CN111655853A - 抗虫性能增强的植物和涉及害虫抗性基因的构建体和方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了分离的多聚核苷酸和多肽，以及赋予植物抗虫性的重组DNA构建体；包含这些重组DNA构建体的组合物(例如植物或种子)，以及利用这些重组DNA构建体的方法。所述重组DNA构建体包含可操作的连接植物中有功能的启动子的多聚核苷酸，其中所述多聚核苷酸编码抗虫多肽。

Description

抗虫性能增强的植物和涉及害虫抗性基因的构建体和方法
技术领域
本技术领域涉及植物育种和遗传学，并且具体地涉及用于赋予植物抗害虫性能的重组DNA构建体和植物虫害的防治方法。
发明背景
许多昆虫品种是玉米、大豆、豌豆、棉花、水稻和类似的粮食以及纤维作物等农作物的重要害虫，害虫的为害每年可以导致诸如作物损失或购买控制害虫的昂贵杀虫剂等巨大的经济损失。在过去的几个世纪中，控制这些害虫的主要方法是使用化学合成的杀虫化合物，然而由于杀虫化合物非选择性以及昆虫对化学制品的抗药性的产生，化学化合物的广泛应用造成了许多环境问题。
近几十年来生物技术的发展为通过基因工程控制害虫提供了机遇，特别是植物遗传学的发展，再加上昆虫生长因子和自然发生的植物防御化合物或试剂的鉴定，为创造能够产生这些防御试剂的转基因作物提供了机遇，从此保护植物免受昆虫攻击。
已知的芽孢杆菌属(Bacillus)微生物的某些种对一系列昆虫害虫具有杀虫活性，这些昆虫包括鳞翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、半翅目(Hemiptera)害虫以及其他害虫。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)(Bt)和日本金龟子芽孢杆菌(Bacillus popilliae)是至今为止发现的最成功的生物防治剂的代表。昆虫致病性也被认为是由幼虫芽孢杆菌(B.larvae)、缓病芽孢杆菌(B.lentimorbus)、球形芽孢杆菌(B.sphaericus)和蜡样芽孢杆菌(B.cereus)的菌株引起的。微生物杀昆虫剂，特别是那些从芽孢杆菌菌株获得的微生物杀昆虫剂，在农业上作为害虫化学防治的替代方案已起到重要的作用。
编码苏云金芽孢杆菌(Bt)内毒素或植物蛋白酶抑制剂(PIs)基因的转基因植物能够抵抗特定害虫，例如能够产生苏云金芽胞杆菌菌株的杀虫蛋白的玉米和棉花已通过遗传工程获得，这些遗传转化的作物目前广泛用于农业，并为农民提供了环境友好和商业吸引力的替代昆虫控制的传统方法。通常来说，与传统广谱的化学杀虫剂相比，生物杀虫剂的污染和环境危害风险较低，且生物杀虫剂具有较好的目标特异性。另外，生物杀虫剂生产成本低，因此提高了各种作物的经济产量。
生物杀虫剂已被证明是非常成功的商业化，这些转基因抗虫作物只对一个狭窄的范围内的重要经济害虫具有抗性。在某些情况下，昆虫对不同的杀虫化合物产生抗性，这就需要鉴定出控制害虫的可替代性生物控制试剂。仍然需要对昆虫害虫具有不同范围杀昆虫活性的新杀虫蛋白，例如对鳞翅目和半翅目的多种昆虫具有活性的杀昆虫蛋白，所述多种昆虫包括但不限于对现有杀虫剂已产生抗性的昆虫害虫。
发明概述
本发明包括如下实施方案：
一方面，本发明包括一种分离的多核苷酸，过量表达所述多核苷酸提高植物抗害虫性，所述多核苷酸,包含：(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：4、7或10的序列一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：5、8或11的序列一致性至少为85％；(c)一种多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：6、9和12的序列一致性至少为90％；或(d)核苷酸序列(a)、(b)或(c)的全长互补序列。所述分离的多核苷酸包括SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的核苷酸序列；所述分离的多核苷酸编码多肽，所述多肽包括SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：12的氨基酸序列。所述害虫是鳞翅类，尤其是玉米螟(Ostriniafurnacalis)、二化螟(Chilo suppressalis)或粘虫(Mythimna separata)。
另一方面，本发明包括一种重组DNA构建体，其包含分离的多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控元件，其中所述多核苷酸包括(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQID NO：4、5、7、8、10或11的序列一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：6、9或12的序列一致性至少为90％；或(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列；所述至少一个调控元件是植物中有功能的启动子。所述分离的多核苷酸编码SLT1、DN-ITP6或DN-ITP7多肽。
另一方面，本发明包括一种植物、植物细胞或种子，所述植物、植物细胞或种子包括一种重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包括一种多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控元件，所述多核苷酸包括(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：4、5、7、8、10或11的序列一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ IDNO：6、9或12的序列一致性至少为90％；或(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列。
另一方面，本发明包括一种植物或植物细胞，在其基因组中包括一种重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包括一种多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控元件，其中，所述多核苷酸包括(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：4、5、7、8、10或11的序列一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：6、9或12的序列一致性至少为90％；(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列；与对照植物相比，所述植物显示出增强的抗虫性。所述增强的抗虫性针对选自下列目的昆虫：鞘翅目(Coleoptera)、双翅目(Diptera)、膜翅目(Hymenoptera)、鳞翅目(Lepidoptera)、禽虱目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthroptera)、缨尾目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、虱目(Anoplura)、蚤目(Siphonaptera)和毛翅目(Trichoptera)等，特别是鳞翅目(Lepidoptera)。所述害虫是亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)、二化螟(Chilo suppressalis)或粘虫(Mythimnaseparata)。本发明包括本发明中任一植物，其中所述植物选自水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。
另一方面，提供了提高植物抗虫性的方法，其包括增加表达编码SLT1、DN-ITP6或DN-ITP7多肽的至少一个多核苷酸，所述多核苷酸包括：(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：4、7或10的序列一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ IDNO：5、8或11的序列一致性至少为85％；(c)一种多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：6、9或12的序列一致性至少为90％。所述提高植物抗虫性的方法包括(a)向可再生植物细胞导入重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作连接至少一个调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码一个多肽，其氨基酸序列与SEQ ID NO：6、9或12序列一致性至少为80％；(b)由步骤(a)后的可再生细胞再生转基因植物，其中转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体；和(c)由步骤(b)的转基因植物获得子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含重组DNA构建体，与不包含重组DNA构建体的对照植物相比，所述子代转基因植物显示增强的抗虫性能。所述害虫为鳞翅目(Lepidoptera)，特别是亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)、二化螟(Chilo suppressalis)或粘虫(Mythimna separata)。
另一方面，提供了评估植物抗虫性的方法，其包括：(a)向可再生植物细胞导入重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含一种多核苷酸和与其可操作连接至少一个调控元件，其中所述多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：6、9或12的序列一致性至少为80％；(b)由步骤(a)的可再生细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体；(c)由所述转基因植物获得子代植物，其中所述子代植物的基因组中包含重组DNA构建体；和(d)以不包含重组DNA构建体的对照植物为对照，评估子代植物的抗虫性能。所述害虫为鳞翅目(Lepidoptera)，特别是亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)、二化螟(Chilo suppressalis)或粘虫(Mythimna separata)。
另一方面，本发明涉及一个重组DNA构建体，其包含本发明中任一分离的多聚核苷酸，并与至少一个调控元件可操作连接；以及包含重组DNA构建体的细胞、植物和种子。所述细胞包括真核细胞，如酵母、昆虫或植物细胞；或原核细胞，如细菌。
详细描述和序列表
根据以下的发明详述和序列表，可更全面地理解本发明，以下的发明详述和序列表形成本申请的一部分。
表1.序列表中核苷酸序列和氨基酸序列的编号
Figure BDA0002599881850000031
序列描述以及关联的序列表遵循如37C.F.R.§1.821-1.825中所列出的管理专利申请中的核苷酸和/或氨基酸序列公开的规则。序列表包含核苷酸序列字符的单字母码以及氨基酸的三字母码，如遵照IUPAC-IUBMB标准所定义的，该标准在Nucleic AcidsRes.13：3021-3030(1985)以及在Biochemical J.219(No.2)：345-373(1984)中有所描述，这两篇文献以引用的方式并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循37C.F.R.§1.822中列出的规则。
发明详述
本文中所列出的每篇参考文献的公开内容的全文均以引用的方式并入本文。
如本文所用的并在所附权利要求书中的单数形式“一个”和“所述”包括复数涵义，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“一株植物”的涵义包括多株该类植物。“一个细胞”的涵义包括一个或多个细胞及其本领域的技术人员已知的等同物，等等。
如本文所用：
术语“OsSLT1”是SLT1蛋白，涉及水稻基因位点LOC_Os03g16910.1编码的，能够提高植物耐虫性的多肽，“SLT1多肽”此处指OsSLT1多肽和来源于其他植物的同源物。
OsSLT1多肽(SEQ ID NO：6)是水稻基因位点LOC_Os03g16910.1的编码序列(CDS)(SEQ ID NO：5)或核苷酸序列(SEQ ID NO：4)编码的多肽。该多肽在TIGR(植物生物学网址msu.edu/index.shtml)和在NCBI(ncbi.nlm.nih.gov)中注释为“SLT1蛋白，推测的，表达”，但是没有在先的功能介绍。
术语“OsDN-ITP6”是耐虫性蛋白6(insect tolerance protein 6)，涉及水稻基因位点LOC_Os01g53730.1编码的，能够提高植物耐虫性的多肽，“DN-ITP6多肽”此处指OsDN-ITP6多肽和来源于其他植物的同源物。
OsDN-ITP6多肽(SEQ ID NO：9)是水稻基因位点LOC_Os01g53730.1的编码序列(CDS)(SEQ ID NO：8)或核苷酸序列(SEQ ID NO：7)编码的多肽。该多肽在TIGR中注释为“表达的蛋白”，但是没有在先的功能介绍。
术语“OsDN-ITP7”是耐虫性蛋白7(insect tolerance protein 7)，涉及水稻基因位点LOC_Os09g10010.1编码的，能够提高植物耐虫性的多肽，“DN-ITP7多肽”此处指OsDN-ITP7多肽和来源于其他植物的同源物。
OsDN-ITP7多肽(SEQ ID NO：12)是水稻基因位点LOC_Os09g10010.1的编码序列(CDS)(SEQ ID NO：11)或核苷酸序列(SEQ ID NO：10)编码的多肽。该多肽在TIGR中注释为“表达的蛋白”，但是没有在先的功能介绍。
如本文所用，“耐虫蛋白”是指能够抑制、阻碍一种或多种害虫的生长和/或能够杀死一种或多种害虫的多肽，所述害虫包括但不限于鳞翅目、双翅目、半翅目和鞘翅目的害虫。
本发明中的单子叶植物包括禾本科的植物。
本发明中的双子叶植物包括十字花科、豆科和茄科的植物。
“全长互补序列”是指给定核苷酸序列的互补序列，互补序列和核苷酸序列含有相同的核苷酸数，并且100％的互补。
“转基因的”指其基因组因异源核酸(如重组DNA构建体)的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初的转基因事件以及从最初的转基因事件通过有性杂交或无性生殖而产生的那些。如本文所用的术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)改变。
“对照”、“对照植物”或“对照植物细胞”为测定受测试植物或植物细胞的表型变化提供参考，由于转化，受测植物或植物细胞的基因组改变影响到目的基因，测试的植物或植物细胞可以是上述改变植物或植物细胞的子代，并含有相同的改变。
对照植物或对照植物细胞包括，例如：(a)相同基因型作为起始材料的用于基因改变产生受测植物或细胞的野生型植物或细胞；(b)相同基因型作为起始材料但是转入空载体(如带有标记基因的并对目标的性状没有影响的载体)的植物或植物细胞；(c)转基因植物或植物细胞性状分离，获得的非转基因的子代植物或植物细胞；(d)没有暴露于可以诱导基因表达的条件或刺激下的，与转基因植物或植物细胞基因组相同的植物或植物细胞；(e)特定的目标基因不表达情况下的，转基因植物或者植物细胞本身。
本发明中，ZH11-TC和空载体植物指对照植物。ZH11-TC代表通过组织培养中花11获得的水稻植株，空载体代表转化空载DP0158获得水稻植株。
“基因组”在用于植物细胞时不仅涵盖存在于细胞核中的染色体DNA，而且还包括存在于细胞的亚细胞组分(如线粒体、质粒)中的细胞器DNA。
“植物”包括整个植株、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及同一植株的子代。植物细胞包括但不限于得自下列物质的细胞：种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。
“子代”包括植物的任何后续世代。
“修饰植物”包括在其基因组内包含异源多核苷酸或修饰的基因或启动子的植物。异源多核苷酸能够稳定地整合进基因组中，并遗传连续的世代。异源多核苷酸可单独地或作为重组DNA构建体的部分整合进基因组中。T0植物直接源于转化和再生过程，T0植物的子代为T1代(第一个子代)，T2代(第二个子代)等。修饰的基因或启动子可以是植物基因组中单个或几个或一段脱氧核苷酸的插入或删除。
针对序列而言的“异源”意指来自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则指通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因座的显著改变的序列。
“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用并且是任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基的单链或双链RNA或DNA聚合物。核苷酸(通常以5′-单磷酸形式存在)通过如下它们的单个字母名称来指代：“A”为腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别对应RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脱氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“I”表示肌苷，并且“N”表示任何核苷酸。
“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可包括修饰形式，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和ADP-核糖基化。
“信使RNA(mRNA)”指无内含子并且可通过细胞翻译成蛋白质的RNA。
“cDNA”指与mRNA模板互补并且利用逆转录酶从mRNA模板合成的DNA。cDNA可为单链的或者可用DNA聚合成酶I的Klenow片段转化成双链形式。
“成熟”蛋白质指经翻译后加工的多肽；即已经去除了存在于初级翻译产物中的任何前肽或原肽的多肽。
“前体”蛋白质指mRNA的翻译初级产物；即带有前肽和原肽的蛋白质。前肽和原肽可为并且不限于细胞内定位信号。
“分离的”指物质，例如核酸和/或蛋白质，该物质基本上是游离的，或者以其他方式从通常与自然环境中的物质相伴或者相互作用的组份中分离出来的。分离的多核苷酸可从它们天然存在的宿主细胞中纯化。技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获得分离的多核苷酸。该术语也涵盖重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。
“重组体”指(例如)通过化学合成或者通过用基因工程技术操纵分离的核酸片段来实现的两个原本分离的序列片段的人工组合。“重组体”也包括指已经通过引入异源核酸而进行了修饰的细胞或载体，或源于经这样修饰的细胞的细胞，但不涵盖没有蓄意人为干扰而发生的天然发生的事件(如自发突变、自然转化/转导/转座)对细胞或载体的改变。
“非基因组核酸序列”、“非基因组核酸分子”或“非基因组多核苷酸”指与天然或基因组核酸序列相比，存在一处或多处核酸序列改变的核酸分子。在某些实施方案中，天然或基因组核酸分子的改变包括但不限于：由于遗传密码的简并性而产生的核酸序列变化；植物表达的核酸序列密码子优化；与天然或基因组序列相比，至少一个氨基酸的替代、插入、删除和/或添加而引起的核酸序列的变化；与基因组核酸序列相连的一个或多个内含子的移除；一个或多个异源内含子的插入；与基因组核酸序列相连一个或多个上游或下游调控区域的删除；一个或多个异源上游或下游调控区域的插入；与基因组核酸序列相连的5’和/或3’非翻译区的删除；一个异源5’和/或3’非翻译区的插入；和多聚腺苷酸位点的修饰。在一些实施方案中，非基因组核酸分子是cDNA。在一些实施方案中，非基因组核酸分子为合成的核酸序列。
“重组DNA构建体”指在自然界中通常不会一起存在的核酸片段的组合。因此，重组DNA构建体可包含不同来源的调控序列和编码序列，或相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。
术语“入门克隆”和“入门载体”本文可互换使用。
“调控序列”和“调控元件”可互换使用，指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、中间或下游(3′非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。
“启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。
“植物中有功能的启动子”是能够控制植物细胞中的转录的启动子，无论其是否来源于植物细胞。
“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”可互换使用，并且指主要但非必须专一地在一种组织或器官中表达，也可在一种特定细胞中表达的启动子。
“发育调控启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。
术语“可操作地连接”指核酸片段连接成单一片段，使得其中一个核酸片段的功能受到另一个核酸片段的调控。例如，在启动子能够调节核酸片段的转录时，该启动子与该核酸片段进行了可操作地连接。
“表达”指功能产物的产生。例如，核酸片段的表达可指核酸片段的转录(如转录生成mRNA或功能RNA)和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。
“表型”意指细胞或生物体的可检测的特征。
有关将核酸片段(例如重组DNA构建体)插入细胞内的“导入”是指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括指将核酸片段整合进真核或原核细胞中，在该细胞中核酸片段可整合进细胞的基因组(如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)内，转变成自主的复制子或瞬时表达(如转染的mRNA)。
“转化细胞”是将核酸片段(如重组DNA构建体)导入其中的任何细胞。
本文所用的“转化”指稳定转化和瞬时转化两者。
“稳定转化”指将核酸片段导入宿主生物体的基因组中，导致基因稳定遗传。一旦稳定转化，核酸片段稳定地整合进宿主生物体和任何连续世代的基因组中。
“瞬时转化”指将核酸片段导入宿主生物体的核中或包含DNA的细胞器中，引起基因表达而没有基因稳定遗传。
“等位基因”是占据染色体上给定位点的基因的几种供选择形式的其中一种。当二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因相同时，该植物在该基因座处是纯合的。如果二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因不同，则该植物在该基因座处是杂合的。如果转基因存在于二倍体植物中一对同源染色体中的其中之一上，则该植物在该基因座处是半合子的。
“叶绿体转运肽”是与蛋白协同翻译并将蛋白导向叶绿体或翻译蛋白的细胞中存在的其它质体类型的氨基酸序列。“叶绿体转运序列”指编码叶绿体转运肽的核苷酸序列。“信号肽”是一种与蛋白协同翻译并将蛋白导向分泌器官的氨基酸序列(Chrispeels，M.(1991)Ann.Rev.PlantPhys.Plant Mol.Biol.42：21-53)。如果将所述蛋白导向液泡，可另外加上液泡靶向信号，或者如果将所述蛋白导向内质网，可加上内质网驻留信号。如果将蛋白导向细胞核，将移除任何存在的信号肽并用以核定位信号替代(Raikhel(1992)PlantPhys.100：1627-1632)。“线粒体信号肽”是引导前体蛋白进入线粒体的氨基酸序列(Zhang和Glaser(2002)Trends Plant Sci 7：14-21)。
序列比对和同一性百分比采用设计用于检测同源序列的多种比较方法来测定，这些方法包括但不限于生物信息计算包(Inc.，Madison，WI)的程序。除非另外说明，本文提供的序列的多重比对用Clustal V比对方法(Higgins和Sharp，1989，CABIOS.5：151-153)采用默认参数(空位罚分＝10，空位长度罚分＝10)执行。用Clustal V方法进行成对比对和蛋白质序列的同一性百分比计算的默认参数为KTUPLE＝1、空位罚分(GAP PENALTY)＝3、窗口(WINDOW)＝5并且DIAGONALS SAVED＝5。而对于核酸，这些参数为KTUPLE＝2，空位罚分＝5，窗口＝4并且DIAGONALS SAVED＝4。用Clustal V程序比对序列后，可通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“同一性百分比”和“趋异”值。除非另外说明，本文提供的和申明的同一性百分比和趋异度是以该方式计算。
本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual；Cold Spring HarborLaboratory Press：Cold Spring Harbor，1989(下文称为“Sambrook”)。
现在转向实施方案：
实施方案包括分离的多核苷酸和多肽、赋予植物抗虫害的重组DNA构建体、包含这些重组DNA构建体的组合物(例如植物或种子)，以及利用这些重组DNA构建体的方法。
分离的多核苷酸和多肽：
本发明包括如下分离的多核苷酸和多肽：
在一些实施方案中，多核苷酸编码SLT1、DN-ITP6或DN-ITP7多肽。
在一些实施方案中，分离的多核苷酸包含：(i)一种编码多肽的核酸序列，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：6、9或12进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；或(ii)核酸序列(i)的全长互补序列，其中全长互补序列和核酸序列(i)由相同数目的核苷酸组成并且是100％互补的。任一上述分离的多核苷酸可用于本发明的任何重组DNA构建体。
在一些实施方案中，分离的多肽，其氨基酸序列在与SEQ ID NO：6、9或12进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性。所述多肽为抗虫多肽SLT1、DN-ITP6或DN-ITP7。
在一些实施方案中，分离的多核苷酸，其包括：(i)一种核酸序列，所述核苷酸序列在与SEQ ID NO：4、5、7、8、10或11进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；或(ii)核酸序列(i)的全长互补序列。任一上述分离的多核苷酸可用于本发明的任何重组DNA构建体。分离的多核苷酸优选地编码抗虫蛋白。过量表达所述抗虫多肽增加了植物对害虫的抗性。
重组DNA构建体
在一方面，本发明包括重组DNA构建体。
在一个实施方案中，重组DNA构建体包含一种多核苷酸和与其可操作地连接至少一种调控元件(如，在植物中有功能的启动子)，其中所述多核苷酸包括(i)一种核酸序列，其编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：6、9或者12进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％的序列一致性；或(ii)核酸序列(i)的全长互补序列。
在另一个实施方案中，重组DNA构建体包含一种多核苷酸和与其可操作地连接至少一种调控元件(如，在植物中有功能的启动子)的，其中所述多核苷酸包括(i)一种核酸序列，所述核苷酸序列在与SEQ ID NO：4、5、7、8、10或11进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％的序列一致性；或(ii)核酸序列(i)的全长互补序列。
在另一实施方案中，重组DNA构建体包含一种多核苷酸和与其可操作地连接至少一种调控元件(如，在植物中有功能的启动子)，其中所述多核苷酸编码SLT1、DN-ITP6或DN-ITP7多肽。这些多肽具有抗害虫的活性，并可来自，例如水稻(Oryza sativa)、野生稻(Oryza australiensis)、短舌野生稻(Oryza barthii)、非洲型稻(Oryza glaberrima)、阔叶稻(Oryza latifolia)、长雄野生稻(Oryza longistaminata)、南方野生稻(Oryzameridionalis)、药用野生稻(Oryza officinalis)、斑点野生稻(Oryza punctata)、普通野生稻(Oryza rufipogon)(红稻)、印度野生稻(Oryza nivara)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、烟豆(Glycine tabacina)、野大豆(Glycine soja)和短绒野大豆(Glycine tomentella)。
应当理解(正如本领域技术人员将会理解的)，本发明不仅仅涵盖这些具体的示例性序列。导致给定位点处产生化学上等价的氨基酸但不影响所编码多肽的功能特性的核酸片段中的改变是本领域众所周知的。例如，丙氨酸(一种疏水性氨基酸)的密码子可被编码另一个疏水性较弱的残基(例如甘氨酸)或疏水性较强的残基(例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，导致一个带负电荷的残基替换为另一个带负电荷的残基(例如，天冬氨酸替代谷氨酸)或者一个带正电荷的残基替换为另一个带正电荷的残基(例如，赖氨酸替换精氨酸)的改变也可预期产生功能上等价的产物。导致多肽分子的N-末端和C-末端部分改变的核苷酸变化也将预计不会改变多肽的活性。所提出的修饰中的每一种均完全在本领域常规技术内，如测定所编码的产物的生物活性的保留。
调控序列：
本发明的重组DNA构建体可包含至少一种调控元件。
调控元件可为启动子或增强子。
多种启动子可用于本发明的重组DNA构建体中。可根据所需结果来选择启动子，并且可包括用于在宿主生物体中表达的组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子或其他启动子。
一般将引起基因在多数细胞类型中在多数情况下表达的启动子称为“组成型启动子”。
虽然候选基因当通过组成型启动子驱动表达时可预测其效应，但候选基因在35S或UBI启动子控制下的高水平、组成型表达可(或可能不)具有多重效应。使用组织特异和/或胁迫特异启动子可消除不需要的效应但保留抗虫性的能力。在拟南芥属中已经观察到了对于耐旱性和耐冷性的该种类型的效应(Kasuga等人(1999)Nature Biotechnol.17：287-91)。
适用于植物宿主细胞的组成型启动子包括(例如)Rsyn7启动子的核心启动子和在WO 99/43838和美国专利6,072,050中公开的其他组成型启动子；CaMV 35S核心启动子(Odell等人，Nature 313：810-812(1985))；稻肌动蛋白启动子(McElroy等人，Plant Cell2：163-171(1990))；泛素启动子(Christensen等人，Plant Mol.Biol.12：619-632(1989)和Christensen等人，Plant Mol.Biol.18：675-689(1992))；pEMU(Last等人，Theor.Appl.Genet.81：581-588(1991))；MAS(Velten等人，EMBO J.3：2723-2730(1984))；ALS启动子(美国专利5,659,026)等。其他组成型启动子包括例如在美国专利5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611中公开的那些启动子。
在选择启动子用于本发明方法时，可能有利的是使用组织特异性启动子或发育调节启动子。
组织特异性启动子或发育调节启动子是这样的DNA序列，其调节DNA序列选择性地在对雄穗发育、结籽或两者重要的植物细胞/组织中表达，并限制这种DNA序列只在植物的雄穗发育或种子成熟期间表达。任何引起所需时空表达的可鉴定启动子均可用于本发明的方法中。
种子或胚特异性的并且可用于本发明的启动子包括大豆Kunitz胰蛋白酶抑制剂(Kti3，Jofuku和Goldberg，Plant Cell 1：1079-1093(1989))、patatin(马铃薯块茎)(Rocha-Sosa，M.等人，1989，EMBOJ.8：23-29)、convicilin、豌豆球蛋白和豆球蛋白(豌豆子叶)Rerie，W.G.等人，1991，Mol.Gen.Genet.259：149-157；Newbigin，E.J.等人，1990，Planta 180：461-470；Higgins，T.J.V.等人，1988，Plant.Mol.Biol.11：683-695)、玉米蛋白(玉米胚乳)(Schemthaner，J.P.等人，1988，EMBO J.7：1249-1255)、菜豆蛋白(菜豆子叶)(Segupta-Gopalan，C.等人，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：3320-3324)、植物血球凝集素(菜豆子叶)(Voelker，T.等人，1987，EMBO J.6：3571-3577)、B-伴球蛋白和大豆球蛋白(大豆子叶)(Chen，Z-L等人，1988，EMBOJ.7：297-302)、谷蛋白(稻胚乳)、大麦醇溶蛋白(大麦胚乳)(Marris，C.等人，1988，Plant Mol.Biol.10：359-366)、麦谷蛋白和麦醇溶蛋白(小麦胚乳)(Colot，V.等人，1987，EMBO J.6：3559-3564)和甘薯贮藏蛋白(sporamin)(甘薯块根)(Hattori，T.等人，1990，Plant Mol.Biol.14：595-604)。可操作地连接至嵌合基因构建体异源编码区的种子特异性基因的启动子在转基因植物中保持它们的时空表达模式。这样的实施例包括在拟南芥和甘蓝型油菜(Brassica napus)种子中表达脑啡肽的拟南芥属2S种子储藏蛋白基因启动子(Vanderkerckhove等人，Bio/Technology 7：L929-932(1989))、表达荧光素酶的菜豆凝集素和β-菜豆蛋白启动子(Riggs等人，PlantSci.63：47-57(1989))，以及表达氯霉素乙酰转移酶的小麦谷蛋白启动子(Colot等人，EMBOJ6：3559-3564(1987))。
可诱导启动子响应内源性或外源性刺激的存在，例如，通过化合物(化学诱导剂)，或响应环境、激素、化学信号和/或发育信号而选择性表达可操纵连接的DNA序列。可诱导的或受调控的启动子包括(例如)受光、热、胁迫、水涝或干旱、植物激素、创伤或诸如乙醇、茉莉酮酸酯、水杨酸或安全剂之类的化学品调控的启动子。
用于本发明的启动子包括以下启动子：1)胁迫诱导型RD29A启动子(Kasuga等人，1999，Nature Biotechnol.17：287-91)；2)大麦启动子B22E；B22E的表达是发育中的玉米籽粒中的柄所特异性的(“Primary Structure of a Novel Barley Gene DifferentiallyExpressed inImmature Aleurone Layers(在未成熟糊粉层中差异表达的新大麦基因的一级结构)”。Klemsdal，S.S.等人，Mol.Gen.Genet.228(1/2)：9-16(1991))；和3)玉米启动子，Zag2(“Identification and molecularcharacterization of ZAG1，the maize homologof the Arabidopsis floralhomeotic gene AGAMOUS”，Schmidt，R.J.等人，Plant Cell 5(7)：729-737(1993)；“Structural characterization，chromosomal localizationandphylogenetic evaluation of two pairs of AGAMOUS-like MADS-boxgenes frommaize”，Theissen等人，Gene 156(2)：155-166(1995)；NCBI GenBank登录号X80206))。Zag2转录物可在授粉前5天至授粉后(DAP)7至8天被检测到，并且引导Ciml在发育中的雌花序的心皮中表达，Ciml对发育中的玉米籽粒的籽仁而言是特异性的。Ciml转录物在授粉前4至5天至授粉后6至8天被检测到。其他可用的启动子包括可源自其表达与发育中的雌小花母系相关的基因的任何启动子。
对于在发育种子组织中表达的多聚核苷酸，特殊的启动子包括种子优选的启动子，尤其是早期籽粒/胚胎启动子和晚期籽粒/胚乳启动子，授粉后籽粒的发育大致可以分为三个基本阶段，籽粒生长的停滞期起始于授粉后0天到10-12天，在此期间，籽粒不再明显的生长，但是决定籽粒活力的重要事件将在此期间发生(如细胞建成数目)。线性籽粒灌浆期起始于授粉后的10-12天并延续到授粉后的40天左右。在籽粒发育期间，籽粒达到最终的质量，并产生多种储藏物质如淀粉、蛋白质和油等；最终的成熟期起始于授粉后大约40天到收获，籽粒发育的这一过程中，籽粒开始沉寂，变干，为度过种子萌发前漫长的休眠期。本发明中的“早期籽粒/胚乳启动子”指主要在种子发育的停滞期(也就是授粉第0天到授粉后第12天期间)驱动基因表达的启动子；“后期籽粒/胚乳启动子”主要驱动基因在授粉后12天到成熟过程中的种子中表达；表达窗口可能会有一些重叠，将根据使用的ABA偶联的序列和期望的表型选择启动子。
早期籽粒/胚胎启动子包括，Cim1，授粉后第5天活跃在特定组织中(WO 00/11177)；其它的早期籽粒/胚胎启动子包括种子偏爱启动子end1，在授粉后7-10天表达，和end2，授粉后9-14天在整个籽粒中表达，在授粉后10天在胚乳和果皮中表达(WO00/12733)。本发明中的特定方法使用的其它早期籽粒/胚乳启动子包括种子偏爱启动子ltp2(美国专利号5,525,716)；玉米Zm40启动子(美国专利号6,403,862)；玉米nuc1c(美国专利号6,407,315)；玉米ckx1-2启动子(美国专利号6,921,815和美国专利申请公开号2006/0037103)；玉米lec1启动子(美国专利号7,122,658)；玉米ESR启动子(美国专利号7,276,596)；玉米ZAP启动子(美国专利申请公开号20040025206和20070136891)；玉米启动子eep1(美国专利申请公开号20070169226)；和玉米启动子ADF4(美国专利申请号60/963,878，2007年8月7日申请)。本发明中调控核酸序列在植物中表达的其它启动子也可以是茎特异启动子，包括苜蓿S2A启动子(GenBank登录号EF030816；Abrahams等(1995)Plant Mol.Biol.27：513-528)和S2B启动子(GenBank登录号EF030817)和类似的启动子。
启动子可以整个源于天然基因，或者由源于不同的天然存在的启动子的不同元件组成，或者甚至包括合成的DNA片段。
用于本发明的启动子包括：RIP2、mLIP15、ZmCOR1、Rab17、CaMV 35S、RD29A、B22E、Zag2、SAM合成酶、泛素、CaMV19S、nos、Adh、蔗糖合成酶、R-等位基因、维管组织优选启动子S2A(Genbank登录号EF030816)和S2B(Genbank登录号EF030817)及来自玉米的组成型启动子GOS2。其他启动子包括根优选的启动子，例如玉米NAS2启动子、玉米Cyclo启动子(US2006/0156439，公开于2006年7月13日)、玉米ROOTMET2启动子(WO05063998，公开于2005年7月14日)、CRlBIO启动子(WO06055487，公开于2006年5月26日)、CRWAQ81(WO05035770，公开于2005年4月21日)和玉米ZRP2.47启动子(NCBI登录号：U38790；GI No.1063664)。
本发明的重组DNA构建体也可包括其他调控序列，包括但不限于翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。在本发明的另一个实施方案中，本发明的重组DNA构建体还包括增强子或沉默子。
内含子序列可加至5’非翻译区、蛋白编码区或3’非翻译区以增加积聚在胞浆中的成熟信息的量。已经显示，在植物和动物两者的表达构建体的转录单位中包含可剪接内含子可使基因表达在mRNA和蛋白质水平上均增强高达1000倍。参见Buchman和Berg，Mol.CellBiol.8：4395-4405(1988)；Callis等人，Genes Dev.1：1183-1200(1987)。
增强子或增强子元件指的是一个顺式作用的转录调控元件，即顺式元件，它可调控多核苷酸序列整体表达模式的一个方面，但通常不足以单独驱动转录可操作连接的多核苷酸序列。分离的增强子元件可以与一个启动子融合形成一个嵌合的启动子顺式元件，从而调节基因表达。本领域的技术人员均知道增强子，增强子包括SV40增强子区域、CaMV 35S增强子元件等。一些增强子也可以改变普通调控元件的表达模式，例如，当没有增强子时，导致调控元件组成型表达，当存在增强子时，同一调控元件在某一特定组织或某些特定组织表达。CaMV 35S启动子重复上游区域显示出大约增强10倍的表达量(Kay,R.et al.,(1987)Science 236：1299-1302)。
本发明中使用的增强子包括CaMV 35S(Benfey,et al.,(1990)EMBO J.9：1685-96)、4xB3 P-CaMV.35增强子区域—四拷贝串联B3区域(208到155)(美国专利号5,097,025)、4xAS-1P—CaMV 35S增强子区域-四拷贝串联激活序列(83到62)(美国专利号5,097,025)、2xB1-B2 P-CaMV 35S增强子区域—二拷贝串联B1-B2区域(148到90)(美国专利号5,097,025)、2xA1-B3 P-CaMV 35S增强子区域—二拷贝串联A1-B3区域(208到46)(美国专利号5,097,025)、2xB1-B5 P-CaMV 35S增强子区域—二拷贝B1-B5区域(343到90)(美国专利号5,097,025)、欧米伽增强子或欧米伽基本增强子(Gallie等(1989)Molecular Biologyof RNA ed.Cech(Liss,New York)237-256和Gallie等(1987)Gene 60:217-25)、美国专利号7,803,992的增强子和甘蔗棒状病毒(SCBV)增强子元件(WO2013130813)。
任何植物都可以选择用来鉴定将用于本发明重组DNA构建体的调控序列和基因。适用于分离基因和调控序列的靶植物的实例应该包括但不限于苜蓿、苹果、杏、拟南芥、洋蓟、芝麻菜、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、豆类、甜菜、黑莓、蓝莓、西兰花、抱子甘蓝、卷心菜、加拿大油菜、香瓜、胡萝卜、木薯、蓖麻子、菜花、芹菜、樱桃、菊苣、芫荽、柑桔、克莱门氏小柑橘、三叶草、椰子、咖啡、玉米、棉、蔓越莓、黄瓜、花旗松、茄子、菊苣、茅菜、桉树、茴香、无花果、大蒜、葫芦、葡萄、柚子树、白兰瓜、豆薯、猕猴桃、生菜、韭葱、柠檬、酸橙、火炬松、亚麻子、芒果、甜瓜、蘑菇、油桃、坚果、燕麦、油棕、油菜、秋葵、橄榄树、洋葱、橙、观赏植物、棕榈、木瓜树、欧芹、欧洲防风草、豌豆、桃树、花生、梨树、胡椒、柿树、松树、菠萝、车前草、李树、石榴树、白杨、马铃薯、南瓜、温柏、辐射松、红菊苣、萝卜、油菜、树莓、稻、黑麦、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、枫香树、柑橘、茶、烟草、蕃茄、黑小麦、草皮草、芜菁、葡萄树、西瓜、小麦、薯蓣和西葫芦。
组合物：
本发明的组合物是其基因组中包含本发明的任何重组DNA构建体(例如上面所讨论的任何一种构建体)的植物。组合物也包括任何植物的子代，以及获取自植物或其子代的任何种子，其中所述子代或种子在其基因组中包含重组DNA构建体。子代包括通过植物的自花授粉或异型杂交而获得的连续世代。子代也包括杂交种和自交系。
在杂交种子繁殖的农作物中，成熟的转基因植物可自花授粉而产生纯合的自交系植物。该自交系植物产生含有新导入的重组DNA构建体的种子。这些种子可生长而产生将会表现出改变的农学特性的植物，或者可用于育种程序以产生杂交种子，这些杂交种子可生长而产生将会表现出如改变的农学特性的植物。所述种子可为玉米种子或水稻种子。
植物可为单子叶植物或双子叶植物，例如玉米或大豆植物，如玉米杂种植物或玉米自交系植物。植物还可为向日葵、高梁、油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦或黍。
重组DNA构建体可稳定地整合进植物的基因组中。
实施方案包括但不限于以下实施方案：
1.在基因组中包含重组DNA构建体的植物(例如水稻、玉米或大豆植物)，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种异源调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列在与SEQ ID NO：6、9或12进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增加的抗虫害性。
2.实施方案1的转基因植物，其中多聚核苷酸编码SLT1、DN-ITP6或DN-ITP7多肽，所述SLT1、DN-ITP6或DN-ITP7多肽可来自水稻(Oryza sativa)、野生稻(Oryzaaustraliensis)、短舌野生稻(Oryza barthii)、非洲型稻(Oryza glaberrima)、阔叶稻(Oryza latifolia)、长雄野生稻(Oryza longistaminata)、南方野生稻(Oryzameridionalis)、药用野生稻(Oryza officinalis)、斑点野生稻(Oryza punctata)、普通野生稻(Oryza rufipogon)(红稻)、印度野生稻(Oryza nivara)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、鹰嘴豆(Cicer arietinum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、甘蓝(Brassicaoleracea)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、烟豆(Glycine tabacina)、野大豆(Glycine soja)和短绒野大豆(Glycine tomentella)。
3.实施方案1或2中任一转基因植物，其中所述转基因植物还包括至少一种编码杀虫多肽的多核苷酸。
4.实施方案1或2中任一转基因植物，其中所述转基因植物还包括至少一种编码关注的多肽的重组多核苷酸。
5.实施方案1-4中所述任一植物的子代，实施方案1-4中所述任一植物的种子，实施方案1-4中所述任一植物子代的种子，和来源于实施方案1-4中任一植物和所述植物子代的细胞。
前述实施方案1-5中的任意一项或本发明公开的其他实施方案中，重组DNA构建体还包括至少一个异源的在植物中有功能的启动子作为调控元件。
此处所用“杀虫蛋白”指一种对一种或多种害虫有毒害作用的多肽或其同源蛋白，所述害虫包括但不限于，鳞翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、半翅目(Hemiptera)和鞘翅目(Coleoptera)成员或线虫动物门(Nematoda phylum)。杀虫蛋白分离自有机体包括，例如，芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、发光杆菌属(Photorhabdus sp.)、致病杆菌属(Xenorhabdus sp.)双酶杆菌属(Clostridiumbifermentans)和日本金龟子芽孢杆菌属(Paenibacillus popilliae)。杀虫蛋白包括但不限于来源于假单胞菌属(Pseudomonas sp.)的杀虫蛋白，如PSEEN3174(Monalysin；(2011)PLoS Pathogens 7：1-13)、源于假单胞菌属(Pseudomonas protegens)的菌株CHA0和Pf-5(previously fluorescens)的杀虫蛋白(Pechy-Tarr，(2008)EnvironmentalMicrobiology 10：2368-2386；GenBank登录号EU400157)、源于黄山假单胞菌(PseudomonasTaiwanensis)的杀虫蛋白(Liu等(2010)J.Agric.Food Chem.,58：12343-12349)和源于假单胞产碱菌属(Pseudomonas pseudoalcligenes)的杀虫蛋白(Zhang等(2009)Annals ofMicrobiology 59：45-50and Li等(2007)Plant Cell Tiss.Organ Cult.89：159-168)；来源于发光杆菌属(Photorhabdus sp.)和致病杆菌(Xenorhabdus sp.)的杀虫蛋白(Hinchliffe等(2010)The Open Toxicology Journal,3：101-118and Morgan,等(2001)Applied and Envir.Micro.67：2062-2069)；美国专利号6,048,838和美国专利号6,379,946，美国公开号US2014008054的PIP-1多肽，美国系列号13/800233的AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽，美国系列号13/839702的PHI-4多肽和δ-内毒素。所述δ-内毒素包括但不限于，δ-内毒素基因的Cry1、Cry2、Cry3、Cry4、Cry5、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry10、Cry11、Cry12、Cry13、Cry14、Cry15、Cry16、Cry17、Cry18、Cry19、Cry20、Cry21、Cry22、Cry23、Cry24、Cry25、Cry26、Cry27、Cry 28、Cry 29、Cry 30、Cry31、Cry32、Cry33、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry38、Cry39、Cry40、Cry41、Cry42、Cry43、Cry44、Cry45、Cry 46、Cry47、Cry49、Cry51、Cry55、Cry56、Cry57、Cry58、Cry59、Cry60、Cry61、Cry62、Cry63、Cry64、Cry65、Cry66、Cry67、Cry68、Cry69、Cry70、Cry71和Cry72类，和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)细胞溶解的cyt1和cyt2基因。苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白的成员包括，但不限于Cry1Aa1(登录号AAA22353)、Cry1Aa2(登录号AAA22552)、Cry1Aa3(登录号BAA00257)、Cry1Aa4(登录号CAA31886)、Cry1Aa5(登录号BAA04468)、Cry1Aa6(登录号AAA86265)、Cry1Aa7(登录号AAD46139)、Cry1Aa8(登录号I26149)、Cry1Aa9(登录号BAA77213)、Cry1Aa10(登录号AAD55382)、Cry1Aa11(登录号CAA70856)、Cry1Aa12(登录号AAP80146)、Cry1Aa13(登录号AAM44305)、Cry1Aa14(登录号AAP40639)、Cry1Aa15(登录号AAY66993)、Cry1Aa16(登录号HQ439776)、Cry1Aa17(登录号HQ439788)、Cry1Aa18(登录号HQ439790)、Cry1Aa19(登录号HQ685121)、Cry1Aa20(登录号JF340156)、Cry1Aa21(登录号JN651496)、Cry1Aa22(登录号KC158223)、Cry1Ab1(登录号AAA22330)、Cry1Ab2(登录号AAA22613)、Cry1Ab3(登录号AAA22561)、Cry1Ab4(登录号BAA00071)、Cry1Ab5(登录号CAA28405)、Cry1Ab6(登录号AAA22420)、Cry1Ab7(登录号CAA31620)、Cry1Ab8(登录号AAA22551)、Cry1Ab9(登录号CAA38701)、Cry1Ab10(登录号A29125)、Cry1Ab11(登录号I12419)、Cry1Ab12(登录号AAC64003)、Cry1Ab13(登录号AAN76494)、Cry1Ab14(登录号AAG16877)、Cry1Ab15(登录号AAO13302)、Cry1Ab16(登录号AAK55546)、Cry1Ab17(登录号AAT46415)、Cry1Ab18(登录号AAQ88259)、Cry1Ab19(登录号AAW31761)、Cry1Ab20(登录号ABB72460)、Cry1Ab21(登录号ABS18384)、Cry1Ab22(登录号ABW87320)、Cry1Ab23(登录号HQ439777)、Cry1Ab24(登录号HQ439778)、Cry1Ab25(登录号HQ685122)、Cry1Ab26(登录号HQ847729)、Cry1Ab27(登录号JN135249)、Cry1Ab28(登录号JN135250)、Cry1Ab29(登录号JN135251)、Cry1Ab30(登录号JN135252)、Cry1Ab31(登录号JN135253)、Cry1Ab32(登录号JN135254)、Cry1Ab33(登录号AAS93798)、Cry1Ab34(登录号KC156668)、Cry1Ab-like(登录号AAK14336)、Cry1Ab-like(登录号AAK14337)、Cry1Ab-like(登录号AAK14338)、Cry1Ab-like(登录号ABG88858)、Cry1Ac1(登录号AAA22331)、Cry1Ac2(登录号AAA22338)、Cry1Ac3(登录号CAA38098)、Cry1Ac4(登录号AAA73077)、Cry1Ac5(登录号AAA22339)、Cry1Ac6(登录号AAA86266)、Cry1Ac7(登录号AAB46989)、Cry1Ac8(登录号AAC44841)、Cry1Ac9(登录号AAB49768)、Cry1Ac10(登录号CAA05505)、Cry1Ac11(登录号CAA10270)、Cry1Ac12(登录号I12418)、Cry1Ac13(登录号AAD38701)、Cry1Ac14(登录号AAQ06607)、Cry1Ac15(登录号AAN07788)、Cry1Ac16(登录号AAU87037)、Cry1Ac17(登录号AAX18704)、Cry1Ac18(登录号AAY88347)、Cry1Ac19(登录号ABD37053)、Cry1Ac20(登录号ABB89046)、Cry1Ac21(登录号AAY66992)、Cry1Ac22(登录号ABZ01836)、Cry1Ac23(登录号CAQ30431)、Cry1Ac24(登录号ABL01535)、Cry1Ac25(登录号FJ513324)、Cry1Ac26(登录号FJ617446)、Cry1Ac27(登录号FJ617447)、Cry1Ac28(登录号ACM90319)、Cry1Ac29(登录号DQ438941)、Cry1Ac30(登录号GQ227507)、Cry1Ac31(登录号GU446674)、Cry1Ac32(登录号HM061081)、Cry1Ac33(登录号GQ866913)、Cry1Ac34(登录号HQ230364)、Cry1Ac35(登录号JF340157)、Cry1Ac36(登录号JN387137)、Cry1Ac37(登录号JQ317685)、Cry1Ad1(登录号AAA22340)、Cry1Ad2(登录号CAA01880)、Cry1Ae1(登录号AAA22410)、Cry1Af1(登录号AAB82749)、Cry1Ag1(登录号AAD46137)、Cry1Ah1(登录号AAQ14326)、Cry1Ah2(登录号ABB76664)、Cry1Ah3(登录号HQ439779)、Cry1Ai1(登录号AAO39719)、Cry1Ai2(登录号HQ439780)、Cry1A-like(登录号AAK14339)、Cry1Ba1(登录号CAA29898)、Cry1Ba2(登录号CAA65003)、Cry1Ba3(登录号AAK63251)、Cry1Ba4(登录号AAK51084)、Cry1Ba5(登录号ABO20894)、Cry1Ba6(登录号ABL60921)、Cry1Ba7(登录号HQ439781)、Cry1Bb1(登录号AAA22344)、Cry1Bb2(登录号HQ439782)、Cry1Bc1(登录号CAA86568)、Cry1Bd1(登录号AAD10292)、Cry1Bd2(登录号AAM93496)、Cry1Be1(登录号AAC32850)、Cry1Be2(登录号AAQ52387)、Cry1Be3(登录号ACV96720)、Cry1Be4(登录号HM070026)、Cry1Bf1(登录号CAC50778)、Cry1Bf2(登录号AAQ52380)、Cry1Bg1(登录号AAO39720)、Cry1Bh1(登录号HQ589331)、Cry1Bi1(登录号KC156700)、Cry1Ca1(登录号CAA30396)、Cry1Ca2(登录号CAA31951)、Cry1Ca3(登录号AAA22343)、Cry1Ca4(登录号CAA01886)、Cry1Ca5(登录号CAA65457)、Cry1Ca6[1](登录号AAF37224)、Cry1Ca7(登录号AAG50438)、Cry1Ca8(登录号AAM00264)、Cry1Ca9(登录号AAL79362)、Cry1Ca10(登录号AAN16462)、Cry1Ca11(登录号AAX53094)、Cry1Ca12(登录号HM070027)、Cry1Ca13(登录号HQ412621)、Cry1Ca14(登录号JN651493)、Cry1Cb1(登录号M97880)、Cry1Cb2(登录号AAG35409)、Cry1Cb3(登录号ACD50894)、Cry1Cb-like(登录号AAX63901)、Cry1Da1(登录号CAA38099)、Cry1Da2(登录号I76415)、Cry1Da3(登录号HQ439784)、Cry1Db1(登录号CAA80234)、Cry1Db2(登录号AAK48937)、Cry1Dc1(登录号ABK35074)、Cry1Ea1(登录号CAA37933)、Cry1Ea2(登录号CAA39609)、Cry1Ea3(登录号AAA22345)、Cry1Ea4(登录号AAD04732)、Cry1Ea5(登录号A15535)、Cry1Ea6(登录号AAL50330)、Cry1Ea7(登录号AAW72936)、Cry1Ea8(登录号ABX11258)、Cry1Ea9(登录号HQ439785)、Cry1Ea10(登录号ADR00398)、Cry1Ea11(登录号JQ652456)、Cry1Eb1(登录号AAA22346)、Cry1Fa1(登录号AAA22348)、Cry1Fa2(登录号AAA22347)、Cry1Fa3(登录号HM070028)、Cry1Fa4(登录号HM439638)、Cry1Fb1(登录号CAA80235)、Cry1Fb2(登录号BAA25298)、Cry1Fb3(登录号AAF21767)、Cry1Fb4(登录号AAC10641)、Cry1Fb5(登录号AAO13295)、Cry1Fb6(登录号ACD50892)、Cry1Fb7(登录号ACD50893)、Cry1Ga1(登录号CAA80233)、Cry1Ga2(登录号CAA70506)、Cry1Gb1(登录号AAD10291)、Cry1Gb2(登录号AAO13756)、Cry1Gc1(登录号AAQ52381)、Cry1Ha1(登录号CAA80236)、Cry1Hb1(登录号AAA79694)、Cry1Hb2(登录号HQ439786)、Cry1H-like(登录号AAF01213)、Cry1Ia1(登录号CAA44633)、Cry1Ia2(登录号AAA22354)、Cry1Ia3(登录号AAC36999)、Cry1Ia4(登录号AAB00958)、Cry1Ia5(登录号CAA70124)、Cry1Ia6(登录号AAC26910)、Cry1Ia7(登录号AAM73516)、Cry1Ia8(登录号AAK66742)、Cry1Ia9(登录号AAQ08616)、Cry1Ia10(登录号AAP86782)、Cry1Ia11(登录号CAC85964)、Cry1Ia12(登录号AAV53390)、Cry1Ia13(登录号ABF83202)、Cry1Ia14(登录号ACG63871)、Cry1Ia15(登录号FJ617445)、Cry1Ia16(登录号FJ617448)、Cry1Ia17(登录号GU989199)、Cry1Ia18(登录号ADK23801)、Cry1Ia19(登录号HQ439787)、Cry1Ia20(登录号JQ228426)、Cry1Ia21(登录号JQ228424)、Cry1Ia22(登录号JQ228427)、Cry1Ia23(登录号JQ228428)、Cry1Ia24(登录号JQ228429)、Cry1Ia25(登录号JQ228430)、Cry1Ia26(登录号JQ228431)、Cry1Ia27(登录号JQ228432)、Cry1Ia28(登录号JQ228433)、Cry1Ia29(登录号JQ228434)、Cry1Ia30(登录号JQ317686)、Cry1Ia31(登录号JX944038)、Cry1Ia32(登录号JX944039)、Cry1Ia33(登录号JX944040)、Cry1Ib1(登录号AAA82114)、Cry1Ib2(登录号ABW88019)、Cry1Ib3(登录号ACD75515)、Cry1Ib4(登录号HM051227)、Cry1Ib5(登录号HM070028)、Cry1Ib6(登录号A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Cyt2B(GenBank登录号U52043)。
δ-内毒素的例子包括但不限于美国专利号中5,880,275和7,858,849中Cry1A蛋白，美国专利号8,304,604、8,304,605和8,476,226中DIG-3或DIG-11毒素(N-端删除的α-helix 1和/或α-helix 2变体cry蛋白，例如Cry1A、Cry3A)，美国专利申请系列号：10/525,318Cry1B，US专利号6,033,874Cry1C，美国专利号5,188,960和6,218,188的Cry1F，美国专利号7,070,982、6,962,705和6,713,063Cry1A/F嵌合体chimeras；Cry2蛋白诸如美国专利号7,064,249中Cry2Ab蛋白；Cry3A蛋白包括但不限于至少两种不同Cry蛋白的可变区和保守区融合独特的组合产生的基因工程杂交杀虫蛋白(eHIP)(美国专利申请公开号2010/0017914)；Cry4蛋白；Cry5蛋白；Cry6蛋白；美国专利号7,329,736、7,449,552、7,803,943、7,476,781、7,105,332、7,378,499和7,462,760的Cry8蛋白；Cry9蛋白例如Cry9A、Cry9B、Cry9C、Cry9D、Cry9E和Cry9F家族成员；Cry15蛋白(Naimov等2008Applied andEnvironmental Microbiology,74:7145-7151)；美国专利号6,127,180、6,624,145和6,340,593中的Cry22和Cry34Ab1蛋白；美国专利号6,248,535、6,326,351、6,399,330、6,949,626、7,385,107和7,504,229中CryET33和cryET34蛋白；美国专利公开号2006/0191034、2012/0278954和PCT公开号WO 2012/139004中CryET33和CryET34同源物；美国专利号6,083,499、6,548,291和6,340,593中Cry35Ab1蛋白；Cry46蛋白、Cry 51蛋白、Cry二元毒素、TIC901或相关毒素；美国专利申请公开号2008/0295207中TIC807；PCT申请US 2006/033867中ET29、ET37、TIC809、TIC810、TIC812、TIC127、TIC128；美国专利号8,236,757中AXMI-027、AXMI-036和AXMI-038；美国专利号7,923,602中AXMI-031、AXMI-039、AXMI-040、AXMI-049；WO 2006/083891中AXMI-018、AXMI-020和AXMI-021；WO 2005/038032中AXMI-010；WO 2005/021585中AXMI-003；美国专利申请公开号2004/0250311中AXMI-008；美国专利申请公开号2004/0216186中AXMI-006；美国专利申请公开号2004/0210965中AXMI-007；美国专利申请号2004/0210964中AXMI-009；美国专利申请公开号2004/0197917中AXMI-014；美国专利申请公开号2004/0197916中AXMI-004；WO 2006/119457中AXMI-028和AXMI-029；WO 2004/074462中AXMI-007、AXMI-008、AXMI-0080rf2、AXMI-009、AXMI-014和AXMI-004；US专利号8,084,416中AXMI-150；美国专利申请公开号2011/0023184中AXMI-205；美国专利申请公开号2011/0263488中AXMI-011、AXMI-012、AXMI-013、AXMI-015、AXMI-019、AXMI-044、AXMI-037、AXMI-043、AXMI-033、AXMI-034、AXMI-022、AXMI-023、AXMI-041、AXMI-063和AXMI-064；美国专利申请公开号2010/0197592中AXMI-R1和相关蛋白；WO 2011/103248中AXMI221Z、AXMI222z、AXMI223z、AXMI224z和AXMI225z；WO 2011/103247中AXMI218、AXMI219、AXMI220、AXMI226、AXMI227、AXMI228、AXMI229、AXMI230和AXMI231；美国专利号8,334,431中AXMI-115、AXMI-113、AXMI-005、AXMI-163和AXMI-184；美国专利申请公开号2010/0298211中AXMI-001、AXMI-002、AXMI-030、AXMI-035和AXMI-045；美国专利申请公开号2009/0144852中AXMI-066和AXMI-076；美国专利号8,318,900中AXMI128、AXMI130、AXMI131、AXMI133、AXMI140、AXMI141、AXMI142、AXMI143、AXMI144、AXMI146、AXMI148、AXMI149、AXMI152、AXMI153、AXMI154、AXMI155、AXMI156、AXMI157、AXMI158、AXMI162、AXMI165、AXMI166、AXMI167、AXMI168、AXMI169、AXMI170、AXMI171、AXMI172、AXMI173、AXMI174、AXMI175、AXMI176、AXMI177、AXMI178、AXMI179、AXMI180、AXMI181、AXMI182、AXMI185、AXMI186、AXMI187、AXMI188、AXMI189；美国专利申请公开号2010/0005543中AXMI079、AXMI080、AXMI081、AXMI082、AXMI091、AXMI092、AXMI096、AXMI097、AXMI098、AXMI099、AXMI100、AXMI101、AXMI102、AXMI103、AXMI104、AXMI107、AXMI108、AXMI109、AXMI110、AXMI111、AXMI112、AXMI114、AXMI116、AXMI117、AXMI118、AXMI119、AXMI120、AXMI121、AXMI122、AXMI123、AXMI124、AXMI1257、AXMI1268、AXMI127、AXMI129、AXMI164、AXMI151、AXMI161、AXMI183、AXMI132、AXMI138、AXMI137；美国专利申请公开号201400962281中AXMI232、AXMI233和AXMI249；美国专利号8,319,019中cry蛋白例如具有修饰蛋白水解位点的Cry1A和Cry3A；美国专利申请公开号2011/0064710中源于苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)菌株VBTS 2528的Cry1Ac、Cry2Aa和Cry1Ca毒素蛋白。本领域技术人员熟知的其他Cry蛋白(见Crickmore等“苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)毒素系统命名法”(2011),at www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)。本领域技术人员熟知Cry蛋白的杀虫活性(详见综述，van Frannkenhuyzen,(2009)J.Invert.Path.101:1-16)。本领域技术人员熟知cry蛋白作为转基因植物性状，Cry-转基因植物已经得到调控许可，这些转基因植物包括但不限于表达Cry1Ac、Cry1Ac+Cry2Ab、Cry1Ab、Cry1A.105、Cry1F、Cry1Fa2、Cry1F+Cry1Ac、Cry2Ab、Cry3A、mCry3A、Cry3Bb1、Cry34Ab1、Cry35Ab1、Vip3A、Cry9c和CBI-Bt的植物(详见Sanahuja,(2011)Plant Biotech Journal 9:283-300和转基因作物数据库中心的环境风险评估GM Crop Database Center for EnvironmentalRisk Assessment(2010)(CERA),ILSI研究基金会,华盛顿特区www.cera-gmc.org/index.php？action＝gm_crop_database)。本领域技术人员熟知的在植物中表达的杀虫蛋白包括，例如Vip3Ab&Cry1Fa(US2012/0317682)，Cry1BE&Cry1F(US2012/0311746)，Cry1CA&Cry1AB(US2012/0311745)，Cry1&CryCa(US2012/0317681)，Cry1DA&Cry1BE(US2012/0331590)，Cry1DA&Cry1Fa(US2012/0331589)，Cry1AB&Cry1BE(US2012/0324606)，Cry1Fa&Cry2Aa和Cry1I&Cry1E(US2012/0324605)，Cry34Ab/35Ab和Cry6Aa(US20130167269)，Cry34Ab/VCry35Ab&Cry3Aa(US20130167268)，和Cry3A和Cry1Ab或Vip3Aa(US20130116170)。杀虫蛋白也包括杀虫脂肪酶，其包括美国专利号7,491,869的脂酰基水解酶,和诸如源于链霉菌的胆固醇氧化酶(Purcell等(1993)Biochem Biophys Res Commun15：1406-1413)。杀虫蛋白也包括美国专利号5,877,012、6,107,279、6,137,033、7,244,820、7,615,686、8,237,020等的VIP(vegetative insecticidal protein，植物杀虫蛋白)毒素。本领域技术人员熟知的其他VIP蛋白见lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html。杀虫蛋白也包括源于嗜线虫致病杆菌属(Xenorhabdus)、初生型发光杆菌属(Photorhabdus)和类芽孢杆菌(Paenibacillus)的毒素复合物(toxin complex(TC))(见美国专利号7,491,698和8,084,418)。一些TC蛋白具有“独立”的杀昆虫活性，其他TC蛋白增强了同一给定有机体产生的独立TC蛋白的活性，“独立”TC蛋白的活性(例如，源于发光杆菌、致病杆菌或芽孢杆菌)能够被一种或多种来源不同种属有机体TC蛋白“增强剂”所增强。主要有三种类型TC蛋白，此处所指的是类型A蛋白(“蛋白质A”)是单体毒素。类型B蛋白(“蛋白质B”)和类型C蛋白(“蛋白质C”)增强类型A蛋白的毒性。类型A蛋白的例子有TcbA、TcdA、XptA1和XptA2，类型B蛋白的例子有TcaC、TcdB、XptB1Xb和XptC1Wi，类型C蛋白的例子有TccC、XptC1Xb和XptB1Wi。杀虫蛋白也包括蜘蛛、蛇和蝎毒蛋白。蜘蛛毒肽的例子包括但不限于lycotoxin-1肽及其突变体(美国专利号8,334,366)。
下面的例子描述了一些代表性的方法和技术用于模拟植物昆虫饲喂条件和/或评估植物在该条件下的抗性状况。
1.转化的植物的子代，该转化的植物对于重组DNA构建体来说是半合子的，该子代分离成包含或不包含该DNA构建体的植株：包含该重组DNA构建体的子代将通常相对于不包含该重组DNA构建体的子代来进行测量(即，不包含该重组DNA构建体的子代是对照或参照植物)。
2.重组DNA构建体基因渗入至近交系中，例如在玉米中，或基因渗入进变种中，例如在大豆中：基因渗入品系将通常相对于亲本近交系或变种品系进行测量(即，亲本近交系或品种品系是对照或参照植物)。
3.双杂交系，其中第一杂交系由两个亲本近交系产生，而第二杂交系由相同的两个亲本近交系产生，不同的是其中一个亲本近交系含有重组DNA构建体：第二杂交系通常将相对于第一杂交系进行测量(即第一杂交系为对照植物或参照植物)。
4.包含重组DNA构建体的植物：该植株可以相对于这样的对照植物进行评价或测量，该对照植物不包含重组DNA构建体，但具有与该植株相当的遗传背景(例如，与包含重组DNA构建体的植株相比较，该遗传物质具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性)。
此外，本领域的普通技术人员将容易认识到，评价或测量转基因植物的农学特性或表型时合适的对照或参照植物将不包括先前已经针对所需的农学特性或表型，通过诱变或转化而选择的植物。
“害虫”包括但不限于昆虫、真菌、细菌、线虫类、螨、虱等。昆虫害虫包括选自以下各目的昆虫：鞘翅目(Coleoptera)、双翅目(Diptera)、膜翅目(Hymenoptera)、鳞翅目(Lepidoptera)、禽虱(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthroptera)、缨尾目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、虱目(Anoplura)、蚤目(Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)等，特别是鳞翅目(Lepidoptera)和鞘翅目(Coleoptera)。
本领域技术人员认识到，并非所有的化合物都能有效的对付所有害虫，本实施例的化合物能够对付昆虫害虫，这些害虫包括经济重要的农业、林业、温室、苗圃花卉、食品和纤维、公众和动物健康、家庭和商业结构、家庭和仓储害虫。
鳞翅目(Lepidoptera)的幼虫包括但不限于夜蛾科(Noctuidae)的粘虫、切根虫、尺蠖和heliothine：秋粘虫(Spodoptera frugiperda JE Smith，fall armyworm)；甜菜夜蛾(S.exigua Hübner，beet armyworm)；斜纹夜蛾(S.litura Fabhcius，tobacco cutworm，cluster caterpillar)；蓓带夜蛾(Mamestra configurata Walker，bertha armyworm)；甘蓝夜蛾(M.brassicae Linnaeus，cabbage moth)；黑切根虫(Agrotis ipsilon Hufnagel，black cutworm)；西部切根虫(A.orthogonia Morrison，western cutworm)；颗粒夜蛾(A.subterranea Fabricius，granulate cutworm)，木棉虫(Alabama argillacea Hübner，cotton leaf worm)；粉纹夜蛾(Trichoplusia ni Hübner，cabbage looper)；大豆夜蛾(Pseudoplusia includens Walker，soybean looper)；黧豆夜蛾(Anticarsia gemmatalisHübner，velvetbean caterpillar)；苜蓿绿夜蛾(Hypena scabra Fabricius，greencloverworm)；烟芽夜蛾(Heliothis virescens Fabricius，tobacco budworm)；一星粘虫(Pseudaletia unipuncta Haworth,armyworm)；粗皮夜蛾(Athetis mindara Barnesand Mcdunnough，rough skinned cutworm)；暗缘地老虎(Euxoa messoria Harris，darksided cutworm)；埃及金钢钻(Earias insulana Boisduval，spiny bollworm)；翠纹金钢钻(E.vittella Fabricius，spotted bollworm)；美洲棉铃虫(Helicoverpa armigeraHübner，American bollworm)；谷实夜蛾(H.zea Boddie，corn earworm或cottonbollworm)；纹蝶毛虫(Melanchra picta Harris，zebra caterpillar)；柑橘夜蛾(Egira(Xylomyges)curialis Grote，citrus cutworm)；Mythimna separate(OrientalArmyworm)；草螟科(Crambidae)的钻蛀虫、鞘蛾幼虫、结网毛虫、球果蛾以及草蛾：亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis，Asian Corn Borer)；欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis，European corn borer)和；螟蛾科(Pyralidae)欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis Hübner，European corn borer)的食叶虫(skeletonizers)；脐橙螟(Amyelois transitellaWalker，naval orangeworm)；地中海粉斑螟(Anagasta kuehniella Zeller，Mediterranean flour moth)；干果斑螟(Cadra cautella Walker，almond moth)；二化螟(Chilo suppressalis Walker，rice stem borer)；斑禾草螟(C.partellus，sorghumborer)；米蛾(Corcyra cephalonicaStainton，rice moth)；玉米根结网毛虫(Crambuscaliginosellus Clemens，corn root webworm)；蓝草结网毛虫(C.teterrellus Zincken，bluegrass webworm)；稻纵卷叶野螟(Cnaphalocrocis medinalis Guenee，rice leafroller)；葡萄卷叶虫(Desmia funeralis Hübner，grape leaffolder)；甜瓜野螟(Diaphania hyalinata Linnaeus，melon worm)；泡菜虫(D.nitidalis Stoll，pickleworm)；西南玉米螟(Diatraea grandiosella Dyar，southwestern corn borer)；小蔗螟(D.saccharalis Fabricius，surgarcane borer)；墨西哥水稻螟(Eoreuma loftiniDyar，Mexican rice borer)；烟草粉螟(Ephestia elutella Hübner，tobacco(cacao)moth)；蜡螟(Galleria mellonella Linnaeus，greater wax moth)；野螟(Herpetogrammalicarsisalis Walker，sod webworm)；向日葵斑螟(Homoeosoma electellum Hulst，sunflower moth)；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus Zeller，lessercornstalk borer)；小蜡螟(Achroia grisella Fabricius，lesser wax moth)；草地螟(Loxostege sticticalis Linnaeus，beet webworm)；茶树螟(Orthaga thyrisalisWalker，tea tree web moth)；豆野螟(Maruca testulalis Geyer，bean pod borer)；印度谷螟(Plodia interpunctella Hübner，Indian meal moth)；三化螟(Scirpophagaincertulas Walker，yellow stem borer)；温室螟(Udea rubigalis Guenee，celeryleaftier)；以及卷蛾科(Tortricidae)的卷叶虫、蚜虫、种实虫以及果实虫：黑头卷叶蛾(Acleris gloverana Walsingham，Western blackheaded budworm)；黑头长翅卷蛾(A.variana Fernald，Eastern blackheaded budworm)；果树黄卷蛾(Archipsargyrospila Walker，fruit tree leaf roller)；欧洲卷叶蛾(A.rosana Linnaeus，European leaf roller)；以及其他的黄卷蛾属(Archips)物种：棉褐带卷蛾(Adoxophyesorana Fischer von summer fruit tortrix moth)；条纹向日葵螟(Cochylis hospesWalsingham，banded sunflower moth)；榛小卷蛾(Cydia latiferreana Walsingham，filbertworm)；苹果蠹蛾(C.pomonella Linnaeus，coding moth)；杂色卷叶蛾(Platynotaflavedana Clemens，variegated leafroller)；荷兰石竹小卷蛾(P.stultanaWalsingham，omnivorous leafroller)；欧洲葡萄小卷叶蛾(Lobesia botrana Denis&Schiffermüller，European grape vine moth)；苹白小卷蛾(Spilonota ocellana Denis&Schiffermüller，eyespotted bud moth)；萄果实蛀虫(Endopiza viteana Clemens，grapeberry moth)；女贞细卷蛾(Eupoecilia ambiguella Hübner，vine moth)；巴西苹果卷叶蛾(Bonagota salubricola Meyrick，Brazilian apple leafroller)；梨小食心虫(Grapholita molesta Busck，oriental fruit moth)；向日葵芽蛾(Suleima helianthanaRiley，sunflower budmoth)；条卷蛾(Argyrotaenia spp.)；尾蛱蝶(Choristoneuraspp.)。
鳞翅目(Lepidoptera)的所选其它农艺害虫包括但不限于：秋星尺蠖(Alsophilapometaria Harris，fall cankerworm)；桃枝麦蛾(Anarsia lineatella Zeller，peachtwig borer)；犀额蛾(Anisota senatoria J.E.Smith，orange striped oakworm)；柞蚕(Antheraea pernyi Guerin-Meneville，Chinese Oak Tussah Moth)；家蚕(Bombyx moriLinnaeus，Silkworm)；棉潜蛾(Bucculatrix thurberiella Busck，cotton leafperforator)；苜蓿黄蝶(Colias eurytheme Boisduval，alfalfa caterpillar)；胡桃黄蝶(Datana integerrima Grote&Robinson，walnut caterpillar)；落叶松毛虫(Dendrolimussibiricus Tschetwerikov，Siberian silk moth)；白尺蠖(Ennomos subsignaria Hübner，elm spanworm)；菩提尺蠖(Erannis tiliaria Harris，linden looper)；黄毒蛾(Euproctis chrysorrhoea Linnaeus，browntail moth)；黑拟蛉蛾(Harrisina americanaGuerin-Meneville，grapeleaf skeletonizer)；范围毛虫飞蛾(Hemileuca oliviaeCockrell，range caterpillar)；美国白蛾(Hyphantria cunea Drury，fall webworm)；番茄蠹蛾(Keiferia lycopersicella Walsingham，tomato pinworm)；二尾蛱蝶(Lambdinafiscellaria fiscellaria Hulst，Eastern hemlock looper)；西部铁杉尺蠖(L.fiscellaria lugubrosa Hulst，Western hemlock looper)；柳毒蛾(Leucoma salicisLinnaeus，satin moth)；舞毒蛾(Lymantria dispar Linnaeus，gypsy moth)；番茄天蛾(Manduca quinquemaculata Haworth，five spotted hawk moth，tomato hornworm)；烟草天蛾(M.sexta Haworth，tomato hornworm，tobacco hornworm)；冬尺蠖(Operophterabrumata Linnaeus，winter moth)；春尺蠖(Paleacrita vernata Peck，springcankerworm)；大凤蝶(Papilio cresphontes Cramer，giant swallowtail，orange dog)；加州株虫(Phryganidia californica Packard，California oakworm)；柑橘潜叶蛾(Phyllocnistis citrella Stainton，citrus leafminer)；斑幕潜叶蛾(Phyllonorycterblancardella Fabricius，spotted tentiform leafminer)；大菜粉蝶(Pieris brassicaeLinnaeus，large white butterfly)；小菜粉蝶(P.rapae Linnaeus，small whitebutterfly)；暗脉菜粉蝶(P.napi Linnaeus，green veined white butterfly)；洋蓟羽蛾(Platyptilia carduidactyla Riley，artichoke plume moth)；菱斑饿(Plutellaxylostella Linnaeus，diamondback moth)；棉红铃虫(Pectinophora gossypiellaSaunders，pink bollworm)；南方菜蛾(Pontia protodice Boisduval&Leconte，Southerncabbageworm)；杂食尺蠖(Sabulodes aegrotata Guenee，omnivorous looper)；康辛蠊(Schizura concinna J.E.Smith，red humped caterpillar)；麦蛾(Sitotrogacerealella Olivier，Angoumois grain moth)；松异带蛾(Thaumetopoea pityocampaSchiffermuller，pine processionary caterpillar)；结网衣蛾(Tineola bisselliellaHummel，webbing clothesmoth)；番茄斑潜蝇(Tuta absoluta Meyrick，tomatoleafminer)；苹果巢蛾(Yponomeuta padella Linnaeus，ermine moth)；Heliothissubflexa Guenee；天幕毛虫(Malacosoma spp)；以及毒蛾(Orgyia spp)。
鞘翅目(Coleoptera)的幼虫和成虫包括长角象鼻虫科(Anthribidae)、豆象科(Bruchidae)以及象甲科(Curculionidae)的象鼻虫(包括但不限于：棉铃象甲(Anthonomusgrandis Boheman，boll weevil)；稻水象甲(Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel，ricewater weevil)；谷象(Sitophilus granarius Linnaeus，granary weevil)；米象(S.oryzae Linnaeus，rice weevil)；车轴草叶象虫(Hypera punctata Fabricius，cloverleaf weevil)；向日葵茎象甲(Cylindrocopturus adspersus LeConte，sunflower stemweevil)；红色葵花籽象甲虫(Smicronyx fulvus LeConte，red sunflower seed weevil)；灰色葵花籽象甲虫(S.sordidus LeConte，gray sunflower seed weevil)；玉米象虫(Sphenophorus maidis Chittenden，maize billbug)；叶甲科(Chrysomelidae)的跳骚甲虫、黄瓜叶甲虫、根虫、叶甲虫、马铃薯叶甲以及潜叶虫(包括但不限于：科罗拉多州马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata Say，Colorado potato beetle)；玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgifera LeConte，western corn rootworm)；巴氏根叶甲(D.barberi Smith&Lawrence，northern corn rootworm)；南方玉米根虫(D.undecimpunctata howardi Barber，southern corn rootworm)；玉米跳甲(Chaetocnema pulicaria Melsheimer，corn flea beetle)；十字花科蔬菜跳甲(Phyllotreta cruciferae Goeze，Crucifer flea beetle)；黄曲条跳甲(Phyllotretastriolata，stripped flea beetle)；葡萄肖叶甲(Colaspis brunnea Fabricius，grapecolaspis)；黑角负泥虫(Oulema melanopus Linnaeus，cereal leaf beetle)；向日葵叶甲(Zygogramma exclamationis Fabricius，sunflower beetle))；瓢虫科(Coccinellidae)的甲虫(包括但不限于：墨西哥豆瓢虫(Epilachna varivestis Mulsant，Mexican beanbeetle)；蜣螂科(Scarabaeidae)的金龟子和其他的甲虫(包括但不限于：日本金龟子(Popillia japonica Newman，Japanese beetle)；北方圆头犀金龟(Cyclocephalaborealis Arrow，northern masked chafer，white grub)；南方圆头犀金龟(C.immaculataOlivier，southern masked chafer，white grub)；欧洲金龟(Rhizotrogus majalisRazoumowsky，European chafer)；蛴螬(Phyllophaga crinita Burmeister，white grub)；胡萝卜甲虫(Ligyrus gibbosus De Geer，carrot beetle))；皮蠹科(Dermestidae)的地毯圆皮蠹；叩甲科(Elateridae)的线虫：伪金针虫(Eleodes spp.)、梳抓叩头虫(Melanotusspp.)、单叶叩甲(Conoderus spp.)、金针虫(Limonius spp.)、锥尾叩甲(Agriotes spp.)、叩甲属(Ctenicera spp.)、Aeolus spp.；小蠹科(Scolytidae)的小蠹虫以及拟步甲科(Tenebrionidae)的甲虫。
双翅目(Diptera)的成虫和幼虫包括：诸如玉米斑潜叶蝇(Agromyza parvicornisLoew，corn blotch leafminer)的潜叶蝇；蚊(包括但不限于：高粱瘿蚊(Contariniasorghicola Coquillett，sorghum midge)；黑森瘿蚊(Mayetiola destructor Say，Hessian fly)；麦红吸浆虫(Sitodiplosis mosellana Gehin，wheat midge)；葵花籽蚊(Neolasioptera murtfeldtiana Felt，sunflower seed midge))；果蝇(实蝇科(Tephritidae))，瑞典秆蝇(Oscinella frit Linnaeus，frit flies)；蛆(包括但不限于：灰地种蝇(Delia platura Meigen，seedcorn maggot)；麦种蝇(D.coarctata Fallen，wheat bulb fly)；以及其它地种蝇(Delia spp.)，美洲秆蝇(Meromyza americana Fitch，wheat stem maggot)；舍蝇(Musca domestica Linnaeus，house flies)；夏厕蝇(Fanniacanicularis Linnaeus)，小舍蝇(F.femoralis Stein，lesser house flies)；厩螫蝇(Stomoxys calcitrans Linnaeus，stable flies))；秋家蝇、角蝇、丽蝇、金蝇(Chrysomyaspp.)；伏蝇(Phormia spp.)；以及其他的苔藓蝇害虫，马蝇，虻(Tabanus spp.)；胃蝇(Gastrophilus spp.)；狂蝇(Oestrus spp.)；牛蛆蝇(Hypoderma spp.)；斑虻(Chrysopsspp.)；绵羊虱蝇(Melophagus ovinus Linnaeus，keds)；以及其他的短角亚目(Brachycera)，蚊子，伊蚊(Aedes spp.)；按蚊(Anopheles spp.)；库蚊(Culex spp.)；黑蝇，原蚋(Prosimulium spp.)；蚋(Simulium spp.)；咬蠓、白蛉、尖眼蕈蚊和其他长角亚目(Nematocera)。
半翅目(Hemiptera)和同翅目(Homoptera)的成虫和若虫包括昆虫，诸如但不限于：球蚜科(Adelgidae)的球蚜、盲蝽科(Miridae)的盲蝽、蝉科(Cicadidae)的蝉、叶蝉科(Cicadellidae)的叶蝉、小绿叶蝉(Empoasca spp.)；大叶禅科(Cicadellidae)的大叶青禅，菱飞虱科(Cixiidae)、蛾蜡蝉科(Flatidae)、蜡蝉总科(Fulgoroidea)、圆飞虱科(Issidae)以及稻虱科(Delphacidae)的飞虱；角蝉科(Membracidae)的角蝉；木虱科(Psyllidae)的木虱；粉虱科(Aleyrodidae)的粉虱；蚜科(Aphididae)的蚜虫；根瘤蚜科(Phylloxeridae)的根瘤蚜；粉蚧科(Pseudococcidae)的粉蚧；链介壳虫科(Asterolecanidae)、软介壳虫科(Coccidae)、洋红蚧科(Dactylopiidae)、盾介壳虫科(Diaspididae)、绒蚧科(Eriococcidae)、旌介壳虫科(Ortheziidae)、刺葵介壳虫科(Phoenicococcidae)以及硕介壳虫科(Margarodidae)的介壳虫；纲蝽科(Tingidae)的网蝽；蝽科(Pentatomidae)的九香虫；长蝽科(Lygaeidae)的麦长蝽，长椿(Blissus spp.)；以及其他的蝽类(seed bugs)，沫蝉科(Cercopidae)的沫蝉、缘蝽科(Coreidae)的南瓜缘蝽、以及红蝽科(Pyrrhocoridae)的秋恙螨和棉蝽。
同翅目(Homoptera)中农艺上重要的成员还包括但不限于：豌豆蚜(Acyrthisiphon pisum Harris，pea aphid)；豇豆蚜(Aphis craccivora Koch，cowpeaaphid)；黑豆蚜(A.fabae Scopoli，black bean aphid)；棉蚜(A.gossypii Glover，cottonaphid，melon aphid)；玉米根蚜(A.maidiradicis Forbes，corn root aphid)；苹果黄蚜(A.pomi De Geer，apple aphid)；绣线菊蚜(A.spiraecola Patch，spirea aphid)；茄沟无网蚜(Aulacorthum solani Kaltenbach，foxglove aphid)；草莓钉蚜(Chaetosiphonfragaefolii Cockerell，strawberry aphid)；麦双尾蚜(Diuraphis noxia Kurdjumov/Mordvilko，Russian wheat aphid)；玫瑰苹果蚜(Dysaphis plantaginea Paaserini，rosyapple aphid)；苹果绵蚜(Eriosoma lanigerum Hausmann，woolly apple aphid)；甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae Linnaeus，cabbage aphid)；桃粉大尾蚜(Hyalopterus pruniGeoffroy，mealy plum aphid)；萝卜蚜(Lipaphis erysimi Kaltenbach，turnip aphid)；麦无网长管蚜(Metopolophium dirrhodum Walker，cereal aphid)；大戟长管蚜(Macrosiphum euphorbiae Thomas，potato aphid)；烟桃蚜(Myzus persicae Sulzer，peach-potato aphid，green peach aphid)；莴苣蚜(Nasonovia ribisnigri Mosley，lettuce aphid)；瘿绵蚜(Pemphigus spp.，root aphids和gall aphids)；玉米蚜(Rhopalosiphum maidis Fitch，corn leaf aphid)；禾谷缢管蚜(R.padi Linnaeus，birdcherry-oat aphid)；麦二叉蚜(Schizaphis graminum Rondani，greenbug)；黄色甘蔗蚜(Sipha flava Forbes，yellow sugarcane aphid)；麦长管蚜(Sitobion avenaeFabricius，English grain aphid)；苜蓿斑蚜(Therioaphis maculata Buckton,spottedalfalfa aphid)；黑色柑橘蚜(Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe,blackcitrus aphid)以及褐色桔蚜(T.citricida Kirkaldy,brown citrus aphid)；球蚜(Adelges spp.,adelgids)；长山核桃根瘤蚜(Phylloxera devastatrix Pergande,pecanphylloxera)；甘薯粉虱(Bemisia tabaci Gennadius,tobacco whitefly,sweetpotatowhitefly)；银叶粉虱(B.argentifolii Bellows&Perring,silverleaf whitefly)；柑桔粉虱(Dialeurodes citri Ashmead,citrus whitefly)；烟粉虱(Trialeurodesabutiloneus,bandedwinged whitefly)以及温室白粉虱(T.vaporariorum Westwood,greenhouse whitefly)；马铃薯小绿叶蝉(Empoasca fabae Harris,potato leafhopper)；灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallen,smaller brown planthopper)；紫菀叶蝉(Macrolestes quadrilineatus Forbes,aster leafhopper)；黑尾叶蝉(Nephotettixcinticeps Uhler,green leafhopper)；二条黑尾叶蝉(N.nigropictus Stal,riceleafhopper)；褐飞虱(Nilaparvata lugens Stal,brown planthopper)；玉米飞虱(Peregrinus maidis Ashmead,corn planthopper)；白背飞虱(Sogatella furciferaHorvath,white-backed planthopper)；稻飞虱(Sogatodes orizicola Muir,ricedelphacid)；苹果白叶蝉(Typhlocyba pomaria McAtee,white apple leafhopper)；葡萄叶蝉(Erythroneoura spp.,grape leafhoppers)；十七年蝉(Magicicada septendecimLinnaeus,periodical cicada)；吹绵蚧(Icerya purchasi Maskell,cottony cushionscale)；梨园盾蚧(Quadraspidiotus perniciosus Comstock,San Jose scale)；柑桔臀纹粉蚧(Planococcus citri Risso,citrus mealybug)；粉蚧的种(Pseudococcus spp.)(其他的粉蚧系群)；梨木虱(Cacopsylla pyricola Foerster,pear psylla)；柿木虱(Triozadiospyri Ashmead,persimmon psylla)。
半翅目(Hemiptera)中农艺上重要的物种包括但不限于：稻绿蝽(Acrosternumhilare Say,green stink bug)；南瓜缘蝽(Anasa tristis De Geer,squash bug)；麦长蝽(Blissus leucopterus leucopterus Say,chinch bug)；方翅网蝽(Corythuca gossypiiFabricius,cotton lace bug)；番茄蝽(Cyrtopeltis modesta Distant,tomato bug)；棉蝽(Dysdercus suturellus Herrich-Schaffer,cotton stainer)；褐臭蝽(Euschistusservus Say,brown stink bug)；一斑臭蝽(E.variolarius Palisot de Beauvois,one-spotted stink bug)；长蝽(Graptostethus spp.)(果实蝽系群(complex of seedbugs))；松叶根蝽(Leptoglossus corculus Say,leaf-footed pine seed bug)；美国牧草盲蝽(Lygus lineolaris Palisot de Beauvois,tarnished plant bug)；豆荚草盲蝽(L.Hesperus Knight,Western tarnished plant bug)；牧草盲蝽(L.pratensisLinnaeus,common meadow bug)；长毛草盲蝽(L.rugulipennis Poppius,Europeantarnished plant bug)；长绿盲蝽(Lygocoris pabulinus Linnaeus,common greencapsid)；水稻稻绿蝽(Nezara viridula Linnaeus,southern green stink bug)；稻蝽(Oebalus pugnax Fabricius,rice stink bug)；突角长蝽(Oncopeltus fasciatusDallas,large milkweed bug)；棉盲蝽(Pseudatomoscelis seriatus Reuter,cottonfleahopper)。
半翅目(Hemiptera)中包括的害虫包括：草莓蝽(Calocoris norvegicus Gmelin,strawberry bug)；Orthops campestris Linnaeus；苹盲蝽(Plesiocoris rugicollisFallen,apple capsid)；番茄蝽(Cyrtopeltis modestus Distant,tomato bug)；烟草小盲蝽(Cyrtopeltis notatus Distant,suckfly)；白斑盲蝽(Spanagonicus albofasciatusReuter,whitemarked fleahopper)；皂荚蝽(Diaphnocoris chlorionis Say,honeylocustplant bug)；洋葱蝽(Labopidicola allii Knight,onion plant bug)；棉盲蝽(Pseudatomoscelis seriatus Reuter,cotton fleahopper)；苜蓿褐盲蝽(Adelphocorisrapidus Say,rapid plant bug)；四线盲蝽(Poecilocapsus lineatus Fabricius,four-lined plant bug)；拟麦长蝽(Nysius ericae Schilling,false chinch bug)；茶黄蓟马(Nysius raphanus Howard,false chinch bug)；稻青蝽(Nezara viridula Linnaeus,Southern green stink bug)；扁盾蝽(Eurygaster spp.)；缘蝽(Coreidae spp.)；红蝽(Pyrrhocoridae spp.)；谷蛾(Tinidae spp.)；负子蝽(Blostomatidae spp.)；猎蝽(Reduviidae spp.)；以及臭蝽(Cimicidae spp.)。
螨(Acari)(螨(mites)目的成虫和幼虫包括：小麦卷叶螨(Aceria tosichellaKeifer,wheat curl mite)；褐色小麦螨(Petrobia latens Müller,brown wheat mite)；叶螨科(Tetranychidae)的蛛螨和恙螨，欧洲叶螨(Panonychus ulmi Koch,European redmite)；二斑叶螨(Tetranychus urticae Koch,two spotted spider mite)；迈叶螨(T.mcdanieli McGregor,McDaniel mite)；朱砂叶螨(T.cinnabarinus Boisduval,carmine spider mite)；土耳其斯坦叶螨(T.turkestani Ugarov&Nikolski,strawberryspider mite)；细须螨科(Tenuipalpidae)的扁平螨，葡萄短须螨(Brevipalpus lewisiMcGregor,citrus flat mite)；瘿螨科(Eriophyidae)的锈螨和芽廮螨以及其他的食叶螨和对人类和动物健康重要的螨，即蜻科(Epidermoptidae)中的锈螨，蠕形螨科(Demodicidae)中的毛囊虫，食甜螨科(Glycyphagidae)的谷螨，硬蜱科(Ixodidae)的扁虱，黑脚硬蜱(Ixodes scapularis Say,deer tick)；全环硬蜱(I.holocyclus Neumann,Australian paralysis tick)；美国狗壁虱(Dermacentor variabilis Say,American dogtick)；美洲壁虱(Amblyomma americanum Linnaeus,lone star tick)；以及痒螨科(Psoroptidae)、蒲螨科(Pyemotidae)和疥螨科(Sarcoptidae)的痒螨和疥螨。
缨尾目(Thysanura)中的昆虫害虫是值得关注的，诸如西洋衣鱼(Lepismasaccharina Linnaeus,silverfish)；小灶衣鱼(Thermobia domestica Packard,firebrat)。
所涵盖的其他节肢害虫包括蜘蛛目(Araneae)中的蜘蛛，如棕色隐遁蜘蛛(Loxosceles reclusa Gertsch&Mulaik,brown recluse spider)；和黑寡妇蜘蛛(Latrodectus mactans Fabricius,black widow spider)；和蚰蜒目(Scutigeromorpha)的蜈蚣，如蚰蜒(Scutigera coleoptrata Linnaeus,house centipede)。
所关注的昆虫害虫包括蝽象总科和其他相关昆虫的总科，包括但不限于蝽象科(稻绿蝽(Nezara viridula),茶翅蝽(Halyomorpha halys),璧蝽(Piezodorus guildini),褐臭蝽(Euschistus servus),拟缘蝽(Acrosternum hilare),大豆褐蝽(Euschistusheros),Euschistus tristigmus,Dichelops furcatus,Dichelops melacanthus,and菘蝽(Bagrada hilaris))、龟蝽科(筛豆龟蝽-豆圆蝽(Megacopta cribraria-Bean plataspid)和土蝽科(根椿象(Scaptocoris castanea-Root stink bug))的物种；以及鳞翅目的物种，包括但不限于菜蛾(diamond-back moth)，如美洲棉铃虫(Helicoverpa zea Boddie)；大豆尺蠖(soybean looper)，如大豆夜蛾；以及黧豆毛虫(velvet bean caterpillar)，如黧豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis Hübner)。
线虫(Nematodes)包括寄生性线虫，例如根结、胞囊和病变线虫，包括胞囊线虫属物种(Heterodera spp.)、根结线虫属物种(Meloidogyne spp.)和球异皮线虫属物种(Globodera spp.)；特别是胞囊线虫的成员，包括但不限于，大豆胞囊线虫(Heteroderaglycines，soybean cyst nematode)；甜菜胞囊线虫(Heterodera schachtii，beet cystnematode)；禾谷胞囊线虫(Heterodera avenae，cereal cyst nematode)以及马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)和马铃薯白线虫(Globodera pailida，potato cystnematodes)。病变线虫包括短体线虫属物种(Pratylenchus spp.)。
用于测量杀虫活性的方法是本领域熟知的。参见例如，Czapla and Lang，(1990)J.Econ.Entomol.83：2480-2485；Andrews等，(1988)Biochem.J.252：199-206；Marrone等，(1985)J.of Economic Entomology78：290-293以及美国专利号5,743,477，所有这些文献全文以引用方式并入本文。一般来讲，将蛋白混合并用于摄食测定。参见例如Marrone等(1985)J.of Economic Entomology78：290-293。此类测定法可包括将植物与一种或多种害虫接触以及测定植物存活和/或促使害虫死亡的能力。
如本文所用，“杀虫活性”是指生物体或物质(诸如，例如蛋白)的活性，不管生物体或物质是否有毒或抑制，其测量可以通过但不限于，害虫死亡率、害虫体重减少、害虫驱避性(repellency)、害虫生长发育迟缓以及进食和暴露适当长时间后害虫的其它行为和物理变化。这种方式，杀虫药的活性影响至少一个与昆虫健康相关的测量参数。同样，“杀昆虫活性”是指害虫是昆虫时的“杀虫活性”。预期的“阻碍生长发育”是指按重量大于50％的生长抑制。例如，“杀虫蛋白”是自身显示或与其它蛋白组合显示杀虫活性的蛋白。监测杀昆虫活性的一般程序包括将试验性化合物或生物体添加到密封容器中的食物来源中。评价杀虫活性的试验是本领域熟知的。参见例如美国专利号6,570,005和6,339,144，文献全文以引用方式并入本文。所关注的昆虫用于测试杀昆虫活性的最佳发育阶段是幼虫或不成熟的昆虫。昆虫可以在完全黑暗、20～30℃和30％～70％的相对湿度下饲养。生物测定可以根据Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.83(6)：2480-2485的描述进行操作。饲养昆虫幼虫的方法和生物测定的方法是本领域的普通技术人员熟知的。
杀昆虫蛋白的毒性和抑制作用包括但不限于，与取食野生植物相比，取食转基因植物阻碍幼虫生长发育、杀死虫卵或者幼虫、减轻成虫或者幼虫的体重；诱导昆虫取食、筑巢或育种的回避行为。植物的抗昆虫性可以由将编码杀昆虫蛋白的核酸序列引入有机体或对有机体(如植物或植物的一部分)施用杀昆虫物质而赋予，其中杀昆虫物质包括但不限于杀昆虫蛋白。正如本文所用，“控制害虫群体”或“控制害虫”指对有害生物产生的进而限制其损害任何效应。控制害虫包括但不限于，杀死害虫、抑制害虫发育、改变害虫的育性或发育以致害虫对植物产生更小的损害、减少害虫产生后代的数量、产生发育不良的害虫、产生的害虫更容易受到捕食者攻击或阻止害虫取食植物。
方法：
方法包括但不限于：用于增强植物抗虫性的方法、用于评价植物抗虫性的方法、用于控制昆虫种群的方法、用于杀死昆虫种群的方法，用于控制昆虫种群对杀昆虫多肽抗性的方法，和用于制备种子的方法。
方法包括但不限于如下方法：
转化细胞的方法包括用本发明的任何分离的多核苷酸转化细胞。也包括通过这种方法转化的细胞。在具体实施方案中，所述细胞是真核细胞，例如酵母、昆虫或植物细胞，或原核细胞例如细菌细胞。
产生转基因植物的方法，其包括用本发明的任何分离的多核苷酸或重组DNA构建体来转化植物细胞并由转化的植物细胞再生转基因植物。本发明也涉及由该方法制备的转基因植物，以及从该转基因植物中获取的转基因种子。
用于从细胞或细胞培养基中分离本发明多肽的方法，其中所述细胞包含具有本发明多核苷酸的重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含本发明的多核苷酸可操作地连接到至少一种调控元件，并且其中转化的宿主细胞在适于重组DNA构建体表达的条件下生长。
改变宿主细胞中本发明多肽表达水平的方法，包括：(a)用本发明的重组DNA构建体转化宿主细胞；以及(b)在适于表达所述重组DNA构建体的条件下使转化的细胞生长，其中重组DNA构建体的表达导致转化的宿主细胞中的本发明多肽含量改变。
增强植物抗虫性的方法，包括(a)将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含一种多核苷酸和与其可操作地连接至少一种调控元件(例如在植物中有功能的启动子)，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQID NO：6、9或12进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；和(b)在步骤(a)之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体，并且在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增强的抗虫性。所述方法还可包括(c)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含重组DNA构建体，并且在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增强的抗虫性。
增强植物抗虫性的方法，包括(a)将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含至少一种异源调控元件可操作地连接的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在植物中基因组编码SLT1、DN-ITP6或DN-ITP7多肽；和(b)由步骤(a)的再生植物细胞再生的转基因植物，其中转基因植物在其基因组中包含DNA构建体，转基因植物中SLT1、DN-ITP6或DN-ITP7多肽的表达增加，并且当与不包含DNA构建体的对照植物相比时显示增强的抗虫性。该方法还包括(c)获得源于转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含DNA构建体，具有增加的SLT1、DN-ITP6或DN-ITP7多肽的表达量，并且与不含DNA构建体的对照植物相比显示增加的抗虫性。
在一些实施方案中，控制害虫的方法包括在植物中过量表达SLT1、DN-ITP6或DN-ITP7多肽，在一些实施方案中，控制害虫的方法包括用本发明的DNA构建体转化植物或植物细胞。
在一些实施方案中，杀死害虫的方法包括在植物中过量表达SLT1、DN-ITP6或DN-ITP7多肽。在一些实施方案中，杀死害虫的方法包括用本发明的DNA构建体转化植物或植物细胞。
评估植物抗虫性的方法包括：(a)将重组DNA构建体导入到可再生植物细胞中，所述重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作地连接至少一个调控序列(例如植物中有功能的启动子)，其中所述多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列在与SEQ ID NO：6、9或12比较时，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；和(b)在步骤(a)之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；和(c)与不包含重组DNA构建体的对照植物相比评估转基因植物抗虫性。该方法可进一步包括(d)获得源于转基因植物的子代植物，其中子代植物在其基因组中包含重组DNA构建体；和(e)与不包含重组DNA构建体的对照植物相比评估子代植物的抗虫性。
产生种子的方法，该方法包括任一上述的方法，并且还包括从所述子代植物获得种子，其中所述种子在其基因组中包含所述重组DNA构建体。
在一些实施方案中，本发明中的种子在其基因组中包含本发明的重组DNA构建体。
种子处理：
为了保护并提高产率产量和性状技术，种子处理剂选项可提供额外的作物计划灵活性并有效控制昆虫、杂草和病害。可用一种或多种本文批露的杀昆虫蛋白或多肽处理种子材料，例如用上述种子处理剂处理种子，所述种子为含有转基因性状的转基因玉米、大豆、芸苔、棉花或水稻。本文披露的一种或多种杀昆虫蛋白或多肽可与其他传统的种子处理剂组合使用。可用包含化学或生物除草剂、除草剂安全剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、萌发抑制剂和增强剂、营养素、植物生长调节剂和活化剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀鸟剂和/或杀软体动物剂的组合物，对种子材料进行处理，通常进行表面处理。这些化合物通常与在配制领域中惯常使用的其他载体、表面活性剂或促进施用的助剂一起配制。包衣可以通过用液体制剂浸渍繁殖材料或通过用混合的湿或干制剂涂覆来实施。可用作种子处理剂的各种类型化合物的例子在由英国农作物保护委员会(British Crop Production Council)出版的ThePesticide Manual：A World Compendium，C.D.S.Tomlin Ed.(《杀虫剂手册：世界纲要》，C.D.S.Tomlin编辑)中提供，该文献据此处以引用方式并入。
可用于作物种子上的一些种子处理剂包括但不限于如下的一种或多种：脱落酸、阿拉酸式苯-S-甲基、阿维菌素、杀草强、氧环唑、固氮螺菌、印楝素、嘧菌酯、芽孢杆菌属物种(包括蜡样芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和/或苏云金芽孢杆菌中的一种或多种)、慢生根瘤菌属物种(bradyrhizobiumspp.)(包括甜菜慢生根瘤菌、加那利慢生根瘤菌、埃氏慢生根瘤菌、西表岛慢生根瘤菌、大豆慢生根瘤菌、辽宁慢生根瘤菌、地瓜慢生根瘤菌和/或圆明园慢生根瘤菌中的一种或多种)、克菌丹、萎锈灵、壳聚糖、噻虫胺、铜、氰虫酰胺、苯醚甲环唑、土菌灵(etidiazole)、氟虫腈、咯菌腈、氟嘧菌酯、氟喹唑、解草胺、氟草肟、超敏蛋白、抑霉唑、吡虫啉、种菌唑、异黄酮(isoflavenoids)、脂壳寡糖、代森锰锌、锰、代森锰、精甲霜灵、甲霜灵、叶菌唑、腈菌唑、PCNB、戊苯吡菌胺、青霉属、吡噻菌胺、氯菊酯、啶氧菌酯、丙硫菌唑、唑菌胺酯、氯虫酰胺、S-异丙甲草胺、皂草苷、环苯吡菌胺、TCMTB、戊唑醇、噻苯哒唑、噻虫嗪、硫双威、福美双、甲基立枯磷、三唑醇、木霉、肟菌酯、灭菌唑和/或锌。PCNB种子包衣是指EPA注册号00293500419，含有五氯硝基苯和依得利。TCMTB是指2-(硫氰基甲基硫代)苯并噻唑。
可测试具有特定转基因性状的种子品种和种子以确定哪种种子处理剂选项和施用速率可补充此类品种和转基因性状以提高产量。例如，具有良好产量潜力但存在丝黑穗病易感性的品种可受益于提供抑制丝黑穗病的种子处理剂的使用，具有良好产量潜力但存在胞囊线虫易感性的品种可受益于提供防胞囊线虫的保护的种子处理剂的使用，以此类推。同样地，涵盖赋予昆虫抗性的转基因性状的品种可受益于种子处理剂所赋予的第二作用模式，涵盖赋予除草剂抗性的转基因性状的品种可受益于种子处理剂和增强植物对该除草剂的抗性的安全剂，等等。此外，由种子处理剂的适当使用所引起的良好根系建成和提早出苗可使得在与种子处理剂结合时包含特定性状的一个品种或多个品种更有效地使用氮、抵御干旱的能力更佳、以及产量潜力总体增加。
在前述任意的方法中或本文其他实施方案披露的任意方法中确定转基因植物农艺性状改变的步骤，如果适当，可包括确定在变化的环境条件下，与不包含重组DNA构建体的对照植物相比，转基因植物是否显示至少一种农艺性状的变化。
在前述任意的方法中或本文其他实施方案披露的任意方法中确定转基因子代植物农艺性状改变的步骤，如果适当，可包括确定在变化的环境条件下，与不包含重组DNA构建体的对照植物相比，转基因子代植物是否显示至少一种农艺性状的变化。
在前述任意的方法中或本文其他实施方案披露的任意方法中，所述引入步骤中所述可再生植物细胞可包括愈伤细胞、胚胎愈伤细胞、配子细胞、分生细胞、或未成熟的胚胎细胞。可再生植物细胞可源于近交玉米植株。
在前述任意方法或本文披露的其他实施方案中的任意方法中，所述再生步骤可包括：(i)在含有胚促激素培养基上培养所述转化的植物细胞直至长出愈伤组织；(ii)将步骤(i)所述的转化植物细胞转移至含有组织促激素的第一培养基上；和(iii)将步骤(ii)所述转化植物细胞接种到第二培养基上，使其茎伸长、根发育或两者均发育。
在前述任意方法或本文披露的其他实施方案的任意方法中，存在将重组DNA构建体导入再生植物细胞的可替代方法，所述重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控序列。例如，将调控序列(诸如一个或多个增强子、可作为转座元件的一部分)导入再生植物细胞中，然后筛选调控序列可操作地与即时披露的编码多肽的内源基因连接的转基因事件。
将本文披露的重组DNA构建导入植物的适当的技术，包括，但不限于直接DNA吸收、化学处理、电穿孔、微注射、细胞融合、转染、载体介导DNA转移、轰击、或农杆菌介导的转化。植物转化和再生的技术在国际专利公开号WO 2009/006276中描述，其全部内容并入作为参考。
另外，也有修饰或改变宿主内源基因组DNA的方法，包括改变宿主天然DNA序列或调控元件、编码或非编码序列等前体转基因序列。这些方法也可以用于将核酸序列靶向到基因组中预先设计的目标识别序列。例如本文中转基因修饰的细胞或植物使用传统的基因工程核酸酶如产生修饰植物基因组的归位核酸内切酶产生(例如WO 2009/114321；Gao等(2010)Plant Journal 1：176-187)。其他的位点定向工程是通过使用锌指结构域识别偶联的限制性内切酶的限制性特点修饰内源基因(例如Urnov等(2010)Nat Rev Genet.11(9)：636-46；Shukla等(2009)Nature 459(7245)：437-41)。转录激活因子类似-DNA修饰酶(transcription activator-like effector-DNA modifying enzyme，TALE或TALEN)可用于基因工程修饰植物基因组，参见例如US20110145940,Cermak等(2011)Nucleic AcidsRes.39(12)和Boch等(2009),Science 326(5959)：1509-12。植物基因组定点修饰也可以使用细菌II型CRISPR(成簇的规律的间隔的短回文的重复序列，clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats)/Cas(CRISPR关联蛋白，CRISPR-associated)系统，参考例如Belhaj等(2013),Plant Methods 9:39.CRISPR/Cas系统可以允许可定制的小的非编码RNA引导的基因组DNA靶向切割。
本领域的技术人员熟悉将编码期望多肽的基因转化植物和培育再生植物的方法。所述再生植物可以自花授粉产生纯合子转基因植物，或者将再生植物的花粉与种子长出的农艺重要的植物杂交，或者农艺重要的植物的花粉与再生的转基因植物杂交。本领域的技术人员熟知培育本文披露的含有期望多肽的转基因植物的方法。
转基因植物中性状的堆叠
转基因植物可包含本文所公开的一个或多个杀昆虫或抗昆虫的多核苷酸与可导致多个多肽序列的产生或抑制的一个或多个另外的多核苷酸的堆叠，可通过传统育种方法或通过遗传工程方法获得包含多核苷酸序列的堆叠的转基因植物。这些方法包括但不限于培育各自包含所关注多核苷酸的单独品系，用后续基因转化包含本文所公开的基因的转基因植物，以及将基因共转化进单个植物细胞中。如本文所用，术语“堆叠”包括具有存在于同一植物中的多种性状(例如，两种性状均掺入核基因组中，一种性状掺入核基因组中且一种性状掺入质体的基因组中，或者两种性状均掺入质体的基因组中)。在一个非限制性例子中，“堆叠性状”包含序列彼此物理相邻的分子堆叠。如本文所用的性状是指衍生自特定序列或序列群组的表型。可使用包含多个基因的单个转化载体或单独地携带于多个载体上的基因进行基因的共转化。如果序列通过遗传转化植株来堆叠，则所关注的多核苷酸序列可在任何时间以任何顺序进行组合。可以用共转化方案将性状与所关注多核苷酸同时引入，所述多核苷酸由转化盒的任何组合提供。例如，如果将要引入两条序列，则可将该两条序列包含在单独的转化盒中(反式)或包含在同一转化盒中(顺式)。可通过相同启动子或不同启动子驱动所述序列表达。在某些情况中，可能期望引入会抑制所关注多核苷酸的表达的转化盒。这可以与其他抑制盒或过表达盒的任何组合进行组合以在植物中生成所需的性状组合。还认识到可使用位点特异性重组系统在所需的基因组位置堆叠多核苷酸序列。参见，例如，WO 1999/25821、WO 1999/25854、WO 1999/25840、WO 1999/25855和WO 1999/25853，上述专利均以引用的方式并入本文。
实施例
实施例1.水稻激活标签突变体库的构建
本研究使用一个双元构建体，它含有4个来自花椰菜花叶病毒35S(CaMV 35S)启动子的多聚增强子，采用林拥军和张启发描述的农杆菌介导法转化中花11号水稻(Oryzasativa L.)(Lin and Zhang((2005)Plant Cell Rep.23:540-547)，构建水稻激活标签突变体库。中花11号水稻是中国农业科学院作物研究所培育的，我们从北京未名凯拓农业生物技术公司获得第一批种子，使用农杆菌对胚胎进行诱导转化。产生的转基因株系苗生长，并和收获的转基因种子构成突变体库。
实施例2.筛选以鉴定实验室条件下抗虫性增强的幼苗株系
亚洲玉米螟(ACB，Ostrinia furnacalis(Guenée))是亚洲玉米的重要昆虫害虫，广泛分布在中国大陆、澳大利亚以及所罗门岛屿，在其北部区域，每年蛾会产生一到几代，在热带区域，世代之间是连续并重叠的。毛虫通过损害籽粒和取食穗、叶和茎导致玉米产量损失严重，毛虫主要在植物的生殖器官部分存活和生长。其它受危害的经济作物包括辣椒、生姜和高粱。近来，亚洲玉米螟似乎已成为棉花的重要害虫，一些野生杂草也成为亚洲玉米螟的宿主(D.M.Nafusa和I.H.Schreinera.2012.Review of the biology and control ofthe Asian corn borer,Ostrinia furnacalis(Lep：Pyralidae)Tropical PestManagement.37:41-56)。
亚洲玉米螟被用于鉴定可以抑制幼虫发育的水稻ATL，ACB饲养种群来自中国农科院植物保护研究所室内饲养种群，在室内温度25～27℃，相对湿度60％～80％，光周期16L:8D条件下饲养10代以上。幼虫用人工饲料饲养(周大荣,叶志华,王振营，1995)，成虫产卵后，将卵纸保存于27℃培养箱中孵化，以初孵幼虫作为试虫。
除其他说明外，T2代转基因种子(在绿色荧光灯下发红光的种子)被用于昆虫抗性试验。每个激活标签株系(ATL)取150粒种子，于32℃800ppm多菌灵消毒8h后，冲洗3～5次，然后将种子置于铺上一层湿纱布的培养皿中(12x12 cm)。发芽的种子用蒸馏水在28℃培养10天时，苗高8～10cm即可用于ACB饲喂试验。
筛选方法：
以32孔板(每孔4cm x 4cm x 2cm，Pitman,N.J.USA-609-582-2392)作为实验器材，在每孔中加入1％的琼脂保湿，琼脂量约为1/3孔体积。32-孔板分成8个区域，每个区域4个孔，插入同一个ATL幼苗。20株水稻幼苗去除根和种子后插入到每个孔的琼脂中，然后使用毛笔将6头玉米螟初孵幼虫接入幼苗中，盖上特殊的膜盖(Pitman,N.J.USA-609-582-2392)。ZH11-TC(组织培养的ZH11)用作对照，对照水稻苗随机置于32孔板的不同区域。将装有水稻幼苗和亚洲玉米螟幼虫的32孔板，放置于27.5℃，相对湿度60％的环境下培养，从第二天开始每天将32-孔板旋转90度。5天后，目测观察ACB的发育状态，并计算抗性值。
每株系每孔取3头最大的幼虫，和对照ZH11-TC孔中幼虫相比，根据表2给出抗性值。如果对照孔幼虫正常发育至三龄，ATL孔中幼虫发育状态正常，那么ATL的抗性值为0；如果ATL孔中幼虫发育至二龄，幼虫比对照幼虫比较小，那么ATL的抗性值为1；如果ATL孔中幼虫发育至一龄，ATL孔中幼虫很小，那么ATL的抗性值为2。
幼虫生长抑制率是亚洲玉米螟抗性试验的一个指标，是指抑制数除以统计总虫数的百分比，其中抑制数是将4个孔中12头试虫的观测值相加的总和；统计总虫数是指观察到的所有虫的数量与一龄幼虫的数量相加的总和。使用卡方测验进行统计学分析，P＜0.01时记为亚洲玉米螟抗性阳性。
表2.玉米螟试验打分的分级标准
Figure BDA0002599881850000311
第一轮筛选中亚洲玉米螟抗性阳性株系会进一步筛选(第二轮筛选和第三轮筛选)，每轮一到两次重复，三次筛选为阳性的ATLs被认为是亚洲玉米螟抗性株系。
筛选结果：
1)AH43610幼苗
亚洲玉米螟初孵幼虫接种到水稻幼苗5天后，ZH11-TC幼苗明显被ACB损害，而AH43610幼苗被损害的程度较轻，且取食AH43610幼苗的幼虫比取食ZH11-TC的幼虫小。如表3所示，在第一轮筛选中，取食AH43610株系水稻幼苗的12头玉米螟幼虫中10头发育到二龄期，幼虫生长受到抑制，而取食对照ZH11-TC的所有12头幼虫中11头正常发育到三龄期。AH43610幼苗的幼虫生长抑制率为83.33％；显著高于ZH11-TC幼苗的幼虫生长抑制率(8.33％)，这些结果表明AH43610幼苗抑制了亚洲玉米螟幼虫的发育。第二轮筛选中，AH43610幼苗的幼虫生长抑制率分别为41.67％和66.67％，而ZH11-TC对照的幼虫生长抑制率为0.00％，因此AH43610的幼虫生长抑制率显著高于对照ZH11-TC幼苗。AH43610的幼虫生长抑制率在第三轮筛选的一次重复中显示了同样的趋势，在另一个重复中AH43610幼苗显示稍高的幼虫生长抑制率。这些结果一致表明，采用AH43610幼苗饲喂亚洲玉米螟阻碍了亚洲玉米螟幼虫向成虫的发育。
表3.AH43610幼苗在实验室筛选条件下的亚洲玉米螟试验
Figure BDA0002599881850000312
Figure BDA0002599881850000321
2)AH35009幼苗
亚洲玉米螟初孵幼虫接种到水稻幼苗5天后，ZH11-TC幼苗明显被ACB损害，而AH35009幼苗被损害的程度较轻，且取食AH35009幼苗的幼虫比取食ZH11-TC的幼虫小。表4为AH35009幼苗的三轮筛选结果，在第一轮筛选中，取食AH35009株系水稻幼苗的6头玉米螟幼虫全部发育到二龄期，幼虫生长受到抑制，而取食对照ZH11-TC幼苗的所有12头幼虫全部正常发育到三龄期。AH35009幼苗的幼虫生长抑制率为100％；显著高于ZH11-TC幼苗的幼虫生长抑制率(0.00％)，这些结果表明AH35009幼苗抑制了亚洲玉米螟幼虫的发育。因此进行了进一步的筛选。第二轮筛选中，AH35009幼苗的幼虫两次重复的生长抑制率分别为91％和50％，显著高于它们对应生长抑制率为0.00％的ZH11-TC对照的幼虫。第三轮筛选的一次重复中，AH35009幼苗的幼虫生长抑制率显著高于其对应的ZH11-TC对照的幼虫的生长抑制率。上述结果清晰且一致的表明，AH35009幼苗阻碍了亚洲玉米螟幼虫的发育，AH35009是ACB抗性株系。
表4.AH35009幼苗在实验室筛选条件下的亚洲玉米螟试验
Figure BDA0002599881850000322
3)AH30161幼苗
亚洲玉米螟初孵幼虫接种到水稻幼苗5天后，ZH11-TC幼苗明显被ACB损害，而AH30161幼苗被损害的程度较轻，且取食AH30161幼苗的幼虫比取食ZH11-TC的幼虫小。表5为AH30161幼苗的三轮筛选结果。在第一轮筛选中，取食AH30161株系水稻幼苗的6头玉米螟幼虫全部发育到二龄期，幼虫生长受到抑制，而取食对照ZH11-TC幼苗的所有12头幼虫全部正常发育到三龄期。AH30161幼苗的幼虫生长抑制率为100％，显著高于ZH11-TC幼苗的幼虫生长抑制率(0.00％)。这些结果表明AH30161幼苗抑制了亚洲玉米螟幼虫的发育。因此进行了进一步的筛选。第二轮筛选中，AH30161幼苗的幼虫两次重复的生长抑制率分别为88％和67％，显著高于其对应ZH11-TC对照的幼虫生长抑制率。第三轮筛选中，AH30161的幼虫生长抑制率显著高于ZH11-TC对照。这些结果清楚一致的表明，AH30161幼苗阻碍了亚洲玉米螟幼虫的发育，AH30161是ACB抗性株系。
表5.AH30161幼苗在实验室筛选条件下的亚洲玉米螟试验
Figure BDA0002599881850000331
上述结果表明，AH43610、AH35009和AH30161幼苗能够显著抑制亚洲玉米螟的生长和发育。
实施例3.实验室条件下粘虫(Mythimna separata)交叉验证亚洲玉米螟抗性的 ATL株系
粘虫(OAW，Mythimna separata)用于杀昆虫活性的交叉验证试验。OAW属于鳞翅目夜蛾科的杂食性昆虫害虫。粘虫虫卵购自中国农科院植物保护研究所，在27℃培养箱中孵化，以初孵幼虫作为交叉验证试验的试虫。
ATL水稻植株的培养方法和实验设计参见实施例2，与ACB幼虫验证相似。5天后，取出所有存活的幼虫，并目测观察，根据表2给出相应的抗性值。
幼虫生长抑制率用作抗性试验的一个参数，指抑制数除以统计总虫数的百分比，其中，抑制数是指一次重复中所有4个孔中观测到的抗性值的总和，统计总虫数是指观测到的总虫数和处于一龄期虫数的总和。
采用卡方统计原始数据，P<0.01时，认为测定的株系为粘虫抗性阳性株系。
筛选结果：
表6展示来了AH43610、AH35009和AH30161幼苗的粘虫筛选结果。在AH43610幼苗的孔中，所有观察到的22头幼虫均没有发育到三龄期，其中15头幼虫发育到二龄期，7头幼虫发育到一龄期；而取食ZH11-TC对照的幼虫中，9头正常发育到三龄期，34头发育到二龄期，2头发育到一龄期。AH43610幼苗的幼虫生长抑制率为100％，显著高于ZH11-TC对照(80.85％)。
取食AH35009幼苗的4个孔中，找到了20头幼虫，其中3头发育到了一龄期，8头发育到二龄期；而取食ZH11-TC幼苗的幼虫，9头发育到一龄期，8头发育到二龄期，AH35009幼苗的幼虫生长抑制率稍高于ZH11-TC对照幼苗。
AH30161株系的两次重复中，AH30161幼苗的幼虫生长抑制率高于ZH11-TC对照。
这些结果表明AH43610、AH35009和AH30161幼虫抑制粘虫幼虫的生长。
表6.AH43610、AH35009和AH30161幼苗在实验室筛选条件下的粘虫试验
Figure BDA0002599881850000341
实施例4.实验室条件下水稻二化螟(Chilo suppressalis)交叉验证亚洲玉米螟 抗性株系
水稻二化螟(RSB，Chilo suppressalis)属于鳞翅目螟蛾科，是非常重要的水稻害虫，寄生于幼苗到成熟期的植物中。虽然广泛分布在世界各地，水稻二化螟在亚洲、中东和地中海地区特别具有危害性。
水稻二化螟的虫卵购自中国农科院植物保护研究所养虫室，在27℃培养箱中孵化，初孵幼虫作为交叉验证试验的试虫。
ATL幼苗培养于温室中，温室中设置比例为1:1的钠灯和金属卤化物灯作为光源，光照/黑暗时间为16h/8h，光源设置在苗床上部大约1.5m处，晴天时，高于苗床30cm处的光强度为10,000～20,000lx，阴天时为6,000～10,000lx；温室相对湿度为30％～90％，温度为20～35℃。改良的IRRI营养液培养40天后的分蘖幼苗用于本试验中。
筛选方法：
40日龄的每个ATL或者ZH11-TC植株取两株，将主茎剪成7-8cm长的2段，插入带有琼脂的100mL三角瓶中，然后用毛笔将10头二化螟初孵幼虫接到茎顶端，盖好封口膜。放入27.5℃，相对湿度70％的培养箱中培养。ZH11-TC的主茎用作对照，本试验设置六次重复。
二化螟接种7天后，调查死亡率和幼虫生长抑制率。死亡率指死亡幼虫数除以接种总虫数的百分比，幼虫生长抑制率是指死亡虫数、一龄虫数和二龄虫数的总和除以接种的总虫数的百分比。
采用卡方分析原始数据，当P<0.01时，测试的株系被认为是二化螟抗性阳性株系。
筛选结果：
1)AH43610主茎
如表7所示，取食AH43610主茎的30头二化螟幼虫中，14头死亡，5头幼虫发育至一龄期，6头幼虫发育至二龄期，而取食ZH11-TC主茎的幼虫中，6头死亡，15头发育到二龄期，3头发育到一龄期。AH43610主茎导致的幼虫死亡率和幼虫生长抑制率分别为46.67％和83.33％；ZH11-TC对照主茎导致的幼虫死亡率和幼虫生长抑制率分别为15％和60％。上述结果清楚的表明AH43610能够显著抑制二化螟幼虫的生长发育。
2)AH35009主茎
取食AH35009主茎的二化螟幼虫中，49头死亡，6头发育到一龄期，5头发育到二龄期；而取食对照ZH11-TC主茎的幼虫中，8头死亡，5头发育到二龄期。AH35009主茎导致的幼虫死亡率和幼虫生长发育抑制率高于ZH11-TC主茎导致的幼虫死亡率和幼虫生长抑制率，表明AH35009幼苗能够抑制二化螟幼虫的生长。
3)AH30161主茎
取食AH30161主茎的二化螟幼虫中，16头死亡，11头发育到一龄期，14头发育到二龄期；而取食对照ZH11-TC主茎的幼虫中，8头死亡，5头发育到二龄期。AH30161主茎导致的幼虫死亡率和幼虫生长发育抑制率高于ZH11-TC主茎导致的幼虫死亡率和幼虫生长抑制率，表明AH30161幼苗能够抑制二化螟幼虫的生长。
表7.AH43610、AH35009和AH30161幼苗在实验室筛选条件下的二化螟试验
Figure BDA0002599881850000351
AH43610、AH35009和AH30161幼苗能够显著抑制亚洲玉米螟、粘虫和水稻二化螟的生长发育，表明这三个株系幼苗具有潜在的广谱的杀昆虫活性。
根据上述结果，分离了能够提高AH43610、AH35009和AH30161株系抗虫性基因。
实施例5.激活标签基因的鉴定
抗虫株系中AH43610、AH35009和AH30161中T-DNA插入位点的侧翼基因被鉴定。
采用CTAB法(Murray,M.G.and W.F.Thompson.(1980)Nucleic Acids Res.8:4321-4326)提取AH43610、AH35009和AH30161株系中叶片组织的基因组DNA，通过分子技术获得T-DNA插入位点的侧翼序列。
T-DNA插入到AH35009水稻植株1号染色体上(MSU7.0http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)，AH35009水稻植株中T-DNA插入位点的RB和LB端侧翼核苷酸序列如SEQ ID NO:1和2所示。
T-DNA插入到AH30161水稻植株9号染色体上(MSU7.0http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)，AH30161水稻植株中T-DNA插入位点LB端侧翼核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
临近插入位点的基因被克隆出来，并验证其是否具有抗虫性功能或其它性状改良。
实施例6.抗虫基因的克隆和过表达构建体的构建
根据基因ID LOC_Os03g16910.1、LOC_Os01g53730.1和LOC_Os09g10010.1的序列信息，设计引物，并克隆水稻抗虫基因。表8展示了引物序列和期望的基因扩增长度。
以中花11号水稻叶、茎和根混合的cDNA库为模板，采用常规方法克隆OsSLT1、OsDN-ITP6和OsDN-ITP7的cDNA。
表8.克隆抗虫基因的引物
Figure BDA0002599881850000352
Figure BDA0002599881850000361
PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳分离后采用柱式试剂盒回收，并与TA克隆载体连接。通过测序确定PCR产物的核酸序列和在构建体中的方向，然后将基因克隆到植物双元载体DP0158(pCAMBIA1300-DsRed，公开号:WO 2016/000237)中。DP1672载体中克隆的核苷酸序列和OsSLT1的编码序列如SEQ ID NO：4和5所示，OsSLT1的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；DP1759载体中克隆的核苷酸序列和OsDN-ITP6的编码序列如SEQ ID NO：7和8所示，OsDN-ITP6的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；DP1791载体中克隆的核苷酸序列和OsDN-ITP7的编码序列如SEQ ID NO：10和11所示，OsDN-ITP7的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示。
实施例7.转化获得转基因水稻株系
过表达载体和空载体(DP0158)采用林拥军和张启发((2005)Plant Cell Rep.23:540-547)描述的农杆菌介导的方法转化入中花11号水稻(Oryza sativa L.)。转化实验室获得的T0代转基因幼苗移栽至田间水田中获得T1种子，T1和T2代种子储藏在4℃冷库中。过表达载体含有DsRED和HYG基因，T1和T2代种子在绿色荧光灯下发红色荧光的为转基因种子，并用于下列抗虫试验。
转基因水稻植株中基因表达分析：
采用标准的实时RT-PCR程序分析转基因水稻植株中基因的表达水平。EF1α基因用作内参显示转基因水稻和对照植物的扩增和上样量类似。EF1αmRNA水平用于规范基因表达量。
采用实时PCR分析不同DP1672转基因水稻株系叶片中OsSLT1基因相对表达量水平，ZH11-TC水稻中的表达量水平设置为1.00，与ZH11-TC相比，OsSLT1在转基因株系中表达量范围约是ZH11-TC的1.21-7.63倍。实时RT-PCR中，OsSLT1基因在过表达转基因水稻中的引物如下：
DP1672-F1：5'-CGGACCTTCAAGTTAGTCGATC-3'(SEQ ID NO:19)
DP1672-R1：5'-CCGAGTAGGGAGTGGAATTTC-3'(SEQ ID NO:20)
采用实时PCR分析测定不同DP1759水稻株系叶片中OsDN-ITP6基因的相对表达水平，ZH11-TC水稻中的表达量水平设置为1.00，与ZH11-TC相比，OsDN-ITP6基因的表达水平在2.38-15.71倍之间浮动，OsDN-ITP6在几乎所有测试的转基因水稻株系中过量表达，实时PCR测定的引物如下面所示：
DP1759-F1：5'-CTATGTAGCACTGGATGGGAAC-3'(SEQ ID NO:21)
DP1759-R1：5'-GCTTTTGGTGTTATTCCTGGC-3'(SEQ ID NO:22)
采用实时PCR分析测定不同DP1791水稻株系叶片中OsDN-ITP7基因的相对表达水平，将ZH11-TC中OsDN-ITP7的表达量设置为1.00，与ZH11-TC相比，转基因水稻株系中OsDN-ITP7基因的表达水平在95-591倍之间浮动，OsDN-ITP7基因在几乎所有测试的转基因水稻株系中过量表达。
DP1791-F1：5'-TGCTATTTCAGACTTAGGCCG-3'(SEQ ID NO:23)
DP1791-R1：5'-AAGGCAGCAGTTCTCATCG-3'(SEQ ID NO:24)
实施例8.OsSLT1转基因水稻植株在实验室条件下的亚洲玉米螟试验
为了调查OsSLT1转基因水稻能否重现AH43610的T-DNA插入突变体的抗虫性状，OsSLT1转基因水稻首先用于亚洲玉米螟试验。玉米螟的饲养方法如实施例2所述。
过表达载体转化产生的T2代植株用于该试验，进行三次试验，每次4到6个重复，ZH11-TC和DP0158幼苗用作对照。本试验验证约10个转基因株系，每个株系取450粒种子，参照实施例2水培养10天。重现试验采用随机区组设计，每个株系的幼苗插入32-孔板的两个孔中，ZH11-TC和DP0158幼苗插入同一板的六个不同孔中。
玉米螟抗性试验的一个指标为幼虫生长抑制率,指幼虫的抑制数除以幼虫统计数的百分比，其中幼虫抑制数指测试孔中抗性值的总和，幼虫统计数指所观测到的幼虫数和一龄期幼虫的总和。
本试验采用随机区组设计，同一构建体的10个转基因株系在一个试验单元中进行验证，通过SAS PROCGLIMMIX考虑载体、转基因株系和环境效应评价基因功能。如果转基因水稻植株的幼虫生长抑制率在载体水平和转基因株系水平显著高于对照(P＜0.05)，则该基因被认为具有亚洲玉米螟抗性功能。
亚洲玉米螟筛选结果：
1)第一次验证试验的结果
亚洲玉米螟初孵幼虫接种水稻幼苗5天后，ZH11-TC和DP0158水稻幼苗明显受玉米螟为害，而OsSLT1转基因幼苗受损较轻，与取食ZH11-TC和DP0158对照幼苗的幼虫相比，取食OsSLT1转基因株系幼苗的幼虫相对较小。
10个OsSLT1转基因株系放置在一个板上，同时进行五次重复。OsSLT1转基因水稻幼苗共接种了600头玉米螟初孵幼虫，共培养5天后，观测到333头幼虫，其中38头发育到一龄期，111头发育到二龄期；ZH11-TC幼苗的孔中，8头发育到一龄期，23头发育到二龄期；DP0158幼苗获得类似的结果，9头发育到一龄期，17头幼虫处于二龄期。OsSLT1转基因水稻、ZH11-TC对照和DP0158对照的平均幼虫生长抑制率分别为50％、28％和24％。OsSLT1转基因水稻的幼虫生长抑制率显著高于ZH11-TC对照和DP0158对照。这些结果表明过量表达OsSLT1可以显著提高转基因水稻在载体水平的玉米螟抗性。
转基因株系水平进一步的分析结果展示在表9中。8个转基因株系的幼虫生长抑制率显著高于ZH11-TC和DP0158对照。这些结果进一步表明，与对照相比，OsSLT1基因在转基因株系水平上提高水稻玉米螟抗性中起作用。
表9.OsSLT1转基因水稻在实验室条件下亚洲玉米螟试验(转基因株系水平，第一次试验)
Figure BDA0002599881850000371
2)第二次验证试验的结果
同样的10个OsSLT1转基因株系用于第二次验证试验中，并设置5个重复。初孵幼虫接种后，共培养5天，OsSLT1转基因水稻的孔中，共观测到389头幼虫，其中22头处于一龄期，94头处于二龄期；ZH11-TC水稻幼苗孔中，共观测到144头幼虫，其中只有6头发育到一龄期，17头发育到二龄期；DP0158幼苗孔中，3头处于一龄期，22头幼虫处于二龄期。OsSLT1转基因水稻、ZH11-TC和DP0158的平均幼虫生长抑制率分别为34％、19％和18％，OsSLT1转基因水稻幼虫生长抑制率显著高于ZH11-TC和DP0158对照，这些结果表明在水稻中过量表达OsSLT1能够提高转基因水稻在载体水平的玉米螟抗性。
转基因株系水平的分析结果展示在表10中，8个转基因株系的幼虫生长抑制率高于ZH11-TC和DP0158幼苗对照，且其中4个转基因株系的幼虫生长抑制率显著高于ZH11-TC和DP0158对照。本次试验的结果与第一次验证试验的结果趋势相同。这些结果进一步表明与对照相比，OsSLT1在提高水稻玉米螟抗性中起作用。
表10.OsSLT1转基因水稻在实验室条件下亚洲玉米螟试验(转基因株系水平，第二次试验)
Figure BDA0002599881850000381
3)第三次验证试验的结果
第三次验证试验设置五个重复，初孵幼虫接种后，共培养5天，OsSLT1转基因水稻的孔中，共观测到287头幼虫，其中32头处于一龄期，106头处于二龄期；ZH11-TC水稻孔中，12头幼虫发育到一龄期，45头发育到二龄期；DP0158幼苗孔中，14头幼虫发育到一龄期，39头发育到二龄期。OsSLT1转基因水稻、ZH11-TC和DP0158的平均幼虫生长抑制率分别为53％、41％和45％，OsSLT1转基因水稻幼虫生长抑制率显著高于ZH11-TC对照，这些结果表明在水稻中过量表达OsSLT1能够提高转基因水稻在载体水平的玉米螟抗性。
转基因株系水平的分析结果展示在表11中，8个转基因株系的幼虫生长抑制率高于ZH11-TC和DP0158幼苗对照,且其中3个转基因株系的幼虫生长抑制率显著高于ZH11-TC和DP0158对照。这些结果一致的表明与对照相比，OsSLT1在提高水稻玉米螟抗性中起作用。
表11.OsSLT1转基因水稻在实验室条件下亚洲玉米螟试验(转基因株系水平，第三次试验)
Figure BDA0002599881850000391
实施例9.OsSLT1转基因水稻植株在实验室条件下粘虫试验
OsSLT1转基因水稻的粘虫试验参照实施例3的描述进行。幼虫生长抑制率作为粘虫抗性试验的一个参数，指幼虫抑制数除以幼虫统计数的百分比，其中幼虫抑制数指十到十二个孔中所观测到的抗性值的总和，幼虫统计数指所观测到的所有幼虫和一龄期幼虫数的总和。
粘虫筛选结果：
用于亚洲玉米螟试验的10个转基因株系用于粘虫试验，这10个株系放置在一个32-孔板中，同时进行五次重复。接种粘虫并共培养5天后，取食OsSLT1转基因水稻的445头幼虫中，6头发育到一龄期，118头发育到二龄期；取食ZH11-TC的215头幼虫中，5头发育到一龄期，37头发育到二龄期；取食DP0158幼苗的218头幼虫中，1头发育到一龄期，35头发育到二龄期，OsSLT1转基因水稻、ZH11-TC幼苗和DP0158幼苗的粘虫幼虫生长抑制率分别为29％、21％和17％。OsSLT1转基因水稻的粘虫生长抑制率高于ZH11-TC对照，并显著高于DP0158对照。
转基因株系水平的分析如表12所示，6个转基因株系的幼虫生长抑制率高于ZH11-TC和DP0158对照，4个株系的粘虫生长抑制率显著高于ZH11-TC和DP0158对照，这些结果表明OsSLT1转基因水稻在幼苗时期提高了粘虫抗性。
表12.OsSLT1转基因水稻在实验室条件下粘虫试验(转基因株系水平)
Figure BDA0002599881850000392
Figure BDA0002599881850000401
实施例10.OsDN-ITP6转基因水稻植株在实验室条件下的亚洲玉米螟试验
为了调查OsDN-ITP6转基因水稻能否重现AH35009的T-DNA插入株系的抗虫性状，OsDN-ITP6转基因水稻用于亚洲玉米螟的抗虫试验中，试验方法如实施例8中描述。
亚洲玉米螟验证结果：
1)第一次验证试验的结果
亚洲玉米螟初孵幼虫接种水稻幼苗5天后，ZH11-TC和DP0158水稻幼苗明显受玉米螟为害，而OsDN-ITP6转基因幼苗受损较轻，与取食ZH11-TC和DP0158对照幼苗的幼虫相比，取食OsDN-ITP6转基因株系幼苗的幼虫相对较小。
7个OsDN-ITP6转基因株系放置在一个32-孔板上，同时进行五次重复。OsDN-ITP6转基因水稻幼苗孔中共观测到330头玉米螟初孵幼虫，其中2头处于一龄期，108头处于二龄期；OsDN-ITP6转基因水稻幼苗的平均幼虫生长抑制率为34％。ZH11-TC幼苗的孔中，观测到155头幼虫，其中31头处于二龄期；DP0158幼苗的孔中，观测到的138头幼虫中，21头处于二龄期。ZH11-TC对照和DP0158对照的幼虫生长抑制率分别为20％和15％。OsDN-ITP6转基因水稻的幼虫生长抑制率显著高于ZH11-TC对照和DP0158对照。这些结果表明过量表达OsDN-ITP6可以显著提高转基因水稻在载体水平的玉米螟抗性。
转基因株系水平进一步的分析结果展示在表13中。所有7个转基因水稻植株的幼虫生长抑制率高于ZH11-TC和DP0158对照幼苗，2个株系的幼虫生长抑制率显著高于ZH11-TC对照，5个株系的幼虫生长抑制率显著高于DP0158对照。这些结果表明OsDN-ITP6转基因水稻抑制亚洲玉米螟的幼虫的生长，OsDN-ITP6能够在载体水平和转基因株系水平提高转基因水稻玉米螟抗性。
表13.OsDN-ITP6转基因水稻在实验室条件下亚洲玉米螟试验(转基因株系水平，第一次试验)
Figure BDA0002599881850000402
Figure BDA0002599881850000411
2)第二次验证试验的结果
同样的7个OsDN-ITP6转基因株系放置在一个32-孔板上，设置6个重复。OsDN-ITP6转基因水稻的孔中，共观测到382头幼虫，其中27头幼虫处于一龄期，169头处于二龄期；OsDN-ITP6转基因水稻的平均幼虫生长抑制率为55％。ZH11-TC水稻孔中，4头幼虫发育到一龄期，38头发育到二龄期；DP0158幼苗孔中，2头幼虫发育到一龄期，37头幼虫处于二龄期。ZH11-TC和DP0158幼苗的平均幼虫生长抑制率分别为41％和34％，OsDN-ITP6转基因水稻幼虫生长抑制率显著高于ZH11-TC和DP0158对照，这些结果表明在水稻中过量表达OsDN-ITP6能够提高转基因水稻在载体水平的玉米螟抗性。
转基因株系水平的进一步分析结果展示在表14中，所有7个转基因株系的幼虫生长抑制率显著高于DP0158幼苗对照，和1个转基因株系的幼虫生长抑制率显著高于ZH11-TC对照。这些结果表明OsDN-ITP6转基因水稻抑制亚洲玉米螟的幼虫的生长，OsDN-ITP6能够在载体水平和转基因株系水平提高转基因水稻玉米螟抗性。
表14.OsDN-ITP6转基因水稻在实验室条件下亚洲玉米螟试验(转基因株系水平，第二次试验)
Figure BDA0002599881850000412
3)第三次验证试验的结果
第三次验证试验中，OsDN-ITP6转基因水稻幼苗孔中共观测到384头玉米螟初孵幼虫，其中32头处于一龄期，103头处于二龄期；OsDN-ITP6转基因水稻幼苗的平均幼虫生长抑制率为40％。ZH11-TC幼苗的孔中，观测到169头幼虫，其中11头处于一龄期，41头处于二龄期；DP0158幼苗的孔中，观测到的164头幼虫中，其中5头幼虫处于一龄期，24头处于二龄期。ZH11-TC对照和DP0158对照的幼虫生长抑制率分别为35％和20％。OsDN-ITP6转基因水稻的幼虫生长抑制率高于ZH11-TC对照，并显著高于DP0158对照。这些结果表明过量表达OsDN-ITP6可以显著提高转基因水稻在载体水平的玉米螟抗性。
转基因株系水平进一步的分析结果展示在表15中。5个转基因水稻植株的幼虫生长抑制率高于ZH11-TC和DP0158对照幼苗。这些结果表明OsDN-ITP6转基因水稻抑制亚洲玉米螟的幼虫的生长，OsDN-ITP6在载体水平和转基因株系水平提高转基因水稻玉米螟抗性中起作用。
表15.OsDN-ITP6转基因水稻在实验室条件下亚洲玉米螟试验(转基因株系水平，第三次试验)
Figure BDA0002599881850000421
实施例11.OsDN-ITP6转基因水稻植株在实验室条件下粘虫试验
OsDN-ITP6转基因水稻的粘虫试验参照实施例3的描述进行。筛选结果如下。粘虫 筛选结果：
8个OsDN-ITP6转基因水稻株系用于粘虫试验，这8个株系放置在一个32-孔板中，同时进行六次重复。接种粘虫并共培养5天后，取食OsDN-ITP6转基因水稻的532头幼虫中，2头发育到一龄期，195头发育到二龄期；取食ZH11-TC的203头幼虫中，22头发育到二龄期；取食DP0158幼苗的229头幼虫中，19头发育到二龄期，OsDN-ITP6转基因水稻、ZH11-TC幼苗和DP0158幼苗的粘虫幼虫生长抑制率分别为37％、11％和9％。OsDN-ITP6转基因水稻的粘虫生长抑制率显著高于ZH11-TC对照和DP0158对照。
转基因株系水平的分析如表16所示，8个转基因株系的幼虫生长抑制率显著高于ZH11-TC和DP0158对照，这些结果表明OsDN-ITP6转基因水稻在幼苗时期提高了粘虫抗性。
表16.OsDN-ITP6转基因水稻在实验室条件下粘虫试验(转基因株系水平，第一次试验)
Figure BDA0002599881850000422
Figure BDA0002599881850000431
OsDN-ITP6转基因水稻株系再次进行验证，第二次试验中，接种粘虫并共培养5天后，取食OsDN-ITP6转基因水稻的502头幼虫中，20头发育到一龄期，276头发育到二龄期，OsDN-ITP6转基因水稻的粘虫生长抑制率为61％。取食ZH11-TC的154头幼虫中，1头发育到一龄期，72头发育到二龄期；取食DP0158幼苗的145头幼虫中，3头发育到一龄期，56头发育到二龄期。OsDN-ITP6转基因水稻的粘虫生长抑制率显著高于ZH11-TC对照和DP0158对照。这些结果表明OsDN-ITP6转基因水稻在载体水平上显示出粘虫抗性。
转基因株系水平的分析表明，6个转基因株系的幼虫生长抑制率高于60％，显著高于ZH11-TC和DP0158对照(表17)，这些结果进一步确认过量表达OsDN-ITP6基因提高转基因水稻的粘虫抗性，OsDN-ITP6在提高植物粘虫抗性中发挥作用。
表17.OsDN-ITP6转基因水稻在实验室条件下粘虫试验(转基因株系水平，第二次试验)
Figure BDA0002599881850000432
实施例12.OsDN-ITP7转基因水稻植株在实验室条件下的亚洲玉米螟试验
为了调查OsDN-ITP7转基因水稻能否重现AH30161的T-DNA插入株系的抗虫性状，OsDN-ITP7转基因水稻用于亚洲玉米螟的抗虫试验中，试验方法如实施例8中描述。
亚洲玉米螟验证结果：
1)第一次验证试验的结果
亚洲玉米螟初孵幼虫接种水稻幼苗5天后，ZH11-TC和DP0158水稻幼苗明显受玉米螟为害，而OsDN-ITP7转基因幼苗受损较轻，与取食ZH11-TC和DP0158对照幼苗的幼虫相比，取食OsDN-ITP7转基因株系幼苗的幼虫相对较小。
10个OsDN-ITP7转基因株系放置在一个32-孔板上，同时进行五次重复。初孵幼虫共培养5天后，OsDN-ITP7转基因水稻幼苗孔中共观测到325头玉米螟初孵幼虫，其中57头处于一龄期，120头处于二龄期；ZH11-TC幼苗的孔中，48头发育到二龄期；DP0158幼苗得到类似的结果，48头发育到二龄期。OsDN-ITP7转基因水稻幼苗、ZH11-TC对照和DP0158对照的平均幼虫生长抑制率分别为61％、50％和47％。OsDN-ITP7转基因水稻的幼虫生长抑制率显著高于ZH11-TC对照和DP0158对照。这些结果表明过量表达OsDN-ITP7可以显著提高转基因水稻在载体水平的玉米螟抗性。
转基因株系水平进一步的分析结果展示在表18中。所有测试的转基因株系的幼虫生长抑制率高于ZH11-TC和DP0158对照幼苗，3个株系的幼虫生长抑制率显著高于ZH11-TC和DP0158对照。这些结果进一步表明，与对照相比，OsDN-ITP7在提高水稻玉米螟抗性中发挥作用。
表18.OsDN-ITP7转基因水稻在实验室条件下亚洲玉米螟试验(转基因株系水平，第一次试验)
Figure BDA0002599881850000441
2)第二次验证试验的结果
同样的10个OsDN-ITP7转基因株系进行第二次试验，同时进行六次重复。初孵幼虫共培养5天后，OsDN-ITP7转基因水稻幼苗孔中共观测到556头玉米螟初孵幼虫，其中38头处于一龄期，205头处于二龄期；ZH11-TC幼苗的孔中，共观测到182头幼虫，其中5头发育到一龄期，43头发育到二龄期；DP0158幼苗孔中，共观测到162头幼虫，其中8头发育到一龄期，45头发育到二龄期。OsDN-ITP7转基因水稻幼苗、ZH11-TC对照和DP0158对照的平均幼虫生长抑制率分别为47％、28％和36％。OsDN-ITP7转基因水稻的幼虫生长抑制率显著高于ZH11-TC对照和DP0158对照。这些结果表明过量表达OsDN-ITP7可以显著提高转基因水稻在载体水平的玉米螟抗性。
转基因株系水平进一步的分析结果展示在表19中。8个转基因株系的幼虫生长抑制率显著高于ZH11-TC对照幼苗，3个株系的幼虫生长抑制率显著高于DP0158对照。这些结果与第一次验证的结果类似，进一步表明，与对照相比，OsDN-ITP7在提高水稻玉米螟抗性中发挥作用。
表19.OsDN-ITP7转基因水稻在实验室条件下亚洲玉米螟试验(转基因株系水平，第二次试验)
Figure BDA0002599881850000451
实施例13.OsDN-ITP7转基因水稻植株在实验室条件下粘虫试验
OsDN-ITP7转基因水稻的粘虫试验参照实施例3的描述进行。筛选结果如下。
粘虫筛选结果：
10个OsDN-ITP7转基因水稻株系用于粘虫试验，这10个株系放置在一个32-孔板中，同时进行五次重复。接种粘虫并培养5天后，取食OsDN-ITP7转基因水稻的517头幼虫中，30头发育到一龄期，161头发育到二龄期；而取食ZH11-TC的112头幼虫中，5头发育到一龄期，24头发育到二龄期；取食DP0158幼苗的121头幼虫中，1头发育到一龄期，28头发育到二龄期，OsDN-ITP7转基因水稻、ZH11-TC幼苗和DP0158幼苗的粘虫幼虫生长抑制率分别为40％、29％和25％。OsDN-ITP7转基因水稻的粘虫生长抑制率显著高于ZH11-TC对照和DP0158对照。
转基因株系水平的分析如表20所示，9个转基因株系的幼虫生长抑制率高于ZH11-TC和DP0158对照，且3个株系的幼虫生长抑制率显著高于ZH11-TC和DP0158对照，这些结果表明OsDN-ITP7转基因水稻在幼苗时期提高了粘虫抗性。
表20.OsDN-ITP7转基因水稻在实验室条件下粘虫试验(转基因株系水平，第一次试验)
Figure BDA0002599881850000461
第二次试验中，接种粘虫并共培养5天后，取食OsDN-ITP7转基因水稻的573头幼虫中，14头发育到一龄期，249头发育到二龄期；OsDN-ITP7转基因水稻的粘虫幼虫生长抑制率47％。而取食ZH11-TC幼苗的148头幼虫中，2头发育到一龄期，53头发育到二龄期；取食DP0158幼苗的136头幼虫中，2头发育到一龄期，56头发育到二龄期。OsDN-ITP7转基因水稻的粘虫生长抑制率显著高于ZH11-TC对照，这些结果表明OsDN-ITP7转基因水稻在载体水平显示了粘虫抗性。
转基因株系水平的分析表明，7个转基因株系的幼虫生长抑制率高于ZH11-TC和DP0158对照(表20)，这些结果进一步表明，过量表达OsDN-ITP7提高转基因水稻植株的粘虫抗性，OsDN-ITP7基因在提高植物粘虫抗性中发挥作用。
表21.OsDN-ITP7转基因水稻在实验室条件下粘虫试验(转基因株系水平，第二次试验)
Figure BDA0002599881850000462
Figure BDA0002599881850000471
序列表
<110> 未名生物农业集团有限公司
先锋海外公司
<120> 抗虫性能增强的植物和涉及害虫抗性基因的构建体和方法
<130> RTS22593K
<150> 201810067456.8
<151> 2018-01-24
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 496
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 1
ttctctggcg tggtcggctg gttcagctag ccggtcagat gcatggagcg gatagagtcg 60
atttctcttg tacgagtaga tcacggaagg aatgatgata tttttcgtac ataggcctag 120
agaattttta gggcgtttcg tagtggatgg gtcaatgtat ggagcactgt gttttaataa 180
gacgggaaag ctggaatcca agtagaaact cctggagaca ccgccgcgcc ggggggacaa 240
gcatcgtgat cggtaggaag gcgatgagcg ggagaacaac gatacttgct taggtcgagt 300
acgttagatc ttccgcgttc ttttcggcaa ttcggcccac tgaacacggc tggtcttgcg 360
gcccacagta gcggttggca atgtcagttt attgacttcc tgagctcaag ctacgcctct 420
ctgaccatgg aatcgttttt ttttttcttt ctcgaaacaa aaatacaaac ataaagctcg 480
tgtacatact tcccat 496
<210> 2
<211> 517
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 2
ctaatagaaa tataagtgca aaacagagaa ttgcaaaata taggaaaaat acaaaaatga 60
tcatttgatt ggactccagg aaatacatag gaatcggacg agcaagatag actcaaaggg 120
atatttccaa gaggttgtag ctcttactaa atttcctcca aaatctttat aggattgttc 180
attccatagg aatttcaaaa gataacatat aattcaatct tttgtttcaa aggttttcat 240
atgaaatttt actataggat tgaaattatc caaaatttat atgatcttcc tccaaatcaa 300
aggggccctt ataaaagtga ggtctttttt ttaagatgca gattgtactt tattttcgtt 360
agtatgtttt cctaatctga aaaacgatat gttttgtgtg aaaaccttat ataaaaagtt 420
gctctaaaat atcaaataaa tctattttta aatttataat aattaaaact taattaatca 480
tgcgttaata ttttttttat tttacgtgcc cttgctt 517
<210> 3
<211> 753
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 3
ctttatgtcg aagatctcat tcaccttttt gtacacatga agattggtga caactttttt 60
gccttcaata attacattga aacttcgatt tggtattggg tggaaatctg catcatcttg 120
atttgattta gttgtaattg cctattttta tcttagaaat atcaatagta tatcggtttg 180
ttattggcaa tgtcattttg gaattggcta ttactacatt ttatctcatt tagttatgtg 240
ctgttgagta attaccctat gaattttata cagatacatt gccgtgggaa atgagccgtt 300
cttgacgagc taccagggtc aattccagtc atatgttatt ccagcaatga caaacattca 360
gcaatcgctg gtgaaggcta atcttgctag ctatgtgaag cttgttgtcc catgcaatgc 420
tgatgcttat cagagtgctt ctctcccatc acaaggagtt tttaggactg aactgactca 480
gataatgacc cagctcgccg cttttctcag ttctagtgga gcgccatttg tggtcaatat 540
ataccctttt ctcagtcttt atcagagctc tgactttcca caagattatg ccttcttcga 600
gggatctact cacccggttg tagatggtcc taacacatac tacaatgctt ttgatggcaa 660
ctttgacaca ttagttgctg cgctgggtaa aattggatat ggacagctac cgattgcaat 720
tggtgaagtt ggctggccaa ctgaaggagc acc 753
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<211> 1806
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 4
gtggagagat ttggaggaga ggagcgcgcg gtgaggaggc ggtggaggcg gaagcggcga 60
cgagttggcg agaagcgcag cagcgacgga cgacgagcaa ccggcgggcg acgagggcag 120
gaagagggct gctcctcccc ctccgcctcc gccgccggcc gacgccgtca tgggggagtc 180
gctgctcacc gcgctctcca tggacaccac cacggcccac cacccgcacc agggcccctc 240
cacgttcctc tccatggaca ccgcctccca cgacgacttc gacctcttcc tcccgccgcc 300
gccggggccg ttccgccgct gcctccatgc cgcggccgcc gccccccctg acatcaacct 360
ccccctcgac gccgacccct cccctccgcc tccggctctg cagtccggcg ccctccacga 420
ccccaacgtc gacatgcttg atgtcggcct cggcggcccg cagctttacg actcggactc 480
acctgctgcc accaccggcg tgtcccctgc cccggccgcc gcgaccacca cggtcgccgt 540
atcacatgcc aagggctcca attccagcgc tgcccgcaag tgcgtgaaga ggaacgatac 600
catatggggc gcgtggttct tcttcaccca ctacttcaag ccggtcatgt cggctgacaa 660
gaacggcaag gcgaaggccc ccaccgccgg tgggaacggt aataatgcta cgctggatgc 720
tttcctagtg cagcacgaca tggagaacat gtacatgtgg gtgttcaagg agcggccaga 780
gaatgccctg gggaagatgc agctaaggag cttcatgaac gggcactcgc gccttgggga 840
gcctcagttc ccgttcagcg cggagaaagg gttcgtgcgc tcacaccgca tgcagcgcaa 900
gcactaccgg gggctgtcca acccgcagtg cctgcacggg atcgagatcg tccgggcacc 960
aaacttggct ggtgtgcccg aagctgattt gaagaggtgg acagagctca ccggaaggga 1020
cgctaacttc tcgattgatg ctgaggcgag tgattatgag tcatggagaa atcttcctag 1080
cacagatttt gagcttgaga ggccagcaac tactgctgcc acgaagacta gctcacatgg 1140
ccatcacaag aagttgctca acggttctgg ccttaacctg tcaacacagc catcgaatca 1200
cagctctggg gatggtctgg acatcccaaa tatttgcaac aagcgccgga aggattcctc 1260
ccccacagcg atggaagaag attgcagcaa ttcaaattca gacaaggtcc aggacatgga 1320
agtgagccac acgttcgagc cgtcatggat gaatgacttc actggtgtga tgcgccatgc 1380
ttctggtcca gtgactgcag caaaaacaat ctatgaagat agcaaggggt acttgatcat 1440
cattagccta ccgtttgctg atatacaaag ggtgaaggtt tcatggaaga atactcttac 1500
aaatgggata gttaaggtat catgcactag tgttggccgg atgccattct tgaagagaca 1560
tgaccggacc ttcaagttag tcgatcctac acctgagcat tgtccaccag gagagtttat 1620
tcgggaaatt ccactcccta ctcggatccc ggaagatgct actttagaag catactgtga 1680
tgaatcagga acaggcctag agattattgt tccaaaatac cgtgttggtc ctgaagaaca 1740
tgaagttcat gtgtccatga ggcccccctc gtcatggtgc cagtcttaac atgttcaagg 1800
tgtgtg 1806
<210> 5
<211> 1620
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 5
atgggggagt cgctgctcac cgcgctctcc atggacacca ccacggccca ccacccgcac 60
cagggcccct ccacgttcct ctccatggac accgcctccc acgacgactt cgacctcttc 120
ctcccgccgc cgccggggcc gttccgccgc tgcctccatg ccgcggccgc cgccccccct 180
gacatcaacc tccccctcga cgccgacccc tcccctccgc ctccggctct gcagtccggc 240
gccctccacg accccaacgt cgacatgctt gatgtcggcc tcggcggccc gcagctttac 300
gactcggact cacctgctgc caccaccggc gtgtcccctg ccccggccgc cgcgaccacc 360
acggtcgccg tatcacatgc caagggctcc aattccagcg ctgcccgcaa gtgcgtgaag 420
aggaacgata ccatatgggg cgcgtggttc ttcttcaccc actacttcaa gccggtcatg 480
tcggctgaca agaacggcaa ggcgaaggcc cccaccgccg gtgggaacgg taataatgct 540
acgctggatg ctttcctagt gcagcacgac atggagaaca tgtacatgtg ggtgttcaag 600
gagcggccag agaatgccct ggggaagatg cagctaagga gcttcatgaa cgggcactcg 660
cgccttgggg agcctcagtt cccgttcagc gcggagaaag ggttcgtgcg ctcacaccgc 720
atgcagcgca agcactaccg ggggctgtcc aacccgcagt gcctgcacgg gatcgagatc 780
gtccgggcac caaacttggc tggtgtgccc gaagctgatt tgaagaggtg gacagagctc 840
accggaaggg acgctaactt ctcgattgat gctgaggcga gtgattatga gtcatggaga 900
aatcttccta gcacagattt tgagcttgag aggccagcaa ctactgctgc cacgaagact 960
agctcacatg gccatcacaa gaagttgctc aacggttctg gccttaacct gtcaacacag 1020
ccatcgaatc acagctctgg ggatggtctg gacatcccaa atatttgcaa caagcgccgg 1080
aaggattcct cccccacagc gatggaagaa gattgcagca attcaaattc agacaaggtc 1140
caggacatgg aagtgagcca cacgttcgag ccgtcatgga tgaatgactt cactggtgtg 1200
atgcgccatg cttctggtcc agtgactgca gcaaaaacaa tctatgaaga tagcaagggg 1260
tacttgatca tcattagcct accgtttgct gatatacaaa gggtgaaggt ttcatggaag 1320
aatactctta caaatgggat agttaaggta tcatgcacta gtgttggccg gatgccattc 1380
ttgaagagac atgaccggac cttcaagtta gtcgatccta cacctgagca ttgtccacca 1440
ggagagttta ttcgggaaat tccactccct actcggatcc cggaagatgc tactttagaa 1500
gcatactgtg atgaatcagg aacaggccta gagattattg ttccaaaata ccgtgttggt 1560
cctgaagaac atgaagttca tgtgtccatg aggcccccct cgtcatggtg ccagtcttaa 1620
<210> 6
<211> 539
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 6
Met Gly Glu Ser Leu Leu Thr Ala Leu Ser Met Asp Thr Thr Thr Ala
1 5 10 15
His His Pro His Gln Gly Pro Ser Thr Phe Leu Ser Met Asp Thr Ala
20 25 30
Ser His Asp Asp Phe Asp Leu Phe Leu Pro Pro Pro Pro Gly Pro Phe
35 40 45
Arg Arg Cys Leu His Ala Ala Ala Ala Ala Pro Pro Asp Ile Asn Leu
50 55 60
Pro Leu Asp Ala Asp Pro Ser Pro Pro Pro Pro Ala Leu Gln Ser Gly
65 70 75 80
Ala Leu His Asp Pro Asn Val Asp Met Leu Asp Val Gly Leu Gly Gly
85 90 95
Pro Gln Leu Tyr Asp Ser Asp Ser Pro Ala Ala Thr Thr Gly Val Ser
100 105 110
Pro Ala Pro Ala Ala Ala Thr Thr Thr Val Ala Val Ser His Ala Lys
115 120 125
Gly Ser Asn Ser Ser Ala Ala Arg Lys Cys Val Lys Arg Asn Asp Thr
130 135 140
Ile Trp Gly Ala Trp Phe Phe Phe Thr His Tyr Phe Lys Pro Val Met
145 150 155 160
Ser Ala Asp Lys Asn Gly Lys Ala Lys Ala Pro Thr Ala Gly Gly Asn
165 170 175
Gly Asn Asn Ala Thr Leu Asp Ala Phe Leu Val Gln His Asp Met Glu
180 185 190
Asn Met Tyr Met Trp Val Phe Lys Glu Arg Pro Glu Asn Ala Leu Gly
195 200 205
Lys Met Gln Leu Arg Ser Phe Met Asn Gly His Ser Arg Leu Gly Glu
210 215 220
Pro Gln Phe Pro Phe Ser Ala Glu Lys Gly Phe Val Arg Ser His Arg
225 230 235 240
Met Gln Arg Lys His Tyr Arg Gly Leu Ser Asn Pro Gln Cys Leu His
245 250 255
Gly Ile Glu Ile Val Arg Ala Pro Asn Leu Ala Gly Val Pro Glu Ala
260 265 270
Asp Leu Lys Arg Trp Thr Glu Leu Thr Gly Arg Asp Ala Asn Phe Ser
275 280 285
Ile Asp Ala Glu Ala Ser Asp Tyr Glu Ser Trp Arg Asn Leu Pro Ser
290 295 300
Thr Asp Phe Glu Leu Glu Arg Pro Ala Thr Thr Ala Ala Thr Lys Thr
305 310 315 320
Ser Ser His Gly His His Lys Lys Leu Leu Asn Gly Ser Gly Leu Asn
325 330 335
Leu Ser Thr Gln Pro Ser Asn His Ser Ser Gly Asp Gly Leu Asp Ile
340 345 350
Pro Asn Ile Cys Asn Lys Arg Arg Lys Asp Ser Ser Pro Thr Ala Met
355 360 365
Glu Glu Asp Cys Ser Asn Ser Asn Ser Asp Lys Val Gln Asp Met Glu
370 375 380
Val Ser His Thr Phe Glu Pro Ser Trp Met Asn Asp Phe Thr Gly Val
385 390 395 400
Met Arg His Ala Ser Gly Pro Val Thr Ala Ala Lys Thr Ile Tyr Glu
405 410 415
Asp Ser Lys Gly Tyr Leu Ile Ile Ile Ser Leu Pro Phe Ala Asp Ile
420 425 430
Gln Arg Val Lys Val Ser Trp Lys Asn Thr Leu Thr Asn Gly Ile Val
435 440 445
Lys Val Ser Cys Thr Ser Val Gly Arg Met Pro Phe Leu Lys Arg His
450 455 460
Asp Arg Thr Phe Lys Leu Val Asp Pro Thr Pro Glu His Cys Pro Pro
465 470 475 480
Gly Glu Phe Ile Arg Glu Ile Pro Leu Pro Thr Arg Ile Pro Glu Asp
485 490 495
Ala Thr Leu Glu Ala Tyr Cys Asp Glu Ser Gly Thr Gly Leu Glu Ile
500 505 510
Ile Val Pro Lys Tyr Arg Val Gly Pro Glu Glu His Glu Val His Val
515 520 525
Ser Met Arg Pro Pro Ser Ser Trp Cys Gln Ser
530 535
<210> 7
<211> 600
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 7
atacacaaag cgtacctgtt ctttcggtgt ctttgttcca gaagccagaa aaactgcgag 60
catgggcaaa ttcggtggag ctgcggtcct tccagtatac cgtgaagaag aagatgaaga 120
cttgttcgag acatcatcgt ccatctcagg cgactccgat gatgaggctc aattttcaga 180
cagcgaggaa gctgaagctc aagaagacca gtttgcgcag cagccagcga gaaggatgaa 240
ttcagatagc ctctacgatc tgtcatctat gaaggcacaa ctccctgtca agaaaggatt 300
atccaaatac tacgacggaa agtctcaatc ttttgcatgt atgtctgagg tgagatgcct 360
agaggatcta cgcaagaagg agaatccata caagaagatc aaatcatcca agagctatgt 420
agcactggat gggaaccagg aagcttgtca tatacctggc gcaaacagca catcaatagc 480
caagaagtct ggaagttctt gcgcaaatct gatggccagg aataacacca aaagcatgct 540
ctataggcct cccccaattc ctgtaaacaa aagcggatat catcagtagg aacagtatcg 600
<210> 8
<211> 528
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 8
atgggcaaat tcggtggagc tgcggtcctt ccagtatacc gtgaagaaga agatgaagac 60
ttgttcgaga catcatcgtc catctcaggc gactccgatg atgaggctca attttcagac 120
agcgaggaag ctgaagctca agaagaccag tttgcgcagc agccagcgag aaggatgaat 180
tcagatagcc tctacgatct gtcatctatg aaggcacaac tccctgtcaa gaaaggatta 240
tccaaatact acgacggaaa gtctcaatct tttgcatgta tgtctgaggt gagatgccta 300
gaggatctac gcaagaagga gaatccatac aagaagatca aatcatccaa gagctatgta 360
gcactggatg ggaaccagga agcttgtcat atacctggcg caaacagcac atcaatagcc 420
aagaagtctg gaagttcttg cgcaaatctg atggccagga ataacaccaa aagcatgctc 480
tataggcctc ccccaattcc tgtaaacaaa agcggatatc atcagtag 528
<210> 9
<211> 175
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 9
Met Gly Lys Phe Gly Gly Ala Ala Val Leu Pro Val Tyr Arg Glu Glu
1 5 10 15
Glu Asp Glu Asp Leu Phe Glu Thr Ser Ser Ser Ile Ser Gly Asp Ser
20 25 30
Asp Asp Glu Ala Gln Phe Ser Asp Ser Glu Glu Ala Glu Ala Gln Glu
35 40 45
Asp Gln Phe Ala Gln Gln Pro Ala Arg Arg Met Asn Ser Asp Ser Leu
50 55 60
Tyr Asp Leu Ser Ser Met Lys Ala Gln Leu Pro Val Lys Lys Gly Leu
65 70 75 80
Ser Lys Tyr Tyr Asp Gly Lys Ser Gln Ser Phe Ala Cys Met Ser Glu
85 90 95
Val Arg Cys Leu Glu Asp Leu Arg Lys Lys Glu Asn Pro Tyr Lys Lys
100 105 110
Ile Lys Ser Ser Lys Ser Tyr Val Ala Leu Asp Gly Asn Gln Glu Ala
115 120 125
Cys His Ile Pro Gly Ala Asn Ser Thr Ser Ile Ala Lys Lys Ser Gly
130 135 140
Ser Ser Cys Ala Asn Leu Met Ala Arg Asn Asn Thr Lys Ser Met Leu
145 150 155 160
Tyr Arg Pro Pro Pro Ile Pro Val Asn Lys Ser Gly Tyr His Gln
165 170 175
<210> 10
<211> 244
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 10
tggaagtgga gcaaggttga gttacctgtg agacagtaat gaagaggaac accatccttg 60
ctctcttcat ctgggccatg gctatggtga tcttcgccac ggcaatgccg gccaaggcaa 120
ggatggaggg gatccatcct caaggatgca gatgctgcta tttcagactt aggccgatga 180
tccagtgtgc caaggcttgc tgtggctctg acgatgagaa ctgctgcctt gtgaacaact 240
agtt 244
<210> 11
<211> 204
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 11
atgaagagga acaccatcct tgctctcttc atctgggcca tggctatggt gatcttcgcc 60
acggcaatgc cggccaaggc aaggatggag gggatccatc ctcaaggatg cagatgctgc 120
tatttcagac ttaggccgat gatccagtgt gccaaggctt gctgtggctc tgacgatgag 180
aactgctgcc ttgtgaacaa ctag 204
<210> 12
<211> 67
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 12
Met Lys Arg Asn Thr Ile Leu Ala Leu Phe Ile Trp Ala Met Ala Met
1 5 10 15
Val Ile Phe Ala Thr Ala Met Pro Ala Lys Ala Arg Met Glu Gly Ile
20 25 30
His Pro Gln Gly Cys Arg Cys Cys Tyr Phe Arg Leu Arg Pro Met Ile
35 40 45
Gln Cys Ala Lys Ala Cys Cys Gly Ser Asp Asp Glu Asn Cys Cys Leu
50 55 60
Val Asn Asn
65
<210> 13
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for cloning cDNA of OsSLT1 gene
<400> 13
ctgctgaggg tggagagatt tggaggagag gag 33
<210> 14
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for cloning cDNA of OsSLT1 gene
<400> 14
ccgctgaggc acacaccttg aacatgttaa gactg 35
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for cloning cDNA of OsDN-ITP6 gene
<400> 15
atacacaaag cgtacctgtt ctttcg 26
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for cloning cDNA of OsDN-ITP6 gene
<400> 16
cgatactgtt cctactgatg atatccg 27
<210> 17
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for cloning cDNA of OsDN-ITP7 gene
<400> 17
ctgctgaggt ggaagtggag caaggttgag ttac 34
<210> 18
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for cloning cDNA of OsDN-ITP7 gene
<400> 18
ccgctgagga actagttgtt cacaaggcag cag 33
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for real-time PCR analysis of OsSLT1 gene
<400> 19
cggaccttca agttagtcga tc 22
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for real-time PCR analysis of OsSLT1 gene
<400> 20
ccgagtaggg agtggaattt c 21
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for real-time PCR analysis of OsDN-ITP6 gene
<400> 21
ctatgtagca ctggatggga ac 22
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for real-time PCR analysis of OsDN-ITP6 gene
<400> 22
gcttttggtg ttattcctgg c 21
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for real-time PCR analysis of OsDN-ITP7 gene
<400> 23
tgctatttca gacttaggcc g 21
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for real-time PCR analysis of OsDN-ITP7 gene
<400> 24
aaggcagcag ttctcatcg 19

Claims (20)

1.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸,包含：(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQID NO：4、7或10的序列一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：5、8或11的序列一致性至少为85％；(c)一种多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQID NO：6、9和12的序列一致性至少为90％；或(d)核苷酸序列(a)、(b)或(c)的全长互补序列，其中过量表达所述多核苷酸提高植物抗害虫性。
2.如权利要求1所述的分离的多核苷酸，所述多核苷酸的核酸序列包括SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11。
3.如权利要求1所述的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：12。
4.如权利要求1所述的分离的多核苷酸，所述害虫是鳞翅类。
5.如权利要求4所述的分离的多核苷酸，所述害虫是亚洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)、二化螟(Chilo suppressalis)或粘虫(Mythimna separata)。
6.一种重组DNA构建体，其包含1-3任一权利要求分离的多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控元件。
7.一种转基因植物、植物细胞或种子，其基因组内包含权利要求6所述的重组DNA构建体，其中所述重组DNA构建体包含权利要求1-3中任一项的多核苷酸和与其可操作连接的至少一个异源调控元件。
8.如权利要求7所述的转基因植物或植物细胞，其中所述多核苷酸包括SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11。
9.如权利要求7所述的转基因植物或植物细胞，其中所述多核苷酸编码多肽的氨基酸序列包括SEQ ID CO:6、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12。
10.如权利要求7-9所述的转基因植物或植物细胞，其中所述害虫为鳞翅目昆虫。
11.如权利要求10所述的转基因植物或植物细胞，其中所述害虫是亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)、二化螟(Chilo suppressalis)或粘虫(Mythimna separata)。
12.如权利要求7-11所述的植物，其中所述植物选自水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。
13.一种提高植物抗害虫性的方法，其包括提高权利要求1所述的多核苷酸的表达量。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述多核苷酸包含：(a)一种多聚核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：4、7或10序列的一致性至少为85％；(b)一种多聚核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：5、8或11序列一致性至少为85％；和(c)一种多聚核苷酸，其编码的多肽氨基酸序列与SEQ ID NO：6、9或12的序列一致性至少为90％。
15.如权利要求14所述的方法，包括：
(a)将重组DNA构建体转入可再生植物细胞，所述重组DNA构建体包含一种多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控元件，其中所述多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与SEQID NO：6、9或12相比序列一致性至少为80％；
(b)由步骤(a)后的可再生细胞再生转基因植物，其中转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体；和
(c)由步骤(b)的转基因植物获得子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含重组DNA构建体；与不含有重组DNA构建体的对照植物相比，所述子代植物显示增强的抗害虫性能。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述害虫为鳞翅目。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述害虫是亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)、二化螟(Chilo suppressalis)或粘虫(Mythimna separata)。
18.一种评估植物抗虫性的方法，包括：
(a)将重组DNA构建体转入可再生植物细胞，所述重组DNA构建体包含一种多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控元件，其中所述多核苷酸序列编码多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：6、9或12相比具有至少80％的序列一致性；
(b)由步骤(a)后的可再生植物细胞再生转基因植物，其中转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体；
(c)由转基因植物获得子代植物，其中子代植物在其基因组中包含重组DNA构建体；和
(d)与不包含重组DNA构建体的对照植物相比，评估子代转基因植物的抗害虫性能。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述害虫为鳞翅目。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述害虫是亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)、二化螟(Chilo suppressalis)或粘虫(Mythimna separata)。
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