CN112189560A - 一种箱根草组织培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种箱根草组织培养方法，属于植物组织培养技术领域。本发明旨在建立一种箱根草的组培体系，以通过组织培养扩繁技术为快速得到无菌的箱根草苗提供方法依据，以便加速箱根草扩繁速度、提高箱根草成活率，适应大规模生产的需要，以及后期对箱根草的多种生理机制，以及耐阴基因等研究打下基础。

Description

一种箱根草组织培养方法
技术领域
本发明涉及一种箱根草组织培养方法；属于植物组织培养技术领域。
背景技术
随着观赏草在现代园林景观中的应用愈来愈多，耐阴植物也更多地受到人们的关注， 箱根草(Hakonechloa macra)属禾本科箱根草属植物，又称为日本风知草，多年生宿根植物，耐阴，冬天在南方地区可露天过冬，且其生长速度慢，不会威胁生态平衡。然而 对于箱根草的繁殖大多采用分株，而国内培育多为小苗，分株效率低。与传统的繁殖方 式相比，植物组织培养生长周期短，繁殖率高，生产效率高，便于管理。
目前对于箱根草的组织培养快速繁殖技术研究较少。因此本发明旨在建立一种箱根 草的组培体系，以通过组织培养扩繁技术为快速得到无菌的箱根草苗提供方法依据，以便加速箱根草扩繁速度、提高箱根草成活率，适应大规模生产的需要，以及后期对箱根 草的多种生理机制，以及耐阴基因等研究打下基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种箱根草组织培养方法，加速箱根草扩繁速度、提高箱根草 成活率。
本发明采用的技术方案为：
一种箱根草组织培养方法，包括如下步骤：
1)、剪取当年生枝条健壮且无病害的带节茎段或茎尖10cm左右，用小刷子轻轻在水龙头下刷洗去茎段表面附着的灰尘等大颗粒污染物，然后用剪刀将茎段剪成2-3cm 的长度，小心剥尽叶鞘，保留腋芽，放入加洗洁精的锥形瓶中不断震荡，清洗3min后， 在流水下冲洗10min，然后吸干水分喷洒酒精放入超净工作台上，用无菌水清洗3遍， 75％酒精浸泡15s后再用无菌水冲洗3～5遍，然后在1％NaClO溶液中浸泡8min，期 间不断摇晃锥形瓶，用无菌水冲洗5～7遍，用灭过菌的滤纸吸干茎段表面水分，切除茎 段最顶端和最底部，后将茎段接种于如下培养基上：MS+30g/L蔗糖+7.2-7.5g/L琼脂， pH值调为5.7～5.8；培养40-50天；
2)、然后将箱根草茎段接种到初代诱导的培养基上，所述的初代诱导的培养基为：MS+30g/L蔗糖+7.2-7.5g/L琼脂+0.5mg/L 6-BA+0.25mg/L NAA，pH值调为5.7～5.8； 或MS+30g/L蔗糖+7.2-7.5g/L琼脂+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA，pH值调为5.7～5.8； 三周后腋芽开始萌发；
3)、将箱根草茎段诱导出的腋芽接种到增殖培养基上，两周后开始萌发丛状不定芽；增 殖培养基为MS+30g/L蔗糖+7.2-7.5g/L琼脂+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA，pH值调为5.7～5.8；
4)、不定芽的高度达到3～4cm，每个芽长3-5片叶时，将丛芽进行分丛，每从4-5个丛 芽，转入生根培养基中；所述生根培养基为1/2MS+30g/L蔗糖+7.2-7.5g/L琼脂+0.5mg/LIBA，pH值调为5.7～5.8。在培养一周后逐渐有新根产生。
优选地，在NaClO溶液中，每100ml加入1-2滴20吐温。
优选地，所述的初代诱导的培养基为：MS+30g/L蔗糖+7.2-7.5g/L琼脂+0.5mg/L6-BA+0.25mg/L NAA。
优选地，该方法的培养室温度为(25±1)℃，空气相对湿度保持在50％-60％，光照强度为2000lx，光周期为14h·d-1。
本发明所具有的有益效果：
本发明旨在建立一种箱根草的组培体系，以通过组织培养扩繁技术为快速得到无菌的 箱根草苗提供方法依据，以便加速箱根草扩繁速度、提高箱根草成活率，适应大规模生 产的需要。
附图说明：
图1为实施例1箱根草芽诱导培养20天的生长情况示意图；
图2为实施例1箱根草增殖培养40天的生长情况示意图；
图3为实施例1箱根草生根培养20天的生长情况示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不限定本发明的保护范围。
试验材料取自天津滨海新区开发区第八大街泰达植物资源库的箱根草，选取其当年 生带节茎段作为供试材料进行试验。
实施例1
一种箱根草组织培养方法，包括如下步骤：
1)、剪取当年生枝条健壮且无病害的带节茎段或茎尖10cm左右，用小刷子轻轻在水龙头下刷洗去茎段表面附着的灰尘等大颗粒污染物，然后用剪刀将茎段剪成2-3cm 的长度，小心剥尽叶鞘，保留腋芽，放入加洗洁精的锥形瓶中不断震荡，清洗3min后， 在流水下冲洗10min，然后吸干水分喷洒酒精放入超净工作台上，用无菌水清洗3遍， 75％酒精浸泡15s后再用无菌水冲洗3～5遍，然后在1％NaClO溶液(在NaClO溶液 中，每100ml加入2滴20吐温。)中浸泡8min，期间不断摇晃锥形瓶，用无菌水冲洗 5～7遍，用灭过菌的滤纸吸干茎段表面水分，切除茎段最顶端和最底部，后将茎段接种 于如下培养基上：MS+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH值调为5.7～5.8；培养40-50天；
2)、将箱根草茎段接种到初代诱导的培养基上，所述的初代诱导的培养基为：MS+30g/L 蔗糖+7.5g/L琼脂+0.5mg/L 6-BA+0.25mg/L NAA，pH值调为5.7～5.8；三周后腋芽开始萌发；
3)、将箱根草茎段诱导出的腋芽接种到增殖培养基上，两周后开始萌发丛状不定芽；增 殖培养基为MS+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA，pH值调为 5.7～5.8；
4)、不定芽的高度达到3～4cm，每个芽长3-5片叶时，将丛芽进行分丛，每从4-5个丛 芽，转入生根培养基中；所述生根培养基为1/2MS+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂+0.5mg/LIBA， pH值调为5.7～5.8。在培养一周后逐渐有新根产生。
该方法的培养室温度为(25±1)℃，空气相对湿度保持在50％-60％，光照强度为2000lx，光周期为14h·d-1。
该方法中，箱根草的茎段作为外植体进行消毒时，消毒方式为75％酒精消毒15s，而后1％NaClO2消毒8min，此时成活率最高，为60.00％。箱根草腋芽萌发的初代诱导 的培养基MS+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂+0.5mg/L 6-BA+0.25mg/L NAA，分化率可达 63.33％，平均腋芽数最多为1.73。芽增殖的最佳培养基为MS+30g/L蔗糖+7.2-7.5g/L琼 脂+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA，其芽增殖倍数为6.27。生根培养基为：1/2MS+30g/L 蔗糖+7.2-7.5g/L琼脂+0.5mg/L IBA，生根率可达到80.00％。
1.1改变步骤1)的消毒时间，对比例选择的消毒时间分别为：1％NaClO处理3min、5min、10min、13min、15min、18min。每处理接种30个茎段，每瓶接种一个茎段，重 复3次。30d后统计不同消毒时间的污染率、褐化率和存活率；如表1所示。
表1不同消毒时间对箱根草茎段消毒效果的影响
Figure BDA0002661172590000031
Figure BDA0002661172590000041
通过表1可以看出，在消毒时间分别为3min、5min时，褐化率均为0，之后外植 体的褐化率随消毒时间的延长而增加，消毒时间3-8min染菌率随着消毒时间的增加而减 少。总体来看，在1％ NaClO处理8min时对箱根草的消毒效果最好，此时存活率最高 为60.00％。
1.2选择不同的初代诱导培养基，对比例中选择不同浓度的6-BA和NAA组合； 每处理30个外植体。20d后统计腋芽萌发率，平均腋芽数，并比较两种激素组合对芽 诱导的影响。如表2所示：
表2不同激素配比对箱根草初代诱导培养的影响
处理序号 6-BA(mg/L) NAA(mg/L) 腋芽诱导率(％) 平均腋芽数(个)
实施例1 0.5 0.25 63.33％ 1.73
实施例2 0.5 0.5 60.00％ 1.50
对比例8 0.25 0.25 26.67％ 0.37
对比例9 0.5 0.1 56.67％ 1.17
对比例10 1 0.25 50.00％ 0.87
1.3选择不同的增殖培养基，对比例中选择不同浓度的6-BA和NAA组合，每处理 30个外植体。30d后统计增殖芽数，计算增殖倍数，并比较两种激素组合对芽增殖的影 响。如表3所示：
表3不同激素配比对箱根草增殖培养的影响
Figure BDA0002661172590000042
Figure BDA0002661172590000051
1.4不同激素配比对箱根草生根诱导的影响
选择不同的生根培养基，对比例中选择不同浓度的NAA或IBA，以期取得最适宜 的生根效果。每处理30个外植体，定期观察箱根草生根情况并记录生长状况。接种20 d后统计生根率、平均生根数、平均根长。如表4所示：
表4不同激素配比对箱根草不定芽生根的影响
处理序号 IBA(mg/L) NAA(mg/L) 生根率(％) 平均生根数(个) 平均根长(cm)
实施例1 0.5 0 80.00 4.21 1.58
对比例13 0.25 0 43.33 1.85 2.08
对比例14 0.75 0 63.33 3.21 0.91
对比例15 0 0.5 40.00 2.00 1.30
具体实施方式中，数据统计与分析
褐化率(％)＝(褐化的外植体个数/接种的外植体总数)×100％；
染菌率(％)＝(污染的外植体个数/接种的外植体总数)×100％；
存活率(％)＝(存活的外植体个数/接种的外植体总数)×100％；
腋芽诱导率(％)＝(诱导出腋芽的外植体个数/接种的外植体总数)×100％；
平均腋芽数(个)＝(诱导出腋芽个数/接种的外植体总数)；
增殖倍数(％)＝(增殖后芽的总数/接种时外植体芽的总数)×100％；
生根率(％)＝(生根的外植体数/接种外植体总数)×100％；
平均生根数(个)＝生根的总数/生根的外植体总数；
平均根长(cm)＝生根的总长/生根的总数；
移栽存活率(％)＝(移栽成活的组培苗数/移栽总组培苗数)×100％。
采用Microsoft Office Excel 2007计算测定数据。

Claims (4)

1.一种箱根草组织培养方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)、剪取当年生枝条健壮且无病害的带节茎段或茎尖10cm左右，用小刷子轻轻在水龙头下刷洗去茎段表面附着的灰尘等大颗粒污染物，然后用剪刀将茎段剪成2-3cm的长度，小心剥尽叶鞘，保留腋芽，放入加洗洁精的锥形瓶中不断震荡，清洗3min后，在流水下冲洗10min，然后吸干水分喷洒酒精放入超净工作台上，用无菌水清洗3遍，75％酒精浸泡15s后再用无菌水冲洗3～5遍，然后在1％NaClO溶液中浸泡8min，期间不断摇晃锥形瓶，用无菌水冲洗5～7遍，用灭过菌的滤纸吸干茎段表面水分，切除茎段最顶端和最底部，后将茎段接种于如下培养基上：MS+30g/L蔗糖+7.2-7.5g/L琼脂，pH值调为5.7～5.8；培养40-50天；
2)、然后将箱根草茎段接种到初代诱导的培养基上，所述的初代诱导的培养基为：MS+30g/L蔗糖+7.2-7.5g/L琼脂+0.5mg/L 6-BA+0.25mg/L NAA，pH值调为5.7～5.8；或MS+30g/L蔗糖+7.2-7.5g/L琼脂+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA，pH值调为5.7～5.8；三周后腋芽开始萌发；
3)、将箱根草茎段诱导出的腋芽接种到增殖培养基上，两周后开始萌发丛状不定芽；增殖培养基为MS+30g/L蔗糖+7.2-7.5g/L琼脂+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA，pH值调为5.7～5.8；
4)、不定芽的高度达到3～4cm，每个芽长3-5片叶时，将丛芽进行分丛，每从4-5个丛芽，转入生根培养基中；所述生根培养基为1/2MS+30g/L蔗糖+7.2-7.5g/L琼脂+0.5mg/L IBA，pH值调为5.7～5.8。在培养一周后逐渐有新根产生。
2.根据权利要求1所述的一种箱根草组织培养方法，其特征在于：在NaClO溶液中，每100ml加入1-2滴20吐温。
3.根据权利要求1所述的一种箱根草组织培养方法，其特征在于：所述的初代诱导的培养基为：MS+30g/L蔗糖+7.2-7.5g/L琼脂+0.5mg/L 6-BA+0.25mg/L NAA。
4.根据权利要求1所述的一种箱根草组织培养方法，其特征在于：该方法的培养室温度为(25±1)℃，空气相对湿度保持在50％-60％，光照强度为2000lx，光周期为14h·d-1。
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