BR112019013010A2

BR112019013010A2 - polipeptídeo ipd-101 recombinante, polinucleotídeo recombinante, planta transgênica ou célula de planta, construto de dna, composição, proteína de fusão, método para controlar uma população de praga de inseto, método para inibir o crescimento ou exterminar uma praga de inseto e uso do polipeptídeo ipd-101

Info

Publication number: BR112019013010A2
Application number: BR112019013010A
Authority: BR
Inventors: James THORPE Daniel; Dong Hua; Gilliam Jacob; English James; Kara Barry Jennifer; M Hillman Kai; Yalpani Nasser; Chad Wolfe Thomas
Original assignee: Pioneer Hi Bred Int
Priority date: 2016-12-22
Filing date: 2017-12-18
Publication date: 2019-12-17
Also published as: US20190364894A1; EP3558004A1; US11825843B2; US20240049710A1; US20220087259A1; CA3046226A1; US11213028B2; WO2018118811A1; MX2019007491A

Abstract

trata-se de composições e métodos para controlar pragas. os métodos envolvem transformar organismos com uma sequência de ácido nucleico codificadora de uma proteína inseticida. em particular, as sequências de ácido nucleico são úteis para preparar plantas e micro-organismos que têm atividade inseticida. portanto, bactérias, plantas, células de plantas, tecidos de planta e sementes transformados são fornecidos. composições são proteínas e ácidos nucleicos inseticidas de espécies bacterianas. as sequências encontram uso na construção de vetores de expressão para transformação subsequente em organismos de interesse o que inclui plantas, como sondas para o isolamento de outros genes homólogos (ou parcialmente homólogos). as proteínas pesticidas encontram uso no controle, inibição de crescimento e extermínio de populações de praga de lepidópteros, coleópteros, diptera, fungos, hemiptera e nemátodos e para produzir composições com atividade inseticida.

Description

POLIPEPTÍDEO IPD-101 RECOMBINANTE, POLINUCLEOTÍDEO RECOMBINANTE, PLANTA TRANSGÊNICA OU CÉLULA DE PLANTA, CONSTRUTO DE DNA, COMPOSIÇÃO, PROTEÍNA DE FUSÃO, MÉTODO PARA CONTROLAR UMA POPULAÇÃO DE PRAGA DE INSETO, MÉTODO PARA INIBIR O CRESCIMENTO OU EXTERMINAR UMA PRAGA DE INSETO E USO DO POLIPEPTÍDEO IPD-101

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS [0001] Este pedido reivindica o benefício do pedido provisório nsU.S. 62/438.179, depositado em 22 de dezembro de 2016, que está incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

REFERÊNCIA Ã LISTAGEM DE SEQUÊNCIA APRESENTADA ELETRONICAMENTE [0002] A cópia oficial da listagem de sequências é enviada eletronicamente via EFS-Web como uma listagem de sequências formatada em ASCII com um arquivo nomeado 6729WOPCT_Sequence_Listing criado em 30 de novembro de 2017 e que tem um tamanho de 107 kilobytes e é depositada simultaneamente com o relatório descritivo. A listagem de sequências contidas nesse documento ASCII formatado é parte do relatório descritivo e é incorporada na sua totalidade nesse documento para referência.

CAMPO [0003] Esta revelação refere-se ao campo de biologia molecular. São fornecidos genes inovadores que codificam proteínas pesticidas. Essas proteínas pesticidas e as sequências de ácido nucleico que codificam as mesmas são úteis no preparo de formulações pesticidas e na produção de plantas resistentes à praga transgênica.

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ANTECEDENTES [0004] O controle biológico de pragas de inseto de significância agrícola com o uso de um agente microbiano, como fungos, bactérias ou outras espécies de inseto, fornece uma alternativa ecologicamente correta e comercialmente atrativa aos pesticidas químicos sintéticos. De modo geral, o uso de biopesticidas apresenta um risco mais baixo de poluição e riscos ambientais e biopesticidas fornecem especificidade alvo maior do que é característico de inseticidas químicos de amplo espectro tradicionais. Além disso, os biopesticidas normalmente custam menos para produzir e melhoram, desse modo, rendimento econômico para uma variedade ampla de culturas.

[0005] Certas espécies de micro-organismos do gênero Bacillus são conhecidas por terem atividade pesticida contra uma faixa de pragas de insetos incluindo Lepidóptera, Diptera, Coleóptera, Hemiptera e outras. Bacillus thuringiensis (Bt) e Bacillus popilliae estão dentre os agentes de biocontrole mais bem-sucedidos descobertos até hoje. A patogenicidade de inseto sempre foi atribuída a cepas de B. larvae, B. lentimorbus, B. sphaericus e B. cereus. Os inseticidas microbianos, particularmente aqueles obtidos a partir de cepas de Bacillus, tiveram uma função importante na agricultura como alternativas a controle químico de pragas.

[0006] As plantas de culturas foram desenvolvidas com a resistência a insetos aprimorada modificando-se geneticamente as plantas de cultura para produzir proteínas pesticidas a partir de Bacillus. Por exemplo, plantas de milho e algodão foram geneticamente modificadas para

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3/163 produzir proteínas pesticidas isoladas de cepas de Bacillus thuringiensis. Essas culturas geneticamente modificadas são agora amplamente usadas na agricultura e dotaram o agricultor de uma alternativa ecologicamente correta para os métodos tradicionais de controle de insetos. Embora tenham demonstrado ser muito bem-sucedidas comercialmente, estas plantas de cultura resistentes a insetos geneticamente modificadas podem proporcionar resistência a apenas uma faixa estreita das pragas de insetos economicamente importantes. Em alguns casos, os insetos podem desenvolver resistência a compostos inseticidas diferentes, o que gera a necessidade de identificar agentes de controle biológico alternativos para controle de pragas.

[0007] Consequentemente, permanece uma necessidade de novas proteínas pesticidas com diferentes alcances de atividade inseticida contra pragas de inseto, por exemplo, proteínas inseticidas que são ativas contra uma variedade de insetos na ordem Lepidóptera e a ordem Coleóptera, que inclui, mas sem limitação, pragas de inseto que desenvolveram resistência a inseticidas existentes.

SUMÁRIO [0008] Em um aspecto, são fornecidos composições e métodos para conferir atividade pesticida a bactérias, plantas, células, tecidos e sementes de planta. As composições incluem moléculas de ácido nucleico codificadoras de sequências para polipeptídeos pesticidas e inseticidas, vetores que compreendem essas moléculas de ácido nucleico e células hospedeiras que compreendem os vetores. As composições também incluem as sequências de polipeptídeos pesticidas e anticorpos para esses

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4/163 polipeptídeos. As composições também compreendem bactérias transformadas, plantas, células de plantas, tecidos e sementes.

[0009] Em outro aspecto, as moléculas de ácido nucleico isolado ou recombinante são fornecidas codificando polipeptídeos IPD101 incluindo substituições, deleções, inserções de aminoácidos e fragmentos dos mesmos. São

fornecidas	moléculas de	ácido	nucleico	isolado	ou
recombinante	com capacidade	para	codificar	polipeptídeos
IPD101 de SEQ ID NOS: 2, 4,	6, 8,	10, 12, 14	, 16, 18,	20,
22, 24, 25,	26, 28, 29, 30, :	32, 46,	48, 50, 52	, 54, 56,	58,
e 60, bem	como substituições,	deleções,	inserções	de

aminoácidos, fragmentos dos mesmos e combinações dos mesmos. As sequências de ácido nucleico que são complementares a uma sequência de ácido nucleico das modalidades ou que hibridizam a uma sequência das modalidades também são abrangidas. As sequências de ácido nucleico podem ser usadas em construtos de DNA ou cassetes de expressão para transformação e expressão em organismos, incluindo microorganismos e plantas. As sequências de nucleotídeo ou aminoácidos podem ser sequências sintéticas que foram projetadas para expressão em um organismo que inclui, mas sem limitação, um micro-organismo ou uma planta.

[0010] Em outro aspecto, os polipeptídeos IPD101 são abrangidos. Também são fornecidos polipeptídeos IPD101 isolados ou recombinantes de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 32, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, e 60, bem como substituições, deleções,

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5/163 inserções de aminoácidos, fragmentos dos mesmos e combinações dos mesmos.

[0011] Em outro aspecto, são fornecidos métodos para produzir os polipeptídeos e para usar esses polipeptídeos para controlar ou exterminar pragas Lepidópteras, Coleópteras, nemátodos, fungos e/ou Diptera. As plantas transgênicas das modalidades expressam uma ou mais dentre as sequências pesticidas reveladas no presente documento. Em várias modalidades, a planta transgênica compreende adicionalmente um ou mais genes adicionais para resistência a inseto, por exemplo, um ou mais genes adicionais para controlar pragas de Coleópteros, Lepidópteros, Hemiptera ou nemátodos. Será entendido por uma pessoa versada na técnica que a planta transgênica pode compreender qualquer gene que confere um traço agronômico de interesse.

[0012] Em outro aspecto, também estão incluídos métodos para detectar os ácidos nucleicos e polipeptídeos das modalidades em uma amostra. Fornece-se um kit para detectar a presença de um polipeptídeo IPD101 ou detectar a presença de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo IPD101 em uma amostra. O kit pode ser fornecido juntamente com todos os reagentes e amostras de controle necessários para executar um método para detectar o agente destinado, assim como instruções para uso.

[0013] Em outro aspecto, as composições e métodos das modalidades são úteis para a produção de organismos com tolerância ou resistência a pragas aprimorada. Esses organismos e composições que compreendem os organismos são desejáveis para propósitos agrícolas. As composições das modalidades também são úteis para gerar proteínas alteradas

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6/163 ou melhoradas que têm atividade pesticida ou para detectar a presença de polipeptideos IPD101.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0014] As Figuras 1(a) a 1(d) mostram um alinhamento de sequência de aminoácidos, com o uso do módulo ALIGNX® do pacote Vector NTI®, do polipeptídeo IPDIOlAa (SEQ ID NO: 2), do polipeptídeo IPDIOlAb (SEQ ID NO: 4), do polipeptídeo

IPDIOlAc	(SEQ	ID NO: 6)	, do	polipeptídeo	IPDIOIBa	(SEQ	ID
NO: 8 ) ,	do ]	polipeptídeo IPDIOlCa	(SEQ	ID	NO:	10) ,	do
polipeptídeo	IPDIOlCb	(SEQ	ID NO:	12) ,	do	polipeptídeo
IPDIOlCc	(SEQ	ID NO: 14	) , do	polipeptídeo	IPDIOlGd	(SEQ	ID
NO: 16),	do	polipeptídeo IPDIOlCe	(SEQ	ID	NO:	18) ,	do
polipeptídeo	IPDIOlCf	(SEQ	ID NO:	20) ,	do	polipeptídeo
IPDIOlEa	(SEQ	ID NO: 22	) , do	polipeptídeo	IPDIOlEb	(SEQ	ID
NO: 24),	do	polipeptídeo IPDIOlEe	(SEQ	ID	NO:	25) ,	do
polipeptídeo	IPDIOlEa	(SEQ	ID NO:	26) ,	do	polipeptídeo
IPDIOlFb	(SEQ	ID NO: 28	) , do	polipeptídeo	IPDIOlGa	(SEQ	ID
NO: 2 9),	do	polipeptídeo IPDIOlGb	(SEQ	ID	NO:	30) ,	do
polipeptídeo	IPDIOlGc	(SEQ	ID NO:	32) ,	do	polipeptídeo
IPDIOlGd	(SEQ	ID NO: 56	) , do	polipeptídeo	IPDIOlGe	(SEQ	ID
NO: 58)	e dc	> polipeptídeo	IPDIOlGf	(SEQ	ID	NO:	60) .	A

diversidade de sequência de aminoácidos entre as sequências de aminoácidos é destacada. As diferenças de aminoácido conservativas são indicadas pelo sombreamento (A).

[0015] A Figura 2: A competição homóloga da ligação de IPDIOlAa identificado com Alexa (1,5 nM) às BBMVs de WCRW revela ligação específica com alta afinidade aparente (EC50=2 nM).

DESCRIÇÃO DETALHADA [0016] Deve ser entendido que esta revelação não é

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7/163 limitada à metodologia, protocolos, linhagens celulares, gêneros e reagentes particulares descritos, visto que os mesmos podem variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada no presente documento tem o propósito de descrever apenas as modalidades particulares e não é destinada a limitar o escopo da presente revelação.

[0017] Conforme usado no presente documento, as formas singulares um, uma e o/a incluem referentes plurais, a menos que o contexto dite claramente de outro modo. Desse modo, por exemplo, a referência a uma célula inclui uma pluralidade de tais células e referência à proteína inclui referência a uma ou mais proteínas e equivalentes dos mesmos e assim por diante. Todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado que o comumente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica à qual esta revelação pertence, a menos que claramente indicado de outro modo.

[0018] A presente revelação é direcionada a composições e métodos para controlar pragas. Os métodos envolvem transformar organismos com sequências de ácido nucleico que codificam polipeptídeos IPD101. Em particular, as sequências de ácido nucleico das modalidades são úteis para preparar plantas e micro-organismos que têm atividade pesticida. Desse modo, bactérias, plantas, células de plantas, tecidos de planta e sementes transformados são fornecidos. As composições incluem ácidos nucleicos e proteínas pesticidas de espécies bacterianas. As sequências de ácido nucleico encontram uso na construção de vetores de expressão para a transformação subsequente em organismos de interesse, como sondas para o isolamento de outros genes homólogos (ou

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8/163 parcialmente homólogos) e para a geração de polipeptídeos IPD101 alterados através de métodos conhecidos na técnica, como mutagênese sitio-dirigida, permuta de domínio ou embaralhamento de DNA. Os polipeptídeos IPD101 encontram uso no controle ou extermínio de populações da praga Lepidoptera, Coleoptera, Díptera, fúngica, Hemíptera e nemátoda e para produzir composições com atividade pesticida. As pragas de inseto de interesse incluem, mas sem limitação, espécies de Lepidoptera que incluem, mas sem limitação: Lagarta de Espiga de Milho, (CEW) (Helícoverpa zea) _r Broca de Milho Européia (ECB) (Ostrínía nubíalís), traça-das-crucíferas_r por exemplo, Helícoverpa zea Boddie; lagarta falsa-medideira, por exemplo, Pseudoplusía íncludens Walker; e lagarta-da-soja, por exemplo, Antícarsía gemmatalís Hübner e espécies Coleoptera, incluindo, porém sem limitação, Verme de Raiz do Milho Ocidental (Díabrotíca vírgífera) - WCRW, Verme de raiz do milho do sul (Díabrotíca undecímpunctata howardi) - SCRW e Lagarta da raiz do milho setentrional (Díabrotíca barber!) - NCRW.

[0019] Por toxina pesticida ou proteína pesticida é usada no presente documento para se referir a uma toxina que tem atividade tóxica contra uma ou mais pragas, incluindo, mas sem limitação, membros das ordens Lepidótera, Díptera, Hemíptera e Coleoptera ou do filo Nemátodo ou uma proteína que tem homologia com tal proteína. As proteínas pesticidas foram isoladas dos organismos incluindo, por exemplo, Bacillus sp., Pseudomonas sp., Photorhabdus sp., Xenorhabdus sp., Clostridium bífermentans e Paeníbací11us popíllíae.

[0020] Em algumas modalidades o polipeptídeo IPD101

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9/163 inclui uma sequência de aminoácidos deduzida da sequência de ácidos nucleicos de comprimento total revelada no presente documento e sequências de aminoácidos que são mais curtas do que as sequências de comprimento total, ou devido ao uso de um sítio de início a jusante alternativo ou devido ao processamento que produz uma proteína mais curta que tem atividade pesticida. 0 processamento pode ocorrer no organismo em que a proteína é expressa ou na praga após a ingestão da proteína.

[0021] Desse modo, são fornecidas no presente documento as sequências de ácido nucleico isolado ou recombinante inovadoras que conferem atividade pesticida. Também são fornecidas sequências de aminoácidos de polipeptídeos de IPD101. O polipeptídeo que resulta da translação desses genes de IPD101 permite que células controlem ou exterminem pragas que ingerem a mesma.

Proteínas IPD101 e Variantes e Fragmentos Das Mesmas [0022] Os polipeptídeos IPD101 são abrangidos pela revelação. Polipeptídeo IPD101 e proteína IPD101 conforme usado no presente documento de forma intercambiável referem-se a um polipeptídeo que tem atividade inseticida incluindo, porém sem limitação, atividade inseticida contra uma ou mais pragas de inseto das ordens Lepidoptera e/ou Coleoptera e é suficientemente homólogo ao polipeptídeo IPDIOlAa da SEQ ID NO: 2, Contempla-se uma variedade de polipeptídeos IPD101. Fontes de polipeptídeos IPD101 ou proteínas relacionadas incluem espécies bacterianas selecionadas dentre, porém sem limitação, espécies de Lysíníbacíllus. O alinhamento das sequências de aminoácido de homólogos de polipeptídeo IPD101 (por exemplo, consultar

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10/163 a Figura 1) permite a identificação de resíduos que são altamente conservados entre os homólogos naturais dessa família.

[0023] Suficientemente homólogo é usado no presente documento para se referir a uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de homologia de sequência em comparação a uma sequência de referência com o uso de um dentre os programas de alinhamento descritos no presente documento com o uso de parâmetros padrões. Em algumas modalidades, a homologia de sequência é contra a sequência de comprimento total de um polipeptídeo IPD101. Em algumas modalidades, o polipeptídeo IPD101 tem pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência em comparação com qualquer uma das SEQ ID NOS:

2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 32, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, e 60. O termo cerca de quando usado no presente documento em contexto com o percentual de identidade de sequência significa +/- 0,5%. Uma pessoa versada na técnica reconhecerá que esses valores podem ser apropriadamente ajustados para determinar

homologia

correspondente de proteínas levando em

consideração a similaridade de aminoácidos e semelhantes.

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Em algumas modalidades, a identidade de sequência é calculada com o uso de algoritmo ClustalW no módulo ALIGNX® do Pacote de Programa Vector NTI® (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Calif.) com todos os parâmetros padrão. Em algumas modalidades, a identidade de sequência é pelo comprimento inteiro do polipeptídeo calculado com o uso de algoritmo ClustalW no módulo ALIGNX® do Pacote de Programa Vector NTI® (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Calif.) com todos os parâmetros padrão.

[0024] Conforme usado no presente documento, os termos proteína, molécula de peptídeo ou polipeptídeo incluem qualquer molécula que compreende cinco ou mais aminoácidos. Sabe-se bem na técnica que as moléculas de proteína, peptídeo ou polipeptídeo podem ser submetidas à modificação, incluindo modificações pós-tradução como, mas sem limitação, formação de ligação dissulfeto, glicosilação, fosforilação ou oligomerização. Desse modo, conforme usado no presente documento, os termos proteína, molécula de peptídeo ou polipeptídeo incluem qualquer proteína que é modificada por qualquer processo biológico ou não biológico. Os termos aminoácido e aminoácidos se referem a todos os Laminoácidos de ocorrência natural.

[0025] Uma proteína recombinante é usada no presente documento para se referir a uma proteína que não está mais em seu ambiente natural, por exemplo, in vitro ou em uma célula hospedeira de planta ou bacteriana recombinante. Um polipeptídeo IPD101 que é substancialmente isento de material celular inclui preparações de proteína que têm menos do que cerca de 30%, 20%, 10% ou 5% (em peso seco) de proteína não pesticida (também denominada no presente

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12/163 documento como uma proteína contaminante).

[0026] Fragmentos ou porções biologicamente ativas incluem fragmentos de polipeptídeo que compreendem sequências de aminoácidos suficientemente idênticas a um polipeptídeo IPD101 e que exibem atividade inseticida. Fragmentos ou porções biologicamente ativas de polipeptídeos IPD101 inclui fragmentos que compreende

sequências	de aminoácidos	suficientemente	idênticas	à
sequência	de aminoácidos apresenta em qualquer	uma das	SEQ
ID NOS: 2,	4, 6, 8, 10, 12,	14, 16, 18, 20, 22,	24, 25,	26,
28, 29, 30	, 32, 46, 48, 50,	52, 54, 56, 58, e	60 sendo	que

o polipeptídeo IPD101 tem atividade inseticida. Tais porções biologicamente ativas podem ser preparadas por técnicas recombinantes e avaliadas em relação à atividade inseticida. Em algumas modalidades, o fragmento do polipeptídeo IPD101 é um truncamento N-terminal e/ou C-terminal de pelo menos

1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,	θ,	9,	10,	11, 12,	13,	14, 15, 16, 17,
18, 19, 20, 21, 22,	23,	24,	25	, 26, 27	, 28,	, 29, 30, 31 ou
mais aminoácidos do	terminal N	e/ou terminal	C em relação a
qualquer uma das SEQ	ID	NOS :	2,	4, 6, 8,	10,	12, 14, 16, 18,
20, 22, 24, 25, 26,	28,	29,	30,	32, 46,	48,	50, 52, 54, 56,
58, e 60, por exemplo,	por	proteólise,	por	inserção de um

códon inicial, por deleção dos códons que codificam os aminoácidos deletados e inserção concomitante de um códon inicial e/ou inserção de um códon de parada. Em algumas modalidades, o fragmento do polipeptídeo IPD101 é um truncamento N-terminal de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 aminoácidos do terminal N de qualquer uma das SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 25, 26, 28,

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29, 30, 32, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, e 60. Em algumas modalidades, o fragmento do polipeptídeo IPD101 e um truncamento N-terminal e/ou C-terminal de pelo menos 1, 2,

3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,

20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou mais aminoácidos do terminal a qualquer uma das SEQ ID NOS:

18, 20, 22, 24, 25, 26, 28, 29,

56, 58, e 60.

[0027] Variantes conforme

13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,

28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 N e/ou terminal C em relação 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16,

30, 32, 46, 48, 50, 52, 54, usado no presente documento refere-se a proteínas ou polipeptídeos que têm uma sequência

de aminoácidos	que é	pelo	menos cerca	de	50%,	55%,	60%,	65%,
70%, 75%, 80%,	81%,	82%,	83%, 84%, 85	% y	86%,	87%,	88%,	89%,
90%, 91%, 92%,	93%,	94%,	95%, 96%,	97%	, 98	%, 99	% ou	mais

idêntica à sequência de aminoácidos parentais.

[0028] Em algumas modalidades, um polipeptídeo IPD101 compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 32, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, e 60, sendo que o polipeptídeo IPD101 tem atividade inseticida.

[0029] Em algumas modalidades, um polipeptídeo IPD101 compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de

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identidade	através de	todo	o	comprimento da	sequência	de
aminoácidos	de qualquer	uma	das	SEQ ID NOS: 2,	4, 6, 8,	10,
12, 14, 16,	18, 20, 22,	24,	25,	26, 28, 29, 30	, 32, 46,	48,

50, 52, 54, 56, 58, e 60.

[0030] Em algumas modalidades, a identidade de sequência é pelo comprimento inteiro do polipeptídeo calculada com o uso de algoritmo ClustalW no módulo ALIGNX® do Pacote de Programa Vector NTI® (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Califórnia) com todos os parâmetros padrão.

[0031] Em algumas modalidades, um polipeptídeo IPD101 compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma ou

mais	; dentre	as SEQ	ID NOS:	2, 4, 6, 8, 10,	12,	14, 16,	18,
20,	22, 24,	25, 26,	28, 29	, 30, 32, 46, 48,	50,	52, 54,	56,
58,	e 60 tendo 1, 2,	-3,4,	5, 6, 7, 8, 9, 10	11,	12, 13,	14,
15,	16, 17,	18, 19,	20, 21	, 22, 23, 24, 25,	26,	27, 28,	29,
30,	31, 32,	33, 34,	35, 36	, 37, 38, 39, 40,	41,	42, 43,	44,
45,	46, 47,	48, 49,	50, 51	, 52, 53, 54, 55,	56,	57, 58,	59,
60,	61, 62,	63, 64,	65, 66, 67, 68, 69, 70,	71,	72, 73,	74,
75,	76, 77,	78, 79,	80, 81	, 82, 83, 84, 85,	86,	87, 88,	89,
90,	91, 92,	93, 94,	95 ou :	mais substituições	; de	aminoácidos
em	comparação com o	aminoácido nativo	na posição
correspondente de qualquer	uma ou mais dentre as	respectivas
SEQ	ID NOS:	2, 4, 6	,8,10	, 12, 14, 16, 18,	20,	22, 24,	25,
26,	28, 29,	30, 32,	46, 48	, 50, 52, 54, 56,	58,	e 60 .
[0032] Métodos j	Dara tais manipulações	são	geralmente
conhecidos	na técnica.	Por exemplo, as	variantes	da
sequência de	aminoácidos de um polipeptídeo IPD1	01 podem	ser

preparadas por meio de mutações no DNA. Isso também pode ser alcançado por uma dentre diversas formas de mutagênese e/ou em evolução direcionada. Em alguns aspectos, as mudanças

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15/163 codificadas na sequência de aminoácidos não afetarão substancialmente a função da proteína. Tais variantes terão a atividade pesticida desejada. No entanto, compreende-se que a habilidade de um polipeptídeo IPD101 para conferir atividade pesticida pode ser aprimorada pelo uso de tais técnicas nas composições desta revelação.

[0033] Por exemplo, as substituições de aminoácido conservativas podem ser feitas em um ou mais resíduos de aminoácido não essencial previstos. Um resíduo de aminoácido não essencial é um resíduo que pode ser alterado da sequência de tipo selvagem de um polipeptídeo IPD101 sem alterar a atividade biológica. Uma substituição de aminoácido conservativa é uma na qual o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido que tem uma cadeia lateral similar. As famílias de resíduos de aminoácido que têm cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Essas famílias incluem: aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina); cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico); resíduos negativamente carregados polares e suas amidas (por exemplo, ácido aspártico, asparagina, ácido glutâmico, glutamina; cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína); resíduos alifáticos pequenos, não polares ou levemente polares (por exemplo, Alanina, serina, treonina, prolina, glicina); cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano); resíduos não polares alifáticos grandes (por exemplo, metionina, leucina,

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16/163 isoleucina, valina, cisteina); cadeias laterais beta ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina); cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina); cadeias laterais aromáticas grandes (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano).

[0034] As substituições de aminoácidos podem ser feitas em regiões não conservadas que retêm função. Em geral, tais substituições não seriam feitas para resíduos de aminoácido conservados ou para resíduos de aminoácido que residem em um motivo conservado, em que tais resíduos são essenciais para atividade de proteína. Os exemplos de resíduos que são conservados e que podem ser essenciais para a atividade de proteína incluem, por exemplo, resíduos que são idênticos entre todas as proteínas contidas em um alinhamento de toxinas semelhantes ou relacionadas às sequências das modalidades (por exemplo, resíduos que são idênticos em um alinhamento de proteínas homólogas) . Os exemplos de resíduos que são conservados, mas que podem permitir substituições de aminoácido conservadoras e ainda podem reter atividade incluem, por exemplo, resíduos que têm apenas substituições conservadoras entre todas as proteínas contidas em um alinhamento de toxinas semelhantes ou relacionadas às sequências das modalidades (por exemplo, resíduos que têm apenas substituições conservadoras entre todas as proteínas contidas no alinhamento das proteínas homólogas). Entretanto, a pessoa versada na técnica entendería que as variantes funcionais podem ter alterações conservadas ou não conservadas menores nos resíduos conservados. As diretrizes a respeito de substituições de aminoácido apropriadas que

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17/163 não afetam a atividade biológica da proteína de interesse podem ser encontradas no modelo de Dayhoff, et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.).

[0035] Na realização de tais mudanças, o índice hidropático de aminoácidos pode ser considerado. A importância do índice de aminoácido hidropático ao conferir a função biológica interativa em uma proteína é geralmente entendida na técnica (Kyte e Doolittle, (1982) J Mol Bíol. 157(1):105 a 132). É aceito que o caráter hidropático relativo do aminoácido contribua para a estrutura secundária da proteína resultante, que define, por sua vez, a interação da proteína com outras moléculas, por exemplo, enzimas, substratos, receptores, DNA, anticorpos, antígenos e semelhantes.

[0036] Sabe-se na técnica que certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos que têm índice ou escore hidropático similar e ainda resultar em uma proteína com atividade biológica similar, isto é, ainda obter uma proteína equivalente funcionalmente biológica. A cada aminoácido foi atribuído um índice hidropático com base em sua hidrofobicidade e características de carga (Kyte e Doolittle, ibid). Esses são: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9) e arginina (-4,5). Na realização de tais mudanças, a substituição de aminoácidos

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18/163 cujos índices hidropáticos estão dentro de +2 é preferida, aquelas das quais estão dentro de +1 são particularmente preferidas, e aquelas dentro de +0,5 são ainda mais particularmente preferidas.

[0037] Compreende-se também que na técnica que a substituição de aminoácidos semelhantes pode ser feita efetivamente com base na hidrofilicidade. A Patente dos E.U.A. n.° 4.554.101 declara que a maior hidrofilicidade média local de uma proteína, conforme manipulado pela hidrofilicidade de seus aminoácidos adjacentes, se correlaciona a uma propriedade biológica da proteína.

[0038] Conforme detalhado na Patente dos E.U.A. n.° 4.554.101, os valores de hidrofilicidade a seguir foram atribuídos a resíduos de aminoácido: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0+0,1); glutamato (+3,0+0,1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5+0,1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptofano (-3,4).

[0039] Alternativamente, alterações podem ser feitas à sequência de proteína de muitas proteínas no terminal amino ou carbóxi sem afetar substancialmente a atividade. Isso pode incluir inserções, deleções ou alterações introduzidas por métodos moleculares modernos, como PCR, incluindo amplificações de PCR que alteram ou estendem a sequência de codificação de proteína em virtude da inclusão de sequências codificadoras de aminoácido nos oligonucleotídeos utilizados na amplificação de PCR. Alternativamente, as sequências de proteína adicionadas podem incluir sequências de codificação

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19/163 de proteína inteiras, tais como aquelas usadas comumente na técnica para gerar fusões de proteína. Tais proteínas de fusão são frequentemente usadas para (1) aumentar a expressão de uma proteína de interesse (2) introduzir um domínio de ligação, atividade enzimática ou epítopo para facilitar a purificação de proteína, a detecção de proteína ou outros usos experimentais conhecidos na técnica (3) direcionar a secreção ou tradução de uma proteína a uma organela subcelular, como o espaço periplásmico de bactérias Gram negativas, mitocôndrias ou cloroplastos de plantas ou o retículo endoplasmático de células eucarióticas, sendo que o último resulta frequentemente em glicosilação da proteína. [0040] As sequências de nucleotídeo e de aminoácidos variantes da revelação também abrangem as sequências derivadas de procedimentos mutagênicos e recombinogênicos, como embaralhamento de DNA. Com tal procedimento, uma ou mais regiões de codificação de polipeptídeo de IPD101 diferentes podem ser usadas para criar um novo polipeptídeo de IPD101 que possui as propriedades desejadas. Dessa maneira, as bibliotecas de polinucleotídeos recombinantes são geradas a partir de uma população de polinucleotídeos de sequência relacionada que compreendem regiões de sequência que têm identidade de sequência substancial e podem ser recombinadas de modo homólogo in vitro ou in vivo. Por exemplo, com o uso dessa abordagem, os motivos de sequência codificadores de um domínio de interesse podem ser embaralhados entre um gene pesticida e outros genes pesticidas conhecidos para obter um gene novo que codifica uma proteína com uma propriedade de interesse melhorada, como uma atividade inseticida aumentada. As estratégias para

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20/163 tal embaralhamento de DNA são conhecidas na técnica. Consultar, por exemplo, Stemmer, (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:10747 a 10751; Stemmer, (1994) Nature 370:389 a 391; Crameri, et al., (1997) Nature Biotech. 15:436 a 438; Moore, et al., (1997) J. Mol. Biol. 272:336 a 347; Zhang, et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4.504 a 4.509; Crameri, et al., (1998) Nature 391:288 a 291; e as Patentes dos E.U.A. n.^os 5.605.793 e 5.837.458.

[0041] A permuta ou o embaralhamento de domínio é um outro mecanismo para gerar polipeptídeos IPD101 alterados. Os domínios podem ser comutados entre polipeptídeos IPD101, o que resulta em toxinas híbridas ou quiméricas com atividade inseticida ou espectro-alvo aprimorado. Os métodos para gerar proteínas recombinantes e testar as mesmas por atividade pesticida são bem conhecidos na técnica (consultar, por exemplo, Naimov, et al., (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5328 a 5330; de Maagd, et al., (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:1537 a 1543; Ge, et al., (1991) J. Biol. Chem. 266:17954 a 17958; Schnepf, et al., (1990) J. Biol. Chem. 265:20923 a 21010; Rang, et al., 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2918 a 2925) .

Análises filogenéticas, de motivo da sequência e estruturais das famílias de proteína inseticida.

[0042] Um método de análise de estrutura e sequência pode ser empregado, que é composto de quatro componentes: construção de árvore filogenética, descoberta de motivos de sequência de proteínas, previsão de estrutura secundária e alinhamento de sequências de proteínas e estruturas secundárias. Os detalhes sobre cada componente são ilustrados abaixo.

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1) Construção de árvore filogenética [0043] A análise filogenética pode ser realizada com o uso do software MEGA5. As sequências de proteínas podem ser submetidas à análise ClustalW versão 2 (Larkin M.A et ai (2007) Bioinformatics 23(21): 2.947 a 2.948) para múltiplos alinhamentos de sequências. A história evolutiva é, então, inferida pelo método de Máxima Verossimilhança com base no modelo baseado em matriz de JTT. A árvore com a maior verossimilhança de log é obtida, exportada em formato Newick e, adicionalmente, processada para extrair as IDs de sequência na mesma ordem em que apareceram na árvore. Alguns ciados que representam subfamílias podem ser manualmente identificados para cada família de proteína inseticida.

2) Achado de motivos de sequência de proteínas [0044] As sequências de proteína são reordenadas de acordo com a árvore filogenética construída anteriormente, e fornecidas à ferramenta de análise de MOTIVO MEME (Múltiplos EM para Elicitação de MOTIVO) (Bailey T.L., e Elkan 0., Proceedings of the Second International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, páginas 28 a 36, AAAI Press, Menlo Park, Califórnia, 1994) para identificação de motivos-chave de sequência. MEME é configurado conforme segue: Número mínimo de sítios 2, Largura mínima de motivo 5 e Número máximo de motivos 30. Os motivos de sequência únicos para cada subfamília foram identificados por meio de observação visual. A distribuição de MOTIVOS ao longo de toda a família de gene pode ser visualizada na página da web HTML. Os MOTIVOS são numerados em relação à classificação do valor E para cada MOTIVO.

3) Previsão de estrutura secundária

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22/163 [0045] PSIPRED, método de previsão de estrutura secundária de alta classificação (Jones DT. (1999) J. Mol. Biol. 292: 195 a 202), pode ser usado para previsão de estrutura secundária de proteína. A ferramenta fornece previsão de estrutura exata com o uso de duas redes neurais de alimentação direta com base no produto PSI-BLAST. A base de dados de PSI-BLAST é criada removendo-se as regiões de baixa complexidade, transmembranares e de bobina espiralada em UnireflOO. Os resultados de PSIPRED contêm as estruturas secundárias previstas (Alpha helix: H, filamento Beta: E, e Bobina: C) e as classificações de confidência correspondentes para cada aminoácido em uma dada sequência de proteínas.

4) Alinhamento de sequências de proteína e estruturas secundárias [0046] Um roteiro pode ser desenvolvido para gerar um alinhamento de estrutura secundária com lacunas de acordo com o alinhamento de sequência de múltiplas proteínas da etapa 1 para todas as proteínas. Todas as sequências de proteína alinhadas e estruturas são concatenadas em um único arquivo FASTA e, então, importadas para MEGA para visualização e identificação de estruturas conservadas.

[0047] Em algumas modalidades, o polipeptídeo IPD101 tem uma propriedade física modificada. Conforme usado no presente documento, o termo propriedade física se refere a qualquer parâmetro adequado para descrever as características físico-químicas de uma proteína. Conforme usado no presente documento, propriedade física de interesse e propriedade de interesse são usados de modo intercambiável para se referir a propriedades físicas de

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23/163 proteínas que estão sob investigação e/ou modificação. Exemplos de propriedades físicas incluem, mas não estão limitados a, carga líquida na superfície e distribuição de carga na superfície da proteína, hidrofobicidade efetiva e distribuição de resíduos hidrofóbicos na superfície da proteína, densidade de carga na superfície, densidade de hidrofobicidade da superfície, contagem total de grupos ionizáveis da superfície, tensão da superfície, tamanho da proteína e sua distribuição em solução, temperatura de fusão, capacidade térmica e segundo coeficiente virial. Os exemplos de propriedades físicas também incluem o polipeptídeo IPD101 ter expressão aumentada, solubilidade aumentada, fitotoxicidade diminuída e digestibilidade de fragmentos proteolíticos em um intestino de inseto. Modelos para digestão por fluidos gástricos simulados são conhecidos por um indivíduo versado na técnica (Fuchs, R.L. e J.D. Astwood. Food Technology 50: 83 a 88, 1996; Astwood, J.D., et al Nature Biotechnology 14: 1269 a 1273, 1996; Fu TJ et al J. Agric Food Chem. 50: 7154 a 7160, 2002) .

[0048] Em algumas modalidades, as variantes incluem polipeptídeos que diferem em sequência de aminoácidos devido à mutagênese. As proteínas variantes abrangidas pela revelação são biologicamente ativas, isto é, continuam a ter a atividade biológica desejada (isto é, atividade pesticida) da proteína nativa. Em alguma modalidade, a variante terá pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80% ou mais da atividade inseticida da proteína nativa. Em algumas modalidades, as variantes podem ter atividade melhorada sobre a proteína nativa.

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24/163 [0049] Os genes bacterianos têm frequentemente vários códons iniciais de metionina em proximidade ao início do quadro de leitura aberta. Normalmente, a iniciação de tradução em um ou mais dentre esses códons iniciais levará à geração de uma proteína funcional. Esses códons iniciais podem incluir códons ATG. Entretanto, as bactérias, como Bacillus sp. , também reconhecem o códon GTG como um códon inicial, e proteínas que iniciam a tradução em códons GTG contêm uma metionina no primeiro aminoácido. Em ocasiões raras, a tradução em sistemas bacterianos pode iniciar em um códon TTG, embora, nesse caso, o TTG codifique uma metionina. Adicionalmente, não é normalmente determinado a priori qual desses códons é usado naturalmente na bactéria. Desse modo, é entendido que o uso de um dentre os códons de metionina alternativos também pode levar à geração de proteínas pesticidas. Essas proteínas pesticidas são abrangidas na presente revelação e podem ser usadas nos métodos da presente revelação. Será entendido que, quando expressas em plantas, será necessário alterar o códon inicial alternado para ATG para tradução apropriada.

[0050] Em algumas modalidades, um polipeptídeo IPD101

compreende	a sequência	de	aminoácidos	de qualquer	uma	ou
mais dentre	as SEQ ID NOS:	2, 4, 6, 8,	10, 12, 14,	16,	18,
20, 22, 24,	25, 26, 28,	29,	30, 32, 46,	48, 50, 52,	54,	56,

58, e 60.

[0051] Em algumas modalidades, os polipeptídeos quiméricos são fornecidos compreendendo regiões de pelo menos dois polipeptídeos IPD101 diferentes da revelação.

[0052] Em algumas modalidades, são fornecidos polipeptídeos quiméricos que compreendem regiões de pelo

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25/163 menos dois diferentes polipeptideos IPD101 selecionados dentre qualquer uma ou mais dentre as SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 32, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, e 60.

[0053] Em algumas modalidades, o polipeptídeo IPD101 quimérico é fornecido compreendendo uma região N-terminal de um primeiro polipeptídeo IPD101 da revelação fundido de modo operacional a uma região C-terminal de um segundo polipeptídeo IPD101 da revelação.

[0054] Em outras modalidades, o polipeptídeo IPD101 pode ser expressado como uma proteína precursora com uma sequência interveniente que catalisa a união de proteína pós-tradução de múltiplas etapas. A união de proteína envolve a remoção de uma sequência interveniente de um polipeptídeo com a união concomitante das sequências de flanqueamento para render um polipeptídeo novo (Chong, et al. , (1996) J. Biol. Chem., 271:22159 a 22168). Essa sequência interveniente ou elemento de união de proteína, denominada inteínas, que catalisam sua própria excisão através das três reações coordenadas nas junções de união do terminal N e do terminal C: uma disposição acil da cisteína ou serina do terminal N; uma reação de transesterficação entre os dois terminais para formar um intermediário de tioéster ou éster ramificado e divagem de ligação de peptídeo acoplada à ciclização da asparagina de terminal C de inteína para libertar a inteína (Evans, et al., (2000) J. Biol. Chem., 275:9.091 a 9.094. A elucidação do mecanismo de união de proteína levou a várias aplicações com base em inteína (Comb, et al. , Patente dos E.U.A. n.° 5.496.714; Comb, et al., Patente dos E.U.A. n.° 5.834.247;

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Camarero e Muir, (1999) J. Amer. Chem. Soc. 121:5597 a 5598; Chong, et al., (1997) Gene 192:271 a 281, Chong, etal., (1998) Nucleic Acids Res. 26:5109 a 5115; Chong, etal., (1998) J. Biol. Chem. 273:10567 a 10577; Cotton, etal., (1999) J. Am. Chem. Soc. 121:1100 a 1101; Evans, etal., (1999) J. Biol. Chem. 274:18359 a 18363; Evans, etal., (1999) J. Biol. Chem. 274:3923 a 3926; Evans, et al., (1998) Protein Sci. 7:2256 a 2264; Evans, et al., (2000) J. Biol.

Chem. 275:9091 a 9094; Iwai e Pluckthun, (1999) FEES Lett.

459:166 a 172; Mathys, et al., (1999) Gene 231:1 a 13; Mills, et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3543 a 3548; Muir, et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6705 a 6710; Otomo, et al., (1999) Biochemistry 38:16040 a 16044; Otomo, et al., (1999) J. Biolmol. RMN 14:105 a 114; Scott, et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:13.638 a 13.643; Severinov e Muir, (1998) J. Biol. Chem. 273:16.205 a 16.209;

Shingledecker, et al., (1998) Gene 207:187 a 195;

Southworth, et al., (1998) EMBO J. 17:918 a 926; Southworth, et al., (1999) Biotechniques 27:110 a 120; Wood, etal., (1999) Nat. Biotechnol. 17:889 a 892; Wu, et al., (1998a)

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:9.226 a 9.231; Wu, etal., (1998b) Biochim Biophys Acta 1387:422 a 432; Xu, etal., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:388 a 393; Yamazaki, et al., (1998) J. Am. Chem. Soc., 120:5.591 a 5.592). Para a aplicação de inteinas em transgenes de planta, consultar Yang, et al., (Transgene Res 15:583 a 593 (2006)) e Evans, et al., (Annu. Rev. Plant Biol. 56:375 a 392 (2005)).

[0055] Em outra modalidade, o polipeptídeo IPD101 pode ser codificado por dois genes separados em que a inteína da proteína precursora é proveniente dos dois genes, denominada

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27/163 inteína de separação, e as duas porções do precursor são unidas por uma formação de ligação de peptídeo. Essa formação de ligação peptídica é alcançada por união trans mediada por inteína. Com esse propósito, um primeiro e um segundo cassete de expressão que compreendem os dois genes separados codificam adicionalmente as inteínas com capacidade para mediar união trans de proteína. Por união trans, as proteínas e os polipeptídeos codificados pelo primeiro e segundo fragmentos podem ser ligados por formação de ligação peptídica. As inteínas de união trans podem ser selecionadas a partir dos genomas de nucléolo e de organela de organismos diferentes, incluindo eucariotas, arcabactérias e eubactérias. As inteínas que podem ser usadas são listadas em neb.com/neb/inteins.html, que pode ser acessado pela rede mundial de computadores com o uso do prefixo www) . A sequência de nucleotídeo que codifica uma inteína pode ser dividida em uma parte 5' e uma parte 3' que codificam a parte 5' e a parte 3' da inteína, respectivamente. As porções de sequência não necessárias para a união de inteína (por exemplo, domínio de endonuclease de migração) podem ser deletadas. A sequência de codificação de inteína é dividida de modo que as partes 5' e 3' tenham capacidade para união trans. Para selecionar um sítio de divisão adequado da sequência de codificação de inteína, as considerações publicadas por Southworth, et al., (1998) EMBO J. 17:918 a 926 podem ser seguidas. Na construção do primeiro e do segundo cassete de expressão, a sequência de codificação de inteína 5' é ligada à extremidade 3' do primeiro fragmento que codifica a parte de terminal N do polipeptídeo IPD101 e a sequência de codificação de inteína 3' é ligada à

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28/163 extremidade 5' do segundo fragmento que codifica a parte de terminal C do polipeptídeo IPD101.

[0056] Em geral, os parceiros de união trans podem ser projetados com o uso de qualquer inteína dividida, incluindo qualquer inteína artificialmente dividida ou de ocorrência natural. Diversas inteínas divididas de ocorrência natural são conhecidas, por exemplo: a inteína dividida do gene DnaE de Synechocystis sp. PCC6803 (consultar Wu, et al., (1998) Proc Natl Acad Sei USA. 95(16):9226 a 9231 e Evans, et al., (2000) J Biol Chem. 275(13):9091 a 9094 e do gene DnaE de Nostoc punctíforme (consultar Iwai, et al. , (2006) FEBS

Lett. 580(7):1853 a 1858). As inteínas não divididas foram artificialmente divididas no laboratório para criar inteínas divididas novas, por exemplo: a inteína DnaB Ssp artificialmente dividida (consultar, Wu, et al. , (1998)

Biochim Biophys Acta. 1387:422 a 432) e inteína See VMA dividida (consultar, Brenzel, et al., (2006) Biochemistry. 45(6) :1571 a 1578) e uma mini-inteína fúngica dividida artificialmente (consultar, Elleuche, et al. , (2007) Biochem Biophys Res Commun. 355(3):830 a 834). Também há bancos de dados de inteína disponíveis que catalogam inteínas conhecidas (consultar, por exemplo, o banco de dados online disponível em:

bioinformatics.weizmann.ac.il/~pietro/inteins/Inteinstable .html, que pode ser acessado pela world-wide web com o uso do prefixo www).

[0057] As inteínas não divididas de ocorrência natural podem ter endonuclease ou outras atividades enzimáticas que podem ser tipicamente removidas durante a projeção de uma inteína artificialmente dividida. Tais mini-inteínas ou

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29/163 inteínas divididas minimizadas são bem conhecidas na técnica e têm tipicamente menos de 200 resíduos de aminoácido de comprimento (consultar, Wu, et al. , (1998) Biochim Bíophys Acta. 1387:422 a 432). As inteínas divididas adequadas podem ter outros elementos de polipeptídeo que habilitam purificação adicionados à sua estrutura, visto que tais elementos não inibem a união da inteína dividida ou são adicionados de maneira que permita que os mesmos sejam removidos antes da união. A união de proteína foi relatada com o uso de proteínas que compreendem domínios semelhantes à inteína bacteriana (BIL) (consultar Amitai, et al. , (2003) Mol Microbiol. 47:61 a 73) e domínios de autoprocessamento de porco-espinho (porco) (o posterior é combinado com inteínas quando em referência à superfamília porco/inteína ou família HINT (consultar Dassa, et al. , (2004) J Biol Chem. 279:32001 a 32007) e domínios como esses também podem ser usados para preparar inteínas artificialmente divididas. Em particular, os membros de não união de tais famílias podem ser modificados por metodologias de biologia molecular para introduzir ou restaurar a atividade de união em tais espécies relacionadas. Os estudos recentes demonstram que a união pode ser observada quando é permitido que um componente de inteína dividida terminal N reaja com um componente de inteína dividida terminal C não encontrado na natureza para ser seu parceiro; por exemplo, a união foi observada com a utilização de parceiros que têm de 30 a 50% de homologia com o parceiro de união natural (consultar, Dassa, et al., (2007) Biochemistry. 46(1):322 a 330). Outras tais misturas de parceiros de inteína dividida divergentes se demonstraram não reativos entre si (consultar, Brenzel, et al. , (2006)

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Biochemistry. 45(6):1571 a 1578). Entretanto, está dentro da habilidade de uma pessoa versada na técnica relevante determinar a possibilidade de um par particular de polipeptídeos se poder associar um ao outro para fornecer uma inteína funcional com o uso de métodos de rotina e sem o exercício da técnica inventiva.

[0058] Em algumas modalidades, o polipeptídeo IPD101 é uma variante permutada circular. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo IPD101 é uma variante permutada circular de qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 32, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, e 60, ou uma variante dos mesmos que tem uma substituição, deleção, adição de aminoácido ou combinações das mesmas. A abordagem usada na criação de sequências novas lembra aquela de pares de ocorrência natural de proteínas que são relacionados por reorganização linear de suas sequências de aminoácidos (Cunningham, et al. , (1979) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 76:3218 a 3222; leather e Erfle, (1990) J. Bacteriol. 172:3837 a 3841; Schimming, et al., (1992) Eur. J. Biochem. 204:13 a 19; Yamiuchi e Minamikawa, (1991) FEES Lett. 260:127 a 130; MacGregor, et al. , (1996) FEES Lett. 378:263 a 266) . Esse tipo de disposição para proteínas foi descrito por Goldenberg e Creighton (J. Mol. Biol. 165:407 a 413, 1983). Na criação de uma variante permutada circular, um terminal N novo é selecionado em um sítio interno (interrupção) da sequência original, a sequência nova que tem a mesma ordem de aminoácidos que a original da interrupção até alcançar um aminoácido que está em ou próximo do terminal C original. Nesse ponto, a sequência nova é unida, diretamente ou através

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31/163 de uma porção adicional de sequência (ligante), a um aminoácido que está em ou próximo do terminal N original e a sequência nova continua com a mesma sequência que a original até alcançar um ponto em que está em ou próxima do aminoácido que foi terminal N ao sítio de interrupção da sequência original, em que esse resíduo forma o terminal C novos da cadeia. 0 comprimento da sequência de aminoácidos do ligante pode ser selecionado empiricamente ou com orientação a partir de informações estruturais ou usando-se uma combinação das duas abordagens. Quando nenhuma informação estrutural está disponível, uma pequena série de ligantes pode ser preparada para teste com o uso de um projeto cujo comprimento é variado a fim de abranger uma o

faixa de 0 a 50 A e cuja sequência é escolhida a fim de ser consistente com a exposição da superfície (hidrofilicidade, Hopp e Woods, (1983) Mol. Immunol. 20:483 a 489; Kyte e Doolittle, (1982) J. Mol. Biol. 157:105 a 132; área superficial exposta a solvente, Lee e Richards, (1971) J. Mol. Biol. 55:379 a 400) e a capacidade para adotar a conformação necessária sem desarranjar a configuração do polipeptídeo pesticida (conformacionalmente flexível; Karplus e Schulz, (1985) Naturwissenschaften 72:212 a 213) .

o

Considerando-se uma média de tradução de 2,0 a 3,8 A por resíduo, isso significaria o comprimento para testar seria entre 0 a 30 resíduos, sendo que 0 a 15 resíduos é a faixa preferencial. Uma exemplificativa de tal série empírica seria construir ligantes com o uso de uma sequência de cassete, como Gly-Gly-Gly-Ser repetida n vezes, em que n é 1, 2, 3 ou 4. Aqueles versados na técnica reconhecerão que há muitas tais sequências que variam em comprimento ou

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32/163 composição que podem servir como ligantes com a consideração primária de que não são excessivamente longas ou curtas (cf., Sandhu, (1992) Critical Rev. Biotech. 12:437 a 462); se foram muito longas, os efeitos de entropia provavelmente desestabilizarão o enovelamento tridimensional e também tornarão o enovelamento cineticamente impraticável, e se forem muito curtas, as mesmas provavelmente desestabilizarão a molécula devido à deformação torcional ou estérica. Aqueles versados na análise de informações estruturais de proteína reconhecerão que o uso da distância entre as extremidades de cadeia, definida como a distância entre carbonos c-alfa, pode ser usado para definir o comprimento da sequência a ser usada ou pelo menos limitar o número de possibilidades que devem ser testadas em uma seleção empírica de ligantes. Os mesmos também reconhecerão que é algumas vezes o caso em que as posições das extremidades da cadeia polipeptídica são mal definidas em modelos estruturais derivados de difração de raio X ou dados de espectroscopia por ressonância magnética nuclear e que, quando verdadeira, essa situação precisará ser, portanto, levada em consideração a fim de estimar apropriadamente o comprimento do ligante exigido. A partir desses resíduos cujas posições são bem definidas, são selecionados dois resíduos que estão próximos em sequência às extremidades de cadeia, e a distância entre seus carbonos c-alfa é usada para calcular um comprimento aproximado para um ligante entre os mesmos. Com o uso do comprimento calculado como um guia, ligantes com uma faixa de número de resíduos (calculada o

com o uso de 2 a 3,8 A por resíduo) são então selecionados. Esses ligantes podem ser compostos da sequência original,

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33/163 encurtada ou alongada conforme necessário, e quando alongados, os resíduos adicionais podem ser escolhidos para serem flexíveis e hidrofílicos conforme descrito acima; ou opcionalmente a sequência original pode ser substituída para uso de uma série de ligantes, em que um exemplo é a abordagem de cassete Gly-Gly-Gly-Ser mencionada acima; ou, opcionalmente, uma combinação da sequência original e da sequência nova que tem o comprimento total apropriado pode ser usada.

[0059] As sequências de polipeptídeos pesticidas com capacidade para enovelar estados biologicamente ativos podem ser preparadas por seleção apropriada das posições de começo (terminal amino) e fim (terminal carboxila) de dentro da cadeia de polipeptídeo original com o uso da sequência ligante, conforme descrito acima. Os terminais amino e carboxila são selecionados de dentro de um estiramento comum de sequência, chamado de região de interrupção, com o uso das diretrizes descritas abaixo. Uma sequência de aminoácidos inovadora é gerada desse modo selecionando-se terminais amino e carboxila dentre a mesma região de interrupção. Em muitos casos, a seleção dos terminais novos será realizada de modo que a posição original do terminal carboxila preceda imediatamente aquela do terminal amino. Entretanto, as pessoas versadas na técnica reconhecerão que as seleções de terminais em qualquer local na região podem funcionar e que as mesmas levarão de modo eficaz a quaisquer deleções ou adições às porções amino ou carboxila da sequência nova. É um princípio central da biologia molecular que a sequência de aminoácidos primária de uma proteína dite o enovelamento para a estrutura tridimensional necessária

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34/163 para a expressão de sua função biológica. Os métodos são bem conhecidos por aqueles versados na técnica para obter e interpretar informações estruturais tridimensionais com o uso de difração de raio X de cristais de proteína únicos ou espectroscopia por ressonância magnética nuclear de soluções de proteína. Os exemplos de informações estruturais que são relevantes para a identificação de regiões de interrupção incluem a localização e o tipo de estrutura secundária de proteína (hélices alfa e 3-10, folhas beta paralelas e antiparalelas, inversões e voltas de cadeia, e laços; Kabsch e Sander, (1983) Biopolymers 22:2577 a 2637); o grau de exposição a solvente de resíduos de aminoácido, a extensão e o tipo de interações de resíduos entre si (Chothia, (1984) Ann. Rev. Biochem. 53:537 a 572) e a distribuição estática e dinâmica de conformações ao longo da cadeia polipeptídica (Alber e Mathews, (1987) Methods Enzymol. 154:511 a 533) . Em alguns casos, as informações adicionais sobre a exposição de solvente de resíduos são conhecidas; um exemplo é um sítio de ligação pós-tradução de carboidrato que está necessariamente na superfície da proteína. Quando as informações estruturais experimentais não estão disponíveis ou não são praticáveis para obter, os métodos também estão disponíveis para analisar a sequência de aminoácidos primária a fim de fazer previsões de estrutura terciária e secundária de proteína, acessibilidade de solvente e a ocorrência de voltas e laços. Os métodos bioquímicos também são algumas vezes aplicáveis para determinar empiricamente a exposição de superfície quando métodos estruturais diretos não são praticáveis; por exemplo, com o uso da identificação de sítios de cisão de cadeia que segue a proteólise limitada

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35/163 a fim de inferir exposição de superfície (Gentile e Salvatore, (1993) Eur. J. Biochem. 218:603 a 621). Portanto, com o uso das informações estruturais experimentalmente derivadas ou métodos preditivos (por exemplo, Srinivisan e Rose, (1995) Proteins: Struct., Funct. & Genetics 22:81 a 99) , a sequência de aminoácidos parentais é inspecionada para classificar regiões de acordo com a possibilidade de serem ou não integrais à manutenção de estrutura secundária e terciária. A ocorrência de sequências dentro de regiões que são conhecidas por serem envolvidas na estrutura secundária periódica (hélices alfa e 3-10, folhas beta paralelas e antiparalelas) são regiões que devem ser evitadas. De modo similar, as regiões de sequência de aminoácidos que são observadas ou previstas por ter um grau baixo de exposição a solvente são mais propensas a serem parte do chamado núcleo hidrofóbico da proteína e também devem ser evitadas para seleção de terminais amino e carboxila. Em contraste, aquelas regiões que são conhecidas ou previstas por estarem em voltas ou laços de superfície, e especialmente aquelas regiões que são conhecidas por não serem exigidas para atividade biológica, são os sítios preferidos para localização dos extremos da cadeia polipeptídica. Os estiramentos contínuos de sequência de aminoácidos que são preferidos com base nos critérios acima são chamados de região de interrupção. Os polinucleotídeos que codificam polipeptídeos IPD101 permutados circulares com novos terminal N/terminal C que contêm uma região de ligante que separa o terminal C e terminal N originais podem ser produzidos essencialmente seguindo o método descrito em Mullins, et al., (1994) J. Am. Chem. Soc. 116:5529 a 5533.

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As múltiplas etapas de amplificações de reação em cadeia de polimerase (PCR) são usadas para reorganizar a sequência de DNA codificadora da sequência de aminoácidos primária da proteína. Os polinucleotídeos que codificam polipeptídeos IPD101 permutados circulares com novos terminal N/terminal C que contêm uma região ligante que separa o terminal C e terminal N originais podem ser produzidos com base no método de duplicação em tandem descrito em Horlick, et al., (1992) Protein Eng. 5:427 a 431. A amplificação de reação em cadeia da polimerase (PCR) dos genes de terminal N/terminal C novos é realizada com o uso de DNA modelo duplicado de modo consecutivo.

[0060] Em outra modalidade, proteínas de fusão são fornecidas, as quais incluem em sua sequência de aminoácidos uma sequência de aminoácidos que compreende um polipeptídeo IPD101 da revelação. Os métodos para projeto e construção de proteínas de fusão (e polinucleotídeos codificadores das mesmas) são conhecidos por aqueles versados na técnica. Os polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo IPD101 podem ser fundidos a sequências sinal que irão direcionar a localização do polipeptídeo IPD101 para compartimentos específicos de uma célula procariótica ou eucariótica e/ou direcionar a secreção do polipeptídeo IPD101 das modalidades de uma célula procariótica ou eucariótica. Por exemplo, em E. colí, pode-se desejar direcionar a expressão da proteína ao espaço periplásmico. Os exemplos de sequências de sinal ou proteínas (ou fragmentos das mesmas) às quais o polipeptídeo IPD101 pode ser fundido a fim de direcionar a expressão do polipeptídeo para o espaço periplásmico das bactérias incluem, mas sem limitação, a sequência de sinal

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37/163 pelB, a sequência de sinal de proteína de ligação de maltose (MBP), MBP, a sequência de sinal ompA, a sequência de sinal da subunidade B de enterotoxina termolábil de E. coll periplásmica e a sequência de sinal de fosfatase alcalina. Diversos vetores estão comercialmente disponíveis para a construção de proteínas de fusão que direcionarão a localização de uma proteína, como a série pMAL de vetores (particularmente a série pMAL-p) disponível a partir de New England Biolabs®. Em uma modalidade específica, o polipeptídeo IPD101 pode ser fundido à sequência de sinal de pectato liase pelB para aumentar a eficiência de expressão e purificação de tais polipeptídeos nas bactérias Gramnegativas (consultar, documentos de Patente dos E.U.A. n.^os5.576.195 e 5.846.818). As fusões de peptídeo/polipeptídeo de transição de plastídeo de planta são bem conhecidas na técnica. Os peptídeos de transição de apoplasto, como sinal de secreção de alfa-amilase de arroz ou cevada também são bem conhecidos na técnica. 0 peptídeo de transição de plastídeo é geralmente fundido no terminal N ao polipeptídeo a ser direcionado (por exemplo, o parceiro de fusão). Em uma modalidade, a proteína de fusão consiste essencialmente no peptídeo de transição de plastídeo e no polipeptídeo IPD101 a serem direcionados. Em outra modalidade, a proteína de fusão compreende o peptídeo de transição de plastídeo e o polipeptídeo a ser direcionado. Em tais modalidades, o peptídeo de transição de plastídeo está preferencialmente no terminal N da proteína de fusão. Entretanto, os resíduos de aminoácido adicionais podem ser N-terminais ao peptídeo de transição de plastídeo, visto que a proteína de fusão é pelo menos parcialmente direcionada a um plastídeo. Em uma

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38/163 modalidade específica, o peptídeo de transição de plastídeo está na metade terminal N, no terço terminal N ou no quarto terminal N da proteína de fusão. A maior parte ou todos os peptídeos de transição de plastídeo geralmente são clivados a partir da proteína de fusão com a inserção no plastídeo. A posição de divagem pode variar levemente entre espécies de planta em estágios de desenvolvimento de planta diferentes, como resultado de condições intercelulares específicas ou da combinação particular de peptídeo de transição/parceiro de fusão usado. Em uma modalidade, a divagem de peptídeo de transição de plastídeo é homogênea, de modo que o sítio de divagem seja idêntico em uma população de proteínas de fusão. Em outra modalidade, o peptídeo de transição de plastídeo não é homogêneo, de modo que o sítio de divagem varie em 1 a 10 aminoácidos em uma população de proteínas de fusão. O peptídeo de transição de plastídeo pode ser fundido de modo recombinante a uma segunda proteína em uma de diversas maneiras. Por exemplo, um sítio de reconhecimento de endonuclease de restrição pode ser introduzido na sequência de nucleotídeo do peptídeo de transição em uma posição correspondente à sua extremidade terminal Ceo mesmo ou um sítio compatível pode ser projetado na sequência de nucleotídeo da proteína a ser direcionada em sua extremidade terminal N. Deve-se tomar cuidado na projeção desses sítios para garantir que as sequências de codificação do peptídeo de transição e a segunda proteína sejam mantidas em quadro para permitir a síntese da proteína de fusão desejada. Em alguns casos, pode ser preferencial remover a metionina iniciadora da segunda proteína quanto o sítio de restrição novo é introduzido. A

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39/163 introdução de sítios de reconhecimento de endonuclease de restrição em ambas as moléculas parentes e sua união subsequente através de técnicas de DNA recombinante podem resultar na adição de um ou mais aminoácidos extras entre o peptídeo de transição e a segunda proteína. Isso geralmente não afeta a atividade de direcionamento enquanto o sítio de divagem de peptídeo de transição permanecer acessível e a função da segunda proteína não for alterada pela adição desses aminoácidos extras em seu terminal N. Alternativamente, a pessoa versada na técnica pode criar um sítio de divagem preciso entre o peptídeo de transição e a segunda proteína (com ou sem sua metionina iniciadora) com o uso de síntese de gene (Stemmer, et al., (1995) Gene 164:49 a 53) ou métodos similares. Além disso, a fusão de peptídeo de transição pode incluir intencionalmente os aminoácidos a jusante do sítio de divagem. Os aminoácidos no terminal N da proteína madura podem afetar a habilidade do peptídeo de transição para direcionar proteínas a plastídeos e/ou a eficácia de divagem que segue a importação de proteína. Isso pode ser dependente da proteína a ser direcionada. Consultar, por exemplo, Cornai, et al., (1988) J. Biol. Chem. 263 (29) :15104 a 15109. Em algumas modalidades, o polipeptídeo IPD101 é fundido a um peptídeo sinal heterólogo ou peptídeo de trânsito heterólogo.

[0061] Em algumas modalidades, as proteínas de fusão são fornecidas compreendendo um polipeptídeo IPD101 ou polipeptídeo IPD101 quimérico da revelação representado por uma fórmula selecionada a partir do grupo que consiste em: R¹-L-R², R²-L- R¹, R¹- R² ou R²- R¹

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40/163 em que R¹ é um polipeptídeo IPD101 ou polipeptídeo IPD101 quimérico da revelação e R² é uma proteína de interesse. Em algumas modalidades R¹ e R² são um polipeptídeo IPD101 ou polipeptídeo IPD101 quimérico da revelação. O polipeptídeo R¹ é fundido diretamente ou através de um segmento ligante (L) ao polipeptídeo R². O termo diretamente define fusões nas quais os polipeptídeos são unidos sem um peptídeo ligante. Desse modo, L representa uma ligação química ou segmento polipeptídico ao qual tanto R¹ quanto R² são fundidos em quadro, mais comumente L é um peptídeo linear ao qual R¹ e R² são ligados por ligações amida que ligam o terminal carbóxi de R¹ ao terminal amino de L e o terminal carbóxi de L ao terminal amino de R². Por fundido em quadro, significa que não há terminação ou interrupção de tradução entre os quadros de leitura de R¹ e R². O grupo ligante (L) é geralmente um polipeptídeo com entre 1 e 500 aminoácidos em comprimento. Os ligantes que unem as duas moléculas são preferencialmente projetados para (1) permitir que as duas moléculas se enovelem e atuem independentemente entre si, (2) não tenham uma propensão para desenvolver uma estrutura secundária ordenada, o que pode interferir nos domínios funcionais das duas proteínas, (3) ter característica hidrofóbica ou carregada mínima que pode interagir com os domínios de proteína funcionais e (4) fornecer separação estérica de R¹ e R², de modo que R¹ e R²possam interagir simultaneamente com seus receptores correspondentes em uma célula única. Tipicamente, os aminoácidos de superfície em regiões de proteína flexíveis incluem Gly, Asn e Ser. Seria esperado que virtualmente qualquer permutação de sequências de aminoácidos que contém

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Gly, Asn e Ser satisfaça os critérios acima para uma sequência ligante. Outros aminoácidos neutros, como Thr e Ala, também podem ser usados na sequência ligante. Os aminoácidos adicionais também podem ser incluídos nos ligantes devido à adição de sítios de restrição únicos na sequência ligante para facilitar a construção das fusões.

[0062] Em algumas modalidades, os ligantes compreendem sequências selecionadas a partir do grupo de fórmulas: (Gly3Ser)n, (Gly4Ser)_n, (GlysSerK, (Gly_nSer)_n ou (AlaGlySer)_nem que n é um número inteiro. Um exemplo de um ligante altamente flexível é a região espaçadora rica em (GlySer) presente dentro da proteína pill dos bacteriófagos filamentosos, por exemplo, bacteriófagos M13 ou fd (Schaller, et al., 1975) . Essa região fornece uma região espaçadora flexível longa entre dois domínios da proteína de superfície pill. Também são incluídos os ligantes nos quais uma sequência de reconhecimento de endopeptidase é incluída. Tal sítio de divagem pode ser valioso para separar os componentes individuais da fusão para determinar se são apropriadamente enovelados e ativos in vitro. Os exemplos de várias endopeptidases incluem, mas sem limitação, Plasmin, Enteroquinase, Calicreína, Uroquinase, Ativador do plasminogênio tecidual, clostripaína, Quimosina, Colagenase, Protease de Veneno de Víbora de Russell, Enzima de divagem pós-prolina, protease V8, Trombina e fator Xa. Em algumas modalidades, o ligante compreende os aminoácidos

EEKKN	(SEQ ID NO:61)	do veículo	de	expressão de múltiplos
genes	(MGEV), que	é clivado	por	proteases	vacudares
conforme revelado na	Publicação	de	Pedido de	Patente dos

E.U.A. n.° 2007/0277263. Em outras modalidades, os segmentos

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42/163 de peptideo ligante da região de articulação de imunoglobulinas de cadeia pesada IgG, IgA, IgM, IgD ou IgE fornecem uma relação angular entre os polipeptídeos ligados. São especialmente úteis aquelas regiões de articulação em que as cisteínas são substituídas por serinas. Ligantes da presente revelação incluem sequências derivadas da região de articulação gama 2b de IgG de murino em que as cisteínas foram mudadas para serinas. As proteínas de fusão não são limitadas pela forma, tamanho ou número de sequências ligantes empregadas e a única exigência do ligante é que não interfere de modo funcional e adverso no enovelamento e função das moléculas individuais da fusão.

Moléculas de Ácido Nucleico e Variantes e Fragmentos das mesmas [0063] As moléculas de ácido nucleico isoladas ou recombinantes que compreendem sequências de ácido nucleico que codificam polipeptídeos IPD101 ou porções biologicamente ativas dos mesmos, assim como moléculas de ácido nucleico suficientes para uso como sondas de hibridização para identificar moléculas de ácido nucleico que codificam as proteínas com regiões de homoiogia de sequência são fornecidas. Conforme usado no presente documento, o termo molécula de ácido nucleico se refere a moléculas de DNA (por exemplo, DNA recombinante, cDNA, DNA genômico, DNA plastídeo, DNA mitocondrial) e moléculas de RNA (por exemplo, mRNA) e análogos do DNA ou RNA gerado com o uso de análogos de nucleotídeo. A molécula de ácido nucleico pode ser de fita única ou de fita dupla, mas preferencialmente é DNA de fita dupla.

[0064] Uma molécula de ácido nucleico isolada (ou DNA)

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43/163 é usada no presente documento para se referir a uma sequência de ácido nucleico (ou DNA) que não está mais em seu ambiente natural, por exemplo, in vitro. Uma molécula de ácido nucleico recombinante (ou DNA) é usada no presente documento para se referir a uma sequência de ácido nucleico (ou DNA) que está em uma célula hospedeira de planta ou bacteriana recombinante. Em algumas modalidades, um ácido nucleico isolado ou recombinante está livre de sequências (preferencialmente sequências codificadoras de proteína) que flanqueiam naturalmente o ácido nucleico (isto é, sequências localizadas nas extremidades 5' e 3' do ácido nucleico) no DNA genômico do organismo a partir do qual o ácido nucleico é derivado. Com propósitos da revelação,

isolado	ou	recombinante quando	usado	se refere a
moléculas	de	ácido nucleico que	excluem	cromossomos
isolados.	Por	exemplo, em várias modalidades,	a moléculas

de ácido nucleico recombinante que codifica os polipeptídeos IPD101 pode conter menos que cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb ou 0,1 kb de sequências de ácido nucleico que flanqueiam naturalmente a molécula de ácido nucleico no DNA genômico da célula a partir da qual o ácido nucleico é derivado.

[0065] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica polipeptídeos IPD101 tem uma ou mais alterações na sequência de ácido nucleico em comparação com a sequência de ácido nucleico nativa ou genômica. Em algumas modalidades, a mudança na sequência de ácido nucleico nativo ou genômico inclui, mas sem limitação: mudanças na sequência de ácido nucleico devido à degeneração do código genético; mudanças na sequência de ácido nucleico

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44/163 devido à substituição, inserção, deleção e/ou adição de aminoácido em comparação à sequência nativa ou genômica; remoção de um ou mais introns; deleção de uma ou mais regiões regulatórias a montante ou a jusante; e deleção da região não traduzida 5' e/ou 3' associada à sequência de ácido nucleico genômico. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo IPD101 é uma sequência não genômica.

[0066] Uma variedade de polinucleotídeos que codificam polipeptídeos IPD101 ou proteínas relacionadas é contemplada. Tais polinucleotídeos são úteis para a produção de polipeptídeos IPD101 em células hospedeiras quando ligados de modo operacional a uma sequência promotora, de terminação de transcrição e/ou de poliadenilação adequada. Tais polinucleotídeos também são úteis como sondas para isolar polinucleotídeos homólogos ou substancialmente homólogos gue codificam polipeptídeos IPD101 ou proteínas relacionadas.

Polinucleotídeos que codificam polipeptídeos IPD101 [0067] Uma fonte de polinucleotídeos que codificam polipeptídeos IPD101 ou proteínas relacionadas é uma bactéria Lysíníbacíllus, que pode conter um polinucleotídeo

IPD101 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, ou 23, que codifica um polipeptídeo IPD101 de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, ou 24, respectivamente. Os polinucleotídeos de qualquer uma ou mais dentre as SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 27, 31, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, ou 59, podem ser usados para expressar polipeptídeos IPD101 em hospedeiros bacterianos recombinantes que incluem, porém sem limitação,

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45/163 células hospedeiras bacterianas de Bacillus, Escherichia, Salmonella, Lysinibacillus, Acetobacter, Pseudomonas e Rhizobium. Os polinucleotideos também são úteis como sondas para isolar polinucleotideos homólogos ou substancialmente homólogos gue codificam polipeptídeos IPD101 ou proteínas relacionadas. Tais sondas podem ser usadas para identificar homólogos ou polinucleotideos substancialmente homólogos derivados da espécie Pseudomonas.

[0068] Os polinucleotideos que codificam polipeptídeos IPD101 também podem ser sintetizados de novo a partir de uma sequência de polipeptídeos IPD101. A sequência do gene de polinucleotídeo pode ser deduzida a partir de uma sequência de polipeptídeos IPD101 através do uso do código genético. Os programas de computador, como BackTranslate (GOG™ Package, Acclerys, Inc. San Diego, Califórnia) podem ser usados para converter uma sequência de peptídeos na sequência de nucleotídeo correspondente codificadora do peptídeo. Os exemplos de sequências de polipeptídeos IPD101 que podem ser usadas para obter sequências codificadoras de nucleotídeos correspondentes incluem, porém, sem limitação, os polipeptídeos IPD101 de SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 32, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, e 60. Além disso, sequências de polinucleotideos IPD101 sintéticos da revelação podem ser projetadas de modo a serem expressas em plantas.

[0069] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico gue codifica um polipeptídeo IPD101 é um polinucleotídeo que tem a sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,

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23, 27, 31, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, ou 59, e variantes, fragmentos e complementos das mesmas. Complemento é usado no presente documento para se referir a uma sequência de ácido nucleico que é suficientemente complementar a uma dada sequência de ácido nucleico, de modo que possa hibridizar a dada sequência de ácido nucleico para formar, assim, um duplex estável. Variantes de sequência de polinucleotídeo é usado no presente documento para se referir a uma sequência de ácido nucleico que, exceto pela degeneração do código genético, codifica o mesmo polipeptídeo.

[0070] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codificadora do polipeptídeo IPD101 é uma sequência de ácido nucleico não genômico. Conforme usado no presente documento, uma sequência de ácido nucleico não genômico ou molécula de ácido nucleico não genômico ou polinucleotídeo não genômico se refere a uma molécula de ácido nucleico que tem uma ou mais mudanças na sequência de ácido nucleico em comparação a uma sequência de ácido nucleico nativo ou genômico. Em algumas modalidades, a mudança para uma molécula de ácido nucleico nativa ou genômica inclui, porém sem limitação: mudanças na sequência de ácidos nucleicos devido à degeneração do código genético; otimização da sequência de ácidos nucleicos para expressão em plantas; mudanças na sequência de ácidos nucleicos para introduzir pelo menos uma substituição, inserção, deleção e/ou adição de aminoácido em comparação à sequência nativa ou genômica; remoção de um ou mais introns associados à sequência de ácidos nucleicos genômica; inserção de um ou mais introns heterólogos; deleção de uma ou mais regiões regulatórias a montante ou a jusante associadas à sequência

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47/163 de ácidos nucleicos genômica; inserção de uma ou mais regiões regulatórias a montante ou a jusante heterólogas; deleção da região não traduzida 5' e/ou 3' associada à sequência de ácidos nucleicos genômica; inserção de uma região não traduzida 5' e/ou 3' heteróloga; e modificação de um sítio de poliadenilação. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não genômico é uma sequência de ácido nucleico sintético.

[0071] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo IPD101 revelado no presente documento é um polinucleotídeo não genômico que tem

uma	sequência de nucleotídeos que	tem	pelo menos	50%,	51%,
52%	, 53%, 54%, 55%,	56%,	57%, 58%,	59%,	60%, 61%,	62%,	63%,
64%	, 65%, 66%, 67%,	68%,	69%, 70%,	71%,	72%, 73%,	74%,	75%,
76%	, 77%, 78%, 79%,	80%,	81%, 82%,	83%,	84%, 85%,	86%,	87%,
88%	, 89%, 90%, 91%,	92%,	93%, 94%,	95%	, 96%, 97%,	98%,	99%
ou	mais de identidade com a sequência	de ácidos	nucleicos
de	qualquer uma das	SEQ	ID NOS: 1,	3,	5, 7, 9, 11	, 13,	15,
17,	19, 21, 23, 27,	31,	45, 47, 49	, 51	, 53, 55, 57, ou	59,
sendo que o polipeptídeo	IPD101 tem atividade inseticida.

[0072] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica uma variante do polipeptídeo IPD101 que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos na sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 2,

4, 6, 8,	10, 12,	14,	16, 18,	20,	22, 24, 25,	26, 28, 29, 30,
32, 46,	48, 50,	52,	54, 56,	58,	e 60 .
[0073]	Também	são	fornecidas	moléculas de	ácido nucleico

que codificam produtos de transcrição e/ou tradução que são subsequentemente unidos para produzir finalmente polipeptídeos IPD101 funcionais. A união pode ser alcançada

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48/163 in vitro ou in vivo, e pode envolver unir cis ou trans. 0 substrato para unir pode ser polinucleotídeos (por exemplo, transcritos de RNA) ou polipeptídeos. Um exemplo de união cis de um polinucleotídeo é quando um intron inserido em uma sequência de codificação é removido e as duas regiões de éxon de flanqueamento são unidas para gerar uma sequência de codificação de polipeptídeo IPD101. Um exemplo de união trans seria quando um polinucleotídeo é encriptado separando-se a sequência de codificação em dois ou mais fragmentos que podem ser separadamente transcritos e, então, submetidos à união para formar a sequência de codificação pesticida de comprimento completo. 0 uso de uma sequência de aprimoramento de união, a qual pode ser introduzida em um construto, pode facilitar a união na união em cis ou trans de polipeptídeos (Patentes dos E.U.A. n.^os 6.365.377 e 6.531.316). Desse modo, em algumas modalidades, os polinucleotídeos não codificam diretamente um polipeptídeo IPD101 de comprimento total, mas, ao invés disso, codificam um fragmento ou fragmentos de um polipeptídeo IPD101. Esses polinucleotídeos podem ser usados para expressar um polipeptídeo IPD101 funcional através de um mecanismo que envolve união, em que a união pode ocorrer no nível do polinucleotídeo (por exemplo, íntron/éxon) e/ou do polipeptídeo (por exemplo, inteína/exteína). Isso pode ser útil, por exemplo, no controle de expressão de atividade pesticida, visto que um polipeptídeo pesticida funcional será apenas expresso se todos os fragmentos exigidos forem expressos em um ambiente que permite os processos de união para gerar o produto funcional. Em outro exemplo, a introdução de uma ou mais sequências de inserção em um

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49/163 polinucleotídeo pode facilitar a recombinação com um polinucleotídeo de homologia baixa; o uso de um intron ou inteína para a sequência de inserção facilita a remoção da sequência interveniente, restaurando, assim, a função da variante codificada.

[0074] As moléculas de ácido nucleico que são fragmentos dessas sequências de ácido nucleico que codificam polipeptídeos IPD101 também são abrangidas pelas modalidades. Fragmento, conforme usado no presente documento, se refere a uma porção da sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo IPD101. Um fragmento de uma sequência de ácido nucleico pode codificar uma porção biologicamente ativa de um polipeptídeo IPD101 ou o mesmo pode ser um fragmento que pode ser usado como uma sonda de hibridização ou iniciador PCR com o uso de métodos revelados abaixo. As moléculas de ácido nucleico são fragmentos de uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo IPD101 compreendem pelo menos cerca de 150, 180, 210, 240, 270, 300, 330, 360, 400, 450 ou 500, nucleotídeos contíguos ou até o número de nucleotídeos presentes em uma sequência de ácido nucleico de comprimento total que codifica um polipeptídeo IPD101 revelado no presente documento, dependendo do uso pretendido. Nucleotídeos contíguos é usado no presente documento para se referir a resíduos de nucleotídeo que são imediatamente adjacentes um ao outro. Os fragmentos das sequências de ácido nucleico das modalidades codificarão fragmentos de proteína que retêm a atividade biológica do polipeptídeo IPD101 e, por isso, retêm a atividade inseticida. Retém atividade inseticida é usado no presente documento para se referir a um

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50/163 polipeptídeo que tem pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70%, 80%, 90%, 95% ou mais da atividade inseticida de qualquer um dos polipeptídeos IPD101 de comprimento total apresentados nas SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 32, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, e 60. Em algumas modalidades, a atividade inseticida é contra uma espécie de Lepidópteros. Em uma modalidade, a atividade inseticida é contra uma espécie de Coleópteros. Em algumas modalidades, a atividade inseticida é contra uma ou mais pragas de insetos do complexo de lagarta da raiz do milho: Lagarta da Raiz do Milho, Diabrotáca vírgífera; lagarta da raiz do milho setentrional, D. barberí: verme da raiz do milho do sul ou broca-de-raiz; Diabrotáca undecímpunctata howardí, Diabrotáca speciosa e o verme de raiz do milho mexicano, D. virgifera zeae. Em uma modalidade, a atividade inseticida é contra uma espécie de Diabrotica.

[0075] Em algumas modalidades, o polipeptídeo IPD101 é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos suficientemente homóloga a qualquer uma das sequências de ácidos nucleicos de SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 27, 31, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, ou 59.

[0076]	Para	determinar	a	identidade	percentual	de	duas
sequências	de	aminoácidos	ou	das duas	sequências	de	ácido
nucleico,	as	sequências	são	alinhadas	aos propósitos de

comparação ideais. A identidade percentual entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (isto é, identidade percentual = número de posições idênticas/número total de posições (por exemplo, posições em sobreposição)χ100). Em

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51/163 uma modalidade, as duas sequências têm o mesmo comprimento. Em outra modalidade, a comparação é por toda a totalidade da sequência de referência (por exemplo, pela totalidade da SEQ ID NO: 1). A identidade percentual entre duas sequências pode ser determinada com o uso de técnicas similares àquelas descritas abaixo, com ou sem permitir vãos. Ao calcular a identidade percentual, geralmente combinações exatas são contadas.

[0077] Outro exemplo não limitante de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo de Needleman e Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443 a 453, usou software GAP Versão 10 para determinar a identidade de sequência ou similaridade com o uso dos seguintes parâmetros padrão: % de identidade e % de similaridade para uma sequência de ácido nucleico com o uso de GAP Peso de 50 e Peso de Comprimento de 3, e a matriz de pontuação de nwsgapdna. cmpii; % de identidade ou % de similaridade para uma sequência de aminoácidos com o uso de Peso de GAP de 8 e peso de comprimento de 2 e o programa de pontuação BLOSUM62. Os programas equivalentes podem também ser usados. Programa equivalente é usado no presente documento para se referir a qualquer programa de comparação de sequência que, para quaisquer duas sequências em questão, gera um alinhamento que tem combinações de resíduo de nucleotídeo idênticas e uma identidade de sequência percentual idêntica quando em comparação com o alinhamento correspondente gerado por GAP Versão 10.

[0078] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo IPD101 codifica um polipeptídeo IPD101 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%,

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83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade através de todo o comprimento da sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 32, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, e 60 .

[0079] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos são fornecidos codificando polipeptídeos quiméricos que compreendem regiões de pelo menos dois polipeptídeos IPD101 diferentes da revelação.

[0080] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos são fornecidos codificando polipeptídeos quiméricos que compreendem uma região N-terminal de um primeiro polipeptídeo IPD101 da revelação fundida de modo operacional a uma região C-terminal de um segundo polipeptídeo IPD101 da revelação.

[0081] As modalidades também abrangem moléculas de ácido nucieico que codificam variantes de polipeptídeo IPD101. Variantes das sequências de ácido nucieico que codificam polipeptídeo IPD101 incluem aquelas sequências que codificam os polipeptídeos IPD101 revelados no presente documento, mas que diferem conservadoramente devido à degenerescência do código genético assim como aquelas que são suficientemente idênticas conforme discutido acima. As variantes alélicas de ocorrência natural podem ser identificadas com o uso de técnicas de biologia molecular conhecidas, tais como reação em cadeia da polimerase (PCR) e técnicas de hibridização conforme delineado acima. As sequências de ácido nucieico variantes também incluem sequências de ácido nucieico sinteticamente derivadas que foram geradas, por exemplo, com

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53/163 o uso de mutagênese sitio-dirigida, mas que ainda codificam os polipeptídeos IPD101 revelados conforme discutido abaixo.

[0082] A presente revelação fornece polinucleotideos isolados ou recombinantes que codificam qualquer um dos polipeptídeos IPD101 revelados no presente documento. Aqueles indivíduos que têm habilidade comum na técnica irão observar prontamente que, devido à degenerescência do código genético, existe uma multiplicidade de sequências de nucleotídeos que codificam polipeptídeos IPD101 da presente revelação.

[0083] 0 perito na técnica irá observar que mudanças podem ser introduzidas por mutação das sequências de ácido nucleico o que leva a mudanças na sequência de aminoácidos dos polipeptídeos de IPD101 codificados, sem alterar a atividade biológica das proteínas. Portanto, as moléculas de ácido nucleico variantes podem ser criadas introduzindose uma ou mais substituições, adições e/ou exclusões de nucleotídeo nas sequências de ácido nucleico correspondentes reveladas no presente documento, de modo que uma ou mais substituições, adições ou exclusões de aminoácido sejam introduzidas na proteína codificada. As mutações podem ser introduzidas por técnicas padrão, como mutagênese sítiodirigida e mutagênese mediada por PCR. Tais sequências de ácido nucleico variante são também englobadas pela presente revelação.

[0084] Alternativamente, as sequências de ácido nucleico variante podem ser feitas introduzindo-se mutações aleatoriamente ao longo de toda ou parte da sequência de codificação, como por mutagênese por saturação, e os mutantes resultantes podem ser triados para a habilidade para conferir atividade pesticida para identificar mutantes

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54/163 que retêm atividade. Após a mutagênese, a proteína codificada pode ser expressa de modo recombinante e a atividade da proteína pode ser determinada com o uso de técnicas de ensaio padrão.

[0085] Os polinucleotídeos da revelação e fragmentos dos mesmos são opcionalmente usados como substratos para uma variedade de reações de recombinação e recombinação recursiva, além de métodos de clonagem padrão, conforme estabelecido em, por exemplo, Ausubel, Berger e Sambrook, isto é, para produzir homólogos de polipeptídeo pesticida adicionais e fragmentos dos mesmos com propriedades desejadas. Uma variedade de tais reações é conhecida. Métodos para produzir uma variante de qualquer ácido nucleico listado no presente documento que compreende recombinar recursivamente tal polinucleotídeo com um segundo (ou mais) polinucleotídeo, formando, assim, uma biblioteca de polinucleotídeos variantes são também modalidades da revelação, assim como as bibliotecas produzidas, as células que compreendem as bibliotecas e qualquer polinucleotídeo recombinante produzido por tais métodos. Adicionalmente, tais métodos compreendem opcionalmente selecionar um polinucleotídeo variante de tais bibliotecas com base na atividade pesticida, em que tal combinação recursiva é feita in vitro ou in vivo.

[0086] Uma variedade de protocolos geradores de diversidade, incluindo protocolos de recombinação recursiva de ácido nucleico, estão disponíveis e completamente descritos na técnica. Os procedimentos podem ser usados separadamente, e/ou em combinação para produzir uma ou mais variantes de um ácido nucleico ou conjunto de ácidos

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55/163 nucleicos, assim como variantes de proteínas codificadas. Individual e coletivamente, esses procedimentos fornecem maneiras amplamente aplicáveis e robustas para gerar ácidos nucleicos diversificados e conjuntos de ácidos nucleicos (incluindo, por exemplo, bibliotecas de ácido nucleico) úteis, por exemplo, para a projeção ou evolução rápida de ácidos nucleicos, proteínas, vias, células e/ou organismos com características novas e/ou melhoradas.

[0087] Embora distinções e classificações sejam feitas no decorrer da discussão por clareza, será notado que as técnicas normalmente não são mutuamente exclusivas. Certamente, os vários métodos podem ser usados unicamente ou em combinação, em paralelo ou em série, para acessar diversas variantes de sequência.

[0088] 0 resultado de qualquer um dos procedimentos de geração de diversidade descritos no presente documento pode ser a geração de um ou mais ácidos nucleicos, os quais podem ser selecionados ou triados para ácidos nucleicos com ou que conferem propriedades desejáveis ou que codificam proteínas com ou que conferem propriedades desejáveis. Após a diversificação por um ou mais dos métodos no presente documento ou disponíveis de outro modo para uma pessoa versada na técnica, quaisquer ácidos nucleicos que são produzidos podem ser selecionados para uma atividade ou propriedade desejada, por exemplo, atividade pesticida ou tal atividade a um pH desejado, etc. Isso pode incluir identificar qualquer atividade que pode ser detectada, por exemplo, em um formato automatizado ou automatizável, por qualquer um dentre os ensaios da técnica, consultar, por exemplo, a discussão de triagem de atividade inseticida,

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56/163 infra. Uma variedade de propriedades relacionadas (ou até mesmo não relacionadas) pode ser avaliada, em série ou em paralelo, a critério do praticante.

[0089] As descrições de uma variedade de procedimentos de geração de diversidade para gerar sequências de ácido nucleico modificado, por exemplo, aquelas que codificam polipeptídeos que têm atividade pesticida ou fragmentos dos mesmos, são encontradas nas publicações a seguir e nas referências citadas nas mesmas: Soong, et al. , (2000) Nat Genet 25(4):436 a 439; Stemmer, et al., (1999) Tumor Targeting 4:1 a 4; Ness, et al. , (1999) Nat Biotechnol 17:893 a 896; Chang, et al., (1999) Nat Biotechnol 17:793 a 797; Minshull e Stemmer, (1999) Curr Opin Chem Biol 3:284 a 290; Christians, et al., (1999) Nat Biotechnol 17:259 a 264; Crameri, et al. , (1998) Nature 391:288 a 291; Crameri, et al. , (1997) Nat Biotechnol 15:436 a 438; Zhang, et al. , (1997) PNAS USA 94:4504 a 4509; Patten, et al., (1997) Curr

Opin Biotechnol 8:724 a 733; Crameri, et al., (1996) Nat Med 2:100 a 103; Crameri, et al., (1996) Nat Biotechnol 14:315 a 319; Gates, et al. , (1996) J Mol Biol 255:373 a 386;

Stemmer, (1996) Sexual PGR and Assembly PGR em: The Encyclopedia of Molecular Biology. VCH Publishers, Nova Iorque. páginas 447 a 457; Crameri e Stemmer, (1995) BioTechniques 18:194 a 195; Stemmer, et al. , (1995) Gene, 164:49 a 53; Stemmer, (1995) Science 270: 1510; Stemmer, (1995) Bio/Technology 13:549 a 553; Stemmer, (1994) Nature 370:389 a 391 e Stemmer, (1994) PNAS USA 91:10747 a 10751.

[0090] Os métodos mutacionais de geração de diversidade incluem, por exemplo, mutagênese direcionada a local (Ling, et al., (1997) Anal Biochem 254(2):157 a 178; Dale, et al.,

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57/163 (1996) Methods Mol Biol 57:369 a 374; Smith, (1985) Ann Rev Genet 19:423 a 462; Botstein and Shortle, (1985) Science 229:1.193 a 1201; Carter, (1986) Biochem J 237:1 a 7 e Kunkel, (1987) The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis em Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein and Lilley, eds., Springer Verlag, Berlin)); mutagênese com o uso de modelos que contêm uracil (Kunkel, (1985) PNAS EUA 82:488 a 492; Kunkel, et al., (1987) Methods Enzymol 154:367 a 382 e Bass, et al., (1988) Science 242:240 a 245); mutagênese direcionada a oligonucleotideo (Zoller e Smith, (1983) Methods Enzymol 100:468 a 500; Zoller e Smith, (1987) Methods Enzymol 154:329 a 350 (1987); Zoller e Smith, (1982) Nucleic Acids Res 10:6.487 a 6.500), mutagênese de DNA modificada por fosforotioato (Taylor, et al., (1985) Nucl Acids Res 13:8.749 a 8.764; Taylor, et al., (1985) Nucl Acids Res 13:8.765 a 8.787 (1985); Nakamaye e Eckstein, (1986) Nucl Acids Res 14:9.679 a 9.698; Sayers, et al., (1988) Nucl Acids Res 16:791 a 802 e Sayers, et al., (1988) Nucl Acids Res 16:803 a 814); mutagênese com o uso de DNA dúplex incompleto (Kramer, et al., (1984) Nucl Acids Res 12:9.441 a 9.456; Kramer e Fritz, (1987) Methods Enzymol 154:350 a 367; Kramer, et al., (1988) Nucl Acids Res 16:7.207 e Fritz, et al., (1988) Nucl Acids Res 16:6.987 a 6.999).

[0091] Os métodos adequados adicionais incluem reparo de ponto de emparelhamento errôneo (Kramer, et al. , (1984) Cell 38:879 a 887), mutagênese com o uso de cepas hospedeiras deficientes de reparo (Carter, et al., (1985) Nucl Acids Res 13:4431 a 4443 e Carter, (1987) Methods in Enzymol 154:382 a 403), mutagênese por deleção (Eghtedarzadeh e Henikoff, (1986) Nucl Acids Res 14:5115), seleção de restrição e

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58/163 purificação de restrição (Wells, et al., (1986) Phil Trans R Soc Lend A 317:415 a 423), mutagênese por síntese de gene total (Nambiar, et al. , (1984) Science 223:1.299 a 1.301; Sakamar e Khorana, (1988) Nucl Acids Res 14:6.361 a 6.372; Wells, et al., (1985) Gene 34:315 a 323 e Grundstrom, et al., (1985) Nucl Acids Res 13:3.305 a 3.316), reparo de quebra em fita dupla (Mandecki, (1986) PNAS USA, 83:7.177 a 7.181 e Arnold, (1993) Curr Opin Biotech 4:450 a 455). Os detalhes adicionais de muitos dentre os métodos acima podem ser encontrados em Methods Enzymol Volume 154, que também descreve os controles úteis para a resolução de problemas com vários métodos de mutagênese.

[0092] Os detalhes adicionais em relação a vários métodos geradores de diversidade podem ser encontrados nas Patentes dos E.U.A., Pedidos e publicações PCT e publicações EPO a seguir: Patente dos E.U.A. n.° 5.723.323, Patente dos E.U.A. n.° 5.763.192, Patente dos E.U.A. n.° 5.814.476, Patente dos E.U.A. n.° 5.817.483, Patente dos E.U.A. n.° 5.824.514,

Patente dos	E.U.A. n.	° 5.976	.862, Patente dos E.U	.A.	n. °
5.605.793,	Patente dos E.U.A,	. n.° 5.811.	238, Patente	dos
E.U.A. n.°	5.830.721,	Patent	e dos E.U.A	. n.° 5.834.	252,
Patente do	s E.U.A.	n. ° 5.	837.458, documento	n. °	WO
1995/22625,	documento	n. ° WO	1996/33207,	documento	n.	° WO
1997/20078,	documento	n. ° WO	1997/35966,	documento	n.	° WO
1999/41402,	documento	n. ° WO	1999/41383,	documento	n.	° WO
1999/41369,	documento	n. ° WO	1999/41368,	documento	n.	° EP
752008, documento n.	EP	1012670, documento	n. °	WO
1999/23107,	documento	n. ° WO	1999/21979,	documento	n.	° WO
1998/31837,	documento	n. ° WO	1998/27230,	documento	n.	° WO
1998/27230,	documento	n. ° WO	2000/00632,	documento	n.	° WO

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59/163

2000/09679,	documento	n. °	WO	1998/42832,	documento	n. °	WO
1999/29902,	documento	n. °	WO	1998/41653,	documento	n. °	WO
1998/41622,	documento	n. °	WO	1998/42727,	documento	n. °	WO
2000/18906,	documento	n. °	WO	2000/04190,	documento	n. °	WO
2000/42561,	documento	n. °	WO	2000/42559,	documento	n. °	WO
2000/42560,	documento	n. °	WO	2001/23401	e documento	n. °

PCT/US01/Ο 6775.

[0093] As sequências de nucleotídeos das modalidades podem também ser usadas para isolar as sequências correspondentes de uma fonte bacteriana, incluindo, porém sem limitação, uma espécie Pseudomonas. Dessa maneira, os métodos, como PCR, hibridização e semelhantes podem ser usados para identificar tais sequências com base em sua homologia de sequência às sequências estabelecidas no presente documento. As sequências que são selecionadas com base em sua identidade de sequência com as sequências inteiras estabelecidas no presente documento ou com os fragmentos das mesmas são abrangidas pelas modalidades. Tais sequências incluem sequências que são ortólogas das sequências reveladas. O termo ortólogos se refere a genes derivados de um gene ancestral comum e que são encontrados em espécies diferentes como resultado da especiação. Os genes encontrados em espécies diferentes são considerados ortólogos guando suas sequências de nucleotídeo e/ou suas sequências de proteínas codificadas compartilham identidade substancial, conforme definido em outra parte no presente documento. As funções de ortólogos são muitas vezes altamente conservadas dentre as espécies.

[0094] Em uma abordagem de PCR, os iniciadores de oligonucleotídeo podem ser projetados para o uso em reações

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60/163 de PCR para amplificar sequências de DNA correspondentes a partir de cDNA ou DNA genômico extraído de qualquer organismo de interesse. Métodos para projetar iniciadores de PCR e clonagem de PCR são geralmente conhecidos na técnica e são revelados em Sambrook, et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2^a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nova Iorque), mais adiante no presente documento, Sambrook. Também consultar Innis, et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nova Iorque); Innis e Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nova Iorque); e Innis e Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nova Iorque). Os métodos conhecidos de PCR incluem, mas sem limitação, métodos que usam iniciadores emparelhados, iniciadores encaixados, iniciadores específicos únicos, iniciadores degenerados, iniciadores específicos de gene, iniciadores específicos de vetor, iniciadores com emparelhamento parcialmente errôneo e semelhantes.

[0095] Para identificar polipeptídeos de IPD101 potenciais de coleções bacterianas, os lisados de célula bacteriana podem ser triados com anticorpos gerados contra polipeptídeos IPD101 com o uso de métodos Western blotting e/ou ELISA. Esse tipo de ensaio pode ser realizado em um modo de alto rendimento. As amostras positivas podem ser adicionalmente analisadas por várias técnicas, como purificação e identificação de proteína com base em anticorpos. Os métodos para gerar anticorpos são bem conhecidos na técnica, conforme discutido abaixo.

[0096] Alternativamente, o método de identificação de proteína baseado em espectrometria de massa pode ser usado

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61/163 para identificar homólogos de polipeptídeos IPD101 com o uso de protocolos nas literaturas (Scott Patterson, (1998), 10.22, 1 a 24, Current Protocol in Molecular Biology publicado por John Wiley & Son Inc.). Especificamente, o método de identificação de proteína com base em LC-MS/MS é usado para associar os dados de MS de determinado lisado celular ou amostras enriquecidas com peso molecular desejado (excisadas do gel de SDS-PAGE de bandas de peso molecular relevante para polipeptídeos IPD101) com informações de sequência de um polipeptídeo IPD101 revelado no presente documento. Qualquer correspondência em sequências de peptídeos indica o potencial para ter as proteínas homólogas nas amostras. As técnicas adicionais (purificação de proteína e biologia molecular) podem ser usadas para isolar a proteína e identificar as sequências dos homólogos.

[0097] Em métodos de hibridização, toda ou parte da sequência de ácido nucleico pesticida pode ser usada para triar cDNA ou bibliotecas genômicas. Métodos para construção de tais bibliotecas de cDNA e genômicas são geralmente conhecidos na técnica e são revelados em Sambrook e Russell, (2001), supra. As chamadas sondas de hibridização podem ser fragmentos de DNA genômico, fragmentos de cDNA, fragmentos de RNA ou outros oligonucleotídeos e podem ser identificadas com um grupo detectável, como 32P ou qualquer outro marcador detectável, como outros radioisótopos, um composto fluorescente, uma enzima ou um cofator enzimático. As sondas para hibridização podem ser produzidas por meio de identificação de oligonucleotídeos sintéticos com base nas sequências de ácidos nucleicos de codificação de polipeptídeos IPD101 revelada no presente documento.

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Iniciadores de degeneração projetados com base em nucleotídeos conservados ou resíduos de aminoácido nas sequências de ácido nucleico ou sequência de aminoácidos codificada podem adicionalmente ser usados. A sonda compreende tipicamente uma região de sequência de ácidos nucleicos que hibridiza sob condições estringentes a pelo menos cerca de 12, pelo menos cerca de 25, pelo menos cerca de 50, 75, 100, 125, 150, 175 ou 200 nucleotídeos consecutivos de sequências de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos IPD101 da revelação ou um fragmento ou variante dos mesmos. Os métodos para a preparação de sondas para condições de estringência e hibridização são geralmente conhecidos na técnica e são revelados em Sambrook e Russell, (2001), supra, incorporado no presente documento a título de referência.

[0098] Por exemplo, toda uma sequência de ácido nucleico, que codifica um polipeptídeo IPD101, revelada no presente documento ou uma ou mais porções da mesma podem ser usadas como uma sonda com capacidade para hibridizar especificamente as sequências de ácido nucleico correspondentes que codificam sequências do tipo polipeptídeo IPD101 e RNAs mensageiros. Para alcançar a hibridização específica sob uma variedade de condições, tais sondas incluem sequências que são únicas e têm preferencialmente pelo menos cerca de 10 nucleotídeos em comprimento ou pelo menos cerca de 20 nucleotídeos em comprimento. Tais sondas podem ser usadas para amplificar sequências pesticidas correspondentes a partir de um organismo escolhido por PCR. Essa técnica pode ser usada para isolar sequências de codificação adicionais a partir

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63/163 de um organismo desejado ou como um ensaio diagnóstico para determinar a presença de sequências de codificação em um organismo. As técnicas de hibridização incluem triagem por hibridização de bibliotecas de DNA plaqueadas (placas ou colônias; consultar, por exemplo, Sambrook, et al. , (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2^a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).

[0099] A hibridização de tais sequências pode ser executada sob condições estringentes. Condições estringentes ou condições de hibridização estringentes é usado no presente documento para se referir a condições sob as quais uma sonda hibridizará a sua sequência direcionada a um grau maior de modo detectável do que outras sequências (por exemplo, pelo menos 2 vezes sobre o fundo). As condições estringentes são dependentes de sequência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. Controlando-se a estringência da hibridização e/ou condições de lavagem, as sequências direcionadas que são 100% complementares à sonda podem ser identificadas (sondagem homóloga). Alternativamente, as condições de estringência podem ser ajustadas para permitir algum desajuste nas sequências de modo que graus menores de similaridade sejam detectados (sondagem heteróloga). Geralmente, uma sonda tem menos de cerca de 1.000 nucleotídeos em comprimento, preferencialmente menos de 500 nucleotídeos em comprimento.

Anticorpos [0100] Os anticorpos para um polipeptídeo IPD101 das modalidades ou para variantes ou fragmentos do mesmo também são abrangidos. Os anticorpos da revelação incluem anticorpos policlonais e monoclonais assim como fragmentos

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64/163 dos mesmos que retêm sua habilidade para se ligar a um polipeptídeo IPD101. Um anticorpo, anticorpo monoclonal ou fragmento do mesmo é dito como tendo capacidade para se ligar a uma molécula se tiver capacidade para reagir especificamente com a molécula para ligar, assim, a molécula ao anticorpo, anticorpo monoclonal ou fragmento do mesmo. 0 termo anticorpo (Ab) ou anticorpo monoclonal (Mab) é destinado a incluir as moléculas intatas, assim como fragmentos ou regiões ligantes ou domínios das mesmas (como, por exemplo, fragmentos Fab e F(ab) .sub. 2) que têm capacidade para ligar hapteno. Tais fragmentos são tipicamente produzidos por divagem proteolítica, como papaína ou pepsina. Alternativamente, os fragmentos de ligação de hapteno podem ser produzidos através da aplicação de tecnologia de DNA recombinante ou através de química sintética. Os métodos para a preparação dos anticorpos da presente revelação são geralmente conhecidos na técnica. Por exemplo, consultar Antibodies, A Laboratory Manual, Ed Harlow e David Lane (eds.) Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1988), assim como as referências citadas no mesmo. Os trabalhos de referência padrão que estabelecem os princípios gerais de imunologia incluem: Klein, J. Immunology: The Science of Cell-Noncell Discrimination, John Wiley & Sons, N.Y. (1982); Dennett, et al., Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, N.Y. (1980) e Campbell, Monoclonal Antibody Technology, In Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13, Burdon, et al., (eds.), Elsevier, Amsterdã (1984) . Também consultar as Patentes dos E.U.A. n.^os 4.196.265; 4.609.893; 4.713.325; 4.714.681;

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4.716.111; 4.716.117 e 4.720.459. Os anticorpos contra polipeptídeos IPD101 ou porções de ligação de antigeno do mesmo podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo metodologia de anticorpo monoclonal convencional, por exemplo, a técnica de hibridização de célula somática padrão de Kohler e Milstein, (1975) Nature 256:495. As outras técnicas para produzir anticorpo monoclonal também podem ser empregadas, como transformação viral ou oncogênica de linfócitos B. Um sistema animal para preparar hibridomas é um sistema murino. Os protocolos e técnicas de imunização para isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são conhecidos na técnica. Os parceiros de fusão (por exemplo, células de mieloma murinas) e procedimentos de fusão também são conhecidos. O anticorpo e anticorpos monoclonais da revelação podem ser preparados utilizando-se um polipeptídeo IPD101 como antígenos.

[0101] Fornece-se um kit para detectar a presença de um polipeptídeo IPD101 ou detectar a presença de uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo IPD101, em uma amostra. Em uma modalidade, o kit fornece reagentes à base de anticorpo para detectar a presença de um polipeptídeo IPD101 em uma amostra de tecido. Em outra modalidade, o kit fornece sondas de ácido nucieico identificadas úteis para detectar a presença de um ou mais polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo IPD101. O kit é fornecido juntamente com reagentes e controles apropriados para executar um método de detecção, assim como instruções para uso do kit.

Identificação e isolamento de receptor [0102] Receptores para os polipeptídeos IPD101 das

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66/163 modalidades ou para variantes ou fragmentos dos mesmos também estão abrangidos. Os métodos para identificar receptores são bem conhecidos na técnica (consultar Hofmann, et. al. , (1988) Eur. J. Biochem. 173:85 a 91; Gill, et al., (1995) J. Biol. Chem. 27.277 a 27.282) e podem ser empregados para identificar e isolar o receptor que reconhece o polipeptídeo IPD101 com o uso das vesículas de membrana de borda em escova de insetos suscetíveis. Além do método de identificação radioativa listado nas literaturas citadas, um polipeptídeo IPD101 pode ser identificado com corante fluorescente e outras identificações comuns, como estreptavidina. Vesículas de membrana de borda em escova (BBMV) de insetos suscetíveis, tais como lagarta falsamedideira e percevejos, podem ser preparadas de acordo com os protocolos listados nas referências de Hofmann e Gill acima e separadas em gel de SDS-PAGE e transferidas para membrana adequada. 0 polipeptídeo IPD101 identificado pode ser incubado com membrana transferida de BBMV e o polipeptídeo IPD101 identificado pode ser identificado com os repórteres identificados. A identificação de banda (ou bandas) de proteína que interage com o polipeptídeo IPD101 pode ser detectada por meio de sequenciamento de fase gasosa de aminoácido de terminal N ou método de identificação de proteína baseado em espectrometria de massa (Patterson, (1998) 10.22, 1 a 24, Current Protocol in Molecular Biology publicado por John Wiley & Son Inc). Uma vez que a proteína é identificada, o gene correspondente pode ser clonado a partir de biblioteca de DNA ou cDNA genômico dos insetos suscetíveis e a afinidade de ligação pode ser medida diretamente com o polipeptídeo IPD101. A função de receptor

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67/163 para atividade inseticida pelo polipeptídeo IPD101 pode ser verificada pelo tipo de RNAi do método de knock-out de gene (Rajagopal, et al. , (2002) J. Biol. Chem. 277:46.849 a 46.851).

Construtos de Nucleotídeo, Cassetes de Expressão e Vetores [0103] 0 uso do termo construtos de nucleotídeo no presente documento não é destinado a limitar as modalidades aos construtos de nucleotídeo que compreendem DNA. Os peritos na técnica reconhecerão que as construções de nucleotídeos, particularmente polinucleotídeos e oligonucleotídeos compostos por ribonucleotídeos e combinações de ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos, podem também ser empregues nos métodos aqui revelados. Os construtos de nucleotídeo, ácidos nucleicos e sequências de nucleotídeo das modalidades abrangem adicionalmente todas as formas complementares de tais construtos, moléculas e sequências. Adicionalmente, os construtos de nucleotídeo, moléculas de nucleotídeo e sequências de nucleotídeo das modalidades abrangem todos os construtos de nucleotídeo, moléculas e sequências que podem ser empregadas nos métodos das modalidades para transformar plantas que incluem, mas sem limitação, aqueles compreendidos de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e combinações dos mesmos. Tais desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos incluem tanto as moléculas de ocorrência natural quanto os análogos sintéticos. Os construtos de nucleotídeo, ácidos nucleicos e sequências de nucleotídeo das modalidades também abrangem todas as formas de construtos de nucleotídeo incluindo, mas sem limitação, formas de fita única, formas de fita dupla, grampos, estruturas de haste e alça e

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68/163 semelhantes .

[0104] Uma modalidade adicional se refere a um organismo transformado, como um organismo selecionado dentre células de planta e inseto, bactérias, levedura, baculovírus, protozoários, nemátodos e algas. O organismo transformado compreende uma molécula de DNA das modalidades, um cassete de expressão que compreende a molécula de DNA ou um vetor que compreende o cassete de expressão, o qual pode ser incorporado de modo estável ao genoma do organismo transformado.

[0105] As sequências das modalidades são fornecidas em construtos de DNA para expressão no organismo de interesse. O construto incluirá sequências regulatórias 5' e 3' ligadas de modo operacional a uma sequência das modalidades. O termo ligado de modo operacional, conforme usado no presente documento, se refere a uma ligação funcional entre um promotor e uma segunda sequência, em que a sequência promotora inicia e medeia a transcrição da sequência de DNA correspondente à segunda sequência. De modo geral, ligado de modo operacional significa que as sequências de ácido nucleico em ligação são contíguas e onde necessário para unir duas regiões de codificação de proteína no mesmo quadro de leitura. O construto pode conter adicionalmente pelo menos um gene adicional a ser cotransformado no organismo. Alternativamente, o gene (genes) adicional(ais) pode(m) ser fornecido(s) em múltiplos construtos de DNA.

[0106] Tal construto de DNA é dotado de uma pluralidade de sítios de restrição para a inserção da sequência de gene de pollpeptídeo IPD101 da revelação estar sob a regulação transcricional das regiões regulatórias. O construto de DNA

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69/163 pode adicionalmente conter genes marcadores selecionáveis.

[0107] 0 construto de DNA incluirá geralmente na direção de 5' a 3' de transcrição: uma região de iniciação de transcrição e tradução (isto é, um promotor), uma sequência de DNA das modalidades, e uma região de terminação de transcrição e de tradução (isto é, região de terminação) funcional no organismo que serve como um hospedeiro. A região de iniciação de transcrição (isto é, o promotor) pode ser nativa, análoga, estranha ou heteróloga ao organismo hospedeiro e/ou à sequência das modalidades. Adicionalmente, o promotor pode ser a sequência natural ou alternativamente uma sequência sintética. O termo estranho conforme usado no presente documento indica que o promotor não é encontrado no organismo nativo no qual o promotor é introduzido. Quando o promotor é estranho ou heterólogo à sequência das modalidades, é pretendido que o promotor não seja nativo ou promotor de ocorrência natural para a sequência ligada de modo operacional das modalidades. Conforme usado no presente documento, um gene quimérico compreende uma sequência de codificação ligada de modo operacional a uma região de iniciação de transcrição que é heteróloga à sequência de codificação. Quando o promotor é uma sequência nativa ou natural, a expressão da sequência operacionalmente ligada é alterada a partir da expressão do tipo selvagem que resulta em uma alteração no fenótipo.

[0108] Em algumas modalidades, o construto de DNA compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo IPD101 das modalidades. Em algumas modalidades, o construto de DNA compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão que compreende um polipeptídeo IPD101 das

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70/163 modalidades .

[0109] Em algumas modalidades, o construto de DNA também pode incluir uma sequência de aprimoramento de transcrição. Conforme usado no presente documento, o termo um aprimorador se refere a uma sequência de DNA que pode estimular a atividade de promotor e pode ser um elemento inato do promotor ou um elemento heterólogo inserido para acentuar o nível ou a especificidade para tecido de um promotor. Vários intensificadores são conhecidos na técnica incluindo, por exemplo, introns com propriedades de intensificação de expressão de gene em plantas (Publicação de Pedido de Patente Número US 2009/0144863, o intron de ubiquitina (isto é, o intron de ubiquitina de mais 1 (consulte, por exemplo, sequência de NCBI S94464)), o intensificador de ômega ou o intensificador de iniciador de ômega (Gallie, et al., (1989) Molecular Biology of RNA ed. Cech (Liss, Nova York) 237 a 256 e Gallie, et al., (1987) Gene 60:217 a 225), o intensificador de CaMV 35S (consulte, por exemplo, Benfey, et al., (1990) EMBO J. 9:1.685 a 1.696) e os intensificadores de Patente número US 7.803.992 também podem ser usados. A lista acima de aprimoradores de transcrição não é destinada a ser limitante. Qualquer aprimorador de transcrição apropriado pode ser usado nas modalidades.

[0110] A região de terminação pode ser nativa com a região de iniciação de transcrição, pode ser nativa com a sequência de DNA de interesse ligada de modo operacional, pode ser nativa com o hospedeiro de planta ou pode ser derivada de outra fonte (isto é, estranha ou heteróloga ao promotor, a sequência de interesse, o hospedeiro de planta ou qualquer

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71/163 combinação dos mesmos).

[0111] As regiões de terminação convenientes estão disponíveis a partir do plasmídeo de Ti de A. tumefaciens, como as regiões de terminação de octopina sintase e nopalina sintase. Também consultar Guerineau, et al. , (1991) Mol.

Gen.	Genet. 262:141	a	144;	Proudfoot, i	(1991)	Cell	64:671 a
67 4;	Sanfacon, et al	• r	(1991) Genes	Dev.	5:141	a 149	; Mogen,
et al	.. , (1990) Plant	Cell	2:1261	a 12	72; Munroe,	et al.,
(1990	) Gene 91:151	a	158;	Ballas,	et	al. , (	1989)	Nucleic
Acids	Res. 17:7891	a	7903	e Joshi,	et	al., (	1987)	Nucleic
Acid	Res. 15:9627 a	9639.

[0112] Quando apropriado, um ácido nucleico pode ser otimizado para a expressão aumentada no organismo hospedeiro. Desse modo, quando o organismo hospedeiro for uma planta, os ácidos nucleicos sintéticos podem ser sintetizados com o uso de códons preferidos de plantas para expressão melhorada. Consultar, por exemplo, Campbell e Gowri, (1990) Plant Physiol. 92:1 a 11 para uma discussão sobre o uso preferido de hospedeiro. Por exemplo, embora as sequências de ácidos nucleicos das modalidades possam ser expressas em espécies de planta tanto monocotiledôneas quanto dicotiledôneas, as sequências podem ser modificadas de modo a representar as preferências específicas e as preferências de teor de GC de monocotiledôneas ou dicotiledôneas, uma vez que se demonstrou que essas preferências diferem (Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477 a 498) . Assim, o mais preferencial para um aminoácido particular pode ser derivado de sequência de genes conhecidas. O uso de mais para 28 genes de plantas de mais é listado na Tabela 4 de Murray, et al., supra. Métodos

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72/163 estão disponíveis na técnica para sintetizar genes preferenciais para plantas. Consultar, por exemplo, Murray, et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17:477 a 498, e Liu H et al. Mol Bio Rep 37:677 a 684, 2010, incorporado ao presente documento a título de referência. Uma tabela de uso de Zea maize pode também ser encontrada em kazusa.ou.jp//cgibin/show.cgi?species=4577, que pode ser acessado com o uso do prefixo www. Uma tabela de uso de Glycine max pode ser

encontrada	em	kazusa.ou.jp//cgi-
bin/show.	cgi?species=3847&aa=l&style^:	=N,	que	pode	ser
acessado	com o uso do	prefixo www.
[0113]	Em algumas	modalidades,	a	molécula	de	ácido
nucleico	recombinante	que codifica	um	polipeptídeo	IPD101
tem códons otimizados	de mais.

[0114] As modificações de sequência adicionais são conhecidas por intensificar a expressão genética em um hospedeiro celular. As mesmas incluem a eliminação de sequências codificadoras de sinais de poliadenilação espúria, sinais de sítio de união de éxon-íntron, repetições semelhantes a transposons e outras sequências bem caracterizadas que podem ser prejudiciais para a expressão de gene. O teor de GC da sequência pode ser ajustado aos níveis médios para um dado hospedeiro celular, conforme calculado em referência a genes conhecidos expressados na célula hospedeira. O termo célula hospedeira, conforme usado no presente documento, se refere a uma célula que contém um vetor e suporta a replicação e/ou expressão do vetor de expressão pretendida. As células hospedeiras podem ser células procarióticas, como E. coli, ou células eucarióticas, como células de levedura, inseto, anfíbio ou

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73/163 mamífero ou células de plantas monocotiledôneas ou dicotiledôneas. Um exemplo de uma célula hospedeira monocotiledônea é uma célula hospedeira de mais. Quando possível, a sequência é modificada para evitar estruturas de mRNA secundárias em grampo previstas.

[0115] Os cassetes de expressão podem conter adicionalmente sequências líder 5'. Tais sequências líder podem atuar para aprimorar a tradução. Os líderes de tradução são conhecidos na técnica e incluem: líderes de picornavírus, por exemplo, líder EMCV (região de não codificação 5' de Encefalomiocardite) (Elroy-Stein, et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:6.126 a 6.130); líderes de potivírus, por exemplo, líder TEV (Vírus Gravado do Tabaco) (Gallie, et al., (1995) Gene 165(2):233 a 238), líder MDMV (Vírus Mosaico Anão de Mais), proteína de ligação de cadeia pesada de imunoglobulina humana (BiP) (Macejak, et al. , (1991) Nature 353:90 a 94); líder não traduzido da proteína mRNA de revestimento de vírus do mosaico da alfafa (AMV RNA 4) (Jobling, et al., (1987) Nature 325:622 a 625); líder de vírus do mosaico do tabaco (TMV) (Gallie, et al., (1989) em Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, Nova Iorque), páginas 237 a 256) e líder de vírus de mancha clorótica do mais (MCMV) (Lommel, et al. , (1991) Virology 81:382 a 385). Também consultar Della-Cioppa, et al., (1987) Plant Physiol. 84:965 a 968. Tais construtos também contêm uma sequência de sinal ou sequência líder para facilitar o transporte de cotradução ou pós-tradução do peptídeo determinadas estruturas intracelulares, como o cloroplasto (ou outro plastídeo), retículo endoplasmático ou aparelho de Golgi.

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74/163 [0116] Sequência de sinal, conforme usado no presente documento, se refere a uma sequência que é conhecida ou que há suspeitas de resultar em transporte de peptídeo de cotradução ou pós-tradução através da membrana de célula. Em eucariotas, isso envolve tipicamente a secreção no aparelho de Golgi com parte resultando em glicosilação. Toxinas inseticidas de bactérias são frequentemente sintetizadas como pró-toxinas que são proteoliticamente ativadas no estômago da praga alvo (Chang, (1987) Methods Enzymol. 153:507-516). Em algumas modalidades, a sequência de sinal está localizada na sequência nativa ou pode ser derivada de uma sequência das modalidades. Sequência líder, conforme usado no presente documento, se refere a qualquer sequência que, quando traduzida, resulta em uma sequência de aminoácidos suficiente para acionar o transporte de cotradução da cadeia peptídica a uma organela subcelular. Desse modo, isso inclui sequências líderes que direcionam o transporte e/ou glicosilação pela passagem no retículo endoplasmático, passagem para vacúolos, plastídeos incluindo cloroplastos, mitocôndrias e semelhantes. As proteínas codificadas nucleares direcionadas ao compartimento de lúmen de tilacoide de cloroplasto têm um peptídeo de transição bipartido característico, composto por um peptídeo sinal de direcionamento estromal e um peptídeo sinal de direcionamento de lúmen. As informações de direcionamento estromal estão na porção aminoproximal do peptídeo de transição. O peptídeo sinal de direcionamento de lúmen está na porção carboxila-proximal do peptídeo de transição e contém todas as informações para direcionamento ao lúmen. A pesquisa recente em proteômica do cloroplasto

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75/163 de planta superior alcançou a identificação de várias proteínas de lúmen codificadas nucleares (Kieselbach et ai. FEES LETT 480:271 a 276, 2000; Peltier et al. Plant Cell 12:319 a 341, 2000; Bricker et al. Biochim. Biophys Acta 1503:350 a 356, 2001), cujo peptídeo sinal de direcionamento de lúmen pode ser potencialmente usado de acordo com a presente revelação. Cerca de 80 proteínas de Arabidopsis, assim como proteínas homólogas de espinafre e ervilha, são relatadas por Kieselbach et al., Photosynthesis Research, 78:249 a 264, 2003. Em particular, a Tabela 2 dessa publicação, a qual está incorporada à descrição do presente documento a título de referência, revela 85 proteínas do lúmen do cloroplasto, identificadas por seu número de acesso (também consultar a Publicação de Pedido de Patente dos E.U.A. n.° 2009/09044298).

[0117] Os peptídeos de transição de cloroplasto (CTP) adequados são bem conhecidos por um indivíduo versado na técnica e também incluem CTs quiméricos que compreendem, mas sem limitação, um domínio N-terminal, um domínio central ou um domínio C-terminal de um CTP de Oryza sativa 1-decoi-D xilose-5-fosfato sintase, Superóxido dismutase de Oryza sativa, amido sintase solúvel em Oryza sativa, enzima de ácido málico dependente de NADP-Oryza sativa, Oryza sativaFosfo-2-deidro-3-deoxiheptonato aldolase 2, Oryza sativa-LAscorbato peroxidase 5, Oryza sativa-fosfoglucano água diquinase, Zea Mays ssRUBISCO, Zea Mays-beta-glucosidase, Zea Mays-malato desidrogenase, triorredoxina tipo M Zea Mays (consultar a Publicação de Pedido de Patente dos E.U.A. n.° 2012/0304336).

[0118] 0 gene de polipeptídeo IPD101 a ser direcionado

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76/163 para o cloroplasto pode ser otimizado para expressão no cloroplasto para responder por diferenças em uso entre o núcleo vegetal e sua organela. Dessa maneira, os ácidos nucleicos de interesse podem ser sintetizados com o uso de sequências preferenciais para cloroplasto.

[0119] No preparo do cassete de expressão, os vários fragmentos de DNA podem ser manipulados de modo a fornecer as sequências de DNA na orientação apropriada e, conforme apropriado, no quadro de leitura apropriado. Para esse fim, os adaptadores ou ligantes podem ser empregados para unir os fragmentos de DNA ou outras manipulações podem ser envolvidas para fornecer sítios de restrição convenientes, remoção de DNA supérfluo, remoção de sítios de restrição ou semelhantes. Com esse propósito, a mutagênese in vitro, o reparo de iniciador, restrição, anelamento, ressubstituições, por exemplo, transições e transversões, podem ser envolvidos.

[0120] Vários promotores podem ser usados na prática das modalidades. Os promotores podem ser selecionados com base no resultado desejado. Os ácidos nucleicos podem ser combinados com promotores constitutivos, preferenciais de tecido, induzíveis ou outros promotores para a expressão no organismo hospedeiro. Os promotores constitutivos adequados para uso em uma célula hospedeira de planta incluem, por exemplo, o promotor de núcleo do promotor Rsyn7 e outros promotores constitutivos revelados no documento n.° WO 1999/43838 e na Patente dos E.U.A. n.° 6.072.050; o promotor CaMV 35S de núcleo (Odell, et al. , (1985) Nature 313:810 a 812); actina de arroz (McElroy, et al., (1990) Plant Cell 2:163 a 171); ubiquitina (Christensen, et al., (1989) Plant

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Mol. Biol. 12:619 a 632 e Christensen, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 18:675 a 689); pEMU (Last, et al., (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581 a 588); MAS (Velten, et al., (1984) EMBO J. 3:2.723 a 2.730); promotor ALS (Patente dos E.U.A. n.° 5.659.026) e semelhantes. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, aqueles discutidos nas Patentes dos E.U.A. n.^os 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; 5.608.142 e 6.177.611.

[0121] Dependendo do resultado desejado, pode ser benéfico expressar o gene a partir de um promotor induzível. Os promotores induzíveis por ferimento são de interesse particular para regular a expressão das sequências de nucleotídeo das modalidades em plantas. Tais promotores induzíveis por ferimento podem responder ao dano causado por alimentação de insetos e incluir o gene de inibidor de proteinase de batata (pin IT) (Ryan, (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28:425 a 449; Duan, et al., (1996) Nature Biotechnology 14:494 a 498); wunl e wun2, Patente dos E.U.A. n.° 5.428.148; winl e win2 (Stanford, et al., (1989) Mol. Gen. Genet. 215:200 a 208); sistemina (McGurl, et al., (1992) Science 225:1570 a 1573); WIP1 (Rohmeier, et al., (1993) Plant Mol. Biol. 22:783 a 792; Eckelkamp, et al., (1993) FEBS Letters 323:73 a 76) ; gene MPI (Corderok, et al., (1994) Plant J. 6(2):141 a 150) e similares.

[0122] Adicionalmente, os promotores induzíveis por patógenos podem ser empregados nos métodos e construtos de nucleotídeo das modalidades. Tais promotores induzíveis por patógeno incluem aqueles de proteínas relacionadas à patogênese (proteínas PR) , que são induzidas em seguida à infecção por um patógeno; por exemplo, proteínas PR,

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78/163 proteínas SAR, beta-1,3-glucanase, quitinase, etc. Consultar, por exemplo, Redolfi, et al. , (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89:245 a 254; Uknes, et al., (1992) Plant Cell 4: 645 a 656 e Van Loon, (1985) Plant Mol. Virol. 4:111 a 116. Consultar também o documento WO 1999/43819.

[0123] São de interesse os promotores que são expressos no local ou próximos ao sítio de infecção de patógeno. Consultar, por exemplo, Marineau, et al., (1987) Plant Mol. Biol. 9:335 a 342; Matton, et al., (1989) Molecular PlantMicrobe Interactions 2:325 a 331; Somsisch, et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2427 a 2430; Somsisch, et al., (1988) Mol. Gen. Genet. 2:93 a 98 e Yang, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14972 a 14977. Também consultar Chen, et al., (1996) Plant J. 10:955 a 966; Zhang, et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2507 a 2511; Warner, et al., (1993) Plant J. 3:191 a 201; Siebertz, et al., (1989) Plant Cell 1:961 a 968; Patente dos E.U.A. n.° 5.750.386 (induzivel por nemátodo) e as referências citadas nos mesmos. É de interesse particular o promotor induzivel para o gene PRms de mais, cuj a expressão é induzida pelo patógeno Fusarium moniliforme (consultar, por exemplo, Cordero, et al., (1992) Physiol. Mol. Plant Path. 41:189 a 2 00) .

[0124] Os promotores regulados quimicamente podem ser utilizados para modular a expressão de um gene em uma planta através da aplicação de um regulador químico exógeno. Dependendo do objetivo, o promotor pode ser um promotor quimicamente induzivel, em que a aplicação da substância química induz a expressão genética ou um promotor quimicamente repressível, em que a aplicação da substância química reprime a expressão genética. Os promotores

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79/163 induzíveis por substância química são conhecidos na técnica e incluem, mas sem limitação, o promotor In2-2 de milho, que é ativado por protetores herbicidas de benzenosulfonamida, sendo que o promotor GST de milho, que é ativado por compostos eletrofílicos hidrofóbicos que são usados como herbicidas pré-emergentes, e o promotor PR-la de tabaco, que é ativado por ácido salicílico. Outros promotores de interesse regulados quimicamente incluem promotores responsivos a esteroides (consultar, por exemplo, o promotor induzível por glicocorticoide em Schena et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:10421 a 10425 e McNeills et al. , (1998) Plant J. 14(2):247 a 257) e promotores induzíveis por tetraciclina e repressíveis por tetraciclina (ver, por exemplo, Gatz et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229 a 237 e Patentes números US 5.814.618 e 5.789.156).

[0125] Os promotores preferenciais de tecido podem ser utilizados para direcionar a expressão de polipeptídeo IPD101 intensificada em um tecido de planta específico. Os promotores preferidos para tecidos incluem aqueles discutidos em Yamamoto, et al., (1997) Plant J. 12(2)255 a 265; Kawamata, et al., (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792 a 803; Hansen, et al., (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337 a 343; Russell, et al., (1997) Transgenic Res. 6(2):157 a 168; Rinehart, et al., (1996) Plant Physiol. 112(3):1331 a 1341; Van Camp, et al., (1996) Plant Physiol. 112(2):525 a 535; Canevascini, et al., (1996) Plant Physiol. 112(2):513 a 524; Yamamoto, et al., (1994) Plant Cell Physiol. 35(5) :773 a 778; Lam, (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181 a 196; Orozco, et al., (1993) Plant Mol Biol. 23(6) :1129 a 1138; Matsuoka, et al., (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA

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90(20):9586 a 9590 e Guevara-Garcia, et al., (1993) Plant J. 4(3) :495 a 505. Tais promotores podem ser modificados, se necessário, para expressão fraca.

[0126] Promotores preferenciais de folha são conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255 a 265; Kwon et al. (1994) Plant Physiol. 105:357 a 367; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773 a 778; Gotor et al. (1993) Plant J. 3:509 a 518; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23(6) :1.129 a 1.138 e Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (20) :9.586 a 9.590.

[0127] Os promotores preferidos para raiz ou específicos de raiz são conhecidos e podem ser selecionados a partir dos muitos disponíveis a partir da literatura ou isolados de novo das várias espécies compatíveis. Consultar, por exemplo, Hire, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 20(2):207 a 218 (gene de glutamina sintetase específico de raiz de soja); Keller e Baumgartner, (1991) Plant Cell 3(10):1051 a 1061 (elemento de controle específico de raiz no gene GRP 1.8 de Vagem); Sanger, et al., (1990) Plant Mol. Biol. 14(3):433 a 443 (promotor específico de raiz do gene de manopina sintase (MAS) de Agrobacterium tumefaciens) e Miao, et al., (1991) Plant Cell 3(1):11 a 22 (glutamina sintetase (GS) citosólica codificadora de clone de cDNA de comprimento completo, a qual é expressa em raízes e nódulos de raiz de soja). Também consultar Bogusz, et al., (1990) Plant Cell 2(7):633 a 641, em que dois promotores específicos de raiz isolados de genes de hemoglobina da não leguminosa de fixação de nitrogênio Parasponia andersonii e a não leguminosa de não fixação de nitrogênio Trema tomentosa são descritos. Os promotores

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81/163 desses genes foram ligados a um gene-repórter de βglucuronidase e introduzidos tanto na não leguminosa Nicotiana tabacum quanto na leguminosa Lotus cornículatus, e em ambos casos a atividade promotora específica de raiz foi preservada. Leach e Aoyagi (1991) descrevem sua análise dos promotores dos genes indutores de raízes de rolC e rolD altamente expressos de Agrobacteríum rhízogenes (consultar, Plant Science (Limerick) 79(1):69 a 76). Os mesmos concluíram que o intensificador e os determinantes de DNA preferíveis de tecido são dissociados naqueles promotores. Teeri, et al., (1989) usaram fusão de gene para lacZ para mostrar que o gene de T-DNA de Agrobacteríum gene codificador de octopina sintase é especialmente ativo na epiderme da ponta de raiz e que o gene de TR2' é específico de raiz na planta intata e estimulado por ferimento no tecido de folha, uma combinação especialmente desejável de características para uso com um gene inseticida ou larvicida (consultar, EMBO J. 8(2):343 a 350). O gene TR1' fundido para nptll (neomicina fosfotransferase II) mostrou características similares. Os promotores preferidos para raiz adicionais

incluem	o promotor	de gene de	VÍENOD-GRP3	(Kuster, et	al. ,
(1995)	Plant Mol.	Biol. 29(4):	759 a	772)	e o promotor	rolB
(Capana	, et al., i	(1994) Plant	Mol.	Biol.	25(4):681 a	691.
Também	consultar	as Patentes	dos	E .U.A	n.⁰³ 5.837	.876;

5.750.386; 5.633.363; 5.459.252; 5.401.836; 5.110.732 e 5.023.179. As sequências regulatórias preferenciais para raiz de Arabidopsis thaliana são reveladas no documento ns US20130117883 .

[0128] Promotores preferenciais de semente incluem tanto promotores específicos de semente (aqueles

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82/163 promotores ativos durante o desenvolvimento de semente tal como promotores de proteínas de armazenamento de semente) assim como promotores de germinação de semente (aqueles promotores ativos durante a germinação de semente). Consulte Thompson et al. , (1989) BioEssays 10:108. Tais promotores preferidos para semente incluem, mas sem limitação, Ciml (mensagem induzida por citoquinina); cZ19Bl (zeína de 19 kDa de mais); e milps (mio-inositol-l-fosfato sintase) (consultar a Patente dos E.U.A. n.° 6.225.529). Gama-zeína e Glb-1 são promotores específicos de endosperma. Para dicotiledôneas, promotores específicos de semente incluem, mas sem limitação, inibidor de tripsina Kunitz 3 (KTÍ3) (Jofuku e Goldberg, (1989) Plant Cell 1:1.079 a 1.101), βfaseolina de feijão, napina, β-conglicinina, glicinina 1, lectina de soja, cruciferina e similares. Para monocotiledôneas, os promotores específicos para semente incluem, porém sem limitação, zeína de 15 kDa de mais, zeína de 22 kDa, zeína de 27 kDa, g-zeina, ceroso, shrunken 1, shrunken 2, globulina 1, etc. Consultar também o documento WO 2000/12733, em que os promotores com preferência para semente de genes endl e end2 são revelados. Em dicotiledôneas, os promotores específicos de semente incluem, mas sem limitação, promotor de revestimento de semente de Arabidopsis, pBAN; e os promotores de semente iniciais de Arabidopsis, p26, p63 e p63tr (Patentes dos E.U.A. η.^οε 7.294.760 e 7.847.153) . Um promotor que tem expressão preferida em um tecido particular é expresso nesse tecido até um grau maior do que pelo menos um outro tecido de planta. Alguns promotores preferidos para tecido mostram a expressão quase exclusivamente no tecido

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83/163 particular .

[0129] Quando a expressão de nível baixo for desejada, os promotores fracos serão usados. Geralmente, o termo promotor fraco, conforme usado no presente documento, se refere a um promotor que aciona a expressão de uma sequência de codificação em um nível baixo. Por expressão de nível baixo, níveis entre cerca de 1/1.000 transcrições a cerca de 1/100.000 transcrições a cerca de 1/500.000 transcrições são pretendidos. Alternativamente, é reconhecido que o termo promotores fracos também abrange os promotores que acionam a expressão apenas em algumas células e não em outras para gerar um nível baixo total de expressão. Quando um promotor aciona a expressão em níveis altos de modo inaceitável, as porções da sequência promotora podem ser deletadas ou modificadas para diminuir os níveis de expressão.

[0130] Tais promotores constitutivos fracos incluem, por exemplo, o promotor de núcleo do promotor Rsyn7 (documento n.° WO 1999/43838 e Patente dos E.U.A. n.° 6.072.050), o promotor CaMV 35S de núcleo e semelhantes. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, aqueles discutidos nas Patentes dos E.U.A. n.^os 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; 5.608.142 e 6.177.611 .

[0131] A lista acima de promotores não é destinada a ser limitante. Qualquer promotor apropriado pode ser usado nas modalidades.

[0132] Geralmente, o cassete de expressão compreenderá um gene marcador selecionável para a seleção de células transformadas. Os genes marcadores selecionáveis são utilizados para a seleção de células ou tecidos

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84/163 transformados. Os genes marcadores incluem os genes que codificam a resistência antibiótica, como aqueles que codificam a neomicina fosfotransferase II (NEO) e higromicina fosfotransferase (HPT), assim como genes que conferem resistência aos compostos herbicidas, como glufosinato amônio, bromoxinila, imidazolinonas e 2,4diclorofenoxiacetato (2,4-D). Os exemplos adicionais de genes marcadores selecionáveis adequados incluem, mas sem limitação, resistência de codificação de gene a cloranfenicol (Herrera Estrella, et al. , (1983) EMBO J. 2:987 a 992); metotrexato (Herrera Estrella, et al. , (1983) Nature 303:209 a 213 e Meijer, et al. , (1991) Plant Mol. Biol. 16:807 a 820); estreptomicina (Jones, et al., (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86 a 91); espectinomicina (BretagneSagnard, et al., (1996) Transgenic Res. 5:131 a 137); bleomicina (Hille, et al., (1990) Plant Mol. Biol. 7:171 a

176); sulfonamida	(Guerineau, et	al., (1990)	Plant	Mol.
Biol. 15	:127 a 136	); bromoxinila (	Stalker,	et	al., (	1988)
Science	242:419 a	423) ; glifosato	(Shaw,	et	al., (	1986)
Science	233:478 a	481 e Pedidos de	Patente	dos	E .U.A	. n.°

10/004.357 e 10/427.692); fosfinotricina (DeBlock, et al.,

(1987)

EMBO J. 6:2513 a 2518) . Consultar, de modo geral,

Yarranton, (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506 a 511; Christopherson, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6314 a 6318; Yao, et al., (1992) Cell 71:63 a 72;

Reznikoff, (1992) Mol. Microbiol. 6:2419 a 2422; Barkley,

et al.,	(1980) em The Operon, páginas 177 a 220; Hu, et al.,
(1987)	Cell 48:555 a 566; Brown, et al., (1987) Cell 49:603
a 612;	Figge, et al., (1988) Cell 52:713 a 722; Deuschle,
et al.,	, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5400 a 5404;

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85/163

Fuerst, et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549 a 2553; Deuschle, et al., (1990) Science 248:480 a 483; Gossen, (1993) Tese de Ph.D., University of Heidelberg; Reines, et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1917 a 1921; Labow, et al., (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343 a 3356; Zambretti, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952 a 3956; Bairn, et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072 a 5076; Wyborski, et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647 a 4653; Hillenand-Wissman, (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143 a 162; Degenkolb, et al., (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591 a 1595; Kleinschnidt, et al., (1988) Biochemistry 27:1094 a 1104; Bonin, (1993) Tese de Ph.D., University of Heidelberg; Gossen, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547 a 5551; Oliva, et al., (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913 a 919; Hlavka, et al., (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlim) e Gill, et al., (1988) Nature 334:721 a 724.

[0133] A lista acima de genes marcadores selecionáveis não é destinada a ser limitante. Qualquer gene marcador selecionável pode ser usado nas modalidades.

Transformação de Planta [0134] Os métodos das modalidades envolvem introduzir um polipeptídeo ou polinucleotídeo em uma planta. Introduzir significa, conforme usado no presente documento, apresentar à planta o polinucleotídeo ou polipeptídeo de tal maneira que a sequência ganhe acesso ao interior de uma célula da planta. Os métodos das modalidades não dependem de um método específico para introduzir um polinucleotídeo ou polipeptídeo em uma planta, apenas que o polinucleotídeo (ou

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86/163 polinucleotídeos) ou o polipeptídeo (ou polipeptídeos) ganhe acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta. Métodos para introduzir polinucleotídeo (ou polinucleotídeos) ou polipeptídeo (ou polipeptídeos) em plantas são conhecidos na técnica, incluindo, porém sem limitação, métodos de transformação estável, métodos de transformação transiente e métodos mediados por vírus.

[0135] Transformação estável, conforme usado no presente documento, significa que o construto de nucleotídeo introduzido em uma planta integra o genoma da planta e tem capacidade para ser herdado pela progênie da mesma. Transformação transiente significa, conforme usado no presente documento, que um polinucleotídeo é introduzido na planta e não se integra no genoma da planta ou um polipeptídeo é introduzido em uma planta. Planta se refere, conforme usado no presente documento, a plantas inteiras, planta órgãos (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc.), sementes, células de plantas, propágulos, embriões e descendência dos mesmos. As células de planta podem ser diferenciadas ou não diferenciadas (por exemplo, calo, células de cultura de suspensão, protoplastos, células de folha, células de raiz, células de floema e pólen).

[0136] Os protocolos de transformação, assim como protocolos para introduzir sequências de nucleotídeo em plantas, podem variar dependendo do tipo de planta ou célula de planta, isto é, monocotiledônea ou dicotiledônea, direcionado para transformação. Métodos adequados de introdução de sequências de nucleotídeos em células de planta e subsequente inserção no genoma de planta incluem microinjeção (Crossway, et al., (1986) Biotechniques 4:320

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87/163 a 334), eletroporação (Riggs, et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 83:5.602 a 5.606), Transformação de mediada por Agrobacterium(Patentes n£ US 5.563.055 e 5.981.840), transferência de gene direta (Paszkowski, et al., (1984) EMBO J. 3:2.111 a 2.722) e aceleração de partícula de balística (consultar, por exemplo, Patente dos E.U.A. n.2 4.945.050; 5.879.918; 5.886.244 e 5.932.782; Tomes, et al., (1995) em Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg e Phillips, (Springer-Verlag, Berlim) e McCabe, et al., (1988) Biotechnology 6:923 a 926) e transformação Led (documento n.° WO 00/28058) . Para transformação de batata, consultar Tu, et al., (1998) Plant Molecular Biology 37:829 a 838 e Chong, et al., (2000) Transgenic Research 9:71 a 78. Os procedimentos de transformação adicionais podem ser encontrados em Weissinger, et al., (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421 a 477;

Sanford, et al., (1987) Particulate Science and Technology 5:27 a 37 (cebola); Christou, et al., (1988) Plant Physiol. 87:671 a 674 (soja); McCabe, et al., (1988) Bio/Technology 6:923 a 926 (soja); Finer e McMullen, (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175 a 182 (soja); Singh, et al., (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); Datta, et al., (1990) Biotechnology 8:736 a 740 (arroz); Klein, et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4.305 a 4.309 (mais); Klein, et al., (1988) Biotechnology 6:559 a 563 (mais); Patentes dos E.U.A. n.^os 5.240.855; 5.322.783 e 5.324.646; Klein, et al., (1988) Plant Physiol. 91:440 a 444 (mais); Fromm, et al., (1990) Biotechnology 8:833 a 839 (mais); Hooykaas-Van Slogteren, et al., (1984) Nature (Londres) 311:763 a 764; Patente dos E.U.A. n.° 5.736.369 (cereais); Bytebier, et

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88/163 al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5.345 a 5.349 (Liliaceae) ; De Wet, et al., (1985) em The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman, et al., (Longman, Nova Iorque) , páginas 197 a 209 (pólen) ; Kaeppler, et al., (1990) Plant Cell Reports 9:415 a 418 e Kaeppler, et al., (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560 a 566 (transformação mediada por fibras); D'Halluin, et al., (1992) Plant Cell 4:1.495 a 1.505 (eletroporação); Li, et al., (1993) Plant Cell Reports 12:250 a 255 e Christou e Ford, (1995) Annals of Botany 75:407 a 413 (arroz); Osjoda, et al., (1996) Nature Biotechnology 14:745 a 750 (mais por meio de Agrobacterium tumefaciens) .

[0137] Em modalidades específicas, as sequências das modalidades podem ser fornecidas a uma planta com o uso de uma variedade de métodos de transformação transiente. Tais métodos de transformação transitória incluem, mas sem limitação, a introdução do polipeptídeo IPD101 ou variantes e fragmentos das mesmas diretamente na planta ou a introdução da transcrição de polipeptídeo IPD101 na planta. Tais métodos incluem, por exemplo, microinjeção ou bombardeamento de partículas. Consultar, por exemplo, Crossway, et al. , (1986) Mol Gen. Genet. 202:179 a 185; Nomura, et al., (1986) Plant Sci. 44:53 a 58; Hepler, et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91:2176 a 2180 e Hush, et al., (1994) The Journal of Cell Science 107:775 a 784. Alternativamente, o polinucleotídeo IPD101 pode ser transformado transitoriamente na planta com o uso das técnicas conhecidas na técnica. Tais técnicas incluem sistema de vetor viral e a precipitação do polinucleotídeo de um modo que impede subsequente liberação do DNA. Portanto, a transcrição a

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89/163 partir do DNA ligado à partícula pode ocorrer, mas a frequência com que a mesma é liberada para se integrar ao genoma é muito reduzida. Tais métodos incluem a utilização de partículas revestidas com polietilimina (PEI; Sigma #P3143) .

[0138] São conhecidos na técnica métodos para a inserção direcionada de um polinucleotídeo em uma localização específica no genoma da planta. Em uma modalidade, a inserção do polinucleotídeo em um local genômico desejado é alcançada com o uso de um sistema de recombinação específico de local. Consultar, por exemplo, os documentos WO 1999/25821, WO 1999/25854, WO 1999/25840, WO 1999/25855 e WO 1999/25853. Brevemente, o polinucleotídeo das modalidades pode ser contido em cassete de transferência flanqueado por dois sítios de recombinação não idênticos. O cassete de transferência é introduzido em uma planta que incorporou de modo estável em seu genoma um sítio direcionado que é flanqueado por dois sítios de recombinação não idênticos que correspondem aos sítios do cassete de transferência. Uma recombinase apropriada é fornecida e o cassete de transferência é integrado no sítio direcionado. O polinucleotídeo de interesse é, assim, integrado em uma posição cromossômica específica no genoma de planta.

[0139] Os vetores de transformação de planta podem ser compreendidos de um ou mais vetores de DNA necessários para alcançar a transformação de planta. Por exemplo, é uma prática comum na técnica utilizar os vetores de transformação de planta que são compreendidos de mais de um segmento de DNA contíguo. Esses vetores são frequentemente chamados na técnica de vetores binários. Os vetores

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90/163 binários, assim como vetores com plasmídeos auxiliares, são mais frequentemente usados para transformação mediada por Agrobacterium, em que o tamanho e complexidade dos segmentos de DNA necessários para alcançar transformação eficiente são bem maiores, e isso é vantajoso para separar funções em moléculas de DNA separadas. Os vetores binários contêm tipicamente um vetor plasmídeo que contém as sequências de atuação cis exigidas para a transferência de T-DNA (como borda esquerda e borda direita), um marcador selecionável que é modificado geneticamente para ter capacidade para expressão em uma célula de planta e um gene de interesse (um gene modificado geneticamente para ter capacidade para expressão em uma célula de planta para a qual a geração de plantas transgênicas é desejada). Também estão presentes nesse vetor plasmídeo as sequências exigidas para replicação bacteriana. As sequências de atuação cis são dispostas de maneira a permitir a transferência eficaz para células de plantas e expressão nas mesmas. Por exemplo, o gene marcador selecionável e o gene pesticida são localizados entre as bordas esquerda e direita. Frequentemente, um segundo vetor plasmídeo contém os fatores de atuação trans que medeiam a transferência de T-DNA de Agrobacterium para células de plantas. Esse plasmídeo contém frequentemente as funções de virulência (genes Vir) que permitem a infecção de células de plantas por Agrobacterium, e transferência de DNA por divagem em sequências de borda e transferência de DNA mediada por Vir, conforme é entendido na técnica (Hellens e Mullineaux, (2000) Trends in Plant Science 5:446 a 451) . Diversos tipos de cepas de Agrobacterium (por exemplo, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, etc.) podem ser usados para

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91/163 transformação de planta. 0 segundo vetor plasmideo não é necessário para transformar as plantas por outros métodos, como microprojeção, microinjeção, eletroporação, polietilenoglicol, etc.

[0140] Em geral, os métodos de transformação de planta envolvem transferir o DNA heterólogo para células de plantas direcionadas (por exemplo, embriões imaturos ou maduros, culturas de suspensão, calo não diferenciado, protoplastos, etc.), seguidos pela aplicação de um nível de limiar máximo de seleção apropriada (dependendo do gene marcador selecionável) para recuperar as células de plantas transformadas a partir de um grupo de massa de célula não transformada. Após a integração de DNA estranho heterólogo em células de plantas, é aplicado um nível de limiar máximo de seleção apropriada no meio para exterminar as células não transformadas e separar e proliferar as células transformadas de modo putativo que sobrevivem a partir desse tratamento de seleção transferindo-se as mesmas de modo regular para um meio novo. Pela passagem contínua e o desafio com seleção apropriada, são identificadas e proliferadas as células que são transformadas com o vetor plasmideo. Os métodos moleculares e bioquímicos podem, então, ser usados para confirmar a presença do gene de interesse heterólogo integrado no genoma da planta transgênica.

[0141] Explantes são tipicamente transferidos para um suprimento fresco do mesmo meio e cultivados de modo rotineiro. Subsequentemente, as células transformadas são diferenciadas em brotos após colocação em meio de regeneração suplementado com um nível de limiar máximo de agente de seleção. Os brotos são, então, transferidos para

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92/163 um meio de enraizamento seletivo para recuperar o broto ou plântula enraizado. A plântula transgênica cresce, então, para uma planta madura e produz sementes férteis (por exemplo, Hiei, et al., (1994) The Plant Journal 6:271 a 282; Ishida, et al., (1996) Nature Biotechnology 14:745 a 750) . Explantes são tipicamente transferidos para um suprimento fresco do mesmo meio e cultivados de modo rotineiro. Uma descrição geral das técnicas e métodos para gerar plantas transgênicas são encontrados em Ayres e Park, (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219 a 239 e Bommineni e Jauhar, (1997) Maydica 42:107 a 120. Visto que o material transformado contém muitas células, tanto as células transformadas quanto não transformadas estão presentes em qualquer parte de calo direcionado submetido ou tecido ou grupo de células. A habilidade para exterminar as células não transformadas e permitir que as células transformadas proliferem resulta em culturas de planta transformadas. Frequentemente, a habilidade para remover células não transformadas é uma limitação à recuperação rápida de células de plantas transformadas e geração bem-sucedida de plantas transgênicas.

[0142] As células que foram transformadas podem ser cultivadas em plantas, de acordo com maneiras convencionais. Consultar, por exemplo, McCormick, et al. , (1986) Plant Cell Reports 5:81 a 84. Essas plantas podem, então, ser cultivadas e ser polinizadas com a mesma cepa transformada ou cepas diferentes, e o híbrido resultante que tem expressão constitutiva ou induzível da característica fenotípica desejada identificada. Duas ou mais gerações podem ser cultivadas para garantir que a expressão da característica

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93/163 fenotípica desejada seja mantida de modo estável e herdada e, então, as sementes cultivadas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada tenha sido alcançada.

[0143] As sequências de nucleotídeo das modalidades podem ser fornecidas à planta colocando-se a planta em contato com um vírus ou ácidos nucleicos virais. Geralmente, tais métodos envolvem incorporar o construto de nucleotídeo de interesse em uma molécula de RNA ou DNA viral. Reconhece-se que as proteínas recombinantes das modalidades podem ser inicialmente sintetizadas como parte de uma poliproteína viral, que posteriormente pode ser processada por meio de proteólise in vivo ou in vitro para produzir o polipeptídeo IPD101 desejado. Também reconhece-se que tal poliproteína viral, que compreende pelo menos uma porção da sequência de aminoácidos de um polipeptídeo IPD101 das modalidades, pode ter a atividade pesticida desejada. Tais poliproteínas virais e as sequências de nucleotídeo que codificam as mesmas são englobadas pelas modalidades. Os métodos para dotar plantas de construtos de nucleotídeo e produzir as proteínas codificadas nas plantas que envolvem moléculas de RNA ou DNA viral são conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, as Patentes dos E.U.A. n.° 5.889.191; 5.889.190; 5.866.785; 5.589.367 e 5.316.931.

[0144] Os métodos para transformação de cloroplastos são conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Svab, et al. , (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:8526 a 8530; Svab e Maliga, (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:913 a 917; Svab e Maliga, (1993) EMBO J. 12:601 a 606. O método depende da entrega de canhão de partículas de DNA que contém um marcador

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94/163 selecionável e direcionamento do DNA ao genoma plastídeo através de recombinação homóloga. Adicionalmente, a transformação de plastídeo pode ser realizada pela transativação de um transgene originado por plastídeo silenciado por expressão preferida de tecido de uma RNA polimerase codificada nuclear e direcionada por plastídeo. Tal sistema foi relatado em McBride, et al. , (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301 a 7305.

[0145] As modalidades se referem adicionalmente a material de propagação de planta de uma planta transformada das modalidades o que inclui, mas sem limitação, sementes, tubérculos, cormo, bulbos, folhas e cortes de raízes e brotos.

[0146] As modalidades podem ser usadas para transformação de quaisquer espécies de planta, incluindo, mas sem limitação, monocotiledôneas e dicotiledôneas. Os exemplos de plantas de interesse incluem, mas sem limitação, milho {Zea mays), Brassica sp. (por exemplo, B. napus, B. rapa, B. juncea), particularmente aquelas espécies de Brassica úteis como fontes de óleo de semente, alfafa {Medicago sativa) , arroz {Oryza sativa), centeio {Secale cereale), sorgo {Sorghum bicolor, Sorghum vulgare) , milhete (por exemplo, milhete-pérola {Pennisetum glaucum), milho miúdo {Panicum miliaceum), milho painço {Setaria italica) , capimpé-de-galinha-gigante {Eleusine coracana)), girassol {Helianthus annuus), cártamo {Carthamus tinctorius) , trigo {Triticum aestivum), soja {Glycine max), tabaco {Nicotiana tabacum), batata {Solanum tuberosum), amendoins {Arachis hypogaea), algodão {Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata doce {Ipomoea batatus), mandioca {Manihot

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95/163 esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucifera) , abacaxi (Ananas comosus) , árvores de citrinos (Citrus spp.), cacau (Theobroma cacao), chá (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), abacate (Persea americana) , figueira (Ficus casica) , goiaba (Psidium guajava) , manga (Mangifera indica) , oliveira (Olea europaea), papaia (Carica papaya), caju (Anacardium occidentale), macadâmia (Macadamia integrifolia) , amêndoa (Prunus amygdalus), beterraba sacarina (Beta vulgaris), cana-de-açúcar (Saccharum spp.), aveia, cevada, plantas ornamentais e coníferas.

[0147] Os vegetais incluem tomates (Lycopersicon esculentum), alface (por exemplo, Lactuca sativa) , feijões verdes (Phaseolus vulgaris), feijões-de-lima (Phaseolus limensis), ervilhas (Lathyrus spp.) e membros do gênero Cucumis, como pepino (C. sativus), cantalupo (C. cantalupensis) e melão (C. melo) . As plantas ornamentais incluem azaleia (Rhododendron spp.), hortênsia (Macrophylla hydrangea), hibisco (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipas (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), petúnias (Petunia hybrida), cravo (Dianthus caryophyllus) , poinsétia (Euphorbia pulcherrima) e crisântemo. As coníferas que podem ser empregadas na prática das modalidades incluem, por exemplo, pinheiros, como pinheiro (Pinus taeda), pinheiro-americano (Pinus elliotii), pinheiro ponderosa (Pinus ponderosa), pinheiro de lodgepole (Pinus contorta) e pinheiro-de-Monterey (Pinus radiata) ; pinheiro-do-oregon (Pseudotsuga menziesii); cicuta ocidental (Tsuga canadensis); abeto Sitka (Picea glauca); sequoia (Sequoia sempervirens); abetos verdadeiros, como abeto (Abies amabilis) e abeto balsâmico (Abies balsamea); e cedros, como

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96/163 cedro vermelho ocidental (Thuja plicata) e cedro amarelo do Alasca (Chamaecyparís nootkatensis) . As plantas das modalidades incluem plantas de cultura (por exemplo, milho, alfafa, girassol, Brassica, soja, algodão, cártamo, amendoim, sorgo, trigo, milhete, tabaco, etc.), como plantas de milho e soja.

[0148] Os gramados incluem, mas sem limitação: poa-anual (Poa annua); azevém anual (Lolium multiflorum); poa canadiana (Poa compressa); festuca-encarnada (Festuca rubra); Agrostide-ténue (Agrostis tenuis); erva-fina (Agrostis palustris); grama de trigo do deserto (crested wheatgrass) (Agropyron desertorum); capim-mombaça (Agropyron cristatum); festuca rígida (hard fescue) (Festuca longifolia); erva-de-febra (Poa pratensis); panasco (Dactylis glomerata); azevém perene (Lolium perenne); festuca-encarnada (Festuca rubra); germínia rubra (Agrostis alba); poa-comum (Poa trivialis) ; festuca ovina (Festuca ovina) ; bromo (Bromus inermis); festuca alta (Festuca arundinacea); rabo-de-gato (Phleum pratense); Agrostis-decão (velvet bentgrass) (Agrostis canina); weeping alkaligrass (Puccinellia distans); erva-trigo ocidental (Agropyron smithii); grama Bermuda (Cynodon spp.); grama Santo Agostinho (Stenotaphrum secundatum); Grama Zoysia (Zoysia spp.); grama-bahia (Paspalum notatum); grama tapete (Axonopus affinis); grama centipede (Eremochloa ophiuroides) ; grama Kikuio (Pennisetum clande si num) ; capimarame-da-praia (Paspalum vaginatum); grama azul (Bouteloua gracilis); grama americana (Buchloe dactyloids); sideoats gramma (Bouteloua curtipendula) .

[0149] As plantas de interesse incluem plantas de grãos

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97/163 que fornecem sementes de interesse, plantas de semente de óleo e leguminosas. Sementes de interesse incluem sementes de grão, tais como milho, trigo, cevada, arroz, sorgo, centeio, milheto, etc. Plantas com semente oleosa incluem algodão, soja, açafrão-bastardo, girassol, Brassica, milho, alfalfa, palma, coco, linho, rícino, azeitona, etc. Plantas leguminosas incluem feijões e ervilhas. Os feijões incluem guar, feijão de alfarroba, feno-grego, soja, feijão de jardim, caupi, feijão mungo, feijão-de-lima, feijão-fava, lentilhas, grão-de-bico, etc.

[0150] Após a introdução de DNA estranho heterólogo em células de plantas, a transformação ou integração de gene heterólogo no genoma de planta é confirmada por vários métodos, como análise de ácidos nucleicos, proteínas e metabólitos associados ao gene integrado.

[0151] A análise de PCR é um método rápido para triar células transformadas, tecido ou brotos para a presença de gene incorporado no estágio inicial antes de transplante para o solo (Sambrook e Russell, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) . É executada PCR com o uso de iniciadores de oligonucleotideo específicos para o gene de interesse ou fundo de vetor de Agrobacterium, etc.

[0152] A transformação de planta pode ser confirmada por análise de transferência de Southern de DNA genômico (Sambrook e Russell, (2001) supra) . Na análise de transferência de Northern, RNA é isolado de tecidos específicos de transformantes, fracionado em um gel de agarose de formaldeido e transferido para um filtro de náilon de acordo com procedimentos padrões que são usados de modo

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98/163 rotineiro na técnica (Sambrook e Russell, (2001) supra). A expressão de RNA codificada pelo gene pesticida é, então, testada hibridizando-se o filtro para uma sonda radioativa derivada de um gene pesticida por métodos conhecidos na técnica (Sambrook e Russell, (2001) supra). Western blot, ensaios bioquímicos e semelhantes podem ser realizados nas plantas transgênicas para confirmar a presença de proteína codificada pelo gene pesticida por meio de procedimentos padrão (Sambrook e Russell, 2001, supra) com o uso de

anticorpos que se ligam	a um ou mais	epítopos	presentes	no
polipeptídeo	IPD101.
Métodos para	Introduzir	Tecnologias	de Edição	de Genoma	em
Plantas
[0153] Em	algumas	modalidades,	as composições	de

polinucleotídeo IPD101 reveladas podem ser introduzidas no genoma de uma planta com o uso de tecnologias de edição de genoma, ou polinucleotídeos IPD101 anteriormente introduzidos no genoma de uma planta podem ser editados com o uso de tecnologias de edição de genoma. Por exemplo, os polinucleotídeos revelados podem ser introduzidos em uma localização desejada no genoma de uma planta através do uso de tecnologias de quebra de fita dupla, tal como TALENs, meganucleases, nucleases de dedo de zinco, CRISPR-Cas e similares. Por exemplo, os polinucleotídeos revelados podem ser introduzidos em uma localização desejada em um genoma com o uso de um sistema CRISPR-Cas, para o propósito de inserção específica para sítio. A localização desejada em um genoma de planta pode ser qualquer sítio alvo desejado para inserção, tal como uma região genômica favorável para melhoramento ou pode ser um sítio alvo localizado em uma

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99/163 janela genômica com um traço de interesse existente. Os traços de interesse existente poderíam ser um traço endógeno ou um traço anteriormente introduzido.

[0154] Em algumas modalidades, quando o polinucleotideo IPD101 revelado foi anteriormente introduzido em um genoma, as tecnologias de edição de genoma podem ser usadas para alterar ou modificar a sequência de polinucleotideo introduzida. As modificações específicas de sítio que podem ser introduzidas nas composições de polinucleotideo IPD101 reveladas incluem aqueles produzidos com o uso de qualquer método para introduzir a modificação sítio específica, incluindo, mas sem limitação, através do uso de oligonucleotideos de reparo de gene (por exemplo, Publicação dos E.U.A. 2013/0019349), ou através do uso de tecnologias de quebra de fita dupla, como TALENs, meganucleases, nucleases de dedo de zinco, CRISPR-Cas, e semelhantes. Tais tecnologias podem ser usadas para modificar o polinucleotideo anteriormente introduzido através de inserção, deleção ou substituição de nucleotideos dentro do polinucleotideo introduzido. Alternativamente, tecnologias de quebra de fita dupla podem ser usadas para adicionar sequências de nucleotideos adicionais ao polinucleotideo introduzido. As sequências adicionais que podem ser adicionadas incluem elementos de expressão adicionais, tal como sequências intensificadoras e promotoras. Em outra modalidade, as tecnologias de edição de genoma podem ser usadas para posicionar proteínas ativas como inseticida adicionais em proximidade com as composições de polinucleotideo IPD101 reveladas no presente documento dentro do genoma de uma planta, a fim de gerar pilhas

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100/163 moleculares de proteínas ativas como inseticida.

[0155] Um sítio-alvo alterado, sequência-alvo alterada, sítio-alvo modificado e sequência-alvo modificada são usados de forma intercambiável no presente documento e se referem a uma sequência-alvo conforme revelado no presente documento que compreende pelo menos uma alteração em comparação com a sequência-alvo não alterada. Tais alterações incluem, por exemplo: (i) substituição de pelo menos um nucleotídeo, (ii) uma deleção de pelo menos um nucleotídeo, (iii) uma inserção de pelo menos um nucleotídeo, ou (iv) qualquer combinação de (i) a (iii) .

Empilhamento de traços em planta transgênica [0156] As plantas transgênicas podem compreender uma pilha de um ou mais polinucleotídeos inseticidas revelados no presente documento com um ou mais polinucleotídeos adicionais que resultam na produção ou supressão de múltiplas sequências de polipeptídeos. As plantas transgênicas que compreendem pilhas de sequências de polinucleotídeo podem ser obtidas por qualquer um ou ambos os métodos de reprodução tradicionais ou através de métodos de manipulação genética. Esses métodos incluem, mas sem limitação, linhas individuais de cultivo sendo que cada uma compreende um polinucleotídeo de interesse, transformando uma planta transgênica que compreende um gene revelado no presente documento com um gene subsequente e a cotransformação de genes em uma célula de planta única. Conforme usado no presente documento, o termo empilhado inclui ter os múltiplos traços presentes na mesma planta (isto é, ambos os traços são incorporados no genoma nuclear, um traço é incorporado no genoma nuclear e um traço é

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101/163 incorporado no genoma de um plastídeo ou ambos os traços são incorporados no genoma de um plastídeo). Em um exemplo não limitante, traços empilhados compreendem uma pilha molecular em que as sequências são fisicamente adjacentes entre si. Um traço, conforme usado no presente documento, refere-se ao fenótipo derivado de uma sequência particular ou grupos de sequências. A cotransformação de genes pode ser executada com o uso de vetores de transformação únicos que compreendem múltiplos genes ou genes portados separadamente em múltiplos vetores. Se as sequências forem empilhadas transformando-se geneticamente as plantas, as sequências de polinucleotídeo de interesse podem ser combinadas em qualquer momento e em qualquer ordem. Os traços podem ser introduzidos simultaneamente em um protocolo de cotransformação com os polinucleotídeos de interesse fornecidos por qualquer combinação de cassetes de transformação. Por exemplo, se duas sequências serão introduzidas, as duas sequências podem ser contidas em cassetes de transformação separados (trans) ou contidas no mesmo cassete de transformação (cis) . A expressão das sequências pode ser acionada pelo mesmo promotor ou por promotores diferentes. Em certos casos, pode ser desejável introduzir um cassete de transformação que suprima a expressão do polinucleotídeo de interesse. Isso pode ser combinado com qualquer combinação de outros cassetes de supressão ou cassetes de superexpressão para gerar a combinação desejada de traços na planta. É adicionalmente reconhecido que as sequências de polinucleotídeo podem ser empilhadas em uma localização genômica desejada com o uso de um sistema de recombinação específica de sítio.

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Consultar, por exemplo, os documentos n.° WO 1999/25821, n.° WO 1999/25854, n.° WO 1999/25840, n.° WO 1999/25855 e n.° WO 1999/25853, todos os quais são incorporados ao presente documento a título de referência.

[0157] Em algumas modalidades, um ou mais dentre os polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo IPD101 (ou polipeptídeos IPD101) revelado no presente documento, isoladamente ou empilhados com um ou mais traços adicionais de resistência a inseto, podem ser empilhados com um ou mais traços de entrada adicionais (por exemplo, resistência a herbicidas, resistência a fungos, resistência a vírus, tolerância a estresse, resistência a doenças, esterilidade masculina, resistibilidade de caule e semelhantes) ou traços de saída (por exemplo, aumento de rendimento, amidos modificados, perfil de óleo melhorado, aminoácidos balanceados, alto teor de lisina ou metionina, aumento da digestibilidade, qualidade de fibra melhorada, resistência à seca e semelhantes). Portanto, as modalidades de polinucleotídeo podem ser usadas para fornecer um pacote agronômico completo de qualidade de cultivo aprimorada com a habilidade de controlar de modo flexível e rentável quaisquer pragas agronômicas.

[0158] Transgenes úteis para empilhamento incluem, porém sem limitação: transgenes que conferem resistência a um herbicida; transgenes que conferem ou contribuem para uma característica de grão alterada; genes que controlam a esterilidade masculina; genes que criam um sítio para integração de DNA específica de sítio; genes que afetam a resistência a estresse abiótico; genes que conferem rendimento aumentado, genes que conferem digestibilidade de

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103/163 planta; e transgenes que conferem resistência a insetos ou doença.

[0159] Os exemplos de transgenes que conferem resistência a insetos incluem genes que codificam uma proteína de Bacillus thuringiensis, um derivado da mesma ou um polipeptídeo sintético modelado na mesma. Consultar, por exemplo, Geiser, et al. , (1986) Gene 48:109, que revela a clonagem e sequência de nucleotídeos de um gene de deltaendotoxina Bt. Além disso, moléculas de DNA que codificam genes delta-endotoxina podem ser comprados junto a American Type Culture Collection (Rockville, Md.), por exemplo, com número de acesso ATCC® 40098, 67136, 31995 e 31998. Outros exemplos não limitantes de transgenes de Bacillus

thuringiensis que são	modificados genericamente são dados
nas seguintes patentes	e pedidos de	patente:	Patentes dos
E.U.A. n.⁰³	5.188.960;	5.689.052;	5.880.275;	5.986.177;
6.023.013,	6.060.594,	6.063.597,	6.077.824,	6.620.988,
6.642.030,	6.713.259,	6.893.826,	7.105.332;	7.179.965,
7.208.474;	7.227.056,	7.288.643,	7.323.556,	7.329.736,
7.449.552,	7.468.278,	7.510.878,	7.521.235,	7.544.862,
7.605.304,	7.696.412,	7.629.504,	7.705.216,	7.772.465,
7.790.846,	7.858.849	e documento	n. ° WO	1991/14778;
documento n.	° WO 1999/	31248; documento n.° WO	2001/12731;
documento n.	° WO 1999/24581 e documento n.° WO	1997/40162.
[0160] Genes que codificam proteínas pesticidas podem

também ser empilhados, o que inclui, mas sem limitação: proteínas inseticidas de Pseudomonas sp. , tal como PSEEN3174 (Monalysin, (2011) PLoS Pathogens, 7:1 a 13), de cepas de Pseudomonas protegens CHAO e Pf-5 (anteriormente fluorescens) (Pechy-Tarr, (2008) Environmental Microbiology

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10:2.368 a 2.386: ns de Acesso GenBank EU400157); de Pseudomonas taiwanensis (Liu, et al., (2010) J. Agric. Food Chem. 58:12.343 a 12.349) e de Pseudomonas pseudoalcaligenes (Zhang, et al., (2009) Annals of Microbiology 59:45 a 50 e Li, et al., (2007) Plant Cell Tiss. Organ Cult. 89:159 a 168); proteínas inseticidas de Photorhabdus sp. e Xenorhabdus sp. (Hinchliffe, et al., (2010) The Open Toxinology Journal 3:101 a 118 e Morgan, et al., (2001) Applied and Envir. Micro. 67:2.062 a 2.069), patente dos E.U.A. n.2 6.048.838 e patente dos E.U.A. n.£ 6.379.946; urn polipeptídeo PIP-1 da publicação de pedido de patente dos E.U.A. n.2 US20140007292; um polipeptídeo AfIP-lA e/ou AflP1B da publicação de pedido de patente dos E.U.A. n.s US20140033361; um polipeptídeo PHI-4 das publicações de pedido de patente dos E.U.A. n.s^ US20140274885 e US20160040184; um polipeptídeo PIP-47 da publicação de pedido de patente dos E.U.A. n.2 US20160186204, urn polipeptídeo PIP-72 da publicação de pedido de patente dos E.U.A. n.s US20160366891; um polipeptídeo PtIP-50 e urn polipeptídeo PtIP-65 da publicação de pedido de patente dos E.U.A. n.2 20170166921; um polipeptídeo PtIP-83 da publicação de pedido de patente dos E.U.A. n.2 20160347799; um polipeptídeo PtIP-96 da publicação de pedido de patente dos E.U.A. n.2 20170233440; um polipeptídeo IPD079 do documento n.a US 62/201977; um polipeptídeo IPD082 do documento na US 62/269482 e δ-endotoxinas, incluindo, porém sem limitação, as classes Cryl, Cry2, Cry3, Cry4, Cry5, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, CrylO, Cryll, Cryl2, Cryl3, Cryl4, Cryl5, Cryl6, Cryl7, Cryl8, Cryl9, Cry20, Cry21, Cry22, Cry23, Cry24, Cry25, Cry26, Cry27, Cry 28, Cry 29, Cry 30, Cry31,

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Cry32,	Cry33,	Cry34,	Cry35,Cry36,	Cry37,	Cry38,	Cry39,
Cry4 0,	Cry41,	Cry42,	Cry43, Cry44,	Cry45,	Cry 46,	Cry47,
Cry49,	Cry50,	Cry51,	Cry52, Cry53,	Cry 54,	Cry55,	Cry56,
Cry57,	Cry58,	Cry59,	Cry60, Cry61,	Cry62,	Cry63,	Cry64,
Cry65,	Cry66,	Cry67,	Cry68, Cry69,	Cry70, Cry71, e	Cry 72
de genes de	δ-endotoxina e os genes citolíticos	de B.

thuringiensis Cytl e Cyt2. Os membros dessas de proteínas inseticidas de B. thuringiensis bem conhecidas pelo versado na técnica (consulte, Crickmore, et al., Bacillus thuringiensis toxin nomenclature (2011), em lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/ que pode ser acessado na rede mundial de computadores com o uso do prefixo www).

[0161] Exemplos de δ-endotoxinas também incluem, porém sem limitação, proteínas CrylA das patentes dos E.U.A. n.s^ 5.880.275 e 7.858.849; uma toxina DIG-3 ou DIG-11 (deleção N-terminal de variantes α-hélice 1 e/ou a-hélice 2 de proteínas Cry, tal como CrylA) das patentes dos E.U.A. n.2£ 8.304.604 e 8.304.605, CrylB do pedido de patente dos E.U.A. n.s 10/525.318; CrylC da patente dos E.U.A. n.a 6.033.874; CrylF das patentes dos E.U.A. n.s^ 5.188.960, 6.218.188; quimeras de CrylA/F das patentes dos E.U.A. n.2£ 7.070.982; 6.962.705 e 6.713.063; uma proteína Cry2, tal como a proteína Cry2Ab da patente dos E.U.A. n.2 7.064.249; uma proteína Cry3A, incluindo, porém sem limitação, uma proteína inseticida híbrida geneticamente modificada (eHIP) criada fundindo-se combinações exclusivas de regiões variáveis e blocos conservados de pelo menos duas proteínas Cry diferentes (publicação de pedido de patente dos E.U.A. n.2 2010/0017914); uma proteína Cry4; uma proteína Cry5; uma

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106/163 proteína Cry6; proteínas Cry8 das patentes dos E.U.A. n.sr 7.329.736, 7.449.552, 7.803.943, 7.476.781, 7.105.332, 7.378.499 e 7.462.760; uma proteína Cry9, tal como membros das famílias Cry9A, Cry9B, Cry9C, Cry9D, Cry9E e Cry9F; uma proteína Cryl5 de Naimov, et al., (2008) Applied and Environmental Microbiology 74:7.145 a 7.151; uma Cry22, uma proteína Cry34Abl das patentes nsr US 6.127.180, 6.624.145 e 6.340.593; uma proteína CryET33 e CryET34 das patentes nsr US 6.248.535, 6.326.351, 6.399.330, 6.949.626, 7.385.107 e 7.504.229; homólogos de CryET33 e CryET34 das publicações de patente dos E.U.A. n.2£ 2006/0191034, 2012/0278954, e da publicação PCT dos E.U.A. n.2 WO 2012/139004; uma proteína Cry35Abl das patentes dos E.U.A. n.s^ 6.083.499, 6.548.291 e 6.340.593; uma proteína Cry46, uma proteína Cry 51, uma toxina binária de Cry; uma TIC901 ou toxina relacionada; TIC807 do documento n.2US 2008/0295207; ET29, ET37, TIC809, TIC810, TIC812, TIC127, TIC128 do documento PCT n.2 2006/033867; AXMI-027, AXMI-036 e AXMI-038 da patente dos E.U.A. n.s 8.236.757; AXMI-031, AXMI-039, AXMI-040, AXMI-049 do documento n.sUS 7.923.602; AXMI-018, AXMI-020 e AXMI-021 do documento n.sWO 2006/083891; AXMI-010 do documento n.2W0 2005/038032; AXMI-003 do documento n.2 WO 2005/021585; AXMI008 do documento n.2 US 2004/0250311; AXMI-006 do documento n.2 US 2004/0216186; AXMI-007 do documento n.2 US 2004/0210965; AXMI-009 do documento n.s US 2004/0210964; AXMI-014 do documento n.a US 2004/0197917; AXMI-004 do documento n.a US 2004/0197916; AXMI-028 e AXMI-029 do documento n.2 WO 2006/119457; AXMI-007, AXMI-008, AXMI0080rf2, AXMI-009, AXMI-014 e AXMI-004 do documento n£ WO 2004/074462; AXMI-150 da patente dos E.U.A. n.2 8.084.416;

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AXMI-205 do documento η.2 US20110023184; AXMI-011, AXMI-012,

AXMI-013, AXMI-015, AXMI-019, AXMI-044, AXMI-037, AXMI-043, AXMI-033, AXMI-034, AXMI-022, AXMI-023, AXMI-041, AXMI-063, e AXMI-064 do documento n.2 US 2011/0263488; AXMI-R1 e proteínas relacionadas do documento n. ° US 2010/0197592;

AXMI221Z,	AXMI222z,	AXMI223z,	AXMI224z	e AXMI225z of WO
2011/1032	48; AXMI218, AXMI219	, AXMI220,	AXMI226,	AXMI227,
AXMI228,	AXMI229, AXMI230, e AXMI231 of	WO11/103247; AXMI-
115, AXMI	-113, AXMI	-005, AXMI-	163 e AXMI-	-184 da patente dos
E.U.A. n.	° 8.334.431; AXMI-00	1, AXMI-002, AXMI-03	0, AXMI-
035, e AXMI-045 of	US 2010/0298211; ΑΧΜΊ	:-066 e AXMI-076 do
documento	n.2 US20	09/0144852;	AXMI128,	AXMI130,	AXMI131,
AXMI133,	AXMI140,	AXMI141,	AXMI142,	AXMI143,	AXMI144,
AXMI146,	AXMI148,	AXMI149,	AXMI152,	AXMI153,	AXMI154,
AXMI155,	AXMI156,	AXMI157,	AXMI158,	AXMI162,	AXMI165,
AXMI166,	AXMI167,	AXMI168,	AXMI169,	AXMI170,	AXMI171,
AXMI172,	AXMI173,	AXMI174,	AXMI175,	AXMI176,	AXMI177,
AXMI178,	AXMI179,	AXMI180,	AXMI181,	AXMI182,	AXMI185,
AXMI186, .	AXMI187, AXMI188, AXMI189 da patente dos E	.U.A. n.2
8.318.900	; AXMI079,	, AXMI080,	AXMI081,	AXMI082,	AXMI091,
AXMI092,	AXMI096,	AXMI097,	AXMI098,	AXMI099,	AXMI100,
AXMI101,	AXMI102,	AXMI103,	AXMI104,	AXMI107,	AXMI108,
AXMI109,	AXMI110,	AXMI111,	AXMI112,	AXMI114,	AXMI116,
AXMI117,	AXMI118,	AXMI119,	AXMI120,	AXMI121,	AXMI122,
AXMI123,	AXMI124,	AXMI1257,	AXMI1268,	AXMI127,	AXMI129,
AXMI164,	AXMI151,	AXMI161,	AXMI183,	AXMI132,	AXMI138,

AXMI137 do documento n.a US 2010/0005543; e proteínas Cry, tais como CrylA e Cry3A que têm sítios proteolíticos modificados da patente dos E.U.A. n.£ 8.319.019; e uma proteína de toxina CrylAc, Cry2Aa e CrylCa da cepa de

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Bacillus thuringiensis VBTS 2528 da publicação de pedido de patente dos E.U.A. n.a 2011/0064710. Outras proteínas Cry também são bem conhecidas por um indivíduo versado na técnica (consultar, Crickmore, et al. , Bacillus thuringiensis toxin nomenclature (2011), em lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/ que pode ser acessado pela rede mundial de computadores com o uso do prefixo www). A atividade inseticida de proteínas Cry é bem conhecida por um versado na técnica (para análise, consultar van Frannkenhuyzen, (2009) J. Invert. Path. 101:1 a 16) . 0 uso de proteínas Cry como traços de planta transgênica é bem conhecido por um versado na técnica e plantas transgênicas Cry incluindo, mas sem limitação, CrylAc, CrylAc+Cry2Ab, CrylAb, CrylA.105, CrylF, CrylFa2, CrylF+CrylAc, Cry2Ab, Cry3A, mCry3A, Cry3Bbl, Cry34Abl, Cry35Abl, Vip3A, mCry3A, Cry9c e CBI-Bt receberam a aprovação regulatória (consultar Sanahuja, (2011) Plant Biotech Journal 9:283 a 300 e CERA (2010) GM Crop Database Center for Environmental Risk Assessment (CERA) , ILSI Research Foundation, Washington D.C. em ceragmc.org/index.php?action=gm_crop_database, que pode ser acessado pela rede mundial de computadores com o uso do prefixo www). Mais de uma proteína pesticida bem conhecida por um versado na técnica também pode ser expressas em plantas como Vip3Ab e CrylFa (documento n.s US2012/0317682), CrylBE e CrylF (documento n.s US2012/0311746) , CrylCA e CrylAB (documento n.s US2012/0311745), CrylF e CryCa (documento n.2 US2012/0317681), CrylDA e CrylBE (documento n.2 US2012/0331590), CrylDA e CrylFa (documento n.2 US2012/0331589), CrylAB e CrylBE (documento n.2

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US2012/0324606) e CrylFa e Cry2Aa, Cryll ou CrylE (documento n.s US2012/0324605). Proteínas inseticidas também incluem lipases inseticidas que incluem lipídeo acil-hidrolases da Patente dos E.U.A. n.2 7,491,869, e colesterol oxidases tais como de Streptomyces (Purcell et al. (1993) Biochem Biophys Res Commun 15:1.406 a 1.413) . As proteínas pesticidas também incluem toxinas VIP (proteínas inseticidas vegetativas) da Patente dos E.U.A. n.s 5,877,012, 6,107,279, 6,137,033, 7,244,820, 7,615,686 e 8,237,020 e similares. Outras proteínas VIP são bem conhecidas para um indivíduo versado na técnica (consultar, lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html que pode ser acessado pela rede mundial de computadores on com o uso do prefixo www). As proteínas pesticidas também incluem proteínas de complexo de toxina (TC), obteníveis a partir de organismos, tal como Xenorhabdus, Photorhabdus e Paenibacillus (consultar as Patentes números US 7.491.698 e 8.084.418) . Algumas proteínas TC têm atividade inseticida autônoma e outras proteínas TC melhoram a atividade das toxinas autônomas produzidas pelo mesmo dado organismo. A toxicidade de uma proteína TC autônoma (de Photorhabdus, Xenorhabdus ou Paenibacillus, por exemplo) pode ser melhorada por um ou mais potenciadores de proteína TC derivados de um organismo-fonte de um gênero diferente. Há três tipos principais de proteínas TC. Conforme referido no presente documento, as proteínas de Classe A (Proteína A) são toxinas autônomas. As proteínas de Classe B (Proteína B) e as proteínas de Classe C (Proteína C) melhoram a toxicidade das proteínas de Classe A. Os exemplos de proteínas de Classe A são TcbA, TcdA, XptAl e XptA2. Os

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110/163 exemplos de proteínas de Classe B são TcaC, TcdB, XptBlXb e XptCIWi. Os exemplos de proteínas de Classe C são TccC, XptClXb e XptBIWi. As proteínas pesticidas também incluem proteínas de veneno de aranha, cobra e escorpião. Exemplos de peptídeos de venom de aranha incluem, mas sem limitação, peptídeos de licotoxina-1 e mutantes dos mesmos (Patente dos E.U.A. n.a 8,334,366).

[0162] Os transgenes adicionais que conferem resistência a insetos podem regular descendentemente a expressão de genes de direcionamento em espécies de praga de inseto por moléculas de ácido ribonucleico (RNA) interferentes através de interferência de RNA. A interferência de RNA se refere ao processo de silenciamento de gene pós-transcrição específico de sequência em animais mediado por RNAs de interferência curta (siRNAs) (Fire, et al. , (1998) Nature 391:806) . Os transgenes de RNAi podem incluir, porém sem limitação, a expressão de moléculas de dsRNA, siRNA, miRNA, iRNA, RNA antissenso ou RNA senso que regulam descendentemente a expressão dos genes-alvo em pragas de insetos. A Publicação PCT n.° WO 2007/074405 descreve métodos para inibir a expressão de genes de direcionamento em pragas invertebradas incluindo besouro do Colorado da batata. A Publicação PCT n.° WO 2005/110068 descreve métodos para inibir a expressão de genes de direcionamento em pragas invertebradas incluindo, em particular, verme da raiz do milho do oeste como um meio para controlar a infestação de inseto. Adicionalmente, a Publicação PCT n.° WO 2009/091864 descreve composições e métodos para a supressão de genes de direcionamento de espécies de praga de inseto incluindo pragas do gênero Lygus.

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111/163 [0163] Transgenes de RNAi são fornecidos para direcionar a subunidade de ATPase H vacuolar, úteis para controlar uma população de pragas de Coleópteros e infestação conforme descrito na Publicação de Pedido de Patente dos E.U.A. n.° 2012/0198586. A Publicação PCT WO 2012/055982 descreve um ácido ribonucleico (RNA ou RNA de filamento duplo) que inibe ou regula de modo decrescente a expressão de um gene-alvo que codifica: uma proteína ribossômica de inseto, como a proteína ribossômica L19, a proteína ribossômica L40 ou a proteína ribossômica S27A; uma subunidade de proteassoma de inseto, como a proteína Rpn6, a Pros 25, a proteína Rpn2, a proteína de subunidade beta 1 de proteassoma ou a proteína Pros beta 2; um β-coatômero de inseto da vesícula COPI, o γ-coatômero da vesícula COPI, a proteína de β'-coatômero ou o ζ-coatômero da vesícula COPI; uma proteína Tetraspanina 2 A de inseto que é uma proteína de domínio de transmembrana putativa; uma proteína de inseto que pertence à família de actina, como Actina 5C; uma proteína ubiquitina-5E de inseto; uma proteína Sec23 de inseto que é um ativador de GTPase envolvido em transporte de proteína intracelular; uma proteína plissada de inseto que é uma miosina não convencional que está envolvida em atividade motora; uma proteína crooked neck de inseto que está envolvida na regulação de união de mRNA alternativo nuclear; uma proteína de subunidade G de H+-ATPase vacuolar de inseto e uma Tbp-1 de inseto, como uma proteína de ligação de Tat. A Publicação PCT WO 2007/035650 descreve um ácido ribonucleico (RNA ou RNA de filamento duplo) que inibe ou regula de modo decrescente a expressão de um gene-alvo que codifica Snf7. A Publicação de Pedido de Patente dos E.U.A. n.° 2011/0054007

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112/163 descreve elementos de silenciamento de polinucleotideo que direciona RPS10. A Publicação de Pedido de Patente dos E.U.A. n.° 2014/0275208 e US2015/0257389 descreve elementos de silenciamento de polinucleotideo que direcionam RyanR e PAT3. As publicações PCT número WO 2016/138106, WO 2016/060911, WO 2016/060912, WO 2016/060913 e WO 2016/060914 descrevem elementos de silenciamento de polinucleotideo que direcionam moléculas de ácido nucleico de subunidade de coatômero COPI que conferem resistência às pragas Coleoptera e Hemíptera. As Publicações de Pedido de Patente dos E.U.A. n.° 2012/029750, n.° US 20120297501, e n.° 2012/0322660 descrevem os ácidos ribonucleicos interferentes (RNA ou RNA de fita dupla) que funcionam mediante captação por uma espécie de praga de inseto para regular de modo descendente a expressão de um gene de direcionamento na dita praga de inseto, em que o RNA compreende pelo menos um elemento de silenciamento, em que o elemento de silenciamento é uma região de RNA de fita dupla que compreende fitas complementares aneladas, em que uma fita compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos parcialmente complementar a uma sequência de direcionamento de nucleotídeo dentro do gene de direcionamento. A Publicação de Pedido de Patente dos E.U.A. n.° 2012/0164205 descreve direcionamentos potenciais para ácidos ribonucleicos de fita dupla interferentes para inibir pragas invertebradas incluindo: uma Sequência Homóloga Chd3, uma Sequência Homóloga de Beta-Tubulina, uma Sequência Homóloga de ATPase V de 40 kDa, uma Sequência Homóloga de EFla, uma Sequência Homóloga p28 de Subunidade de Proteassoma 26S, uma Sequência Homóloga de Hidrolase de Epóxido de Hormônio

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Juvenil, uma Sequência Homóloga de Proteína de Canal de Cloreto Dependente de Inchaço, uma Sequência Homóloga de Proteína Glicose-6-Fosfato 1-Desidrogenase, uma Sequência Homóloga de Proteína Act42A, uma Sequência Homóloga de Fator 1 de Ribosilação de ADP, uma Sequência Homóloga de Proteína de Fator IIB de Transcrição, umas Sequências Homólogas de Quitinase, uma Sequência Homóloga de Enzima de Conjugação de Ubiquitina, uma Sequência Homóloga de Gliceraldeído-3Fosfato Desidrogenase, uma Sequência Homóloga de Ubiquitina B, um Homólogo de Esterase de Hormônio Juvenil e uma Sequência Homóloga de Alfa Tubulina.

Uso em Controle de Pesticida [0164] Os métodos gerais para empregar cepas que compreendem uma sequência de ácido nucleico das modalidades ou uma variante da mesma em controle de pesticida ou na projeção de outros organismos como agentes pesticidas são conhecidos na técnica.

[0165] Os hospedeiros de micro-organismos que são conhecidos por ocupar a fitosfera (filoplano, filosfera, rizosfera e/ou rizoplana) de uma ou mais culturas de interesse podem ser selecionados. Esses micro-organismos são selecionados de modo a terem capacidade para competir com sucesso no ambiente específico com os micro-organismos do tipo selvagem, fornecem manutenção e expressão estáveis do gene (ou genes) que expressa um ou mais dos polipeptídeos

IPD101 e, desejavelmente, pesticida contra degradação [0166] Alternativamente, produzido introduzindo-se fornecem proteção melhorada do e inativação ambiental.

o polipeptídeo IPD101 é um gene heterólogo em um hospedeiro celular

A expressão do gene heterólogo resulta,

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114/163 direta ou indiretamente, na produção intracelular e manutenção do pesticida. Essas células são, então, tratadas sob condições que prolongam a atividade da toxina produzida na célula guando a célula é aplicada ao ambiente de praga (ou pragas) de direcionamento. 0 produto resultante retém a toxicidade da toxina. Esses polipeptídeos de IPD101 naturalmente encapsulados podem então ser formulados de acordo com técnicas convencionais para a aplicação ao ambiente hospedando uma praga-alvo, por exemplo, água do solo, água e folhagem de plantas. Consultar, por exemplo, o documento n.° EPA 0192319 e as referências citadas no mesmo.

Composições Pesticidas [0167] Em algumas modalidades, os ingredientes ativos podem ser aplicados na forma de composições e podem ser aplicados na área de cultura ou planta a ser tratada, simultaneamente ou em sucessão, com outros compostos. Esses compostos podem ser fertilizantes, exterminadores de gramíneas, crioprotetores, tensoativos, detergentes, sabonetes pesticidas, óleos inativos, polímeros e/ou formulações de carreador de liberação por tempo ou biodegradável que permite a dosagem a longo prazo de uma área de direcionamento após uma aplicação única da formulação. Os mesmos também podem ser herbicidas seletivos, inseticidas químicos, virucidas, microbiocidas, amebicidas, pesticidas, fungicidas, bactericidas, nematocidas, moluscicidas ou misturas de diversas dentre essas preparações, se desejado, junto com carreadores adicionais aceitáveis de modo agrícola, tensoativos ou adjuvantes de promoção de aplicação empregados de modo costumeiro na técnica de formulação. Os carreadores e adjuvantes adequados

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115/163 podem ser sólidos ou líquidos e correspondem às substâncias empregadas de modo comum na tecnologia de formulação, por exemplo, substâncias minerais naturais ou regeneradas, solventes, dispersantes, agentes umectantes, acentuadores de pegajosidade, ligantes ou fertilizantes. De modo similar, as formulações podem ser preparadas em iscas comestíveis ou fabricadas em armadilhas para praga para permitir alimentação ou ingestão por uma praga alvo da formulação pesticida.

[0168] Os métodos de aplicação de um ingrediente ativo ou uma composição agroquímica que contém pelo menos um dos polipeptídeo (ou polipeptídeos) IPD101 produzido através das cepas bacterianas incluem aplicação em folha, revestimento de semente e aplicação em solo. O número de aplicações e a taxa de aplicação dependem da intensidade da infestação pela praga correspondente.

[0169] A composição pode ser formulada como um pó, poeira, pélete, grânulo, aspersão, emulsão, coloide, solução ou semelhantes, e pode ser preparada por tais meios convencionais, como dessecação, liofilização, homogeneização, extração, filtração, centrifugação, sedimentação ou concentração de uma cultura de células que compreende o polipeptídeo. Em todas as tais composições que contêm pelo menos um tal polipeptídeo pesticida, o polipeptídeo pode estar presente em uma concentração de cerca de 1% a cerca de 99% em peso.

[0170] As pragas de Lepidópteros, Diptera, Heteroptera, nemátodos, Hemiptera ou Coleópteros podem ser exterminadas ou reduzidas em números em uma dada área pelos métodos da revelação ou podem ser aplicados de modo profilático em uma

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116/163 área ambiental para impedir a infestação por uma praga suscetível. Preferencialmente, a praga ingere ou faz contato com uma quantidade eficaz para pesticida do polipeptídeo. Quantidade eficaz para pesticida, conforme usado no presente documento, se refere a uma quantidade do pesticida que é capaz de exterminar pelo menos uma praga ou reduzir de modo notável o crescimento, alimentação ou desenvolvimento fisiológico normal de praga. Essa quantidade irá variar dependendo de tais fatores como, por exemplo, as pragas-alvo específicas a serem controladas, o ambiente específico, a localização, a planta, cultura ou local agrícola a ser tratado, as condições ambientais e o método, taxa, concentração, estabilidade e quantidade de aplicação de composição polipeptídica eficaz para pesticida. As formulações também podem variar em relação a condições climáticas, considerações ambientais e/ou frequência de aplicação e/ou severidade de infestação de praga.

[0171] As composições pesticidas descritas podem ser feitas formulando-se a célula bacteriana, cristal e/ou suspensão de esporo ou componente de proteína isolada com o carreador aceitável de modo agrícola desejado. As composições podem ser formuladas antes da administração em meios apropriados, como liofilizada, secada a frio, dessecada ou em um carreador, meio ou diluente aquoso adequado, como salino ou outro tampão. As composições formuladas podem estar na forma de uma poeira ou material granular ou uma suspensão em óleo (vegetal ou mineral) ou água ou emulsões de óleo/água ou como um pó molhável ou em combinação com qualquer outro material carreador adequado para aplicação agrícola. Os carreadores agrícolas adequados

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117/163 podem ser sólidos ou líquidos e são bem conhecidos na técnica. 0 termo carreador aceitável de modo agrícola abrange todos os adjuvantes, componentes inertes, dispersantes, tensoativos, aprimoradores de pegajosidade, ligantes, etc. que são usados de modo comum na tecnologia de formulação de pesticida; esses são bem conhecidos por aqueles versados na técnica de formulação de pesticida. As formulações podem ser misturadas com um ou mais adjuvantes sólidos ou líquidos e preparados por vários meios, por exemplo, por mistura de modo homogêneo, mescla e/ou moagem da composição pesticida com adjuvantes adequados com o uso de técnicas de formulação convencional. As formulações e métodos de aplicação adequados são descritos na Patente dos E.U.A. n.° 6.468.523. As plantas também podem ser tratadas com uma ou mais composições químicas, incluindo um ou mais herbicidas, inseticidas ou fungicidas. As composições químicas exemplificativas incluem: Herbicidas____de Frutas/Vegetais: Atrazina, Bromacil, Diuron, Glifosato, Linuron, Metribuzin, Simazina, Trifluralina, Fluazifope, Glufosinato, Halosulfuron Gowan, Paraquate, Propizamida, Setoxidim, Butafenacil, Halosulfuron, Indaziflam; Inseticidas de Frutas/Vegetais: Aldicarb, Bacillus thuriengiensis, Carbaryl, Carbofuran, Chlorpyrifos, Cypermethrin, Deltamethrin, Diazinon, Malathion, Abamectin, Cyfluthrin/beta-cyfluthrin, Esfenvalerate, Lambdacyhalothrin, Acequinocyl, Bifenazate, Methoxyfenozide, Novaluron, Chromafenozide, Thiacloprid, Dinotefuran, FluaCrypyrim, Tolfenpyrad, Clothianidin, Spirodiclofen, Gamma-cyhalothrin, Spiromesifen, Spinosad, Rynaxypyr, Cyazypyr, Spinoteram, Triflumuron, Spirotetramat,

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Imidacloprid, Flubendiamide, Thiodicarb, Metaflumizone, Sulfoxaflor, Cyflumetofen, Cyanopyrafen, Imidacloprid, Clothianidin, Thiamethoxam, Spinotoram, Thiodicarb, Flonicamid, Methiocarb, Emamectin-benzoate, Indoxacarb, Forthiazate, Fenamiphos, Cadusaphos, Pyriproxifen, Fenbutatin-oxid, Hexthiazox, Methomyl, 4-[[(6-Chlorpyridin3-yl)methyl] (2,2-difluorethyl) amino]furan-2(5H)-on;

Fungicidas de Frutas/Vegetais: Carbendazim, Clorotalonil, EBDCs, Enxofre, Tiofanato metilico, Azoxistrobina, Cimoxanil, Fluazinam, Fosetil, Iprodiona, Kresoxim metilico, Metalaxil/mefenoxam, Trifloxistrobina, Etaboxam, Iprovalicarbe, Trifloxistrobina, Fenexamida, fumarato de oxpoconazol, ciazofamida, Fenamidona, Zoxamida, Picoxistrobina, Piraclostrobina, Ciflufenamida, Boscalida; Herbicidas de Cereais: Isoproturon, Bromoxinil, loxinil, Fenóxidos, Clorosulfuron, Clodinafope, Diclofope, Diflufenican, Fenoxaprope, Florasulam, Fluoroxipir, Metsulfuron, Triasulfuron, Flucarbazona, lodosulfuron, Propoxicarbazona, Picolinafen, Mesosulfuron, Beflubutamida, Pinoxaden, Amidosulfuron, Tifensulfuron Metil, Tribenuron, Flupirsulfuron, Sulfosulfuron, Pirasulfotol, Piroxsulam, Flufenacet, Tralcoxidim, Piroxasulfon; Fungicidas de Cereais: Carbendazim, Clorotalonil, Azoxistrobina, Ciproconazol, Ciprodinil, Fenpropimorf, Epoxiconazol, Kresoxim metilico, Quinoxifen, Tebuconazol, Trifloxistrobina, Simeconazol, Picoxistrobina, Piraclostrobin, Dimoxistrobina, Protioconazol, Fluoxastrobin; Inseticidas de Cereais: Dimetoato, Lambdacialotrina, Deltametrina, alfa-Cipermetrina, β-ciflutrina, Bifentrina, Imidacloprida, Clotianidina, Tiametoxam,

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Tiaclopride, Acetamiprida, Dinetofuran, Clorpirifós, Metamidofós, Oxidemeton metilico, Pirimicarbe, Metiocarbe; Herbicidas de Mais: Atrazina, Alacloro, Bromoxinil, Acetocloro, Dicamba, Clopiralida, (S-)Dimetenamida, Glufosinato, Glifosato, Isoxaflutol, (S-)Metolacloro, Mesotriona, Nicosulfuron, Primisulfuron, Rimsulfuron, Sulcotriona, Foramsulfuron, Topramezona, Tembotriona, Saflufenacil, Tiencarbazona, Flufenacet, Piroxasulfon; Inseticidas de Mais: Carbofuran, Clorpirifós, Bifentrina, Fipronil, Imidacloprida, Lambda-Cialotrina, Teflutrina, Terbufós, Tiametoxam, Clotianidina, Espiromesifeno, Flubendiamida, Triflumuron, Rinaxipir, Deltametrina, Tiodicarbe, β-Ciflutrina, Cipermetrina, Bifentrina, Lufenuron, Triflumoron, Teflutrina,Tebupirimifós, Etiprol, Ciazipir, Tiacloprida, Acetamiprida, Dinetofurano, Avermectina, Metiocarbe, Espirodiclofeno, Espirotetramate; Fungicidas de Mais: Fenitropano, Tiram, Protioconazol, Tebuconazol, Trifloxistrobina; Herbicidas de Arroz: Butaclor, Propanil, Azimsulfuron, Bensulfuron, Cialofope, Daimuron, Fentrazamida, Imazosulfuron, Mefenacet, Oxaziclomefona, Pirazosulfuron, Piributicarbe, Quinclorac, Tiobencarbe, Indanofano, Flufenacete, Fentrazamida, Halosulfuron, Oxaziclomefona, Benzobiciclon, Piriftalida, Penoxsulam, Bispiribac, Oxadiargil, Etoxisulfuron, Pretilaclor, Mesotriona, Tefuriltriona, Oxadiazona, Fenoxaprope, Pirimisulfan; Inseticidas de Arroz: Diazinon, Fenitrotiona, Fenobucarb, Monocrotofós, Benfuracarbe, Buprofezina, Dinotefurano, Fipronil, Imidacloprida, Isoprocarbe, Tiacloprida, Cromafenozida, Tiacloprida, Dinotefurano, Clotianidina, Etiprol, Flubendiamida,

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Rinaxipir, Deltametrina, Acetamiprida, Tiametoxam, Ciazipir, Espinosade, Espinotoram, Benzoato de Emamectina, Cipermetrina, Clorpirifós, Cartape, Metamidofós, Etofenprox, Triazofós, 4-[[(6-Cloropiridin-3-il)metil](2,2— difluoretil)amino]furan-2(5H)-on, Carbofurano,

Benfuracarbe; Fungicidas de Arroz: Tiofanato metilico, Azoxistrobina, Carpropamida, Edifenfós, Ferimzone, Iprobenfós, Isoprotiolana, Pencicuron, Probenazol,

Piroquilon, Triciclazol, Trifloxistrobina, Diclocimet, Fenoxanil, Simeconazol, Tiadinil; Herbicidas de Algodão: Diuron, Fluometuron, MSMA, Oxifluorfen, Prometrina, Trifluralina, Carfentrazona, Cletodim, Fluazifope-butil, Glifosato, Norflurazon, Pendimetalina, Piritiobaque sódico, Trifloxisulfuron, Tepraloxidim, Glufosinato, Flumioxazin, Tidiazuron; Inseticidas de Algodão: Acefato, Aldicarbe, Clorpirifós, Cipermetrina, Deltametrina, Malation,

Monocrotofós, Abamectina, Acetamiprida, Benzoato de Emamectina, Imidacloprida, Indoxacarbe, Lambda-Cialotrina, Espinosade, Tiodicarbe, Gama-Cialotrina, Espiromesifeno, Piridalil, Flonicamida, Flubendiamida, Triflumuron, Rinaxipir, Beta-Ciflutrina, Espirotetramato, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprida, Dinetofurano, Flubendiamida, Ciazipir, Espinosade, Espinotoram, gama Cialotrina, 4— [ [ (6 — Cloropiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan2(5H)-on, Tiodicarbe, Avermectina, Flonicamida, Piridalil, Espiromesifeno, Sulfoxaflor, Profenofós, Triazofós,

Endosulfan; Fungicidas de Algodão: Etridiazol, Metalaxil, Quintozeno; Herbicidas de Soja: Alacloro, Bentazona, Trifluralina, Clorimuron Etilico, Cloransulam Metilico, Fenoxaprope, Fomesafen, Fluazifope, Glifosato, Imazamox,

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Imazaquin, Imazetapir, (S-)Metolacloro, Metribuzin, Pendimetalina, Tepraloxidim, Glufosinato; Inseticidas de So j a: Lambda-cialotrina, Metomil, Paration, Tiocarbe, Imidacloprida, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprida, Acetamiprida, Dinetofurano, Flubendiamida, Rinaxipir, Ciazipir, Espinosade, Espinotoram, Benzoato de Emamectina, Fipronil, Etiprole, Deltametrina, β-Ciflutrina, gama e lambda Cialotrina, 4-[ [ ( 6-Cloropiridin-3-il)metil](2,2— difluoretil)amino]furan-2(5H)-on, Espirotetramate, Espinodiclofeno, Triflumuron, Flonicamida, Tiodicarbe, beta-Ciflutrina; Fungicidas de Soja: Azoxistrobina, Ciproconazol, Epoxiconazol, Flutriafol, Piraclostrobina, Tebuconazol, Trifloxistrobina, Protioconazol, Tetraconazol; Herbicidas de Beterraba sacarina: Cloridazon, Desmedifam, Etofumesato, Fenmedifam, Trialato, Clopiralida, Fluazifope, Lenacil, Metamitron, Quinmerac, Cicloxidim, Triflusulfuron, Tepraloxidim, Quizalofope; Inseticidas de Beterraba sacarina: Imidacloprida, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprida, Acetamiprida, Dinetofurano, Deltametrina, βCiflutrina, gama/lambda Cialotrina, 4-[ [ ( 6-Cloropiridin-3il)metil] (2,2-difluoretil) amino]furan-2(5H)-on, Teflutrina, Rinaxipir, Ciaxipir, Fipronil, Carbofurano; Herbicidas de Canola: Clopiralida, Diclofope, Fluazifope, Glufosinato, Glifosato, Metazaclor, Trifluralina Etametsulfuron, Quinmerac, Quizalofope, Cletodim, Tepraloxidim; Fungicidas de Canola: Azoxistrobina, Carbendazim, Fludioxonil, Iprodiona, Procloraz, Vinclozolina; Inseticidas de Canola: Organofosfatos de carbofurano, Piretroides, Tiacloprida, Deltametrina, Imidacloprida, Clotianidina, Tiametoxam, Acetamiprida, Dinetofurano, β-Ciflutrina, gama e lambda

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Cialotrina, tau-Fluvaleriato, Etiprol, Espinosade, Espinotoram, Flubendiamida, Rinaxipir, Ciazipir, 4—[[(6— Cloropiridin-3-il) met11] (2,2-difluoretil)amino]furan2(5H)-on.

[0172] Em algumas modalidades, o herbicida é Atrazina, Bromacil, Diuron, Clorsulfuron, Metsulfuron, Tifensulfuron Metil, Tribenuron, Acetoclor, Dicamba, Isoxaflutole, Nicosulfuron, Rimsulfuron, Piritiobaque-sódico,

Flumioxazin, Clorimuron-Etil, Metribuzin, Quizalofop, Smetolaclor, Hexazinona ou combinações dao mesmos.

[0173] Em algumas modalidades, o inseticida é Esfenvalerato, Clorantraniliprol, Metomil, Indoxacarbe, Oxamil ou combinações dos mesmos.

Atividade pesticida e inseticida [0174] Praga inclui, mas sem limitação, insetos, fungos, bactérias, nemátodos, ácaros, carrapatos e semelhantes. As pragas de inseto incluem insetos selecionados dentre as ordens Coleóptera, Diptera,

Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura,

Siphonaptera, Trichoptera, etc., particularmente Lepidoptera e Coleóptera.

[0175] Aqueles versados na técnica reconhecerão que nem todos os compostos são igualmente eficazes contra todas as pragas. Os compostos das modalidades exibem atividade contra pragas de inseto, que podem incluir pragas agronômicas, florestais, estufas, viveiros, plantas ornamentais, alimentos e fibras, de saúde pública e animal, de estrutura doméstica e comercial, domésticas e de produtos armazenados de importância econômica.

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123/163 [0176] Larvas da ordem Lepidoptera incluem, mas sem limitação, lagartas-militares, larvas cortadoras, lagartas falsa-medideiras e lagartas da maçã-do-algodoeiro na família Noctuidae Spodoptera frugíperda JE Smith (lagarta-militar do outono); S. exígua Hübner (lagarta-militar da beterraba); S. lítura Fabricius (lagarta cortadora do tabaco, lagartarosca de tabaco); Mamestra configurata Walker (lagartamilitar bertha); M. brassicae Linnaeus (traça do repolho); Agrotis ípsílon Hufnagel (lagarta-rosca); A. orthogonia Morrison (lagarta-rosca ocidental); A. subterrânea Fabricius (lagarta-rosca granulada); Alabama argillacea Hübner (Curuquerê-do-algodoeiro); Trichoplusia ni Hübner (falsamedideira da couve); Pseudoplusia includens Walker (falsamedideira da soja); Anticarsia gemmatalis Hübner (lagartada-soja); Hypena scabra Fabricius (verme-de-trevo verde); Heliothis virescens Fabricius (lagarta da maça); Pseudaletia unipuncta Haworth (lagarta-militar); Athetis mindara Barnes e Mcdunnough (lagarta-rosca de pele áspera); Euxoa messoria Harris (lagarta-rosca de lado escuro); Earias insulana Boisduval (lagarta capulho espinhosa); E. vittella Fabricius (lagarta capulho pontilhada); Helicoverpa armigera Hübner (lagarta capulho americana); H. zea Boddie (lagarta de espiga de milho ou lagarta de capulho de algodão); Melanchra picta Harris (lagartas zebra); Egira (Xylomyges) curialis Grote (lagarta-rosca de citros); brocas, traça-das-paredes, lagartas cone e skeletonizers da familiaPyralidae Ostrinia nubilalis Hübner (broca de milho europeia); Ãmyelois transitella Walker (lagarta de laranja naval); Anagasta kuehniella Zeller (Traça do trigo mediterrâneo); Cadra cautella Walker (traça-do-cacau); Chilo suppressalis Walker

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124/163 (broca de caule de arroz); C. partellus, (broca de sorgo); Corcyra cephaloníca Stainton (traça de arroz); Crambus caliginosellus Clemens (lagarta de rede de raiz de milho); C. teterrellus Zincken (lagarta que tece teia de gramíneas); Cnaphalocrocis medinalis Guenée (traça tortricídea de arroz); Desmia funeralis Hübner (dobrador de folha de uva); Díaphanía hyalínata Linnaeus (lagarta de melão); D. nítídalís Stoll (lagarta de picles); Diatraea grandíosella Dyar (broca de milho sudoeste), D. saccharalís Fabricius (broca de cana-de-açúcar); Eoreuma loftini Dyar (broca de arroz mexicano); Ephestía elutella Hübner (traça do tabaco (cacau); Galleria mellonella Linnaeus (traça grande da cera); Herpetogramma licarsisalis Walker (lagarta de rede de céspede); Homoeosoma electellum Hulst (traça de girassol); Elasmopalpus lignosellus Zeller (broca-do-colo); Achroia grisella Fabricius (traça da cera) ; Loxostege sticticalis Linnaeus (lagarta de rede de beterraba); Orthaga thyrisalis Walker (mariposa teia da árvore do chá); Maruca testulalis Geyer (broca de feijão); Plodia interpunctella Hübner (Mariposa de refeição Indiana); Scirpophaga incertulas Walker (broca do tronco amarelo); Udea rubigalis Guenée (traça do aipo); e lagartas enroladeiras, lagartas de broto, lagartas de semente e lagartas de fruta na família Tortricidae Aderis gloverana Walsingham (lagarta de broto de cabeça preta do oeste); A. variana Fernald (lagarta de broto de cabeça preta do leste); Archips argyrospila Walker (lagarta enroladeira de árvore frutífera); A. rosana Linnaeus (lagarta enroladeira europeia); e outras espécies Archips, Adoxophyes orana Fischer von Rõsslerstamm (traça tortricídea dos frutos de verão); Cochylis hospes Walsingham

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125/163 (mariposa bandeada de girassol); Cydia latiferreana Walsingham (traça da avelaneira) ; C. pomonella Linnaeus (Bichado das 5 pomoideas); Platynota flavedana Clemens (lagarta enroladeira de folha variegado); P. stultana Walsingham (lagarta enroladeira de folha de onívoro); Lobesia botrana Denis & Schiffermüller (Eudémis); Spilonota ocellana Denis & Schiffermüller (traça vermelha dos 10 gomos); Endopiza víteana Clemens (mariposa de bagas de uva); Eupoecilia ambíguella Hübner (Cochilis); Bonagota salubrícola Meyrick (Lagarta enroladeira da maçã); Grapholita molesta Busck (Traça oriental do pessegueiro); Suleima helianthana Riley (mariposa de broto de girassol); Argyrotaenia spp.; Choristoneura spp. .

[0177] Outras pragas agronômicas selecionadas da ordem Lepidóptera incluem, mas sem limitação, Alsophila pometaria Harris (locustas); Anarsia lineatella Zeller (broca do pêssego); Anisota sanatoria J.E. Smith (lagarta de carvalho de listras laranjas); Antheraea pernyi Guérin-Méneville (Traça de Tussah de Carvalho Chinesa); Bombyx mori Linnaeus (Mariposa-de-seda); Bucculatrix thurberiella Busck (Lagarta mineradora das folhas); Colias eurytheme Boisduval (lagarta de alfalfa); Datana integerrima Grote & Robinson (lagarta de nogueira); Dendrolimus sibiricus Tschetwerikov (Mariposade-seda siberiana), Ennomos subsignaria Hübner (lagarta de olmoErannis tiliaria Harris (mede-palmo de tília); Euproctis chrysorrhoea Linnaeus (maripora de rabo marrom); Harrisina americana Guérin-Méneville (skeletonizer de folha de uva); Hemileuca oliviae Cockrell (lagarta de faixa); Hyphantria cunea Drury (larva de teias de outono); Keiferia lycopersicella Walsingham (oxiúro de tomate); Lambdina

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126/163 fiscellaria fiscellaria Hulst (lagarta-enroladora de cicuta do leste); L. fiscellaria lugubrosa Hulst (lagartaenroladora de cicuta do oeste); Leucoma salicis Linnaeus (mariposa de cetim); Lymantria dispar Linnaeus (mariposacigana); Manduca quinquemaculata Haworth (mariposa falcão de 5 manchas, hornworm de tomate); M. sexta Haworth (hornworm de tomate, hornworm de tabaco); Operophtera brumata Linnaeus (Traça de inverno); Paleacrita vernata Peck (lagarta de gangrena de primavera); Papilio cresphontes Cramer (calda engolidora gigante, cachorro laranja); Phryganidia californica Packard (lagarta de carvalho da Califórnia); Phyllocnistis citrella Stainton (minerador de folha de citros); Phyllonorycter blancardella Fabricius (minerador de folha manchado); Pieris brassicae Linnaeus (borboleta grande branca); P. rapae Linnaeus (borboleta pequena branca); P. napi Linnaeus (borboleta branca com verde raiado); Platyptilia carduidactyla Riley (mariposa plumosa de alcachofra); Plutella xylostella Linnaeus (mariposa de costas de diamante); Pectinophora gossypiella Saunders lagarta capulho rosa) ; Pontia protodice Boisduval and Leconte (lagarta de repolho do sul); Sabulodes aegrotata Guenée (lagarta enroladora de onivoros); Schizura concinna J.E. Smith (lagarta arqueada vermelha); Sitotroga cerealella Olivier (mariposa Angoumois dos cereais); Thaumetopoea pityocampa Schiffermuller (mariposa processionária do pinheiro); Tineola bisselliella Hummel (traça doméstica de riscas); Tuta absoluta Meyrick (lagarta mineira do tomate); Yponomeuta padella Linnaeus (mariposa arminho); Heliothis subflexa Guenée; Malacosoma spp. e Orgyia spp.

[0178] São de interesse as larvas e os adultos da ordem

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Coleoptera incluindo gorgulhos das famílias Anthribidae, Bruchidae e Curculionidae (incluindo, mas sem limitação: Anthonomus grandís Boheman (bicudo-do-algodeiro) ; Lissorhoptrus oryzophílus Kuschel (gorgulho da água do arroz); Sitophilus granaríus Linnaeus (gorgulho do celeiro); S. oryzae Linnaeus (gorgulho do arroz); Hypera punctata Fabricius (gorgulho da folha de trevo); Cylindrocopturus adspersus LeConte (gorgulho do caule de girassol); Smicronyx fulvus LeConte (gorgulho vermelho da semente de girassol); S. sordidus LeConte (gorgulho cinzento da semente de girassol); Sfenophorus maídís Chittenden (gorgulho do mais)); besouros-pulga, besouros do pepino, vermes da raiz, besouros da folha, besouros da batata e lagartas mineiras na família Chrysomelidae (incluindo, mas sem limitação: Leptinotarsa decemlíneata Say (besouro do Colorado da batata); Diabrotica virgifera virgifera LeConte (verme de raiz do milho ocidental); D. barber! Smith e Lawrence (verme de raiz do milho do norte); D. undecímpunctata howardí Barber (verme de raiz do milho do sul); Chaetocnema pulícaría Melsheimer (besouro-pulga do milho); Phyllotreta crucíferae Goeze (besouro-pulga crucífero); Phyllotreta striolata (besouro-pulga listrado); Colaspis brunnea Fabricius (colaspis da uva); Oulema melanopus Linnaeus (besouro da folha de cereal); Zygogramma exclamationis Fabricius (besouro do girassol)); besouros da família Coccinellidae (incluindo, mas sem limitação: Epilachna varivestis Mulsant (besouro mexicano do feijão)); Escaravelhos e outros besouros da família Scarabaeidae (incluindo, mas sem limitação: Popillia japonica Newman (besouro japonês); Cyclocephala borealis Arrow (escaravelho mascarado do norte,

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128/163 escaravelho branco); C. immaculata Olivier (escaravelho mascarado do sul, escaravelho branco); Rhízotrogus majalís Razoumowsky (escaravelho europeu); Phyllophaga críníta Burmeister (escaravelho branco); Lígyrus gíbbosus De Geer (besouro da cenoura)); besouros de carpete da família Dermestidae; larvas-arame da família Elateridae, Eleodes spp., Melanotus spp.; Conoderus spp.; Limonius spp. ; Agriotes spp.; Ctenicera spp.; Aeolus spp.; besouros da casca da família Scolytidae e besouros da família Tenebrionidae.

[0179] Adultos e imaturos da ordem Diptera são de interesse, incluindo lagartas mineiras Agromyza parvicornis Loew (lagarta mineira da folha do milho); moscas (incluindo, mas sem limitação: Contarinia sorghicola Coquillett (mosca do sorgo); Mayetiola destructor Say (mosca Hessian); Sitodiplosis mosellana Géhin (mosca do trigo); Neolasioptera murtfeldtiana Felt, (mosca da semente do girassol)); moscas dos frutos (Tephritidae), Oscinella frit Linnaeus (moscas dos frutos); vermes (incluindo, mas sem limitação: Delia platura Meigen (verme da semente do milho); D. coarctata Fallen (mosca do bulbo do trigo) e outra Delia spp., Meromyza americana Fitch (verme do caule do trigo); Musca domestica Linnaeus (moscas domésticas); Fannia canicularis Linnaeus, F. femoralis Stein (moscas menores domésticas); Stomoxys calcitrans Linnaeus (moscas estáveis)); moscas da face, moscas de corno, moscas de sopro, Chrysomya spp.; Phormia spp. e outras pragas de moscas, moscas dos cavalos Tabanus spp.; moscas da família Gastrophilus spp.; Oestrus spp.; besouros do gado Hypoderma spp.; moscas dos veados Chrysops spp.; Melophagus ovinus Linnaeus (keds) e outra Brachycera,

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129/163 mosquitos Aedes spp.; Anopheles spp.; Culex spp.; moscas negras Prosimulium spp.; Simulium spp.; moscas mordedoras, moscas da areia, esciarídeos e outros Nematocera.

[0180] Incluídos como insetos de interesse estão adultos e ninfas das ordens Hemiptera e Homóptera, tais como, mas sem limitação, adelgídeo da família Adelgidae, insetos de planta da família Miridae, cicadas da família Cicadidae, cigarrinhas, Empoasca spp.; da Cicadellidae, cigarrinhas de plantas das famílias Cixiidae, Flatidae, Fulgoroidea, Issidae e Delphacidae, cigarrinhas de árvore da família Membracidae, psilídeos da família Psyllidae, moscas-brancas da família Aleyrodidae, afídeos da família Aphididae, pfiloxera da família Phylloxeridae, cochonilhas-farinhentas da família Pseudococcidae, escalas das famílias Asterolecanidae, Coccidae, Dactylopiidae, Diaspididae, Eriococcidae Ortheziidae, Phoenicococcidae e Margarodidae, percevejo-de-renda da família Tingidae, percevejos da família Pentatomidae, percevejos-de-cincha, Blissus spp.; e outros percevejos de semente da família Lygaeidae, cigarrinhas da família Cercopidae, percevejos de polpa da família Coreidae e percevejos vermelhos e percevejos manchados de algodão da família Pyrrhocoridae.

[0181] Os membros agronomicamente importantes da ordem Hemiptera incluem adicionalmente, mas sem limitação: Acyrthisiphon pisum Harris (afídeo de ervilha) ; Aphis craccivora Koch (afídeo do feijão-frade); A. fabae Scopoli (afídeo do feijão preto); A. gossypii Glover (afídeo do algodão, afídeo do melão); A. maidiradicis Forbes (afídeo da raiz de milho) ; A. pomi De Geer (afídeo da maçã) ; A. spiraecola Patch (afídeo de spiraea); Aulacorthum solani

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Kaltenbach (afideo de Dedalis); Chaetosiphon fragaefolii Cockerell (afideo do morango); Díuraphís noxia Kurdjumov/Mordvilko (afideo do trigo russo); Dysaphis plantaginea Paaserini (afideo cinzento da macieira); Eriosoma lanigerum Hausmann (afideo lanigero das macieiras); Brevicoryne brassicae Linnaeus (afideo do repolho); Hyalopterus pruni Geoffroy (afideo farinhento da ameixa); Lipaphis erysimi Kaltenbach (afideo do nabo); Metopolophium dirrhodum Walker (afideo do cereal); Macrosiphum euphorbiae Thomas (afideo da batata); Myzus persicae Sulzer (afideo do pessegueiro, afideo verde do pessegueiro); Nasonovia ribisnigri Mosley (afideo do alface); Pemphigus spp. (afideos da raiz e afideos de galha); Rhopalosiphum maidis Fitch (afideo da folha do milho); R. padi Linnaeus (afideoda-cerejeira-brava); Schizaphis graminum Rondani (pulgão dos cereais); Sipha flava Forbes (afideo amarelo da cana-deaçúcar); Sitobion avenae Fabricius (afideo inglês dos grãos); Therioaphis maculata Buckton (afideo manchado da alfafa); Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe (afideo preto dos citrinos) e T. citricida Kirkaldy (afideo marrom dos citrinos); Adelges spp. (adelgideos); Phylloxera devastatrix Pergande (filoxera de nogueira-pecã); Bemisia tabaci Gennadius (mosca-branca do tabaco, mosca-branca da batata doce); B. argent!folii Bellows & Perring (moscabranca da folha de prata); Dialeurodes citri Ashmead (moscabranca dos citrinos); Trialeurodes abutiloneus (mosca-branca de asa listrada) e T. vaporariorum Westwood (mosca-branca de estufa); Empoasca fabae Harris (cigarrinha da batata); Laodelphax striatellus Fallen (cigarrinha menor marrom); Macrolestes quadrilineatus Forbes (cigarrinha de áster);

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Nephotettix cinticeps Uhler (cigarrinha verde); N. nígropíctus Stâl (cigarrinha do arroz); Nilaparvata lugens Stal (cigarrinha marrom); Peregrinus maidis Ashmead (cigarrinha do milho); Sogatella furcifera Horvath (cigarrinha de costas brancas); Sogatodes orizicola Muir (delfacideo do arroz); Typhlocyba pomaria McAtee (cigarrinha branca da macieira); Erythroneoura spp. (cigarrinhas da uva) ; Magicicada septendecim Linnaeus (cigarra periódica); Icerya purchase Maskell (pulgão branco); Quadraspidiotus perniciosus Comstock (pulgão de São José); Pianococcus citri Risso (cochonilha dos citrinos); Pseudococcus spp. (outro complexo de cochonilha); Cacopsylla pyricola Foerster (psilideo da pera); Trioza diospyri Ashmead (psilideo do caqui).

[0182] Espécies agronomicamente importantes de interesse da ordem Hemíptera incluem, mas sem limitação: Acrosternum hilare Say (percevejo verde); Anasa tristis De Geer (escaravelho da abóbora); Blissus leucopterus leucopterus Say (escaravelho das gramíneas); Corythuca gossypii Fabricius (escaravelho da renda de algodão); Cyrtopeltis modesta Distant (escaravelho do tomate); Dysdercus suturellus Herrich-Schãffer (percevejo manchador de algodão); Euschistus servus Say (percevejo marrom); E. variolarius Palisot de Beauvois (percevejo manchado);

Graptostethus spp. (complexo de escaravelhos de semente); Leptoglossus corculus Say (escaravelho de semente de pinheiro de pé em folha); Lygus lineolaris Palisot de Beauvois (escaravelho manchado da planta); L. Hesperus Knight (escaravelho ocidental manchado da planta); L. pratensis Linnaeus (escaravelho comum de prado); L.

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132/163 rugulipennis Poppius (escaravelho europeu manchado da planta); Lygocorís pabulínus Linnaeus (capsídeo verde comum); Nezara viridula Linnaeus (percevejo verde do sul); Oebalus pugnax Fabricius (percevejo do arroz); Oncopeltus fasciatus Dallas (escaravelho grande da asclépia); Pseudatomoscelis seriatus Reuter (pulga do algodão).

[0183] Adicionalmente, as modalidades podem ser eficazes contra Hemiptera como Calocoris norvegicus Gmelin (escaravelho do morango); Orthops campestris Linnaeus; Plesiocoris rugicollis Fallen (capsídeo da maçã); Cyrtopeltis modestus Distant (escaravelho do tomate); Cyrtopeltis notatus Distant (mosca); Spanagonicus albofasciatus Reuter (pulga de marca branca); Diaphnocoris chloríonís Say (escaravelho de espinheiro-da-Virgínia); Labopidicola allii Knight (escaravelho da planta de cebola); Pseudatomoscelis seriatus Reuter (pulga do algodão); Adelphocoris rapidus Say (escaravelho rápido da planta); Poecilocapsus lineatus Fabricius (escaravelho da planta de quatro linhas); Nysius ericae Schilling (escaravelho falso das gramíneas); Nysius raphanus Howard (escaravelho falso das gramíneas); Nezara viridula Linnaeus (percevejo verde do sul); Eurygaster spp.; Coreidae spp.; Pyrrhocoridae spp.; Tinidae spp.; Blostomatidae spp.; Reduviidae spp. e Cimicidae spp.

[0184] Também são incluídos os adultos e as larvas da ordem Acari (ácaros), como Aceria tosichella Keifer (ácaro do enrolamento do trigo); Petrobia latens Müller (ácaro marrom do trigo); ácaros aranhas e ácaros vermelhos na família Tetranychidae, Panonychus ulmi Koch (ácaro vermelho europeu); Tetranychus urticae Koch (ácaro aranha de duas

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133/163 manchas); (T. mcdanieli McGregor (ácaro McDaniel); T. cínnabarínus Boisduval (ácaro aranha carmim); T. turkestaní Ugarov & Nikolski (ácaro aranha do morango); ácaros planos na família Tenuipalpidae, Brevipalpus lewísí McGregor (ácaro plano dos citrinos); ácaros da ferugem e do broto na família Eriophyidae e outros ácaros de alimentação foliar e ácaros importantes na saúde humana e animal, isto é, os ácaros de poeira na família Epidermoptidae, ácaros do foliculo na família Demodicidae, ácaros dos grãos na família Glycyphagidae, carrapatos na ordem Ixodidae. Ixodes scapularís Say (carrapato de veado); I. holocyclus Neumann (carrapato da paralisia australiana); Dermacentor variabilis Say (carrapato do cão americano); Amblyomma americanum Linnaeus (carrapato lone star) e ácaros de sarna e coceira nas famílias Psoroptidae, Pyemotidae e Sarcoptidae.

[0185] As pragas de inseto da ordem Thysanura são de interesse, como Lepisma saccharins Linnaeus (traça); Thermobia domestica Packard (tesourinha).

[0186] As pragas de artrópodes adicionais abrangidas incluem: aranhas na ordem Araneae como Loxosceles reclusa Gertsch e Mulaik (aranha reclusa marrom) e a Latrodectus mactans Fabricius (aranha viúva negra) e centopeias na ordem Scutigeromorpha como Scutigera coleoptrata Linnaeus (centopeia doméstica).

[0187] As pragas de inseto de interesse incluem a superfamilia de percevejos e outros insetos relacionados incluindo, mas sem limitação, espécies que pertencem à família Pentatomidae (Nezara viridula, Halyomorpha halys, Piezodorus guildini, Euschistus servus, Acrosternum hilare, Euschistus heros, Euschistus tristigmus, Acrosternum hilare,

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Dichelops furcatus, Dichelops melacanthus e Bagrada hilaris (escaravelho Bagrada)), a família Plataspidae (Megacopta cribraria - Plataspid do feijão) e uma família Cydnidae (Scaptocoris castanea - percevejo da raiz) e espécies de Lepidópteros incluindo, mas sem limitação: traça-dascrucíferas, por exemplo, Helicoverpa zea Boddie; lagarta falsa-medideira, por exemplo, Pseudoplusia includens Walker e lagarta-da-soja por exemplo, Anticarsia gemmatalis Hübner. [0188] Os métodos para medir a atividade pesticida são bem conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Czapla e Lang, (1990) J. Econ. Entomol. 83:2.480 a 2.485; Andrews, et al. , (1988) Biochem. J. 252:199 a 206; Marrone, et al., (1985) J. of Economic Entomology 78:290 a 293 e a Patente dos E.U.A. n.° 5.743.477. Geralmente, a proteína é misturada e usada em ensaios de alimentação. Consultar, por exemplo Marrone, et al., (1985) J. of Economic Entomology 78:290 a 293. Tais ensaios podem incluir colocar plantas em contato com uma ou mais pragas e determinar a habilidade da planta para sobreviver e/ou causar o extermínio das pragas.

[0189] Nemátodos incluem nemátodos parasíticos, como nemátodos das galhas radiculares, formadores de cistos e lesões, incluindo Heterodera spp., Meloidogyne spp. e Globodera spp.; particularmente membros dos nemátodos de cisto, incluindo, mas sem limitação, Heterodera glycines (nemátodo do cisto da soja); Heterodera schachtii (nemátodo do cisto da beterraba); Heterodera avenae (nemátodo do cisto do cereal) e Globodera rostochiensis e Globodera pailida (nemátodo do cisto da batata) . Os nemátodos de lesão incluem Pratylenchus spp.

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Tratamento de Semente [0190] Para proteger e aprimorar as tecnologias de produção de rendimento e traço, as opções de tratamento de semente podem fornecer flexibilidade de plano de cultura adicional e controle custo-benef1cio contra insetos, gramíneas e doenças. O material de semente pode ser tratado, tipicamente tratado em superfície, com uma composição que compreende combinações de herbicidas químicos ou biológicos, fitoprotetores herbicidas, inseticidas, fungicidas, inibidores de germinação e aprimoradores, nutrientes, reguladores e ativadores de crescimento de planta, bactericidas, nematocidas, avicidas e/ou moluscicidas. Esses compostos são tipicamente formulados juntos com carreadores, tensoativos ou adjuvantes de promoção de aplicação adicionais empregados de modo costumeiro na técnica de formulação. Os revestimentos podem ser aplicados impregnando-se o material de propagação com uma formulação líquida ou por revestimento com uma formulação úmida ou seca combinada. Os exemplos dos vários tipos de compostos que podem ser usados como tratamentos de semente são fornecidos em The Pesticide Manual: A World Compendium, C.D.S. Tomlin Ed., publicado pelo British Crop Production Council.

[0191] Alguns tratamentos de semente que podem ser usados em semente de cultivo incluem, mas sem limitação, um ou mais dentre ácido abscísico, acibenzolar-S-metil, avermectina, amitrol, azaconazol, azospirillum, azadiractina, azoxistrobina, Bacillus spp. (o que inclui um ou mais espécies dentre cereus, firmus, megaterium, pumilis, sphaericus, subtilis e/ou thuringiensis), bradyrhizobium spp. (o que inclui um ou mais dentre betae, canariense,

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136/163 elkanii, iriomotense, japonicum, liaonigense, pachyrhizi e/ou yuanmingense), captana, carboxina, quitosana, clotianidina, cobre, ciazipir, difenoconazol, etidiazole, fipronil, fludioxonil, fluoxastrobina, fluquinconazol, flurazole, fluxofenim, proteína harpina, imazalil, imidacloprid, ipconazol, isoflavonoides, lipo-quitooligosacarídeo, mancozeb, manganês, maneb, mefenoxam, metalaxil, metconazol, miclobutanil, PCNB, penflufen, penicillium, pentiopirade, permetrina, picoxistrobina, protioconazol, piraclostrobina, rinaxipir, S-metolaclor, saponina, sedaxano, TCMTB, tebuconazol, tiabendazol, tiametoxam, tiocarb, thiram, tolclofos-metil, triadimenol, tricoderma, trifloxistrobina, triticonazol e/ou zinco. Revestimento de semente PCNB se refere ao Número de Registro EPA 00293500419, que contém quintozen e terrazol. TCMTB se refere a 2-(tiocianometiltio) benzotiazol.

[0192] As variedades de semente e sementes com traços transgênicos específicos podem ser testadas para determinar quais opções de tratamento de semente e taxas de aplicação podem complementar tais variedades e traços transgênicos a fim de aprimorar o rendimento. Por exemplo, uma variedade com potencial de rendimento satisfatório, mas a suscetibilidade à ferrugem do milho pode se beneficiar a partir do uso de um tratamento de semente que fornece a proteção contra ferrugem do milho, uma variedade com potencial de rendimento satisfatório, mas a suscetibilidade a nemátodo de cisto pode se beneficiar a partir do uso de um tratamento de semente que fornece proteção contra nemátodo de cisto, e assim por diante. De modo semelhante, uma variedade que abrange um traço transgênico que confere

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137/163 resistência a inseto pode se beneficiar a partir do segundo modo de ação conferido pelo tratamento de semente, uma variedade que abrange um traço transgênico que confere resistência a herbicida pode se beneficiar a partir de um tratamento de semente com um fitoprotetor que aprimora a resistência de plantas àquele herbicida, etc. Adicionalmente, o estabelecimento de raiz satisfatório e a emergência inicial resultantes do uso apropriado de um tratamento de semente podem resultar em um uso de nitrogênio mais eficaz, uma habilidade melhor para resistir à seca e um aumento geral em potencial de rendimento de uma variedade ou variedades que contêm um certo traço quando combinadas com um tratamento de semente.

Métodos para exterminar uma praga de inseto e controlar uma população de insetos [0193] Em algumas modalidades, os métodos são fornecidos para exterminar uma praga de inseto compreendendo colocar a praga de inseto, seja simultânea seja sequencialmente, em contato com uma quantidade eficaz em termos de inseticida de um polipeptídeo IPD101 recombinante da revelação. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para exterminar uma praga de inseto que compreendem colocar a praga de inseto em contato com uma quantidade eficaz em termos de inseticida de um ou mais dentre uma proteína pesticida recombinante das

SEQ	ID NOS:	2,	4, 6, 8, 10, 12,	14, 16, 18, 20, 22, 24,	25,
26,	28, 29,	30,	32, 46, 48, 50,	52, 54, 56, 58, e 60, ou	uma
variante ou	um	fragmento ativo	em termos de inseticida	das

mesmas.

[0194] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para controlar uma população de praga de inseto que

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138/163 compreendem colocar a população de praga de inseto, simultânea ou sequencialmente, em contato com uma quantidade eficaz em termos de inseticida de um ou mais dentre um polipeptídeo IPD101 recombinante da revelação. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para controlar uma população de praga de inseto que compreendem colocar a população de praga de inseto em contato com uma quantidade eficaz em termos de inseticida de um ou mais dentre um polipeptídeo IPD101 recombinante das SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 32, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, e 60, ou uma variante ou fragmento ativo em termos de inseticida das mesmas. Conforme usado no presente documento, controlar uma população de pragas ou controla uma praga se refere a qualquer efeito em uma praga que resulta na limitação do dano que a praga causa. Controlar uma praga inclui, mas sem limitação, exterminar a praga, inibir o desenvolvimento da praga, alterar a fertilidade ou crescimento da praga de tal maneira que a praga forneça menos dano à planta, diminuir o número de descendentes produzido, produzir pragas menos adaptadas, produzir pragas mais suscetíveis a ataque de predadores ou impedir as pragas de se alimentarem com a planta.

[0195] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para controlar uma população de praga de inseto resistente a uma proteína pesticida que compreendem colocar a população de praga de inseto, simultânea ou sequencialmente, em contato com uma quantidade eficaz em termos de inseticida de um ou mais dentre um polipeptídeo IPD101 recombinante da revelação. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para controlar uma população de praga de inseto resistente

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139/163 a uma proteína pesticida que compreendem colocar a população de praga de inseto em contato com uma quantidade eficaz em

termos	de inseticida de	um	ou	mais	dentre	um	polipeptídeo
IPD101	recombinante das	SEQ	ID	NOS :	2, 4, 6	, θ,	10, 12, 14,
16, 18,	20, 22, 24, 25,	26,	28,	29,	30, 32,	46,	48, 50, 52,

54, 56, 58, e 60, ou uma variante ou fragmento ativo em termos de inseticida das mesmas.

[0196] Em algumas modalidades, os métodos são fornecidos para proteger uma planta contra uma praga de inseto, compreendendo expressar na planta ou célula da mesma pelo menos um polinucleotideo recombinante que codifica um polipeptídeo IPD101 da revelação. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para proteger uma planta contra uma praga de inseto que compreendem expressar, na planta ou célula da mesma, um polinucleotideo recombinante que codifica um ou mais polipeptídeos IPD101 de SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 32, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, e 60, ou variantes ou fragmentos ativos em termos de inseticida das mesmas.

Estratégias de Gerenciamento de Resistência a Insetos (IRM) [0197] A expressão de δ-endotoxinas de B. thuringiensis em plantas de milho transgênicas se demonstrou como um meio eficaz para controlar pragas de inseto importantes para agricultura (Perlak, et al. , 1990; 1993) . Entretanto, em certos casos, os insetos evoluíram, de modo que se tornassem resistentes a δ-endotoxinas de B. thuringiensis expressas em plantas transgênicas. Tal resistência, se disseminada, limitaria claramente o valor comercial de germoplasma que contém genes codificadores de tais δ-endotoxinas de B. thuringiensis.

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140/163 [0198] Uma maneira para aumentar a eficácia dos inseticidas transgênicos contra pragas-alvo e reduzir de modo contemporâneo o desenvolvimento de pragas resistentes a inseticidas é fornecer refúgios (uma seção de culturas/milho não inseticidas) não transgênicos (isto é, proteínas não inseticidas) para uso com culturas transgênicas que produzem uma proteína inseticida única ativa contra pragas-alvo. A Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (epa. gov/oppbppdl/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2 00 6.h tm, que pode ser acessado com o uso do prefixo www) publica as exigências para o uso com culturas transgênicas que produzem uma proteína Bt única ativa contra pragas-alvo. Além disso, a National Corn Growers Association, em seu sítio da web: (nega.com/inseto-resistência-management-fact-sheetbt-corn, que pode ser acessado com o uso do prefixo www) também fornece orientação similar em relação a exigências de refúgio. Devido a perdas de insetos dentro da área de refúgio, os refúgios maiores podem reduzir o rendimento geral.

[0199] Outra maneira para aumentar a eficácia dos inseticidas transgênicos contra pragas-alvo e reduzir de modo contemporâneo o desenvolvimento de pragas resistentes a inseticidas seria uma reposição de genes inseticidas que são eficazes contra grupos de pragas de inseto e que manifestam seus efeitos através de modos diferentes de ação.

[0200] A expressão em uma planta de duas ou mais composições inseticidas tóxicas para a mesma espécie de inseto, em que cada inseticida é expresso em níveis eficazes, seria outra maneira para alcançar o controle do

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141/163 desenvolvimento de resistência. Isso tem base no principio de que a evolução de resistência contra dois modos separados de ação é muito mais improvável que apenas um. Roush, por exemplo, destaca estratégias com duas toxinas, também chamadas de formação de pirâmide ou empilhamento para o gerenciamento de culturas transgênicas inseticidas. (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353:1777 a 1786). 0 empilhamento ou formação de pirâmide de duas proteínas diferentes, cada uma eficaz contra as pragas-alvo e com pouca ou nenhuma resistência cruzada, pode permitir uso de um refúgio menor. A Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos exige significativamente menos refúgio estruturado (geralmente 5%) de milho não Bt a ser plantado em relação aos produtos de traço único (geralmente 20%). Há várias maneiras para fornecer os efeitos de IRM de um refúgio, incluindo vários padrões de plantio geométricos nos campos e misturas de semente em bolsas, conforme discutido adicionalmente por Roush.

[0201] Em algumas modalidades, os polipeptídeos IPD101 da revelação são úteis como uma estratégia de gerenciamento de resistência a insetos em combinação (isto é, em pirâmide) com outras proteínas pesticidas ou outros transgenes (isto é, um traço de RNAi) incluindo, porém sem limitação, toxinas Bt, proteínas inseticidas de Xenorhabdus sp. ou Photorhabdus sp., outras proteínas ativas como inseticida e semelhantes. [0202] São fornecidos os métodos para controlar infestação (ou infestações) de insetos de Lepidópteros e/ou Coleópteros em uma planta transgênica que promovem gerenciamento de resistência a inseto que compreendem expressar na planta pelo menos duas proteínas inseticidas

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142/163 diferentes que têm modos diferentes de ação.

[0203] Em algumas modalidades, os métodos para controlar infestação de insetos Lepidópteros e/ou Coleópteros em uma planta transgênica e promover gerenciamento de resistência a inseto compreendem a apresentação de pelo menos uma dentre as proteínas inseticidas de polipeptídeo IPD101 a insetos na ordem Lepidóptera e/ou Coleoptera.

[0204] Em algumas modalidades, os métodos para controlar infestação de insetos Lepidópteros e/ou Coleópteros em uma planta transgênica e promover gerenciamento de resistência a inseto compreendem a apresentação de pelo menos um dos polipeptídeos IPD101 da SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 32, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, e 60, ou variantes ou fragmentos ativos em termos de inseticida das mesmas, inseticidas para insetos na ordem Lepidóptera e/ou Coleoptera.

[0205] Em algumas modalidades, os métodos para controlar infestação de insetos Lepidópteros e/ou Coleópteros em uma planta transgênica e promover gerenciamento de resistência a inseto compreendem expressar na planta transgênica um polipeptídeo IPD101 e uma proteína Cry ou outra proteína inseticida para insetos na ordem Lepidóptera e/ou Coleoptera que têm modos diferentes de ação.

[0206] Em algumas modalidades, os métodos para controlar infestação de insetos Lepidópteros e/ou Coleópteros em uma planta transgênica e promover gerenciamento de resistência a inseto compreendem a expressão na planta transgênica de pelo menos um dentre um polipeptídeo IPD101 das SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 32, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, e 60, ou variantes ou

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143/163 fragmentos ativos em termos de inseticida das mesmas e uma proteína Cry ou outra proteína inseticida para insetos na ordem Lepidóptera e/ou Coleóptera, sendo que o polipeptídeo IPD101 e a proteína Cry têm modos de ação diferentes.

[0207] Também são fornecidos métodos para reduzir a probabilidade de emergência de resistência a insetos Lepidópteros e/ou Coleópteros a plantas transgênicas que expressam, nas plantas, proteínas inseticidas para controlar as espécies de inseto que compreendem a expressão de pelo menos um dentre um polipeptídeo IPD101 inseticida paras as espécies de inseto em combinação com uma segunda proteína inseticida para as espécies de inseto que têm modos de ação diferentes.

[0208] Também são fornecidos meios para o gerenciamento de resistência a insetos Lepidópteros e/ou Coleópteros eficaz de plantas transgênicas compreendendo coexpressar em altos níveis nas plantas duas ou mais proteínas inseticidas ou outros transgenes inseticidas (por exemplo, um traço de RNAi) tóxicos para insetos Lepidópteros e/ou Coleópteros, mas cada uma exibe um modo diferente de efetuar sua atividade de extermínio, em que duas ou mais das proteínas inseticidas ou dos outros transgenes inseticidas compreendem um polipeptídeo IPD101 e uma proteína Cry. Também são fornecidos meios para gerenciamento de resistência a inseto Lepidóptero e/ou Coleóptero eficaz de plantas transgênicas que compreendem coexpressar, em altos níveis nas plantas, duas ou mais proteínas inseticidas ou outros transgenes inseticidas (por exemplo, um traço de RNAi) tóxicos para insetos Lepidópteros e/ou Coleópteros, mas cada um exibindo um modo diferente de efetuar sua atividade de extermínio,

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144/163 sendo que duas ou mais proteínas inseticidas ou outros transgenes inseticidas compreendem pelo menos um dentre um polipeptídeo IPD101 das SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 32, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, e 60, ou variantes ou fragmentos ativos em termos de inseticida das mesmas, e uma proteína Cry ou outra proteína ativa em termos de inseticida.

[0209] Além disso, os métodos são fornecidos para obter aprovação regulamentar para o plantio ou comercialização de plantas que expressam proteínas inseticidas para insetos na ordem Lepidoptera e/ou Coleoptera, compreendendo a etapa de se referir a, apresentar ou confiar em dados de ligação de ensaio de inseto que mostram que o polipeptídeo IPD101 não compete com os sítios de ligação para proteínas Cry em tais insetos. Além disso, são fornecidos métodos para obter aprovação regulamentar para o plantio ou comercialização de plantas que expressam proteínas inseticidas para insetos na ordem Lepidoptera e/ou Coleoptera que compreendem a etapa

de	se referir	a, apresentar	ou confiar em	dados de	ligação
de	ensaio de	inseto	que	mostram	que	um ou mais dos
pol	ipeptídeos	IPD101 de	SEQ	ID NOS:	2, 4,	6, 8, 10,	12, 14,
16,	18, 20, 22	, 24, 25,	26,	28, 29,	30, 32	, 46, 48,	50, 52,

54, 56, 58, e 60, ou variantes ou fragmento ativo em termos de inseticida das mesmas, não competem com sítio de ligação para proteínas Cry em tais insetos.

Métodos para Aumentar o Rendimento de Planta [0210] Os métodos para aumentar o rendimento de planta são fornecidos. Os métodos compreendem fornecer uma planta ou célula de planta que expressa um polinucleotídeo codificador da sequência de polipeptídeo pesticida revelada

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145/163 no presente documento e cultivar a planta ou uma semente da mesma em um campo infestado com uma praga contra a qual o polipeptídeo tem atividade pesticida. Em algumas modalidades, o polipeptídeo tem atividade pesticida contra uma praga de Lepidópteros, Coleópteros, Diptera, Hemiptera ou nemátodos e o campo é infestado com uma praga de Lepidópteros, Hemiptera, Coleópteros, Diptera ou nemátodos. [0211] Conforme definido no presente documento, o rendimento da planta se refere à qualidade e/ou quantidade de biomassa produzida pela planta. Biomassa, conforme usado no presente documento, se refere a qualquer produto de planta medido. Um aumento na produção de biomassa é qualquer melhora no rendimento do produto de planta medido. Aumentar o rendimento de planta tem diversas aplicações comerciais. Por exemplo, aumentar a biomassa de folha de planta pode aumentar o rendimento de vegetais com folhas para consumo humano ou animal. Adicionalmente, o aumento de biomassa de folha pode ser usado para aumentar a produção de produtos farmacêuticos ou industriais derivados de planta. Um aumento em rendimento pode compreender qualquer aumento estatisticamente significativo incluindo, mas sem limitação, pelo menos um aumento de 1%, pelo menos um aumento de 3%, pelo menos um aumento de 5%, pelo menos um aumento de 10%, pelo menos um aumento de 20%, pelo menos de 30%, pelo menos de 50%, pelo menos de 70%, pelo menos de 100% ou um aumento maior em rendimento em comparação a uma planta que não expressa a sequência pesticida.

[0212] Em métodos específicos, o rendimento de planta é aumentado como resultado da resistência a pragas melhorada de uma planta que expressa pelo menos um polipeptídeo IPD101

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146/163 revelado no presente documento. A expressão do polipeptídeo IPD101 (ou polipeptídeos IPD101) resulta em uma capacidade reduzida de uma praga para infestar ou alimentar-se na planta, melhorando, assim, o rendimento de planta.

Métodos de Processamento [0213] São fornecidos, ainda, métodos para processar uma planta, parte de plantas ou semente para obter um alimento ou produto alimentício proveniente de uma planta, parte de plantas ou semente que compreende pelo menos um polinucleotideo IPD101. As plantas, partes de planta ou sementes fornecidas no presente documento podem ser processadas para render óleo, produtos de proteína e/ou subprodutos que são derivados obtidos pelo processamento que têm valor comercial. Exemplos não limitadores incluem sementes transgênicas que compreendem uma molécula de ácido nucleico que codifica um ou mais polipeptídeos IPD101 que podem ser processados para render óleo se soja, produtos de soja e/ou subprodutos de soja.

[0214] Processar se refere a quaisquer métodos físicos e químicos usados para obter qualquer produto de soja e incluem, mas sem limitação, o condicionamento térmico, floculação e moagem, extrusão, extração de solvente ou embebição aquosa e extração de sementes inteiras ou parciais.

[0215] Os exemplos a seguir são oferecidos a título de ilustração e não como limitação.

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EXEMPLOS

Exemplo 1 - Identificação de uma Proteína Inseticida Ativa Contra Verme de Raiz do Milho Ocidental (WCRW) da Cepa JH70371-1 [0216] A proteína inseticida IPDIOlAa foi identificada por purificação de proteína, sequenciamento de aminoácidos N-terminal e clonagem por PCR da cepa bacteriana JH70371-1 da seguinte forma. A atividade inseticida contra WCRW foi observada a partir de um lisado celular da cepa JH70371-1 que foi desenvolvida em Caldo Terrific (BD Difco™, n.° de catálogo 243820) e cultivada durante a noite a 28 °C com agitação a 200 rpm. Essa atividade inseticida exibiu sensibilidade à protease e calor indicando uma natureza proteinácea.

[0217] Bioensaios com WCRW foram conduzidos com o uso das amostras de lisado celular misturadas com dieta de WCRW fundida com baixo ponto de fusão (Frontier Agricultural Sciences, Newark, DE) em um formato de 96 poços. Neonatos de WCRW foram colocados em cada cavidade de uma placa de 96 cavidades. O ensaio foi executado por quatro dias a 25 °C e, então, classificado quanto à mortalidade de inseto e atrofia de crescimento de inseto. As classificações foram denotadas como morto (3), severamente atrofiado (2) (pouco ou nenhum crescimento, mas vivo), atrofiado (1) (crescimento até segundo estágio de desenvolvimento, mas não equivalente aos controles) ou nenhuma atividade observada (0). As amostras demonstrando mortalidade ou atrofia severa foram adicionalmente estudadas.

[0218] 0 DNA genômico da cepa JH70371-1 isolada foi preparado de acordo com um protocolo de construção de

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148/163 biblioteca e sequenciado com o uso do Analisador de Genoma IIx Illumina® (Illumina Inc., San Diego, CA). As sequências contíguas de ácido nucleico foram montadas e quadros de leitura aberta foram gerados. A sequência de DNA ribossômico 16S da cepa JH70371-1 foi pesquisada no BLAST contra o banco de dados NCBI que indicou que a mesma é uma Lysíníbacíllus sp.

[0219] Os péletes de célula da cepa JH70371-1 foram homogeneizados a ~30.000 psi após a ressuspensão em tampão MOPS 20 mM, pH 7 com coquetel inibidor de protease Completo, isento de EDTA (Roche, Indianapolis, Indiana). O lisado bruto foi clareado por centrifugação e dessalinizado em Tris 20 mM, pH 8,5 com o uso de uma coluna de dessalinização HiPrep™ 26/10 (GE Healthcare, Piscataway, NJ) e, então, carregado em uma coluna CaptoQ™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ) equilibrada em Tris 20 mM, pH 8,5 e eluído com um gradiente de NaCl 0 a 0,4 M em 30 volumes de coluna (CV) . As frações ativas foram agrupadas e carregadas em uma coluna Superdex™ 200 (GE Healthcare) equilibrada em bicarbonate de amônio 100 mM. A análise por SDS-PAGE das frações indicou que a atividade de WCRW coincidiu com uma banda de proteína proeminente após manchamento com Reagente de Manchamento Azul GelCode® (Thermo Fisher Scientific®) . A banda de proteína foi excisada, digerida com tripsina e analisada por cromatografia nanolíquida/espectrometria de masse por eletroaspersão em tandem (nano-LC/ESI-MS/MS) em um espectrômetro de massa Thermo Q Exactive™ Orbitrap™ (Thermo Fisher Scientific®, 81 Wyman Street, Waltham, MA 02454) em interface com um sistema nano-lc Eksigent NanoLC 1-D Plus (AB Sciex™, 500 Old Connecticut Path, Framingham, MA 01701).

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A identificação de proteína foi feita por buscas em bancos de dados com o uso de Mascot® (Matrix Science, 10 Perrins Lane, Londres NW3 1QY, Reino Unido). As buscas contra um banco de dados interno e banco de dados não redundante NCBI (nr) identificaram o polipeptídeo IPDIOlAa inovador (SEQ ID NO: 2) que é codificado pelo polinucleotídeo de SEQ ID NO: 1. A clonagem e a expressão recombinante confirmaram a atividade inseticida do IPDIOlAa contra WCRW.

Exemplo 2 - Identificação de Homólogos de IPDIOlAa [0220] Além da presença na cepa JH70371-1, buscas BLAST identificaram diversos homólogos que têm percentuais variados de identidade de aminoácidos com IPDIOlAa (SEQ ID NO: 2): IPDIOlAb (SEQ ID NO: 4) com 98,2% de identidade e 99,7% de similaridade com IPDIOlAa foi identificado na cepa PMCH4031E7-1 da DuPont Pioneer. IPDIOlAc (SEQ ID NO: 6) com 97,9% de identidade e 99,4% de similaridade com IPDIOlAa foi identificado na cepa PMCH4053Dllb da DuPont Pioneer. IPDIOlBa (SEQ ID NO: 8) com 80,9% de identidade e 89,7% de similaridade com IPDIOlAa foi identificado no banco de dados público NCBI como gi_928971774_ref_WP_053996211, como uma proteína hipotética de Lysíníbacíllus macroides. IPDIOlCa (SEQ ID NO: 10) com 77,0% de identidade e 87,9% de similaridade com IPDIOlAa foi identificado no banco de dados público NCBI como gi_499133538_ref_WP_010861479, como uma proteína hipotética de Lysíníbacíllus sphaericus. Além disso, IPDIOlCb (SEQ ID NO: 12) foi identificado na cepa da AM2685 DuPont Pioneer com 78,2% de identidade com IPDIOlAa. IPDIOlCc (SEQ ID NO: 14) com 88,2% de identidade com IPDIOlAa foi identificado na cepa JAPH0723-1 da DuPont Pioneer. IPDIOlCd (SEQ ID NO: 16) com 73,0% de identidade com IPDIOlAa

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150/163 foi identificado na cepa AM11987 da DuPont Pioneer. IPDIOlCe (SEQ ID NO: 18) com 69,4% de identidade com IPDIOlAa foi identificado na cepa DP3525M da DuPont Pioneer. IPDIOlCf (SEQ ID NO: 20) com 78,8% de identidade com IPDIOlAa foi identificado na cepa BD22 da DuPont Pioneer. IPDIOlEa (SEQ ID NO: 22) com 54,1% de identidade com IPDIOlAa foi identificado no banco de dados público NCBI como WP_024363526.1, como uma proteína hipotética de Lysinibacillus sphaerícus. IPDIOlEb (SEQ ID NO: 24) com 53,5% de identidade com IPDIOlAa foi identificado no banco de dados público NCBI como AHN24097.1, como uma proteína hipotética de Lysíníbacíllus varians. IPDIOlEe (SEQ ID NO: 25) com 55,4% de identidade com IPDIOlAa foi identificado no banco de dados público NCBI como WP_058336899, como uma proteína hipotética de Bacillus sp. IPDIOlEa (SEQ ID NO: 26) com 45,0% de identidade com IPDIOlAa foi identificado no banco de dados público NCBI como WP_047474321, como uma proteína hipotética de Bacillus amyloliquefaciens. IPDIOlEb (SEQ ID NO: 28) com 44,6% de identidade com IPDIOlAa foi identificado na cepa PMC4018E9-1 da DuPont Pioneer. IPDIOlGa (SEQ ID NO: 29) com 33,7% de identidade com IPDIOlAa foi identificado no banco de dados público NCBI como WP_050637303, como uma proteína hipotética de Candidatus stoquefichus. IPDIOlGb (SEQ ID NO: 30) com 37,8% de identidade com IPDIOlAa foi identificado no banco de dados público NCBI como WP_050637304, como uma proteína hipotética de Candidatus stoquefichus. IPDIOlGc (SEQ ID NO: 32) com 32,3% de identidade com IPDIOlAa foi identificado no banco de dados público NCBI como AL041133, como uma proteína hipotética de Pseudoalteromonas phenolica. IPDIOlGd (SEQ ID

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NO: 56) com 34,8% de identidade com IPDIOlAa foi identificado no banco de dados público NCBI como WP_066332372, como uma proteína hipotética de Flavobacterium crassostreae. IPDIOlGe (SEQ ID NO: 58) com 35,1% de identidade com IPDIOlAa foi identificado no banco de dados público NCBI como WP_066758778, como uma proteína hipotética de Chryseobacterium sp. IPDIOlGf (SEQ ID NO: 60) com 33,7% de identidade com IPDIOlAa foi identificado no banco de dados público NCBI como WP_063304516, como uma proteína hipotética de Pseudovibrio sp. Os homólogos de IPDIOlAa e a fonte da sequência em que foram identificados são mostrados na Tabela 1.

Tabela 1:

Nome de Gene	Fonte	Organismo	Seq de DNA	Seq de AA
IPDIOlAa	JH70371	Lysinibacillus sp.	SEQ ID NO: 1	SEQ ID NO: 2
IPDIOlAb	PMCH4031E7-1	Lysinibacillus sp.	SEQ ID NO: 3	SEQ ID NO: 4
IPDIOlAc	PMCH4053Dllb	Lysinibacillus sp.	SEQ ID NO: 5	SEQ ID NO: 6
IPDIOIBa	NCBI WP 053996211	Lysinibacillus macroides	SEQ ID NO: 7	SEQ ID NO: 8
IPDIOlCa	NCBI WP_010861479 , 1	Lysinibacillus sphaericus	SEQ ID NO: 9	SEQ ID NO: 10
IPDIOlCb	AM2685	Lysinibacillus sp.	SEQ ID NO: 11	SEQ ID NO: 12
IPDIOlCc	JAPH0723	Lysinibacillus sp.	SEQ ID NO: 13	SEQ ID NO: 14

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IPDIOlCd	AM11987	Lysinibacillus sp.	SEQ ID NO: 15	SEQ ID NO: 16
IPDIOlCe	DP3525M	Bacillus sp.	SEQ ID NO: 17	SEQ ID NO: 18
IPDIOlCf	BD22	Lysinibacillus sp.	SEQ ID NO: 19	SEQ ID NO: 20
IPDIOlEa	NCBI WP_024363526 , 1	Lysinibacillus sphaericus	SEQ ID NO: 21	SEQ ID NO: 22
IPDIOlEb	NCBI AHN24097,1	Lysinibacillus varians	SEQ ID NO: 23	SEQ ID NO: 24
IPDIOlEe	NCBI WP 058336899	Bacillus sp.		SEQ ID NO: 25
IPDIOlEa	NCBI WP_047474321	Bacillus amyl ol 1 que fa ci en s		SEQ ID NO: 26
IPDIOlEb	PMC4018E9-1	Pseudomonas monteilii	SEQ ID NO: 27	SEQ ID NO: 28
IPDIOlGa	NCBI WP 050637303	Candidatus stoquefichus		SEQ ID NO: 29
IPDIOlGb	NCBI WP 050637304	Candidatus stoquefichus		SEQ ID NO: 30
IPDIOlGc	NCBI AL041133	Pseudoalteromona s phenolica	SEQ ID NO: 31	SEQ ID NO: 32
IPDIOlGd	WP_066332372	Fl a vobacterium crassostreae	SEQ ID NO: 55	SEQ ID NO: 56
IPDIOlGe	WP_066758778	Ch rys eobacterium sp.	SEQ ID NO: 57	SEQ ID NO: 58
IPDIOlGf	WP_063304516	Pseudovibrio sp.	SEQ ID NO: 59	SEQ ID NO: 60

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153/163 [0221] As identidades de sequência de aminoácidos dos homólogos de IPDIOlAa com o uso do algoritmo de NeedlemannWunsch, calculadas com uma penalidade de criação de Lacuna: 8 e penalidade de extensão de Lacuna: 2, são mostrados na Tabela 2.

Tabela 2:

	IPDIOlAb	IPDIOlAc	IPDIOIBa	IPDIOlCa	IPDIOlCb	IPDIOlCc	IPDIOlCd	IPDIOlCe	IPDIOlCf	IPDIOlEa	IPDIOlEb	IPDIOlEe	IPDIOlEa	IPDIOlEb	IPDIOlGa	IPDIOlGb	IPDIOlGc	IPDIOlGd	IPDIOlGe	IPDIOlGf
IPDIOlAa	98,2	97,9	80,9	77,0	78,2	78,8	73,3	69,4	78,8	54,1	53,5	55,4	45,0	44,6	33,7	37,8	32,3	36,8	36,0	35,8
IPDIOlAb	-	97,9	80,9	76,4	77,6	78,2	73,0	69,7	78,2	53,8	53,2	56,5	45,5	44,6	34,3	38,1	32,0	37,1	36,3	35,6
IPDIOlAc	-	-	81,2	75,8	77,3	77,9	72,4	69,1	77,6	53,8	53,2	55,4	45,0	44,4	33,7	38,5	32,0	37,1	36,3	35,6
IPDIOIBa	-	-	-	82,1	82,7	82,1	76,7	72,7	80,6	56,3	55,7	54,6	45,5	44,9	34,9	35,8	30,5	38,0	38,0	35,6
IPDIOlCa	-	-	-	-	92,7	93,3	81,5	75,5	90,6	58,1	58,1	55,2	46,3	43,9	33,4	37,6	30,2	38,7	37,6	36,0
IPDIOlCb	-	-	-	-	-	97,0	82,4	74,5	88,2	60,1	59,8	54,9	45,8	44,6	32,9	36,6	29,9	39,8	37,0	36,0
IPDIOlCc	-	-	-	-	-	-	81,2	75,4	88,5	59,0	58,7	53,8	45,5	45,6	33,4	36,3	29,8	38,8	37,0	36,3
IPDIOlCd	-	-	-	-	-	-	-	71,1	80,6	59,4	58,8	56,9	46,3	42,7	32,8	34,6	29,3	37,2	36,3	34,7
IPDIOlCe					-				75,5	56,8	56,5	55,2	48,2	43,2	33,1	37,8	31,7	38,0	35,6	35,3
IPDIOlCf					-				-	57,7	57,4	55,5	44,4	45,0	34,6	38,3	30,2	38,2	36,6	37,1
IPDIOlEa						-					99,4	51,4	46,5	40,9	31,3	35,0	31,6	35,7	34,3	32,2
IPDIOlEb						-						51,2	46,2	40,6	31,3	34,7	31,2	35,7	33,7	32,0
IPDIOlEe							-						48,4	36,6	31,7	33,2	28,2	33,8	31,9	30,2
IPDIOlEa							-							33,4	31,0	35,2	29,2	30,5	30,6	30,3
IPDIOlEb								-							31,5	33,0	28,7	35,6	35,5	36,8
IPDIOlGa								-								38,2	29,6	29,7	28,2	33,4
IPDIOlGb									-								29,2	32,8	36,2	31,2
IPDIOlGc									-									28,4	27,9	29,4
IPDIOlGf																			78,6	30,7
IPDIOlGe										-										33,1
IPDIOlGf

Exemplo 3 - Clonagem e Expressão de IPDIOlAa em E. coli [0222] Um quadro de leitura aberta que contém a sequência de codificação de IPDIOlAa foi identificado na sequência genômica da cepa JH70371 com o uso de fragmentos de peptideo de análise de MS. Essa sequência foi usada para projetar os seguintes iniciadores, AAAGGATCCATGCATACAACAATTGATATTGATCT (IPDIOlAa Direto) (SEQ ID NO: 33) e

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TTTCTCGAGCTATTTTTTAAATGCACGAGC (IPDIOlAa Reverso) (SEQ ID NO: 34), para subclonar a sequência de codificação de IPDIOlAa no vetor pET-28a (Novagen) com o uso dos sítio de restrição BamHI/XhoI no quadro com uma etiqueta 6X-His Nterminal e o códon de parada nativo de IPDIOlAa (TAG). A Mistura Principal KOD Hot Start (EMD Biosciences, San Diego, CA) foi usada para amplificação por PCR do gene IPDIOlAa em um ciclador térmico BioRad C1000 Touch. Amplicons foram purificados em gel, ligados (T4 DNA Ligase, New England BioLabs, Ipswich, MA) ao pET28a digerido com BamHI/XhoI, transformados em células quimicamente competentes de alta eficácia TOPIO de E. coll (Invitrogen), e os clones foram confirmados por sequenciamento.

[0223] O construto etiquetado com 6x-His N-terminal de IPDIOlAa foi transformado em células BL21 (DE3) quimicamente competentes (Invitrogen) e desenvolvido durante a noite a 37 °C com seleção de canamicina e, então, inoculado em um meio fresco 2xYT (1:100) e depois desenvolvido em uma densidade óptica de cerca de 0,8 a 1,2. A expressão de proteína foi induzida adicionando-se IPTG 1,0 mM, e as células cresceram adicionalmente a 16 °C por 16 horas. As proteínas expressas em E. coli foram purificadas por cromatografia iônica de metal imobilizado (IMAC) com o uso da resina Talon Cobalt (Clonetech: Mountain View, GA) de acordo com os protocolos do fabricante. As frações purificadas de 1,5 ml eluidas em imidazol 250 mM foram dialisadas em tampão PBS com o uso de tubos 6K MWCO Flextubes (IBI: Peosta, IA) durante a noite em uma placa de agitação a 4 °C. A proteína dialisada foi executada em ensaios de dieta para avaliar os efeitos da proteína inseticida em

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155/163 larvas de uma diversidade de Lepídoptera e Coieoptera. A proteína purificada e dessalinizada etiquetada com 6X-His N-terminal de IPDIOlAa foi submetida a bioensaio contra WCRW e constatou-se que a mesma está ativa conforme mostrado na Tabela 4 abaixo.

Exemplo 4 - Clonagem de Homólogos de IPDIOlAa IPDIOlCb, Cc, Cd, Ce e Cf [0224] Genes com similaridade de sequência com a sequência de polinucleotídeos para IPDIOlAa (SEQ ID NO: 1) identificados nos bancos e dados internos foram amplificados por PCR a partir do DNA preparado a partir do organismofonte (Tabela 1) com o uso dos iniciadores projetados para as sequências de codificação de cada homólogo (Tabela 3) . Todos os iniciados continham mais de 30 nucleotídeos de homologia com pET28a (Novagen) ou uma versão modificada de pET28a. Os produtos de PCR foram purificados em gel, montados com o uso do Kit de Clonagem Gibson Assembly (New England Biolabs, Ipswich, MA) com os vetores e expressão que têm a sequência de sobreposição correspondente, transformados em células quimicamente competentes de alta eficácia TOPIO de E. coli (Invitrogen), e os clones foram confirmados por senquenciamento. A proteína homóloga purificada e dessalinizada etiquetada com 6X-His N-terminal de IPD101 foi submetida a bioensaio contra WCRW e observou-se que tinha atividade conforme referenciado abaixo (Tabela 4 abaixo).

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Tabela 3: Iniciadores de PCR usados para clonar homólogos de IPDIOlAa.

Nome de Gene	SEQ ID de Iniciador Direto	Iniciador Direto	SEQ ID de Iniciador Reverso	Iniciador Reverso
IPDIOlCb	SEQ ID	ACTGGTGGACAGCAAA	SEQ ID	CTCGAGTGCGGCCGCA
	NO: 43	TGGGTCGCGGATCCAT	NO: 44	AGCTTTTAGGCTTTAA
		GCAMACTACAATTGAT		ATGCTCGTGCAACGTA
		ATCGATCTTAA		ATA
IPDIOlCc	SEQ ID	ACTGGTGGACAGCAAA	SEQ ID	CTCGAGTGCGGCCGCA
	NO: 41	TGGGTCGCGGATCCAT	NO: 42	AGCTTTTATGCTTTAA
		GCAMACTACAATTGAT		ATGCTCGTGCTACGTA
		ATCGATCTTAA		GTA
IPDIOlCd	SEQ ID	ACTGGTGGACAGCAAA	SEQ ID	CTCGAGTGCGGCCGCA
	NO: 37	TGGGTCGCGGATCCAT	NO: 38	AGCTTCTATGCTTTAT
		GCAMACTACAATTGAT		ATGCGCGTGCTACATA
		ATCGATCTTAA		ATA
IPDIOlCe	SEQ ID	CCGCGCGGCAGCATCG	SEQ ID	CTTTCGACTGAGCCTT
	NO: 39	AGGGAAGGCATATGCA	NO: 40	TCGTTTTACTCGAGTT
		AAT TKCACATGATAT T		ATGATCGATATGCACG
		GATTTAAGG		AGCAACGTAGTA
IPDIOlCf	SEQ ID	ACTGGTGGACAGCAAA	SEQ ID	CTCGAGTGCGGCCGCA
	NO: 35	TGGGTCGCGGATCCAT	NO: 36	AGCTTTTAAGCTTTAT
		GCAMACTACAATTGAT		ATGCTCGTGCTACGTA
		ATCGATCTTAA		ATA

Exemplo 5 - Clonagem de Homólogos de IPDIOlAa IPDIOlCa, Ea e Eb [0225] As sequências de aminoácidos de IPDIOlCa, IPDIOlEa e IPDIOlEb foram identificadas por uma busca BLAST do banco de dados público de sequência de proteínas não redundante (Tabela 1). As sequências de codificação correspondentes (SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 23, respectivamente)

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157/163 foram geradas como fragmentos de DNA sintéticos com sítio de restrição BamHI/Xhol, ligadas a pET28a (Novagen) digerido com BamHI/Xhol, transformadas em células quimicamente competentes de alta eficácia TOPIO de E. coli (Invitrogen) e confirmadas por sequenciamento. A proteína homóloga purificada e dessalinizada etiquetada com 6X-His N-terminal de IPD101 foi submetida a bioensaio contra WCRW, e os resultados de atividade são apresentados abaixo (Tabela 4 abaixo).

Tabela 4

Proteína	Dose Máxima	Tipo de ensaio	WC- RW	FAW	CE- W	ECB	SBL	BCW	VBC	SC- RW
IPDIOlAa	1.200 ppm	incorp	Sim	Não	Sim	Não	Não	Não	Sim	Sim
IPDIOlCa	1.500 ppm	incorp	Sim	Não	Sim	Sim	Sim	Não	Não	NT
IPDIOlCb	333 ppm	incorp	Sim	NT	NT	NT	NT	NT	NT	NT
IPDIOlCc	1.199 ppm	incorp	Sim	NT	NT	NT	NT	NT	NT	NT
IPDIOlCd	453 ppm	incorp	Não	NT	NT	NT	NT	NT	NT	NT
IPDIOlCe	156 ppm	incorp	Sim	NT	NT	NT	NT	NT	NT	NT
IPDIOlCf	409 ppm	incorp	Sim	NT	NT	NT	NT	NT	NT	NT
IPDIOlEa	1.125 pg/cm²	sobre- posição	Não	Não	Não	Não	Não	Não	Não	NT
IPDIOlEb	20 pg/cm²	sobre- posição	Não	Não	Não	Não	Não	Não	Não	NT

[0226] NT denota não testado; WCRW denota Verme de Raiz do Milho Ocidental; FAW denota Lagarta-militar do outono; CEW denota Lagarta de Espiga de Milho; ECB denota Broca de milho do leste; SBL denota Lagarta falsamedideira; BCW denota Lagarta-rosca; VBC denota Lagartada-soja; SCRW denota Verme de raiz do milho do sul.

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Exemplo 6 - Quimeras Entre Homólogos de IPD101 [0227] Para gerar variantes ativos com sequências diversificadas, quimeras entre os polipeptídeos IPDIOlAa (SEQ ID NO: 2) e IPDIOlCc (SEQ ID NO: 14) foram geradas por montagem de sobreposição de fragmentos multi-PCR. Um total de cinco quimeras entre IPDIOlAa e IPDIOlCc foi construído e clonado em pET28a com uma etiqueta de histidina 6X Nterminal conforme descrito no Exemplo 4. Os construtos foram transformados em BL21 DE3 e cultivados para a expressão de proteína. Lisados celulares foram gerados com o uso do Reagente de Extração de Proteína B-PER® da Thermo Scientific (3747 N. Meridian Rd., Rockford, IL EUA 61101) e triados quanto à atividade inseticida de WCRW. A Tabela 5 mostra os limites de quimera e a % de identidade de sequência com IPDIOlAa (SEQ ID NO: 2) conforme calculado com o uso do algoritmo de Needlemann-Wunsch com uma penalidade de criação de Lacuna: 8 e penalidade de extensão de Lacuna: 2.

Tabela 5. Porcentagem de identidade de sequência de quimeras com IPDIOlAa.

Designação de Quimera	Polinucleotídeo	% de identidade de sequência com IPDIOlAa (SEQ ID NO: 2)	WCRW ativa
Quimera 23 SEQ ID NO: 46	SEQ ID NO: 45	97	Sim
Quimera 27 SEQ ID NO: 48	SEQ ID NO: 47	90	Sim
Quimera 29 SEQ ID NO: 50	SEQ ID NO: 49	95	Sim
Quimera 41	SEQ ID NO: 51	87	Sim

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SEQ ID NO: 52
Quimera 44 SEQ ID NO: 54	SEQ ID NO: 53	82	Sim

Exemplo 7 - Bioensaios com base em dieta com lagarta de raiz de milho para determinação de LC50 e IC50 [0228] Bioensaios padronizados de incorporação de dieta de lagarta de raiz de milho similares a Zhao, J.-Z. et al.

(J. Econ. Entomol. 109: 1.369 a 1.377 (2016)) foram utilizados para testar a atividade do polipeptídeo IPDIOlAa (SEQ ID NO: 2) contra WCRW. A dieta de lagarta de raiz de milho foi preparada de acordo as diretivas do fabricante para a dieta de Dlabrotlca (Frontier, Newark, DE). O teste envolveu seis does diferentes de polipeptídeo IPDIOlAa mais o controle de tampão com 32 observações para cada dose em cada bioensaio. Neonatos foram infestados em placas de 96 poços que contêm uma mistura do polipeptídeo IPDIOlAa (5 μΐ/poço) e dieta (25 μΐ/poço), cada poço com aproximadamente 5 a 8 larvas (<24 h após eclosão) . Após um dia, uma única larva foi transferida para cada poço de uma segunda placa de 96 poços que contém uma mistura do polipeptídeo IPDIOlAa (20 μΐ/poço) e dieta (100 μΐ/poço) na mesma concentração do tratamento ao qual o isento foi exposto no primeiro dia. Para ensaios de NCRW, dois neonatos foram infestados diretamente em cada poço de uma placa de 96 poços que contêm uma mistura do polipeptídeo IPDIOlAa (20 μΐ/poço) e dieta (100 μΐ/poço) .

[0229] As placas foram incubadas a 27 °C, 65% de RH no escuro por 6 dias. As placas com uma única larva de WCRW por poço foram classificadas como mortas, severamente atrofiadas (>60% de redução de tamanho em comparação com as larvas de

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160/163 controle) ou não afetadas. As placas infestadas com duas larvas de NCRW por poço foram classificadas com base no indivíduo menos afetado para cada poço. Os dados de mortalidade foram analisados pelo procedimento PROBIT no software SAS (Versão 9.4, SAS Institute. Cary, NC, EUA) para determinar as concentrações letais que afetam 50% das larvas (LCso) · De modo similar, os números totais de larvas mortas e severamente atrofiadas foram usados para calcular as concentrações de inibição de crescimento que afetam 50% das larvas (IC50) .

[0230] O LC50 e IC50 contra WCRW (Diabrotica virgifera vírgífera) foram 5,1 ppm e 3,0 ppm, respectivamente, e contra NCRW (Díabrotíca barberí) foram 54,2 ppm e 11,6 ppm, respectivamente. Os resultados são mostrados na Tabela 6.

Tabela 6. Bioensaios com base em dieta de IPDIOlAa em WCRW e NCRW.

Inseto	LC/IC	IPDIOlAa N-6xHis (pg/ml, 6 d)	95% de CL	Inclinação	N
WCRW*	LC50	5, 1	3,3-7,2	2,2	159
IC50	3, 0	2,1-3,9	3, 6	127
NCRW**	LC50	54,2	41,5-68,8	2,5	244
IC50	11, 6	7,3-14,0	4,3	212

* Método de uma larva por poço; ** Método de duas larvas por poço.

Exemplo 8 - Modo de Ação [0231] A bioatividade da proteína recombinante purificada incorporada em dieta artificial revelou toxicidade de IPDIOlAa (SEQ ID NO: 2) para larvas de WCRW. Para compreender

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161/163 o mecanismo de toxicidade de IPDIOlAa, a ligação específica da proteína purificada com tecido de intestino médio de WCRW foi avaliada por ensaios de competição in vitro. Os intestinos médios foram isolados das larvas de WCRW em terceiro estágio de desenvolvimento para preparar vesículas de membranas de borda em escova (BBMV) seguindo um método modificado de Wolfersberger et al. (Comp Bioch Physiol 86A: 301 a 308 (1987)) com o uso de atividade de amino-peptidase para rastrear o enriquecimento. As BBMVs representam o componente de membrana apical do forro celular epitelial do tecido de intestino médio do inseto e, portanto, servem como um sistema-modelo em relação a como as proteínas inseticidas interagem dentro do intestino que segue a ingestão.

[0232] IPDIOlAa recombinante foi expresso e purificado a partir de um sistema de expressão de E.coli que utiliza uma etiqueta de fusão de poli-histidina carboxi-terminal (6x His) . A proteína purificada de comprimento total (SEQ ID NO: 2) foi identificada com Alexa-Fluor® 488 (Life Technologies) e o fluoróforo não incorporado foi separado da proteína identificada com o uso de resina de troca de tampão (Life Technologies, A30006) seguindo as recomendações do fabricante. Antes dos experimentos de ligação, as proteínas foram quantificadas por densitometria em gel após o manchamento com Simply Blue® (Thermo Scientific) de amostras resolvidas com SDS-PAGE que incluíam BSA como um padrão.

[0233] 0 tampão de ligação consistiu em BBS suplementados com 0,1% de Tween 20, pH 7,4. Para demonstrar a ligação específica e para avaliar a afinidade, BBMVs (1 pg) foram incubadas com IPDIOlAa identificado com Alexa (1,5 nM) em 100 μΐ de tampão de ligação por 1 h à RT na ausência e

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162/163 presença de concentrações crescentes de IPDIOlAa não identificado. Centrifugação a 20.000 xg foi usada para peletizar as BBMVs para separar a toxina não ligada remanescente em solução. O pélete de BBMV foi, então, lavado duas vezes com tampão de ligação para eliminar a toxina não ligada remanescente. O pélete final de BBMV (com toxina fluorescente ligada) foi solubilizado na redução de tampão de amostra de Laemmli, aquecido a 100 °C por 5 minutos e submetido a SDS-PAGE com o uso de géis de poliacrilamida Bis-Tris a 4 a 12% (Life Technologies) . A quantidade de IPDIOlAa identificado com Alexa no gel de cada amostra foi medida por um sistema de imageamento de fluorescência digital (Image Quant LAS4000 GE Healthcare). As imagens digitalizadas foram analisadas por software de densitometria (Phoretix ID, TotalLab, Ltd.).

[0234] A afinidade aparente de IPDIOlAa para BBMVs de WCRW foi estimada com base na concentração de proteína não identificada que foi necessária para reduzir a ligação de IPDIOlAa identificado com Alexa em 50% (valor EC50) . Esse valor foi de aproximadamente 2 nM para ligação de IPDIOlAa com BBMVs de WCR (Figura 2).

[0235] A descrição acima de várias modalidades ilustradas da revelação não pretende ser exaustiva ou limitar o escopo à forma precisa revelada. Embora modalidades específicas e exemplos sejam descritos no presente documento com propósitos de ilustração, várias modificações equivalentes são possíveis dentro do escopo da revelação, como aqueles indivíduos versados na técnica relevante reconhecerão. Os ensinamentos fornecidos no presente documento podem ser aplicados com outros

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163/163 propósitos, diferentes daqueles dos exemplos descritos acima. Diversas modificações e variações são possíveis a luz dos ensinamentos acima e, portanto, estão dentro do escopo das reivindicações anexas.

[0236] Essas e outras mudanças podem ser feitas a luz da descrição detalhada acima. Em geral, nas reivindicações a seguir, os termos usados não devem ser interpretados como limitantes para as modalidades específicas reveladas no relatório descritivo e nas reivindicações.

[0237] Toda a revelação de cada documento citado (o que inclui patentes, pedidos de patente, artigos de periódico, resumos, manuais, livros e outras revelações) nos Antecedentes da Técnica, Descrição Detalhada e Exemplos é incorporada ao presente documento a título de referência em suas totalidades.

[0238] Esforços foram feitos para garantir precisão em relação aos números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, concentrações, etc.), mas alguns erros experimentais e desvios devem ser permitidos. A não ser que indicado de outro modo, as partes são partes em peso, o peso molecular é o peso molecular médio; a temperatura está em graus centígrados; e a pressão está em ou próxima à atmosférica.

Claims

Polipeptídeo

IPD-101 recombinante caracterizado pelo fato de que tem pelo menos 8 0% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52 ou SEQ ID NO: 54.

Polipeptídeo IPD-101 recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo IPD-101 tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52 ou SEQ ID NO: 54 .

3.

Polipeptídeo IPD-101 recombinante, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo IPD-101 tem atividade inseticida contra Verme de Raiz do Milho Ocidental (Díabrotíca virgifera virgifera) .

Polinucleotídeo recombinante caracterizado pelo fato de que codifica o polipeptídeo IPD-101, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3.

5.

Polinucleotídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é um polinucleotídeo não genômico.

6.

Polinucleotídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é um polinucleotídeo sintético.

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7. Polinucleotídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo tem códons otimizados para a expressão em uma cultura agricolamente importante.

8. Planta transgênica ou célula de planta caracterizada pelo fato de que compreende um polinucleotídeo IPD-101 que codifica um polipeptídeo IPD-101 que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ

ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: : 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: : 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: : 32, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: : 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, ou : SEQ ID NO: 60.

9. Construto de DNA caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo IPD-101 que codifica um polipeptídeo IPD-101 que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2,

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 , SEQ ID NO : θ, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: : 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: : 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: : 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: : 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO : 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, OU

SEQ ID NO: 60.

10. Planta transgênica ou célula de planta caracterizada pelo fato de que compreende o construto de DNA, conforme definido na reivindicação 9.

Petição 870190057695, de 21/06/2019, pág. 218/229
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11 . Composição caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptideo IPD-101, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3. 12 . Proteína de fusão caracterizada pelo fato de

que compreende o polipeptideo IPD-101, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3.

13. Método para controlar uma população de praga de inseto caracterizado pelo fato de que compreende colocar a população de praga de inseto em contato com um polipeptideo IPD-101 que tem pelo menos 80% de identidade de sequência

com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, í 3EQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: : 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: : 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: : 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: : 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO : 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, OU SEQ ID NO:

60 .

14. Método para inibir o crescimento ou exterminar uma praga de inseto caracterizado pelo fato de que compreende colocar a praga de inseto em contato com uma composição que compreende um polipeptideo IPD-101 que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, ou SEQ ID NO: 60.

Petição 870190057695, de 21/06/2019, pág. 219/229
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15. Método para inibir o crescimento ou exterminar uma praga de inseto, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a praga de inseto é uma praga de inseto Lepidóptera e/ou Coleóptera.

16. Método para controlar uma população de praga de inseto caracterizado pelo fato de que compreende colocar a população de praga de inseto em contato com a planta transgênica ou célula de planta, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 8, 9 ou 10.

17. Método para inibir o crescimento ou exterminar uma praga de inseto caracterizado pelo fato de que compreende transformar uma planta com o construto de DNA, conforme definido na reivindicação 9.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, colocar a praga de inseto em contato com a planta transgênica ou célula de planta.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que a praga de inseto é Verme de Raiz do Milho Ocidental (Díabrotíca virgifera virgifera) .

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14, 15 16, 17, 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que a praga de inseto ou população de praga de inseto é resistente a pelo menos uma toxina Bt.

21. Uso do polipeptídeo IPD-101, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que é para inibir o crescimento ou extermínio de um inseto ou uma população de inseto.