CN101505589A

CN101505589A - 昆虫抗性转基因草坪草

Info

Publication number: CN101505589A
Application number: CNA2006800394100A
Authority: CN
Inventors: 广田贡; 浅野真一郎
Original assignee: Phyllom LLC
Current assignee: Phyllom LLC
Priority date: 2005-08-30
Filing date: 2006-08-30
Publication date: 2009-08-12
Also published as: ZA200801884B; AU2006284817A1; US20090070896A1; WO2007027828A3; EP1957653A2; WO2007027828A2; CA2620862A1; EP1957653A4

Abstract

本发明涉及到具有草坪草有害昆虫抗性的转基因草坪草。叙述了产生这种昆虫抗性转基因草坪草片段的方法。本发明还涉及到这种昆虫抗性转基因草坪草的应用，来消除或减少喷射型杀虫剂的使用，来保护草坪草免于受到昆虫的毁坏。

Description

昆虫抗性转基因草坪草

技术领域

本发明包括一种转基因草坪草，该种植物具有攻击草坪草的某种昆虫的抗性。本发明也包括产生昆虫抗性转基因草坪草的方法。本发明还提供了转基因草的应用，来保护草坪使之免于昆虫攻击。

背景技术

苏云金芽胞杆菌是芽孢型，棒状，革兰氏阳性细菌，与所说的蜡样芽胞杆菌相近。我们发现了大量的苏云金芽胞杆菌菌株，它们组成了苏云金芽胞杆菌亚种，如苏云金芽胞杆菌，苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种，苏云金芽胞杆菌鲇泽亚种等等，这是根据最初由Bonnefoi和de Barjac于1963年提出的分类方案来分类的。苏云金芽胞杆菌在细胞内晶体的产生上，明显区别于其它的芽胞杆菌，这些晶体是不溶性蛋白质沉淀物，其中许多对于不同种类的昆虫具有杀虫的活性。在孢子形成的过程中，苏云金芽胞杆菌合成大量这种蛋白质，然后这些蛋白质结晶成许多类型的晶体。

苏云金芽胞杆菌中编码这种晶体蛋白的基因，由于其晶体产生的表现型被称为“cry”。随后被命名为crylAa的第一个cry基因是由Schnepf和Whiteley约在20年前克隆的(1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78，2893-2897)。此后，发表了许多其它的cry基因克隆的报告。

苏云金芽胞杆菌产生了许多种晶体蛋白，其在对昆虫的专一性是不同的，甚至在一个菌株内也是不同的。大多数苏云金芽胞杆菌产生晶体杀虫蛋白对于抵抗鳞翅类是很有效的。另外，有一种苏云金芽胞杆菌菌株，它能产生具有能抵抗双翅目和鞘翅目类昆虫的晶体杀虫蛋白。在苏云金芽胞杆菌的晶体蛋白中，已经知道Cry3，Cry7，Cry8，Cry9，Cry43对于抵抗鞘翅目类昆虫是有效的。其中，据报道Cry8Ca对于抵抗金龟子是有效的(Ohba et al.，1992，J.Appl.Microbiol.14，54-57)。2003年，Asano等人(2003，Biological Control 28(2003)，191-196)发现了一种新的苏云金芽胞杆菌菌株，叫做SDS-502，它对于抵抗金龟子类的古铜丽金龟，东方丽金龟，和豆金龟子显示出非常高水平的有效性。豆金龟子，一种日本丽金龟，在美国有着特别的重要性。它偶然的被引入了美国，变成了一种对于草地和公园植物种类如观赏性植物严重有害的昆虫。这种昆虫的幼虫食草根，这会导致对草坪草的严重毁坏。成年日本丽金龟食不同的庄稼和包括玫瑰和草莓类植物的观赏植物。这个基因对于SDS-502菌株的高郁李抗性是非常重要的，它已经被分离出来，被命名为cry8Da。编码cry8Da这个基因的蛋白质被发现具有抵抗日本丽金龟的高比活性，它至少是Cry8Ca和Cry43Aa比活性的两倍高，Cry8Ca和Cry43Aa是两种其它的苏云金芽胞杆菌，它们具有日本丽金龟和其它甲虫抗性的晶体蛋白。

最近，采用所选的苏云金芽胞杆菌cry基因在庄稼植物中表达来进行昆虫防治。从表达cry1Ab基因的玉米和表达cry1Ac基因的棉花中获得了技术和商业上的成功。然而，据报道无论是转基因草坪草还是观赏植物都不具有这种昆虫抗性。有报道称，经转化的草坪草具有真菌抗性和除草抗性(e.g.，Cho，et al.，2000，Plant Cell Reports 19，1084-1089)，但是没有表明草坪草或观赏植物的转化。这是因为其中有许多未解决的难题。例如，在高活性草坪草细胞中，高转化率对于引入昆虫抗性是非常重要的，但是，技术上的难题阻碍了成功转化草坪草细胞的进行。此外，高效率的从转化细胞再生成完整植物对于产生一个抵抗幼虫和成年日本丽金龟的转基因草坪草和转基因观赏植物是也是具有决定性的。这两点证明了产生一个完整的转基因草坪草植物或完整的观赏植物的过程中，存在一些严重的技术上的困难，阻碍了过程的发展。

此外，技术上的困难还体现在产生可转化植物细胞或愈伤组织上，缺乏一个有效的昆虫抗性基因，特别是一个高效抵抗圣甲虫类昆虫的基因，这个困难是产生昆虫抗性转基因草坪草和其它观赏植物另外一个主要的障碍。本专利的一个申请者发现了苏云金芽胞杆菌的一个cry基因，cry8Da，它编码一个对金龟子有高效抗性的蛋白质(参见U.S.Patent Application No.20030017967，该文献通过引用而被合并于此)。本发明克服了产生了具有昆虫抗性的转基因草坪草技术上的困难，证明了昆虫抗性可以引入草坪草，接下来这种转化的草坪草具有生长成具有昆虫抗性的完整植物的能力。

发明内容

本发明采用了一种方法，这种方法能产生具有再生成完整草坪草植物的能力的高效(可转化)草坪草愈伤组织。

在另一个实施例中，提供了具有昆虫抗性基因cry8Da转基因草，这是在苏云金芽胞杆菌SDS—502菌株中发现的。

在一个实施例中，提供了不同的苏云金芽胞杆菌昆虫抗性基因，用来转化成活性草愈伤组织。这些苏云金芽胞杆菌基因与抵抗不同昆虫种类昆虫抗性作比较。cry8Da基因对于金龟子具有专一性，另一个苏云金芽胞杆菌基因cry1Ca与粘虫复合物，如甜菜粘虫的抗性作比较，在本发明中也发现了其应用。

在另一个实施例中，提供了区别转化草细胞和非转化细胞的不同标记。

在另一个实施例中，提供了一个含有昆虫抗性基因的转基因草坪草。这个昆虫抗性基因可以从苏云金芽孢杆菌中获得，例如，cry8Da是来自苏云金芽孢杆菌SDS502菌株。

在另一个实施例中，昆虫抗性基因与选自南部蒙面金龟子，无斑金龟；草坪草蒙面金龟子，多毛犀金龟和西北黑头金龟子；六月或五月甲虫，绿金龟；玫瑰金龟子，蔷薇鳃角金龟；欧洲金龟子，欧洲鳃角金龟子；棕色金龟子，雌性金龟子；栗褐色金龟子，斑喙丽金龟；东方丽金龟，东方异丽金龟；日本丽金龟，豆金龟子；大豆金龟子，红铜丽金龟；绿金龟，古铜异丽金龟；黑草坪草金龟，黑绒金龟；贪夜蛾，甜菜夜蛾；粘虫，美洲粘虫；土蚕，球菜夜蛾；杂色地老虎，杂色夜蛾；颗粒地老虎，地老虎；紫苜蓿蛾，麦牧野螟；西方菌苔蛾，西方草螟；和斯佩里菌苔蛾，斯佩里草螟中的昆虫抗性作比较。

昆虫抗性基因可以从对草坪草有害昆虫致病的细菌中获得。在一个实施例中，这个基因可从选自苏芸金芽胞杆菌，日本甲虫芽胞杆菌，如缓死芽孢杆菌(Paenibacillus lentimorbus)，幼虫芽孢杆菌菌株的微生物中获得。

这种昆虫抗性基因可编码对昆虫活性蛋白质，可从以下基因选择，Cry1Aa1，Cry1Aa2，Cry1Aa3，Cry1Aa4，Cry1Aa5，Cry1Aa6，Cry1Aa7，Cry1Aa8，Cry1Aa9，Cry1Aa10，Cry1Aa11，Cry1Aa12，Cry1Aa13，Cry1Aa14，Cry1Ab1，Cry1Ab2，Cry1Ab3，Cry1Ab4，Cry1Ab5，Cry1Ab6，Cry1Ab7，Cry1Ab8，Cry1Ab9，Cry1Ab10，Cry1Ab11，Cry1Ab12，Cry1Ab13，Cry1Ab14，Cry1Ab15，Cry1Ab16，Cry1Ac1，Cry1Ac2，Cry1Ac3，Cry1Ac4，Cry1Ac5，Cry1Ac6，Cry1Ac7，Cry1Ac8，Cry1Ac9，Cry1Ac10，Cry1Ac11，Cry1Ac12，Cry1Ac13，Cry1Ac14，Cry1Ac15，Cry1Ad1，Cry1Ad2，Cry1Ae1，Cry1Af1，Cry1Ag1，Cry1Ah1，Cry1Ai1，Cry1Ba1，Cry1Ba2，Cry1Ba3，Cry1Ba4，Cry1Bb1，Cry1Bc1，Cry1Bd1，Cry1Bd2，Cry1Be1，Cry1Be2，Cry1Bf1，Cry1Bf2，Cry1Bg1，Cry1Ca1，Cry1Ca2，Cry1Ca3，Cry1Ca4，Cry1Ca5，Cry1Ca6，Cry1Ca7，Cry1Ca8，Cry1Ca9，Cry1Ca10，Cry1Cb1，Cry1Cb2，Cry1Da1，Cry1Da2，Cry1Db1，Cry1Db2，Cry1Ea1，Cry1Ea2，Cry1Ea3，Cry1Ea4，Cry1Ea5，Cry1Ea6，Cry1Eb1，Cry1Fa1，Cry1Fa2，Cry1Fb1，Cry1Fb2，Cry1Fb3，Cry1Fb4，Cry1Fb5，Cry1Ga1，Cry1Ga2，Cry1Gb1，Cry1Gb2，Cry1Gc，Cry1Ha1，Cry1Hb1，Cry1Ia1，Cry1Ia2，Cry1Ia3，Cry1Ia4，Cry1Ia5，Cry1Ia6，Cry1Ia7，Cry1Ia8，Cry1Ia9，Cry1Ia10，Cry1Ia11，Cry1Ib1，Cry1Ic1，Cry1Ic2，Cry1Id1，Cry1Ie1，Cry1If1，Cry1Ja1，Cry1Jb1，Cry1Jc1，Cry1Jc2，Cry1Jd1，Cry1Ka1，Cry2Aa1，Cry2Aa2，Cry2Aa3，Cry2Aa4，Cry2Aa5，Cry2Aa6，Cry2Aa7，Cry2Aa8，Cry2Aa9，Cry2Aa10，Cry2Aa11，Cry2Ab1，Cry2Ab2，Cry2Ab3，Cry2Ab4，Cry2Ab5，Cry2Ab6，Cry2Ac1，Cry2Ac2，Cry2Ac3，Cry2Ad1，Cry2Ae1，Cry3Aa1，Cry3Aa2，Cry3Aa3，Cry3Aa4，Cry3Aa5，Cry3Aa6，Cry3Aa7，Cry3Ba1，Cry3Ba2，Cry3Bb1，Cry3Bb2，Cry3Bb3，Cry3Ca1，Cry4Aa1，Cry4Aa2，Cry4Aa3，Cry4Ba1，Cry4Ba2，Cry4Ba3，Cry4Ba4，Cry4Ba5，Cry5Aa1，Cry5Ab1，Cry5Ac1，Cry5Ba1，Cry6Aa1，Cry6Aa2，Cry6Ba1，Cry7Aa1，Cry7Ab1，Cry7Ab2，Cry8Aa1，Cry8Ba1，Cry8Bb1，Cry8Bc1，Cry8Ca1，Cry8Ca2，Cry8Da1，Cry8Da2，Cry8Da3，Cry8Ea1，Cry9Aa1，Cry9Aa2，Cry9Ba1，Cry9Ca1，Cry9Ca2，Cry9Da1，Cry9Da2，Cry9Ea1，Cry9Ea2，Cry9Eb1，Cry9Ec1，Cry10Aa1，Cry10Aa2，Cry10Aa3，Cry11Aa1，Cry11Aa2，Cry11Aa3，Cry11Ba1，Cry11Bb1，Cry12Aa1，Cry13Aa1，Cry14Aa1，Cry15Aa1，Cry16Aa1，Cry17Aa1，Cry18Aa1，Cry18Ba1，Cry18Ca1，Cry19Aa1，Cry19Ba1，Cry20Aa1，Cry21Aa1，Cry21Aa2，Cry21Ba1，Cry22Aa1，Cry22Aa2，Cry22Ab1，Cry22Ab2，Cry22Ba1，Cry23Aa1，Cry24Aa1，Cry25Aa1，Cry26Aa1，Cry27Aa1，Cry28Aa1，Cry28Aa2，Cry29Aa1，Cry30Aa1，Cry30Ba1，，Cry31Aa1，Cry31Aa2，Cry32Aa1，Cry32Ba1，Cry32Ca1，Cry32Da1，Cry33Aa1，Cry34Aa1，Cry34Aa2，Cry34Ab1，Cry34Ac1，Cry34Ac2，Cry34Ba1，Cry35Aa1，Cry35Aa2，Cry35Ab1，Cry35Ab2，Cry35Ac1，Cry35Ba1，Cry36Aa1，Cry37Aa1，Cry38Aa1，Cry39Aa1，Cry40Aa1，Cry40Ba1，Cry41Aa1，Cry41Ab1，Cry42Aa1，Cry43Aa1，Cry43Ba1，Cry44Aa，Cry45Aa，Cry46Aa，Cry47Aa，Cyt1Aa1，Cyt1Aa2，Cyt1Aa3，Cyt1Aa4，Cyt1Aa5，Cyt1Ab1，Cyt1Ba1，Cyt2Aa1，Cyt2Aa2，Cyt2Ba1，Cyt2Ba2，Cyt2Ba3，Cyt2Ba4，Cyt2Ba5，Cyt2Ba6，Cyt2Ba7，Cyt2Ba8，Cyt2Ba9，Cyt2Bb1，Cyt2Bc1，Cyt2Ca1，Vip3A(a)and Vip3A(b).and Vip3a(b)。

这种昆虫抗性基因可从选自沙雷菌类，发光杆菌类和致病杆菌类的微生物中获得。这种沙雷菌类包括变形斑沙雷菌，嗜虫沙雷氏菌，荧光假单孢菌，嗜线虫致病杆菌和伯氏致病杆菌。

这种昆虫抗性基因可包括来自于苏云金芽孢杆菌蓓蓓(buibui)菌株的cry8Ca基因，来自于日本甲虫芽胞杆菌或苏云金芽孢杆菌cry1Ca基因的cry43A基因。

本发明进一步指出了通过将一种或多种昆虫抗性基因引入到草坪草中，来减少或消除任何喷射到草坪草上化学或生物上杀虫剂的方法。

这种转基因草坪草可以选自：碱地鼠尾粟(Sporobolus airoides)；窄颖赖草(Leymus angustus)；多花黑麦草(Lolium multiflorum)；百喜草(Paspalum notatum)；披碱草杂交的大麦(Elyhordeum)；狗牙根(Cynodon dactylon)；须芒草(Andropogon)；雀麦(Bromus)；黍(Panicummiliaceum)；刚莠竹(Microstegium)；荞麦(Eriogonum)；野牛草(Buchloedactyloides)；喜湿虉草(Phalaris aquatica)；加州雀麦(Californiabrome)；阿拉斯加雀麦(Bromus sitchensis)；加拿大早熟禾(Poacompressa)；金黄草(Phalaris)；紫羊茅(Festuca rubra)；草(Echinochloa)；剪股颖(rostis tenuis)；大麦(Hordeum vulgare)；小麦(Triticum aestivum)；匍匐剪股颖(Agrostis stolonifera)；苇状看麦娘(Alopecurus arundinaceus)；扁穗冰草(Agropyron cristatum)；披碱草(Elymus dahuricus)；毛花雀稗(Paspalum dilatatum)；羊茅(Festuca)；丝状疣羊茅(Festuca filiformis)；穇子(Eleusinecoracana)；鸭茅状磨擦禾(Tripsacum)；甜高粱(Sorghum bicolor)；牧草(Bouteloua)；无芒雀麦(Bromus stamineus)；硬羊茅(Festucatrachyphylla)；假高粱(Sorghastrum nutans)；中间偃麦草(Thinopyrumintermedium)；食用稗(Echinochloa esculenta)；草地早熟禾(Poapratensis)；狼尾草(Pennisetum clandestinum)；杂色黍(Panicumcoloratum)；知风草(Eragrostis)；多毛雀麦Bromus commutatus)；牛尾草(Festuca pratensis)；草原看麦娘(Alopecurus pratensis)；草地黑麦草(Lolium pratense)；粟草(Milium)；燕麦(Avena)；鸭茅(Dactylis glomerata)；黑黍(Penni setum ameri canum)；多年生黑麦草(Lolium perenne)；草原草(Bromus wildenowii)；北美草原牧草(Koeleria macrantha)；鼠尾羊茅(Vulpia myuros)；紫羊茅(Festucarubra)；小糠草(Agrostis gigantea)；哈定草(Phalaris arundinacea)；粗茎早熟禾(Poa trivialis)；高冰草(Thinopyrum ponticum)；俄罗斯新麦草(Psathyrostachys juncea)；黑麦(Secale cereale)；黑麦草(Lolium)；羊茅(Festuca ovina)；紫羊茅(Festuca rubra)；籽粒苋(Bromus inermis)；双色高粱(Sorghum bicolor)；河边冰草(Elymuslanceolatus)；苏丹草(Sorghum bicolor)；柳枝稷(Panicum virgatum)；高羊茅(Lolium arundinaceum)；高燕麦草(Arrhenatherum elatius)；长穗偃麦草(Thinopyrum ponticum)；猫尾草(Phleum pratense)；小黑麦(Triticosecale rimpaui)；发草(Deschampsia caespitosa)；蓝茎冰草(Pascopyrum smithii)；小麦(Triticum)；芽草(Agropyron)和披碱草(Elymus)。

在另一个实施例中，产生昆虫抗性草坪草的方法包括：a)将包含一个或多个昆虫抗性基因的一个或多个质粒引入一个或多个草坪草愈伤组织，其中所述的愈伤组织是转化物；b)培养愈伤组织；c)愈伤组织生长为成熟的草坪草；d)测试成熟草坪草的昆虫抗性。

详细说明：

A 发明概况

本发明提供了来自不同杆菌微生物如来自苏云金芽孢杆菌SDS-502菌株的cry8Da基因的昆虫抗性基因转化而来的转基因草坪草和观赏植物。最终转化的草坪草和观赏植物具有了昆虫捕食抗性。本发明还提供了来自于杆菌微生物如由SDS—502菌株的cry8Da基因的昆虫抗性基因转化而来的草坪草和观赏植物的方法。

杀虫晶体蛋白如cry8Da是大量蛋白的聚集物(约130～149k道尔顿)，实际上，它是一个原毒素，它必需经过活化才能起作用。在正常条件下，这个晶体蛋白是高不溶解的，所以一般来讲，它对人类，高等动物和大多数昆虫是安全的。然而，在高PH(约PH＝9.5以上)的还原条件下，它是可溶的，这个条件通常存在于鳞翅类幼虫的中肠中。因此，苏云金芽孢杆菌的晶体蛋白是高度专一的杀虫剂。

一旦它在昆虫的肠中溶解，这个原毒素由肠蛋白酶分开生产约60k道尔顿的活性毒素。这个毒素术语叫△-内毒素。它连接中肠上皮细胞，在细胞膜上产生小孔来保持离子平衡。因此，肠道迅速被固定化，上皮细胞溶解，幼虫停止生长，经由血液PH平衡，肠道PH降低。

转基因植物如由编码杀虫蛋白的基因如cry8Da基因转化的草坪草和观赏植物通过表达这个晶体蛋白来抵抗昆虫侵袭和捕食以得到保护，晶体蛋白的作用与晶体蛋白作为植物生物杀虫剂的外源应用是一样的。这样，昆虫抗性与转基因植物作比较，结果表明，野生植物很正常的成为昆虫喜欢捕食的目标。

B 常规技术

本发明的实践应用除了特别指出的，将广泛应用分子生物学，微生物学细胞生物学，生物化学和免疫学的常规技术，这些在技术的技能之内。这些技术在文献中已经完全解释说明了，例如，在细胞生物学中：实验手册(J.E.Cellis，ed.，1998)；分子生物学最新实验指导(F.M.Ausubel etal.，eds，1987)；分子生物学精编实验指南(Wiley and Sons，1999)。此外，商业上采用的测试试剂盒和试剂的实验操作完全根据实验册规定的操作方法来操作，除了特别指出的。

C 定义

此处采用的“外源DNA片段”，“异源序列”，“异源核苷酸”或“异源基因”是来自于与特定宿主细胞或生物体不同的来源，或者说，如果来自于相同的来源，多聚核苷酸或氨基酸序列就要被修改。因此，一个宿主细胞或生物体的异源基因包括特定宿主细胞的一个内源基因，但是它必需来自于不同的来源或者被修改。本发明异源序列的修改是通过不同DNA片段连接到一起来构建一个异源基因。或者是一个异源基因可由核苷酸合成来产生。这个术语指的是一个DNA片段，这个片段是细胞外来的或异源的，或细胞同源的，或在通常不存在元素的宿主细胞核苷酸内的一个异源和同源基因序列的联合体。当外源DNA片段被表达时，它们产生外源多肽。

术语“基因”被广泛应用，指的是与生物体功能有关的任何DNA片段。基因包括需表达的编码序列或调节序列，还有具有组合功能的序列，如本发明中的例子，两个基因经由一个连接序列合并来构建一个单个新基因，这个基因具有许多复杂的生物功能。基因也包括非表达的DNA片段，这片段具有许多种表达如其它蛋白质的识别序列基因的功能。基因可由许多种来源来获得，包括目的基因的克隆，如任何活体，或由已知或推测序列信息合成，还包括根据所希望获得的特性来设计的人工序列。

术语“转基因”，当它用于描述一个细胞或多细胞生物体时，指的是这个细胞或生物体复制了一个异源核苷酸或表达了由异源核苷酸编码的一个肽或蛋白质。转基因细胞或生物体可含有细胞本身(非重组体)不存在的基因。转基因细胞和生物体除了被修改和由人工方式再导入的基因还可以含有细胞或生物体本身就有的基因。这个术语也包含了含有以不将核苷酸从细胞或生物体移除的形式修改的细胞内源性核苷酸的细胞或生物体；这种修改包括由基因替代，定点变异和相关技术来获得。

术语“昆虫抗性”意思是与抵抗有害昆虫攻击(例如，细胞或多细胞生物体的昆虫侵袭或昆虫捕食)相对照的一种基因，细胞或多细胞生物体的一种特性。这种特性包括杀虫，击退昆虫和抑制昆虫捕食的能力。在昆虫抗性的例子中，包括的特性有由于植物产生的一种或多种昆虫活性(例如，杀虫的或昆虫顿态)复合物，或由植物产生的一种或多种驱虫剂或喂食抑制剂复合物，有害昆虫不以植物为食。

术语“昆虫活性”在此的意思是一种具有杀虫，抵抗昆虫或抑制昆虫喂食能力的基因，这是蛋白质的一种特性。它指的是对某种昆虫具有非常高的专一性或者具有一个广普的活性。在广谱昆虫活性基因或蛋白的例子中，这种活性指的是植物能以许多种昆虫种类为目标或者说对这些昆虫具有抵抗的活性，甚至对于非昆虫类如蜘蛛也有抵抗的活性，但是它必需具有抵抗某种种类昆虫的能力，这是本发明预期到达的目标，使得草坪草和观赏植物免于昆虫的攻击。

D 本发明的方法和应用

本发明涉及到具有有害昆虫抗性的转基因草坪草的生产和应用。

采用一些不同的方法，本发明产生了许多具有很强抵抗金龟子攻击转基因草坪草的能力，但是本发明的方法和应用并不是有限的，它还适用于其它适合的昆虫抗性基因转化的草坪草对有害昆虫的控制。

为了产生昆虫抗性转基因草坪草，申请者改善了产生转化草坪草愈伤组织的效率和由转化的愈伤组织再生成完整植物的效率。申请者开展了不同培养条件的广泛调查，发现高效率产生一些昆虫抗性转基因片段活性愈伤组织的一些条件。为了产生昆虫抗性转基因草坪草，申请者采用了以一个合理的速率产生高效活性能再生的草愈伤组织的条件。申请者的没有转基因草具有昆虫抗性活性的实验和事实指出可以再生成完整植物的高活性(例如，可转化的)草坪草愈伤组织的诱导是一个重要的突破。

在一个实施例中，采用两个载体来转化活性草坪草。在一个载体中，pBI221，一个昆虫活性基因连同花椰菜花叶病毒35S启动子和根癌农杆菌Ti质粒胭脂碱合成酶终止子一起被克隆。应当注意，除了pBI221以外，许多载体可以在它们整合到宿主植物基因的时候采用，这个在载体中被克隆的昆虫抗性基因具有一个适合的启动子和终止子。任何一个转化载体的适当选择都可以由人们采用技术中的一般技能来完成。

多数的启动子对于表达转基因植物中的一个基因是有用的。技术中熟练的技工就可以从已知的数据库中获得有用的植物启动子。例如，植物CARE：植物启动子和顺式调控元件的数据库在http://sphinx.rug.ac.be：8080/PlantCARE/网页中有最近的明细。(Lescot，et al.，2002，Nucl.Acids Res.，30，325-327)

在转基因植物中表达的昆虫抗性基因可以是一个结合蛋白。例如，原生质体靶向引导序列可添加到昆虫抗性蛋白中来。或者说，昆虫活性蛋白可由chroloplast靶向序列结合来使基因在chroloplast中表达。

在另一个实施例中，采用了两个载体包括pBI221，另外一个载体，GFP(绿色荧光蛋白)基因与相同的35S启动子和NOS终止子一起被克隆。这两个载体混合起来覆盖金粉。覆盖金粉的DNA由基因枪注射到活性草细胞中。显示出绿色荧光的转化的草细胞被切开，进一步培养直到生长成完整植物体。在这个例子中，GFP作为一个“报道”基因。当转化发生时，它由绿色荧光蛋白报道。报道基因另一个例子是gus基因。文献报道的大肠杆菌(EC 3.2.1.31)的葡糖苷酸酶(GUS)在转化植物中，能够作为标记基因提供期望的特性。Gus基因和其它报道基因对于技术上熟练的人们来说是相当了解了。

本发明不仅仅局限于选择转化草细胞的GFP报道基因。在另一个例子中，采用了双丙氨膦除草剂抗性基因(bar)。这个方法也产生了一个昆虫抗性草片段。这是一个采用选择基因的例子。只有转化草细胞可以在专门的组织培养基中生存(因此所选择)。其它可以用来产生昆虫抗性转基因草的除草剂抗性基因包括草甘磷抗性(例，3-烯酰(基)丙酮酸莽草酸5-磷酸酶)基因，溴草腈抗性(例，溴草腈水解酶)基因，磺胺类药物抗性(例，二氢蝶酸合酶)基因，和磺脲类抗性(例，乙酰乳酸合酶)基因。此外，抗生素抗性基因例如卡那徽素和均霉素抗性基因也可以采用。另一方面，代谢相关的基因也可采用来选择转化草细胞。例如，编码磷酸甘露糖异构酶的大肠杆菌的manA基因(Miles et al.，1984，Gene 32，41-48)可以转化甘露糖-6-磷酸为果糖-6-磷酸，果糖-6-磷酸接下来可被植物细胞利用。当被放入含有唯一糖原甘露糖的培养基中时，非转化细胞又转化细胞过渡生长。植物转化中这些选择标记基因的采用对于技术中般熟练的技工是熟知的。

在本发明中，采用基因枪技术转化活性草坪草愈伤组织，在下文的例子中有叙述。此外，也采用农杆菌介导，花器浸蘸法，原生质体和电穿孔转化技术方法。这些转化方法对于技术中般熟练的技工是熟知的。

再生的完整的植物被移植到盆栽的泥土中来接收受日本丽金龟幼虫的攻击。日本丽金龟幼虫选择性的捕食那些缺乏昆虫抗性的植物(例如，那些没有被适合的昆虫抗性基因转化的植物)，但是它并不捕食那些由适合昆虫抗性基因转化的植物(见下文)。比较昆虫保护的水平，由昆虫抗性基因转化为草坪草的昆虫保护水平与采用非转化草坪草植物的化学杀虫剂(倍硫磷)获得的保护水平一样高。

在另一个例子中，本发明证明了申请者的方法可以产生两个其它草类的昆虫抗性转基因片段，茅花黑麦草和多年生黑麦草。

昆虫抗性草可由任何下面的草类来获得。尽管是非限制性的，适当的列出其一般的名字和拉丁文名字，如下：碱地鼠尾粟(Sporobolusairoides)；窄颖赖草(Leymus angustus)；多花黑麦草(Loliummultiflorum)；百喜草(Paspalum notatum)；大麦(Elyhordeum)；狗牙根(Cynodon dactylon)；须芒草(Andropogon)；雀麦(Bromus)；黍(Panicum miliaceum)；刚莠竹(Microstegium)；荞麦(Eriogonum)；野牛草(Buchloe dactyloides)；喜湿虉草(Phalaris aquatica)；加州雀麦(California brome)，阿拉斯加雀麦(Bromus sitchensis)；加拿大早熟禾(Poa compressa)；金黄草(Phalaris)；紫羊茅(Festucarubra)；稗草(Echinochloa)；剪股颖(rostis tenuis)；大麦(Hordeumvulgare)；小麦(Triticum aestivum)；匍匐剪股颖(Agrostisstolonifera)；苇状看麦娘(Alopecurus arundinaceus)；扁穗冰草(Agropyron cristatum)；披碱草(Elymus dahuricus)；毛花雀稗(Paspalum dilatatum)；羊茅(Festuca)；丝状疣羊茅(Festucafiliformis)；穆子(Eleusine coracana)；鸭茅状磨擦禾(Tripsacum)；甜高粱(Sorghum bicolor)；牧草(Bouteloua)；无芒雀麦(Bromusstamineus)；硬羊茅(Festuca trachyphylla)；假高粱(Sorghastrumnutans)；中间偃麦草(Thinopyrum intermedium)；食用稗(Echinochloaesculenta)；草地早熟禾(Poa pratensis)；狼尾草(Pennisetumclandestinum)；杂色黍(Panicum coloratum)；知风草(Eragrostis)；多毛雀麦Bromus commutatus)；牛尾草(Festuca pratensis)；草原看麦娘(Alopecurus pratensis)；草地黑麦草(Lolium pratense)；粟草(Milium)；燕麦(Avena)；鸭茅(Dactylis glomerata)；黑黍(Pennisetum americanum)；多年生黑麦草(Lolium perenne)；草原草(Bromus wildenowii)；北美草原牧草(Koeleria macrantha)；鼠尾羊茅(Vulpia myuros)；紫羊茅(Festuca rubra)；小糠草(Agrostisgigantea)；哈定草(Phalaris arundinacea)；粗茎早熟禾(Poatrivialis)；高冰草(Thinopyrum ponticum)；俄罗斯新麦草(Psathyrostachys juncea)；黑麦(Secale cereale)；黑麦草(Lolium)；羊茅(Festuca ovina)；紫羊茅(Festuca rubra)；籽粒苋(Bromusinermis)；双色高粱(Sorghum bicolor)；河边冰草(Elymuslanceolatus)；苏丹草(Sorghum bicolor)；柳枝稷(Panicum virgatum)；高羊茅(Lolium arundinaceum)；高燕麦草(Arrhenatherum elatius)；长穗偃麦草(Thinopyrum ponticum)；猫尾草(Phleum pratense)；小黑麦(Triticosecale rimpaui)；发草(Deschampsia caespitosa)；蓝茎冰草(Pascopyrum smithii)；小麦(Triticum)；芽草(Agropyron)；和披碱草(Elymus)。

一旦具有昆虫抗性特性的一个转基因草片段产生，这个特性可以由杂交技术转移到其它草片段中，这些对于技术中一般熟练的技工是熟知的。

本发明的另一方面，草坪草的昆虫抗性由苏云金芽孢杆菌昆虫活性毒素来完成，如下文的例子所述。在这个例子中，采用一个编码cry8Da蛋白的苏云金芽孢杆菌基因cry8Da。这个基因被克隆到一个载体中，用来转化来自于茅花黑麦草和多年生黑麦草活性草细胞。为了产生抵抗金龟子的草坪草，可采用除cry8Da外的苏云金芽孢杆菌昆虫活性基因。例如，可采用cry8Da，cry18’s和cry43Aa。这些基因可以由苏云金芽胞杆菌日本亚种(cry8Ca)和日本甲虫孢子杆菌，如，缓死芽孢杆菌(cry18’s和cry43Aa)分离出来。另一个例子说明了在转化载体中怎样克隆cry43Aa。这些基因属于苏云金芽孢杆菌cry基因种类，尽管一些来自于非苏云金芽孢杆菌(例如cry18和cry43Aa)。

其它有效抵抗金龟子的微生物的毒素包括那些来自于其它杆菌如幼虫芽孢杆菌和来自于非杆菌细菌的。例如，沙雷菌属某种，如变形斑沙雷菌和嗜虫沙雷氏菌(Hurst et al.，2004，J.Bacteriol.186，5116-5128)；发光杆菌，如荧光假单孢菌；(Hurst et al.，2004，J.Bateriol.186，5116-5128，and Bowen et al.，1998，Science，280，2129-2132)，和致病杆菌如嗜线虫致病杆菌和伯氏致病杆菌(Brillard et al.，2001，Appl.Environ.Microbiol.，67，2515-2525)，这些是已知的用来产生对昆虫致病的蛋白，在本发明中打算采用。

申请者发明的范围不仅仅局限于金龟子。贪夜蛾和甜菜夜蛾是很有害的草坪草害虫。采用本发明的方法，鳞翅类的昆虫抗性可被导入到草坪草中。这个昆虫活性基因可从苏云金芽孢杆菌中分离出来，并在草坪草中表达来产生一种或多种昆虫活性蛋白。例如，本发明打算采用下面的苏云金芽孢杆菌昆虫活性蛋白，包括：Cry1Aa1，Cry1Aa2，Cry1Aa3，Cry1Aa4，Cry1Aa5，Cry1Aa6，Cry1Aa7，Cry1Aa8，Cry1Aa9，Cry1Aa10，Cry1Aa11，Cry1Aa12，Cry1Aa13，Cry1Aa14，Cry1Ab1，Cry1Ab2，Cry1Ab3，Cry1Ab4，Cry1Ab5，Cry1Ab6，Cry1Ab7，Cry1Ab8，Cry1Ab9，Cry1Ab10，Cry1Ab11，Cry1Ab12，Cry1Ab13，Cry1Ab14，Cry1Ab15，Cry1Ab16，Cry1Ac1，Cry1Ac2，Cry1Ac3，Cry1Ac4，Cry1Ac5，Cry1Ac6，Cry1Ac7，Cry1Ac8，Cry1Ac9，Cry1Ac10，Cry1Ac11，Cry1Ac12，Cry1Ac13，Cry1Ac14，Cry1Ac15，Cry1Ad1，Cry1Ad2，Cry1Ae1，Cry1Af1，Cry1Ag1，Cry1Ah1，Cry1Ai1，Cry1Ba1，Cry1Ba2，Cry1Ba3，Cry1Ba4，Cry1Bb1，Cry1Bc1，Cry1Bd1，Cry1Bd2，Cry1Be1，Cry1Be2，Cry1Bf1，Cry1Bf2，Cry1Bg1，Cry1Ca1，Cry1Ca2，Cry1Ca3，Cry1Ca4，Cry1Ca5，Cry1Ca6，Cry1Ca7，Cry1Ca8，Cry1Ca9，Cry1Ca10，Cry1Cb1，Cry1Cb2，Cry1Da1，Cry1Da2，Cry1Db1，Cry1Db2，Cry1Ea1，Cry1Ea2，Cry1Ea3，Cry1Ea4，Cry1Ea5，Cry1Ea6，Cry1Eb1，Cry1Fa1，Cry1Fa2，Cry1Fb1，Cry1Fb2，Cry1Fb3，Cry1Fb4，Cry1Fb5，Cry1Ga1，Cry1Ga2，Cry1Gb1，Cry1Gb2，Cry1Gc，Cry1Ha1，Cry1Hb1，Cry1Ia1，Cry1Ia2，Cry1Ia3，Cry1Ia4，Cry1Ia5，Cry1Ia6，Cry1Ia7，Cry1Ia8，Cry1Ia9，Cry1Ia10，Cry1Ia11，Cry1Ib1，Cry1Ic1，Cry1Ic2，Cry1Id1，Cry1Ie1，Cry1If1，Cry1Ja1，Cry1Jb1，Cry1Jc1，Cry1Jc2，Cry1Jd1，Cry1Ka1，Cry2Aa1，Cry2Aa2，Cry2Aa3，Cry2Aa4，Cry2Aa5，Cry2Aa6，Cry2Aa7，Cry2Aa8，Cry2Aa9，Cry2Aa10，Cry2Aa11，Cry2Ab1，Cry2Ab2，Cry2Ab3，Cry2Ab4，Cry2Ab5，Cry2Ab6，Cry2Ac1，Cry2Ac2，Cry2Ac3，Cry2Ad1，Cry2Ae1，Cry3Aa1，Cry3Aa2，Cry3Aa3，Cry3Aa4，Cry3Aa5，Cry3Aa6，Cry3Aa7，Cry3Ba1，Cry3Ba2，Cry3Bb1，Cry3Bb2，Cry3Bb3，Cry3Ca1，Cry4Aa1，Cry4Aa2，Cry4Aa3，Cry4Ba1，Cry4Ba2，Cry4Ba3，Cry4Ba4，Cry4Ba5，Cry5Aa1，Cry5Ab1，Cry5Ac1，Cry5Ba1，Cry6Aa1，Cry6Aa2，Cry6Ba1，Cry7Aa1，Cry7Ab1，Cry7Ab2，Cry8Aa1，Cry8Ba1，Cry8Bb1，Cry8Bc1，Cry8Ca1，Cry8Ca2，Cry8Da1，Cry8Da2，Cry8Da3，Cry8Ea1，Cry9Aa1，Cry9Aa2，Cry9Ba1，Cry9Ca1，Cry9Ca2，Cry9Da1，Cry9Da2，Cry9Ea1，Cry9Ea2，Cry9Eb1，Cry9Ec1，Cry10Aa1，Cry10Aa2，Cry10Aa3，Cry11Aa1，Cry11Aa2，Cry11Aa3，Cry11Ba1，Cry11Bb1，Cry12Aa1，Cry13Aa1，Cry14Aa1，Cry15Aa1，Cry16Aa1，Cry17Aa1，Cry18Aa1，Cry18Ba1，Cry18Ca1，Cry19Aa1，Cry19Ba1，Cry20Aa1，Cry21Aa1，Cry21Aa2，Cry21Ba1，Cry22Aa1，Cry22Aa2，Cry22Ab1，Cry22Ab2，Cry22Ba1，Cry23Aa1，Cry24Aa1，Cry25Aa1，Cry26Aa1，Cry27Aa1，Cry28Aa1，Cry28Aa2，Cry29Aa1，Cry30Aa1，Cry30Ba1，，Cry31Aa1，Cry31Aa2，Cry32Aa1，Cry32Ba1，Cry32Ca1，Cry32Da1，Cry33Aa1，Cry34Aa1，Cry34Aa2，Cry34Ab1，Cry34Acl，Cry34Ac2，Cry34Bal，Cry35Aal，Cry35Aa2，Cry35Abl，Cry35Ab2，Cry35Ac1，Cry35Bal，Cry36Aal，Cry37Aal，Cry38Aal，Cry39Aal，Cry40Aal，Cry40Ba1，Cry41Aa1，Cry41Ab1，Cry42Aa1，Cry43Aa1，Cry43Ba1，Cry44Aa，Cry45Aa，Cry46Aa，Cry47Aa，Cyt1Aa1，Cyt1Aa2，Cyt1Aa3，Cyt1Aa4，Cyt1Aa5，Cyt1Ab1，Cyt1Ba1，Cyt2Aa1，Cyt2Aa2，Cyt2Ba1，Cyt2Ba2，Cyt2Ba3，Cyt2Ba4，Cyt2Ba5，Cyt2Ba6，Cyt2Ba7，Cyt2Ba8，Cyt2Ba9，Cyt2Bb1，Cyt2Bc1，Cyt2Ca1，Vip3A(a)andVip3A(b).and Vip3a(b)。采用本发明的方法来表达植物细胞中的蛋白，可以在草坪草或观赏植物中产生上面列出的蛋白。(例如，通过克隆编码以上蛋白的基因到适合载体和转化植物细胞，这在上面和下面有详细的描述)。

在另一方面，本发明提供了一个保护草坪草使其免于昆虫攻击的方法。根据一个实施例，被普遍称为蛴螬的甲虫幼虫可应用本发明来控制。蛴螬是甲虫的幼虫期阶段，如南部蒙面金龟子，无斑金龟；草坪草蒙面金龟子，多毛犀金龟和西北黑头金龟子；六月或五月甲虫，绿金龟；玫瑰金龟子，蔷薇鳃角金龟；欧洲金龟子，欧洲鳃角金龟子；棕色金龟子，雌性金龟子；栗褐色金龟子，斑喙丽金龟；东方丽金龟，东方异丽金龟；日本丽金龟，豆金龟子；大豆金龟子，红铜丽金龟；绿金龟，古铜异丽金龟；黑草坪草金龟，黑绒金龟。

除了这些金龟子以外，本发明还产生了具有抗蛾子和蝴蝶幼虫活性的转基因草坪草片段。例如，可获得地蚕和黏虫抗性如甜菜黏虫，甜菜夜蛾；黏虫，美洲粘虫；土蚕，球菜夜蛾；苹果银蛾，杂色夜蛾；颗粒夜蛾，地老虎还有抵抗紫苜蓿蛾，麦牧野螟；西部大草坪蛾，西方草螟；和斯佩里菌苔蛾，斯佩里草螟。

另一方面，提供了昆虫抗性观赏植物。表一举例说明了本发明采用的一些观赏植物。

表一易于被成年日本丽金龟攻击的景观植物

学名通用名

鸡爪槭(Acer palmatum) 日本槭

紫叶挪威槭(Acer plananoides) 挪威枫

欧洲七叶树(Aesculus hippocastanum) 马栗树

灰色桦树(Betula populifolia) 杨叶桦

美洲板栗(Castanea dentata) 美国栗子

木槿(Nibiscus syriacus) 白槿、木槿

黑核桃(Juglans nigra) 黑胡桃

苹果属(Malus species) 海棠、苹果

悬铃木(Platanus aceri folia) 二球悬铃木

钻天杨(Populus nigra italica) 意大利白杨

李属(Prunus species) 樱桃、黑梅、李子、桃子

蔷薇属(Rosa species) 玫瑰

黄樟(Sassafras albidum) 黄樟

美洲花楸(Sorbus americana) 美国花楸

美洲椴树(Tilia americana) 美国菩提树

美洲榆树(Ulmus americana) 美国榆树

英国榆树(Ulmus procera) 英国榆树

葡萄属(Vitis species) 食用葡萄

那些生长迅速而且对甲虫特别有吸引力的植物是最难保护的。玫瑰开花迅速而且对甲虫特别有吸引力。当甲虫量很多时，采用掐掉小芽和喷射杀虫剂来保护叶子或者用网覆盖玫瑰，使得甲虫不能入内。

甲虫喜爱某种杂草和非经济型植物，如蕨菜，接骨木，野蔷薇，印度锦葵，黄樟，常春藤，荨麻，野生葡萄和野生夏季葡萄。当毁坏这些昆虫侵袭连续源时，这些植物就被消除。

以上列出的植物(表一)和其它植物采用技术中熟练技工熟知的标准分子生物学和植物学方法由昆虫抗性基因转化，使植物生长，由接受昆虫攻击来确定昆虫抗性，在例子中举例说明了这种转基因草坪草，如下。

下面的例子显示出本发明可以用来产生具有昆虫抗性的转基因草坪草。技术中的那些熟练的技工可以知道当特定的实施例被图解和描述时，它们不限制这个发明。

附图说明

图一描述了转化的草坪草的PCR分析，显示的是以2kb带形式的cry8Da基因(右侧3条泳道)。左泳道是一个大小标记。左边第二泳道是非转基因草的阴性对照。

图二描述的是一张含有一些转基因草坪草片段盆栽的图片。这盆盆栽含有两只处在第三龄期的日本丽金龟幼虫，允许它们在盆栽里消耗草坪草为期一个月。一些植物显示出抗性，而另一些植物被昆虫毁坏。

图3A—3D显示的是SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：10的序列。

具体实施方式

下面通过实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。

实施例1：克隆cry8Da基因

根据Asano等((2003)，Biological Control 28，191-196，这文献由于整体上应用而合并与此)发表的文章描述的方法，从苏云金芽孢杆菌SDS—502菌株中克隆cry8Da基因。含有活性区域的cry8Da基因的一个片段以以下两个序列作引物和以克隆的cry8Da基因作为模版进行PCR扩增，

5’-GGATCCCATGAGTCCAAATAATCAAAATG(SEQ ID NO：1)

5’-CCCGGGTCACACATCTAGGTCTTCTTCTGC(SEQ ID NO：2)

PCR在含有10pg模版DNA和适当浓度的其它成分的一个100ul反应混合物中进行(对于技术中熟练技工熟知的)。在一个例子中，PCR混合物包含：10u110X缓冲液，2u1d-NTP，2.5ul引物1(20uM)，2.5ul引物2(20uM)，2ul耐热性DNA聚合酶，1ul模版DNA和80ul水。根据给定的质粒制造说明书PCR中的循环温度为96℃(30秒)45℃(45秒)72℃(1分钟30秒)，循环25次。PCR扩增基因片段在pGEM-T-Easy(美国威斯康辛州麦迪逊Promega公司)中被克隆，克隆的基因被依次证明了cry8Da基因的序列，如美国专利申请20030017967发表的(这个文献由于整体引用而合并与此)。pGEM-T-Easy中PCR扩增的cry8Da基因利用pGEM-T-Easy提供的位点和pBI221克隆的位点，由BamHI和SacI切断这些位点已经由BamHI和SacI切断移除gusA基因。产物质粒来自于pBI221，其中，cry8Da基因由叫做pBI221-8D1(SEQ ID NO：3)的克隆，并在植物转化中采用。在植物转化中采用的质粒pBI221-8D1和其它质粒，p35S-GFP，购买自Clonetech(美国加利福尼亚洲Mountain View)。

实施例2：克隆除cry8Da以外的甲虫活性基因

Cry43Aa基因(基因库序列号：AB115422)编码一个金龟子蛋白质毒素，如古铜异丽金龟和豆金龟子。这些是对草坪草严重有害的害虫，它们的捕食行为能引起相当大的毁坏。Cry43Aa基因从日本甲虫芽胞杆菌菌株中克隆，这个菌株是从患病的绿金龟和古铜异丽金龟分离出来的。全长的cry43Aa基因以两个以下序列为引物进行PCR扩增。

5’-GGATCCATGAATCAGTATCATAACCAAAACG(SEQ ID NO：4)

5’-CCCGGGTTACTTTTCCATACAAATCAATTCCAC(SEQ ID NO：5)

在PCR反应混合物中，采用由含有约100ngDNA的B.polilliae Hime菌株配制的1ul基因组DNA。

cry8Ca基因(基因库序列号：U04366)也编码一个金龟子蛋白质毒素。cry8Ca基因在Bacillus thrungiensis蓓蓓(buibui)菌株中克隆，这个菌株是从日本国际贸易和工业部工业科学与技术机构发酵研究所中获得的。全长的cry8Ca基因以两个下列序列为引物进行PCR扩增。

5’-GGATCCATGAGTCCAAATAATCAAAATGAG(SEQ ID NO：6)

5’-CCCGGGTTACTCTTCTTCTAACACGAGTTCTAC(SEQ ID NO：7)

在PCR反应混合物中，采用由含有约100ngDNA的B.thrungiensis蓓蓓(buibui)菌株配制的1ul基因组DNA。

PCR扩增的cryAa和cryCa基因在pBI221中克隆，如实施例1中所描述的，在抗甲虫活性测试之后，在草坪草转化中采用，如实施例10中描述的，如下。

实施例3：克隆crylCa基因

CrylCa基因(基因库序列号：X07518)编码一个黏虫复合物的蛋白毒素，如甜菜夜蛾，秋粘虫，美洲粘虫等。这些是对草坪草的严重有害的害虫，能引起相当大的毁坏。CrylCa基因在B.thringiensis subsp.aizawaiHD133菌株中克隆，这个菌株是从美国伊利诺州北方研究中心农业调研服务美国农业部中获得的。全长的crylCa基因以两个以下序列为引物进行PCR扩增，

5’-GGATCCCATGGAGGAAAATAATCAAAATCAATGC(SEQ ID NO：8)

5’-CCCGGGTTATTCCTCCATAAGGAGTAATTCC(SEQ ID NO：9)

在PCR反应混合物中，采用由含有100ngDNA的HD—133菌株配制的1ul基因组DNA。PCR扩增的crylCa基因在pBI221中克隆，如实施例1中所描述的，在抗甲虫活性测试之后，在草坪草转化中采用，如实施例10中描述的，如下。

实施例4：富含GC的cry8Da的合成

合成的cry8Da基因(SEQ ID NO：10)是从美国加利福尼亚洲Menlo ParkPhyllom LLC公司中获得。在这个基因中，GC和AT含量的比率被修改来增加天然存在的苏云金芽孢杆菌cry8Da序列的GC含量。苏云金芽孢杆菌基因利用富含AT的密码子多过如动物和植物的真核生物。在合成的cry8Da中，肽序列没有改变。合成的基因具有BamHI和NotI位点，这些位点可以直接克隆到被限制性内切酶酶切的pBI221中。基因在pBI221中克隆，在抗甲虫活性测试之后，在草坪草转化中采用，如实施例10中描述的，如下。实施例5愈伤组织诱导

在例子中采用茅花黑麦草和多年生黑麦草两种草坪草。将草的种子浸渍到1％的次氯酸钠中15分钟，以将种子表面灭菌。在不育的种子中，将种皮除去，去皮的种子浸渍到蒸馏水中过夜。种子由1％的次氯酸钠再处理15分钟。在第二次次氯酸钠处理后，切开种子，将种胚分离出来。胚在基于MS培养基的愈伤组织诱导培养基中培养(Murashige and Skoog，1962，Physiol.Plant，15，473-497)。在这个愈伤组织诱导培养基中，硝酸铵浓度减小到原始的MS培养基配方的50％，再加入3％的蔗糖。在实验中，不同的植物生长调节物质被测试以得到最好的结果，如表2所示。表2说明了由30个茅花黑麦草胚样品诱导的大量愈伤组织和大量的愈伤组织都可以再生成完整的植物。

表2：草坪草愈伤组织诱导和再生

实验中，申请者采用的MS培养基中2，4一二氯苯氧乙酸(2，4-D)和苄氨基嘌呤(BAP)的浓度分别为2mg/l，0.001mg/l。硫酸铜的浓度增加了50％。培养基含有0.25％的

(美国宾夕法尼亚纪北威尔士Merck公司)。胚在24℃条件下，愈伤组织诱导培养基中每天光照16小时，培养2个星期，直到愈伤组织形成。每三个星期，将愈伤组织转移到新鲜的培养基中持续到转化为止。

实施例6：转化

转化采用基因枪转化技术来完成。实验设计基于由日本北海道基因枪(GIE-III IDER)制造前沿科学提供的使用者手册。在愈伤组织诱导培养基中生长的愈伤组织，浸渍在高渗透压(HOP)，含有愈伤组织诱导培养基的全部成分和0.5M甘露醇的培养基中过夜。浸渍在高渗透压培养基的愈伤组织被切成1mm³的小尺寸。在一个转化中采用约有40块愈伤组织，将其放入愈伤组织诱导培养基中。用不同量(1ug—4ug)的pBI221—8D1和p35S—GEP在4ul乙醇中覆盖不同量的(10g到40ug)的金粉(1.5~3.0微米)，在样品上12cm处向愈伤组织块注射一次或两次。采用GFP作为转化率的指示剂，发现2ug产生的最高转化率的DNA覆盖了100ug金粉。注射一次和两次转化率没有明显差别。因此，许多大规模实验在此条件下进行。在一次转化中要采用草坪草种子的1600块愈伤组织。

实施例7：再生

转化的愈伤组织被转移到新鲜培养基中。每块愈伤组织被放到培养基中间距约1cm。几天内，转化细胞显示出GFP荧光。一周内，将显示出很强的GFP荧光的细胞群从每块愈伤组织中切下来，移植到一个再生培养基中。除了没有添加激素以外，这个再生培养基与愈伤组织诱导培养基相同。转化细胞在24℃的条件下每天光照16小时进行培养。每两个星期，将细胞转移到新鲜的培养基中。在四个星期内，3株GFP阳性茅花黑麦草片段生长成带有叶子和根的完整植物。

实施例8：转化愈伤组织的选择方法

除了GFP以外，双丙氨瞵抗性(bar)基因也可被采用作为转化细胞的选择标记。双丙氨瞵是谷氨酰胺合成酶抑制剂，bar基因编码的这个酶草胺膦酰基转移酶使得双丙氨瞵失去活性。Bar基因由PGTV-BAR(Becker，etal.，1992，Plant Mol.Biol.20，1195-1197)连同采用如下引物进行PCR的启动子和终止子中获得，

5’-CCGGAATTCGATCATGAGCGGAGAATTAAGG(SEQ ID NO：11)

5’-CCGGAATTCATCTTGAAAGAAATATAGTTTAAAT(SEQ ID NO：12)

该基因在Stratagene公司的pBluescriptII-SK+中克隆，被用来转化草坪草愈伤组织和pBI221-8Da1质粒。一些由双丙氨瞵选择的转化草细胞生长成双丙氨瞵抗性的完整植物。上面描述的昆虫攻击显示出一些植物对日本丽金龟的确有抗性。在另一个实施例中，采用潮霉素B对转化草细胞进行选择。在这个例子中，潮霉素B抗性基因由NOS启动子和终止子来进行克隆。

实施例9：转化草植物的PCR分析

当转化愈伤组织生长成完整植物时，从每个植物中取一部分叶子，根据试剂盒中的说明书(美国加州巴伦西亚Qiagen公司)采用Qiagen公司的微量植物DNA提取试剂盒(DNeasy Plant Mini Kit)从叶子样本中提取DNA。样本中cry8Da基因采用以下序列为引物进行PCR扩增分析，

5’-GGATCCCATGAGTCCAAATAATCAAAATG(SEQ ID NO：13)

5’-CCCGGGTCACACATCTAGGTCTTCTTCTGC(SEQ ID NO：14)

如果cry8Da基因存在于模板DNA样本(植物叶子提取)中，那这些引物可以产生2kb的扩增片段。所有的叶子样本都来源于GFP阳性愈伤组织部分，由插入植物基因组的cry8Da基因的PCR分析显示出这2kb片段(图1)。四个片段，其中三个来自于茅花黑麦草，一个来自于多年生黑麦草，它们由PCR分析选择出来，来进行昆虫抗性测试。

实施例10：昆虫抗性测试

将来自于转化愈伤组织的再生完整植物转移到含有盆栽肥料的15厘米直径的盆栽中。每个盆栽植入约6种植物。每个盆栽中，放入2个收集自草地的第三龄期的日本丽金龟幼虫，允许它们以草根为食，为期一个月。昆虫捕食了对昆虫没有抗性的植物的根(如，没有由昆虫抗性基因转化)，从而杀死植物。然而，那些经PCR分析(实施例9)对cry8Da成阳性的植物显示出对日本丽金龟的抗性而生存下来(图2)。保护植物的水平不比采用化学杀虫剂好，但与其相似。在这个例子中，采用的倍硫磷有机磷酸盐杀虫剂为0.45AI(活性成分)g/cm²。

通过第一次昆虫抗性测试和每个盆栽中5只第三龄期的日本丽金龟测试而生存下来的一种植物采用更多的昆虫攻击进行进一步的测试。含有cry8Da的草片段在更多昆虫攻击的第二次昆虫抗性测试也能生存下来。一个月的测试之后，所有5只昆虫在含有非转化草的盆栽中生存下来，而在大多数转基因盆栽没有生存的昆虫。

Claims

1.一种转基因草坪草，它包含一个昆虫抗性基因。

2 根据权利要求1所述的转基因草坪草，其中所述的昆虫抗性基因来自于苏云金芽孢杆菌。

3.根据权利要求1所述的转基因草坪草，其中所述的昆虫抗性基因包含的cry8Da来自于苏云金芽孢杆菌SDS—502菌株。

4.根据权利要求1所述的转基因草坪草，其中所述的昆虫抗性基因与昆虫的抗性作比较，这些昆虫选自南部蒙面金龟子，无斑金龟；草坪草蒙面金龟子，多毛犀金龟和西北黑头金龟子；六月或五月甲虫，绿金龟；玫瑰金龟子，蔷薇鳃角金龟；欧洲金龟子，欧洲鳃角金龟子；棕色金龟子，雌性金龟子；栗褐色金龟子，斑喙丽金龟；东方丽金龟，东方异丽金龟；日本丽金龟，豆金龟子；大豆金龟子，红铜丽金龟；绿金龟，古铜异丽金龟；黑草坪草金龟，黑绒金龟；贪夜蛾，甜菜夜蛾；粘虫，美洲粘虫；土蚕，球菜夜蛾；杂色地老虎，杂色夜蛾；颗粒地老虎，地老虎；紫苜蓿蛾，麦牧野螟；西方菌苔蛾，西方草螟；和斯佩里菌苔蛾，斯佩里草螟。

5.根据权利要求1所述的昆虫抗性基因，其中所述的基因由对草坪草有害昆虫致病的细菌获得。

6.根据权利要求3所述的昆虫抗性基因，其中所述的基因由选择自苏云金芽胞杆菌，日本甲虫芽胞杆菌，例如，缓死芽孢杆菌，和幼虫芽胞杆菌的微生物获得。

7.根据权利要求1所述的昆虫抗性基因，其中所述的基因编码昆虫活性蛋白，这些基因选择自Cry1Aa1，Cry1Aa2，Cry1Aa3，Cry1Aa4，Cry1Aa5，Cry1Aa6，Cry1Aa7，Cry1Aa8，Cry1Aa9，Cry1Aa10，Cry1Aa11，Cry1Aa12，Cry1Aa13，Cry1Aa14，Cry1Ab1，Cry1Ab2，Cry1Ab3，Cry1Ab4，Cry1Ab5，Cry1Ab6，Cry1Ab7，Cry1Ab8，Cry1Ab9，Cry1Ab10，Cry1Ab11，Cry1Ab12，Cry1Ab13，Cry1Ab14，Cry1Ab15，Cry1Ab16，Cry1Ac1，Cry1Ac2，Cry1Ac3，Cry1Ac4，Cry1Ac5，Cry1Ac6，Cry1Ac7，Cry1Ac8，Cry1Ac9，Cry1Ac10，Cry1Ac11，Cry1Ac12，Cry1Ac13，Cry1Ac14，Cry1Ac15，Cry1Ad1，Cry1Ad2，Cry1Ae1，Cry1Af1，Cry1Ag1，Cry1Ah1，Cry1Ai1，Cry1Ba1，Cry1Ba2，Cry1Ba3，Cry1Ba4，Cry1Bb1，Cry1Bc1，Cry1Bd1，Cry1Bd2，Cry1Be1，Cry1Be2，Cry1Bf1，Cry1Bf2，Cry1Bg1，Cry1Ca1，Cry1Ca2，Cry1Ca3，Cry1Ca4，Cry1Ca5，Cry1Ca6，Cry1Ca7，Cry1Ca8，Cry1Ca9，Cry1Ca10，Cry1Cb1，Cry1Cb2，Cry1Da1，Cry1Da2，Cry1Db1，Cry1Db2，Cry1Ea1，Cry1Ea2，Cry1Ea3，Cry1Ea4，Cry1Ea5，Cry1Ea6，Cry1Eb1，Cry1Fa1，Cry1Fa2，Cry1Fb1，Cry1Fb2，Cry1Fb3，Cry1Fb4，Cry1Fb5，Cry1Ga1，Cry1Ga2，Cry1Gb1，Cry1Gb2，Cry1Gc，Cry1Ha1，Cry1Hb1，Cry1Ia1，Cry1Ia2，Cry1Ia3，Cry1Ia4，Cry1Ia5，Cry1Ia6，Cry1Ia7，Cry1Ia8，Cry1Ia9，Cry1Ia10，Cry1Ia11，Cry1Ib1，Cry1Ic1，Cry1Ic2，Cry1Id1，Cry1Ie1，Cry1If1，Cry1Ja1，Cry1Jb1，Cry1Jc1，Cry1Jc2，Cry1Jd1，Cry1Ka1，Cry2Aa1，Cry2Aa2，Cry2Aa3，Cry2Aa4，Cry2Aa5，Cry2Aa6，Cry2Aa7，Cry2Aa8，Cry2Aa9，Cry2Aa10，Cry2Aa11，Cry2Ab1，Cry2Ab2，Cry2Ab3，Cry2Ab4，Cry2Ab5，Cry2Ab6，Cry2Ac1，Cry2Ac2，Cry2Ac3，Cry2Ad1，Cry2Ae1，Cry3Aa1，Cry3Aa2，Cry3Aa3，Cry3Aa4，Cry3Aa5，Cry3Aa6，Cry3Aa7，Cry3Ba1，Cry3Ba2，Cry3Bb1，Cry3Bb2，Cry3Bb3，Cry3Ca1，Cry4Aa1，Cry4Aa2，Cry4Aa3，Cry4Ba1，Cry4Ba2，Cry4Ba3，Cry4Ba4，Cry4Ba5，Cry5Aa1，Cry5Ab1，Cry5Ac1，Cry5Ba1，Cry6Aa1，Cry6Aa2，Cry6Ba1，Cry7Aa1，Cry7Ab1，Cry7Ab2，Cry8Aa1，Cry8Ba1，Cry8Bb1，Cry8Bc1，Cry8Ca1，Cry8Ca2，Cry8Da1，Cry8Da2，Cry8Da3，Cry8Ea1，Cry9Aa1，Cry9Aa2，Cry9Ba1，Cry9Ca1，Cry9Ca2，Cry9Da1，Cry9Da2，Cry9Ea1，Cry9Ea2，Cry9Eb1，Cry9Ec1，Cry10Aa1，Cry10Aa2，Cry10Aa3，Cry11Aa1，Cry11Aa2，Cry11Aa3，Cry11Ba1，Cry11Bb1，Cry12Aa1，Cry13Aa1，Cry14Aa1，Cry15Aa1，Cry16Aa1，Cry17Aa1，Cry18Aa1，Cry18Ba1，Cry18Ca1，Cry19Aa1，Cry19Ba1，Cry20Aa1，Cry21Aa1，Cry21Aa2，Cry21Ba1，Cry22Aa1，Cry22Aa2，Cry22Ab1，Cry22Ab2，Cry22Ba1，Cry23Aa1，Cry24Aa1，Cry25Aa1，Cry26Aa1，Cry27Aa1，Cry28Aa1，Cry28Aa2，Cry29Aa1，Cry30Aa1，Cry30Ba1，，Cry31Aa1，Cry31Aa2，Cry32Aa1，Cry32Ba1，Cry32Ca1，Cry32Da1，Cry33Aa1，Cry34Aa1，Cry34Aa2，Cry34Ab1，Cry34Ac1，Cry34Ac2，Cry34Ba1，Cry35Aa1，Cry35Aa2，Cry35Ab1，Cry35Ab2，Cry35Ac1，Cry35Ba1，Cry36Aa1，Cry37Aa1，Cry38Aa1，Cry39Aa1，Cry40Aa1，Cry40Ba1，Cry41Aa1，Cry41Ab1，Cry42Aa1，Cry43Aa1，Cry43Ba1，Cry44Aa，Cry45Aa，Cry46Aa，Cry47Aa，Cyt1Aa1，Cyt1Aa2，Cyt1Aa3，Cyt1Aa4，Cyt1Aa5，Cyt1Ab1，Cyt1Ba1，Cyt2Aa1，Cyt2Aa2，Cyt2Ba1，Cyt2Ba2，Cyt2Ba3，Cyt2Ba4，Cyt2Ba5，Cyt2Ba6，Cyt2Ba7，Cyt2Ba8，Cyt2Ba9，Cyt2Bb1，Cyt2Bc1，Cyt2Ca1，Vip3A(a)和Vip3A(b)和Vip3a(b)。

8.根据权利要求1所述的昆虫抗性基因，其中所述的昆虫抗性基因由选自沙雷菌类，发光杆菌类，致病杆菌类的微生物获得。

变形斑沙雷菌，嗜虫沙雷氏菌，荧光假单孢菌，嗜线虫致病杆菌和伯氏致病杆菌

9.根据权利要求8所述的沙雷菌类，其中所述的种类包括变形斑沙雷菌和嗜虫沙雷氏菌。

10.根据权利要求8所述的发光杆菌类，其中所述的种类包括荧光假单孢菌。

11.根据权利要求8所述的致病杆菌类，其中所述的种类包括嗜线虫致病杆菌和伯氏致病杆菌。

12.根据权利要求1中所述的转基因草坪草，其中所述的昆虫抗性基因包括来自于苏云金芽胞杆菌蓓蓓(buibui)菌株的cry8Ca基因。

13.根据权利要求1中所述的转基因草坪草，其中所述的昆虫抗性基因包括来自于日本甲虫芽胞杆菌的cry43A基因。

14.根据权利要求1中所述的转基因草坪草，其中所述的昆虫抗性基因包括苏云金芽胞杆菌cry1Ca基因。

15.根据权利要求1中所述的转基因草坪草，包含有SEQIDNO：10的多聚核苷酸序列。

16.一种减少或消除任何针对草坪草的化学或生物的杀虫剂喷射的方法，这种方法通过在草坪草中引入一个或多个昆虫抗性基因来控制虫害。

17.根据权利要求1或6中所述的转基因草坪草，其中所述的草种类选择自：碱地鼠尾粟(Sporobolus airoides)；窄颖赖草(Leymusangustus)；多花黑麦草(Lolium multiflorum)；百喜草(Paspalumnotatum)；披碱草杂交的大麦(Elyhordeum)；狗牙根(Cynodondactylon)；须芒草(Andropogon)；雀麦(Bromus)；黍(Panicummiliaceum)；刚莠竹(Microstegium)；荞麦(Eriogonum)；野牛草(Buchloe dactyloides)；喜湿虉草(Phalaris aquatica)；加州雀麦(California brome)；阿拉斯加雀麦(Bromus sitchensis)；加拿大早熟禾(Poa compressa)；金黄草(Phalaris)；紫羊茅(Festucarubra)；草(Echinochloa)；剪股颖(rostis tenuis)；大麦(Hordeum vulgare)；小麦(Triticum aestivum)；匍匐剪股颖(Agrostis stolonifera)；苇状看麦娘(Alopecurusarundinaceus)；扁穗冰草(Agropyron cristatum)；披碱草(Elymusdahuricus)；毛花雀稗(Paspalum dilatatum)；羊茅(Festuca)；丝状疣羊茅(Festuca filiformis)；穇子(Eleusine coracana)；鸭茅状磨擦禾(Tripsacum)；甜高粱(Sorghum bicolor)；牧草(Bouteloua)；无芒雀麦(Bromus stamineus)；硬羊茅(Festucatrachyphylla)；假高粱(Sorghastrum nutans)；中间偃麦草(Thinopyrum intermedium)；食用稗(Echinochloa esculenta)；草地早熟禾(Poa pratensis)；狼尾草(Pennisetum clandestinum)；杂色黍(Panicum coloratum)；知风草(Eragrostis)；多毛雀麦Bromus commutatus)；牛尾草(Festuca pratensis)；草原看麦娘(Alopecurus pratensis)；草地黑麦草(Lolium pratense)；粟草(Milium)；燕麦(Avena)；鸭茅(Dactylis glomerata)；黑黍(Pennisetum americanum)；多年生黑麦草(Lolium perenne)；草原草(Bromus wildenowii)；北美草原牧草(Koeleria macrantha)；鼠尾羊茅(Vulpia myuros)；紫羊茅(Festuca rubra)；小糠草(Agrostis gigantea)；哈定草(Phalaris arundinacea)；粗茎早熟禾(Poa trivialis)；高冰草(Thinopyrum ponticum)；俄罗斯新麦草(Psathyrostachys juncea)；黑麦(Secale cereale)；黑麦草(Lolium)；羊茅(Festuca ovina)；紫羊茅(Festuca rubra)；籽粒苋(Bromus inermis)；双色高粱(Sorghum bicolor)；河边冰草(Elymus lanceolatus)；苏丹草(Sorghum bicolor)；柳枝稷(Panicum virgatum)；高羊茅(Lolium arundinaceum)；高燕麦草(Arrhenatherum elatius)；长穗偃麦草(Thinopyrum ponticum)；猫尾草(Phleum pratense)；小黑麦(Triticosecale rimpaui)；发草(Deschampsia caespitosa)；蓝茎冰草(Pascopyrum smithii)；小麦(Triticum)；芽草(Agropyron)和披碱草(Elymus)。

18.一种产生昆虫抗性草坪草的方法，包括

a)将包含一个或多个昆虫抗性基因的一个或多个质粒引入草坪草愈伤组织，其中所述的愈伤组织是转化了的；

b)培养所述的愈伤组织；

c)使所述的愈伤组织生长成成熟草坪草；

d)测试所述的成熟草坪草的昆虫抗性。