를 약 60％ 초과로 대체할 수 있다는 것을 증명하였다. 나머지 약 40％는 다른 곳에서 기재된 바와 같은 포화 결합 결과 및 비-특이적 결합의 정의에 기초하여 대체될 수 없는 비-특이적 결합인 것으로 간주되었으며, 따라서 비-특이적 결합은 감산하였고 여기에 나타내지 않았다. 이는 특이적 결합이 500배 과량의 비표지화 Cry3Aa에 의해 완전히 대체되었음을 시사한다 (도 2). 그러나, Cry6Aa는 125I-Cry3Aa를 대체할 수 없었다. 이들 데이터는 Cry3Aa가 Cry6Aa와 수용체 또는 결합 부위를 공유하지 않는다는 것을 나타낸다.
인용문헌:
Figure pct00004
Figure pct00005
SEQUENCE LISTING <110> DOW AGROSCIENCES <120> Combinations Including Cry34Ab/35Ab and Cry6Aa Proteins to Prevent Development of Resistance in Corn Rootworms (Diabrotica spp.) <130> DAS-P0171-US-04 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 644 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 1 Met Asn Pro Asn Asn Arg Ser Glu His Asp Thr Ile Lys Thr Thr Glu 1 5 10 15 Asn Asn Glu Val Pro Thr Asn His Val Gln Tyr Pro Leu Ala Glu Thr 20 25 30 Pro Asn Pro Thr Leu Glu Asp Leu Asn Tyr Lys Glu Phe Leu Arg Met 35 40 45 Thr Ala Asp Asn Asn Thr Glu Ala Leu Asp Ser Ser Thr Thr Lys Asp 50 55 60 Val Ile Gln Lys Gly Ile Ser Val Val Gly Asp Leu Leu Gly Val Val 65 70 75 80 Gly Phe Pro Phe Gly Gly Ala Leu Val Ser Phe Tyr Thr Asn Phe Leu 85 90 95 Asn Thr Ile Trp Pro Ser Glu Asp Pro Trp Lys Ala Phe Met Glu Gln 100 105 110 Val Glu Ala Leu Met Asp Gln Lys Ile Ala Asp Tyr Ala Lys Asn Lys 115 120 125 Ala Leu Ala Glu Leu Gln Gly Leu Gln Asn Asn Val Glu Asp Tyr Val 130 135 140 Ser Ala Leu Ser Ser Trp Gln Lys Asn Pro Val Ser Ser Arg Asn Pro 145 150 155 160 His Ser Gln Gly Arg Ile Arg Glu Leu Phe Ser Gln Ala Glu Ser His 165 170 175 Phe Arg Asn Ser Met Pro Ser Phe Ala Ile Ser Gly Tyr Glu Val Leu 180 185 190 Phe Leu Thr Thr Tyr Ala Gln Ala Ala Asn Thr His Leu Phe Leu Leu 195 200 205 Lys Asp Ala Gln Ile Tyr Gly Glu Glu Trp Gly Tyr Glu Lys Glu Asp 210 215 220 Ile Ala Glu Phe Tyr Lys Arg Gln Leu Lys Leu Thr Gln Glu Tyr Thr 225 230 235 240 Asp His Cys Val Lys Trp Tyr Asn Val Gly Leu Asp Lys Leu Arg Gly 245 250 255 Ser Ser Tyr Glu Ser Trp Val Asn Phe Asn Arg Tyr Arg Arg Glu Met 260 265 270 Thr Leu Thr Val Leu Asp Leu Ile Ala Leu Phe Pro Leu Tyr Asp Val 275 280 285 Arg Leu Tyr Pro Lys Glu Val Lys Thr Glu Leu Thr Arg Asp Val Leu 290 295 300 Thr Asp Pro Ile Val Gly Val Asn Asn Leu Arg Gly Tyr Gly Thr Thr 305 310 315 320 Phe Ser Asn Ile Glu Asn Tyr Ile Arg Lys Pro His Leu Phe Asp Tyr 325 330 335 Leu His Arg Ile Gln Phe His Thr Arg Phe Gln Pro Gly Tyr Tyr Gly 340 345 350 Asn Asp Ser Phe Asn Tyr Trp Ser Gly Asn Tyr Val Ser Thr Arg Pro 355 360 365 Ser Ile Gly Ser Asn Asp Ile Ile Thr Ser Pro Phe Tyr Gly Asn Lys 370 375 380 Ser Ser Glu Pro Val Gln Asn Leu Glu Phe Asn Gly Glu Lys Val Tyr 385 390 395 400 Arg Ala Val Ala Asn Thr Asn Leu Ala Val Trp Pro Ser Ala Val Tyr 405 410 415 Ser Gly Val Thr Lys Val Glu Phe Ser Gln Tyr Asn Asp Gln Thr Asp 420 425 430 Glu Ala Ser Thr Gln Thr Tyr Asp Ser Lys Arg Asn Val Gly Ala Val 435 440 445 Ser Trp Asp Ser Ile Asp Gln Leu Pro Pro Glu Thr Thr Asp Glu Pro 450 455 460 Leu Glu Lys Gly Tyr Ser His Gln Leu Asn Tyr Val Met Cys Phe Leu 465 470 475 480 Met Gln Gly Ser Arg Gly Thr Ile Pro Val Leu Thr Trp Thr His Lys 485 490 495 Ser Val Asp Phe Phe Asn Met Ile Asp Ser Lys Lys Ile Thr Gln Leu 500 505 510 Pro Leu Val Lys Ala Tyr Lys Leu Gln Ser Gly Ala Ser Val Val Ala 515 520 525 Gly Pro Arg Phe Thr Gly Gly Asp Ile Ile Gln Cys Thr Glu Asn Gly 530 535 540 Ser Ala Ala Thr Ile Tyr Val Thr Pro Asp Val Ser Tyr Ser Gln Lys 545 550 555 560 Tyr Arg Ala Arg Ile His Tyr Ala Ser Thr Ser Gln Ile Thr Phe Thr 565 570 575 Leu Ser Leu Asp Gly Ala Pro Phe Asn Gln Tyr Tyr Phe Asp Lys Thr 580 585 590 Ile Asn Lys Gly Asp Thr Leu Thr Tyr Asn Ser Phe Asn Leu Ala Ser 595 600 605 Phe Ser Thr Pro Phe Glu Leu Ser Gly Asn Asn Leu Gln Ile Gly Val 610 615 620 Thr Gly Leu Ser Ala Gly Asp Lys Val Tyr Ile Asp Lys Ile Glu Phe 625 630 635 640 Ile Pro Val Asn <210> 2 <211> 486 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 2 Asn Pro His Ser Gln Gly Arg Ile Arg Glu Leu Phe Ser Gln Ala Glu 1 5 10 15 Ser His Phe Arg Asn Ser Met Pro Ser Phe Ala Ile Ser Gly Tyr Glu 20 25 30 Val Leu Phe Leu Thr Thr Tyr Ala Gln Ala Ala Asn Thr His Leu Phe 35 40 45 Leu Leu Lys Asp Ala Gln Ile Tyr Gly Glu Glu Trp Gly Tyr Glu Lys 50 55 60 Glu Asp Ile Ala Glu Phe Tyr Lys Arg Gln Leu Lys Leu Thr Gln Glu 65 70 75 80 Tyr Thr Asp His Cys Val Lys Trp Tyr Asn Val Gly Leu Asp Lys Leu 85 90 95 Arg Gly Ser Ser Tyr Glu Ser Trp Val Asn Phe Asn Arg Tyr Arg Arg 100 105 110 Glu Met Thr Leu Thr Val Leu Asp Leu Ile Ala Leu Phe Pro Leu Tyr 115 120 125 Asp Val Arg Leu Tyr Pro Lys Glu Val Lys Thr Glu Leu Thr Arg Asp 130 135 140 Val Leu Thr Asp Pro Ile Val Gly Val Asn Asn Leu Arg Gly Tyr Gly 145 150 155 160 Thr Thr Phe Ser Asn Ile Glu Asn Tyr Ile Arg Lys Pro His Leu Phe 165 170 175 Asp Tyr Leu His Arg Ile Gln Phe His Thr Arg Phe Gln Pro Gly Tyr 180 185 190 Tyr Gly Asn Asp Ser Phe Asn Tyr Trp Ser Gly Asn Tyr Val Ser Thr 195 200 205 Arg Pro Ser Ile Gly Ser Asn Asp Ile Ile Thr Ser Pro Phe Tyr Gly 210 215 220 Asn Lys Ser Ser Glu Pro Val Gln Asn Leu Glu Phe Asn Gly Glu Lys 225 230 235 240 Val Tyr Arg Ala Val Ala Asn Thr Asn Leu Ala Val Trp Pro Ser Ala 245 250 255 Val Tyr Ser Gly Val Thr Lys Val Glu Phe Ser Gln Tyr Asn Asp Gln 260 265 270 Thr Asp Glu Ala Ser Thr Gln Thr Tyr Asp Ser Lys Arg Asn Val Gly 275 280 285 Ala Val Ser Trp Asp Ser Ile Asp Gln Leu Pro Pro Glu Thr Thr Asp 290 295 300 Glu Pro Leu Glu Lys Gly Tyr Ser His Gln Leu Asn Tyr Val Met Cys 305 310 315 320 Phe Leu Met Gln Gly Ser Arg Gly Thr Ile Pro Val Leu Thr Trp Thr 325 330 335 His Lys Ser Val Asp Phe Phe Asn Met Ile Asp Ser Lys Lys Ile Thr 340 345 350 Gln Leu Pro Leu Val Lys Ala Tyr Lys Leu Gln Ser Gly Ala Ser Val 355 360 365 Val Ala Gly Pro Arg Phe Thr Gly Gly Asp Ile Ile Gln Cys Thr Glu 370 375 380 Asn Gly Ser Ala Ala Thr Ile Tyr Val Thr Pro Asp Val Ser Tyr Ser 385 390 395 400 Gln Lys Tyr Arg Ala Arg Ile His Tyr Ala Ser Thr Ser Gln Ile Thr 405 410 415 Phe Thr Leu Ser Leu Asp Gly Ala Pro Phe Asn Gln Tyr Tyr Phe Asp 420 425 430 Lys Thr Ile Asn Lys Gly Asp Thr Leu Thr Tyr Asn Ser Phe Asn Leu 435 440 445 Ala Ser Phe Ser Thr Pro Phe Glu Leu Ser Gly Asn Asn Leu Gln Ile 450 455 460 Gly Val Thr Gly Leu Ser Ala Gly Asp Lys Val Tyr Ile Asp Lys Ile 465 470 475 480 Glu Phe Ile Pro Val Asn 485 <210> 3 <211> 475 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 3 Met Ile Ile Asp Ser Lys Thr Thr Leu Pro Arg His Ser Leu Ile His 1 5 10 15 Thr Ile Lys Leu Asn Ser Asn Lys Lys Tyr Gly Pro Gly Asp Met Thr 20 25 30 Asn Gly Asn Gln Phe Ile Ile Ser Lys Gln Glu Trp Ala Thr Ile Gly 35 40 45 Ala Tyr Ile Gln Thr Gly Leu Gly Leu Pro Val Asn Glu Gln Gln Leu 50 55 60 Arg Thr His Val Asn Leu Ser Gln Asp Ile Ser Ile Pro Ser Asp Phe 65 70 75 80 Ser Gln Leu Tyr Asp Val Tyr Cys Ser Asp Lys Thr Ser Ala Glu Trp 85 90 95 Trp Asn Lys Asn Leu Tyr Pro Leu Ile Ile Lys Ser Ala Asn Asp Ile 100 105 110 Ala Ser Tyr Gly Phe Lys Val Ala Gly Asp Pro Ser Ile Lys Lys Asp 115 120 125 Gly Tyr Phe Lys Lys Leu Gln Asp Glu Leu Asp Asn Ile Val Asp Asn 130 135 140 Asn Ser Asp Asp Asp Ala Ile Ala Lys Ala Ile Lys Asp Phe Lys Ala 145 150 155 160 Arg Cys Gly Ile Leu Ile Lys Glu Ala Lys Gln Tyr Glu Glu Ala Ala 165 170 175 Lys Asn Ile Val Thr Ser Leu Asp Gln Phe Leu His Gly Asp Gln Lys 180 185 190 Lys Leu Glu Gly Val Ile Asn Ile Gln Lys Arg Leu Lys Glu Val Gln 195 200 205 Thr Ala Leu Asn Gln Ala His Gly Glu Ser Ser Pro Ala His Lys Glu 210 215 220 Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Leu Lys Thr Thr Leu Glu Arg Thr Ile 225 230 235 240 Lys Ala Glu Gln Asp Leu Glu Lys Lys Val Glu Tyr Ser Phe Leu Leu 245 250 255 Gly Pro Leu Leu Gly Phe Val Val Tyr Glu Ile Leu Glu Asn Thr Ala 260 265 270 Val Gln His Ile Lys Asn Gln Ile Asp Glu Ile Lys Lys Gln Leu Asp 275 280 285 Ser Ala Gln His Asp Leu Asp Arg Asp Val Lys Ile Ile Gly Met Leu 290 295 300 Asn Ser Ile Asn Thr Asp Ile Asp Asn Leu Tyr Ser Gln Gly Gln Glu 305 310 315 320 Ala Ile Lys Val Phe Gln Lys Leu Gln Gly Ile Trp Ala Thr Ile Gly 325 330 335 Ala Gln Ile Glu Asn Leu Arg Thr Thr Ser Leu Gln Glu Val Gln Asp 340 345 350 Ser Asp Asp Ala Asp Glu Ile Gln Ile Glu Leu Glu Asp Ala Ser Asp 355 360 365 Ala Trp Leu Val Val Ala Gln Glu Ala Arg Asp Phe Thr Leu Asn Ala 370 375 380 Tyr Ser Thr Asn Ser Arg Gln Asn Leu Pro Ile Asn Val Ile Ser Asp 385 390 395 400 Ser Cys Asn Cys Ser Thr Thr Asn Met Thr Ser Asn Gln Tyr Ser Asn 405 410 415 Pro Thr Thr Asn Met Thr Ser Asn Gln Tyr Met Ile Ser His Glu Tyr 420 425 430 Thr Ser Leu Pro Asn Asn Phe Met Leu Ser Arg Asn Ser Asn Leu Glu 435 440 445 Tyr Lys Cys Pro Glu Asn Asn Phe Met Ile Tyr Trp Tyr Asn Asn Ser 450 455 460 Asp Trp Tyr Asn Asn Ser Asp Trp Tyr Asn Asn 465 470 475

Claims (25)

  1. Cry3A 살곤충성 단백질 및 Cry6A 살곤충성 단백질을 생성하는 유전자이식 식물.
  2. 제1항에 있어서, Cry3B, Cry34 및 Cry35로 이루어진 군으로부터 선택된 제3 살곤충 활성 단백질을 추가로 생성하는 유전자이식 식물.
  3. 제1항 또는 제2항에 따른 식물의, 상기 DNA를 포함하는 종자.
  4. 제1항 또는 제2항에 따른 식물 다수를 포함하는 식물 경작지.
  5. 제4항에 있어서, 비-Bt 피난처 식물을 추가로 포함하며, 상기 피난처 식물이 상기 경작지에 존재하는 모든 작물 식물의 40％ 미만을 차지하는 식물 경작지.
  6. 제5항에 있어서, 상기 피난처 식물이 상기 경작지에 존재하는 모든 작물 식물의 30％ 미만을 차지하는 식물 경작지.
  7. 제5항에 있어서, 상기 피난처 식물이 상기 경작지에 존재하는 모든 작물 식물의 20％ 미만을 차지하는 식물 경작지.
  8. 제5항에 있어서, 상기 피난처 식물이 상기 경작지에 존재하는 모든 작물 식물의 10％ 미만을 차지하는 식물 경작지.
  9. 제5항에 있어서, 상기 피난처 식물이 상기 경작지에 존재하는 모든 작물 식물의 5％ 미만을 차지하는 식물 경작지.
  10. 제4항에 있어서, 상기 경작지에 피난처 식물이 존재하지 않는 식물 경작지.
  11. 제5항에 있어서, 상기 피난처 식물이 블록 또는 스트립(strip)으로 존재하는 식물 경작지.
  12. 비-Bt 피난처 식물로부터 유래된 피난처 종자 및 제3항의 종자 다수를 포함하며, 상기 피난처 종자가 종자 혼합물에 존재하는 모든 종자의 40％ 미만을 차지하는 종자 혼합물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 피난처 종자가 상기 혼합물에 존재하는 모든 종자의 30％ 미만을 차지하는 종자 혼합물.
  14. 제12항에 있어서, 상기 피난처 종자가 상기 혼합물에 존재하는 모든 종자의 20％ 미만을 차지하는 종자 혼합물.
  15. 제12항에 있어서, 상기 피난처 종자가 상기 혼합물에 존재하는 모든 종자의 10％ 미만을 차지하는 종자 혼합물.
  16. 제12항에 있어서, 상기 피난처 종자가 상기 혼합물에 존재하는 모든 종자의 5％ 미만을 차지하는 종자 혼합물.
  17. 제3항의 종자 다수를 포함하며, 피난처 종자를 갖지 않는 용기.
  18. 종자를 심어 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항의 식물 경작지를 조성하는 것을 포함하는, 곤충에 의한 Cry 단백질에 대한 내성 발달을 관리하는 방법.
  19. 제5항 내지 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물이 10 에이커를 초과하여 차지하는 경작지.
  20. 제1항 또는 제2항에 있어서, 메이즈(maize) 식물인 식물.
  21. 제1항 또는 제2항의 식물의 세포로서, 상기 Cry3A 단백질이 Cry3Aa 단백질이고, Cry6A 단백질이 Cry6Aa 단백질인 식물 세포.
  22. 제21항에 있어서, 상기 Cry3A 단백질이 서열 1 및 서열 2로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 95％ 이상 일치하고, 상기 Cry6A 살곤충성 단백질이 서열 3과 95％ 이상 일치하는 식물 세포.
  23. 제21항에 있어서, 상기 Cry3A 단백질이 서열 1 및 서열 2로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하고, 상기 Cry6Aa 단백질이 서열 3을 포함하는 식물 세포.
  24. 제21항의 식물 세포를 생성하는 방법.
  25. 뿌리벌레 곤충을 Cry3A 살곤충성 단백질 및 Cry6A 살곤충성 단백질과 접촉시킴으로써 뿌리벌레 곤충을 방제하는 방법.
KR1020127030552A 2010-04-23 2011-04-22 옥수수 뿌리벌레 (디아브로티카 종)에서의 내성 발달 방지를 위한 Cry3Aa 및 Cry6Aa 단백질을 포함하는 조합물 KR101845097B1 (ko)

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