JP5922100B2 - コーンルートワーム(ジアブロティカ種(Diabroticaspp.))に関する抵抗性の発生を予防するためのCry3Aa及びCry6Aaタンパク質を含む組み合わせ - Google Patents
コーンルートワーム(ジアブロティカ種(Diabroticaspp.))に関する抵抗性の発生を予防するためのCry3Aa及びCry6Aaタンパク質を含む組み合わせ Download PDFInfo
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Description
[1]Cry3A殺虫タンパク質及びCry6A殺虫タンパク質を生産する、トランスジェニック植物。
[2]Cry3B、Cry34及びCry35からなる群より選択される第三の殺虫活性タンパク質をさらに生産する、上記[1]に記載のトランスジェニック植物。
[3]上記DNAを含む、上記[1]から[2]のいずれかに記載の植物の種子。
[4]上記[1]から[2]のいずれかに記載の複数の植物を含む植物の圃場。
[5]非Btリフュージ植物をさらに含む圃場であって、上記リフュージ植物が、上記圃場内のすべての作物植物の40%未満を構成する、上記[4]に記載の植物の圃場。
[6]上記リフュージ植物が、上記圃場内のすべての作物植物の30%未満を構成する、上記[5]に記載の植物の圃場。
[7]上記リフュージ植物が、上記圃場内のすべての作物植物の20%未満を構成する、上記[5]に記載の植物の圃場。
[8]上記リフュージ植物が、上記圃場内のすべての作物植物の10%未満を構成する、上記[5]に記載の植物の圃場。
[9]上記リフュージ植物が、上記圃場内のすべての作物植物の5%未満を構成する、上記[5]に記載の植物の圃場。
[10]リフュージ植物がない、上記[4]に記載の植物の圃場。
[11]上記リフュージ植物が、区画又は植栽帯内に存在する、上記[5]に記載の植物の圃場。
[12]非Btリフュージ植物からのリフュージ種子と上記[3]に記載の複数の種子とを含む種子の混合物であって、上記リフュージ種子が上記混合物中のすべての種子の40%未満を構成する、種子の混合物。
[13]上記リフュージ種子が、上記混合物中のすべての種子の30%未満を構成する、上記[12]に記載の種子の混合物。
[14]上記リフュージ種子が、上記混合物中のすべての種子の20%未満を構成する、上記[12]に記載の種子の混合物。
[15]上記リフュージ種子が、上記混合物中のすべての種子の10%未満を構成する、上記[12]に記載の種子の混合物。
[16]上記リフュージ種子が、上記混合物中のすべての種子の5%未満を構成する、上記[12]に記載の種子の混合物。
[17]上記[3]に記載の複数の種子を含む種子容器であって、ゼロのリフュージ種子を含む容器。
[18]昆虫によるCryタンパク質に対する抵抗性の発生を管理する方法であって、種子を作付けして、上記[5]から[11]のいずれかに記載の植物の圃場を作ることを含む方法。
[19]上記植物が、10エーカーより多くを占有する、上記[5]から[11]のいずれかに記載の圃場。
[20]上記植物が、とうもろこし植物である、上記[1]から[2]のいずれかに記載の植物。
[21]上記Cry3Aタンパク質が、Cry3Aaタンパク質であり、上記Cry6Aタンパク質が、Cry6Aaタンパク質である、上記[1]又は[2]に記載の植物の植物細胞。
[22]上記Cry3Aタンパク質が、配列番号1及び配列番号2からなる群より選択される配列と95%同一であり、並びに上記Cry6Aタンパク質が、配列番号3と少なくとも95%同一である、上記[21]に記載の植物細胞。
[23]上記Cry3Aタンパク質が、配列番号1及び配列番号2からなる群より選択される配列を含み、並びに上記Cry6Aaタンパク質が、配列番号3を含む、上記[21]に記載の植物細胞。
[24]上記[21]に記載の植物細胞を生産する方法。
[25]ルートワーム昆虫を防除する方法であって、上記昆虫をCry3A殺虫タンパク質及びCry6A殺虫タンパク質と接触させることによる方法。
[26]上記Cry3Aタンパク質が、Cry3Aaタンパク質であり、上記Cry6Aタンパク質が、Cry6Aaタンパク質である、上記[1]に記載の植物。
[27]上記Cry3Aタンパク質が、Cry3Aaタンパク質であり、上記Cry6Aタンパク質が、Cry6Aaタンパク質である、上記[25]に記載の方法。
本発明は、一つには、Cry6Aaとの組み合わせでのCry3Aaに関する。本発明は、一つには、Cry3Aa及びCry6Aaがコーンルートワーム(ジアブロティカ種)集団による(いずれかの殺虫タンパク質系のみに対する)抵抗性の発生の予防に有用であるという驚くべき発見に関する。本開示のおかげで当業者には分かるであろうが、これらの殺虫Cryタンパク質を生産する植物は、これらの殺虫タンパク質系のいずれかのみに対して抵抗性であるコーンルートワーム集団が発生し得る懸念の軽減に有用であろう。
「マツマダラメイガ(corn borer)防護Bt(Cry1Ab又はCry1F)トウモロコシ製品についての具体的な構造化要件は、次のとおりである:
構造化リフュージ:コーンベルト内に20%非レプチドプレラ属Btトウモロコシリフュージ;コットンベルト内に50%非レプチドプレラ属Btリフュージ;
区画
内部(すなわち、Bt圃場内)
外部(すなわち、任意交配を最大にするためのBt圃場から1/2マイル(可能な場合には1/4マイル)以内の離隔した圃場)
圃場内植栽帯(In−field Strips)
植栽帯は、幼虫移動の影響を低減させるために少なくとも4畝幅(好ましくは6畝)でなければならない」
「マツマダラメイガIRMの要件:
−貴方のトウモロコシ畑の少なくとも20%をリフュージハイブリッドのために作付けすること
−ワタ生産地では、リフュージは50%でなければならない
−リフュージハイブリッドから1/2マイル以内に作付けしなければならない
−リフュージをBt圃場内の植栽帯として作付けすることができる;リフュージ植栽帯は、少なくとも4畝幅でなければならない
−標的昆虫のために経済的許容限界に達する場合にのみ、リフュージを従来の殺有害生物剤で処理してもよい
−Bt系噴霧可能殺虫剤をリフュージトウモロコシに対して使用することはできない
−適切なリフュージを、Btトウモロコシを有するすべての農地に作付けしなければならない」
Cry3Aa及びCry6Aa完全長毒素をコードする発現プラスミドの構築。完全長Cry3Aa及びCry6Aa Cryタンパク質をそれぞれ生産するように遺伝子操作で作り変えられたシュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)(Pf)発現プラスミドの構築には標準的なクローニング法を用いた。New England BioLabs(NEB;マサチューセッツ州イプスウィッチ)からの制限エンドヌクレアーゼをDNA消化に使用し、InvitrogenからのT4 DNAリガーゼをDNAライゲーションに使用した。Plasmid Mimi Kit(Qiagen、カリフォルニア州バレンシア)をその供給業者の指示書に従って使用して、プラスミド調製を行った。アガロースTris−アセテートゲル電気泳動の後、Millipore Ultrafree(登録商標)−DAカートリッジ(マサチューセッツ州ビルリカ)を使用して、DNAフラグメントを精製した。基本クローニング戦略は、完全長Cryタンパク質のコーディング配列(CDS)を、Cry3AaについてはpMYC1803における並びにCry6AaについてはpDOW1169におけるSpeI及びXhoI(又はXhoIと適合性であるSalI)制限部位に、それぞれサブクローニングすること、それによって、それらを、それぞれプラスミドpKK223−3(PL Pharmacia、ウィスコンシン州ミルウォーキー)からのPtacプロモーター及びrrnBT1T2又はrrnBT2ターミネータの発現制御下に置くことを必要とした。pMYC1803は、RSF1010複製起点と、テトラサイクリン抵抗性遺伝子と、DNAフラグメント含有タンパク質コーディング領域を導入することができる制限酵素認識部位の前にリボソーム結合部位とを有する中コピー数プラスミドである(米国特許出願第20080193974号)。Cry3Aa(組換えpMYC1803)についてはその発現プラスミドを電気穿孔法によってP.フルオレッセンス株MB214に形質転換させ、SOC−Soy加水分解物培地に回収し、20μg/mL テトラサイクリンを含有する溶原培地(Lysogeny broth)(LB)培地にプレーティングした。発現ベクターpDOW1169は、pMYC1803に類似しているが、pDOW1169は、ウラシルをコードするpyrF遺伝子を保有し、この遺伝子は、ウラシルを欠くM9最小培地のプレートでの形質転換にP.フルオレッセンスウラシル栄養要求性菌株(例えばDPf10)が使用されたときに形質転換体をスクリーニングするためのマーカーとして使用された(Schneider et al. 2005)。微生物操作の詳細は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第20060008877号、同第20080193974号及び同第20080058262号から入手できる。miniprepプラスミドDNAの制限消化によって、コロニーをさらにスクリーニングした。挿入物を含有する選択されたコロニーのプラスミドDNAは、商業的シークエンシング供給業者、例えばeurofins MWG Operon(アラバマ州ハンツヴィル)、との契約によりシークエンシングされた。配列データを集め、Sequencher(商標)ソフトウェア(Gene Codes Corp、ミシガン州アナーバー)を使用して分析した。
成長及び発現。Bt受容体結合及び昆虫バイオアッセイをはじめとする特性づけのためのCry3Aa及びCry6Aa毒素の振盪フラスコ生産での成長及び発現分析を、発現構築物を持つ振盪フラスコ成長P.フルオレッセンス株(例えば、Cry3AaについてはクローンpMYC1334、及びCry6AaについてはpDAB102018)によって遂行した。20μg/mL テトラサイクリンを補足したP.フルオレッセンス培地で一晩成長させたCry3Aaについての種培養物を使用して、20μg/mL テトラサイクリンを伴う200mLの同培地に接種した。しかし、Cry6Aaについての種培養物は、M9最小ブロスにおいて一晩成長させ、それを使用して、抗生物質なしの200mLのP.フルオレッセンス培地に接種した。24時間、28〜30℃で、300rpmで振盪しながらの最初のインキュベーションの後、イソプロピル−β−D−1−チオガラクトピラノシド(IPTG)の添加により、PtacプロモーターによるCry3Aa及びCry6Aa毒素の発現を誘導した。誘導時に及び誘導後の様々な時点で培養物をサンプリングした。600nmでの光学密度(OD600)により、細胞密度を測定した。
振盪フラスコサンプルの細胞分画及びSDS−PAGE分析。各サンプリング時、サンプルの細胞密度をOD600=20に調整し、1mLアリコートを14,000×gで5分間、遠心分離した。細胞ペレットを−80℃で凍結させた。EasyLyse(商標)細菌タンパク質抽出溶液(EPICENTRE(登録商標)Biotechnologies、ウィスコンシン州マディソン)を使用して、凍結細胞ペレットサンプルから可溶性及び不溶性画分を生成した。各細胞ペレットを1mL EasyLyse(商標)溶液に再浮遊させ、溶解バッファでさらに1:4希釈し、振盪しながら室温で30分間インキュベートした。溶解産物を14,000rpmで20分間、4℃で遠心分離し、上清を可溶性画分として回収した。その後、ペレット(不溶性画分)を等容量のリン酸緩衝食塩水(PBS;11.9mM Na2HPO4、137mM NaCl、2.7mM KCl、pH7.4)に再浮遊させた。サンプルを、β−メルカプトエタノールを含有する4× Laemmliサンプルバッファと3:1で混合し、5分間沸騰させた後、NuPAGE Novex 4−20% Bis−Trisゲル(Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド)に負荷した。電気泳動は、推奨NuPAGE MOPSバッファ中で行った。SimplyBlue(商標)Safe Stainをその製造業者(Invitrogen)のプロトコルに従って用いてゲルを染色し、Typhoon画像形成システム(GE Healthcare Life Sciences、ペンシルバニア州ピッツバーグ)を使用して画像形成した。
封入体調製。SDS−PAGE及びMALDI−MS(マトリックス支援レーザー脱離/イオン化質量分析)によって実証されるように、不溶性B.t.殺虫タンパク質を生産したP.フルオレッセンスから、Cryタンパク質封入体(IB)調製を行った。誘導後48時間のものから作成したP.フルオレッセンス細胞ペレットを37oC水浴で解凍した。それらの細胞を、溶解バッファ(50mM Tris、pH7.5、200mM NaCl、20mM EDTA二ナトリウム塩(エチレンジアミン四酢酸)、1%Triton X−100、及び5mM ジチオトレイトール(DTT))に再浮遊させて25% w/vにした;Cry3Aaについてのみ使用直前に5mL/Lの細菌プロテアーゼ阻害剤カクテル(P8465 Sigma−Aldrich、ミズーリ州セントルイス)を添加した。最低設定でホモジナイザー(Tissue Tearor、BioSpec Products,Inc.、オクラホマ州バートルズヴィル)を使用して、細胞を浮遊させた。金属製スパチュラで混ぜることによって25mgのリゾチーム(Sigma L7651、白色鶏卵からのもの)をその細胞浮遊液に添加し、その浮遊液を室温で1時間インキュベートした。その浮遊液を氷で15分間冷却し、その後、Branson Sonifier 250を使用して音波処理した(1分セッションを2回、50%デューティサイクル、30%アウトプット)。細胞溶解産物を顕微鏡検査によって点検した。追加の25mgのリゾチームを必要に応じて添加し、インキュベーション及び音波処理を繰り返した。細胞溶解が顕微鏡検査によって確認されたら、溶解産物を11,500×gで25分間(4℃)遠心分離してIBペレットを形成し、上清を廃棄した。IBペレットを100mL 溶解バッファに再浮遊させ、ハンドミキサーで均質化し、上記のように遠心分離した。上清が無色になり、IBペレットが堅くなり、オフホワイトの色になるまで、そのIBペレットを(50mL 溶解バッファへの)再浮遊、音波処理及び遠心分離によって繰り返し洗浄した。最終洗浄については、2mM EDTAを含有する滅菌濾過(0.22μm)蒸留水にIBペレットを再浮遊させ、遠心分離した。2mM EDTAを含有する滅菌濾過蒸留水に最終ペレットを再浮遊させ、1mLアリコートを−80oCで保存した。
SDS−PAGE分析及び定量。IBペレットの1mLアリコートを解凍し、滅菌濾過蒸留水で1:20希釈することによって、IB調製物中のタンパク質のSDS−PAGE分析及び定量を行った。次に、その希釈サンプルを4×還元用サンプルバッファ[250mM Tris、pH6.8、40% グリセロール(v/v)、0.4% ブロモフェノールブルー(w/v)、8%SDS(w/v)及び8% β−メルカプト−エタノール(v/v)]と共に沸騰させ、Novex(登録商標)4〜20% Tris−グリシン、12+2ウエルゲル(Invitrogen)上に負荷し、1×Tris/グリシン/SDSバッファ(Invitrogen)で泳動させた。ゲルをおおよそ60分間、200ボルトで泳動させて、染色し、脱染し、その後、SimplyBlue(商標)Safe Stain(Invitrogen)手順を行った。同じゲルでのウシ血清アルブミン(BSA)サンプル泳動についての濃度測定値を比較することによって標的バンドの定量を行って、Bio−Rad Quantity Oneソフトウェアを使用して標準曲線を生成した。
封入体の可溶化。(50〜70mg/mLのCry3Aa及びCry6Aaタンパク質をそれぞれ含有する)P.フルオレッセンスクローンMR832及びDPf13032からの10mLの封入体浮遊液をEppendorf モデル5415C微量遠心管の最高設定(おおよそ14,000×g)で遠心分離して、封入体をペレット化した。保存用バッファ上清を除去し、50mLコニカルチューブの中で、Cry3Aa及びCry6Aaの両方について25mLの50mM CAPS[3−(シクロヘキシルアミノ)−1−プロパンスルホン酸(3−(cyclohexamino)1−propanesulfonic acid)]バッファ、pH10.5でそれぞれ置換した。ピペットを使用して封入体を再浮遊させ、ボルテックスにかけて徹底的に混合した。4℃で一晩、穏やかに揺動するプラットフォーム上にそれらのチューブを置いて、完全長Cry3Aa及びCry6Aaタンパク質を抽出した。それらの抽出物を30,000×gで30分間、4℃で遠心分離し、可溶化された完全長Cryタンパク質を含有するそれらの得られた上清を保存した。
完全長プロトキシンのトランケーション。完全長Cry3Aaをトリプシンで消化して、さらなるトリプシン消化に対して抵抗性である活性形態のCryタンパク質を生成した。具体的には、可溶化された完全長Cry3Aaとトリプシン(ウシ膵臓)(Sigma、ミズーリ州St.)を(20:1=Cryタンパク質:酵素、w/w)で、100mM 炭酸ナトリウムバッファ、pH11中、室温で1〜3時間インキュベートした。SDS−PAGE分析によって完全活性化又はトランケーションを確認した。それぞれ、完全長Cry3Aaの分子質量は、≒73kDaであり、そのトリプシンコアは、≒55kDaであった。Cry3Aaの完全長及びトリプシンコアのアミノ酸配列を、SEQ ID 1及びSEQ ID 2として提供する。完全長Cry6Aaは、標的昆虫コーンルートワームに対してそのキモトリプシンまたはトリプシンいずれのコアより有意に活性である。従って、完全長Cry6Aaを結合アッセイに用いた。完全長Cry6Aaのアミノ酸配列を、SEQ ID 3として提供する。
Cry毒素の精製。イオン交換クロマトグラフィーシステムを使用して、トリプシン処理Cry3Aa及び完全長Cry6Aaをさらに精製した。具体的には、ATKA Explorer液体クロマトグラフィーシステム(Amersham Biosciences)を使用して、それらをさらに精製した。Cry3AaとCry6Aaの両方については、バッファAは、10mM CAPSバッファ、pH10.5であり、バッファBは、10mM CAPSバッファ、pH10.5+1M NaClであった。Capto Q(5mL)カラム(GE)を使用した。バッファAを使用してカラムを十分に平衡させた後、Cry毒素溶液をカラムに5mL/分の流量で注入した。1mL/画分で5mL/分での0〜100%のバッファB勾配を使用して溶離を行った。選択された画分の、最高品質の標的タンパク質を含有する画分をさらに選択するための、SDS−PAGE分析の後、それらの画分をプールした。生成Cry3Aaトリプシンコアと完全長Cry6Aaの両方について、透析によりバッファを10mM CAPS、pH10.5に変えた。SDS−PAGE、及びBSAを標準物質として用いるTyphoon画像形成システム(GE)分析を用いて定量した後、サンプルを、後の結合アッセイのために4℃で保存した。
BBMV調製。昆虫中腸の刷子縁膜小胞(BBMV)調製物を、Cry毒素受容体結合アッセイのために広範に使用した。本発明において使用するBBMV調製物は、Wolfersberger et al.(1987)によって記載された方法を用いて第3齢のウエスタンコーンルートワーム(ジアブロティカ・ヴィルギフェラ・ヴィルギフェラ(Diabrotica virgifera virgifera)LeConte)の単離された中腸から調製した。ロイシンアミノペプチダーゼを前記調製物中の膜タンパク質のマーカーとして使用し、以前に記載されているように(Li et al.2004a)、粗製ホモジネート及びBBMV調製物のロイシンアミノペプチダーゼ活性を判定した。ブラッドフォード法(1976)を用いて、BBMV調製物のタンパク質濃度を測定した。
125I標識。飽和及び競合結合アッセイのために、125Iを使用して精製Cry3Aaトリプシンコア及び完全長Cry6Aaを標識した。放射標識がCry毒素の生物活性を無効にしないことを保証するために、Pierce(登録商標)Iodination Beads(Pierce Biotechnology,Thermo Scientific、イリノイ州ロックフォード)の指示書に従うことによりNaIを使用して低温ヨウ素標識化を行った。バイオアッセイの結果は、ヨウ素標識化Cry3Aaトリプシンコア及び完全長Cry6Aa両方がウエスタンコーンルートワームの幼虫に対して依然として活性であることを示した。125I−Cry3Aa及び125I−Cry6AaをPierce(登録商標)Iodination Beads(Pierce)及びNa125Iで得た。Zeba(商標)Desalt Spin Columns(Pierce)を使用して、ヨウ素標識化タンパク質から取り込まれない又は遊離125Iを除去した。ヨウ素標識化Cryタンパク質の比放射能は、1〜5uCi/ugの範囲であった。標識及び結合アッセイの多重反復を行った。
飽和結合アッセイ。以前に記載されているように(Li et al. 2004b)、125I標識Cry毒素を使用して飽和結合アッセイを行った。昆虫BBMVへのCry3Aa及びCry6Aaの特異的結合を判定するために、並びに結合親和性(解離定数、Kd)及び結合部位濃度(所与の量のMMVに特異的に結合する毒素の最大量、Bmax)を推定するために、一連の漸増濃度の125I−Cry3Aa又は125I−Cry6Aaのいずれかを、それぞれ、所与の濃度(0.1mg/mL)の昆虫BBMVと共に、0.1% BSAを補足した150uLの20mM Bis−Tris、pH6.0、150mM KCl中、室温で60分間、穏やかに攪拌しながらインキュベートした。20,000×gで、室温で8分間の遠心分離により、浮遊液中の遊離毒素から、BBMVに結合した毒素を分離した。0.1% BSAを含有する900uLの氷冷した同じバッファでそのペレットを2回洗浄した。ペレットに残存する放射能をCOBRAII Auto−Gamma counter(Packard、a Canberra company)で測定し、全結合を考究した。別の系列の結合反応を並行して準備し、BBMVのすべての特異的結合部位を完全に占有するように500〜1000倍過剰の対応する非標識毒素を結合反応のそれぞれに含め、それを使用して非特異的結合を判定した。全結合から非特異的結合を引くことによって、特異的結合を推定した。GraphPad Prism 5.01(GraphPad Software、カリフォルニア州サンディエゴ)を実行することにより、使用した標識毒素の濃度に対するピコモルあたりのBBMVタンパク質に特異的に結合した毒素分子数(pmol)を用いてこれらの毒素のKd及びBmax値を推定した。Microsoft Excel又はGraphPad Prismプログラムのいずれかを使用して、チャートを作成した。実験を少なくとも3回繰り返した。これらの結合実験は、125I−Cry3Aaと125I−Cry6Aaの両方がBBMVに特異的に結合できることを明示した(図1A及び1B)。125I−Cry3Aa及び125I−Cry6Aaは、結合親和性Kd=24.0±9.76、10.14±8.29(nM)、及び結合部位濃度Bmax=21.97±5.99pmole/mg、0.66±0.33(pmole/mg BBMV)をそれぞれ有した。
競合結合アッセイ。Cry3Aaトリプシンコアと完全長Cry6AaがBBMV結合部位を共有するかどうかを判定するために、さらに競合結合アッセイを行った。Cry3Aa同種競合結合アッセイのために、漸増量(0〜2500nM)の非標識Cry3Aaを、先ず、5nM 標識Cry3Aaと混合し、その後、それぞれ、所与の濃度(0.1mg/mL)のBBMVと共に室温で60分間インキュベートした。BBMVと結合した125I−Cry3Aaの百分率を、それぞれの反応について、非標識競合物不在での最初の特異的結合と比較して決定した。125I−Cry3Aaと非標識Cry6Aaの間の異種競合結合アッセイを行って、それらが同じセットの受容体(単数又は複数)を共有するかどうかを特定した。これは、BBMV上の推定受容体(単数又は複数)について標識Cry3Aaと競合させるために反応に含める競合物としての非標識Cry6Aaの量を増加させることによって果たした。実験を少なくとも3回繰り返した。実験結果は、Cry3Aaは、モル濃度がおおよそ2500nM(5nM 125I−Cry3Aaと比較して500倍過剰)に増加すると、それ自体を約60%置換できることを明示した。残りの40%は、他の箇所で説明した飽和結合結果及び非特異的結合の定義に基づいて、置換され得ない非特異的結合と見なし、従って、この非特異的結合を減算し、ここには示さなかった。これは、この特異的結合が、500倍過剰の非標識Cry3Aaによって完全に置換されたことを示唆している(図2)。しかし、Cry6Aaは、125I−Cry3Aaを置換することができなかった。これらのデータは、Cry3AaがCry6Aaと受容体又は結合部位を共有しないことを示す。
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Claims (13)
- Cry3Aa殺虫タンパク質及びCry6Aa殺虫タンパク質を産生するトランスジェニック植物であって、前記Cry3Aaタンパク質が、配列番号1および配列番号2からなる群から選択される配列と少なくとも95%同一であり、前記Cry6Aaタンパク質が、配列番号3と少なくとも95%同一である、トランスジェニック植物。
- Cry3Ba、Cry34Ab及びCry35Abからなる群より選択される第三の殺虫活性タンパク質をさらに産生する、請求項1に記載のトランスジェニック植物。
- 前記DNAを含む、請求項1から2のいずれかに記載の植物の種子。
- 非Btリフュージ植物からのリフュージ種子と請求項3に記載の複数の種子とを含む種子の混合物であって、前記リフュージ種子が前記混合物中のすべての種子の40%未満を構成する、種子の混合物。
- 前記リフュージ種子が、前記混合物中のすべての種子の30%未満を構成する、請求項4に記載の種子の混合物。
- 前記リフュージ種子が、前記混合物中のすべての種子の20%未満を構成する、請求項4に記載の種子の混合物。
- 前記リフュージ種子が、前記混合物中のすべての種子の10%未満を構成する、請求項4に記載の種子の混合物。
- 前記リフュージ種子が、前記混合物中のすべての種子の5%未満を構成する、請求項4に記載の種子の混合物。
- 請求項3に記載の複数の種子を含む種子容器であって、ゼロのリフュージ種子を含む容器。
- 前記植物が、とうもろこし植物である、請求項1から2のいずれかに記載の植物。
- 前記植物細胞が、Cry3Aa殺虫タンパク質および前記Cry6Aa殺虫タンパク質を産生する、請求項1又は2に記載の植物の植物細胞。
- 前記Cry3Aタンパク質が、配列番号1及び配列番号2からなる群より選択される配列を含み、並びに前記Cry6Aaタンパク質が、配列番号3を含む、請求項11に記載の植物細胞。
- ルートワーム昆虫を防除する方法であって、前記昆虫を請求項1に記載のトランスジェニック植物またはその一部と接触させることによる、方法。
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