BR112019015911A2 - construto, planta transgênica, milho transgênico ou planta de soja, composição, método para controlar uma população de pragas - Google Patents

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Abstract

são proporcionadas composições e métodos para controlar pragas. os métodos envolvem transformar organismos com sequências de ácido nucleico que codificam duas proteínas inseticidas ptlp-83 que têm um sítio de ação diferente em um ensaio de ligação heteróloga. em particular, as sequências de ácido nucleico são úteis para preparar plantas e microrganismos que possuem atividade inseticida. assim, são proporcionadas bactérias, plantas, células de plantas, tecidos de plantas e sementes transformadas. composições são ácidos nucleicos e proteínas inseticidas de espécies bacterianas. as sequências encontram uso na construção de vetores de expressão para transformação subsequente em organismos de interesse incluindo plantas, como sondas para o isolamento de outros genes homólogos (ou parcialmente homólogos). as proteínas pesticidas encontram uso no controle, inibição do crescimento ou extermínio de populações de pragas de lepidópteros, coleópteros, dípteros, fungos, hemípteros e nematódeos e para produzir composições com atividade inseticida.

Description

CONSTRUTO, PLANTA TRANSGÊNICA, MILHO TRANSGÊNICO OU PLANTA DE
SOJA, COMPOSIÇÃO, MÉTODO PARA CONTROLAR UMA POPULAÇÃO DE PRAGAS
REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SUBMETIDA ELETRONICAMENTE [0001] A cópia oficial da listagem de sequências é submetida eletronicamente através de EFS-Web como uma listagem de sequências em formato ASCII com um ficheiro nomeado 7417USPSP_SequenceListing.txt criado em 18 de janeiro de 2017, e que tem um tamanho de 4,505 quilobites e é depositado simultaneamente com o relatório descritivo. A listagem de sequências contida neste documento em formato ASCII faz parte do relatório descritivo e está incorporada ao presente documento em sua totalidade a titulo de referência.
ÁREA DA INVENÇÃO [0002] Esta divulgação se relaciona com o campo da biologia molecular. São fornecidos genes inovadores que codificam proteínas pesticidas. Estas proteínas pesticidas e as sequências de ácidos nucleicos que codificam as mesmas são úteis na preparação de formulações pesticidas e na produção de plantas resistentes a pragas transgênicas.
ANTECEDENTES [0003] O controle biológico de pragas de inseto de significância agrícola com o uso de um agente microbiano, como fungos, bactérias ou outras espécies de inseto, fornece uma alternativa ecologicamente correta e comercialmente atrativa aos pesticidas guímicos sintéticos. De modo geral, o uso de biopesticidas apresenta um risco mais baixo de poluição e riscos ambientais e biopesticidas fornecem especificidade alvo maior do
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2/525 que é característico de inseticidas químicos de amplo espectro tradicionais. Além disso, os biopesticidas normalmente custam menos para produzir e melhoram, desse modo, rendimento econômico para uma variedade ampla de culturas.
[0004] Certas espécies de microrganismos do gênero Bacillus são conhecidas por terem atividade pesticida contra uma faixa de pragas de insetos incluindo Lepidóptera, Diptera, Coleóptera, Hemiptera e outras. Bacillus thuringiensis (Bt) e Bacillus popilliae estão dentre os agentes de biocontrole mais bem-sucedidos descobertos até hoje. A patogenicidade de inseto sempre foi atribuída a cepas de B. larvae, B. lentimorbus, B. sphaericus e B. cereus. Os inseticidas microbianos, particularmente os obtidos de cepas de Bacillus, têm desempenhado um papel importante na agricultura como alternativas ao controle químico de pragas.
[0005] As plantas de culturas foram desenvolvidas com resistência a insetos potenciada por geneticamente manipulando as plantas de cultura para produzir proteínas pesticidas a partir de Bacillus. Por exemplo, as plantas de milho e de algodão foram geneticamente modificadas para produzir proteínas pesticidas isoladas das cepas de Bt. Essas culturas geneticamente modificadas são agora amplamente usadas na agricultura e dotaram o agricultor de uma alternativa ecologicamente correta para os métodos tradicionais de controle de insetos. Embora tenham demonstrado ser muito bem-sucedidas comercialmente, essas plantas de cultura resistentes a insetos geneticamente modificadas fornecem resistência a apenas uma faixa estreita das pragas de inseto economicamente importantes. Em alguns casos, os insetos podem desenvolver resistência a compostos inseticidas
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3/525 diferentes, o que gera a necessidade de identificar agentes de controle biológico alternativos para controle de pragas.
[0006] Consequentemente, permanece uma necessidade de novas proteínas pesticidas com diferentes alcances de atividade inseticida contra pragas de inseto, por exemplo, proteínas inseticidas gue são ativas contra uma variedade de insetos na ordem Lepidóptera e a ordem Coleóptera incluindo, mas sem limitação, pragas de inseto que desenvolveram resistência a inseticidas existentes.
SUMÁRIO [0007] As composições e os métodos para conferir atividade pesticida a bactérias, plantas, células de plantas, tecidos e sementes são fornecidos. As composições incluem moléculas de ácido nucleico codificadoras de sequências para polipeptídeos pesticidas e inseticidas, vetores que compreendem essas moléculas de ácido nucleico e células hospedeiras que compreendem os vetores. As composições também incluem as sequências de polipeptídeos pesticidas e anticorpos para esses polipeptídeos. As sequências de ácido nucleico podem ser usadas em construtos de DNA ou cassetes de expressão para transformação e expressão em organismos, incluindo microrganismos e plantas. As sequências de nucleotídeo ou aminoácidos podem ser sequências sintéticas que foram projetadas para expressão em um organismo que inclui, mas sem limitação, um microrganismo ou uma planta. As composições também compreendem bactérias transformadas, plantas, células de plantas, tecidos e sementes.
[0008] Em particular, as moléculas de ácido nucleico isolado ou recombinante são fornecidas codificando polipeptídeos
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4/525 da Proteína Inseticida 83 (PtIP-83) de Pteridophyta incluindo substituições, deleções, inserções de aminoácidos e fragmentos dos mesmos. Adicionalmente, as sequências de aminoácidos que correspondem aos polipeptídeos PtIP-83 são abrangidas. São fornecidas moléculas de ácidos nucleicos isolados ou recombinantes com capacidade para codificar polipeptídeos PtIP83 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7,
SEQ ID NO: 9 , SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, i 3EQ
ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 , SE( 2 ID NO : 21, SEQ ID NO: : 23, SEQ ID
NO: 716, SEQ ID NO : 754, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID
NO: 757, SEQ ID NO : 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NO: 760, SEQ ID
NO: 761, SEQ ID NO : 762, SEQ ID NO: 763, SEQ ID NO: 764, SEQ ID
NO: 765, SEQ ID NO : 766, SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO: 768, SEQ ID
NO: 7 69, e SEQ ID NOs: 95E )-1026, assim como substituições,
deleções, inserções de aminoácidos, fragmentos dos mesmos e combinações dos mesmos. As sequências de ácido nucleico que são complementares a uma sequência de ácido nucleico das modalidades ou que hibridizam a uma sequência das modalidades também são abrangidas. Também são fornecidos polipeptídeos PtIP-83 isolados ou recombinantes de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO: 754, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NO: 760, SEQ ID NO: 761, SEQ ID NO: 762, SEQ ID NO: 763, SEQ ID NO: 764, SEQ ID NO: 765, SEQ ID NO: 766, SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO: 768, SEQ ID NO: 769, e SEQ ID NOs: 958-1026, assim como substituições, deleções, inserções de aminoácidos, fragmentos dos mesmos e combinações dos mesmos.
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5/525 [0009] Métodos são fornecidos para produzir os polipeptídeos e para usar esses polipeptídeos para controlar ou exterminar pragas Lepidóptera, Coleóptera, nemátoda, fúngica e/ou Díptera. As plantas transgênicas das modalidades expressam uma ou mais dentre as sequências pesticidas divulgadas no presente documento. Em várias modalidades, a planta transgênica compreende adicionalmente um ou mais genes adicionais para resistência a inseto, por exemplo, um ou mais genes adicionais para controlar pragas de coleópteros, lepidópteros, hemípteros ou nematódeos. Será entendido por uma pessoa versada na técnica que a planta transgênica pode compreender qualquer gene que confira um traço agronômico de interesse.
[0010] Os métodos para detectar os ácidos nucleicos e polipeptídeos das modalidades em uma amostra também são incluídos. É fornecido um kit para detectar a presença de um polipeptídeo PtIP-83 ou detectar a presença de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo PtIP-83 em uma amostra. O kit pode ser fornecido juntamente com todos os reagentes e amostras de controle necessários para executar um método para detectar o agente pretendido, assim como instruções para uso.
[0011] São também contemplados pela divulgação composições e métodos para abordar o gerenciamento de resistência a insetos. Em uma modalidade, as composições são contempladas que compreendem sequências de polinucleotídeos que codificam polinucleotídeos PTIP-83Aa (SEQ ID NO: 1) e PtIP-83Cb (SEQ ID NO: 7) ou PtIP-83Gb (SEQ ID NO: 798) aqui divulgados. Em outra modalidade, os métodos são contemplados para minimizar o desenvolvimento de resistência a insetos compreendendo utilizar
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6/525 composições, incluindo plantas transgênicas, compreendendo sequências de polinucleotídeos que codificam PTIP-83Aa (SEQ ID NO: 1) e PtIP-83Cb (SEQ ID NO: 7) ou PtIP-83Gb (SEQ ID NO: 798) aqui divulgados.
[0012] As composições e os métodos das modalidades são úteis para a produção de organismos com resistência ou tolerância a pragas melhorada. Esses organismos e composições que compreendem os organismos são desejáveis para propósitos agrícolas. As composições das modalidades também são úteis para gerar proteínas alteradas ou melhoradas que têm atividade pesticida ou para detectar a presença de polipeptídeos PtIP-83.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0013] A Figura 1 mostra a filogenia de samambaias baseada na classificação para samambaias existentes por A. R. Smith et al , TAXON, 55:705-731 (2006).
[0014] As Figuras 2a a 2j mostram um alinhamento das sequências de aminoácidos de PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 1), PtIP-83Ca (SEQ ID NO: 5), PtIP-83Cb (SEQ ID NO: 7), PtIP-83Cc (SEQ ID NO: 9), PtIP-83Cd (SEQ ID NO: 11), PtIP-83Ce (SEQ ID NO: 13), PtlP83Cf (SEQ ID NO: 15), e PtIP-83Fa (SEQ ID NO: 3); um alinhamento da previsão da estrutura secundária, pelo método de previsão da estrutura secundária de alta classificação PSIPRED para PtlP83Aa (SEQ ID NO: 1) e PtIP-83Fa (SEQ ID NO: 3); e as localizações das sequência de aminoácidos MOTIVOS, como previsto por análise MEME de motivos, em relação a PTIP-83Aa (SEQ ID NO: 1). Um H indica uma estrutura helicoidal prevista, um E indica uma estrutura de cadeia beta PtIP e um C indica uma estrutura em espiral prevista.
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7/525 [0015] As Figuras 3a a 3b mostram um alinhamento de sequência entre PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 1) e PtIP-50Aa (SEQ ID NO: 34). Os pontos de cruzamento nas quimeras PtIP-83 Aa / PtIP-50Aa indicados na Tabela 13 são indicados por uma seta (;) acima do aminoácido.
[0016] As Figuras 4a a 4d mostram um alinhamento de
sequência de aminoácidos de PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 1), PtIP-83Fa (SEQ ID NO: 3), PtIP-50Aa (SEQ ID NO: 34), PtIP-50Ba (SEQ ID NO: 35), e PtIP-50Bb (SEQ ID NO: 36) . Os motivos de sequência conservados identificados são indicados e a sequência de aminoácidos dos motivos em PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 1) são sublinhados.
[0017] As Figura 5a a 5e mostra um alinhamento de
sequência de aminoácidos de PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 1), PtIP-83Ca (SEQ ID NO: 5), PtIP-83Cb (SEQ ID NO: 7), PtIP-83Cc (SEQ ID NO: 9), PtIP-83Cd (SEQ ID NO: 11), PtIP-83Ce (SEQ ID NO: 13), PtlP83Cf (SEQ ID NO: 15), PtIP-83Cg (SEQ ID NO: 17), e PtIP-83Da (SEQ ID NO: 19). A diversidade de sequência é realçada.
[0018] A Fig. 6 mostra uma avaliação da ligação especifica, ligação, afinidade e competição entre PtIP-83Aa e PtIP-83Cb em CEW BBMVs. (A) As imagens do gel mostram competição homóloga dependente da concentração entre PtIP-83Aa ou PtIP-83Cb marcadas com Alexa e não marcadas. (B) A afinidade de ligação aparente relatada como EC50 determinado a partir do ajuste da
relação do sinal dePTIP-83Aa ou PTIP-83Cb marcadas com Alexa
versus concentrações das suas contrapartes não marcadas. Os
sinais de fluorescência de Alexa foram determinados por
densitometria realizada em imagens de gel como representado em (A) . (C) Competição heteróloga entre Alexa-PtIP-83Aa e PtIP-83Cb
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8/525 não marcada. Cada barra reflete a ligação específica medida em cada condição. (D) Competição heteróloga entre Alexa-PtIP-83Cb e PtIP-83Aa não marcada determinada como descrito em (C).
DESCRIÇÃO DETALHADA [0019] Deve ser entendido que esta divulgação não é limitada à metodologia, protocolos, linhagens celulares, gêneros e reagentes particulares descritos, visto que os mesmos podem variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada no presente documento tem o propósito de descrever apenas as modalidades particulares e não é destinada a limitar o escopo da presente divulgação.
[0020] Conforme usado no presente documento, as formas singulares um, uma e o/a incluem referentes plurais, a menos que o contexto dite claramente de outro modo. Desse modo, por exemplo, a referência a uma célula inclui uma pluralidade de tais células e a referência a a proteína inclui referência a uma ou mais proteínas e equivalentes das mesmas conhecidos pelas pessoas versadas na técnica, e assim por diante. Todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado que o comumente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica à qual esta divulgação pertence, a menos que claramente indicado de outro modo.
[0021] A presente divulgação é direcionada a composições e métodos para controlar pragas. Os métodos envolvem transformar organismos com sequências de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos PtIP-83. Em particular, as sequências de ácido nucleico das modalidades são úteis para preparar plantas e microrganismos que têm atividade pesticida. Desse modo,
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9/525 bactérias, plantas, células de plantas, tecidos de planta e sementes transformados são fornecidos. As composições são ácidos nucleicos pesticidas e proteínas de espécies bacterianas. As sequências de ácidos nucleicos encontram uso na construção de vetores de expressão para a transformação subsequente em organismos de interesse, como sondas para o isolamento de outros genes homólogos (ou parcialmente homólogos) e para a geração de polipeptideos PtIP-83 alterados através de métodos conhecidos na técnica, como mutagênese dirigida a sítios, troca de domínios ou embaralhamento de DNA. Os polipeptideos PtIP-83 encontram uso no controle ou extermínio de populações de pragas de lepidópteros, coleópteros, dípteros, fúngicas, hemípteros e de nematódeos e para produzir composições com atividade pesticida. As pragas de insetos de interesse incluem, mas sem limitação, espécies de Lepidoptera gue incluem, mas sem limitação: Lagarta da espiga, (CEW) (Helícoverpa zea Boddie,), Broca europeia do milho (ECB) (Ostrinia nubílalís Hübner), traça das crucíferas (DBM) (Plutella xylostella Linnaeus), por exemplo, Helícoverpa zea Boddie; lagarta falsa-medideira (SBL) Chrysodeixis includens Walker; e lagarta da soja (VBC) (Anticarsia gemmatalis Hübner) e espécies de Coleóptera que incluem, mas sem limitação, Lagartada-raiz do milho do oeste (Diabrotica virgifera) - WCRW, Lagartada-raiz do milho do sul (Diabrotica undecimpunctata howardi) SCRW, e Lagarta-da-raiz do milho do norte (Diabrotica barberi) - NCRW.
[0022] Toxina pesticida ou proteína pesticida é usada no presente documento para se referir a uma toxina que tem atividade tóxica contra uma ou mais pragas, incluindo, mas sem limitação, membros das ordens Lepidoptera , Diptera, Hemiptera e
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Coleoptera ou do filo Nematoda ou uma proteína que tem homologia com tal proteína. As proteínas pesticidas foram purificadas dos organismos incluindo, por exemplo, Bacillus sp., Pseudomonas sp., Photorhabdus sp., Xenorhabdus sp., Clostridium bifermentans e Paenibacillus popilliae.
[0023] Em algumas modalidades, os polipeptídeos PtlP83 incluem sequências de aminoácidos deduzidas das sequências de ácido nucleico de comprimento completo divulgadas no presente documento e sequências de aminoácidos que são mais curtas do que as sequências de comprimento completo, devido ao uso de um sítio de iniciação a jusante alternativo ou devido ao processamento que produz uma proteína mais curta que tem atividade pesticida. O processamento pode ocorrer no organismo em que a proteína é expressa ou na praga após a ingestão da proteína.
[0024] Desse modo, são fornecidas no presente documento novas sequências de ácidos nucleicos isolados ou recombinantes que conferem atividade pesticida. Também são fornecidas sequências de aminoácidos de polipeptídeos PtIP-83. A proteína que resulta da tradução desses genes do polipeptídeo PtIP-83 permite que células controlem ou exterminem pragas que ingerem a mesma.
Moléculas de Ácidos Nucleicos e Variantes e Fragmentos das Mesmas [0025] Um aspecto se refere a moléculas de ácido nucleico isolado ou recombinante que compreendem sequências de ácido nucleico que codificam polipeptídeos PtIP-83 ou porções biologicamente ativas das mesmas, assim como moléculas de ácido nucleico suficientes para o uso como sondas de hibridização para identificar moléculas de ácido nucleico que codificam proteínas
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11/525 com regiões de homologia de sequência. Conforme usado no presente documento, o termo molécula de ácido nucleico se refere a moléculas de DNA (por exemplo, DNA recombinante, cDNA, DNA genômico, DNA plastideo, DNA mitocondrial) e moléculas de RNA (por exemplo, mRNA) e análogos do DNA ou RNA gerados com o uso de análogos de nucleotídeos. A molécula de ácido nucleico pode ser de fita única ou de fita dupla, mas preferencialmente é DNA de fita dupla.
[0026] Uma molécula de ácido nucleico (ou DNA) isolada é usada no presente documento para se referir a uma sequência de ácido nucleico (ou DNA) que não está mais em seu ambiente natural, por exemplo, in vitro. Uma molécula de ácido nucleico (ou DNA) recombinante é usada no presente documento para se referir a uma sequência de ácido nucleico (ou DNA) que está em uma célula hospedeira bacteriana ou de planta recombinante. Em algumas modalidades, um ácido nucleico isolado ou recombinante está livre de sequências (preferencialmente sequências codificadoras de proteína) que flanqueiam naturalmente o ácido nucleico (isto é, sequências localizadas nas extremidades 5' e 3' do ácido nucleico) no DNA genômico do organismo a partir do qual o ácido nucleico é derivado. Para propósitos da divulgação, isolado ou recombinante, quando usado para se referir a moléculas de ácidos nucléicos, exclui cromossomos isolados. Por exemplo, em várias modalidades, as moléculas de ácidos nucléicos recombinantes que codificam os polipeptídeos PtIP-83 podem conter menos que cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb ou 0,1 kb de sequências de ácidos nucléicos que flanqueiam
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12/525 naturalmente a molécula de ácido nucleico no DNA genômico da célula do qual o ácido nucleico é derivado.
[0027] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica polipeptídeos PtIP-83 tem uma ou mais alterações na sequência de ácido nucleico em comparação com a sequência de ácido nucleico nativa ou genômica. Em algumas modalidades, a mudança na sequência de ácido nucleico nativa ou genômica inclui, mas sem limitação: mudanças na sequência de ácido nucleico devido à degenerescência do código genético; mudanças na sequência de ácido nucleico devido à substituição, inserção, deleção e/ou adição de aminoácidos em comparação com a sequência nativa ou genômica; remoção de um ou mais introns; deleção de uma ou mais regiões reguladoras a montante ou a jusante; e deleção da região 5' e/ou 3' não traduzida associada à sequência de ácido nucleico genômico. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo PtlP83 é uma sequência não genômica.
[0028] Uma variedade de polinucleotídeos que codificam polipeptídeos PtIP-83 ou proteínas relacionadas é contemplada. Tais polinucleotídeos são úteis para a produção de polipeptídeos PtIP-83 em células hospedeiras quando operacionalmente ligados a sequências de promotor, de terminação da transcrição e/ou de poliadenilação adequadas. Tais polinucleotídeos também são úteis como sondas para isolar polinucleotídeos homólogos ou substancialmente homólogos que codificam polipeptídeos PtIP-83 ou proteínas relacionadas.
Polinucleotídeos que codificam polipeptídeos PtIP-83
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13/525 [0029] Uma fonte de polinucleotídeos que codificam polipeptídeos PtIP-83 ou proteínas relacionadas é uma samambaia ou outras espécies de plantas primitivas que contêm um polinucleotídeo PtIP-83 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 717, SEQ ID NO: 738, SEQ ID NO: 739, SEQ ID NO: 740, SEQ ID NO: 741, SEQ ID NO: 742, SEQ ID NO: 743, SEQ ID NO: 744, SEQ ID NO: 745, SEQ ID NO: 746, SEQ ID NO: 747, SEQ ID NO: 748, SEQ ID NO: 749, SEQ ID NO: 750, SEQ ID NO: 751, SEQ ID NO: 752 ou SEQ ID NO: 753, que codifica um polipeptídeo PtIP-83 da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO: 754, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NO: 760, SEQ ID NO: 761, SEQ ID NO: 762, SEQ ID NO: 763, SEQ ID NO: 764, SEQ ID NO: 765, SEQ ID NO: 766, SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO: 768, SEQ ID NO: 769 ou SEQ ID NOs: 889-957,. Os polinucleotídeos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:
10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: : 16, SEQ ID ' NO: 18,
SEC ) ID NO: 20, t 3EQ ID NO: 22 , SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO: 717, SEQ
ID NO: 738, SEQ ID NO: 739, SEQ ID NO: 740, SEQ ID NO: 741, SEQ
ID NO: 742, SEQ ID NO: 743, SEQ ID NO: 744, SEQ ID NO: 745, SEQ
ID NO: 746, SEQ ID NO: 747, SEQ ID NO: 748, SEQ ID NO: 749, SEQ
ID NO: 750, SEQ ID NO: 751, SEQ ID NO: 752 e SEQ ID NO: 753 podem ser usados para expressar polipeptídeos PtIP-83 em hospedeiros bacterianos que incluem, mas não se limitam a, células hospedeiras bacterianas de Agrobacterium, Bacillus, Escherichia,
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Salmonella, Pseudomonas e Rhizobium Os polinucleotídeos também são úteis como sondas para isolar polinucleotídeos homólogos ou substancialmente homólogos que codificam polipeptídeos PtIP-83 ou proteínas relacionadas. Tais sondas podem ser usadas para identificar homólogos ou polinucleotídeos substancialmente homólogos derivados da espécie Pteridophyta.
[0030] Polinucleotídeos que codificam polipeptídeos PtIP-83 também podem ser sintetizados de novo a partir de uma sequência de polipeptídeo PtIP-83. A sequência do gene de polinucleotídeo pode ser deduzida de uma sequência de polipeptídeo PtIP-83 através do uso do código genético. Os programas de computador, como BackTranslate (Pacote GCG™, Acclerys, Inc. San Diego, Califórnia) podem ser usados para converter uma sequência de peptídeo na sequência de nucleotídeos correspondente codificadora do peptídeo. Exemplos de sequências do polipeptídeo PtIP-83 que podem ser usadas para se obterem as correspondentes sequências de nucleotídeos codificadoras incluem, mas não estão limitadas aos polipeptídeos PtIP-83 de
SEQ ID NO: 1, SEQ IE ) NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID
NO: 9, SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO : 13 , SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO:
17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO: 716,
SEQ ID NO: 754, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757,
SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NO: 760, SEQ ID NO: 761,
SEQ ID NO: 762, SEQ ID NO: 763, SEQ ID NO: 764, SEQ ID NO: 765,
SEQ ID NO: 766, SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO: 768 , SEQ ID NO: 769
e SEQ ID NOs: 958-1026. Além dis so, sequências de
polinucleotídeos PtIP-83 sintéticos da divulgação podem ser concebidas de modo a serem expressas em plantas. Métodos estão disponíveis na técnica para sintetizar genes preferidos de
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15/525 plantas. Consultar, por exemplo, Murray, et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, e Liu H et al. Mol Bio Rep 37:677-684, 2010, incorporado ao presente documento a titulo de referência. Uma tabela de uso de Zea maize pode também ser encontrada em kazusa.ou.jp//cgi-bin/show.cgi?species=4577, que pode ser acessado com o uso do prefixo www.
[0031] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codificando um polipeptideo PtIP-83 é um polinucleotídeo que tem a sequência apresentada em SEQ ID NO: 2,
SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEC ) ID
NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:
20, SEQ ID NO: 22, SEQ I :d NO: 24, SEQ ID NO: 717, SEQ ID NO:
738, SEQ ID NO: 739, SEQ ID NO: 740, SEQ ID NO: 741, SEQ ID NO:
742, SEQ ID NO: 743, SEQ ID NO: 744, SEQ ID NO: 745, SEQ ID NO:
746, SEQ ID NO: 747, SEQ ID NO: 748, SEQ ID NO: 749, SEQ ID NO:
750, SEQ ID NO: 751, SEQ ID NO : 752, SEQ i ID NO: 753 , θ SEQ ID
NOs: 889-957, e suas variantes, fragmentos e complementos.
Complemento é usado no presente documento para se referir a uma sequência de ácido nucleico que é suficientemente complementar a uma dada sequência de ácido nucleico, de modo que possa hibridizar a dada sequência de ácido nucleico para formar, assim, um dúplex estável. Variantes de sequência de polinucleotídeo é usado no presente documento para se referir
a uma sequência de ácido nucleico que, exceto pela
degenerescência do código genético, codifica o mesmo
polipeptideo.
[0032] Em algumas modalidades, a molécula de ácido
nucleico codificando o polipeptideo PtIP-83 é uma sequência de ácido nucleico não genômico. Conforme usado no presente
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16/525 documento, uma sequência de ácido nucleico não genômico ou molécula de ácido nucleico não genômico ou polinucleotídeo não genômico se refere a uma molécula de ácido nucleico que tem uma ou mais mudanças na sequência de ácido nucleico em comparação com uma sequência de ácido nucleico nativo ou genômico. Em algumas modalidades a mudança para uma molécula de ácido nucleico nativa ou genômica inclui mas não está limitada a: alterações na sequência de ácido nucleico devido à degenerescência do código genético; otimização de códons da sequência de ácido nucleico para a expressão em plantas; mudanças na sequência de ácido nucleico para introduzir pelo menos uma substituição, inserção, deleção e/ou adição de aminoácidos em comparação com a sequência nativa ou genômica; a remoção de um ou mais introns associados com a sequência de ácido nucleico genômica; inserção de um ou mais introns heterólogos; deleção de uma ou mais regiões reguladoras a montante ou a jusante associadas com a sequência de ácido nucleico genômica; inserção de uma ou mais regiões reguladoras heterólogas a montante ou a jusante; deleção da região 5' e/ou 3' não traduzida associada à sequência de ácido nucleico genômica; inserção de uma região heteróloga 5' e/ou 3' não traduzida; e modificação de um sítio de poliadenilação. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não genômico é um cDNA. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não genômico é uma sequência de ácido nucleico sintético.
[0033] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo PtIP-83 é um polinucleotídeo não genômico que tem uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%,
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70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade, em relação à sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 717, SEQ ID NO: 738, SEQ ID NO: 739, SEQ ID NO: 740, SEQ ID NO: 741, SEQ ID NO: 742, SEQ ID NO: 743, SEQ ID NO: 744, SEQ ID NO: 745, SEQ ID NO: 746, SEQ ID NO: 747, SEQ ID NO: 748, SEQ ID NO: 749, SEQ ID NO: 750, SEQ ID NO: 751, SEQ ID NO: 752, SEQ ID NO: 753, ou SEQ ID NOs: 889-957, em que o polipeptídeo PtIP-83 tem atividade inseticida.
[0034]
Em algumas modalidades, o polinucleotídeo não genômico não é a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 717, SEQ ID NO: 738, SEQ ID NO: 739, SEQ ID NO: 740, SEQ ID NO: 741, SEQ ID NO: 742, SEQ ID NO: 743, SEQ ID NO: 744, SEQ ID NO: 745, SEQ ID NO: 746, SEQ ID NO: 747, SEQ ID NO: 748, SEQ ID NO: 749, SEQ ID NO: 750, SEQ ID NO: 751, SEQ ID NO: 752, SEQ ID NO: 753 ou SEQ ID NOs: 889-957,.
[0035]
Em algumas modalidades, a molécula de ácido
nucleico que codifica um polipeptídeo PtIP-83 compreendendo uma
sequência de aminoácidos que tem pelo menos 40%, 45%, 50%, 51%,
52%, 53%, 54% , 55%, 56%, 57%, 58%, 59% , 60%, 61%, 62%, 63%, 64%,
65%, 66%, 67% , 68%, 69%, 70%, 71%, 72% , 73%, 74%, 75%, 76%, 77%,
78%, 79%, 80% , 81%, 82%, 83%, 84%, 85% , 86%, 87%, 88%, 89%, 90%,
91%, 92%, 93% , 94%, 95%, 96%, 97%, 98£ è ou 99% de identidade com
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18/525 a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID
NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13,
SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ
ID NO: 23, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO: 754, SEQ ID NO: 755, SEQ
ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ
ID NO: 760, SEQ ID NO: 761, SEQ ID NO: 762, SEQ ID NO: 763, SEQ
ID NO: 764, SEQ ID NO: 765, SEQ ID NO: 766, SEQ ID NO: 767, SEQ
ID NO: 768, SEQ ID NO : 769 , OU SEQ ID NOs: 958 -1026, em que o
polipeptídeo PtIP-83 tem atividade inseticida.
[0036] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo PtIP-83 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID
NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO c 11 , SEQ ID NO: 13,
SEC ) ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 , SEQ ID NO: 21, SEQ
ID NO: 23, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO: 754, SEQ ID NO: 755, SEQ
ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ
ID NO: 760, SEQ ID NO: 761, SEQ ID NO: 762, SEQ ID NO: 763, SEQ
ID NO: 764, SEQ ID NO: 765, SEQ ID NO: 7 6 6, SEQ ID NO: 767, SEQ
ID NO: 768, SEQ ID NO: 769, ou ; SEQ ID NOs: 958- 1026, que tern 1,
2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,
20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 , 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35,
36, 37 , 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 , 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,
52, 53 , 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 , 61, 62, 63, 64, 65, 6 6, 67,
68, 69 , 70 ou mais substituições de aminoácidos em comparação
com o aminoácido nativo na posição correspondente de SEQ ID NO:
1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ
ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID
NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO:
754, SEQ ID NO: : 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO:
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758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NO: 760, SEQ ID NO: 761, SEQ ID NO
762, SEQ ID NO: 763, SEQ ID NO: 764, SEQ ID NO: 765, SEQ ID NO
766, SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO: 768 SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO
768’ SEQ ID NO: 769 ou SEQ Ί :D NOs: 958-1026 , .
[0037] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptideo PtIP-83 compreendendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO: 236-299, SEQ ID NO: 334-367, SEQ ID NO: 398-427, SEQ ID NO: 518-607, SEQ ID NO: 640-645 e SEQ ID NO: 728-737.
[0038] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptideo PtIP-83 é qualquer uma de
SEQ ID NO: 172-235, SEQ ID NO: 300-333, SEQ ID NO: 368-397, SEQ
ID NO: 428· -517, SEQ ID NO: 634-639 e SEQ ID NO: 718-727.
[0039] Em algumas modalidades, a molécula de ácido
nucleico codifica um polipeptideo PtIP-83 variante da SEQ ID NO: 1, em que o aminoácido na posição 53 é Vai, Ala, Cys ou Thr; o aminoácido na posição 54 é Lys, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, lie, Leu, Met, Asn, Gin, Arg, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 55 é Arg, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Gin, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 56 é Leu, Glu, Phe, lie, Met, Thr ou Vai; o aminoácido na posição 57 é Tyr, Cys, lie, Leu, Met, Thr ou Vai; o aminoácido na posição 58 é Vai, Cys, Ile ou Leu; o aminoácido na posição 59 é Phe, Leu, Met, Vai ou Tyr; o aminoácido na posição 60 é Ala, Cys, Gly, Ser, Thr ou Vai; o aminoácido na posição 61 é Asp, Glu, His ou Ser; o aminoácido na posição 62 é Vai, Ala, Cys, Ile, Leu ou Thr; o aminoácido na posição 63 é Vai, Ala, Cys, lie, Leu, Met ou Thr; o aminoácido na posição 64 é Glu, Ala, Cys, Phe, Gly, His, lie, Leu, Met, Asn, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o
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20/525 aminoácido na posição 65 é Leu, Ala, Cys, Phe, His, lie, Met,
Asn, Gin, Thr, Vai ou Trp; o aminoácido na posição 66 é Pro,
Asp, Gly, Met, Gin ou Arg; o aminoácido na posição 363 é Gin,
Ala, Cys, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Asn, Arg, Ser, Thr, Vai
ou Trp; o aminoácido na posição 364 é Ile, Ala, Cys, Glu, Phe, His, Lys, Leu, Met, Asn, Gin, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 365 é Leu, Ala, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Arg, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 366 é Gly, Ala, Cys, Phe, His, Tie, Lys, Leu, Met, Asn, Ser, Thr ou Vai; o aminoácido na posição 367 é Ser, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, lie, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Thr, Vai ou Trp; o aminoácido na posição 368 é Tyr, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, lie, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai ou Trp; o aminoácido na posição 369 é Leu, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, lie, Met, Thr ou Vai; o aminoácido na posição 370 é Leu, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, lie, Lys, Met, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 371 é Gin, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Asn, Arg, Ser, Thr, Vai ou Trp; o aminoácido na posição 372 é Gin, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Arg, Ser, Vai ou Tyr; o aminoácido na posição 373 é Asn, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Gin, Ser, Thr, Vai ou Trp; o aminoácido na posição 556 é Trp, Phe, Thr ou Tyr; o aminoácido na posição 557 é Arg, Cys, Asp, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 558 é Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 559 é Lys, Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai ou Tyr; o aminoácido na posição 560 é Cys, Ala, Phe, Gly, lie, Met, Asn, Arg, Ser, Thr ou Vai; o
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21/525 aminoácido na posição 561 é Lys, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, lie, Leu, Met, Asn, Arg, Ser, Thr, Vai ou Tyr; o aminoácido na posição 562 é Asn, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Leu, Met, Arg, Ser, Thr, Vai ou Tyr; o aminoácido na posição 563 é Vai, Ala, Cys, Asp, Phe, His, Tie, Leu, Met, Asn, Gin, Thr ou Trp; o aminoácido na posição 564 é Ala, Cys, Gly, Met, Gin, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 646 é Leu, Ala, Cys, Gly, Tie, Met, Asn, Gin, Ser, Thr ou Vai; o aminoácido na posição 647 é Leu, Asp, Gly, Met, Asn, Gin ou Thr; o aminoácido na posição 648 é Met, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 649 é Pro, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Met, Asn, Gin, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 650 é Thr, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Tie, Lys, Leu, Met, Pro, Gin, Arg, Ser, Vai ou Tyr; o aminoácido na posição 651 é Glu, Ala, Cys, Asp, Gly, His, Tie, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai ou Tyr; o aminoácido na posição 652 é Leu, Cys, Phe, Tie, Lys, Met, Pro, Arg, Ser, Thr ou Vai; o aminoácido na posição 653 é Thr, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Tie, Lys, Leu, Pro, Arg, Ser, Vai ou Trp; o aminoácido na posição 654 é Thr, Ala, Cys, Phe, Tie, Lys, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 655 é Trp, Phe ou Tyr; o aminoácido na posição 771 é Arg, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, lie, Lys, Leu,
Asn, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 772 é
Arg, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, lie, Lys, Leu, Met, Pro,
Gin, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 773 é
Asp, Ala, Glu, Phe, Gly, His, lie, Lys, Leu, Met, Asn, Gin, Arg,
Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 774 é Gin,
Ala, Asp, Gly, His, lie, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr,
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Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 775 é Vai, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, lie, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr ou Tyr; o aminoácido na posição 776 é Leu, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Tie, Lys, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai ou Tyr; o aminoácido na posição 777 é Pro, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Gin, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 778 é Phe, Ala, His, Tie, Leu, Met, Asn, Gin, Ser, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 779 é Gin, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Leu, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr ou Vai; o aminoácido na posição 780 é Ala, Cys, Asn, Pro, Gin ou Ser; o aminoácido na posição 781 é Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Tie, Asn, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 782 é Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Tie, Lys, Met, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 783 é Pro, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Asn, Gin, Arg, Ser, Thr ou Vai; o aminoácido na posição 784 é Leu, Ala, Glu, Phe, His, Tie, Lys, Met, Asn, Pro, Gin, Ser, Thr, Vai ou Trp; o aminoácido na posição 785 é Asn, Ala, Cys, Glu, Phe, Gly, His, Tie, Lys, Leu, Met, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; e o aminoácido na posição 786 é Tyr, Phe, Tie, Leu ou Trp.
[0040] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo PtIP-83 variante da SEQ ID NO: 1, em que o aminoácido na posição 1 é Met ou deletado; o aminoácido na posição 2 é Ala ou deletado; o aminoácido na posição 3 é Leu, Vai ou deletado; o aminoácido na posição 4 é Vai, Met ou Leu; o aminoácido na posição 7 é Gly ou Ser; o aminoácido na posição 8 é Lys ou Thr; o aminoácido na posição 10 é Phe ou Tyr; o aminoácido na posição 11 é Glu ou Arg; o aminoácido na posição 18 é Met ou lie; o aminoácido na posição
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23/525 é Gly, Pro ou Ala; o aminoácido na posição 20 é Vai ou deletado; o aminoácido na posição 21 é Leu ou Vai; o aminoácido na posição 23 é Arg ou Gin; o aminoácido na posição 37 é Vai ou Leu; o aminoácido na posição 38 é Arg ou Asn; o aminoácido na posição 40 é Ala ou Ser; o aminoácido na posição 43 é Asn ou Asp; o aminoácido na posição 45 é Gly ou Ala; o aminoácido na posição 46 é Gin ou Glu; o aminoácido na posição 48 é Glu, Pro ou Vai; o aminoácido na posição 51 é Glu ou Gly; o aminoácido na posição 52 é Lys, Arg ou Thr; o aminoácido na posição 56 é Leu ou Vai; o aminoácido na posição 59 é Phe ou Leu; o aminoácido na posição 66 é Pro ou Ala; o aminoácido na posição 67 é Vai, Pro ou Thr; o aminoácido na posição 68 é Vai, Arg, Phe ou Gly; o aminoácido na posição 69 é Glu, Ala ou Lys; o aminoácido na posição 70 é Trp, Thr, His, Tyr ou Arg; o aminoácido na posição 71 é Arg, Pro ou deletado; o aminoácido na posição 72 é Trp, Asp, Leu ou deletado; o aminoácido na posição 73 é Pro, Gin, Asn, His ou deletado; o aminoácido na posição 74 é Pro, Met ou Thr; o aminoácido na posição 75 é Gin, His ou Arg; o aminoácido na posição 76 é Tie, Met ou Leu; o aminoácido na posição 84 é Ile ou Vai; o aminoácido na posição 91 é Trp ou Phe; o aminoácido na posição 93 é Thr ou Ile; o aminoácido na posição 94 é Asp ou Gly; o aminoácido na posição 96 é Arg ou Ser; o aminoácido na posição 97 é Gin, Phe ou Arg; o aminoácido na posição 98 é Ser ou deletado; o aminoácido na posição 99 é Asp ou Ala; o aminoácido na posição 100 é Thr ou Ala; o aminoácido na posição 101 é Glu, Thr ou Trp o aminoácido na posição 103 é His, Arg, Glu ou Gin; o aminoácido na posição 105 é Thr ou Pro; o aminoácido na posição 108 é Lys, Gin ou Glu; o aminoácido na posição 109 é Leu ou Vai; o aminoácido na posição 111 é Ala ou Thr; o aminoácido
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24/525 na posição 112 é Ile, Arg, Thr ou deletado; o aminoácido na posição 113 é Gin, Ala, Gly ou deletado; o aminoácido na posição 114 é Arg, Glu ou Ile; o aminoácido na posição 115 é Glu ou Gin; o aminoácido na posição 116 é Glu, Asn, Gin ou Arg; o aminoácido na posição 117 é Asn, Vai, Tyr ou Phe; o aminoácido na posição 118 é Arg ou Lys; o aminoácido na posição 119 é Trp ou Ser; o aminoácido na posição 122 é Thr, Lys ou Ala; o aminoácido na posição 124 é Ala ou Thr; o aminoácido na posição 126 é Gly ou Asp; o aminoácido na posição 127 é Met ou Ala; o aminoácido na posição 128 é Asn ou Lys; o aminoácido na posição 131 é Vai, Ile ou Thr; o aminoácido na posição 133 é Ile ou Vai; o aminoácido na posição 134 é His ou Tyr; o aminoácido na posição 135 é Ala ou Gly; o aminoácido na posição 137 é Glu ou Lys; o aminoácido na posição 139 é Gin ou Glu; o aminoácido na posição 140 é Vai, Arg ou Leu; o aminoácido na posição 141 é Gly ou Ser; o aminoácido na posição 142 é Vai ou Pro; o aminoácido na posição 144 é Thr, Leu, Phe ou Tyr; o aminoácido na posição 145 é Met, Pro ou Asn; o aminoácido na posição 146 é Ser, Gly ou Asn; o aminoácido na posição 147 é Trp ou Asn; o aminoácido na posição 148 é Ser, Ala ou Pro; o aminoácido na posição 149 é Ser ou deletado; o aminoácido na posição 150 é Vai, Ile ou Tyr; o aminoácido na posição 152 é Arg, Ala, Vai ou Gly; o aminoácido na posição 154 é Ser, Trp ou Glu; o aminoácido na posição 156 é Leu, Asp ou Gin; o aminoácido na posição 158 é Ser ou Cys; o aminoácido na posição 159 é Vai, Thr ou Ile; o aminoácido na posição 162 é Ser ou Ala; o aminoácido na posição 163 é Gly ou deletado; o aminoácido na posição 164 é Phe ou deletado; o aminoácido na posição 165 é Arg ou Ala; o aminoácido na posição 166 é Ala, Arg, Met ou Phe; o aminoácido na posição 167 é Vai ou His; o
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25/525 aminoácido na posição 168 é Ser ou Asn; o aminoácido na posição 169 é Vai, His ou Thr; o aminoácido na posição 170 é Phe ou Vai; o aminoácido na posição 171 é Glu, Asn ou Asp; o aminoácido na posição 172 é Vai, Ala, Arg ou Glu; o aminoácido na posição 175 é Ser, Arg ou Trp; o aminoácido na posição 176 é Vai ou Ile; o aminoácido na posição 177 é Arg ou Ile; o aminoácido na posição 179 é Thr, Ile, Vai ou Ser; o aminoácido na posição 180 é Leu, Phe ou Thr; o aminoácido na posição 181 é Gly, Thr, Gin ou Ser; o aminoácido na posição 182 é Ala, Leu, Phe ou Ile; o aminoácido na posição 183 é Thr ou Gly; o aminoácido na posição 184 é Leu, Thr, Ser ou Arg; o aminoácido na posição 185 é Arg, Gly, Asp ou Ala; o aminoácido na posição 186 é Pro, Vai ou Gin; o aminoácido na posição 187 é Asp, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 188 é His, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 189 é Ala, Arg, Pro ou deletado; o aminoácido na posição 190 é Leu, Asn ou deletado; o aminoácido na posição 191 é Tyr ou deletado; o aminoácido na posição 192 é Ser, Ile, Vai ou Asn; o aminoácido na posição 193 é Thr ou Asp; o aminoácido na posição 194 é Thr ou Ser; o aminoácido na posição 195 é Met ou Thr; o aminoácido na posição 196 é Gin, His, Leu ou Ser; o aminoácido na posição 197 é Ala, Gly ou Leu; o aminoácido na posição 198 é Thr, Glu ou Ala; o aminoácido na posição 199 é Pro ou Arg; o aminoácido na posição 200 é Asn, Ser, Thr ou Gly; o aminoácido na posição 201 é Ala, Leu, Glu ou Trp; o aminoácido na posição 202 é Ser, Asp, Phe ou Leu; o aminoácido na posição 203 é His, Pro, Gly ou Ser; o aminoácido na posição 204 é Ile, Trp, His ou Gly; o aminoácido na posição 205 é Ser, Asn ou Ile; o aminoácido na posição 206 é Ala, Gly, Asp, Tyr ou Arg; o aminoácido na posição 207 é Phe, Vai ou Leu; o aminoácido na posição 208 é Asn, Ser, Pro ou Leu;
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26/525 o aminoácido na posição 210 é Arg, Asp, Glu ou Tyr; o aminoácido na posição 211 é lie, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 212 é Vai, Ala ou Asp; o aminoácido na posição 214 é Pro ou Arg; o aminoácido na posição 215 é Ser ou Thr; o aminoácido na posição 217 é Tyr ou Phe; o aminoácido na posição 218 é Arg ou Ser; o aminoácido na posição 219 é Vai ou Ala; o aminoácido na posição 220 é Cys, Leu ou Ser; o aminoácido na posição 221 é Pro ou His; o aminoácido na posição 222 é Leu, Arg ou Ser; o aminoácido na posição 224 é Asn ou Ser; o aminoácido na posição 225 é Asp, Arg ou Thr; o aminoácido na posição 226 é Thr ou Asn; o aminoácido na posição 227 é Asp, Leu ou deletado; o aminoácido na posição 228 é Thr ou deletado; o aminoácido na posição 229 é Tyr ou deletado; o aminoácido na posição 230 é Leu ou deletado; o aminoácido na posição 231 é Gly ou deletado; o aminoácido na posição 232 é lie ou deletado; o aminoácido na posição 233 é Pro ou deletado; o aminoácido na posição 234 é Ala, Pro ou deletado;
o aminoácido na posição 235 é Asp, lie ou Vai; o aminoácido na posição 236 é Vai, Ser ou Glu; o aminoácido na posição 237 é Ala, Phe ou Tyr; o aminoácido na posição 238 é Ala ou Thr; o aminoácido na posição 239 é Vai, Ser ou Gly; o aminoácido na posição 240 é Leu ou lie; o aminoácido na posição 243 é Asp ou Glu; o aminoácido na posição 249 é Asn ou Ser; o aminoácido na posição 252 é Leu ou Met; o aminoácido na posição 257 é Thr ou Ser; o aminoácido na posição 259 é His ou Leu; o aminoácido na posição 266 é Ala ou Vai; o aminoácido na posição 267 é Cys ou Gly; o aminoácido na posição 268 é His, Arg ou Tyr; o aminoácido na posição 272 é Asp ou Glu; o aminoácido na posição 273 é Vai, Met, lie ou Leu; o aminoácido na posição 274 é Vai ou Met; o aminoácido na posição 278 é Gly ou Ala; o aminoácido na posição
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279 é Glu ou Vai; o aminoácido na posição 281 é Leu ou Ala; o aminoácido na posição 282 é Asn, Leu ou Ile; o aminoácido na posição 285 é Asn ou Ser; o aminoácido na posição 286 é Lys, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 287 é Leu ou Vai; o aminoácido na posição 290 é Pro, Gin ou Arg; o aminoácido na posição 291 é Leu ou Vai; o aminoácido na posição 292 é Lys ou Vai; o aminoácido na posição 293 é Glu ou Gin; o aminoácido na posição 294 é Ser, Asn ou Lys; o aminoácido na posição 295 é Thr ou Ser; o aminoácido na posição 296 é Gin ou His; o aminoácido na posição 297 é Leu ou Met; o aminoácido na posição 300 é Ser ou Thr; o aminoácido na posição 301 é Glu ou Ala; o aminoácido na posição 302 é Ser, Pro ou Ala; o aminoácido na posição 304 é Lys ou Asn; o aminoácido na posição 313 é Vai ou Ile; o aminoácido na posição 314 é His, Glu ou Gin; o aminoácido na posição 315 é Ala, Cys ou Ser; o aminoácido na posição 316 é Ala ou Vai; o aminoácido na posição 317 é Met ou Ile; o aminoácido na posição 319 é Met ou Ile; o aminoácido na posição 320 é Vai ou Gly; o aminoácido na posição 321 é Arg ou Pro; o aminoácido na posição 322 é Ile ou Phe; o aminoácido na posição 323 é Gly ou Vai; o aminoácido na posição 324 é Leu ou Ser; o aminoácido na posição 336 é Ser ou Asn; o aminoácido na posição 339 é Asn, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 350 é Arg ou Gin; o aminoácido na posição 351 é Glu ou Asp; o aminoácido na posição 353 é Lys ou Arg; o aminoácido na posição 354 é Gin ou Arg; o aminoácido na posição 355 é Phe ou Leu; o aminoácido na posição 356 é Lys ou Arg; o aminoácido na posição 360 é Ile, Vai ou Ala; o aminoácido na posição 365 é Leu ou Phe; o aminoácido na posição 371 é ou Glu; o aminoácido na posição 372 é ou Lys; o aminoácido na posição 374 é Arg ou Lys; o aminoácido na posição 37 6 é Phe ou Leu; o aminoácido na posição
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378 é Glu ou Asp; o aminoácido na posição 381 é Leu ou Vai; o aminoácido na posição 388 é Ala ou Ser; o aminoácido na posição 395 é Arg ou Lys; o aminoácido na posição 396 é Glu, Gin ou Gly; o aminoácido na posição 399 é Asp ou Asn; o aminoácido na posição 400 é Asn, Thr ou Asp; o aminoácido na posição 401 é Thr ou Ala; o aminoácido na posição 402 é Phe, lie ou Leu; o aminoácido na posição 406 é Asp ou Glu; o aminoácido na posição 408 é Leu ou Met; o aminoácido na posição 410 é Gly ou Leu; o aminoácido na posição 414 é Ala ou Glu; o aminoácido na posição 416 é Ser, Asn ou Asp; o aminoácido na posição 417 é Ser, Arg ou Gly; o aminoácido na posição 423 é Lys ou Gin; o aminoácido na posição 431 é Arg ou Lys; o aminoácido na posição 432 é Gin ou Glu; o aminoácido na posição 436 é Arg ou Glu; o aminoácido na posição 440 é Asn ou Arg; o aminoácido na posição 442 é Leu ou Vai; o aminoácido na posição 447 é Ser, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 448 é Ala ou Ser; o aminoácido na posição 451 é Gin ou Met; o aminoácido na posição 453 é Gly ou Ala; o aminoácido na posição 455 é Ala ou Vai; o aminoácido na posição 457 é Leu ou Vai; o aminoácido na posição 467 é Vai ou Ala; o aminoácido na posição 471 é Gly ou Ala; o aminoácido na posição 475 é Ser ou Asn; o aminoácido na posição 483 é Gly ou Ala; o aminoácido na posição 493 é Gin ou Gly; o aminoácido na posição 504 é Vai ou lie; o aminoácido na posição 506 é Asp ou His; o aminoácido na posição 509 é Asp ou Asn; o aminoácido na posição 510 é Ser ou Ala; o aminoácido na posição 512 é Glu ou Asp; o aminoácido na posição 515 é Gly ou Ser; o aminoácido na posição 516 é Gin ou His; o aminoácido na posição 517 é lie ou Leu; o aminoácido na posição 519 é Asp, Gly ou Gin; o aminoácido na posição 522 é
Vai
Glu,
Pro ou Vai;
o aminoácido na posição 525 é Glu ou Asp;
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29/525 o aminoácido na posição 526 é Leu ou Met; o aminoácido na posição 539 é Vai ou lie; o aminoácido na posição 555 é Vai ou Ala; o aminoácido na posição 557 é Arg ou Lys; o aminoácido na posição 563 é Vai ou Met; o aminoácido na posição 571 é Ser ou Cys; o aminoácido na posição 575 é Vai ou Glu; o aminoácido na posição 577 é Met ou lie; o aminoácido na posição 579 é Glu ou Gin; o aminoácido na posição 583 é Asp ou Glu; o aminoácido na posição 589 é Met ou Leu; o aminoácido na posição 590 é Met ou Leu; o aminoácido na posição 593 é Met ou lie; o aminoácido na posição 595 é Arg ou Gin; o aminoácido na posição 596 é Ser ou Thr; o aminoácido na posição 597 é Gin ou His; o aminoácido na posição 607 é Ala ou Vai; o aminoácido na posição 608 é Asp ou Asn; o aminoácido na posição 612 é Tyr, His ou Phe; o aminoácido na posição 617 é Thr ou lie; o aminoácido na posição 618 é Gin ou His; o aminoácido na posição 625 é Arg ou Ser; o aminoácido na posição 626 é Met ou lie; o aminoácido na posição 628 é Leu ou lie; o aminoácido na posição 633 é lie ou Met; o aminoácido na posição 634 é Leu ou Met; o aminoácido na posição 642 é Arg ou Met; o aminoácido na posição 648 é Met ou Thr; o aminoácido na posição 651 é Glu ou Gin; o aminoácido na posição 654 é Thr, Vai ou Ala; o aminoácido na posição 658 é Gly ou Arg; o aminoácido na posição 663 é Gly ou Ala; o aminoácido na posição 664 é Asp ou Asn; o aminoácido na posição 668 é Ala ou Thr; o aminoácido na posição 669 é Gin ou His; o aminoácido na posição 671 é Asn ou Ser o aminoácido na posição 675 é lie, Vai ou Ser; o aminoácido na posição 678 é Met, lie, Ala ou Thr; o aminoácido na posição 682 é Pro ou Gin; o aminoácido na posição 683 é Ser ou Pro; o aminoácido na posição 685 é Asp ou Asn; o aminoácido na posição 694 é Asp ou Gly; o aminoácido na posição 697 é Asn ou Ser; o
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30/525 aminoácido na posição 704 é Glu ou Gly; o aminoácido na posição 714 é Ala ou Gly; o aminoácido na posição 721 é Ser ou Phe; o aminoácido na posição 722 é Ser ou Asn; o aminoácido na posição 724 é Ser ou Thr; o aminoácido na posição 734 é His ou Gin; o aminoácido na posição 736 é Vai ou Ala; o aminoácido na posição 737 é Lys ou Gin; o aminoácido na posição 739 é Ala ou Ser; o aminoácido na posição 740 é Ser ou Met; o aminoácido na posição 741 é Gly ou Asn; o aminoácido na posição 742 é Ile ou Gly; o aminoácido na posição 743 é Gly ou deletado; o aminoácido na posição 745 é Gly ou Asp; o aminoácido na posição 751 é Thr, Ser ou Ala; o aminoácido na posição 753 é Gin ou Arg; o aminoácido na posição 754 é Thr ou Ser; o aminoácido na posição 756 é Thr ou Ile; o aminoácido na posição 757 é Vai ou Ile; o aminoácido na posição 766 é Ile ou Vai; o aminoácido na posição 773 é Asp ou Glu; o aminoácido na posição 774 é Gin ou Glu; o aminoácido na posição 776 é Leu ou Met; o aminoácido na posição 777 é Pro ou Thr; o aminoácido na posição 782 é Ala, Asp ou Vai; o aminoácido na posição 786 é Tyr ou Phe; o aminoácido na posição 787 é His ou Gin; o aminoácido na posição 788 é Tyr ou Met; o aminoácido na posição 789 é Ala ou Arg; o aminoácido na posição 790 é Tyr ou Thr; o aminoácido na posição 791 é Arg ou Ala; o aminoácido na posição 792 é Leu ou Ser; o aminoácido na posição 796 é Asp ou Glu; o aminoácido na posição 797 é Ser, Thr ou Ala o aminoácido na posição 802 é Glu ou Gin; o aminoácido na posição 806 é Gin, Asp, Glu ou His; o aminoácido na posição 810 é Lys ou Thr; o aminoácido na posição 819 é Arg ou His; o aminoácido na posição 829 é Lys, Ser, Ala ou Pro; o aminoácido na posição 832 é Ala, Lys ou Glu; o aminoácido na posição 833 é Gly ou Glu; o aminoácido na posição 842 é Leu ou Pro; o aminoácido na posição
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847 é Gin ou Glu; o aminoácido na posição 848 é Ile ou Vai; o aminoácido na posição 849 é Vai ou Ala; o aminoácido na posição 855 é Thr ou Met; o aminoácido na posição 860 é Ile ou Vai; e o aminoácido na posição 864 é His ou Gin.
[0041] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptideo PtIP-83 variante da SEQ ID NO: 1, em que o aminoácido na posição 1 é Met ou deletado; o aminoácido na posição 2 é Ala ou deletado; o aminoácido na posição 3 é Leu, Vai, Ile ou deletado; o aminoácido na posição 4 é Vai, Met, lie ou Leu; o aminoácido na posição 7 é Gly, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 8 é Lys, Arg, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 10 é Phe, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 11 é Glu, Asp, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 18 é Met, Vai, Leu ou Ile; o aminoácido na posição 19 é Gly, Pro ou Ala; o aminoácido na posição 20 é Vai, Ile, Leu ou deletado; o aminoácido na posição 21 é Leu, Ile ou Vai; o aminoácido na posição 23 é Arg, Lys, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 37 é Vai, Ile ou Leu; o aminoácido na posição 38 é Arg, Lys, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 40 é Ala, Gly, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 43 é Asn, Gin, Glu ou Asp; o aminoácido na posição 45 é Gly ou Ala; o aminoácido na posição 46 é Gin, Asp, Asn ou Glu; o aminoácido na posição 48 é Glu, Asp, Pro, lie, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 51 é Glu, Asp, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 52 é Lys, Arg, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 56 é Leu, Ile ou Vai; o aminoácido na posição 59 é Phe, Ile, Vai ou Leu; o aminoácido na posição 66 é Pro, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 67 é Vai, Pro, lie, Leu, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 68 é Vai, Arg, Phe, Ile, Leu, Lys ou Gly; o aminoácido na posição 69 é Glu, Ala, Asp, Gly, Arg ou Lys; o
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aminoácido na posição 70 i é Trp, Thr, His, Tyr, Lys ou Arg; o
aminoácido na posição 71 é Arg, , Pro, Lys ou deletado; o
aminoácido na posição 72 é Trp, Asp, Leu, Ile, Vai, Glu ou
deletado; o aminoácido na posição 73 é Pro, Gin, Asn, His ou
deletado; o aminoácido na posição 74 é Pro, Met, Ser ou Thr; o
aminoácido na posição 75 é Gin, His, Asn, Lys ou Arg; o
aminoácido na posição 76 é lie, Met, Vai ou Leu; o aminoácido na posição 84 é Ile, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 91 é Trp ou Phe; o aminoácido na posição 93 é Thr, Ser, Leu, Vai ou Ile; o aminoácido na posição 94 é Asp, Glu, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 96 é Arg, Lys, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 97 é Gin, Phe, Asn, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 98 é Ser, Thr ou deletado; o aminoácido na posição 99 é Asp, Glu, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 100 é Thr, Ser, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 101 é Glu, Thr, Asp, Ser ou Trp o aminoácido na posição 103 é His, Arg, Lys, Glu ou Gin; o aminoácido na posição 105 é Thr, Ser ou Pro; o aminoácido na posição 108 é Lys, Arg, Asn, Asp, Gin ou Glu; o aminoácido na posição 109 é Leu, Ile ou Vai; o aminoácido na posição 111 é
Ala, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 112 é Ile, Arg, Thr,
Leu, Vai, Lys, Ser ou deletado; o aminoácido na posição 113 é
Gin, Ala, Gly, Asn ou deletado; o aminoácido na posição 114 é
Arg, Glu, Lys, Asp ou Ile; o aminoácido na posi ção 115 é Glu,
Asp, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 116 é Glu, Asn, Gin,
Asp, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 117 é Asn, Vai, Tyr,
Ile, Leu, Gin, Trp ou Phe; o aminoácido na posição 118 é Arg ou Lys; o aminoácido na posição 119 é Trp, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 122 é Thr, Lys, Ser, Arg ou Ala; o aminoácido na posição 124 é Ala, Gly, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 126
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33/525 é Gly, Ala, Glu ou Asp; o aminoácido na posição 127 é Met, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 128 é Asn, Gin, Arg ou Lys; o aminoácido na posição 131 é Vai, Ile, Leu, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 133 é Ile, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 134 é His ou Tyr; o aminoácido na posição 135 é Ala ou Gly; o aminoácido na posição 137 é Glu, Asp, Arg ou Lys; o aminoácido na posição 139 é Gin, Asn, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 140 é Vai, Arg, Ile, Lys ou Leu; o aminoácido na posição 141 é Gly, Ala, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 142 é Vai, lie, Leu ou Pro; o aminoácido na posição 144 é Thr, Leu, Phe, Ile, Vai ou Tyr; o aminoácido na posição 145 é Met, Pro, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 146 é Ser, Gly, Thr, Ala, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 147 é Trp, Gin, Tyr ou Asn;
o aminoácido na posição 148 é Ser, Ala, Thr, Gly ou Pro; o aminoácido na posição 149 é Ser, Thr ou deletado; o aminoácido na posição 150 é Vai, Ile, Leu ou Tyr; o aminoácido na posição 152 é Arg, Ala, Vai, Ile, Leu, Lys ou Gly; o aminoácido na posição 154 é Ser, Trp, Thr, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 156 é Leu, Asp, Ile, Vai, Asn, Glu ou Gin; o aminoácido na posição 158 é Ser, Thr ou Cys; o aminoácido na posição 159 é Vai, Thr, Leu ou Ile; o aminoácido na posição 162 é Ser, Thr, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 163 é Gly, Ala ou deletado; o aminoácido na posição 164 é Phe ou deletado; o aminoácido na posição 165 é Arg, Lys, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 166 é Ala, Arg, Met, Lys ou Phe; o aminoácido na posição 167 é Vai, Ile, Leu ou His; o aminoácido na posição 168 é Ser, Thr, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 169 é Vai, His, Ile, Leu, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 170 é Phe, Ile, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 171 é Glu, Asn, Gin ou Asp; o aminoácido
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34/525 na posição 172 é Vai, Ala, Arg, lie, Leu, Gly, Lys, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 175 é Ser, Arg, Thr, Lys ou Trp; o aminoácido na posição 176 é Vai, Leu ou lie; o aminoácido na posição 177 é Arg, Lys, Leu, Vai ou lie; o aminoácido na posição 179 é Thr, lie, Vai, Leu ou Ser; o aminoácido na posição 180 é Leu, Phe, lie, Vai, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 181 é Gly, Thr, Gin, Asn ou Ser; o aminoácido na posição 182 é Ala, Leu, Phe, Vai ou lie; o aminoácido na posição 183 é Thr, Ser, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 184 é Leu, Thr, Ser, lie, Vai, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 185 é Arg, Gly, Asp, Lys, Glu ou Ala; o aminoácido na posição 186 é Pro, Vai, lie, Leu, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 187 é Asp, Thr, Glu ou Ser; o aminoácido na posição 188 é His, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 189 é Ala, Arg, Pro, Lys, Gly ou deletado; o aminoácido na posição 190 é Leu, Asn, lie, Vai, Gin ou deletado; o aminoácido na posição 191 é Tyr ou deletado; o aminoácido na posição 192 é Ser, lie, Vai, Leu, Thr ou Asn; o aminoácido na posição 193 é Thr, Ser, Glu ou Asp; o aminoácido na posição 194 é Thr ou Ser; o aminoácido na posição 195 é Met ou Thr; o aminoácido na posição 196 é Gin, His, Leu, Asn, lie, Vai, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 197 é Ala, Gly, lie, Vai ou Leu; o aminoácido na posição 198 é Thr, Glu, Ser, Asp, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 199 é Pro, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 200 é Asn, Ser, Thr, Gin, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 201 é Ala, Leu, Glu, Tie, Asp ou Trp; o aminoácido na posição 202 é Ser, Asp, Phe, lie, Vai, Thr, Glu ou Leu; o aminoácido na posição 203 é His, Pro, Gly, Ala, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 204 é lie, Trp, His, Leu, Vai, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 205 é Ser, Asn, Leu, Vai, Thr, Gin ou
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35/525 lie; o aminoácido na posição 206 é Ala, Gly, Asp, Tyr, Glu, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 207 é Phe, Vai, lie ou Leu; o aminoácido na posição 208 é Asn, Ser, Pro, Gin, Thr, Vai, lie ou Leu; o aminoácido na posição 210 é Arg, Asp, Glu, Lys, Ser ou Tyr; o aminoácido na posição 211 é lie, Ser, Leu, Vai ou Thr; o aminoácido na posição 212 é Vai, Ala, lie, Leu, Glu, Gly ou Asp; o aminoácido na posição 214 é Pro, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 215 é Ser ou Thr; o aminoácido na posição 217 é Tyr ou Phe; o aminoácido na posição 218 é Arg, Lys, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 219 é Vai, lie, Leu ou Ala; o aminoácido na posição 220 é Cys, Leu, lie, Vai, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 221 é Pro ou His; o aminoácido na posição 222 é Leu, Arg, Lys, lie, Vai, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 224 é Asn, Gin, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 225 é Asp, Arg, Glu, Lys, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 226 é Thr, Ser, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 227 é Asp, Leu, Glu, lie, Vai ou deletado; o aminoácido na posição 228 é Thr, Ser ou deletado; o aminoácido na posição 229 é Tyr ou deletado; o aminoácido na posição 230 é Leu, lie, Vai ou deletado; o aminoácido na posição 231 é Gly, Ala ou deletado; o aminoácido na posição 232 é lie, Leu, Vai ou deletado; o aminoácido na posição 233 é Pro ou deletado; o aminoácido na posição 234 é Ala, Pro, Gly ou deletado; o aminoácido na posição 235 é Asp, lie, Leu, Glu ou Vai; o aminoácido na posição 236 é Vai, Ser, lie, Leu, Thr, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 237 é Ala, Phe ou Tyr; o aminoácido na posição 238 é Ala, Gly, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 239 é Vai, Ser, lie, Leu, Thr, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 240 é Leu, Vai ou lie; o aminoácido na posição 243 é Asp ou Glu; o aminoácido na posição 249 é Asn,
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Gin, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 252 é Leu, lie, Vai ou Met; o aminoácido na posição 257 é Thr ou Ser; o aminoácido na posição 259 é His, lie, Vai ou Leu; o aminoácido na posição 266 é Ala, lie, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 267 é Cys, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 268 é His, Arg, Lys ou Tyr; o aminoácido na posição 272 é Asp ou Glu; o aminoácido na posição 273 é Vai, Met, lie ou Leu; o aminoácido na posição 274 é Vai, lie, Leu ou Met; o aminoácido na posição 278 é Gly ou Ala; o aminoácido na posição 279 é Glu, Asp, Gly ou Vai; o aminoácido na posição 281 é Leu, lie, Vai, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 282 é Asn, Leu ou lie; o aminoácido na posição 285 é Asn, Gin, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 286 é Lys, Asp, Arg ou Glu; o aminoácido na posição 287 é Leu, lie ou Vai; o aminoácido na posição 290 é Pro, Gin, Asn, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 291 é Leu, lie ou Vai; o aminoácido na posição 292 é Lys, Arg, lie, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 293 é Glu, Asp, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 294 é Ser, Asn, Thr, Gin, Arg ou Lys; o aminoácido na posição 295 é Thr ou Ser; o aminoácido na posição 296 é Gin, Asn ou His; o aminoácido na posição 297 é Leu, lie, Vai ou Met; o aminoácido na posição 300 é Ser ou Thr; o aminoácido na posição 301 é Glu, Asp, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 302 é Ser, Pro, Thr, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 304 é Lys, Arg, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 313 é Vai, Leu ou lie; o aminoácido na posição 314 é His, Glu, Asn, Asp ou Gin; o aminoácido na posição 315 é Ala, Cys, Gly, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 316 é Ala, lie, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 317 é Met, Leu, Vai ou lie; o aminoácido na posição 319 é Met, Leu, Vai ou lie; o aminoácido na posição 320 é Vai, lie, Leu, Ala ou Gly; o aminoácido na
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37/525 posição 321 é Arg, Lys ou Pro; o aminoácido na posição 322 é lie, Leu, Vai ou Phe; o aminoácido na posição 323 é Gly, lie, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 324 é Leu, lie, Vai, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 336 é Ser, Thr, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 339 é Asn, Lys, Gin ou Arg; o aminoácido na posição 350 é Arg, Lys, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 351 é Glu ou Asp; o aminoácido na posição 353 é Lys ou Arg; o aminoácido na posição 354 é Gin, Asn, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 355 é Phe, lie, Leu ou Leu; o aminoácido na posição 356 é Lys ou Arg; o aminoácido na posição 360 é lie, Vai, Leu, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 365 é Leu, lie, Vai ou Phe; o aminoácido na posição 371 é ou Glu ou Asp; o aminoácido na posição 372 é ou Lys ou Arg; o aminoácido na posição 374 é Arg ou Lys; o aminoácido na posição 376 é Phe, lie, Vai ou Leu; o aminoácido na posição 378 é Glu ou Asp; o aminoácido na posição 381 é Leu, lie ou Vai; o aminoácido na posição 388 é Ala, Thr, Gly ou Ser; o aminoácido na posição 395 é Arg ou Lys; o aminoácido na posição 396 é Glu, Gin, Asp, Asn, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 399 é Asp, Gin, Glu ou Asn; o aminoácido na posição 400 é Asn, Thr, Ser, Glu, Gin ou Asp; o aminoácido na posição 401 é Thr, Ser, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 402 é Phe, lie, Vai ou Leu; o aminoácido na posição 406 é Asp ou Glu; o aminoácido na posição 408 é Leu, Tie, Vai ou Met; o aminoácido na posição 410 é Gly, lie, Vai, Ala ou Leu; o aminoácido na posição 414 é
Ala, Gly, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 416 é Ser, Asn,
Thr, Gin, Glu ou Asp; o aminoácido na posição 417 é Ser, Arg,
Lys, Thr, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 423 é Lys, Arg,
Asn ou Gin; o aminoácido na posição 431 é Arg ou Lys; o aminoácido na posição 432 é Gin, Asn, Asp ou Glu; o aminoácido na posição
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436 é Arg, Lys, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 440 é Asn, Gin, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 442 é Leu, lie ou Vai; o aminoácido na posição 447 é Ser, Lys, Thr ou Arg; o aminoácido na posição 448 é Ala, Gly, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 451 é Gin, Asn ou Met; o aminoácido na posição 453 é Gly ou Ala; o aminoácido na posição 455 é Ala, Leu, Tie ou Vai; o aminoácido na posição 457 é Leu, Tie ou Vai; o aminoácido na posição 467 é Vai, Tie, Leu, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 471 é Gly ou Ala; o aminoácido na posição 475 é Ser, Thr, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 483 é Gly ou Ala; o aminoácido na posição 493 é Gin, Asn ou Gly; o aminoácido na posição 504 é Vai, Leu ou Tie; o aminoácido na posição 506 é Asp, Glu ou His; o aminoácido na posição 509 é Asp, Glu, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 510 é Ser, Thr, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 512 é Glu ou Asp; o aminoácido na posição 515 é Gly, Ala, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 516 é Gin, Asn ou His; o aminoácido na posição 517 é Tie, Vai ou Leu; o aminoácido na posição 519 é Asp, Asn, Glu, Gly ou Gin; o aminoácido na posição 522 é Vai, Glu, Pro, Tie, Leu ou Asp; o aminoácido na posição 525 é Glu ou Asp; o aminoácido na posição 526 é Leu, Tie, Vai ou Met; o aminoácido na posição 539 é Vai, Leu ou Tie; o aminoácido na posição 555 é Vai, Leu, Tie ou Ala; o aminoácido na posição 557 é Arg ou Lys; o aminoácido na posição 563 é Vai, Leu, Tie ou Met; o aminoácido na posição 571 é Ser, Thr ou Cys; o aminoácido na posição 575 é Vai, Leu, Tie, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 577 é Met, Leu, Vai ou Tie; o aminoácido na posição 579 é Glu, Asp, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 583 é Asp ou Glu; o aminoácido na posição 589 é Met, Tie, Vai ou Leu; o aminoácido na posição 590 é Met, Tie, Vai ou Leu; o aminoácido
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39/525 na posição 593 é Met, Leu, Vai ou lie; o aminoácido na posição 595 é Arg, Lys, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 596 é Ser ou Thr; o aminoácido na posição 597 é Gin, Asn ou His; o aminoácido na posição 607 é Ala, Gly, lie, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 608 é Asp, Glu, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 612 é Tyr, His ou Phe; o aminoácido na posição 617 é Thr, Ser, Leu, Vai ou lie; o aminoácido na posição 618 é Gin, Asn ou His; o aminoácido na posição 625 é Arg, Lys, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 626 é Met, Leu, Vai ou lie; o aminoácido na posição 628 é Leu, Vai ou lie; o aminoácido na posição 633 é lie, Leu, Vai ou Met; o aminoácido na posição 634 é Leu, Tie, Vai ou Met; o aminoácido na posição 642 é Arg, Lys ou Met; o aminoácido na posição 648 é Met, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 651 é Glu, Asp, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 654 é Thr, Vai, Ser, lie, Leu, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 658 é Gly, Lys, Ala ou Arg; o aminoácido na posição 663 é Gly ou Ala; o aminoácido na posição 664 é Asp, Glu, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 668 é Ala, Gly, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 669 é Gin, Asn ou His; o aminoácido na posição 671 é Asn, Gin, Thr ou Ser o aminoácido na posição 675 é lie, Vai, lie, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 678 é Met, lie, Ala, Leu, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 682 é Pro, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 683 é Ser, Thr ou Pro; o aminoácido na posição 685 é Asp, Glu, Asp ou Asn; o aminoácido na posição 694 é Asp, Glu, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 697 é Asn, Gin, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 704 é Glu, Asp, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 714 é Ala ou Gly; o aminoácido na posição 721 é Ser, Thr ou Phe; o aminoácido na posição 722 é Ser, Thr, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 724 é Ser ou Thr; o aminoácido na posição
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734 é His, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 736 é Vai, Leu, lie ou Ala; o aminoácido na posição 737 é Lys, Arg, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 739 é Ala, Gly, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 740 é Ser, Thr ou Met; o aminoácido na posição 741 é Gly, Ala, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 742 é lie, Leu, Vai, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 743 é Gly ou deletado; o aminoácido na posição 745 é Gly, Ala, Glu ou Asp; o aminoácido na posição 751 é Thr, Ser, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 753 é Gin, Asn, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 754 é Thr ou Ser; o aminoácido na posição 756 é Thr, Ser, Leu, Vai ou lie; o aminoácido na posição 757 é Vai, Leu ou lie; o aminoácido na posição 766 é lie, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 773 é Asp ou Glu; o aminoácido na posição 774 é Gin, Asn, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 776 é Leu, Tie, Vai ou Met; o aminoácido na posição 777 é Pro, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 782 é Ala, Asp, Glu, lie, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 786 é Tyr ou Phe; o aminoácido na posição 787 é His, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 788 é Tyr ou Met; o aminoácido na posição 789 é Ala, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 790 é Tyr ou Thr; o aminoácido na posição 791 é Arg, Lys, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 792 é Leu, lie, Vai, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 796 é Asp ou Glu; o aminoácido na posição 797 é Ser, Thr ou Ala o aminoácido na posição 802 é Glu, Lys, Asp, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 806 é Gin, Asp, Glu, Asn ou His; o aminoácido na posição 810 é Lys, Arg ou Thr; o aminoácido na posição 819 é Arg, Lys ou His; o aminoácido na posição 829 é Lys, Ser, Ala ou Pro; o aminoácido na posição 832 é Ala, Lys, Arg, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 833 é Gly, Ala, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 842 é Leu, Tie, Vai ou Pro; o
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41/525 aminoácido na posição 847 é Gin, Asn, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 848 é Ile, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 849 é Vai, Leu, Ile, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 855 é Thr, Ser ou Met; o aminoácido na posição 860 é Ile, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 864 é His, Asn ou Gin;
[0042] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo PtIP-83 variante da SEQ ID NO: 1, em que o aminoácido na posição 1 é Met ou deletado; o aminoácido na posição 2 é Ala ou deletado; o aminoácido na posição 3 é Leu, Vai, Ile ou deletado; o aminoácido na posição 4 é Vai, Met, lie ou Leu; o aminoácido na posição 7 é Gly, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 8 é Lys, Arg, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 10 é Phe, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 11 é Glu, Asp, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 18 é Met, Vai, Leu ou Ile; o aminoácido na posição 19 é Gly, Pro ou Ala; o aminoácido na posição 20 é Vai, Ile, Leu ou deletado; o aminoácido na posição 21 é Leu, Ile ou Vai; o aminoácido na posição 23 é Arg, Lys, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 37 é Vai, Ile ou Leu; o aminoácido na posição 38 é Arg, Lys, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 40 é Ala, Gly, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 43 é Asn, Gin, Glu ou Asp; o aminoácido na posição 45 é Gly ou Ala; o aminoácido na posição 46 é Gin, Asp, Asn ou Glu; o aminoácido na posição 48 é Glu, Asp, Pro, lie, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 51 é Glu, Asp, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 52 é Lys, Arg, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 53 é Vai, Ala, Cys ou Thr; o aminoácido na posição 54 é Lys, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, lie, Leu, Met, Asn, Gin, Arg, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 55 é Arg, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Gin, Ser, Thr, Vai, Trp ou
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Tyr; o aminoácido na posição 56 é Leu, Glu, Phe, lie, Met, Thr ou Vai; o aminoácido na posição 57 é Tyr, Cys, Tie, Leu, Met, Thr ou Vai; o aminoácido na posição 58 é Vai, Cys, lie ou Leu; o aminoácido na posição 59 é Phe, Leu, Met, Vai ou Tyr; o aminoácido na posição 60 é Ala, Cys, Gly, Ser, Thr ou Vai; o aminoácido na posição 61 é Asp, Glu, His ou Ser; o aminoácido na posição 62 é Vai, Ala, Cys, lie, Leu ou Thr; o aminoácido na posição 63 é Vai, Ala, Cys, Tie, Leu, Met ou Thr; o aminoácido na posição 64 é Glu, Ala, Cys, Phe, Gly, His, Tie, Leu, Met, Asn, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 65 é Leu, Ala, Cys, Phe, His, Tie, Met, Asn, Gin, Thr, Vai ou Trp; o aminoácido na posição 66 é Pro, Asp, Gly, Met, Gin ou Arg; o aminoácido na posição 67 é Vai, Pro, lie, Leu, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 68 é Vai, Arg, Phe, lie, Leu, Lys ou Gly; o aminoácido na posição 69 é Glu, Ala, Asp, Gly, Arg ou Lys; o aminoácido na posição 70 é Trp, Thr, His, Tyr, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 71 é Arg, Pro, Lys ou deletado; o aminoácido na posição 72 é Trp, Asp, Leu, lie, Vai, Glu ou deletado; o aminoácido na posição 73 é Pro, Gin, Asn, His ou deletado; o aminoácido na posição 74 é Pro, Met, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 75 é Gin, His, Asn, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 76 é Tie, Met, Vai ou Leu; o aminoácido na posição 84 é lie, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 91 é Trp ou Phe; o aminoácido na posição 93 é Thr, Ser, Leu, Vai ou lie; o aminoácido na posição 94 é Asp, Glu, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 96 é Arg, Lys, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 97 é Gin, Phe, Asn, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 98 é Ser, Thr ou deletado; o aminoácido na posição 99 é Asp, Glu, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 100 é Thr, Ser, Gly ou Ala; o
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aminoácido na posição 101 é Glu , Thr, Asp , Ser ou Trp o
aminoácido na posição 103 é His, Arg, Lys, Glu ou Gin; o
aminoácido na posição 105 é Thr, Ser ou Pro ; o aminoácido na
posição 108 é Lys, Arg , Asn, Asp, Gin ou Glu; o aminoácido na
posição 109 é Leu, lie ou Vai; o aminoácido na posição 111 é
Ala, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 112 é Tie, Arg, Thr, Leu, Vai, Lys, Ser ou deletado; o aminoácido na posição 113 é Gin, Ala, Gly, Asn ou deletado; o aminoácido na posição 114 é Arg, Glu, Lys, Asp ou Tie; o aminoácido na posição 115 é Glu, Asp, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 116 é Glu, Asn, Gin, Asp, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 117 é Asn, Vai, Tyr, Tie, Leu, Gin, Trp ou Phe; o aminoácido na posição 118 é Arg ou Lys; o aminoácido na posição 119 é Trp, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 122 é Thr, Lys, Ser, Arg ou Ala; o aminoácido na posição 124 é Ala, Gly, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 126 é Gly, Ala, Glu ou Asp; o aminoácido na posição 127 é Met, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 128 é Asn, Gin, Arg ou Lys; o aminoácido na posição 131 é Vai, Tie, Leu, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 133 é Tie, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 134 é His ou Tyr; o aminoácido na posição 135 é Ala ou Gly; o aminoácido na posição 137 é Glu, Asp, Arg ou Lys; o aminoácido na posição 139 é Gin, Asn, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 140 é Vai, Arg, Tie, Lys ou Leu; o aminoácido na posição 141 é Gly, Ala, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 142 é Vai, Tie, Leu ou Pro; o aminoácido na posição 144 é Thr, Leu, Phe, Tie, Vai ou Tyr; o aminoácido na posição 145 é Met, Pro, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 146 é Ser, Gly, Thr, Ala, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 147 é Trp, Gin, Tyr ou Asn; o aminoácido na posição 148 é Ser, Ala, Thr, Gly ou Pro; o
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44/525 aminoácido na posição 149 é Ser, Thr ou deletado; o aminoácido na posição 150 é Vai, Ile, Leu ou Tyr; o aminoácido na posição 152 é Arg, Ala, Vai, Ile, Leu, Lys ou Gly; o aminoácido na posição 154 é Ser, Trp, Thr, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 156 é Leu, Asp, Ile, Vai, Asn, Glu ou Gin; o aminoácido na posição 158 é Ser, Thr ou Cys; o aminoácido na posição 159 é Vai, Thr, Leu ou Ile; o aminoácido na posição 162 é Ser, Thr, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 163 é Gly, Ala ou deletado; o aminoácido na posição 164 é Phe ou deletado; o aminoácido na posição 165 é Arg, Lys, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 166 é Ala, Arg, Met, Lys ou Phe; o aminoácido na posição 167 é Vai, Ile, Leu ou His; o aminoácido na posição 168 é Ser, Thr, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 169 é Vai, His, Ile, Leu, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 170 é Phe, Ile, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 171 é Glu, Asn, Gin ou Asp; o aminoácido na posição 172 é Vai, Ala, Arg, Ile, Leu, Gly, Lys, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 175 é Ser, Arg, Thr, Lys ou Trp; o aminoácido na posição 176 é Vai, Leu ou Ile; o aminoácido na posição 177 é Arg, Lys, Leu, Vai ou Ile; o aminoácido na posição 179 é Thr, Ile, Vai, Leu ou Ser; o aminoácido na posição 180 é Leu, Phe, Ile, Vai, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 181 é Gly, Thr, Gin, Asn ou Ser; o aminoácido na posição 182 é Ala, Leu, Phe, Vai ou Ile; o aminoácido na posição 183 é Thr, Ser, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 184 é Leu, Thr, Ser, Ile, Vai, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 185 é Arg, Gly, Asp, Lys, Glu ou Ala; o aminoácido na posição 186 é Pro, Vai, Ile, Leu, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 187 é Asp, Thr, Glu ou Ser; o aminoácido na posição 188 é His, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 189 é Ala, Arg, Pro, Lys, Gly ou deletado; o
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45/525 aminoácido na posição 190 é Leu, Asn, lie, Vai, Gin ou deletado; o aminoácido na posição 191 é Tyr ou deletado; o aminoácido na posição 192 é Ser, lie, Vai, Leu, Thr ou Asn; o aminoácido na posição 193 é Thr, Ser, Glu ou Asp; o aminoácido na posição 194 é Thr ou Ser; o aminoácido na posição 195 é Met ou Thr; o aminoácido na posição 196 é Gin, His, Leu, Asn, lie, Vai, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 197 é Ala, Gly, lie, Vai ou Leu; o aminoácido na posição 198 é Thr, Glu, Ser, Asp, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 199 é Pro, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 200 é Asn, Ser, Thr, Gin, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 201 é Ala, Leu, Glu, Tie, Asp ou Trp; o aminoácido na posição 202 é Ser, Asp, Phe, lie, Vai, Thr, Glu ou Leu; o aminoácido na posição 203 é His, Pro, Gly, Ala, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 204 é lie, Trp, His, Leu, Vai, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 205 é Ser, Asn, Leu, Vai, Thr, Gin ou lie; o aminoácido na posição 206 é Ala, Gly, Asp, Tyr, Glu, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 207 é Phe, Vai, lie ou Leu; o aminoácido na posição 208 é Asn, Ser, Pro, Gin, Thr, Vai, lie ou Leu; o aminoácido na posição 210 é Arg, Asp, Glu, Lys, Ser ou Tyr; o aminoácido na posição 211 é lie, Ser, Leu, Vai ou Thr; o aminoácido na posição 212 é Vai, Ala, lie, Leu, Glu, Gly ou Asp; o aminoácido na posição 214 é Pro, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 215 é Ser ou Thr; o aminoácido na posição 217 é Tyr ou Phe; o aminoácido na posição 218 é Arg, Lys, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 219 é Vai, lie, Leu ou Ala; o aminoácido na posição 220 é Cys, Leu, lie, Vai, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 221 é Pro ou His; o aminoácido na posição 222 é Leu, Arg, Lys, lie, Vai, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 224 é Asn, Gin, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 225 é Asp, Arg,
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Glu, Lys, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 226 é Thr, Ser, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 227 é Asp, Leu, Glu, Tie, Vai ou deletado; o aminoácido na posição 228 é Thr, Ser ou deletado; o aminoácido na posição 229 é Tyr ou deletado; o aminoácido na posição 230 é Leu, Tie, Vai ou deletado; o aminoácido na posição 231 é Gly, Ala ou deletado; o aminoácido na posição 232 é Tie, Leu, Vai ou deletado; o aminoácido na posição 233 é Pro ou deletado; o aminoácido na posição 234 é Ala, Pro, Gly ou deletado; o aminoácido na posição 235 é Asp, Tie, Leu, Glu ou Vai; o aminoácido na posição 236 é Vai, Ser, Tie, Leu, Thr, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 237 é Ala, Phe ou Tyr; o aminoácido na posição 238 é Ala, Gly, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 239 é Vai, Ser, Tie, Leu, Thr, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 240 é Leu, Vai ou Tie; o aminoácido na posição 243 é Asp ou Glu; o aminoácido na posição 249 é Asn, Gin, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 252 é Leu, Tie, Vai ou Met; o aminoácido na posição 257 é Thr ou Ser; o aminoácido na posição 259 é His, Tie, Vai ou Leu; o aminoácido na posição 266 é Ala, Tie, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 267 é Cys, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 268 é His, Arg, Lys ou Tyr; o aminoácido na posição 272 é Asp ou Glu; o aminoácido na posição 273 é Vai, Met, Tie ou Leu; o aminoácido na posição 274 é Vai, Tie, Leu ou Met; o aminoácido na posição 278 é Gly ou Ala; o aminoácido na posição 279 é Glu, Asp, Gly ou Vai; o aminoácido na posição 281 é Leu, Tie, Vai, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 282 é Asn, Leu ou Tie; o aminoácido na posição 285 é Asn, Gin, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 286 é Lys, Asp, Arg ou Glu; o aminoácido na posição 287 é Leu, Tie ou Vai; o aminoácido na posição 290 é Pro, Gin, Asn, Lys ou Arg; o
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47/525 aminoácido na posição 291 é Leu, Ile ou Vai; o aminoácido na posição 292 é Lys, Arg, Ile, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 293 é Glu, Asp, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 294 é Ser, Asn, Thr, Gin, Arg ou Lys; o aminoácido na posição 295 é Thr ou Ser;inoácido na posição 304 é Lys, Arg, Gin ou Asn; o aminoácido na o aminoácido na posição 296 é Gin, Asn ou His; o aminoácido na posição 297 é Leu, lie, Vai ou Met; o aminoácido na posição 300 é Ser ou Thr; o aminoácido na posição 301 é Glu, Asp, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 302 é Ser, Pro, Thr, Gly ou Ala; o am posição 313 é Vai, Leu ou Ile; o aminoácido na posição 314 é His, Glu, Asn, Asp ou Gin; o aminoácido na posição 315 é Ala, Cys, Gly, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 316 é Ala, Ile, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 317 é Met, Leu, Vai ou Ile; o aminoácido na posição 319 é Met, Leu, Vai ou Ile; o aminoácido na posição 320 é Vai, Ile, Leu, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 321 é Arg, Lys ou Pro; o aminoácido na posição 322 é Ile, Leu, Vai ou Phe; o aminoácido na posição 323 é Gly, Ile, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 324 é Leu, Ile, Vai, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 336 é Ser, Thr, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 339 é Asn, Lys, Gin ou Arg; o aminoácido na posição 350 é Arg, Lys, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 351 é Glu ou Asp; o aminoácido na posição 353 é Lys ou Arg; o aminoácido na posição 354 é Gin, Asn, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 355 é Phe, Ile, Leu ou Leu; o aminoácido na posição 356 é Lys ou Arg; o aminoácido na posição 360 é Ile, Vai, Leu, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 363 é Gin, Ala, Cys, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Asn, Arg, Ser, Thr, Vai ou Trp; o aminoácido na posição 364 é Ile, Ala, Cys, Glu, Phe, His, Lys, Leu, Met, Asn, Gin, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na
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48/525 posição 365 é Leu, Ala, Glu, Phe, Gly, His, lie, Lys, Met, Asn,
Arg, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 366 é Gly, Ala,
Cys, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Ser, Thr ou Vai; o
aminoácido na posição 367 é Ser, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly,
His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Thr, Vai ou Trp; o
aminoácido na posição 368 é Tyr, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly,
His, lie, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai ou Trp; o aminoácido na posição 369 é Leu, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, lie, Met, Thr ou Vai; o aminoácido na posição 370 é Leu, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Tie, Lys, Met, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 371 é Gin, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Asn, Arg, Ser, Thr, Vai ou Trp; o aminoácido na posição 372 é Gin, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Arg, Ser, Vai ou Tyr; o aminoácido na posição 373 é Asn, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Gin, Ser, Thr, Vai ou Trp; o aminoácido na posição 374 é Arg ou Lys; o aminoácido na posição 376 é Phe, Ile, Vai ou Leu; o aminoácido na posição 378 é Glu ou Asp; o aminoácido na posição 381 é Leu, Ile ou Vai; o aminoácido na posição 388 é Ala, Thr, Gly ou Ser; o aminoácido na posição 395 é Arg ou Lys; o aminoácido na posição 396 é Glu, Gin, Asp, Asn, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 399 é Asp, Gin, Glu ou Asn; o aminoácido na posição 400 é Asn, Thr, Ser, Glu, Gin ou Asp; o aminoácido na posição 401 é Thr, Ser, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 402 é Phe, Ile, Vai ou Leu; o aminoácido na posição 406 é Asp ou Glu; o aminoácido na posição 408 é Leu, lie, Vai ou Met; o aminoácido na posição 410 é Gly, Ile, Vai, Ala ou Leu; o aminoácido na posição 414 é Ala, Gly, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 416 é Ser, Asn, Thr, Gin, Glu ou Asp; o aminoácido na posição 417 é Ser, Arg, Lys,
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Thr, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 423 é Lys, Arg, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 431 é Arg ou Lys; o aminoácido na posição 432 é Gin, Asn, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 436 é Arg, Lys, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 440 é Asn, Gin, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 442 é Leu, lie ou Vai; o aminoácido na posição 447 é Ser, Lys, Thr ou Arg; o aminoácido na posição 448 é Ala, Gly, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 451 é Gin, Asn ou Met; o aminoácido na posição 453 é Gly ou Ala; o aminoácido na posição 455 é Ala, Leu, lie ou Vai; o aminoácido na posição 457 é Leu, lie ou Vai; o aminoácido na posição 467 é Vai, lie, Leu, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 471 é Gly ou Ala; o aminoácido na posição 475 é Ser, Thr, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 483 é Gly ou Ala; o aminoácido na posição 493 é Gin, Asn ou Gly; o aminoácido na posição 504 é Vai, Leu ou lie; o aminoácido na posição 506 é Asp, Glu ou His; o aminoácido na posição 509 é Asp, Glu, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 510 é Ser, Thr, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 512 é Glu ou Asp; o aminoácido na posição 515 é Gly, Ala, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 516 é Gin, Asn ou His; o aminoácido na posição 517 é lie, Vai ou Leu; o aminoácido na posição 519 é Asp, Asn, Glu, Gly ou Gin; o aminoácido na posição 522 é Vai, Glu, Pro, lie, Leu ou Asp; o aminoácido na posição 525 é Glu ou Asp; o aminoácido na posição 526 é Leu, lie, Vai ou Met; o aminoácido na posição 539 é Vai, Leu ou lie; o aminoácido na posição 555 é Vai, Leu, lie ou Ala; o aminoácido na posição 556 é Trp, Phe, Thr ou Tyr; o aminoácido na posição 557 é Arg, Cys, Asp, Gly, His, lie, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 558 é Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His, lie, Lys, Leu, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Vai, Trp ou
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Tyr; o aminoácido na posição 559 é Lys, Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai ou Tyr; o aminoácido na posição 560 é Cys, Ala, Phe, Gly, Tie, Met, Asn, Arg, Ser, Thr ou Vai; o aminoácido na posição 561 é Lys, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Tie, Leu, Met, Asn, Arg, Ser, Thr, Vai ou Tyr; o aminoácido na posição 562 é Asn, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Leu, Met, Arg, Ser, Thr, Vai ou Tyr; o aminoácido na posição 563 é Vai, Ala, Cys, Asp, Phe, His, lie, Leu, Met, Asn, Gin, Thr ou Trp; o aminoácido na posição 564 é Ala, Cys, Gly, Met, Gin, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 571 é Ser, Thr ou Cys; o aminoácido na posição 575 é Vai, Leu, Ile, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 577 é Met, Leu, Vai ou Ile; o aminoácido na posição 579 é Glu, Asp, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 583 é Asp ou Glu; o aminoácido na posição 589 é Met, lie, Vai ou Leu; o aminoácido na posição 590 é Met, lie, Vai ou Leu; o aminoácido na posição 593 é Met, Leu, Vai ou Ile; o aminoácido na posição 595 é Arg, Lys, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 596 é Ser ou Thr; o aminoácido na posição 597 é Gin, Asn ou His; o aminoácido na posição 607 é Ala, Gly, Ile, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 608 é Asp, Glu, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 612 é Tyr, His ou Phe; o aminoácido na posição 617 é Thr, Ser, Leu, Vai ou Ile; o aminoácido na posição 618 é Gin, Asn ou His; o aminoácido na posição 625 é Arg, Lys, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 626 é Met, Leu, Vai ou Ile; o aminoácido na posição 628 é Leu, Vai ou Ile; o aminoácido na posição 633 é lie, Leu, Vai ou Met; o aminoácido na posição 634 é Leu, Ile, Vai ou Met; o aminoácido na posição 642 é Arg, Lys ou Met; o aminoácido na posição 646 é Leu, Ala, Cys, Gly, lie, Met, Asn, Gin, Ser, Thr ou Vai; o aminoácido na posição 647 é Leu, Asp,
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Gly, Met, Asn, Gin ou Thr; o aminoácido na posição 648 é Met,
Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Asn, Pro, Gin, Arg,
Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 649 é Pro,
Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Met, Asn, Gin, Arg, Ser,
Thr, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 650 é Thr, Ala, Cys,
Asp, Phe, Gly, His, lie, Lys, Leu, Met, Pro, Gin, Arg, Ser , Vai
ou Tyr; o aminoácido na posição 651 é Glu, Ala, Cys, Asp, Gly,
His, lie, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai ou Tyr; o
aminoácido na posição 652 é Leu, Cys, Phe, lie, Lys, Met, Pro, Arg, Ser, Thr ou Vai; o aminoácido na posição 653 é Thr, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Tie, Lys, Leu, Pro, Arg, Ser, Vai ou Trp; o aminoácido na posição 654 é Thr, Ala, Cys, Phe, lie, Lys, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 655 é Trp, Phe ou Tyr; o aminoácido na posição 658 é Gly, Lys, Ala ou Arg; o aminoácido na posição 663 é Gly ou Ala; o aminoácido na posição 664 é Asp, Glu, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 668 é Ala, Gly, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 669 é Gin, Asn ou His; o aminoácido na posição 671 é Asn, Gin, Thr ou Ser o aminoácido na posição 675 é lie, Vai, lie, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 678 é Met, lie, Ala, Leu, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 682 é Pro, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 683 é Ser, Thr ou Pro; o aminoácido na posição 685 é Asp, Glu, Asp ou Asn; o aminoácido na posição 694 é Asp, Glu, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 697 é Asn, Gin, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 704 é Glu, Asp, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 714 é Ala ou Gly; o aminoácido na posição 721 é Ser, Thr ou Phe; o aminoácido na posição 722 é Ser, Thr, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 724 é Ser ou Thr; o aminoácido na posição 734 é His, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 736 é Vai, Leu,
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52/525 lie ou Ala; o aminoácido na posição 737 é Lys, Arg, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 739 é Ala, Gly, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 740 é Ser, Thr ou Met; o aminoácido na posição 741 é Gly, Ala, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 742 é lie, Leu, Vai, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 743 é Gly ou deletado; o aminoácido na posição 745 é Gly, Ala, Glu ou Asp; o aminoácido na posição 751 é Thr, Ser, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 753 é Gin, Asn, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 754 é Thr ou Ser; o aminoácido na posição 756 é Thr, Ser, Leu, Vai ou lie; o aminoácido na posição 757 é Vai, Leu ou lie; o aminoácido na posição 766 é lie, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 771 é Arg, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, lie, Lys, Leu, Asn, Ser, Thr,
Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 772 é Arg, Ala, Cys,
Asp, Glu, Phe, Gly, His, Tie, Lys, Leu, Met, Pro, Gin, Ser, Thr,
Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 773 é Asp, Ala, Glu,
Phe, Gly, His, Tie, Lys, Leu, Met, Asn, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai,
Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 774 é Gin, Ala, Asp, Gly, His, Tie, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 775 é Vai, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Tie, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr ou Tyr; o aminoácido na posição 776 é Leu, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, lie, Lys, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai ou Tyr; o aminoácido na posição 777 é Pro, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Gin, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 778 é Phe, Ala, His, Tie, Leu, Met, Asn, Gin, Ser, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 779 é Gin, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Leu, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr ou Vai; o aminoácido na posição
780 é Ala, Cys, Asn, Pro, Gin ou Ser; o aminoácido na posição
781 é Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, lie, Asn, Gin, Arg,
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Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 782 é Ala,
Cys, Asp, Glu, Phe, Gly , His, lie, Lys, Met, Pro, Gin, Arg, Ser,
Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 783 é Pro, Ala,
Cys, Asp, Glu, Gly, His, Asn, Gin, Arg, Ser, Thr ou Vai; o aminoácido na posição 784 é Leu, Ala, Glu, Phe, His, lie, Lys, Met, Asn, Pro, Gin, Ser, Thr, Vai ou Trp; o aminoácido na posição 785 é Asn, Ala, Cys, Glu, Phe, Gly, His, lie, Lys, Leu, Met, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 786 é Tyr, Phe, lie, Leu ou Trp; o aminoácido na posição 787 é His, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 788 é Tyr ou Met; o aminoácido na posição 789 é Ala, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 790 é Tyr ou Thr; o aminoácido na posição 791 é Arg, Lys, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 792 é Leu, lie, Vai, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 796 é Asp ou Glu; o aminoácido na posição 797 é Ser, Thr ou Ala o aminoácido na posição 802 é Glu, Lys, Asp, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 806 é Gin, Asp, Glu, Asn ou His; o aminoácido na posição 810 é Lys, Arg ou Thr; o aminoácido na posição 819 é Arg, Lys ou His; o aminoácido na posição 829 é Lys, Ser, Ala ou Pro; o aminoácido na posição 832 é Ala, Lys, Arg, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 833 é Gly, Ala, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 842 é Leu, lie, Vai ou Pro; o aminoácido na posição 847 é Gin, Asn, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 848 é lie, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 849 é Vai, Leu, lie, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 855 é Thr, Ser ou Met; o aminoácido na posição 860 é lie, Leu ou Vai; e o aminoácido na posição 864 é His, Asn ou Gin.
[0043] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo PtIP-83 é derivada de uma espécie de samambaia da Divisão Pterídophyta. A filogenia de
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54/525 samambaias, como usado no presente documento, é baseada na classificação para samambaias existentes por A. R. Smith et al, TAXON, 55:705-731 (2006). A filogenia de consenso baseada na classificação de A. R. Smith é mostrada na Figura 1. Outras classificações filogênicas de samambaias existentes são conhecidas do perito na técnica. Informação adiiconal sobre a filogenia de samambaias pode ser encontrada em mobot.org/MOBOT/research/APweb/ (que pode ser acessado usando o prefixo www) e Schuettpelz E. e Pryer K. Μ., TAX0N 56: 10371050 (2007) com base em três genes plastidicos. Samambaias adicionais e outras espécies de plantas primitivas podem ser encontradas em homepages . caverock.net.nz/~bj/fern/list.htm (que pode ser acessado usando o prefixo usando http://).
[0044] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptideo PtIP-83 é derivada de uma espécie de samambaia da Classe Psilotopsida. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptideo PtIP-83 é derivada de uma espécie de samambaia da Classe Psilotopsida, Ordem Psilotales. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptideo PtIP83 é derivada de uma espécie de samambaia da Classe Psilotopsida , Ordem Ophioglossales. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptideo PtIP-83 é derivada de uma espécie de samambaia da Classe Psilotopsida, Ordem Ophioglossales, Família Psilotaceae. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptideo PtIP-83 é derivada de uma espécie de samambaia da Classe Psilotopsida , Ordem Ophioglossales Família Ophioglossaceae. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica o
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55/525 polipeptídeo PtIP-83 é derivada de uma espécie de samambaia do
Gênero Ophioglossum L., Botrychíum, Botrypus, Helminthostachys, Ophioderma, Cheiroglossa, Sceptrídíum ou Mankyua.
[0045] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico gue codifica o polipeptídeo PtIP-83 é derivada de uma espécie da Classe Polypodíopsída/Pterídopsída. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico gue codifica o polipeptídeo PtIP-83 é derivada de uma espécie de samambaia da Ordem Osmundales (samambaias reais); Família Osmundaceae. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico gue codifica o polipeptídeo PtIP-83 é derivada de uma espécie de samambaia da Ordem Hymenophyllales; Família Hymenophyllaceae. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico gue codifica o polipeptídeo PtIP-83 é derivada de uma espécie de samambaia da Ordem Gleícheníales; Família Gleicheniaceae , Família Dipteridaceae ou Família Matoniaceae. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico gue codifica o polipeptídeo PtIP-83 é derivada de uma espécie de samambaia da Ordem Schizaeales; Família Lygodíaceaer Família Anemiaceae ou Família Schízaeaceae. Em algumas modalidades, o ácido nucleico gue codifica o polipeptídeo PtIP-83 é derivado de uma espécie de samambaia da Ordem Schizaeales; Família Schízaeaceae, Gênero Lygodium selecionada a partir de, mas sem limitação Lygodium articulatum, Lygodium circinatum, Lygodium conforme, Lygodium cubense, Lygodium digitatum, Lygodium flexuosum, Lygodium heterodoxum, Lygodium japonicum, Lygodium kerstenii, Lygodium lanceoiatum, Lygodium iongifolium, Lygodium merrilii, Lygodium mi cans, Lygodium microphyllum, Lygodium microstachyum, Lygodium oligostachyum, Lygodium palmatum, Lygodium polystachyum,
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Lygodium radiatum, Lygodium reticulatum, Lygodium salicifolium, Lygodium scandens, Lygodium smithianum, Lygodium subareolatum, Lygodium trifurcatum, Lygodium venustum, Lygodium versteeghii, Lygodium volubile, e Lygodium yunnanen.se. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica ο polipeptídeo PtIP-83 é derivada de uma espécie de samambaia da Ordem Salviniales; Família Marsileaceae ou Família Salviniaceae. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo PtIP-83 é derivada de uma espécie de samambaia da Ordem Cyatheales; Família Thyrsopteridaceae , Família Loxsomataceae, Família Culcitaceaer Família Plagiogyriaceaer Família Cibotiaceaer Família Cyatheaceae, Família Dicksoniaceae ou Família Metaxyaceae.
[0046] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo PtIP-83 é derivada de uma espécie de samambaia da Ordem Polypodiales; Família Lindsaeaceae, Família Saccolomataceaer Família Cystodiaceaer Família Dennstaedtiaceae, Família Pteridaceae, Família Aspleniaceae, Família Thelypteridaceae, Família Woodsiaceae , Família Onocleaceae, Família Blechnaceaer Família Dryopteridaceaer Família Lomariopsidaceae, Família Tectariaceae, Família Oleandraceae , Família Davalliaceae ou Família Polypodiaceae.
[0047] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo PtIP-83 é derivada de uma espécie de samambaia da Ordem Polypodiales, Família Pteridaceae, Gênero Adiantaceae selecionada a partir de, mas sem limitação Adiantum aethiopicum, Adiantum aleuticum, Adiantum bonatianum, Adiantum cajennense, Adiantum capillus-j unonis, Adiantum
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57/525 capillus-junonis, Adiantum caudatum, Adiantum chienii, Adiantum chilense, Adiantum cuneatum, Adiantum cunninghamii, Adiantum
da vidii, Adiantum diaphanum, Adiantum edentulum, Adiantum
edgeworthii, Adiantum excisum, Adiantum fengianum, Adiantum fimbriatum, Adiantum flabellulatum, Adiantum formosanum,
Adiantum formosanum, Adiantum fulvum, Adiantum gravesii,
Adiantum hispidulum, Adiantum induratum, Adiantum jordanii,
Adiantum juxtapositum, Adiantum lati folium, Adiantum leveillei,
Adiantum lianxianense, Adiantum malesianum, Adiantum mariesii,
Adiantum monochlamys, Adiantum myriosorum, Adiantum obliquum,
Adiantum ogasawarense, Adiantum pedatum, Adiantum pentadactylon,
Adiantum peruvianum, Adiantum philippense, Adiantum princeps,
Adiantum pubescens, Adiantum raddianum, Adiantum reniforme,
Adiantum roborowskii, Adiantum serratodentatum, Adiantum
sinicum, Adiantum soboliferum, Adiantum subcordatum, Adiantum
tenerum, Adiantum terminatum, Adiantum tetraphyllum, Adiantum
trapeziforme, Adiantum venustum, Adiantum viridescens, e
Adiantum viridimontanum.
[0048] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo PtIP-83 é derivada de uma espécie de samambaia da Ordem Polypodiales, Família Aspleniaceae, Gênero Asplenium.
[0049] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo PtIP-83 é derivada de uma espécie de samambaia da Ordem Polypodiales, Família Aspleniaceae, Gênero AspleniumI selecionada a partir de, mas sem limitação Asplenium adiantum, Asplenium adulterinum, Asplenium aequibasis, Asplenium aethiopicum, Asplenium africanum, Asplenium * alternifolium, Asplenium angustum , Asplenium
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58/525 antiquum, Asplenium ascensionis, Asplenium attenuatum, Aspienium aureum, Asplenium auritum, Asplenium australasicum, Asplenium azoricum, Asplenium bifrons, Asplenium billottii, Asplenium bipinnatifidum, Asplenium brachycarpum, Asplenium bradleyi, Asplenium bulbiferum, Asplenium caudatum, Asplenium ceterach, Asplenium compressum, Asplenium congestum, Asplenium corderoanum, Asplenium crinicaule, Asplenium cristatum,
Asplenium cunei folium , Asplenium cymbifolium, Asplenium daghestanicum, Asplenium dalhousiae , Asplenium dareoides,
Asplenium daucifolium, Asplenium difforme , Asplenium fissum,
Asplenium dimorphum, Asplenium divaricatum, Asplenium dregeanum,
Asplenium * ebenoides, Asplenium ecuadorense, Asplenium feel Kunze, Asplenium fissum, Asplenium flabellifolium, Asplenium flaccidum, Asplenium fontanum, Asplenium forisiense, Asplenium formosum, Asplenium gemmiferum, Asplenium * germanicum, Asplenium gueinzii, Asplenium goudeyi, Asplenium hemionitis, Asplenium hermannii-christii, Asplenium hookerianum, Asplenium hybridum, Asplenium incisum, Asplenium * j acksonii, Asplenium * kenzoi, Asplenium laciniatum, Asplenium lamprophyllum, Asplenium laserpitiifolium, Asplenium lepidum, Asplenium listeri, Asplenium longissimum, Asplenium lucidum, Asplenium lunulatum, Asplenium lyallii, Asplenium macedonicum, Asplenium majoricum, Asplenium marinum, Asplenium * microdon, Asplenium milnei, Asplenium montanum, Asplenium musifolium, Asplenium nidus, Asplenium normale, Asplenium obliquum, Asplenium oblongifolium, Asplenium obovatum, Asplenium obtusatum, Asplenium oligolepidum, Asplenium oligolepidum, Asplenium onopteris, Asplenium pacificum, Asplenium paleaceum, Asplenium palmeri, Asplenium petrarchae, Asplenium pinnatifidum, Asplenium planicaule,
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Asplenium platybasis, Asplenium platybasis, Asplenium polyodon, Asplenium praemorsum, Asplenium prolongatum, Asplenium pteridoides, Asplenium resiliens, Asplenium rhizophyllum, Asplenium richardii, Asplenium ruprechtii, Asplenium rutamuraria, Asplenium rust!folium, Asplenium sagittatum, Asplenium sandersonii, Asplenium * sarniense, Asplenium schizotrichum, Asplenium schweinfurthii, Asplenium scleroprium, Asplenium scolopendrium /sin. Phyllitis scolopendrium) , Asplenium seelosii, Asplenium septentrionale, Asplenium septentrionale, Asplenium serra, Asplenium serratum, Asplenium sessilifolium, Asplenium shuttleworthianum, Asplenium simplicifrons, Asplenium splendens, Asplenium surrogatum, Asplenium tenerum, Asplenium terrestre, Asplenium theciferum, Asplenium thunbergii, Asplenium trichomanes, Asplenium tutwilerae, Asplenium vespertinum, Asplenium vieillardii, Asplenium virens, Asplenium viride, Asplenium vittiforme, e Asplenium viviparum.
[0050] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptideo PtIP-83 é derivada de uma espécie de samambaia da Ordem Polypodiales, Família Blechnaceae, Gênero Blecnum.
[0051] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptideo PtIP-83 é derivada de uma espécie de samambaia da Ordem Polypodiales, Família Dryopteridaceae Gênero Acrophorus, Gênero Acrorumohra, Gênero Anapausia, Gênero Arachniodes, Gênero Bolbitis, Gênero Ctenitis, Gênero Cyclodium, Gênero Cyrtogonellum, Gênero Cyrtomidictyum, Gênero Cyrtomium, Gênero Diacalper Gênero Didymochlaenar Gênero Dryopsis , Gênero Dryopteris, Gênero Elaphoglossum, Gênero Hypodematium, Gênero Lastreopsis, Gênero Leptorumohra, Gênero
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Leucostegia, Gênero Lithostegia, Gênero Lomagramma, Gênero Maxonia, Gênero Megalastrum, Gênero Olfersia, Gênero Peranema, Gênero Phanerophlebia, Gênero Phanerophlebiopsis, Gênero Polybotrya, Gênero Polystichopsis, Gênero Polystichum, Gênero Rumohra, Gênero Sorolepidium, Gênero Stigmatopteris ou Gênero Teratophyl1 um.
[0052] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo PtIP-83 é derivada de uma espécie de samambaia da Ordem Polypodiales, Família Dryopteridaceae, Gênero Polystichum. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo PtIP-83 é derivada de uma espécie de samambaia da Ordem Polypodiales, Família Dryopteridaceae , Gênero Polystichum selecionada a partir de, mas sem limitação Polystichum acanthophyllum, Polystichum acrostichoides, Polystichum aculeatum, Polystichum aculeatum, Polystichum aculeatum, Polystichum alcicorne, Polystichum aleuticum, Polystichum andersonii, Polystichum atkinsonii, Polystichum australiense , Polystichum bakerianum, Polystichum biaristatum, Polystichum bomiense, Polystichum bonseyi,
Polystichum brachypterum, Polystichum brachypterum, Polystichum brachypterum , Polystichum calderonense, Polystichum calderonense, Polystichum capillipes, Polystichum castaneum, Polystichum chilense, Polystichum christii Ching, Polystichum chunii Ching, Polystichum craspedosorum, Polystichum cyclolobum, Polystichum cystostegia, Polystichum deltodon, Polystichum dielsii, Polystichum discretum, Polystichum drepanum, Polystichum dudleyi, Polystichum duthiei, Polystichum echinatum, Polystichum erosum, Polystichum excellens, Polystichum eximium, Polystichum falcatipinnum, Polystichum falcatipinnum,
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Polystichum gongboense, falcatipinnum, Polystichum formosanum, Polystichum
Polystichum grandifrons, Polystichum gymnocarpium,
Polystichum haleakalense, Polystichum hancockii,
Polystichum hecatopteron, Polystichum herbaceum, Polystichum imbricans,
Polystichum incongruum, Polystichum kruckebergii,
Polystichum kwakiutlii,
Polystichum lachenense, Polystichum lanceolatum,
Polystichum lemmonii, Polystichum lentum, Polystichum lonchitis,
Polystichum lonchitis, Polystichum lonchitis, Polystichum lonchi tis,
Polystichum luctuosum, Polystichum macleae
Polystich um macleae, Polystichum makinoi, Polystichum martini,
Polystich um mayebarae, Polystichum mediocre,
Polystich um mediocre, Polystichum microchlamys,
Polystich um mohrioides,
Polystichum mollissimum, Polystichum monticola,
Polystichum moorei, Polystichum morii, Polystichum moupinense,
Polystichum muricatum,
Polystichum nakenense,
Polystichum neolobatum,
Polystichum nepalense,
Polystichum ningshenense,
Polystichum obliquum,
Polystichum omeiense,
Polystich um ordinatum,
Polystichum orientalitibeticum,
Polystichum paramoupinense,
Polystichum paramoupinense,
Polystichum piceopaleaceum,
Polystichum polyblepharum,
Polystichum prescottianum,
Polystichum prionolepis, Polystichum proliferum,
Polystichum pseudocastaneum, Polystichum pseudocastaneum,
Polystichum punctiferum,
Polystichum punctiferum, Polystichum qamdoense,
Polystichum retrosopaleaceum, Polystichum rhombiforme, Polystichum rhombiforme, Polystichum richardii, Polystichum rigens, Polystichum rotundilobum, Polystichum scopulinum, Polystichum semi fertile, Polystichum set!ferum, Polystichum set! f erum, Polystichum shensiense, Polystichum silvaticum, Polystichum simplicipinnum, Polystichum sinense, Polystichum
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62/525 squarrosum, Polystichum stenophyllum, Polystichum stimulans, Polystichum submite, Polystichum tacticopterum, Polystichum thomsoni, Polystichum tibeticum, Polystichum transvaalense, Polystichum tripteron, Polystichum tsus-simense, Polystichum vestitum, Polystichum wattii, Polystichum whiteleggei, Polystichum xiphophyllum, Polystichum yadongense, e Polystichum yunnanense.
[0053] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo PtIP-83 é derivada de uma espécie de samambaia da Ordem Polypodiales, Família Dryopteridaceae, Gênero Rumohra. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo PtIP-83 é derivada de uma espécie de samambaia da Ordem Polypodiales, Família Dryopteridaceae, Gênero Rumohra selecionada a partir de, mas sem limitação Rumohra adiantiformis, Rumohra aristata, Rumohra bartonae, Rumohra berteroana, Rumohra capuronii, Rumohra glandulosa, Rumohra humbertii, Rumohra linearisquamosa, Rumohra lokohensis, Rumohra madagascarica, e Rumohra quadrangularis.
[0054] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo PtIP-83 é derivada de uma espécie de samambaia da Ordem Polypodiales, Família Polypodiaceae Gênero Campyloneurum, Gênero Drynaria, Gênero Lepisorus, Gênero Microgramma, Gênero Microsorum, Gênero Neurodium, Gênero Niphidium, Gênero Pecluma M.G., Gênero Phlebodium, Gênero Phymatosorus, Gênero Platycerium, Gênero Pleopeltis, Gênero Polypodium.
[0055] Em algumas modalidades, o polipeptídeo PtIP-83 é derivado de uma espécie de samambaia da Ordem Polypodiales, Família Polypodiaceae, Gênero Microsorum.
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63/525 [0056] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo PtIP-83 é derivada de uma espécie de samambaia da Ordem Polypodiales, Família Polypodíaceae, Gênero Mícrosorum. selecionada a partir de, mas sem limitação Mícrosorum alatum, Mícrosorum angustífolium, Mícrosorum aurantiacum, Mícrosorum australiense, Mícrosorum baithoense, Mícrosorum basicordatum, Mícrosorum biseriatum, Mícrosorum brassii, Mícrosorum buergerianum, Mícrosorum chapaense, Mícrosorum cinctum, Mícrosorum commutatum, Mícrosorum congregate folium, Mícrosorum cuneatum, Mícrosorum cuspidatum, Mícrosorum dengii, Mícrosorum egregium, Mícrosorum emeiensis, Mícrosorum ensatum, Mícrosorum ensiforme, Mícrosorum excelsum, Mícrosorum fortunei, Mícrosorum griseorhizoma, Mícrosorum grossum, Mícrosorum hemionitideum, Mícrosorum henryi, Mícrosorum heterocarpum, Mícrosorum heterocarpum, Mícrosorum howense, Mícrosorum insigne, Mícrosorum intermedium, Mícrosorum kongtingense, Mícrosorum krayanense, Mícrosorum lanceolatum, Mícrosorum lanceolatum, Mícrosorum lastii, Mícrosorum latilobatum, Mícrosorum leandrianum, Mícrosorum lineare, Mícrosorum linguiforme, Mícrosorum longíssímum, Mícrosorum longíssímum, Mícrosorum maculosum, Mícrosorum maximum, Mícrosorum membranaceum, Mícrosorum membranaceum, Mícrosorum microsorioides, Mícrosorum minor, Mícrosorum monstrosum, Mícrosorum mulíense, Mícrosorum mutense, Mícrosorum nanchuanense, Mícrosorum níngpoense, Mícrosorum normals, Mícrosorum novae-zealandíae, Mícrosorum ovalífolium, Mícrosorum ovatum, Mícrosorum palmatopedatum, Mícrosorum pappeí, Mícrosorum papuanum, Mícrosorum parksíí, Mícrosorum pentaphyllum, Mícrosorum pílíferum, Mícrosorum pítcaírnense, Mícrosorum
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64/525 powellii, Microsorum pteropodum, Microsorum pteropodum, Microsorum punctatum, Microsorum pustulatum, Microsorum rampans, Microsorum revolution, Microsorum rubidum, Microsorum samarense, Microsorum sapaense, Microsorum sarawakense, Microsorum scandens, Microsorum scolopendria, Microsorum sibomense, Microsorum sinense, Microsorum sopuense, Microsorum espectro, Microsorum steerei, Microsorum subhemionitideum, Microsorum submarginale, Microsorum subnudum, Microsorum superficiale, Microsorum takhtajanil, Microsorum tenuipes, Microsorum tibeticum, Microsorum triglossum, Microsorum truncatum, Microsorum tsaii, Microsorum variants, Microsorum venosum, Microsorum vieillardii, Microsorum x inaequibasis, Microsorum yiliangensis, e Microsorum zippelii.
[0057] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptideo PtIP-83 é derivada de uma espécie de samambaia da Ordem Polypodiales, Familia Polypodiaceae, Gênero Polypodium L. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptideo PtIP-83 é derivada de uma espécie de samambaia da Ordem Polypodiales, Familia Polypodiaceae, Gênero Polypodium L. selecionada a partir de, mas sem limitação Polypodium absidatum, Polypodium acutifolium, Polypodium adiantiforme, Polypodium aequale, Polypodium affine, Polypodium albidopaleatum, Polypodium alcicorne, Polypodium alfarii, Polypodium alfredii, Polypodium alfredii var. curtii, Polypodium allosuroides, Polypodium alsophilicola, Polypodium amamianum, Polypodium amoenum, Polypodium amorphum, Polypodium anetioides, Polypodium anfractuosum, Polypodium anguinum, Polypodium angustifolium f. remotifolia, Polypodium angustifolium var. amphostenon,
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65/525
Polypodium angustifolium heterolepis
Polypodi um angustifolium monstrosa, Polypodium angustipaleatum
Polypodium angustissimum, Polypodium anisomeron var. pectinatum
Polypodi um antioquianum, Polypodium aoristisorum
Polypodi um apagolepis
Polypodium apicidens, Polypodium apiculatum
Polypodi um apoense, Polypodium appalachianum
Polypodi um approssum
Polypodium arenarium, Polypodium argentinum
Polypodi um argutum, Polypodium armatum, Polypodium aromaticum
Polypodi um aspersum, Polypodium assurgens, Polypodium atrum
Polypodi um auriculatum, Polypodium balaonense
Polypodi um balliviani
Polypodium bamleri, Polypodium bangii
Polypodi um bartlettii
Polypodium basale, Polypodium bernoullii
Polypodium biauritum
Polypodium bifrons
Polypodium blepharodes
Polypodi um bolivari
Polypodium bolivianum
Polypodi um bolobense
Polypodium bombycinum, Polypodium bombycinum insularum
Polypodium bradeorum, Polypodium bryophilum
Polypodi um bryopodum, Polypodium buchtienii, Polypodium buesii
Polypodi um bulbotrichum, Polypodium caceresii, Polypodium californicum brauscombii, Polypodium californicum parsonsiae, Polypodium californicum, Polypodium calophlebium
Polypodium calvum, Polypodium camptophyllarium var. abbreviatum
Polypodium capitellatum, Polypodium carpinterae, Polypodium chachapoyense, Polypodium chartaceum, Polypodium chimantense
Polypodium chiricanum, Polypodium choquetangense, Polypodium christensenii, Polypodium christii
Polypodium chrysotrichum
Polypodi um ciliolepis
Polypodi um
Polypodi um
Polypodi um colysoides
Polypodi um confluens
Polypodi um conforme
Polypodi um confusum
Polypodi um congregatifolium, Polypodium connellii, Polypodium consimile
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66/525 var. bourgaeanum, Polypodium consimile var. minor, Polypodium conterminans, Polypodium contiguum, Polypodium cookii, Polypodium coriaceum, Polypodium coronans, Polypodium costaricense, Polypodium costatum, Polypodium crass!folium f. angustissimum, Polypodium crass!folium var. longipesr Polypodium crassulum, Polypodium craterisorum, Polypodium cryptum, Polypodium crystalloneuron, Polypodium cucullatum var. planum,
Polypodi um cuencanum
Polypodium cumingianum, Polypodium cupreolepis
Polypodi um curranii, Polypodium curvans, Polypodium cyathicola
Polypodi um cyathisorum, Polypodium cyclocolpon
Polypodi um daguense
Polypodium damunense
Polypodi um dareiformioides, Polypodium dasypleura, Polypodium decipiens
Polypodi um decorum
Polypodi um delicatulum
Polypodium deltoideum
Polypodi um demeraranum
Polypodi um denticulatum
Polypodi um diaphanum
Polypodi um dilatatum
Polypodium dispersum
Polypodi um dissectum
Polypodi um dissimulans
Polypodi um dolichosorum, Polypodium dolorense
Polypodi um donnell-smithii
Polypodium drymoglossoides
Polypodium ebeninum
Polypodium eggersii, Polypodium elmeri
Polypodium elongatum
Polypodium enterosoroides, Polypodium erubescens
Polypodi um erythrolepis, Polypodium erythrotrichum
Polypodi um eurybasis
Polypodi um eurybasis villosum
Polypodi um
Polypodi um falcoideum
Polypodium fallacissimum
Polypodi um farinosum
Polypodi um faucium, Polypodium feei
Polypodi um ferrugineum, Polypodium feuillei
Polypodi um firmul um
Polypodium firmum, Polypodium flaccidum, Polypodium flagellare, Polypodium flexuosum, Polypodium flexuosum var.
ekmanii, Polypodium forbesii, Polypodium formosanum, Polypodium fraxinifolium subsp. articulatum, Polypodium fraxinifolium
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67/525 subsp. luridum, Polypodium fructuosum, Polypodium fucoides
Polypodi um fulvescens, Polypodium galeottii, Polypodium glaucum
Polypodi um glycyrrhiza
Polypodium gracillimum, Polypodium gramineum
Polypodi um grandifolium
Polypodium gratum
Polypodi um graveolens
Polypodium griseo-nigrum, Polypodium griseum
Polypodi um guttatum
Polypodium haalilioanum
Polypodi um hammatisorum, Polypodium hancockii, Polypodium haplophlebicum, Polypodium harrisii, Polypodium hastatum simplex , Polypodium hawaiiense, Polypodium heanophyllum
Polypodium helleri, Polypodium hemionitidium, Polypodium henryi
Polypodium herzogii, Polypodium hesperium, Polypodium hessii
Polypodium hombersleyi, Polypodium hostmannii
Polypodi um humi1e
Polypodium hyalinum, Polypodium iboense
Polypodium induens subdentatum, Polypodium insidiosum
Polypodium insigne
Polypodium intermedium subsp. masafueranum obtuse serra turn
Polypodi um intramarginale
Polypodium involutum, Polypodium itatiayense, Polypodium j avanicum
Polypodium j uglandifolium, Polypodium kaniense
Polypodi um knowltoniorum, Polypodium kyimbilense, Polypodium 1 ’ herminieri costaricense, Polypodium lachniferum incurvata
Polypodium lachniferum var. glabrescens
Polypodi um lachnopus
Polypodium lanceolatum var. complanatum trichophorum, Polypodium latevagans
Polypodium lanceolatum
Polypodium laxifrons
Polypodium laxifrons var. lividum, Polypodium lehmannianum, Polypodium leiorhizum, Polypodium leptopodon, Polypodium leuconeuron var. angustifolia, Polypodium leuconeuron var. latifolium, Polypodium leucosticta, Polypodium limulum,
Polypodium lindigii, Polypodium lineatum, Polypodium lomarioides, Polypodium longifrons, Polypodium loretense,
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68/525
Polypodium loriceum var. umbraticum, Polypodium loriforme , Polypodium loxogramme f. gigas, Polypodium ludens, Polypodium luzonicum, Polypodium lycopodioides f. obtusum, Polypodium lycopodioides L. , Polypodium macrolepis, Polypodium macrophyllum, Polypodium macrosorum, Polypodium macrosphaerum,
Polypodium maculosum, Polypodium madrense, Polypodium manmeiense, Polypodium margaritiferum, Polypodium maritimum, Polypodium martensii, Polypodium mayor!s, Polypodium megalolepis,
Polypodium melanotrichum,
Polypodium menisciifolium var. pubescens, Polypodium meniscioides,
Polypodium merrillii, Polypodium mettenii, Polypodium mexiae,
Polypodium microsorum, Polypodium militare, Polypodium minimum,
Polypodium minusculum, Polypodium mixtum, Polypodium mollendense, Polypodium mollissimum, Polypodium moniliforme var.
minus, Polypodium monoides, Polypodium monticola, Polypodium montigenum, Polypodium moritzianum, Polypodium moultonii,
Polypodium multicaudatum, Polypodium multilineatum, Polypodium multisorum, Polypodium munchii, Polypodium muscoides, Polypodium myriolepis, Polypodium myr iophy Hum, Polypodium myriotrichum,
Polypodi um nematorhizon, Polypodium nemorale
Polypodi um nesioticum, Polypodium nigrescentium,
Polypodium nigripes,
Polypodi um nigrocinctum, Polypodium nimbatum
Polypodium nitidissimum, nubrigenum,
Polypodi um
Polypodi um
Polypodi um oligosorum, ni tidissimum oligolepis ,
Polypodi um var. latior,
Polypodi um olivaceum,
Polypodi um oligosorum,
Polypodi um olivaceum var. elatum, Polypodium oodes, Polypodium oosphaerum,
Polypodium oreophilum, Polypodium ornatissimum, Polypodium ornatum, Polypodium ovatum, Polypodium oxylobum, Polypodium oxypholis, Polypodium pakkaense, Polypodium pallidum
Polypodium
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69/525 palmatopedatum, Polypodium palmeri, Polypodium panamense, Polypodium parvum, Polypodium patagonicum, Polypodium paucisorum, Polypodium pavonianum, Polypodium pectinatum var. caliense, Polypodium pectinatum var. hispidum, Polypodium pellucidum, Polypodium pendulum var. boliviense , Polypodium percrassum, Polypodium perpusillum, Polypodium peruvianum var. subgibbosum, Polypodium phyllitidis var. elongatum, Polypodium pichinchense, Polypodium pilosissimum, Polypodium pilosissimum var. glabriusculum, Polypodium pilossimum var. tunguraquensis, Polypodium pityrolepis, Polypodium platyphyllum, Polypodium playfairii, Polypodium plebeium var. cooper!, Polypodium plectolepidioides , Polypodium pleolepis, Polypodium plesiosorum var.i, Polypodium podobasis, Polypodium podocarpum, Polypodium poloense, Polypodium polydatylon, Polypodium polypodioides var.
aciculare, Polypodium polypodioides var. michauxianum, Polypodium praetermissum, Polypodium preslianum var. immersum, Polypodium procerum, Polypodium procerum, Polypodium productum, Polypodium productum, Polypodium prolongilobum, Polypodium propinguum, Polypodium proteus, Polypodium pruinatum, Polypodium pseudocapillare, Polypodium pseudofraternum, Polypodium pseudonutans, Polypodium pseudoserratum, Polypodium pulcherrimum, Polypodium pulogense, Polypodium pungens,
Polypodium purpusii, Polypodium radicals, Polypodium randallii, Polypodium ratiborii, Polypodium reclinatum, Polypodium recreense, Polypodium repens var. abruptum, Polypodium revolvens, Polypodium rhachipterygium, Polypodium rhomboideum,
Polypodium rigens, Polypodium robustum, Polypodium roraimense,
Polypodium roraimense, Polypodium rosei, Polypodium rosenstockii, Polypodium rubidum, Polypodium rudimentum,
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70/525
Polypodium rusbyi
Polypodi um sablanianum
Polypodiurn sarmentosum, Polypodium saxicola
Polypodi urn schenckii
Polypodium schlechteri
Polypodi urn scolopendria
Polypodiurn scolopendria, Polypodium scolopendrium, Polypodium scouleri
Polypodium scutulatum
Polypodium segregatum
Polypodiurn semihirsutum, Polypodium semihirsutum fuscosetosum
Polypodium senile minor, Polypodium sericeolanatum
Polypodium serraeforme
Polypodium serricula, Polypodium sesquipedala, Polypodium sessilifolium, Polypodium setosum var.
calvum, Polypodium setulosum
Polypodium shaferi
Polypodiurn sibomense, Polypodium siccum
Polypodium simacense
Polypodium simulans, Polypodium singeri
Polypodium sinicum
Polypodium sintenisii, Polypodium skutchii, Polypodium sloanei sodiroi, Polypodium sordidulum, Polypodium sordidum
Polypodium
Polypodium sphaeropteroides, Polypodium sphenodes, Polypodium sprucei
Polypodium sprucei var. furcativenosa, Polypodium steirolepis,
Polypodium stenobasis, Polypodium stenolepis, Polypodium stenopterum, Polypodium subcapillare, Polypodium subflabelliforme, Polypodium subhemionitidium, Polypodium subinaequale, Polypodium subintegrum, Polypodium subspathulatum, Polypodium subtile, Polypodium subvestitum,
Polypodium subviride, Polypodium superficiale var. attenuatum,
Polypodium super ficiale var.
chinensis,
Polypodium sursumcurrens, Polypodium tablazianum, Polypodium taenifolium,
Polypodium tamandarei, Polypodium tatei, Polypodium tenuiculum var. acrosora, Polypodium tenuiculum var. brasiliense,
Polypodium tenuilore, Polypodium tenuinerve, Polypodium tepuiense, Polypodium teresae, Polypodium tetragonum var. incompletum, Polypodium thysanolepis var. bipinnatifidum,
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71/525
Polypodium thyssanolepis, var. thyssanolepis, Polypodium thyssanolepsi, Polypodium tobagense, Polypodium trichophyllum,
Polypodi um tridactylum, Polypodium tridentatum
Polypodi um trifurcatum brevipes, Polypodium triglossum
Polypodium truncatulum
Polypodi um truncicola major
Polypodi um truncicola minor
Polypodi um tuberosum
Polypodi um tunguraguae
Polypodi um turquinum
Polypodi um turrialbae
Polypodium ursipes, Polypodium vagans
Polypodi um valdealatum
Polypodi um versteegii, Polypodium villagranii
Polypodi um virginianum cambroideum, Polypodium virginianum peraferens
Polypodium vittarioides , Polypodium vulgare
Polypodium vulgare L. , Polypodium vulgare subsp. oreophilum,
Polypodium vulgare var. acuminatum, Polypodium vulpinum,
Polypodium williamsii,
Polypodium wobbense, Polypodium x fallacissimum-guttatum,
Polypodium xantholepis, Polypodium xiphopteris, Polypodium yarumalense,
Polypodium yungense, e
Polypodium zosteriforme.
[0058] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptideo PtIP-83 é derivada de uma espécie de samambaia da Ordem Polypodiales, Família Polypodiaceae, Gênero Platycerium.
[0059] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptideo PtIP-83 é derivada de uma espécie da Divisão Lycophyta. A filogenia dos Lycopods existentes, tal como aqui utilizada, baseia-se na classificação por N. Wikstrom, American Fern Journal, 91:150-156 (2001) . Outras classificações filogênicas de Lycopods existentes são conhecidas do perito na técnica. Informação adiiconal sobre a filogenia de samambaias pode ser encontrada em
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72/525 mobot.org/MOBOT/research/APweb/ (gue pode ser acessado usando o
prefixo www ) e Schuettpelz E. e Pryer K. M. , TAXON ' 56: 1037-
1050 (2007) com base em três genes plastídicos. Espécies
adicionais de Lycopod podem ser encontradas em
homepages.caveroc k.net.nz/~bj/fern/list. htm (gue pode ser
acessado usando o prefixo usando http:// ) . •
[0060] Em algumas modalidades, a molécula de ácido
nucleico gue codifica o polipeptídeo PtIP-83 é derivada de uma espécie de samambaia da Classe Isoetopsida ou Classe Lycopodíopsída.
[0061] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico gue codifica o polipeptídeo PtIP-83 é derivada de uma espécie da Classe Isoetopsida, Ordem Selaginales. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico gue codifica o polipeptídeo PtIP-83 é derivada de uma espécie de samambaia da Classe Isoetopsida, Ordem Selaginales, Família Selaginellaceae. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico gue codifica o polipeptídeo PtIP-83 é derivada de uma espécie do Gênero Selaginella.
[0062] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico gue codifica o polipeptídeo PtIP-83 é derivada de uma espécie da Classe Lycopodiopsida , Ordem Lycopodiales. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico gue codifica o polipeptídeo PtIP-83 é derivada de uma espécie de samambaia da Classe Lycopodiopsida, Ordem Lycopodiales Família Lycopodiaceae ou Família Huperziaceae. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico gue codifica o polipeptídeo PtIP-83 é derivada de uma espécie do Gênero Austrolycopodium, Dendrolycopodium, Diphasiastrum, Diphasium, Huperzia, Lateristachys,
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Lycopodiastrum, Lycopodiella, Lycopodium, Palhinhaea, Pseudodiphasium, Pseudolycopodiella, Pseudolycopodium ou Spinulum. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo PtIP-83 é derivada de uma espécie do Gênero Lycopodium.
[0063] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo PTIP-83 que compreende uma sequência de aminoácidos MOTIVO selecionada a partir de: uma sequência de aminoácidos MOTIVO 1 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
PF[DE]MPSEADWSIFVNE[IV]EAVAEGMPTEVSEVP[AV]WKAKCKN[MV]AALGREM[S C] I (SEQ ID NO: 646); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 2 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula PQLQYRMYG[NS]LI[KN]QMAQVAQNYDQ[ED]FKQ[FL]KLFI[IA]QNQI[LF]GSYLL QQN[KR]AF (SEQ ID NO: 647); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 3 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula NTFMQMTPFTRWRLRLSASASENA[EG]LAFPTATA[PL]DSTT[EQ][IV]VITFHVTAIR (SEQ ID NO: 648); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 4 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula [DN] FTSRHWK [GD] IPVSLLLDGEDWEFEIPVQ [AG] GMSSFP (SEQ ID NO: 649); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 5 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
IIHQP[SA]T[RQ][ST]G[IT]VYILLQGSTIFHDRRR[DE]EVMTFQAA[DA]PLN[FY] [QH]YAYRLDTG (SEQ ID NO: 650); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 6 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula S[HQ]ADRLAAIQP[AV]DLTN[HY]LEMAT[HQ]MDMRTT[RS][MI]L[IL]GLLN[MI] LRIQNAALMYEY (SEQ ID NO: 651); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 7 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula [VL]DRVEFSEVMVIHRMYVRL[SA]DL[ND]VGEL[PE]GA[EG][RK]VKR[VL]YV[EL
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74/525 ]ADWE (SEQ ID NO: 652); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 8 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula A[DE]RELQMESFHSAVISQRRQEL[ND]TA[IF]AKM[DE]R[LM]SLQMEEE[NS]RAME QAQKEM (SEQ ID NO: 653); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 9 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula FVTAGATAPGA [AV] ASAGQAVSIAGQAAQ [AG] LRRWEILE [GQ] LEAVMEWAA [VI ] K (SEQ ID NO: 654); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 10 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula DGMNWG[IT]YI[YH]GE[KE]V[EQ]RSPLLPSNAILAVWADRC[TI]ITSARHNH[VE]N APGR[IV]I (SEQ ID NO: 655); uma sequência de aminoácidos MOTIVO representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula [KV] [VK] [CA] RPPSPDM [MV] SAVAEHALWLNDVLLQWQ [KN] ESQ [LM] QGT [AE] PY NECLALLGR (SEQ ID NO: 656); uma sequência de aminoácidos MOTIVO representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
PTELT[VA]WPLGMDTV[AG]NLLIAQENAAL[VL]GLIQLGPSS (SEQ ID NO: 657); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 13 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
RDQ[MT][HQ]MPGSVTVI[IV]LCRLLQFP[IT]DGSQA[TA]T (SEQ ID NO: 658); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 14 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
TSIPVEWTDP [SN] ILLGMQTTV [LH] IAEL (SEQ ID NO: 659); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 15 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula EGLR[EQ]FQNRQVARA[VL]FAVLKAVA[MQ]I[AG] (SEQ ID NO: 660); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 16 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula W[TS]RVRIRHLEM[QH]F[AV]QEASG (SEQ ID NO: 661); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 17 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula QISELQY[ED]IWVQG[LM][ML]RDIA (SEQ ID NO: 662); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 18 representada por
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75/525 uma sequência de aminoácidos de fórmula TFTLGSGVTGITSMHGEPSLDPWNGVSLDSASPTAF (SEQ ID NO: 663); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 19 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula MDYSTLYRDLNQIS (SEQ ID NO: 664); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 20 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula LRLPFM[QK]LHARVIEQN[VR]K[SE] (SEQ ID NO: 665); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 21 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula VDSLEQVG[QH][IL]V[GD]AP (SEQ ID NO: 666); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 22 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula [IV] [EQ] [CA]VMK[IM] GRF[VG] [SL]W (SEQ ID NO: 667); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 23 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula TLTNEPSE[EQ]F (SEQ ID NO: 668); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 24 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula LPRQSRNISF (SEQ ID NO: 669) .
[0064] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptideo PTIP-83 que compreende uma sequência de aminoácidos MOTIVO selecionada a partir de: uma sequência de aminoácidos MOTIVO 1 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
PE[DE]MPSEADWSIFVNE[IV]EAVAEGMPTEVSEVP[AV]WKAKCKN[MV]AALGREM[S C]I (SEQ ID NO: 646); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 2 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
PQLQYRMYG[NS]LI[KN]QMAQVAQNYDQ[ED]FKQ[FL]KLFI[IA]QNQI[LF]GSYLL QQN[KR]AF (SEQ ID NO: 647); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 3 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a
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76/525 sequência de aminoácidos representada pela fórmula NTFMQMTPFTRWRLRLSASASENA[EG]LAFPTATAfPL]DSTT[EQ][IV]VITFHVTAIR (SEQ ID NO: 648); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 4 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula [DN] FTSRHWK [GD] IPVSLLLDGEDWEFEIPVQ [AG] GMSSFP (SEQ ID NO: 649); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 5 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
IIHQP[SA]T[RQ][ST]G[IT]VYILLQGSTIFHDRRR[DE]EVMTFQAA[DA]PLN[FY] [QH]YAYRLDTG (SEQ ID NO: 650); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 6 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula S[HQ]ADRLAAIQP[AV]DLTN[HY]LEMAT[HQ]MDMRTT[RS][MI]L[IL]GLLN[MI] LRIQNAALMYEY (SEQ ID NO: 651); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 7 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula [VL] DRVEFSEVMVIHRMYVRL [SA] DL [ND] VGEL [ PE ] GA [EG] [RK] VKR [VL] YV [ EL ]ADWE (SEQ ID NO: 652); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 8 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
A[DE]RELQMESFHSAVISQRRQEL[ND]TA[IF]AKM[DE]R[LM]SLQMEEE[NS] RAME QAQKEM (SEQ ID NO: 653); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 9 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
FVTAGATAPGA [AV] ASAGQAVSIAGQAAQ [AG] LRRWEILE [GQ] LEAVMEWAA [VI ] K (SEQ ID NO: 654); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 10 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
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DGMNWG[IT]YI[YH]GE[KE]V[EQ]RSPLLPSNAILAVWADRC[TI]ITSARHNH[VF]N APGR[IV]I (SEQ ID NO: 655); uma sequência de aminoácidos MOTIVO que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula [KV] [VK] [CA] RPPSPDM [MV] SAVAEHALWLNDVLLQWQ [KN] ESQ [LM] QGT [AE] PY NECLALLGR (SEQ ID NO: 656); uma sequência de aminoácidos MOTIVO que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula PTELT[VA]WPLGMDTV[AG]NLLIAQENAAL[VL]GLIQLGPSS (SEQ ID NO: 657); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 13 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
RDQ[MT][HQ]MPGSVTVI[IV]LCRLLQFP[IT]DGSQA[TA]T (SEQ ID NO: 658); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 14 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula TSIPVEWTDP[SN]ILLGMQTTV[LH]IAEL (SEQ ID NO: 659); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 15 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
EGLR[EQ]FQNRQVARA [VL]FAVLKAVA[MQ]I[AG] (SEQ ID NO: 660); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 16 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula W [TS]RVRIRHLEM[QH]F[AV]QEASG (SEQ ID NO: 661); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 17 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
QISELQY[ED]IWVQG[LM][ML]RDIA (SEQ ID NO: 662); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 18 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela
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78/525 fórmula TFTLGSGVTGITSMHGEPSLDPWNGVSLDSASPTAF (SEQ ID NO: 663) ; uma sequência de aminoácidos MOTIVO 19 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula MDYSTLYRDLNQIS (SEQ ID NO: 664); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 20 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula LRLPFM[QK]LHARVIEQN[VR]K[SE] (SEQ ID NO: 665); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 21 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula VDSLEQVG[QH][IL]V[GD]AP (SEQ ID NO: 666); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 22 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula [IV] [EQ] [CA]VMK[IM] GRF[VG] [SL]W (SEQ ID NO: 667); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 23 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula TLTNEPSE[EQ]F (SEQ ID NO: 668); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 24 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula LPRQSRNISF (SEQ ID NO: 669).
[0065] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo PTIP-83 que compreende uma sequência de aminoácidos MOTIVO selecionada a partir de: uma sequência de aminoácidos MOTIVO 1 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
PF[DE]PF[ST][ED]ADWSIFVNE[IVL]EAVAEGMPTEVSEVP[AV]W[KR]AKCKN[MV ]AALGREM[SC]I (SEQ ID NO: 670); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 2 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula PQLQYRMYG[NS]LI[KRN]QMAQVAQNYD[QR][ED]FK[QR][FL][KR]LEI[IAVL]Q
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79/525
NQI[LF]GSYLL[QE]QN[KR]AF (SEQ ID NO: 671); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 3 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
N[TK]FMQMTPFT[RH]WRLRLSASA[SPKA]ΕΝ[AK][EG]LAFPTATA[PL]DSTT[EQ] [IV] [VA]ITFHVTAIR (SEQ ID NO: 672) ; uma sequência de aminoácidos
MOTIVO 4 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula [DN] FTSRHWK[GD] IPV [ SN] LLLDG [EG] DWEFEIPVQ [AG] GMSSFP (SEQ ID NO: 673); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 5 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
IIHQP[SA]T[RQ][ST]G[IT][VI]YILLQGST[IV]FHDRRR[DE][EQ]V[ML]T[FP ]QAA[DAV]PLN[FY][QH]YAYRLDTG (SEQ ID NO: 674); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 6 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
S[HQ]ADRLAAIQP[AV][DN]LTN[HYE]LEMAT[HQ]MDMRTT[RS][MI]L[IL]GLLN [MI] [LM] RIQNAAL [MR] YEY (SEQ ID NO: 675); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 7 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula [VL]D[RQ]VEFSEVMVIHRMYV[N]RL[SA]DL[ND]V[GA][EQ]L[PE]GA[EG][RK]
VKR[VL] YV[FL]ADWE (SEQ ID NO: 676); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 8 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
A[DE]RELQMESFH[SA]AVISO[RK]R[QGE]EL[ND][TD][A][IF]AKM[DE]R[LM] SLQMEEE[NSD][RG]AMEQA[QR]KEM (SEQ ID NO: 677); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 9 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
F [VL] TAGATAPGA [AV] ASAGQAV[SN] IAGQAAQ [AG] LRRWEILE [GQ] LEAVMEWA A[VI]K (SEQ ID NO: 678); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 10 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula D[GD][MA][NK]WG[IT]Y[IV][YH][GA]E[KE]V[EQ][RVL]SPL[LYE][PN][SN
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G][NW][ASP][IY]L[AGV]V[WE]A[DQ]R[CS][TI]IT[SA]A[REM]HN[HVT][VF ] [ND] [AER] PG [RW] [IV] [IR] (SEQ ID NO: 679); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 11 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula [KV] [VK] [CA] [RGC] [PHY]PSP[DE] [MIL] [MV]SAV[AG] [EV]HA[LIN]WL[NS] [DK]VLL[QR]VVQ[KN]ES[QH] [LM]QGT [AE] [PSA]YNECLALLGR (SEQ ID NO: 680); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 12 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula [PN]T[EQ]LT[VAT]WPL[GR]MDTV[AG][ND]LLI[A][QH]E[NS]AAL[VLS]GL[I TMA]QLG[PQ][SP]S (SEQ ID NO: 681); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 13 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula [RLC][DLWK][QNPR][MTP][HQR][MIL]PGSVTVI[IV]LCRLLQFP[IT][DG]G[S R][QFR][AS][TAD][TW] (SEQ ID NO: 682); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 14 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula [TA][SGV][IL]PV[ED]VVTDP[SN]IL[LM]GMQT[TS]V[LH]IAEL (SEQ ID NO:
683) ; uma sequência de aminoácidos MOTIVO 15 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula EGLR[EQ]FQN[RE]QVA[RN]A[VL]FAVL[KS][AS]VA[MQ]I[AG] (SEQ ID NO:
684) ; uma sequência de aminoácidos MOTIVO 16 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula W [TS] RVRIRHLEM [QH] F [AV] [QK] E [AS] [SM] [GN] (SEQ ID NO: 685); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 17 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
Q [IM] S [EQ] LQY [ED] IWVQG [LM] [ML] RD [IM] A (SEQ ID NO: 686); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 18 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
TFTLGSGVTGITSMHGEPSLDPWNGVSLDSASPTAF (SEQ ID NO: 663); uma
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81/525 sequência de aminoácidos MOTIVO 19 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula [MLV]DY[SK][TSK]L[YF][RE]DLNQIS (SEQ ID NO: 687); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 20 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
L[RHQ]L[PT]FM[QK]LHA[RIT][VQL][IR]E[QER][NF][VR][KWS][SE] (SEQ ID NO: 688); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 21 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula V[DN][SA]L[ED]QV[GS][QH][IL]V[GD]AP (SEQ ID NO: 689); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 22 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula [IV] [EQH] [CAS] [VA] [MI]K[IM] [GV] [RP] [FI] [VG] [SL]W (SEQ ID NO: 690); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 23 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula TLTN[EQ]PSE[EQDH]F (SEQ ID NO: 691); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 24 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula LP[RS]QS[RT]N[IV]SE (SEQ ID NO: 692).
[0066] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo PTIP-83 que compreende uma sequência de aminoácidos MOTIVO selecionada a partir de: uma sequência de aminoácidos MOTIVO 1 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
PF[DE]PF[ST][ED]ADWSIFVNE[IVL]EAVAEGMPTEVSEVP[AV]W[KR]AKCKN[MV ]AALGREM[SC]I (SEQ ID NO: 670); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 2 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula PQLQYRMYG[NS]LI[KRN]QMAQVAQNYD[QR][ED]FK[QR][FL][KR]LEI[IAVL]Q NQI[LF]GSYLL[QE]QN[KR]AF (SEQ ID NO: 671); uma sequência de
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82/525 aminoácidos MOTIVO 3 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
N[TK]FMQMTPFT[RH]WRLRLSASA[SPKA]ΕΝ[AK][EG]LAFPTATA[PL]DSTT[EQ] [IV] [VA]ITFHVTAIR (SEQ ID NO: 672) ; uma sequência de aminoácidos MOTIVO 4 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula [DN] FTSRHWK[GD] IPV [ SN] LLLDG [EG] DWEFEIPVQ [AG] GMSSFP (SEQ ID NO: 673); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 5 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
IIHQP[SA]T[RQ][ST]G[IT][VI]YILLQGST[IV]FHDRRR[DE][EQ]V[ML]T[FP ]QAA[DAV]PLN[FY][QH]YAYRLDTG (SEQ ID NO: 674); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 6 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
S[HQ]ADRLAAIQP[AV][DN]LTN[HYE]LEMAT[HQ]MDMRTT[RS][MI]L[IL]GLLN [MI] [LM] RIQNAAL [MR] YEY (SEQ ID NO: 675); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 7 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula [VL]D[RQ]VEFSEVMVIHRMYV[N]RL[SA]DL[ND]V[GA][EQ]L[PE]GA[EG][RK]
VKR[VL] YV[FL]ADWE (SEQ ID NO: 676); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 8 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
A[DE]RELQMESFH[SA]AVISO[RK]R[QGE]EL[ND][TD][A][IF]AKM[DE]R[LM]
SLQMEEE[NSD][RG]AMEQA[QR]KEM (SEQ ID NO: 677); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 9 que tem pelo menos 90% de identidade de
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 86/553
83/525 sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
F [VL] TAGATAPGA [AV] ASAGQAV [ SN] IAGQAAQ [AG] LRRWEILE [GQ] LEAVMEWA A[VI]K (SEQ ID NO: 678); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 10 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
D[GD][MA][NK]WG[IT]Y[IV][YH][GA]E[KE]V[EQ][RVL]SPL[LYE][PN][SN G][NW][ASP][IY]L[AGV]V[WE]A[DQ]R[CS][TI]IT[SA]A[REM]HN[HVT][VE ] [ND] [AER] PG [RW] [IV] [IR] (SEQ ID NO: 679); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 11 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula [KV][VK][CA][RGC][PHY]PSP[DE][MIL][MV]SAV[AG][EV]HA[LIN]WL[NS] [DK]VLL[QR]VVQ[KN]ES[QH] [LM]QGT [AE] [PSA]YNECLALLGR (SEQ ID NO: 680); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 12 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula [PN]T[EQ]LT[VAT]WPL[GR]MDTV[AG][ND]LLI[A][QH]E[NS]AAL[VLS]GL[I TMA]QLG[PQ] [SP]S (SEQ ID NO: 681); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 13 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula [RLC][DLWK][QNPR][MTP][HQR][MIL]PGSVTVI[IV]LCRLLQFP[IT][DG]G[S R] [QFR] [AS] [TAD] [TW] (SEQ ID NO: 682); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 14 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula [TA][SGV][IL]PV[ED]VVTDP[SN]IL[LM]GMQT[TS]V[LH]IAEL (SEQ ID NO: 683); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 15 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
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84/525
EGLR[EQ]FQN[RE]QVA[RN]A[VL]FAVL[KS][AS]VA[MQ]I[AG] (SEQ ID NO: 684); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 16 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula W [TS] RVRIRHLEM [QH] F [AV] [QK] E [AS] [SM] [GN] (SEQ ID NO: 685); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 17 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula Q[IM]S[EQ]LQY[ED]IWVQG[LM][ML]RD[IM]A (SEQ ID NO: 686); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 18 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula TFTLGSGVTGITSMHGEPSLDPWNGVSLDSASPTAF (SEQ ID NO: 663); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 19 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula [MLV]DY[SK][TSK]L[YF][RE]DLNQIS (SEQ ID NO: 687); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 20 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula L[RHQ]L[PT]FM[QK]LHA[RIT][VQL][IR]E[QER][NF][VR][KWS][SE] (SEQ ID NO: 688); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 21 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula V[DN] [SA] L [ED] QV[GS] [QH] [IL] V[GD] AP (SEQ ID NO: 689); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 22 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula [IV] [EQH] [CAS] [VA] [MI]K[IM] [GV] [RP] [FI] [VG] [SL]W (SEQ ID NO: 690); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 23 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 88/553
85/525 representada pela fórmula TLTN[EQ]PSE[EQDH]F (SEQ ID NO: 691); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 24 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula LP[RS]QS[RT]N[IV]SF (SEQ ID NO: 692).
[0067] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo PTIP-83 que compreende uma sequência de aminoácidos MOTIVO selecionada a partir de: uma sequência de aminoácidos MOTIVO 1 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
PF[DE]PF[ST][ED]ADWSIFVNE[IVL]EAVAEGMPTEVSEVP[AVIL]W[KR]AKCKN[ MVIL]AALGREM[SGT]I (SEQ ID NO: 693); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 2 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
PQLQYRMYG[NS]LI[KRNQ]QMAQVAQNYD[QRNK][ED]FK[QRNK][EL][KR]LFI[I AVL]QNQI[LFIV]GSYLL[QEND]QN[KR]AF (SEQ ID NO: 694); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 3 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
N[TKSR]FMQMTPFT[RHK]WRLRLSASA[SPKATR]EN[AKR][EG]LAFPTATA[PLIV] DSTT [EQND] [IVL] [VAIL] ITFHVTAIR (SEQ ID NO: 695); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 4 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula [DNQE] FTSRHWK [GDE] IPV [SNTQ] LLLDG [EGD] DWEFEIPVQ [AG] GMSSFP (SEQ ID NO: 696); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 5 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula IIHQP[SAT]T[RQKN][ST]G[ITLVS][VIL]YILLQGST[IVL]FHDRRR[DE][EQDN ]V[MLIV]T[FP]QAA[DAVEIL]PLN[FY][QHN]YAYRLDTG (SEQ ID NO: 697); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 6 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
S[HQN]ADRLAAIQP[AVIL][DN]LTN[HYE]LEMAT[HQN]MDMRTT[RSKT][MILV]L
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86/525 [ILV]GLLN[MILV][LMIV]RIQNAAL[MRILVK]YEY (SEQ ID NO: 698); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 7 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula [VLI] D [RQKN] VEFSΕλ/MVIHRMYV [N] RL [SAT] DL [NDQE] V[GA] [EQND] L [PED] G
A [EGD] [RK] VKR [VLI ] YV [ ELIV] ADWE (SEQ ID NO: 699); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 8 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
A[DE]RELQMESFH[SAT]AVISO[RK]R[QGEND]EL[NDQE][TDSE][ATS][IFLV]A KM[DE]R[LMIV]SLQMEEE[NSDQET][RGK]AMEQA[QRNK]KEM (SEQ ID NO: 700); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 9 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
F [VLI] TAGATAPGA [AVIL] ASAGQAV [ SNTQ] IAGQAAQ [AG] LRRWEILE [GQN] LEA VMEWAA[VIL] K (SEQ ID NO: 701); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 10 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
D[GDE][MA][NKQK]WG[ITLVS]Y[IVL][YH][GA]E[KERD]V[EQND][RVLKI]SP L[LYFIV][PNQ][SNGTQ][NWQ][ASPT][IYLV]L[AGVIL]V[WED]A[DQNE]R[CS T][TISLV]IT[SAT]A[RFMK]HN[HVTILS][VEIL][NDQE][AERDK]PG[RWK][IV L][IRLVK] (SEQ ID NO: 702); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 11 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula [KVRIL][VKRIL][CA][RGCK][PHY]PSP[DE][MILV][MVIL]SAV[AG][EVDIL] HA[LINVQ] WL [NSQT] [DKER] VLL [QRNK] WQ [KNRQ] ES [QHN] [LMIV] QGT [AED] [PSAT]YNECLALLGR (SEQ ID NO: 703); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 12 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula [PNQ]T[EQDN]LT[VATILS]WPL[GRK]MDTV[AG][NDQE]LLI[ATS][QHN]E[NSQ T]AAL[VLSIT]GL[ITMALVS]QLG[PQN][SPT]S (SEQ ID NO: 704); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 13 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
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87/525 [RLCKIV][DLWKEIVR][QNPRK][MTP][HQR][MILV]PGSVTVI[IVL]LCRLLQFP[
ITLVS] [DGE]G[SRTK] [QFRNK] [AST] [TADES] [TWS] (SEQ ID NO: 705); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 14 representada por uma sequencia de aminoácidos de fórmula [TA] [SGVTIL] [ILV] PV[ED] WTDP [SNTQ] IL [LMIV] GMQT [TS] V[LHIV] IAEL (SEQ ID NO: 706); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 15 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula EGLR[EQND]FQN[REKD]QVA[RNKQ]A[VLI]FAVL[KSRT][AST]VA[MQN]I[AG] (SEQ ID NO: 707); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 16 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula W [TS] RVRIRHLEM [QHN] F [AVIL] [QKNR] E [AST] [SMT] [GNQ] (SEQ ID NO:
708) ; uma sequência de aminoácidos MOTIVO 17 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula Q[IMLV]S[EQND]LQY[ED]IWVQG[LMIV][MLIV]RD[IMLV]A (SEQ ID NO:
709) ; uma sequência de aminoácidos MOTIVO 18 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula TFTLGSGVTGITSMHGEPSLDPWNGVSLDSASPTAF (SEQ ID NO: 663); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 19 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula [MLVI]DY[SKTR][TSKR]L[YF][REKD]DLNQIS (SEQ ID NO: 710); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 20 representada por uma sequencia de aminoácidos de fórmula
L[RHQKN]L[PTS]FM[QKNR]LHA[RITKLVS][VQLIN][IRLVK]E[QERNDK][NFQ] [VRILK][KWSRT][SETD] (SEQ ID NO: 711); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 21 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
V[DNQE] [SAT] L [ED] QV[GST] [QHN] [ILV] V[GDE] AP (SEQ ID NO: 712); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 22 representada por uma sequencia de aminoácidos de fórmula
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88/525 [IVL][EQHND][CAST][VAIL][MILV]K[IMLV][GVIL][RPK][FILV][VGIL][S LTIV]W (SEQ ID NO: 713); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 23 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula TLTN[EQDN]PSE[EQDHN]F (SEQ ID NO: 714); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 24 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula LP[RSKT]QS[RTKS]N[IVL]SF (SEQ ID NO: 715) .
[0068] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo PTIP-83 que compreende uma sequência de aminoácidos MOTIVO selecionada a partir de: uma sequência de aminoácidos MOTIVO 1 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
PF[DE]PF[ST][ED]ADWSIFVNE[IVL]EAVAEGMPTEVSEVP[AVIL]W[KR]AKCKN[ MVIL]AALGREM[SOT]I (SEQ ID NO: 693); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 2 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
PQLQYRMYG[NS]LI[KRNQ]QMAQVAQNYD[QRNK][ED]FK[QRNK][EL][KR]LFI[I AVL]QNQI[LFIV]GSYLL[QEND]QN[KR]AF (SEQ ID NO: 694); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 3 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
N[TKSR]FMQMTPFT[RHK]WRLRLSASA[SPKATR]EN[AKR][EG]LAFPTATA[PLIV] DSTT [EQND] [IVL] [VAIL] ITFHVTAIR (SEQ ID NO: 695); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 4 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula [DNQE] FTSRHWK [GDE] IPV [SNTQ] LLLDG [EGD] DWEFEIPVQ [AG] GMSSFP (SEQ
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ID NO: 696); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 5 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
IIHQP[SAT]T[RQKN] [ST]G[ITLVS] [ VIL ] YILLQGST[IVL]FHDRRR[DE] [EQDN ]V[MLIV]T[FP]QAA[DAVEIL]PLN[FY][QHN]YAYRLDTG (SEQ ID NO: 697); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 6 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
S[HQN]ADRLAAIQP[AVIL][DN]LTN[HYE]LEMAT[HQN]MDMRTT[RSKT][MILV]L [ILV]GLLN[MILV][LMIV]RIQNAAL[MRILVK]YEY (SEQ ID NO: 698); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 7 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula [VLI]D[RQKN]VEFSEVMVIHRMYV[N]RL[SAT]DL[NDQE]V[GA][EQND]L[PED]G
A[EGD][RK]VKR[VLI]YV[ELIV]ADVVE (SEQ ID NO: 699); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 8 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
A[DE]RELQMESFH[SAT]AVISO[RK]R[QGEND]EL[NDQE][TDSE][ATS][IFLV]A KM[DE]R[LMIV]SLQMEEE[NSDQET][RGK]AMEQA[QRNK]KEM (SEQ ID NO: 700); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 9 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
F [VLI] TAGATAPGA [AVIL] ASAGQAV [ SNTQ] IAGQAAQ [AG] LRRWEILE [GQN] LEA VMEWAA[VIL] K (SEQ ID NO: 701); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 10 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula D[GDE][MA][NKQK]WG[ITLVS]Y[IVL][YH][GA]E[KERD]V[EQND][RVLKI]SP L[LYFIV][PNQ][SNGTQ][NWQ][ASPT][IYLV]L[AGVIL]V[WED]A[DQNE]R[CS
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T][ TISLV]IT[SAT]A[RFMK]ΗΝ[HVTILS][VFIL][NDQE][AERDK]PG[RWK][IV L][IRLVK] (SEQ ID NO: 702); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 11 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula [KVRIL][VKRIL][CA][RGCK][PHY]PSP[DE][MILV][MVIL]SAV[AG][EVDIL] HA[LINVQ] WL [NSQT] [DKER] VLL [QRNK] WQ [KNRQ] ES [QHN] [LMIV] QGT [AED] [PSAT]YNECLALLGR (SEQ ID NO: 703); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 12 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula [PNQ]T[EQDN]LT[VATILS]WPL[GRK]MDTV[AG][NDQE]LLI[ATS][QHN]E[NSQ T]AAL[VLSIT]GL[ITMALVS]QLG[PQN][SPT]S (SEQ ID NO: 704); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 13 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula [RLCKIV][DLWKEIVR][QNPRK][MTP][HQR][MILV]PGSVTVI[IVL]LCRLLQFP[ ITLVS] [DGE]G[SRTK] [QFRNK] [AST] [TADES] [TWS] (SEQ ID NO: 705); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 14 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula [TA][SGVTIL][ILV]PV[ED]VVTDP[SNTQ]IL[LMIV]GMQT[TS]V[LHIV]IAEL (SEQ ID NO: 706); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 15 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
EGLR[EQND]FQN[REKD]QVA[RNKQ]A[VLI]FAVL[KSRT][AST]VA[MQN]I[AG] (SEQ ID NO: 707); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 16 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
W [TS] RVRIRHLEM [QHN] F [AVIL] [QKNR] E [AST] [SMT] [GNQ] (SEQ ID NO: 708); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 17 que tem pelo menos
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90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
Q[IMLV]S[EQND]LQY[ED]IWVQG[LMIV][MLIV]RD[IMLV]A (SEQ ID NO: 709); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 18 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula TFTLGSGVTGITSMHGEPSLDPWNGVSLDSASPTAF (SEQ ID NO: 663); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 19 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula [MLVI]DY[SKTR][TSKR]L[YF][REKD]DLNQIS (SEQ ID NO: 710); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 20 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
L[RHQKN]L[PTS]FM[QKNR]LHA[RITKLVS][VQLIN][IRLVK]E[QERNDK][NFQ] [VRILK][KWSRT][SETD] (SEQ ID NO: 711); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 21 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula V[DNQE][SAT]L[ED]QV[GST][QHN][ILV]V[GDE]AP (SEQ ID NO: 712); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 22 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula [IVL][EQHND][CAST][VAIL][MILV]K[IMLV][GVIL][RPK][FILV][VGIL][S LTIV]W (SEQ ID NO: 713); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 23 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula TLTN[EQDN]PSE[EQDHN]F (SEQ ID NO: 714); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 24 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula LP[RSKT]QS[RTKS]N[IVL]SF (SEQ ID NO: 715).
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92/525 [0069] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo PtIP-83 compreendendo, sequencialmente do terminal N ao terminal C, uma sequência de aminoácidos MOTIVO selecionada a partir de: MOTIVO 19 (SEQ ID
NO: 664, SEQ ID NO: 687 ou SEQ ID NO: 710 ), MOTIVO 7 (SEQ ID NO
652, SEQ ID NO: 676 ou SEQ ID NO : 699), MOTIVO 13 (SEQ ID NO
658, SEQ ID NO: 682 ou SEQ ID NO : 70 5) , MOTIVO 20 (SEQ ID NO
665, SEQ ID NO: 688 ou SEQ ID NO : 71 1) , MOTIVO 10 (SEQ ID NO
655, SEQ ID NO: 679 ou SEQ ID NO : 702), MOTIVO 18 (SEQ ID NO
663) , MOTIVO 24 (SEQ ID NO: 6 6 9, SEQ ID NO: 692 ou SEQ ID NO
715) , MOTIVO 14 (SEQ ID NO: 659, SEQ ID NO: 683 ou SEQ ID NO
706) , MOTIVO 11 (SEQ ID NO: 656, SEQ ID NO: 680 ou SEQ ID NO
703) , MOTIVO 22 (SEQ ID NO: 667, SEQ ID NO: 690 ou SEQ ID NO
713) , MOTIVO 2 (SEQ ID NO: 647, SEQ ID NO: 671 ou SEQ ID NO
694) , MOTIVO 8 (SEQ ID NO: 653, SEQ ID NO: 677 ou SEQ ID NO
700) , MOTIVO 15 (SEQ ID NO: 660, SEQ ID NO: 684 ou SEQ ID NO
707) , MOTIVO 9 (SEQ ID NO: 654, SEQ ID NO: 678 ou SEQ ID NO
701) , MOTIVO 21 (SEQ ID NO: 6 6 6, SEQ ID NO: 689 ou SEQ ID NO
712) , MOTIVO 1 (SEQ ID NO: 646, SEQ ID NO: 670 ou SEQ ID NO
693) , MOTIVO 17 (SEQ ID NO: 662, SEQ ID NO: 686 ou SEQ ID NO
709) , MOTIVO 6 (SEQ ID NO: 651, SEQ ID NO: 675 ou SEQ ID NO
698) , MOTIVO 12 (SEQ ID NO: 657, SEQ ID NO: 681 ou SEQ ID NO
704) , MOTIVO 4 (SEQ ID NO: 649, SEQ ID NO: 673 ou SEQ ID NO
696) , MOTIVO 16 (SEQ ID NO: 661, SEQ ID NO: 685 ou SEQ ID NO
708) , MOTIVO 5 (SEQ ID NO: 650, SEQ ID NO: 674 ou SEQ ID NO
697) , MOTIVO 23 (SEQ ID NO: 668, SEQ ID NO: 691 ou SEQ ID NO
714) e MOTIVO 3 (SEQ ID NO: 648, SEQ ID NO: 672 ou SEQ ID NO
695) .
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93/525 [0070] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo PtIP-83 compreendendo, sequencialmente do terminal N ao terminal C, uma sequência de aminoácidos MOTIVO selecionada a partir de: MOTIVO 19 (SEQ ID
NO: 664, SEQ ID NO: i 687 ou SEQ ID NO: 710) , MOTIVO 7 (SEQ ID NO
652, SEQ ID NO: 676 OU SEQ ID NO: 699) r MOTIVO 13 (SEQ ID NO
658, SEQ ID NO: 682 OU SEQ ID NO: 705) r MOTIVO 20 (SEQ ID NO
665, SEQ ID NO: 688 OU SEQ ID NO: 711) r MOTIVO 14 (SEQ ID NO
659, SEQ ID NO: 683 OU SEQ ID NO : 706 ) f MOTIVO 2 (SEQ ID NO
647, SEQ ID NO: 671 OU SEQ ID NO : 694 ) f MOTIVO 8 (SEQ ID NO
653, SEQ ID NO: 677 OU SEQ ID NO: 700) r MOTIVO 15 (SEQ ID NO
660, SEQ ID NO: 684 OU SEQ ID NO : 707 ) f MOTIVO 9 (SEQ ID NO
654, SEQ ID NO: 678 OU SEQ ID NO: 701) r MOTIVO 21 (SEQ ID NO
6 6 6, SEQ ID NO: 689 OU SEQ ID NO : 712 ) f MOTIVO 1 (SEQ ID NO
646, SEQ ID NO: 670 OU SEQ ID NO: 693) r MOTIVO 17 (SEQ ID NO
662, SEQ ID NO: 686 OU SEQ ID NO : 709 ) f MOTIVO 6 (SEQ ID NO
651, SEQ ID NO: 675 OU SEQ ID NO: 698) r MOTIVO 12 (SEQ ID NO
657, SEQ ID NO: 681 OU SEQ ID NO : 704 ) f MOTIVO 4 (SEQ ID NO
649, SEQ ID NO: 673 OU SEQ ID NO: 696) r MOTIVO 16 (SEQ ID NO
661, SEQ ID NO: 685 OU SEQ ID NO : 708 ) f MOTIVO 5 (SEQ ID NO
650, SEQ ID NO: 674 OU SEQ ID NO: 697) r MOTIVO 23 (SEQ ID NO
668, SEQ ID NO: 691 OU SEQ ID NO: 714) € i MOTIVO 3 (SEQ ID NO
648, SEQ ID NO: 672 OU Í 3EQ I :D NO: 695) .
[0071] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo PtIP-83 compreendendo, sequencialmente do terminal N ao terminal C, a sequência de aminoácidos de motivos: MOTIVO 19 (SEQ ID NO: 664, SEQ ID NO: 687 ou SEQ ID NO: 710), MOTIVO 7 (SEQ ID NO: 652, SEQ ID NO: 676 ou SEQ ID NO: 699), MOTIVO 13 (SEQ ID NO: 658, SEQ ID NO: 682 ou
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SEQ ID NO: 705), MOTIVO 20 (SEQ ID NO: 665, SEQ ID NO: 688 ou
SEQ ID NO: 711), MOTIVO 10 (SEQ ID NO: 655, SEQ ID NO: 679 ou
SEQ ID NO: 702), MOTIVO 18 (SEQ ID NO: 663) , MOTIVO 24 i (SEQ ID
NO: 669, SEQ ID NO: 692 ou SEQ ID NO: 715) , MOTIVO 14 ( :seq ID
NO: 659, SEQ ID NO: 683 ou SEQ ID NO: 706) , MOTIVO 11 ( :seq ID
NO: 656, SEQ ID NO: 680 ou SEQ ID NO: 703) , MOTIVO 22 ( :seq ID
NO: 667, SEQ ID NO: 690 < du SEQ II ) NC ): 713) , MOTIVO 2 (SEQ ID NO:
647, SEQ ID NO: 671 ou SEQ ID NO : 694 ), MOTIVO 8 (SEQ ID NO
653, SEQ ID NO: 677 ou SEQ ID NO: 700) , MOTIVO 15 (SEQ ID NO
660, SEQ ID NO: 684 ou SEQ ID NO : 707 ), MOTIVO 9 (SEQ ID NO
654, SEQ ID NO: 678 ou SEQ ID NO: 701) , MOTIVO 21 (SEQ ID NO
6 6 6, SEQ ID NO: 689 ou SEQ ID NO : 712 ), MOTIVO 1 (SEQ ID NO
646, SEQ ID NO: 670 ou SEQ ID NO: 693) , MOTIVO 17 (SEQ ID NO
662, SEQ ID NO: 686 ou SEQ ID NO : 709 ) , MOTIVO 6 (SEQ ID NO
651, SEQ ID NO: 675 ou SEQ ID NO: 698) , MOTIVO 12 (SEQ ID NO
657, SEQ ID NO: 681 ou SEQ ID NO : 704 ), MOTIVO 4 (SEQ ID NO
649, SEQ ID NO: 673 ou SEQ ID NO: 696) , MOTIVO 16 (SEQ ID NO
661, SEQ ID NO: 685 ou SEQ ID NO : 708 ) , MOTIVO 5 (SEQ ID NO
650, SEQ ID NO: 674 ou SEQ ID NO: 697) , MOTIVO 23 (SEQ ID NO
668, SEQ ID NO: 691 ou SEQ ID NO: 714) e MOTIVO 3 (SEQ ID NO
648, SEQ ID NO: 672 OU Í 3EQ I :D NO: 695) .
[0072] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo PtIP-83 compreendendo, sequencialmente do terminal N ao terminal C, a sequência de aminoácidos de motivos: MOTIVO 19 (SEQ ID NO: 664, SEQ ID NO: 687 ou SEQ ID NO: 710), MOTIVO 7 (SEQ ID NO: 652, SEQ ID NO: 676 ou SEQ ID NO: 699), MOTIVO 13 (SEQ ID NO: 658, SEQ ID NO: 682 ou
SEQ ID NO: 705), MOTIVO 20 (SEQ ID NO: 665, SEQ ID NO: 688 ou
SEQ ID NO: 711),
MOTIVO 14 (SEQ ID NO: 659, SEQ ID NO: 683 ou
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95/525
SEQ ID NO: 706) , MOTIVO 2 (SEQ ID NO: 647 , SEQ ID NO: 671 ou SEQ
ID ] 40 : 694), MOTIVO 8 (SEQ ID NO: 653, , SEQ ID NO: 677 ou SEÇ ) ID
NO: 7 00), MOTIVO 15 (SEQ ID NO: 6 6 0, SE( 2 ID NO: 684 ou SEQ 1 ID
NO: 707), MOTIVO 9 (SEQ ID NO: 654, SEQ ID NO: 678 ou SEQ ID NO:
701 MOTIVO 21 (SEQ ID NO: 666, SEQ ID NO: 689 OU SEQ ID NO:
712 MOTIVO 1 ( SEQ ID NO: 646, SEQ ID NO: 670 ou SEQ ID NO:
693 MOTIVO 17 (SEQ ID NO: 662, SEQ ID NO: 686 ou SEQ ID NO:
709 MOTIVO 6 ( SEQ ID NO: 651, SEQ ID NO: 675 ou SEQ ID NO:
698 MOTIVO 12 (SEQ ID NO: 657, SEQ ID NO: 681 ou SEQ ID NO:
704 MOTIVO 4 ( SEQ ID NO: 649, SEQ ID NO: 673 ou SEQ ID NO:
696 MOTIVO 16 (SEQ ID NO: 661, SEQ ID NO: 685 ou SEQ ID NO:
708 MOTIVO 5 ( SEQ ID NO: 650, SEQ ID NO: 674 ou SEQ ID NO:
697 MOTIVO 23 (SEQ ID NO: 668, SEQ ID NO: 691 ou SEQ ID NO:
714 e MOTIVO 3 (SEQ ID NO: 648, SEQ ID NO: 672 ou SEQ ID NO:
695) .
[0073] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo PtIP-83 compreendendo sequencialmente do terminal N ao terminal C: uma Região A entre cerca de 200 a cerca de 300 aminoácidos de comprimento compreendendo uma sequência de aminoácidos MOTIVO de: MOTIVO 19
SEQ ID NO: 664, SEQ ID NO: 687 ou SEQ ID NO: 710) , MOTIVO 7
SEQ ID NO: 652, SEQ ID NO: 676 ou SEQ ID NO: 699), MOTIVO 13
SEQ ID NO: 658, SEQ ID NO: 682 ou SEQ ID NO: 705), MOTIVO 20
SEQ ID NO: 665, SEQ ID NO: 688 ou SEQ ID NO: 711), MOTIVO 10
SEQ ID NO: 655, SEQ ID NO: 679 ou SEQ ID NO: 702), MOTIVO 18
SEQ ID NO: 663) , MOTIVO 24 (SEQ ID NO: 669, SEQ ID NO: 692 ou
SEQ ID NO: 715), e/ou MOTIVO 14 tendo predominantemente uma estrutura secundária não conservada; uma Região B entre cerca de 380 a cerca de 465 aminoácidos de comprimento compreendendo uma
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96/525 sequência de aminoácidos MOTIVO de MOTIVO 22 (SEQ ID NO: 667, SEQ ID NO: 690 ou SEQ ID NO: 713), MOTIVO 2 (SEQ ID NO: 647, SEQ ID NO: 671 ou SEQ ID NO: 694), MOTIVO 8 (SEQ ID NO: 653, SEQ ID NO: 677 ou SEQ ID NO: 700), MOTIVO 15 (SEQ ID NO: 660, SEQ ID NO: 684 ou SEQ ID NO: 707), MOTIVO 9 (SEQ ID NO: 654, SEQ ID NO: 678 ou SEQ ID NO: 701), MOTIVO 21 (SEQ ID NO: 666, SEQ ID NO: 689 ou SEQ ID NO: 712), MOTIVO 1 (SEQ ID NO: 646, SEQ ID NO: 670 ou SEQ ID NO: 693), MOTIVO 17 (SEQ ID NO: 662, SEQ ID NO: 686 ou SEQ ID NO: 709), MOTIVO 6 (SEQ ID NO: 651, SEQ ID NO: 675 ou SEQ ID NO: 698), e/ou MOTIVO 12 e tendo predominantemente uma estrutura hélice alfa; e uma Região C entre cerca de 150 a cerca de 180 aminoácidos de comprimento compreendendo uma sequência de aminoácidos MOTIVO de MOTIVO 16 (SEQ ID NO: 661, SEQ ID NO: 685 ou SEQ ID NO: 708), MOTIVO 5 (SEQ ID NO: 650, SEQ ID NO: 674 ou SEQ ID NO: 697), MOTIVO 23 (SEQ ID NO: 668, SEQ ID NO: 691 ou SEQ ID NO: 714), e/ou MOTIVO 3 (SEQ ID NO: 648, SEQ ID NO: 672 ou SEQ ID NO: 695), tendo uma estrutura secundária de consenso compreendendo predominantemente a estrutura de cadeia beta.
[0074] Em algumas modalidades, o polipeptideo PtIP-83 compreende uma sequência de aminoácidos MOTIVO nas posições como mostrado na Tabela 2.
[0075] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptideo PtIP-83 compreendendo sequencialmente do terminal N até ao terminal C: uma Região A entre cerca de 200 e cerca de 300 aminoácidos de comprimento, tendo predominantemente uma estrutura secundária não conservada; uma Região B entre cerca de 380 a cerca de 465 aminoácidos de comprimento tendo uma estrutura secundária de consenso compreendendo 8 a 10 segmentos de predominantemente estrutura de
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97/525 hélice alfa; e uma Região C entre cerca de 150 a cerca de 180 aminoácidos de comprimento tendo uma estrutura secundária de consenso compreendendo 6 a 8 segmentos de predominantemente estrutura de cadeia beta. Como aqui utilizado predominantemente estrutura secundária não conservada significa que as regiões da estrutura secundária não estão consistentemente alinhadas dentro da família dos polipeptídeos PtIP. Tal como aqui utilizado predominantemente estrutura de hélice alfa significa gue a previsão da estrutura secundária pode ter um ou mais espaços entre 1 a 6 aminoácidos da estrutura em espiral e/ou cadeia beta intervenientes na estrutura da hélice alfa. Como aqui utilizado predominantemente estrutura de cadeia beta significa gue a previsão da estrutura secundária pode ter um ou mais intervalos entre 1 a 6 aminoácidos da estrutura em espiral e/ou hélice alfa que intervém na estrutura da cadeia beta. Em algumas modalidades, a estrutura secundária é gerada pelo PSIPRED, método de previsão da estrutura secundária de alta classificação (Jones DT. (1999) J. Mol. Biol. 292: 195-202).
[0076] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo PtIP-83 compreendendo sequencialmente do terminal N até ao terminal C: uma Região A entre cerca de 200 e cerca de 300 aminoácidos de comprimento, tendo predominantemente uma estrutura secundária não conservada; uma Região B entre cerca de 380 a cerca de 465 aminoácidos de comprimento tendo uma estrutura secundária de consenso compreendendo nove segmentos de predominantemente estrutura de hélice alfa; e uma Região C entre cerca de 150 a cerca de 180 aminoácidos de comprimento tendo uma estrutura secundária de
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98/525 consenso compreendendo sete segmentos de predominantemente estrutura de cadeia beta.
[0077] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptideo PtIP-83 compreendendo sequencialmente do terminal N até ao terminal C: uma Região A entre cerca de 200 e cerca de 300 aminoácidos de comprimento, tendo uma estrutura secundária de consenso flexível, em que a Região A compreende uma cadeia beta 1 (pia) conservada entre cerca de 4 e cerca de 12 aminoácidos de comprimento dentro de cerca do resíduo de aminoácido 30 a cerca do resíduo de aminoácido 130 a partir do terminal N do polipeptideo PTIP-83; uma Região B entre cerca de 380 a cerca de 465 aminoácidos de comprimento tendo uma estrutura secundária de consenso compreendendo nove segmentos de predominantemente estrutura de hélice alfa; e uma Região C entre cerca de 150 a cerca de 180 aminoácidos de comprimento tendo uma estrutura secundária de consenso compreendendo sete segmentos de predominantemente estrutura de cadeia beta.
[0078] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptideo PtIP-83 compreendendo sequencialmente do terminal N até ao terminal C: uma Região A entre cerca de 200 e cerca de 300 aminoácidos de comprimento, tendo uma estrutura secundária de consenso flexível, em que a Região A compreende uma cadeia beta 1 (pia) conservada entre cerca de 4 e cerca de 12 aminoácidos de comprimento, uma espiral entre cerca de 3 e cerca de 18 aminoácidos de comprimento e uma cadeia beta 2 (plb) entre cerca de 4 e cerca de 32 aminoácidos de comprimento, dentro de cerca do resíduo de aminoácido 50 a cerca do resíduo de aminoácido 165 a partir do terminal N do
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99/525 polipeptídeo PTIP-83; uma Região B entre cerca de 380 a cerca de 465 aminoácidos de comprimento tendo uma estrutura secundária de consenso compreendendo nove segmentos de predominantemente estrutura de hélice alfa; e uma Região C entre cerca de 150 a cerca de 180 aminoácidos de comprimento tendo uma estrutura secundária de consenso compreendendo sete segmentos de predominantemente estrutura de cadeia beta.
[0079] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo PtIP-83 compreendendo sequencialmente do terminal N até ao terminal C: uma Região A entre cerca de 200 e cerca de 300 aminoácidos de comprimento tendo uma estrutura secundária predominantemente não conservada; uma Região B entre cerca de 380 a cerca de 465 aminoácidos de comprimento tendo uma estrutura secundária de consenso compreendendo sequencialmente: i) uma hélice alfa-1 entre cerca de 10 e cerca de 26 aminoácidos de comprimento; ii) uma espiral1 entre cerca de 2 e cerca de 8 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-1 e hélice alfa-2; iii) uma hélice alfa-2 entre cerca de 15 e cerca de 24 aminoácidos de comprimento; iv) uma espiral-2 entre cerca de 4 e cerca de 14 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-2 e hélice alfa-3; v) uma hélice alfa 3 entre cerca de 15 e cerca de 27 aminoácidos de comprimento; vi) uma espiral-3 entre cerca de 11 e cerca de 13 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-3 e hélice alfa-4; vii) uma hélice alfa-4 com cerca de 180 aminoácidos de comprimento; viii) uma espiral-4 entre cerca de 4 e cerca de 5 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-4 e hélice alfa-5; ix) uma hélice alfa-5 entre cerca de 50 e cerca de 54 aminoácidos de comprimento; x) uma espiral-5 entre
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100/525 cerca de 11 e cerca de 17 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-5 e hélice alfa-6; xi) uma hélice alfa-6 entre cerca de 15 e cerca de 16 aminoácidos de comprimento; xii) uma espiral-6 entre cerca de 6 e cerca de 9 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-6 e hélice alfa-7; xiii) uma hélice alfa-7 entre cerca de 49 e cerca de 55 aminoácidos de comprimento; xiv) uma espiral-7 entre cerca de 3 e cerca de 8 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-7 e hélice alfa-8; xv) uma hélice alfa-8 entre cerca de 33 e cerca de 36 aminoácidos de comprimento; xvi) uma espiral-8 entre cerca de 14 e cerca de 16 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-8 e hélice alfa-9; xvii) uma hélice alfa-9 entre cerca de 16 e cerca de 23 aminoácidos de comprimento; xviii) uma espiral9 entre cerca de 21 e cerca de 28 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-9 e Região C; e uma Região C entre cerca de 150 a cerca de 180 aminoácidos de comprimento tendo uma estrutura secundária de consenso compreendendo sete segmentos predominantemente de estrutura de cadeia beta.
[0080] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptideo PtIP-83 compreendendo sequencialmente do terminal N até ao terminal C: uma Região A entre cerca de 200 a cerca de 300 aminoácidos de comprimento tendo uma estrutura secundária predominantemente não conservada; uma Região B entre cerca de 380 a cerca de 465 aminoácidos de comprimento tendo uma estrutura secundária de consenso compreendendo nove segmentos de predominantemente estrutura de hélice alfa; e uma Região C entre cerca de 150 a cerca de 180 aminoácidos de comprimento tendo uma estrutura secundária de consenso compreendendo sequencialmente: 1) uma cadeia beta-1
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101/525 (βΐ) entre cerca de 3 aminoácidos e cerca de 5 aminoácidos de comprimento; ii) uma espiral entre cerca de 13 aminoácidos e cerca de 17 aminoácidos de comprimento; iii) uma cadeia beta-2 (β2) entre cerca de 7 aminoácidos e cerca de 11 aminoácidos de comprimento; iv) uma espiral entre cerca de 17 aminoácidos e cerca de 23 aminoácidos de comprimento; v) uma cadeia beta-3 (β3) entre cerca de 5 aminoácidos e cerca de 7 aminoácidos de comprimento; vi) uma espiral entre cerca de 12 aminoácidos e cerca de 14 aminoácidos de comprimento; vii) uma cadeia beta-4 (β4) entre cerca de 5 aminoácidos e cerca de 6 aminoácidos em comprimento; viii) uma espiral entre cerca de 2 aminoácidos e cerca de 7 aminoácidos de comprimento; ix) uma cadeia beta-5 (β5) entre cerca de 5 aminoácidos e cerca de 7 aminoácidos de comprimento; x) uma espiral entre cerca de 26 aminoácidos e cerca de 28 aminoácidos de comprimento; xi) uma cadeia beta-6 (β6) entre cerca de 5 aminoácidos e cerca de 7 aminoácidos de comprimento; xii) uma espiral entre cerca de 16 aminoácidos e cerca de 20 aminoácidos de comprimento; e xiii) uma cadeia beta1 (β7) entre cerca de 13 aminoácidos e cerca de 17 aminoácidos de comprimento.
[0081] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo PtIP-83 compreendendo sequencialmente do terminal N até ao terminal C: uma Região A entre cerca de 200 e cerca de 300 aminoácidos de comprimento tendo uma estrutura secundária predominantemente não conservada; uma Região B entre cerca de 380 a cerca de 465 aminoácidos de comprimento tendo uma estrutura secundária de consenso compreendendo sequencialmente: i) uma hélice alfa-1 entre cerca de 10 e cerca de 26 aminoácidos de comprimento; ii) uma espiralPetição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 105/553
102/525 entre cerca de 2 e cerca de 8 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-1 e hélice alfa-2; iii) uma hélice alfa-2 entre cerca de 15 e cerca de 24 aminoácidos de comprimento; iv) uma espiral-2 entre cerca de 4 e cerca de 14 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-2 e hélice alfa-3; v) uma hélice alfa 3 entre cerca de 15 e cerca de 27 aminoácidos de comprimento; vi) uma espiral-3 entre cerca de 11 e cerca de 13 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-3 e hélice alfa-4; vii) uma hélice alfa-4 com cerca de 180 aminoácidos de comprimento; viii) uma espiral-4 entre cerca de 4 e cerca de 5 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-4 e hélice alfa-5; ix) uma hélice alfa-5 entre cerca de 50 e cerca de 54 aminoácidos de comprimento; x) uma espiral-5 entre cerca de 11 e cerca de 17 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-5 e hélice alfa-6; xi) uma hélice alfa-6 entre cerca de 15 e cerca de 16 aminoácidos de comprimento; xii) uma espiral-6 entre cerca de 6 e cerca de 9 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-6 e hélice alfa-7; xiii) uma hélice alfa-7 entre cerca de 49 e cerca de 55 aminoácidos de comprimento; xiv) uma espiral-7 entre cerca de 3 e cerca de 8 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-7 e hélice alfa-8; xv) uma hélice alfa-8 entre cerca de 33 e cerca de 36 aminoácidos de comprimento; xvi) uma espiral-8 entre cerca de 14 e cerca de 16 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-8 e hélice alfa-9; xvii) uma hélice alfa-9 entre cerca de 16 e cerca de 23 aminoácidos de comprimento; xviii) uma espiral9 entre cerca de 21 e cerca de 28 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-9 e Região C; e uma Região C entre cerca de 150 a cerca de 180 aminoácidos de comprimento tendo uma
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103/525 estrutura secundária de consenso compreendendo sequencialmente: 1) uma cadeia beta-1 (βΐ) entre cerca de 3 aminoácidos e cerca de 5 aminoácidos de comprimento; ii) uma espiral entre cerca de 13 aminoácidos e cerca de 17 aminoácidos de comprimento; iii) uma cadeia beta-2 (β2) entre cerca de 7 aminoácidos e cerca de 11 aminoácidos de comprimento; iv) uma espiral entre cerca de 17 aminoácidos e cerca de 23 aminoácidos de comprimento; v) uma cadeia beta-3 (β3) entre cerca de 5 aminoácidos e cerca de 7 aminoácidos de comprimento; vi) uma espiral entre cerca de 12 aminoácidos e cerca de 14 aminoácidos de comprimento; vii) uma cadeia beta-4 (β4) entre cerca de 5 aminoácidos e cerca de 6 aminoácidos em comprimento; viii) uma espiral entre cerca de 2 aminoácidos e cerca de 7 aminoácidos de comprimento; ix) uma cadeia beta-5 (β5) entre cerca de 5 aminoácidos e cerca de 7 aminoácidos de comprimento; x) uma espiral entre cerca de 26 aminoácidos e cerca de 28 aminoácidos de comprimento; xi) uma cadeia beta-6 (β6) entre cerca de 5 aminoácidos e cerca de 7 aminoácidos de comprimento; xii) uma espiral entre cerca de 16 aminoácidos e cerca de 20 aminoácidos de comprimento; e xiii) uma cadeia beta-1 (β7) com cerca de 13 aminoácidos e cerca de 17 aminoácidos de comprimento.
[0082] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptideo PtIP-83 compreendendo sequencialmente do terminal N até ao terminal C: uma região A entre cerca de 200 a cerca de 300 aminoácidos de comprimento tendo uma estrutura secundária de consenso flexível, em que a região A compreende uma cadeia beta 1 (βΐη) conservada entre cerca de 4 e cerca de 12 aminoácidos de comprimento dentro de cerca do resíduo aminoácido 30 a cerca do resíduo de aminoácido
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130 a partir do terminal N do polipepetideo PtIP-83; uma Região B entre cerca de 380 a cerca de 465 aminoácidos de comprimento tendo uma estrutura secundária de consenso compreendendo sequencialmente: i) uma hélice alfa-1 entre cerca de 10 e cerca de 26 aminoácidos de comprimento; ii) uma espiral-1 entre cerca de 2 e cerca de 8 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-1 e hélice alfa-2; iii) uma hélice alfa-2 entre cerca de 15 e cerca de 24 aminoácidos de comprimento; iv) uma espiral- entre cerca de 4 e cerca de 14 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-2 e hélice alfa-3; v) uma hélice alfa entre cerca de 15 e cerca de 27 aminoácidos de comprimento; vi) uma espiral-3 entre cerca de 11 e cerca de 13 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-3 e hélice alfa-4; vii) uma hélice alfa-4 com cerca de 180 aminoácidos de comprimento;
viii) uma espiral-4 entre cerca de 4 e cerca de 5 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-4 e hélice alfa-5; ix) uma hélice alfa-5 entre cerca de 50 e cerca de 54 aminoácidos de comprimento; x) uma espiral-5 entre cerca de 11 e cerca de 17 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-5 e hélice alfa-6; xi) uma hélice alfa-6 entre cerca de 15 e cerca de 16 aminoácidos de comprimento; xii) uma espiral-6 entre cerca de 6 e cerca de 9 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-6 e hélice alfa-7; xiii) uma hélice alfa-7 entre cerca de 49 e cerca de 55 aminoácidos de comprimento; xiv) uma espiral-7 entre cerca de 3 e cerca de 8 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-7 e hélice alfa-8; xv) uma hélice alfa-8 entre cerca de 33 e cerca de 36 aminoácidos de comprimento; xvi) uma espiral-8 entre cerca de 14 e cerca de 16 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-8 e hélice
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105/525 alfa-9; xvii) uma hélice alfa-9 entre cerca de 16 e cerca de 23 aminoácidos de comprimento; xviii) uma espiral-9 entre cerca de 21 e cerca de 28 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-9 e Região C; e uma Região C entre cerca de 150 a cerca de 180 aminoácidos de comprimento tendo uma estrutura secundária de consenso compreendendo sequencialmente: i) uma cadeia beta-1 (βΐ) entre cerca de 3 aminoácidos e cerca de 5 aminoácidos de comprimento; ii) uma espiral entre cerca de 13 aminoácidos e cerca de 17 aminoácidos de comprimento; iii) uma cadeia beta-2 (β2) entre cerca de 7 aminoácidos e cerca de 11 aminoácidos de comprimento; iv) uma espiral entre cerca de 17 aminoácidos e cerca de 23 aminoácidos de comprimento; v) uma cadeia beta-3 (β3) entre cerca de 5 aminoácidos e cerca de 7 aminoácidos de comprimento; vi) uma espiral entre cerca de 12 aminoácidos e cerca de 14 aminoácidos de comprimento; vii) uma cadeia beta-4 (β4) entre cerca de 5 aminoácidos e cerca de 6 aminoácidos em comprimento; viii) uma espiral entre cerca de 2 aminoácidos e cerca de 7 aminoácidos de comprimento; ix) uma cadeia beta-5 (β5) entre cerca de 5 aminoácidos e cerca de 7 aminoácidos de comprimento; x) uma espiral entre cerca de 26 aminoácidos e cerca de 28 aminoácidos de comprimento; xi) uma cadeia beta-6 (β6) entre cerca de 5 aminoácidos e cerca de 7 aminoácidos de comprimento; xii) uma espiral entre cerca de 16 aminoácidos e cerca de 20 aminoácidos de comprimento; e xiii) uma cadeia beta1 (β7) com cerca de 13 aminoácidos e cerca de 17 aminoácidos de comprimento.
[0083] Também são fornecidas moléculas de ácido nucleico que codificam produtos de transcrição e/ou tradução que são subsequentemente encadeados para produzir finalmente
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106/525 polipeptídeos PtIP-83 funcionais. A união pode ser alcançada in vitro ou in vivo, e pode envolver unir cis ou trans. O substrato para a união pode consistir em polinucleotídeos (por exemplo, transcritos de RNA) ou polipeptídeos. Um exemplo de união cis de um polinucleotideo é quando um intron inserido em uma sequência de codificação é removido e as duas regiões de éxons de flanqueamento são unidas para gerar uma sequência de codificação do polipeptídeo PtIP-83. Um exemplo de união trans seria quando um polinucleotideo é encriptado separando-se a sequência de codificação em dois ou mais fragmentos que podem ser separadamente transcritos e, então, submetidos à união para formar a sequência de codificação pesticida de comprimento completo. O uso de uma sequência de melhoramento da união, a qual pode ser introduzida em um construto, pode facilitar a união em uma união cis ou trans de polipeptídeos (Patente dos EUA N° 6,365,377 e 6,531,316). Portanto, em algumas modalidades, os polinucleotídeos não codificam diretamente um polipeptídeo PtIP83 de comprimento completo, mas codificam um fragmento ou fragmentos de um polipeptídeo PtIP-83. Esses polinucleotídeos podem ser usados para expressar um polipeptídeo PtIP-83 funcional através de um mecanismo que envolve união, em que a união pode ocorrer ao nível do polinucleotideo (por exemplo, íntron/éxon) e/ou do polipeptídeo (por exemplo, inteína/exteína). Isso pode ser útil, por exemplo, no controle de expressão de atividade pesticida, visto que um polipeptídeo pesticida funcional será apenas expresso se todos os fragmentos exigidos forem expressos em um ambiente que permite os processos de união para gerar o produto funcional. Em outro exemplo, a introdução de uma ou mais sequências de inserção em um
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107/525 polinucleotídeo pode facilitar a recombinação com um polinucleotídeo de homologia baixa; o uso de um íntron ou inteína para a sequência de inserção facilita a remoção da sequência interveniente, restaurando, assim, a função da variante codificada.
[0084] Moléculas de ácidos nucleicos que são fragmentos dessas sequências de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos PtIP-83 também são abrangidas pelas modalidades. Fragmento, conforme usado no presente documento, se refere a uma porção da sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo PtIP-83. Um fragmento de uma sequência de ácido nucleico pode codificar uma porção biologicamente ativa de um polipeptídeo PtIP-83, ou o mesmo pode ser um fragmento que pode ser usado como uma sonda de hibridização ou iniciador de PCR com o uso de métodos divulgados abaixo. As moléculas de ácido nucleico que são fragmentos de uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo PtIP-83 compreendem pelo menos cerca de 150, 180, 210, 240, 270, 300, 330 ou 360, nucleotídeos contíguos ou até o número de nucleotídeos presentes em uma sequência de ácido nucleico de comprimento total que codifica um polipeptídeo PtIP-83 divulgado no presente documento, dependendo do uso pretendido. Nucleotídeos contíguos é usado no presente documento para se referir a resíduos de nucleotídeos que são imediatamente adjacentes uns aos outros. Os fragmentos das sequências de ácidos nucleicos das modalidades irão codificar fragmentos de proteína que retêm a atividade biológica do polipeptídeo PtIP-83 e, por isso, retêm a atividade inseticida. Retém atividade inseticida é usado no presente documento para se referir a um polipeptídeo que tem pelo menos cerca de 10%,
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108/525 pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70%, 80%, 90%, 95% ou mais da atividade inseticida do polipeptídeo PtIP-83Aa de comprimento total (SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a atividade inseticida é atividade de Lepidópteros. Em uma modalidade, a atividade inseticida é contra uma espécie de Coleópteros. Em algumas modalidades, a atividade inseticida é contra uma ou mais pragas de insetos do complexo de lagarta da raiz do milho: lagarta da raiz do milho do oeste, Diabrotáca vírgífera; lagarta da raiz do milho do norte, D. barberí: verme da raiz do milho do sul ou broca-de-raiz; Diabrotáca undecímpunctata howardí e o verme de raiz do milho mexicano, D. virgifera zeae. Em uma modalidade, a atividade inseticida é contra uma espécie de Díabrotíca.
[0085] Em algumas modalidades, um fragmento de uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo PtIP83 que codifica uma porção biologicamente ativa de uma proteína codificara pelo menos cerca de 15, 20, 30, 50, 75, 100, 125 aminoácidos contíguos ou até o número total de aminoácidos presentes em um polipeptídeo PtIP-83 de comprimento total das modalidades. Em algumas modalidades, o fragmento é um truncamento no terminal N e/ou terminal C de pelo menos cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,
19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, ou mais aminoácidos do terminal
SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO
17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 2
716, SEQ ID NO: 754, SEQ ID NO:
757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO:
27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 N e/ou terminal C em relação a
ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID : 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NO: 760, SEQ ID NO:
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761, SEQ ID NO: 762, SEQ ID NO: 763, SEQ ID NO: 764, SEQ ID NO: 765, SEQ ID NO: 766, SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO: 768, SEQ ID NO: 769 ou SEQ ID NOs: 958-1026, ou suas variantes, por exemplo, por proteólise, inserção de um códon inicial, deleção dos códons que codificam os aminoácidos deletados com a inserção concomitante de um códon de terminação ou por inserção de um códon de terminação na sequência codificadora. Em algumas modalidades, os fragmentos agui englobados resultam da remoção dos aminoácidos do terminal N 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais a partir do terminal N em relação a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID
NO: 23, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO: 754, SEQ ID NO: 755, SEQ ID
NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID
NO: 760, SEQ ID NO: 761, SEQ ID NO: 762, SEQ ID NO: 763, SEQ ID
NO: 764, SEQ ID NO: 765, SEQ ID NO: 766, SEQ ID NO: 767, SEQ ID
NO: 768, SEQ ID NO: 769, SEQ ID NOs: 958- 1026, OU suas variantes,
por exemplo, por proteólise ou por inserção de um codão de iniciação na sequência de codificação. Em algumas modalidades, os fragmentos aqui englobados resultam da remoção dos aminoácidos do terminal N 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 em relação a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO: 754, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NO: 760, SEQ ID NO: 761, SEQ ID NO: 762, SEQ ID NO: 763, SEQ ID NO: 764, SEQ ID NO: 765, SEQ ID NO: 766, SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO:
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768, SEQ ID NO: 769, ou SEQ ID NOs: 958-1026, ou suas variantes, por exemplo, por proteólise ou por inserção de um codão de iniciação na sequência de codificação.
[0086] Em algumas modalidades, o polipeptideo PtIP-83 é codificado por uma sequência de ácido nucleico suficientemente homóloga à sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2, SEQ ID
NO: 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12,
SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: : 16, SEQ : ID NO: 18, SEC ) ID NO: 2 0, SEQ
ID : NO: 22, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO >: 717, SEQ ID NO: 738, SEQ ID
NO: 739, SEQ ID NO: 740, SEQ ID NO : 741, SEQ ID NO: 742, SEQ ID
NO: 743, SEQ ID NO: 744, SEQ ID NO : 745, SEQ ID NO: 746, SEQ ID
NO: 747, SEQ ID NO: 748, SEQ ID NO : 749, SEQ ID NO: 750, SEQ ID
NO: 751, SEQ ID NO: 752, SEQ ID NO: 753, ou SEQ ID NOs: 9581026. Suficientemente homólogo é usado no presente documento para se referir a uma sequência de aminoácidos ou ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de homologia de sequência em comparação com uma sequência de referência com o uso de um dos programas de alinhamento descritos no presente documento com o uso de parâmetros padrão. Um indivíduo versado na técnica reconhecerá que esses valores podem ser apropriadamente ajustados para determinar homologia correspondente de proteínas codificadas pelas duas sequências de ácido nucleico levando-se em consideração a degeneracidade de códon, similaridade de aminoácido, posicionamento de quadro de leitura e similares.
[0087]
Em algumas modalidades, a homologia de sequência é contra a sequência de comprimento completo do polinucleotideo
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111/525 que codifica um polipeptideo PtIP-83 ou contra a sequência de comprimento completo de um polipeptideo PtIP-83.
[0088] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica um polipeptideo PtIP-83 é selecionado de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, qualquer uma de SEQ ID NO: 172-235, qualquer uma de SEQ ID NO: 300-333, qualquer uma de SEQ ID NO: 368-397, qualquer uma de SEQ ID NO: 428-517, SEQ ID NO: 717, qualquer uma dentre a SEQ ID NO: 718-727 e qualquer uma de SEQ ID NO: 738-753.
[0089] Em algumas modalidades, o ácido nucleico codifica um polipeptideo PtIP-83 tendo, pelo menos, cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência em comparação com SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO: 754, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NO: 760, SEQ ID NO: 761, SEQ ID NO: 762, SEQ ID NO: 763, SEQ ID NO: 764, SEQ ID NO: 765, SEQ ID NO: 766, SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO: 768 ou SEQ ID NO: 769. Em algumas modalidades, a identidade de sequência é calculada usando o algoritmo ClustalW do módulo ALIGNX® do Pacote de Programas Vector NTI® (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Calif.) com todos os parâmetros predeterminados. Em algumas modalidades, a identidade de sequência é pelo comprimento completo do polipeptideo calculado com o uso de algoritmo ClustalW no módulo
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ALIGNX do Pacote de Programa Vector NTI (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Calif.) com todos os parâmetros padrão.
[0090] Para determinar a identidade percentual de duas sequências de aminoácidos ou das duas sequências de ácido nucleico, as sequências são alinhadas aos propósitos de comparação ideais. A identidade percentual entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (isto é, identidade percentual = número de posições idênticas/número total de posições (por exemplo, posições em sobreposição) χ100) . Em uma modalidade, as duas sequências têm o mesmo comprimento. Em outra modalidade, a comparação é pela totalidade da sequência de referência (por exemplo, pela totalidade da SEQ ID NO: 1). A identidade percentual entre duas sequências pode ser determinada com o uso de técnicas similares àquelas descritas abaixo, com ou sem permissão de intervalos. Ao calcular a identidade percentual, tipicamente correspondências exatas são contadas.
[0091] A determinação da identidade percentual entre duas sequências pode ser alcançada com o uso de um logaritmo matemático. Um exemplo não limitante de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de duas sequências é o algoritmo de Karlin e Altschul, (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:2264, modificado como em Karlin e Altschul, (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-5877. Tal algoritmo é incorporado aos programas BLASTN e BLASTX de Altschul, et al. , (1990) J. Mol. Biol. 215:403. As buscas por nucleotídeo com BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTN, pontuação = 100, comprimento de palavra = 12, para obter sequências de ácido nucleico homólogas às moléculas de ácido nucleico pesticidas das modalidades. As
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113/525 buscas por proteína com BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTX, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3, para obter sequências de aminoácidos homólogas a moléculas de proteína pesticida das modalidades. Para obter alinhamentos incompletos para propósitos de comparação, Gapped BLAST (em BLAST 2.0) pode ser utilizado conforme descrito em Altschul, et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3.389. Alternativamente, PSI-Blast pode ser usado para realizar uma busca iterada que detecta relações distantes entre moléculas. Consultar Altschul, et al. , (1997) supra. Ao utilizar os programas BLAST, Gapped BLAST e PSI-Blast, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, BLASTX e BLASTN) podem ser usados. O alinhamento também pode ser realizado manualmente por inspeção.
[0092] Outro exemplo não limitante de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo ClustalW (Higgins, et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). ClustalW compara sequências e alinha a totalidade do aminoácido ou sequência de DNA e, portanto, pode fornecer dados sobre a conservação de sequência de toda a sequência de aminoácidos. O algoritmo ClustalW é usado em diversos pacotes de software de análise de aminoácido/DNA comercialmente disponíveis, tais como, o módulo ALIGNX® do Pacote de Programas Vector NTI® (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Calif.). Depois do alinhamento das sequências de aminoácidos com ClustalW, a identidade de aminoácido percentual pode ser avaliada. Um exemplo não limitante de um programa de software útil para a análise de alinhamentos ClustalW é GENEDOC™. GENEDOC™ (Karl Nicholas) permite avaliação da similaridade e da identidade de aminoácido (ou DNA) entre múltiplas proteínas. Outro exemplo não
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114/525 limitante de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo de Myers eMiller, (1988) CABIOS 4:1117. Tal algoritmo é incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), que é parte do Pacote de Software GCG Wisconsin Genetics, Versão 10 (disponível junto a Accelrys, Inc., 9685 Scranton Rd., San Diego, Calif., EUA). Ao utilizar o programa ALIGN para comparar sequências de aminoácidos, uma tabela de resíduo de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de vão de 12 e uma penalidade de vão de 4 podem ser usadas.
[0093] Outro exemplo não limitante de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo de Needleman e Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443453, usou software GAP Versão 10 para determinar a identidade de sequência ou similaridade com o uso dos seguintes parâmetros padrão: % de identidade e % de similaridade para uma sequência de ácido nucleico com o uso de GAP Peso de 50 e Peso de Comprimento de 3, e a matriz de pontuação de nwsgapdna.cmpii; % de identidade ou % de similaridade para uma sequência de aminoácidos com o uso de Peso de GAP de 8 e peso de comprimento de 2 e o programa de pontuação BLOSUM62. Os programas equivalentes podem também ser usados. Programa equivalente é usado no presente documento para se referir a qualquer programa de comparação de sequência que, para quaisquer duas sequências em questão, gera um alinhamento que tem combinações de resíduo de nucleotídeo idênticas e uma identidade de sequência percentual idêntica quando em comparação com o alinhamento correspondente gerado por GAP Versão 10.
[0094] As modalidades também abrangem moléculas de ácidos nucleicos que codificam variantes do polipeptideo PtlP
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83. Variantes das sequências de ácidos nucleicos que codificam polipeptideo PtIP-83 incluem aquelas sequências que codificam os polipeptídeos PtIP-83 divulgados no presente documento, mas que diferem conservativamente devido à degenerescência do código genético, assim como aquelas que são suficientemente idênticas conforme discutido acima. As variantes alélicas de ocorrência natural podem ser identificadas com o uso de técnicas de biologia molecular conhecidas, tais como reação em cadeia da polimerase (PCR) e técnicas de hibridização conforme delineado acima. As sequências de ácidos nucleicos variantes também incluem sequências de ácidos nucleicos sinteticamente derivadas que foram geradas, por exemplo, com o uso de mutagênese sítiodirigida mas que ainda codificam os polipeptídeos PtIP-83 divulgados conforme discutido abaixo.
[0095] A presente divulgação fornece polinucleotídeos isolados ou recombinantes que codificam qualquer um dos polipeptídeos PtIP-83 divulgados no presente documento. Aqueles indivíduos que têm habilidade comum na técnica irão observar prontamente que devido à degenerescência do código genético existe uma multiplicidade de sequências de nucleotídeos que codificam polipeptídeos PtIP-83 da presente divulgação. A Tabela 1 é uma tabela de códons que fornece os códons sinônimos para cada aminoácido. Por exemplo, todos os códons AGA, AGG, CGA, CGC, CGG e CGU codificam o aminoácido arginina. Desse modo, em todas as posições nos ácidos nucleicos da divulgação em que uma arginina é especificada por um códon, o códon pode ser alterado em qualquer um dos códons correspondentes descritos acima sem alterar o polipeptideo codificado. É entendido que U em uma sequência de RNA corresponde a T em uma sequência de DNA.
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Tabela 1
Alanina Ala A GCA GCC GCG GC
Cisteina Cys UGC UGU
Ácido
Asp D GAC GAU
aspártico
Ácido
Glu E GAA GAG
glutâmico
FenilalaninaPhe F UUC UUU
Glicina Gly G GGA GGC GGG GGU
Histidina His GAC GAU
Isoleucina 11 I AUA AUG AUU
Lisina Lys K AAA AAG
Leucina Leu L UUA UUG GUA GUC GUG CO
Metionina Me M AUG
Asparagina Asn N AAC AAU
Prolina Pro P GCA GCC GCG GGU
Glutamina Gin Q GAA GAG
Arginina Arg R AGA AGG GGA GGC GGG GGU
Serina Ser S AGC AGU UCA UGC UCG UGC
Treonina Thr T AGA AGC AGG AGU
Valina Vai V GUA GUC GUG GUU
Triptofano Trp W TGG
Tirosina Tyr Y UAC UAU
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117/525 [0096] O perito na técnica irá também apreciar que mudanças podem ser introduzidas por mutação das sequências de ácidos nucleicos, o que leva a mudanças na sequência de aminoácidos dos polipeptídeos PtIP-83 codificados, sem alterar a atividade biológica das proteínas. Deste modo, as moléculas de ácidos nucleicos variantes podem ser criadas pela introdução de uma ou mais substituições, adições e/ou deleções de nucleotídeos na correspondente sequência de ácidos nucleicos aqui descrita, de tal modo que uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácidos sejam introduzidas na proteína codificada. As mutações podem ser introduzidas por técnicas convencionais, tais como mutagênese sitio-dirigida e mutagênese mediada por PCR. Tais sequências variantes de ácido nucleico são também abrangidas pela presente divulgação.
[0097] Alternativamente, as sequências de ácidos nucleicos variantes podem ser preparadas introduzindo mutações aleatoriamente ao longo de toda ou parte da sequência de codificação, como por mutagênese por saturação, e os mutantes resultantes podem ser analisados quanto à capacidade para conferir atividade pesticida com o propósito de identificar mutantes que retêm a atividade. Após a mutagênese, a proteína codificada pode ser expressa de modo recombinante e a atividade da proteína pode ser determinada com o uso de técnicas de ensaio padrão.
[0098] Os polinucleotídeos da divulgação e fragmentos dos mesmos são opcionalmente usados como substratos para uma variedade de reações de recombinação e recombinação recursiva, além de métodos de clonagem padrão, conforme estabelecido, por exemplo, em Ausubel, Berger e Sambrook, isto é, para produzir
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118/525 homólogos de polipeptideos pesticidas adicionais e fragmentos dos mesmos com propriedades desejadas. Uma variedade de tais reações é conhecida, incluindo aquelas desenvolvidas pelos inventores e seus colegas de trabalho. Os métodos para produzir uma variante de qualquer ácido nucleico listados no presente documento que compreendem recombinar de modo recursive tal polinucleotideo com um segundo (ou mais) polinucleotideo, formando, desse modo, uma biblioteca de polinucleotideos variantes, também são modalidades da divulgação, assim como as bibliotecas produzidas, as células que compreendem as bibliotecas e qualquer polinucleotideo recombinante produzido por tais métodos. Adicionalmente, tais métodos compreendem opcionalmente selecionar um polinucleotideo variante de tais bibliotecas com base na atividade pesticida, em que tal combinação recursiva é feita in vitro ou in vivo.
[0099] Uma variedade de protocolos geradores de diversidade, incluindo protocolos de recombinação recursiva de ácidos nucleicos, estão disponíveis e completamente descritos na técnica. Os procedimentos podem ser usados separadamente e/ou em combinação para produzir uma ou mais variantes de um ácido nucleico ou conjunto de ácidos nucleicos, assim como variantes de proteínas codificadas. Individual e coletivamente, esses procedimentos fornecem maneiras amplamente aplicáveis e robustas para gerar ácidos nucleicos diversificados e conjuntos de ácidos nucleicos (incluindo, por exemplo, bibliotecas de ácidos nucleicos) úteis, por exemplo, para a manipulação ou evolução rápida de ácidos nucleicos, proteínas, vias, células e/ou organismos com características novas e/ou melhoradas.
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119/525 [0100] Embora distinções e classificações sejam feitas no decorrer da discussão por clareza, será notado que as técnicas normalmente não são mutuamente exclusivas. Certamente, os vários métodos podem ser usados unicamente ou em combinação, em paralelo ou em série, para acessar diversas variantes de sequência.
[0101] O resultado de qualquer um dos procedimentos de geração de diversidade descritos no presente documento pode ser a geração de um ou mais ácidos nucleicos, os quais podem ser selecionados ou triados para ácidos nucleicos com ou que conferem propriedades desejáveis ou que codificam proteínas com ou que conferem propriedades desejáveis. Após a diversificação por um ou mais dos métodos no presente documento ou disponíveis de outro modo para uma pessoa versada na técnica, quaisquer ácidos nucleicos que são produzidos podem ser selecionados para uma atividade ou propriedade desejada, por exemplo, atividade pesticida ou tal atividade a um pH desejado, etc. Isso pode incluir identificar qualquer atividade que pode ser detectada, por exemplo, em um formato automatizado ou automatizável, por qualquer um dentre os ensaios da técnica, consultar, por exemplo, a discussão de triagem de atividade inseticida, infra. Uma variedade de propriedades relacionadas (ou até mesmo não relacionadas) pode ser avaliada, em série ou em paralelo, a critério do praticante.
[0102] As descrições de uma variedade de procedimentos de geração de diversidade para gerar sequências de ácido nucleico modificado, por exemplo, aquelas que codificam polipeptídeos que têm atividade pesticida ou fragmentos dos mesmos, são encontradas nas publicações a seguir e nas referências citadas nas mesmas: Soong, et al. , (2000) Nat Genet 25(4) :436-439;
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[0103] Métodos de mutação para gerar diversidade incluem, por exemplo, mutagênese dirigida a sítios (Ling, et al., (1997) Anal Biochem 254 (2):157-178; Dale, et al. , (1996) Methods Mol Biol 57:369-374; Smith, (1985) Ann Rev Genet 19:423462; Botstein e Shortle, (1985) Science 229:1193-1201; Carter, (1986) Biochem J 237:1-7 e Kunkel, (1987) The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein e Lilley, eds., Springer Verlag, Berlin)); mutagenesis using uracil containing templates (Kunkel, (1985) PNAS USA 82:488-492; Kunkel, et al., (1987) Methods Enzymol 154:367-382 e Bass, et al., (1988) Science 242:240-245); mutagênese direcionada a oligonucleotideos (Zoller e Smith, (1983) Methods Enzymol 100:468-500; Zoller e Smith, (1987)
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Methods Enzymol 154:329-350 (1987); Zoller e Smith, (1982) Nucleic Acids Res 10:6487-6500), mutagênese de DNA modificado por fosforotiato (Taylor, et al., (1985) Nucl Acids Res 13:87498764; Taylor, et al., (1985) Nucl Acids Res 13:8765-8787 (1985); Nakamaye e Eckstein, (1986) Nucl Acids Res 14:9679-9698; Sayers, et al., (1988) Nucl Acids Res 16:791-802 e Sayers, et al., (1988) Nucl Acids Res 16:803-814) ; mutagênese com o uso de DNA de dúplex incompleto (Kramer, et al., (1984) Nucl Acids Res 12:9441-9456; Kramer e Fritz, (1987) Methods Enzymol 154:350-367; Kramer, et al., (1988) Nucl Acids Res 16:7207 e Fritz, et al., (1988) Nucl Acids Res 16:6987-6999).
[0104] Os métodos adequados adicionais incluem reparo de ponto de emparelhamento errôneo (Kramer, et al., (1984) Cell 38:879-887), mutagênese com o uso de cepas hospedeiras deficientes de reparo (Carter, et al. , (1985) Nucl Acids Res 13:4431-4443 e Carter, (1987) Methods in Enzymol 154:382-403), mutagênese por deleção (Eghtedarzadeh e Henikoff, (1986) Nucl Acids Res 14:5115), seleção de restrição e purificação de restrição (Wells, et al., (1986) Phil Trans R Soc Lond A 317:415423), mutagênese por síntese de gene total (Nambiar, et al., (1984) Science 223:1299-1301; Sakamar e Khorana, (1988) Nucl Acids Res 14:6361-6372; Wells, et al., (1985) Gene 34:315-323 e Grundstrom, et al., (1985) Nucl Acids Res 13:3305-3316), reparo de quebra em fita dupla (Mandecki, (1986) PNAS USA, 83:7177-7181 e Arnold, (1993) Curr Opin Biotech 4:450-455). Os detalhes adicionais de muitos dentre os métodos acima podem ser encontrados em Methods Enzymol Volume 154, que também descreve os controles úteis para a resolução de problemas com vários métodos de mutagênese.
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122/525 [0105] Detalhes adicionais em relação a vários métodos geradores de diversidade podem ser encontrados nas Patentes dos EUA, Pedidos e Publicações PCT e publicações EPO a seguir:
Patente dos EUA N° 5, 723,323, Patente dos EUA N° 5, 763, 192,
Patente dos EUA N° 5, 814,476, Patente dos EUA N° 5, 817, 483,
Patente dos EUA N° 5, 824,514, Patente dos EUA N° 5, 976, 862,
Patente dos EUA N° 5, 605,793, Patente dos EUA N° 5, 811, 238,
Patente dos EUA N° 5, 830,721, Patente dos EUA N° 5, 834, 252,
Patente dos EUA N° 5, 837,458, WO 1995/22625, WO 1996/33207 , WO
1997/20078, WO 1997/35966, WO 1999/41402, WO 1999/41383, WO
1999/41369, WO 1999/41368, EP ' 752008, EP 0932 670, WO 1999/231 07,
WO 1999/21979, WO 1998/31837 , WO 1998/27230, WO 1998/27230, WO
2000/00632, WO 2000/09679, WO 1998/42832, WO 1999/29902, WO
1998/41653, WO 1998/41622, WO 1998/42727, WO 2000/18906, WO
2000/04190, WO 2000/42561, WO 2000/42559, WO 2000/42560, WO
2001/23401 e PCT/US01/06775.
[0106] As sequências de nucleotídeo das modalidades também podem ser usadas para isolar as sequências correspondentes de samambaia ou outras espécies de plantas primitivas, particularmente uma espécie Asplenium, Polypodium, Adiantum, Platycerium, Nephrolepis, Ophioglossum, Colysis, Bolbitis, Blechnum, Selaginella, Lycopodium, e Huperzia. Desta maneira, métodos tais como PCR, hibridação e semelhantes podem ser utilizados para identificar tais sequências com base na sua homologia de sequência com as sequências aqui apresentadas. As sequências que são selecionadas com base na sua identidade de sequência com as sequências inteiras aqui apresentadas ou com fragmentos das mesmas são abrangidas pelas modalidades. Tais sequências incluem sequências que são ortólogos das sequências
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123/525 divulgadas. 0 termo ortólogos se refere a genes derivados de um gene ancestral comum e que são encontrados em diferentes espécies como resultado da especiação. Os genes encontrados em diferentes espécies são considerados ortólogos quando as suas sequências de nucleotídeos e/ou as suas sequências de proteínas codificadas partilham identidade substancial como definido noutro local no presente documento. As funções de ortólogos são frequentemente altamente conservadas entre espécies.
[0107] Em uma abordagem de POR, os iniciadores oligonucleotídeos podem ser concebidos para utilização em reações de POR para amplificar sequências de DNA correspondentes a partir de cDNA ou de DNA genômico extraído de qualquer organismo de interesse. Métodos para projetar iniciadores de POR e clonagem de PCR são geralmente conhecidos na técnica e são divulgados em Sambrook, et al. , (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nova Iorque), mais adiante no presente documento, Sambrook. Também consultar Innis, et al. , eds.
(1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nova Iorque); Innis e Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nova Iorque); e Innis e Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nova Iorque). Métodos conhecidos de PCR incluem, mas não estão limitados a, métodos utilizando iniciadores emparelhados, iniciadores internos, iniciadores específicos individuais, iniciadores degenerados, iniciadores específicos de genes, iniciadores específicos de vetor, iniciadores com desemparelhamento parcial, e semelhantes.
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124/525 [0108] Para identificar os polipeptídeos PtIP-83 potenciais de coleções de samambaia ou musgo, os lisados celulares de samambaia ou musgo podem ser analisados com anticorpos gerados contra polipeptídeos PtIP-83 e/ou polipeptídeos PtIP-83 com o uso de métodos Western blotting e/ou ELISA. Esse tipo de ensaio pode ser realizado em um modo de alto rendimento. As amostras positivas podem ser adicionalmente analisadas por várias técnicas, como purificação e identificação de proteínas com base em anticorpos. Os métodos para gerar anticorpos são bem conhecidos na técnica, conforme discutido abaixo.
[0109] Alternativamente, o método de identificação de proteína baseado em espectrometria de massa pode ser usado para identificar homólogos d polipeptídeosPtIP-83 com o uso de protocolos nas literaturas (Scott Patterson, (1998), 10.22, 124, Current Protocol in Molecular Biology publicado por John Wiley & Son Inc). Especificamente, o método de identificação de proteínas com base em LC-MS/MS é usado para associar os dados de MS de um determinado lisado celular ou amostras enriquecidas de peso molecular desejado (extraídas de gel de SDS-PAGE de bandas de peso molecular relevante para polipeptídeos PtIP-83) com informações de sequência de polipeptídeos PtIP-83 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ
ID NO: 11 SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID
NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO:
754 , SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO:
758 , SEQ ID NO: 759, SEQ ID NO: 760, SEQ ID NO: 761, SEQ ID NO:
762 , SEQ ID NO: 763, SEQ ID NO: 764, SEQ ID NO: 765, SEQ ID NO:
766 , SEQ ID NO : 767, SEQ ID NO : 768 OU SEC ) ID NO: 769 e : seus
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125/525 homólogos. Qualquer correspondência em sequências de peptídeos indica o potencial para ter as proteínas homólogas nas amostras. As técnicas adicionais (purificação de proteína e biologia molecular) podem ser usadas para isolar a proteína e identificar as sequências dos homólogos.
[0110] Em métodos de hibridação, toda ou parte da sequência de ácido nucleico pesticida pode ser usada para analisar cDNA ou bibliotecas genômicas. Métodos para construção de tais bibliotecas de cDNA e genômicas são geralmente conhecidos na técnica e são divulgados em Sambrook e Russell, (2001), supra. As chamadas sondas de hibridização podem ser fragmentos de DNA genômico, fragmentos de cDNA, fragmentos de RNA ou outros oligonucleotídeos e podem ser marcadas com um grupo detectável, tal como 32P ou qualquer outro marcador detectável, como outros radioisótopos, um composto fluorescente, uma enzima ou um cofator enzimático. As sondas para hibridização podem ser produzidas por meio de marcação de oligonucleotídeos sintéticos com base na sequência conhecida de ácidos nucleicos de codificação de polipeptídeos PtIP-83divulgada no presente documento. Iniciadores de degeneração projetados com base em nucleotídeos conservados ou resíduos de aminoácido nas sequências de ácido nucleico ou sequência de aminoácidos codificada podem adicionalmente ser usados. A sonda compreende tipicamente uma região de sequência de ácidos nucleicos que hibridiza em condições estringentes a pelo menos cerca de 12, pelo menos cerca de 25, pelo menos cerca de 50, 75, 100, 125, 150, 175 ou 200 nucleotídeos consecutivos de sequências de ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo PtIP-83 da divulgação ou um seu fragmento ou variante. Métodos para a preparação de sondas
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126/525 para hibridação são geralmente conhecidos na técnica e são divulgados em Sambrook e Russell, (2001), supra, incorporado no presente documento a título de referência.
[0111] Por exemplo, toda uma sequência de ácido nucleico, que codifica um polipeptídeo PtIP-83, divulgada no presente documento ou uma ou mais porções da mesma podem ser usadas como uma sonda com capacidade para hibridizar especificamente as sequências de ácido nucleico correspondentes que codificam sequências do tipo polipeptídeo PtIP-83 e RNAs mensageiros. Para alcançar a hibridização específica sob uma variedade de condições, tais sondas incluem sequências que são únicas e têm preferencialmente pelo menos cerca de 10 nucleotídeos de comprimento ou pelo menos cerca de 20 nucleotídeos de comprimento. Tais sondas podem ser usadas para amplificar sequências pesticidas correspondentes de um organismo escolhido por PCR. Essa técnica pode ser usada para isolar sequências de codificação adicionais de um organismo desejado ou como um ensaio de diagnóstico para determinar a presença de sequências de codificação em um organismo. Técnicas de hibridização incluem análise com hibridação de bibliotecas de DNA plaqueadas (placas ou colônias; ver, por exemplo, Sambrook, et al. , (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.I.) .
[0112] A hibridização de tais sequências pode ser realizada sob condições estringentes. Condições estringentes ou condições de hibridação estringentes é usado no presente documento para se referir a condições sob as quais uma sonda hibridará com a sua sequência-alvo em um grau maior de modo
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127/525 detectável do que com outras sequências (por exemplo, pelo menos 2 vezes sobre o fundo). Condições estringentes dependem da sequência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. Por controle da estringência das condições de hibridização e/ou de lavagem podem ser identificadas sequências-alvo que são 100% complementares à sonda (sondagem homóloga). Alternativamente, condições de estringência podem ser ajustadas para permitir algum desemparelhamento nas sequências de modo que sejam detectados graus mais baixos de similaridade (sondagem heteróloga). Geralmente, uma sonda tem menos de cerca de 1,000 nucleotídeos em comprimento, preferencialmente menos de 500 nucleotídeos em comprimento.
[0113] Tipicamente, as condições estringentes serão aquelas nas quais a concentração de sal é menor que cerca de íon Na a 1,5 M, tipicamente cerca de concentração de íon Na a 0,01 a 1,0 M (ou outros sais) a pH 7,0 a 8,3, e a temperatura é de pelo menos cerca de 30 °C para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60 °C para sondas longas (por exemplo, maiores que 50 nucleotídeos). As condições estringentes também podem ser alcançadas com a adição de agentes desestabilizantes, como formamida. As condições de estringência baixa exemplificativas incluem hibridização com uma solução tampão de formamida a 30 a 35%, NaCI a 1 M, SDS a 1% (dodecil sulfato de sódio) a 37 °C e uma lavagem em 1χ a 2*SSC (20xSSC=NaCl a 3,0 M/citrato trissódico a 0,3 M) a 50 a 55 °C. As condições de estringência moderada exemplificativas incluem hibridização em formamida a 40 a 45%, NaCI a 1,0 M, SDS a 1% a 37 °C e uma lavagem em 0,5χ a IxSSC a 55 a 60 °C. As condições de estringência altas exemplificativas incluem a hibridização em formamida a
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50%, NaCl a 1 M, SDS a 1% a 37 °C e uma lavagem em 0,lxSSC a 60 a 65 °C. Opcionalmente, os tampões de lavagem podem compreender cerca de 0,1% a cerca de SDS a 1%. A duração de hibridização é geralmente menor que cerca de 24 horas, usualmente cerca de 4 a cerca de 12 horas.
[0114] A especificidade é tipicamente a função de lavagens pós-hibridação, em que os fatores críticos são a força iônica e temperatura da solução de lavagem final. Para híbridos DNA-DNA, a Tm pode ser aproximada a partir da equação de Meinkoth e Wahl, (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81,5 °C + 16,6 (log M) + 0,41 (% de GC) - 0,61 (% de form) - 500/L; em que M é a molaridade de cátions monovalentes, % GC é a porcentagem de nucleotídeos guanosina e citosina no DNA, % de form é a porcentagem de formamida na solução de hibridização, e L é o comprimento do híbrido em pares de bases. A Tm é a temperatura (sob força iônica definida e pH) na qual 50% de uma sequênciaalvo complementar hibridiza para uma sonda perfeitamente correspondida. A Tm é reduzida em cerca de 1 °C para cada 1% de emparelhamento errôneo; desse modo, Tm, hibridização e/ou condições de lavagem podem ser ajustadas para hibridizar a sequências da identidade desejada. Por exemplo, se as sequências com ^90% de identidade são buscadas, a Tm pode ser diminuída 10 °C. Geralmente, condições estringentes são selecionadas para serem cerca de 5 °C abaixo do ponto de derretimento térmico (Tm) para a sequência específica e seu complemento em uma força iônica e pH definidos. Entretanto, as condições severamente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 1, 2, 3 ou 4 °C mais baixos que o ponto de fusão térmica (Tm) ; condições moderadamente estringentes podem utilizar uma
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129/525 hibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9 ou 10 °C mais baixos que o ponto de fusão térmica (Tm); as condições de estringência baixa podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 11, 12, 13, 14, 15 ou 20 °C mais baixos que o ponto de fusão térmica (Tm). Com o uso das equação, hibridização e composições de lavagem, e Tm desejada, aqueles de habilidade comum na técnica entenderão que as variações na severidade de hibridização e/ou soluções de lavagem são inerentemente descritas. Se o grau desejado de emparelhamento errôneo resultar em uma Tm de menos de 45 °C (solução aquosa) ou 32 °C (solução de formamida), é preferido aumentar a concentração de SSC para que uma temperatura mais alta possa ser usada. Um guia extensivo para a hibridização de ácidos nucleicos é encontrado em Tijssen, (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization com Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, N.I.); e Ausubel, et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing e Wiley-Interscience, Nova Iorque). Consultar, Sambrook, et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.I.).
[0115] Em algumas modalidades, são fornecidos polinucleotídeos codificando um polipeptideo PtIP-83 compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com qualquer uma de SEQ ID NO: 786-888.
[0116]
Em algumas modalidades, são fornecidos polinucleotídeos codificando um polipeptideo PtIP-83
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130/525 compreendendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ
ID NO: 786-888.
[0117] Em algumas modalidades, o polinucleotideo codificando o polipeptídeo PtIP-83 compreendendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO: 786-888 é uma sequência não genômica.
[0118] Em algumas modalidades, o polinucleotideo codificando o polipeptídeo PtIP-83 compreendendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO: 786-888 é um cDNA.
Proteínas e Variantes e Fragmentos Dos Mesmos [0119] Os polipeptideos PtIP-83 também são abrangidos pela divulgação. Proteína Inseticida 83 de Pterídophyta plipeptídeo PtIP-83 e proteína PtIP-83 conforme usados no presente documento se referem de forma intercambiável a um polipeptídeo que tem atividade inseticida incluindo, mas sem limitação, atividade inseticida contra uma ou mais pragas de inseto das ordens Lepidóptera e/ou Coleóptera, e é suficientemente homólogo à proteína da SEQ ID NO: 1. Uma variedade de polipeptideos PtIP-83 é contemplada. Fontes de polipeptideos PtIP-83 ou proteínas relacionadas são espécies de samambaias selecionadas, mas não limitadas a Polypodíum punctatum, Lygodíum flexuosum, Mícrosorum musífolium, Adíantum peruvíanum, Adíantum trapezíforme e Adíantum pedatum.
[0120]
Suficientemente homólogo é usado no presente documento para se referir a uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 40%, 45%,
57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%,
70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%,
50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%,
63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%,
76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%,
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83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,
96%, 97%, 98%, 99% ou mais de homologia de sequência em comparação a uma sequência de referência com o uso de um entre os programas de alinhamento descritos no presente documento com o uso de parâmetros padrões. Em algumas modalidades, a homologia de sequência é contra a sequência de comprimento completo de um polipeptídeo PtIP-83. Em algumas modalidades, o polipeptídeo
PtIP-83 tem pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência em comparação com a SEQ ID NO: 1. Uma pessoa versada na técnica reconhecerá que esses valores podem ser apropriadamente ajustados para determinar homologia correspondente de proteínas levando em consideração a similaridade de aminoácidos e semelhantes.
[0121] Conforme usados no presente documento, os termos proteína, molécula peptídica ou polipeptídeo incluem qualquer molécula que compreenda cinco ou mais aminoácidos. É bem conhecido na técnica as moléculas de proteína, peptídeo ou polipeptídeo podem ser submetidas a modificação, incluindo modificações pós-tradução como, mas sem limitação, formação de ligação dissulfeto, glicosilação, fosforilação ou oligomerização. Desse modo, conforme usado no presente documento, os termos proteína, molécula peptídica ou polipeptídeo incluem qualquer proteína que seja modificada por qualquer processo biológico ou não biológico. Os termos
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132/525 aminoácido e aminoácidos se referem a todos os L-aminoácidos de ocorrência natural.
[0122] Uma proteína recombinante ou polipeptideo recombinante é usado no presente documento para se referir a uma proteína que não está mais em seu ambiente natural, por exemplo, in vitro ou em uma célula hospedeira bacteriana recombinante ou de planta. Uma proteína purificada ou polipeptideo purificado é aqui utilizada para se referir a uma proteína que é substancialmente livre de material celular. Um polipeptideo PtIP-83 que é substancialmente isento de material celular inclui preparações de proteína que têm menos do que cerca de 30%, 20%, 10% ou 5% (em peso seco) de proteína não pesticida (também denominada no presente documento como uma proteína contaminante).
[0123]
Fragmentos ou porções biologicamente ativas incluem fragmentos de polipeptideo que compreendem sequências de aminoácidos suficientemente idênticas a um polipeptideo PtIP-83 e que exibem atividade inseticida. Fragmentos ou porções biologicamente ativas de polipeptídeos PtIP-83 incluem fragmentos compreendendo sequências de aminoácidos suficientemente idênticas à sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO: 754, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NO: 760, SEQ ID NO: 761, SEQ ID NO: 762, SEQ ID NO: 763, SEQ ID NO: 764, SEQ ID NO: 765, SEQ ID NO: 766, SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO: 768, SEQ ID NO: 769, ou SEQ ID NOs: 958-1026, em que o polipeptideo PtIP-83 tem
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133/525 atividade inseticida. Tais porções biologicamente ativas podem ser preparadas por técnicas recombinantes e avaliadas em relação à atividade inseticida. Em algumas modalidades, o fragmento do polipeptídeo PtIP-83 é um truncamento do terminal N e/ou terminal
C de pelo menos 1, 2, 3 ,4,5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,
15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 26, 27 , 28, 29, 30 , 31, 32, 33, 34
ou mais aminoácidos a partir do terminal N e/ou terminal C
relativamente a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID
NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO:
15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23,
SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO: 754, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756,
SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NO: 760,
SEQ ID NO: 761, SEQ ID NO: 762, SEQ ID NO: 763, SEQ ID NO: 764,
SEQ ID NO: 765, SEQ ID NO: 766, SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO: 768
ou SEQ ID NO: 769, por exemplo, por proteólise, por inserção de um códon de iniciação, por deleção dos códons que codificam os aminoácidos deletados e inserção concomitante de um códon de iniciação e/ou inserção de um códon de terminação.
[0124] Em algumas modalidades, os fragmentos de polipeptídeo PtP-83 aqui englobados resultam da remoção dos aminoácidos do terminal N 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais em relação a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO: 754, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NO: 760, SEQ ID NO: 761, SEQ ID NO: 762, SEQ ID NO: 763, SEQ ID NO: 764, SEQ ID NO: 765, SEQ ID NO: 766, SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO: 768, SEQ ID NO: 769, SEQ ID NOs: 958-1026, ou suas variantes, por
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134/525 exemplo, por proteólise ou por inserção de um codão de iniciação, por deleção dos códons que codificam os aminoácidos deletados e inserção concomitante de um códon de iniciação.
[0125] Variantes, conforme usado no presente documento, se referem a proteínas ou polipeptídeos que têm uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos genitora.
[0126] Em algumas modalidades, um polipeptideo PtIP-83 compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO: 754, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NO: 760, SEQ ID NO: 761, SEQ ID NO: 762, SEQ ID NO: 763, SEQ ID NO: 764, SEQ ID NO: 765, SEQ ID NO: 766, SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO: 768, SEQ ID NO: 769, ou SEQ ID NOs: 958-1026, em que o polipeptideo PtIP-83 tem atividade inseticida.
[0127]
Em algumas modalidades, um polipeptideo PtIP-83 compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%,
92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade através
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135/525 de todo o comprimento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO: 754, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NO: 760, SEQ ID NO: 761, SEQ ID NO: 762, SEQ ID NO: 763, SEQ ID NO: 764, SEQ ID NO: 765, SEQ ID NO: 766, SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO: 768, SEQ ID NO: 769 ou SEQ ID
NOs: 958-1026.
[0128] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PtIP-83 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ao longo de todo o comprimento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ
ID NO: 11 r SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID
NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO:
754 , SEQ ID NO : 755, SEQ ID NO: : 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO:
758 , SEQ ID NO : 759, SEQ ID NO: : 760, SEQ ID NO: 761, SEQ ID NO:
762 , SEQ ID NO : 763, SEQ ID NO: : 764, SEQ ID NO: 765, SEQ ID NO:
766 , SEQ ID NO : 767, SEQ ID NO : 768, SEQ ID NO: 769, ou SEQ ID
NOs: 958-1026, e tem pelo menos uma substituição, deleção, inserção e/ou adição de aminoácidos no terminal N ou terminal C em comparação com a sequência nativa de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19,, SEQ ID NO: 769 ou SEQ ID NOs: 958-1026.
[0129] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PtIP-83 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID
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NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO: 754, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NO: 760, SEQ ID NO: 761, SEQ ID NO: 762, SEQ ID NO: 763, SEQ ID NO: 764, SEQ ID NO: 765, SEQ ID NO: 766, SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO: 768, SEQ ID NO: 769, ou SEQ ID NOs: 9581026, que tem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 ou mais substituições de aminoácidos em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO: 754, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NO: 760, SEQ ID NO: 761, SEQ ID NO: 762, SEQ ID NO: 763, SEQ ID NO: 764, SEQ ID NO: 765, SEQ ID NO: 766, SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO: 768, SEQ ID NO: 769, ou SEQ ID NOs: 958-1026.
[0130] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PtIP-83 compreende uma sequência de aminoácidos que tem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 ou 60 substituições de aminoácidos, em qualquer combinação, em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:
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5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11,
SEQ ID NO: 13, SEQ
ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID
NO: 23, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO: 754, SEQ ID NO: 755, SEQ ID
NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: : 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID
NO: 760, SEQ ID NO: 761, SEQ ID NO: : 762, SEQ ID NO: 763, SEQ ID
NO: 764, SEQ ID NO: 765, SEQ ID NO: : 766, SEQ ID NO: 767, SEQ ID
NO: 768, SEQ ID NO: 769, ou ; SEQ ID NOs : 958- 1026.
[0131] Em algumas modalidades, um polipeptideo PtIP-83 compreende uma sequência de aminoácidos que tem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ou 29 substituições de aminoácidos, em qualquer combinação, em comparação com o aminoácido nativo na posição correspondente de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO: 754, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NO: 760, SEQ ID NO: 761, SEQ ID NO: 762, SEQ ID NO: 763, SEQ ID NO: 764, SEQ ID NO: 765, SEQ ID NO: 766, SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO: 768, SEQ ID NO: 769, ou SEQ ID NOs: 958-1026.
[0132] Em algumas modalidades, o polipeptideo PtIP-83 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ
ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID
NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQID
NO: 759, SEQ ID NO: 760, SEQID
NO: 763, SEQ ID NO: 764, SEQID
NO: 716, SEQ ID NO: 754, SEQID
NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQID
NO: 761, SEQ ID NO: 762, SEQID
NO: 765, SEQ ID NO: 766, SEQID
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NO: 767, SEQ ID NO: 768, SEQ ID NO: 769, ou SEQ ID NOs: 9581026.
[0133] Em algumas modalidades, o polipeptídeo PtIP-83 compreende uma seguência de aminoácidos de ocorrência não natural. Como agui utilizado, o termo seguência de aminoácidos de ocorrência não natural significa uma seguência de aminoácidos não encontrada na natureza.
[0134] Em algumas modalidades, o polipeptídeo PtIP-83
não é o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO:
5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEÇ ) ID NO: 13, SEQ
ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID
NO: 23, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO: 754, SEQ ID NO: 755, SEQ ID
NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID
NO: 760, SEQ ID NO: 761, SEQ ID NO: 762, SEQ ID NO: 763, SEQ ID
NO: 764, SEQ ID NO: 765, SEQ ID NO: 766, SEQ ID NO: 767, SEQ ID
NO: 768, SEQ ID NO: 769, ou SEQ ID NOs: 958-1026
[01 35] Em algumas modalidades, o polipeptídeo PtIP-83
é uma variante do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO: 754, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NO: 760, SEQ ID NO: 761, SEQ ID NO: 762, SEQ ID NO: 763, SEQ ID NO: 764, SEQ ID NO: 765, SEQ ID NO: 766, SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO: 768, SEQ ID NO: 769, ou SEQ ID NOs: 958-1026, em gue a variante do polipeptídeo PtIP-83 possui pelo menos uma substituição, deleção, inserção e/ou adição de aminoácidos no terminal N ou no terminal C em comparação com SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO:
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11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 , SEQ ID NO: : 19,
SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO: 754,
SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO : 757, SEQ ID NO: 758,
SEQ ID NO: 759, SEQ ID NO: 760, SEQ ID NO : 761, SEQ ID NO: 762,
SEQ ID NO: 763, SEQ ID NO: 764, SEQ ID NO : 765, SEQ ID NO: 766,
SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO : 768NO: 761, SEQ ID NO: 762, SEQ ID
NO: 763 , SEQ ID NO: 764 :, SEQ ID NO: 765, SEQ ID NO: 766, SEQ ID
NO: 767 ', SEQ II 3 NO: 768, SEQ ID NC ): 769 , ou SEQ ID NOs: 958-
1026.
[0136] Em algumas modalidades, polipeptídeo PtIP-83 compreendendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO: 236-299, SEQ ID NO: 334-367, SEQ ID NO: 398-427, SEQ ID NO: 518-607, SEQ ID NO: 640-645 e SEQ ID NO: 728-737.
[0137] Em algumas modalidades, o polipeptídeo PtIP-83 é uma variante da SEQ ID NO: 1, em que o aminoácido na posição 53 é Vai, Ala, Cys ou Thr; o aminoácido na posição 54 é Lys, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, lie, Leu, Met, Asn, Gin, Arg, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 55 é Arg, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Gin, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 56 é Leu, Glu, Phe, lie, Met, Thr ou Vai; o aminoácido na posição 57 é Tyr, Cys, lie, Leu, Met, Thr ou Vai; o aminoácido na posição 58 é Vai, Cys, Ile ou Leu; o aminoácido na posição 59 é Phe, Leu, Met, Vai ou Tyr; o aminoácido na posição 60 é Ala, Cys, Gly, Ser, Thr ou Vai; o aminoácido na posição 61 é Asp, Glu, His ou Ser; o aminoácido na posição 62 é Vai, Ala, Cys, Ile, Leu ou Thr; o aminoácido na posição 63 é Vai, Ala, Cys, lie, Leu, Met ou Thr; o aminoácido na posição 64 é Glu, Ala, Cys, Phe, Gly, His, lie, Leu, Met, Asn, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição
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140/525 é Leu, Ala, Cys, Phe, His, lie, Met, Asn, Gin, Thr, Vai ou Trp; o aminoácido na posição 66 é Pro, Asp, Gly, Met, Gin ou Arg; o aminoácido na posição 363 é Gin, Ala, Cys, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Asn, Arg, Ser, Thr, Vai ou Trp; o aminoácido na posição 364 é lie, Ala, Cys, Glu, Phe, His, Lys, Leu, Met, Asn, Gin, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 365 é Leu, Ala, Glu, Phe, Gly, His, lie, Lys, Met, Asn, Arg, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 366 é Gly, Ala, Cys, Phe, His, lie, Lys, Leu, Met, Asn, Ser, Thr ou Vai; o aminoácido na posição 367 é Ser, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, lie, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Thr, Vai ou Trp; o aminoácido na posição 368 é Tyr, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, lie, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai ou Trp; o aminoácido na posição
369 é Leu, Al a, Cys, Asp, Phe, Gly, Ile, Met, Thr ou Vai; o
aminoácido na posição 370 é Leu, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly,
His, Ile, Lys , Met, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o
aminoácido na posição 371 é Gin, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly,
Ile, Lys, Leu, Asn, Arg, Ser, Thr, Vai ou Trp; o aminoácido na posição 372 é Gin, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Arg, Ser, Vai ou Tyr; o aminoácido na posição 373 é Asn, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Gin, Ser, Thr, Vai ou Trp; o aminoácido na posição 556 é Trp, Phe, Thr ou Tyr; o aminoácido na posição 557 é Arg, Cys, Asp, Gly, His, lie, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 558 é Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His, lie, Lys, Leu, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 559 é Lys, Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai ou Tyr; o aminoácido na posição 560 é Cys, Ala, Phe, Gly, lie, Met, Asn, Arg, Ser, Thr ou Vai; o aminoácido na posição 561
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141/525 é Lys, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, lie, Leu, Met, Asn, Arg, Ser, Thr, Vai ou Tyr; o aminoácido na posição 562 é Asn, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Leu, Met, Arg, Ser, Thr, Vai ou Tyr; o aminoácido na posição 563 é Vai, Ala, Cys, Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Asn, Gin, Thr ou Trp; o aminoácido na posição 564 é Ala, Cys, Gly, Met, Gin, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 646 é Leu, Ala, Cys, Gly, lie, Met, Asn, Gin, Ser, Thr ou Vai; o aminoácido na posição 647 é Leu, Asp, Gly, Met, Asn, Gin ou Thr; o aminoácido na posição 648 é Met, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 649 é Pro, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Met, Asn, Gin, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 650 é Thr, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His, lie, Lys, Leu, Met, Pro, Gin, Arg, Ser, Vai ou Tyr; o aminoácido na posição 651 é Glu, Ala, Cys, Asp, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai ou Tyr; o aminoácido na posição 652 é Leu, Cys, Phe, lie, Lys, Met, Pro, Arg, Ser, Thr ou Vai; o aminoácido na posição 653 é Thr, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, lie, Lys, Leu, Pro, Arg, Ser, Vai ou Trp; o aminoácido na posição 654 é Thr, Ala, Cys, Phe, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 655 é Trp, Phe ou Tyr; o aminoácido na posição 771 é Arg, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 772 é Arg, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, lie, Lys, Leu, Met, Pro, Gin, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 773 é Asp, Ala, Glu, Phe, Gly, His, lie, Lys, Leu, Met, Asn, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 774 é Gin, Ala, Asp, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido
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142/525 na posição 775 é Vai, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr ou Tyr; o aminoácido na posição 776 é Leu, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, lie, Lys, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai ou Tyr; o aminoácido na posição 777 é Pro, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Gin, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 778 é Phe, Ala, His, lie, Leu, Met, Asn, Gin, Ser, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 779 é Gin, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Leu, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr ou Vai; o aminoácido na posição 780 é Ala, Cys, Asn, Pro, Gin ou Ser; o aminoácido na posição 781 é Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Asn, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 782 é Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, lie, Lys, Met, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 783 é Pro, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Asn, Gin, Arg, Ser, Thr ou Vai; o aminoácido na posição 784 é Leu, Ala, Glu, Phe, His, lie, Lys, Met, Asn, Pro,
Gin, Ser, Thr, Vai ou Trp; o aminoácido na posição 785 é Asn, Ala, Cys, Glu, Phe, Gly, His, lie, Lys, Leu, Met, Gin, Arg, Ser,
Thr, Vai, Trp ou Tyr; e o aminoácido na posição 786 é Tyr, Phe,
Ile, Leu ou Trp.
[0138] Em algumas modalidades, o polipeptídeo PtIP-83 é uma variante da SEQ ID NO: 1, em que o aminoácido na posição 1 é Met ou deletado; o aminoácido na posição 2 é Ala ou deletado; o aminoácido na posição 3 é Leu, Vai ou deletado; o aminoácido na posição 4 é Vai, Met ou Leu; o aminoácido na posição 7 é Gly ou Ser; o aminoácido na posição 8 é Lys ou Thr; o aminoácido na posição 10 é Phe ou Tyr; o aminoácido na posição 11 é Glu ou Arg; o aminoácido na posição 18 é Met ou Ile; o aminoácido na posição 19 é Gly, Pro ou Ala; o aminoácido na posição 20 é Vai
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143/525 ou deletado; o aminoácido na posição 21 é Leu ou Vai; o aminoácido na posição 23 é Arg ou Gin; o aminoácido na posição 37 é Vai ou Leu; o aminoácido na posição 38 é Arg ou Asn; o aminoácido na posição 40 é Ala ou Ser; o aminoácido na posição 43 é Asn ou Asp; o aminoácido na posição 45 é Gly ou Ala; o aminoácido na posição 46 é Gin ou Glu; o aminoácido na posição 48 é Glu, Pro ou Vai; o aminoácido na posição 51 é Glu ou Gly; o aminoácido na posição 52 é Lys, Arg ou Thr; o aminoácido na posição 56 é Leu ou Vai; o aminoácido na posição 59 é Phe ou Leu; o aminoácido na posição 66 é Pro ou Ala; o aminoácido na posição 67 é Vai, Pro ou Thr; o aminoácido na posição 68 é Vai, Arg, Phe ou Gly; o aminoácido na posição 69 é Glu, Ala ou Lys; o aminoácido na posição 70 é Trp, Thr, His, Tyr ou Arg; o aminoácido na posição 71 é Arg, Pro ou deletado; o aminoácido na posição 72 é Trp, Asp, Leu ou deletado; o aminoácido na posição 73 é Pro, Gin, Asn, His ou deletado; o aminoácido na posição 74 é Pro, Met ou Thr; o aminoácido na posição 75 é Gin, His ou Arg; o aminoácido na posição 7 6 é Tie, Met ou Leu; o aminoácido na posição 84 é Tie ou Vai; o aminoácido na posição 91 é Trp ou Phe; o aminoácido na posição 93 é Thr ou Tie; o aminoácido na posição 94 é Asp ou Gly; o aminoácido na posição 96 é Arg ou Ser; o aminoácido na posição 97 é Gin, Phe ou Arg; o aminoácido na posição 98 é Ser ou deletado; o aminoácido na posição 99 é Asp ou Ala; o aminoácido na posição 100 é Thr ou Ala; o aminoácido na posição 101 é Glu, Thr ou Trp o aminoácido na posição 103 é His, Arg, Glu ou Gin; o aminoácido na posição 105 é Thr ou Pro; o aminoácido na posição 108 é Lys, Gin ou Glu; o aminoácido na posição 109 é Leu ou Vai; o aminoácido na posição 111 é Ala ou Thr; o aminoácido na posição 112 é Tie, Arg, Thr ou deletado; o
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144/525 aminoácido na posição 113 é Gin, Ala, Gly ou deletado; o aminoácido na posição 114 é Arg, Glu ou Ile; o aminoácido na posição 115 é Glu ou Gin; o aminoácido na posição 116 é Glu, Asn, Gin ou Arg; o aminoácido na posição 117 é Asn, Vai, Tyr ou Phe; o aminoácido na posição 118 é Arg ou Lys; o aminoácido na posição 119 é Trp ou Ser; o aminoácido na posição 122 é Thr, Lys ou Ala; o aminoácido na posição 124 é Ala ou Thr; o aminoácido na posição 126 é Gly ou Asp; o aminoácido na posição 127 é Met ou Ala; o aminoácido na posição 128 é Asn ou Lys; o aminoácido na posição 131 é Vai, Ile ou Thr; o aminoácido na posição 133 é Ile ou Vai; o aminoácido na posição 134 é His ou Tyr; o aminoácido na posição 135 é Ala ou Gly; o aminoácido na posição 137 é Glu ou Lys; o aminoácido na posição 139 é Gin ou Glu; o aminoácido na posição 140 é Vai, Arg ou Leu; o aminoácido na posição 141 é Gly ou Ser; o aminoácido na posição 142 é Vai ou Pro; o aminoácido na posição 144 é Thr, Leu, Phe ou Tyr; o aminoácido na posição 145 é Met, Pro ou Asn; o aminoácido na posição 146 é Ser, Gly ou Asn; o aminoácido na posição 147 é Trp ou Asn; o aminoácido na posição 148 é Ser, Ala ou Pro; o aminoácido na posição 149 é Ser ou deletado; o aminoácido na posição 150 é Vai, Ile ou Tyr; o aminoácido na posição 152 é Arg, Ala, Vai ou Gly; o aminoácido na posição 154 é Ser, Trp ou Glu; o aminoácido na posição 156 é Leu, Asp ou Gin; o aminoácido na posição 158 é Ser ou Cys; o aminoácido na posição 159 é Vai, Thr ou Ile; o aminoácido na posição 162 é Ser ou Ala; o aminoácido na posição 163 é Gly ou deletado; o aminoácido na posição 164 é Phe ou deletado; o aminoácido na posição 165 é Arg ou Ala; o aminoácido na posição 166 é Ala, Arg, Met ou Phe; o aminoácido na posição 167 é Vai ou His; o aminoácido na posição 168 é Ser ou Asn; o aminoácido na
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145/525 posição 169 é Vai, His ou Thr; o aminoácido na posição 170 é Phe ou Vai; o aminoácido na posição 171 é Glu, Asn ou Asp; o aminoácido na posição 172 é Vai, Ala, Arg ou Glu; o aminoácido na posição 175 é Ser, Arg ou Trp; o aminoácido na posição 176 é Vai ou lie; o aminoácido na posição 177 é Arg ou lie; o aminoácido na posição 179 é Thr, lie, Vai ou Ser; o aminoácido na posição 180 é Leu, Phe ou Thr; o aminoácido na posição 181 é Gly, Thr, Gin ou Ser; o aminoácido na posição 182 é Ala, Leu, Phe ou lie; o aminoácido na posição 183 é Thr ou Gly; o aminoácido na posição 184 é Leu, Thr, Ser ou Arg; o aminoácido na posição 185 é Arg, Gly, Asp ou Ala; o aminoácido na posição 186 é Pro, Vai ou Gin; o aminoácido na posição 187 é Asp, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 188 é His, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 189 é Ala, Arg, Pro ou deletado; o aminoácido na posição 190 é Leu, Asn ou deletado; o aminoácido na posição 191 é Tyr ou deletado; o aminoácido na posição 192 é Ser, lie, Vai ou Asn; o aminoácido na posição 193 é Thr ou Asp; o aminoácido na posição 194 é Thr ou Ser; o aminoácido na posição 195 é Met ou Thr; o aminoácido na posição 196 é Gin, His, Leu ou Ser; o aminoácido na posição 197 é Ala, Gly ou Leu; o aminoácido na posição 198 é Thr, Glu ou Ala; o aminoácido na posição 199 é Pro ou Arg; o aminoácido na posição 200 é Asn, Ser, Thr ou Gly; o aminoácido na posição 201 é Ala, Leu, Glu ou Trp; o aminoácido na posição 202 é Ser, Asp, Phe ou Leu; o aminoácido na posição 203 é His, Pro, Gly ou Ser; o aminoácido na posição 204 é lie, Trp, His ou Gly; o aminoácido na posição 205 é Ser, Asn ou lie; o aminoácido na posição 206 é Ala, Gly, Asp, Tyr ou Arg; o aminoácido na posição 207 é Phe, Vai ou Leu; o aminoácido na posição 208 é Asn, Ser, Pro ou Leu; o aminoácido na posição 210 é Arg, Asp, Glu ou Tyr; o aminoácido
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146/525 na posição 211 é lie, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 212 é Vai, Ala ou Asp; o aminoácido na posição 214 é Pro ou Arg; o aminoácido na posição 215 é Ser ou Thr; o aminoácido na posição 217 é Tyr ou Phe; o aminoácido na posição 218 é Arg ou Ser; o aminoácido na posição 219 é Vai ou Ala; o aminoácido na posição 220 é Cys, Leu ou Ser; o aminoácido na posição 221 é Pro ou His; o aminoácido na posição 222 é Leu, Arg ou Ser; o aminoácido na posição 224 é Asn ou Ser; o aminoácido na posição 225 é Asp, Arg ou Thr; o aminoácido na posição 226 é Thr ou Asn; o aminoácido na posição 227 é Asp, Leu ou deletado; o aminoácido na posição 228 é Thr ou deletado; o aminoácido na posição 229 é Tyr ou deletado; o aminoácido na posição 230 é Leu ou deletado; o aminoácido na posição 231 é Gly ou deletado; o aminoácido na posição 232 é Ile ou deletado; o aminoácido na posição 233 é Pro ou deletado; o aminoácido na posição 234 é Ala, Pro ou deletado; o aminoácido na posição 235 é Asp, Ile ou Vai; o aminoácido na posição 236 é Vai, Ser ou Glu; o aminoácido na posição 237 é Ala, Phe ou Tyr; o aminoácido na posição 238 é Ala ou Thr; o aminoácido na posição 239 é Vai, Ser ou Gly; o aminoácido na posição 240 é Leu ou Ile; o aminoácido na posição 243 é Asp ou Glu; o aminoácido na posição 249 é Asn ou Ser; o aminoácido na posição 252 é Leu ou Met; o aminoácido na posição 257 é Thr ou Ser; o aminoácido na posição 259 é His ou Leu; o aminoácido na posição 266 é Ala ou Vai; o aminoácido na posição 267 é Cys ou Gly; o aminoácido na posição 268 é His, Arg ou Tyr; o aminoácido na posição 272 é Asp ou Glu; o aminoácido na posição 273 é Vai, Met, lie ou Leu; o aminoácido na posição 274 é Vai ou Met; o aminoácido na posição 278 é Gly ou Ala; o aminoácido na posição 279 é Glu ou Vai; o aminoácido na posição 281 é Leu ou Ala; o
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147/525 aminoácido na posição 282 é Asn, Leu ou lie; o aminoácido na posição 285 é Asn ou Ser; o aminoácido na posição 286 é Lys, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 287 é Leu ou Vai; o aminoácido na posição 290 é Pro, Gin ou Arg; o aminoácido na posição 291 é Leu ou Vai; o aminoácido na posição 292 é Lys ou Vai; o aminoácido na posição 293 é Glu ou Gin; o aminoácido na posição 294 é Ser, Asn ou Lys; o aminoácido na posição 295 é Thr ou Ser; o aminoácido na posição 296 é Gin ou His; o aminoácido na posição 297 é Leu ou Met; o aminoácido na posição 300 é Ser ou Thr; o aminoácido na posição 301 é Glu ou Ala; o aminoácido na posição 302 é Ser, Pro ou Ala; o aminoácido na posição 304 é Lys ou Asn; o aminoácido na posição 313 é Vai ou lie; o aminoácido na posição 314 é His, Glu ou Gin; o aminoácido na posição 315 é Ala, Cys ou Ser; o aminoácido na posição 316 é Ala ou Vai; o aminoácido na posição 317 é Met ou lie; o aminoácido na posição 319 é Met ou lie; o aminoácido na posição 320 é Vai ou Gly; o aminoácido na posição 321 é Arg ou Pro; o aminoácido na posição 322 é lie ou Phe; o aminoácido na posição 323 é Gly ou Vai; o aminoácido na posição 324 é Leu ou Ser; o aminoácido na posição 336 é Ser ou Asn; o aminoácido na posição 339 é Asn, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 350 é Arg ou Gin; o aminoácido na posição 351 é Glu ou Asp; o aminoácido na posição 353 é Lys ou Arg; o aminoácido na posição 354 é Gin ou Arg; o aminoácido na posição 355 é Phe ou Leu; o aminoácido na posição 356 é Lys ou Arg; o aminoácido na posição 360 é lie, Vai ou Ala; o aminoácido na posição 365 é Leu ou Phe; o aminoácido na posição 371 é ou Glu; o aminoácido na posição 372 é ou Lys; o aminoácido na posição 374 é Arg ou Lys; o aminoácido na posição 37 6 é Phe ou Leu; o aminoácido na posição 378 é Glu ou Asp; o aminoácido na posição 381 é Leu ou Vai; o
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148/525 aminoácido na posição 388 é Ala ou Ser; o aminoácido na posição
395 é Arg ou Lys; o aminoácido na posição 396 é Glu, Gin ou Gly;
o aminoácido na posição 399 é Asp ou Asn; o aminoácido na posição 400 é Asn, Thr ou Asp; o aminoácido na posição 401 é Thr ou Ala; o aminoácido na posição 402 é Phe, Ile ou Leu; o aminoácido na posição 406 é Asp ou Glu; o aminoácido na posição 408 é Leu ou Met; o aminoácido na posição 410 é Gly ou Leu; o aminoácido na posição 414 é Ala ou Glu; o aminoácido na posição 416 é Ser, Asn ou Asp; o aminoácido na posição 417 é Ser, Arg ou Gly; o aminoácido na posição 423 é Lys ou Gin; o aminoácido na posição 431 é Arg ou Lys; o aminoácido na posição 432 é Gin ou Glu; o aminoácido na posição 436 é Arg ou Glu; o aminoácido na posição 440 é Asn ou Arg; o aminoácido na posição 442 é Leu ou Vai; o aminoácido na posição 447 é Ser, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 448 é Ala ou Ser; o aminoácido na posição 451 é Gin ou Met; o aminoácido na posição 453 é Gly ou Ala; o aminoácido na posição 455 é Ala ou Vai; o aminoácido na posição 457 é Leu ou Vai; o aminoácido na posição 467 é Vai ou Ala; o aminoácido na posição 471 é Gly ou Ala; o aminoácido na posição 475 é Ser ou Asn; o aminoácido na posição 483 é Gly ou Ala; o aminoácido na posição 493 é Gin ou Gly; o aminoácido na posição 504 é Vai ou Ile; o aminoácido na posição 506 é Asp ou His; o aminoácido na posição 509 é Asp ou Asn; o aminoácido na posição 510 é Ser ou Ala; o aminoácido na posição 512 é Glu ou Asp; o aminoácido na posição 515 é Gly ou Ser; o aminoácido na posição 516 é Gin ou His; o aminoácido na posição 517 é Ile ou Leu; o aminoácido na posição 519 é Asp, Gly ou Gin; o aminoácido na posição 522 é
Vai, Glu, Pro ou Vai; o aminoácido na posição 525 é Glu ou Asp;
o aminoácido na posição
526 é Leu ou Met o aminoácido na posição
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539 é Vai ou Ile; o aminoácido na posição 555 é Vai ou Ala; o aminoácido na posição 557 é Arg ou Lys; o aminoácido na posição 563 é Vai ou Met; o aminoácido na posição 571 é Ser ou Cys; o aminoácido na posição 575 é Vai ou Glu; o aminoácido na posição 577 é Met ou Ile; o aminoácido na posição 579 é Glu ou Gin; o aminoácido na posição 583 é Asp ou Glu; o aminoácido na posição 589 é Met ou Leu; o aminoácido na posição 590 é Met ou Leu; o aminoácido na posição 593 é Met ou Ile; o aminoácido na posição 595 é Arg ou Gin; o aminoácido na posição 596 é Ser ou Thr; o aminoácido na posição 597 é Gin ou His; o aminoácido na posição 607 é Ala ou Vai; o aminoácido na posição 608 é Asp ou Asn; o aminoácido na posição 612 é Tyr, His ou Phe; o aminoácido na posição 617 é Thr ou Ile; o aminoácido na posição 618 é Gin ou His; o aminoácido na posição 625 é Arg ou Ser; o aminoácido na posição 626 é Met ou Ile; o aminoácido na posição 628 é Leu ou Ile; o aminoácido na posição 633 é lie ou Met; o aminoácido na posição 634 é Leu ou Met; o aminoácido na posição 642 é Arg ou Met; o aminoácido na posição 648 é Met ou Thr; o aminoácido na posição 651 é Glu ou Gin; o aminoácido na posição 654 é Thr, Vai ou Ala; o aminoácido na posição 658 é Gly ou Arg; o aminoácido na posição 663 é Gly ou Ala; o aminoácido na posição 664 é Asp ou Asn; o aminoácido na posição 668 é Ala ou Thr; o aminoácido na posição 669 é Gin ou His; o aminoácido na posição 671 é Asn ou Ser o aminoácido na posição 675 é Ile, Vai ou Ser; o aminoácido na posição 678 é Met, lie, Ala ou Thr; o aminoácido na posição 682 é Pro ou Gin; o aminoácido na posição 683 é Ser ou Pro; o aminoácido na posição 685 é Asp ou Asn; o aminoácido na posição 694 é Asp ou Gly; o aminoácido na posição 697 é Asn ou Ser; o aminoácido na posição 704 é Glu ou Gly; o aminoácido na posição
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714 é Ala ou Gly; o aminoácido na posição 721 é Ser ou Phe; o aminoácido na posição 722 é Ser ou Asn; o aminoácido na posição 724 é Ser ou Thr; o aminoácido na posição 734 é His ou Gin; o aminoácido na posição 736 é Vai ou Ala; o aminoácido na posição 737 é Lys ou Gin; o aminoácido na posição 739 é Ala ou Ser; o aminoácido na posição 740 é Ser ou Met; o aminoácido na posição 741 é Gly ou Asn; o aminoácido na posição 742 é lie ou Gly; o aminoácido na posição 743 é Gly ou deletado; o aminoácido na posição 745 é Gly ou Asp; o aminoácido na posição 751 é Thr, Ser ou Ala; o aminoácido na posição 753 é Gin ou Arg; o aminoácido na posição 754 é Thr ou Ser; o aminoácido na posição 756 é Thr ou lie; o aminoácido na posição 757 é Vai ou lie; o aminoácido na posição 766 é lie ou Vai; o aminoácido na posição 773 é Asp ou Glu; o aminoácido na posição 774 é Gin ou Glu; o aminoácido na posição 776 é Leu ou Met; o aminoácido na posição 777 é Pro ou Thr; o aminoácido na posição 782 é Ala, Asp ou Vai; o aminoácido na posição 786 é Tyr ou Phe; o aminoácido na posição 787 é His ou Gin; o aminoácido na posição 788 é Tyr ou Met; o aminoácido na posição 789 é Ala ou Arg; o aminoácido na posição 790 é Tyr ou Thr; o aminoácido na posição 791 é Arg ou Ala; o aminoácido na posição 792 é Leu ou Ser; o aminoácido na posição 796 é Asp ou Glu; o aminoácido na posição 797 é Ser, Thr ou Ala o aminoácido na posição 802 é Glu ou Gin; o aminoácido na posição 806 é Gin, Asp, Glu ou His; o aminoácido na posição 810 é Lys ou Thr; o aminoácido na posição 819 é Arg ou His; o aminoácido na posição 829 é Lys, Ser, Ala ou Pro; o aminoácido na posição 832 é Ala, Lys ou Glu; o aminoácido na posição 833 é Gly ou Glu; o aminoácido na posição 842 é Leu ou Pro; o aminoácido na posição 847 é Gin ou Glu; o aminoácido na posição 848 é lie ou Vai; o
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151/525 aminoácido na posição 849 é Vai ou Ala; o aminoácido na posição 855 é Thr ou Met; o aminoácido na posição 860 é lie ou Vai; e o aminoácido na posição 864 é His ou Gin.
[0139] Em algumas modalidades, o polipeptideo PtIP-83 é uma variante da SEQ ID NO: 1, em que o aminoácido na posição 1 é Met ou deletado; o aminoácido na posição 2 é Ala ou deletado; o aminoácido na posição 3 é Leu, Vai, lie ou deletado; o aminoácido na posição 4 é Vai, Met, lie ou Leu; o aminoácido na posição 7 é Gly, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 8 é Lys, Arg, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 10 é Phe, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 11 é Glu, Asp, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 18 é Met, Vai, Leu ou lie; o aminoácido na posição 19 é Gly, Pro ou Ala; o aminoácido na posição 20 é Vai, lie, Leu ou deletado; o aminoácido na posição 21 é Leu, lie ou Vai; o aminoácido na posição 23 é Arg, Lys, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 37 é Vai, lie ou Leu; o aminoácido na posição 38 é Arg, Lys, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 40 é Ala, Gly, Thr ou
Ser; o aminoácido na posição 43 é Asn, Gin, Glu ou Asp; o
aminoácido na posição 45 é Gly ou Ala; o aminoácido na posição
4 6 é Gin, Asp, Asn ou Glu; o aminoácido na posição 48 é Glu,
Asp, Pro, lie, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 51 é Glu,
Asp, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 52 é Lys, Arg, Ser ou
Thr; o aminoácido na posição 56 é Leu, lie ou Vai; o aminoácido na posição 59 é Phe, lie, Vai ou Leu; o aminoácido na posição 66 é Pro, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 67 é Vai, Pro, lie, Leu, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 68 é Vai, Arg, Phe, lie, Leu, Lys ou Gly; o aminoácido na posição 69 é Glu, Ala, Asp, Gly, Arg ou Lys; o aminoácido na posição 70 é Trp, Thr,
His, Tyr, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 71 é Arg, Pro, Lys
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152/525 ou deletado; o aminoácido na posição 72 é Trp, Asp, Leu, Tie, Vai, Glu ou deletado; o aminoácido na posição 73 é Pro, Gin, Asn, His ou deletado; o aminoácido na posição 74 é Pro, Met, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 75 é Gin, His, Asn, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 76 é Tie, Met, Vai ou Leu; o aminoácido na posição 84 é Tie, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 91 é Trp ou Phe; o aminoácido na posição 93 é Thr, Ser, Leu, Vai ou
Tie; o aminoácido na posição 94 é Asp, Glu, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 96 é Arg, Lys, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 97 é Gin, Phe, Asn, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 98 é Ser, Thr ou deletado; o aminoácido na posição 99 é Asp,
Glu, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 100 é Thr, Ser, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 101 é Glu, Thr, Asp, Ser ou Trp o aminoácido na posição 103 é His, Arg, Lys, Glu ou Gin; o aminoácido na posição 105 é Thr, Ser ou Pro; o aminoácido na posição 108 é Lys, Arg, Asn, Asp, Gin ou Glu; o aminoácido na posição 109 é Leu, Tie ou Vai; o aminoácido na posição 111 é Ala, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 112 é Tie, Arg, Thr,
Leu, Vai, Lys, Ser ou deletado; o aminoácido na posição 113 é Gin, Ala, Gly, Asn ou deletado; o aminoácido na posição 114 é Arg, Glu, Lys, Asp ou Tie; o aminoácido na posição 115 é Glu, Asp, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 116 é Glu, Asn, Gin, Asp, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 117 é Asn, Vai, Tyr,
Tie, Leu, Gin, Trp ou Phe; o aminoácido na posição 118 é Arg ou Lys; o aminoácido na posição 119 é Trp, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 122 é Thr, Lys, Ser, Arg ou Ala; o aminoácido na posição 124 é Ala, Gly, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 126 é Gly, Ala, Glu ou Asp; o aminoácido na posição 127 é Met, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 128 é Asn, Gin, Arg ou Lys; o
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153/525 aminoácido na posição 131 é Vai, Ile, Leu, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 133 é Ile, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 134 é His ou Tyr; o aminoácido na posição 135 é Ala ou Gly; o aminoácido na posição 137 é Glu, Asp, Arg ou Lys; o aminoácido na posição 139 é Gin, Asn, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 140 é Vai, Arg, Ile, Lys ou Leu; o aminoácido na posição 141 é Gly, Ala, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 142 é Vai, lie, Leu ou Pro; o aminoácido na posição 144 é Thr, Leu, Phe, Ile, Vai ou Tyr; o aminoácido na posição 145 é Met, Pro, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 146 é Ser, Gly, Thr, Ala, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 147 é Trp, Gin, Tyr ou Asn; o aminoácido na posição 148 é Ser, Ala, Thr, Gly ou Pro; o aminoácido na posição 149 é Ser, Thr ou deletado; o aminoácido na posição 150 é Vai, Ile, Leu ou Tyr; o aminoácido na posição 152 é Arg, Ala, Vai, Ile, Leu, Lys ou Gly; o aminoácido na posição 154 é Ser, Trp, Thr, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 156 é Leu, Asp, Ile, Vai, Asn, Glu ou Gin; o aminoácido na posição 158 é Ser, Thr ou Cys; o aminoácido na posição 159 é Vai, Thr, Leu ou Ile; o aminoácido na posição 162 é Ser, Thr, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 163 é Gly, Ala ou deletado; o aminoácido na posição 164 é Phe ou deletado; o aminoácido na posição 165 é Arg, Lys, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 166 é Ala, Arg, Met, Lys ou Phe; o aminoácido na posição 167 é Vai, Ile, Leu ou His; o aminoácido na posição 168 é Ser, Thr, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 169 é Vai, His, Ile, Leu, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 170 é Phe, Ile, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 171 é Glu, Asn, Gin ou Asp; o aminoácido na posição 172 é Vai, Ala, Arg, Ile, Leu, Gly, Lys, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 175 é Ser, Arg, Thr, Lys ou Trp; o
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154/525 aminoácido na posição 176 é Vai, Leu ou lie; o aminoácido na posição 177 é Arg, Lys, Leu, Vai ou lie; o aminoácido na posição 179 é Thr, lie, Vai, Leu ou Ser; o aminoácido na posição 180 é Leu, Phe, lie, Vai, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 181 é Gly, Thr, Gin, Asn ou Ser; o aminoácido na posição 182 é Ala, Leu, Phe, Vai ou lie; o aminoácido na posição 183 é Thr, Ser, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 184 é Leu, Thr, Ser, lie, Vai, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 185 é Arg, Gly, Asp, Lys, Glu ou Ala; o aminoácido na posição 186 é Pro, Vai, lie, Leu, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 187 é Asp, Thr, Glu ou Ser; o aminoácido na posição 188 é His, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 189 é Ala, Arg, Pro, Lys, Gly ou deletado; o aminoácido na posição 190 é Leu, Asn, lie, Vai, Gin ou deletado; o aminoácido na posição 191 é Tyr ou deletado; o aminoácido na posição 192 é Ser, lie, Vai, Leu, Thr ou Asn; o aminoácido na posição 193 é Thr, Ser, Glu ou Asp; o aminoácido na posição 194 é Thr ou Ser; o aminoácido na posição 195 é Met ou Thr; o aminoácido na posição 196 é Gin, His, Leu, Asn, lie, Vai, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 197 é Ala, Gly, lie, Vai ou Leu; o aminoácido na posição 198 é Thr, Glu, Ser, Asp, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 199 é Pro, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 200 é Asn, Ser, Thr, Gin, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 201 é Ala, Leu, Glu, Tie, Asp ou Trp; o aminoácido na posição 202 é Ser, Asp, Phe, lie, Vai, Thr, Glu ou Leu; o aminoácido na posição 203 é His, Pro, Gly, Ala, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 204 é lie, Trp, His, Leu, Vai, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 205 é Ser, Asn, Leu, Vai, Thr, Gin ou lie; o aminoácido na posição 206 é Ala, Gly, Asp, Tyr, Glu, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 207 é Phe, Vai, lie ou Leu; o
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155/525 aminoácido na posição 208 é Asn, Ser, Pro, Gin, Thr, Vai, Ile ou Leu; o aminoácido na posição 210 é Arg, Asp, Glu, Lys, Ser ou Tyr; o aminoácido na posição 211 é Ile, Ser, Leu, Vai ou Thr; o aminoácido na posição 212 é Vai, Ala, Ile, Leu, Glu, Gly ou Asp; o aminoácido na posição 214 é Pro, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 215 é Ser ou Thr; o aminoácido na posição 217 é Tyr ou Phe; o aminoácido na posição 218 é Arg, Lys, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 219 é Vai, Ile, Leu ou Ala; o aminoácido na posição 220 é Cys, Leu, Ile, Vai, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 221 é Pro ou His; o aminoácido na posição 222 é Leu, Arg, Lys, Ile, Vai, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 224 é Asn, Gin, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 225 é Asp, Arg, Glu, Lys, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 226 é Thr, Ser, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 227 é Asp, Leu, Glu, Ile, Vai ou deletado; o aminoácido na posição 228 é Thr, Ser ou deletado; o aminoácido na posição 229 é Tyr ou deletado; o aminoácido na posição 230 é Leu, Ile, Vai ou deletado; o aminoácido na posição 231 é Gly, Ala ou deletado; o aminoácido na posição 232 é Ile, Leu, Vai ou deletado; o aminoácido na posição 233 é Pro ou deletado; o aminoácido na posição 234 é Ala, Pro, Gly ou deletado; o aminoácido na posição 235 é Asp, Ile, Leu, Glu ou Vai; o aminoácido na posição 236 é Vai, Ser, Ile, Leu, Thr, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 237 é Ala, Phe ou Tyr; o aminoácido na posição 238 é Ala, Gly, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 239 é Vai, Ser, Ile, Leu, Thr, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 240 é Leu, Vai ou Ile; o aminoácido na posição 243 é Asp ou Glu; o aminoácido na posição 249 é Asn, Gin, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 252 é Leu, Ile, Vai ou Met; o aminoácido na posição 257 é Thr ou Ser; o aminoácido na
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156/525 posição 259 é His, Ile, Vai ou Leu; o aminoácido na posição 266 é Ala, Ile, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 267 é Cys, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 268 é His, Arg, Lys ou Tyr; o aminoácido na posição 272 é Asp ou Glu; o aminoácido na posição 273 é Vai, Met, lie ou Leu; o aminoácido na posição 274 é Vai, lie, Leu ou Met; o aminoácido na posição 278 é Gly ou Ala; o aminoácido na posição 279 é Glu, Asp, Gly ou Vai; o aminoácido na posição 281 é Leu, Ile, Vai, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 282 é Asn, Leu ou Ile; o aminoácido na posição 285 é Asn, Gin, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 286 é Lys, Asp, Arg ou Glu; o aminoácido na posição 287 é Leu, Ile ou Vai; o aminoácido na posição 290 é Pro, Gin, Asn, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 291 é Leu, Ile ou Vai; o aminoácido na posição 292 é Lys, Arg, Ile, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 293 é Glu, Asp, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 294 é Ser, Asn, Thr, Gin, Arg ou Lys; o aminoácido na posição 295 é Thr ou Ser; o aminoácido na posição 296 é Gin, Asn ou His; o aminoácido na posição 297 é Leu, lie, Vai ou Met; o aminoácido na posição 300 é Ser ou Thr; o aminoácido na posição 301 é Glu, Asp, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 302 é Ser, Pro, Thr, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 304 é Lys, Arg, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 313 é Vai, Leu ou Ile; o aminoácido na posição 314 é His, Glu, Asn, Asp ou Gin; o aminoácido na posição 315 é Ala, Cys, Gly, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 316 é Ala, Ile, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 317 é Met, Leu, Vai ou Ile; o aminoácido na posição 319 é Met, Leu, Vai ou Ile; o aminoácido na posição 320 é Vai, Ile, Leu, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 321 é Arg, Lys ou Pro; o aminoácido na posição 322 é Ile, Leu, Vai ou Phe; o aminoácido na posição 323 é Gly, Ile,
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Leu ou Vai; o aminoácido na posição 324 é Leu, lie, Vai, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 336 é Ser, Thr, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 339 é Asn, Lys, Gin ou Arg; o aminoácido na posição 350 é Arg, Lys, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 351 é Glu ou Asp; o aminoácido na posição 353 é Lys ou Arg; o aminoácido na posição 354 é Gin, Asn, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 355 é Phe, lie, Leu ou Leu; o aminoácido na posição 356 é Lys ou Arg; o aminoácido na posição 360 é lie, Vai, Leu, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 365 é Leu, lie, Vai ou Phe; o aminoácido na posição 371 é ou Glu ou Asp; o aminoácido na posição 372 é ou Lys ou Arg; o aminoácido na posição 374 é Arg ou Lys; o aminoácido na posição 376 é Phe, lie, Vai ou Leu; o aminoácido na posição 378 é Glu ou Asp; o aminoácido na posição 381 é Leu, lie ou Vai; o aminoácido na posição 388 é Ala, Thr, Gly ou Ser; o aminoácido na posição 395 é Arg ou Lys; o aminoácido na posição 396 é Glu, Gin, Asp, Asn, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 399 é Asp, Gin, Glu ou Asn; o aminoácido na posição 400 é Asn, Thr, Ser, Glu, Gin ou Asp; o aminoácido na posição 401 é Thr, Ser, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 402 é Phe, lie, Vai ou Leu; o aminoácido na posição 406 é Asp ou Glu; o aminoácido na posição 408 é Leu, lie, Vai ou Met; o aminoácido na posição 410 é Gly, lie, Vai, Ala ou Leu; o aminoácido na posição 414 é
Ala, Gly, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 416 é Ser, Asn,
Thr, Gin, Glu ou Asp; o aminoácido na posição 417 é Ser, Arg,
Lys, Thr, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 423 é Lys, Arg,
Asn ou Gin; o aminoácido na posição 431 é Arg ou Lys; o aminoácido na posição 432 é Gin, Asn, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 436 é Arg, Lys, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 440 é Asn, Gin, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 442 é Leu, lie ou Vai;
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158/525 o aminoácido na posição 447 é Ser, Lys, Thr ou Arg; o aminoácido na posição 448 é Ala, Gly, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 451 é Gin, Asn ou Met; o aminoácido na posição 453 é Gly ou Ala; o aminoácido na posição 455 é Ala, Leu, lie ou Vai; o aminoácido na posição 457 é Leu, lie ou Vai; o aminoácido na posição 467 é Vai, lie, Leu, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 471 é Gly ou Ala; o aminoácido na posição 475 é Ser, Thr, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 483 é Gly ou Ala; o aminoácido na posição 493 é Gin, Asn ou Gly; o aminoácido na posição 504 é Vai, Leu ou lie; o aminoácido na posição 506 é Asp, Glu ou His; o aminoácido na posição 509 é Asp, Glu, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 510 é Ser, Thr, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 512 é Glu ou Asp; o aminoácido na posição 515 é Gly, Ala, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 516 é Gin, Asn ou His; o aminoácido na posição 517 é lie, Vai ou Leu; o aminoácido na posição 519 é Asp, Asn, Glu, Gly ou Gin; o aminoácido na posição 522 é Vai, Glu, Pro, lie, Leu ou Asp; o aminoácido na posição 525 é Glu ou Asp; o aminoácido na posição 526 é Leu, Tie, Vai ou Met; o aminoácido na posição 539 é Vai, Leu ou lie; o aminoácido na posição 555 é Vai, Leu, lie ou Ala; o aminoácido na posição 557 é Arg ou Lys; o aminoácido na posição 563 é Vai, Leu, lie ou Met; o aminoácido na posição 571 é Ser, Thr ou Cys; o aminoácido na posição 575 é Vai, Leu, Tie, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 577 é Met, Leu, Vai ou lie; o aminoácido na posição 579 é Glu, Asp, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 583 é Asp ou Glu; o aminoácido na posição 589 é Met, lie, Vai ou Leu; o aminoácido na posição 590 é Met, lie, Vai ou Leu; o aminoácido na posição 593 é Met, Leu, Vai ou lie; o aminoácido na posição 595 é Arg, Lys, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 596 é Ser ou
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Thr; o aminoácido na posição 597 é Gin, Asn ou His; o aminoácido na posição 607 é Ala, Gly, lie, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 608 é Asp, Glu, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 612 é Tyr, His ou Phe; o aminoácido na posição 617 é Thr, Ser, Leu, Vai ou lie; o aminoácido na posição 618 é Gin, Asn ou His; o aminoácido na posição 625 é Arg, Lys, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 626 é Met, Leu, Vai ou lie; o aminoácido na posição 628 é Leu, Vai ou lie; o aminoácido na posição 633 é lie, Leu, Vai ou Met; o aminoácido na posição 634 é Leu, Tie, Vai ou Met; o aminoácido na posição 642 é Arg, Lys ou Met; o aminoácido na posição 648 é Met, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 651 é Glu, Asp, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 654 é Thr, Vai, Ser, lie, Leu, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 658 é Gly, Lys, Ala ou Arg; o aminoácido na posição 663 é Gly ou Ala; o aminoácido na posição 664 é Asp, Glu, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 668 é Ala, Gly, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 669 é Gin, Asn ou His; o aminoácido na posição 671 é Asn, Gin, Thr ou Ser o aminoácido na posição 675 é lie, Vai, lie, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 678 é Met, lie, Ala, Leu, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 682 é Pro, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 683 é Ser, Thr ou Pro; o aminoácido na posição 685 é Asp, Glu, Asp ou Asn; o aminoácido na posição 694 é Asp, Glu, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 697 é Asn, Gin, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 704 é Glu, Asp, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 714 é Ala ou Gly; o aminoácido na posição 721 é Ser, Thr ou Phe; o aminoácido na posição 722 é Ser, Thr, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 724 é Ser ou Thr; o aminoácido na posição 734 é His, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 736 é Vai, Leu, lie ou Ala; o aminoácido na posição 737 é Lys, Arg, Asn ou Gin;
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160/525 o aminoácido na posição 739 é Ala, Gly, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 740 é Ser, Thr ou Met; o aminoácido na posição 741 é Gly, Ala, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 742 é Ile, Leu, Vai, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 743 é Gly ou deletado;
o aminoácido na posição 745 é Gly, Ala, Glu ou Asp; o aminoácido na posição 751 é Thr, Ser, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 753 é Gin, Asn, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 754 é Thr ou Ser; o aminoácido na posição 756 é Thr, Ser, Leu, Vai ou Ile; o aminoácido na posição 757 é Vai, Leu ou Ile; o aminoácido na posição 766 é Ile, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 773 é Asp ou Glu; o aminoácido na posição 774 é Gin, Asn, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 776 é Leu, lie, Vai ou Met; o aminoácido na posição 777 é Pro, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 782 é Ala, Asp, Glu, Ile, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 786 é Tyr ou Phe; o aminoácido na posição 787 é His, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 788 é Tyr ou Met; o aminoácido na posição 789 é Ala, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 790 é Tyr ou Thr;
o aminoácido na posição 791 é Arg, Lys, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 792 é Leu, Ile, Vai, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 796 é Asp ou Glu; o aminoácido na posição 797 é Ser, Thr ou Ala o aminoácido na posição 802 é Glu, Lys, Asp, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 806 é Gin, Asp, Glu, Asn ou His; o aminoácido na posição 810 é Lys, Arg ou Thr; o aminoácido na posição 819 é Arg, Lys ou His; o aminoácido na posição 829 é Lys, Ser, Ala ou Pro; o aminoácido na posição 832 é Ala, Lys, Arg, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 833 é Gly, Ala, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 842 é Leu, lie, Vai ou Pro; o aminoácido na posição 847 é Gin, Asn, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 848 é Ile, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 849 é
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Vai, Leu, lie, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 855 é Thr, Ser ou Met; o aminoácido na posição 860 é lie, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 864 é His, Asn ou Gin;
[0140] Em algumas modalidades, o polipeptideo PtIP-83 é uma variante da SEQ ID NO: 1, em que o aminoácido na posição 1 é Met ou deletado; o aminoácido na posição 2 é Ala ou deletado; o aminoácido na posição 3 é Leu, Vai, Ile ou deletado; o aminoácido na posição 4 é Vai, Met, lie ou Leu; o aminoácido na posição 7 é Gly, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 8 é Lys, Arg, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 10 é Phe, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 11 é Glu, Asp, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 18 é Met, Vai, Leu ou Ile; o aminoácido na posição 19 é Gly, Pro ou Ala; o aminoácido na posição 20 é Vai, Ile, Leu ou deletado; o aminoácido na posição 21 é Leu, Ile ou Vai; o aminoácido na posição 23 é Arg, Lys, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 37 é Vai, Ile ou Leu; o aminoácido na posição 38 é Arg, Lys, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 40 é Ala, Gly, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 43 é Asn, Gin, Glu ou Asp; o aminoácido na posição 45 é Gly ou Ala; o aminoácido na posição 46 é Gin, Asp, Asn ou Glu; o aminoácido na posição 48 é Glu, Asp, Pro, lie, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 51 é Glu, Asp, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 52 é Lys, Arg, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 53 é Vai, Ala, Cys ou Thr; o aminoácido na posição 54 é Lys, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, lie, Leu, Met, Asn, Gin, Arg, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 55 é Arg, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Gin, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 56 é Leu, Glu, Phe, lie, Met, Thr ou Vai; o aminoácido na posição 57 é Tyr, Cys, lie, Leu, Met, Thr ou Vai; o aminoácido na posição 58
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162/525 é Vai, Cys, Ile ou Leu; o aminoácido na posição 59 é Phe, Leu,
Met, Vai ou Tyr; o aminoácido na posição 60 é Ala, Cys, Gly, Ser, Thr ou Vai; o aminoácido na posição 61 é Asp, Glu, His ou
Ser; o aminoácido na posição 62 é Vai, Ala, Cys, Ile, Leu ou
Thr; o aminoácido na posição 63 é Vai, Ala, Cys, lie, Leu, Met
ou Thr; o aminoácido na pos ição 64 é Glu, Ala, Cys, Phe r Gly,
His, lie, Leu, Met, Asn, Gin , Arg, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o
aminoácido na posição 65 é Leu, Ala, Cys, Phe, His, Ile Met,
Asn, Gin, Thr, Vai ou Trp; o aminoácido na posição 66 é Pro,
Asp, Gly, Met, Gin ou Arg; o aminoácido na posição 67 é Vai,
Pro, lie, Leu, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 68 é Vai,
Arg, Phe, Ile, Leu, Lys ou Gly; o aminoácido na posição 69 é
Glu, Ala, Asp, Gly, Arg ou Lys ; o aminoácido na posição 70 é
Trp, Thr, His, Tyr, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 71 é
Arg, Pro, Lys ou deletado; o aminoácido na posição 72 é Trp, Asp, Leu, Ile, Vai, Glu ou deletado; o aminoácido na posição 73 é Pro, Gin, Asn, His ou deletado; o aminoácido na posição 74 é Pro, Met, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 75 é Gin, His, Asn, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 76 é lie, Met, Vai ou Leu; o aminoácido na posição 84 é Ile, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 91 é Trp ou Phe; o aminoácido na posição 93 é Thr, Ser, Leu, Vai ou Ile; o aminoácido na posição 94 é Asp, Glu, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 96 é Arg, Lys, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 97 é Gin, Phe, Asn, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 98 é Ser, Thr ou deletado; o aminoácido na posição 99 é Asp, Glu, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 100 é Thr, Ser, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 101 é Glu, Thr, Asp, Ser ou Trp o aminoácido na posição 103 é His, Arg, Lys, Glu ou Gin; o aminoácido na posição 105 é Thr, Ser ou Pro; o
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163/525 aminoácido na posição 108 é Lys, Arg, Asn, Asp, Gin ou Glu; o aminoácido na posição 109 é Leu, Ile ou Vai; o aminoácido na posição 111 é Ala, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 112 é Ile, Arg, Thr, Leu, Vai, Lys, Ser ou deletado; o aminoácido na posição 113 é Gin, Ala, Gly, Asn ou deletado; o aminoácido na posição 114 é Arg, Glu, Lys, Asp ou Ile; o aminoácido na posição 115 é Glu, Asp, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 116 é Glu, Asn, Gin, Asp, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 117 é Asn, Vai, Tyr, Ile, Leu, Gin, Trp ou Phe; o aminoácido na posição 118 é Arg ou Lys; o aminoácido na posição 119 é Trp, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 122 é Thr, Lys, Ser, Arg ou Ala; o aminoácido na posição 124 é Ala, Gly, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 126 é Gly, Ala, Glu ou Asp; o aminoácido na posição 127 é Met, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 128 é Asn, Gin, Arg ou Lys; o aminoácido na posição 131 é Vai, Ile, Leu, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 133 é Ile, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 134 é His ou Tyr; o aminoácido na posição 135 é Ala ou Gly; o aminoácido na posição 137 é Glu, Asp, Arg ou Lys; o aminoácido na posição 139 é Gin, Asn, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 140 é Vai, Arg, Ile, Lys ou Leu; o aminoácido na posição 141 é Gly, Ala, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 142 é Vai, lie, Leu ou Pro; o aminoácido na posição 144 é Thr, Leu, Phe, Ile, Vai ou Tyr; o aminoácido na posição 145 é Met, Pro, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 146 é Ser, Gly, Thr, Ala, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 147 é Trp, Gin, Tyr ou Asn; o aminoácido na posição 148 é Ser, Ala, Thr, Gly ou Pro; o aminoácido na posição 149 é Ser, Thr ou deletado; o aminoácido na posição 150 é Vai, Ile, Leu ou Tyr; o aminoácido na posição 152 é Arg, Ala, Vai, Ile, Leu, Lys ou Gly; o aminoácido na
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164/525 posição 154 é Ser, Trp, Thr, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 156 é Leu, Asp, Ile, Vai, Asn, Glu ou Gin; o aminoácido na posição 158 é Ser, Thr ou Cys; o aminoácido na posição 159 é Vai, Thr, Leu ou Ile; o aminoácido na posição 162 é Ser, Thr, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 163 é Gly, Ala ou deletado; o aminoácido na posição 164 é Phe ou deletado; o aminoácido na posição 165 é Arg, Lys, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 166 é Ala, Arg, Met, Lys ou Phe; o aminoácido na posição 167 é Vai, Ile, Leu ou His; o aminoácido na posição 168 é Ser, Thr, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 169 é Vai, His, Ile, Leu, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 170 é Phe, Ile, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 171 é Glu, Asn, Gin ou Asp; o aminoácido na posição 172 é Vai, Ala, Arg, Ile, Leu, Gly, Lys, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 175 é Ser, Arg, Thr, Lys ou Trp; o aminoácido na posição 176 é Vai, Leu ou Ile; o aminoácido na posição 177 é Arg, Lys, Leu, Vai ou Ile; o aminoácido na posição 179 é Thr, Ile, Vai, Leu ou Ser; o aminoácido na posição 180 é Leu, Phe, Ile, Vai, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 181 é Gly, Thr, Gin, Asn ou Ser; o aminoácido na posição 182 é Ala, Leu, Phe, Vai ou Ile; o aminoácido na posição 183 é Thr, Ser, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 184 é Leu, Thr, Ser, Ile, Vai, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 185 é Arg, Gly, Asp, Lys, Glu ou Ala; o aminoácido na posição 186 é Pro, Vai, Ile, Leu, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 187 é Asp, Thr, Glu ou Ser; o aminoácido na posição 188 é His, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 189 é Ala, Arg, Pro, Lys, Gly ou deletado; o aminoácido na posição 190 é Leu, Asn, Ile, Vai, Gin ou deletado; o aminoácido na posição 191 é Tyr ou deletado; o aminoácido na posição 192 é Ser, Ile, Vai, Leu, Thr ou Asn; o aminoácido na
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165/525 posição 193 é Thr, Ser, Glu ou Asp; o aminoácido na posição 194 é Thr ou Ser; o aminoácido na posição 195 é Met ou Thr; o aminoácido na posição 196 é Gin, His, Leu, Asn, Ile, Vai, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 197 é Ala, Gly, Ile, Vai ou Leu; o aminoácido na posição 198 é Thr, Glu, Ser, Asp, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 199 é Pro, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 200 é Asn, Ser, Thr, Gin, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 201 é Ala, Leu, Glu, Ile, Asp ou Trp; o aminoácido na posição 202 é Ser, Asp, Phe, Ile, Vai, Thr, Glu ou Leu; o aminoácido na posição 203 é His, Pro, Gly, Ala, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 204 é Ile, Trp, His, Leu, Vai, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 205 é Ser, Asn, Leu, Vai, Thr, Gin ou Ile; o aminoácido na posição 206 é Ala, Gly, Asp, Tyr, Glu, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 207 é Phe, Vai, Ile ou Leu; o aminoácido na posição 208 é Asn, Ser, Pro, Gin, Thr, Vai, Ile ou Leu; o aminoácido na posição 210 é Arg, Asp, Glu, Lys, Ser ou Tyr; o aminoácido na posição 211 é Ile, Ser, Leu, Vai ou Thr; o aminoácido na posição 212 é Vai, Ala, Ile, Leu, Glu, Gly ou Asp; o aminoácido na posição 214 é Pro, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 215 é Ser ou Thr; o aminoácido na posição 217 é Tyr ou Phe; o aminoácido na posição 218 é Arg, Lys, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 219 é Vai, Ile, Leu ou Ala; o aminoácido na posição 220 é Cys, Leu, Ile, Vai, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 221 é Pro ou His; o aminoácido na posição 222 é Leu, Arg, Lys, Ile, Vai, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 224 é Asn, Gin, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 225 é Asp, Arg, Glu, Lys, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 226 é Thr, Ser, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 227 é Asp, Leu, Glu, Ile, Vai ou deletado; o aminoácido na posição 228 é Thr, Ser ou
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166/525 deletado; o aminoácido na posição 229 é Tyr ou deletado; o aminoácido na posição 230 é Leu, lie, Vai ou deletado; o aminoácido na posição 231 é Gly, Ala ou deletado; o aminoácido na posição 232 é lie, Leu, Vai ou deletado; o aminoácido na posição 233 é Pro ou deletado; o aminoácido na posição 234 é Ala, Pro, Gly ou deletado; o aminoácido na posição 235 é Asp, lie, Leu, Glu ou Vai; o aminoácido na posição 236 é Vai, Ser, lie, Leu, Thr, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 237 é Ala, Phe ou Tyr; o aminoácido na posição 238 é Ala, Gly, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 239 é Vai, Ser, lie, Leu, Thr, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 240 é Leu, Vai ou lie; o aminoácido na posição 243 é Asp ou Glu; o aminoácido na posição 249 é Asn, Gin, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 252 é Leu, lie, Vai ou Met; o aminoácido na posição 257 é Thr ou Ser; o aminoácido na posição 259 é His, lie, Vai ou Leu; o aminoácido na posição 266 é Ala, lie, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 267 é Cys, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 268 é His, Arg, Lys ou Tyr; o aminoácido na posição 272 é Asp ou Glu; o aminoácido na posição 273 é Vai, Met, lie ou Leu; o aminoácido na posição 274 é Vai, Tie, Leu ou Met; o aminoácido na posição 278 é Gly ou Ala; o aminoácido na posição 279 é Glu, Asp, Gly ou Vai; o aminoácido na posição 281 é Leu, lie, Vai, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 282 é Asn, Leu ou lie; o aminoácido na posição 285 é Asn, Gin, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 286 é Lys, Asp, Arg ou Glu; o aminoácido na posição 287 é Leu, lie ou Vai; o aminoácido na posição 290 é Pro, Gin, Asn, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 291 é Leu, lie ou Vai; o aminoácido na posição 292 é Lys, Arg, lie, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 293 é Glu, Asp, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 294 é Ser,
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Asn, Thr, Gin, Arg ou Lys; o aminoácido na posição 295 é Thr ou Ser; o aminoácido na posição 296 é Gin, Asn ou His; o aminoácido na posição 297 é Leu, Tie, Vai ou Met; o aminoácido na posição 300 é Ser ou Thr; o aminoácido na posição 301 é Glu, Asp, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 302 é Ser, Pro, Thr, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 304 é Lys, Arg, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 313 é Vai, Leu ou Tie; o aminoácido na posição 314 é His, Glu, Asn, Asp ou Gin; o aminoácido na posição 315 é Ala, Cys, Gly, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 316 é Ala, Tie, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 317 é Met, Leu, Vai ou Tie; o aminoácido na posição 319 é Met, Leu, Vai ou Tie; o aminoácido na posição 320 é Vai, Tie, Leu, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 321 é Arg, Lys ou Pro; o aminoácido na posição 322 é Tie, Leu, Vai ou Phe; o aminoácido na posição 323 é Gly, Tie, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 324 é Leu, Tie, Vai, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 336 é Ser, Thr, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 339 é Asn, Lys, Gin ou Arg; o aminoácido na posição 350 é Arg, Lys, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 351 é Glu ou Asp; o aminoácido na posição 353 é Lys ou Arg; o aminoácido na posição 354 é Gin, Asn, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 355 é Phe, Tie, Leu ou Leu; o aminoácido na posição 356 é Lys ou Arg; o aminoácido na posição 360 é Tie, Vai, Leu, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 363 é Gin, Ala, Cys, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Asn, Arg, Ser, Thr, Vai ou Trp; o aminoácido na posição 364 é Tie, Ala, Cys, Glu, Phe, His, Lys, Leu, Met, Asn, Gin, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 365 é Leu, Ala, Glu, Phe, Gly, His, Tie, Lys, Met, Asn, Arg, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 366 é Gly, Ala, Cys, Phe, His, Tie, Lys, Leu, Met, Asn, Ser, Thr ou Vai; o
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aminoácido na posição 367 é Ser, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly,
His, lie, Leu , Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Thr, Vai ou Trp; o
aminoácido na posição 368 é Tyr, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly,
His, lie, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai ou Trp; o aminoácido na posição 369 é Leu, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, lie, Met, Thr ou Vai; o aminoácido na posição 370 é Leu, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, lie, Lys, Met, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 371 é Gin, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, lie, Lys, Leu, Asn, Arg, Ser, Thr, Vai ou Trp; o aminoácido na posição 372 é Gin, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Arg, Ser, Vai ou Tyr; o aminoácido na posição 373 é Asn, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His, lie, Lys, Gin, Ser, Thr, Vai ou Trp; o aminoácido na posição 374 é Arg ou Lys; o aminoácido na posição 376 é Phe, lie, Vai ou Leu; o aminoácido na posição 378 é Glu ou Asp; o aminoácido na posição 381 é Leu, lie ou Vai; o aminoácido na posição 388 é Ala, Thr, Gly ou Ser; o aminoácido na posição 395 é Arg ou Lys; o aminoácido na posição 396 é Glu, Gin, Asp, Asn, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 399 é Asp, Gin, Glu ou Asn; o aminoácido na posição 400 é Asn, Thr, Ser, Glu, Gin ou Asp; o aminoácido na posição 401 é Thr, Ser, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 402 é Phe, lie, Vai ou Leu; o aminoácido na posição 406 é Asp ou Glu; o aminoácido na posição 408 é Leu, lie, Vai ou Met; o aminoácido na posição 410 é Gly, lie, Vai, Ala ou Leu; o aminoácido na posição 414 é Ala, Gly, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 416 é Ser, Asn, Thr, Gin, Glu ou Asp; o aminoácido na posição 417 é Ser, Arg, Lys, Thr, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 423 é Lys, Arg, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 431 é Arg ou Lys; o aminoácido na posição 432 é Gin, Asn, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 436
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169/525 é Arg, Lys, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 440 é Asn, Gin, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 442 é Leu, lie ou Vai; o aminoácido na posição 447 é Ser, Lys, Thr ou Arg; o aminoácido na posição 448 é Ala, Gly, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 451 é Gin, Asn ou Met; o aminoácido na posição 453 é Gly ou Ala; o aminoácido na posição 455 é Ala, Leu, lie ou Vai; o aminoácido na posição 457 é Leu, lie ou Vai; o aminoácido na posição 467 é Vai, lie, Leu, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 471 é Gly ou Ala; o aminoácido na posição 475 é Ser, Thr, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 483 é Gly ou Ala; o aminoácido na posição 493 é Gin, Asn ou Gly; o aminoácido na posição 504 é Vai, Leu ou lie; o aminoácido na posição 506 é Asp, Glu ou His; o aminoácido na posição 509 é Asp, Glu, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 510 é Ser, Thr, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 512 é Glu ou Asp; o aminoácido na posição 515 é Gly, Ala, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 516 é Gin, Asn ou His; o aminoácido na posição 517 é lie, Vai ou Leu; o aminoácido na posição 519 é Asp, Asn, Glu, Gly ou Gin; o aminoácido na posição 522 é Vai, Glu, Pro, lie, Leu ou Asp; o aminoácido na posição 525 é Glu ou Asp; o aminoácido na posição 526 é Leu, Tie, Vai ou Met; o aminoácido na posição 539 é Vai, Leu ou lie; o aminoácido na posição 555 é Vai, Leu, lie ou Ala; o aminoácido na posição 556 é Trp, Phe, Thr ou Tyr; o aminoácido na posição 557 é Arg, Cys, Asp, Gly, His, Tie, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 558 é Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Tie, Lys, Leu, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 559 é Lys, Ala, Cys, Phe, Gly, His, lie, Leu, Asn, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai ou Tyr; o aminoácido na posição 560 é Cys, Ala, Phe, Gly, Tie, Met, Asn, Arg, Ser, Thr
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170/525 ou Vai; o aminoácido na posição 561 é Lys, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, lie, Leu, Met, Asn, Arg, Ser, Thr, Vai ou Tyr; o aminoácido na posição 562 é Asn, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Leu, Met, Arg, Ser, Thr, Vai ou Tyr; o aminoácido na posição 563 é Vai, Ala, Cys, Asp, Phe, His, lie, Leu, Met, Asn, Gin, Thr ou Trp; o aminoácido na posição 564 é Ala, Cys, Gly, Met, Gin, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 571 é Ser, Thr ou Cys; o aminoácido na posição 575 é Vai, Leu, Ile, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 577 é Met, Leu, Vai ou Ile; o aminoácido na posição 579 é Glu, Asp, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 583 é Asp ou Glu; o aminoácido na posição 589 é Met, lie, Vai ou Leu; o aminoácido na posição 590 é Met, lie, Vai ou Leu; o aminoácido na posição 593 é Met, Leu, Vai ou Ile; o aminoácido na posição 595 é Arg, Lys, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 596 é Ser ou Thr; o aminoácido na posição 597 é Gin, Asn ou His; o aminoácido na posição 607 é Ala, Gly, Ile, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 608 é Asp, Glu, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 612 é Tyr, His ou Phe; o aminoácido na posição 617 é Thr, Ser, Leu, Vai ou Ile; o aminoácido na posição 618 é Gin, Asn ou His; o aminoácido na posição 625 é Arg, Lys, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 626 é Met, Leu, Vai ou Ile; o aminoácido na posição 628 é Leu, Vai ou Ile; o aminoácido na posição 633 é lie, Leu, Vai ou Met; o aminoácido na posição 634 é Leu, Ile, Vai ou Met; o aminoácido na posição 642 é Arg, Lys ou Met; o aminoácido na posição 646 é Leu, Ala, Cys, Gly, lie, Met, Asn, Gin, Ser, Thr ou Vai; o aminoácido na posição 647 é Leu, Asp, Gly, Met, Asn, Gin ou Thr; o aminoácido na posição 648 é Met, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 649 é Pro,
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Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Met, Asn, Gin, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 650 é Thr, Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Tie, Lys, Leu, Met, Pro, Gin, Arg, Ser, Vai ou Tyr; o aminoácido na posição 651 é Glu, Ala, Cys, Asp, Gly, His, Tie, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai ou Tyr; o aminoácido na posição 652 é Leu, Cys, Phe, Tie, Lys, Met, Pro, Arg, Ser, Thr ou Vai; o aminoácido na posição 653 é Thr, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Tie, Lys, Leu, Pro, Arg, Ser, Vai ou Trp; o aminoácido na posição 654 é Thr, Ala, Cys, Phe, Tie, Lys, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 655 é Trp, Phe ou Tyr; o aminoácido na posição 658 é Gly, Lys, Ala ou Arg; o aminoácido na posição 663 é Gly ou Ala; o aminoácido na posição 664 é Asp, Glu, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 668 é Ala, Gly, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 669 é Gin, Asn ou His; o aminoácido na posição 671 é Asn, Gin, Thr ou Ser o aminoácido na posição 675 é Tie, Vai, Tie, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 678 é Met, Tie, Ala, Leu, Ser ou Thr; o aminoácido na posição 682 é Pro, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 683 é Ser, Thr ou Pro; o aminoácido na posição 685 é Asp, Glu, Asp ou Asn; o aminoácido na posição 694 é Asp, Glu, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 697 é Asn, Gin, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 704 é Glu, Asp, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 714 é Ala ou Gly; o aminoácido na posição 721 é Ser, Thr ou Phe; o aminoácido na posição 722 é Ser, Thr, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 724 é Ser ou Thr; o aminoácido na posição 734 é His, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 736 é Vai, Leu, Tie ou Ala; o aminoácido na posição 737 é Lys, Arg, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 739 é Ala, Gly, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 740 é Ser, Thr ou Met; o aminoácido na posição 741 é
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Gly, Ala, Gin ou Asn; o aminoácido na posição 742 é lie, Leu, Vai, Ala ou Gly; o aminoácido na posição 743 é Gly ou deletado; o aminoácido na posição 745 é Gly, Ala, Glu ou Asp; o aminoácido na posição 751 é Thr, Ser, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 753 é Gin, Asn, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 754 é Thr ou Ser; o aminoácido na posição 756 é Thr, Ser, Leu, Vai ou lie; o aminoácido na posição 757 é Vai, Leu ou lie; o aminoácido na posição 766 é lie, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 771 é Arg, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, lie, Lys, Leu, Asn, Ser, Thr,
Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 772 é Arg, Ala, Cys,
Asp, Glu, Phe, Gly, His, lie, Lys, Leu, Met, Pro, Gin, Ser, Thr,
Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 773 é Asp, Ala, Glu,
Phe, Gly, His, lie, Lys, Leu, Met, Asn, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai,
Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 774 é Gin, Ala, Asp, Gly, His, lie, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 775 é Vai, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, lie, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr ou Tyr; o aminoácido na posição 776 é Leu, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, lie, Lys, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai ou Tyr; o aminoácido na posição 777 é Pro, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Gin, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 778 é Phe, Ala, His, lie, Leu, Met, Asn, Gin, Ser, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 779 é Gin, Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Leu, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr ou Vai; o aminoácido na posição
780 é Ala, Cys, Asn, Pro, Gin ou Ser; o aminoácido na posição
781 é Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, lie, Asn, Gin, Arg,
Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 782 é Ala,
Cys, Asp, Glu, Phe, Gly , His, lie, Lys, Met, Pro, Gin, Arg, Ser,
Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 783 é Pro, Ala,
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Cys, Asp, Glu, Gly, His, Asn, Gin, Arg, Ser, Thr ou Vai; o aminoácido na posição 784 é Leu, Ala, Glu, Phe, His, Tie, Lys, Met, Asn, Pro, Gin, Ser, Thr, Vai ou Trp; o aminoácido na posição 785 é Asn, Ala, Cys, Glu, Phe, Gly, His, Tie, Lys, Leu, Met, Gin, Arg, Ser, Thr, Vai, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 786 é Tyr, Phe, lie, Leu ou Trp; o aminoácido na posição 787 é His, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 788 é Tyr ou Met; o aminoácido na posição 789 é Ala, Lys ou Arg; o aminoácido na posição 790 é Tyr ou Thr; o aminoácido na posição 791 é Arg, Lys, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 792 é Leu, Tie, Vai, Thr ou Ser; o aminoácido na posição 796 é Asp ou Glu; o aminoácido na posição 797 é Ser, Thr ou Ala o aminoácido na posição 802 é Glu, Lys, Asp, Asn ou Gin; o aminoácido na posição 806 é Gin, Asp, Glu, Asn ou His; o aminoácido na posição 810 é Lys, Arg ou Thr; o aminoácido na posição 819 é Arg, Lys ou His; o aminoácido na posição 829 é Lys, Ser, Ala ou Pro; o aminoácido na posição 832 é Ala, Lys, Arg, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 833 é Gly, Ala, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 842 é Leu, Tie, Vai ou Pro; o aminoácido na posição 847 é Gin, Asn, Asp ou Glu; o aminoácido na posição 848 é Tie, Leu ou Vai; o aminoácido na posição 849 é Vai, Leu, Tie, Gly ou Ala; o aminoácido na posição 855 é Thr, Ser ou Met; o aminoácido na posição 860 é Tie, Leu ou Vai; e o aminoácido na posição 864 é His, Asn ou Gin.
[0141] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo PtIP-83 é derivada de uma espécie de samambaia da Divisão Pterídophyta. Em algumas modalidades, o polipeptídeo PtIP-83 é derivado de uma espécie de samambaia da Classe Psílotopsída. Em algumas modalidades, o polipeptídeo PtIP-83 é derivado de uma espécie de samambaia da
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Classe Psilotopsida, Ordem Psilotales. Em algumas modalidades, o polipeptídeo PtIP-83 é derivado de uma espécie de samambaia da Classe Psilotopsida, Ordem Ophíoglossales. Em algumas modalidades, o polipeptídeo PtIP-83 é derivado de uma espécie de samambaia da Classe Psilotopsida, Ordem Ophíoglossales, Família Psilotaceae. Em algumas modalidades, o polipeptídeo PtIP-83 é derivado de uma espécie de samambaia da Classe Psilotopsida , Ordem Ophíoglossales Família Ophioglossaceae. Em algumas modalidades, o polipeptídeo PtIP-83 é derivado de uma espécie de samambaia do Gênero Ophioglossum L., Botrychium, Botrypus, Helminthostachys, Ophioderma, Cheiroglossa, Sceptridium ou Mankyua. Em algumas modalidades, o polipeptídeo PtIP-83 é derivado de uma espécie de samambaia da Classe Polypodiopsida/Pteridopsida. Em algumas modalidades, o polipeptídeo PtIP-83 é derivado de uma espécie de samambaia da Ordem Osmundales (samambaias reais); Família Osmundaceae. Em algumas modalidades, o polipeptídeo PtIP-83 é derivado de uma espécie de samambaia da Ordem Hymenophyllales; Família Hymenophyllaceae. Em algumas modalidades, o polipeptídeo PtIP83 é derivado de uma espécie de samambaia da Ordem Gleichenlales; Família Gleicheniaceae, Família Dipteridaceae ou Família Matoniaceae. Em algumas modalidades, o polipeptídeo PtIP-83 é derivado de uma espécie de samambaia da Ordem Schizaeales; Família Lygodiaceaer Família Anemiaceae ou Família Schizaeaceae. Em algumas modalidades, o polipeptídeo PtIP-83 é derivado de uma espécie de samambaia da Ordem Schizaeales; Família Schizaeaceae, Gênero Lygodium selecionada a partir de, mas sem limitação Lygodium articulation, Lygodium circinatum, Lygodium conforme, Lygodium cubense, Lygodium digitatum, Lygodium flexuosum,
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Lygodium heterodoxum, Lygodium j aponicum, Lygodium kerstenii,
Lygodium lanceolatum, Lygodium long!folium, Lygodium merrilii,
Lygodium micans, Lygodium microphyHum, Lygodium microstachyum,
Lygodium oligostachyum, Lygodium palmatum,
Lygodium polystachyum, Lygodium radiatum, Lygodium reticulatum, Lygodium salicifolium, Lygodium scandens, Lygodium smithianum,
Lygodium subareolatum, Lygodium trifurcatum,
Lygodium venustum,
Lygodium versteeghii, Lygodium volubile, e Lygodium yannanense.
[0142] Em algumas modalidades, o polipeptideo PtIP-83 é derivado de uma espécie de samambaia da Ordem Salviniales; Família Marsileaceae ou Família Salviniaceae. Em algumas modalidades, o polipeptideo PtIP-83 é derivado de uma espécie de samambaia da Ordem Cyatheales; Família Thyrsopteridaceae , Família Loxsomataceae, Família Culcitaceae, Família Plagiogyriaceaer Família Cibotiaceaer Família Cyatheaceae, Família Dicksoniaceae ou Família Metaxyaceae.
[0143] Em algumas modalidades, o polipeptideo PtIP-83 é derivado de uma espécie de samambaia da Ordem Polypodiales; Família Lindsaeaceae, Família Saccolomataceaer Família Cystodiaceae, Família Dennstaedtiaceae, Família Pteridaceae, Família Aspleniaceae, Família Thelypteridaceae , Família Woodsiaceae, Família Onocleaceae, Família Blechnaceaer Família Dryopteridaceaer Família Lomariopsidaceae, Família Tectariaceae, Família Oleandraceae, Família Davalliaceae ou Família Polypodiaceae.
[0144] Em algumas modalidades, o polipeptideo PtIP-83 é derivado de uma espécie de samambaia da Ordem Polypodiales, Família Pteridaceae, Gênero Adiantaceae selecionada a partir de, mas sem limitação Adiantum aethiopicum, Adiantum aleuticum,
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Adiantum bonatianum, Adiantum cajennense, Adiantum capillusjunonis, Adiantum capillus-j unonis, Adiantum caudatum, Adiantum chienii, Adiantum chilense, Adiantum cuneatum, Adiantum cunninghamii, Adiantum davidii, Adiantum diaphanum, Adiantum edentulum, Adiantum edgeworthii, Adiantum excisum, Adiantum fengianum, Adiantum fimbriatum, Adiantum flabellulatum, Adiantum formosanum, Adiantum formosanum, Adiantum fulvum, Adiantum gravesn
Adiantum hispidulum
Adiantum induratum
Adiantum j ordanii
Adiantum juxtapositum, Adiantum latifolium,
Adiantum leveillei
Adiantum lianxianense, Adiantum malesianum,
Adiantum mariesii,
Adiantum monochlamys, Adiantum myriosorum,
Adiantum obliquum,
Adiantum ogasawarense, Adiantum pedatum,
Adiantum pentadactylon, Adiantum peruvianum, Adiantum philippense,
Adiantum princeps, Adiantum pubescens, Adiantum raddianum,
Adiantum reniforme, Adiantum roborowskii, Adiantum serratodentatum, Adiantum sinicum, Adiantum soboliferum, Adiantum subcordatum, Adiantum tenerum, Adiantum terminatum, Adiantum tetraphyllum, Adiantum trapeziforme, Adiantum venustum, Adiantum viridescens, e Adiantum viridimontanum.
[0145] Em algumas modalidades, o polipeptídeo PtIP-83 é derivado de uma espécie de samambaia da Ordem Polypodiales, Família Aspleniaceae, Gênero Asplenium.
[0146] Em algumas modalidades, o polipeptídeo PtIP-83 é derivado de uma espécie de samambaia da Ordem Polypodiales, Família Aspleniaceae, Gênero AspleniumI selecionada a partir de, mas sem limitação Asplenium adiantum, Asplenium adulterinum, Asplenium aequibasis, Asplenium aethiopicum, Asplenium africanum, Asplenium * alternifolium, Asplenium angustum , Asplenium antiquum, Asplenium ascensionis, Asplenium attenuatum,
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 180/553
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Asplenium aureum, Asplenium auritum, Asplenium australasicum, Asplenium azoricum, Asplenium bifrons, Asplenium billottii, Asplenium bipinnatifidum, Asplenium brachycarpum, Asplenium bradleyi, Asplenium bulbiferum, Asplenium caudatum, Asplenium ceterach, Asplenium compressum, Asplenium congestum, Asplenium corderoanum, Asplenium crinicaule, Asplenium cristatum, Asplenium cunei folium , Asplenium cymbifolium, Asplenium daghestanicum, Asplenium dalhousiae , Asplenium dareoides,
Asplenium daucifolium, Asplenium difforme , Asplenium fissum,
Asplenium dimorphum, Asplenium divaricatum, Asplenium dregeanum,
Asplenium * ebenoides, Asplenium ecuadorense, Asplenium feel
Kunze, Asplenium fissum, Asplenium flabellifolium, Asplenium flaccidum, Asplenium fontanum, Asplenium forisiense, Asplenium formosum, Asplenium gemmiferum, Asplenium * germanicum, Asplenium gueinzii, Asplenium goudeyi, Asplenium hemionitis, Asplenium hermannii-christii, Asplenium hookerianum, Asplenium hybridum, Asplenium incisum, Asplenium * j acksonii, Asplenium * kenzoi, Asplenium laciniatum, Asplenium lamprophyllum, Asplenium laserpitiifolium, Asplenium lepidum, Asplenium listeri, Asplenium longissimum, Asplenium lucidum, Asplenium lunulatum, Asplenium lyallii, Asplenium macedonicum, Asplenium majoricum, Asplenium marinum, Asplenium * microdon, Asplenium milnei Carruth, Asplenium montanum, Asplenium musifolium, Asplenium nidus, Asplenium normale, Asplenium obliquum, Asplenium oblongifolium, Asplenium obovatum, Asplenium obtusatum, Asplenium oligolepidum, Asplenium oligolepidum, Asplenium onopteris, Asplenium pacificum, Asplenium paleaceum, Asplenium palmeri, Asplenium petrarchae, Asplenium pinnatifidum, Asplenium planicaule, Asplenium platybasis, Asplenium platybasis,
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 181/553
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Asplenium polyodon, Asplenium praemorsum, Asplenium prolongation, Asplenium pteridoides, Asplenium resiliens, Asplenium rhizophyllum, Asplenium richardii, Asplenium ruprechtii, Asplenium ruta-muraria, Asplenium rust!folium, Asplenium sagittatum, Asplenium sandersonii, Asplenium * sarniense, Asplenium schizotrichum, Asplenium schweinfurthii, Asplenium scleroprium, Asplenium scolopendrium (sin. Phyllitis scolopendrium), Asplenium seelosii, Asplenium septentrionale, Asplenium septentrionale, Asplenium serra, Asplenium serratum, Asplenium sessilifolium, Asplenium shuttleworthianum, Asplenium simplicifrons, Asplenium splendens, Asplenium surrogatum, Asplenium tenerum, Asplenium terrestre, Asplenium theciferum, Asplenium thunbergii, Asplenium trichomanes, Asplenium tutwilerae, Asplenium vespertinum, Asplenium vieillardii, Asplenium virens, Asplenium viride, Asplenium vitti forme, e Asplenium viviparum.
[0147] Em algumas modalidades, o polipeptídeo PtIP-83 é derivado de uma espécie de samambaia da Ordem Polypodiales, Família Blechnaceae, Gênero Blecnum.
[0148] Em algumas modalidades, o polipeptídeo PtIP-83 é derivado de uma espécie de samambaia da Ordem Polypodiales, Família Dryopteridaceae Gênero Acrophorus, Gênero Acrorumohra, Gênero Anapausia, Gênero Arachniodes, Gênero Bolbitis, Gênero Ctenitis, Gênero Cyclodium, Gênero Cyrtogonellum, Gênero Cyrtomidictyum, Gênero Cyrtomium, Gênero Diacalpe, Gênero Didymochlaenar Gênero Dryopsisr Gênero Dryopterisr Gênero Elaphoglossum, Gênero Hypodematium, Gênero Lastreopsis, Gênero Leptorumohra, Gênero Leucostegiar Gênero Lithostegia, Gênero Lomagrammar Gênero Maxoniar Gênero Megalastrum, Gênero Olfersia,
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 182/553
179/525
Gênero Peranema, Gênero Phanerophlebia, Gênero Phanerophlebiopsis, Gênero Polybotrya, Gênero Polystichopsis, Gênero Polystichum, Gênero Rumohra, Gênero Sorolepidium, Gênero Stigmatopteris ou Gênero Teratophyllum.
[0149] Em algumas modalidades, o polipeptídeo PtIP-83 é derivado de uma espécie de samambaia da Ordem Polypodiales, Família Dryopteridaceae , Gênero Polystichum. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo PtIP-83 é derivada de uma espécie de samambaia da Ordem Polypodiales, Família Dryopteridaceae, Gênero Polystichum selecionada a partir de, mas sem limitação Polystichum acanthophyllum, Polystichum acrostichoides, Polystichum aculeatum, Polystichum aculeatum, Polystichum aculeatum, Polystichum alcicorne, Polystichum aleuticum, Polystichum andersonii, Polystichum atkinsonii, Polystichum australiense , Polystichum bakerianum, Polystichum biaristatum, Polystichum bomiense, Polystichum bonseyi, Polystichum brachypterum, Polystichum brachypterum, Polystichum brachypterum , Polystichum calderonense, Polystichum calderonense, Polystichum capillipes, Polystichum castaneum, Polystichum chilense, Polystichum christii Ching, Polystichum chunii Ching, Polystichum craspedosorum, Polystichum cyclolobum, Polystichum cystostegia, Polystichum deltodon, Polystichum dielsii, Polystichum discretum, Polystichum drepanum, Polystichum dudleyi, Polystichum duthiei, Polystichum echinatum, Polystichum erosum, Polystichum excellens, Polystichum eximium, Polystichum falcatipinnum, Polystichum falcatipinnum, Polystichum falcatipinnum, Polystichum formosanum, Polystichum gongboense, Polystichum grand!frons, Polystichum gymnocarpium, Polystichum
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 183/553
180/525 haleakalense, Polystichum hancockii, Polystichum hecatopteron, Polystichum herbaceum, Polystichum imbricans, Polystichum incongruum, Polystichum kruckebergii, Polystichum kwakiutlii, Polystichum lachenense, Polystichum lanceolatum, Polystichum lemmonii, Polystichum lentum, Polystichum lonchitis, Polystichum lonchitis, Polystichum lonchitis, Polystichum lonchitis, Polystichum luctuosum, Polystichum macleae, Polystichum macleae, Polystichum makinoi, Polystichum martini, Polystichum mayebarae, Polystichum mediocre, Polystichum mediocre, Polystichum microchlamys, Polystichum mohrioides, Polystichum mollissimum,
Polystichum monticola, Polystichum moorei, Polystichum morii,
Polystichum moupinense, Polystichum muricatum, Polystichum nakenense, Polystichum neolobatum, Polystichum nepalense, Polystichum ningshenense, Polystichum obliquum, Polystichum omeiense, Polystichum ordinatum, Polystichum orientalitibeticum, Polystichum paramoupinense, Polystichum paramoupinense, polyblepharum, prionolepis, pseudocastaneuni ,
Polystich um
Polystich um
Polystich um
Polystich um piceopaleaceum, prescottianum, proliferum, pseudocastaneum,
Polystichum
Polystichum
Polystichum
Polystichum punctiferum, Polystichum punctiferum, Polystichum qamdoense,
Polystichum retrosopaleaceum, Polystichum rhombiforme, Polystichum rhombiforme, Polystichum richardii, Polystichum rigens, Polystichum rotundilobum, Polystichum scopulinum,
Polystichum semi fertile, Polystichum setiferum, Polystichum setiferum, Polystichum shensiense, Polystichum silvaticum, Polystichum simplicipinnum, Polystichum sinense, Polystichum squarrosum, Polystichum stenophyllum, Polystichum stimulans, Polystichum submite, Polystichum tacticopterum, Polystichum
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 184/553
181/525 thomsoni, Polystichum tibeticum, Polystichum transvaalense, Polystichum tripteron, Polystichum tsus-simense, Polystichum vestitum, Polystichum wattii, Polystichum whiteleggei, Polystichum xiphophyllum, Polystichum yadongense, e Polystichum yunnanense.
[0150] Em algumas modalidades, o polipeptideo PtIP-83 é derivado de uma espécie de samambaia da Ordem Polypodiales, Família Dryopteridaceae, Gênero Rumohra. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptideo PtIP83 é derivada de uma espécie de samambaia da Ordem Polypodiales, Família Dryopteridaceae, Gênero Rumohra selecionada a partir de, mas sem limitação Rumohra adi antiformis, Rumohra aristata, Rumohra bartonae, Rumohra berteroanar Rumohra capuronii, Rumohra glandulosa, Rumohra humbertii, Rumohra linearisquamosa, Rumohra lokohensis, Rumohra madagascaricar e Rumohra quadrangularis.
[0151] Em algumas modalidades, o polipeptideo PtIP-83 é derivado de uma espécie de samambaia da Ordem Polypodiales, Família Lomariopsidaceae, Gênero Nephrolepis.
[0152] Em algumas modalidades, o polipeptideo PtIP-83 é derivado de uma espécie de samambaia da Ordem Polypodiales, Família Polypodiaceae, Gênero Campyloneurum, Gênero Drynaria, Gênero Lepisorus, Gênero Microgramma, Gênero Microsorum, Gênero Neurodium, Gênero Niphidium, Gênero Pecluma M.G., Gênero Phlebodium, Gênero Phymatosorus, Gênero Platycerium, Gênero Pleopeltis, Gênero Polypodium.
[0153] Em algumas modalidades, o polipeptideo PtIP-83 é derivado de uma espécie de samambaia da Ordem Polypodiales, Família Polypodiaceae, Gênero Microsorum.
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 185/553
182/525 [0154] Em algumas modalidades, o polipeptídeo PtIP-83 é derivado de uma espécie de samambaia da Ordem Polypodiales, Família Polypodíaceae, Gênero Mícrosorum selecionada a partir de, mas sem limitação Mícrosorum alatum, Mícrosorum angustífolium, Mícrosorum aurantiacum, Mícrosorum australiense, Mícrosorum baithoense, Mícrosorum basicordatum, Mícrosorum biseriatum, Mícrosorum brassii, Mícrosorum buergerianum, Mícrosorum chapaense, Mícrosorum cinctum, Mícrosorum commutatum, Mícrosorum congregatifolium, Mícrosorum cuneatum, Mícrosorum cuspidatum, Mícrosorum dengii, Mícrosorum egregium, Mícrosorum emeiensis, Mícrosorum ensatum, Mícrosorum ensiforme, Mícrosorum excelsum, Mícrosorum fortunei, Mícrosorum griseorhizoma, Mícrosorum grossum, Mícrosorum hemionitideum, Mícrosorum henryi, Mícrosorum heterocarpum, Mícrosorum heterocarpum, Mícrosorum howense, Mícrosorum insigne, Mícrosorum intermedium, Mícrosorum kongtingense, Mícrosorum krayanense, Mícrosorum lanceolatum, Mícrosorum lanceolatum, Mícrosorum lastii, Mícrosorum latilobatum, Mícrosorum leandrianum, Mícrosorum lineare, Mícrosorum linguiforme, Mícrosorum longissimum, Mícrosorum longíssímum, Mícrosorum maculosum, Mícrosorum maximum, Mícrosorum membranaceum, Mícrosorum membranaceum, Mícrosorum microsorioides, Mícrosorum minor, Mícrosorum monstrosum, Mícrosorum muliense, Mícrosorum mutense, Mícrosorum nanchuanense, Mícrosorum níngpoense, Mícrosorum normals, Mícrosorum novae-zealandíae, Mícrosorum ovalífolium, Mícrosorum ovatum, Mícrosorum palmatopedatum, Mícrosorum pappeí, Mícrosorum papuanum, Mícrosorum parksíí, Mícrosorum pentaphyllum, Mícrosorum pílíferum, Mícrosorum pítcaírnense, Mícrosorum powellíí, Mícrosorum pteropodum, Mícrosorum pteropodum,
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 186/553
183/525
Microsorum punctatum, Microsorum pustulatuia, Microsorum rampans, Microsorum revolution, Microsorum rubiduia, Microsorum samarense, Microsorum sapaense, Microsorum sarawakense, Microsorum scandens, Microsorum scolopendria, Microsorum sibomense, Microsorum sinense, Microsorum sopuense, Microsorum espectro, Microsorum steerei, Microsorum subheiaionitideuia, Microsorum subiaarginale, Microsorum subnuduia, Microsorum superficiale, Microsorum takhtaj anil, Microsorum tenuipes, Microsorum tibeticuia, Microsorum triglossuia, Microsorum truncatuia, Microsorum tsaii, Microsorum varians, Microsorum venosum, Microsorum vieillardii, Microsorum x inaequibasis, Microsorum yiliangensis, e Microsorum zippelii.
[0155] Em algumas modalidades, o polipeptídeo PtIP-83 é derivado de uma espécie de samambaia da Ordem Polypodiales, Família Polypodiaceae, Gênero Polypodium L.
[0156] Em algumas modalidades, o polipeptídeo PtIP-83 é derivado de uma espécie de samambaia da Ordem Polypodiales, Família Polypodiaceae, Gênero Polypodium L. selecionada a partir de, mas sem limitação Polypodium absidatum, Polypodium acutifolium, Polypodium adiantiforme, Polypodium aequale, Polypodium affine, Polypodium albidopaleatum, Polypodium alcicorne, Polypodium alfarii, Polypodium alfredil, Polypodium alfredii var. curtii, Polypodium allosuroides, Polypodium alsophilicola, Polypodium amamianum, Polypodium amoenum, Polypodium amorphum, Polypodium anetioides, Polypodium anfractuosum, Polypodium anguinum, Polypodium angustifolium f. remotifolia, Polypodium angustifolium var. amphostenon, Polypodium angustifolium var. heterolepis, Polypodium angustifolium var. monstrosa, Polypodium angustipaleatum,
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 187/553
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Polypodium angustissimum, Polypodium anisomeron var. pectination
Polypodi um antioquianum, Polypodium aoristisorum
Polypodi um apagolepis
Polypodium apicidens, Polypodium apiculatum
Polypodi um apoense, Polypodium appalachianum
Polypodi um appressum
Polypodium arenarium, Polypodium argentinum
Polypodi um argutum, Polypodium armatum, Polypodium aromaticum
Polypodi um aspersum, Polypodium assurgens, Polypodium atrum
Polypodi um auriculatum, Polypodium balaonense
Polypodi um balliviani
Polypodium bamleri, Polypodium bangii
Polypodi um bartlettii
Polypodium basale, Polypodium bernoullii
Polypodium biauritum
Polypodium bifrons
Polypodium blepharodes
Polypodi um bolivari
Polypodium bolivianum
Polypodi um bolobense
Polypodium bombycinum, Polypodium bombycinum insularum
Polypodium bradeorum, Polypodium bryophilum
Polypodi um bryopodum, Polypodium buchtienii, Polypodium buesii
Polypodi um bulbotrichum, Polypodium caceresii, Polypodium californicum brauscombii, Polypodium californicum parsonsiae, Polypodium californicum, Polypodium calophlebium
Polypodium calvum, Polypodium camptophyllarium var. abbreviatum
Polypodium capitellatum, Polypodium carpinterae, Polypodium chachapoyense, Polypodium chartaceum, Polypodium chimantense
Polypodium chiricanum, Polypodium choquetangense, Polypodium christensenii, Polypodium christii, Polypodium chrysotrichum,
Polypodi um ciliolepis, Polypodi um cinerascens, Polypodium
collinsii, Polypodi um colysoides, Polypodi um confluens,
Polypodi um conforme , Polypodi um confusum, Polypodi um
congregatifolium, Polypodium connellii, Polypodium consimile var. bourgaeanum, Polypodium consimile var. minor, Polypodium conterminans, Polypodium contiguum, Polypodium cookii,
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 188/553
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Polypodium coriaceum
Polypodium coronans
Polypodi um costaricense, Polypodium costatum, Polypodium crassifolium f.
angustissimum, Polypodium crassifolium var. longipes, Polypodium crassulum, Polypodium craterisorum, Polypodium cryptum
Polypodium crystalloneuron, Polypodium cucullatum var. planum
Polypodi um cuencanum
Polypodium cumingianum, Polypodium cupreolepis
Polypodi um curranii, Polypodium curvans, Polypodium cyathicola
Polypodi um cyathisorum, Polypodium cyclocolpon
Polypodi um daguense
Polypodium damunense
Polypodi um dareiformioides, Polypodium dasypleura, Polypodium decipiens
Polypodi um decorum
Polypodi um delicatulum
Polypodium deltoideum
Polypodi um demeraranum
Polypodi um denticulatum
Polypodi um diaphanum
Polypodi um dilatatum
Polypodium dispersum
Polypodi um dissectum
Polypodi um dissimulans
Polypodi um dolichosorum, Polypodium dolorense
Polypodi um donnell-smithii
Polypodium drymoglossoides
Polypodi um ebeninum
Polypodium eggersii, Polypodium elmeri
Polypodium elongatum
Polypodium enterosoroides, Polypodium erubescens
Polypodi um erythrolepis, Polypodium erythrotrichum
Polypodi um eurybasis
Polypodi um eurybasis villosum
Polypodi um
Polypodi um falcoideum
Polypodium fallacissimum
Polypodi um farinosum
Polypodi um faucium, Polypodium feei
Polypodi um ferrugineum, Polypodium feuillei
Polypodi um firmul um
Polypodium firmum, Polypodium flaccidum, Polypodium flagellare, Polypodium flexuosum, Polypodium flexuosum ekmanii, Polypodium forbesii, Polypodium formosanum, Polypodium fraxinifolium subsp. articulatum, Polypodium fraxinifolium subsp. luridum, Polypodium fructuosum, Polypodium fucoides
Polypodium fulvescens, Polypodium galeottii, Polypodium glaucum,
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 189/553
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Polypodium glycyrrhiza , Polypodium gracillimum, Polypodium gramineum, Polypodium grand!folium, Polypodium gratum, Polypodium graveolens, Polypodium griseo-nigrum, Polypodium griseum, Polypodium guttatum, Polypodium haalilioanum, Polypodium hammatisorum, Polypodium hancockii, Polypodium haplophlebicum, Polypodium harrisii, Polypodium hastatum var. simplex, Polypodium hawaiiense, Polypodium heanophyllum, Polypodium heller!, Polypodium hemionitidium, Polypodium henry!,
Polypodium herzogii, Polypodium hesperium, Polypodium hessii,
Polypodium hombersleyi, Polypodium hostmannii, Polypodium humile, Polypodium hyalinum, Polypodium iboense, Polypodium induens var. subdentatum, Polypodium insidiosum, Polypodium insigne, Polypodium intermedium subsp. masafueranum var.
obtuseserratum, Polypodium intramarginale, Polypodium involutum, Polypodium itatiayense, Polypodium javanicum, Polypodium j uglandifolium, Polypodium kaniense, Polypodium knowltoniorum, Polypodium kyimbilense, Polypodium 1'herminieri var. costaricense, Polypodium lachniferum f. incurvata, Polypodium lachniferum var. glabrescens, Polypodium lachnopus, Polypodium lanceolatum var. complanatum, Polypodium lanceolatum var. trichophorum, Polypodium latevagans, Polypodium laxifrons,
Polypodium laxifrons var. lividum, Polypodium lehmannianum,
Polypodi um leiorhizum, Polypodium leptopodon, Polypodium leuconeuron var. angustifolia, Polypodium leuconeuron var.
latifolium
Polypodi um leucosticta
Polypodi um limulum
Polypodi um lindigii
Polypodi um lineatum
Polypodium lomarioides
Polypodi um longifrons
Polypodi um loretense
Polypodium loriceum umbraticum
Polypodi um loriforme
Polypodium loxogramme f.
gigas, Polypodium ludens
Polypodium
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 190/553
187/525 luzonicum, Polypodium lycopodioides obtusum
Polypodi um lycopodia ides
L.
Polypodi um macrolepis
Polypodium macrophyllum, Polypodium macrosorum
Polypodium macrosphaerum
Polypodi um maculosum
Polypodi um madrense
Polypodi um manmeiense
Polypodium margaritiferum, Polypodium maritimum
Polypodi um martensii
Polypodium mayoris
Polypodium megalolepis
Polypodi um melanotrichum
Polypodium menisciifolium pubescens
Polypodium meniscioides
Polypodi um
Polypodium mettenii, Polypodium mexiae
Polypodi um microsorum
Polypodium militare, Polypodium minimum
Polypodi um minusculum
Polypodium mixtum
Polypodium mollendense, Polypodium mollissimum, Polypodium moniliforme var.
minus, Polypodium monoides, Polypodium monticola
Polypodium montigenum
Polypodium moritzianum, Polypodium moultonii
Polypodi um multicaudatum, Polypodium multilineatum
Polypodi um multisorum
Polypodium munchii, Polypodium muscoides
Polypodium myriolepis
Polypodium myriophyllum, Polypodium myriotrichum
Polypodi um nematorhizon, Polypodium nemorale
Polypodi um nesioticum
Polypodium nigrescentium
Polypodi um nigripes
Polypodi um nigrocinctum, Polypodium nimbatum
Polypodium nitidissimum, Polypodium ni tidissimum
Polypodi um nubrigenum, Polypodium oligolepis
Polypodi um oligosorum
Polypodium oligosorum
Polypodi um olivaceum
Polypodi um olivaceum var. elatum, Polypodium codes, Polypodium oosphaerum
Polypodium oreophilum, Polypodium ornatissimum
Polypodium ornatum, Polypodium ovatum, Polypodium oxylobum
Polypodium oxypholis, Polypodium pakkaense, Polypodium pallidum
Polypodium palmatopedatum, Polypodium palmeri, Polypodium panamense
Polypodium parvum
Polypodium patagonicum
Polypodium
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 191/553
188/525 paucisorum, Polypodium pavonianum, Polypodium pectination var. caliense, Polypodium pectinatum var. hispidum, Polypodium pellucidum, Polypodium pendulum var. boliviense , Polypodium percrassum, Polypodium perpusillum, Polypodium peruvianum var. subgibbosum, Polypodium phyllitidis var. elongatum, Polypodium pichinchense, Polypodium pilosissimum, Polypodium pilosissimum var. glabriusculum, Polypodium pilossimum var. tunguraquensis, Polypodium pityrolepis, Polypodium platyphyllum, Polypodium playfairii, Polypodium plebeium var. cooper!, Polypodium plectolepidioides, Polypodium pleolepis, Polypodium plesiosorum var.i, Polypodium podobasis, Polypodium podocarpum, Polypodium poloense, Polypodium polydatylon, Polypodium polypodioides var.
aciculare, Polypodium polypodioides var. michauxianum, Polypodium praetermissum, Polypodium preslianum var. immersum, Polypodium procerum, Polypodium procerum, Polypodium productum, Polypodium productum, Polypodium prolongilobum, Polypodium propinguum, Polypodium proteus, Polypodium pruinatum, Polypodium pseudocapillare, Polypodium pseudofraternum, Polypodium pseudonutans, Polypodium pseudoserratum, Polypodium pulcherrimum, Polypodium pulogense, Polypodium pungens,
Polypodium purpusii, Polypodium radicals, Polypodium randallii, Polypodium ratiborii, Polypodium reclinatum, Polypodium recreense, Polypodium repens var. abruptum, Polypodium revolvens, Polypodium rhachipterygium, Polypodium rhomboideum, Polypodium rigens, Polypodium robustum, Polypodium roraimense, Polypodium roraimense, Polypodium rosei, Polypodium rosenstockii, Polypodium rubidum, Polypodium rudimentum, Polypodium rusbyi, Polypodium sablanianum, Polypodium sarmentosum, Polypodium saxicola, Polypodium schenckii,
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 192/553
189/525
Polypodium schlechteri, Polypodium scolopendria, Polypodium scolopendria, Polypodium scolopendrium, Polypodium scouleri, Polypodium scutulatum, Polypodium segregatum, Polypodium semihirsutum, Polypodium semihirsutum var. fuscosetosum, Polypodium senile var. minor, Polypodium sericeolanatum, Polypodium serraeforme, Polypodium serricula, Polypodium sesquipedala, Polypodium sessilifolium, Polypodium setosum var.
calvum, Polypodium setulosum, Polypodium shaferi, Polypodium sibomense, Polypodium siccum, Polypodium simacense, Polypodium simulans, Polypodium singeri, Polypodium sinicum, Polypodium sintenisii, Polypodium skutchii, Polypodium sloanei, Polypodium sodiroi, Polypodium sordidulum, Polypodium sordidum, Polypodium sphaeropteroides, Polypodium sphenodes, Polypodium spruce!,
Polypodium sprucei var. furcativenosa, Polypodium steirolepis,
Polypodium stenobasis, Polypodium stenolepis, Polypodium stenopterum, Polypodium subcapillare, Polypodium subflabelliforme , Polypodium subhemionitidium, Polypodium subinaequale, Polypodium subintegrum, Polypodium subspathulatum, Polypodium subtile, Polypodium subvestitum,
Polypodium subviride, Polypodium superficiale var. attenuatum,
Polypodium super ficiale var.
chinensis,
Polypodium sursumcurrens , Polypodium tablazianum, Polypodium taenifolium,
Polypodium tamandarei, Polypodium tatei, Polypodium tenuiculum var. acrosora, Polypodium tenuiculum var. brasiliense, Polypodium tenuilore, Polypodium tenuinerve, Polypodium tepuiense, Polypodium teresae, Polypodium tetragonum var. incompletum, Polypodium thysanolepis var. bipinnatifidum, Polypodium thyssanolepis, var. thyssanolepis, Polypodium thyssanolepsi, Polypodium tobagense, Polypodium trichophyllum,
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 193/553
190/525
Polypodi um tridactylum, Polypodium tridentatum
Polypodi um trifurcatum brevipes , Polypodium triglossum
Polypodium truncatulum
Polypodi um truncicola major
Polypodi um truncicola minor
Polypodi um tuberosum
Polypodi um tunguraguae
Polypodi um turquinum
Polypodi um turrialbae
Polypodium ursipes, Polypodium vagans
Polypodi um valdealatum
Polypodi um versteegii, Polypodium villagranii
Polypodi um vlrglnlanum cambroideum, Polypodium virginianum peraferens
Polypodium vittarioides , Polypodium vulgare
Polypodium vulgare L. , Polypodium vulgare subsp. oreophilum,
Polypodium vulgare var. acuminatum, Polypodium vulpinum,
Polypodium williamsii,
Polypodium wobbense, Polypodium x fallacissimum-guttatum,
Polypodium xantholepis, Polypodium xiphopteris, Polypodium yarumalense
Polypodium yungense, e
Polypodium zosteriforme.
[0157] Em algumas modalidades, o polipeptideo PtIP-83 é derivado de uma espécie de samambaia da Ordem Polypodiales, Familia Polypodiaceae, Gênero Platycerium.
[0158] Em algumas modalidades, o polipeptideo PtIP-83 é derivado de uma espécie da Divisão Lycophyta.
[0159] Em algumas modalidades, o polipeptideo PtIP-83 é derivado de uma espécie da Classe Isoetopsida ou Classe Lycopodiopsida.
[0160] Em algumas modalidades, o polipeptideo PtIP-83 é derivado de uma espécie da Classe Isoetopsida Ordem Selaginales. Em algumas modalidades, o polipeptideo PtIP-83 é derivado de uma espécie de samambaia da Classe Isoetopsida, Ordem Selaginales , Família Selaginellaceae. Em algumas modalidades, o
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191/525 polipeptídeo PtIP-83 é derivado de uma espécie do Gênero Selaginella. Em algumas modalidades, o polipeptídeo PtIP-83 é derivado de uma espécie da Classe Lycopodiopsida , Ordem Lycopodiales.
[0161] Em algumas modalidades, o polipeptídeo PtIP-83 é derivado de uma espécie de samambaia da Classe Lycopodiopsida , Ordem Lycopodiales Família Lycopodia ceae ou Família Huperziaceae.
[0162] Em algumas modalidades, o polipeptídeo PtIP-83 é derivado de uma espécie do Gênero Austrolycopodium, Dendrolycopodium, Diphasiastrum, Diphasium, Huperzia, Lateristachys, Lycopodiastrum, Lycopodiella, Lycopodium, Palhinhaea, Pseudodiphasium, Pseudolycopodiella, Pseudolycopodium ou Spinulum.
[0163] Em algumas modalidades, o polipeptídeo PtIP-83 é derivado de uma espécie do Gênero Lycopodium.
[0164] Em algumas modalidades, o polipeptídeo PtIP-83 é derivado de uma espécie do Gênero Huperzia.
Filogenética, motivo da sequência e análise estrutural para famílias de proteína inseticida [0165] O método de análise de estrutura e seguência empregue é composto por guatro componentes: construção da árvore filogenética, descoberta de motivos de seguência de proteínas, previsão da estrutura secundária e alinhamento de seguências de proteínas e estruturas secundárias. Os detalhes sobre cada componente são ilustrados abaixo.
Construção da árvore filogenética
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192/525 [0166] A análise filogenética foi realizada com o uso do software MEGA5. As sequências de proteína foram submetidas à análise por ClustalW versão 2 (Larkin M.A et al (2007) Bioinformatics 23(21) : 2947-2948) para múltiplos alinhamentos de sequências. A história evolutiva foi então inferida pelo método de Máxima Verosimilhança com base no modelo baseado em matriz JTT. A árvore com a maior verosimilhança de log foi obtida, exportada em formato Newick e, adicionalmente, processada para extrair as IDs de sequência na mesma ordem em que apareceram na árvore. Alguns ciados que representam subfamílias foram manualmente identificados para cada família de proteínas inseticidas.
Descoberta de motivos de sequências de proteínas [0167] As sequências de proteína foram reordenadas de acordo com a árvore filogenética construída anteriormente, e fornecidas à ferramenta de análise de MOTIVO MEME (Múltiplos EM para Elicitação de MOTIVO) (Bailey T.L., e Elkan 0., Proceedings of the Second International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, pp. 28-36, AAAI Press, Menlo Park, Califórnia, 1994) para identificação de motivos-chave de sequência. MEME foi configurado conforme segue: Número mínimo de sítios 2, Largura mínima de motivo 5 e Número máximo de motivos 30. Os motivos de sequência únicos para cada subfamília foram identificados por meio de observação visual. A distribuição de MOTIVOS ao longo de toda a família de gene pode ser visualizada na página da web HTML. Os MOTIVOS são numerados em relação à classificação do valor E para cada MOTIVO. As sequências de aminoácidos MOTIVOS identificadas para cada um dos polipeptideos PTIP-83 e as gamas de resíduos que definem os MOTIVOS em relação
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193/525 a cada um do identificador de sequência correspondente (SEQ ID NO :) estão apresentados na Tabela 2. A Figura 2 mostra um alinhamento dos polipeptideos PtIP-83 PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 1), PtIP-83Ca (SEQ ID NO: 5), PtIP-83Cb (SEQ ID NO: 7), PtIP-83Cc (SEQ ID NO: 9), PtIP-83Cd (SEQ ID NO: 11), PtIP-83Ce (SEQ ID NO: 13), PtIP-83Cf (SEQ ID NO: 15), e PtIP-83Fa (SEQ ID NO: 3), e a localização relativa a PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 1) da sequência de aminoácidos MOTIVOS presente em PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 1).
Previsão da estrutura secundária [0168] PSIPRED, método de previsão da estrutura secundária de alta classificação (Jones DT. (1999) J. Mol. Biol. 292: 195-202), foi instalado em servidor Linux local, e usado para a previsão de estrutura secundária de proteína. A ferramenta fornece previsão de estrutura exata com o uso de duas redes neurais de alimentação direta com base no produto de PSI-BLAST. A base de dados de PSI-BLAST foi criada removendo as regiões de baixa complexidade, transmembrana e de super-hélice em UnireflOO. Os resultados de PSIPRED contêm as estruturas secundárias previstas PtlP (Hélice alfa: H, Fita beta: E, e Espiral: C) e as classificações de confiança correspondentes para cada aminoácido em uma dada sequência de proteína. A Figura 2 mostra os alinhamentos da sequência de aminoácidos do polipeptideo PtIP-83 e as regiões estruturais secundárias conservadas.
Tabela 2
SEQ ID MOTIVO MOTIVO MOTIVO MOTIVO MOTIVO MOTIVO
NO: 19 7 13 20 10 18
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PtTP- 8 3Aa 1 4-17 21-64 71-100 102-120 n. p. n. p.
PtlP- 83Ca 5 1-14 17-60 68-97 98-116 122-171 173-208
PtlP- 83Cb 7 1-14 17-60 69-98 n. p. 121-170 n. p.
PtlP- 83Cc 9 1-14 17-60 68-97 98-116 122-171 173-208
PtlP- 83Cd 11 1-14 17-60 68-97 98-116 122-171 173-208
PtlP- 83Ce 13 1-14 17-60 68-97 98-116 121-170 173-208
PtlP- 83Cf 15 1-14 21-64 68-97 98-116 122-171 n. p.
PtlP- 83Fa 3 5-18 17-60 68-97 n. p. n. p. n. p.
SEQ ID MOTIVO MOTIVO MOTIVO MOTIVO MOTIVO MOTIVO
NO: 24 14 11 22 2 8
PtlP- 8 3Aa 1 n. p. 238-263 n. p. 313-326 327-376 376-425
PtlP- 83Ca 5 211-220 221-246 248-297 298-311 312-361 362-411
PtlP- 83Cb 7 n. p. 223-248 249-298 299-312 313-362 363-412
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PtlP- 83Cc 9 211-220 221-246 248-297 298-311 312-361 362-411
PtlP- 83Cd 11 211-220 221-246 248-297 298-311 312-361 362-411
PtlP- 83Ce 13 211-220 221-246 248-297 298-311 312-361 362-411
PtlP- 83Cf 15 211-220 221-246 248-297 298-311 312-361 362-411
PtlP- 83Fa 3 247-256 262-287 n. p. 329-342 344-393 394-443
SEQ ID MOTIVO MOTIVO MOTIVO MOTIVO MOTIVO MOTIVO
NO: 21 15 9 1 17 6
PtlP- 8 3Aa 1 508-521 428-453 455-504 523-572 576-594 596-645
PtlP- 83Ca 5 493-506 413-438 441-490 508-557 561-579 581-630
PtlP- 83Cb 7 494-507 414-439 442-491 509-558 562-580 582-631
PtlP- 83Cc 9 493-506 413-438 441-490 508-557 561-579 581-630
PtlP- 83Cd 11 493-506 413-438 441-490 508-557 561-579 581-630
PtlP- 83Ce 13 493-506 413-438 441-490 508-557 561-579 581-630
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PtlP- 83Cf 15 493-506 413-438 441-490 508-557 561-579 581-630
PtlP- 83Fa 3 525-538 445-470 473-522 540-589 593-611 613-662
SEQ ID MOTIVO MOTIVO MOTIVO MOTIVO MOTIVO MOTIVO
NO: 12 4 16 5 23 3
PtlP- 8 3Aa 1 648-683 684-719 723-741 746-795 798-807 809-858
PtlP- 83Ca 5 634-669 670-705 708-726 732-781 784-793 795-844
PtlP- 83Cb 7 635-670 671-706 709-727 731-780 783-792 794-843
PtlP- 83Cc 9 634-669 670-705 708-726 730-779 782-791 793-842
PtlP- 83Cd 11 634-669 670-705 708-726 730-779 782-791 793-842
PtlP- 83Ce 13 634-669 670-705 708-726 730-779 782-791 793-842
PtlP- 83Cf 15 634-669 670-705 708-726 731-780 783-792 794-843
PtlP- 83Fa 3 667-702 703-738 740-758 763-812 815-824 826-875
η. ρ. = não presente
Alinhamento de sequências de proteína e estruturas secundárias
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197/525 [0169] Um roteiro personalizado foi desenvolvido para gerar alinhamento de estrutura secundária com intervalos de acordo com o múltiplo alinhamento de sequência de proteínas da etapa 1 para todas as proteínas. Todas as sequências de proteínas alinhadas e estruturas foram concatenadas em um único arquivo FASTA e, então, importadas para MEGA para visualização e identificação de estruturas conservadas.
[0170] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PTIP-83 compreende uma sequência de aminoácidos MOTIVO selecionada a partir de: uma sequência de aminoácidos MOTIVO 1 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula MP[DE]MPSEADWSIFVNE[IV]EAVAEGMPTEVSEVP[AV]WKAKCKN[MV]AALGREM[S C] I (SEQ ID NO: 646); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 2 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula PQLQYRMYG[NS]LI[KN]QMAQVAQNYDQ[ED]FKQ[FL]KLFI[IA]QNQI[LF]GSYLL QQN[KR]AF (SEQ ID NO: 647); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 3 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula NTFMQMTPFTRWRLRLSASASENA[EG]LAFPTATA[PL]DSTT[EQ][IV]VITFHVTAIR (SEQ ID NO: 648); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 4 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula [DN] FTSRHWK [GD] IPVSLLLDGEDWEFEIPVQ [AG] GMSSFP (SEQ ID NO: 649); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 5 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
IIHQP[SA]T[RQ][ST]G[IT]VYILLQGSTIFHDRRR[DE]EVMTFQAA[DA]PLN[FY] [QH]YAYRLDTG (SEQ ID NO: 650); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 6 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula S[HQ]ADRLAAIQP[AV]DLTN[HY]LEMAT[HQ]MDMRTT[RS][MI]L[IL]GLLN[MI] LRIQNAALMYEY (SEQ ID NO: 651); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 7 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
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198/525 [VL]DRVEFSEVMVIHRMYVRL[SA]DL[ND]VGEL[PE]GA[EG][RK]VKR[VL]YV[FL ]ADWE (SEQ ID NO: 652); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 8 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula A[DE]RELQMESFHSAVISQRRQEL[ND]TA[IF]AKM[DE]R[LM]SLQMEEE[NS]RAME QAQKEM (SEQ ID NO: 653); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 9 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula FVTAGATAPGA [AV] ASAGQAVSIAGQAAQ [AG] LRRWEILE [GQ] LEAVMEVVAA [VI ] K (SEQ ID NO: 654); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 10 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula DGMNWG[IT]YI[YH]GE[KE]V[EQ]RSPLLPSNAILAVWADRC[TI]ITSARHNH[VE]N APGR[IV]I (SEQ ID NO: 655); uma sequência de aminoácidos MOTIVO representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula [KV][VK][CA]RPPSPDM[MV]SAVAEHALWLNDVLLQVVQ[KN]ESQ[LM]QGT[AE]PY NECLALLGR (SEQ ID NO: 656); uma sequência de aminoácidos MOTIVO representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
PTELT[VA]WPLGMDTV[AG]NLLIAQENAAL[VL]GLIQLGPSS (SEQ ID NO: 657); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 13 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
RDQ[MT][HQ]MPGSVTVI[IV]LCRLLQFP[IT]DGSQA[TA]T (SEQ ID NO: 658); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 14 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
TSIPVEWTDP [SN] ILLGMQTTV [LH] IAEL (SEQ ID NO: 659); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 15 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula EGLR[EQ]FQNRQVARA[VL]FAVLKAVA[MQ]I[AG] (SEQ ID NO: 660); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 16 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula W[TS]RVRIRHLEM[QH]F[AV]QEASG (SEQ ID NO: 661); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 17 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula QISELQY[ED]IWVQG[LM][ML]RDIA (SEQ ID NO:
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662); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 18 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula TFTLGSGVTGITSMHGEPSLDPWNGVSLDSASPTAF (SEQ ID NO: 663); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 19 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula MDYSTLYRDLNQIS (SEQ ID NO: 664); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 20 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula LRLPFM[QK]LHARVIEQN[VR]K[SE] (SEQ ID NO: 665); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 21 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula VDSLEQVG[QH][IL]V[GD]AP (SEQ ID NO: 666); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 22 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula [IV] [EQ] [CA]VMK[IM] GRF[VG] [SL]W (SEQ ID NO: 667); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 23 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula TLTNEPSE[EQ]F (SEQ ID NO: 668); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 24 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula LPRQSRNISF (SEQ ID NO: 669).
[0171] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PTIP-83 compreende uma sequência de aminoácidos
MOTIVO selecionada a partir de:
uma sequência de aminoácidos
MOTIVO 1 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
MP[DE]MPSEADWSIFVNE[IV]EAVAEGMPTEVSEVP[AV]WKAKCKN[MV]AALGREM[S
C]I (SEQ ID NO: 646); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 2 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula PQLQYRMYG[NS]LI[KN]QMAQVAQNYDQ[ED]FKQ[FL]KLFI[IA]QNQI[LF]GSYLL
QQN[KR]AF (SEQ ID NO: 647); uma sequência de aminoácidos MOTIVO que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a
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200/525 sequência de aminoácidos representada pela fórmula NTFMQMTPFTRWRLRLSASASENA[EG]LAFPTATAfPL]DSTT[EQ][IV]VITFHVTAIR (SEQ ID NO: 648); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 4 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula [DN] FTSRHWK [GD] IPVSLLLDGEDWEFEIPVQ [AG] GMSSFP (SEQ ID NO: 649); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 5 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
IIHQP[SA]T[RQ][ST]G[IT]VYILLQGSTIFHDRRR[DE]EVMTFQAA[DA]PLN[FY] [QH]YAYRLDTG (SEQ ID NO: 650); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 6 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula S[HQ]ADRLAAIQP[AV]DLTN[HY]LEMAT[HQ]MDMRTT[RS][MI]L[IL]GLLN[MI] LRIQNAALMYEY (SEQ ID NO: 651); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 7 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula [VL] DRVEFSEVMVIHRMYVRL [SA] DL [ND] VGEL [ PE ] GA [EG] [RK] VKR [VL] YV [ EL ]ADWE (SEQ ID NO: 652); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 8 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
A[DE]RELQMESFHSAVISQRRQEL[ND]TA[IF]AKM[DE]R[LM]SLQMEEE[NS] RAME QAQKEM (SEQ ID NO: 653); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 9 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
FVTAGATAPGA [AV] ASAGQAVSIAGQAAQ [AG] LRRWEILE [GQ] LEAVMEWAA [VI ] K (SEQ ID NO: 654); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 10 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
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201/525
DGMNWG[IT]YI[YH]GE[KE]V[EQ]RSPLLPSNAILAVWADRC[TI]ITSARHNH[VF]N APGR[IV]I (SEQ ID NO: 655); uma sequência de aminoácidos MOTIVO que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula [KV] [VK] [CA] RPPSPDM [MV] SAVAEHALWLNDVLLQWQ [KN] ESQ [LM] QGT [AE] PY NECLALLGR (SEQ ID NO: 656); uma sequência de aminoácidos MOTIVO que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula PTELT[VA]WPLGMDTV[AG]NLLIAQENAAL[VL]GLIQLGPSS (SEQ ID NO: 657); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 13 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
RDQ[MT][HQ]MPGSVTVI[IV]LCRLLQFP[IT]DGSQA[TA]T (SEQ ID NO: 658); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 14 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula TSIPVEWTDP[SN]ILLGMQTTV[LH]IAEL (SEQ ID NO: 659); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 15 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
EGLR[EQ]FQNRQVARA [VL]FAVLKAVA[MQ]I[AG] (SEQ ID NO: 660); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 16 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula W [TS]RVRIRHLEM[QH]F[AV]QEASG (SEQ ID NO: 661); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 17 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
QISELQY[ED]IWVQG[LM][ML]RDIA (SEQ ID NO: 662); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 18 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela
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202/525 fórmula TFTLGSGVTGITSMHGEPSLDPWNGVSLDSASPTAF (SEQ ID NO: 663) ; uma sequência de aminoácidos MOTIVO 19 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula MDYSTLYRDLNQIS (SEQ ID NO: 664); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 20 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula LRLPFM[QK]LHARVIEQN[VR]K[SE] (SEQ ID NO: 665); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 21 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula VDSLEQVG[QH][IL]V[GD]AP (SEQ ID NO: 666); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 22 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula [IV] [EQ] [CA] VMK[IM]GRE[VG] [SL]W (SEQ ID NO: 667); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 23 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula TLTNEPSE[EQ]F (SEQ ID NO: 668); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 24 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula LPRQSRNISF (SEQ ID NO: 669).
[0172] Em algumas modalidades, um polipeptideo PTIP-83 compreende uma sequência de aminoácidos MOTIVO selecionada a partir de: uma sequência de aminoácidos MOTIVO 1 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula PF[DE]PF[ST][ED]ADWSIFVNE[IVL]EAVAEGMPTEVSEVP[AV]W[KR]AKCKN[MV ]AALGREM[SC]I (SEQ ID NO: 670); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 2 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula PQLQYRMYG[NS]LI[KRN]QMAQVAQNYD[QR][ED]FK[QR][FL][KR]LEI[IAVL]Q NQI[LF]GSYLL[QE]QN[KR]AF (SEQ ID NO: 671); uma sequência de
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203/525 aminoácidos MOTIVO 3 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
N[TK]FMQMTPFT[RH]WRLRLSASA[SPKA]ΕΝ[AK][EG]LAFPTATA[PL]DSTT[EQ] [IV] [VA]ITFHVTAIR (SEQ ID NO: 672) ; uma sequência de aminoácidos MOTIVO 4 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula [DN] FTSRHWK[GD] IPV [ SN] LLLDG [EG] DWEFEIPVQ [AG] GMSSFP (SEQ ID NO: 673); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 5 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
IIHQP[SA]T[RQ][ST]G[IT][VI]YILLQGST[IV]FHDRRR[DE][EQ]V[ML]T[FP ]QAA[DAV]PLN[FY][QH]YAYRLDTG (SEQ ID NO: 674); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 6 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
S[HQ]ADRLAAIQP[AV][DN]LTN[HYE]LEMAT[HQ]MDMRTT[RS][MI]L[IL]GLLN [MI] [LM] RIQNAAL [MR] YEY (SEQ ID NO: 675); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 7 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula [VL]D[RQ]VEFSEVMVIHRMYV[N]RL[SA]DL[ND]V[GA][EQ]L[PE]GA[EG][RK]
VKR[VL] YV[FL]ADWE (SEQ ID NO: 676); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 8 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
A[DE]RELQMESFH[SA]AVISQ[RK]R[QGE]EL[ND][TD][A][IF]AKM[DE]R[LM] SLQMEEE[NSD][RG]AMEQA[QR]KEM (SEQ ID NO: 677); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 9 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
F [VL] TAGATAPGA [AV] ASAGQAV[SN] IAGQAAQ [AG] LRRWEILE [GQ] LEAVMEWA A[VI]K (SEQ ID NO: 678); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 10 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula D[GD][MA][NK]WG[IT]Y[IV][YH][GA]E[KE]V[EQ][RVL]SPL[LYE][PN][SN G][NW][ASP][IY]L[AGV]V[WE]A[DQ]R[CS][TI]IT[SA]A[REM]HN[HVT][VE
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204/525 ] [ND] [AER] PG [RW] [IV] [IR] (SEQ ID NO: 679); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 11 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula [KV][VK][CA][RGC][PHY]PSP[DE][MIL][MV]SAV[AG][EV]HA[LIN]WL[NS] [DK]VLL[QR]VVQ[KN]ES[QH] [LM]QGT [AE] [PSA]YNECLALLGR (SEQ ID NO: 680); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 12 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula [PN]T[EQ]LT[VAT]WPL[GR]MDTV[AG][ND]LLI[A][QH]E[NS]AAL[VLS]GL[I TMA]QLG[PQ] [SP]S (SEQ ID NO: 681); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 13 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula [RLC][DLWK][QNPR][MTP][HQR][MIL]PGSVTVI[IV]LCRLLQFP[IT][DG]G[S R][QFR][AS][TAD][TW] (SEQ ID NO: 682); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 14 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula [TA][SGV][IL]PV[ED]VVTDP[SN]IL[LM]GMQT[TS]V[LH]IAEL (SEQ ID NO:
683) ; uma sequência de aminoácidos MOTIVO 15 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula EGLR[EQ]FQN[RE]QVA[RN]A[VL]FAVL[KS][AS]VA[MQ]I[AG] (SEQ ID NO:
684) ; uma sequência de aminoácidos MOTIVO 16 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula W [TS] RVRIRHLEM [QH] F [AV] [QK] E [AS] [SM] [GN] (SEQ ID NO: 685); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 17 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
Q [IM] S [EQ] LQY [ED] IWVQG [LM] [ML] RD [IM] A (SEQ ID NO: 686); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 18 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
TFTLGSGVTGITSMHGEPSLDPWNGVSLDSASPTAF (SEQ ID NO: 663); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 19 representada por uma
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205/525 sequência de aminoácidos de fórmula [MLV]DY[SK][TSK]L[YF][RE]DLNQIS (SEQ ID NO: 687); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 20 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
L[RHQ]L[PT]FM[QK]LHA[RIT][VQL][IR]E[QER][NF][VR][KWS][SE] (SEQ ID NO: 688); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 21 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula V[DN] [SA] L [ED] QV[GS] [QH] [IL] V[GD] AP (SEQ ID NO: 689); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 22 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula [IV] [EQH] [CAS] [VA] [MI]K[IM] [GV] [RP] [FI] [VG] [SL]W (SEQ ID NO: 690); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 23 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula TLTN[EQ]PSE[EQDH]F (SEQ ID NO: 691); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 24 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula LP[RS]QS[RT]N[IV]SF (SEQ ID NO: 692).
[0173] Em algumas modalidades, um polipeptideo PTIP-83 compreende uma sequência de aminoácidos MOTIVO selecionada a partir de: uma sequência de aminoácidos MOTIVO 1 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
PF[DE]PF[ST][ED]ADWSIFVNE[IVL]EAVAEGMPTEVSEVP[AV]W[KR]AKCKN[MV ]AALGREM[SC]I (SEQ ID NO: 670); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 2 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula PQLQYRMYG[NS]LI[KRN]QMAQVAQNYD[QR][ED]FK[QR][FL][KR]LEI[IAVL]Q NQI[LF]GSYLL[QE]QN[KR]AF (SEQ ID NO: 671); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 3 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela
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206/525 fórmula
N[TK]FMQMTPFT[RH]WRLRLSASA[SPKA]ΕΝ[AK][EG]LAFPTATA[PL]DSTT[EQ] [IV] [VA]ITFHVTAIR (SEQ ID NO: 672) ; uma sequência de aminoácidos MOTIVO 4 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula [DN] FTSRHWK[GD] IPV [ SN] LLLDG [EG] DWEFEIPVQ [AG] GMSSFP (SEQ ID NO: 673); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 5 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
IIHQP[SA]T[RQ][ST]G[IT][VI]YILLQGST[IV]FHDRRR[DE][EQ]V[ML]T[EP ]QAA[DAV]PLN[FY][QH]YAYRLDTG (SEQ ID NO: 674); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 6 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
S[HQ]ADRLAAIQP[AV][DN]LTN[HYE]LEMAT[HQ]MDMRTT[RS][MI]L[IL]GLLN [MI] [LM] RIQNAAL [MR] YEY (SEQ ID NO: 675); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 7 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula [VL]D[RQ]VEFSEVMVIHRMYV[N]RL[SA]DL[ND]V[GA][EQ]L[PE]GA[EG][RK] VKR[VL] YV[FL]ADWE (SEQ ID NO: 676); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 8 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
A[DE]RELQMESFH[SA]AVISO[RK]R[QGE]EL[ND][TD][A][IF]AKM[DE]R[LM] SLQMEEE[NSD][RG]AMEQA[QR]KEM (SEQ ID NO: 677); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 9 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
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207/525
F [VL] TAGATAPGA [AV] ASAGQAV [ SN] IAGQAAQ [AG] LRRWEILE [GQ] LEAVMEWA A[VI]K (SEQ ID NO: 678); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 10 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
D[GD][MA][NK]WG[IT]Y[IV][YH][GA]E[KE]V[EQ][RVL]SPL[LYE][PN][SN G][NW][ASP][IY]L[AGV]V[WE]A[DQ]R[CS][TI]IT[SA]A[REM]HN[HVT][VE ] [ND] [AER] PG [RW] [IV] [IR] (SEQ ID NO: 679); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 11 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula [KV][VK][CA][RGC][PHY]PSP[DE][MIL][MV]SAV[AG][EV]HA[LIN]WL[NS] [DK]VLL[QR]VVQ[KN]ES[QH] [LM]QGT [AE] [PSA]YNECLALLGR (SEQ ID NO: 680); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 12 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula [PN]T[EQ]LT[VAT]WPL[GR]MDTV[AG][ND]LLI[A][QH]E[NS]AAL[VLS]GL[I TMA]QLG[PQ][SP]S (SEQ ID NO: 681); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 13 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula [RLC][DLWK][QNPR][MTP][HQR][MIL]PGSVTVI[IV]LCRLLQFP[IT][DG]G[S R][QFR][AS][TAD][TW] (SEQ ID NO: 682); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 14 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula [TA][SGV][IL]PV[ED]VVTDP[SN]IL[LM]GMQT[TS]V[LH]IAEL (SEQ ID NO: 683); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 15 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
EGLR[EQ]FQN[RE]QVA[RN]A[VL]FAVL[KS][AS]VA[MQ]I[AG] (SEQ ID NO: 684); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 16 que tem pelo menos
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208/525
90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula W [TS] RVRIRHLEM [QH] F [AV] [QK] E [AS] [SM] [GN] (SEQ ID NO: 685); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 17 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula Q[IM]S[EQ]LQY[ED]IWVQG[LM][ML]RD[IM]A (SEQ ID NO: 686); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 18 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula TFTLGSGVTGITSMHGEPSLDPWNGVSLDSASPTAF (SEQ ID NO: 663); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 19 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula [MLV]DY[SK][TSK]L[YF][RE]DLNQIS (SEQ ID NO: 687); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 20 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula L[RHQ]L[PT]FM[QK]LHA[RIT][VQL][IR]E[QER][NF][VR][KWS][SE] (SEQ ID NO: 688); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 21 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula V[DN] [SA] L [ED] QV[GS] [QH] [IL] V[GD] AP (SEQ ID NO: 689); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 22 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula [IV] [EQH] [CAS] [VA] [MI]K[IM] [GV] [RP] [FI] [VG] [SL]W (SEQ ID NO: 690); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 23 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula TLTN[EQ]PSE[EQDH]F (SEQ ID NO: 691); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 24 que tem pelo menos 90% de
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 212/553
209/525 identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula LP[RS]QS[RT]N[IV]SF (SEQ ID NO: 692).
[0174] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PTIP-83 compreende uma sequência de aminoácidos MOTIVO selecionada a partir de: uma sequência de aminoácidos MOTIVO 1 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula PF[DE]PF[ST][ED]ADWSIFVNE[IVL]EAVAEGMPTEVSEVP[AVIL]W[KR]AKCKN[ MVIL]AALGREM[SGT]I (SEQ ID NO: 693); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 2 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
PQLQYRMYG[NS]LI[KRNQ]QMAQVAQNYD[QRNK][ED]FK[QRNK][EL][KR]LFI[I AVL]QNQI[LFIV]GSYLL[QEND]QN[KR]AF (SEQ ID NO: 694); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 3 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
N[TKSR]FMQMTPFT[RHK]WRLRLSASA[SPKATR]EN[AKR][EG]LAFPTATA[PLIV] DSTT[EQND][IVL][VAIL]ITFHVTAIR (SEQ ID NO: 695); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 4 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula [DNQE] FTSRHWK [GDE] IPV [SNTQ] LLLDG [EGD] DWEFEIPVQ [AG] GMSSFP (SEQ ID NO: 696); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 5 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula IIHQP[SAT]T[RQKN][ST]G[ITLVS][VIL]YILLQGST[IVL]FHDRRR[DE][EQDN ]V[MLIV]T[FP]QAA[DAVEIL]PLN[FY][QHN]YAYRLDTG (SEQ ID NO: 697); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 6 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
S[HQN]ADRLAAIQP[AVIL][DN]LTN[HYE]LEMAT[HQN]MDMRTT[RSKT][MILV]L [ILV]GLLN[MILV][LMIV]RIQNAAL[MRILVK]YEY (SEQ ID NO: 698); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 7 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 213/553
210/525 [VLI]D[RQKN]VEFSEVMVIHRMYV [N]RL[SAT]DL[NDQE]V[GA][EQND]L[PED]G A[EGD] [RK]VKR[VLI] YV[FLIV]ADWE (SEQ ID NO: 699); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 8 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
A[DE]RELQMESFH[SAT]AVISQ[RK]R[QGEND]EL[NDQE][TDSE][ATS][IFLV]A KM[DE]R[LMIV]SLQMEEE[NSDQET][RGK]AMEQA[QRNK]KEM (SEQ ID NO: 700); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 9 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
F [VLI] TAGATAPGA [AVIL] ASAGQAV [ SNTQ] IAGQAAQ [AG] LRRWEILE [GQN] LEA VMEWAA[VIL] K (SEQ ID NO: 701); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 10 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
D[GDE][MA][NKQK]WG[ITLVS]Y[IVL][YH][GA]E[KERD]V[EQND][RVLKI]SP L[LYFIV][PNQ][SNGTQ][NWQ][ASPT][IYLV]L[AGVIL]V[WED]A[DQNE]R[CS T][TISLV]IT[SAT]A[RFMK]HN[HVTILS][VEIL][NDQE][AERDK]PG[RWK][IV L][IRLVK] (SEQ ID NO: 702); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 11 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula [KVRIL][VKRIL][CA][RGCK][PHY]PSP[DE][MILV][MVIL]SAV[AG][EVDIL] HA[LINVQ] WL [NSQT] [DKER] VLL [QRNK] WQ [KNRQ] ES [QHN] [LMIV] QGT [AED] [PSAT]YNECLALLGR (SEQ ID NO: 703); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 12 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula [PNQ]T[EQDN]LT[VATILS]WPL[GRK]MDTV[AG][NDQE]LLI[ATS][QHN]E[NSQ T]AAL[VLSIT]GL[ITMALVS]QLG[PQN][SPT]S (SEQ ID NO: 704); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 13 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula [RLCKIV][DLWKEIVR][QNPRK][MTP][HQR][MILV]PGSVTVI[IVL]LCRLLQFP[ ITLVS] [DGE]G[SRTK] [QFRNK] [AST] [TADES] [TWS] (SEQ ID NO: 705); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 14 representada por uma
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 214/553
211/525 sequência de aminoácidos de fórmula [TA] [SGVTIL] [ ILV] PV [ED] WTDP [ SNTQ] IL [LMIV] GMQT [ TS ] V [LHIV] IAEL (SEQ ID NO: 706); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 15 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula EGLR[EQND]FQN[REKD]QVA[RNKQ]A[VLI]FAVL[KSRT][AST]VA[MQN]I[AG] (SEQ ID NO: 707); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 16 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula W [TS] RVRIRHLEM [QHN] F [AVIL] [QKNR] E [AST] [SMT] [GNQ] (SEQ ID NO:
708) ; uma sequência de aminoácidos MOTIVO 17 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula Q[IMLV]S[EQND]LQY[ED]IWVQG[LMIV][MLIV]RD[IMLV]A (SEQ ID NO:
709) ; uma sequência de aminoácidos MOTIVO 18 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula TFTLGSGVTGITSMHGEPSLDPWNGVSLDSASPTAF (SEQ ID NO: 663); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 19 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula [MLVI]DY[SKTR][TSKR]L[YE][REKD]DLNQIS (SEQ ID NO: 710); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 20 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
L[RHQKN]L[PTS]FM[QKNR]LHA[RITKLVS][VQLIN][IRLVK]E[QERNDK][NFQ]
[VRILK][KWSRT] [SETD] (SEQ ID NO: 711); uma sequência de
aminoácidos MOTIVO 21 representada por uma sequência de
aminoácidos de fórmula
V[DNQE][SAT ]L[ ED] QV[ GST] [QHN] [ILV]V| [GDE ]AP (SEQ ID NO: 712) ; uma
sequência de aminoácidos MOTIVO 22 representada por uma
sequência de aminoácidos de fórmula
[IVL][EQHND][CAST][VAIL][MILV]K[IMLV][GVIL][RPK][FILV][VGIL][S
LTIV]W (SEQ ID NO: 713); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 23 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 215/553
212/525
TLTN[EQDN]PSE[EQDHN]F (SEQ ID NO: 714); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 24 representada por uma sequência de aminoácidos de fórmula LP[RSKT]QS[RTKS]N[IVL]SF (SEQ ID NO: 715) .
[0175]
Em algumas modalidades, um polipeptídeo PTIP-83 compreende uma sequência de aminoácidos MOTIVO selecionada a partir de: uma sequência de aminoácidos MOTIVO 1 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
PF[DE]PF[ST][ED]ADWSIFVNE[IVL]EAVAEGMPTEVSEVP[AVIL]W[KR]AKCKN[
MVIL]AALGREM[SOT]I (SEQ ID NO: 693); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 2 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
PQLQYRMYG[NS]LI[KRNQ]QMAQVAQNYD[QRNK][ED]FK[QRNK][EL][KR]LFI[I
AVL]QNQI[LFIV]GSYLL[QEND]QN[KR]AF (SEQ ID NO: 694); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 3 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula N[TKSR]FMQMTPFT[RHK]WRLRLSASA[SPKATR]EN[AKR][EG]LAFPTATA[PLIV]
DSTT [EQND] [IVL] [VAIL] ITFHVTAIR (SEQ ID NO: 695); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 4 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula [DNQE] FTSRHWK [GDE] IPV [SNTQ] LLLDG [EGD] DWEFEIPVQ [AG] GMSSFP (SEQ ID NO: 696); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 5 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
IIHQP[SAT]T[RQKN] [ST]G[ITLVS] [ VIL ] YILLQGST[IVL]FHDRRR[DE] [EQDN
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213/525 ]V[MLIV]T[FP]QAA[DAVEIL]PLN[FY][QHN]YAYRLDTG (SEQ ID NO: 697); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 6 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
S[HQN]ADRLAAIQP[AVIL][DN]LTN[HYE]LEMAT[HQN]MDMRTT[RSKT][MILV]L [ILV]GLLN[MILV][LMIV]RIQNAAL[MRILVK]YEY (SEQ ID NO: 698); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 7 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula [VLI]D[RQKN]VEFSEVMVIHRMYV[N]RL[SAT]DL[NDQE]V[GA][EQND]L[PED]G
A[EGD][RK]VKR[VLI]YV[FLIV]ADVVE (SEQ ID NO: 699); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 8 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
A[DE]RELQMESFH[SAT]AVISQ[RK]R[QGEND]EL[NDQE][TDSE][ATS][IFLV]A KM[DE]R[LMIV]SLQMEEE[NSDQET][RGK]AMEQA[QRNK]KEM (SEQ ID NO: 700); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 9 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
F [VLI] TAGATAPGA [AVIL] ASAGQAV [ SNTQ] IAGQAAQ [AG] LRRWEILE [GQN] LEA VMEWAA[VIL] K (SEQ ID NO: 701); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 10 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula D[GDE][MA][NKQK]WG[ITLVS]Y[IVL][YH][GA]E[KERD]V[EQND][RVLKI]SP L[LYFIV][PNQ][SNGTQ][NWQ][ASPT][IYLV]L[AGVIL]V[WED]A[DQNE]R[CS T][TISLV]IT[SAT]A[RFMK]HN[HVTILS][VEIL][NDQE][AERDK]PG[RWK][IV
L][IRLVK] (SEQ ID NO: 702); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 11 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 217/553
214/525 [KVRIL][VKRIL][CA][RGCK][PHY]PSP[DE][MILV][MVIL]SAV[AG][EVDIL] HA[LINVQ] WL [NSQT] [DKER] VLL [QRNK] WQ [KNRQ] ES [QHN] [LMIV] QGT [AED] [PSAT]YNECLALLGR (SEQ ID NO: 703); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 12 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula [PNQ]T[EQDN]LT[VATILS]WPL[GRK]MDTV[AG][NDQE]LLI[ATS][QHN]E[NSQ T]AAL[VLSIT]GL[ITMALVS]QLG[PQN][SPT]S (SEQ ID NO: 704); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 13 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula [RLCKIV][DLWKEIVR][QNPRK][MTP][HQR][MILV]PGSVTVI[IVL]LCRLLQFP[ ITLVS] [DGE]G[SRTK] [QFRNK] [AST] [TADES] [TWS] (SEQ ID NO: 705); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 14 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula [TA][SGVTIL][ILV]PV[ED]VVTDP[SNTQ]IL[LMIV]GMQT[TS]V[LHIV]IAEL (SEQ ID NO: 706); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 15 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
EGLR[EQND]FQN[REKD]QVA[RNKQ]A[VLI]FAVL[KSRT][AST]VA[MQN]I[AG] (SEQ ID NO: 707); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 16 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
W [TS] RVRIRHLEM [QHN] F [AVIL] [QKNR] E [AST] [SMT] [GNQ] (SEQ ID NO:
708) ; uma sequência de aminoácidos MOTIVO 17 que tem pelo menos
90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
Q[IMLV]S[EQND]LQY[ED]IWVQG[LMIV][MLIV]RD[IMLV]A (SEQ ID NO:
709) ; uma sequência de aminoácidos MOTIVO 18 que tem pelo menos
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 218/553
215/525
90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula TFTLGSGVTGITSMHGEPSLDPWNGVSLDSASPTAF (SEQ ID NO: 663); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 19 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula [MLVI]DY[SKTR][TSKR]L[YE][REKD]DLNQIS (SEQ ID NO: 710); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 20 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula
L[RHQKN]L[PTS]FM[QKNR]LHA[RITKLVS][VQLIN][IRLVK]E[QERNDK][NFQ] [VRILK][KWSRT][SETD] (SEQ ID NO: 711); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 21 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula V[DNQE][SAT]L[ED]QV[GST][QHN][ILV]V[GDE]AP (SEQ ID NO: 712); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 22 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula [IVL][EQHND][CAST][VAIL][MILV]K[IMLV][GVIL][RPK][FILV][VGIL][S LTIV]W (SEQ ID NO: 713); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 23 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula TLTN[EQDN]PSE[EQDHN]F (SEQ ID NO: 714); uma sequência de aminoácidos MOTIVO 24 que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos representada pela fórmula LP[RSKT]QS[RTKS]N[ IVL] SE (SEQ ID NO: 715).
[0176] Em alguma modalidade, um polipeptídeo PtIP-83 compreende, sequencialmente do terminal N ao terminal C, uma sequência de aminoácidos MOTIVO selecionada a partir de: MOTIVO 19 (SEQ ID NO: 664, SEQ ID NO: 687 ou SEQ ID NO: 710), MOTIVO 7
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(SEQ ID NO: 652, SEQ ID NO: 676 ou SEQ ID NC ): 699), MOTIVO 13
(SEQ ID NO: 658, SEQ ID NO: 682 ou SEQ ID NC ): 705), MOTIVO 20
(SEQ ID NO: 665, SEQ ID NO: 688 ou SEQ ID NC ): 711), MOTIVO 10
(SEQ ID NO: 655, SEQ ID NO: 679 ou SEQ ID NC ): 702), MOTIVO 18
(SEQ ID NO: 663) , MOTIVO 24 (SEQ ID NO: 6 6 9, SEQ ID NO: 692 ou
SEQ ID NO: 715), MOTIVO 14 (SEQ ID NO: 659, SEQ ID NO: 683 ou
SEQ ID NO: 706), MOTIVO 11 (SEQ ID NO: 656, SEQ ID NO: 680 ou
SEQ ID NO: 703), MOTIVO 22 (SEQ ID NO: 667, SEQ ID NO: 690 ou
SEQ ID NO: 713) , MOTIVO 2 (SEQ ID NO: 647 , SEQ ) ID NO: 671 ou SEQ
ID NO: 694), MOTIVO 8 (SEQ ID NO: 653, SEQ ID NO: 677 ou SEQ 1 ID
NO: 700), MOTIVO 15 (SEQ ID NO: 660, SEQ ID NO: 684 ou SEQ ID
NO: 707), MOTIVO 9 (SEQ ID NO: 654, SEQ ID NO: 678 ou SEQ ID NO:
701), MOTIVO 21 (SEQ ID NO: 6 6 6, SEQ ID NO: 689 ou SEQ ID NO:
712), MOTIVO 1 ( SEQ ID NO: 646, SEQ ID NO: 670 ou SEQ ID NO:
693), MOTIVO 17 (SEQ ID NO: 662, SEQ ID NO: 686 ou SEQ ID NO:
709) , MOTIVO 6 ( SEQ ID NO: 651, SEQ ID NO: 675 ou SEQ ID NO:
698), MOTIVO 12 (SEQ ID NO: 657, SEQ ID NO: 681 ou SEQ ID NO:
704), MOTIVO 4 ( SEQ ID NO: 649, SEQ ID NO: 673 ou SEQ ID NO:
696), MOTIVO 16 (SEQ ID NO: 661, SEQ ID NO: 685 ou SEQ ID NO:
708), MOTIVO 5 ( SEQ ID NO: 650, SEQ ID NO: 674 ou SEQ ID NO:
697), MOTIVO 23 (SEQ ID NO: 668, SEQ ID NO: 691 ou SEQ ID NO:
714) e MOTIVO 3 (SEQ ID NO: 648, SEQ ID NO: 672 ou SEQ ID NO:
695) .
[0177] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PtIP-83 compreende, sequencialmente do terminal N ao terminal C, uma sequência de aminoácidos MOTIVO selecionada a partir de: MOTIVO 19 (SEQ ID NO: 664, SEQ ID NO: 687 ou SEQ ID NO: 710), MOTIVO 7 (SEQ ID NO: 652, SEQ ID NO: 676 ou SEQ ID NO: 699), MOTIVO 13 (SEQ ID NO: 658, SEQ ID NO: 682 or SEQ ID NO: 705), MOTIVO 20
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SEQ ID NO: 665, SEQ ID NO: 688 ou SEQ ID NO: 711) , MOTIVO 14
SEQ ID NO: 659, SEQ ID NO 683 ou SEQ ID NO: 706) , MOTIVO 2
SEQ ID NO: 647, SEQ ID NO 671 ou SEQ ID NO: 694) , MOTIVO 8
SEQ ID NO: 653, SEQ ID NO: 677 ou SEQ ID NO: 700) , MOTIVO 15
SEQ ID NO: 660, SEQ ID NO 684 ou SEQ ID NO: 707) , MOTIVO 9
SEQ ID NO: 654, SEQ ID NO: 678 ou SEQ ID NO: 701) , MOTIVO 21
SEQ ID NO: 6 6 6, SEQ ID NO 689 ou SEQ ID NO: 712) , MOTIVO 1
SEQ ID NO: 646, SEQ ID NO: 670 ou SEQ ID NO: 693) , MOTIVO 17
SEQ ID NO: 662, SEQ ID NO 686 ou SEQ ID NO: 709) , MOTIVO 6
SEQ ID NO: 651, SEQ ID NO: 675 ou SEQ ID NO: 698) , MOTIVO 12
SEQ ID NO: 657, SEQ ID NO 681 ou SEQ ID NO: 704) , MOTIVO 4
SEQ ID NO: 649, SEQ ID NO: 673 ou SEQ ID NO: 696) , MOTIVO 16
SEQ ID NO: 661, SEQ ID NO 685 ou SEQ ID NO: 708) , MOTIVO 5
SEQ ID NO: 650, SEQ ID NO: 674 ou SEQ ID NO: 697) , MOTIVO 23
SEQ ID NO: 668, SEQ ID NO: 691 ou SEQ ID NO: 714) e MOTIVO 3
SEQ ID NO: 648, SEQ ID I 40: 672 ou SEQ ID NO: 695).
[0178] Em algumas modalidades, um polipeptideo PtIP-83 compreende, sequencialmente do terminal N ao terminal C, a sequência de aminoácidos MOTIVOS: MOTIVO 19 (SEQ ID NO: 664, SEQ
ID NO: 687 ou SEQ ID NO: 710) i, MOTIVO 7 (SEC 2 ID NO: 652, SEQ ID
NO: 676 ou SEQ ID NO : 699), MOTIVO 13 ( SEQ ID NO: 658, SEQ ID
NO: 682 ou SEQ ID NO : 705), MOTIVO 20 ( SEQ ID NO: 665, SEQ ID
NO: 688 ou SEQ ID NO : 711), MOTIVO 10 ( SEQ ID NO: 655, SEQ ID
NO: 679 ou SEQ ID NO: 702) , MOTIVO 18 (í 3EQ ID ] ΧΓΟ: 663), MOTIVO
24 ( SEQ ID NO: 6 69 , SEQ ID NO : 692 ou SEC ) ID NO: 715) , MOTIVO 14
(SEQ ID NO : 659 r SEQ ID NO: 683 ou SEQ ID NO: 706) , MOTIVO 11
(SEQ ID NO : 656 r SEQ ID NO: 68 0 ou SEQ ID NO: 703) , MOTIVO 22
(SEQ ID NO : 667 r SEQ ID NO: 690 ou SEQ ID NO: 713 ) , MOTIVO 2
(SEQ ID NO : 647 r SEQ ID NO: 671 ou SEQ ID NO: 694 ), MOTIVO 8
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SEQ ID NO: 653, SEQ ID NO: 677 ou SEQ ID NO: 700) , MOTIVO 15
SEQ ID NO: 660, SEQ ID NO 684 ou SEQ ID NO: 707) , MOTIVO 9
SEQ ID NO: 654, SEQ ID NO: 678 ou SEQ ID NO: 701) , MOTIVO 21
SEQ ID NO: 6 6 6, SEQ ID NO 689 ou SEQ ID NO: 712) , MOTIVO 1
SEQ ID NO: 646, SEQ ID NO: 670 ou SEQ ID NO: 693) , MOTIVO 17
SEQ ID NO: 662, SEQ ID NO 686 ou SEQ ID NO: 709) , MOTIVO 6
SEQ ID NO: 651, SEQ ID NO: 675 ou SEQ ID NO: 698) , MOTIVO 12
SEQ ID NO: 657, SEQ ID NO 681 ou SEQ ID NO: 704) , MOTIVO 4
SEQ ID NO: 649, SEQ ID NO: 673 ou SEQ ID NO: 696) , MOTIVO 16
SEQ ID NO: 661, SEQ ID NO 685 ou SEQ ID NO: 708) , MOTIVO 5
SEQ ID NO: 650, SEQ ID NO: 674 ou SEQ ID NO: 697) , MOTIVO 23
SEQ ID NO: 668, SEQ ID NO: 691 ou SEQ ID NO: 714) e MOTIVO 3
SEQ ID NO: 648, SEQ ID 1 40: 672 ou SEQ ID NO: 695).
[0179] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PtIP-83 compreende, sequencialmente do terminal N ao terminal C, a sequência de aminoácidos MOTIVOS: MOTIVO 19 (SEQ ID NO: 664, SEQ
ID NO: 687 ou SEQ ID NO: 710: ), MOTIVO 7 (SEQ ID NO: 652, SEQ ID
NO: 676 ou SEQ ID NO : 699), MOTIVO 13 ( (SEQ ID NO: 658, SEQ ID
NO: 682 ou SEQ ID NO : 705), MOTIVO 20 ( (SEQ ID NO: 665, SEQ ID
NO: 688 ou SEQ ID NO : 711), MOTIVO 14 ( (SEQ ID NO: 659, SEQ ID
NO: 683 ou SEQ ID NO: 706), MOTIVO 2 (SEÇ 2 TD NO: 647 , SEQ ID NO:
671 ou í SEQ ID NO: 694 ), MOTIVO 8 (SEQ ID NO: 653 , SEQ ID : NO: 677
ou SEQ ID NO: 700), MOTIVO 15 (SEQ ID NO: 660, SEQ ID NO: 684 ou SEQ ID NO: 707), MOTIVO 9 (SEQ ID NO: 654, SEQ ID NO: 678 ou SEQ ID NO: 701), MOTIVO 21 (SEQ ID NO: 666, SEQ ID NO: 689 ou SEQ ID NO: 712), MOTIVO 1 (SEQ ID NO: 646, SEQ ID NO: 670 ou SEQ ID NO:
693) , MOTIVO 17 (SEQ ID NO: 662, SEQ ID NO: 686 ou SEQ ID NO
709) , MOTIVO 6 (SEQ ID NO: 651, SEQ ID NO: 675 ou SEQ ID NO
698) , MOTIVO 12 (SEQ ID NO: 657, SEQ ID NO: 681 ou SEQ ID NO
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704) , MOTIVO 4 (SEQ ID NO: 649, SEQ ID NO: 673 OU SEQ ID NO
696), MOTIVO 16 (SEQ ID NO: 661, SEQ ID NO: 685 OU SEQ ID NO
708), MOTIVO 5 (SEQ ID NO: 650, SEQ ID NO: 674 OU SEQ ID NO
697) , MOTIVO 23 (SEQ ID NO: 668, SEQ ID NO: 691 OU SEQ ID NO
714) e MOTIVO 3 (SEQ ID NO: 648, SEQ ID NO: 672 OU SEQ ID NO
695) .
[0180] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PtIP-83 compreende sequencialmente do terminal N ao terminal C: uma Região A entre cerca de 200 a cerca de 300 aminoácidos de comprimento compreendendo uma sequência de aminoácidos MOTIVO de: MOTIVO 19 (SEQ ID NO: 664, SEQ ID NO: 687 ou SEQ ID NO: 710), MOTIVO 7 (SEQ ID NO: 652, SEQ ID NO: 676 ou SEQ ID NO: 699), MOTIVO 13 (SEQ ID NO: 658, SEQ ID NO: 682 ou SEQ ID NO: 705), MOTIVO 20 (SEQ ID NO: 665, SEQ ID NO: 688 ou SEQ ID NO: 711), MOTIVO 10 (SEQ ID NO: 655, SEQ ID NO: 679 ou SEQ ID NO: 702), MOTIVO 18 (SEQ ID NO: 663), MOTIVO 24 (SEQ ID NO: 669, SEQ ID NO: 692 ou SEQ ID NO: 715), e/ou MOTIVO 14 tendo predominantemente uma estrutura secundária não conservada; uma Região B entre cerca de 380 a cerca de 465 aminoácidos de comprimento compreendendo uma sequência de aminoácidos MOTIVO de
MOTIVO 22 (SEQ ID NO: 667, SEQ ID NO: 690 OU SEQ ID NO: 713
MOTIVO 2 (SEQ ID NO: 647, SEQ ID NO: 671 OU SEQ ID NO: 694
MOTIVO 8 (SEQ ID NO: 653, SEQ ID NO: 677 OU SEQ ID NO: 700
MOTIVO 15 (SEQ ID NO: 660, SEQ ID NO: 684 OU SEQ ID NO: 707
MOTIVO 9 (SEQ ID NO: 654, SEQ ID NO: 678 OU SEQ ID NO: 701
MOTIVO 21 (SEQ ID NO: 6 6 6, SEQ ID NO: 689 OU SEQ ID NO: 712
MOTIVO 1 (SEQ ID NO: 646, SEQ ID NO: 670 OU SEQ ID NO: 693
MOTIVO 17 (SEQ ID NO: 662, SEQ ID NO: 686 OU SEQ ID NO: 709
MOTIVO 6 (SEQ ID NO: 651, SEQ ID NO: 675 OU SEQ ID NO: 698
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220/525 e/ou MOTIVO 12 e tendo predominantemente uma estrutura hélice alfa; e uma Região C entre cerca de 150 a cerca de 180 aminoácidos de comprimento compreendendo uma sequência de aminoácidos MOTIVO
de MOTIVO 16 (SEQ ID NO: 661, SEQ ID NO : 685 ou SEQ ID NO: 708) ,
MOTIVO 5 (SEQ ID NO: 650, SEQ ID NO: 674 ou SEQ ID NO: 697) ,
MOTIVO 23 (SEQ ID NO: 668, SEQ ID NO: 691 ou SEQ ID NO: 714) ,
e/ou MOTIVO 3 tendo uma estrutura secundária de consenso compreendendo predominantemente a estrutura de cadeia beta.
[0181] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PtIP-83 compreende sequencialmente do terminal N até ao terminal C: uma Região A entre cerca de 200 e cerca de 300 aminoácidos de comprimento, tendo predominantemente uma estrutura secundária não conservada; uma Região B entre cerca de 380 a cerca de 465 aminoácidos de comprimento tendo uma estrutura secundária de consenso compreendendo 8 a 10 segmentos de predominantemente estrutura de hélice alfa; e uma Região C entre cerca de 150 a cerca de 180 aminoácidos de comprimento tendo uma estrutura secundária de consenso compreendendo 6 a 8 segmentos de predominantemente estrutura de cadeia beta. Como aqui utilizado predominantemente uma estrutura secundária não conservada significa que as regiões da estrutura secundária não estão consistentemente alinhadas dentro da família dos polipeptídeos PtIP. Tal como aqui utilizado predominantemente estrutura de hélice alfa significa que a previsão da estrutura secundária pode ter um ou mais espaços entre 1 a 4 aminoácidos da estrutura em espiral e/ou cadeia beta intervenientes na estrutura da hélice alfa. Como aqui utilizado predominantemente estrutura de cadeia beta significa que a previsão da estrutura secundária pode ter um intervalo entre 1 a 4 aminoácidos da estrutura em espiral
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221/525 e/ou hélice alfa que intervém na estrutura da cadeia beta. Em algumas modalidades, a estrutura secundária é gerada pelo PSIPRED, método de previsão da estrutura secundária de alta classificação (Jones DT. (1999) J. Mol. Biol. 292: 195-202).
[0182] Em algumas modalidades, um polipeptideo PtIP-83 compreende sequencialmente do terminal N até ao terminal C: uma Região A entre cerca de 200 e cerca de 300 aminoácidos de comprimento, tendo predominantemente uma estrutura secundária não conservada; uma Região B entre cerca de 380 a cerca de 465 aminoácidos de comprimento tendo uma estrutura secundária de consenso compreendendo nove segmentos de predominantemente estrutura de hélice alfa; e uma Região C entre cerca de 150 a cerca de 180 aminoácidos de comprimento tendo uma estrutura secundária de consenso compreendendo sete segmentos de predominantemente estrutura de cadeia beta.
[0183] Em algumas modalidades, um polipeptideo PtIP-83 compreende sequencialmente do terminal N até ao terminal C: uma Região A entre cerca de 200 e cerca de 300 aminoácidos de comprimento, tendo uma estrutura secundária de consenso flexível, em que a Região A compreende uma cadeia beta 1 (pia) conservada entre cerca de 4 e cerca de 12 aminoácidos de comprimento dentro de cerca do resíduo de aminoácido 30 a cerca do resíduo de aminoácido 130 a partir do terminal N do polipeptideo PTIP-83; uma Região B entre cerca de 380 a cerca de 465 aminoácidos de comprimento tendo uma estrutura secundária de consenso compreendendo nove segmentos de predominantemente estrutura de hélice alfa; e uma Região C entre cerca de 150 a cerca de 180 aminoácidos de comprimento tendo uma estrutura secundária de consenso compreendendo sete segmentos de
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222/525 predominantemente estrutura de cadeia beta. Como utilizado no presente documento, o termo cerca de quando utilizado no contexto do limite inferior/superior do comprimento de um elemento estrutural secundário significa o maior de -/+ um inteiro de até -/+ 20% do comprimento do elemento estrutural secundário ou -/+ 1 aminoácido. Por meio de exemplo, um elemento da estrutura secundária entre cerca de 3 aminoácidos e cerca de 23 aminoácidos de comprimento significa um elemento de estrutura secundária entre 2 e 27 aminoácidos de comprimento.
[0184] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PtIP-83 compreende sequencialmente do terminal N até ao terminal C: uma Região A entre cerca de 200 e cerca de 300 aminoácidos de comprimento, tendo uma estrutura secundária de consenso flexível, em que a Região A compreende uma cadeia beta 1 (pia) conservada entre cerca de 4 e cerca de 12 aminoácidos de comprimento, uma espiral entre cerca de 10 e cerca de 20 aminoácidos de comprimento e uma cadeia beta 2 (plb) entre cerca de 4 e cerca de 12 aminoácidos de comprimento, dentro de cerca do resíduo de aminoácido 30 a cerca do resíduo de aminoácido 165 a partir do terminal N do polipeptídeo PTIP-83; uma Região B entre cerca de 380 a cerca de 465 aminoácidos de comprimento tendo uma estrutura secundária de consenso compreendendo nove segmentos de predominantemente estrutura de hélice alfa; e uma Região C entre cerca de 150 a cerca de 180 aminoácidos de
comprimento tendo uma estrutura secundária de consenso
compreendendo sete segmentos de predominantemente estrutura de
cadeia beta.
[0185] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PtIP-83
compreende sequencialmente do terminal N até ao terminal C: uma
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Região A entre cerca de 200 e cerca de 300 aminoácidos de comprimento tendo uma estrutura secundária predominantemente não conservada; uma Região B entre cerca de 380 a cerca de 465 aminoácidos de comprimento tendo uma estrutura secundária de consenso compreendendo sequencialmente: 1) uma hélice alfa-1 entre cerca de 10 e cerca de 26 aminoácidos de comprimento; ii) uma espiral-1 entre cerca de 2 e cerca de 8 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-1 e hélice alfa-2; iii) uma hélice alfa-2 entre cerca de 15 e cerca de 24 aminoácidos de comprimento; iv) uma espiral-2 entre cerca de 4 e cerca de 14 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-2 e hélice alfa-3; v) uma hélice alfa 3 entre cerca de 15 e cerca de 27 aminoácidos de comprimento; vi) uma espiral-3 entre cerca de 11 e cerca de 13 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-3 e hélice alfa-4; vii) uma hélice alfa-4 com cerca de 180 aminoácidos de comprimento; viii) uma espiral-4 entre cerca de 4 e cerca de 5 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-4 e hélice alfa-5; ix) uma hélice alfa-5 entre cerca de 50 e cerca de 54 aminoácidos de comprimento; x) uma espiral-5 entre cerca de 11 e cerca de 17 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-5 e hélice alfa-6; xi) uma hélice alfa-6 entre cerca de 15 e cerca de 16 aminoácidos de comprimento; xii) uma espiral-6 entre cerca de 6 e cerca de 9 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-6 e hélice alfa-7; xiii) uma hélice alfa-7 entre cerca de 49 e cerca de 55 aminoácidos de comprimento; xiv) uma espiral-7 entre cerca de 3 e cerca de 8 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-7 e hélice alfa-8; xv) uma hélice alfa-8 entre cerca de 33 e cerca de 36 aminoácidos de comprimento; xvi) uma espiral-8 entre cerca de 14
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224/525 e cerca de 16 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-8 e hélice alfa-9; xvii) uma hélice alfa-9 entre cerca de 16 e cerca de 23 aminoácidos de comprimento; xviii) uma espiral9 entre cerca de 21 e cerca de 28 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-9 e Reqião C; e uma Reqião C entre cerca de 150 a cerca de 180 aminoácidos de comprimento tendo uma estrutura secundária de consenso compreendendo sete seqmentos predominantemente de estrutura de cadeia beta.
[0186] Em alqumas modalidades, um polipeptídeo PtIP-83 compreende sequencialmente do terminal N até ao terminal C: uma Reqião A entre cerca de 200 a cerca de 300 aminoácidos de comprimento tendo uma estrutura secundária predominantemente não conservada; uma Reqião B entre cerca de 380 a cerca de 465 aminoácidos de comprimento tendo uma estrutura secundária de consenso compreendendo nove seqmentos de predominantemente estrutura de hélice alfa; e uma Reqião C entre cerca de 150 a cerca de 180 aminoácidos de comprimento tendo uma estrutura secundária de consenso compreendendo sequencialmente: i) uma cadeia beta-1 (βΐ) entre cerca de 3 aminoácidos e cerca de 5 aminoácidos de comprimento; ii) uma espiral entre cerca de 13 aminoácidos e cerca de 17 aminoácidos de comprimento; iii) uma cadeia beta-2 (β2) entre cerca de 7 aminoácidos e cerca de 11 aminoácidos de comprimento; iv) uma espiral entre cerca de 17 aminoácidos e cerca de 23 aminoácidos de comprimento; v) uma cadeia beta-3 (β3) entre cerca de 5 aminoácidos e cerca de 7 aminoácidos de comprimento; vi) uma espiral entre cerca de 12 aminoácidos e cerca de 14 aminoácidos de comprimento; vii) uma cadeia beta-4 (β4) entre cerca de 5 aminoácidos e cerca de 6 aminoácidos em comprimento; viii) uma espiral entre cerca de 2
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225/525 aminoácidos e cerca de 7 aminoácidos de comprimento; ix) uma cadeia beta-5 (β5) entre cerca de 5 aminoácidos e cerca de 7 aminoácidos de comprimento; x) uma espiral entre cerca de 26 aminoácidos e cerca de 28 aminoácidos de comprimento; xi) uma cadeia beta-6 (β6) entre cerca de 5 aminoácidos e cerca de 7 aminoácidos de comprimento; xii) uma espiral entre cerca de 16 aminoácidos e cerca de 20 aminoácidos de comprimento; e xiii) uma cadeia beta-1 (β7) entre cerca de 13 aminoácidos e cerca de 17 aminoácidos de comprimento.
[0187] Em algumas modalidades,um polipeptideo PtIP-83 compreende sequencialmente do terminal N até ao terminal C: uma Região A entre cerca de 200 e cerca de 300 aminoácidos de comprimento tendo uma estrutura secundária predominantemente não conservada; uma Região B entre cerca de 380 a cerca de 465 aminoácidos de comprimento tendo uma estrutura secundária de consenso compreendendo sequencialmente: i) uma hélice alfa-1 entre cerca de 10 e cerca de 26 aminoácidos de comprimento; ii) uma espiral-1 entre cerca de 2 e cerca de 8 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-1 e hélice alfa-2; iii) uma hélice alfa-2 entre cerca de 15 e cerca de 24 aminoácidos de comprimento; iv) uma espiral-2 entre cerca de 4 e cerca de 14 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-2 e hélice alfa-3; v) uma hélice alfa 3 entre cerca de 15 e cerca de 27 aminoácidos de comprimento; vi) uma espiral-3 entre cerca de 11 e cerca de 13 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-3 e hélice alfa-4; vii) uma hélice alfa-4 com cerca de 180 aminoácidos de comprimento; viii) uma espiral-4 entre cerca de 4 e cerca de 5 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-4 e hélice alfa-5; ix) uma hélice alfa-5 entre cerca de 50
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226/525 e cerca de 54 aminoácidos de comprimento; x) uma espiral-5 entre cerca de 11 e cerca de 17 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-5 e hélice alfa-6; xi) uma hélice alfa-6 entre cerca de 15 e cerca de 16 aminoácidos de comprimento; xii) uma espiral-6 entre cerca de 6 e cerca de 9 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-6 e hélice alfa-7; xiii) uma hélice alfa-7 entre cerca de 49 e cerca de 55 aminoácidos de comprimento; xiv) uma espiral-7 entre cerca de 3 e cerca de 8 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-7 e hélice alfa-8; xv) uma hélice alfa-8 entre cerca de 33 e cerca de 36 aminoácidos de comprimento; xvi) uma espiral-8 entre cerca de 14 e cerca de 16 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-8 e hélice alfa-9; xvii) uma hélice alfa-9 entre cerca de 16 e cerca de 23 aminoácidos de comprimento; xviii) uma espiral9 entre cerca de 21 e cerca de 28 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-9 e Região C; e uma Região C entre cerca de 150 a cerca de 180 aminoácidos de comprimento tendo uma estrutura secundária de consenso compreendendo sequencialmente: i) uma cadeia beta-1 (βΐ) entre cerca de 3 aminoácidos e cerca de 5 aminoácidos de comprimento; ii) uma espiral entre cerca de 13 aminoácidos e cerca de 17 aminoácidos de comprimento; iii) uma cadeia beta-2 (β2) entre cerca de 7 aminoácidos e cerca de 11 aminoácidos de comprimento; iv) uma espiral entre cerca de 17 aminoácidos e cerca de 23 aminoácidos de comprimento; v) uma cadeia beta-3 (β3) entre cerca de 5 aminoácidos e cerca de 7 aminoácidos de comprimento; vi) uma espiral entre cerca de 12 aminoácidos e cerca de 14 aminoácidos de comprimento; vii) uma cadeia beta-4 (β4) entre cerca de 5 aminoácidos e cerca de 6 aminoácidos em comprimento; viii) uma espiral entre cerca de 2
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227/525 aminoácidos e cerca de 7 aminoácidos de comprimento; ix) uma cadeia beta-5 (β5) entre cerca de 5 aminoácidos e cerca de 7 aminoácidos de comprimento; x) uma espiral entre cerca de 26 aminoácidos e cerca de 28 aminoácidos de comprimento; xi) uma cadeia beta-6 (β6) entre cerca de 5 aminoácidos e cerca de 7 aminoácidos de comprimento; xii) uma espiral entre cerca de 16 aminoácidos e cerca de 20 aminoácidos de comprimento; e xiii) uma cadeia beta-1 (β7) com cerca de 13 aminoácidos e cerca de 17 aminoácidos de comprimento.
[0188] Em algumas modalidades, um polipeptideo PtIP-83 compreende sequencialmente do terminal N até ao terminal C: uma região A entre cerca de 200 a cerca de 300 aminoácidos de comprimento tendo uma estrutura secundária de consenso flexível, em que a região A compreende uma cadeia beta 1 (β13) conservada entre cerca de 4 e cerca de 12 aminoácidos de comprimento dentro de cerca do resíduo aminoácido 30 a cerca do resíduo de aminoácido 130 a partir do terminal N do polipepetídeo PtIP-83; uma Região B entre cerca de 380 a cerca de 465 aminoácidos de comprimento tendo uma estrutura secundária de consenso compreendendo sequencialmente: i) uma hélice alfa-1 entre cerca de 10 e cerca de 26 aminoácidos de comprimento; ii) uma espiral1 entre cerca de 2 e cerca de 8 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-1 e hélice alfa-2; iii) uma hélice alfa-2 entre cerca de 15 e cerca de 24 aminoácidos de comprimento; iv) uma espiral-2 entre cerca de 4 e cerca de 14 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-2 e hélice alfa-3; v) uma hélice alfa 3 entre cerca de 15 e cerca de 27 aminoácidos de comprimento; vi) uma espiral-3 entre cerca de 11 e cerca de 13 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice
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228/525 alfa-3 e hélice alfa-4; vii) uma hélice alfa-4 com cerca de 180 aminoácidos de comprimento; viii) uma espiral-4 entre cerca de 4 e cerca de 5 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-4 e hélice alfa-5; ix) uma hélice alfa-5 entre cerca de 50 e cerca de 54 aminoácidos de comprimento; x) uma espiral-5 entre cerca de 11 e cerca de 17 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-5 e hélice alfa-6; xi) uma hélice alfa-6 entre cerca de 15 e cerca de 16 aminoácidos de comprimento; xii) uma espiral-6 entre cerca de 6 e cerca de 9 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-6 e hélice alfa-7; xiii) uma hélice alfa-7 entre cerca de 49 e cerca de 55 aminoácidos de comprimento; xiv) uma espiral-7 entre cerca de 3 e cerca de 8 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-7 e hélice alfa-8; xv) uma hélice alfa-8 entre cerca de 33 e cerca de 36 aminoácidos de comprimento; xvi) uma espiral-8 entre cerca de 14 e cerca de 16 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-8 e hélice alfa-9; xvii) uma hélice alfa-9 entre cerca de 16 e cerca de 23 aminoácidos de comprimento; xviii) uma espiral9 entre cerca de 21 e cerca de 28 aminoácidos de comprimento flanqueada por hélice alfa-9 e Região C; e uma Região C entre cerca de 150 a cerca de 180 aminoácidos de comprimento tendo uma estrutura secundária de consenso compreendendo sequencialmente: i) uma cadeia beta-1 (βΐ) entre cerca de 3 aminoácidos e cerca de 5 aminoácidos de comprimento; ii) uma espiral entre cerca de 13 aminoácidos e cerca de 17 aminoácidos de comprimento; iii) uma cadeia beta-2 (β2) entre cerca de 7 aminoácidos e cerca de 11 aminoácidos de comprimento; iv) uma espiral entre cerca de 17 aminoácidos e cerca de 23 aminoácidos de comprimento; v) uma cadeia beta-3 (β3) entre cerca de 5 aminoácidos e cerca de 7
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229/525 aminoácidos de comprimento; vi) uma espiral entre cerca de 12 aminoácidos e cerca de 14 aminoácidos de comprimento; vii) uma cadeia beta-4 (β4) entre cerca de 5 aminoácidos e cerca de 6 aminoácidos em comprimento; viii) uma espiral entre cerca de 2 aminoácidos e cerca de 7 aminoácidos de comprimento; ix) uma cadeia beta-5 (β5) entre cerca de 5 aminoácidos e cerca de 7 aminoácidos de comprimento; x) uma espiral entre cerca de 26 aminoácidos e cerca de 28 aminoácidos de comprimento; xi) uma cadeia beta-6 (β6) entre cerca de 5 aminoácidos e cerca de 7 aminoácidos de comprimento; xii) uma espiral entre cerca de 16 aminoácidos e cerca de 20 aminoácidos de comprimento; e xiii) uma cadeia beta-1 (β7) com cerca de 13 aminoácidos e cerca de 17 aminoácidos de comprimento.
[0189] Em algumas modalidades, um polipeptídeo PtIP-83 tem um peso molecular calculado entre cerca de 70 kD e cerca de 120 kD, entre cerca de 75 kD e cerca de 110 kD, e entre cerca de 80 kD e cerca de 105 kD e entre cerca de 85 kD e cerca de 105 kD.
[0190] Em algumas modalidades, o polipeptídeo PtIP-83 tem uma propriedade física modificada. Tal como aqui utilizado, o termo propriedade física se refere a qualquer parâmetro adequado para descrever as características f1sico-químicas de uma proteína. Tal como aqui utilizado, propriedade física de interesse e propriedade de interesse são utilizados indistintamente para referir propriedades físicas de proteínas que estão a ser investigadas e/ou modificadas. Exemplos de propriedades físicas incluem, mas não estão limitados a, carga líquida na superfície e distribuição de carga na superfície da proteína, hidrofobicidade efetiva e distribuição de resíduos
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230/525 hidrofóbicos na superfície da proteína, densidade de carga na superfície, densidade de hidrofobicidade da superfície, contagem total de grupos ionizáveis da superfície, tensão da superfície, tamanho da proteína e sua distribuição em solução, temperatura de fusão, capacidade térmica e segundo coeficiente virial. Exemplos de propriedades físicas também incluem, mas não estão limitados a solubilidade, dobragem, estabilidade e digestibilidade. Em algumas modalidades, o polipeptídeo PtIP-83 tem digestibilidade aumentada de fragmentos proteolíticos em um intestino de inseto. Os modelos para digestão por fluidos gástricos simulados são conhecidos por uma pessoa versada na técnica (Fuchs, R.L. e J.D. Astwood. Food Technology 50: 83-88, 1996; Astwood, J.D., et al Nature Biotechnology 14: 1269-1273, 1996; Fu TJ et al J. Agric Food Chem. 50: 7154-7160, 2002).
[0191] Em algumas modalidades, as variantes incluem polipeptideos que diferem na sequência de aminoácidos devido a mutagênese. As proteínas variantes abrangidas pela divulgação são biologicamente ativas, isto é, continuam a ter a atividade biológica desejada (isto é, atividade pesticida) da proteína nativa. Em alguma modalidade, a variante terá pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80% ou mais da atividade inseticida da proteína nativa. Em algumas modalidades, as variantes podem ter atividade melhorada relativamente à proteína nativa.
[0192] Os genes bacterianos têm frequentemente múltiplos códons de início de metionina em proximidade com o início do quadro de leitura aberto. Normalmente, o início da tradução em um ou mais desses códons de início levará à geração
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231/525 de uma proteína funcional. Esses códons de início podem incluir códons ATG. Entretanto, as bactérias, como Bacillus sp., também reconhecem o códon GTG como um códon inicial, e proteínas que iniciam a tradução em códons GTG contêm uma metionina no primeiro aminoácido. Em ocasiões raras, a tradução em sistemas bacterianos pode iniciar em um códon TTG, embora, nesse caso, o TTG codifique uma metionina. Adicionalmente, não é normalmente determinado a priori qual desses códons é usado naturalmente na bactéria. Desse modo, é entendido que o uso de um dentre os códons de metionina alternativos também pode levar à geração de proteínas pesticidas. Essas proteínas pesticidas são abrangidas na presente divulgação e podem ser usadas nos métodos da presente divulgação. Será entendido que, quando expressas em plantas, será necessário alterar o códon inicial alternado para ATG para tradução apropriada.
[0193] Em outro aspecto, o polipeptideo PtIP-83 pode ser expresso como uma proteína precursora com uma sequência interveniente que catalisa a união de proteínas pós-tradução em múltiplas etapas. A união de proteína envolve a remoção de uma sequência interveniente de um polipeptideo com a união concomitante das sequências de flanqueamento para render um polipeptideo novo (Chong, et al., (1996) J. Biol. Chem., 271:22159-22168) . Essa sequência interveniente ou elemento de união de proteína, denominada inteínas, que catalisam sua própria excisão através das três reações coordenadas nas junções de união do terminal N e do terminal C: uma disposição acil da cisteína ou serina do terminal N; uma reação de transesterficação entre os dois terminais para formar um intermediário de tioéster ou éster ramificado e divagem de ligação de peptídeo acoplada
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232/525 à ciclização da asparagina de terminal C de inteína para libertar a inteína (Evans, et al. , (2000) J. Blol. Chem., 275:9091-9094. A elucidação do mecanismo de união de proteína levou a várias aplicações com base em inteína (Comb, et al., Patente dos EUA N° 5, 496, 714; Comb, et al. , Patente dos EUA N° 5, 834,247; Camarero e Muir, (1999) J. Amer. Chem. Soc. 121:5597-5598; Chong, et al., (1997) Gene 192:271-281, Chong, et al. , (1998) Nucleic Acids
Res. 26:5109-5115; Chong, et al., (1998) J. Biol. Chem. 273:10567-10577; Cotton, et al., (1999) J. Am. Chem. Soc. 121:1100-1101; Evans, et al., (1999) J. Biol. Chem. 274:1835918363; Evans, et al., (1999) J. Biol. Chem. 274:3923-3926; Evans, et al., (1998) Protein Scl. 7:2256-2264; Evans, et al., (2000)
J. Biol. Chem. 275:9091-9094; Iwai e Pluckthun, (1999) FEBS Lett. 459:166-172; Mathys, et al., (1999) Gene 231:1-13; Mills, et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Scl. USA 95:3543-3548; Muir, et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Scl. USA 95:6705-6710; Otomo, et al., (1999) Biochemistry 38:16040-16044; Otomo, et al., (1999) J. Blolmol. NMR 14:105-114; Scott, et al., (1999) Proc. Natl.
Acad. Scl. USA 96:13638-13643; Severinov e Muir, (1998) J. Biol. Chem. 273:16205-16209; Shingledecker, et al., (1998) Gene
207:187-195; Southworth, et al., (1998) EMBO J. 17:918-926;
Southworth, et al., (1999) Biotechniques 27:110-120; Wood, et al., (1999) Nat. Blotechnol. 17:889-892; Wu, et al., (1998a)
Proc. Natl. Acad. Scl. USA 95:922 6-9231; Wu, et al., (1998b)
Blochlm Blophys Acta 1387:422-432; Xu, et al., (1999) Proc. Natl.
Acad. Scl. USA 96:388-393; Yamazaki, et al., (1998) J. Am. Chem.
Soc., 12 0:5591-5592) . Quanto à aplicação de inteinas em transgenes de planta, consultar Yang, et al., (Transgene Res
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15:583-593 (2006)) e Evans, et al., (Annu. Rev. Plant Biol. 56:375-392 (2005) ) .
[0194] Em outro aspecto, o polipeptideo PtIP-83 pode ser codificado por dois genes separados em que a inteina da proteína precursora é proveniente dos dois genes, denominada inteina de separação, e as duas porções do precursor são unidas por uma formação de ligação de peptídeo. Essa formação de ligação peptídica é alcançada por união trans mediado por inteina. Com esse propósito, um primeiro e um segundo cassetes de expressão que compreendem os dois genes separados codificam adicionalmente as inteínas com capacidade para mediar a união trans de proteínas. Por união trans, as proteínas e os polipeptídeos codificados pelo primeiro e segundo fragmentos podem ser ligados por formação de ligação peptídica. As inteínas de união trans podem ser selecionadas a partir dos genomas de nucléolo e de organela de organismos diferentes, incluindo eucariotas, arqueobactérias e eubactérias. As inteínas que podem ser usadas são listadas em neb.com/neb/inteins.html, que pode ser acessado pela rede mundial de computadores com o uso do prefixo www. A sequência de nucleotideos que codifica uma inteina pode ser dividida em uma parte 5' e uma parte 3' que codificam a parte 5' e a parte 3' da inteina, respectivamente. As porções de sequência não necessárias para a união de inteina (por exemplo, domínio de endonuclease de endereçamento) podem ser deletadas. A sequência de codificação de inteina é dividida de modo que as partes 5' e 3' tenham capacidade para união trans. Para selecionar um sítio de divisão adequado da sequência de codificação de inteina, as considerações publicadas por Southworth, et al., (1998) EMBO J. 17:918-926 podem ser seguidas. Na construção do primeiro e do
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234/525 segundo cassetes de expressão, a sequência de codificação de inteina 5' é ligada à extremidade 3' do primeiro fragmento que codifica a parte do terminal N do polipeptídeo PtIP-83 e a sequência de codificação de inteina 3' é ligada à extremidade 5' do segundo fragmento que codifica a parte do terminal C do polipeptídeo PtIP-83.
[0195] Em geral, os parceiros de união trans podem ser projetados com o uso de qualquer inteina dividida, incluindo qualquer inteina artificialmente dividida ou de ocorrência natural. Diversas inteínas divididas de ocorrência natural são conhecidas, por exemplo: a inteina dividida do gene DnaE de Synechocystis sp. PCC6803 (consultar Wu, et al. , (1998) Proc
Natl Acad Sei USA. 95(16):9226-31 e Evans, et al., (2000) J Biol Chem. 275(13) :9091-9094 e do gene DnaE de Nostoc pune ti forme (consultar Iwai, et al., (2006) FEES Lett. 580(7) :1853-1858) . As inteínas não divididas foram artificialmente divididas no laboratório para criar inteínas divididas novas, por exemplo: a inteina DnaB Ssp artificialmente dividida (consultar, Wu, et al. , (1998) Biochim Biophys Acta. 1387:422-432) e inteina See
VMA dividida (consultar, Brenzel, et al. , (2006) Biochemistry.
45(6):1571-8) e uma mini-inteína fúngica dividida artificialmente (consultar, Elleuche, et al. , (2007) Biochem
Biophys Res Commun. 355(3):830-4). Também há bancos de dados de inteina disponíveis que catalogam inteínas conhecidas (consultar, por exemplo, o banco de dados online disponível em: bioinformatics.weizmann.ac.il/~pietro/inteins/Inteinstable.htm 1, o qual pode ser acessado pela rede mundial de computadores com o uso do prefixo www).
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235/525 [0196] As inteínas não divididas de ocorrência natural podem ter atividade de endonuclease ou outras atividades enzimáticas que podem ser tipicamente removidas durante a projeção de uma inteína artificialmente dividida. Tais miniinteínas ou inteínas divididas minimizadas são bem conhecidas na técnica e têm tipicamente menos de 200 resíduos de aminoácidos de comprimento (consultar, Wu, et al. , (1998) Biochim Blophys Acta. 1387:422-432). As inteínas divididas adequadas podem ter outros elementos de polipeptídeo que habilitam purificação adicionados à sua estrutura, visto que tais elementos não inibem a união da inteína dividida ou são adicionados de maneira que permita que os mesmos sejam removidos antes da união. A união de proteína foi relatada com o uso de proteínas que compreendem domínios semelhantes à inteína bacteriana (BIL) (consultar Amitai, et al., (2003) Mol Microbiol. 47:61-73) e domínios de autoprocessamento de porco-espinho (porco) (o posterior é combinado com inteínas quando em referência à superfamília porco/inteína ou família HINT (consultar Dassa, et al., (2004) J Biol Chem. 279:32001-32007) e domínios como esses também podem ser usados para preparar inteínas artificialmente divididas. Em particular, os membros de não união de tais famílias podem ser modificados por metodologias de biologia molecular para introduzir ou restaurar a atividade de união em tais espécies relacionadas. Os estudos recentes demonstram que a união pode ser observada quando é permitido que um componente de inteína dividida terminal N reaja com um componente de inteína dividida terminal C não encontrado na natureza para ser seu parceiro; por exemplo, a união foi observada com a utilização de parceiros que têm de 30 a 50% de homologia com o parceiro de união natural
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236/525 (consultar, Dassa, et al., (2007) Biochemistry. 46(1):322-330). Outras tais misturas de parceiros de inteína dividida divergentes se demonstraram não reativos entre si (consultar, Brenzel, et al. , (2006) Biochemistry. 45(6) :1571-8) . Entretanto, está dentro da habilidade de uma pessoa versada na técnica relevante determinar a possibilidade de um par particular de polipeptídeos se poder associar um ao outro para fornecer uma inteína funcional com o uso de métodos de rotina e sem o exercício da técnica inventiva.
[0197] Em outro aspecto, o polipeptídeo PtIP-83 é uma variante permutada circular. Em certas modalidades, o polipeptídeo PtIP-83 é uma variante permutada circular do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO: 754, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NO: 760, SEQ ID NO: 761, SEQ ID NO: 762, SEQ ID NO: 763, SEQ ID NO: 764, SEQ ID NO: 765, SEQ ID NO: 766, SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO: 768, SEQ ID NO: 769, ou SEQ ID NOs: 958-1026.
[0198] O desenvolvimento de métodos de DNA recombinante tornou possível estudar os efeitos de transposição de sequências no enovelamento, estrutura e função de proteínas. A abordagem usada na criação de sequências novas lembra aquela de pares de ocorrência natural de proteínas que são relacionados por reorganização linear de suas sequências de aminoácidos (Cunningham, et al., (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76:3218-3222; leather e Erfle, (1990) J. Bacteriol. 172:38373841; Schimming, et al., (1992) Eur. J. Biochem. 204:13-19;
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Yamiuchi e Minamikawa, (1991) FEES Lett. 260:127-130; MacGregor, et al., (1996) FEES Lett. 378:263-266) . A primeira aplicação in vitro deste tipo de rearranjo para proteínas foi descrita por Goldenberg e Creighton (J. Mol. Biol. 165:407-413, 1983) . Na criação de uma variante permutada circular, um terminal N novo é selecionado em um sítio interno (interrupção) da sequência original, a sequência nova que tem a mesma ordem de aminoácidos que a original da interrupção até alcançar um aminoácido que está em ou próximo do terminal C original. Nesse ponto, a sequência nova é unida, diretamente ou através de uma porção adicional de sequência (ligante), a um aminoácido que está em ou próximo do terminal N original e a sequência nova continua com a mesma sequência que a original até alcançar um ponto em que está em ou próxima do aminoácido que foi terminal N ao sítio de interrupção da sequência original, em que esse resíduo forma o terminal C novos da cadeia. O comprimento da sequência de aminoácidos do ligante pode ser selecionado empiricamente ou com orientação a partir de informações estruturais ou usando-se uma combinação das duas abordagens. Quando nenhuma informação estrutural está disponível, uma pequena série de ligantes pode ser preparada para teste com o uso de um projeto cujo comprimento o
é variado de modo a abranger uma gama de 0 a 50 A e cuja sequência é escolhida a fim de ser consistente com a exposição da superfície (hidrofilicidade, Hopp e Woods, (1983) Mol. Lmmunol. 20:483-489; Kyte e Doolittle, (1982) J. Mol. Biol. 157:105-132; área superficial exposta a solvente, Lee e Richards, (1971) J. Mol. Biol. 55:379-400) e a capacidade para adotar a conformação necessária sem desarranjar a configuração do polipeptídeo pesticida (conformacionalmente flexível; Karplus e Schulz,
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238/525 (1985) Naturwissenschaften 72:212-213). Considerando uma média o de tradução de 2,0 a 3,8 A por resíduo, isso significa que o comprimento a testar será entre 0 e 30 resíduos, sendo que 0 a 15 resíduos é a gama preferencial. Uma exemplificativa de tal série empírica seria construir ligantes com o uso de uma sequência de cassete, como Gly-Gly-Gly-Ser repetida n vezes, em que n é 1, 2, 3 ou 4. Aqueles versados na técnica reconhecerão que há muitas tais sequências que variam em comprimento ou composição que podem servir como ligantes com a consideração primária de que não são excessivamente longas ou curtas (cf., Sandhu, (1992) Critical Rev. Biotech. 12:437-462); se foram muito longas, os efeitos de entropia provavelmente desestabilizarão o enovelamento tridimensional e também tornarão o enovelamento cineticamente impraticável, e se forem muito curtas, as mesmas provavelmente desestabilizarão a molécula devido à deformação torcional ou estérica. Aqueles versados na análise de informações estruturais de proteína reconhecerão que o uso da distância entre as extremidades de cadeia, definida como a distância entre carbonos c-alfa, pode ser usado para definir o comprimento da sequência a ser usada ou pelo menos limitar o número de possibilidades que devem ser testadas em uma seleção empírica de ligantes. Os mesmos também reconhecerão que é algumas vezes o caso em que as posições das extremidades da cadeia polipeptídica são mal definidas em modelos estruturais derivados de difração de raio X ou dados de espectroscopia por ressonância magnética nuclear e que, quando verdadeira, essa situação precisará ser, portanto, levada em consideração a fim de estimar apropriadamente o comprimento do ligante exigido. A partir desses resíduos cujas posições são bem definidas, são
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239/525 selecionados dois resíduos que estão próximos em sequência às extremidades de cadeia, e a distância entre seus carbonos c-alfa é usada para calcular um comprimento aproximado para um ligante entre os mesmos. Com o uso do comprimento calculado como um guia, ligantes com uma gama de número de resíduos (calculada com o uso o
de 2 a 3,8 A por resíduo) são então selecionados. Esses ligantes podem ser compostos pela sequência original, encurtada ou alongada conforme necessário, e quando alongada, os resíduos adicionais podem ser escolhidos para serem flexíveis e hidrofílicos conforme descrito acima; ou opcionalmente a sequência original pode ser substituída com o uso de uma série de ligantes, em que um exemplo é a abordagem de cassete Gly-GlyGly-Ser mencionada acima; ou, opcionalmente, uma combinação da sequência original e da sequência nova que tem o comprimento total apropriado pode ser usada. As sequências de polipeptídeos pesticidas com capacidade para enovelamento em estados biologicamente ativos podem ser preparadas por seleção apropriada das posições de começo (terminal amino) e fim (terminal carboxila) de dentro da cadeia de polipeptideo original com o uso da sequência ligante, conforme descrito acima. Os terminais amino e carboxila são selecionados de dentro de um estiramento comum de sequência, chamado de região de interrupção, com o uso das diretrizes descritas abaixo. Uma sequência de aminoácidos inovadora é gerada desse modo selecionando terminais amino e carboxila dentre a mesma região de interrupção. Em muitos casos, a seleção dos terminais novos será realizada de modo que a posição original do terminal carboxila preceda imediatamente aquela do terminal amino. Entretanto, os indivíduos versados na técnica reconhecerão que
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240/525 as seleções de terminais em qualquer local na região podem funcionar e gue as mesmas levarão de modo eficaz a deleções ou adições às porções amino ou carboxila da nova sequência. É um principio central da biologia molecular que a sequência de aminoácidos primária de uma proteína referida o enovelamento para a estrutura tridimensional necessária para a expressão de sua função biológica. Os métodos são bem conhecidos por aqueles versados na técnica para obter e interpretar informações estruturais tridimensionais com o uso de difração de raios X de Cristais de proteína únicos ou espectroscopia por ressonância magnética nuclear de soluções de proteína. Os exemplos de informações estruturais que são relevantes para a identificação de regiões de interrupção incluem a localização e o tipo de estrutura secundária de proteína (hélices alfa e 3-10, folhas beta paralelas e antiparalelas, inversões e voltas de cadeia e alças; Kabsch e Sander, (1983) Biopolymers 22:2577-2637; o grau de exposição a solvente de resíduos de aminoácidos, a extensão e o tipo de interações de resíduos entre si (Chothia, (1984) Ann. Rev. Biochem. 53:537-572) e a distribuição estática e dinâmica de conformações ao longo da cadeia polipeptídica (Alber e Mathews, (1987) Methods Enzymol. 154:511-533) . Em alguns casos, as informações adicionais sobre a exposição de solvente de resíduos são conhecidas; um exemplo é um sítio de ligação pós-tradução de carboidrato que está necessariamente na superfície da proteína. Quando as informações estruturais experimentais não estão disponíveis ou não são praticáveis para obter, os métodos também estão disponíveis para analisar a sequência de aminoácidos primária a fim de fazer previsões de estrutura terciária e secundária de proteína, acessibilidade de
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241/525 solvente e a ocorrência de voltas e laços. Os métodos bioquímicos também são algumas vezes aplicáveis para determinar empiricamente a exposição de superfície quando métodos estruturais diretos não são praticáveis; por exemplo, com o uso da identificação de sítios de cisão de cadeia que segue a proteólise limitada a fim de inferir exposição de superfície (Gentile e Salvatore, (1993) Eur. J. Biochem. 218:603-621). Portanto, com o uso das informações estruturais experimentalmente derivadas ou métodos preditivos (por exemplo, Srinivisan e Rose, (1995) Proteins: Struct., Funct. & Genetics 22:81-99), a sequência de aminoácidos parentais é inspecionada para classificar regiões de acordo com a possibilidade de serem ou não integrais à manutenção de estrutura secundária e terciária. A ocorrência de sequências dentro de regiões que são conhecidas por serem envolvidas na estrutura secundária periódica (hélices alfa e 3-10, folhas beta paralelas e antiparalelas) são regiões que devem ser evitadas. De modo similar, as regiões de sequência de aminoácidos que se observa ou PtlP- terem um grau baixo de exposição a solvente são mais propensas a fazerem parte do chamado núcleo hidrofóbico da proteína e também devem ser evitadas para seleção de terminais amino e carboxila. Em contraste, aquelas regiões que se conhece ou PtlP- estarem em voltas ou alças de superfície, e especialmente aquelas regiões que são conhecidas por não serem exigidas para a atividade biológica, são os sítios preferidos para localização dos extremos da cadeia polipeptídica. Os estiramentos contínuos de sequência de aminoácidos que são preferidos com base nos critérios acima são chamados de região de interrupção. Os polinucleotídeos que codificam polipeptídeos
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PtIP-83 permutados circulares com novos terminal N/terminal C que contêm uma região de ligante que separa o terminal C e terminal N originais podem ser produzidos essencialmente seguindo o método descrito em Mullins, et al. , (1994) J. Am. Chem. Soc. 116:5529-5533. As múltiplas etapas de amplificações por reação em cadeia de polimerase (PCR) são usadas para rearranjar a sequência de DNA codificadora da sequência de aminoácidos primária da proteína. Os polinucleotídeos que codificam polipeptideos PtIP-83 permutados circulares com novos terminal N/terminal C que contêm uma região ligante que separa o terminal C e terminal N originais podem ser produzidos com base no método de duplicação em tandem descrito em Horlick, et al., (1992) Protein Eng. 5:427-431. A amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR) dos genes de terminal N/terminal C novos é realizada com o uso de DNA molde duplicado em tandem.
[0199]
Em outro aspecto, proteínas de fusão são fornecidas as quais incluem dentro da sua sequência de aminoácidos uma sequência de aminoácidos compreendendo um polipeptídeo PtIP-83 que inclui, mas sem limitação, o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO: 754, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NO: 760, SEQ ID NO: 761, SEQ ID NO: 762, SEQ ID NO: 763, SEQ ID NO: 764, SEQ ID NO: 765, SEQ ID NO: 766, SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO: 768, SEQ ID NO: 769, e seus fragmentos ativos.
[0200]
Os métodos para projeto e construção de proteínas de fusão (e polinucleotídeos codificadores das mesmas)
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243/525 são conhecidos por aqueles versados na técnica. Polinucleotídeos codificadores de um polipeptídeo de PtIP-83 podem ser fundidos a sequências de sinal que irão localizar diretamente o polipeptídeo de PtIP-83 em compartimentos particulares de uma célula procariótica ou eucariótica e/ou direcionar a secreção do polipeptídeo de PtIP-83 das modalidades de uma célula procariótica ou eucariótica. Por exemplo, em E. colí, pode-se desejar direcionar a expressão da proteína ao espaço periplásmico. Os exemplos de sequências de sinal ou proteínas (ou fragmentos das mesmas) às quais o polipeptídeo PtIP-83 pode ser fundido a fim de direcionar a expressão do polipeptídeo para o espaço periplásmico das bactérias incluem, mas sem limitação, a sequência de sinal pelB, a sequência de sinal de proteína de ligação de maltose (MBP), MBP, a sequência de sinal ompA, a sequência de sinal da subunidade B de enterotoxina termolábil de E. colí periplásmica e a sequência de sinal de fosfatase alcalina. Diversos vetores estão comercialmente disponíveis para a construção de proteínas de fusão que direcionarão a localização de uma proteína, como a série de vetores pMAL (particularmente a série pMAL-p) disponível a partir da New England Biolabs. Em uma modalidade específica, o polipeptídeo PtIP-83 pode ser fundido à sequência de sinal de pectato liase pelB para aumentar a eficiência de expressão e purificação de tais polipeptídeos nas bactérias Gram-negativas (consultar, Patente dos EUA N°s 5, 576, 195 e 5, 846, 818) . Fusões de polipeptídeo/peptídeo de transição de plastídeo de planta são bem conhecidas na técnica (consultar, Patente dos EUA N° 7,193, 133) . Os peptídeos de transição de apoplasto, como sinal de secreção de alfa-amilase de arroz ou cevada também são bem conhecidos na técnica. 0
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244/525 peptideo de transição de plastídeo é geralmente fundido no terminal N ao polipeptideo a ser direcionado (por exemplo, o parceiro de fusão) . Em uma modalidade, a proteína de fusão consiste essencialmente no peptideo de trânsito de plastídeo e no polipeptideo PtIP-83 a ser direcionado. Em outra modalidade, a proteína de fusão compreende o peptideo de trânsito de plastídeo e o polipeptideo a ser direcionado. Em tais modalidades, o peptideo de trânsito de plastídeo está preferencialmente no terminal N da proteína de fusão. No entanto, resíduos de aminoácidos adicionais podem ser N-terminais ao peptideo de trânsito de plastídeo, desde que a proteína de fusão seja pelo menos parcialmente direcionada para um plastídeo. Em uma modalidade específica, o peptideo de trânsito de plastídeo está na metade N-terminal, terço N-terminal ou quarto N-terminal da proteína de fusão. A maior parte ou a totalidade do peptideo de trânsito de plastídeo é geralmente clivada da proteína de fusão por inserção no plastídeo. A posição de divagem pode variar ligeiramente entre espécies de plantas, em diferentes estágios de desenvolvimento de plantas, como resultado de condições intercelulares específicas ou da combinação particular de peptideo de trânsito/parceiro de fusão usada. Em uma modalidade, a divagem do peptideo de trânsito de plastídeo é homogênea, de modo que o sítio de divagem é idêntico em uma população de proteínas de fusão. Em outra modalidade, o peptideo de trânsito de plastídeo não é homogêneo, de modo que o sítio de divagem varia por 1-10 aminoácidos em uma população de proteínas de fusão. O peptideo de trânsito de plastídeo pode ser fundido de modo recombinante a uma segunda proteína em uma de diversas maneiras. Por exemplo, um sítio de reconhecimento de
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245/525 endonucleases de restrição pode ser introduzido na sequência de nucleotídeos do peptídeo de trânsito em uma posição correspondente à sua extremidade terminal Ceo mesmo sítio ou um sítio compatível pode ser manipulado na sequência de nucleotídeos da proteína a ser direcionada em sua extremidade terminal N. Deve ter-se cuidado na projeção desses sítios para garantir que as sequências de codificação do peptídeo de trânsito e da segunda proteína sejam mantidas no quadro para permitir a síntese da proteína de fusão desejada. Em alguns casos, pode ser preferencial remover o códon de metionina iniciador da segunda proteína quanto o sítio de restrição novo é introduzido. A introdução de sítios de reconhecimento de endonuclease de restrição em ambas as moléculas parentes e sua união subsequente através de técnicas de DNA recombinante podem resultar na adição de um ou mais aminoácidos extras entre o peptídeo de transição e a segunda proteína. Isso geralmente não afeta a atividade de direcionamento enquanto o sítio de clivagem de peptídeo de transição permanecer acessível e a função da segunda proteína não for alterada pela adição desses aminoácidos extras em seu terminal N. Alternativamente, um indivíduo versado na técnica pode criar um sítio de clivagem preciso entre o peptídeo de transição e a segunda proteína (com ou sem sua metionina iniciadora) com o uso de síntese de gene (Stemmer, et al., (1995) Gene 164:49-53) ou métodos similares. Além disso, a fusão de peptídeo de transição pode incluir intencionalmente os aminoácidos a jusante do sítio de clivagem. Os aminoácidos no terminal N da proteína madura podem afetar a habilidade do peptídeo de transição para direcionar proteínas a plastídeos e/ou a eficácia de clivagem que segue a importação de proteína.
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246/525
Isso pode ser dependente da proteína a ser direcionada.
Consultar, por exemplo, Cornai, et al. , (1988) J. Biol. Chem.
263 (29) :15104-9.
[0201] Em algumas modalidades, proteínas de fusão são fornecidas compreendendo um polipeptídeo PtIP-83 e um polipeptídeo inseticida unido por um ligante de aminoácido. Em algumas modalidades, as proteínas de fusão são fornecidas
representadas por uma formula selecionada a partir do grupo que
consiste em:
R!-L-R2, R2-L- R1, R1- R2 ou R2- R1
em que R1 é um polipeptídeo PtIP-83, R2 é uma proteína de
interesse. O polipeptídeo R1 é fundido diretamente ou através de um segmento ligante (L) ao polipeptídeo R2. O termo diretamente define fusões nas quais os polipeptídeos são unidos sem um peptídeo ligante. Desse modo, L representa uma ligação química ou segmento polipeptídico ao qual tanto R1 quanto R2 são fundidos em quadro, mais comumente L é um peptídeo linear ao qual R1 e R2 são ligados por ligações amida que ligam o terminal carbóxi de R1 ao terminal amino de L e o terminal carbóxi de L ao terminal amino de R2. Por fundido em quadro, significa que não há terminação ou interrupção de tradução entre os quadros de leitura de R1 e R2. O grupo ligante (L) é geralmente um polipeptídeo com entre 1 e 500 aminoácidos em comprimento. Os ligantes que unem as duas moléculas são preferencialmente projetados para (1) permitir que as duas moléculas se enovelem e atuem independentemente entre si, (2) não tenham uma propensão para desenvolver uma estrutura secundária ordenada, o que pode interferir nos domínios funcionais das duas proteínas, (3) ter característica hidrofóbica ou carregada mínima que pode
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247/525 interagir com os domínios de proteína funcionais e (4) fornecer separação estérica de R1 e R2, de modo que R1 e R2 possam interagir simultaneamente com seus receptores correspondentes em uma célula única. Tipicamente, os aminoácidos de superfície em regiões de proteína flexíveis incluem Gly, Asn e Ser. Será esperado que virtualmente qualquer permutação de sequências de aminoácidos que contêm Gly, Asn e Ser satisfaça os critérios acima para uma sequência ligante. Outros aminoácidos neutros, como Thr e Ala, também podem ser usados na sequência ligante. Aminoácidos adicionais também podem ser incluídos nos ligantes devido à adição de sítios de restrição únicos na sequência ligante para facilitar a construção das fusões.
[0202] Em algumas modalidades, os ligantes compreendem sequências selecionadas a partir do grupo de fórmulas: (GlysSerJn, (Gly4Ser)n, (GlysSer)n, (GlynSer)n ou (AlaGlySer)n em que n é um número inteiro. Um exemplo de um ligante altamente flexível é a região espaçadora rica em (GlySer) presente na proteína pill dos bacteriófagos filamentosos, por exemplo, bacteriófagos M13 ou fd (Schaller, et al. , 1975) . Essa região fornece uma região espaçadora flexível longa entre dois domínios da proteína de superfície pill. Também são incluídos os ligantes nos quais uma sequência de reconhecimento de endopeptidase é incluída. Tal sítio de divagem pode ser valioso para separar os componentes individuais da fusão para determinar se são apropriadamente enovelados e ativos in vitro. Exemplos de várias endopeptidases incluem, mas sem limitação, Plasmina, Enterocinase, Calicreína, Urocinase, Ativador do plasminogênio em tecidos, clostripaína, Quimosina, Colagenase, Protease de Veneno de Víbora de Russell, Enzima de divagem pós-prolina,
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248/525 protease V8, Trombina e fator Xa. Em algumas modalidades, ο ligante compreende os aminoácidos EEKKN (SEQ ID NO: 37) do veiculo de expressão de múltiplos genes (MGEV), que é clivado por proteases vacuolares, conforme divulgado na Publicação de Pedido de Patente dos EUA N° 2007/0277263. Em outras modalidades, os segmentos de ligante peptidico da região de articulação de imunoglobulinas de cadeia pesada IgG, IgA, IgM, IgD ou IgE fornecem uma relação angular entre os polipeptideos ligados. São especialmente úteis aquelas regiões de articulação em que as cisteinas são substituídas por serinas. Ligantes da presente divulgação incluem sequências derivadas da região de articulação de IgG gama 2b murina na qual as cisteinas foram mudadas para serinas. As proteínas de fusão não são limitadas pela forma, tamanho ou número de sequências ligantes empregues e a única exigência do ligante é que funcionalmente não interfira de modo adverso no enovelamento e função das moléculas individuais da fusão.
[0203] Em um outro aspecto, os polipeptideos PtIP-83 quiméricos são fornecidos os quais são criados através da união de duas ou mais porções de genes de PtIP-83 que originalmente codificaram as proteínas PtIP-83 separadas para criar um gene quimérico. A tradução do gene quimérico resulta em um único polipeptideo PtIP-83 quimérico com regiões, motivos ou domínios derivados de cada um dos polipeptideos originais. Em determinadas modalidades, a proteína quimérica compreende porções, motivos ou domínios de polipeptideos PtIP-83 de SEQ ID
NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO: 9,
SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ
ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 716, SEQ ID
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NO: 754, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID
NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NO: 760, SEQ ID NO: 761, SEQ ID
NO: 762, SEQ ID NO: 763, SEQ ID NO: 764, SEQ ID NO: 765, SEQ ID
NO: 766, SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO: 768, SEQ ID NO: 769, ou ; SEQ
ID NOs: 958-1026, em qualquer combinação.
[0204] Em uma modalidade, um polipeptideo PTIP-83 quimérico compreende um fragmento terminal N de cerca de 100, cerca de 200, cerca de 300, ou cerca de 400 aminoácidos de um polipeptideo PTIP-83 heterólogo para a região terminal C do polipeptideo PTIP-83 quimérico. Em uma modalidade adicional, ο fragmento terminal N compreende regiões conservadas de cerca do aminoácido 1-65; cerca de aminoácidos 78-88; e/ou cerca de 242292 aminoácidos, em que as fronteiras destas regiões podem variar por cerca de 10 aminoácidos. Em algumas modalidades, o polipeptideo PtIP-83 compreende um fragmento terminal N compreendendo um fragmento terminal N PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 1) . Em algumas modalidades, o polipeptideo PtIP-83 compreende um fragmento terminal N compreendendo um fragmento terminal N PtlP83Cb (SEQ ID NO: 7). Em determinadas modalidades, o polipeptideo PtIP-83 quimérico compreende um fragmento terminal N compreendendo um fragmento terminal N PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 1) ou PtIP-83Cb (SEQ ID NO: 7) altera o local de ação do polipeptideo quimérico PTIP-83 em comparação com o fragmento terminal C original do polipeptideo PTIP-83 quimérico em um ensaio de ligação heterólogo.
[0205] É reconhecido que as sequências de DNA podem ser alteradas por vários métodos, e que essas alterações podem resultar em sequências de DNA codificadoras de proteínas com sequências de aminoácidos diferentes das codificadas pela
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250/525 proteína pesticida do tipo selvagem (ou nativo). Em algumas modalidades, um polipeptídeo PtIP-83 pode ser alterado de várias maneiras, incluindo substituições de aminoácidos, deleções,
truncamentos e inserções de um ou mais aminoácidos, incluindo
até 2, 3, 4, 5, 6, 7, θ, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 , 45, 50,
55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 105, 110, 115, 120, 125,
130, 135, 140 , 145 ou mais substituições, deleções e/ou inserções
de aminoácidos ou suas combinações em comparação com qualquer um
de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO: 7, SEQ
ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID
NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO:
716, SEQ ID NO : 754, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO:
757, SEQ ID NO : 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NO: 760, SEQ ID NO:
761, SEQ ID NO : 762, SEQ ID NO: 763, SEQ ID NO: 764, SEQ ID NO:
765, SEQ ID NO : 766, SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO: 768, SEQ ID NO:
769, ou SEQ ID NOs: ! 358-1026
[0206] Em algumas modalidades , uma variante do
polipeotídeo PtIP-83 compreende uma ou mais substituições de
aminoácidos, da Tabela 13, Tabela 14, Tabela 15, Tabela 16,
Tabela 17, Tabela 18, Tabela 20, Tabela 21, Tabela 23, Tabela 24 ou suas combinações, em comparação com o aminoácido nativo de PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 1) no resíduo correspondente.
[0207] Em algumas modalidades uma variante de polipeptídeo PtIP-83 é selecionada a partir de, mas não limitada a qualquer uma, SEQ ID NO: 236-299, SEQ ID NO: 334-367, SEQ ID NO: 398-427, SEQ ID NO: 518-607, e SEQ ID NO: 728-737.
[0208] Em algumas modalidades, um polippeptídeos PtIP83 compreende uma deleção de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais aminoácidos do terminal N do polipeptídeo
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PtIP-83 em relação à posição de aminoácido de qualquer um de SEQ
ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO:
9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO : 13 , SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO: 17,
SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO: 716, SEQ
ID NO: 754, SEQ ID NO : 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ
ID NO: 758, SEQ ID NO : 759, SEQ ID NO: 760, SEQ ID NO: 761, SEQ
ID NO: 762, SEQ ID NO : 763, SEQ ID NO: 764, SEQ ID NO: 765, SEQ
ID NO: 766, SEQ ID NO : 767, SEQ ID NO: 768 , SEQ ID NO: 769, OU
SEQ ID NOs: 958-1026.
[0209] Em algumas modalidades, um polippeptídeos PtIP83 compreende uma deleção de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,
12, 13, 14, 15 ou mais aminoácidos do terminal C do polipeptídeo PtIP-83 em relação à posição de aminoácido de qualquer um de SEQ
ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO:
9, SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17,
SEÇ ) ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO: 716, SEQ
ID NO: 754, SEQ ID NO : 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ
ID NO: 758, SEQ ID NO : 759, SEQ ID NO: 760, SEQ ID NO: 761, SEQ
ID NO: 762, SEQ ID NO : 763, SEQ ID NO: 764, SEQ ID NO: 765, SEQ
ID NO: 766, SEQ ID NO : 767, SEQ ID NO: 768, SEQ ID NO: 769, OU
SEQ ID NOs: 958-1026.
[0210] Métodos para tais manipulações são geralmente conhecidos na técnica. Por exemplo, as variantes da sequência de aminoácidos de um polipeptídeo PtIP-83 podem ser preparadas por mutações no DNA. Isso também pode ser alcançado por uma dentre diversas formas de mutagênese e/ou em evolução direcionada. Em alguns aspectos, as mudanças codificadas na sequência de aminoácidos não afetarão substancialmente a função da proteína. Tais variantes terão a atividade pesticida desejada. Contudo,
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252/525 compreende-se que a habilidade de um polipeptídeo PtIP-83 para conferir atividade pesticida pode ser melhorada pelo uso de tais técnicas nas composições desta divulgação.
[0211] Por exemplo, as substituições de aminoácido conservativas podem ser feitas em um ou mais resíduos de aminoácidos não essenciais, PtIP. Um resíduo de aminoácido não essencial é um resíduo que pode ser alterado a partir da sequência do tipo selvagem de um polipeptídeo PtIP-83 sem alterar a atividade biológica. Uma substituição de aminoácidos conservativa é uma na qual o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido que tem uma cadeia lateral similar. As famílias de resíduos de aminoácido que têm cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Estas famílias incluem: aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina); cadeias laterais acídicas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico); resíduos negativamente carregados polares e suas amidas (por exemplo, ácido aspártico, asparagina, ácido glutâmico, glutamina); cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína); resíduos alifáticos pequenos, não polares ou levemente polares (por exemplo, Alanina, serina, treonina, prolina, glicina) ; cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano); resíduos não polares alifáticos grandes (por exemplo, metionina, leucina, isoleucina, valina, cisteína); cadeias laterais com ramificação beta (por exemplo, treonina, valina, isoleucina); cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina); cadeias laterais
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253/525 aromáticas grandes (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano).
[0212] As substituições de aminoácidos podem ser feitas em regiões não conservadas que retêm função. Em geral, tais substituições não serão feitas para resíduos de aminoácidos conservados ou para resíduos de aminoácidos que residem em um motivo conservado, em que tais resíduos são essenciais para atividade da proteína. Os exemplos de resíduos que estão conservados e que podem ser essenciais para a atividade da proteína incluem, por exemplo, resíduos que são idênticos entre todas as proteínas contidas em um alinhamento de toxinas semelhantes ou relacionadas com as sequências das modalidades (por exemplo, resíduos que são idênticos em um alinhamento de proteínas homólogas). Os exemplos de resíduos que estão conservados, mas que podem permitir substituições de aminoácido conservativas e ainda retêm a atividade incluem, por exemplo, resíduos que têm apenas substituições conservativas entre todas as proteínas contidas em um alinhamento de toxinas semelhantes ou relacionadas com as sequências das modalidades (por exemplo, resíduos que têm apenas substituições conservativas entre todas as proteínas contidas no alinhamento das proteínas homólogas). Entretanto, a pessoa versada na técnica entenderá que as variantes funcionais podem ter alterações conservadas ou não conservadas muito pequenas nos resíduos conservados. Diretrizes a respeito de substituições de aminoácidos apropriadas que não afetam a atividade biológica da proteína de interesse podem ser encontradas no modelo de Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), incorporado aqui a título de referência. Na realização de
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254/525 tais mudanças, o índice hidropático de aminoácidos pode ser considerado. A importância do índice hidropático de aminoácidos ao conferir a função biológica interativa em uma proteína é geralmente entendida na técnica (Kyte e Doolittle, (1982) J Mol Biol. 157(1):105-132). É aceite que o caráter hidropático relativo do aminoácido contribui para a estrutura secundária da proteína resultante, que define, por sua vez, a interação da proteína com outras moléculas, por exemplo, enzimas, substratos, receptores, DNA, anticorpos, antígenos e semelhantes.
[0213] É conhecido na técnica que certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos que têm índice ou escore hidropático similar e ainda resultar em uma proteína com atividade biológica similar, isto é, ainda obter uma proteína equivalente funcionalmente biológica. A cada aminoácido foi atribuído um índice hidropático com base em sua hidrofobicidade e características de carga (Kyte e Doolittle, ibid) . Esses são: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9) e arginina (-4,5). Na realização de tais mudanças, a substituição de aminoácidos cujos índices hidropáticos estão dentro de +2 é preferida, aquelas das quais estão dentro de +1 são particularmente preferidas, e aquelas dentro de +0,5 são ainda mais particularmente preferidas.
[0214] Compreende-se também que na técnica que a substituição de aminoácidos semelhantes pode ser feita
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255/525 efetivamente com base na hidrofilicidade. A Patente dos EUA N° 4,554,101 declara que a maior hidrofilicidade média local de uma proteína, conforme manipulado pela hidrofilicidade de seus aminoácidos adjacentes, se correlaciona a uma propriedade biológica da proteína.
[0215] Conforme detalhado na Patente dos EUA N°
4,554,101, os valores de hidrofilicidade a seguir foram atribuídos a resíduos de aminoácido: arginina (+3,0); lisina
( + 3,0) ; aspartato (+3,0+0,1); glutamato (+3,0+0,1); serina
( + 0,3) ; asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0);
treonina (-0,4); prolina (-0,5+0,!); alanina (-0,5); histidina
(-0,5) ; cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5);
leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina
(-2,5) ; triptofano (-3,4).
[0216] Alternativamente, alterações podem ser feitas à
sequência de proteína de muitas proteínas no terminal amino ou
carbóxi sem afetar substancialmente a atividade. Isso pode
incluir inserções, deleções ou alterações introduzidas por
métodos moleculares modernos, como PCR, incluindo amplificações
de PCR que alteram ou estendem a sequência de codificação de proteína em virtude da inclusão de sequências codificadoras de aminoácido nos oligonucleotídeos utilizados na amplificação de PCR. Alternativamente, as sequências de proteína adicionadas podem incluir sequências de codificação de proteína inteiras, tais como aquelas usadas comumente na técnica para gerar fusões de proteína. Tais proteínas de fusão são frequentemente usadas
para (1) i aumentar a expressão de uma proteína de interesse (2)
introduzir um domínio de ligação, atividade enzimática ou epítopo para facilitar a purificação de proteína, a detecção de
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256/525 proteína ou outros usos experimentais conhecidos na técnica (3) direcionar a secreção ou tradução de uma proteína a uma organela subcelular, como o espaço periplásmico de bactérias Gram negativas, mitocôndrias ou cloroplastos de plantas ou o retículo endoplasmático de células eucarióticas, sendo que o último resulta frequentemente em glicosilação da proteína.
[0217] As sequências de nucleotídeos e de aminoácidos variantes da divulgação também abrangem as sequências derivadas de procedimentos mutagênicos e recombinogênicos, como embaralhamento de DNA. Com tal procedimento, uma ou mais regiões de codificação de polipeptídeo PtIP-83 diferentes podem ser usadas para criar um novo polipeptídeo PtIP-83 que possui as propriedades desejadas. Deste modo, as bibliotecas de polinucleotídeos recombinantes são geradas a partir de uma população de polinucleotídeos de sequências relacionadas compreendendo regiões de sequências que têm identidade de sequências substancial e podem ser recombinadas de modo homólogo in vitro ou in vivo. Por exemplo, com o uso dessa abordagem, os motivos de sequência codificadores de um domínio de interesse podem ser embaralhados entre um gene pesticida e outros genes pesticidas conhecidos para obter um gene novo que codifica uma proteína com uma propriedade de interesse melhorada, como uma atividade inseticida aumentada. As estratégias para tal embaralhamento de DNA são conhecidas na técnica. Consultar, por exemplo, Stemmer, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1074710751; Stemmer, (1994) Nature 370:389-391; Crameri, et al., (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore, et al., (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang, et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci.
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USA 94:4504-4509; Crameri, et al., (1998) Nature 391:288-291; e as Patentes dos EUA Números 5,605,793 e 5,837,458.
[0218] A permuta ou o embaralhamento de domínios é um outro mecanismo para gerar polipeptideos PtIP-83 alterados. Os domínios podem ser permutados entre polipeptideos PtIP-83, o que resulta em toxinas híbridas ou quiméricas com atividade inseticida melhorada ou espectro direcionado. Os métodos para gerar proteínas recombinantes e testar as mesmas por atividade pesticida são bem conhecidos na técnica (consultar, por exemplo, Naimov, et al., (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5328-5330; de Maagd, et al., (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:1537-1543; Ge, et al., (1991) J. Biol. Chem. 266:17954-17958; Schnepf, et al., (1990) J. Biol. Chem. 265:20923-20930; Rang, et al., 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2918-2925) .
[0219] O alinhamento de homólogos de PtIP-83 (Figura 2) permite a identificação de resíduos que são altamente conservados dentre os homólogos de origem natural nesta família.
[0220] Em algumas modalidades, são fornecidos polipeptideos PtIP-83 compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com qualquer uma de SEQ ID NO: 786-888.
[0221] Em algumas modalidades, são fornecidos polipeptideos PtIP-83 compreendendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO: 786-888.
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258/525 [0222]
Em algumas modalidades, o polipeptideo PtIP-83 não é a sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO:
786-888.
Composições [0223]
Composições que compreendem um polipeptideo
PtIP-83 da divulgação também são incluídas. Em algumas modalidades, a composição compreende um polipeptideo PtIP-83 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO: 754, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NO: 760, SEQ ID NO: 761, SEQ ID NO: 762, SEQ ID NO: 763, SEQ ID NO: 764, SEQ ID NO: 765, SEQ ID NO: 766, SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO: 768, SEQ ID NO: 769, ou SEQ ID NOs: 958-1026 ou uma sua variante. Em algumas modalidades, a composição compreende uma proteína de fusão de PtIP-83.
[0224] Em algumas modalidades, são fornecidas composições compreendendo um polipeptideo PtIP-83 compreendendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO: 236299, SEQ ID NO: 334-367, SEQ ID NO: 398-427, SEQ ID NO: 518-607, SEQ ID NO: 640-645 e SEQ ID NO: 728-737 ou uma sua variante.
[0225] Em algumas modalidades, são fornecidas composições compreendendo um polipeptideo PtIP-83 compreendendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO: 7 8 6888 ou uma sua variante.
[0226] Em algumas modalidades, são divulgadas composições agrícolas de polipeptideos PtIP-83. Nas modalidades,
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259/525 um microrganismo transformado (que inclui organismos completos, células, esporo(s), polipeptídeos PtIP-83, componente(s) pesticida(s), componente(s) para ter(em) impacto em pragas, variante(s), células e componentes celulares vivos ou mortos, incluindo misturas de células e componentes celulares vivos e mortos, e incluindo células e componentes celulares danificados) ou um polipeptídeo(s) PtIP-83 isolado(s) pode(m) ser formulado(s) com um transportador aceitável em uma composição(ões) pesticida(s) que é, por exemplo, uma suspensão, uma solução, uma emulsão, um pó de empoeiramento, um grânulo ou pélete dispersível, um pó molhante e um concentrado emulsionável, um aerossol ou pulverização, um grânulo impregnado, um adjuvante, uma pasta de revestimento, um coloide, e também encapsulações, por exemplo, em substâncias poliméricas. Tais composições formuladas podem ser preparadas por meios convencionais tais como dessecação, liofilização, homogeneização, extração, filtração, centrifugação, sedimentação ou concentração de uma cultura de células compreendendo o polipeptídeo.
[0227] Essas composições divulgadas acima podem ser obtidas pela adição de um agente tensioativo, um transportador inerte, um conservante, um umectante, um estimulante da alimentação, um atrator, um agente encapsulante, um ligante, um emulsionante, um corante, um protetor de UV, um tampão, um agente de fluxo ou fertilizantes, doadores de micronutrientes ou outras preparações que influenciam o crescimento de plantas. Um ou mais produtos agroquímicos incluindo, mas não se limitando a herbicidas, inseticidas, fungicidas, bactericidas, nematocidas, moluscicidas, acaricidas, reguladores de crescimento de plantas,
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260/525 adjuvantes de colheita e fertilizantes, podem ser combinados com transportadores, tensoativos ou adjuvantes habitualmente utilizados na técnica de formulação ou outros componentes para facilitar o manuseamento do produto e a sua aplicação em pragasalvo particulares. Os transportadores e adjuvantes adequados podem ser sólidos ou líquidos e correspondem às substâncias normalmente utilizadas na tecnologia de formulação, por exemplo, substâncias minerais naturais ou regeneradas, solventes, dispersantes, agentes molhantes, agentes de adesividade, ligantes ou fertilizantes. Os ingredientes ativos das modalidades são normalmente aplicados na forma de composições e podem ser aplicados na área de cultura, planta ou semente a ser tratada. Por exemplo, as composições das modalidades podem ser aplicadas em grão em preparação para ou durante o armazenamento em um tegão ou silo, etc. As composições das modalidades podem ser aplicadas simultânea ou sucessivamente com outros compostos. Os métodos de aplicação de um ingrediente ativo das modalidades ou uma composição agroquímica das modalidades que contém pelo menos um dos polipeptídeos CytlA variante produzidos pelas cepas bacterianas das modalidades incluem, mas não estão limitados a, aplicação foliar, revestimento de sementes e aplicação no solo. O número de aplicações e a taxa de aplicação dependem da intensidade da infestação pela praga correspondente.
[0228] Agentes tensoativos adequados incluem, mas não estão limitados a, compostos aniônicos tais como um carboxilato de, por exemplo, um metal; um carboxilato de um ácido graxo de cadeia longa; um N-acilsarcosinato; mono- ou diésteres de ácido fosfórico com etoxilatos de álcool graxo ou sais de tais ésteres; sulfatos de álcoois graxos tais como dodecilsulfato de sódio,
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261/525 octadecilsulfato de sódio ou cetilsulfato de sódio; sulfatos de álcoois graxos etoxilados; sulfatos de alquilfenóis etoxilados; sulfonatos de lignina; sulfonatos de petróleo; sulfonatos de alquilarila, tais como sulfonatos de alquilbenzeno ou sulfonatos de alquilnaftaleno de cadeia curta, por exemplo, sulfonato de butilnaftaleno; sais de condensados de naftaleno-formaldeído sulfonados; sais de condensados de fenol-formaldeído sulfonados; sulfonatos mais complexos tais como sulfonatos de amida, por exemplo, o produto de condensação sulfonado de ácido oleico e Nmetiltaurina; ou sulfossuccinatos de dialquila, por exemplo, sulfonato de sódio de succinato de dioctila. Os agentes não iônicos incluem produtos de condensação de ésteres de ácidos graxos, álcoois graxos, amidas de ácidos graxos ou fenóis substituídos com alquila ou alquenila graxa com óxido de etileno, ésteres graxos de éteres de álcoois poli-hídricos, por exemplo, ésteres de ácidos graxos de sorbitana, produtos de condensação destes ésteres com óxido de etileno, por exemplo, ésteres de ácidos graxos de polioxietilenossorbitana, copolimeros de bloco de óxido de etileno e óxido de propileno, glicois acetilênicos tais como 2,4,7,9-tetraetil-5-decin-4,7-diol ou glicois acetilênicos etoxilados. Exemplos de um agente tensoativo catiônico incluem, por exemplo, uma mono-, di- ou poliamina alifática tal como um acetato, naftenato ou oleato; ou uma amina contendo oxigênio tal como um óxido de amina de polioxietilenoalquilamina; uma amina ligada por amida preparada pela condensação de um ácido carboxílico com uma di- ou poliamina; ou um sal de amônio quaternário.
[0229] Exemplos de materiais inertes incluem mas não estão limitados a minerais inorgânicos tais como caulino,
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262/525 filossilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos, Mica, Silica Gel Amorfa, talco, argila, cinzas vulcânicas ou materiais botânicos tais como cortiça, espigas de milho em pó, cascas de amendoim, cascas de arroz e cascas de noz. Os caulinos tais como caulinita, diquita, nacrita, anauxita, haloisita e endelita são úteis como materiais transportadores. As montmorilonitas, tais como beidelita, nontronita, montmorilonita, hectorita, saponita, sauconita e bentonita são úteis como materiais transportadores. As vermiculitas tais como biotita são úteis como materiais transportadores.
[0230] As composições das modalidades podem estar em uma forma adequada para aplicação direta ou como um concentrado de composição primária que requer a diluição com uma quantidade adequada de água ou outro diluente antes da aplicação. A concentração pesticida irá variar dependendo da natureza da formulação particular, especificamente, se é um concentrado ou para ser utilizado diretamente. A composição contém 1 a 98% de um transportador inerte sólido ou líquido e 0 a 50% ou 0,1 a 50% de um tensoativo. Estas composições serão administradas à taxa marcada para o produto comercial, por exemplo, cerca de 0,01 1b5,0 1b por acre quando na forma seca e a cerca de 0,01 pts. - 10 pts. por acre quando em forma líquida.
Anticorpos [0231] Anticorpos para um polipeptídeo PtIP-83 das modalidades ou para suas variantes ou fragmentos são também englobados. Os anticorpos da divulgação incluem anticorpos policlonais e monoclonais assim como seus fragmentos que retêm sua capacidade para se ligarem a um polipeptídeo PtIP-83 encontrado no intestino de inseto. Um anticorpo, anticorpo
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263/525 monoclonal ou fragmento do mesmo é dito como tendo capacidade para se ligar a uma molécula se tiver capacidade para reagir especificamente com a molécula para ligar, assim, a molécula ao anticorpo, anticorpo monoclonal ou fragmento do mesmo. 0 termo anticorpo (Ab) ou anticorpo monoclonal (Mab) é destinado a incluir as moléculas intatas, assim como fragmentos ou regiões ligantes ou seus domínios (como, por exemplo, fragmentos Fab e F(ab).sub.2) que têm capacidade de ligar a hapteno. Tais fragmentos são tipicamente produzidos por divagem proteolítica, como papaína ou pepsina. Alternativamente, os fragmentos de ligação a hapteno podem ser produzidos através da aplicação de tecnologia de DNA recombinante ou através de química sintética. Os métodos para a preparação dos anticorpos da presente divulgação são geralmente conhecidos na técnica. Por exemplo, consultar Antibodies, A Laboratory Manual, Ed Harlow e David Lane (eds.) Cold Spring Harbor Laboratory, N.I. (1988), assim como as referências citadas no mesmo. Os trabalhos de referência padrão que estabelecem os princípios gerais de imunologia incluem: Klein, J. Immunology: The Science of Cell-Noncell Discrimination, John Wiley & Sons, N.I. (1982); Dennett, et al., Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, N.I. (1980) e Campbell, Monoclonal Antibody Technology, Em Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13, Burdon, et al., (editores), Elsevier, Amsterdã (1984) . Também consultar as Patentes dos EUA N°s 4, 196, 265; 4, 609, 893; 4,713,325; 4,714,681; 4,716,111; 4,716,117 e 4,720,459. Os anticorpos do polipeptídeo PtIP-83 ou porções de ligação a antígenos dos mesmos podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo metodologia
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264/525 de anticorpos monoclonais convencionais, por exemplo, a técnica de hibridação de células somáticas padrão de Kohler e Milstein, (1975) Nature 256:495. Outras técnicas para produzir anticorpos monoclonais também podem ser empregues, como transformação viral ou oncogênica de linfócitos B. Um sistema animal para preparar hibridomas é um sistema murino. Protocolos de imunização e técnicas para isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são conhecidos na técnica. Os parceiros de fusão (por exemplo, células de mieloma murino) e procedimentos de fusão também são conhecidos. 0 anticorpo e anticorpos monoclonais da divulgação podem ser preparados utilizando um polipeptídeo PtIP-83 como antigenos.
[0232] É fornecido um kit para detectar a presença de um polipeptídeo PtIP-83 ou detectar a presença de uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo PtIP-83 em uma amostra. Em uma modalidade, o kit fornece reagentes com base em anticorpo para detectar a presença de um polipeptídeo PtIP-83 em uma amostra de tecido. Em outra modalidade, o kit fornece sondas de ácidos nucleicos marcadas úteis para detectar a presença de um ou mais polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo PtlP-
83. 0 kit é fornecido juntamente com reagentes e controles
apropriados para executar um método de detecção, assim como
instruções para uso do kit.
Identificação e isolamento de receptores
[0233] Os receptores para o polipeptídeo PtIP-83 das
modalidades ou para suas variantes ou fragmentos também são
abrangidos. Os métodos para identificar receptores são bem conhecidos na técnica (consultar Hofmann, et. al., (1988) Eur. J. Biochem. 173:85-91; Gill, et al. , (1995) J. Biol. Chem. 27277
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27282) e podem ser empregados para identificar e isolar o receptor que reconhece o polipeptídeo PtIP-83 com o uso das vesículas de membrana de borda em escova de insetos suscetíveis. Além do método de identificação radioativa listado nas literaturas citadas, o polipeptídeo PtIP-83 pode ser identificado com corante fluorescente e outras identificações comuns, como estreptavidina. As vesículas de membrana de borda em escova (BBMV) de insetos suscetíveis, como lagarta falsamedideira e percevejos, podem ser preparadas de acordo com os protocolos listados nas referências e separadas em gel de SDSPAGE e coradas em uma membrana adequada. 0 polipeptídeo PtIP-83 identificado pode ser incubado com a membrana corada de BBMV e o polipeptídeo PtIP-83 marcado pode ser identificado com os repórteres marcados. A identificação de banda(s) de proteína que interage(m) com o polipeptídeo PtIP-83 pode ser detectada por meio de sequenciamento em fase gasosa de aminoácido de terminal N ou método de identificação de proteína baseado em espectrometria de massa (Patterson, (1998) 10.22, 1-24, Current Protocol in Molecular Biology publicado por John Wiley & Son Inc). Assim que a proteína é identificada, o gene correspondente pode ser clonado da biblioteca de DNA genômico ou cDNA dos insetos suscetíveis e a afinidade de ligação pode ser medida diretamente com o polipeptídeo PtIP-83. A função de receptores para atividade inseticida pelo polipeptídeo PtIP-83 pode ser verificada, obtida, por meio do tipo de RNAi do método de nocaute de genes (Rajagopal, et al. , (2002) J. Biol. Chem. 277:4684946851) .
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Construtos de Nucleotídeos, Cassetes de Expressão e Vetores [0234] 0 uso do termo construtos de nucleotídeos no presente documento não é destinado a limitar as modalidades aos construtos de nucleotídeos que compreendem DNA. Os peritos na técnica reconhecerão que os construtos de nucleotídeos, particularmente polinucleotídeos e oligonucleotídeos compostos por ribonucleotídeos e combinações de ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos podem também ser empregues nos métodos aqui divulgados. Os construtos de nucleotídeos, ácidos nucleicos e sequências de nucleotídeos das modalidades abrangem adicionalmente todas as formas complementares de tais construtos, moléculas e sequências. Além disso, as construções de nucleotídeos, moléculas de nucleotídeos e sequências de nucleotídeos das modalidades abrangem todas as construções, moléculas e sequências de nucleotídeos que podem ser empregues nos métodos das modalidades para transformação de plantas incluindo, mas não se limitando a, aqueles compreendidos por desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, e suas combinações. Tais desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos incluem tanto moléculas que ocorrem naturalmente como análogos sintéticos. Os construtos de nucleotídeos, ácidos nucleicos e sequências de nucleotídeos das modalidades também abrangem todas as formas de construtos de nucleotídeos incluindo, mas sem limitação, formas de fita única, formas de fita dupla, forquilhas, estruturas de haste e alça e semelhantes.
[0235] Uma modalidade adicional se refere a um organismo transformado, como um organismo selecionado de células de planta e inseto, bactérias, levedura, baculovírus, protozoários, nematódeos e algas. O organismo transformado
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267/525 compreende uma molécula de DNA das modalidades, um cassete de expressão que compreende a molécula de DNA ou um vetor que compreende o cassete de expressão, o qual pode ser incorporado de modo estável no genoma do organismo transformado.
[0236] Em algumas modalidades, células hospedeiras transgénicas são fornecidas transformadas com um polinucleotídeo que codifica um polipeptideo PTIP-83 da divulgação. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula vegetal. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma bactéria.
[0237] As sequências das modalidades são proporcionadas em construtos de DNA para expressão no organismo de interesse. O construto incluirá sequências reguladoras 5' e 3' ligadas operacionalmente a uma sequência das modalidades. O termo ligado operacionalmente como aqui utilizado se refere a uma ligação funcional entre um promotor e uma segunda sequência, em que a sequência promotora inicia e medeia a transcrição da sequência de DNA correspondente à segunda sequência. De modo geral, ligado operacionalmente significa que as sequências de ácidos nucleicos em ligação são contíguas e, quando necessário, para unir duas regiões de codificação de proteína no mesmo quadro de leitura. 0 construto pode conter adicionalmente pelo menos um gene adicional a ser cotransformado no organismo. Alternativamente, o(s) gene(s) adicional(ais) pode(m) ser proporcionado(s) em múltiplos construtos de DNA.
[0238] Tal construto de DNA é dotado de uma pluralidade de sítios de restrição para inserção da sequência genética do polipeptideo PtIP-83 para estar sob regulação transcricional das regiões regulatórias. O construto de DNA pode conter adicionalmente os genes marcadores selecionáveis.
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268/525 [0239] O construto de DNA incluirá geralmente na direção de 5' a 3' de transcrição: uma região de iniciação de transcrição e tradução (isto é, um promotor), uma sequência de DNA das modalidades, e uma região de terminação de transcrição e de tradução (isto é, região de terminação) funcional no organismo que serve como um hospedeiro. A região de iniciação de transcrição (isto é, o promotor) pode ser nativa, análoga, estranha ou heteróloga ao organismo hospedeiro e/ou à sequência das modalidades. Adicionalmente, o promotor pode ser a sequência natural ou, alternativamente, uma sequência sintética. O termo estranho, tal como aqui utilizado, indica que o promotor não é encontrado no organismo nativo no qual o promotor é introduzido. Quando o promotor é estranho ou heterólogo à sequência das modalidades, se pretende que o promotor não seja o promotor nativo ou de ocorrência natural para a sequência operacionalmente ligada das modalidades. Tal como aqui utilizado, um gene quimérico compreende uma sequência codificante operacionalmente ligada a uma região de iniciação da transcrição que é heteróloga com a sequência codificante. Quando o promotor é uma sequência nativa ou natural, a expressão da sequência ligada operacionalmente é alterada da expressão de tipo selvagem, o que resulta em uma alteração no fenótipo.
[0240] Em algumas modalidades, o construto de DNA também pode incluir uma sequência potenciadora da transcrição. Conforme usado no presente documento, o termo um potenciador se refere a uma sequência de DNA que pode estimular a atividade de promotor e pode ser um elemento inato do promotor ou um elemento heterólogo inserido para potenciar o nível ou a especificidade para tecido de um promotor. Vários potenciadores
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269/525 são conhecidos na técnica incluindo, por exemplo, introns com propriedades potenciadoras de expressão de gene em plantas (Publicação de Pedido de Patente dos EUA N° 2009/0144863, o intron de ubiquitina (isto é, o intron de ubiquitina de mais 1 (consulte, por exemplo, sequência de NCBI S94464)), o potenciador de ômega ou o potenciador de iniciador de ômega (Gallie, et al., (1989) Molecular Biology of RNA ed. Cech (Liss, Nova Iorque) 237-256 e Gallie, et al. , (1987) Gene 60:217-225), o potenciador de CaMV 35S (consulte, por exemplo, Benfey, et al., (1990) EMBO J. 9:1685-96) e os potenciadores da Patente dos EUA N° 7,803, 992 também podem ser usados, cada um dos quais é incorporado a titulo de referência. A lista acima de potenciadores de transcrição não é destinada a ser limitante. Qualquer potenciador de transcrição apropriado pode ser usado nas modalidades.
[0241] A região de terminação pode ser nativa com a região de iniciação de transcrição, pode ser nativa com a sequência de DNA de interesse ligada de modo operacional, pode ser nativa com o hospedeiro de planta ou pode ser derivada de outra fonte (isto é, estranha ou heteróloga ao promotor, a sequência de interesse, o hospedeiro de planta ou qualquer combinação dos mesmos).
[0242] Regiões de terminação convenientes são disponibilizadas pelo plasmideo de Ti de A. tumefaciens, tal como as regiões de terminação de octopina sintase e nopalina sintase. Em uma modalidade, o terminador é o terminador de ubiquitina 14 (Callis, J. et al. (1995) Genetics 139, 921-39) . Também consultar , Guerineau, et al. , (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot, (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon, et
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270/525 al., (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen, et al., (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe, et al., (1990) Gene 91:151-158; Ballas, et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903 e Joshi, et al., (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.
[0243] Quando apropriado, um ácido nucleico pode ser otimizado para a expressão aumentada no organismo hospedeiro. Assim, quando o organismo hospedeiro é uma planta, os ácidos nucleicos sintéticos podem ser sintetizados utilizando códons preferidos para plantas para uma expressão melhorada. Consultar, por exemplo, Campbell e Gowri, (1990) Plant Physiol. 92:1-11 para uma discussão de uso de códon preferido por hospedeiro. Por exemplo, embora as sequências de ácidos nucleicos das modalidades possam ser expressas em espécies de planta tanto monocotiledôneas quanto dicotiledôneas, as sequências podem ser modificadas de modo a representar as preferências especificas de códon e as preferências de teor de GC de monocotiledôneas ou dicotiledôneas, uma vez que se demonstrou que essas preferências diferem (Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498) . Assim, o códon preferencial de milho para um aminoácido particular pode ser derivado de sequências de genes conhecidas de milho. O uso de códon de milho para 28 genes de plantas de milho está listado na Tabela 4 de Murray, et al., supra. Métodos estão disponíveis na técnica para sintetizar genes preferidos de plantas. Consultar, por exemplo, Murray, et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498 e Liu H et al. Mol Bio Rep 37:677-684, 2010, incorporado ao presente documento a titulo de referência. Uma tabela de uso de códons de Zea mays também pode ser encontrada em kazusa. or.jp/codon/cgibin/showcodon.cgi?species=4577, que pode ser acessado usando o
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271/525 prefixo www. A Tabela 3 mostra uma análise de códon ótima de mais (adaptado de Liu H et al. Mol Bio Rep 37:677-684, 2010).
Tabela 3
Amino Códon Alta RSCU Baixa RSCU Amino Códon Alta RSCU Baixa RSCU
Ácido Conta- gem Conta- gem Ácido Conta- gem Conta- gem
Phe UUU 115 0, 04 2,301 1,22 Ala GCU 629 0, 17 3, 063 1,59
UUC* 5,269 1,96 1,485 0, 78 GCC* 8, 057 2,16 1, 136 0, 59
Ser UCU 176 0, 13 2,498 1, 48 GCA 369 0, 1 2, 872 1,49
UCC* 3, 489 2,48 1,074 0, 63 GCG* 5, 835 1,57 630 0, 33
UCA 104 0, 07 2, 610 1, 54 Tyr UAU 71 0, 04 1, 632 1,22
UCG* 1, 975 1,4 670 0, 4 UAC* 3, 841 1,96 1, 041 0, 78
AGU 77 0, 05 1,788 1, 06 His CAU 131 0, 09 1, 902 1,36
AGC* 2, 617 1,86 1,514 0, 89 CAC* 2, 800 1,91 897 0, 64
Leu UUA 10 0, 01 1,326 0, 79 Cys UGU 52 0, 04 1,233 1,12
UUG 174 0, 09 2,306 1, 37 UGC* 2,291 1,96 963 0, 88
CUU 223 0, 11 2,396 1, 43 Gin CAA 99 0, 05 2, 312 1,04
CUC* 5, 979 3, 08 1,109 0, 66 CAG* 3, 557 1,95 2, 130 0, 96
CUA 106 0, 05 1,280 0,76 Arg CGU 153 0, 12 751 0, 74
CUG* 5,161 2, 66 1, 646 0, 98 CGC* 4,278 3,25 466 0, 46
Pro CCU 427 0,22 1,900 1, 47 CGA 92 0, 07 659 0, 65
CCC* 3, 035 1,59 601 0, 47 CGG* 1, 793 1,36 631 0, 62
CCA 311 0, 16 2,140 1, 66 AGA 83 0, 06 1, 948 1,91
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CCG* 3, 846 2,02 513 0, 4 AGG* 1, 493 1,14 1, 652 1, 62
Ile AUU 138 0, 09 2,388 1, 3 Asn AAU 131 0, 07 3, 074 1,26
AUG* 4, 380 2,85 1,353 0, 74 AAC* 3, 814 1,93 1, 807 0, 74
AUA 88 0, 06 1,756 0, 96 Lys ΑΆΑ 130 0, 05 3,215 0, 98
Thr ACU 136 0, 09 1,990 1, 43 AAG* 5, 047 1,95 3, 340 1,02
ACC* 3, 398 2,25 991 0, 71 Asp GAU 312 0, 09 4,217 1,38
ACA 133 0, 09 2,075 1, 5 GAC* 6, 729 1,91 1, 891 0, 62
ACG* 2, 378 1,57 495 0, 36 Gly GGU 363 0, 13 2, 301 1,35
Vai GUU 182 0, 07 2,595 1, 51 GGC* 7, 842 2,91 1,282 0, 75
GUC* 4, 584 1,82 1,096 0, 64 GGA 397 0, 15 2, 044 1,19
GUA 74 0, 03 1,325 0, 77 GGG* 2, 186 0, 81 1,215 0, 71
GUG* 5, 257 2,08 1,842 1, 07 Glu GAA 193 0, 06 4, 080 1,1
GAG* 6, 010 1,94 3, 307 0, 9
[0244] O uso de códon foi comparado com o uso do teste de contingência de Chi ao quadrado para identificar códons ótimos. Os códons que ocorrem mais frequentemente de modo significativo (P\0,01) são indicados com um asterisco.
Tabela 4
TTT F 21,2 (10493) TCT S 18,4 (9107)
TTC F 21,2 (10487) TCC S 12,9 (6409)
TTA L 9, 2 (4545) TCA S 15, 6 (7712)
TTG L 22,9 (11340) TCG S 4, 8 (2397)
CTT L 23, 9 (11829) CCT P 18,9 (9358)
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CTC L 17, 1 (8479) CCC P 10, 1 (5010)
CTA L 8,5 (4216) CCA P 19, 1 (9461)
CTG L 12,7 (6304) CCG P 4,7 (2312)
ATT I 25, 1 (12411) ACT T 17, 1 (8490)
ATC I 16,3 (8071) ACC T 14,3 (7100)
ATA I 12,9 (6386) AGA T 14,9 (7391)
ATG M 22,7 (11218) ACG T 4,3 (2147)
GTT V 26,1 (12911) GCT A 26,7 (13201)
GTC V 11,9 (5894) GCC A 16,2 (8026)
GTA V 7,7 (3803) GCA A 21,4 (10577)
GTG V 21,4 (10610) GCG A 6, 3 (3123)
TAT Y 15, 7 (7779) TGT C 8, 1 (3995)
TAG Y 14,9 (7367) TGC C 8, 0 (3980)
TAA * 0, 9 (463) TGA * 1, 0 (480)
TAG * 0,5 (263) TGG w 13, 0 (6412)
CAT H 14, 0 (6930) CGT R 6, 6 (3291)
GAG H 11, 6 (5759) CGC R 6, 2 (3093)
CAA Q 20,5 (10162) CGA R 4, 1 (2018)
GAG Q 16,2 (8038) CGG R 3, 1 (1510)
AAT N 22,4 (11088) AGT S 12, 6 (6237)
AAC N 22,8 (11284) AGC S 11,3 (5594)
AAA K 26,9 (13334) AGA R 14, 8 (7337)
AAG K 35, 9 (17797) AGG R 13,3 (6574)
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GAT D 32,4 (16040) GGT G 20, 9 (10353)
GAC D 20,4 (10097) GGC G 13,4 (6650)
GAA E 33,2 (16438) GGA G 22,3 (11022)
GAG E 33,2 (16426) GGG G 13, 0 (6431)
[0245] Uma tabela de utilização de códon Glycine max é apresentada na Tabela 4 e também pode ser encontrada em kazusa. or .jp/codon/cgibin/showcodon.cgi?species=3847&aa=l&style=N, que pode ser consultada utilizando o prefixo www.
[0246] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico recombinante que codifica um polipeptídeo PtIP-83 tem códons otimizados de milho.
[0247] As modificações de sequência adicionais são conhecidas por intensificar a expressão genética em um hospedeiro celular. As mesmas incluem a eliminação de sequências codificadoras de sinais de poliadenilação espúria, sinais de sítio de união de éxon-íntron, repetições semelhantes a transposons e outras sequências bem caracterizadas que podem ser prejudiciais para a expressão de gene. O teor de GC da sequência pode ser ajustado aos níveis médios para um dado hospedeiro celular, conforme calculado em referência a genes conhecidos expressados na célula hospedeira. O termo célula hospedeira, conforme usado aqui, se refere a uma célula que contém um vetor e suporta a replicação e/ou expressão do vetor de expressão pretendida. As células hospedeiras podem ser células procarióticas, como E. coii, ou células eucarióticas, como células de levedura, inseto, anfíbio ou mamífero ou células de plantas monocotiledôneas ou dicotiledôneas. Um exemplo de uma
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275/525 célula hospedeira monocotiledônea é uma célula hospedeira de mais. Quando possível, a sequência é modificada para evitar estruturas de mRNA secundárias em forquilha de PtIP.
[0248] Os cassetes de expressão podem conter adicionalmente sequências líderes 5'. Tais sequências líder podem atuar para potenciar a tradução. Os líderes de tradução são conhecidos na técnica e incluem: líderes de picornavírus, por exemplo, líder EMCV (região de não codificação 5' de Encefalomiocardite) (Elroy-Stein, et al. , (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:6126-6130); líderes de potivírus, por exemplo, líder TEV (Vírus Gravado do Tabaco) (Gallie, et al., (1995) Gene 165(2):233-238), líder MDMV (Vírus Mosaico Anão de Mais), proteína de ligação de cadeia pesada de imunoglobulina humana (BiP) (Macejak, et al. , (1991) Nature 353:90-94); líder não traduzido da proteína mRNA de revestimento de vírus do mosaico da alfafa (AMV RNA 4) (Jobling, et al., (1987) Nature 325:622625); líder de vírus do mosaico do tabaco (TMV) (Gallie, et al., (1989) em Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, Nova Iorque) , pp. 237-256) e líder de vírus de mancha clorótica do mais (MCMV) (Lommel, et al. , (1991) Virology 81:382-385) . Também consultar Della-Cioppa, et al., (1987) Plant Physiol. 84:965-968. Tais construtos também podem conter uma sequência de sinal ou sequência líder para facilitar o transporte cotradução ou póstradução do peptídeo para determinadas estruturas intracelulares, como o cloroplasto (ou outro plastídeo), retículo endoplasmático ou aparelho de Golgi.
[0249]
Sequência de sinal, conforme usado no presente documento, se refere a uma sequência que é conhecida ou que há suspeitas de resultar em transporte de peptídeo cotradução ou
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276/525 pós-tradução através da membrana da célula. Em eucariotas, isso envolve tipicamente a secreção no aparelho de Golgi com alguma glicosilação resultante. As toxinas inseticidas de bactérias são frequentemente sintetizadas como protoxinas, as quais são ativadas de modo protolítico no intestino da praga direcionada (Chang, (1987) Methods Enzymol. 153:507-516). Em algumas modalidades, a sequência de sinal está localizada na sequência nativa ou pode ser derivada de uma sequência das modalidades. Sequência líder, conforme usado no presente documento, se refere a qualquer sequência que, quando traduzida, resulta em uma sequência de aminoácidos suficiente para acionar o transporte de cotradução da cadeia peptídica a uma organela subcelular. Desse modo, isso inclui sequências líderes que direcionam o transporte e/ou glicosilação pela passagem no retículo endoplasmático, passagem para vacúolos, plastídeos incluindo cloroplastos, mitocôndrias e semelhantes. As proteínas codificadas nucleares direcionadas ao compartimento de lúmen de tilacoide de cloroplasto têm um peptídeo de transição bipartido característico, composto por um peptídeo sinal de direcionamento estromal e um peptídeo sinal de direcionamento de lúmen. As informações de direcionamento estromal estão na porção aminoproximal do peptídeo de transição. O peptídeo sinal de direcionamento de lúmen está na porção carboxila-proximal do peptídeo de transição e contém todas as informações para direcionamento ao lúmen. Pesquisa recente em proteômica do cloroplasto de plantas superiores alcançou a identificação de numerosas proteínas do lúmen codificadas de modo nuclear Kieselbach et al. FEES LETT 480:271-276, 2000; Peltier et al. Plant Cell 12:319-341, 2000; Bricker et al. Biochim. Biophys
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Acta 1503:350-356, 2001), cujo peptídeo sinal de direcionamento para o lúmen pode ser potencialmente usado de acordo com a presente divulgação. Cerca de 80 proteínas de Arabidopsis, assim como proteínas homólogas de espinafre e ervilha, são relatadas por Kieselbach et al. , Photosynthesis Research, 78:249-264, 2003. Em particular, a Tabela 2 dessa publicação, a qual está incorporada à descrição do presente documento a título de referência, revela 85 proteínas do lúmen do cloroplasto, identificadas por seu número de acesso (também consultar a Publicação de Pedido de Patente dos EUA N° 2009/09044298). Além disso, a versão de rascunho recentemente publicada do genoma de arroz (Goff et al, Science 296:92-100, 2002) é uma fonte adequada para peptídeo sinal de direcionamento para o lúmen, a qual pode ser usada de acordo com a presente divulgação.
[0250] Peptídeos de transição de cloroplasto (CTP) adequados são bastante conhecidos para um indivíduo versado na técnica também incluem CTPs quiméricos que compreendem, mas sem limitação, um domínio de terminal N, um domínio central ou um domínio de terminal C de um CTP a partir de Oryza sativa 1deóxi-D xiulose-5-Fosfato Sintase, Superóxido de Oryza sativa dismutase, amido solúvel em Oryza sativa sintase, Enzima de ácido málico dependente de NADP-Oryza sativa, Oryza sativa-Fosfo-2dehidro-3-deoxiheptonato Aldolase 2, Oryza sati va-L-Ascorbato peroxidase 5, Oryza sativa-Fosfoglucano água diquinase, Zea Mays ssRUBISCO, Zea Mays-beta-glucosidase, Zea Mays-Malate dehidrogenase, Zea Mays Tioredoxina tipo M Publicação do Pedido de Patente dos EUA 2012/0304336.
[0251] O gene de polipeptídeo PtIP-83 a ser direcionado ao cloroplasto pode ser otimizado para a expressão no cloroplasto
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278/525 para contabilizar as diferenças em uso de códon entre o núcleo de planta e essa organela. Dessa maneira, os ácidos nucleicos de interesse podem ser sintetizados com o uso dos códons preferidos de cloroplasto. Consultar, por exemplo, a Patente dos EUA N° 5,380,831, incorporada ao presente documento a título de referência.
[0252] No preparo do cassete de expressão, os vários fragmentos de DNA podem ser manipulados de modo a fornecer as sequências de DNA na orientação apropriada e, conforme apropriado, no quadro de leitura apropriado. Para esse fim, os adaptadores ou ligantes podem ser empregados para unir os fragmentos de DNA ou outras manipulações podem ser envolvidas para fornecer sítios de restrição convenientes, remoção de DNA supérfluo, remoção de sítios de restrição ou semelhantes. Com esse propósito, a mutagênese in vitro, o reparo de iniciador, restrição, anelamento, ressubstituições, por exemplo, transições e transversões, podem ser envolvidos.
[0253] Vários promotores podem ser usados na prática das modalidades. Os promotores podem ser selecionados com base no resultado desejado. Os ácidos nucleicos podem ser combinados com promotores constitutivos, preferenciais para tecidos, induzíveis ou outros promotores para expressão no organismo hospedeiro. Promotores constitutivos adequados para uso em uma célula hospedeira de planta incluem, por exemplo, o promotor nuclear do promotor de Rsyn7 e outros promotores constitutivos divulgados em WO 1999/43838 e na Patente dos EUA N° 6,072,050; o promotor nuclear de CaMV 35S (Odell, et al. , (1985) Nature 313:810-812); actina de arroz (McElroy, et al., (1990) Plant Cell 2:163-171); ubiquitina (Christensen, et al. , (1989) Plant
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Mol. Biol. 12:619-632 e Christensen, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); promoter da ubiquitina 10 (Grefen, C. et al. (2010) The Plant Journal 64, 355-365); pEMU (Last, et al., (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten, et al., (1984) EMBO J. 3:2723-2730); promotor de ALS (Patente dos EUA N° 5,659,026) e semelhantes. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, aqueles discutidos nas Patentes dos EUA N°s 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785;
5, 399, 680; 5,268,463; 5, 608,142 e 6,177,611.
[0254] Dependendo do resultado desejado, pode ser benéfico expressar o gene a partir de um promotor induzível. Os promotores induzíveis por ferimento são de interesse particular para regular a expressão das sequências de nucleotídeos das modalidades em plantas. Tais promotores induzíveis por ferimento podem responder ao dano causado por alimentação de insetos e incluem o gene de inibidor de proteinase de batata (pin II) (Ryan, (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28:425-449; Duan, et al., (1996) Nature Biotechnology 14:494-498); wunl e wun2, Patente dos EUA N° 5,428,148; winl e win2 (Stanford, et al., (1989) Mol. Gen. Genet. 215:200-208); sistemina (McGurl, et al., (1992) Science 225:1570-1573); WIP1 (Rohmeier, et al., (1993) Plant Mol. Biol. 22:783-792; Eckelkamp, et al., (1993) FEES Letters 323:73-76) ; gene MPI (Corderok, et al., (1994) Plant J. 6(2):141150) e semelhantes, aqui incorporados a título de referência.
[0255] Adicionalmente, os promotores induzíveis por patógenos podem ser empregues nos métodos e construtos de nucleotídeos das modalidades. Tais promotores induzíveis por patógeno incluem aqueles de proteínas relacionadas à patogênese (proteínas PR), que são induzidas em seguida à infecção por um
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280/525 patógeno; por exemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1,3glucanase, quitinase, etc. Consultar, por exemplo, Redolfi, et al. , (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89:245-254; Uknes, et al., (1992) Plant Cell 4: 645-656 e Van Loon, (1985) Plant Mol. Virol. 4:111-116. Também consultar, WO 1999/43819, aqui incorporado a titulo de referência.
[0256] De interesse são os promotores que são expressos localmente no local ou perto do sitio da infeção patogênica. Consultar, por exemplo, Marineau, et al. , (1987) Plant Mol. Biol. 9:335-342; Matton, et al., (1989) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-331; Somsisch, et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2427-2430; Somsisch, et al., (1988) Mol. Gen.
Genet. 2:93-98 e Yang, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14972-14977. Também consultar, Chen, et al., (1996) Plant J. 10:955-966; Zhang, et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2507-2511; Warner, et al., (1993) Plant J. 3:191-201;
Siebertz, et al., (1989) Plant Cell 1:961-968; Patente dos EUA N° 5,750,386 (induzivel por nematódeo) e as referências citadas nos mesmos. É de interesse particular o promotor induzivel para o gene PRms de mais, cuj a expressão é induzida pelo patógeno Fusarium moniliforme (consultar, por exemplo, Cordero, et al., (1992) Physiol. Mol. Plant Path. 41:189-200).
[0257] Os promotores regulados quimicamente podem ser utilizados para modular a expressão de um gene em uma planta através da aplicação de um regulador químico exógeno. Dependendo do objetivo, o promotor pode ser um promotor quimicamente induzivel, em que a aplicação da substância química induz a expressão genética ou um promotor quimicamente repressível, em que a aplicação da substância química reprime a expressão
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281/525 genética. Os promotores induzíveis por substância química são conhecidos na técnica e incluem, mas sem limitação, o promotor In2-2 de milho, que é ativado por protetores herbicidas de benzenosulfonamida, sendo que o promotor GST de milho, que é ativado por compostos eletrofílicos hidrofóbicos que são usados como herbicidas pré-emergentes e o promotor PR-la de tabaco, que é ativado por ácido salicílico. Outros promotores de interesse regulados quimicamente incluem promotores responsivos a esteroides (consultar, por exemplo, o promotor induzível por glicocorticoide em Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:10421-10425 e McNeills et al. (1998) Plant J. 14(2):247257) e promotores induzíveis por tetraciclina e repressíveis por tetraciclina (ver, por exemplo, Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237 e Patentes dos EUA N°s 5,814,618 e 5,789,156), incorporados aqui a título de referência.
[0258] Os promotores preferenciais de tecido podem ser utilizados para direcionar a expressão de polipeptídeo PtIP-83 intensificada em um tecido de planta específico. Os promotores preferidos para tecidos incluem aqueles discutidos em Yamamoto,
et al. , (1997) Plant J. 12(2)255-2 65; Kawamata, et al ., (1997)
Plant Cell Physiol. 38(7):792 -803; Hansen, et al., (1 997) Mol.
Gen Genet. 254(3) :337-343; Russell , et al., ( 1997) Transgenic
Res • 6(2):157-168; Rinehart, et al. , (1996) Plant Physiol.
112 (3 ):1331-1341; Van Camp, et c 21 . , (1996) Plant Physiol.
112 (2 ):525-535; Canevascini, et al., (1996) Plant Physiol.
112 (2 ):513-524; Yamamoto, et al., (1994 ) Plant Cell Physiol.
35 ( 5) :773-778; Lam, (1994) Results Probl . Cell Differ . 20:181-
196 r Orozco, et al., (1993) Plant Mol Biol. 23(6) :1 129-1138;
Matsuoka, et al., (1993) Proc Natl. Acad. . Sci. USA 90( 20):9586-
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9590 e Guevara-Garcia, et al., (1993) Plant J. 4(3) :495-505. Tais promotores podem ser modificados, se necessário, para expressão fraca.
[0259] Promotores preferenciais para folhas são conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Yamamoto, et al., (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kwon, et al., (1994) Plant Physiol. 105:357-67; Yamamoto, et al. , (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Gotor, et al., (1993) Plant J. 3:50918; Orozco, et al., (1993) Plant Mol. Biol. 23(6):1129-1138 e Matsuoka, et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):95869590 .
[0260] Promotores preferenciais para raizes ou específicos para raízes são conhecidos e podem ser selecionados dos muitos disponíveis na literatura ou isolados de novo de várias espécies compatíveis. Consultar, por exemplo, Hire, et al. , (1992) Plant Mol. Biol. 20(2) :207-218 (gene de glutamina sintetase específico de raiz de soja); Keller e Baumgartner, (1991) Plant Cell 3(10):1051-1061 (elemento de controle específico de raiz no gene GRP 1.8 de Vagem); Sanger, et al., (1990) Plant Mol. Biol. 14(3) :433-443 (promotor específico de raiz do gene de manopina sintase (MAS) de Agrobacterium tumefaciens} e Miao, et al., (1991) Plant Cell 3(1) :11-22 (glutamina sintetase (GS) citosólica codificadora de clone de cDNA de comprimento completo, a qual é expressa em raízes e nódulos de raiz de soja). Também consultar Bogusz, et al., (1990) Plant Cell 2(7):633-641, em que dois promotores específicos de raiz isolados de genes de hemoglobina da não leguminosa de fixação de nitrogênio Parasponia andersonii e a não leguminosa de não fixação de nitrogênio Trema tomentosa são descritos. Os
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283/525 promotores destes genes foram ligados a um gene repórter de βglucuronidase e introduzidos tanto na não leguminosa Nicotiana tabacum quanto na leguminosa Lotus cornículatus e em ambos os casos a atividade promotora específica para raízes foi preservada. Leach e Aoyagi (1991) descrevem sua análise dos promotores dos genes indutores de raízes de rolC e rolD altamente expressos de Agrobacteríum rhízogenes (consultar, Plant Science (Limerick) 79(1):69-76). Concluiu-se que o potenciador e os determinantes de DNA preferidos pelos tecidos estão dissociados nesses promotores. Teeri, et al., (1989) usaram fusão de gene para lacZ para mostrar que o gene de T-DNA de Agrobacteríum codificador de octopina sintase é especialmente ativo na epiderme da ponta de raiz e que o gene de TR2' é específico de raiz na planta intata e estimulado por ferimento no tecido de folha, uma combinação especialmente desejável de características para uso com um gene inseticida ou larvicida (consultar, EMBO J. 8(2):343-350). O gene TR1' fundido a nptll (neomicina fosfotransferase II) apresentou características semelhantes. Os promotores preferidos para raiz adicionais incluem o promotor do gene VÍENOD-GRP3 (Kuster, et al., (1995) Plant Mol. Biol. 29(4):759-772) e o promotor de rolB (Capana, et al., (1994) Plant Mol. Biol. 25(4):681-691. Também consultar as Patentes dos EUA N°s 5,837,876; 5,750,386; 5,633,363; 5,459,252; 5,401,836; 5,110,732 e 5,023,179. As sequências regulatórias preferenciais para raiz de Arabidopsis thaliana são divulgadas em US20130117883.
[0261] Promotores preferenciais para sementes incluem tanto promotores específicos para sementes (aqueles promotores ativos durante o desenvolvimento de sementes tais como
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284/525 promotores de proteínas de armazenamento de sementes) assim como promotores de germinação de sementes (aqueles promotores ativos durante a germinação de sementes). Consultar Thompson, et al., (1989) BioEssays 10:108, incorporado ao presente documento a título de referência. Tais promotores preferidos para sementes incluem, mas sem limitação, Ciml (mensagem induzida por citoquinina) ; cZ19Bl (zeína de 19 kDa de mais) e milps (mioinositol-l-fosfato sintase) (consultar a Patente dos EUA N° 6,225,529 incorporada no presente documento a título de referência). Gama-zeína e Glb-1 são promotores específicos para endosperma. Para dicotiledôneas, promotores específicos de semente incluem, mas sem limitação, inibidor de tripsina Kunitz 3 (KTi3) (Jofuku e Goldberg, (1989) Plant Cell 1:1079-1093), βfaseolina de feijão, napina, β-conglicinina, glicinina 1, lectina de soja, cruciferina e similares. Para monocotiledôneas, promotores específicos de semente incluem, mas sem limitação, zeína de 15 kDa de milho, zeína de 22 kDa, zeína de 27 kDa de milho, g-zeína, ceroso, murcho 1, murcho 2, globulina 1, etc. Consultar também, WO 2000/12733, em que promotores preferenciais de semente de genes de endl e end2 são divulgados; no presente documento incorporados a título de referência. Em dicotiledôneas, os promotores específicos de semente incluem, mas sem limitação, promotor de revestimento de semente de Arabidopsis, pBAN; e os promotores de semente iniciais de Arabidopsis, p26, p63 e p63tr (Patentes dos EUA N°s 7,294,760 e 7,847,153). Um promotor que tem expressão preferida em um tecido particular é expresso nesse tecido até um grau maior do que pelo menos um outro tecido de planta. Alguns promotores
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285/525 preferidos para tecido mostram a expressão quase exclusivamente no tecido particular.
[0262] Quando a expressão de nível baixo for desejada, os promotores fracos serão usados. Geralmente, o termo promotor fraco, conforme usado aqui, se refere a um promotor que aciona a expressão de uma sequência de codificação em um nível baixo. Por expressão de nível baixo, níveis entre cerca de 1/1,000 transcritos a cerca de 1/100,000 transcritos a cerca de 1/500,000 transcritos são pretendidos. Alternativamente, é reconhecido que o termo promotores fracos também abrange os promotores que acionam a expressão apenas em algumas células e não em outras para gerar um nível baixo total de expressão. Quando um promotor aciona a expressão em níveis inaceitavelmente altos, porções da sequência promotora podem ser deletadas ou modificadas para diminuir os níveis de expressão.
[0263] Tais promotores constitutivos fracos incluem, por exemplo, o promotor nuclear do promotor de Rsyn7 (WO 1999/43838 e Patente dos EUA N° 6,072,050), o promotor nuclear do CaMV 35S e semelhantes. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, aqueles divulgados nas Patentes dos EUA N° 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142 e 6,177,611, incorporado no presente documento a título de referência.
[0264] A lista acima de promotores não é destinada a ser limitante. Qualquer promotor apropriado pode ser usado nas modalidades.
[0265] Geralmente, o cassete de expressão compreenderá um gene marcador selecionável para a seleção de células
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286/525 transformadas. Genes marcadores selecionáveis são utilizados para a seleção de células ou tecidos transformados. Os genes marcadores incluem os genes que codificam a resistência a antibióticos, como aqueles que codificam a neomicina fosfotransferase II (NEO) e higromicina fosfotransferase (HPT), assim como genes que conferem resistência aos compostos herbicidas, como glufosinato de amônio, bromoxinil, imidazolinonas e 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Os exemplos adicionais de genes marcadores selecionáveis adequados incluem, mas sem limitação, genes codificando resistência ao cloranfenicol (Herrera Estrella, et al. , (1983) EMBO J. 2:987992); metotrexato (Herrera Estrella, et al. , (1983) Nature
303:209-213 e Meijer, et al. , (1991) Plant Mol. Biol. 16:807820); estreptomicina (Jones, et al. , (1987) Mol. Gen. Genet.
210:86-91); espectinomicina (Bretagne-Sagnard, et al., (1996) Transgenic Res. 5:131-137); bleomicina (Hille, et al. , (1990) Plant Mol. Biol. 7:171-176); sulfonamida (Guerineau, et al. , (1990) Plant Mol. Biol. 15:127-136); bromoxinil (Stalker, et al., (1988) Science 242:419-423); glifosato (Shaw, et al. , (1986) Science 233:478-481 e Pedidos de Patente dos EUA N° 10/004,357 e 10/427, 692); fosfinotricina (DeBlock, et al. , (1987) EMBO J. 6:2513-2518) . Consultar, de modo geral, Yarranton, (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-511; Christopherson, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:6314-6318; Yao, et al. , (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff, (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley, et al., (1980) em The Operon, pp. 177-220; Hu, et al. , (1987) Cell 48:555-566; Brown, et al., (1987) Cell 49:603-612; Figge, et al. , (1988)
Cell 52:713-722; Deuschle, et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sei.
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USA 86:5400-5404; Fuerst, et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549-2553; Deuschle, et al., (1990) Science 248:480-483; Gossen, (1993) Tese de Ph.D., University of Heidelberg; Reines, et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1917-1921; Labow, et al., (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Zambretti, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952-3956; Bairn, et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072-5076; Wyborski, et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman, (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb, et al., (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt, et al., (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin, (1993) Tese de Ph.D., University of Heidelberg; Gossen, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551; Oliva, et al., (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka, et al., (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlim) e Gill, et al., (1988) Nature 334:721-724. Tais divulgações são incorporadas ao presente documento a título de referência.
[0266]
A lista acima de genes marcadores selecionáveis não é destinada a ser limitante. Qualquer gene marcador selecionável pode ser utilizado nas modalidades.
Transformação de Plantas [0267] Os métodos das modalidades envolvem introduzir um polipeptideo ou polinucleotideo em uma planta. Introduzir significa, conforme usado no presente documento, apresentar à planta o polinucleotideo ou polipeptideo de tal maneira que a sequência ganhe acesso ao interior de uma célula da planta. Os métodos das modalidades não dependem de um método particular para introduzir um polinucleotideo ou polipeptideo em uma
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288/525 planta, apenas que o polinucleotideo ou polipeptídeos ganhem acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta. Os métodos para introduzir polinucleotideo ou polipeptídeos em plantas são conhecidos na técnica incluindo, mas sem limitação, métodos de transformação estável, métodos de transformação transiente e métodos mediados por vírus.
[0268] Transformação estável significa, conforme usado no presente documento, que o construto de nucleotídeos introduzido em uma planta se integra no genoma da planta e tem capacidade para ser herdado pela descendência da mesma. Transformação transiente significa, conforme usado no presente documento, que um polinucleotideo é introduzido na planta e não se integra no genoma da planta ou um polipeptideo é introduzido em uma planta. Planta se refere, conforme usado no presente documento, a plantas inteiras, órgãos de plantas (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc.), sementes, células de plantas, propágulos, embriões e descendência dos mesmos. As células de planta podem ser diferenciadas ou não diferenciadas (por exemplo, calo, células de cultura em suspensão, protoplastos, células de folha, células de raiz, células de floema e pólen).
[0269] Os protocolos de transformação, assim como protocolos para introduzir sequências de nucleotídeos em plantas, podem variar dependendo do tipo de planta ou célula de planta, isto é, monocotiledônea ou dicotiledônea, visada para transformação. Métodos adequados de introdução de sequências de nucleotídeos em células de planta e subsequente inserção no genoma de planta incluem microinjeção (Crossway, et al., (1986) Biotechniques 4:320-334), eletroporação (Riggs, et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:5602-5606), transformação mediada
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289/525 por Agrobacterium (Patentes dos EUA N° 5,563,055 e 5,981,840), transferência de genes direta (Paszkowski, et al. , (1984) EMBO J. 3:2717-2722) e aceleração balística de partículas (consultar, por exemplo, Patentes dos EUA N° 4,945,050; 5,879,918; 5,886,244 e 5, 932,782; Tomes, et al. , (1995) em Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg e Phillips, (Springer-Verlag, Berlin) e McCabe, et al., (1988) Biotechnology 6:923-926) e transformação Led (WO 00/28058) . Para transformação de batata, consultar Tu, et al., (1998) Plant Molecular Biology 37:829-838 e Chong, et al., (2000) Transgenic Research 9:71-78. Os procedimentos de transformação adicionais podem ser encontrados em Weissinger, et al., (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford, et al., (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebola); Christou, et al., (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja); McCabe, et al., (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soja); Finer e McMullen, (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182 (soja); Singh, et al., (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); Datta, et al., (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein, et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (mais); Klein, et al., (1988) Biotechnology 6:559-563 (mais); Patentes dos EUA N° 5,240,855; 5,322,783 e 5,324,646; Klein, et al., (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (mais); Fromm, et al., (1990) Biotechnology 8:833839 (mais); Hooykaas-Van Slogteren, et al., (1984) Nature (Londres) 311:763-764; Patente dos EUA N° 5,736,369 (cereais);
Bytebier, et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet, et al., (1985) em The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman, et al., (Longman, Nova Iorque), páginas 197-209 (pólen); Kaeppler, et al., (1990)
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Plant Cell Reports 9:415-418 e Kaeppler, et al., (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformação mediada por fibras); D'Halluin, et al., (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (eletroporação) ; Li, et al. , (1993) Plant Cell Reports 12:250255 e Christou e Ford, (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda, et al., (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (mais por meio de Agrobacterium tumefaciens); todos os quais são incorporados ao presente documento a título de referência.
[0270] Em modalidades específicas, as sequências das modalidades podem ser fornecidas a uma planta com o uso de uma variedade de métodos de transformação transiente. Tais métodos de transformação transiente incluem, mas sem limitação, a introdução do polipeptídeo PtIP-83 ou suas variantes e fragmentos diretamente na planta ou a introdução do transcrito do polipeptídeo PtIP-83 na planta. Tais métodos incluem, por exemplo, microinjeção ou bombardeamento de partículas. Consultar, por exemplo, Crossway, et al. , (1986) Mol Gen. Genet. 202:179-185; Nomura, et al. , (1986) Plant Sei. 44:53-58; Hepler, et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. 91:2176-2180 e Hush, et al. , (1994) The Journal of Cell Science 107:775-784, todos os quais são incorporados no presente documento a título de referência. Alternativamente, o polinucleotídeo de polipeptídeo PtIP-83 pode ser transitoriamente transformado na planta com o uso de técnicas conhecidas na técnica. Tais técnicas incluem o sistema de vetor viral e a precipitação do polinucleotídeo de uma forma que impede a libertação subsequente do DNA. Assim, pode ocorrer a transcrição a partir do DNA ligado a partículas, mas a frequência com que é libertada para se integrar no genoma
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291/525 é grandemente reduzida. Tais métodos incluem a utilização de partículas revestidas com polietilimina (PEI; Sigma #P3143) .
[0271] São conhecidos na técnica métodos para a inserção direcionada de um polinucleotídeo em uma localização específica no genoma da planta. Em uma modalidade, a inserção do polinucleotídeo em uma localização genômica desejada é conseguida utilizando um sistema de recombinação sítioespecífico. Consultar, por exemplo, WO 1999/25821, WO 1999/25854, WO 1999/25840, WO 1999/25855 e WO 1999/25853, todos os quais são incorporados no presente documento a título de referência. Brevemente, o polinucleotídeo das modalidades pode ser contido em um cassete de transferência flanqueado por dois sítios de recombinação não idênticos. O cassete de transferência é introduzido em uma planta que incorporou de modo estável em seu genoma um sítio-alvo que é flanqueado por dois sítios de recombinação não idênticos que correspondem aos sítios do cassete de transferência. Uma recombinase apropriada é fornecida e o cassete de transferência é integrado no sítio-alvo. O polinucleotídeo de interesse é deste modo integrado em uma posição cromossômica específica no genoma da planta.
[0272] Os vetores de transformação de planta podem ser compreendidos por um ou mais vetores de DNA necessários para alcançar a transformação da planta. Por exemplo, é uma prática comum na técnica utilizar os vetores de transformação de planta que são compreendidos por mais de um segmento de DNA contíguo. Esses vetores são frequentemente chamados na técnica de vetores binários. Vetores binários, assim como vetores com plasmídeos auxiliares, são muito frequentemente usados para transformação mediada por Agrobacteríum, em que o tamanho e complexidade dos
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292/525 segmentos de DNA necessários para alcançar transformação eficiente são bem grandes, e é vantajoso separar funções em moléculas de DNA separadas. Vetores binários contêm tipicamente um vetor plasmidico que contém as sequências de atuação cis exigidas para a transferência de T-DNA (como borda esquerda e borda direita), um marcador selecionável que é modificado para ter capacidade para expressão em uma célula de planta e um gene de interesse (um gene modificado para ter capacidade para expressão em uma célula de planta para a qual a geração de plantas transgênicas é desejada). Também estão presentes nesse vetor plasmidico as sequências exigidas para replicação bacteriana. As sequências de atuação cis são dispostas de maneira a permitir a transferência eficaz para células de plantas e expressão nas mesmas. Por exemplo, o gene marcador selecionável e o gene pesticida são localizados entre as bordas esquerda e direita. Frequentemente, um segundo vetor plasmidico contém os fatores de atuação trans que medeiam a transferência de T-DNA de Agrobacteríum para células de plantas. Esse plasmídeo contém frequentemente as funções de virulência (genes Vir) que permitem a infecção de células de plantas por Agrobacteríum, e transferência de DNA por divagem em sequências de borda e transferência de DNA mediada por Vir, conforme é entendido na técnica (Hellens e Mullineaux, (2000) Trends in Plant Science 5:446-451) . Diversos tipos de cepas de Agrobacteríum (por exemplo, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, etc.) podem ser usados para transformação de plantas. O segundo vetor plasmidico não é necessário para transformar as plantas por outros métodos, como microprojeção, microinjeção, eletroporação, polietilenoglicol, etc.
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293/525 [0273] Em geral, os métodos de transformação de plantas envolvem transferir DNA heterólogo para células alvo de plantas (por exemplo, embriões imaturos ou maduros, culturas em suspensão, calo não diferenciado, protoplastos, etc.), seguido da aplicação de um nível de limiar máximo de seleção apropriada (dependendo do gene marcador selecionável) para recuperar as células de plantas transformadas a partir de um grupo de massa de células não transformadas. Após a integração de DNA estranho heterólogo em células de plantas, é aplicado um nível de limiar máximo de seleção apropriada no meio para matar as células não transformadas e separar e proliferar as células transformadas de modo putativo que sobrevivem a esse tratamento de seleção transferindo as mesmas de modo regular para um meio fresco. Pela passagem contínua e o desafio com seleção apropriada, são identificadas e proliferadas as células que são transformadas com o vetor plasmídeo. Os métodos moleculares e bioquímicos podem, então, ser usados para confirmar a presença do gene de interesse heterólogo integrado no genoma da planta transgênica.
[0274] Explantes são tipicamente transferidos para um suprimento fresco do mesmo meio e cultivados de modo rotineiro. Subsequentemente, as células transformadas são diferenciadas em brotos após colocação em meio de regeneração suplementado com um nível de limiar máximo de agente de seleção. Os brotos são, então, transferidos para um meio de enraizamento seletivo para recuperar o broto ou plântula enraizado. A plântula transgênica cresce, então, para uma planta madura e produz sementes férteis (por exemplo, Hiei, et al., (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida, et al., (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). Explantes são tipicamente transferidos para um suprimento fresco
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294/525 do mesmo meio e cultivados de modo rotineiro. Uma descrição geral das técnicas e métodos para gerar plantas transgênicas é encontrada em Ayres e Park, (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239 e Bommineni e Jauhar, (1997) Maydica 42:107120. Visto que o material transformado contém muitas células, tanto as células transformadas quanto não transformadas estão presentes em qualquer parte de calo direcionado submetido ou tecido ou grupo de células. A habilidade para exterminar as células não transformadas e permitir que as células transformadas proliferem resulta em culturas de planta transformadas. Frequentemente, a habilidade para remover células não transformadas é uma limitação à recuperação rápida de células de plantas transformadas e geração bem-sucedida de plantas transgênicas.
[0275] As células que foram transformadas podem ser cultivadas em plantas, de acordo com maneiras convencionais. Consultar, por exemplo, McCormick, et al. , (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Essas plantas podem, então, ser cultivadas e ser polinizadas com a mesma cepa transformada ou com cepas diferentes, e o híbrido resultante que tem expressão constitutiva ou induzível da característica fenotípica desejada pode ser identificado. Duas ou mais gerações podem ser cultivadas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada é mantida de modo estável e herdada e, então, as sementes são recolhidas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada foi alcançada.
[0276] As sequências podem ser fornecidas à planta um vírus ou ácidos nucleicos de nucleotídeos das modalidades colocando a planta em contato com virais. Geralmente, tais métodos
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295/525 envolvem incorporar o construto de nucleotídeos de interesse dentro de uma molécula de RNA ou DNA viral. Reconhece-se que as proteínas recombinantes das modalidades podem ser inicialmente sintetizadas como parte de uma poliproteína viral, que posteriormente pode ser processada por meio de proteólise ín vivo ou in vitro para produzir o polipeptídeo PtIP-83 desejado. É também reconhecido que uma tal poliproteína viral, compreendendo pelo menos uma porção da sequência de aminoácidos de uma PtIP-83 das modalidades, pode ter a atividade pesticida desejada. Tais poliproteínas virais e as sequências de nucleotídeo que codificam as mesmas são englobadas pelas modalidades. Os métodos para dotar plantas de construtos de nucleotídeo e produzir as proteínas codificadas nas plantas que envolvem moléculas de RNA ou DNA viral são conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Patentes dos EUA 5,889,191; 5,889,190; 5,866,785; 5,589,367 e 5,316,931; incorporadas no presente documento a título de referência.
[0277] Os métodos para transformação de cloroplastos são conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Svab, et al. , (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:852 6-8530; Svab e Maliga, (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:913-917; Svab e Maliga, (1993) EMBO J. 12:601-606. O método se baseia na entrega com canhão de partículas de DNA que contém um marcador selecionável e direcionamento do DNA para o genoma plastídico através de recombinação homóloga. Adicionalmente, a transformação de plastídeos pode ser realizada pela transativação de um transgene originado por plastídeo silencioso por expressão preferida para tecidos de uma RNA polimerase codificada de modo nuclear e
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296/525 direcionada para plastídeo. Tal sistema foi relatado em McBride, et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:7301-7305.
[0278] As modalidades se referem adicionalmente a material de propagação de planta de uma planta transformada das modalidades o que inclui, mas sem limitação, sementes, tubérculos, cormo, bulbos, folhas e cortes de raízes e brotos.
[0279] As modalidades podem ser usadas para transformação de quaisquer espécies de planta, incluindo, mas sem limitação, monocotiledôneas e dicotiledôneas. Os exemplos de plantas de interesse incluem, mas sem limitação, milho (Zea mays), Brassica sp. (por exemplo, B. napus, B. rapa, B. juncea), particularmente aquelas espécies de Brassica úteis como fontes de óleo de semente, alfafa (Medicago sativa) , arroz (Oryza sativa), centeio (Secale cereale) , sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare) , milhete (por exemplo, milhete-pérola (Pennisetum glaucum), milho miúdo (Panicum miliaceum), milho painço (Setaria italica) , capim-pé-de-galinha-gigante (Eleusine coracana) ), girassol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius) , trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tobaco (Nicotiana tabacum), batata (Solanum tuberosum), amendoins (Arachis hypogaea), algodão (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata doce (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucifera) , abacaxi (Ananas comosus), árvores de citrinos (Citrus spp.), cacau (Theobroma cacao), chá (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), abacate (Persea americana), figueira (Ficus casica), goiaba (Psidium guajava), manga (Mangifera indica), oliveira (Olea europaea), papaia (Carica papaya), caju (Anacardium occidentale) , macadâmia (Macadamia integrifolia), almêndoa
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297/525 (Prunus amygdalus) , beterraba sacarina (Beta vulgaris) , canade-açúcar (Saccharum spp.), aveia, cevada, plantas ornamentais e coníferas.
[0280] Os vegetais incluem tomates (Lycopersicon esculentum), alface (por exemplo, Lactuca sativa), feijões verdes (Phaseolus vulgaris), feijões-de-lima (Phaseolus limensis), ervilhas (Lathyrus spp.) e membros do gênero Cucumis, como pepino (C. sativus), cantalupo (C. cantalupensis) e melão (C. melo). As plantas ornamentais incluem azaleia (Rhododendron spp.), hortênsia (Macrophylla hydrangea), hibisco (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipas (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), petúnias (Petunia hybrida), cravo (Dianthus caryophyllus) , poinsétia (Euphorbia pulcherrima) e crisântemo. As coníferas que podem ser empregadas na prática das modalidades incluem, por exemplo, pinheiros, como pinheiro (Pinus taeda) , pinheiro-americano (Pinus elliotii), pinheiro ponderosa (Pinus ponderosa), pinheiro de lodgepole (Pinus contorta) e pinheiro-de-Monterey (Pinus radiata) ; pinheiro-dooregon (Pseudotsuga menziesii); cicuta ocidental (Tsuga canadensis) ; abeto Sitka (Picea glauca); sequoia (Sequoia sempervirens); abetos verdadeiros, como abeto (Abies amabilis) e abeto balsâmico (Abies balsamea); e cedros, como cedro vermelho ocidental (Thuja plicata) e cedro amarelo do Alasca (Chamaecyparis nootkatensis) . As plantas das modalidades incluem plantas de cultura (por exemplo, milho, alfafa, girassol, Brassica, soja, algodão, cártamo, amendoim, sorgo, trigo, milhete, tabaco, etc.), como plantas de milho e soja.
[0281] Os gramados incluem, mas sem limitação: poaanual (Poa annua); azevém anual (Lolium multiflorum); poa
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298/525 canadiana (Poa compressa) ; festuca-encarnada (Festuca rubra); Agrostide-ténue (Agrostís tenuís); erva-fina (Agrostís palustrís); grama de trigo do deserto (crested wheatgrass) (Agropyron desertorum); capim-mombaça (Agropyron crístatum); festuca rígida (hard fescue) (Festuca longífolia) ; erva-de-febra (Poa pratensis); panasco (Dactylis glomerata); azevém perene (Lolium perenne); festuca-encarnada (Festuca rubra); germínia rubra (Agrostís alba); poa-comum (Poa trivialis) ; festuca ovina (Festuca ovina) ; bromo (Bromus inermis); festuca alta (Festuca arundinacea); rabo-de-gato (Phleum pratense); Agrostis-de-cão (velvet bentgrass) (Agrostís canina); weeping alkaligrass (Puccinellia distans) ; erva-trigo ocidental (Agropyron smithii) ; grama Bermuda (Cynodon spp.); grama Santo Agostinho (Stenotaphrum secundatum); Grama Zoysia (Zoysia spp.); gramabahia (Paspalum notatum); grama tapete (Axonopus affinis); grama centipede (Eremochloa ophiuroides); grama Kikuio (Pennisetum clandesinum); capim-arame-da-praia (Paspalum vaginatum); grama azul (Bouteloua gracilis); grama americana (Buchloe dactyloids); grama sideoats (Bouteloua curtipendula) .
[0282] As plantas de interesse incluem plantas de grãos que fornecem sementes de interesse, plantas de semente de óleo e leguminosas. Sementes de interesse incluem sementes de grão, tais como milho, trigo, cevada, arroz, sorgo, centeio, milheto, etc. Plantas com semente oleosa incluem algodão, soja, açafrãobastardo, girassol, Brassica, milho, alfalfa, palma, coco, linho, rícino, azeitona, etc. Plantas leguminosas incluem feijões e ervilhas. Os feijões incluem guar, feijão de alfarroba, feno-grego, soja, feijão de jardim, feijão-frade, feijão mungo, feijão-de-lima, feijão-fava, lentilhas, grão-de-bico, etc.
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Avaliação da Transformação de Plantas [0283] Após a introdução de DNA estranho heterólogo em células de plantas, a transformação ou integração do gene heterólogo no genoma da planta é confirmada por vários métodos, como análise de ácidos nucleicos, proteínas e metabólitos associados ao gene integrado.
[0284] A análise de PCR é um método rápido para triar células, tecido ou brotos transformados quanto à presença de gene incorporado no estágio inicial antes da transplantação para o solo (Sambrook e Russell, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). É executada PCR com o uso de iniciadores de oligonucleotídeos específicos para o gene de interesse ou fundo de vetor de Agrobacteríum, etc.
[0285] A transformação de planta pode ser confirmada por análise de transferência Southern de DNA genômico (Sambrook e Russell, (2001) supra). Em geral, DNA total é extraído do transformante, digerido com enzimas de restrição apropriadas, fracionado em um gel de agarose e transferido para uma membrana de nitrocelulose ou náilon. A membrana ou coloração é então sondada com, por exemplo, fragmento de DNA-alvo radioetiquetado com 32P para confirmar a integração do gene introduzido no genoma de planta, de acordo com técnicas padrão (Sambrook e Russell, (2001) s upra) .
[0286] Na análise de transferência Northern, RNA é isolado de tecidos específicos do transformante, fracionado em um gel de agarose e formaldeido e transferido para um filtro de náilon de acordo com procedimentos padrão que são usados de modo
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300/525 rotineiro na técnica (Sambrook e Russell, (2001) supra). A expressão de RNA codificado pelo gene pesticida é, então, testada hibridando o filtro com uma sonda radioativa derivada de um gene pesticida por métodos conhecidos na técnica (Sambrook e Russell, (2001) s upra) .
[0287] Transferência Western, ensaios bioquímicos e semelhantes podem ser realizados nas plantas transgênicas para confirmar a presença de proteína codificada pelo gene pesticida por meio de procedimentos padrão (Sambrook e Russell, 2001, supra) com o uso de anticorpos que se ligam a um ou mais epítopos presentes no polipeptídeo PtIP-83.
Empilhamento de traços em planta transgênica [0288] As plantas transgênicas podem compreender um empilhamento de um ou mais polinucleotídeos inseticidas divulgados no presente documento com um ou mais polinucleotídeos adicionais que resultam na produção ou supressão de múltiplas sequências de polipeptideos. As plantas transgênicas que compreendem empilhamentos de sequências de polinucleotídeos podem ser obtidas por qualquer um ou ambos os métodos de reprodução tradicionais ou através de métodos de manipulação genética. Estes métodos incluem, mas sem limitação, cultivar linhas individuais, sendo que cada uma compreende um polinucleotídeo de interesse, transformar uma planta transgênica que compreende um gene divulgado no presente documento com um gene subsequente e cotransformar genes em uma célula de planta única. Conforme usado no presente documento, o termo empilhado inclui ter os múltiplos traços presentes na mesma planta (isto é, ambos os traços são incorporados no genoma nuclear, um traço é incorporado no genoma nuclear e um traço é incorporado no
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301/525 genoma de um plastideo ou ambos os traços são incorporados no genoma de um plastideo). Em um exemplo não limitante, traços empilhados compreendem um empilhamento molecular em que as sequências são fisicamente adjacentes entre si. Um traço, conforme usado no presente documento, se refere ao fenótipo derivado de uma sequência particular ou grupos de sequências. A cotransformação de genes pode ser executada com o uso de vetores de transformação únicos que compreendem múltiplos genes ou genes portados separadamente em múltiplos vetores. Se as sequências forem empilhadas transformando geneticamente as plantas, as sequências de polinucleotídeos de interesse podem ser combinadas em qualquer momento e em qualquer ordem. Os traços podem ser introduzidos simultaneamente em um protocolo de cotransformação com os polinucleotídeos de interesse fornecidos por qualquer combinação de cassetes de transformação. Por exemplo, se duas sequências serão introduzidas, as duas sequências podem ser contidas em cassetes de transformação separados (trans) ou contidas no mesmo cassete de transformação (cis) . A expressão das sequências pode ser acionada pelo mesmo promotor ou por promotores diferentes. Em certos casos, pode ser desejável introduzir um cassete de transformação que suprima a expressão do polinucleotídeo de interesse. Isso pode ser combinado com qualquer combinação de outros cassetes de supressão ou cassetes de superexpressão para gerar a combinação desejada de traços na planta. É adicionalmente reconhecido que as sequências de polinucleotídeo podem ser empilhadas em uma localização genômica desejada com o uso de um sistema de recombinação específica de sítio. Consultar, por exemplo, WO 1999/25821, WO 1999/25854, WO
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1999/25840, WO 1999/25855 e WO 1999/25853, todos os quais são incorporados ao presente documento a título de referência.
[0289] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos que codificam o polipeptideo PtIP-83 divulgados no presente documento, sozinhos ou empilhados com um ou mais traços de resistência a inseto adicionais podem ser empilhados com um ou mais traços de entrada adicionais (por exemplo, resistência a herbicida, resistência fúngica, resistência a vírus, tolerância à tensão, resistência a doenças, esterilidade do macho, força da haste e semelhantes) ou traços de saída (por exemplo, rendimento aumentado, amidos modificados, perfil de óleo melhorado, aminoácidos equilibrados, lisina ou metionina alta, digestibilidade aumentada, qualidade de fibra melhorada, resistência à seca e semelhantes). Portanto, as modalidades de polinucleotídeo podem ser usadas para fornecer um pacote agronômico completo de qualidade de cultura melhorada com a capacidade de controlar de modo flexível e rentável quaisquer pragas agronômicas.
[0290] Os transgenes úteis para empilhamento incluem, mas sem limitação:
1. Transgenes que Conferem Resistência a Insetos ou Doença e que Codificam:
[0291] (A) Genes de resistência a doença de plantas. As defesas de plantas são frequentemente ativadas por interação específica entre o produto de um gene de resistência a doenças (R) na planta e o produto de um gene de avirulência (Avr) correspondente no patógeno. Uma variedade de planta pode ser transformada com gene de resistência clonado para manipular
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303/525 plantas que são resistentes a cepas de patógenos específicos. Consultar, por exemplo, Jones, et al. , (1994) Science 266:789 (clonagem do gene Cf-9 de tomate para resistência a Cladosporium fulvum) ; Martin, et al., (1993) Science 262:1432 (gene Pto de tomate para resistência a Pseudomonas syringae pv. tomate codifica uma proteína cinase) ; Mindrinos, et al. , (1994) Cell 78:1089 (gene RSP2 de Arabidopsis para resistência a Pseudomonas syringae), McDowell e Woffenden, (2003) Trends Biotechnol. 21(4):178-83 e Toyoda, et al. , (2002) Transgenic Res. 11(6):56782. Uma planta resistente a uma doença é uma que é mais resistente a um patógeno em comparação com planta de tipo selvagem.
[0292] (B) Genes codificadores de uma proteína de Bacillus thuringiensis, um derivado da mesma ou um polipeptídeo sintético modelado na mesma. Consultar, por exemplo, Geiser, et al., (1986) Gene 48:109, que divulga a clonagem e sequência de nucleotídeos de um gene de delta-endotoxina Bt. Além disso, moléculas de DNA que codificam genes delta-endotoxina podem ser comprados à American Type Culture Collection (Rockville, Md.), por exemplo, com número de acesso ATCC® 40098, 67136, 31995 e 31998. Outros exemplos não limitantes de transgenes de Bacillus thuringiensis geneticamente modificados são dados nas patentes a seguir e nos pedidos de patente e são incorporados ao presente documento a título de referência com esse propósito: Patentes dos EUA N° 5,188,960; 5,689,052; 5,880,275; 5,986,177; 6, 023, 013, 6, 060,594, 6, 063,597, 6, 077,824, 6, 620, 988, 6, 642,030, 6, 713,259, 6, 893, 826, 7,105, 332; 7, 179, 965, 7,208,474; 7,227,056, 7,288,643, 7,323,556, 7,329,736, 7,449,552, 7,468,278, 7,510,878, 7,521,235, 7,544,862,
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7, 605, 304, 7, 696, 412, 7, 629, 504, 7,705, 216, 7,772,465,
7,790,846, 7,858,849 e WO 1991/14778; WO 1999/31248; WO 2001/12731; WO 1999/24581 e WO 1997/40162.
[0293] Genes que codificam proteínas pesticidas podem também ser empilhados, o que inclui, mas sem limitação: proteínas inseticidas de Pseudomonas sp. , tal como PSEEN3174 (Monalysin, (2011) PLoS Pathogens, 7:1-13), de cepas de Pseudomonas protegens CHAO e Pf-5 (anteriormente fluorescens) (Pechy-Tarr, (2008) Environmental Microbiology 10:2368-2386: Acesso do GenBank N° EU400157); de Pseudomonas Taiwanensis (Liu, et al., (2010) J. Agric. Food Chem. 58:12343-12349) e de Pseudomonas pseudoalcligenes (Zhang, et al., (2009) Annals of Microbiology 59:45-50 e Li, et al. , (2007) Plant Cell Tiss. Organ Cult. 89:159-168); proteínas inseticidas de Photorhabdus sp. e Xenorhabdus sp. (Hinchliffe, et al., (2010) The Open Toxinology Journal 3:101-118 e Morgan, et al., (2001) Applied and Envir. Micro. 67:2062-2069), Patente dos EUA N° 6,048,838 e Patente dos EUA N° 6,379,946; um polipeptídeo PIP-1 da Publicação de Patente dos EUA US20140007292 ; um polipeptídeo AfIP-lA e/ou AfIP-lB da Publicação de Patente dos EUA US20140033361; um polipeptídeo PHI-4 da Publicação de Patente dos EUA US20140274885 ou Publicação de Patente PCT W02014/150914; um polipeptídeo PIP-47 de Número de Série PCT PCT/US14/51063, um polipeptídeo PIP-72 de Número de Série PCT PCT/US14/55128, e δ-endotoxinas incluindo, porém, sem limitação, as classes Cryl, Cry2, Cry3, Cry4, Cry5, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, CrylO, Cryll, Cryl2, Cryl3, Cryl4, Cryl5, Cryl6, Cryl7, Cryl8, Cryl9, Cry20, Cry21, Cry22, Cry23, Cry24, Cry25, Cry26, Cry27, Cry 28, Cry 29, Cry 30, Cry31, Cry32, Cry33, Cry34, Cry35,Cry36, Cry37, Cry38, Cry39, Cry40, Cry41, Cry42,
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Cry43, Cry44, Cry45, Cry 46, Cry47, Cry49, Cry50, Cry51, Cry52,
Cry53, Cry 54, Cry55, Cry56, Cry57, Cry58, Cry59, Cry60, Cry61,
Cry62, Cry63, Cry64, Cry65, Cry66, Cry67, Cry68, Cry69, Cry70,
Cry71, e Cry 72 de genes de δ-endotoxina e os genes Cytl e Cyt2 citoliticos de B. thuríngíensís. Membros destas classes de proteínas inseticidas de B. thuríngíensís incluem, mas não estão limitados a CrylAal (Acesso # AAA22353); CrylAa2 (Acesso # Acesso
# AAA22552); CrylAaí 3 (Acesso # BAA00257) ; CrylAa4 (Acesso #
CAA31886) ; CrylAa5 (Acesso # BAA04468); CrylAa6 (Acesso #
AAA8 62 65) ; CrylAa7 (Acesso # AAD46139); CrylAa8 (Acesso #
126149); CrylAa9 (Acesso # BAA77213); CrylAalO (Acesso #
AAD55382) ; CrylAal1 (Acesso # CAA70856); CrylAal2 (Acesso #
AAP80146) ; CrylAal3 (Acesso # AAM44305); CrylAal4 (Acesso #
AAP40639) ; CrylAal5 (Acesso # AAY66993); CrylAal6 (Acesso #
HQ439776) ; CrylAal7 (Acesso # HQ439788); CrylAal8 (Acesso #
HQ439790) ; CrylAal9 (Acesso # HQ685121); CrylAa2 0 (Acesso #
JF340156) ; CrylAa21 (Acesso # JN 6514 9 6) ; CrylAa22 (Acesso #
KC158223) ; CrylAbl (Acesso # AAA22330); CrylAb2 (Acesso #
AAA22613) ; CrylAb3 (Acesso # AAA22561); CrylAb4 (Acesso #
BAA00071 ) ; CrylAb5 (Acesso f CAA28405) ; CrylAb6 (Acesso #
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AAA22551) ; CrylAb9 (Acesso # CAA3 8 7 01) ; CrylAblO (Acesso #
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AAC64003) ; CrylAbl3 (Acesso # AAN76494); CrylAbl4 (Acesso #
AAG16877) ; CrylAbl5 (Acesso # AAO13302); CrylAbl6 (Acesso #
AAK5554 6) ; CrylAbl7 (Acesso # AAT46415); CrylAbl8 (Acesso #
AAQ88259) ; CrylAbl9 (Acesso # AAW31761); CrylAb2 0 (Acesso #
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AAB93476) ; Cry20Bal (Acesso # ACS93601); Cry2 0Ba2 (Acesso #
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BAD00052) r Cry30Cal (Acesso # BAD67157); Cry30Ca2 (Acesso #
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BAE80088) r Cry30Eal (Acesso # ACC95445); Cry30Ea2 (Acesso #
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315/525
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AAK64561); Cry35Aa3 (Acesso # AAT29028); Cry35Aa4 (Acesso #
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AAK64563); Cry35Ab3 (Acesso # AY536891); Cry35Acl (Acesso #
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316/525
AAG50117); Cry35Bal (Acesso # AAK64566); Cry35Ba2 (Acesso#
AAT29027); Cry35Ba3 (Acesso # AAT29026); Cry36Aal (Acesso#
AAK64558); Cry37Aal (Acesso # AAF76376 ); Cry38Aal (Acesso # AAK64559); Cry39Aal (Acesso # BAB72016); Cry40Aal (Acesso#
BAB72018); Cry40Bal (Acesso # BAC77648); Cry40Cal (Acesso#
EU381045); Cry40Dal (Acesso # ACF15199); Cry41Aal (Acesso#
BAD35157); Cry41Abl (Acesso # BAD35163); Cry41Bal (Acesso#
HM461871); Cry41Ba2 (Acesso # ZP_04099652) ; Cry42Aal (Acesso # BAD35166); Cry43Aal (Acesso # BAD15301); Cry43Aa2 (Acesso#
BAD95474 ); Cry43Bal (Acesso # BAD15303); Cry43Cal (Acesso # KC156676); Cry43Cbl (Acesso # KC156695); Cry43Ccl (Acesso#
KC156696); semelhante a Cry43 (Acesso # BAD15305); Cry44Aa (Acesso # BAD08532); Cry45Aa (Acesso # BAD22577); Cry46Aa (Acesso # BAC79010); Cry46Aa2 (Acesso # BAG68906); Cry46Ab (Acesso # BAD35170); Cry47Aa (Acesso # AAY24695); Cry48Aa (Acesso # CAJ18351); Cry48Aa2 (Acesso # CAJ86545); Cry48Aa3 (Acesso # CAJ86546 ); Cry48Ab (Acesso # CAJ86548); Cry48Ab2 (Acesso # CAJ86549); Cry49Aa (Acesso # CAH56541); Cry49Aa2 (Acesso # CAJ86541); Cry49Aa3 (Acesso # CAJ86543); Cry49Aa4 (Acesso # CAJ86544); Cry49Abl (Acesso # CAJ86542); Cry50Aal (Acesso # BAE86999); Cry50Bal (Acesso # GU446675); Cry50Ba2 (Acesso # GU446676); Cry51Aal (Acesso # ABI14444); Cry51Aa2 (Acesso # GU570697); Cry52Aal (Acesso # EF613489); Cry52Bal (Acesso # FJ361760); Cry53Aal (Acesso # EF633476); Cry53Abl (Acesso # FJ361759) ; Cry54Aal (Acesso # ACA52194); Cry54Aa2 (Acesso # GQ140349); Cry54Bal (Acesso # GU446677); Cry55Aal (Acesso # ABW88932); Cry54Abl (Acesso # JQ916908); Cry55Aa2 (Acesso # AAE33526); Cry56Aal (Acesso # ACU57499); Cry56Aa2 (Acesso # GQ483512); Cry56Aa3 (Acesso # JX025567); Cry57Aal
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 320/553
317/525
(Acesso # ANC87261); Cry58Aal (Acesso # ANC87260); Cry59Bal
(Acesso # JN790647); Cry59Aal (Acesso # ACR43758); Cry60Aal
(Acesso # ACU24782); Cry60Aa2 (Acesso # EAO57254); Cry60Aa3
(Acesso # EEM99278); Cry60Bal (Acesso # GU810818); Cry60Ba2
(Acesso # EAO572 53) ; Cry60Ba3 (Acesso # EEM99279); Cry61Aal
(Acesso # HM035087); Cry61Aa2 (Acesso # HM132125); Cry61Aa3
(Acesso # EEM19308); Cry62Aal (Acesso # HM054509); Cry63Aal
(Acesso # BAI44028); Cry64Aal (Acesso # BAJ05397); Cry65Aal
(Acesso # HM461868); Cry65Aa2 (Acesso # ZP _04123838); Cry66Aal
(Acesso # HM485581); Cry66Aa2 (Acesso # ZP _04099945); Cry67Aal
(Acesso # HM485582); Cry67Aa2 (Acesso # ZP -04148882); Cry68Aal
(Acesso # HQ113114) ; Cry69Aal (Acesso # HQ401006); Cry69Aa2
(Acesso # JQ821388) ; Cry69Abl (Acesso # JN209957); Cry7 OAal
(Acesso # JN646781); Cry7 OBal (Acesso # AD051070); Cry7 OBbl
(Acesso # EEL67276); Cry7lAal (Acesso # JX025568); Cry72Aal
(Acesso # JX025569).
[0294] Exemplos de δ-endotoxinas também incluem, porém, sem limitação, proteínas CrylA das Patentes dos EUA Número 5,880,275 e 7,858,849; uma toxina DIG-3 ou DIG-11 (deleção Nterminal de variantes de α-hélice 1 e/ou a-hélice 2 de proteínas Cry, tais como CrylA) das Patentes dos EUA Números 8,304,604 e 8,304,605, CrylB do Pedido de Patente dos EUA Número de Série 10/525,318; CrylC da Patente dos EUA N° 6,033,874; CrylF das Patentes dos EUA Números 5,188,960, 6,218,188; quimeras CrylA/F das Patentes dos EUA Números 7,070,982; 6,962,705 e 6,713,063; uma proteína Cry2, tal como a proteína Cry2Ab da Patente dos EUA Número 7,064,249; uma proteína Cry3A, incluindo, porém, sem limitação, uma proteína inseticida híbrida modificada (eHIP) criada por fusão de combinações únicas de regiões variáveis e
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318/525 blocos conservados de pelo menos duas proteínas Cry diferentes (Publicação de Pedido de Patente dos EUA Número 2010/0017914); uma proteína Cry4; uma proteína Cry5; uma proteína Cry6; proteínas Cry8 das Patentes dos EUA Números 7,329,736, 7,449,552, 7,803,943, 7,476,781, 7,105,332, 7,378,499 e 7,462,760; uma proteína Cry9 tal como os membros das famílias Cry9A, Cry9B, Cry9C, Cry9D, Cry9E e Cry9F; uma proteína Cryl5 de Naimov, et al. , (2008) Applied and Environmental Microbiology 74:7145-7151; uma Cry22, uma proteína Cry34Abl das Patentes dos EUA Números 6,127,180, 6,624,145 e 6,340,593; uma proteína CryET33 e CryET34 das Patentes dos EUA Números 6,248,535, 6, 326, 351, 6, 399, 330, 6, 949, 626, 7,385, 107 e 7,504,229; um homólogo CryET33 e CryET34 da Publicação de Patente dos EUA Número 2006/0191034, 2012/0278954 e Publicação PCT Número WO 2012/139004; uma proteína Cry35Abl das Patentes dos EUA Números 6,083,499, 6,548,291 e 6,340,593; uma proteína Cry46, uma proteína Cry 51, uma toxina binária Cry; uma TIC901 ou toxina relacionada; TIC807 de US 2008/0295207; ET29, ET37, TIC809, TIC810, TIC812, TIC127, TIC128 de PCT US 2006/033867; AXMI-027, AXMI-036 e AXMI-038 da Patente dos EUA Número 8,236,757; AXMI031, AXMI-039, AXMI-040, AXMI-049 de US7,923,602; AXMI-018, AXMI-020 e AXMI-021 de WO 2006/083891; AXMI-010 de WO 2005/038032; AXMI-003 de WO 2005/021585; AXMI-008 de US 2004/0250311; AXMI-006 de US 2004/0216186; AXMI-007 de US 2004/0210965; AXMI-009 de US 2004/0210964; AXMI-014 de US 2004/0197917; AXMI-004 de US 2004/0197916; AXMI-028 e AXMI-029 de WO 2006/119457; AXMI-007, AXMI-008, AXMI-008 Orf2 , AXMI-009, AXMI-014 e AXMI-004 de WO 2004/074462; AXMI-150 da Patente dos EUA US 8,084,416; AXMI-205 de US20110023184; AXMI-011, AXMI-012,
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319/525
AXMI-013, AXMI-015, AXMI-019, AXMI-044, AXMI-037, AXMI-043,
AXMI-033, AXMI-034, AXMI-022, AXMI-023, AXMI-041, AXMI-063 e AXMI-064 de US 2011/0263488; AXMI-R1 e proteínas relacionadas de US 2010/0197592; AXMI221Z, AXMI222z, AXMI223z, AXMI224z e AXMI225z de WO 2011/103248; AXMI218, AXMI219, AXMI220, AXMI226, AXMI227, AXMI228, AXMI229, AXMI230 e AXMI231 de WO11/103247;
AXMI-115, AXMI-113, AXMI-005, AXMI-163 e AXMI-184 da Patente dos EUA Número 8,334,431; AXMI-001, AXMI-002, AXMI-030, AXMI-035, e
AXMI-045 de US 2010/0298211; AXMI-066 e AXMI-076 de
US20090144852; AXMI128, AXMI130, AXMI131, AXMI133, AXMI140,
AXMI141, AXMI142, AXMI143, AXMI144, AXMI146, AXMI148, AXMI149,
AXMI152, AXMI153, AXMI154, AXMI155, AXMI156, AXMI157, AXMI158,
AXMI162, AXMI165, AXMI166, AXMI167, AXMI168, AXMI169, AXMI170,
AXMI171, AXMI172, AXMI173, AXMI174, AXMI175, AXMI176, AXMI177,
AXMI178, AXMI179, AXMI180, AXMI181, AXMI182, AXMI185, AXMI186,
AXMI187, AXMI188, AXMI189 da Patente dos EUA Número 8, .318,900;
AXMI079, AXMI080, AXMI081, AXMI082, AXMI091, AXMI092, AXMI096,
AXMI097, AXMI098, AXMI099, AXMI100, AXMI101, AXMI102, AXMI103,
AXMI104, AXMI107, AXMI108, AXMI109, AXMI110, AXMI111, AXMI112,
AXMI114, AXMI116, AXMI117, AXMI118, AXMI119, AXMI120, AXMI121,
AXMI122, AXMI123, AXMI124, AXMI1257, AXMI1268, AXMI127, AXMI129,
AXMI164, AXMI151, AXMI161, AXMI183, AXMI132, AXMI138, AXMI137 de
US 2010/0005543; e proteínas Cry, tais como CrylA e Cry3A, que têm sítios proteolíticos modificados da Patente dos EUA Número 8,319,019; e uma proteína de toxina CrylAc, Cry2Aa e CrylCa de Bacillus thuringiensis cepa VBTS 2528 da Publicação do Pedido de Patente dos EUA Número 2011/0064710. Outras proteínas Cry são bem conhecidas por uma pessoa versada na técnica (consultar Crickmore, et al. , Bacillus thuringiensis toxin nomenclature
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320/525 (2011), em lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/ que pode ser acessado pela rede mundial de computadores com o uso do prefixo www). A atividade inseticida de proteínas Cry é bem conhecida por um indivíduo versado na técnica (para revisão, consultar van Frannkenhuyzen, (2009) J. Invert. Path. 101: 116). 0 uso de proteínas Cry como traços de planta transgênica é bem conhecido por um indivíduo versado na técnica e plantas transgênicas Cry incluindo, mas sem limitação, CrylAc, CrylAc+Cry2Ab, CrylAb, CrylA.105, CrylF, CrylFa2, CrylF+CrylAc, Cry2Ab, Cry3A, mCry3A, Cry3Bbl, Cry34Abl, Cry35Abl, Vip3A, mCry3A, Cry9c e CBI-Bt receberam a aprovação regulatória (consultar Sanahuja, (2011) Plant Biotech Journal 9:283-300 e CERA (2010) GM Crop Database Center for Environmental Risk Assessment (CERA), ILSI Research Foundation, Washington D.C. em cera-gmc.org/index.php?action=gm_crop_database, que pode ser acessado pela rede mundial de computadores com o uso do prefixo www) . Mais de uma proteína pesticida bem conhecida por um indivíduo versado na técnica também pode ser expressa em plantas como Vip3Ab e CrylFa (US2012/0317682), CrylBE e CrylF (US2012/0311746), CrylCA e CrylAB (US2012/0311745), CrylF e CryCa (US2012/0317681) , CrylDA e CrylBE (US2012/0331590) , CrylDA e CrylFa (US2012/0331589), CrylAB e CrylBE (US2012/0324606) e CrylFa e Cry2Aa, Cryll ou CrylE (US2012/0324605) . As proteínas pesticidas também incluem lipases inseticidas incluindo lipídio acil hidrolases da Patente dos EUA N° 7,491,869, e colesterol oxidases, tais como de Streptomyces (Purcell et al. (1993) Biochem Biophys Res Commun 15:140 6-1413) . As proteínas pesticidas também incluem toxinas de VIP (proteínas inseticidas vegetativas) das Patentes dos EUA N°s 5,877,012, 6,107,279,
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6,137,033, 7,244,820, 7,615,686 e 8,237,020 e semelhantes. Outras proteínas VIP são bem conhecidas de um indivíduo versado na técnica (consultar lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html que pode ser acessado pela rede mundial de computadores com o uso do prefixo www). As proteínas pesticidas também incluem proteínas de complexo de toxina (TC) , obteníveis de organismos tais como Xenorhabdus, Photorhabdus e Paeníbacíllus (consultar as Patentes dos EUA N°s 7,491, 698 e 8, 084,418) . Algumas proteínas TC têm atividade inseticida autônoma e outras proteínas TC melhoram a atividade das toxinas autônomas produzidas pelo mesmo dado organismo. A toxicidade de uma proteína TC autônoma (de Photorhabdus, Xenorhabdus ou Paeníbacíllus, por exemplo) pode ser melhorada por um ou mais potenciadores de proteína TC derivados de um organismo-fonte de um gênero diferente. Há três tipos principais de proteínas TC. Conforme mencionado no presente documento, as proteínas de Classe A (Proteína A) são toxinas independentes. As proteínas de Classe B (Proteína B) e as proteínas de Classe C (Proteína C) aumentam a toxicidade das proteínas de Classe A. Os exemplos de proteínas de Classe A são TcbA, TcdA, XptAl e XptA2. Os exemplos de proteínas de Classe B são TcaC, TcdB, XptBlXb e XptCIWi. Os exemplos de proteínas de Classe C são TccC, XptClXb e XptBIWi. As proteínas pesticidas também incluem proteínas de veneno de aranha, cobra e escorpião. Exemplos de peptídeos de veneno de aranha incluem, mas sem limitação, peptídeos de licotoxina-1 e mutantes dos mesmos (Patente dos EUA N° 8,334,366) .
[0295] (C) um polinucleotídeo que codifica um hormônio ou feromônio específico para inseto, tal como um ecdisteroide e
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322/525 hormônio juvenil, uma variante do mesmo, um mimético à base do mesmo ou um antagonista ou agonista do mesmo. Consultar, por exemplo, a divulgação por Hammock, et al. , (1990) Nature 344:458, de expressão em baculovírus de hormônio juvenil esterase clonado, um inativador de hormônio juvenil.
[0296] (D) Um polinucleotideo codificador de um peptídeo específico para inseto que, mediante expressão, perturba a fisiologia da praga afetada. Por exemplo, consultar as divulgações de Regan, (1994) J. Biol. Chem. 269:9 (clonagem de expressão rende DNA que codifica receptor de hormônio diurético de inseto); Pratt, et al. , (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 163:1243 (uma alostatina é identificada em Diploptera puntata) ; Chattopadhyay, et al. , (2004) Critical Reviews in Microbiology 30(1) :33-54; Zj awiony, (2 004) J Nat Prod 67 (2) :300310; Carlini e Grossi-de-Sa, (2002) Toxicon 40 (11) :1515-1539; Ussuf, et al., (2001) Curr Sci. 80(7) :847-853 e Vasconcelos e Oliveira, (2004) Toxicon 44(4):385-403. Ver também, Patente dos EUA N° 5,266,317 atribuída a Tomalski, et al., que divulga genes codificando toxinas específicas para insetos.
[0297] (E) Um polinucleotideo que codifica uma enzima responsável por um hiperacúmulo de um monoterpeno, um sesquiterpene, um esteroide, ácido hidroxâmico, um derivado fenilpropanoide ou outra molécula não proteica com atividade inseticida .
[0298] (F) Um polinucleotideo que codifica uma enzima envolvida na modificação, incluindo a modificação pós-tradução, de uma molécula biologicamente ativa; por exemplo, uma enzima glicolítica, uma enzima proteolítica, uma enzima lipolítica, uma nuclease, uma ciclase, uma transaminase, uma esterase, uma
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323/525 hidrolase, uma fosfatase, uma cinase, uma fosforilase, um polimerase, uma elastase, uma quitinase e uma glucanase, seja natural ou sintética. Consultar o Pedido PCT WO 1993/02197 no nome de Scott, et al., o qual revela a sequência de nucleotídeos de um gene de calase. As moléculas de DNA que contêm as sequências codificadoras de quitinase podem ser obtidas, por exemplo, de ATCC® sob os Números de Acesso 39637 e 67152. Também consultar Kramer, et al. , (1993) Insect Biochem. Molec. Biol. 23:691, que ensina a sequência de nucleotídeos de um cDNA codificador de quitinase de ancilóstomo de tabaco e Kawalleck, et al., (1993) Plant Molec. Biol. 21:673, que fornece a sequência de nucleotídeos do gene de poliubiquitina ubi4-2 de salsa, e as Patentes dos EUA N°s 6,563,020; 7,145,060 e 7,087,810.
[0299] (G) Um polinucleotideo codificador de uma molécula que estimula a transdução de sinal. Por exemplo, consultar a divulgação por Botella, et al., (1994) Plant Molec. Biol. 24:757 de sequências de nucleotídeos para clones de cDNA de calmodulina de feijão-mungo, e Griess, et al., (1994) Plant Physiol. 104:1467, que fornece a sequência de nucleotídeos de um clone de cDNA de calmodulina de mais.
[0300] (H) Um polinucleotideo codificador de um peptídeo de momento hidrofóbico. Consultar o Pedido PCT WO 1995/16776 e a divulgação da Patente dos EUA N° 5, 580, 852 de derivados de peptídeos de Taquiplesina que inibem patógenos de planta fúngicos, e o Pedido PCT WO 1995/18855 e a Patente dos EUA N° 5,607,914 (ensina peptídeos antimicrobianos sintéticos que conferem resistência a doenças).
[0301] (I) Um polinucleotideo codificador de uma permease de membrana, um formador de canal ou um bloqueador de
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324/525 canal. Por exemplo, consultar a divulgação por Jaynes, et al., (1993) Plant Sci. 89:43, de expressão heteróloga de um análogo de peptídeo lítico de cecropina-beta para tornar plantas de tabaco transgênicas resistentes a Pseudomonas solanacearum.
[0302] (J) Um gene codificador de uma proteína invasiva de modo viral ou uma toxina complexa derivada da mesma. Por exemplo, o acúmulo de proteínas de revestimento viral em células de plantas transformadas confere resistência à infecção viral e/ou desenvolvimento de doença efetuado pelo vírus do gual o gene de proteína de revestimento é derivado, assim como por vírus relacionados. Ver, Beachy, et al., (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28:451. A resistência mediada por proteínas de revestimento foi conferida mediante plantas transformadas contra vírus do mosaico da alfafa, vírus do mosaico do pepino, vírus da risca de tabaco, vírus X da batata, vírus Y da batata, vírus etch do tabaco, vírus rattle do tabaco e vírus do mosaico do tabaco. Id.
[0303] (K) Um gene gue codifica um anticorpo específico de inseto ou uma imunotoxina derivada do mesmo. Assim, um anticorpo direcionado para uma função metabólica crítica nos intestinos do inseto pode inativar uma enzima afetada, exterminando o inseto. Cf. Taylor, et al., Resumo n° 497, SEVENTH INT'L SYMPOSIUM ON MOLECULAR PLANT-MICROBE INTERACTIONS (Edimburgo, Escócia, 1994) (inativação enzimática em tabaco transgênico por meio de produção de fragmentos de anticorpos de cadeia única).
[0304] (L) Um gene codificador de um anticorpo específico para vírus. Consultar, por exemplo, Tavladoraki, et al. , (1993) Nature 366:469, gue mostra gue as plantas
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325/525 transgênicas que expressam genes de anticorpo recombinante são protegidas do ataque de vírus.
[0305] (M) Um polinucleotideo codificador de uma proteína de retenção de desenvolvimento produzida na natureza por um patógeno ou um parasita. Desse modo, endo alfa-l,4-Dpoligalacturonases fúngicas facilitam a colonização fúngica e a liberação de nutrientes de plantas solubilizando a homo-alfa1,4-D-galacturonase de parede de célula de planta. Consultar, Lamb, et al. , (1992) Bio/Technology 10:1436. A clonagem e caracterização de um gene que codifica uma proteína de inibição de endopoligalacturonase de feijão são descritas por Toubart, et al., (1992) Plant J. 2:367.
[0306] (N) Um polinucleotideo codificador de uma proteína de retenção de desenvolvimento produzida na natureza por uma planta. Por exemplo, Logemann, et al. , (1992) Bio/Technology 10:305 mostrou que plantas transgênicas que expressam o gene de desativação de ribossomo de cevada têm uma resistência aumentada à doença fúngica.
[0307] (O) Genes envolvidos na Resposta de Resistência Adquirida Sistêmica (SAR) e/ou os genes relacionados com a patogênese. Briggs, (1995) Current Biology 5(2), Pieterse e Van Loon, (2004) Curr. Opin. Plant Bio. 7(4):456-64 e Somssich, (2003) Cell 113 (7) :815-6.
[0308] (P) Genes antifúngicos (Cornelissen e Melchers, (1993) Pl. Physiol. 101:709-712 e Parijs, et al., (1991) Planta 183:258-264 e Bushnell, et al., (1998) Can. J. of Plant Path. 20(2):137-149. Também consultar os Pedidos de Patente dos EUA N° 09/950,933; 11/619,645; 11/657,710; 11/748,994; 11/774,121 e
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Patentes dos EUA N° 6,891,085 e 7,306,946. As cinases semelhantes a receptor LysM para a percepção de fragmentos de quitina como uma primeira etapa na resposta de defesa de planta contra patógenos fúngicos (US 2012/0110696) .
[0309] (Q) Genes de desintoxicação, como para fumonisina, beauvericina, moniliformina e zearalenona e seus derivados estruturalmente relacionados. Por exemplo consultar, as Patentes dos EUA N° 5,716,820; 5,792,931; 5,798,255; 5,846,812; 6,083,736; 6,538,177; 6,388,171 e 6,812,380.
[0310] (R) Um polinucleotídeo codificador de uma Cistatina e inibidores de cisteína proteinase. Consultar a Patente dos EUA N° 7,205,453.
[0311] (S) Genes de defensina. Consultar WO 2003/000863 e as Patentes dos EUA N° 6,911,577; 6,855,865; 6,777,592 e 7,238,781.
[0312] (T) Genes que conferem resistência a nematódeos. Consultar, por exemplo, o Pedido PCT WO 1996/30517; Pedido PCT WO 1993/19181, WO 2003/033651 e Urwin, et al., (1998) Planta 204:472-479, Williamson, (1999) Curr Opin Plant Bio. 2(4):32731; Patentes dos EUA N° 6,284,948 e 7,301,069 e genes miR164 (WO 2012/058266).
[0313] (U) Genes que conferem resistência à Podridão de Raízes de Phytophthora, como os genes Rps 1, Rps 1-a, Rps 1-b, Rps 1-c, Rps 1-d, Rps 1-e, Rps 1-k, Rps 2, Rps 3-a, Rps 3-b, Rps 3-c, Rps 4, Rps 5, Rps 6, Rps 7 e outros genes Rps. Consultar, por exemplo, Shoemaker, et al. , Phytophthora Root Rot Resistance Gene Mapping in Soybean, Plant Genome IV Conference, San Diego, Califórnia (1995) .
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327/525 [0314] (V) Genes que conferem resistência a Podridão do Caule Marrom, conforme descrito na Patente dos EUA N 5,689,035 e incorporada a título de referência para este propósito.
[0315] (W) Genes que conferem resistência a Colletotrichum, conforme descrito na Publicação de Pedido de Patente dos EUA N° US 2009/0035765 e incorporada a título de referência para este propósito. Isso inclui o lócus Rcg que pode ser utilizado com uma conversão de lócus único.
2. Transgenes que Conferem Resistência a um Herbicida, por Exemplo:
[0316] (A) Um polinucleotideo codificador de resistência a um herbicida que inibe o ponto de crescimento ou meristema, como uma imidazolinona ou uma sulfonilureia. Os genes exemplificativos nessa categoria codificam a enzima ALS e AHAS mutante conforme descrito, por exemplo, por Lee, et al. , (1988) EMBO J. 7:1241 e Miki, et al. , (1990) Theor. Appl. Genet. 80:449, respectivamente. Também consultar as Patentes dos EUA N° 5,605,011; 5,013,659; 5,141,870; 5,767,361; 5,731,180; 5,304,732; 4,761,373; 5,331,107; 5,928,937 e 5,378,824; Pedido de Patente dos EUA N° 11/683,737 e Publicação Internacional n° WO 1996/33270.
[0317] (B) Um polinucleotideo codificador de uma proteína para resistência ao Glifosato (resistência conferida por genes de 5-enolpiruvil-3-fosfiquimato sintase (EPSP) e aroA mutantes, respectivamente) e outros compostos fosfônicos, como glufosinato (genes de fosfinotricina-acetil-transferase (PAT) e fosfinotricina-acetil-transferase (bar) de Streptomyces hygroscopicus), e ácidos piridinoxi- ou fenoxipropiônicos e
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328/525 ciclo-hexonas (genes codificadores de inibidor de ACCase). Consultar, por exemplo, a Patente dos EUA N° 4,940,835 atribuída a Shah, et al., a qual revela a sequência de nucleotídeos de uma forma de EPSPS que pode conferir resistência ao glifosato. A Patente dos EUA 5,627,061 de Barry, et al., também descreve os genes codificadores de enzimas EPSPS. Também consultar as Patentes dos EUA N° 6,566,587; 6,338,961; 6,248,876 Bl; 6,040,497; 5,804,425; 5,633,435; 5,145,783; 4,971,908; 5,312,910; 5, 188, 642; 5, 094,945, 4,940, 835; 5, 866, 775; 6, 225, 114 Bl; 6,130,366; 5,310,667; 4,535,060; 4,769,061; 5,633,448; 5,510,471; documento Re. 36,449; RE 37,287 E e 5,491,288 e Publicações Internacionais EP 1173580; WO 2001/66704; EP 1173581 e EP 1173582, que são incorporadas no presente documento a título de referência com esse propósito. A resistência a glifosato também é conferida a plantas que expressam um gene codificante de uma enzima glifosato oxidorredutase, conforme descrito mais completamente nas Patentes dos EUA N° 5,776,760 e 5,463,175, que são incorporadas ao presente documento a título de referência com esse propósito. Além disso, a resistência a glifosato pode ser conferida a plantas pela superexpressão de genes codificadores de glifosato N-acetiltransferase. Consultar, por exemplo, as Patentes dos EUA N° 7,462,481; 7,405,074 e a Publicação de Pedido de Patente dos EUA N° 2008/0234130. Uma molécula de DNA codificante de um gene aroA mutante pode ser obtida sob o Número de Acesso ATCC® 39256 e a sequência de nucleotídeos do gene mutante é divulgada na Patente dos EUA N° 4,769,061 de Cornai. O Pedido EP N° 0 333 033 de Kumada, et al., e a Patente dos EUA N° 4,975, 374 de Goodman, et al. , revelam sequências de nucleotídeo de genes de glutamina sintetase que
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329/525 conferem resistência a herbicidas, como L-fosfinotricina. A sequência de nucleotídeos de um gene de fosfinotricina-acetiltransferase é fornecida nos Pedidos EP N° 0 242 246 e 0 242 236 de Leemans, et al. ; De Greef, et al. , (1989) Bio/Technology 7 : 61, descrevem a produção de plantas transgênicas que expressa os genes bar quiméricos que codificam a atividade de fosfinotricina-acetil-transferase. Também consultar as Patentesdos EUA N° 5,969,213; 5,489,520; 5,550,318; 5,874,265; 5, 919, 675; 5, 561,236; 5, 648,477; 5, 646, 024; 6,177,616 BI e 5,879,903, que são incorporadas ao presente documento a título de referência com esse propósito. Os genes exemplificativos que conferem resistência a ácidos fenóxi propiônicos e ciclohexonas, como setoxidim e haloxifope, são os genes Accl-Sl, AcclS2 e Accl-S3 descritos por Marshall, et al., (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435.
[0318] (C) Um polinucleotideo codificador de uma proteína para resistência a herbicida que inibe a fotossíntese, como uma triazina (psbA e gs + genes) e uma benzonitrila (gene nitrilase) . Przibilla, et al., (1991) Plant Cell 3:169 descreve a transformação de Chlamydomonas com plasmídeos codificadores de genes psbA mutantes. As sequências de nucleotídeos para genes de nitrilase são divulgadas na Patente dos EUA N° 4,810,648 de Stalker e moléculas de DNA que contêm esses genes estão disponíveis sob os Números de Acesso ATCC® 53435, 67441 e 67442. A clonagem e a expressão de DNA que codifica uma glutationa-Stransferase são descritas por Hayes, et al., (1992) Biochem. J. 285:173.
[0319] (D) Um polinucleotideo codificador de uma proteína para resistência a aceto-hidroxiácido sintase, que foi
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330/525 constatada por tornar plantas que expressam essa enzima resistentes a múltiplos tipos de herbicidas, foi introduzido em uma variedade de plantas (consultar, por exemplo, Hattori, et al. , (1995) Mol Gen Genet. 246:419) . Outros genes que conferem resistência a herbicidas incluem: um gene codificador de uma proteína quimérica de citocromo de rato P4507A1 e oxidorredutase P450 de citocromo de NADPH de levedura (Shiota, et al. , (1994) Plant Physiol 106:17), genes para glutationa redutase e superóxido dismutase (Aono, et al. , (1995) Plant Cell Physiol 36:1.687) e genes para várias fosfotransferases (Datta, et al., (1992) Plant Mol Biol 20:619) .
[0320] (E) Um polinucleotídeo codificador de resistência a uma protoporfirinogênio oxidase (protox) de direcionamento de herbicida que é necessário para a produção de clorofila. A enzima protox serve como o direcionamento para uma variedade de compostos herbicidas. Esses herbicidas também inibem o crescimento de todas as espécies diferentes de plantas presentes, causando sua destruição total. O desenvolvimento de plantas que contêm atividade de protox alterada que são resistentes a esses herbicidas é descrito nas Patentes dos EUA N° 6,288,306 Bl; 6,282,837 BI e 5,767,373 e na Publicação Internacional WO 2001/12825.
[0321] (F) O gene aad-1 (originalmente de Sphingobium herbicidovorans) codifica a proteína arilalcoxialcanoato desoxigenase (AAD-1). O traço confere tolerância aos herbicidas ácido 2,4-diclorofenoxiacético e ariloxifenoxipropionato (comumente chamados de herbicidas fope, como quizalofope). O gene aad-1, em si, para tolerância a herbicida em plantas foi primeiramente divulgado em WO 2005/107437 (também consultar US
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2009/0093366). O gene aad-12, derivado de Delftia acidovorans, que codifica a proteína ariloxialcanoato dioxigenase (AAD-12) que confere tolerância a ácido 2,4-diclorofenoxiacético e herbicidas de piridiloxiacetato desativando diversos herbicidas com uma porção química de ariloxialcanoato, incluindo fenoxiauxina (por exemplo, 2,4-D, MCPA), assim como piridiloxiauxinas (por exemplo, fluroxipir, triclopir).
[0322] (G) Um polinucleotídeo codificador de uma dicamba mono-oxigenase resistente a herbicidas divulgado na Publicação de Pedido de Patente dos EUA N° 2003/0135879 para conferir tolerância a dicamba;
[0323] (H) Uma molécula de polinucleotídeo codificadora de bromoxinil nitrilase (Bxn) divulgada na Patente dos EUA N° 4,810,648 para conferir tolerância a bromoxinil;
[0324] (I) Uma molécula de polinucleotídeo codificadora de fitoeno (crtl) descrita em Misawa, et al., (1993) Plant J. 4:833-840 e em Misawa, et al., (1994) Plant J. 6:481-489 para tolerância a norflurazon.
3. Transgenes que Conferem ou Contribuem para uma Característica de Grão Alterado [0325] Como:
(A) Ácidos graxos alterados, por exemplo, por [0326] (1) Regulação descendente de esteraroil-ACP para aumentar o teor de ácido esteárico da planta. Consultar, Knultzon, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:2624 e WO 1999/64579 (Genes to Alter Lipid Profiles in Corn).
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332/525 [0327] (2) Elevação do ácido oleico por meio de modificação do gene de FAD-2 e/ou diminuição de ácido linolênico por meio de modificação do gene de FAD-3 (consultar as Patentes dos EUA N°s 6, 063, 947; 6, 323,392; 6, 372,965 e WO 1993/11245) .
[0328] (3) Alteração do teor de ácido linonênico ou linoleico conjugado, como em WO 2001/12800.
[0329] (4) Alteração de LEC1, AGP, Dekl, Superall, mil ps, vários genes Ipa, como Ipal, Ipa3, hpt ou hggt. Por exemplo, consultar WO 2002/42424, WO 1998/22604, WO 2003/011015, WO 2002/057439, WO 2003/011015, as Patentes dos EUA N°s 6,423,886, 6,197,561, 6,825,397 e as Publicações de Pedido de Patente dos EUA N°s 2003/0079247, US 2003/0204870 e Rivera-Madrid, et al. , (1995) Proc. Natl. Acad. Sei. 92:5620-5624.
[0330] (5) Genes codificadores de delta-8 dessaturase para produzir ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa (Patentes dos EUA N°s 8,058,571 e 8,338,152), delta-9 dessaturase para reduzir gorduras saturadas (Patente dos EUA N°s 8,063,269), Primula A6-dessaturase para intensificar os perfis de ácido graxo ômega-3.
[0331] (6) Ácidos nucleicos e proteínas isolados associados à regulação do metabolismo de lipídeos e açúcares, em particular, proteína de metabolismo de lipídeo (LMP) usada em métodos para produzir plantas transgênicas e modulação de níveis de compostos de armazenamento de sementes incluindo lipídeos, ácidos graxos, amidos ou proteínas de armazenamento de sementes e uso em métodos para modular o tamanho de sementes, número de sementes, pesos de sementes, comprimento de raízes e tamanho de folhas de plantas (EP 2404499) .
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333/525 [0332] (7) Alteração da expressão de uma proteína de Expressão de Alto Nível Induzível por Açúcar 2 (HSI2) na planta para aumentar ou diminuir a expressão de HSI2 na planta. Aumentar a expressão de HSI2 aumenta o teor de óleo enquanto a diminuição da expressão de HSI2 diminui a sensibilidade ao ácido abscísico e/ou aumenta a resistência à seca (Publicação de Pedido de Patente dos EUA N° 2012/0066794).
[0333] (8) Expressão de citocromo b5 (Cb5) isoladamente ou com FAD2 para modular o teor de óleo de sementes de planta, particularmente para aumentar os níveis de ácidos graxos ômega3 e intensificar a razão entre ácidos graxos ômega-6 e ômega-3 (Publicação de Pedido de Patente dos EUA N° 2011/0191904).
[0334] (9) As moléculas de ácido nucleico codificadoras de polipeptídeos semelhantes a wrinkledl para modular o metabolismo de açúcares (Patente dos EUA N° 8,217,223).
[0335] (B) Teor de fósforo alterado, por exemplo, por [0336] (1) Introdução de um gene de codificação de fitase que potenciará o rompimento de fitato, adicionando mais fosfato livre à planta transformada. Por exemplo, consultar, Van Hartingsveldt, et al., (1993) Gene 127:87, para uma divulgação da sequência de nucleotídeos de um gene de fitase de Aspergillus niger.
[0337] (2) Modulação de um gene que reduz o teor de fitato. Em mais, isso, por exemplo, pode ser alcançado por clonagem e, então, reintrodução de DNA associado a um ou mais dos alelos, como os alelos de LPA, identificados em mutantes de mais distinguidos por níveis baixos de ácido fítico, como em WO 2005/113778 e/ou alterando a atividade de inositol cinase como
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334/525 em WO 2002/059324, Publicação de Pedido de Patente dos EUA N° 2003/0009011, WO 2003/027243, Publicação de Pedido de Patente dos EUA N° 2003/0079247, WO 1999/05298, Patente dos EUA N° 6,197,561, Patente dos EUA N° 6,291,224, Patente dos EUA N° 6,391,348, WO 2002/059324, Publicação de Pedido de Patente dos EUA N° 2003/0079247, WO 1998/45448, WO 1999/55882, WO 2001/04147 .
[0338] (C) Carboidratos alterados afetados, por exemplo, alterando um gene para uma enzima que afeta o padrão de ramificação de amido ou um gene que altera tiorredoxina, como NTR e/ou TRX (consultar a Patente dos EUA N° 6, 531, 648 que é incorporada a titulo de referência para este propósito) e/ou uma gama zeina nocaute ou mutante, como cs27 ou TUSC27 ou en27 (consultar Patente dos EUA N° 6,858,778 e Publicação de Pedido de Patente dos EUA N° 2005/0160488, Publicação de Pedido de Patente dos EUA N° 2005/0204418, que são incorporados a titulo de referência para este propósito). Consultar Shiroza, et al., (1988) J. Bacteriol. 170:810 (sequência de nucleotídeo de gene frutosiltransferase mutante de Streptococcus) , Steinmetz, et al. , (1985) Mol. Gen. Genet. 200:220 (sequência de nucleotídeo de gene levansucrase de Bacillus subtilis), Pen, et al. , (1992) Bio/Technology 10:292 (produção de plantas transgênicas que expressam alfa-amilase de Bacillus licheniformis), Elliot, et al., (1993) Plant Molec. Biol. 21:515 (sequências de nucleotídeo de genes invertase de tomate), Sogaard, et al., (1993) J. Biol. Chem. 268:22480 (mutagênese sítio-dirigida de gene alfa-amilase de cevada) e Fisher, et al. , (1993) Plant Physiol. 102:1045 (enzima de ramificação de amido de endosperma de mais II), WO 1999/10498 (digestibilidade melhorada e/ou extração de amido
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335/525 através da modificação de UDP-D-xilose 4-epimerase, Frágil 1 e 2, Refl, HCHL, C4H) , Patente dos EUA 6, 232,529 (método para produzir semente oleaginosa superior por modificação de níveis de amido (AGP)). Os genes de modificação de ácido graxo mencionados no presente documento também podem ser usados para afetar o teor de amido e/ou composição através da inter-relação das vias de amido e óleo.
[0339] (D) Teor ou composição de antioxidante alterado, como alteração de tocoferol ou trocotrienóis. Por exemplo, consultar, Patente dos EUA N° 6,787,683, Publicação de Pedido de Patente dos EUA N° 2004/0034886 e WO 2000/68393 que envolvem a manipulação de níveis de antioxidantes e WO 2003/082899 através da alteração de uma homogentisato geranil-geranil transferase (hggt).
[0340] (E) Aminoácidos de semente essenciais alterados. Por exemplo, consultar a Patente dos EUA N° 6,127,600 (método para aumentar o acúmulo de aminoácidos essenciais em sementes), Patente dos EUA N° 6,080,913 (métodos binários para aumentar o acúmulo de aminoácidos essenciais em sementes), Patente dos EUA N° 5,990,389 (rico em lisina), documento n° WO 1999/40209 (alteração de composições de aminoácido em sementes), documento n° WO 1999/29882 (métodos para alterar o teor de aminoácidos de proteínas), Patente dos EUA N° 5,850,016 (alteração de composições de aminoácidos em sementes), WO 1998/20133 (proteínas com níveis aprimorados de aminoácidos essenciais), Patente dos EUA N° 5,885,802 (rico em metionina), Patente dos EUA N° 5,885,801 (treonina superior), Patente dos EUA N° 6,664,445 (enzimas biossintéticas de aminoácidos de plantas), Patente dos EUA N° 6,459,019 (lisina e treonina aumentadas),
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Patente dos EUA N° 6,441,274 (subunidade beta de triptofano sintase de planta), Patente dos EUA N° 6,346,403 (enzimas metabólicas de metionina), Patente dos EUA N° 5,939,599 (rico em enxofre), Patente dos EUA N° 5,912,414 (metionina aumentada), WO 1998/56935 (enzimas biossintéticas de aminoácidos de plantas), WO 1998/45458 (proteína de sementes modificada que tem percentagem mais elevada de aminoácidos essenciais), WO 1998/42831 (lisina aumentada), Patente dos EUA N° 5,633,436 (aumento do teor de aminoácidos com enxofre), Patente dos EUA N° 5,559,223 (proteínas de armazenamento sintéticas com estrutura definida contendo níveis programáveis de aminoácidos essenciais para a melhoria do valor nutricional de plantas), WO 1996/01905 (treonina aumentada), WO 1995/15392 (lisina aumentada), Publicação de Pedido de Patente dos EUA N° 2003/0163838, Publicação de Pedido de Patente dos EUA 2003/0150014, Publicação de Pedido de Patente dos EUA N° 2004/0068767, Patente dos EUA N° 6,803,498, WO 2001/79516.
4. Genes que Controlam a Esterilidade Masculina:
[0341] Há diversos métodos disponíveis para conferir esterilidade masculina genética, como múltiplos genes mutantes em localizações separadas dentro do genoma que conferem esterilidade masculina, conforme divulgado nas Patentes doa EUA N° 4, 654,465 e 4,727,219 de Brar, et al. , e translocações cromossômicas, conforme descrito por Patterson nas Patentesdos EUA N° 3,861,709 e 3,710,511. Além desses métodos, Albertsen, et al. , Patente dos EUA N° 5, 432,068, descreve um sistema de esterilidade masculina nuclear que inclui: identificar um gene que é crítico para a fertilidade masculina; silenciar esse gene nativo que é crítico para a fertilidade masculina; remover o
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337/525 promotor nativo do gene de fertilidade masculina essencial e substituir o mesmo por um promotor induzível; inserir esse gene geneticamente modificado de volta na planta; e criando, desse modo, uma planta gue com esterilidade masculina devido ao fato de o promotor induzível não estar ligado, resultando no gene de fertilidade masculina não sendo transcrito. A fertilidade é restaurada induzindo ou ligando o promotor, o gue permite, por sua vez, gue o gene gue confere fertilidade masculina seja transcrito.
[0342] (A) Introdução de um gene desacetilase sob o controle de um promotor específico de tapete e com a aplicação de N-Ac-PPT guímico (WO 2001/29237).
[0343] (B) Introdução de vários promotores específicos de estame (WO 1992/13956, WO 1992/13957).
[0344] (C) Introdução do gene barnase e barstar (Paul, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 19:611-622).
[0345] Para exemplos adicionais de sistemas e genes nucleares de esterilidade masculina e feminina, também consultar as Patentes dos EUA N°s 5,859,341; 6,297,426; 5,478,369; 5,824,524; 5,850,014 e 6,265,640, todas as guais são incorporadas no presente documento a título de referência.
5. Genes que criam um sitio para integração de DNA específica de sítio.
[0346] Isso inclui a introdução de sítios FRT gue podem ser usados no sistema FLP/FRT e/ou sítios Lox gue podem ser usados no sistema Cre/Loxp. Por exemplo, consultar, Lyznik, et al. , (2003) Plant Cell Rep 21:925-932 e WO 1999/25821, os guais são incorporados no presente documento a título de referência.
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Outros sistemas que podem ser usados incluem a Gin recombinase do fago Mu (Maeser, et al., (1991) Vicki Chandler, The Maize Handbook capítulo 118 (Springer-Verlag 1994), a Pin recombinase de E. coll (Enomoto, et al., 1983) e o sistema R/RS do plasmídeo pSRi (Araki, et al., 1992) .
6. Genes que afetam a resistência a estresse abiótico [0347] Incluindo, mas sem limitação, desenvolvimento de flor, espiga e semente, o melhoramento da eficácia de utilização de nitrogênio, capacidade de resposta a nitrogênio alterada, resistência ou tolerância à seca, resistência ou tolerância ao frio e resistência ou tolerância a sais e rendimento aumentado sob estresse.
[0348] (A) Por exemplo, consultar: WO 2000/73475 em que a eficácia do uso de água é alterada através da alteração de malato; as Patentes dos EUA N°s 5,892,009, 5,965,705, 5,929,305, 5, 891,859, 6, 417,428, 6, 664,446, 6, 706, 866, 6, 717, 034, 6,801,104, WO 2000/060089, WO 2001/026459, WO 2001/035725, WO 2001/034726, WO 2001/035727, WO 2001/036444, WO 2001/036597, WO 2001/036598, WO 2002/015675, WO 2002/017430, WO 2002/077185, WO 2002/079403, WO 2003/013227, WO 2003/013228, WO 2003/014327, WO 2004/031349, WO 2004/076638, WO 199809521.
[0349] (B) O WO 199938977 descreve genes, incluindo genes CBF e fatores de transcrição eficazes para mitigar efeitos negativos de congelamento, salinidade e seca altas em plantas, assim como conferir outros efeitos positivos no fenótipo de plantas.
[0350] (C) Publicação de Pedido de Patente dos EUA N°
2004/0148654 e WO 2001/36596, em que o ácido abscísico é alterado
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339/525 em plantas que resultam em fenótipo de planta melhorado, como rendimento aumentado e/ou tolerância aumentada a estresse abiótico.
[0351] (D) WO 2000/006341, WO 2004/090143, Patentes dos EUA N° 7,531,723 e 6,992,237 em que a expressão de citoquinina é modificada, resultando em plantas com tolerância a estresse aumentada, como tolerância à seca e/ou rendimento aumentado. Também consultar WO 2002/02776, WO 2003/052063, JP 2002/281975, Patente dos EUA N° 6,084,153, WO 2001/64898, Patente dos EUA N° 6,177,275 e Patente dos EUA N° 6,107,547 (melhoramento de utilização de nitrogênio e resposta a nitrogênio alterada).
[0352] (E) Para alteração de etileno, consultar a Publicação de Pedido de Patente dos EUA N° 2004/0128719, a Publicação de Pedido de Patente dos EUA N° 2003/0166197 e WO 2000/32761.
[0353] (F) Para fatores de transcrição ou reguladores de transcrição de estresse abiótico de plantas, consultar, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente dos EUA N° 2004/0098764 ou Publicação de Pedido de Patente dos EUA N° 2004/0078852.
[0354] (G) Genes que aumentam a expressão de pirofosfatase vacuolar, como AVP1 (Patente dos EUA 8,058,515) para rendimento aumentado; ácido nucleico codificador de um polipeptideo HSFA4 ou um polipeptideo HSFA5 (Fator de Choque Térmico da classe A4 ou A5) , um polipeptideo de proteína transportadora de oligopeptideo (semelhante a OPT4); um polipeptideo semelhante a plastochron2 (semelhante a PLA2) ou um polipeptideo semelhante a homeobox 1 relacionado com Wuschel
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340/525 (semelhante a WOX1) (Pedido de Publicação de Patente dos EUA N° 2011/0283420).
[0355] (H) Regulação descendente de polinucleotídeos codificadores de proteínas de poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) para modular a morte celular programada (Patente dos EUA N° 8,058,510) para vigor aumentado.
[0356] (I) Polinucleotídeo de codificação de polipeptídeos DTP21 para conferir resistência à seca (Publicação de Pedido de Patente dos EUA N° 2011/0277181) .
[0357] (J) As sequências de nucleotídeos codificadoras das proteínas ACC Sintase 3 (ACS3) para modular o desenvolvimento, modular resposta ao estresse e modular a tolerância ao estresse (Publicação de Pedido de Patente dos EUA N° 2010/0287669).
[0358] (K) Polinucleotídeos que codificam proteínas que conferem um fenótipo de tolerância à seca (DTP) para conferir resistência à seca (WO 2012/058528).
[0359] (L) Genes de tocoferol ciclase (TC) para conferir tolerância à seca e sais (Publicação de Pedido de Patente dos EUA N° 2012/0272352).
[0360] (M) Proteínas de família de terminal amino de CAAX para tolerância ao estresse (Patente dos EUA N° 8,338,661).
[0361] (N) Mutações no gene de codificação de SAL1 têm tolerância ao estresse aumentada, incluindo resistência à seca aumentada (Publicação de Pedido de Patente dos EUA N° 2010/0257633).
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341/525 [0362] (O) Expressão de uma sequência de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em: polipeptídeo GRF, polipeptídeo semelhante a RAA1, polipeptídeo SYR, polipeptídeo ARKL e polipeptídeo YTP que aumentam os traços relacionados com o rendimento (Publicação de Pedido de Patente dos EUA N° 2011/0061133) .
[0363] (P) Modulação da expressão em uma planta de um ácido nucleico codificador de um polipeptídeo de Trealose Fosfato Fosfatase de Classe (TPP) III para melhorar os traços relacionados com o rendimento em plantas, aumentando particularmente o rendimento de sementes (Publicação de Pedido de Patente dos EUA N° 2010/0024067) .
[0364] Outros genes e fatores de transcrição que afetam o crescimento e traços agronômicos de plantas, como o rendimento, florescimento, crescimento de plantas e/ou estrutura de plantas, podem ser introduzidos ou sofrer introgressão em plantas, consultar, por exemplo, WO 1997/49811 (LHY), WO 1998/56918 (ESD4), WO 1997/10339 e Patente dos EUA N° 6,573,430 (TFL), Patente dos EUA N° 6, 713, 663 (ET), WO 1996/14414 (CON) , WO 1996/38560, WO 2001/21822 (VRN1), WO 2000/44918 (VRN2), WO 1999/49064 (GI), WO 2000/46358 (FR1),WO 1997/29123, Patente dos EUA N° 6,794,560, Patente dos EUA N° 6,307,126 (GAI), WO 1999/09174 (D8 e Rht) e WO 2004/076638 e WO 2004/031349 (fatores de transcrição).
7. Genes que conferem rendimento aumentado [0365] (A) Uma planta de cultura transgênica transformada por um ácido nucleico de codificação de
Polipeptídeo semelhante a 1-Aminociclopropano-l-Carboxilato
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Desaminase (ACCDP) , em que a expressão da sequência de ácido nucleico na planta de cultura resulta no crescimento de raiz aumentado da planta, e/ou rendimento aumentado, e/ou tolerância
aumentada ao estresse ambiental, como em comparação com uma
variedade do tipo selvagem da planta ( Patente dos EUA N°
8,097,769) •
[0366] (B) A sobre-expressão de gene de proteína de
dedos de zinco de mais (Zm-ZFPl) com o uso de um promotor
preferido para sementes demonstrou melhorar o crescimento de planta, aumentar o número de grãos e peso de grãos total por planta (Publicação de Pedido de Patente dos EUA N° 2012/0079623) .
[0367] (C) A sobre-expressão constitutiva de proteína de domínio de limites de órgãos laterais (LOB) de mais (ZmLOBDP1) demonstrou aumentar o número de grãos e o peso de grãos total por planta (Publicação de Pedido de Patente dos EUA N° 2012/0079622).
[0368] (D) O melhoramento de traços relacionados com o rendimento em plantas modulando a expressão em uma planta de um ácido nucleico codificador de um polipeptideo semelhante a VIM1 (Variante em Metilação 1) ou um polipeptideo semelhante a VTC2 (GDP-L-galactose fosforilase) ou um polipeptideo DUF1685 ou um polipeptideo semelhante a ARF6 (Fator Responsive a Auxina) (WO 2012/038893).
[0369] (E) Modulação da expressão em uma planta de um ácido nucleico codificador de um polipeptideo semelhante a Ste20 ou um homólogo do mesmo fornece plantas que têm rendimento aumentado em relação a plantas de controle (EP 2431472) .
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343/525 [0370] (F) Genes codificadores de polipeptídeos nucleosídeo difosfatase cinase (NDK) e homólogos dos mesmos para modificar a arquitetura de raiz da planta (Publicação de Pedido de Patente dos EUA N° 2009/0064373) .
8. Genes que conferem digestibilidade de plantas.
[0371] (A) Alteração do nível de xilano presente na parede celular de uma planta modulando a expressão de xilano sintase (Patente dos EUA N° 8,173,866).
[0372] Em algumas modalidades, o traço empilhado pode ser um traço ou evento que recebeu aprovação regulatória que inclui, mas sem limitação, os eventos na Tabela 5A a 5F.
Table 5A Alfalfa Medicago sativa
Evento Companhia Descrição
J101, J163 Monsanto Company e Forage Genetics International Alfafa tolerante a herbicida de glifosato (Lucerna) produzida inserindo-se um gene de codificação da enzima 5enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS) da cepa CP4 de Agrobacterium tumefaciens.
Tabela 5B Girassol Helianthus annuus
Evento Companhia Descrição
X81359 BASE Inc. Tolerância a herbicidas de imidazolinona por seleção de um mutante de ocorrência natural.
Tabela 5C Arroz Oryza sativa
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Evento Companhia Descrição
CL121, CL141, CFX51 BASE Inc. Tolerância ao herbicida de imidazolinona, imazetapir, induzida por mutagênese química da enzima acetolactato sintase (ALS) com o uso de metanossulfonato de etila (EMS).
IMINTA-1, IMINTA-4 BASE Inc. Tolerância a herbicidas de imidazolinona induzida por mutagênese química da enzima acetolactato sintase (ALS) com o uso de azeto de sódio.
LLRICE06, LLRICE62 Aventis CropScience Arroz tolerante a herbicida de glufosinato amônio produzido inserindo-se um gene de codificação de fosfinotricina acetilferase (PAT) modificada da bactéria do solo Streptomyces hygroscopicus) .
LLRICE601 Bayer CropScience (Aventis CropScience(AgrEvo)) Arroz tolerante a herbicida de glufosinato amônio produzido inserindo-se um gene de codificação de fosfinotricina acetilferase (PAT) modificada da bactéria
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do solo Streptomyces hygroscopicus) .
PWC16 BASE Inc. Tolerância ao herbicida de imidazolinona, imazetapir, induzida por mutagênese química da enzima acetolactato sintase (ALS) com o uso de metanossulfonato de etila (EMS).
Tabela 5C Trigo Triticum aestivum
Evento Companhia Descrição
AP205CL BASE Inc. Seleção para uma versão com mutagênese da enzima acetohidroxiácido sintase (AHAS), também conhecida como acetolactato sintase (ALS) ou acetolactato piruvatoliase.
AP602CL BASE Inc. Seleção para uma versão com mutagênese da enzima acetohidroxiácido sintase (AHAS), também conhecida como acetolactato sintase (ALS) ou acetolactato piruvatoliase.
BW255-2, BW238- 3 BASE Inc. Seleção para uma versão com mutagênese da enzima acetohidroxiácido sintase (AHAS),
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Evento Companhia Descrição
também conhecida como acetolactato sintase (ALS) ou acetolactato piruvatoliase.
BW7 BASE Inc. Tolerância a herbicidas de imidazolinona induzida por mutagênese química do gene aceto-hidroxiácido sintase (AHAS) com o uso de azeto de sódio.
MON71800 Monsanto Company Variedade de trigo tolerante a glifosato produzida inserindose um gene de codificação de 5enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase modificado (EPSPS) da bactéria do solo Agrobacteríuir tumefacíens, cepa CP4.
SWP965001 Cyanamid Crop Protection Seleção para uma versão com mutagênese da enzima acetohidroxiácido sintase (AHAS), também conhecida como acetolactato sintase (ALS) ou acetolactato piruvatoliase.
Teal 11A BASF Inc. Seleção para uma versão com mutagênese da enzima acetohidroxiácido sintase (AHAS), também conhecida como
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acetolactato sintase (ALS) ou acetolactato piruvatoliase.
Tabela 5E L. Soja Glycine max
Evento Companhia Descrição
A2704-12, A2704-21, A5547-35 Bayer CropScience (Aventis CropScience (AgrEvo)) Soja tolerante a herbicida de amônio glufosinato produzida inserindo-se um gene de codificação de fosfinotricina acetiltransferase (PAT) modificada da bactéria de solo Streptomyces viridochromogenes.
A5547-127 Bayer CropScience (Aventis CropScience (AgrEvo)) Soja tolerante a herbicida de amônio glufosinato produzida inserindo-se um gene de codificação de fosfinotricina acetiltransferase (PAT) modificada da bactéria de solo Streptomyces viridochromogenes.
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Evento Companhia Descrição
BPS-CV127-9 BASE Inc. 0 gene csrl-2 introduzido a partir de Arabídopsís thaláana codifica uma proteína de acetohidroxiácido sintase que confere tolerância a herbicidas de imidazolinona devido a uma mutação de ponto que resulta em uma substituição de aminoácido única na qual o resíduo de serina na posição 653 é substituído por asparagina (S653N).
DP-305423 Pioneer Hi-Bred International Inc. Soja de ácido oleico alto produzida inserindo-se cópias adicionais de uma porção do gene de codificação de dessaturase omega-6, gm-fad21 que resulta no silenciamento do gene dessaturase omega-6 endógeno (FAD2-1).
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DP356043 Pioneer Hi-Bred International Inc. Evento de soja com dois genes de tolerância a herbicida: glifosato Nacetiltransferase, que desintoxica glifosato, e urn gene acetolactato sintase (ALS) modificado que é tolerante a herbicidas de inibição de ALS
G94-1, G94- 19, G168 DuPont Canada Agricultural Products Soja de ácido oleico alto produzida inserindo-se uma segunda cópia do gene de codificação de dessaturase de ácido graxo (GmFad2-l) de soja que resultou no silenciamento do gene hospedeiro endógeno.
GTS 40-3-2 Monsanto Company Variedade de soja tolerante a glifosato produzida inserindo-se um gene de codificação de 5- enolpiruvilchiquimato-3fosfato sintase (EPSPS) modificado da bactéria do solo Agrobacteríuir tumefacíens.
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Evento Companhia Descrição
GU2 62 Bayer CropScience Soja tolerante a herbicida de
(Aventis amônio glufosinato produzida
CropScience(AgrEvo)) inserindo-se um gene de
codificação de fosfinotricina
acetiltransferase (PAT)
modificada de i bactéria de
solo Streptomyces
viridochromogenes.
MON87701 Monsanto Company Resistência a pragas de
Lepidópteros de soja
incluindo lagarta-da-soja
(Anticarsia gemma tal is) e
lagarta falsa-medideira
(Pseudoplusia includens) .
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Evento Companhia Descrição
MON87701 x MON89788 Monsanto Company Tolerância a herbicida de glifosato através da expressão do gene de codificação EPSPS da cepa de A. tumefacíens CP4, e resistência a pragas de Lepidópteros de soja incluindo lagarta-da-soja (Antícarsía gemmatalís) e lagarta falsa-medideira (Pseudoplusía íncludens) por meio da expressão do gene de codificação CrylAc de B. thuríngíensís.
MON89788 Monsanto Company Soja tolerante a glifosato produzida inserindo-se gene aroA (epsps) de codificação de 5-enolpiruvilchiquimato-3fosfato sintase (EPSPS) modificado de Agrobacteríuir tumefacíens CP4.
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Evento Companhia Descrição
OT96-15 Agriculture & Agri- Food Canada Soja de ácido linolênico baixo produzida através de reprodução cruzada tradicional para incorporar o traço inovador de um mutante de gene fanl de ocorrência natural que foi selecionado para ácido linolênico baixo.
W62, W98 Bayer CropScience (Aventis CropScience(AgrEvo)) Soja tolerante a herbicida de glufosinato amônio produzida inserindo-se um gene de codificação de fosfinotricina acetilferase (PAT) modificada da bactéria do solo Streptomyces hygroscopicus.
Tabela 5F Mais Zea mays L.
Evento Companhia Descrição
176 Syngenta Seeds, Inc . Mais resistente a insetos produzido inserindo-se o gene CrylAb de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. A modificação genética fornece resistência ao ataque pela broca europeia do milho (ECB).
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Evento Companhia Descrição
3751IR Pioneer Hi-Bred International Inc . Seleção de variantes somaclonais por cultura de embriões em imidazolinona que contém meios .
676, 678, 680 Pioneer Hi-Bred International Inc . Mais tolerante a herbicida de glufosinate amônio e com esterilidade masculina produzido inserindo-se adenina metilase de DNA de codificação de genes e fosfinotricina acetiltransferase (PAT) modificada de Escherichia coii e Streptomyces viridochromogenes, respectivamente.
B16 (DLL25) Dekalb Genetics Corporation Mais tolerante a herbicida de glufosinato amônio produzido inserindo-se a fosfinotricina acetiltransferase (PAT) modificada de codificação de gene de Streptomyces hygroscopicus.
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Evento Companhia Descrição
BT11 (X4334CBR, X4734CBR) Syngenta Seeds, Inc . Mais tolerante a herbicida e resistente a insetos produzido inserindo-se o gene CrylAb de Bacillus thuríngíensís subsp. kurstaki, e o gene de codificação de fosfinotricina N-acetiltransferase (PAT) de S. viridochromogenes.
BT11 x GA21 Syngenta Seeds, Inc . Mais tolerante a herbicida e resistente a insetos empilhado produzido pela reprodução cruzada convencional de linhagens parentais BT11 (identificador único OECD: SYNBTO11-1) e GA21 (identificador único OECD: MON-OOO21-9).
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Evento Companhia Descrição
BT11 x MIR162 X Syngenta Seeds, Resistência a pragas de
MIR604 x GA21 Inc . Coleópteros , particularmente
pragas de verme de raiz do milho
(Díabrotíca spp. ) e diversas
pragas de Lepidópteros de milho,
incluindo broca europeia do
milho (ECB, Ostrínía
nubílalís), lagarta-da-espiga-
do-milho (CEW, Helícoverpa
zea) , lagarta-do-cartucho do
milho FAW, Spodoptera
frugiperda) e lagarta-rosca
negra (BCW, Agrotis ipsilon);
tolerância a herbicidas que
contêm glifosato e glufosinato
amônio.
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BT11 x MIR162 Syngenta Seeds, Inc . Mais tolerante a herbicida e resistente a insetos empilhado produzido pela reprodução cruzada convencional de linhagens parentais BT11 (identificador único OECD: SYNBTO11-1) e MIR162 (identificador único OECD: SYNIR162-4). Resistência à Broca Européia do Milho e tolerância ao herbicida de glufosinato amônio (Liberty) são derivadas de BT11, que contém o gene CrylAb de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, e o gene de codificação fosfinotricina Nacetiltransferase (PAT) de S. viridochromogenes. Resistência a outras pragas de Lepidópteros, incluindo H. zea, S. frugiperda, A. ipsilon, e S. albicosta, é derivada de MIR162, que contém o gene vip3Aa da cepa de Bacillus thuringiensis AB88.
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Evento Companhia Descrição
BT11 x MIR162 X Syngenta Seeds, Proteína delta- endotoxina
MIR604 Inc . CrylAb de Bacillus
thuringiensis e o material
genético necessário para sua
produção (através dos elementos
de vetor de pZO1502) no Evento
de mi Iho Btll milho
(Identificador Único OECD: SYN-
BTO11-1) x proteína inseticida
Vip3Aa20 de Bacillus
thuríngíensís e o material
genético necessário para sua
produção (por meio de elementos
de vetor pNOV1300) no mais de
Evento MIR162 (Identificador
Único de OECD: SYN-IR162-4) x
proteína Cry3A modif içada e o
material genético necessário
para sua produção (por meio de
elementos de vetor pZM2 6) no
mais de Evento MIR604
(Identificador Único de OECD:
SYN-IR6O4 -5) .
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Evento Companhia Descrição
CBH-351 Aventis CropScience Milho tolerante a amônio glufosinato e resistente a inseto desenvolvido inserindose genes que codificam proteína Cry9C de Bacillus thuringiensis subespécie tolworthi e fosfinotricina acetiltransferase (PAT) de Streptomyces hygroscopicus.
DAS-06275-8 DOW AgroSciences LLC Variedade de mais tolerante a herbicida de glufosinato amônio e resistente a insetos Lepidópteros produzida inserindo-se o gene CrylF de Bacillus thuringiensis var aizawai e a fosfinotricina acetiltransferase (PAT) modificada de Streptomyces hygroscopicus.
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Evento Companhia Descrição
BT11 x MIR604 Syngenta Seeds, Inc . Mais tolerante a herbicida e resistente a insetos empilhado produzido pela reprodução cruzada convencional de linhagens parentais BT11 (identificador único OECD: SYNBTO11-1) e MIR604 (identificador único OECD: SYNIR6O5-5). Resistência à Broca Européia do Milho e tolerância ao herbicida de glufosinato amônio (Liberty) são derivadas de BT11, que contém o gene CrylAb de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, e o gene de codificação fosfinotricina Nacetiltransferase (PAT) de S. viridochromogenes. Resistência a verme da raiz do milho é derivada de MIR604 que contém o gene mCry3A de Bacillus thuringiensis.
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Evento Companhia Descrição
BT11 x MIR604 x GA21 Syngenta Seeds, Inc. Mais tolerante a herbicida e resistente a insetos empilhado produzido pela reprodução cruzada convencional de linhagens parentais BT11 (identificador único OECD: SYNBTO11-1), MIR604 (identificador único OECD: SYN-IR6O5-5) e GA21 (identificador único OECD: MON00021-9). Resistência à Broca Européia do Milho e tolerância ao herbicida de glufosinato amônio (Liberty) são derivadas de BT11, que contém o gene CrylAb de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, e o gene de codificação fosfinotricina Nacetiltransferase (PAT) de S. viridochromogenes. Resistência a verme da raiz do milho é derivada de MIR604 que contém o gene mCry3A de Bacillus thuringiensis. Tolerância a herbicida de glifosato é derivada de GA21 que contém um gene EPSPS modificado de mais.
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Evento Companhia Descrição
DAS-59122-7 DOW Mais resistente a verme de raiz
AgroSciences de milho produzido inserindo-se
LLC e Pioneer os genes Cry34Abl e Cry35Abl da
Hi-Bred cepa Bacillus thuringiensis
International PS149B1. 0 gene de codificação
Inc . de PAT de Streptomyces
viridochromogenes foi
introduzido como um marcador
selecionável.
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DAS-59122-7 x TC1507 x NK603 DOW AgroSciences LLC e Pioneer Hi-Bred International Inc . Mais tolerante a herbicida e resistente a insetos empilhado produzido pela reprodução cruzada convencional de linhagens parentais DAS-59122-7 (identificador único OECD: DAS59122-7) e TC1507 (identificador único OECD: DAS01507-1) com NK603 (identificador único OECD: MON00603-6) . Resistência a verme da raiz do milho é derivada de DAS59122-7 que contém os genes Cry34Abl e Cry35Abl da cepa de Bacillus thuringiensis PS149B1. A resistência a Lepidópteros e tolerância a herbicida de glufosinato amônio é derivada de TC1507. Tolerância a herbicida de glifosato é derivada de NK603.
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Evento Companhia Descrição
DBT418 Dekalb Genetics Corporation Mais tolerante a herbicida de glufosinato amônio e resistente a insetos desenvolvido inserindo-se proteína CrylAC de codificação de genes de Bacillus thuringiensis subsp kurstaki e fosfinotricina acetiltransferase (PAT) modificada de Streptomyces hygroscopicus
MIR604 x GA21 Syngenta Seeds, Inc . Mais tolerante a herbicida e resistente a insetos empilhado produzido pela reprodução cruzada convencional de linhagens parentais MIR604 (identificador único OECD: SYNIR6O5-5) e GA21 (identificador único OECD: MON-OOO21-9). Resistência a verme da raiz do milho é derivada de MIR604 que contém o gene mCry3A de Bacillus thuringiensis. Tolerância a herbicida de glifosato é derivada de GA21.
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Evento Companhia Descrição
MON80100 Monsanto Company Mais resistente a insetos produzido inserindo-se o gene CrylAb de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. A modificação genética fornece resistência ao ataque pela broca europeia do milho (ECB).
MON802 Monsanto Company Mais tolerante a herbicida de glifosato e resistente a insetos produzido inserindo-se os genes de codificação da proteína CrylAb de Bacillus thuringiensis e a 5enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS) da cepa de A. tumefaciens CP4.
MON809 Pioneer Hi-Bred International Inc . Resistência à broca europeia do milho (Ostrinia nubilalis) por introdução de um gene sintético CrylAb. Resistência a glifosato por meio da introdução da versão bacteriana de uma enzima de planta, 5enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS).
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MON810 Monsanto Company Mais resistente a inseto produzido inserindo-se uma forma truncada do gene CrylAb de Bacillus thuringiensis subespécie HD-1. A modificação genética fornece resistência ao ataque pela broca europeia do milho (ECB).
MON810 x LY038 Monsanto Company Mais de teor de lisina intensificado e resistente a inseto empilhado derivado de reprodução cruzada convencional das linhagens parentais MON810 (identificador OECD: M0N-008106) e LY038 (identificador OECD: REN-OOO38-3).
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Evento Companhia Descrição
MON810 x MON88017 Monsanto Company Mais tolerante a glifosato e resistente a inseto empilhado derivado de reprodução cruzada convencional das linhagens parentais MON810 (identificador OECD: MON-OO81O-6) e MON88017 (identificador OECD:MON-88O173). A resistência à broca europeia do milho (ECB) é derivada de uma forma truncada do gene CrylAb de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD-1 presente em MON810. A resistência ao verme da raiz do milho é derivada do gene Cry3Bbl da cepa de Bacillus thuringiensis subespécie kumamotoensis EG4691 presente em MON88017. A tolerância a glifosato é derivada de um gene de codificação de 5enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS) da cepa de Agrobacterium tumefaciens CP4 presente em MON88017.
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Evento Companhia Descrição
MON832 Monsanto Company Introdução, por bombardeio de partícula, de glifosato oxidase (GOX) e uma 5enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS) modificada, uma enzima envolvida na via bioquímica de chiquimato para a produção dos aminoácidos aromáticos.
MON863 Monsanto Company Mais resistente ao verme da raiz do milho produzido inserindo-se o gene Cry3Bbl de Bacillus thuringiensis subsp. kumamotoensis.
MON863 χ MON810 Monsanto Company Híbrido de mais resistente a insetos empilhado derivado da reprodução cruzada convencional das linhagens parentais MON863 (identificador OECD: MON-OO8635) e MON810 (identificador OECD: MON-OO81O-6)
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Evento Companhia Descrição
MON863 x MON810 x NK603 Monsanto Company Híbrido de mais tolerante a herbicida e resistente a insetos empilhado derivado da reprodução cruzada convencional do híbrido empilhado MON-OO8635 x MON-OO81O-6 e NK603 (identificador OECD:MON-OO6O36) .
MON863 x NK603 Monsanto Company Híbrido de mais tolerante a herbicida e resistente a insetos empilhado derivado da reprodução cruzada convencional das linhagens parentais MON863 (identificador OECD:M0N-008635) e NK603 (identificador OECD: MON-OO6O3-6).
MON87460 Monsanto Company MON 87460 foi desenvolvido para fornecer perda de rendimento reduzida sob condições limitadas de água em comparação ao mais convencional. A eficácia em MON 87460 é derivada pela expressão da proteína B de choque a frio (CspB) de Bacillus subtilis inserida.
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Evento Companhia Descrição
MON88017 Monsanto Company Mais resistente a verme da raiz do milho produzido inserindo-se o gene Cry3Bbl da cepa de Bacillus thuringiensis subespécie kumamotoensis EG4691. Tolerância a glifosato derivada pela inserção de um gene de codificação de 5enolpiruvilchiguimato-3-fosfato sintase (EPSPS) da cepa de Agrobacterium tumefaciens CP4.
MON89034 Monsanto Company Evento de mais gue expressa duas proteínas inseticidas diferentes de Bacillus thuringiensis gue fornecem resistência a várias pragas de Lepidópteros.
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Evento Companhia Descrição
MON89034 x MON88017 Monsanto Company Mais tolerante a glifosato e resistente a inseto empilhado derivado de reprodução cruzada convencional das linhagens parentais MON89034 (identificador OECD: MON-89O343) e MON88017 (identificador OECD:MON-88017-3). A resistência a insetos Lepidópteros é derivada de dois genes Cry presentes em MON89043. A resistência ao verme da raiz do milho é derivada de um gene Cry único e a tolerância a glifosato é derivada do gene de codificação de 5enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS) de Agrobacteríum tumefacíens presente em MON88017.
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Evento Companhia Descrição
MCN89034 x NK603 Monsanto Company Mais tolerante a herbicida e resistente a insetos empilhado produzido por reprodução cruzada convencional de linhagens parentais MON89034 (identificador OECD: MON-89O343) com NK603 (identificador único OECD: MON-OO6O3-6). Ά resistência a insetos Lepidópteros é derivada de dois genes Cry presentes emMCN89043. Tolerância a herbicida de glifosato é derivada de NK603.
NK603 x MCN810 Monsanto Company Híbrido de mais tolerante a herbicida e resistente a insetos empilhado derivado da reprodução cruzada convencional das linhagens parentais NK603 (identificador OECD: MON-OO6O36) e MCN810 (identificador OECD: MON-OO81O-6).
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MON89034 x TC1507 x MON88017 x DAS- 59122-7 Monsanto Company e Mycogen Seeds c/o Dow AgroSciences LLC Mais tolerante a herbicida e resistente a insetos empilhado produzido pela reprodução cruzada convencional das linhagens parentais: MON89034, TC1507, MON88017 e DAS-59122. Resistência a pragas de inseto acima do solo e abaixo do solo e tolerância a herbicidas que contêm glifosato e glufosinato amônio.
MS 3 Bayer CropScience (Aventis CropScience(AgrEvo)) Esterilidade masculina causada por expressão do gene barnase ribonuclease de Bacillus amyloliquefaciens; resistência a PPT foi por meio da PPTacetiltransferase (PAT).
MS 6 Bayer CropScience (Aventis CropScience(AgrEvo)) Esterilidade masculina causada por expressão do gene barnase ribonuclease de Bacillus amyloliquefaciens; resistência a PPT foi por meio da PPTacetiltransferase (PAT).
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NK603 Monsanto Company Introdução, por bombardeio de partícula, de uma 5- enolpiruvilchiquimato-3fosfato sintase (EPSPS) modificada, uma enzima envolvida na via bioquímica de chiquimato para a produção dos aminoácidos aromáticos.
NK603 χ T25 Monsanto Company Híbrido de mais tolerante a herbicida de glifosato e glufosinato amônio empilhado derivado da reprodução cruzada convencional das linhagens parentais NK603 (identificador OECD: MON-OO6O3-6) e T25 (identificador OECD: ACS-ZM0032) .
T25 χ MON810 Bayer CropScience (Aventis CropScience(AgrEvo)) Híbrido de mais tolerante a herbicida e resistente a insetos empilhado derivado da reprodução cruzada convencional das linhagens parentais T25 (identificador OECD: ACS-ZMOO32) e MON810 (identificador OECD :M0N-00810-6) .
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TC1507 Mycogen (c/o Dow AgroSciences); Pioneer (c/o DuPont) Mais tolerante a herbicida de glufosinato amônio e resistente a insetos produzido inserindose o gene CrylF de Bacillus thuringiensis var. aizawai e o gene de codificação de fosfinotricina Nacetiltransferase de Streptomyces viridochromogenes.
TC1507 x NK603 DOW AgroSciences LLC Híbrido de milho tolerante a herbicida e resistente a insetos empilhado derivado da reprodução cruzada convencional das linhagens parentais 1507 (identificador OECD: DAS-O15O71) e NK603 (identificador OECD: MON-OO6O3-6).
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 378/553
375/525
TC1507 x DAS- 59122-7 DOW AgroSciences LLC e Pioneer Hi-Bred International Inc. Mais tolerante a herbicida e resistente a insetos empilhado produzido pela reprodução cruzada convencional de linhagens parentais TC1507 (identificador único OECD: DAS01507-1) com DAS-59122-7 (identificador único OECD: DAS59122-7) . Resistência a insetos Lepidópteros é derivada de TC1507 devido à presença do gene CrylF de Bacillus thuringiensis var. aizawai. Resistência a verme da raiz do milho é derivada de DAS-59122-7 que contém os genes Cry34Abl e Cry35Abl da cepa de Bacillus thuringiensis PS149B1. Tolerância a herbicida de glufosinato amônio é derivada de TC1507 do gene de codificação de fosfinotricina Nacetiltransferase de Streptomyces viridochromogenes.
[0373] Outros eventos com aprovação regulatória são bem conhecidos por uma pessoa versada na técnica e podem ser encontrados em Center for Environmental Risk Assessment (ceragmc.org/?action=gm_crop_database, que pode ser acessado com o
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376/525 uso do prefixo www) e em International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Applications (isaaa.org/gmapprovaldatabase/default.asp, que pode ser acessado com o uso do prefixo www).
Silenciamento de gene [0374] Em algumas modalidades, o traço empilhado pode estar na forma de silenciamento de um ou mais polinucleotideos de interesse resultando na supressão de um ou mais polipeptídeos de praga direcionada. Em algumas modalidades, o silenciamento é alcançado através do uso de um construto de DNA de supressão.
[0375] Em algumas modalidades, um ou mais polinucleotideos que codificam os polipeptídeos do polipeptideo PtIP-83 ou fragmentos ou variantes dos mesmos podem ser empilhados com um ou mais polinucleotideos que codificam um ou mais polipeptídeos que têm atividade inseticida ou traços agronômicos conforme estabelecido supra e, opcionalmente, podem incluir adicionalmente um ou mais polinucleotideos que fornecem silenciamento de genes de um ou mais polinucleotídeos-alvo conforme discutido infra.
[0376] Construto de DNA de supressão é um construto de DNA recombinante que, quando transformado ou integrado de modo estável no genoma da planta, resulta no silenciamento de um gene-alvo na planta. 0 gene-alvo pode ser endógeno ou transgênico à planta. Silenciamento, conforme usado no presente documento em relação ao gene-alvo, se refere geralmente à supressão de níveis de mRNA ou proteína/enzima expressos pelo gene-alvo, e/ou o nível da atividade enzimática ou funcionalidade da proteína. 0 termo supressão inclui baixar,
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377/525 reduzir, declinar, diminuir, inibir, eliminar e prevenir. Silenciamento ou silenciamento de genes não especifica o mecanismo e é inclusivo, e não limitado a antissentido, cossupressão, supressão viral, supressão de grampo, supressão de haste-alça, abordagens à base de RNAi e abordagens à base de RNA pequeno.
[0377] Um construto de DNA de supressão pode compreender uma região derivada de um gene-alvo de interesse e pode compreender toda ou parte da sequência de ácido nucleico da fita sentido (ou fita antissentido) do gene-alvo de interesse. Dependendo da abordagem a ser utilizada, a região pode ser 100% idêntica ou menos que 100% idêntica (por exemplo, pelo menos 50% ou qualquer número inteiro entre 51% e 100% idêntica) a toda ou parte da fita de sentido (ou fita de antissentido) do gene de interesse.
[0378] Os construtos de DNA de supressão são bem conhecidos na técnica, são prontamente construídos assim que o gene-alvo de interesse é selecionado, e incluem, sem limitação, construtos de cossupressão, construtos antissentido, construtos de supressão viral, construtos de supressão por forquilha, construtos de supressão por haste-alça, construtos de produção de RNA de fita dupla, e mais geralmente, construtos de RNAi (interferência de RNA) e construtos de RNA pequeno, como construtos de siRNA (RNA de interferência curto) e construtos de miRNA (microRNA).
[0379] Inibição antissentido se refere à produção de transcritos de RNA antissentido com capacidade para suprimir a expressão da proteína-alvo.
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378/525 [0380] RNA de antissentido se refere a um transcrito de RNA que é complementar a todo ou parte de um transcrito primário direcionado ou mRNA e que bloqueia a expressão de um fragmento de ácido nucleico isolado direcionado (Patente dos EUA N° 5, 107,065) . A complementaridade de um RNA de antissentido pode estar com qualquer parte do transcrito de gene especifico, isto é, na sequência de não codificação 5', sequência de não codificação 3', introns ou a sequência de codificação.
[0381] Cossupressão se refere à produção de transcritos de RNA de sentido com capacidade para suprimir a expressão da proteína direcionada. RNA de sentido se refere ao transcrito de RNA que inclui o mRNA e pode ser traduzido na proteína dentro de uma célula ou in vitro. Construtos de cossupressão em plantas foram anteriormente projetados se focando na sobre-expressão de uma sequência de ácido nucleico que tem homologia com um mRNA nativo, na orientação sentido, o que resulta na redução de todo o RNA que tem homologia com a sequência sobre-expressa (consultar, Vaucheret, et al. , (1998) Plant J. 16:651-659 e Gura, (2000) Nature 404:804-808) .
[0382] Outra variação descreve o uso de sequências virais de planta para direcionar a supressão de sequências de codificação de mRNA próximo (Publicação PCT n° WO 1998/36083).
[0383] Um trabalho recente descreveu o uso de estruturas em grampo que incorporam toda ou parte de uma sequência de codificação de mRNA em uma orientação complementar que resulta em uma estrutura haste-alça potencial para o RNA expresso (Publicação PCT n° WO 1999/53050). Nesse caso, a haste é formada por polinucleotídeos correspondentes ao gene de interesse inseridos na orientação de sentido ou antissentido em
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379/525 relação ao promotor e a alça é formada por alguns polinucleotídeos do gene de interesse, que não têm um complemento no construto. Isso aumenta a frequência de cossupressão ou silenciamento nas plantas transgênicas recuperadas. Quanto a uma revisão da supressão por forquilha, consultar Wesley, et al. , (2003) Methods in Molecular Biology, Plant Functional Genomics: Methods and Protocols 236:273-286.
[0384] Um construto em que a haste é formada por pelo menos 30 nucleotídeos de um gene a ser suprimido e a alça é formada por uma sequência de nucleotídeos aleatória também foi usado de modo eficaz para supressão (Publicação PCT WO 1999/61632).
[0385] O uso de sequências poli-T e poli-A para gerar a haste na estrutura haste-alça também foi descrito (Publicação PCT n° WO 2002/00894).
[0386] Ainda outra variação inclui o uso de repetições sintéticas para promover a formação de uma haste na estrutura haste-alça. Os organismos transgênicos preparados com tais fragmentos de DNA recombinante demonstraram ter níveis reduzidos da proteína codificada pelo fragmento de nucleotídeos que forma a alça conforme descrito na Publicação PCT n° WO 2002/00904.
[0387] Interferência de RNA se refere ao processo de silenciamento de genes pós-transcrição específico para sequências em animais mediado por RNAs curtos de interferência (siRNAs) (Fire, et al., (1998) Nature 391:806). O processo correspondente em plantas é comumente chamado de silenciamento de genes pós-transcrição (PTGS) ou silenciamento de RNA e também é chamado de repressão em fungos. Se crê que o processo de
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380/525 silenciamento de genes pós-transcrição seja um mecanismo de defesa celular conservado de modo evolutivo usado para prevenir a expressão de genes estranhos e é comumente compartilhado por flora e filos diversos (Fire, et al. , (1999) Trends Genet. 15:358) . Tal proteção de expressão de genes estranhos pode ter evoluído em resposta à produção de RNAs de fita dupla (dsRNAs) derivados de infecção viral ou da integração aleatória de elementos de transposon em um genoma hospedeiro por meio de uma resposta celular que destrói especificamente o RNA de fita única homólogo de RNA genômico viral. A presença de dsRNA em células aciona a resposta de RNAi através de um mecanismo que ainda necessita ser completamente caracterizado.
[0388] A presença de dsRNAs longos em células estimula a atividade de uma enzima ribonuclease III chamada de dicer. Dicer é envolvida no processamento do dsRNA em partes curtas de dsRNA conhecidas como RNAs de interferência curta (siRNAs) (Berstein, et al., (2001) Nature 409:363). Os RNAs de interferência curta derivados da atividade de dicer têm tipicamente cerca de 21 a cerca de 23 nucleotídeos em comprimento e compreendem cerca de 19 duplexes de pares de bases (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188) . Dicer também foi implicada na remoção de RNAs temporais curtos de 21 e 22 nucleotídeos (stRNAs) do RNA precursor de estrutura conservada que são implicados no controle de tradução (Hutvagner, et al. , (2001) Science 293:834). A resposta de RNAi também fornece um complexo de endonuclease, comumente chamado de um complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) que media a divagem de RNA de fita única que tem complementaridade de sequência com a fita de antissentido do duplex de siRNA. A divagem do RNA de direcionamento ocorre
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381/525 no meio da região complementar à fita de antissentido do duplex de siRNA (Elbashir, et al. , (2001) Genes Dev. 15:188) . Além disso, a interferência de RNA também pode envolver silenciamento de gene mediado por RNA pequeno (por exemplo, miRNA), presumivelmente através de mecanismos celulares que regulam a estrutura de cromatina e previnem, assim, a transcrição de sequências de gene de direcionamento (consultar, por exemplo, Allshire, (2002) Science 297:1818-1819; Volpe, et al. , (2002) Science 297:1833-1837; Jenuwein, (2002) Science 297:2215-2218 e Hall, et al., (2002) Science 297:2232-2237). Como tal, moléculas de miRNA da divulgação podem ser usadas para mediar o silenciamento de genes por meio da interação com transcritos de RNA ou alternativamente por interação com sequências de genes particulares, em que tal interação resulta no silenciamento de genes ao nível da transcrição ou pós-transcrição.
[0389] Métodos e composições são adicionalmente fornecidos, os quais permitem um aumento no RNAi produzido a partir do elemento de silenciamento. Em tais modalidades, os métodos e composições empregam um primeiro polinucleotídeo que compreende um elemento de silenciamento para uma sequência de praga-alvo operacionalmente ligado a um promotor ativo na célula de planta; e, um segundo polinucleotídeo que compreende um elemento potenciador de supressor que compreende a sequência de praga-alvo ou uma variante ativa ou fragmento da mesma operacionalmente ligada a um promotor ativo na célula de planta. A expressão combinada do elemento de silenciamento com o elemento potenciador de supressor leva a uma amplificação aumentada do RNA inibidor produzido a partir do elemento de silenciamento relativamente àquele alcançável apenas com a expressão do
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382/525 elemento de silenciamento isolado. Além da amplificação aumentada da espécie de RNAi especifica em si, os métodos e as composições permitem adicionalmente a produção de uma população diversificada de espécies de RNAi que podem potenciar a eficácia de interrupção de expressão de gene-alvo. Como tal, quando o elemento potenciador de supressor é expresso em uma célula de planta em combinação com o elemento de silenciamento, os métodos e a composição podem permitir a produção sistêmica de RNAi em toda a planta; a produção de quantidades maiores de RNAi do que seria observado apenas com o construto de elemento de silenciamento isolado; e, a carga melhorada de RNAi no floema da planta, fornecendo, desse modo, o controle melhor de insetos de alimentação de floema por uma abordagem de RNAi. Desse modo, os vários métodos e composições fornecem métodos melhorados para a
entrega de RNA inibitório no organismo-alvo. Consultar, por
exemplo, a Publicação de Pedido de Patente dos EUA N°
2009/0188008 •
[0390] Conforme usado no presente documento, um
elemento potenciador de supressor compreende um
polinucleotí deo que compreende < a sequência-alvo a ser suprimida
ou um fragmento ativo ou variante da mesma. É reconhecido que o elemento potenciador de supressor não precisa ser idêntico à sequência de direcionamento, mas em vez disso, o elemento potenciador de supressor pode compreender uma variante da sequência de direcionamento, enquanto o elemento potenciador de supressor tiver identidade de sequência suficiente à sequência de direcionamento para permitir um nível aumentado do RNAi produzido pelo elemento de silenciamento sobre aquele alcançável apenas com a expressão do elemento de silenciamento. De modo
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383/525 similar, o elemento supressor pode compreender um fragmento da sequência de direcionamento, em que o fragmento é de comprimento suficiente para permitir um nível aumentado do RNAi produzido pelo elemento de silenciamento sobre aquele alcançável apenas com a expressão do elemento de silenciamento.
[0391] É reconhecido que múltiplos elementos potenciadores de supressor da mesma sequência de direcionamento ou de sequências de direcionamento diferentes ou de regiões diferentes da mesma sequência de direcionamento podem ser empregues. Por exemplo, os elementos potenciadores de supressor empregues podem compreender fragmentos da sequência de direcionamento derivados da região diferente da sequência de direcionamento (isto é, de 3'UTR, sequência de codificação, intron e/ou 5'UTR). Adicionalmente, o elemento potenciador de supressor pode ser contido em um cassete de expressão, conforme descrito em outro local no presente documento, e em modalidades específicas, o elemento potenciador de supressor está no mesmo ou em um vetor ou construto de DNA diferente do elemento de silenciamento. O elemento potenciador de supressor pode ser ligado de modo operacional a um promotor, conforme divulgado no presente documento. É reconhecido que o elemento potenciador de supressor pode ser expresso de modo constitutivo ou, alternativamente, pode ser produzido de uma maneira específica de estágio que emprega os vários promotores regulados de modo associado ao desenvolvimento ou preferidos para tecidos ou induzíveis que são discutidos em outro local no presente documento.
[0392] Em modalidades específicas, empregando tanto um elemento de silenciamento quanto o elemento potenciador de
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384/525 supressor, a produção sistêmica de RNAi ocorre ao longo da planta inteira. Em modalidades adicionais, a planta ou partes de planta da divulgação têm uma carga melhorada de RNAi no floema da planta em relação ao gue seria observado com a expressão do construto de elemento de silenciamento isoladamente e, desse modo, fornecem um controle melhor de insetos de alimentação de floema por uma abordagem de RNAi. Em modalidades específicas, as plantas, partes de plantas e células de plantas da divulgação podem ser adicionalmente caracterizadas como permitindo a produção de uma diversidade de espécies de RNAi gue podem potenciar a eficácia de interrupção de expressão do gene-alvo.
[0393] Em modalidades específicas, a expressão combinada do elemento de silenciamento e do elemento potenciador de supressor aumenta a concentração do RNA inibitório na célula de planta, planta, parte de planta, tecido ou floema de planta relativamente ao nível gue é alcançado guando o elemento de silenciamento é expresso isoladamente.
[0394] Conforme usado no presente documento, um nível aumentado de RNA inibitório compreende gualguer aumento significativo de modo estatístico no nível de RNAi produzido em uma planta gue tem a expressão combinada guando em comparação com uma planta de controle apropriada. Por exemplo, um aumento do nível de RNAi na planta, parte de planta ou célula de planta pode compreender um aumento de pelo menos cerca de 1%, cerca de l%-5%, cerca de 5% a 10%, cerca de 10% a 20%, cerca de 20% a 30%, cerca de 30% a 40%, cerca de 40% a 50%, cerca de 50% a 60%, cerca de 60 a 70%, cerca de 70% a 80%, cerca de 80% a 90%, cerca de 90% a 100% ou maior do nível de RNAi na planta, parte de planta, célula ou floema de planta guando em comparação com um
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385/525 controle apropriado. Em outras modalidades, o aumento no nível de RNAi na planta, parte de planta, célula ou floema de planta pode compreender um aumento de pelo menos cerca de 1 vez, cerca de 1 vez a 5 vezes, cerca de 5 vezes a 10 vezes, cerca de 10 vezes a 20 vezes, cerca de 20 vezes a 30 vezes, cerca de 30 vezes a 40 vezes, cerca de 40 vezes a 50 vezes, cerca de 50 vezes a 60 vezes, cerca de 60 vezes a 70 vezes, cerca de 70 vezes a 80 vezes, cerca de 80 vezes a 90 vezes, cerca de 90 vezes a 100 vezes ou maior do nível de RNAi na planta, parte de planta, célula ou floema de planta quando em comparação com um controle apropriado. Os exemplos de expressão combinada do elemento de silenciamento com o elemento potenciador de supressor para o controle de Percevejos e Lygus podem ser encontrados na Publicação de Pedido de Patente dos EUA N° 2011/0301223 e na Publicação de Pedido de Patente dos EUA N° 2009/0192117.
[0395] Algumas modalidades se referem à regulação descendente de expressão de genes de direcionamento em espécies de praga de inseto por moléculas de ácido ribonucleico (RNA) interferentes. A Publicação PCT WO 2007/074405 descreve métodos para inibir a expressão de genes de direcionamento em pragas invertebradas, incluindo besouro do Colorado da batata. A Publicação PCT WO 2005/110068 descreve métodos para inibir a expressão de genes de direcionamento em pragas invertebradas incluindo, em particular, verme da raiz do milho do oeste, como um meio para controlar a infestação de inseto. Adicionalmente, a Publicação PCT WO 2009/091864 descreve composições e métodos para a supressão de genes de direcionamento de espécies de praga de inseto, incluindo pragas do gênero Lygus. As moléculas de ácido nucleico incluindo RNAi para direcionar a subunidade de
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ATPase H vacuolar são úteis para controlar uma população de pragas de Coleópteros e infestação conforme descrito na Publicação de Pedido de Patente dos EUA N° 2012/0198586. A Publicação PCT WO 2012/055982 descreve um ácido ribonucleico (RNA ou RNA de fita dupla) que inibe ou regula de modo decrescente a expressão de um gene-alvo que codifica: uma proteína ribossômica de inseto, como a proteína ribossômica L19, a proteína ribossômica L40 ou a proteína ribossômica S27A; uma subunidade de proteassomo de inseto, como a proteína Rpn6, a Pros 25, a proteína Rpn2, a proteína de subunidade beta 1 de proteassomo ou a proteína Pros beta 2; um β-coatômero de inseto da vesícula COPI, o γ-coatômero da vesícula COPI, a proteína β'coatômero ou o ζ-coatômero da vesícula COPI; uma proteína Tetraspanina 2 A de inseto que é uma proteína de domínio transmembrana putativo; uma proteína de inseto que pertence à família de actina, como Actina 5C; uma proteína ubiquitina-5E de inseto; uma proteína Sec23 de inseto que é um ativador de GTPase envolvido em transporte de proteína intracelular; uma proteína plissada de inseto que é uma miosina não convencional que está envolvida em atividade motora; uma proteína torcicolo de inseto que está envolvida na regulação de encadeamento de mRNA alternativo nuclear; uma proteína de subunidade G de H+-ATPase vacuolar de inseto e uma Tbp-1 de inseto, como uma proteína de ligação a Tat. As Publicações de Pedido de Patente dos EUA 2012/029750, EUA 20120297501 e 2012/0322660 descrevem os ácidos ribonucleicos interferentes (RNA ou RNA de fita dupla) que funcionam mediante captação por uma espécie de praga de inseto para regular de modo descendente a expressão de um gene de direcionamento na dita praga de inseto, em que o RNA compreende
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387/525 pelo menos um elemento de silenciamento, em que o elemento de silenciamento é uma região de RNA de fita dupla que compreende fitas complementares aneladas, em que uma fita compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos parcialmente complementar a uma sequência de direcionamento de nucleotídeo dentro do gene de direcionamento. Publicação de Pedido de Patente dos EUA 2012/0164205 descreve alvos potenciais para ácidos ribonucleicos de filamento duplo de interferência para inibir pragas invertebradas que incluem: uma Sequência Homóloga a Chd3, uma Sequência Homóloga a Beta-Tubulina, uma Sequência Homóloga a V-ATPase de 40 kDa, uma Sequência Homóloga a EFla, uma Sequência Homóloga p28 Subunidade de Proteossoma 26S, uma Sequência Homóloga a Eopozido Hidrolase de Hormônio Juvenil, uma Sequência Homóloga à Proteína de Canal de Cloreto Dependente de Inchaço, uma Sequência Homóloga à Proteína Glicose-6-Fosfato 1-Dehidrogenase, uma Sequência Homóloga à Proteína Act42A, uma Sequência Homóloga a ADP-Ribosilação Fator 1, uma Sequência Homóloga a Proteína IIB de Fator de Transcrição, Sequências Homólogas a Quitinase, uma Sequência Homóloga a Enzima de Conjugação Ubiquitina, uma Sequência Homóloga de Gliceraldeído-3-Fosfato Dehidrogenase, uma Sequência Homóloga Ubiquitina B , um Homólogo de Estearase do Hormônio Juvenil e uma Sequência Homóloga de Alfa Tubulilna.
Uso em Controle Pesticida [0396] Os métodos gerais para empregar cepas que compreendem uma sequência de ácido nucleico das modalidades ou uma variante da mesma em controle pesticida ou na manipulação de outros organismos como agentes pesticidas são conhecidos na
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388/525 técnica. Consultar, por exemplo, a Patente dos EUA N° 5,039,523 e EP 0480762A2.
[0397] Os hospedeiros de microrganismos que são conhecidos por ocupar a fitosfera (filoplano, filosfera, rizosfera e/ou rizoplana) de uma ou mais culturas de interesse podem ser selecionados. Esses microrganismos são selecionados de modo a terem capacidade de competir de modo bem-sucedido no ambiente particular com os microrganismos do tipo selvagem, fornecer manutenção estável e expressão do gene que expressa o polipeptídeo PtIP-83 e, desejavelmente, fornecer proteção melhorada do pesticida contra degradação ambiental e inativação.
[0398] Tais microrganismos incluem bactérias, algas e fungos. São de particular interesse são microrganismos tais como bactérias, por exemplo, Pseudomonas, Erwinia , Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas , Methylius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, e Alcaligenes, fungos, particularmente leveduras, por exemplo, Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula, e Aureobasidium. São de particular interesse espécies bacterianas de fitosfera tais como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas chlororaphis, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacteria, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, Clavibacter xyli e Azotobacter vinelandii e espécies de levedura de fitosfera tais como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S.
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389/525 odorus, Kluyveromyces veronae, e Aureobasidium pollulans. São de particular interesse os microrganismos pigmentados. Os organismos hospedeiros de interesse particular incluem levedura, como Rhodotorula spp., Aureobasidium spp., Saccharomyces spp. (como S. cerevisiae), Sporobolomyces spp., organismos de filoplano, como Pseudomonas spp. (como P. aeruginosa, P. fluorescens, P. chlororaphis), Erwinia spp. e Flavobacterium spp., e outros tais organismos, incluindo Agrobacterium tumefaciens, E. coli, Bacillus subtilis, Bacillus cereus e semelhantes.
[0399] Genes que codificam os polipeptídeos PtIP-83 das modalidades podem ser introduzidos nos microrganismos que se multiplicam nas plantas (epífitas) para entregar polipeptídeos PtIP-83 para pragas alvo potenciais. Epífitos, por exemplo, podem ser bactérias gram-positivas ou gram-negativas.
[0400] As bactérias colonizadoras de raiz, por exemplo, podem ser isoladas da planta de interesse por métodos conhecidos na técnica. Especificamente, uma estirpe de Bacillus cereus que coloniza as raízes pode ser isolada das raízes de uma planta (ver, por exemplo, Handelsman et al. (1991) Appl. Environ.
Microbiol. 56:713-718). Genes que codificam o polipeptideo PtIP83 das modalidades podem ser introduzidos em um Bacillus cereus colonizador de raiz por métodos padrão conhecidos na técnica.
[0401] Genes que codificam polipeptídeos PtIP-83 podem ser introduzidos, por exemplo, no Bacillus colonizador de raiz por meio de eletrotransformação. Especificamente, genes que codificam os polipeptídeos PtIP-83 podem ser clonados em um vetor de transporte, por exemplo, pHT3101 (Lerecius, et al. , (1989) FEMS Microbiol. Letts. 60:211-218. O vetor do tipo bifuncional
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390/525 pHT3101 que contém a sequência de codificação para o gene do polipeptídeo PtIP-83 em particular pode, por exemplo, ser transformado no Bacillus colonizador de raiz por meio de eletroporação (Lerecius, et al. , (1989) FEMS Microbiol. Letts. 60:211-218).
[0402] Os sistemas de expressão podem ser projetados de modo que os polipeptideos de PtIP-83 sejam secretadas fora do citoplasma de bactérias gram-negativas, tais como E. coli, por exemplo. Vantagens de ter um polipeptídeo PtIP-83 secretado são:
(1) impedimentos de efeitos citotóxicos potenciais do polipeptídeo PtIP-83 expresso; e (2) melhoria na eficiência de purificação do polipeptídeo PtIP-83, o que inclui, mas sem limitação, uma eficiência aumentada na recuperação e purificação da proteína por caldo celular em volume e tempo e/ou custos diminuídos de recuperação e purificação por unidade de proteína.
[0403] Os polipeptideos de PtIP-83 podem ser feitos para secretarem em E. coli, por exemplo, fundindo-se um peptídeo de sinal de E. coli apropriado para a extremidade do terminal amino do polipeptídeo de PtIP-83. Os peptídeos sinal reconhecidos por E. coli podem ser encontrados em proteínas já conhecidas por serem secretadas em E. coli, por exemplo, a proteína OmpA (Ghrayeb, et al., (1984) EMBO J, 3:2437-2442) . OmpA é uma proteína principal da membrana externa de E. coli, e assim o seu peptídeo de sinal é pensado para ser eficiente no processo de translocação. Adicionalmente, o peptídeo sinal de OmpA não precisa ser modificado antes do processamento, conforme pode ser o caso para outros peptídeos sinal, por exemplo, peptídeo sinal de lipoproteína (Duffaud, et al. , (1987) Meth. Enzymol. 153:492).
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391/525 [0404] Os polipeptideos de PtIP-83 das modalidades podem ser fermentados em um hospedeiro bacteriano e a bactéria resultante processada e usada como uma aspersão microbiana do mesmo modo que as cepas Bt foram usadas como aspersões inseticidas. No caso de um polipeptideo PtIP-83 (que é secretado de Bacillus, o sinal de secreção é removido ou mutacionado com o uso de procedimentos na técnica. Tais mutações e/ou deleções impedem a secreção do(s) polipeptideo(s) PtIP-83 no meio de crescimento durante o processo de fermentação. O polipeptideo PtIP-83 é retido dentro da célula, e as células são então processadas para gerar o polipeptideo PtIP-83 encapsulado. Qualquer microrganismo adequado pode ser utilizado para este fim. Pseudomonas foram usados para expressar toxinas Bt como proteínas encapsuladas e as células resultantes processadas e aspergidas como um inseticida (Gaertner, et al. , (1993), in: Advanced Engineered Pesticides, ed. Kim) .
[0405] Alternativamente, o polipeptideo PtIP-83 é produzido introduzindo um gene heterólogo em um hospedeiro celular. A expressão do gene heterólogo resulta, direta ou indiretamente, na produção intracelular e manutenção do pesticida. Estas células são então tratadas em condições que prolongam a atividade da toxina produzida na célula quando a célula é aplicada ao ambiente da(s) praga(s) alvo. O produto resultante mantém a toxicidade da toxina. Esses polipeptideos PtIP-83 naturalmente encapsulados podem então ser formulados de acordo com técnicas convencionais para a aplicação no ambiente hospedando uma praga-alvo, por exemplo, solo, água e folhagem de plantas. Consultar, por exemplo, o documento n° EPA 0192319 e as referências citadas no mesmo.
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392/525
Composições Pesticidas [0406] Em algumas modalidades, os ingredientes ativos podem ser aplicados na forma de composições e podem ser aplicados na área de cultura ou planta a ser tratada, simultaneamente ou em sucessão, com outros compostos. Esses compostos podem ser fertilizantes, exterminadores de ervas daninhas, Crioprotetores, tensoativos, detergentes, sabões pesticidas, óleos inativos, polímeros e/ou formulações de transportadores de liberação no tempo ou biodegradáveis que permitem a dosagem de longa duração de uma área alvo após uma aplicação única da formulação. Os mesmos também podem ser herbicidas seletivos, inseticidas químicos, virucidas, microbiocidas, amebicidas, pesticidas, fungicidas, bactericidas, nematocidas, moluscicidas ou misturas de diversas dentre essas preparações, se desejado, junto com transportadores adicionais aceitáveis de modo agrícola, tensoativos ou adjuvantes de promoção de aplicação empregues de modo costumeiro na técnica da formulação. Os transportadores e adjuvantes adequados podem ser sólidos ou líquidos e correspondem às substâncias empregues de modo comum na tecnologia da formulação, por exemplo, substâncias minerais naturais ou regeneradas, solventes, dispersantes, agentes umectantes, acentuadores de pegajosidade, ligantes ou fertilizantes. De modo similar, as formulações podem ser preparadas em iscas comestíveis ou fabricadas em armadilhas para praga para permitir alimentação ou ingestão por uma praga alvo da formulação pesticida.
[0407] Os métodos de aplicação de um ingrediente ativo ou uma composição agroquímica que contém pelo menos um dos polipeptideos PtIP-83 produzidos pelas cepas bacterianas incluem
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393/525 aplicação em folha, revestimento de semente e aplicação em solo. 0 número de aplicações e a taxa de aplicação dependem da intensidade da infestação pela praga correspondente.
[0408] A composição pode ser formulada como um pó, poeira, pélete, grânulo, pulverização, emulsão, coloide, solução ou semelhantes, e pode ser preparada por meios convencionais, tais como dessecação, liofilização, homogeneização, extração, filtração, centrifugação, sedimentação ou concentração de uma cultura de células que compreende o polipeptídeo. Em todas as tais composições que contêm pelo menos um tal polipeptídeo pesticida, o polipeptídeo pode estar presente em uma concentração de cerca de 1% a cerca de 99% em peso.
[0409] As pragas de Lepidópteros, Diptera, Heteroptera, nematódeos, Hemiptera ou Coleópteros podem ser exterminadas ou reduzidas em números em uma dada área pelos métodos da divulgação ou podem ser aplicados de modo profilático em uma área ambiental para impedir a infestação por uma praga suscetível. Preferencialmente, a praga ingere ou faz contato com uma quantidade eficaz para pesticida do polipeptídeo. Quantidade eficaz para pesticida, conforme usado no presente documento, se refere a uma quantidade do pesticida que é capaz de exterminar pelo menos uma praga ou reduzir de modo notável o crescimento, alimentação ou desenvolvimento fisiológico normal de praga. Essa quantidade irá variar dependendo de tais fatores como, por exemplo, as pragas-alvo específicas a serem controladas, o ambiente específico, a localização, a planta, cultura ou local agrícola a ser tratado, as condições ambientais e o método, taxa, concentração, estabilidade e quantidade de aplicação de composição polipeptídica eficaz para pesticida. As formulações
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394/525 também podem variar em relação a condições climáticas, considerações ambientais e/ou frequência de aplicação e/ou severidade de infestação de praga.
[0410] As composições pesticidas descritas podem ser feitas formulando-se a célula bacteriana, cristal e/ou suspensão de esporo ou componente de proteína isolada com o carreador aceitável de modo agrícola desejado. As composições podem ser formuladas antes da administração em meios apropriados, como liofilizada, secada a frio, dessecada ou em um carreador, meio ou diluente aquoso adequado, como salino ou outro tampão. As composições formuladas podem estar na forma de uma poeira ou material granular ou uma suspensão em óleo (vegetal ou mineral) ou água ou emulsões de óleo/água ou como um pó molhável ou em combinação com qualquer outro material carreador adequado para aplicação agrícola. Os carreadores agrícolas adequados podem ser sólidos ou líquidos e são bem conhecidos na técnica. O termo carreador aceitável de modo agrícola abrange todos os adjuvantes, componentes inertes, dispersantes, tensoativos, agentes de adesividade, ligantes, etc. que são usados de modo comum na tecnologia de formulação de pesticida; esses são bem conhecidos por aqueles versados na técnica de formulação de pesticida. As formulações podem ser misturadas com um ou mais adjuvantes sólidos ou líquidos e preparados por vários meios, por exemplo, por mistura de modo homogêneo, mescla e/ou moagem da composição pesticida com adjuvantes adequados com o uso de técnicas de formulação convencional. As formulações e métodos de aplicação adequados são descritos na Patente dos EUA N° 6,468,523, incorporada ao presente documento a título de referência. As plantas também podem ser tratadas com uma ou mais
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395/525 composições químicas, incluindo um ou mais herbicidas, inseticidas ou fungicidas. As composições químicas exemplificativas incluem: Herbicidas de Frutas/Vegetais: Atrazina, Bromacil, Diuron, Glifosato, Linuron, Metribuzina, Simazina, Trifluralina, Fluazifope, Glufosinate, Halossulfuron Gowan, Paraquate, Propizamida, Setoxidim, Butafenacil, Halossulfuron, Indaziflam; Inseticidas de Frutas/Vegetais: Aldicarb, Bacillus thuriengiensis, Carbaril, Carbofurano, Clorpirifos, Cipermetrina, Deltametrina, Diazinon, Malation, Abamectina, Ciflutrina/beta-ciflutrina, Esfenvalerato, Lambdacialotrina, Acequinocil, Bifenazato, Metoxifenozida, Novaluron, Cromafenozida, Tiacloprida, Dinotefurano, FluaCripirim,
Tolfenpirad, Clotianidina, Espirodiclofeno, Gama-cialotrina, Espiromesifeno, Espinosad, Rinaxipir, Ciazipir, Espinoteram, Triflumuron, Espirotetramate, Imidacloprida, Flubendiamida, Tiodicarb, Metaflumizona, Sulfoxaflor, Ciflumetofeno, Cianopirafeno, Imidacloprida, Clotianidina, Tiametoxam,
Espinotoram, Tiodicarb, Flonicamida, Metiocarb, Emamectinabenzoato, Indoxacarb, Fostiazato, Fenamifos, Cadusafos,
Piriproxifeno, Fenbutatina-óxido, Hexitiazox, Metomil, 4—[ [ (6 — Cloropiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)ona; Fungicidas de Frutas/Vegetais: Carbendazim, Clorotalonil, EBDCs, Enxofre, Tiofanato metilico, Azoxistrobina, Cimoxanil, Fluazinam, Fosetil, Iprodiona, Cresoxim metilico, Metalaxil/mefenoxam, Trifloxistrobina, Etaboxam, Iprovalicarb, Trifloxistrobina, Fenexamida, Fumarato de oxpoconazol, ciazofamida, Fenamidona, Zoxamida, Picoxistrobina, Piraclostrobina, Ciflufenamida, Boscalida; Herbicidas de
Cereais: Isoproturon, Bromoxinil, loxinil, Fenóxidos,
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396/525
Clorossulfuron, Clodinafop, Diclofop, Diflufenican, Fenoxaprop,
Florasulam
Fluoroxipir
Metsulfuron
Triassulfuron
Flucarbazona, lodossulfuron, Propoxicarbazona, Picolinafeno,
Mesossulfuron, Beflubutamida, Pinoxadeno, Amidossulfuron,
Tifensulfuron
Metila
Tribenuron
Flupirsulfuron
Sulfossulfuron
Pirassulfotol
Piroxsulam
Flufenacet
Tralcoxidim, Piroxassulfona; Fungicidas de Cereais: Carbendazim,
Clorotalonil
Azoxistrobina
Ciproconazol
Ciprodinil
Fenpropimorf, Epoxiconazol, Cresoxim metilico, Quinoxifeno, Tebuconazol, Trifloxistrobina, Simeconazol, Picoxistrobina, Piraclostrobina, Dimoxistrobina, Protioconazol, Fluoxastrobina; Inseticidas____de____Cereais : Dimetoato, Lambda-cialotrina, Deltametrina, alfa-Cipermetrina, β-ciflutrina, Bifentrina, Imidacloprida, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprida, Acetamiprida, Dinetofurano, Clorpirifos, Metamidofos, Oxidemeton metilico, Pirimicarb, Metiocarb; Herbicidas de Mais: Atrazina, Alaclor, Bromoxinil, Acetoclor, Dicamba, Clopiralida, (S-)Dimetenamida, Glufosinato, Glifosato, Isoxaflutol, (S)Metolaclor, Mesotriona, Nicossulfuron, Primissulfuron, Rimsulfuron, Sulcotriona, Foramsulfuron, Topramezona, Tembotriona, Saflufenacil, Tiencarbazona, Flufenacet, Piroxassulfona; Inseticidas de Mais: Carbofurano, Clorpirifos, Bifentrina, Fipronil, Imidacloprida, Lambda-Cialotrina, Teflutrina, Terbufos, Tiametoxam, Clotianidina, Espiromesifeno, Flubendiamida, Triflumuron, Rinaxipir, Deltametrina, Tiodicarb, β-Ciflutrina, Cipermetrina, Bifentrina, Lufenuron, Triflumoron, Teflutrina, Tebupirimifos, Etiprol, Ciazipir, Tiacloprida, Acetamiprida, Dinetofurano, Avermectina, Metiocarb, Espirodiclof eno, Espirotetramate; Fungicidas___de Mais:
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Fenitropano, Tiram, Protioconazol, Tebuconazol, Trifloxistrobina; Herbicidas de Arroz: Butaclor, Propanil, Azimsulfuron, Bensulfuron, Cialofop, Daimuron, Fentrazamida, Imazossulfuron, Mefenacet, Oxaziclomefona, Pirazossulfuron, Piributicarb, Quinclorac, Tiobencarb, Indanofano, Flufenacet, Fentrazamida, Halossulfuron, Oxaziclomefona, Benzobiciclon, Piriftalida, Penoxsulam, Bispiribac, Oxadiargil, Etoxissulfuron, Pretilaclor, Mesotriona, Tefuriltriona, Oxadiazona, Fenoxaprop, Pirimissulfano; Inseticidas de Arroz: Diazinon, Fenitrotiona, Fenobucarb, Monocrotofos, Benfuracarb, Buprofezina, Dinotefurano, Fipronil, Imidacloprida, Isoprocarb, Tiacloprida, Cromafenozida, Tiacloprida, Dinotefurano, Clotianidina, Etiprol, Flubendiamida, Rinaxipir, Deltametrina, Acetamiprida, Tiametoxam, Ciazipir, Espinosad, Espinotoram, Benzoato de Emamectina, Cipermetrina, Clorpirifos, Cartap, Metamidofos, Etofenprox, Triazofos, 4-[ [ ( 6-Cloropiridin-3il)metil] (2,2-difluoretil) amino]furan-2(5H)-ona, Carbofurano, Benfuracarb; Fungicidas de Arroz: Tiofanato metílico, Azoxistrobina, Carpropamida, Edifenfos, Ferimzona, Iprobenfos, Isoprotiolano, Pencicuron, Probenazol, Piroquilon, Triciclazol, Trifloxistrobina, Diclocimet, Fenoxanil, Simeconazol, Tiadinil; Herbicidas de Algodão: Diuron, Fluometuron, MSMA, Oxifluorfeno, Prometrina, Trifluralina, Carfentrazona, Cletodim, Fluazifopbutila, Glifosato, Norflurazon, Pendimetalina, Piritiobac sódico, Trifloxissulfuron, Tepraloxidim, Glufosinato, Flumioxazina, Tidiazuron; Inseticidas de Algodão: Acefato, Aldicarb, Clorpirifos, Cipermetrina, Deltametrina, Malation, Monocrotofos, Abamectina, Acetamiprida, Benzoato de Emamectina, Imidacloprida, Indoxacarb, Lambda-Cialotrina, Espinosad,
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Tiodicarb, Gama-Cialotrina, Espiromesifeno, Piridalil,
Flonicamida, Flubendiamida, Triflumuron, Rinaxipir, BetaCiflutrina, Espirotetramat, Clotianidina, Tiametoxam,
Tiacloprida, Dinetofurano, Flubendiamida, Ciazipir, Espinosad, Espinotoram, gama Cialotrina, 4-[ [ (6-Cloropiridin-3il)metil] (2,2-difluoretil) amino]furan-2(5H)-ona, Tiodicarb, Avermectina, Flonicamida, Piridalil, Espiromesifeno,
Sulfoxaflor, Profenofos, Triazofos, Endossulfano; Fungicidas de Algodão: Etridiazol, Metalaxil, Quintozeno; Herbicidas de Soja: Alaclor, Bentazona, Trifluralina, Clorimuron Etilico,
Cloransulam Metílico, Fenoxaprop, Fomesafeno, Fluazifop,
Glifosato, Imazamox, Imazaquin, Imazetapir, (S-)Metolaclor,
Metribuzina, Pendimetalina, Tepraloxidim, Glufosinato; Inseticidas de Soja: Lambda-cialotrina, Metomil, Paration, Tiocarb, Imidacloprida, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprida, Acetamiprida, Dinetofurano, Flubendiamida, Rinaxipir, Ciazipir, Espinosad, Espinotoram, Benzoato de Emamectina, Fipronil, Etiprol, Deltametrina, β-Ciflutrina, gama e lambda Cialotrina, 4-[[(6-Cloropiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan2(5H)-ona, Espirotetramat, Espinodiclofeno, Triflumuron, Flonicamida, Tiodicarb, beta-Ciflutrina; Fungicidas de Soja: Azoxistrobina, Ciproconazol, Epoxiconazol, Flutriafol, Piraclostrobina, Tebuconazol, Trifloxistrobina, Protioconazol, Tetraconazol; Herbicidas de Beterraba sacarina: Cloridazon, Desmedifam, Etofumesato, Fenmedifam, Trialato, Clopiralida, Fluazifop, Lenacil, Metamitron, Quinmerac, Cicloxidim,
Triflussulfuron, Tepraloxidim, Quizalofope; Inseticidas de
Beterraba sacarina: Imidacloprida, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprida, Acetamiprida, Dinetofurano, Deltametrina, β
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Ciflutrina, gama/lambda Cialotrina, 4-[ [ ( 6-Cloropiridin-3il)metil] (2,2-difluoretil) amino]furan-2(5H)-ona, Teflutrina, Rinaxipir, Ciaxipir, Fipronil, Carbofurano; Herbicidas de Canola: Clopiralida, Diclofop, Fluazifop, Glufosinato, Glifosato, Metazaclor, Trifluralina Etametsulfuron, Quinmerac, Quizalofop, Cletodim, Tepraloxidim; Fungicidas de Canola: Azoxistrobina, Carbendazim, Fludioxonil, Iprodiona, Procloraz, Vinclozolina; Inseticidas de Canola: Organofosfatos de carbofurano, Piretroides, Tiacloprida, Deltametrina, Imidacloprida, Clotianidina, Tiametoxam, Acetamiprida, Dinetofurano, β-Ciflutrina, gama e lambda Cialotrina, tauFluvaleriato, Etiprol, Espinosad, Espinotoram, Flubendiamida, Rinaxipir, Ciazipir, 4-[[(6-Cloropiridin-3-il)metil](2,2— difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona.
[0411] Em algumas modalidades, o herbicida é Atrazina, Bromacil, Diuron, Clorsulfuron, Metsulfuron, Tifensulfuron Metil, Tribenuron, Acetoclor, Dicamba, Isoxaflutole, Nicosulfuron, Rimsulfuron, Piritiobaque-sódico, Flumioxazin, Clorimuron-Etil, Metribuzin, Quizalofop, S-metolaclor, Hexazinona ou combinações dao mesmos.
[0412] Em algumas modalidades, o inseticida é Esfenvalerato, Clorantraniliprol, Metomil, Indoxacarbe, Oxamil ou combinações dos mesmos.
Atividade pesticida e inseticida [0413] Praga inclui, mas sem limitação, insetos, fungos, bactérias, nematódeos, ácaros, carrapatos e semelhantes. Pragas de insetos incluem insetos selecionados dentre as ordens Coleoptera, Díptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga,
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Homoptera , Hemiptera,
Isopterar Anoplurar
Orthropterar Thysanopterar Dermaptera,
Siphonaptera, Trichoptera, etc., particularmente Lepidoptera e Coleoptera.
[0414] Aqueles versados na técnica reconhecerão que nem todos os compostos são igualmente eficazes contra todas as pragas. Os compostos das modalidades exibem atividade contra pragas de insetos, que podem incluir pragas agronômicas, florestais, de estufas, viveiros, plantas ornamentais, alimentos e fibras, de saúde pública e animal, de estrutura doméstica e comercial, domésticas e de produtos armazenados de importância econômica.
[0415] Larvas da ordem Lepidoptera incluem, mas sem limitação, lagartas-militares, larvas cortadoras, lagartas falsa-medideiras e lagartas da maçã-do-algodoeiro na família Noctuidae Spodoptera frugiperda JE Smith (lagarta-militar do outono); S. exígua Hübner (lagarta-militar da beterraba); S. litura Fabricius (lagarta cortadora do tabaco, lagarta-rosca de tabaco); Mamestra configurata Walker (lagarta-militar bertha); M. brassicae Linnaeus (traça do repolho); Agrotis ipsilon Hufnagel (lagarta-rosca); A. orthogonia Morrison (lagarta-rosca ocidental); A. subterrânea Fabricius (lagarta-rosca granulada); Alabama argillacea Hübner (curuquerê-do-algodoeiro) ; Trichoplusia ni Hübner (falsa-medideira da couve); Pseudoplusia includens Walker (falsa-medideira da soja); Anticarsia gemmatalis Hübner (lagarta-da-soja); Hypena scabra Fabricius (verme-de-trevo verde); Heliothis virescens Fabricius (lagarta da maçã); Pseudaletia unipuncta Haworth (lagarta-militar); Athetis mindara Barnes e Mcdunnough (lagarta-rosca de pele áspera); Euxoa messoria Harris (lagarta-rosca de lado escuro);
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Earias insulana Boisduval (lagarta capulho espinhosa); E. vittella Fabricius (lagarta capulho pontilhada); Helicoverpa armigera Hübner (lagarta capulho americana); H. zea Boddie (lagarta de espiga de milho ou lagarta de capulho de algodão);
Melanchra picta Harris (lagartas zebra); Egira (Xylomyges) curialis Grote (lagarta-rosca de citros); brocas, traça-dasparedes, larva das teias, lagartas cone e descarnadores da família Pyralidae Ostrinia nubilalis Hübner (broca de milho europeia); Amyelois transitella Walker (lagarta de laranja naval); Anagasta kuehniella Zeller (Traça do trigo mediterrâneo); Cadra cautella Walker (traça-do-cacau); Chilo suppressalis Walker (broca de caule de arroz); C. partellus, (broca de sorgo); Corcyra cephalonica Stainton (traça de arroz); Crambus caliginosellus Clemens (lagarta de teia de raiz de milho); C. teterrellus Zincken (lagarta tecedeira de teia de gramíneas); Cnaphalocrocis medinalis Guenée (traça tortricídea de arroz); Desmia funeralis Hübner (dobrador de folha de uva);
Diaphania hyalinata Linnaeus (lagarta de melão); D. nitidalis Stoll (lagarta de picles); Diatraea grandiosella Dyar (broca de milho do sudoeste), D. saccharalis Fabricius (broca de cana-deaçúcar) ; Eoreuma loftini Dyar (broca de arroz mexicano); Ephestia elutella Hübner (traça do tabaco (cacau); Galleria mellonella Linnaeus (traça grande da cera); Herpetogramma licarsisalis Walker (lagarta de teia de céspede); Homoeosoma electellum Hulst (traça de girassol); Elasmopalpus lignosellus Zeller (broca-do-colo) ; Achroia grisella Fabricius (traça da cera); Loxostege sticticalis Linnaeus (lagarta de teia de beterraba); Orthaga thyrisalis Walker (mariposa de teia da árvore do chá); Maruca testulalis Geyer (broca de feijão); Plodia
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402/525 interpunctella Hübner (Mariposa de refeição Indiana); Scirpophaga incertulas Walker (broca do tronco amarelo); Udea rubígalís Guenée (traça do aipo); e lagartas enroladeiras, lagartas de broto, lagartas de semente e lagartas de fruta na família Tortricidae Aderis gloverana Walsingham (lagarta de broto de cabeça preta do oeste); A. variana Fernald (lagarta de broto de cabeça preta do leste); Archips argyrospila Walker (lagarta enroladeira de árvore frutífera); A. rosana Linnaeus (lagarta enroladeira europeia); e outras espécies Archips, Adoxophyes orana Fischer von Rõsslerstamm (traça tortricídea dos frutos de verão); Cochylis hospes Walsingham (mariposa bandeada de girassol); Cydia latiferreana Walsingham (traça da avelaneira); C. pomondla Linnaeus (bichado das pomoideas); Platynota flavedana Clemens (lagarta enroladeira de folha variegada); P. stultana Walsingham (lagarta enroladeira de folha de omnívoro); Lobesia botrana Denis & Schiffermüller (Eudémis); Spilonota ocellana Denis & Schiffermüller (traça vermelha dos 10 gomos); Endopiza viteana Clemens (mariposa de bagas de uva); Eupoecilia ambiguella Hübner (cochilis); Bonagota salubricola Meyrick (lagarta enroladeira da maçã); Graphdita molesta Busck (traça oriental do pessegueiro); Suleima helianthana Riley (mariposa de broto de girassol); Argyrotaenia spp.; Choristoneura spp.
[0416] Outras pragas agronômicas selecionadas da ordem Lepidóptera incluem, mas sem limitação, Alsophila pometaria Harris (locustas); Anarsia lineatella Zeller (broca do pêssego); Anisota sanatoria J.E. Smith (lagarta de carvalho de listras laranjas); Antheraea pernyi Guérin-Méneville (Traça de Tussah de Carvalho Chinesa); Bombyx mori Linnaeus (Mariposa-de-seda);
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Bucculatrix thurberiella Busck (Lagarta mineradora das folhas); Colias eurytheme Boisduval (lagarta de alfalfa); Datana integerrima Grote & Robinson (lagarta de nogueira); Dendrolimus sibiricus Tschetwerikov (Mariposa-de-seda siberiana), Ennomos subsignaria Hübner (lagarta de olroErannis tiliaria Harris (mede-palmo de tília); Euproctis chrysorrhoea Linnaeus (maripora de rabo marrom); Harrisina americana Guérin-Méneville (skeletonizer de folha de uva); Hemileuca oliviae Cockrell (lagarta de faixa); Hyphantria cunea Drury (larva de teias de outono); Keiferia lycopersicella Walsingham (oxiúro de tomate); Lambdina fisceiiaria fisceiiaria Hulst (lagarta-enroladora de cicuta do leste); L. fisceiiaria lugubrosa Hulst (lagartaenroladora de cicuta do oeste); Leucoma salicis Linnaeus (mariposa de cetim); Lymantria dispar Linnaeus (mariposacigana); Manduca quinquemaculata Haworth (mariposa falcão de manchas, hornworm de tomate); M. sexta Haworth (hornworm de tomate, hornworm de tabaco); Operophtera brumata Linnaeus (Traça de inverno); Paleacrita vernata Peck (lagarta de gangrena de primavera); Papilio cresphontes Cramer (calda engolidora gigante, cachorro laranja); Phryganidia californica Packard (lagarta de carvalho da Califórnia); Phyllocnistis citrella Stainton (minerador de folha de citros); Phyllonorycter blancardella Fabricius (minerador de folha manchado); Pieris brassicae Linnaeus (borboleta grande branca); P. rapae Linnaeus (borboleta pequena branca); P. napi Linnaeus (borboleta branca com verde raiado); Platyptilia carduidactyla Riley (mariposa plumosa de alcachofra); Plutella xylostella Linnaeus (mariposa de costas de diamante); Pectinophora gossypiella Saunders lagarta capulho rosa); Pontia protodice Boisduval e Leconte
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404/525 (lagarta de repolho do sul); Sabulodes aegrotata Guenée (lagarta enroladora de onivoros); Schizura concínna J.E. Smith (lagarta arqueada vermelha); Sitotroga cerealella Olivier (mariposa Angoumois dos cereais); Thaumetopoea pítyocampa Schiffermuller (mariposa processionária do pinheiro); Tineola bisselliella Hummel (traça doméstica de riscas); Tuta absoluta Meyrick (lagarta mineira do tomate); Yponomeuta padella Linnaeus (mariposa arminho); Heliothis subflexa Guenée; Malacosoma spp. e Orgyia spp.
[0417] São de interesse as larvas e os adultos da ordem
Coleóptera incluindo gorgulhos das famílias Anthribidae, Bruchidae e Curculionidae (incluindo, mas sem limitação: Anthonomus grandis Boheman (bicudo-do-algodeiro); Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel (gorgulho da água do arroz); Sitophilus granarius Linnaeus (gorgulho do celeiro); S. oryzae Linnaeus (gorgulho do arroz); Hypera punctata Fabricius (gorgulho da folha de trevo); Cylindrocopturus adspersus LeConte (gorgulho do caule de girassol); Smicronyx fulvus LeConte (gorgulho vermelho da semente de girassol); S. sordidus LeConte (gorgulho cinzento da semente de girassol); Sfenophorus maidis Chittenden (gorgulho do mais)); besouros-pulga, besouros do pepino, vermes da raiz, besouros da folha, besouros da batata e lagartas mineiras na família Chrysomelidae (incluindo, mas sem limitação: Leptinotarsa decemlineata Say (besouro do Colorado da batata); Dlabrotlca virgifera virgifera LeConte (verme de raiz do milho ocidental); D. barber! Smith e Lawrence (verme de raiz do milho do norte); D. undecimpunctata howardi Barber (verme de raiz do milho do sul); Chaetocnema pulicaria Melsheimer (besouro-pulga do milho); Phyllotreta cruel ferae Goeze (besouro-pulga
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405/525 crucifero); Phyllotreta striolata (besouro-pulga listrado); Colaspis brunnea Fabricius (colaspis da uva); Oulema melanopus Linnaeus (besouro da folha de cereal); Zygogramma exclamation!s Fabricius (besouro do girassol)); besouros da família Coccinellidae (incluindo, mas sem limitação: Epilachna varivestis Mulsant (besouro mexicano do feijão)); Escaravelhos e outros besouros da família Scarabaeidae (incluindo, mas sem limitação: Popillia japonica Newman (besouro japonês); Cyclocephala borealis Arrow (escaravelho mascarado do norte, escaravelho branco); C. immaculata Olivier (escaravelho mascarado do sul, escaravelho branco); Rhizotrogus majalis Razoumowsky (escaravelho europeu); Phyllophaga crinita Burmeister (escaravelho branco); Ligyrus gibbosus De Geer (besouro da cenoura)); besouros de carpete da família Dermestidae; larvas-arame da família Elateridae, Eleodes spp., Melanotus spp.; Conoderus spp.; Limonius spp.; Agriotes spp. ; Ctenicera spp.; Aeolus spp.; besouros da casca da família Scolytidae e besouros da família Tenebrionidae.
[0418] Adultos e imaturos da ordem Diptera são de interesse, incluindo lagartas mineiras Agromyza parvicornis Loew (lagarta mineira da folha do milho); moscas (incluindo, mas sem limitação: Contarinia sorghicola Coquillett (mosca do sorgo); Mayetiola destructor Say (mosca Hessian); Sitodiplosis mosellana Géhin (mosca do trigo); Neolasioptera murtfeldtiana Felt, (mosca da semente do girassol)); moscas dos frutos (Tephritidae), Oscinella frit Linnaeus (moscas dos frutos); vermes (incluindo, mas sem limitação: Delia platura Meigen (verme da semente do milho); D. coarctata Fallen (mosca do bulbo do trigo) e outra Delia spp., Meromyza americana Fitch (verme do caule do trigo);
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Musca domestica Linnaeus (moscas domésticas); Fannia canicularis Linnaeus, F. femoralis Stein (moscas menores domésticas); Stomoxys calcitrans Linnaeus (moscas estáveis)); moscas da face, moscas de corno, moscas de sopro, Chrysomya spp.; Phormia spp. e outras pragas de moscas, moscas dos cavalos Tabanus spp.; moscas da família Gastrophilus spp.; Oestrus spp.; besouros do gado Hypoderma spp.; moscas dos veados Chrysops spp.; Melophagus ovinus Linnaeus (keds) e outra Brachycera, mosquitos Aedes spp.; Anopheles spp.; Culex spp.; moscas negras Prosimulium spp. ; Simulium spp.; moscas mordedoras, moscas da areia, esciarídeos e outros Nematocera.
[0419] Incluídos como insetos de interesse estão adultos e ninfas das ordens Hemiptera e Homóptera, tais como, mas sem limitação, adelgídeo da família Adelgidae, insetos de planta da família Miridae, cicadas da família Cicadidae, cigarrinhas, Empoasca spp.; da Cicadellidae, cigarrinhas de plantas das famílias Cixiidae, Flatidae, Fulgoroidea, Issidae e Delphacidae, cigarrinhas de árvore da família Membracidae, psilídeos da família Psyllidae, moscas-brancas da família Aleyrodidae, afídeos da família Aphididae, pfiloxera da família Phylloxeridae, cochonilhas-farinhentas da família Pseudococcidae, escalas das famílias Asterolecanidae, Coccidae, Dactylopiidae, Diaspididae, Eriococcidae Ortheziidae, Phoenicococcidae e Margarodidae, percevejo-de-renda da família Tingidae, percevejos da família Pentatomidae, percevejos-decincha, Blissus spp.; e outros percevejos de semente da família Lygaeidae, cigarrinhas da família Cercopidae, percevejos de polpa da família Coreidae e percevejos vermelhos e percevejos manchados de algodão da família Pyrrhocoridae.
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407/525 [0420] Os membros agronomicamente importantes da ordem Hemiptera incluem adicionalmente, mas sem limitação: Acyrthisiphon písum Harris (afídeo de ervilha); Aphis craccivora Koch (afídeo do feijão-frade); A. fabae Scopoli (afídeo do feijão preto); A. gossypii Glover (afídeo do algodão, afídeo do melão); A. maidiradicis Forbes (afídeo da raiz de milho) ; A. pomi De Geer (afídeo da maçã); A. spiraecola Patch (afídeo de spiraea); Aulacorthum solani Kaltenbach (afídeo de Dedalis); Chaetosiphon fragaefolii Cockerell (afídeo do morango); Diuraphis noxia Kurdjumov/Mordvilko (afídeo do trigo russo); Dysaphis plantaginea Paaserini (afídeo cinzento da macieira); Eriosoma lanigerum Hausmann (afídeo lanígero das macieiras); Brevicoryne brassicae Linnaeus (afídeo do repolho); Hyalopterus pruni Geoffroy (afídeo farinhento da ameixa); Lipaphis erysimi Kaltenbach (afídeo do nabo); Metopolophium dirrhodum Walker (afídeo do cereal); Macrosiphum euphorbiae Thomas (afídeo da batata); Myzus persicae Sulzer (afídeo do pessegueiro, afídeo verde do pessegueiro); Nasonovia ribisnigri Mosley (afídeo do alface); Pemphigus spp. (afídeos da raiz e afídeos de galha); Rhopalosiphum maidis Fitch (afídeo da folha do milho); R. padi Linnaeus (afídeo-da-cerejeira-brava); Schizaphis graminum Rondani (pulgão dos cereais); Sipha fiava Forbes (afídeo amarelo da cana-de-açúcar); Sitobion avenae Fabricius (afídeo inglês dos grãos); Therioaphis maculata Buckton (afídeo manchado da alfafa); Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe (afídeo preto dos citrinos) e T. citricida Kirkaldy (afídeo marrom dos citrinos); Adelges spp. (adelgídeos); Phylloxera devastatrix Pergande (filoxera de nogueira-pecã); Bemisia tabaci Gennadius (mosca-branca do tabaco, mosca-branca da batata doce); B.
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408/525 argentifolii Bellows & Perring (mosca-branca da folha de prata); Dialeurodes citri Ashmead (mosca-branca dos citrinos); Trialeurodes abutiloneus (mosca-branca de asa listrada) e T. vaporariorum Westwood (mosca-branca de estufa); Empoasca fabae Harris (cigarrinha da batata); Laodelphax striatellus Fallen (cigarrinha menor marrom); Macrolestes quadrílíneatus Forbes (cigarrinha de áster); Nephotettix cinticeps Uhler (cigarrinha verde); N. nigropictus Stâl (cigarrinha do arroz); Nilaparvata lugens Stâl (cigarrinha marrom); Peregrinus maidis Ashmead (cigarrinha do milho); Sogatella furcifera Horvath (cigarrinha de costas brancas); Sogatodes orizicola Muir (delfacideo do arroz); Typhlocyba pomaria McAtee (cigarrinha branca da macieira); Erythroneoura spp. (cigarrinhas da uva); Magicicada septendecim Linnaeus (cigarra periódica); Icerya purchase Maskell (pulgão branco); Quadraspidiotus pernícíosus Comstock (pulgão de São José); Pianococcus citri Risso (cochonilha dos citrinos); Pseudococcus spp. (outro complexo de cochonilha); Cacopsylla pyricola Foerster (psilídeo da pera); Trioza diospyri Ashmead (psilídeo do caqui).
[0421] Espécies agronomicamente importantes de interesse da ordem Hemiptera incluem, mas sem limitação: Acrosternum hilare Say (percevejo verde); Anasa tristis De Geer (escaravelho da abóbora); Blissus leucopterus leucopterus Say (escaravelho das gramíneas); Corythuca gossypii Fabricius (escaravelho da renda de algodão); Cyrtopeltis modesta Distant (escaravelho do tomate); Dysdercus suturellus Herrich-Schãffer (percevejo manchador de algodão); Euschistus servus Say (percevejo marrom); E. variolarius Palisot de Beauvois (percevejo manchado); Graptostethus spp. (complexo de
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409/525 escaravelhos de semente) ; Leptoglossus corculus Say (escaravelho de semente de pinheiro de pé em folha); Lygus líneolarís Palisot de Beauvois (escaravelho manchado da planta); L. Hesperus Knight (escaravelho ocidental manchado da planta); L. pratensís Linnaeus (escaravelho comum de prado); L. rugulípennís Poppius (escaravelho europeu manchado da planta); Lygocorís pabulínus Linnaeus (capsídeo verde comum); Nezara viridula Linnaeus (percevejo verde do sul); Oebalus pugnax Fabricius (percevejo do arroz); Oncopeltus fasciatus Dallas (escaravelho grande da asclépia); Pseudatomoscelis seriatus Reuter (pulga do algodão).
[0422] Adicionalmente, as modalidades podem ser eficazes contra Hemiptera como Calocoris norvegicus Gmelin (escaravelho do morango); Orthops campestris Linnaeus; Plesiocoris rugícollís Fallen (capsídeo da maçã); Cyrtopeltís modestus Distant (escaravelho do tomate); Cyrtopeltís notatus Distant (mosca); Spanagonlcus albofasclatus Reuter (pulga de marca branca); Diaphnocoris chlorionis Say (escaravelho de espinheiro-da-Virgínia); Labopidicola allll Knight (escaravelho da planta de cebola); Pseudatomoscelis seriatus Reuter (pulga do algodão); Adelphocoris rapidus Say (escaravelho rápido da planta); Poecilocapsus lineatus Fabricius (escaravelho da planta de quatro linhas); Nysius ericae Schilling (escaravelho falso das gramíneas); Nysius raphanus Howard (escaravelho falso das gramíneas); Nezara viridula Linnaeus (percevejo verde do sul); Eurygaster spp.; Coreidae spp.; Pyrrhocoridae spp.; Tinidae spp.; Blostomatidae spp.; Reduviidae spp. e Cimicidae spp.
[0423] Também são incluídos os adultos e as larvas da ordem Acari (ácaros), como Aceria tosichella Keifer (ácaro do enrolamento do trigo); Petrobia latens Müller (ácaro marrom do
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410/525 trigo); ácaros aranhas e ácaros vermelhos na família Tetranychidae, Panonychus ulmí Koch (ácaro vermelho europeu); Tetranychus urticae Koch (ácaro aranha de duas manchas); (T. mcdaníelí McGregor (ácaro McDaniel); T. cínnabarínus Boisduval (ácaro aranha carmim); T. turkestaní Ugarov & Nikolski (ácaro aranha do morango); ácaros planos na família Tenuipalpidae, Brevipalpus lewísí McGregor (ácaro plano dos citrinos); ácaros da ferugem e do broto na família Eriophyidae e outros ácaros de alimentação foliar e ácaros importantes na saúde humana e animal, isto é, os ácaros de poeira na família Epidermoptidae, ácaros do folículo na família Demodicidae, ácaros dos grãos na família Glycyphagidae, carrapatos na ordem Ixodidae. Ixodes scapularís Say (carrapato de veado); I. holocyclus Neumann (carrapato da paralisia australiana); Dermacentor variabilis Say (carrapato do cão americano); Amblyomma americanum Linnaeus (carrapato lone star) e ácaros de sarna e coceira nas famílias Psoroptidae, Pyemotidae e Sarcoptidae.
[0424] As pragas de inseto da ordem Thysanura são de interesse, tal como Lepisma saccharins Linnaeus (traça); Thermobia domestica Packard (tesourinha).
[0425] As pragas de artrópodes adicionais abrangidas incluem: aranhas na ordem Araneae como Loxosceles reclusa Gertsch e Mulaik (aranha reclusa marrom) e a Latrodectus mactans Fabricius (aranha viúva negra) e centopeias na ordem Scutigeromorpha como Scutigera coleoptrata Linnaeus (centopeia doméstica).
[0426] As pragas de inseto de interesse incluem a superfamília de percevejos e outros insetos relacionados incluindo, mas sem limitação, espécies que pertencem à família
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Pentatomidae (Nezara viridula , Halyomorpha halys, Piezodorus guildini, Euschistus servus, Acrosternum hilare, Euschistus heros, Euschistus tristigmus, Acrosternum hilare, Dichelops furcatus, Dichelops melacanthus, e Bagrada hilaris (Bagrada Bug)), à familia Plataspidae (Megacopta cribraria - Bean plataspid) e à família Cydnidae (Scaptocoris castanea percevejo da raiz) e espécies de Lepidópteros incluindo, mas sem limitação: traça-das-crucíferas, por exemplo, Helicoverpa zea Boddie; lagarta falsa-medideira, por exemplo,, Pseudoplusia includens Walker e lagarta-da-soja por exemplo, Anticarsia gemmatalis Hübner.
[0427] Os métodos para medir a atividade pesticida são bem conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Czapla e Lang, (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews, et al. , (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone, et al., (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293 e Patente dos EUA N° 5,743,477, todos os quais são incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade.. Geralmente, a proteína é misturada e usada em ensaios de alimentação. Consultar, por exemplo Marrone, et al. , (1985) J. of Economic Entomology 78:290293. Tais ensaios podem incluir colocar plantas em contato com uma ou mais pragas e determinar a capacidade da planta para sobreviver e/ou causar o extermínio das pragas.
[0428] Nematódeos incluem nematódeos parasitários tais como nematódeos das galhas radiculares, formadores de cistos, e formadores de lesões, incluindo Heterodera spp., Meloidogyne spp., e Globodera spp.; particularmente membros dos nematódeos formadores de cistos, incluindo, mas não se limitando a, Heterodera glycines (nematódeo formador de cistos da soja);
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Heterodera schachtii (nematódeo formador de cistos da beterraba); Heterodera avenae (nematódeo formador de cistos de cereais); e Globodera rostochíensís e Globodera pailida (nematódeos formadores de cistos da batata). Os nematódeos formadores de lesões incluem Pratylenchus spp.
Tratamento de Sementes [0429] Para proteger e aprimorar as tecnologias de produção de rendimento e traço, as opções de tratamento de semente podem fornecer flexibilidade de plano de cultura adicional e controle rentável contra insetos, ervas daninhas e doenças. Material de semente pode ser tratado, tipicamente tratado na superfície, com uma composição que compreende combinações de herbicidas químicos ou biológicos, fitoprotetores herbicidas, inseticidas, fungicidas, inibidores e potenciadores de germinação, nutrientes, reguladores e ativadores de crescimento de planta, bactericidas, nematocidas, avicidas e/ou moluscicidas. Estes compostos são tipicamente formulados juntos com transportadores, tensoativos ou adjuvantes de promoção de aplicação adicionais empregues de modo costumeiro na técnica da formulação. Os revestimentos podem ser aplicados impregnando o material de propagação com uma formulação líquida ou por revestimento com uma formulação úmida ou seca combinada. Os exemplos dos vários tipos de compostos que podem ser usados como tratamentos de semente são fornecidos em The Pesticide Manual: A World Compendium, C.D.S. Tomlin Ed., publicado por British Crop Production Council, que é incorporado no presente documento a título de referência.
[0430] Alguns tratamentos de sementes que podem ser usados em sementes de cultura incluem, porém sem limitação, um
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413/525 ou mais dentre ácido abscísico, acibenzolar-S-metila, avermectina, amitrol, azaconazol, azospirilo, azadiractina, azoxistrobina, Bacílus spp. (incluindo um ou mais dentre as espécies cereus, firmus, megateríum, pumílísr sphaerícus, subtílís e/ou thuringiensis), Bradírhízobíum spp. (incluindo um ou mais dentre betae, canaríense, elkaníí, íríomotense, japonícum, líaonigense, pachyrhízí e/ou yuanmingense), captana, carboxina, quitosano, clotianidina, cobre, ciazipir, difenoconazol, etidiazol, fipronil, fludioxonil, fluoxastrobina, fluquinconazol, flurazol, fluxofenim, proteína harpina, imazalil, imidacloprida, ipconazol, isoflavenoides, lipo-quito-oligossacarídeo, mancozeb, manganês, maneb, mefenoxam, metalaxil, metconazol, miclobutanil, PCNB, penflufeno, penicílio, pentiopirad, permetrina, picoxistrobina, protioconazol, piraclostrobina, rinaxipir, S-metolaclor, saponina, sedaxano, TCMTB, tebuconazol, tiabendazol, tiametoxam, tiocarb, tiram, tolclofos-metila, triadimenol, tricoderma, trifloxistrobina, triticonazol e/ou zinco. Revestimento de semente PCNB se refere ao Número de Registro EPA 00293500419, que contém quintozeno e terrazol. TCMTB se refere a 2(tiocianometiltio)benzotiazol.
[0431] As variedades de semente e sementes com traços transgênicos específicos podem ser testadas para determinar quais opções de tratamento de semente e taxas de aplicação podem complementar tais variedades e traços transgênicos de modo a melhorar o rendimento. Por exemplo, uma variedade com potencial de rendimento satisfatório, mas a suscetibilidade à ferrugem do milho pode beneficiar do uso de um tratamento de semente que fornece a proteção contra ferrugem do milho, uma variedade com
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414/525 potencial de rendimento satisfatório, mas a suscetibilidade a nematódeo formador de cisto pode se beneficiar a partir do uso de um tratamento de semente que fornece proteção contra nematódeo formador de cisto, e assim por diante. De modo semelhante, uma variedade que abrange um traço transgênico que confere resistência a inseto pode se beneficiar a partir do segundo modo de ação conferido pelo tratamento de semente, uma variedade que abrange um traço transgênico que confere resistência a herbicida pode se beneficiar a partir de um tratamento de semente com um fitoprotetor que potência a resistência de plantas àquele herbicida, etc. Adicionalmente, o estabelecimento de raiz satisfatório e a emergência inicial resultantes do uso apropriado de um tratamento de semente podem resultar em um uso de nitrogênio mais eficaz, uma habilidade melhor para resistir à seca e um aumento geral em potencial de rendimento de uma variedade ou variedades que contêm um certo traço quando combinadas com um tratamento de semente.
Métodos para exterminar uma praga de inseto e controlar uma população de insetos [0432] Em algumas modalidades, os métodos são fornecidos para exterminar uma praga de inseto compreendendo colocar a praga de inseto em contato com uma quantidade eficaz de inseticida de um polipeptídeo recombinante PtIP-83. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para exterminar uma praga de insetos, compreendendo colocar a praga de insetos em contato com uma quantidade eficaz em termos inseticidas de uma proteína pesticida recombinante de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:
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21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO: 754, SEQ ID NO
755, SEQ ID NO: 756 , SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: : 758, SEQ ID NO
759, SEQ ID NO: 760 , SEQ ID NO: 761, SEQ ID NO: : 762, SEQ ID NO
763, SEQ ID NO: 764 , SEQ ID NO: 765, SEQ ID NO: : 766, SEQ ID NO
767, SEQ ID NO: 768 , SEQ ID NO: 769 ou uma sua variante .
[0433] Em algumas modalidades, os métodos são fornecidos para exterminar uma praga de inseto compreendendo colocar a praga de inseto em contato com uma quantidade eficaz de inseticida de um polipeptideo recombinante PtIP-83 da SEQ ID NO: 236-299, SEQ ID NO: 334-367, SEQ ID NO: 398-427, SEQ ID NO: 518-607, SEQ ID NO: 640-645 e SEQ ID NO: 728-737.
[0434] Em algumas modalidades, os métodos são fornecidos para exterminar uma praga de inseto compreendendo colocar a praga de inseto em contato com uma quantidade eficaz em termos inseticidas de um polipeptideo recombinante PtIP-83 compreendendo uma sequência de aminoácido de qualquer uma de SEQ ID NO: 786-888 ou uma sua variante.
[0435] Em algumas modalidades, métodos são fornecidos para controlar uma população de praga de inseto compreendendo colocar a população de praga de inseto em contato com uma quantidade eficaz em termos inseticidas de um polipeptideo PtIP83 recombinante. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para controlar uma população de pragas de insetos compreendendo colocar a população de praga de insetos em contato com uma quantidade eficaz em termos inseticidas de um polipeptideo PtIP83 recombinante de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO: 754, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756,
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SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NO: 760,
SEQ ID NO: 761, SEQ ID NO: 762, SEQ ID NO: 763, SEQ ID NO: 764,
SEQ ID NO: 765, SEQ ID NO: 766, SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO: 768,
SEQ ID NO: 769 ou uma sua variante . Conforme usado no presente
documento, controlar uma população de pragas ou controla uma praga se refere a qualquer efeito em uma praga que resulta na limitação do dano que a praga causa. Controlar uma praga inclui, mas sem limitação, exterminar a praga, inibir o desenvolvimento da praga, alterar a fertilidade ou crescimento da praga de tal maneira que a praga faça menos danos à planta, diminuir o número de descendentes produzidos, produzir pragas menos adaptadas, produzir pragas mais suscetíveis a ataque de predadores ou impedir as pragas de se alimentarem da planta.
[0436] Em algumas modalidades, os métodos são fornecidos para controlar uma população de praga de inseto compreendendo colocar a população de praga de inseto em contato com uma quantidade eficaz em termos de inseticida de um polipeptídeo PtIP-83 recombinante de qualquer uma de SEQ ID NO: 236-299, SEQ ID NO: 334-367, SEQ ID NO: 398-427, SEQ ID NO: 518607, SEQ ID NO: 640-645 e SEQ ID NO: 728-737.
[0437] Em algumas modalidades, os métodos são fornecidos para controlar uma população de praga de inseto compreendendo colocar a população de praga de inseto em contato com uma quantidade eficaz em termos de inseticida de um polipeptídeo PtIP-83 recombinante de qualquer uma de SEQ ID NO: 786-888 ou uma sua variante.
[0438] Em algumas modalidades, os métodos são fornecidos para proteger uma planta contra uma praga de inseto, compreendendo expressar na planta ou célula da mesma pelo menos
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417/525 um polinucleotídeo recombinante que codifica um polipeptídeo PtIP-83. Em algumas modalidades, os métodos são fornecidos para proteger uma planta de uma praga de insetos, compreendendo expressar na planta ou célula da mesma um polinucleotídeo recombinante que codifica o polipeptídeo PtIP-83 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID
NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO:
754, SEQ ID NO: : 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO:
758, SEQ ID NO: : 759, SEQ ID NO: 760, SEQ ID NO: 761, SEQ ID NO:
762, SEQ ID NO: : 763, SEQ ID NO: 764, SEQ ID NO: 765, SEQ ID NO:
766, SEQ ID NO : 767, SEQ ID NO: 768 ou SEQ ID NO: 769 ou í suas
variantes •
[0439] Em algumas modalidades, os métodos são
fornecidos para proteger uma planta contra uma praga de inseto, compreendendo expressar na planta ou célula da mesma pelo menos um polinucleotídeo recombinante que codifica um polipeptídeo PtIP-83. Em algumas modalidades, os métodos são fornecidos para proteger uma planta de uma praga de inseto compreendendo expressar na planta ou célula da mesma um polinucleotídeo
recombinante que codifica um polipeptídeo PtIP-83 de qualquer
uma de SEQ ID NO : 236-299, SEQ ID NO: 334-367, SEQ ID NO: 398-
427, SEQ ID NO: 518-607, SEQ ID NO: 640-645 e SEQ ID NO: 728-
737 .
[0440] Em algumas modalidades, os métodos são fornecidos para proteger uma planta contra uma praga de inseto, compreendendo expressar na planta ou célula da mesma pelo menos um polinucleotídeo recombinante que codifica um polipeptídeo PtIP-83. Em algumas modalidades, os métodos são fornecidos para
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418/525 proteger uma planta de uma praga de inseto compreendendo expressar na planta ou célula da mesma um polinucleotídeo recombinante que codifica um polipeptídeo PtIP-83 de qualquer uma de SEQ ID NO: 786-888 ou uma sua variante.
Estratégias de Gerenciamento de Resistência a Insetos (IRM) [0441] A expressão de δ-endotoxinas de B. thuríngíensís em plantas de milho transgênicas demonstrou ser um meio eficaz para controlar pragas de insetos importantes para a agricultura (Perlak, et al. , 1990; 1993) . No entanto, os insetos evoluíram, de modo que se tornaram resistentes a δ-endotoxinas de B. thuringiensis expressas em plantas transgênicas. Tal resistência, se disseminada, limitará claramente o valor comercial de germoplasma que contém genes codificadores de tais δ-endotoxinas de B. thuringiensis.
[0442] Uma maneira para aumentar a duração da eficácia dos inseticidas transgênicos contra pragas-alvo e reduzir ao mesmo tempo o desenvolvimento de pragas resistentes a inseticidas é fornecer plantas de cultura refúgio (uma seção de culturas/milho não inseticidas) não transgênico (isto é, expressando proteínas não inseticidas) para uso com culturas transgênicas que produzem uma proteína inseticida única ativa contra pragas-alvo. A United States Environmental Protection Agency (epa. gov/oppbppdl/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm, que pode ser acessado com o uso do prefixo www) publica as exigências para o uso com culturas transgênicas que produzem uma única proteína Bt ativa contra pragas-alvo. Além disso, a National Corn Growers Association, em seu sítio da web: (ncga. com/inseto-resistência-management-fact-sheet-bt-corn, que
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419/525 pode ser acessado com o uso do prefixo www) também fornece orientação similar em relação a exigências de refúgio. Fatores econômicos restrigem esta abordagem a perdas para insetos dentro da área de refúgio, os refúgios maiores podem reduzir o rendimento geral.
[0443] Outra maneira para aumentar a duração da eficácia dos inseticidas transgênicos contra pragas-alvo e reduzir ao mesmo tempo o desenvolvimento de pragas resistentes a inseticidas consiste em ter um depósito de genes inseticidas que são eficazes contra grupos de pragas de insetos e que manifestam seus efeitos através de modos de ação diferentes em que cada gene podería ser implantado contra um número fixo de gerações de insetos antes de outro gene ser implantado.
[0444] A expressão em uma planta de duas ou mais composições inseticidas tóxicas para a mesma espécie de inseto, em que cada inseticida é expresso em níveis eficazes, será outra maneira para alcançar o controle do desenvolvimento de resistência. Isso tem base no princípio de que a evolução de resistência contra dois modos separados de ação é muito mais improvável do que contra apenas um. Roush, por exemplo, destaca estratégias com duas toxinas, também chamadas de formação de pirâmide ou empilhamento para o gerenciamento de culturas transgênicas inseticidas. (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353:1777-1786). 0 empilhamento ou formação de pirâmide de duas proteínas diferentes, cada uma eficaz contra as pragas-alvo e com pouca ou nenhuma resistência cruzada, pode permitir uso de um refúgio menor. A US Environmental Protection Agency exige significativamente menos refúgio estruturado (geralmente 5%) de milho não Bt a ser plantado em relação aos
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420/525 produtos de traço único (geralmente 20%) . Há várias maneiras para fornecer os efeitos de IRM de um refúgio, incluindo vários padrões de plantio geométricos nos campos e misturas de sementes em bolsas, conforme discutido adicionalmente por Roush.
[0445] As toxinas da família Cry de Bacillus thuringiensis geralmente mostram uma ação de mecanismo de duas fases começando com a ativação proteolítica no intestino médio do inseto e depois a ligação específica às células intestinais do intestino médio seguido pela formação de poros citolíticos (Griffitts e Aroian, BioEssays, 2005) . Esta segunda etapa inclui o local de ação (o local em que a toxina se liga e o modo de ação, a formação dos poros. Geralmente, as toxinas de Bt Cry podem mostrar diferentes sítios de ação, mas todas mostram o mesmo modo de ação através da formação de poros. Um mecanismo empregue para atrasar a resistência de insetos de uma toxina para outra inclui o empilhamento de duas toxinas Bt Cry diferentes com o mesmo modo de ação, mas diferentes sítios de ação, tal como determinado por ensaios de ligação competitivos heterólogos (Consultar Ferre e Van Rie, Annu. Rev. Entomol. 2002).
[0446] Em algumas modalidades, o polipeptídeo PtIP-83 da divulgação são úteis como uma estratégia de gerenciamento de resistência a inseto em combinação (isto é, em pirâmide) com outras proteínas pesticidas incluem, mas sem limitação, toxinas Bt, proteínas inseticidas de Xenorhabdus sp. ou Photorhabdus sp. e semelhantes.
[0447] São fornecidos os métodos para controlar infestação (ou infestações) de insetos Lepidópteros e/ou Coleópteros em uma planta transgênica que promovem gerenciamento
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421/525 de resistência a inseto, compreendendo expressar na planta pelo menos duas proteínas inseticidas diferentes que têm modos diferentes de ação.
[0448] Em algumas modalidades, nos métodos de controle de infestação de inseto Lepidóptera e/ou Coleóptera em uma planta transgênica e promoção de gerenciamento de resistência a insetos, a pelo menos um dentre as proteínas inseticidas compreende um polipeptídeo PtIP-83 inseticida para insetos na ordem Lepidóptera e/ou Coleóptera.
[0449] Em algumas modalidades, os métodos para controlar a infestação de insetos Lepidóptera e/ou Coleóptera em uma planta transgênica e promover o gerenciamento de resistência a insetos de pelo menos uma das proteínas inseticidas compreende um polipeptídeo PtIP-83 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID
NO: 5, SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO : 11, SEQ IE ) NO: 13,
SEC ) ID NO: 15, SEQ ID NO: 1 7, SEQ ID NO: 19, SEQ i ID NO: 21, SEQ
ID NO: 23, SEQ Ί :d 1 40: 716, SEQ ID NO: 754, SEQ ID NO: 755, SEQ
ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ
ID NO: 760, SEQ ID NO: 761, SEQ ID NO: 762, SEQ ID NO: 763, SEQ
ID NO: 764, SEQ ID NO: 765, SEQ ID NO: 766, SEQ ID NO: 767, SEQ
ID NO: 768, SEQ ID NO : 769 ou suas variantes, inseticidas para
insetos na ordem Lepidóptera e/ou Coleóptera.
[0450] Em algumas modalidades, nos métodos de controle de infestação de inseto Lepidóptera e/ou Coleóptera em uma planta transgênica e de promoção de gerenciamento de resistência a inseto, a pelo menos uma das proteínas inseticidas compreende um polipeptídeo PtIP-83 de qualquer uma de SEQ ID NO: 236-299, SEQ ID NO: 334-367, SEQ ID NO: 398-427, SEQ ID NO: 518-607, SEQ ID NO: 640-645 e SEQ ID NO: 728-737.
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422/525 [0451] Em algumas modalidades, os métodos de controle de infestação de inseto Lepidóptera e/ou Coleóptera em uma planta transgênica e de promoção de gerenciamento de resistência a insetos compreendem expressar na planta transgênica um polipeptídeo PtIP-83 e uma proteína Cry inseticida para insetos na ordem Lepidóptera e/ou Coleóptera que têm diferentes modos de ação.
[0452] Em algumas modalidades, os métodos de controle de infestação de inseto Lepidóptera e/ou Coleóptera da uma planta transgênica e de promoção de gerenciamento de resistência a insetos compreendem na planta transgênica um polipeptídeo PtlP-
83 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 5, , SEQ ID NO: 7,
SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, Í 3EQ
ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 , SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: : 23, SEQ ID
NO: 716, SEQ ID NO: 754, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID
NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NO: 760, SEQ ID
NO: 761, SEQ ID NO: 762, SEQ ID NO: 763, SEQ ID NO: 764, SEQ ID
NO: 765, SEQ ID NO: 766, SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO: 768, SEQ ID
NO: 769 ou suas variantes e uma proteína Cry inseticida para insetos na ordem Lepidóptera e/ou Coleóptera que têm diferentes modos de ação.
[0453] Também são fornecidos métodos de redução da probabilidade de emergência de resistência a insetos Lepidópteros e/ou Coleópteros para plantas transgênicas que expressam nas plantas proteínas inseticidas para controlar as espécies de inseto, compreendendo a expressão de um polipeptídeo PtIP-83 inseticida para as espécies de inseto em combinação com uma segunda proteína inseticida para as espécies de inseto que têm diferentes modos de ação.
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423/525 [0454] Também são fornecidos meios para o gerenciamento eficaz de resistência a insetos Lepidópteros e/ou Coleópteros de plantas transgênicas compreendendo coexpressar em altos níveis nas plantas duas ou mais proteínas inseticidas tóxicas para insetos Lepidópteros e/ou Coleópteros, mas cada uma exibe um modo diferente de efetuar a sua atividade de extermínio, em que as duas ou mais proteínas inseticidas compreendem um polipeptídeo PtIP-83e uma proteína Cry. Também são fornecidos meios para o gerenciamento eficaz de resistência a insetos Lepidópteros e/ou Coleópteros de plantas transgênicas compreendendo coexpressar em altos níveis nas plantas duas ou mais proteínas inseticidas tóxicas para insetos Lepidópteros e/ou Coleópteros, mas cada uma exibe um modo diferente de efetuar sua atividade de extermínio, em que as duas ou mais proteínas inseticidas compreendem um polipeptídeo PtIP-83 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID
NO: 11, ; SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 , SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO
19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO
754, SEQ ID NO: : 755, SEQ ID NO : 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO
758, SEQ ID NO: : 759, SEQ ID NO : 760, SEQ ID NO: 761, SEQ ID NO
762, SEQ ID NO: : 763, SEQ ID NO : 764, SEQ ID NO: 765, SEQ ID NO
766, SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO: 768, SEQ ID NO: 769 e uma proteína
Cry.
[0455] Além disso, os métodos são fornecidos para obter aprovação regulamentar para o plantio ou comercialização de plantas que expressam proteínas inseticidas para insetos da ordem Lepidóptera e/ou Coleóptera, compreendendo a etapa de se referir a, apresentar ou confiar em dados de ligação de ensaio de inseto que mostram que o polipeptídeo polipeptídeo PtIP-83
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424/525 não compete com os sítios de ligação para proteínas Cry em tais insetos. Além disso, são fornecidos métodos para obter aprovação regulamentadora para plantio ou comercialização de plantas que expressam proteínas inseticidas para insetos da ordem Lepidóptera e/ou Coleóptera que compreendem a etapa de se referir, submeter ou depender dos dados de ligação de ensaio de insetos que mostram que o polipeptideo PtIP-83 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID
NO: 11, ; SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 , SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO
19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO
754, SEQ ID NO: : 755, SEQ ID NO : 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO
758, SEQ ID NO: : 759, SEQ ID NO : 760, SEQ ID NO: 761, SEQ ID NO
762, SEQ ID NO: : 763, SEQ ID NO : 764, SEQ ID NO: 765, SEQ ID NO
766, SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO: 768, SEQ ID NO: 769 ou sua variante não compete com sítios de ligação para proteínas Cry em tais insetos.
Métodos para Aumentar o Rendimento de Plantas [0456] Os métodos para aumentar o rendimento de planta são fornecidos. Os métodos compreendem fornecer uma planta ou célula de planta que expressa um polinucleotídeo codificador da sequência de polipeptideo pesticida divulgada no presente documento e cultivar a planta ou uma semente da mesma em um campo infestado com uma praga contra a qual o polipeptideo tem atividade pesticida. Em algumas modalidades, o polipeptideo tem atividade pesticida contra uma praga de Lepidópteros, Coleópteros, Dípteros, Hemípteros ou nematódeos e o campo é infestado com uma praga de Lepidópteros, Hemípteros, Coleópteros, Dípteros ou nematódeos.
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425/525 [0457] Conforme definido no presente documento, o rendimento da planta se refere à qualidade e/ou quantidade de biomassa produzida pela planta. Biomassa, conforme usado no presente documento, se refere a qualquer produto de planta medido. Um aumento na produção de biomassa é qualquer melhora no rendimento do produto de planta medido. Aumentar o rendimento de planta tem diversas aplicações comerciais. Por exemplo, aumentar a biomassa de folha de planta pode aumentar o rendimento de vegetais com folhas para consumo humano ou animal. Adicionalmente, o aumento de biomassa de folha pode ser usado para aumentar a produção de produtos farmacêuticos ou industriais derivados de planta. Um aumento do rendimento pode compreender qualquer aumento estatisticamente significativo incluindo, mas sem limitação, pelo menos um aumento de 1%, pelo menos um aumento de 3%, pelo menos um aumento de 5%, pelo menos um aumento de 10%, pelo menos um aumento de 20%, pelo menos de 30%, pelo menos de 50%, pelo menos de 70%, pelo menos de 100% ou um aumento maior do rendimento em comparação com uma planta que não expressa a sequência pesticida.
[0458] Em métodos específicos, o rendimento de planta é aumentado como resultado de resistência a praga melhorada de uma planta gue expressa um polipeptideo PtIP-83 polypeptide divulgado no presente documento. A expressão do polipeptideo PtIP-83 resulta em uma capacidade reduzida de uma praga infestar ou se alimentar da planta melhorando, assim, o rendimento da planta.
Métodos de Processamento [0459] São fornecidos adicionalmente métodos para processar uma planta, parte de planta ou semente para obter um
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426/525 alimento ou produto alimentício a partir de uma planta, parte de planta ou semente compreendendo um polipeptideo PtIP-83. As plantas, partes de planta ou sementes fornecidas no presente documento podem ser processadas para render óleo, produtos de proteína e/ou subprodutos que são derivados obtidos por processamento que têm valor comercial. Exemplos não limitantes incluem sementes transgênicas que compreendem uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptideo PtIP-83 que pode ser processado para gerar óleo de soja, produtos de soja e/ou subprodutos de soja.
[0460] Processar se refere a quaisquer métodos físicos e químicos usados para obter qualquer produto de soja e incluem, mas sem limitação, o condicionamento térmico, floculação e trituração, extrusão, extração por solvente ou embebição aquosa e extração de sementes inteiras ou parciais.
[0461] Os exemplos a seguir são oferecidos a título de ilustração e não como limitação.
EXPERIÊNCIAS
Exemplo 1 - Identificação de uma proteína inseticida ativa contra o espectro amplo de insetos Lepidópteros de Samambaia, Adiantum peda turn, (PS-7140) [0462] A proteína inseticida PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 1) foi identificada por meio de purificação de proteína, espectrometria de massa (MS) e clonagem de PCR de Adiantum pedatum, (PS-7140) conforme segue:
[0463] Adiantum pedatum foi coletado por um colaborador e recebeu o número de identificação PS-7140. PS-7140 foi coletado, congelado rapidamente em N2 líquido e armazenado a
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427/525 °C. Após o armazenamento foi triturado até um pó fino a temperaturas de N2 líquido com uma Fresa de Ponta Esférica Geno (SPEX, Metuchen, NJ) . A fim de extrair a proteína, 20 mL de tampão Tris a 50 mM, pH 8,0, KC1 a 150 mM, EDTA a 2,5 mM, polivinilpolipirrolidona (PVPP) a 1,5% e um coquetel de inibidores de proteases (Roche Diagnostics, Alemanha) foram adicionados a cada 5 g de peso fresco de tecido. O homogenato foi centrifugado para remover detritos celulares, filtrado através de filtros de 0,22 pm e dessalinizado com o uso de Colunas de Dessalinização por Giro de 10 mL Zeba (Thermo Scientific, IL.).
[0464] Os bioensaios contra as três espécies de pragas, Lagarta Falsa-medideira (SBL) (Chrysodeixis includens), Lagarta da espiga (CEW) (Helicoverpa zea) e Broca de Milho Européia (ECB) (Ostrinia nubilalis) foram conduzidos com o uso do extrato de proteína dessalinizado sobreposto em uma dieta de Lepidóptera à base de ágar (Southland Products Inc., Lake Village, AR) em um formato de 96 poços. Seis réplicas foram usadas por amostra. As amostras foram deixadas secar sobre a dieta e dois até cinco insetos neonatais foram colocados em cada poço da placa tratada. Após quatro dias de incubação a 27 °C, as larvas foram pontuadas quanto à mortalidade ou gravidade do atrofiamento. As pontuações foram registradas numericamente como mortas (3), gravemente atrofiadas (2) (pouco ou nenhum crescimento, mas vivos e equivalentes a uma larva de Io instar), atrofiadas (1) (crescimento até ao segundo instar, mas não equivalente a controles) ou normais (0) . A submissão da amostra à proteinase K e aos tratamentos por calor resultaram na perda de atividade,
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428/525 o que indica que o princípio ativo tinha natureza proteinácea.
Os resultados do bioensaio são mostrados na Tabela 6.
Tabela 6
Atividade de extrato de proteína em bruto de A. pedatum contra larvas Lepidóptera
Média Escore Média Pontuação após Proteinase K/Calor
Neonato Lagarta Falsamedideira 3 0
Lagarta-da- Espiga do Milho 2 0
Broca Européia do Milho 1,5 0
[0465] Para a purificação de proteínas, as folhas de
PS-7140 foram moldas até um pó fino a temperaturas de N2 líquido com um Fresa de Ponta Esférica Geno (SPEX, Metuchen, NJ) . A proteína foi extraída em tampão Tris a 100 mM, pH 8,0, KC1 a 150 mM, EDTA a 2,5 mM, PVPP a 1,5% e coquetel de inibidores de proteases (Roche Diagnostics, Alemanha). O material extraído foi centrifugado para remover os detritos celulares, filtrado através de Miracloth™ (Calbiochem) e depois foi adicionado sulfato de amônio a 35% e deixado equilibrar. A suspensão foi centrifugada e o sedimento resultante foi ressuspenso em um pequeno volume de tampão Tris a 20 mM, pH 8. Depois da clarificação por centrifugação foi dessalinizada utilizando uma coluna de Sephadex G25 (GE, Piscataway, NJ) equilibrada em tampão Tris a 20 mM, pH 8. O conjunto da fração de proteína
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429/525 dessalinizada foi carregado em uma coluna Mono Q de 1 mL (GE, Piscataway, N.J.) e eluído com um gradiente linear (60 CV (volumes de coluna) de 0 M a 0,7 M de NaCl em Tris a 20 mM, pH 8,0——As frações ativas contra SBL e ECB foram combinadas e dessalinizadas em MOPS a 25 mM, pH 6,7. Esta foi então carregada em uma coluna Mono P de 4 mL (Tampão A: MOPS a 25 mM, pH 6,7; Tampão B: Polybuffer 74, pH 4) utilizando um gradiente linear de 4 CV (Tampão B a 0%) seguido de uma lavagem de 15 CV com Tampão B a 100%. Frações de 1 mL foram coletadas. As frações 47 e 48 mostraram atividade contra BCE e SBL. Com base em LDS-PAGE, estas frações ativas continham uma banda de proteína a aproximadamente
95 kDa. A proteína representando a banda de 95 kDa foi denominada
PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 1).
[0466] A identificação de proteína foi realizada por
análise de MS após a digestão da proteína com tripsina. As
proteínas para identificação por MS foram obtidas após processar
a amostra em um gel de LDS-PAGE corado com Corante Brilliant Blue G-250. As bandas de interesse foram excisadas do gel, descoradas, reduzidas com ditiotreitol e, em seguida, alquiladas com iodoacetamida. Após a digestão durante a noite com tripsina, as amostras foram foram analisadas por cromatografia nanolíquida/espectrometria de massa por eletroaspersão em tandem (nano-LC/ESI-MS/MS) em um espectrômetro de massa Thermo Q Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) que faz interface com um sistema Eksigent NanoLC Ultra 1-D Plus nano-lc e um autoamostrador nanolc-as2 (AB Sciex). A identificação da proteína foi realizada por pesquisa dos dados nano-LC/MSMS contra um banco de dados de transcriptoma interno contendo os transcritos dos materiais da planta de origem e o banco de dados
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430/525 público de proteínaa Swiss-Prot usando o mecanismo de busca Mascot (Matrix Science).
[0467] A sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 foi pesquisada por BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul, et al., (1993) J. Mol. Biol. 215:403-410; consultar também ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/, que pode ser acessado com o uso do prefixo www) contra bancos de dados públicos e internos DUPONT-PIONEER que incluíram sequências de proteínas de plantas. As sequências de aminoácidos foram alinhadas com proteínas em um banco de dados de proteína de planta DUPONT-PIONEER registrado.
Exemplo 2 Sequenciamento Transcriptômico de PtIP-83Aa [0468] Um transcriptoma para Adiantum pedatum, PS-7140 foi preparado do modo seguinte. RNAs totais foram isolados de tecidos congelados usando o kit Qiagen® RNeasy® para isolamento de RNA total. As bibliotecas de sequenciamento dos RNAs totais resultantes foram preparadas com o uso do kit TruSeq™ mRNA-Seq e do protocolo Illumina®, Inc. (San Diego, CA) . Em resumo, os mRNAs foram isolados por meio da fixação a esférulas de oligo(dT), fragmentados para um tamanho médio de 180 nt, transcritos de maneira reversa em cDNA por iniciador de hexâmero aleatório, foram reparados nas extremidades, dotados de cauda 3' A e ligados com adaptadores TruSeq™ indexados por Illumina®. Os fragmentos de cDNA ligados foram amplificados por PCR com o uso de iniciadores Illumina® TruSeq™ e os produtos de PCR purificados foram verificados quanto à qualidade e quantidade no chip Agilent Bioanalyzer® DNA 7500. Após a avaliação da qualidade e quantidade, 100 ng da biblioteca de transcritos foram normalizados por tratamento com Nuclease Específica para Dúplices (DSN) (Evrogen®, Moscovo, Rússia). A normalização foi
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431/525 realizada pela adição de tampão Hepes 200 mM, seguido de desnaturação por calor e emparelhamento durante cinco horas a 68 °C. A biblioteca emparelhada foi tratada com 2 uL da enzima DSN durante 25 minutos, purificada com colunas Qiagen® MinElute® de acordo com os protocolos do fabricante e amplificada em doze ciclos com o uso de iniciadores específicos para os adaptadores Illumina®. Os produtos finais foram purificados com esférulas Ampure® XP (Beckman Genomics, Danvers, MA) e verificados quanto à qualidade e quantidade no chip Agilent Bioanalyzer® DNA 7500.
[0469] As bibliotecas de transcritos normalizadas foram sequenciadas de acordo com os protocolos do fabricante no Analisador de Genoma Illumina® IIx. Cada biblioteca foi hibridada para duas vias de células de fluxo e amplificada, bloqueada, linearizada e hibridada com iniciadores com o uso do processo de geração de agrupamentos clonais Illumina em cBot®. O sequenciamento foi concluído no Analisador de Genoma IIx, o que gera sessenta milhões de leituras de extremidades emparelhadas de 75 pb por biblioteca normalizada.
[0470] Sequência peptídica identificada para PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 1) por sequenciamento por LC-MS/MS/MS (descrito no Exemplo 1) foi pesquisada contra as sequências de proteínas previstas por quadros de leitura abertos (ORFs) do transcriptoma interno para montagens de PS-7140CF. Os peptídeos forneceram uma compatibilidade perfeita para um transcrito correspondente a PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 2) . As sequências codifIsadoras foram usadas para conceber os seguintes iniciadores para clonar a sequência codificadora de PtIP-83Aa:
CCATGGCTCTCGTGGATTACGGCAAG (95KD N-T Neo I FOR) (SEQ ID NO: 30) e GTTAACCTACTCTTCGTCGTGCCGCCAGTC (95KD C-T Hpa I REV) (SEQ ID
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NO: 31) . Este clone foi produzido por reação em cadeia da polimerase com o uso do kit de PCR da polimerase de DNA KOD Hot Start® (Novagen, Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha) e o RNA total de Adíantum pedatum como um molde. 0 produto de PCR fol confirmado por sequenciamento.
[0471] Com base no DNA e sequenciamento da proteína, a sequência do polinucleotídeo PtIP-83Aa é mostrada como SEQ ID NO: 2 e a sequência polipeptldica como SEQ ID NO: 1.
Exemplo 3 - Identificação de Homólogos de PtIP-83Aa [0472] As identidades de genes podem ser determinadas conduzindo pesquisas por BLAST® (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul, et al., (1993) J. Mol. Biol. 215:403-410; também consultar ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/, o qual pode ser acessado com o uso do prefixo www) com parâmetros padrão quanto à similaridade com sequências. A sequência polinucleotídica para PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 2) foi analisada. Nenhuns homólogos próximos de PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 1) foram identificados em bandos de dados públicos.
[0473] As identidades de gene conduzidas por BLAST™ em um banco de dados de transcriptomas de planta interna DUPONT PIONEER de samambaias e outras plantas primitivas identificaram homólogos para PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 1). Os homólogos PtIP-83Aa e o organismo em que foram identificados são mostrados na Tabela 7 .
Tabela 7
N° ID da sequência Fonte Organismo
PtIP-83Aa SEQ ID NO: 1 PS-7140 Adíantum pedatum
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PtIP-83Ca SEQ ID NO: 5 PS-11481 Adiantum trapeziforme var. braziliense
PtIP-83Cb SEQ ID NO: 7 PS-11481 Adiantum trapeziforme var. braziliense
PtIP-83Cc SEQ ID NO: 9 PS-11481 Adiantum trapeziforme var. braziliense
PtIP-83Cd SEQ ID NO: 11 PS-11481 Adiantum trapeziforme var. braziliense
PtIP-83Ce SEQ ID NO: 13 PS-12345 Adiantum peruvianum
PtIP-83Cf SEQ ID NO: 15 PS-9224 Lygodium flexuosum
PtIP-83Cg SEQ ID NO: 17 PS-12345 Adiantum peruvianum
PtIP-83Da SEQ ID NO: 19 PS-12345 Adiantum peruvianum
PtIP-83Ea SEQ ID NO: 21 PS-11481 Adiantum trapeziforme var. braziliense
PtIP-83Eb SEQ ID NO: 23 PS-11481 Adiantum trapeziforme var. braziliense
PtIP-83Fa SEQ ID NO: 3 PS-8568 Mícrosorum musifolium
PtIP-83Fb SEQ ID NO: 716 PS-9319 Polypodium punctatum 'Serration '
PtIP-83Ch SEQ ID NO: 754 LW13327 Polystichium tsus-simense
semelhante a PtlP83Ch SEQ ID NO: 755 LW13327 Polystichium tsus-simense
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PtIP-83Fd SEQ ID NO: 756 LW13327 Polystíchíum tsus-símense
PtIP-83Fe SEQ ID NO: 757 LW13327 Polystíchíum tsus-símense
PtIP-8301 SEQ ID NO: 758 LW12354 Rumohra adíantíformís
semelhante a PtIP8301 SEQ ID NO: 759 LW12354 Rumohra adíantíformís
PtIP-83Ff SEQ ID NO: 760 LW12354 Rumohra adíantíformís
semelhante a PtlP83Ff SEQ ID NO: 761 LW12354 Rumohra adíantíformís
PtIP-83Cj SEQ ID NO: 762 NY012 Aspleníum tríchomanes
semelhante a PtlP83Cj SEQ ID NO: 763 NY012 Aspleníum tríchomanes
PtIP-83Ga SEQ ID NO: 764 NY0 0 9 Phyllítís scolopendíum 'Angustifolia'
semelhante a PtlP83Ga SEQ ID NO: 765 NY0 0 9 Phyllítís scolopendíum 'Angustifolia'
PtIP-83Fg SEQ ID NO: 766 NY0 0 9 Phyllítís scolopendíum ' Angustifolia'
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PtIP-83Fh SEQ ID NO: 767 NY0 0 9 Phyllítís scolopendíum 'Angustífolia'
PtIP-83Fi SEQ ID NO: 768 NY0 0 9 Phyllítís scolopendíum 'Angustífolia'
semelhante a PtlP83Fi SEQ ID NO: 769 NY0 0 9 Phyllítís scolopendíum 'Angustífolia'
[0474] O cDNA foi gerado a partir de organismos de fonte com homólogos identificados por transcrição reversa de RNA total. Os homólogos foram amplificados por PCR a partir dos seus respectivos cDNAs utilizando iniciadores concebidos para as sequências codificadoras de cada homólogo e subclonados em um vetor transiente de planta contendo o promotor DMMV. Os produtos de PCR foram confirmados por sequenciamento. Os iniciadores de clonagem são mostrados na Tabela 8. O cDNA para o homólogo PtlP83Fb foi sintetizado (SEQ ID NO: 717) baseado na montagem do transcriptoma de PS-9319 e subclonado em um vetor transiente de planta.
Tabela 8
Gene Inicia dor Sequência
PtIP-83Cb GZ- 550- 83Ca-F CGAAATCTCTCATCTAAGAGGCTGGATCCTAGGATGGA TTACAGCACGCTTTACAGGGAC (SEQ ID NO: 608)
PtIP-83Cb GZ- 550- 83Ca-R T TAAG T T G G C CAAT C CAGAAGAT G GACAAG T C TAGAC T ACTCCTCCTCTTGCCGCCAGTC (SEQ ID NO: 609)
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Gene Inicia dor Sequência
PtIP-83Ca, Cc e Cd GZ- 550- 83Ca-F CGAAATCTCTCATCTAAGAGGCTGGATCCTAGGATGGA TTACAGCACGCTTTACAGGGAC (SEQ ID NO: 608)
PtIP-83Ca, Cc e Cd 83Ca- Is-R CAA GGA TTG CAT TGC TAG GAA GG (SEQ ID NO: 611)
PtIP-83Ca, Cc e Cd GZ- 550- 83Ca-R T TAAG T T G G C CAAT C CAGAAGAT G GAGAAG T C TAGAC T ACTCCTCCTCTTGCCGCCAGTC (SEQ ID NO: 609)
PtIP-83Ca, Cc e Cd 83Ca- Is CCTTCCTAGCAATGCAATCCTTG (SEQ ID NO: 613)
PtIP-83Ce GZ- 550- 83Ca-F CGAAATCTCTCATCTAAGAGGCTGGATCCTAGGATGGA TTACAGCACGCTTTACAGGGAC (SEQ ID NO: 608)
PtIP-83Ce 550- 12345- R AAG T T G G C CAAT C CAGAAGAT G GAGAAG T C TAGAC TAG TCCTCCTCTTTCTCCTCCTGCC (SEQ ID NO: 615)
PtIP-83Cf 550- 9224- F1 CGAAATCTCTCATCTAAGAGGCTGGATCCTAGGATGGC CAGTGTACTGGATTACAGCAC (SEQ ID NO: 616)
PtIP-83Cf 550- 9224- R1 T TAAG T T G G C CAAT C CAGAAGAT G GAGAAG T C TAGAC T ACTCCTCCTCGTGCCGCC (SEQ ID NO: 617)
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Gene Inicia dor Sequência
PtIP-83Cg 550- 11790. 2-F GAAATCTCTCATCTAAGAGGCTGGATCCTAGGATGGAT TACAGCACTCTTTACAGGGATC (SEQ ID NO: 618)
PtIP-83Cg GZ- 550- 83Ca-R T TAAG T T G G C CAAT C CAGAAGAT G GACAAG T C TAGAC T ACTCCTCCTCTTGCCGCCAGTC (SEQ ID NO: 609)
PtIP-83Da GZ- 550- 83Ca-F CGAAATCTCTCATCTAAGAGGCTGGATCCTAGGATGGA TTACAGCACGCTTTACAGGGAC (SEQ ID NO: 608)
PtIP-83Da 550- UTR8.7 -R G T T G G C CAAT C CAGAAGAT G GACAAG T C TAGAT TAGAG TGGCTTCGCCAGTGTCG (SEQ ID NO: 621)
PtIP-83Ea GZ- 550- 83Ca-F CGAAATCTCTCATCTAAGAGGCTGGATCCTAGGATGGA TTACAGCACGCTTTACAGGGAC (SEQ ID NO: 608)
PtIP-83Ea 550- 12345- R AAG T T G G C CAAT C CAGAAGAT G GACAAG T C TAGAC TAC TCCTCCTCTTTCTCCTCCTGCC (SEQ ID NO: 615)
PtIP-83Eb GZ- 550- 83Ca-F CGAAATCTCTCATCTAAGAGGCTGGATCCTAGGATGGA TTACAGCACGCTTTACAGGGAC (SEQ ID NO: 608)
PtIP-83Eb 550- 12345- R AAG T T G G C CAAT C CAGAAGAT G GACAAG T C TAGAC TAC TCCTCCTCTTTCTCCTCCTGCC (SEQ ID NO: 615)
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Gene Inicia dor Sequência
PtIP-83Fa infusã o BamHI T T TAAC T TAGCC TAGGAT CCAT GGAATATAGCAGC T T G TAG (SEQ ID NO: 32)
PtIP-83Fa infusã o Hpal ACTCCTTCTTTAGTTAACTTACTCCACATCACCCTCTT GTCG (SEQ ID NO: 33)
semelhante a PtIP-83Ch e PtlP- 83Ch LW1332 7-F1 cgaaatctctcatctaagaggctggatcctaggATGGA TTACAGCACGCTTTACAGG (SEQ ID NO: 770)
semelhante a PtIP-83Ch e PtlP- 83Ch LW1332 7-R1 taagttggccaatccagaagatggacaagtctagaCTA CTCCTCCACCTCCTGCCTCC (SEQ ID NO: 771)
PtIP-83Fd e PtlP- 83Fe LW1332 7-F2 cgaaatctctcatctaagaggctggatcctaggATGAC GATGGCGGCAACTG (SEQ ID NO: 772)
PtIP-83Fd e PtlP- 83Fe LW1332 7-R2 ggccaatccagaagatggacaagtctagaCTAGAAAGA AATTTTCCTGATAGCTGAG (SEQ ID NO: 773)
semelhante a PtIP-83Ci e PtlP- 83C1 LW1235 4-F1 cgaaatctctcatctaagaggctggatcctaggATGGA TTACAGCACTCTTTACACGG (SEQ ID NO: 774)
semelhante a PtIP-83Ci e PtlP- 83C1 LW1235 4-R1 taagttggccaatccagaagatggacaagtctagaCTA CTCCTCTTGCCGCCAGTC (SEQ ID NO: 775)
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Gene Inicia dor Sequência
semelhante a
PtIP-83Ff e PtlP- LW1235 cgaaatctctcatctaagaggctggatcctaggATGGC
83Ff 4-F2 TGCCTCCGCTGCTG (SEQ ID NO: 776)
semelhante a
PtIP-83Ff e PtlP- LW1235 taagttggccaatccagaagatggacaagtctagaCTA
83Ff 4-R2 GAAAGAAATGCGCCGGATAG (SEQ ID NO: 777)
semelhante a
PtIP-83Cj e PtlP- NY012- cgaaatctctcatctaagaggctggatcctaggATGGA
83Cj FI TTACAGCACGCTTTACAGG (SEQ ID NO: 778)
semelhante a
PtIP-83Cj e PtlP- NY012- taagttggccaatccagaagatggacaagtctagaCTA
83Cj RI CTCCTCCTCCTCCTCGTGCC (SEQ ID NO: 779)
semelhante a
PtIP-83Ga e PtlP- NY009- cgaaatctctcatctaagaggctggatcctaggATGGG
83Ga FI TGTCACAGTCGTTAGCG (SEQ ID NO: 780)
semelhante a
PtIP-83Ga e PtlP- NY009- taagttggccaatccagaagatggacaagtctagaTTA
83Ga RI GCTGACGACCTGATCATCGC (SEQ ID NO: 781)
semelhante a
PtIP-83Fg, Fi e NY009- cgaaatctctcatctaagaggctggatcctaggATGGA
Fi F2 GTATGGCAGCTTGTATGG (SEQ ID NO: 782)
semelhante a
PtIP-83Fg, Fi e NY009- gttggccaatccagaagatggacaagtctagaCTATAA
Fi R2a CTCCGCATCAGCTCGTTG (SEQ ID NO: 783)
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Gene Inicia dor Sequência
PtIP-83Fh NY009- F3 cgaaatctctcatctaagaggctggatcctaggATGGA GTACTCCGACTTGTATGAGG (SEQ ID NO: 784)
PtIP-83Fh NY009- R3 taagttggccaatccagaagatggacaagtctagaTCA CTCCTCATCGACTTCCCG (SEQ ID NO: 785)
[0475] A diversidade adicional foi recuperada por amplificação por PCR com iniciadores concebidos para as regiões não codificantes que flanqueiam os homólogos identificados. Os iniciadores foram concebidos para sequências conservadas nas regiões não traduzidas 5' e 3' de PTIP-83Ca dos resultados de pesquisa BLAST dentro da base de dados de transcriptomas internos
DUPONT PIONEER. Pares de iniciadores (D
GCCTTTATCGACTCCTAATTCACACC (SEQ ID NO: 626) e
C C AC AT T G T G C AT T AC GAC C AC (SEQ ID NO: 627) , e (2)
CCAGTGATTTGAGTTCCTTCATTATG (SEQ ID NO: 628) e
GAACAG TACAT T GAC T GOAT G T GC (SEQ ID NO: 629 ) foram usados para
gerar produtos de PCR a partir de cDNA de PS-11481 e PS-12345.
Os produtos de PCR resultantes foram clonados por extremidades abruptas utilizando o Kit de Clonagem por PCR Zero Blunt® TOPO® (Invitrogen) e analisados em sequência. Desta análise, os homólogos PtIP-83Cg, Da, Ea e Eb foram identificados e subclonados no vetor transiente da planta. Os iniciadores de clonagem são mostrados na Tabela 8.
[0476] A identidade de sequência de aminoácidos dos homólogos PtIP-83Aa conforme calculado com o uso do algoritmo Needleman-Wunsch, conforme implantado no programa Needle (pacote de ferramentas EMBOSS) é mostrada na Tabela 9a - 9c.
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Tabela 9a
03 ω oo CO 1 (29 έϊ Λ ω oo co 1 (29 έϊ υ ω οο co I (29 έϊ Ό ω οο co I (29 έϊ φ ω οο co I (29 έϊ PtIP-83Cf ω οο co I (29 (29 semelhante a PtIP-83Ch ω οο co 1 (29 (29 semelhante a PtIP-8301
PtlP- 8 3Aa SEQ ID NO: 1 71,4 71,2 71,9 72,0 71,5 77,4 71,5 74, 8 74, 8 70, 9
PtTP- 83Ca SEQ ID NO: 5 - 76,4 98,5 98,2 98,0 79, 3 76,6 80, 6 80, 6 75, 8
PtlP- 83Cb SEQ ID NO: 7 - - 76,7 76,8 76,3 77, 6 98, 6 78, 0 78, 0 9 6,6
PtlP- 83Cc SEQ ID NO: 9 - - - 99, 8 99, 5 79, 1 76,9 80, 8 80, 8 75, 8
PtlP- 83Cd SEQ ID NO: 11 - - - - 99, 3 79, 3 76,9 80, 9 80, 9 75, 8
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CU) CU)
Φ Φ
cri 44 υ Φ Ψ-Ι 44 44 1—1
ω ω ω ω ω ω ω f4 ω ω f4 ω
CO CO CO CO CO CO CO CÜ CO CO CÜ CO
CO CO CO CO CO CO CO 44 CO CO 44 CO
(29 CM CM CM CM CM CM Φ 49 49 Φ 49
|—I |—1 |—1 |—1 |—1 |—1 |—1 g |—1 |—1 g |—1
_|___) _|___) _|___) _|___) _|___) _|___) _|___) Φ _|___) _|___) Φ _|___)
• (29 CM CM CM CM CM CM ω 49 49 ω 49
PtIP-
83Ce
- - - - - 78,7 76,5 80, 6 80, 6 75, 6
SEQ ID
NO: 13
PtlP-
83Cf
- - - - - - 77, 8 84, 0 84, 0 77,3
SEQ ID
NO: 15
PtlP-
83Cg
- - - - - - - 78,2 78,2 97, 1
SEQ ID
NO: 17
semelhan
te a
PtlP-
— — — — — — — — 99, 9 77,4
83Ch
SEQ ID
NO: 755
PtlP-
83Ch
- - - - - - - - - 77,4
SEQ ID
NO: 754
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03 ω oo CO 1 Q-i έϊ Λ ω cn co 1 (Ο-ι έϊ υ ω οο co I (Ο-ι έϊ Ό ω οο co I (Ο-ι έϊ φ ω οο co I (Ο-ι έϊ PtIP-83Cf ω οο co I (Ο-ι έϊ semelhante a PtIP-83Ch ω οο co 1 (Ο-ι έϊ semelhante a PtIP-83Ci
semelhan te a PtlP83C1 SEQ ID NO: 759 - - - - - - - - - -
PtlP- 83C1 SEQ ID NO: 758 - - - - - - - - - -
semelhan te a PtlP83Cj SEQ ID NO: 763 - - - - - - - - - -
PtlP- 83Cj SEQ ID NO: 762 - - - - - - - - - -
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<15 ω oo co 1 (Ο-ι έϊ Λ ω οο co 1 (Ο-ι έϊ υ ω οο co I (Ο-ι έϊ Ό ω οο co I (Ο-ι έϊ φ ω οο co 1 (0-1 έϊ PtIP-83Cf ω οο co I (Ο-ι έϊ semelhante a PtIP-83Ch 4=1 ω οο co I (Ο-ι έϊ semelhante a PtIP-83Ci
PtlP- 83Da SEQ ID NO: 19 - - - - - - - - - -
PtlP- 83Ea SEQ ID NO: 21 - - - - - - - - - -
PtlP- 83Eb SEQ ID NO: 2 3 - - - - - - - - - -
PtlP- 83Fa SEQ ID NO: 3 - - - - - - - - - -
PtlP- 83Fb SEQ ID NO: 716 - - - - - - - - - -
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03 ω oo CO 1 (0-i έϊ Λ ω oo co 1 (Ο-ι έϊ υ ω οο co I (Ο-ι έϊ Ό ω οο co I (Ο-ι έϊ φ ω οο co 1 (0-1 έϊ PtIP-83Cf ω οο co I (Ο-ι έϊ semelhante a PtIP-83Ch 4=1 ω οο co I (Ο-ι έϊ semelhante a PtIP-83Ci
PtlP- 83Fd SEQ ID NO: 756 - - - - - - - - - -
PtlP- 83Fe SEQ ID NO: 757 - - - - - - - - - -
semelhan te a PtlP83Ff SEQ ID NO: 761 - - - - - - - - - -
PtlP- 83Ff SEQ ID NO: 760 - - - - - - - - - -
PtlP- 83Fg SEQ ID NO: 766 - - - - - - - - - -
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03 ω oo CO 1 Q-i έϊ Λ ω cn co 1 (Ο-ι έϊ υ ω οο co I (Ο-ι έϊ Ό ω οο co I (Ο-ι έϊ φ ω οο co I (Ο-ι έϊ PtIP-83Cf ω οο co I (Ο-ι έϊ semelhante a PtIP-83Ch 4=1 ω οο co I (Ο-ι έϊ semelhante a PtIP-8301
PtlP- 83Fh SEQ ID NO: 767 - - - - - - - - - -
semelhan te a PtlP83F1 SEQ ID NO: 769 - - - - - - - - - -
PtlP- 83F1 SEQ ID NO: 768 - - - - - - - - - -
semelhan te a PtlP83Ga SEQ ID NO: 765 - - - - - - - - - -
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Tabela 9b
1—1 ω oo CO 1 Q_i έϊ semelhante a PtIP-83Cj ω oo CO 1 (0_i έϊ <τ5 Q oo CO 1 Q-i έϊ <τ5 ω oo CO 1 Q-i έϊ Λ ω oo co 1 Q-ι έϊ crJ CO CO 1 P-i έϊ Λ h OO CO 1 Q-i έϊ Ό Ln oo co 1 Q-i έϊ
PtIP-83Aa SEQ ID NO: 1 71, 0 75, 5 73, 6 64,7 55, 8 55, 4 49, 8 50, 1 50, 8
PtIP-83Ca SEQ ID NO: 5 75, 9 79, 5 77,5 89, 7 68, 6 79, 1 48, 8 48,3 48, 8
PtIP-83Cb SEQ ID NO: 7 96, 7 79, 5 77,2 68, 8 59, 3 60,2 49, 7 49, 3 50,4
PtIP-83Cc SEQ ID NO: 9 76,0 79, 8 77, 8 91,1 70, 1 80,4 49, 2 48,7 49, 1
PtIP-83Cd SEQ ID NO: 11 76,0 79, 9 77,9 90, 8 70, 1 80,2 49, 2 48,7 49, 2
PtIP-83Ce SEQ ID NO: 13 75, 7 79, 8 77, 8 90,7 70,5 80, 9 49, 3 48, 8 48,9
PtIP-83Cf SEQ ID NO: 15 77,4 87, 1 84, 8 71,4 60,5 61, 8 49, 3 48,9 52,8
PtIP-83Cg SEQ ID NO: 17 97,2 79, 6 77,4 69, 1 59, 3 60,4 49, 5 49, 4 50,5
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1—1 ω oo CO 1 (0-i έϊ semelhante a PtIP-83Cj ω cn CO 1 (O_i έϊ <τ5 Q oo CO 1 (O-i έϊ ω oo co 1 (Ο-ι έϊ Λ ω οο co I (Ο-ι έϊ CO CO 1 Ρ-Ι έϊ Λ h οο co I (Ο-ι έϊ Ό h οο co I (Ο-ι έϊ
semelhante a PtIP-83Ch SEQ ID NO: 755 77, 6 84,9 82, 6 72,5 62,5 62,9 50, 6 50, 6 52,5
PtIP-83Ch SEQ ID NO: 754 77, 6 84,9 82, 6 72,5 62,5 62,9 50, 6 50,7 52,5
semelhante a PtIP-83Ci SEQ ID NO: 759 99, 9 79, 0 76,8 68, 1 58,9 59, 9 49, 9 49, 8 49, 3
PtIP-83Ci SEQ ID NO: 758 - 79, 1 76,9 68,2 59, 1 59, 9 50, 1 49, 9 49, 4
semelhante a PtIP-83Cj SEQ ID NO: 763 - - 97,0 71,7 61, 1 62,7 50,7 50,7 51,5
PtIP-83Cj SEQ ID NO: 762 - - - 69, 7 61, 6 60,7 50,3 50,3 50,4
PtIP-83Da SEQ ID NO: 19 - - - - 61,4 71,7 43,5 43, 0 44,4
PtIP-83Ea SEQ ID NO: 21 - - - - - 51, 6 38,7 38, 6 38,7
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1—1 ω oo CO 1 Q-i έϊ cü ω οο co 1 (Ο-ι έϊ φ Q οο co I (Ο-ι έϊ φ ω οο co I (Ο-ι έϊ Λ ω οο co I (Ο-ι έϊ CO CO 1 P-l έϊ Λ h οο co I (Ο-ι έϊ Ό h οο co I (Ο-ι έϊ
Φ 5 Φ 4=1 Φ g Φ ω ω cn co 1 (Ο-ι έϊ
PtIP-83Eb SEQ ID NO: 23 - - - - - - 38,8 38,2 37,9
PtIP-83Fa SEQ ID NO: 3 - - - - - - - 97,1 48,4
PtIP-83Fb SEQ ID NO: 716 - - - - - - - - 48,7
PtIP-83Fd
SEQ ID NO: 756
PtIP-83Fe
SEQ ID NO: 757
semelhante a
PtIP-83Ff - - - - - - - - -
SEQ ID NO: 761
PtIP-83Ff
SEQ ID NO: 760
PtIP-83Fg
SEQ ID NO: 766
PtIP-83Fh
SEQ ID NO: 767
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1—1 ω oo co 1 (29 έϊ cü ω οο co 1 CM έϊ φ Q οο co 1 CM έϊ φ ω οο co I CM έϊ Λ ω οο co I CM έϊ cri CO CO 1 P-l έϊ Λ h 00 CO 1 (2L| έϊ Ό h 00 CO 1 (2L| έϊ
Φ s Φ b Φ g Φ ω ω cn co 1 CM έϊ
semelhante PtIP-83Fi a — — — — — — — — -
SEQ ID NO: 769
PtIP-83Fi
SEQ ID NO: 768
semelhante PtIP-83Ga a — — — — — — — — -
SEQ ID NO: 765
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 454/553
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Tabela 9c
tá tá tá
Φ Φ Φ
φ | 1 Ψ-Ι Ψ-Ι tr 4=1 | 1 1—1 1—1 | 1 tá tá
5 It It u u
CO tá CO CO CO CO tá CO CO tá CO CO
CO 4=1 CO CO CO CO 4=1 CO CO 4=1 CO CO
(=9 Φ (=9 (=9 (=9 (=9 Φ (=9 (=9 Φ (=9 (=9
|—I g |—I |—I |—I |—I g |—I |—I g |—I |—I
_|___) Φ _|___) _|___) _|___) _|___) Φ _|___) _|___) Φ _|___) _|___)
• (=9 ω (=9 (=9 (=9 (=9 ω (=9 (=9 ω (=9 (=9
PtIP-83Aa 51, 0 51, 1 50, 8 49, 8 47, 3 50, 2 50, 2 34, 5 34,
SEQ ID NO: 1 6
PtIP-83Ca 49, 0 49, 2 49, 2 47, 8 45, 6 47, 4 47, 4 35, 0 35,
SEQ ID NO: 5 1
PtIP-83Cb 50, 5 51, 0 51, 0 48, 0 47, 3 47, 4 47, 4 34, 5 34,
SEQ ID NO: 7 6
PtIP-83Cc 49, 2 49, 7 49, 7 48, 1 46, 0 47, 6 47, 6 35, 0 35,
SEQ ID NO: 9 1
PtIP-83Cd 49, 3 49, 8 49, 8 48, 2 46, 1 47, 7 47, 7 35, 1 35,
SEQ ID NO: 11 2
PtIP-83Ce 49, 0 49, 5 49, 5 48, 2 46, 0 47, 7 47, 7 35, 0 35,
SEQ ID NO: 13 1
PtIP-83Cf 52, 5 51, 5 51, 5 49, 7 48, 3 49, 3 49, 3 35, 5 35,
SEQ ID NO: 15 6
PtIP-83Cg 50, 7 50, 4 50, 4 47, 8 46, 9 47, 2 47, 2 34, 5 34,
SEQ ID NO: 17 6
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452/525
tá tá tá
Φ Φ Φ
φ | 1 Ψ-Ι Ψ-Ι | 1 1—1 1—1 | 1 tá tá
5 5 5 u u
CO tá CO CO CO CO tá CO CO tá CO CO
CO CO CO CO CO CO CO CO CO
Q-i Φ Q-i Q-i Q-i Q-i Φ Q-i Q-i Φ Q-i Q-i
|—I g |—I |—I |—I |—I g |—I |—I g |—I |—I
_|___) Φ _|___) _|___) _|___) _|___) Φ _|___) _|___) Φ _|___) _|___)
• Q-i ω Q-i Q-i Q-i Q-i ω Q-i Q-i ω Q-i Q-i
semelhante a
PtIP-83Ch 52,4 51,5 51, 6 49, 7 48,4 49, 4 49, 4 34, 6 34,
SEQ ID NO: 7
755
PtIP-83Ch 34,
SEQ ID NO: 52,4 51,5 51, 6 49, 7 48, 1 49, 7 49, 7 34,7 8
754
semelhante a
PtIP-8301 49, 9 50, 9 50,5 47,9 47, 0 47, 6 47, 6 34, 6 34,
SEQ ID NO: 7
759
PtIP-8301 34,
SEQ ID NO: 50, 1 51,0 50,7 48, 0 47, 1 47,7 47,7 34,5 6
758
semelhante a
PtIP-83Cj 51,5 51,5 51,5 49, 3 46,7 49, 2 49, 2 35, 2 35,
SEQ ID NO: 3
763
PtIP-83Cj 34,
SEQ ID NO: 50,4 50,2 50,2 48,9 46,1 48, 8 48, 8 34,8 9
762
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 456/553
453/525
tá tá tá
Φ Φ Φ
φ | ί Ψ-Ι Ψ-Ι tP | ί 1—1 1—1 | ί tá tá
(5 (5 (5 u u
CO tá CO CO CO CO tá CO CO tá CO CO
CO CO CO CO CO CO CO CO CO
Q-i Φ (4-i (4-i (4-i (4-i Φ (4-i (4-i Φ (4-i (4-i
|—I g |—I |—I |—I |—I g |—I |—I g |—I |—I
_|___) Φ _|___) _|___) _|___) _|___) Φ _|___) _|___) Φ _|___) _|___)
• Q-i ω (4-i (4-i (4-i (4-i ω (4-i (4-i ω (4-i (4-i
PtIP-83Da 44, 6 44, 6 44, 6 42, 5 40, 5 42,0 42,0 30,5 30,
SEQ ID NO: 19 6
PtIP-83Ea 38, 6 38,7 38, 7 39, 6 36, 9 39, 3 39, 3 29, 0 29,
SEQ ID NO: 21 1
PtIP-83Eb 38, 1 38,7 38, 7 36, 6 36, 1 36, 4 36, 4 27,4 27,
SEQ ID NO: 23 5
PtIP-83Fa 48, 3 48,9 49, 5 73, 4 64, 6 71,9 71,9 31,8 31,
SEQ ID NO : 3 9
PtIP-83Fb 32,
SEQ ID NO: 48, 8 48,9 48, 9 73, 0 64, 3 71, 8 71, 8 31,9 0
716
PtIP-83Fd 33,
SEQ ID NO: 96, 5 72,9 73, 0 49, 9 47, 7 49, 2 49, 3 33, 8 7
756
PtIP-83Fe 33,
SEQ ID NO: — 72,9 73, 0 50, 0 47, 7 49, 2 49, 3 33,5 4
757
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 457/553
454/525
tá tá tá
Φ Φ Φ
φ | 1 Ψ-Ι Ψ-Ι 4=1 | 1 1—1 1—1 | 1 tá tá
(4 (4 (4 u u
CO tá CO CO CO CO tá CO CO tá CO CO
CO 4=1 CO CO CO CO 4=1 CO CO 4=1 CO CO
Q-i Φ (4-i (4-i (4-i (4-i Φ (4-i (4-i Φ (4-i (4-i
|—I g |—I |—I |—I |—I g |—I |—I g |—I |—I
_|___) Φ _|___) _|___) _|___) _|___) Φ _|___) _|___) Φ _|___) _|___)
• (4-i ω (4-i (4-i (4-i (4-i ω (4-i (4-i ω (4-i (4-i
semelhante a
PtIP-83Ff — — 99, 9 49, 1 46,5 48,4 48,5 33, 1 33,
SEQ ID NO: 1
761
PtIP-83Ff 33,
SEQ ID NO: — — — 49, 1 46,5 48,4 48,5 33,2 2
760
PtIP-83Fg 31,
SEQ ID NO: — — — — 66, 4 94,8 94,9 31,8 9
766
PtIP-83Fh 31,
SEQ ID NO: — — — — — 65, 3 65, 4 31,1 1
767
semelhante a
PtIP-83Fi — — — — — — 99, 9 32,1 32,
SEQ ID NO: 2
769
PtIP-83Fi 32,
SEQ ID NO: — — — — — — — 32,2 3
768
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 458/553
455/525
o h oo co 1 Q-i έϊ cü PtIP-83Ff CO CO 1 P-I έϊ 4=: η, oo co 1 Q-i έϊ 1—1 CO CO 1 P-I έϊ u oo co 1 Q-i έϊ
semelhante Ψ-Ι CO CO 1 P-I έϊ semelhante 1—1 CO CO 1 P-I έϊ semelhante u oo co 1 (0-1 έϊ
semelhante a
PtIP-83Ga 99,
SEQ ID NO: 9
765
Exemplo 4: Expressão transiente em folhas e bioensaio de inseto [0477] Para confirmar a atividade de PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 1) um sistema de expressão transiente sob o controle de um promotor viral pDMMV e/ou AtUBQlO (Dav, et. al. , (1999) Plant Mol. Biol. 40:771-782; Norris SR et al (1993) Plant Mol Biol. 21(5) :895-906) foi utilizado. O método de agroinfiltração para introduzir uma suspensão de células de Agrobacterium em células de plantas de tecidos intatos, para que a infecção reproduzivel e subsequente expressão de transgenes derivados de planta possam ser medidas ou estudadas, é bem conhecido na técnica (Kapila, et. al. , (1997) Plant Science 122:101-108) . Brevemente, o estágio unifoliado de feijão arbusto (feijão comum, Phaseolus vulgaris) ou soja (Glycine max), foi agroinfiltrado com culturas de célula bacteriana normalizada de cepas de teste e controle. Após 4 a 7 dias os discos foliares foram retirados de cada plântula e infestados com 2 neonatos de Lagarta falsa-medideira (SBL) (Chrysodeixis includens), 2 neonatos de Lagarta da espiga (CEW) (Helicoverpa zea) r 2 neonatos de Lagarta-do-cartucho do milho (Spodoptera frugiperda) ou 4 neonates de Broca europeia do
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456/525 milho (ECB) (Ostrinia nubilalis) alone. Os discos foliares de controle foram gerados com Agrobacteríum contendo apenas um vetor de expressão do marcador de fluorescência DsRed2 (Clontech™, 1290 Terra Bella Ave. Mountain View, CA 94043) vetor de expressão. Os discos foliares de plantas não infiltradas foram incluídos como um segundo controle. O consumo de tecido foliar verde foi classificado dois (CEW, FAW) ou três (ECB, SBL, FAW) dias após a infestação e dada classificação de 0 a 9. O PtTP83Aa expresso de modo transiente (SEQ ID NO: 1), protegeu os discos foliares do consumo pelos insetos infestados, ao passo que o consumo de tecido verde total foi observado para o controle negativo e tecido não tratado (Tabela 10). A expressão transiente de proteína PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 1) foi confirmada por método de identificação de proteína com base em espectrometria de massa usando extratos de proteína tripsinizados de tecidos de folha coinfiltrados ((Patterson, (1998) 10(22):1-24, Current Protocol in Molecular Biology publicado por John Wiley & Son Inc) . A expressão transiente pode ser verificada através da utilização de polipeptideos PTIP-83 marcados com HA ou EPEA por análise Western das etiquetas HA ou EPEA.
Tabela 10
Expressão transiente Consumo de Discos Foliares (Escala 1 a 9)
FAW CEW SBL ECB
PtIP-83Aa 8,3 8,3 8, 6 8, 9
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Valor Descrição
1. disco foliar é maior que 90% consumido
2 disco foha·' é 70% - 80% consumido
3 disco foha·' é 50 - 70 % consumido
4 disco foliar é 50 - S0 % consumido
5 disco foliar é 40 - 50 % consumido
S disco foliar é menos que- 30% consumido
7 disco foliar é menos que 10% consumido
& disco foliar tem apenas alguns onficfos
S disco foliar não é tocado pelo inseto
[0478] A atividade de PtIP-83Fa (SEQ ID NO: 4) foi validada utilizando o sistema de expressão transiente de feijão arbusto e foi considerado comparável a PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 2). PtIP-83Fa (SEQ ID NO: 4) mostrou um espectro semelhante de atividade inseticida, exceto pela falta de atividade contra FAW (Tabela 11).
Tabela 11
Experiência transiente Consumo de Discos Foliares (Escala 1 a 9)
FAW CEW SBL ECB
PtIP-83Fa 1, 0 6, 8 8, 1 7,4
Vetor de Controle 1,7 2,3 1, 1 1, 8
branco 1, 0 1, 1 1,4 1, 0
[0479] Atividade de PtIP-83Ca (SEQ ID NO: 5), PtIP-83Cb (SEQ ID NO: 7) , PtIP-83Cc (SEQ ID NO: 9) , PtIP-83Cd (SEQ ID
NO: 11) , PtIP-83Ce (SEQ ID NO: 13), PtIP-83Cf (SEQ ID NO: 15),
PtIP-83Cg (SEQ ID NO: 17), PtIP-83Da (SEQ ID NO: 19), PtIP-83Ea (SEQ ID NO: 21), PtIP-83Eb (SEQ ID NO: 23), PtIP-83Fb (SEQ ID
NO: 716), PtIP-83Ch (SEQ ID NO: 754), semelhante a PtIP-83Ch (SEQ ID NO: 755), PtIP-83Fd (SEQ ID NO: 756), PtIP-83Fe (SEQ ID
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NO: 757), PtIP-83Ci (SEQ ID NO: 758), semelhante a PtIP-83Ci (SEQ ID NO: 759), PtIP-83Ff (SEQ ID NO: 760), semelhante a PtlP83Ff (SEQ ID NO: 761), e outros polipeptídeos como apresentados na Tabela 12 também foram validados utilizando um sistema de expressão transiente de feijão arbusto. Os espectros de atividade para todos os homólogos de PtIP-83 estão resumidos na Tabela 12, onde um + indica um escore de atividade média de <=60% de disco foliar consumido, um indica um escore de atividade médio de.>=60% de disco foliar consumido, e ND indica não determinado.
Tabela 12
SEQ ID NO: FAW CEW SBL ECB
PtIP-83Aa 1 + + + +
PtIP-83Ca 5 - + + +
PtIP-83Cb 7 + + + -
PtIP-83Cc 9 + + + +
PtIP-83Cd 11 + + + +
PtIP-83Ce 13 - + + +
PtIP-83Cf 15 - - + -
PtIP-83Cg 17 + + + +
PtIP-83Da 19 - - - -
PtIP-83Ea 21 - - - +
PtIP-83Eb 23 - - - -
PtIP-83Fa 3 - + + +
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PtIP-83Fb 716 + + +
PtIP-83Ch 754 - - - +
semelhante 755
a PtlP- - - - +
83Ch
PtIP-83Fd 756 - - + -
PtIP-83Fe 757 - - - -
PtIP-83Ci 758 + + + +
semelhante 759
a PtlP- + + + +
83C1
PtIP-83Ff 760 - - - -
semelhante 761
a PtlP-
83Ff + - + +
PtIP-83Fk 958 _ + + ND
PtIP-83Fl 959 + + + +
PtIP-83Fm 960 + + ND
PtIP-83Fn 961 + + _ ND
PtIP-83Cl 962 + + + +
PtIP-83Cm 963 + + + _
PtIP-83Cn 964 + + +
PtIP-83Co 965 _ _ + +
PtIP-83Fi 9 6 6 +
PtIP-83Fo 967 + _ _ +
PtIP-83Gb 968 + + + +
PtIP-83Fo 9 69 _ _ _ _
PtIP-83Fa 970 — — — —
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PtIP-83Fr 971 _ _ _ _
PtIP-83Fs 972 +
PtIP-83Ft 973 _ _ _ +
PtIP-83Gc 974
PtIP-83Fu 975 + _ _ +
PtIP-83Ha 976 + +
PtIP-83Gd 977 _ _ _ _
PtIP-83Hb 978 _ _ _ _
PtIP-83Ca 979 + +
PtIP-83Cr 980 _ _ + +
PtIP-83Cs 981 +
PtIP-83Ct 982 _ _ _ +
PtIP-83Cu 983 + +
PtIP-83Cv 984 _ _ _ +
PtIP-83Cw 985 +
PtIP-83Cx 986 _ _ + +
PtIP-83Ed 987 +
PtIP-83Ec 988 _ _ _ +
PtIP-83Fv 989 + +
PtIP-83Fw 990 + _ + _
PtIP-83Fx 991 _ _ _ _
PtIP-83Fv 992 + +
PtIP-83Fz 993 _ _ + +
PtIP-83Faa 994
PtIP-83Hc 995 _ _ _ _
PtIP-83Fab 99 6
PtIP-83Gf 997 _ _ _ _
PtIP-83Ga 998
PtIP-83Gh 999 + _ _ +
PtIP-83Gi 1000
PtIP-83G4 1001 _ _ _ _
PtIP-83Gk 1002 + +
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PtIP-83Fac 1003 _ _ _ +
PtIP-83Fad 1004 +
PtIP-83Cv 1005 _ _ + +
PtIP-83Fae 1006
PtIP-83Faf 1007 _ _ + +
PtIP-83Fah 1008 + +
PtIP-83Fai 1009 _ _ _ _
PtIP-83Fai 1010 _ _ _ _
PtIP-83Fak 1011
PtIP-83Fal 1012 _ _ _ _
PtIP-83Fam 1013
PtIP-83Fan 1014 _ _ _ _
PtIP-83Fat 1015 + + +
PtIP-83Fau 1016 + _ + +
PtIP-83Fav 1017 + + +
PtIP-83Faw 1018 + _ + +
PtIP-83Fas 1019 + + +
PtIP-83Faa 1020 + + _ +
PtIP-83Fan 1021 + +
PtIP-83Far 1022 _ _ _ _
PtIP-83Gl 1023 _ _ _ _
PtIP-83Gm 1024
PtIP-83Gn 1025 _ _ _ _
PtIP-83Fao 1026 — + + +
Exemplo 5: Expressão em Baculovirus de polipeptideos PtIP-83Aa [0480] 0 gene que codifica PtIP-83Aa SEQ ID NO: 2 foi subclonado no vetor pFastBac™ Dual (Invitrogen) com o códon de terminação removido para a tradução do terminal C de uma adição de lOx de marcador de histidina (SEQ ID NO: 27) e a sequência do polipeptideo PTIP-83Aa marcado com histidina é apresentada como
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SEQ ID NO: 2. Este vetor foi transformado em células DHIOBac para gerar baculovirus. Estes baculovirus foram utilizados para infetar células de insecto sf9 e incubados durante 72 horas a 27 °C. As células de inseto infetadas foram colhidas por centrifugação. 0 pélete de cultura celular foi suspenso com 100 mL de tampão de Use (1XPBS, glicerol a 10%, com inibidor de protease e benzonase) e incubado a 4 °C durante 5 min com agitação, depois homogeneizado duas vezes. O lisado foi centrifugado a 16000 rpm durante 20 min. O sobrenadante foi guardado e carregado em duas colunas de 2 mL de Resina de Ligação Ni-NTA Hi (Novagen, cat#70666) pré-equilibradas com tampão Elute (1XPBS, glicerol a 10%). As colunas foram então eluidas sequencialmente com 10 mL de tampão Elute contendo 10, 20, 50 e 250 mM de imidazol. As amostras foram analisadas por SDS-PAGE. As frações purificadas (E250) foram concentradas usando filtros de Ultra Centrifugação Amicon® 100K (Millipore) para ~0,5 mg/mL e demonstraram atividade inseticida contra CEW, ECB, FAW e SBL similar ao espectro de atividade obtido usando discos foliares que expressam transientes.
Exemplo 6: Transformação Mediada por Agrobacterium de Mais e Regeneração de Plantas Transgênicas [0481] Para transformação mediada por Agrobacteríum de milho com sequências de nucleotideo PtIP-83, tal como PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 2), PtIP-83Aa ModA (otimizado por códon) (SEQ ID NO: 28), e PtIP-83Aa ModB (otimizado por códon (SEQ ID NO: 29) o método de Zhao pode ser usado (Patente dos EUA N° 5, 981,840 e Publicação de Patente PCT N° WO 1998/32326; os conteúdos das quais são aqui incorporados a titulo de referência). Em resumo, embriões imaturos foram isolados de milho e os embriões são
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463/525 colocados em contato com uma suspensão de Agrobacterium sob condições nas quais as bactérias são capazes de transferir a sequência de nucleotídeos (PtIP-83Aa SEQ ID NO: 2, PtIP-83Aa ModA (otimizado por códon) - SEQ ID NO: 28, e PtIP-83Aa ModB (otimizado por códon - SEQ ID NO: 29) para pelo menos uma célula de, pelo menos, um dos embriões imaturos (etapa 1: a etapa de infecção) . Nesta etapa os embriões imaturos podem ser imersos em uma suspensão de Agrobacterium para o inicio da inoculação. Os embriões foram cocultivados por um tempo com o Agrobacterium (etapa 2: a etapa de cocultivar). Os embriões imaturos podem ser cultivados em meio sólido após a etapa de infecção. Após este período de cocultivo, é contemplada uma etapa de repouso opcional. Nessa etapa de repouso, os embriões foram incubados na presença de pelo menos um antibiótico conhecido por inibir o crescimento de Agrobacterium sem a adição de um agente seletivo para transformação de planta (etapa 3: etapa de repouso). Os embriões imaturos foram cultivados em um meio sólido com antibiótico, porém, um agente de seleção para eliminação de Agrobacterium e para uma fase de repouso para as células infectadas. Em seguida, embriões inoculados foram cultivados em meio que contém um agente seletivo e o cultivo de calo transformado é recuperado (etapa 4: etapa de selecionar). Os embriões imaturos foram cultivados em meio sólido com um agente seletivo resultando no crescimento seletivo de células transformadas. 0 calo foi então regenerado em plantas (etapa 5: a etapa de regenerar), e os calos cultivados em meio seletivo foram cultivados em meio sólido para regenerar as plantas.
Exemplo 7: Transformação e Regeneração de Soja (máx de Glicina)
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464/525 [0482] As linhagens de soja transgênica são geradas pelo método de bombardeamento por pistola de partículas (Klein et al. , Nature (London) 327:70-73 (1987); Patente dos EUA N° 4,945,050) com o uso de um instrumento BIORAD Biolistic PDS1000/He e DNA plasmidial ou de fragmento. As soluções de estoque e meios são usados para a transformação e regeneração de plantas de soja:
Soluções de estoque:
Estoque de Sulfato 100 X:
37,0 g de MgSO4.7H2O, 1,69 g de MnSO4.H2O, 0,86 g de ZnSO4.7H2O,
0, 0025 g de CuSO4.5H2O
Estoque de Haletos 100 X:
30,0 g de CaCl2.2H2O, 0, 083 g de Kl, 0, 0025 g de CoCl2.6H20
Estoque de P, B, Mo 100X:
18,5 g KH2PO4, 0,62 g de H3BO3, 0, 025 g de Na2Mo04.2H20
Estoque de Fe EDTA 100X:
3,724 g de Na2EDTA, 2,784 g de FeSO4.7H2O
Estoque de 2,4-D:
mg/mL de Vitamina
Vitaminas B5, Estoque 1000X:
100,0 g de mio-inositol, 1,0 g de ácido nicotínico, 1,0 g de piridoxina HC1, 10 g de tiamina.HCl.
Meios (por litro):
Meio Sólido SB199:
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465/525 pacote de sais MS (Gibco/ BRL - Cat. Cat. 11117-066), 1 mL de estoque 1000X de vitaminas B5, 30 g de Sacarose, 4 mL de
2,4-D (concentração final 40 mg/L), pH 7,0, 2 gm de Gelrite
Meio Sólido SB1:
pacote de sals MS (Gibco/ BRL - Cat. Cat. 11117-066), 1 mL de estoque 1000X de vitaminas B5, 31,5 g de Glicose, 2 mL de
2,4-D (concentração final de 20 mg/L), pH
5,7, 8 g de TC ágar
SB196:
mL de cada uma das soluções de estoque acima 1-4, 1 mL de estoque de Vitamina
B5, 0,463 g de (NH4)2 SO4,
2,83 g de
KNO3, mL de estoque 2,4
D, 1 g de asparagina, g
de Sacarose, pH
5, 7
SB71-4:
Sais B5 de Gamborg, g de sacarose, 5 g de TC ágar, pH 5,7.
SB103:
pacote de mistura de sals de Murashige e
Skoog, mL de estoque de Vitamina B5, 750 mg de hexa-hidrato de MgC12, g de maltose, g de Gelrite™, pH 5,7.
SB166:
SB103 complementado com 5 g por litro de carvão vegetal ativado.
Iniciação de Cultura em Suspensão Embriogênica da Soja:
[0483] As vagens com sementes imaturas de plantas de soja disponíveis 45 a 55 dias após o plantio são colhidas, removidas de suas cascas e colocadas em uma caixa de magenta esterilizada. As sementes de soja são esterilizadas agitando-se as mesmas por 15 min em uma solução de 5% de Clorox® com 1 gota
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466/525 de sabão Ivory™ (isto é, 95 mL de água destilada autoclavada mais 5 mL de Clorox® e 1 gota de sabão, bem misturadas) . As sementes são enxaguadas com o uso de 2 L de água destilada e aqueles menos de 3 mm são colocados em lâmina de microscópio individuais. A extremidade menor da semente é cortada e os cotilédones são pressionados para fora do revestimento das sementes. Os cotilédones são transferidos para as plantas que contêm meio SB199 (25 a 30 cotilédones por placa) por 2 semanas, então, transferidas para SB1 por 2 a 4 semanas. As placas foram enroladas com fita de fibra. Após esse tempo, os embriões secundários são cortados e colocados em meio liquido SB196 por 7 dias.
Condições de cultivo:
[0484] Culturas em suspensão embriogênica da soja (cv. 93Y21) foram mantidas em 50 mL de meio liquido SB196 em um agitador giratório, 100 a 150 rpm, 26 °C em fotoperiodo de 16:8 h dia/noite em intensidade de luz de 80 a 100 pE/m2/s. As culturas são subcultivadas a cada 7 a 14 dias por meio de inoculação até a quantidade de tecido do tamanho de U moeda de dez centavos (nódulos agrupados juntos) em 50 mL de liquido fresco SB196.
Preparação de DNA para Bombardeamento:
[0485] Em procedimentos de bombardeamento por pistola de partículas, é possível usar 1) todo o DNA plasmidial purificado; ou 2) fragmentos de DNA contendo apenas o cassete (ou cassetes) de expressão de DNA recombinante de interesse. Para cada uma das dezessete transformações de bombardeamento, 85 pL de suspensão são preparados contendo 1 a 90 picogramas (pg)
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467/525 de DNA plasmidial por par básico de cada plasmídeo de DNA. Os plasmídeo de DNA ou fragmentos são coprecipitados em partículas de ouro conforme segue. Os DNAs em suspensão são adicionados à 50 pL de uma suspensão de partículas de ouro de 10 a 60 mg/mL 0,6 pm e, então, combinados com 50 pL de CaC12 (2,5 M) e 20 pL de espermidina (0,1 M). A mistura é submetido a vórtice por 5 s, girada em uma microcentrífuga por 5 s, e o sobrenadante foi removido. As partículas revestidas de DNA são, então, lavadas uma vez com 150 pL de 100% de etanol, submetidas a vórtice e giradas em uma microcentrífuga novamente, então, ressuspensas em 85 pL de etanol anidro. Cinco pL das partículas de ouro revestido de DNA são, então, carregadas em cada disco de macrocarreador.
Preparação de Tecido e Bombardeamento com DNA:
[0486] Aproximadamente 100 mg de cultura de suspensão de duas semanas de idade são colocados em uma placa de petri de 60 mm X 15 mm vazia e o líguido residual foi removido do tecido com o uso de uma pipeta. O tecido é colocado em cerca de 8,89 cm (3,5 polegadas) distante da peneira de retenção e cada placa de tecido é bombardeada uma vez. A pressão de ruptura de membrana é definida a 4,48 MPa (650 psi) e a câmara é evacuada para 71,12 cm (-28 polegadas) de Hg. Seguindo-se o bombardeamento, o tecido de cada placa é dividido entre dois frascos, colocados de volta no meio líguido e cultivados conforme descrito acima.
Seleção de Embriões Transformados e Regeneração de Planta:
[0487] Após bombardeamento, o tecido de cada placa bombardeada é dividido e colocado em dois frascos de meio de manutenção de cultura de líguido SB196 por placa de tecido bombardeado. Sete dias pós bombardeamento, o meio líguido em
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468/525 cada frasco é substituído por meio de manutenção de cultura de SB196 fresco complementado com 100 ng/mL de agente seletivo (meio de seleção). Para a seleção de células de soja transformadas o agente seletivo usado pode ser um composto de sulfonilureia (SU) com o nome químico, 2-cloro-N-((4-metoxi-6 meti-1,3,5-triazina2-il)aminocarbonil) benzenossulfonamida (nomes comuns: DPXW4189 e clorossulforon). O clorossulfuron é o ingrediente ativo no herbicida de sulfonilureia da DuPont, GLEAN®. O meio de seleção contendo SU é substituído a cada duas semanas por 8 semanas. Após o período de seleção de 8 semanas, as ilhas de tecido transformado verde são observadas crescendo a partir de agrupamentos embriônicos necróticos não transformados. Os eventos transgênicos putativos são isolados e mantidos em meio líquido SB196 com SU a 100 ng/mL por mais 5 semanas com alterações de meios a cada 1 a 2 semanas para gerar culturas de suspensão embriogênica novas, propagadas em termos de clonagem e transformadas. Os embriões permaneceram em contato com SU um total de cerca de 13 semanas. As culturas de suspensão são subcultivadas e mantidas como agrupamentos de embriões imaturos e também regenerados em plantas totais por meio de maturação e germinação de embriões somáticos individuais.
[0488] Os embriões somáticos se tornaram adequados para a germinação após quatro semanas em meio de maturação (1 semana em SB166 seguido por 3 semanas em SB103). Os mesmos são, então, removidos do meio de maturação e secos em placa de petri vazias por até sete dias. Os embriões secos são, então, plantados em meio SB71-4 em que são permitidos a germinar sob a mesma luz e condições de temperatura conforme descrito acima. Os embriões
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469/525 germinados são transferidos para o meio de plantio em potes e cultuados até a maturidade para produção de semente.
Exemplo 8 - Transformação por bombardeamento de Partículas e Regeneração de Plantas Transgênicas [0489] Os embriões de mais imaturos de plantas doadoras de estufa são bombardeados com um plasmídeo que contém uma sequência de nucleotídeo que codifica a proteína inseticida. As espigas são descascadas e esterilizadas em superfície em 30% de alvejante Clorox® mais 0,5% de Micro detergente por 20 minutos e enxaguadas duas vezes com água estéril. Os embriões imaturos são retirados e colocados com o eixo geométrico de embrião invertido (escutelo para cima), 25 embriões por placa, em meio 560Y por 4 horas e, então, alinhados na zona alvo de 2,5 cm em preparação para bombardeamento. Um DNA de vetor de plasmídeo que compreende a sequência de nucleotídeo que codifica a proteína inseticida ligada operacionalmente a um promotor é precipitado em péletes de tungstênio de 1,1 pm (diâmetro médio) usando um procedimento de precipitação de CaC12 conforme o seguinte: 100 pL de partículas de tungstênio preparadas em água; 10 pL (1 pg) de DNA em tampão Tris EDTA (1 pg de DNA total); 100 pL de CaCl2 a 2,5 M e 10 pL de espermidina a 0,1 M.
[0490] Cada reagente é adicionado sequencialmente à suspensão de partícula de tungstênio, enquanto mantido no vortexer de múltiplos tubos. A mistura final é sonicada brevemente e permitida incubar sob vortexação constante por 10 minutos. Após o período de precipitação, os tubos são centrifugados brevemente, o líquido é removido, são lavados com 500 mL de etanol a 100% e centrifugados por 30 segundos. Novamente, o líquido é removido, e 105 pL de etanol a 100% são
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470/525 adicionados ao pélete de partícula de tungstênio final. Para bombardeamento de pistola de partículas, as partículas de tungstênio/DNA são brevemente sonicadas e manchadas com 10 pL no centro de cada macrocarreador e permite-se que sequem por cerca de 2 minutos antes do bombardeamento. As placas de amostra são bombardeadas em nível n° 4 em uma pistola de partículas. Todas as amostras receberam uma única dose a 3,1 MPa (650 PSI), com um total de dez alíquotas tomadas de cada tubo de partículas preparadas/DNA [0491] Após o bombardeamento, os embriões são mantidos em meio 560Y por 2 dias, então, transferidos para o meio de seleção 560R que compreende 3 mg/L de Bialafos, e subcultivados a cada 2 semanas. Após aproximadamente 10 semanas de seleção, os clones de calo resistentes à seleção são transferidos para meio 288J para iniciar a regeneração de planta. Após a maturação de embrião somático (2 a 4 semanas), os embriões somáticos bem desenvolvidos são transferidos para o meio para germinação e transferidos para o ambiente de cultura iluminado. Aproximadamente 7 a 10 dias depois, as plântulas em desenvolvimento são transferidas para meio sem hormônio 272V em tubos por 7 a 10 dias até as plântulas estarem bem estabelecidas. As plantas são, então, transferidas para insertos em elementos planos (equivalente a um vaso de 6,35 cm (2,5'')) contendo terra para vaso e cultivadas por 1 semana em uma câmara de crescimento, subsequentemente cultivadas por mais 1 a 2 semanas na estufa, depois transferidas para vasos Classic 600 (6,06 litros (1,6 galão)) e cultivadas até à maturidade. As plantas são monitoradas e pontuadas por expressão de um PtIP-83 por ensaios conhecidos na técnica, como, por exemplo, imunoensaios e Western blotting.
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471/525 [0492] As plantas de mais transgênicas positivas para expressão das proteínas inseticidas são testadas pela atividade pesticida com o uso de bioensaios padrão conhecidos na técnica. Tais métodos incluem, por exemplo, bioensaios de remoção de raiz e bioensaios de planta total. Consultar, por exemplo, a Publicação de Pedido de Patente dos EUA N° 2003/0120054 e a Publicação Internacional WO 2003/018810.
[0493] O meio de bombardeamento (560Y) compreende sais basais N6 a 4,0 g/L (SIGMA C-1416), mistura de vitamina de Eriksson a 1,0 mL/L (1000 vezes, SIGMA-1511), HCI de tiamina a 0,5 mg/L, sacarose a 120,0 g/L, 2,4-D a 1,0 mg/L e L-prolina a 2,88 g/L (levada até o volume com D-l H2O após o ajuste a pH 5,8 com KOH) ; Gelrite a 2,0 g/L (adicionado após levado ao volume com D-l H2O) e de nitrato de prata a 8,5 mg/L (adicionado após esterilizar o meio e resfriar à temperatura ambiente). O meio de seleção (560R) compreende sais basais N6 a 4,0 g/L (SIGMA C1416), mistura de vitamina de Eriksson a 1,0 mL/L (1000 vezes, SIGMA-1511), HCI de tiamina a 0,5 mg/L, sacarose a 30,0 g/L e 2,4-D a 2,0 mg/L (levado até o volume com D-I H2O após o ajuste a pH 5,8 com KOH); Gelrite a 3,0 g/L (adicionado após levado ao volume com D-I H2O) e de nitrato de prata a 0,85 mg/L e bialafos a 3,0 mg/L (adicionado após esterilizar o meio e resfriar à temperatura ambiente).
[0494] O meio de regeneração de planta (288J) compreende sais MS a 4,3 g/L (GIBCO 11117-074), solução de estoque de vitaminas MS a 5,0 mL/L (0,100 g de ácido nicotinico, HCI de tiamina a 0,02 g/L, HCI de piridoxina a 0,10 g/L e glicina a 0,40 g/L levada ao volume com D-I D-I H2O polido) (Murashige e Skoog (1962) Physiol. Plant. 15:473), mio-inositol a 100 a mg/L,
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472/525 zeatina a 0,5 mg/L, sacarose a 60 g/L e 1,0 mL/L de ácido abscisico a 0,1 mM (levado ao volume com D-I H2O polido após ajuste a pH 5,6); Gelrite a 3,0 g/L (adicionado após levar ao volume com D-I H2O) ; e ácido indoleacético a 1,0 mg/L e bialafos a 3,0 mg/L (adicionado após esterilizar o meio e resfriar a 60 °C) . O meio sem hormônios (272V) compreende sais MS a 4,3 g/L (GIBCO 11117-074), solução de estoque de vitaminas MS a 5,0 mL/L (ácido nicotínico a 0,100 g/L, HC1 de tiamina a 0,02 g/L, HC1 de piridoxina a 0,10 g/L e glicina a 0,40 g/L levada ao volume com D-I H2O polido), mio-inositol a 0,1 g/L e sacarose a 40,0 g/L (levada ao volume com D-I H2O polido após ajustar o pH a 5,6); e bacto-ágar a 6 g/L (adicionado após levar ao volume com D-I H2O polido), esterilizado e resfriado a 60 °C.
Exemplo 9. Eficácia do Controle de Insetos de Plantas de Soja e Milho Transformadas de Forma Estável Contra Amplo Espectro de Insetos Lepidópteros [0495] Os discos foliares foram retirados de plantas transformadas e testados para atividade inseticida de polipeptideos PtIP-83 contra a Lagarta falsa-medideira (SBL) (Chrysodeíxís íncludens) r Lagarta da espiga, (CEW) (Helicoverpa zea), Broca europeia do milho (ECB) (Ostrínía nubílalís), Lagarta da soja (VBC) (Antícarsía gemmatalís) e Lagarta-docartucho do milho (Spodoptera frugiperda) .
Exemplo 10. Quimeras entre PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 1) e PtIP-50Aa (SEQ ID NO: 34) [0496] Para gerar variantes ativas de componente único com sequências diversificadas, quimeras entre os polipeptideos 83Aa (SEQ ID NO: 1) e PtIP50Aa (SEQ ID NO: 34) foram geradas por
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473/525 montagem de sobreposição de fragmentos de multi-PCR (Gibson
Assembly Cloning Kit, New England Biolabs Inc.). Um total de 6 quimeras foram construídas: A Tabela 13 mostra os pontos de cruzamento e a % de identidade de sequência com PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 1).
Tabela 13
Designação de Quimera poli- nucleotíd eo Início do cruzamento Final do cruzamento Identidade de sequência para PtlP8 3Aa Lagarta da soja ativa
Quimera 1 SEQ ID NO: 640 SEQ ID NO: 634 Q334 S473 94 Não
Quimera 2 SEQ ID NO: 641 SEQ ID NO: 635 G469 N615 95 Não
Quimera 3 SEQ ID NO: 642 SEQ ID NO: 636 P610 E713 95 Sim
Quimera 4 SEQ ID NO: 643 SEQ ID NO: 637 P754 E873 94 Não
Quimera 5 SEQ ID NO: 638 F823 E873 98 Sim
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SEQ ID NO: 644
Quimera 6 SEQ ID NO: 645 SEQ ID NO: 639 Q334 E713 85 Não
[0497] Os números de posição de cruzamento são baseados no alinhamento mostrado na Figura 3 [0498] Os genes quimera foram clonados em um vetor de expressão transiente de planta e os ensaios de atividade SBL foram realizados como descrito no Exemplo 4.
Exemplo 11 - Identificação de motivos que afetam a função proteica de PtIP-83Aa [0499] Para identificar o espaço da sequência que afeta a estabilidade estrutural da proteína e a função inseticida de PtIP-83Aa, cinco motivos únicos foram identificados pelo alinhamento de aminoácidos entre PtIP-83Aa, PtIP-50Aa (SEQ ID NO: 34), PtIP-50Ba (SEQ ID NO: 35), PtIP-50Bb (SEQ ID NO: 36), e PtIP-83Fa (SEQ ID NO: 3) (Figura 4a-4d). Três motivos conservados: aminoácidos V53-P66 de SEQ ID NO: 1 foram definidos como Motivo A, aminoácidos Q363-N373 de SEQ ID NO: 1 como Motivo B e aminoácidos W556-A564 de SEQ ID NO: 1 como Motivo C. Outros dois motivos variáveis foram também escolhidos: aminoácidos L646-W655 de SEQ ID NO: 1 como Motivo D e aminoácidos R771-Y786 de SEQ ID NO: 1 como Motivo E. Os iniciadores de mutagénese por saturação foram concebidos para estes cinco motivos como mostrado na Tabela 14, Tabela 15, Tabela 16, Tabela 17 e Tabela
18. A mutagénese por saturação foi realizada usando o Kit de Mutagénese Sítio Dirigida QuikChange® Lightning da Agilent. As
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475/525 mutações foram introduzidas por amplificação de um vetor de expressão de plantas contendo o polinucleotídeo de SEQ ID NO: 2 que codifica o polipeptídeo PTIP-83Aa (SEQ ID NO: 1) utilizando iniciadores complementares direto e reverso contendo um codão degenerado NNK na posição alvo. As substituições de aminoácidos em cada posição alvo foram identificadas por sequenciamento de DNA. A expressão transiente de plantas e os ensaios de atividade SBL foram realizados como descrito no exemplo 4. As substituições de aminoácidos identificadas no Motivo A, Motivo B, Motivo C, Motivo D e Motivo E de PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 1) e as substituições de aminoácidos com atividade inseticida são mostradas na Tabela 14, Tabela 15, Tabela 16, Tabela 17 e Tabela 18, respectivamente.
Tabela 14
Posição Nome do Oligo Iniciado r Substituições i den ti fi cada s Substituições ativas t
083SM- SEQ ID A, C, D, E, F, G, Η, K, L, A, C, T
V53 V53-F NO: 38 N, P, Q, R, S, T, Y
083SM- SEQ ID A, C, D, E, F, G, Η, I, L, A, C, D, E, G, Η, I,
K54 K54-F NO: 39 Μ, N, P, Q, R, S, T, V, W, L, Μ, N, Q, R, S, T
083SM- SEQ ID Y
K54-R NO: 40
083SM- SEQ ID A, D, E, F, G, Η, K, L,M, A, D, E, F, G, Η, K,
R55-F NO: 41 N, P, Q, S, T, V, W, Y L,M,N, Q, S, T, V,
R55 083SM- SEQ ID W, Y
R55-R NO: 42
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L56 083SM- L56-F SEQ NO: ID 43 A, D, E, F, G, Ι,Μ,Ν, P, Q,R, S, T,V,W, Y E, F, Ι,Μ, T, V
083SM- L5 6-R SEQ NO: ID 44
083SM- SEQ ID A, C, D, E, G, Η, I, K, L, C, I, L,M, T, V
Y57-F NO: 45 Μ, N, P, Q, R, S, T, V
Y57 083SM- SEQ ID
Y57-R NO: 46
083SM- SEQ ID A, C, D, F, G, Η, I, K, L, C, I, L
V58-F NO: 47 N,P,Q,R,S,T,W,Y
V58 083SM- SEQ ID
V58-R NO: 48
083SM- SEQ ID A, C, D, E, G, Η, I, K, L, L,M, V, Y
F59-F NO: 49 Μ, N, P, Q, R, S, T, V, Y
F59 083SM- SEQ ID
F59-R NO: 50
083SM- SEQ ID C, D, E, F, G, Η, I, L,M, C, G, S, T, V
A60-F NO: 51 N, P, Q, R, S, T, V, Y
A6 0 083SM- SEQ ID
A60-R NO: 52
083SM- SEQ ID C,E, F,G,H, I,K,L,N, E, H, S
D61 D61-F NO: 53 P, Q, R, S, T, V, W, Y
083SM- SEQ ID
D61-R NO: 54
V62 083SM- V62-F SEQ NO: ID 55 A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L,M,N, P,R, S, T, Y A, C, I, L, T
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083SM- V62-R SEQ ID NO: 5 6
V63 083SM- V63-F SEQ ID NO: 57 A,C,G,H, I,K,L,M,N, P,Q,R,S,T,W,Y A, C, I, L,M, T
083SM- V63-R SEQ ID NO: 58
E64 083SM- E64-F SEQ ID NO: 59 A,C, F,G,H, I,L,M,N, P, Q, R, S, T, V, W, Y A, C, F, G, Η, I, L, Μ, N, Q, R, S, T, V, W, Y
083SM- E64-R SEQ ID NO: 60
L65 083SM- L65-F SEQ ID NO: 61 A,C,D, F,G,H, Ι,Μ,Ν, P, Q, R, S, T, V, W, Y A,C, Ε,Η, Ι,Μ,Ν, Q, T, V, W
083SM- L65-R SEQ ID NO: 62
P 6 6 083SM- P66-F SEQ ID NO: 63 A, C, D, E, F, G, I, K, L, Μ, N, Q, R, S, T, V, W, Y D, G,M, Q, R
083SM- P66-R SEQ ID NO: 64
t Substituições ativas: escore médio de atividade <= 60% do disco foliar consumido
Tabela 15
Posição Nome do Oligo Sequência do Iniciador Substituições i den ti fi cada s Substituições ativas
Q363 083SM- Q363-F SEQ ID NO: 65 A, C, E, F, G, Η, K, L, N, P,R, S, T,V,W A, C, E, F, G, Η, K, L, N,R, S, T,V,W
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083SM- Q363-R SEQ ID NO: 66
1364 083SM- I364-F SEQ ID NO: 67 A, C, D, E, F, G, Η, K, L,M,N,P,Q,R,S,T, V,W, Y A, C, E, F, Η, K, L,M, N, Q, S, T, V, W, Y
083SM- I364-R SEQ ID NO: 68
L365 083SM- L3 65-F SEQ ID NO: 69 A, E, F, G, Η, I, K,M, N, P, R, S, T, V, W, Y A, E, F, G, Η, I, K,M, N,R,V,W, Y
083SM- L3 65-R SEQ ID NO: 70
G366 083SM- G366-F SEQ ID NO: 71 A, C, E, F, Η, I, K, L, M,N, P,R, S, T,V,W A, C, F, Η, I, K, L,M, N, S,T,V
083SM- G366-R SEQ ID NO: 72
S367 083SM- S367-F SEQ ID NO: 73 A, C, D, E, F, G, Η, I, L, Μ, N, P, Q, R, T, V, W A, C, D, E, F, G, Η, I, L, Μ, N, P, Q, R, T, V, W
083SM- S367-R SEQ ID NO: 74
Y368 083SM- Y368-F SEQ ID NO: 75 A, C, D, E, F, G, Η, I, K,L,M,N,P,Q,R,S, T, V, W A, C, D, E, F, G, Η, I, K,L,M,N,P,Q,R,S, T, V, W
083SM- Y368-R SEQ ID NO: 76
L369 083SM- L369-F SEQ ID NO: 77 A, C, D, F, G, H, I,M, N, P, R, S, T, V A, C, D, F, G, Ι,Μ, T, V
083SM- L369-R SEQ ID NO: 78
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L370 083SM- L370-F SEQ ID NO: 79 A, C, D, E, F, G, Η, I, Κ,Μ, N, P, Q, R, S, T, V,W, Y A, C, D, E, F, G, Η, I, K, M, Q, R, S, T, V, W, Y
083SM- L370-R SEQ ID NO: 80
Q371 083SM- Q371-F SEQ ID NO: 81 A, C, D, E, F, G, I, K, L,N,R, S, T,V,W A, C, D, E, F, G, I, K, L,N,R, S, T,V,W
083SM- Q371-R SEQ ID NO: 82
Q372 083SM- Q372-F SEQ ID NO: 83 A, C, D, F, G, Η, I, L, N, R, S, T, V, Y A, C, D, F, G, Η, I, L, N, R, S, V, Y
083SM- Q372-R SEQ ID NO: 84
N373 083SM- N373-F SEQ ID NO: 85 A, C, D, F, G, Η, I, K, L,M, P, Q, R, S, T, V, W, Y A, C, D, F, G, Η, I, K, Q, S,T, V, W
083SM- N373-R SEQ ID NO: 86
Tabela 16
Posição Nome do Oligo Sequência do Iniciador Substituições i den ti fi cada s Substituições ativas
W55 6 083SM- W556-F SEQ ID NO: 87 A, C, D, F, G, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, S, T, V, Y F, T, Y
083SM- W55 6-R SEQ ID NO: 88
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480/525
Posição Nome do Oligo Sequência do Iniciador Substituições i den ti fi cada s Substituições ativas
R557 083SM- R557-F SEQ ID NO: 89 C, D, G, Η, I, K, L,M, N, P, Q, S, T, V, W, Y C, D, G, Η, I, K, L,M ,N, P, Q, S, T, V, W, Y
083SM- R557-R SEQ ID NO: 90
A558 083SM- A558-F SEQ ID NO: 91 C, D, F, G, Η, I, K, L, N, P, Q, R, S, V, W, Y C, D, F, G, Η, I, K, L , N, P, Q, R, S, V, W, Y
083SM- A558-R SEQ ID NO: 92
K559 083SM- K559-F SEQ ID NO: 93 A,C, F,G,H, I,L,N, P, Q, R, S, T, V, Y A,C, F,G,H, I,L,N , Q, R, S, T, V, Y
083SM- K559-R SEQ ID NO: 94
C560 083SM- C560-F SEQ ID NO: 95 A, D, F, G, Η, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, S, T, V, Y A, F, G, Ι,Μ,Ν, R, S , T, V
083SM- C560-R SEQ ID NO: 96
K561 083SM- K561-F SEQ ID NO: 97 A, C, D, E, F, G, Η, I, L,M,N, P,R, S, T,V, Y A, C, D, E, F, G, Η, I , L, Μ, N, R, S, T, V, Y
083SM- K561-R SEQ ID NO: 98
N562 083SM- N562-F SEQ ID NO: 99 C, D, E, G, H, L,M, R , S,T, V, Y
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Posição Nome do Oligo Sequência do Iniciador Substituições i den ti fi cada s Substituições ativas
083SM- N562-R SEQ ID NO: 100 A, C, D, E, F, G, Η, K, L,M, P,R, S, T,V,W, Y
V563 083SM- V563-F SEQ ID NO: 101 A, C, D, F, G, Η, I, K, L,M,N,P,Q,R,S,T, W A, C, D, F, Η, I, L,M ,N, Q, T, W
083SM- V563-R SEQ ID NO: 102
A564 083SM- A564-F SEQ ID NO: 103 C, D, F, G, Η, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y C, G,M, Q, S, T, V, W , Y
083SM- A564-R SEQ ID NO: 104
Tabela 17
Posição Nome do Oligo Sequência do Oligo Substituições i den ti fi cada s Substituições ativas
L64 6 083SM- L646-F SEQ ID NO: 105 A, C, D, E, F, G, Η, I, K,M,N,P,Q,R,S,T, V,W, Y A, C, G, Ι,Μ,Ν, Q, S, T, V
083SM- L646-R SEQ ID NO: 106
L647 083SM- L647-F SEQ ID NO: 107 A, D, F, G, Η, I, K,M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y D, G,M,N, Q, T
083SM- L647-R SEQ ID NO: 108
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482/525
M648 083SM- M648-F SEQ ID NO: 109 A, C, D, E, F, G, Η, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y A, C, D, E, F, G, H, K,L,N,P,Q,R,S, T,V,W, Y
083SM- M648-R SEQ ID NO: 110
P649 083SM- P649-F SEQ ID NO: 111 A, C, D, E, F, G, Η, I, K,L,M,N,Q,R,S,T, V,W, Y A, C, D, E, F, G, H, K,M,N,Q,R,S,T, W, Y
083SM- P649-R SEQ ID NO: 112
T650 083SM- T650-F SEQ ID NO: 113 A, C, D, F, G, Η, I, K, L,M, P, Q, R, S, V, Y A, C, D, F, G, Η, I, K, L,M, P, Q, R, S, V, Y
083SM- T650-R SEQ ID NO: 114
E651 083SM- E651-F SEQ ID NO: 115 A, C, D, G, Η, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y A, C, D, G, Η, I, L, M,N,P,Q,R,S,T, V, Y
083SM- E651-R SEQ ID NO: 116
L652 083SM- L652-F SEQ ID NO: 117 A, C, D, E, F, G, Η, I, K,M,N,P,Q,R,S,T, V, Y C, F, I, Κ,Μ, P, R, S, T, V
083SM- L652-R SEQ ID NO: 118
T653 083SM- T653-F SEQ ID NO: 119 C, D, E, F, G, Η, I, K, L, P,R, S,V,W C, D, E, F, G, Η, I, K, L, P, R, S, V, W
083SM- T653-R SEQ ID NO: 120
T654 083SM- T654-F SEQ ID NO: 121 A, C, F, Η, I, K, L,M, N, P, Q, R, S, V, W, Y A, C, F, I, K, L,M, P,R, S,V,W, Y
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 486/553
483/525
083SM- T654-R SEQ ID NO: 122
W655 083SM- W655-F SEQ ID NO: 123 Α,Ο,Ε, F,G,L,N,Q, R, S,T, V, Y F, Y
083SM- W655-R SEQ ID NO: 124
Tabela 18
Posição Nome do Oligo Sequência do Iniciador Substituições i den ti fi cada s Substituições ativas
R771 083SM- R771-F SEQ ID NO: 125 A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L,N, P, S, T, V, W, Y A, D, E, F, G, Η, I, K , L, N, S, T, V, W, Y
083SM- R771-R SEQ ID NO: 126
R772 083SM- R772-F SEQ ID NO: 127 A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L,M, P, Q, S, T, V, W, Y A, C, D, E, F, G, Η, I , K, L,M, P, Q, S, T, V,W, Y
083SM- R772-R SEQ ID NO: 128
D773 083SM- D773-F SEQ ID NO: 129 A, C, E, F, G, Η, I, K, L,M,N,P,Q,R,S,T, V,W, Y A, E, F, G, Η, I, K, L , Μ, N, Q, R, S, T, V, W, Y
083SM- D773-R SEQ ID NO: 130
Q774 083SM- Q774-F SEQ ID NO: 131 A, D, G, Η, I, K, L,M, N, P,R, S, T,V,W, Y A, D, G, Η, I, K, L,M ,N, P,R, S, T,V,W, Y
083SM- Q774-R SEQ ID NO: 132
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Posição Nome do Oligo Sequência do Iniciador Substituições i den ti fi cada s Substituições ativas
V7 7 5 083SM- V775-F SEQ ID NO: 133 A, C, D, E, G, Η, I, L, M,N,P,Q,R,S,T,Y A,C,D,E,G,H, I,N , P, Q, R, S, T, Y
083SM- V775-R SEQ ID NO: 134
L776 083SM- L776-F SEQ ID NO: 135 A, C, D, E, F, G, Η, I, K, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y A, C, D, E, F, G, Η, I ,K,N,P,Q,R,S,T, V, Y
083SM- L776-R SEQ ID NO: 136
P777 083SM- P777-F SEQ ID NO: 137 A, C, D, E, F, G, Η, K, L, Μ, N, Q, R, S, T, V, W, Y A, C, D, E, F, G, Η, K , L,M,N, Q, S, T, V, W, Y
083SM- P777-R SEQ ID NO: 138
F778 083SM- F778-F SEQ ID NO: 139 A, D, G, Η, I, K, L,M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y A,H, I,L,M,N,Q,S ,V,W, Y
083SM- F778-R SEQ ID NO: 140
Q779 083SM- Q779-F SEQ ID NO: 141 A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, N, P, R, S, T, V, W A, C, D, E, G, Η, K, L ,N, P,R, S, T,V
083SM- Q779-R SEQ ID NO: 142
A7 8 0 083SM- A780-F SEQ ID NO: 143 C,N, P, Q, S
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Posição Nome do Oligo Sequência do Iniciador Substituições i den ti fi cada s Substituições ativas
083SM- A780-R SEQ ID NO: 144 C, D, E, F, G, Η, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y
A7 81 083SM- A781-F SEQ ID NO: 145 C, D, E, F, G, Η, I, L, Μ, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y C,D,E, F,G,H, I,N , Q, R, S, T, V, W, Y
083SM- A781-R SEQ ID NO: 146
A782 083SM- A782-F SEQ ID NO: 147 C, D, E, F, G, Η, I, K, L,M,N,P,Q,R,S,T, V,W, Y C, D, E, F, G, Η, I, K ,M, P, Q, R, S, T, V, W, Y
083SM- A782-R SEQ ID NO: 148
P783 083SM- P783-F SEQ ID NO: 149 A, C, D, E, F, G, Η, I, L, Μ, N, Q, R, S, T, V, Y A, C, D, E, G, Η, N, Q , R, S,T,V
083SM- P783-R SEQ ID NO: 150
L784 083SM- L784-F SEQ ID NO: 151 A, C, D, E, F, G, Η, I, K,M,N,P,Q,R,S,T, V,W, Y Α,Ε, Ε,Η, Ι,Κ,Μ,Ν , P, Q, S, T, V, W
083SM- L784-R SEQ ID NO: 152
N785 083SM- N785-F SEQ ID NO: 153 A, C, E, F, G, Η, I, K, L,M, P, Q, R, S, T, V, W, Y A, C, E, F, G, Η, I, K , L,M, Q, R, S, T, V, W, Y
083SM- N785-R SEQ ID NO: 154
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Posição Nome do Oligo Sequência do Iniciador Substituições i den ti fi cada s Substituições ativas
Y786 083SM- Y786-F SEQ ID NO: 155 C, D, E, F, G, Η, I, K, L,M,N,P,Q,R,S,T, V, W F, I,L,W
083SM- Y786-R SEQ ID NO: 156
Exemplo 12 - Variantes de PtIP-83Aa com múltiplas substituições de aminoácido no Motivo A ou Motivo C [0500] As variantes de PtIP-83Aa com múltiplas substituições de aminoácidos dentro de um motivo foram construídas para Motivo A e Motivo C usando o Kit de Mutagênese Sítio Dirigida QuikChange® Lightning (Agilent) (como descrito no Exemplo 11)r ou por montagem de sobreposição de fragmentos de multi-PCR (Gibson Assembly Cloning Kit, New England Biolabs Inc.) em um vetor transiente de plantas contendo o promotor DMMV viral. Os iniciadores usados na construção de combinações de mutações dentro de um motivo individual estão resumidos na Tabela
19. As bibliotecas combinatórias resultantes foram transformados em Agrobacteríum para expressão transiente em plantas e subsequentes ensaios de atividade SBL como descrito no Exemplo 4. Variantes ativas, definidas como tendo um escore de atividade médio de <=60% do disco foliar consumido, foram enviadas para identificação da sequência.
Tabela 19
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Bibliote ca Iniciador Sequência
Motivo A Combi -1 83M1- CombiFl CTCGAGGGAGCCGAGAAAGTGADGCRSYTCTATRTCTTKDSC GACRTCVTCGWGVTCCCAGTCGTGGAATGGCGGTGG SEQ ID NO: 157
83M1- CombiF2 CTCGAGGGAGCCGAGAAAGTGADGCRSYTCVTCRTCTTKDSC GACRTCVTCGWGVTCCCAGTCGTGGAATGGCGGTGG SEQ ID NO: 158
83M1- CombiRCl CCACCGCCATTCCACGACTGGGABCWCGABGAYGTCGSHMAA GAYATAGARSYGCHTCACTTTCTCGGCTCCCTCGAG SEQ ID NO: 159
83M1- CombiRC2 CCACCGCCATTCCACGACTGGGABCWCGABGAYGTCGSHMAA GAYGABGARSYGCHTCACTTTCTCGGCTCCCTCGAG SEQ ID NO: 160
Motivo A Combi -2 83MlCmb2- R CGGCCACCGCCATTCCACGACTGGTAGCWCGABAAYGTCGSH AAAAAYATACAASYGCHTCACTTTCTCGGCTCCCTCGAGCTG SEQ ID NO: 161
GZ550- 83Aa-F AATCTCTCATCTAAGAGGCTGGATCCTAGGATGGCTCTCGTG GATTACGGC SEQ ID NO: 162
GZ550- 83Aa-R TGGCCAATCCAGAAGATGGACAAGTCTAGACTACTCTTCGTC GTGCCGCCAG SEQ ID NO: 163
83MlCmb2- 3p-F CTACCAGTCGTGGAATGGCGGTGGCCG SEQ ID NO: 164
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Motivo C Combi PtIP-83- MotivoC- Combi-Fl GTCTCGGAGGTTCCGGTGTGGABSGBCMRGTGCAASWSCGTG GCTGCACTGGGTCGGGAGATG SEQ ID NO: 165
PtIP-83- MotivoC- Combi-F2 GTCTCGGAGGTTCCGGTGTGGCWSGBCMRGTGCAASWSCGTG GCTGCACTGGGTCGGGAGATG SEQ ID NO: 166
PtIP-83- MotivoC- Combi-F3 GTCTCGGAGGTTCCGGTGTGGABSGBCMRGTGCAASMATGTG GCTGCACTGGGTCGGGAGATG SEQ ID NO: 167
PtIP-83- MotivoC- Combi-F4 GTCTCGGAGGTTCCGGTGTGGCWSGBCMRGTGCAASMATGTG GCTGCACTGGGTCGGGAGATG SEQ ID NO: 168
GZ550- 83Aa-F AATCTCTCATCTAAGAGGCTGGATCCTAGGATGGCTCTCGTG GATTACGGC SEQ ID NO: 162
GZ550- 83Aa-R TGGCCAATCCAGAAGATGGACAAGTCTAGACTACTCTTCGTC GTGCCGCCAG SEQ ID NO: 163
PtIP-83- MotivoC- Gibson-R CACCGGAACCTCCGAGACTTCCGTT SEQ ID NO: 171
[0501] Duas bibliotecas com diferentes taxas de mutação foram analisadas para o Motivo A. O Motivo A Combi-1 contém potenciais mutações nas posições K54, R55, L56, Y57, V58, F59, A60, V62, V63, E64 e L65 em PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 1): Motivo A Combi-2 contém potenciais mutações nas posições K54, R55, V58, A60, V62, V63 e E64 em PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 1): Do Motivo A Combi -1, as sequências foram recuperadas para 5 variantes únicas ativas (analisadas um total de 96) . Do Motivo A Combi -2, as
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Tabela 20
Variantes Sequência de DNA Sequência de aminoácido do Motivo A Mutações adiciona is Total # Mut.
PtIP-83Aa SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 VKRLYVFADWE LP (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 1) 0
PtIP-83cmbMl- 1 SEQ ID NO: 236 SEQ ID NO: 172 VKHLYIFCDVIEL P (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 236) 4
PtIP-83cmbMl- 2 SEQ ID NO: 237 SEQ ID NO: 173 VKHL YIFCDWE L P (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 237) 3
PtIP-83cmbMl- 3 SEQ ID NO: 238 SEQ ID NO: 174 VKHLYIESDIIEL P (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 238) 5
PtIP-83cmbMl- 4 SEQ ID NO: 239 SEQ ID NO: 175 VKHLYIFTDVLEL P (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 239) 4
PtIP-83cmbMl- 5 SEQ ID NO: 240 SEQ ID NO: 176 VKHLYVFADIIVLP (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 240) 4
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Variantes Sequência de DNA Sequência de aminoácido do Motivo A Mutações adiciona is Total # Mut.
PtIP-83cmbMl- 6 SEQ ID NO: 241 SEQ ID NO: 177 VKHLYVFADVIE L P (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 241) 2
PtIP-83cmbMl- 7 SEQ ID NO: 242 SEQ ID NO: 178 VKHLYVFGDVIE L P (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 242) 3
PtIP-83cmbMl- 8 SEQ ID NO: 243 SEQ ID NO: 179 VKHLYVFSDVIE L P (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 243) 3
PtIP-83cmbMl- 9 SEQ ID NO: 244 SEQ ID NO: 180 VKHLYVFSDVLVLP (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 244) 4
PtIP-83cmbMl- 10 SEQ ID NO: 245 SEQ ID NO: 181 VKQLIIESDIIEL P (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 245) 6
PtIP-83cmbMl- 11 SEQ ID NO: 246 SEQ ID NO: 182 VKQLYIFCDIIEL P (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 246) 5
PtIP-83cmbMl- 12 SEQ ID NO: 247 SEQ ID NO: 183 VKQLYIFCDVLEL P (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 247) 4
PtIP-83cmbMl- 13 SEQ ID NO: 248 SEQ ID NO: 184 VKQLYIFGDVIEL P (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 248) 4
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Variantes Sequência de DNA Sequência de aminoácido do Motivo A Mutações adiciona is Total # Mut.
PtIP-83cmbMl- 14 SEQ ID NO: 249 SEQ ID NO: 185 VKQLYIESDIIEL P (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 249) V2 4I 6
PtIP-83cmbMl- 15 SEQ ID NO: 250 SEQ ID NO: 186 VKQLYVFCDILEL P (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 250) 4
PtIP-83cmbMl- 16 SEQ ID NO: 251 SEQ ID NO: 187 VKQLYVFSDILEL P (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 251) 4
PtIP-83cmbMl- 17 SEQ ID NO: 252 SEQ ID NO: 188 VKQLYVFSDVLVLP (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 252) 4
PtIP-83cmbMl- 18 SEQ ID NO: 253 SEQ ID NO: 189 VKRFYIFADIVEL P (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 253) 3
PtIP-83cmbMl- 19 SEQ ID NO: 254 SEQ ID NO: 190 VKRFYIESDIIEL P (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 254) 5
PtIP-83cmbMl- 2 0 SEQ ID NO: 255 SEQ ID NO: 191 VKRFYVFSDIVEL P (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 255) 3
PtIP-83cmbMl- 21 SEQ ID NO: 256 SEQ ID NO: 192 VKRLVILGDIIWP (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 256) 8
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Variantes Sequência de DNA Sequência de aminoácido do Motivo A Mutações adiciona is Total # Mut.
PtIP-83cmbMl- 22 SEQ ID NO: 257 SEQ ID NO: 193 VKRLYIFADIIELP (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 257) 3
PtIP-83cmbMl- 2 3 SEQ ID NO: 258 SEQ ID NO: 194 VKRLYIFCDIIVLP (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 258) 5
PtIP-83cmbMl- 2 4 SEQ ID NO: 259 SEQ ID NO: 195 VKRLYIFCDIVELP (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 259) 3
PtIP-83cmbMl- 2 5 SEQ ID NO: 260 SEQ ID NO: 196 VKRLYIFGDIIELP (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 260) P74A 5
PtIP-83cmbMl- 2 6 SEQ ID NO: 261 SEQ ID NO: 197 VKRLYIFGDVIELP (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 261) 3
PtIP-83cmbMl- 2 7 SEQ ID NO: 262 SEQ ID NO: 198 VKRLYIFSDIIVLP (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 262) 5
PtIP-83cmbMl- 2 8 SEQ ID NO: 263 SEQ ID NO: 199 VKRLYIFSDILELP (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 263) 4
PtIP-83cmbMl- 2 9 SEQ ID NO: 264 SEQ ID NO: 200 VKRLYIFSDVIVLP (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 264) 4
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Variantes Sequência de DNA Sequência de aminoácido do Motivo A Mutações adiciona is Total # Mut.
PtIP-83cmbMl- 3 0 SEQ ID NO: 265 SEQ ID NO: 201 VKRLYIFTDVIELP (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 265) 3
PtIP-83cmbMl- 31 SEQ ID NO: 266 SEQ ID NO: 202 VKRLYVFCDIIELP (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 266) 3
PtIP-83cmbMl- 32 SEQ ID NO: 267 SEQ ID NO: 203 VKRLYVFCDIIVLP (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 267) 4
PtIP-83cmbMl- 33 SEQ ID NO: 268 SEQ ID NO: 204 VKRLYVFGDIVELP (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 268) 2
PtIP-83cmbMl- 34 SEQ ID NO: 269 SEQ ID NO: 205 VKRLYVFGDWELP (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 269) 1
PtIP-83cmbMl- 35 SEQ ID NO: 270 SEQ ID NO: 206 VKRLYVFSDIIELP (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 270) 3
PtIP-83cmbMl- 3 6 SEQ ID NO: 271 SEQ ID NO: 207 VKRLYVFSDIVELP (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 271) 2
PtIP-83cmbMl- 37 SEQ ID NO: 272 SEQ ID NO: 208 VKRLYVFSDVIELP (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 272) 2
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Variantes Sequência de DNA Sequência de aminoácido do Motivo A Mutações adiciona is Total # Mut.
PtIP-83cmbMl- 3 8 SEQ ID NO: 273 SEQ ID NO: 209 VKRLYVFTDVIVLP (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 273) 3
PtIP-83cmbMl- 3 9 SEQ ID NO: 274 SEQ ID NO: 210 VKRLYVFTDVVVLP (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 274) 2
PtIP-83cmbMl- 4 0 SEQ ID NO: 275 SEQ ID NO: 211 VMHLYIFADVIEL P (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 275) 4
PtIP-83cmbMl- 41 SEQ ID NO: 276 SEQ ID NO: 212 VMQLYIFCDILELP (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 276) P74T 7
PtIP-83cmbMl- 42 SEQ ID NO: 277 SEQ ID NO: 213 VMRL YIFADWVL P (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 277) 3
PtIP-83cmbMl- 4 3 SEQ ID NO: 278 SEQ ID NO: 214 VMRLYIFCDVIE L P (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 278) 4
PtIP-83cmbMl- 4 4 SEQ ID NO: 279 SEQ ID NO: 215 VMRLYVFCDIIELP (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 279) 4
PtIP-83cmbMl- 4 5 SEQ ID NO: 280 SEQ ID NO: 216 VMRLYVFCDILVLP (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 280) 5
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Variantes Sequência de DNA Sequência de aminoácido do Motivo A Mutações adiciona is Total # Mut.
PtIP-83cmbMl- 4 6 SEQ ID NO: 281 SEQ ID NO: 217 VMRLYVFSDIIVLP (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 281) 5
PtIP-83cmbMl- 4 7 SEQ ID NO: 282 SEQ ID NO: 218 VRHLYIFADIIEL P (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 282) 5
PtIP-83cmbMl- 4 8 SEQ ID NO: 283 SEQ ID NO: 219 VRHLYIFADWE L P (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 283) 3
PtIP-83cmbMl- 4 9 SEQ ID NO: 284 SEQ ID NO: 220 VRHLYIFCDVIEL P (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 284) 5
PtIP-83cmbMl- 50 SEQ ID NO: 285 SEQ ID NO: 221 VRHLYIFSDVIEL P (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 285) 5
PtIP-83cmbMl- 51 SEQ ID NO: 286 SEQ ID NO: 222 VRHLYIFSDWE L P (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 286) 4
PtIP-83cmbMl- 52 SEQ ID NO: 287 SEQ ID NO: 223 VRHLYVFTDVLEL P (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 287) 4
PtIP-83cmbMl- 53 SEQ ID NO: 288 SEQ ID NO: 224 VRQLYIFCDVIVLP (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 288) 6
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Variantes Sequência de DNA Sequência de aminoácido do Motivo A Mutações adiciona is Total # Mut.
PtIP-83cmbMl- 54 SEQ ID NO: 289 SEQ ID NO: 225 VRQLYIFSDWVL P (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 289) 5
PtIP-83cmbMl- 55 SEQ ID NO: 290 SEQ ID NO: 226 VRQLYVFCDVLVLP (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 290) 5
PtIP-83cmbMl- 5 6 SEQ ID NO: 291 SEQ ID NO: 227 VRRLYIFADILEL P (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 291) 4
PtIP-83cmbMl- 57 SEQ ID NO: 292 SEQ ID NO: 228 VRRLYIFADIVEL P (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 292) P74A 4
PtIP-83cmbMl- 58 SEQ ID NO: 293 SEQ ID NO: 229 VRRLYIFGDIVEL P (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 293) 4
PtIP-83cmbMl- 59 SEQ ID NO: 294 SEQ ID NO: 230 VRRLYIFTDIIEL P (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 294) 5
PtIP-83cmbMl- 60 SEQ ID NO: 295 SEQ ID NO: 231 VRRLYVFADIIDLP (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 295) 4
PtIP-83cmbMl- 61 SEQ ID NO: 296 SEQ ID NO: 232 VRRL YVFADIVVL P (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 296) 3
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Variantes Sequência de DNA Sequência de aminoácido do Motivo A Mutações adiciona is Total # Mut.
PtIP-83cmbMl- 62 SEQ ID NO: 297 SEQ ID NO: 233 VRRL YVFCDWVL P (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 297) 3
PtIP-83cmbMl- 63 SEQ ID NO: 298 SEQ ID NO: 234 VRRLYVFTDIIEL P (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 298) 4
PtIP-83cmbMl- 64 SEQ ID NO: 299 SEQ ID NO: 235 VRRLYVFTDVLVLP (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 299) 4
[0502] Uma biblioteca de combinação única de Motivo C contendo potenciais mutações nas posições R557, A558, K559, K561 e N562 de PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 1) foi analisada. De um total de 233 variantes analisadas do Motivo C Combi, foram identificadas 34 variantes de sequência única ativa. A Tabela 21 resume as substituições de aminoácidos das variantes de PtIP-83Aa Motivo C ativo resultante em comparação com o PtIP-83Aa.
Tabela 21
Variantes Sequência de DNA Sequência de AA Mutações adicionai s Total de Mutações
PtIP-83Aa SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 WRAKCKNVA (aa 556 - 564 da SEQ ID NO: 1) 0
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Variantes Sequência de DNA Sequência de AA Mutações adicionai s Total de Mutações
PtIP-83cmbM3- 1 SEQ ID NO: 334 SEQ ID NO: 300 WHARCKSVA (aa 556 - 564 da SEQ ID NO: 334) 3
PtIP-83cmbM3- 2 SEQ ID NO: 335 SEQ ID NO: 301 WHGKCKNVA (aa 556 - 564 da SEQ ID NO: 335) 2
PtIP-83cmbM3- 3 SEQ ID NO: 336 SEQ ID NO: 302 WIAKCKCVA (aa 556 - 564 da SEQ ID NO: 336) 2
PtIP-83cmbM3- 4 SEQ ID NO: 337 SEQ ID NO: 303 WIAKCKSVA (aa 556 - 564 da SEQ ID NO: 337) 2
PtIP-83cmbM3- 5 SEQ ID NO: 338 SEQ ID NO: 304 WIGKCKNVA (aa 556 - 564 da SEQ ID NO: 338) 2
PtIP-83cmbM3- 6 SEQ ID NO: 339 SEQ ID NO: 305 WIGKCKSVA (aa 556 - 564 da SEQ ID NO: 339) 3
PtIP-83cmbM3- 7 SEQ ID NO: 340 SEQ ID NO: 306 WIGKCNNVA (aa 556 - 564 da SEQ ID NO: 340) 3
PtIP-83cmbM3- 8 SEQ ID NO: 341 SEQ ID NO: 307 WIVKCKSVA (aa 556 - 564 da SEQ ID NO: 341) 3
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 502/553
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Variantes Sequência de DNA Sequência de AA Mutações adicionai s Total de Mutações
PtIP-83cmbM3- 9 SEQ ID NO: 342 SEQ ID NO: 308 WLARCKNVA (aa 556 - 564 da SEQ ID NO: 342) 2
PtIP-83cmbM3- 10 SEQ ID NO: 343 SEQ ID NO: 309 WLARCKSVA (aa 556 - 564 da SEQ ID NO: 343) 3
PtIP-83cmbM3- 11 SEQ ID NO: 344 SEQ ID NO: 310 WLGRCKNVA (aa 556 - 564 da SEQ ID NO: 344) 3
PtIP-83cmbM3- 12 SEQ ID NO: 345 SEQ ID NO: 311 WLGRCKSVA (aa 556 - 564 da SEQ ID NO: 345) 4
PtIP-83cmbM3- 13 SEQ ID NO: 346 SEQ ID NO: 312 WLVKCKCVA (aa 556 - 564 da SEQ ID NO: 346) 3
PtIP-83cmbM3- 14 SEQ ID NO: 347 SEQ ID NO: 313 WMAKCKNVA (aa 556 - 564 da SEQ ID NO: 347) A502S 2
PtIP-83cmbM3- 15 SEQ ID NO: 348 SEQ ID NO: 314 WMGRCKSVA (aa 556 - 564 da SEQ ID NO: 348) 4
PtIP-83cmbM3- 16 SEQ ID NO: 349 SEQ ID NO: 315 WMVKCKNVA (aa 556 - 564 da SEQ ID NO: 349) 2
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 503/553
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Variantes Sequência de DNA Sequência de AA Mutações adicionai s Total de Mutações
PtIP-83cmbM3- 17 SEQ ID NO: 350 SEQ ID NO: 316 WMVKCKSVA (aa 556 - 564 da SEQ ID NO: 350) 3
PtIP-83cmbM3- 18 SEQ ID NO: 351 SEQ ID NO: 317 WMVRCKNVA (aa 556 - 564 da SEQ ID NO: 351) 3
PtIP-83cmbM3- 19 SEQ ID NO: 352 SEQ ID NO: 318 WQARCKHVA (aa 556 - 564 da SEQ ID NO: 352) 3
PtIP-83cmbM3- 20 SEQ ID NO: 353 SEQ ID NO: 319 WQARCKNVA (aa 556 - 564 da SEQ ID NO: 353) K505N 3
PtIP-83cmbM3- 21 SEQ ID NO: 354 SEQ ID NO: 320 WQGRCKNVA (aa 556 - 564 da SEQ ID NO: 354) 3
PtIP-83cmbM3- 22 SEQ ID NO: 355 SEQ ID NO: 321 WQVRCKSVA (aa 556 - 564 da SEQ ID NO: 355) 4
PtIP-83cmbM3- 23 SEQ ID NO: 356 SEQ ID NO: 322 WRARCKNVA (aa 556 - 564 da SEQ ID NO: 356) T573A 2
PtIP-83cmbM3- 24 SEQ ID NO: 357 SEQ ID NO: 323 WRGKCKSVA (aa 556 - 564 da SEQ ID NO: 357) 2
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 504/553
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Variantes Sequência de DNA Sequência de AA Mutações adicionai s Total de Mutações
PtIP-83cmbM3- 25 SEQ ID NO: 358 SEQ ID NO: 324 WRGRCKTVA (aa 556 - 564 da SEQ ID NO: 358) 3
PtIP-83cmbM3- 26 SEQ ID NO: 359 SEQ ID NO: 325 WSARCKSVA (aa 556 - 564 da SEQ ID NO: 359) 3
PtIP-83cmbM3- 27 SEQ ID NO: 360 SEQ ID NO: 326 WSVKCKHVA (aa 556 - 564 da SEQ ID NO: 360) 3
PtIP-83cmbM3- 28 SEQ ID NO: 361 SEQ ID NO: 327 WTGRCKTVA (aa 556 - 564 da SEQ ID NO: 361) 4
PtIP-83cmbM3- 29 SEQ ID NO: 362 SEQ ID NO: 328 WTGRCNHVA (aa 556 - 564 da SEQ ID NO: 362) R568Q 6
PtIP-83cmbM3- 30 SEQ ID NO: 363 SEQ ID NO: 329 WTVKCKNVA (aa 556 - 564 da SEQ ID NO: 363) 2
PtIP-83cmbM3- 31 SEQ ID NO: 364 SEQ ID NO: 330 WTVKCKSVA (aa 556 - 564 da SEQ ID NO: 364) 3
PtIP-83cmbM3- 32 SEQ ID NO: 365 SEQ ID NO: 331 WTVRCKNVA (aa 556 - 564 da SEQ ID NO: 365) 3
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 505/553
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Variantes Sequência de DNA Sequência de AA Mutações adicionai s Total de Mutações
PtIP-83cmbM3- 33 SEQ ID NO: 366 SEQ ID NO: 332 WRARCKHVA (aa 556 - 564 da SEQ ID NO: 366) 2
PtIP-83cmbM3- 34 SEQ ID NO: 367 SEQ ID NO: 333 WIGRCKSVA (aa 556 - 564 da SEQ ID NO: 367) 4
Exemplo 13 - Variantes de PtIP-83Aa com múltiplas substituições de aminoácido no Motivo A e Motivo C [0503] Diversidade de sequência adicional foi criada através da combinação de combinações Motivo A ativo com combinações Motivo C ativo. Vinte e quatro variantes de combinação de Motivo A ativo e 11 variantes de combinação de Motivo C ativo foram seleccionadas para a construção de uma Biblioteca Motivo A x Motivo C (Tabela 22).
Tabela 22. Variantes de sequência utilizadas para a construção de Biblioteca de Combinação Motivo A x Motivo C
Motivo A Motivo C
PtIP-83cmbMl- PtIP-83cmbMl- PtIP-83cmbM3-
1 32 2
SEQ ID NO: 236 SEQ ID NO: 267 SEQ ID NO: 335
PtIP-83cmbMl- PtIP-83cmbMl- PtIP-83cmbM3-
2 35 5
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 506/553
503/525
SEQ ID NO: 237 SEQ ID NO: 270 SEQ ID NO: 338
PtIP-83cmbMl- PtIP-83cmbMl- PtIP-83cmbM3-
4 36 9
SEQ ID NO: 239 SEQ ID NO: 271 SEQ ID NO: 342
PtIP-83cmbMl- PtIP-83cmbMl- PtIP-83cmbM3-
6 37 11
SEQ ID NO: 241 SEQ ID NO: 272 SEQ ID NO: 344
PtIP-83cmbMl- PtIP-83cmbMl- PtIP-83cmbM3-
12 44 16
SEQ ID NO: 247 SEQ ID NO: 279 SEQ ID NO: 349
PtIP-83cmbMl- PtIP-83cmbMl- PtIP-83cmbM3-
15 49 19
SEQ ID NO: 250 SEQ ID NO: 284 SEQ ID NO: 352
PtIP-83cmbMl- PtIP-83cmbMl- PtIP-83cmbM3-
16 51 20
SEQ ID NO: 251 SEQ ID NO: 286 SEQ ID NO: 353
PtIP-83cmbMl- PtIP-83cmbMl- PtIP-83cmbM3-
18 55 23
SEQ ID NO: 253 SEQ ID NO: 290 SEQ ID NO: 356
PtIP-83cmbMl- PtIP-83cmbMl- PtIP-83cmbM3-
21 56 24 SEQ ID NO:
SEQ ID NO: 256 SEQ ID NO: 291 357
PtIP-83cmbMl- PtIP-83cmbMl- PtIP-83cmbM3-
22 60 25
SEQ ID NO: 257 SEQ ID NO: 295 SEQ ID NO: 358
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 507/553
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PtIP-83cmbMl- PtIP-83cmbMl- PtIP-83cmbM3-
30 62 30
SEQ ID NO: 265 SEQ ID NO: 297 SEQ ID NO: 363
PtIP-83cmbMl- PtIP-83cmbMl-
31 64
SEQ ID NO: 266 SEQ ID NO: 299
[0504] O DNA plasmidial foi isolado destas variantes e agrupado por motivo. As combinações Motivo A foram amplificadas por PCR a partir do conjunto Motivo A utilizando os seguintes iniciadores: AATCTCTCATCTAAGAGGCTGGATCCTAGGATGGCTCTCGTGGATTACGGC (SEQ ID NO: 630) e GCAGCCACAACCTCCATCACAGC (SEQ ID NO: 631). As combinações Motivo C foram amplificadas por PCR a partir do conjunto Motivo C utilizando os seguintes iniciadores:
TGGCCAATCCAGAAGATGGACAAGTCTAGACTACTCTTCGTCGTGCCGCCAG (SEQ ID NO: 632) e GCTGTGATGGAGGTTGTGGCTGC (SEQ ID NO: 633) . Os dois produtos de PCR foram então montados por sobreposição de fragmentos de multi-PCR (Gibson Assembly Cloning Kit, New England Biolabs Inc.) em um vetor transiente de planta contendo o promotor DMMV viral. Foram analisadas 94 variantes desta biblioteca por expressão transiente de plantas e ensaio de atividade SBL como descrito no Exemplo 4. Foram identificadas por sequenciamento 30 variantes ativas únicas, definidas como tendo um escore de atividade médio de <=60% do disco foliar consumido. A Tabela 23 resume as substituições de aminoácidos das variantes de PtIP-83Aa Motivo A x Motivo C ativo resultantes em comparação com o PtIP-83Aa.
Tabela 23
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 508/553
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Variante Sequência de DNA Sequência do Motivo A Sequência do Motivo C Add. Mut. Mut. Tota 1
PtIP-83Aa SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 VKRLYVFADWEL P (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: D WRAKCKNVA (aa 556 - 564 da SEQ ID NO: 1) 0
PtlP- 83cmbMlxM3-l SEQ ID NO: 398 SEQ ID NO: 368 VKHLYIFTDVLEL P (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 398) WHGKCKNVA (aa 556 - 564 da SEQ ID NO: 398) S533F 7
PtlP83cmbMlxM3-2 SEQ ID NO: 399 SEQ ID NO: 369 VKHLYIFTDVLEL P (aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 399) WLARCKNVA (aa 556 - 564 da SEQ ID NO: 399) 6
PtlP83cmbMlxM3-3 SEQ ID NO: 400 SEQ ID NO: 370 VKHLYIFTDVLEL P(aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 400) WQARCKHVA (aa 556 - 564 da SEQ ID NO: 400) 7
PtlP83cmbMlxM3-4 SEQ ID NO: 401 SEQ ID NO: 371 VKHLYVFADVIEL P(aa 53 - 66 da SEQ ID NO: 401) WQARCKHVA (aa 556 - 564 da SEQ ID NO: 401) 5
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 509/553
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Variante Sequência de DNA Sequência do Motivo A Sequência do Motivo C Add. Mut. Mut. Tota 1
PtlP- VKHLYVFADVIEL WRARCKNVA
83cmbMlxM3-5 SEQ ID P(aa 53 - 66 (aa 556 - 3
SEQ ID NO: NO: 372 da SEQ ID NO: 564 da SEQ
402 402) ID NO: 402)
PtlP- VKQLYIFCDVLEL WQARCKNVA
83cmbMlxM3-6 SEQ ID P(aa 53 - 66 (aa 556 - 6
SEQ ID NO: NO: 373 da SEQ ID NO: 564 da SEQ
403 403) ID NO: 403)
PtlP- VKRFYIFADIVEL WIGKCKNVA
83cmbMlxM3-7 SEQ ID P(aa 53 - 66 (aa 556 - 5
SEQ ID NO: NO: 374 da SEQ ID NO: 564 da SEQ
404 404) ID NO: 404)
PtlP- VKRFYIFADIVEL WTVKCKNVA
83cmbMlxM3-8 SEQ ID P(aa 53 - 66 (aa 556 - 5
SEQ ID NO: NO: 375 da SEQ ID NO: 564 da SEQ
405 405) ID NO: 405)
PtlP- VKRLYIFADIIEL WMVKCKNVA
83cmbMlxM3-9 SEQ ID P(aa 53 - 66 (aa 556 - 5
SEQ ID NO: NO: 376 da SEQ ID NO: 564 da SEQ
406 406) ID NO: 406)
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 510/553
507/525
Variante Sequência de DNA Sequência do Motivo A Sequência do Motivo C Add. Mut. Mut. Tota 1
PtlP- VKRLYIFADIIEL WQARCKNVA
83cmbMlxM3-10 SEQ ID P(aa 53 - 66 (aa 556 - 5
SEQ ID NO: NO: 377 da SEQ ID NO: 564 da SEQ
407 407) ID NO: 407)
PtlP- VKRLYIFADIIEL WRGKCKSVA
83cmbMlxM3-ll SEQ ID P(aa 53 - 66 (aa 556 - K52E, 7
SEQ ID NO: NO: 378 da SEQ ID NO: 564 da SEQ K505N
408 408) ID NO: 408)
PtlP- VKRLYIFADIIEL WRGRCKTVA
83cmbMlxM3-12 SEQ ID P(aa 53 - 66 (aa 556 - 6
SEQ ID NO: NO: 379 da SEQ ID NO: 564 da SEQ
409 409) ID NO: 409)
PtlP- VKRLYIFTDVIEL WIGKCKNVA
83cmbMlxM3-13 SEQ ID P(aa 53 - 66 (aa 556 - 5
SEQ ID NO: NO: 380 da SEQ ID NO: 564 da SEQ
410 410) ID NO: 410)
PtlP- VKRLYVFCDIIEL WLARCKNVA
83cmbMlxM3-14 SEQ ID P(aa 53 - 66 (aa 556 - 5
SEQ ID NO: NO: 381 da SEQ ID NO: 564 da SEQ
411 411) ID NO: 411)
PtlP- VKRLYVFSDIIEL WIGKCKNVA
83cmbMlxM3-15 SEQ ID P(aa 53 - 66 (aa 556 - 5
SEQ ID NO: NO: 382 da SEQ ID NO: 564 da SEQ
412 412) ID NO: 412)
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 511/553
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Variante Sequência de DNA Sequência do Motivo A Sequência do Motivo C Add. Mut. Mut. Tota 1
PtlP- VKRLYVFSDIIEL WRGRCKTVA
83cmbMlxM3-l6 SEQ ID P(aa 53 - 66 (aa 556 - 6
SEQ ID NO: NO: 383 da SEQ ID NO: 564 da SEQ
413 413) ID NO: 413)
PtlP- VKRLYVFSDVIEL WRGKCKSVA
83cmbMlxM3-17 SEQ ID P(aa 53 - 66 (aa 556 - 4
SEQ ID NO: NO: 384 da SEQ ID NO: 564 da SEQ
414 414) ID NO: 414)
PtlP- VKRLYVFSDVIEL WRVKCKNVA
83cmbMlxM3-18 SEQ ID P(aa 53 - 66 (aa 556 - 3
SEQ ID NO: NO: 385 da SEQ ID NO: 564 da SEQ
415 415) ID NO: 415)
PtlP- VMRLYIFADWEL WRGKCKSVA
83cmbMlxM3-19 SEQ ID P (aa 53 - 66 (aa 556 - 4
SEQ ID NO: NO: 386 da SEQ ID NO: 564 da SEQ
416 416) ID NO: 416)
PtlP- VRHLYIFCDVIEL WIGKCKNVA
83cmbMlxM3-20 SEQ ID P(aa 53 - 66 (aa 556 - 7
SEQ ID NO: NO: 387 da SEQ ID NO: 564 da SEQ
417 417) ID NO: 417)
PtlP- VRHLYIFSDWEL WMVKCKNVA
83cmbMlxM3-21 SEQ ID P (aa 53 - 66 (aa 556 - 6
SEQ ID NO: NO: 388 da SEQ ID NO: 564 da SEQ
418 418) ID NO: 418)
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 512/553
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Variante Sequência de DNA Sequência do Motivo A Sequência do Motivo C Add. Mut. Mut. Tota 1
PtlP- VRHLYIFSDWEL WRGKCKSVA
83cmbMlxM3-22 SEQ ID P (aa 53 - 66 (aa 556 - K505N 7
SEQ ID NO: NO: 389 da SEQ ID NO: 564 da SEQ
419 419) ID NO: 419)
PtlP- VRQLYVFCDVLVL WHGKCKNVA
83cmbMlxM3-23 SEQ ID P(aa 53 - 66 (aa 556 - 7
SEQ ID NO: NO: 390 da SEQ ID NO: 564 da SEQ
420 420) ID NO: 420)
PtlP- VRQLYVFCDVLVL WLGRCKNVA
83cmbMlxM3-24 SEQ ID P(aa 53 - 66 (aa 556 - 8
SEQ ID NO: NO: 391 da SEQ ID NO: 564 da SEQ
421 421) ID NO: 421)
PtlP- VRQLYVFCDVLVL WRGKCKSVA
83cmbMlxM3-25 SEQ ID P(aa 53 - 66 (aa 556 - Mil 8
SEQ ID NO: NO: 392 da SEQ ID NO: 564 da SEQ
422 422) ID NO: 422)
PtlP- VRRLYIFADILEL WMVKCKNVA
83cmbMlxM3-2 6 SEQ ID P(aa 53 - 66 (aa 556 - 6
SEQ ID NO: NO: 393 da SEQ ID NO: 564 da SEQ
423 423) ID NO: 423)
PtlP- VRRLYVFCDWVL WRARCKNVA
83cmbMlxM3-27 SEQ ID P (aa 53 - 66 (aa 556 - 4
SEQ ID NO: NO: 394 da SEQ ID NO: 564 da SEQ
424 424) ID NO: 424)
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 513/553
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Variante Sequência de DNA Sequência do Motivo A Sequência do Motivo C Add. Mut. Mut. Tota 1
PtlP- VRRLYVFTDVLVL WIGKCKNVA
83cmbMlxM3-28 SEQ ID P(aa 53 - 66 (aa 556 - 6
SEQ ID NO: NO: 395 da SEQ ID NO: 564 da SEQ
425 425) ID NO: 425)
PtlP- VRRLYVFTDVLVL WRARCKNVA
83cmbMlxM3-29 SEQ ID P(aa 53 - 66 (aa 556 - 5
SEQ ID NO: NO: 396 da SEQ ID NO: 564 da SEQ
426 426) ID NO: 426)
PtlP- VRRLYVFTDVLVL WTVKCKNVA
83cmbMlxM3-30 SEQ ID P(aa 53 - 66 (aa 556 - 6
SEQ ID NO: NO: 397 da SEQ ID NO: 564 da SEQ
427 427) ID NO: 427)
Exemplo 14 Variantes de PtIP-83Aa com múltiplas substituições de aminoácidos [0505] Para criar variantes de PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 1) com múltiplas mudanças de aminoácido, bibliotecas de variantes foram geradas por embaralhamento de familia (Chia-Chun J. Chang et al, 1999, Nature Biotechnology 17, 793-797) do polinucleotídeo (SEQ ID NO: 2) que codifica PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 1) e o polinucleotídeo (SEQ ID NO: 2) que codifica PtIP-83Cb (SEQ ID NO: 7) . As taxas de mutação das bibliotecas foram controladas por variação das regiões de PTIP-83Aa (SEQ ID NO: 1) e PtIP-83Cb (SEQ ID NO: 7) que foram incluídas na reação de embaralhamento da biblioteca. Cinco bibliotecas foram geradas
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 514/553
511/525 entre as duas variantes. Na primeira biblioteca (83FS-1), a sequência do gene de comprimento completo de ambos PTIP-83Aa (SEQ ID NO: 2) e PtIP-83Cb (SEQ ID NO: 8) foram incluídas na reação de embaralhamento. Na segunda biblioteca (83FS-2), fragmentos contendo nt: 1114-2604 da SEQ ID NO: 2 (que codifica PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 1)) e nt: 1072-2559 da SEQ ID NO: 8 (que codifica PtIP-83Cb (SEQ ID NO: 7)) foram embaralhados. Os fragmentos embaralhados foram então combinados com nt: 1-1113 da SEQ ID NO: 2 (que codifica PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 1)) por Gibson Assembly (New England Biolabs). Em uma terceira biblioteca (83FS-3), as regiões 5' e 3' das duas variantes foram misturadas em reações separadas. A reação 5', contendo fragmentos embaralhados de nt: 1-1113 da SEQ ID NO: 2 (que codifica PtlP83Aa (SEQ ID NO: 1)) e nt:l-1071 da SEQ ID NO: 8 (que codifica PtIP-83Cb (SEQ ID NO: 7)), e a reação 3', contendo fragmentos embaralhados de nt: 1114-2604 da SEQ ID NO: 2 (que codifica PtlP83Aa (SEQ ID NO: 1) ) e nt: 1072-2559 da SEQ ID NO: 8 (que codifica PtIP-83Cb (SEQ ID NO: 7)), foram então combinadas por Gibson Assembly. Em uma quarta biblioteca (83FS-4), os fragmentos da região 5' de cada variante (nt: 1-1113 da SEQ ID NO: 2 (que codifica PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 1)) e nt:l-1071 da SEQ ID NO: 8 (que codifica PtIP-83Cb (SEQ ID NO: 7)) foram embaralhados com iniciadores adicionais adicionados à reação de montagem para promover cruzamentos entre as duas variantes. A região 5' embaralhada foi então combinada por Gibson Assembly com a região 3’ da SEQ ID NO: 2 (que codifica PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 1)) ou SEQ ID NO: 8 (que codifica PtIP-83Cb (SEQ ID NO: 7)). Na quinta biblioteca (83FS-5), variantes de cruzamento único foram geradas manualmente entre a SEQ ID NO: 2 (que codifica PtIP-83Aa (SEQ ID
Petição 870190094270, de 20/09/2019, pág. 515/553
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NO: 1)) e SEQ ID NO: 8 (que codifica PtIP-83Cb (SEQ ID NO: 7)) utilizando Gibson Assembly.
[0506] Todas as bibliotecas embaralhadas foram clonadas em um vetor de expressão transiente de planta contendo o promotor dMMV viral para subsequente expressão transiente em feijão arbusto e ensaios de atividade SBL, como descrito no Exemplo 4. Variantes ativas, definidas como tendo um escore de atividade médio de < 60% do disco foliar consumido, foram enviadas para identificação da sequência. Na biblioteca 83FS-1, foram analisadas 197 variantes e 45 variantes únicas ativas tiveram a sequência identificada. Na biblioteca 83FS-2, foram analisadas 96 variantes e 32 variantes únicas ativas tiveram a sequência identificada. Na biblioteca 83FS-3, foram analisadas 192 variantes e 13 variantes únicas ativas tiveram a sequência identificada. Na biblioteca 83FS-4, foram analisadas 96 variantes e 6 variantes ativas únicas tiveram a sequência identificada. Na biblioteca 83FS-5, quatro das onze variantes únicas cruzadas construídas foram consideradas ativas.
[0507] A identidade de sequência de variantes ativas para PtIP-83Aa foi calculada com o uso do algoritmo NeedlemanWunsch, conforme implantado no programa de Needle (pacote de ferramentas EMBOSS). A percentagem de identidade em comparação com PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 1), designação de variante, sequências de nucleotídeo, e sequências de aminoácido das variantes de polipeptídeo PtIP-83Aa ativas resultantes de todas as bibliotecas são resumidas na Tabela 24. A Tabela 25 resume a % de identidade das variantes ativas em comparação com PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 1), o número de variantes com cada % de identidade, e a identificação variante.
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Tabela 24
% Identidade Variante Polinucleotídeo Polipeptídeo
com (SEQ PtIP-83Aa ID NO: 1)
76 S04359885 SEQ ID NO: 428 SEQ ID NO: 518
76 S04359888 SEQ ID NO: 429 SEQ ID NO: 519
73 S04359896 SEQ ID NO: 430 SEQ ID NO: 520
73 S04359899 SEQ ID NO: 431 SEQ ID NO: 521
77 S04359902 SEQ ID NO: 432 SEQ ID NO: 522
76 S04359909 SEQ ID NO: 433 SEQ ID NO: 523
77 S04359911 SEQ ID NO: 434 SEQ ID NO: 524
75 S04359942 SEQ ID NO: 435 SEQ ID NO: 525
74 S04359944 SEQ ID NO: 436 SEQ ID NO: 526
73 S04359948 SEQ ID NO: 437 SEQ ID NO: 527
81 S04359951 SEQ ID NO: 438 SEQ ID NO: 528
80 S04359988 SEQ ID NO: 439 SEQ ID NO: 529
81 S04359991 SEQ ID NO: 440 SEQ ID NO: 530
77 S04360034 SEQ ID NO: 441 SEQ ID NO: 531
76 S04360059 SEQ ID NO: 442 SEQ ID NO: 532
73 S04360064 SEQ ID NO: 443 SEQ ID NO: 533
73 S04360087 SEQ ID NO: 444 SEQ ID NO: 534
73 S04360095 SEQ ID NO: 445 SEQ ID NO: 535
77 S04360104 SEQ ID NO: 446 SEQ ID NO: 536
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% Identidade Variante Polinucleotídeo Polipeptideo
com (SEQ PtIP-83Aa ID NO: 1)
74 S04360110 SEQ ID NO: 447 SEQ ID NO: 537
77 S04360119 SEQ ID NO: 448 SEQ ID NO: 538
73 S04360122 SEQ ID NO: 449 SEQ ID NO: 539
75 S04360130 SEQ ID NO: 450 SEQ ID NO: 540
78 S04360132 SEQ ID NO: 451 SEQ ID NO: 541
93 S04360136 SEQ ID NO: 452 SEQ ID NO: 542
93 S04360141 SEQ ID NO: 453 SEQ ID NO: 543
77 S04360143 SEQ ID NO: 454 SEQ ID NO: 544
76 S04360146 SEQ ID NO: 455 SEQ ID NO: 545
75 S04360160 SEQ ID NO: 456 SEQ ID NO: 546
79 S04360435 SEQ ID NO: 457 SEQ ID NO: 547
77 S04360466 SEQ ID NO: 458 SEQ ID NO: 548
77 S04360467 SEQ ID NO: 459 SEQ ID NO: 549
73 S04360469 SEQ ID NO: 460 SEQ ID NO: 550
78 S04360485 SEQ ID NO: 461 SEQ ID NO: 551
80 S04360504 SEQ ID NO: 462 SEQ ID NO: 552
76 S04360545 SEQ ID NO: 463 SEQ ID NO: 553
77 S04360574 SEQ ID NO: 464 SEQ ID NO: 554
76 S04360579 SEQ ID NO: 465 SEQ ID NO: 555
74 S04360592 SEQ ID NO: 466 SEQ ID NO: 556
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% Identidade Variante Polinucleotideo Polipeptídeo
com (SEQ PtIP-83Aa ID NO: 1)
79 S04360619 SEQ ID NO: 467 SEQ ID NO: 557
77 S04360626 SEQ ID NO: 468 SEQ ID NO: 558
77 S04360660 SEQ ID NO: 469 SEQ ID NO: 559
78 S04360664 SEQ ID NO: 470 SEQ ID NO: 560
77 S04360699 SEQ ID NO: 471 SEQ ID NO: 561
76 S04360787 SEQ ID NO: 472 SEQ ID NO: 562
99 S04363576 SEQ ID NO: 473 SEQ ID NO: 563
97 S04363577 SEQ ID NO: 474 SEQ ID NO: 564
95 S04363578 SEQ ID NO: 475 SEQ ID NO: 565
97 S04363579 SEQ ID NO: 476 SEQ ID NO: 566
97 S04363580 SEQ ID NO: 477 SEQ ID NO: 567
95 S04363584 SEQ ID NO: 478 SEQ ID NO: 568
97 S04363585 SEQ ID NO: 479 SEQ ID NO: 569
96 S04363587 SEQ ID NO: 480 SEQ ID NO: 570
96 S04363588 SEQ ID NO: 481 SEQ ID NO: 571
97 S04363593 SEQ ID NO: 482 SEQ ID NO: 572
95 S04363594 SEQ ID NO: 483 SEQ ID NO: 573
96 S04363600 SEQ ID NO: 484 SEQ ID NO: 574
97 S04363605 SEQ ID NO: 485 SEQ ID NO: 575
96 S04363608 SEQ ID NO: 486 SEQ ID NO: 576
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% Identidade Variante Polinucleotídeo Polipeptideo
com (SEQ PtIP-83Aa ID NO: 1)
96 S04363609 SEQ ID NO: 487 SEQ ID NO: 577
97 S04363612 SEQ ID NO: 488 SEQ ID NO: 578
94 S04363619 SEQ ID NO: 489 SEQ ID NO: 579
97 S04363623 SEQ ID NO: 490 SEQ ID NO: 580
94 S04363625 SEQ ID NO: 491 SEQ ID NO: 581
93 S04363626 SEQ ID NO: 492 SEQ ID NO: 582
97 S04363629 SEQ ID NO: 493 SEQ ID NO: 583
96 S04363631 SEQ ID NO: 494 SEQ ID NO: 584
95 S04363632 SEQ ID NO: 495 SEQ ID NO: 585
94 S04363638 SEQ ID NO: 496 SEQ ID NO: 586
98 S04363643 SEQ ID NO: 497 SEQ ID NO: 587
97 S04363644 SEQ ID NO: 498 SEQ ID NO: 588
97 S04363646 SEQ ID NO: 499 SEQ ID NO: 589
95 S04363648 SEQ ID NO: 500 SEQ ID NO: 590
96 S04363659 SEQ ID NO: 501 SEQ ID NO: 591
94 S04363660 SEQ ID NO: 502 SEQ ID NO: 592
96 S04363662 SEQ ID NO: 503 SEQ ID NO: 593
97 S04363663 SEQ ID NO: 504 SEQ ID NO: 594
64 S04367796 SEQ ID NO: 505 SEQ ID NO: 595
83 S04367808 SEQ ID NO: 506 SEQ ID NO: 596
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% Identidade Variante Polinucleotídeo Polipeptídeo
com (SEQ PtIP-83Aa ID NO: 1)
76 S04367849 SEQ ID NO: 507 SEQ ID NO: 597
78 S04367850 SEQ ID NO: 508 SEQ ID NO: 598
80 S04367851 SEQ ID NO: 509 SEQ ID NO: 599
78 S04367860 SEQ ID NO: 510 SEQ ID NO: 600
77 S04367872 SEQ ID NO: 511 SEQ ID NO: 601
77 S04367882 SEQ ID NO: 512 SEQ ID NO: 602
79 S04367903 SEQ ID NO: 513 SEQ ID NO: 603
78 S04367917 SEQ ID NO: 514 SEQ ID NO: 604
78 S04367945 SEQ ID NO: 515 SEQ ID NO: 605
80 S04367977 SEQ ID NO: 516 SEQ ID NO: 606
78 S04367983 SEQ ID NO: 517 SEQ ID NO: 607
87 S04371015 SEQ ID NO: 718 SEQ ID NO: 728
88 S04371039 SEQ ID NO: 719 SEQ ID NO: 729
84 S04371062 SEQ ID NO: 720 SEQ ID NO: 730
86 S04371086 SEQ ID NO: 721 SEQ ID NO: 731
73 S04382521 SEQ ID NO: 722 SEQ ID NO: 732
84 S04382532 SEQ ID NO: 723 SEQ ID NO: 733
98 S04382574 SEQ ID NO: 724 SEQ ID NO: 734
88 S04382581 SEQ ID NO: 725 SEQ ID NO: 735
89 S04382591 SEQ ID NO: 726 SEQ ID NO: 736
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% Identidade com PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 1) Variante Polinucleotídeo Polipeptídeo
87 S04382601 SEQ ID NO: 727 SEQ ID NO: 737
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Tabela 25
% Identidade com PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 1) n° de variantes Variantes
99 1 S04363576
98 2 S04363643, S04382574
97 12 S04363646, S04363629, S04363612, S04363663, S04363585, S04363580, S04363623, S04363579, S04363605, S04363644, S04363593, S04363577
96 8 S04363662, S04363587, S04363631, S04363659, S04363608, S04363600, S04363588, S04363609
95 5 S04363648, S04363632, S04363584, S04363594, S04363578
94 4 S04363660, S04363619, S04363625, S04363638
93 3 S04363626, S04360136, S04360141
89 1 S04382591
88 2 S04371039, S04382581
87 2 S04371015, S04382601
86 1 S04371086
84 2 S04371062, S04382532
83 1 S04367808
81 2 S04359951, S04359991
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80 4 S04360504, S04359988 S04367851, S04367977,
79 3 S04367903, S04360435, S04360619
S04367983, S04367945, S04367850,
S04360485, S04367917, S04360664,
78 8 S04360132, S04367860
S04367872, S04360467, S04360119,
S04367882, S04360104, S04360626,
S04359902, S04360143, S04359911,
S04360034, S04360660, S04360574,
77 14 S04360466, S04360699
S04359909, S04360787, S04359888,
S04359885, S04360579, S04360146,
76 9 S04360059, S04367849, S04360545
75 3 S04359942, S04360130, S04360160
74 3 S04360592, S04360110, S04359944
S04359896, S04360122, S04360469,
S04360087, S04359899, S04360064,
73 9 S04360095, S04359948, S04382521
64 1 S04367796
Exemplo 14 Ligação Específica de Determinadas Proteínas PTIP-83 a Vesículas de membrana de borda em escova de inseto (BBMV) e estudos de ligação de competição heteróloga.
[0508] Os intestinos dos insetos foram isolados de insetos no quarto estágio, fazendo uma incisão longitudinal
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521/525 através da cutícula ao longo do lado dorsal das larvas. Os intestinos médios foram abertos para remover a membrana peritrófica e o bolo alimentar e separados da carcaça. Os intestinos isolados foram limpos de corpos de gordura e outros tecidos não do intestino médio e imediatamente congelados em nitrogênio líquido para armazenamento a -80 °C até que fossem necessários. As vesículas de membrana de borda em escova (BBMVs) foram preparadas a partir do tecido do intestino médio armazenado essencialmente como descrito em Wolfersberger, M. et al. (Comp Bíoch Physiol (1987)). Os níveis de proteína foram quantificados pelo método colorimétrico do ácido bicinconínico (BCA) (Pierce, Rockland, IL, EUA) . As quantidades de BBMV foram baseadas nestas determinações de proteína. A atividade da aminopeptidase N foi medida e usada como indicador do enriquecimento da membrana apical durante a preparação de BBMV. O ensaio mediu a hidrólise do substrato artificial L-leucina-p-nitroanilida a 1 mM (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) quando misturado com amostras de tecido em tampão consistindo em NaCl a 25 mM e Tris-HCl a 10 mM, pH 8,0, monitorizando a mudança na absorbância a 405 nm em um leitor de placas de 96 poços (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) . Na preparação para ligação e competição, as proteínas PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 1) e PtIP-83Cb (SEQ ID NO: 7) foram dialisadas durante a noite a 4 °C em tampão de ligação que consistia em Na2CO3 a 20 mM, NaHCO3 a 20 mM, pH 9,6, NaCl a 100 mM e Tween20® a 0,2%. Para monitorizar a ligação específica, cada proteína foi marcada com o indicador fluorescente Alexa Fluor®488 (Thermo Fisher Scientific) de acordo com as instruções do fabricante. As condições para medir a ligação específica foram otimizadas variando a quantidade de BBMVs e a concentração de proteína
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522/525 marcada durante o teste da competição causado por um excesso molar de proteína não marcada. As condições ótimas foram determinadas para cada combinação proteína/inseto da seguinte forma: 10 nM de Alexa- PtIP-83Aa e 30 pg de CEW BBMVs; 4 nM de Alexa- PtIP-83Aa e 20 pg de FAW BBMVs; 20 nM de Alexa- PtIP-83Cb e 30 pg CEW ou FAW BBMVs. Os ensaios de ligação consistiram em misturar uma quantidade optima de BBMVs e proteína marcada em 100 microlitros de tampão de ligação na ausência e na presença de diferentes concentrações de proteína não marcada. As misturas foram incubadas a 25 °C durante 1 hora enquanto se mantinha a agitação constante utilizando um agitador orbital de alta velocidade. Após a incubação, foi adicionado tampão de ligação gelado (1,0 mL) a cada reação e as BBMV com proteínas ligadas foram recolhidas por centrifugação (10 min a 20000 g) a 4 °C para separar as proteínas não ligadas. O sedimento de BBMV foi então novamente lavado com 1,0 mL de tampão de ligação gelado com centrifugação (10 min, 20000 g). O sedimento final de BBMV foi então suspenso em tampão de amostra LDS com reagente redutor (Nupage®, ThermoFisher Scientific), fervido durante 5 minutos e submetido a SDS-PAGE (gel Novex NuPage® 4-12% de Bis-Tris utilizando tampão de execução MOPS (Thermo Fisher Scientific)). Após a conclusão da eletroforese, as toxinas marcadas com Alexa foram detectadas como bandas fluorescentes nos géis. A imagem do gel foi capturada eletronicamente usando um sistema de imagem digital (LAS-4010, GE Healthcare). As medições de densitometria de imagens de gel foram usadas para quantificar a ligação das toxinas marcadas usando software de imagem molecular (TotalLab, Newcastle, UK). Os valores de ECso (definidos como a concentração de proteína não marcada que reduziu a ligação da proteína marcada
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523/525 especifica em 50%) foram determinados para aproximar a afinidade de ligação para cada proteína. Os valores de EC50 foram medidos através da incubação de BBMVs com a proteína marcada na ausência e presença de concentrações crescentes de proteína não marcada (competição homóloga) até ser atingida a redução máxima na ligação específica. Os valores de densitometria foram ajustados a uma equação logística usando OriginPro 2015 (Originlab, Northampton, MA, EUA) para determinar o ponto de redução de 50%. Para avaliações de competição heteróloga, foram utilizadas condições de ligação ótimas para a proteína marcada e foram testadas a uma concentração de saturação da proteína não marcada de competição. Os sinais de ligação medidos na presença de proteína não marcada foram normalizados para o sinal medido para proteína marcada isoladamente. Os valores das réplicas foram calculados e a ligação específica foi calculada subtraindo o sinal de ligação não específico. PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 1) e PtlP83Cb (SEQ ID NO: 7) partilham cerca de 71% da identidade da sequência de proteína. As experiências de ligação competitivas heterólogas realizada utilizando Lagarta da espiga (CEW) BBMVs mostrou nenhuma competição significativa em qualquer direção entre estas duas proteínas, indicando que elas reconhecem diferentes sítios alvo (Fig. 6) . Resultados semelhantes foram obtidos com BBMVs preparados a partir de Lagarta-do-cartucho do milho (FAW) e Lagarta falsa-medideira (SBL). Outras experiências de ligação competitiva heteróloga mostraram que PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 1) e I PtIP-83Gb (SEQ ID NO: 798) também não mostraram nenhuma competição significativa em qualquer direção entre estas duas proteínas, indicando que elas reconhecem diferentes sítios
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524/525 alvo. A Tabela 26 representa os resultados de todas as experiências de ligação competitiva heterólogas realizadas.
Tabela 26. Resultados de Ligação de Competição Heteróloga
Proteína Marcada Proteína Não Marcada CEW SBL FAW
PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 1) PtIP-83Cb (SEQ ID NO: 7) Não Não Não
PtIP-83Cb (SEQ ID NO: 7) PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 1) Não Não Não
PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 1) PtIP-83Gb (SEQ ID NO: 798) Não NT Não
PtIP-83Gb (SEQ ID NO: 798) PtIP-83Aa (SEQ ID NO: 1) Não NT Não
PtIP-83Cb (SEQ ID NO: 7) PtIP-83Gb (SEQ ID NO: 798) Sim NT NT
PtIP-83Gb (SEQ ID NO: 798) PtIP-83Cb (SEQ ID NO: 7) Sim NT NT
*Sim - locais de ligação são partilhados no ensaio de ligação de competição heteróloga; Não - locais de ligação não são partilhados no ensaio de ligação heteróloga; NT - não testado [0509] A descrição acima de várias modalidades ilustradas da divulgação não pretende ser exaustiva ou limitar o escopo à forma precisa divulgada. Embora modalidades específicas e exemplos sejam descritos no presente documento com propósitos de ilustração, várias modificações equivalentes são possíveis dentro do escopo da divulgação, como aqueles indivíduos versados na técnica relevante reconhecerão. Os ensinamentos fornecidos no presente documento podem ser aplicados a outros propósitos, diferentes dos exemplos descritos acima. Numerosas modificações e variações são possíveis à luz
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525/525 dos ensinamentos acima e, portanto, estão dentro do escopo das reivindicações anexas.
[0510] Essas e outras mudanças podem ser feitas à luz da descrição detalhada acima. Em geral, nas reivindicações a seguir, os termos usados não devem ser interpretados como limitantes do escopo às modalidades específicas divulgadas no relatório descritivo e nas reivindicações.
[0511] Toda a divulgação de cada documento citado (o que inclui patentes, pedidos de patente, artigos de periódico, resumos, manuais, livros ou outras divulgações) em Antecedentes, Descrição Detalhada e Exemplos é incorporada no presente documento a título de referência na sua totalidade.
[0512] Esforços foram feitos para garantir precisão em relação aos números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, concentrações, etc.), mas alguns erros e desvios experimentais devem ser permitidos. A não ser que indicado de outro modo, as partes são partes em peso, o peso molecular é o peso molecular médio; a temperatura está em graus centígrados; e a pressão é igual ou próxima da atmosférica.

Claims (13)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Construto de DNA caracterizado pelo fato de que compreende i) uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, ou uma sua variante ou fragmento, e que tem atividade inseticida; e uma ou mais das moléculas de ácido nucleico selecionadas do grupo compreendendo ii) uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7 ou 7 98, ou uma sua variante ou fragmento, e que tem atividade inseticida.
  2. 2. Construto de DNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as moléculas de ácido nucleico que codificam o polipeptídeo conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1, ou uma sua variante ou fragmento, e o polipeptídeo conforme estabelecido na SEQ ID NO: 7 ou 798, ou uma sua variante ou fragmento, estão operacionalmente ligadas a um elemento regulador heterólogo.
  3. 3. Construto de DNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1, ou uma sua variante ou fragmento, e o polipeptídeo conforme estabelecido na SEQ ID NO: 7 ou 798, ou uma sua variante ou fragmento, possuem um sítio de ação diferente em um ensaio de ligação heteróloga entre os polipeptídeos como estabelecido na SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 7 ou 798.
  4. 4. Planta transgênica caracterizada pelo fato de que compreende um empilhamento molecular de i) uma molécula de ácido
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    2/4 nucleico que codifica um polipeptídeo que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, ou uma sua variante ou fragmento, e que tem atividade inseticida; e ii) uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7 ou 798, ou uma sua variante ou fragmento, e que tem atividade inseticida.
  5. 5. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que as moléculas de ácido nucleico que codificam o polipeptídeo conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1, ou uma sua variante ou fragmento, e o polipeptídeo conforme estabelecido na SEQ ID NO: 7 ou 798, ou uma sua variante ou fragmento, estão cada uma operacionalmente ligadas a um elemento regulador heterólogo.
  6. 6. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1, ou uma sua variante ou fragmento, e o polipeptídeo conforme estabelecido na SEQ ID NO: 7 ou 798, ou uma sua variante ou fragmento, possuem um sítio de ação diferente em um ensaio de ligação heteróloga entre os polipeptídeos como estabelecido na SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 7 ou 798.
  7. 7. Planta transgênica caracterizada pelo fato de que compreende um empilhamento de cruzamento de: i) uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, ou uma sua variante ou fragmento, e que tem atividade inseticida; e ii) uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que tem pelo menos
    Petição 870190073694, de 31/07/2019, pág. 37/43
    3/4
    95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7 ou 798, ou uma sua variante ou fragmento, e que tem atividade inseticida.
  8. 8. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1, ou uma sua variante ou fragmento, e o polipeptídeo conforme estabelecido na SEQ ID NO: 7 ou 798, ou uma sua variante ou fragmento, estão cada uma operacionalmente ligadas a um elemento regulador heterólogo.
  9. 9. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1, ou uma sua variante ou fragmento, e o polipeptídeo conforme estabelecido na SEQ ID NO: 7 ou 798, ou uma sua variante ou fragmento, possuem um sítio de ação diferente em um ensaio de ligação heteróloga entre os polipeptídeos como estabelecido na SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 7 ou 798.
  10. 10. Planta transgênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4, 5, 6, 7, 8 ou 9, ou sua progênie, caracterizada pelo fato de que a referida planta transgênica é milho ou soja.
  11. 11. Milho transgênico ou planta de soja caracterizados pelo fato de que compreendem o construto de DNA, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3.
  12. 12. Composição caracterizada pelo fato de que compreende: i) uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, ou uma sua variante ou fragmento, e que tem atividade inseticida;
    Petição 870190073694, de 31/07/2019, pág. 38/43
    4/4 e ii) uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptideo que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7 ou 7 98, ou uma sua variante ou fragmento, e que tem atividade inseticida.
  13. 13. Método para controlar uma população de pragas de insetos caracterizado pelo fato de que compreende colocar a população de pragas de insetos em contato com a planta transgênica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11, ou com a composição, conforme definida na reivindicação 12.
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