BR112020005806A2 - proteínas inseticidas quiméricas - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a toxinas inseticidas vegetativas IR-DIG35563, polinucleotídeos codificando tais toxinas, o uso de tais toxinas para controlar pragas e plantas transgênicas que produzem tais toxinas. A invenção inclui variantes, fragmentos e análogos de IR-DIG35563.

Description

Relatório descritivo da patente de invenção para "PROTEÍ- NAS INSETICIDAS QUIMÉRICAS".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade para o Pe- dido Provisório nº U.S. 62/563,228, depositado em 26 de setembro de 2017, que está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência. REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SUBMETIDA ELE-

TRONICAMENTE

[0002] A cópia oficial da listagem de sequências é enviada eletroni- camente através de EFS-Web como uma listagem de sequências em formato ASCIIl com um arquivo denominado "80144 WO PCT Se- quence Listing ST25", criado em 25 de setembro de 2018, e que tem um tamanho de 17 quilobytes e é depositado simultaneamente com o relatório descritivo. A listagem de sequências contida nesse documento formatado em ASCII faz parte do relatório descritivo e é incorporada na sua totalidade neste documento a título de referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0003] Esta invenção se relaciona geralmente com o domínio da bi- ologia molecular. Mais especificamente, a invenção diz respeito a novas toxinas de proteínas inseticidas desenvolvidas a partir de toxinas de pro- teínas inseticidas vegetativas presentes em Bacillus thuringiensis e ao seu uso para controlar insetos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0004] Insetos e outras pragas custam aos agricultores bilhões de dólares anualmente em perdas de culturas e despesas para manter es- tas pragas sob controle. Adicionalmente às perdas nas culturas agríco- las, as pragas de insetos são também um peso para os horticultores e fruticultores, para os produtores de flores ornamentais e para os jardi-

neiros. As perdas causadas por pragas de insetos em ambientes de pro- dução agrícola incluem decréscimo no rendimento de culturas, quali- dade reduzida das colheitas, e custos acrescidos da ceifa.

[0005] As pragas de insetos são principalmente controladas por aplicações intensivas de pesticidas químicos, que são ativos por inibi- ção do crescimento de insetos, prevenção da alimentação ou reprodu- ção de insetos ou por causarem a morte. Desse modo, pode ser alcan- çado um bom controle de insetos, mas estes produtos químicos por ve- zes também podem afetar outros insetos benéficos. Outro problema que resulta do uso amplo de pesticidas químicos é o aparecimento de popu- lações de insetos resistentes. Tal foi parcialmente aliviado por várias práticas de gestão da resistência, mas há uma necessidade crescente de agentes alternativos de controle de pragas. Agentes biológicos de controle de pragas, tais como cepas de Bacillus thuringiensis (Bt) ex- pressando toxinas pesticidas tais como delta-endotoxinas, também têm sido aplicados em plantas de cultura com resultados satisfatórios, ofe- recendo uma alternativa ou complemento aos pesticidas químicos. Os genes que codificam algumas dessas delta-endotoxinas foram isolados e foi mostrado que a sua expressão em hospedeiros heterólogos pro- porciona outra ferramenta para o controle de pragas de insetos econo- micamente importantes. Em particular, a expressão de toxinas insetici- das, tais como delta-endotoxinas de Bacillus thuringiensis, em plantas transgênicas tem proporcionado proteção eficiente contra pragas de in- setos selecionadas, e plantas transgênicas expressando tais toxinas têm sido comercializadas, permitindo aos fazendeiros reduzir aplica- ções de agentes químicos de controle de insetos.

[0006] O micróbio do solo Bacillus thuringiensis é uma bactéria Gram-positiva formadora de esporos caracterizada por inclusões protei- cas cristalinas paraesporais. O Bacillus thuringiensis continua a ser a fonte mais importante de novas proteínas inseticidas para o desenvolvi- mento de pesticidas incorporados em plantas. No mercado norte-ame- ricano de resistência a insetos do maís, Spodoptera frugiperda (lagarta- do-cartucho do milho "FAW"), Ostrinia nubialis Húubner (broca europeia do milho "ECB"), e Helicoverpa zea Boddie (lagarta-da-espiga-do-milho "CEW") são pragas motrizes-chave, apesar de haver outras pragas de insetos-chave em outras geografias (por exemplo, Helicoverpa armigera (lagarta do capulho do algodoeiro "CBW" ou lagarta-da-espiga-do-milho "CEW")) e espécies de pragas de insetos adicionais secundárias, mas importantes. Toxinas Bt representam mais de 90% dos produtos bioin- seticidas comercializados e essencialmente a totalidade da fonte de ge- nes para culturas transgênicas que foram desenvolvidas para proporci- onar resistência à alimentação por insetos. Bactérias Bt produzem delta- endotoxinas inseticidas incluindo toxinas Cristal (Cry), Citotoxina (Cyt) e Proteína Inseticida Vegetativa (VIP), dependendo da sua estrutura gené- tica e proteica. As toxinas Cry são produzidas durante a formação de es- poros como proteínas cristalinas insolúveis. As toxinas VIP, por outro lado, são produzidas como proteínas solúveis durante o estágio vegetativo do crescimento bacteriano de Bt. As proteínas VIP são distintas de proteínas Cry no que se refere às suas estruturas, mas partilham a propriedade com toxinas Cry de serem formadoras de poros atuando em células localizadas no mesentério dos insetos. A classificação de proteínas VIP se baseou previamente nos seus tipos de insetos-alvo. Atualmente é empregue uma nomenclatura que classifica sistematicamente os genes VIP com base na homologia de sequências de aminoácidos em vez de especificidades para insetos. Crickmore, N., Baum, J., Bravo, A., Lereclus, D., Narva, K., Sampson, K., Schnepf, E., Sun, M. e Zeigler, D.R. "Bacillus thurin- giensis toxin nomenciature" (2016); http://www.btnomenclature.info/; e http://www .lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil Crickmore/Bt/vip.html

[0007] O uso continuado de agentes químicos e biológicos para controlar pragas de insetos acentua a possibilidade dos insetos desen- volverem resistência a tais medidas de controle. Além disso, a elevada seletividade de agentes de controle biológicos resulta muitas vezes no controle de apenas algumas pragas de insetos específicas por cada agente. Apesar do êxito do milho transgênico resistente a ECB, a pos- sibilidade do desenvolvimento de populações de insetos resistentes ameaça a durabilidade de longo prazo de proteínas Cry no controle de ECB e cria a necessidade de descobrir e desenvolver novos agentes de controle biológicos Cry ou de outros tipos para controlar ECB e outras pragas.

[0008] Ainda há uma necessidade de descobrir e desenvolver agen- tes de controle de pragas novos e eficazes que forneçam um benefício econômico aos fazendeiros e que sejam aceitáveis em relação ao am- biente. São particularmente necessários agentes de controle que visem um espectro amplo de pragas de insetos economicamente importantes que controlem de forma eficiente as populações de insetos que são, ou se podem tornar, resistentes a agentes de controle de insetos existentes e aqueles com potência igual ou acrescida em comparação com os agentes de controle atuais.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0009] A presente invenção proporciona toxinas VIP quiméricas in- seticidas, incluindo a proteína designada IRDIG35563 (SEQ ID NO:2) que foi construída com base nos primeiros 613 resíduos de aminoácidos de VIP3Ab1 e uma porção C-terminal de outra toxina VIP, variantes de IRDIG35563, ácidos nucleicos codificando estas toxinas quiméricas, métodos de controle de pragas usando as toxinas, métodos de produ- ção das toxinas em células hospedeiras transgênicas, e plantas trans- gênicas que expressam as toxinas. A invenção proporciona adicional- mente um construto de ácido nucleico recombinante compreendendo um ou mais elementos reguladores heterólogos que acionam a expres- são de uma sequência de ácido nucleico codificando a SEQ ID NO:2 e sequências de ácidos nucleicos escolhidas do grupo consistindo em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, e SEQ ID NO:4. Em outra modalidade, a invenção proporciona construtos de ácidos nucleicos compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma toxina de inseto qui- mérica IRDIG35563 operavelmente ligada a uma ou mais regiões regu- ladoras, como um promotor que não é derivado de Bt e é capaz de aci- onar a expressão em uma célula hospedeira, preferencialmente uma célula de planta.

A invenção inclui uma toxina quimérica inseticida com- preendendo os resíduos 1 até 789 da SEQ ID NO:2, e plantas ou partes de plantas compreendendo tais construtos de ácidos nucleicos.

A inven- ção proporciona adicionalmente plantas ou partes de plantas nas quais a toxina quimérica tem atividade inseticida contra insetos selecionados do grupo consistindo em Spodoptera exigua (Lagarta-militar da beter- raba, BAW), Spodoptera eridania (Lagarta-militar do Sul, SAW), Spodoptera frugiperda (Lagarta-do-cartucho do milho, FAW), Spodop- tera frugiperda resistente a Cry1F (rLagarta-do-cartucho do milho, rFAW), Helicoverpa zea (Lagarta-da-espiga-do-milho, CEW), Pseudo- Plusia includens (Lagarta falsa medideira, SBL), Anticarsia gemmatalis (Lagarta-da-soja, VBC), Heliothis virescens (Lagarta-da-maçã, TBW), e Helicoverpa armigera (Lagarta do capulho do algodoeiro, CBW). Tam- bém é proporcionado pela invenção um método para controlar insetos suscetíveis, compreendendo contatar o intestino do referido inseto com uma quantidade eficaz de uma toxina quimérica revelada, bem como um método para controlar uma população de pragas de insetos, com- preendendo contatar o intestino de indivíduos da referida população de pragas com uma quantidade eficaz em termos inseticidas de uma toxina quimérica revelada.

Também é proporcionado um método para produzir uma planta resistente a insetos ou tolerante a insetos, compreendendo cruzar uma planta não transgênica com uma planta transgênica com- preendendo um construto de DNA revelado incorporado de modo está- vel no genoma da planta e selecionar progênie contendo o construto de ácido nucleico revelado.

DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS

[0010] SEQ ID NO:1 Uma sequência de DNA quimérica codificando IRDIG35563.

[0011] SEQ ID NO:2 A sequência da toxina de proteína quimérica de IRDIG35563.

[0012] SEQ ID NO:3 Uma sequência de DNA com elevado teor de GC otimizada para maís codificando IRDIG35563.

[0013] SEQ ID NO:4 Uma sequência de DNA otimizada quanto aos códons mais preferenciais de soja codificando IRDIG35563.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO |. Definições

[0014] Como usadas aqui, as formas singulares "um", "e", e "o/a" incluem referentes plurais a menos que o contexto claramente dite de outro modo. Desse modo, por exemplo, a referência a "uma célula" inclui uma pluralidade de tais células e referência "à proteína" inclui referência a uma ou mais proteínas e equivalentes das mesmas e assim por diante.

Todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado que o comumente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica à qual esta descrição pertence, a me- nos que claramente indicado de outro modo.

[0015] "Suficientemente idêntico" é usado no presente documento para se referir a uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, T5%, 16%, 17%, 18%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,

95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência em comparação com uma sequência de referência utilizando um dentre os programas de alinhamento descritos no presente documento com o uso de parâmetros padrão.

[0016] Como usado aqui, o termo "proteína", "molécula de peptí- deo" ou "polipeptídeo" inclui aquelas moléculas que sofrem modificação, incluindo modificações pós-tradução, tais como, mas sem limitação, for- mação de ligações dissulfeto, glicosilação, fosforilação ou oligomeriza- ção.

[0017] Os termos "aminoácido" e "aminoácidos" se referem a todos os L-aminoácidos de ocorrência natural.

[0018] "Reter atividade inseticida" é usado no presente documento para se referir a um polipeptídeo que tem pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70%, 80%, 90%, 95% ou mais da atividade inseticida do polipeptídeo IRDIG35563 de comprimento completo.

[0019] “Fragmentos" ou "porções biologicamente ativas" incluem fragmentos de polipeptídeo que compreendem sequências de aminoá- cidos suficientemente idênticas a um polipeptídeo IRDIG35563 que e têm atividade inseticida e polinucleotídeos codificando os fragmentos. "Fragmentos" ou "porções biologicamente ativas" de polipeptídeos IR- DIG35563 incluem fragmentos que compreendem sequências de ami- noácidos suficientemente idênticas à sequência de aminoácidos apre- sentada nos polipeptídeos IRDIG35563 da descrição, em que o polipep- tídeo tem atividade inseticida.

[0020] Uma molécula de ácido nucleico (ou DNA) “isolada” é usada no presente documento para se referir a uma sequência de ácido nu- cleico (ou DNA) que não está mais em seu ambiente natural e foi colo- cada em um ambiente diferente pela mão do homem, por exemplo, in vitro. Uma molécula de ácido nucleico (ou DNA) “recombinante” é usada no presente documento para se referir a uma sequência de ácido nu- cleico (ou DNA) que está em uma célula hospedeira bacteriana ou de planta recombinante. Em algumas modalidades, um ácido nucleico "iso- lado" ou "recombinante" está livre de sequências (preferencialmente se- quências codificadoras de proteína) que flanqueiam naturalmente o ácido nucleico (isto é, sequências localizadas nas extremidades 5' e 3' do ácido nucleico) no DNA genômico do organismo a partir do qual o ácido nucleico é derivado.

[0021] "Nucleotídeos contíguos" é usado no presente documento para se referir a resíduos de nucleotídeos que são imediatamente adja- centes uns aos outros.

[0022] Conforme usado no presente documento, sequência de ácido nucleico, molécula de ácido nucleico ou polinucleotídeo não ge- nômico se refere a uma molécula de ácido nucleico que tem uma ou mais alterações na sequência de ácido nucleico em comparação a uma sequência de ácido nucleico nativa ou genômica. Em algumas modali- dades, a mudança em relação a uma molécula de ácido nucleico nativa ou genômica inclui, porém sem limitação: mudanças na sequência de ácido nucleico devido à degenerescência do código genético; otimiza- ção da sequência de ácido nucleico para expressão em plantas; mudan- ças na sequência de ácido nucleico para introduzir pelo menos uma substituição, inserção, deleção e/ou adição de aminoácidos em compa- ração com a sequência nativa ou genômica; deleção de uma ou mais regiões regulatórias a montante ou a jusante associadas à sequência de ácido nucleico genômica; inserção de uma ou mais regiões regulató- rias a montante ou a jusante heterólogas; deleção da região não tradu- zida 5' e/ou 3' associada à sequência de ácido nucleico genômica; in- serção de uma região não traduzida 5' e/ou 3' heteróloga, e modificação de um sítio de poliadenilação. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico não genômico é uma sequência de ácido nucleico sinté- tico.

[0023] A presente invenção proporciona toxinas de proteínas inse- ticidas e métodos para administrar as toxinas que são funcionalmente ativas e eficazes contra muitas ordens de insetos, especialmente inse- tos Lepidópteros. Por "atividade funcional", "funcional", "inseticida" ou "ativo contra" se pretende significar que a proteína é funcional como uma toxina ou agente de controle de insetos oralmente ativo, que a pro- teina tem um efeito tóxico, ou consegue proceder à disrupção ou deter o crescimento ou alimentação de insetos. Quando um inseto ingere uma quantidade eficaz de uma toxina da presente invenção administrada via expressão em plantas transgênicas, composição(ões) proteicas formu- ladas, composição(ões) proteicas pulverizáveis, uma matriz de isca ou outro sistema de administração, os resultados são tipicamente morte do inseto, inibição do crescimento ou proliferação do inseto, ou prevenção de os insetos se alimentarem da fonte, preferencialmente uma planta transgênica, que disponibiliza as toxinas aos insetos. Proteínas funcio- nais da presente invenção também podem funcionar em conjunto ou isoladamente para intensificar ou melhorar a atividade de uma ou mais proteínas de toxinas diferentes. Os termos "tóxico", "toxicidade" ou "to- xina" pretendem significar que as toxinas em questão têm atividade fun- cional como definida aqui.

[0024] Letalidade completa para insetos se alimentando é preferen- cial, mas não é requerida, para alcançar atividade funcional. Se um in- seto evitar a toxina ou cessar de se alimentar, tal revogação será útil em algumas aplicações, mesmo que os efeitos sejam subletais ou a letali- dade seja retardada ou indireta. Por exemplo, se forem desejadas plan- tas transgênicas resistentes a insetos, a relutância dos insetos em se alimentarem das plantas é tão útil quanto a toxicidade letal para os in- setos porque o objetivo final é evitar danos em plantas induzidos por insetos.

[0025] Usando várias cepas de isolados bacterianos, inventamos novas toxinas quiméricas que são ativas contra uma série inesperada- mente grande de pragas de insetos comercialmente importantes. Des- crevemos aqui a invenção de novas toxinas VIP quiméricas que têm um espectro inesperadamente amplo de atividade inseticida, incluindo ativi- dade inseticida contra Spodoptera exigua (Lagarta-militar da beterraba, BAW), Spodoptera eridania (Lagarta-militar do Sul, SAW), Spodoptera frugiperda (Lagarta-do-cartucho do milho, FAW) e FAW resistente a pro- tetores incorporados em plantas desreguladas, Helicoverpa zea (La- garta-da-espiga-do-milho, CEW), Pseudoplusia includens (Lagarta falsa medideira, SBL), Anticarsia gemmatalis (Lagarta-da-soja, VBC), Heli- othis virescens (Lagarta-da-maçã, TBW) e Helicoverpa armigera (La- garta do capulho do algodoeiro, CBW).

[0026] Foi descrita uma classe de proteínas inseticidas denominada VIP3. Ver, por exemplo, Estruch et al. (1996, Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 5389-5394) e Yu et al. (1997, Appl. Environ. Microbiol. 63:532-536). Os genes VIP3 codificam proteínas de aproximadamente 88 kDa que são expressas por Bts durante estágios de crescimento vegetativo. Foi rela- tado que estas toxinas são distintas das delta-endotoxinas formadoras de cristais. A referência a toxinas VIP designadas VIP1A(a), VIP1A(b), VIP2A(a), VIP2A(b), VIP3A(a), e VIP3A(b) é conhecida na literatura. Ver também Lee et al., AEM vol. 69, no. 8 (agosto de 2003), páginas 4648— 4657, quanto a uma discussão do mecanismo de ação e truncamento de proteínas VIP.

[0027] Toxinas de proteínas VIP3A possuem atividade inseticida contra muitas pragas lepidópteras, incluindo FAW, CEW, Agrotis ipsilon Hufnagel (lagarta-rosca negra "BCW") e Heliothis virescens Fabricius (lagarta-da-maçã "TBW"). Mais recentemente, se verificou que proteí-

nas VIP são tóxicas para certas espécies de pragas de insetos hemíp- teras (Nanasaheb, P. et al, "Toxins" (Basileia) vol. 4, no.6 (junho de 2012), páginas 405429, Sattar S. e Maiti M.K., J. Microbiol. Biotechnol. 2011, 21:937-946). Assim, a classe de toxinas de proteínas VIP exibe um espectro único de atividades inseticidas. Outras revelações, WO 98/18932, WO 99/33991, WO 98/00546, e WO 99/57282, também iden- tificaram agora homólogos da classe de proteínas VIP3.

[0028] Polipeptídeos IRDIG35563 e suas variantes e fragmentos. Uma nova proteína inseticida quimérica à base de VIP, IRDIG35563, foi criada combinando os 613 aminoácidos N-terminais de VIP3Ab1 com os 176 aminoácidos C-terminais de IRDIG10870 (também conhecido como DIG740). Devido à redundância do código genético, uma varie- dade de diferentes sequências de ácidos nucleicos pode codificar as sequências de aminoácidos reveladas aqui. Pertence ao âmbito de um perito treinado na técnica criar estas sequências de ácidos nucleicos alternativas codificando as mesmas, ou essencialmente as mesmas, to- xinas depois de serem conhecidas as sequências de aminoácidos.

[0029] Variantes ativas em insetos da toxina IRDIG35563 também são descritas aqui, e são coletivamente referidas como toxinas para in- setos IRDIG35563, ou variantes de IRDIG35563, e incluem formas trun- cadas tendo resíduos Met N-terminais adicionados a truncamentos N- terminais. Variantes de IRDIG35563 são definidas com base na SEQ ID NO:2. Para toxinas completas, substituições de aminoácidos conserva- tivas variando não mais do que 5% da SEQ ID NO:2 que retêm a ativi- dade pertencem ao escopo desta invenção.

[0030] Em algumas modalidades, o polipeptídeo IRDIG35563 tem pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 714%, 175%, 16%, 17%, 18%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%,

93%, 294%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de se- quência em comparação com a SEQ ID NO: 2, bem como substituições, deleções, inserções de aminoácidos, seus fragmentos e suas combina- ções. O termo "cerca de" quando usado no presente documento em contexto com identidade de sequência em porcentagem significa +/- 0,5%. Estes valores podem ser apropriadamente ajustados para deter- minar a homologia correspondente de proteínas considerando a simila- ridade de aminoácidos e semelhantes.

[0031] Em algumas modalidades, a identidade de sequência é con- tra a sequência de comprimento total de um polipeptídeo IRDIG35563.

[0032] Em algumas modalidades, fragmentos de polipeptídeos IR- DIG35563 compreendem uma sequência de aminoácidos suficiente- mente idêntica à sequência de aminoácidos apresentada nos polipeptí- deos IRDIG35563 da descrição, em que o polipeptídeo tem atividade inseticida. Tais porções biologicamente ativas podem ser preparadas por técnicas recombinantes e avaliadas em relação à atividade inseti- cida. Em algumas modalidades, o polipeptídeo IRDIG35563 retém ati- vidade inseticida contra uma espécie Lepidóptera. Em algumas modali- dades, a atividade inseticida é contra uma ou mais pragas de insetos selecionadas de BAW, SAW, FAW, rFAW, CEW, TBW, SBL, VBC e CBW.

[0033] Em algumas modalidades, o fragmento polipeptídico é um truncamento N-terminal e/ou C-terminal de pelo menos 1, 2,3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 ou mais aminoácidos do terminal N e/ou terminal C por proteólise ou por inserção de um códon inicial, por deleção dos có- dons que codificam os aminoácidos deletados e inserção concomitante de um códon inicial, e/ou inserção de um códon de terminação na se- quência que codifica o fragmento polipeptídico.

[0034] Em algumas modalidades, o fragmento polipeptídico IR- DIG35563 é um truncamento N-terminal de pelo menos 1, 2, 3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 aminoá- cidos do terminal N do polipeptídeo IRDIG35563 da SEQ ID NO: 2.

[0035] Em algumas modalidades, o fragmento polipeptídico de IR- DIG35563 é um truncamento N-terminal e/ou C-terminal de pelo menos 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 ou mais aminoácidos do terminal N e/ou terminal C em relação ao polipeptídeo IRDIG35563 da SEQ ID NO: 2.

[0036] Em algumas modalidades, um polipeptídeo IRDIG35563 compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 173%, T4%, T5%, 16%, 177%, 18%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade com a sequência de ami- noácidos do polipeptídeo IRDIG35563 da SEQ ID NO: 2, em que o po- lipeptídeo IRDIG35563 tem atividade inseticida.

[0037] Uma propriedade surpreendente de IRDIG35563 é o fato de se ter verificado que é ativo contra populações de FAW que se tornaram resistentes a certas toxinas Cry, especialmente Cry1F. Em conformi- dade, toxinas IRDIG35563 são candidatas ideais para o controle e pre- venção de populações de pragas Lepidópteras resistentes. Outra pro- priedade surpreendente de toxinas IRDIG35563 é o seu largo espectro de atividade contra muitas pragas de culturas Lepidópteras. Outra pro- priedade surpreendente destas toxinas quiméricas é a sua atividade contra espécies Lepidópteras que são pragas de maiís e soja, incluindo BAW, SAW, FAW, rFAW, CEW, TBW, SBL, VBC e CBW.

[0038] Toxinas IRDIG35563 e variantes ativas em termos insetici- das. Para além da toxina IRDIG35563 completa da SEQ ID NO:2, a in- venção abrange variantes ativas em termos inseticidas da SEQ ID NO:2. Pelo termo variante, os requerentes pretendem incluir certos mutantes de deleção, substituição e inserção. Um fragmento de IRDIG35563 é qualquer sequência proteica que se encontra na SEQ ID NO:2 que é menor do que a sequência de aminoácidos completa de IRDIG35563 e que tem propriedades inseticidas. Fragmentos de variantes de IR- DIG35563 também são contemplados como parte da invenção e são definidos como fragmentos de IRDIG35563 contendo certos mutantes de deleção, substituição e inserção descritos aqui e que têm atividade inseticida.

[0039] Variantes de IRDIG35563 criadas através de um número |li- mitado de deleções, substituições ou adições de aminoácidos. Dele- ções, substituições, e adições de aminoácidos à sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO:2 podem ser prontamente feitas de um modo se- quencial e os efeitos de tais variações na atividade inseticida podem ser testados por bioensaio. A invenção também inclui variantes ativas em termos inseticidas da SEQ ID NO:2, nas quais foram efetuadas até 39 substituições de aminoácidos conservativas independentes.

[0040] Variantes de sequências de aminoácidos de um polipeptídeo IRDIG35563 podem ser preparadas por mutações no DNA. Isso tam- bém pode ser alcançado por uma dentre diversas formas de mutagê- nese e/ou em evolução direcionada.

[0041] Em alguns aspectos, as mudanças codificadas na sequência de aminoácidos não afetarão substancialmente a função da proteína. Tais variantes terão a atividade pesticida desejada. No entanto, é en- tendido que a capacidade de um polipeptídeo IRDIG35563 para conferir atividade pesticida pode ser aprimorada pelo uso de tais técnicas nas composições desta descrição.

[0042] Em algumas modalidades, a metionina iniciadora da tradu- ção do polipeptídeo IRDIG35563 é removida por clivagem de modo pós- tradução, por exemplo, por uma metionina aminopeptidase em muitos sistemas de expressão celular.

[0043] Variantes podem ser preparadas efetuando-se mutações aleatórias ou as variantes podem ser planejadas. No caso de mutantes designados, há uma elevada probabilidade de gerar variantes com ati- vidade similar à da toxina nativa quando a identidade de aminoácidos é mantida em regiões críticas da toxina que são responsáveis pela ativi- dade biológica ou estão envolvidas na determinação da configuração tridimensional que acaba por ser responsável pela atividade biológica. Também ocorrerá uma probabilidade elevada de reter a atividade se as substituições forem conservativas. Os aminoácidos podem ser coloca- dos nas seguintes classes: não polares, polares sem carga, básicos e ácidos. É menos provável que substituições conservativas pelas quais um aminoácido de uma classe é substituído por outro aminoácido do mesmo tipo alterem materialmente a atividade biológica da variante. À Tabela 1 proporciona uma listagem de exemplos de aminoácidos per- tencentes a cada classe. Tabela 1 Classes de aminoácidos Cadeias Laterais Não Polares Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (1), Pro (P), Met ur cs IIELITBD Cadeias Laterais Polares Sem | Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn Cadeias Laterais Com Ramifica- | Thr, Val, Ile cpm

[0044] Alternativamente, alterações podem ser feitas à sequência de proteína de muitas proteínas no terminal amino ou carbóxi sem afetar substancialmente a atividade. Estas podem incluir inserções, deleções ou alterações introduzidas por métodos moleculares modernos, como PCR, incluindo amplificações por PCR que alteram ou estendem a se- quência de codificação de proteína por inclusão de sequências codifica- doras de aminoácidos nos oligonucleotídeos utilizados na amplificação por PCR. Alternativamente, as sequências de proteínas adicionadas po- dem incluir sequências de codificação de proteína inteiras, para gerar fusões de proteínas. Tais proteínas de fusão são frequentemente usa- das para (1) aumentar a expressão de uma proteína de interesse (2) introduzir um domínio de ligação, atividade enzimática ou epítopo para facilitar a purificação da proteína, a detecção da proteína ou outros usos experimentais (3) direcionar a secreção ou tradução de uma proteína para uma organela subcelular, tais como o espaço periplasmático de bactérias Gram-negativas, mitocôndrias ou cloroplastos de plantas ou o retículo endoplasmático de células eucarióticas, sendo que o último re- sulta frequentemente em glicosilação da proteína.

[0045] As sequências de nucleotídeos e de aminoácidos variantes da descrição também abrangem as sequências derivadas de procedi- mentos mutagênicos e recombinogênicos, como embaralhamento de DNA. Com tal procedimento, uma ou mais regiões de codificação de polipeptídeo IRDIG35563 diferentes podem ser usadas para criar um novo polipeptídeo IRDIG35563 que possui as propriedades desejadas. Dessa maneira, as bibliotecas de polinucleotídeos recombinantes são geradas a partir de uma população de polinucleotídeos de sequência relacionada que compreendem regiões de sequência que têm identi- dade de sequência substancial e podem ser recombinadas de modo ho- mólogo in vitro ou in vivo. Por exemplo, com o uso dessa abordagem, os motivos de sequência codificadores de um domínio de interesse po-

dem ser embaralhados entre um gene pesticida e outros genes pestici- das conhecidos para obter um gene novo que codifica uma proteína com uma propriedade de interesse melhorada, como uma atividade inseti- cida aumentada. Estratégias para tal embaralhamento de DNA incluem, por exemplo, Stemmer, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747- 10751; Stemmer, (1994) Nature 370:389-391; Crameri, et al., (1997) Na- ture Biotech. 15:436-438; Moore, et al., (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang, et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri, et al., (1998) Nature 391:288-291; e Patentes US Números 5,605,793 e 5,837,458.

[0046] A troca ou o embaralhamento de domínios é um outro meca- nismo para gerar polipeptídeos IRDIG35563 alterados. Os domínios po- dem ser trocados entre polipeptídeos IRDIG35563, o que resulta em ou- tras toxinas híbridas ou quiméricas com atividade inseticida ou espectro- alvo aprimorado.

[0047] As proteínas pesticidas da presente invenção são codifica- das por uma sequência de nucleotídeos suficientemente idêntica à se- quência de nucleotídeos da SEQ ID NO:1, ou as proteínas pesticidas são suficientemente idênticas à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:2.

[0048] Para determinar a identidade percentual de duas sequências de aminoácidos ou de dois ácidos nucleicos, as sequências são alinha- das para propósitos de comparação ideais. A identidade percentual en- tre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (isto é, identidade percentual = nú- mero de posições idênticas/número total de posições (por exemplo, po- sições em sobreposição) x100). Em uma modalidade, as duas sequên- cias têm o mesmo comprimento. Em outra modalidade, a identidade per- centual é calculada através da totalidade da sequência de referência. À identidade percentual entre duas sequências pode ser determinada com o uso de técnicas similares àquelas descritas abaixo, com ou sem per- missão de intervalos. Ao calcular a identidade percentual, as correspon- dências tipicamente exatas são contadas. Um intervalo (uma posição em um alinhamento em que um resíduo está presente em uma sequên- cia, mas não na outra) é considerado uma posição com resíduos não idênticos.

[0049] A determinação da identidade percentual entre duas sequên- cias pode ser alcançada com o uso de um logaritmo matemático. Um exemplo não limitante de um algoritmo matemático utilizado para a com- paração de duas sequências é o algoritmo incorporado nos programas BLASTN e BLASTX. Karlin e Altschul (1990) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 87:2264, Altschul et a/. (1990) J. Mol. Bioi. 215:403, e Karlin e Altschul (1993) Proc. Nat'.. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. As buscas por nucle- otídeo com BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTN, pontuação = 100, comprimento de palavra = 12, para obter sequências de nucleotídeos homólogas às moléculas de ácidos nucleicos do tipo pesticida da invenção. As buscas por proteína com BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTX, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3, para obter sequências de aminoácidos homólogas a molé- culas de proteínas pesticidas da invenção. Para obter alinhamentos in- completos para propósitos de comparação, Gapped BLAST (em BLAST

2.0) pode ser utilizado conforme descrito em Altschul, et al., (1997) Nu- cleic Acids Res. 25:3.389. Alternativamente, PSI-Blast pode ser usado para realizar uma busca iterada que detecta relações distantes entre moléculas. Ver Altschul et a/. (1997) supra. Ao utilizar os programas BLAST, Gapped BLAST e PSI-Blast, os parâmetros padrão dos respec- tivos programas (por exemplo, BLASTX e BLASTN) podem ser usados. O alinhamento também pode ser realizado manualmente por inspeção.

[0050] Outro exemplo não limitante de um algoritmo matemático uti-

lizado para a comparação de sequências é o algoritmo ClustalW (Hig- gins, et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). ClustalW compara sequências e alinha a totalidade da sequência de DNA ou de aminoá- cido e, portanto, pode fornecer dados sobre a conservação de sequên- cia de toda a sequência de aminoácidos.

O algoritmo ClustalW é usado em diversos pacotes de software de análise de DNA/aminoácidos co- mercialmente disponíveis, tais como, o módulo ALIGNX do Pacote de Programas Vetor NTI (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Depois do alinhamento das sequências de aminoácidos com ClustalW, a identi- dade de aminoácido percentual pode ser avaliada.

Um exemplo não |i- mitante de um programa de software útil para a análise de alinhamentos ClustalW é o GENEDOC'TY.

O GENEDOC'"Y (Karl Nicholas) permite avaliação da similaridade e da identidade de aminoácido (ou DNA) entre múltiplas proteínas.

Outro exemplo não limitante de um algoritmo mate- mático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo de Myers e Miller, (1988) CABIOS 4(1):11-17. Tal algoritmo é incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), que é parte do Pacote de Software GCG Wisconsin Genetics, Versão 10 (disponível junto a Accelrys, Inc., San Diego, CA, EUA). Ao utilizar o programa ALIGN para comparar se- quências de aminoácidos, uma tabela de resíduo de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de vão de 12 e uma penalidade de vão de 4 podem ser usadas.

A menos que afirmado em contrário, GAP Versão 10, que usa o algoritmo de Needleman e Wunsch (1970) J.

Mol.

Biol. 48(3):443-453, será usado para determinar a identidade ou similaridade de sequência usando os parâmetros seguintes: % de identidade e % de similaridade para uma sequência de nucleotídeos com o uso de GAP Peso de 50 e Peso de Comprimento de 3, e a matriz de pontuação nws- gapdna.cmp; % de identidade ou % de similaridade para uma sequência de aminoácidos com o uso de GAP peso de 8 e peso de comprimento de 2, e o programa de pontuação BLOSUMG62. Programas equivalentes podem também ser usados. Por "programa equivalente" pretende-se significar qualquer programa de comparação de sequências que, para quaisquer duas sequências em questão, gera um alinhamento tendo correspondências entre resíduos de nucleotídeos idênticos e uma per- centagem de identidade de sequência idêntica em comparação com o alinhamento correspondente gerado por GAP Versão 10.

[0051] Em outra modalidade da invenção, sítios de clivagem por proteases podem ser manipulados em localizações desejadas para afe- tar o processamento de proteínas dentro do mesentério de larvas sus- cetíveis de certas pragas de insetos. Estes sítios de clivagem por pro- teases podem ser introduzidos por métodos como síntese genética qui- mica ou PCR de encadeamento com sobreposição (Horton et a/., 1989). Sequências de reconhecimento de serina proteases, por exemplo, po- dem ser opcionalmente inseridas em sítios específicos da estrutura de proteínas Cry para afetar o processamento da proteína em pontos de deleção desejados dentro do mesentério de larvas suscetíveis. Serina proteases que podem ser exploradas de tal modo incluem serina pro- teases do mesentério de Lepidópteros como tripsina ou enzimas do tipo tripsina, quimotripsina, elastase, etc. (Christeller et a/., 1992). Além disso, sítios de deleção identificados empiricamente por sequencia- mento de produtos de digestão de proteínas Cry gerados com prepara- ções de proteases do mesentério larvar não fracionadas ou por ligação a vesículas de membranas de bordadura em escova podem ser mani- pulados para efetivar a ativação de proteínas.

[0052] Serina proteases de Lepidópteros e Coleópteros, tais como proteases do tipo tripsina, quimotripsina e catepsina G, cisteína protea- ses de Lepidópteros e Coleópteros, tais como catepsinas (proteases do tipo B, do tipo L, do tipo O, e do tipo K) (Koiwa et a/., (2000) e Bown et al., (2004)), metaloproteases de Lepidópteros e Coleópteros, tais como

ADAM10 (Ochoa-Campuzano et al., (2007)), e ácido aspártico protea- ses de Lepidópteros e Coleópteros, tais como catepsinas do tipo D e tipo E, pepsina, plasmina e quimosina, podem ser adicionalmente ex- ploradas por manipulação de sequências de reconhecimento apropria- das em sítios de processamento desejados para afetar o processa- mento de proteínas Cry dentro do mesentério de larvas suscetíveis de certas pragas de insetos e talvez também funcionar para proporcionar atividade contra pragas de insetos não suscetíveis.

[0053] Variantes de IRDIG35563 podem ser produzidas por introdu- ção ou eliminação de sítios de processamento de proteases em posi- ções apropriadas na sequência codificadora para permitir, ou eliminar, a clivagem proteolítica de uma proteína variante maior por proteases de insetos, plantas, ou microrganismos pertencem ao escopo da invenção. É entendido que o resultado final de tal manipulação é a geração de moléculas de fragmentos de toxinas tendo a mesma ou melhor função e/ou atividade relativamente à proteína da toxina intacta (completa).

[0054] Em outra modalidade, proteínas de fusão são fornecidas, as quais incluem em sua sequência de aminoácidos uma sequência de aminoácidos que compreende um polipeptídeo IRDIG35563 da descri- ção. Os polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo IRDIG35563 podem ser fundidos a sequências de sinal que direcionarão a localiza- ção do polipeptídeo IRDIG35563 a compartimentos particulares de uma célula procariótica ou eucariótica e/ou direcionarão a secreção do poli- peptídeo IRDIG35563 das modalidades de uma célula procariótica ou eucariótica. Por exemplo, em E. coli, pode-se desejar direcionar a ex- pressão da proteína para o espaço periplasmático. Os exemplos de se- quências ou proteínas (ou fragmentos das mesmas) sinal com as quais o polipeptídeo IRDIG35563 pode ser fundido a fim de direcionar a ex- pressão do polipeptídeo para o espaço periplasmáticico de bactérias in- cluem, mas sem limitação, a sequência de sinal de pel/B, a sequência de sinal da proteína de ligação a maltose (MBP), MBP, a sequência de sinal de ompA, a sequência de sinal da subunidade B de enterotoxina termolábil de E. coli periplasmática e a sequência de sinal de fosfatase alcalina.

Diversos vetores estão comercialmente disponíveis para a construção de proteínas de fusão que direcionarão a localização de uma proteína, como a série de vetores pMAL (particularmente a série pMAL- p) disponível a partir do New England Biolabs.

Em uma modalidade es- pecífica, o polipeptídeo IRDIG35563 pode ser fundido à sequência de sinal de pectato liase de pelB para aumentar a eficiência da expressão e purificação de tais polipeptídeos em bactérias Gram-negativas (con- sultar, documentos de Patente nº US 5,576,195 e 5,846,818). A proteína de fusão pode consistir em fusões de peptídeos/polipeptídeos de trân- sito plastídicos de planta ou peptídeos de trânsito de Apoplastos como um sinal de secreção de alfa-amilase de arroz ou cevada.

O peptídeo de trânsito de plastídeo é geralmente fundido de modo N-terminal ao polipeptídeo a ser direcionado (por exemplo, o parceiro de fusão). Em uma modalidade, a proteína de fusão consiste essencialmente no pep- tídeo de trânsito de plastídeo e no polipeptídeo IRDIG35563 a ser dire- cionado.

Em outra modalidade, a proteína de fusão compreende o pep- tídeo de trânsito de plastídeo e o polipeptídeo a ser direcionado.

Em tais modalidades, o peptídeo de trânsito de plastídeo está preferencialmente no terminal N da proteína de fusão.

No entanto, resíduos de aminoáci- dos adicionais podem ser N-terminais ao peptídeo de trânsito de plastí- deo se a proteína de fusão for pelo menos parcialmente direcionada para um plastídeo.

Em uma modalidade específica, o peptídeo de trân- sito de plastídeo está na metade N-terminal, terço N-terminal ou quarto N-terminal da proteína de fusão.

A maior parte ou a totalidade do peptí- deo de trânsito de plastídeo é geralmente clivada da proteína de fusão por inserção no plastídeo.

A posição da clivagem pode variar ligeira-

mente entre espécies de plantas, em diferentes estágios de desenvolvi- mento de plantas, devido a condições intercelulares específicas ou à combinação de peptídeo de trânsito/parceiro de fusão usada.

Em uma modalidade, a clivagem do peptídeo de trânsito de plastídeo é homogê- nea, de modo que o sítio de clivagem é idêntico em uma população de proteínas de fusão.

Em outra modalidade, o peptídeo de trânsito de plastídeo não é homogêneo, de modo que o sítio de clivagem varia de 1-10 aminoácidos em uma população de proteínas de fusão.

O peptídeo de trânsito de plastídeo pode ser fundido de modo recombinante a uma segunda proteína em uma de diversas maneiras.

Por exemplo, um sítio de reconhecimento de endonucleases de restrição pode ser introduzido na sequência de nucleotídeos do peptídeo de trânsito em uma posição correspondente à sua extremidade C-terminal e o mesmo sítio ou um sítio compatível pode ser manipulado na sequência de nucleotídeos da proteína a ser direcionada em sua extremidade N-terminal.

Deve ter-se cuidado na projeção desses sítios para garantir que as sequências de codificação do peptídeo de trânsito e da segunda proteína sejam man- tidas "no quadro" para permitir a síntese da proteína de fusão desejada.

Em alguns casos, pode ser preferencial remover a metionina iniciadora da segunda proteína quando o sítio de restrição novo é introduzido.

À introdução de sítios de reconhecimento de endonucleases de restrição em ambas as moléculas paternas e sua união subsequente através de técnicas de DNA recombinante podem resultar na adição de um ou mais aminoácidos extra entre o peptídeo de trânsito e a segunda proteína.

Isso geralmente não afeta a atividade de direcionamento se o sítio de clivagem do peptídeo de trânsito permanecer acessível e a função da segunda proteína não for alterada pela adição desses aminoácidos ex- tra em seu terminal N.

Um sítio de clivagem preciso entre o peptídeo de trânsito e a segunda proteína (com ou sem sua metionina iniciadora) pode ser criado com o uso de síntese de genes (Stemmer, et al., (1995)

Gene 164:49 a 53) ou métodos similares. Além disso, a fusão do peptí- deo de trânsito pode incluir intencionalmente aminoácidos a jusante do sítio de clivagem. Os aminoácidos no terminal N da proteína madura podem afetar a capacidade do peptídeo de trânsito para direcionar pro- teínas para plastídeos e/ou a eficácia da clivagem após a importação de proteínas. Isso pode ser dependente da proteína a ser direcionada. Ver, por exemplo, Comai, et a/l., (1988) J. Biol. Chem. 263(29):15104-9. Em algumas modalidades, o polipeptídeo IRDIG35563 é fundido a um pep- tídeo sinal heterólogo ou peptídeo de trânsito heterólogo.

[0055] Moléculas de ácidos nucleicos, e suas variantes e fragmen- tos. As moléculas de ácidos nucleicos isoladas ou recombinantes que compreendem sequências de ácidos nucleicos que codificam polipeptí- deos IRDIG35563 ou porções biologicamente ativas dos mesmos, as- sim como moléculas de ácidos nucleicos suficientes para uso como son- das de hibridação para identificar moléculas de ácidos nucleicos que codificam proteínas com regiões de homologia de sequência são forne- cidas. Conforme usado no presente documento, o termo "molécula de ácido nucleico" se refere a moléculas de DNA (por exemplo, DNA re- combinante, cDNA, DNA genômico, DNA plastídico, DNA mitocondrial) e moléculas de RNA (por exemplo, mMRNA) e análogos do DNA ou RNA gerados com o uso de análogos de nucleotídeos. A molécula de ácido nucleico pode ser de fita única ou de fita dupla, mas preferencialmente é DNA de fita dupla.

[0056] Sequências de nucleotídeos que codificam IRDIG35563, Suas variantes e truncamentos, podem ser sintetizadas e clonadas em vetores plasmídicos padrão por meios convencionais, ou podem ser ob- tidas por manipulação padrão de biologia molecular de outros constru- tos contendo as sequências de nucleotídeos. Sítios de restrição únicos internos a uma região codificadora de IRDIG35563 podem ser identifi- cados e fragmentos de DNA compreendendo as sequências entre os sítios de restrição da região codificadora de IRDIG35563 podem ser sin- tetizados, cada um de tais fragmentos codificando uma deleção, inser- ção ou outra variação em IRDIG35563 específica. Os fragmentos de DNA codificando os fragmentos de IRDIG35563 modificados podem ser unidos a outros fragmentos da região codificadora de IRDIG35563 ou outros fragmentos da região codificadora de Cry ou VIP em sítios de restrição apropriados para se obter uma região codificadora codificando a proteína IRDIG35563 completa desejada, proteína IRDIG35563 dele- tada ou variante. Por exemplo, é possível identificar um sítio de reco- nhecimento de restrição apropriado no início de uma primeira região co- dificadora de IRDIG35563, e um segundo sítio de restrição interno à re- gião codificadora de IRDIG35563. A clivagem desta primeira região co- dificadora de IRDIG35563 nestes sítios de restrição irá gerar um frag- mento de DNA compreendendo parte da primeira região codificadora de IRDIG35563. Um segundo fragmento de DNA flanqueado por sítios de restrição compatíveis analogamente situados específicos para outra re- gião codificadora de IRDIG35563 pode ser usado em combinação com o primeiro fragmento de restrição de DNA para construir uma variante.

[0057] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo IRDIG35563 é um polinucleotídeo que tem a sequência apresentada na SEQ ID NO: 1 e variantes, fragmentos e complementos do mesmo. As sequências de ácidos nucleicos que são complementares a uma sequência de ácido nucleico das modalidades ou que hibridam com uma sequência das modalidades também são abrangidas. As sequências de ácidos nucleicos podem ser usadas em construtos de DNA ou cassetes de expressão para transformação e ex- pressão em organismos, incluindo microrganismos e plantas. As se- quências de nucleotídeos ou aminoácidos podem ser sequências sinté- ticas que foram projetadas para expressão em um organismo que inclui, mas sem limitação, um microrganismo ou uma planta.

[0058] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo IRDIG35563 é uma sequência de ácidos nuclei- cos não genômica.

[0059] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo IRDIG35563 é um polinucleotídeo não genô- mico que tem uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 75%, 76%, 77%, 18%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade com a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 1, em que o polipeptídeo IRDIG35563 codificado tem ativi- dade inseticida.

[0060] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo de IR- DIG35563codifica um polipeptídeo IRDIG35563 que tem pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, T5%, 16%, 17%, 18%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência em comparação à SEQ ID NO: 2, e tem pelo menos uma substituição, de- leção, inserção de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos em comparação com a sequência nativa.

[0061] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico co- difica um polipeptídeo IRDIG35563 que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade ao longo do comprimento inteiro da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2.

[0062] Os genes bacterianos têm frequentemente múltiplos códons de início de metionina em proximidade com o início do quadro de leitura aberto. Normalmente, o início da tradução em um ou mais desses có- dons de início levará à geração de uma proteína funcional. Os códons de início podem ser códons ATG. Certas bactérias como Bacillus sp. também reconhecem o códon GTG como códon de início. Em ocasiões raras, a tradução em sistemas bacterianos pode se iniciar em um códon TTG. Adicionalmente, não é normalmente determinado a priori quais desses códons são usados naturalmente na bactéria. Desse modo, é entendido que o uso de um dos códons de metionina alternativos tam- bém pode levar à geração de proteínas pesticidas. Essas proteínas pes- ticidas são abrangidas na presente descrição e podem ser usadas nos métodos da presente descrição. Será entendido que, quando expressas em plantas, será necessário alterar o códon de início alternativo para ATG para tradução apropriada.

[0063] A sequência de codificação de polinucleotídeo pode ser mo- dificada para adicionar um códon na penúltima posição após o códon de início de metionina para criar um sítio de enzima de restrição para propósitos de clonagem recombinante e/ou para propósitos de expres- são. Em algumas modalidades, o polipeptídeo IRDIG35563 compre- ende adicionalmente um resíduo alanina na posição após a metionina iniciadora de tradução.

[0064] Moléculas de ácidos nucleicos que são fragmentos dessas sequências de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos IR- DIG35563 também são abrangidas pelas modalidades. Um fragmento de uma sequência de ácido nucleico pode codificar uma porção biologi- camente ativa de um polipeptídeo IRDIG35563 ou pode ser um frag- mento que pode ser usado como uma sonda de hibridação ou iniciador de PCR com o uso dos métodos revelados abaixo. Moléculas de ácidos nucleicos que são fragmentos de uma sequência de ácido nucleico que são contíguos ou até ao número de nucleotídeos presentes em uma se- quência de ácido nucleico de comprimento completo revelada no pre- sente documento, dependendo do uso destinado. Os fragmentos das sequências de ácidos nucleicos das modalidades codificarão fragmen- tos de proteína que retêm a atividade biológica do polipeptídeo IR- DIG35563 e, por isso, retêm a atividade inseticida. Em algumas moda- lidades, o polipeptídeo IRDIG35563 retém pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70%, 80%, 90%, 95% ou mais da atividade inseticida do polipeptídeo IRDIG35563 completo. Em algumas modalidades, a atividade inseticida é contra uma espécie de Lepidópteros. Em algumas modalidades, a ati- vidade inseticida é contra uma ou mais pragas de insetos selecionadas de BAW, SAW, FAW, CEW, TBW, SBL, VBC e CBW.

[0065] Em algumas modalidades, o ácido nucleico codifica um poli- peptídeo IRDIG35563 que tem pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência em comparação à SEQ ID NO: 2. Em algu- mas modalidades, a identidade de sequência é calculada com o uso do algoritmo ClustalW do módulo ALIGNXO do Pacote de Programa Vetor NTIO (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Calif.) com todos os parâmetros padrão. Em algumas modalidades, a identidade de sequência é deter- minada ao longo do comprimento completo do polipeptídeo calculada com o uso do algoritmo ClustalW do módulo ALIGNX do Pacote de Pro- gramas Vetor NTI (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Calif.) com todos os parâmetros padrão.

[0066] As modalidades também abrangem moléculas de ácidos nu- cleicos que codificam variantes de polipeptídeo IRDIG35563. “Varian- tes" das sequências de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeo IR- DIG35563 incluem aquelas sequências que codificam os polipeptídeos

IRDIG35563 revelados no presente documento, mas que diferem con- servativamente devido à degenerescência do código genético, assim como aquelas que são suficientemente idênticas conforme discutido acima. As sequências de ácido nucleico variantes também incluem se- quências de ácido nucleico sinteticamente derivadas que foram gera- das, por exemplo, com o uso de mutagênese sítio-dirigida, mas que ainda codificam os polipeptídeos IRDIG35563 revelados conforme dis- cutido abaixo.

[0067] A presente descrição fornece polinucleotídeos isolados ou recombinantes que codificam qualquer um dos polipeptídeos IR- DIG35563 revelados no presente documento. Devido à degenerescên- cia do código genético existe uma pluralidade de sequências de nucle- otídeos codificando polipeptídeos IRDIG35563 da presente descrição.

[0068] Mudanças podem ser introduzidas por mutação das sequên- cias de ácidos nucleicos, o que leva a mudanças na sequência de ami- noácidos dos polipeptídeos IRDIG35563 codificados, sem comprometer a atividade funcional das proteínas. Portanto, as moléculas de ácidos nucleicos variantes podem ser criadas introduzindo-se uma ou mais substituições, adições e/ou deleções de nucleotídeos nas sequências de ácidos nucleicos correspondentes reveladas no presente docu- mento, de modo que uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácidos sejam introduzidas na proteína codificada. As mutações podem ser introduzidas por técnicas padrão, como mutagênese dirigida a sítios e mutagênese mediada por PCR. Tais sequências de ácidos nucleicos variantes são também englobadas pela presente descrição.

[0069] Alternativamente, as sequências de ácidos nucleicos varian- tes podem ser preparadas introduzindo-se mutações aleatoriamente ao longo de toda ou parte da sequência de codificação, como por mutagê- nese por saturação, e os mutantes resultantes podem ser triados quanto à capacidade para conferir atividade pesticida com o propósito de iden- tificar mutantes que retêm atividade. Após a mutagênese, a proteína co- dificada pode ser expressa de modo recombinante e a atividade da pro- teína pode ser determinada com o uso de técnicas de ensaio padrão.

[0070] Os polinucleotídeos da descrição e fragmentos dos mesmos são opcionalmente usados como substratos para uma variedade de re- ações de recombinação e recombinação recursiva, além de métodos de clonagem padrão, conforme estabelecido, por exemplo, em Ausubel, Berger e Sambrook, isto é, para produzir homólogos de polipeptídeos pesticidas adicionais e fragmentos dos mesmos com propriedades de- sejadas. Uma variedade de tais reações é conhecida. Métodos para pro- duzir uma variante de qualquer ácido nucleico listado no presente docu- mento compreendendo recombinar recursivamente tal polinucleotídeo com um segundo polinucleotídeo (ou mais), formando, assim, uma bi- blioteca de polinucleotídeos variantes, são também modalidades da descrição, assim como as bibliotecas produzidas, as células que com- preendem as bibliotecas e qualquer polinucleotídeo recombinante pro- duzido por tais métodos. Adicionalmente, tais métodos compreendem opcionalmente selecionar um polinucleotídeo variante de tais bibliotecas com base na atividade pesticida, em que tal combinação recursiva é feita in vitro ou in vivo.

[0071] Uma variedade de protocolos geradores de diversidade, in- cluindo protocolos de recombinação recursiva de ácidos nucleicos, es- tão disponíveis e completamente descritos na técnica. Os procedimen- tos podem ser usados separadamente e/ou em combinação para pro- duzir uma ou mais variantes de um ácido nucleico ou conjunto de ácidos nucleicos, assim como variantes de proteínas codificadas. Individual e coletivamente, esses procedimentos fornecem maneiras amplamente aplicáveis e robustas para gerar ácidos nucleicos diversificados e con- juntos de ácidos nucleicos (incluindo, por exemplo, bibliotecas de ácidos nucleicos) úteis, por exemplo, para a manipulação ou evolução rápida de ácidos nucleicos, proteínas, vias, células e/ou organismos com ca- racterísticas novas e/ou melhoradas.

[0072] Embora distinções e classificações sejam feitas no decorrer da discussão por motivos de clareza, será notado que as técnicas mui- tas vezes não são mutuamente exclusivas. Certamente, os vários mé- todos podem ser usados isoladamente ou em combinação, em paralelo ou em série, para acessar diversas variantes de sequências.

[0073] O resultado de qualquer um dos procedimentos de geração de diversidade descritos no presente documento pode ser a geração de um ou mais ácidos nucleicos, os quais podem ser selecionados ou tria- dos quanto a ácidos nucleicos com, ou que conferem, propriedades de- sejáveis ou que codificam proteínas com, ou que conferem, proprieda- des desejáveis. Após a diversificação por um ou mais dos métodos no presente documento ou disponíveis de outro modo para uma pessoa versada na técnica, quaisquer ácidos nucleicos que sejam produzidos podem ser selecionados quanto a uma atividade ou propriedade dese- jada, por exemplo, atividade pesticida ou tal atividade a um pH dese- jado, etc. Isso pode incluir identificar qualquer atividade que possa ser detectada, por exemplo, em um formato automatizado ou automatizável, por qualquer um dentre os ensaios da técnica, consultar, por exemplo, a discussão de triagem de atividade inseticida, infra. Uma variedade de propriedades relacionadas (ou até mesmo não relacionadas) pode ser avaliada, em série ou em paralelo, a critério do praticante.

[0074] As descrições de uma variedade de procedimentos de gera- ção de diversidade para gerar sequências de ácidos nucleicos modifica- dos, por exemplo, aquelas que codificam polipeptídeos que têm ativi- dade pesticida ou fragmentos dos mesmos, são encontradas nas publi- cações a seguir e nas referências citadas nas mesmas: Soong, et al.,

(2000) Nat Genet 25(4):436 a 439; Stemmer, et a/l., (1999) Tumor Tar- geting 4:1 a 4; Ness, et al., (1999) Nat Biotechnol 17:893 a 896; Chang, et al., (1999) Nat Biotechnol 17:793 a 797; Minshull e Stemmer, (1999) Curr Opin Chem Biol 3:284 a 290; Christians, et al/., (1999) Nat Bio- technol 17:259 a 264; Crameri, et al., (1998) Nature 391:288 a 291; Cra- meri, et al., (1997) Nat Biotechnol 15:436 a 438; Zhang, et al., (1997) PNAS USA 94:4504 a 4509; Patten, et a/., (1997) Curr Opin Biotechnol 8:724 a 733; Crameri, et al., (1996) Nat Med 2:100 a 103; Crameri, et al., (1996) Nat Biotechnol 14:315 a 319; Gates, et al., (1996) J Mol Biol 255:373 a 386; Stemmer, (1996) "Sexual PCR and Assembly PCR" em: The Encyclopedia of Molecular Biology. VCH Publishers, Nova lorque. pp. 447-457; Crameri e Stemmer, (1995) BioTechniques 18:194-195; Stemmer, et a/., (1995) Gene, 164:49-53; Stemmer, (1995) Science 270: 1510; Stemmer, (1995) Bio/Technology 13:549-553; Stemmer, (1994) Nature 370:389-391 e Stemmer, (1994) PNAS USA 91:10747-10751.

[0075] Métodos de mutação para gerar diversidade incluem, por exemplo, mutagênese dirigida a sítios (Ling, et al., (1997) Anal Biochem 254(2):157 a 178; Dale, et al., (1996) Methods Mol Biol 57:369 a 374; Smith, (1985) Ann Rev Genet 19:423 a 462; Botstein e Shortle, (1985) Science 229:1.193 a 1.201; Carter, (1986) Biochem J 237:1 a 7 e Kun- kel, (1987) "The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis" em "Nucleic Acids & Molecular Biology" (Eckstein e Lilley, editores, Springer Verlag, Berlim)); mutagênese com o uso de modelos que contêm uracila (Kunkel, (1985) PNAS USA 82:488 a 492; Kunkel, et al., (1987) Methods Enzymol 154:367 a 382 e Bass, et al., (1988) Science 242:240 a 245); mutagênese direcionada a oligonucleotídeos (Zoller e Smith, (1983) Me- thods Enzymol 100:468 a 500; Zoller e Smith, (1987) Methods Enzymol 154:329 a 350 (1987); Zoller e Smith, (1982) Nucleic Acids Res 10:6.487 a 6.500), mutagênese de DNA modificado por fosforotiato (Taylor, et al., (1985) Nucl Acids Res 13:8.749 a 8.764; Taylor, et al., (1985) Nucl Acids

Res 13:8.765 a 8.787 (1985); Nakamaye e Eckstein, (1986) Nucl Acids Res 14:9679 a 9698; Sayers, et al., (1988) Nucl Acids Res 16:791 a 802 e Sayers, et al., (1988) Nucl Acids Res 16:803 a 814); mutagênese com o uso de DNA de dúplex incompleto (Kramer, et al., (1984) Nucl Acids Res 12:9.441 a 9.456; Kramer e Fritz, (1987) Methods Enzymol 154:350 a 367; Kramer, et al., (1988) Nucl Acids Res 16:7.207 e Fritz, et al., (1988) Nucl Acids Res 16:6.987 a 6.999).

[0076] Os métodos adequados adicionais incluem reparo de ponto de emparelhamento errôneo (Kramer, et al., (1984) Cell 38:879 a 887), mutagênese com o uso de cepas hospedeiras deficientes para reparo (Carter, et al., (1985) Nucl Acids Res 13:4431 a 4443 e Carter, (1987) Methods in Enzymol 154:382 a 403), mutagênese por deleção (Eghte- darzadeh e Henikoff, (1986) Nucl Acids Res 14:5115), seleção de res- trição e purificação de restrição (Wells, et al., (1986) Phil Trans R Soc Lond A 317:415 a 423), mutagênese por síntese de gene total (Nambiar, et al., (1984) Science 223:1.299 a 1.301; Sakamar e Khorana, (1988) Nucl Acids Res 14:6.361 a 6.372; Wells, et al., (1985) Gene 34:315 a 323 e Grundstrôm, et a/l., (1985) Nucl Acids Res 13:3.305 a 3.316), re- paro de quebra em fita dupla (Mandecki, (1986) PNAS USA, 83:7.177 a

7.181 e Arnold, (1993) Curr Opin Biotech 4:450 a 455). Os detalhes adi- cionais de muitos dentre os métodos acima podem ser encontrados em Methods Enzymol Volume 154, que também descreve os controles úteis para a resolução de problemas com vários métodos de mutagênese.

[0077] Desenvolvimento de Sondas de Oligonucleotídeos. Outro método para identificar as toxinas e genes da presente invenção é atra- vés do uso de sondas de oligonucleotídeos. Estas sondas são sequên- cias de nucleotídeos detectáveis. Estas sequências podem ser tornadas detectáveis em virtude de uma etiqueta radioativa apropriada ou podem ser tornadas inerentemente fluorescentes como descrito, por exemplo, na Patente US No. 6,268,132. Como é bem conhecido na técnica, se a molécula de sonda e amostra de ácido nucleico hibridarem por formação de ligações fortes de emparelhamentos de bases entre as duas molé- culas, pode ser razoavelmente presumido que a sonda e amostra têm homologia de sequência substancial. Preferencialmente, a hibridação é conduzida sob condições estringentes por técnicas bem conhecidas na técnica, como descrito, por exemplo, em Keller e Manak (1993). A de- tecção da sonda proporciona um meio para determinar, de um modo conhecido, se ocorreu hibridação. Tal análise de sondas proporciona um método rápido para identificar genes codificadores de toxinas da presente invenção. Os segmentos de nucleotídeos que são usados como sondas de acordo com a invenção podem ser sintetizados usando um sintetizador de DNA e procedimentos comuns. Estas sequências de nucleotídeos também podem ser usadas como iniciadores de PCR para amplificar genes da presente invenção.

[0078] Hibridação de ácidos nucleicos. Como é bem conhecido dos peritos em biologia molecular, a similaridade de dois ácidos nucleicos pode ser caracterizada pela sua tendência para hibridarem. Como usa- dos aqui, os termos "condições estringentes" ou “condições de hibrida- ção estringentes" são destinados a referir condições sob as quais uma sonda hibridará (emparelhará) com a sua sequência-alvo até um grau maior de modo detectável do que com outras sequências (por exemplo, pelo menos 2 vezes sobre fundo). Condições estringentes dependem da sequência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. Através do controle da estringência das condições de hibridação e/ou de lava- gem, podem ser identificadas sequências-alvo que são 100% comple- mentares à sonda (sondagem homóloga). Alternativamente, condições de estringência podem ser ajustadas para permitir algum emparelha- mento defeituoso nas sequências de modo que sejam detectados graus mais baixos de similaridade (sondagem heteróloga). Geralmente, uma sonda tem menos de cerca de 1.000 nucleotídeos em comprimento, pre- ferencialmente menos de 500 nucleotídeos em comprimento.

[0079] Tipicamente, condições estringentes serão aquelas nas quais a concentração de sal é menor que cerca de 1,5 M de íon Na, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M de concentração de íon Na (ou outros sais) em pH 7,0 até pH 8,3, e a temperatura é pelo menos cerca de 30ºC para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60ºC para sondas longas (por exemplo, maiores do que 50 nucleotídeos). Condições estringentes podem também ser conseguidas com a adição de agentes desestabilizadores tais como formamida. As condições de estringência baixa exemplificativas incluem hibridação com uma solução tampão de formamida de 30 a 35%, NaCl a 1 M, SDS (dodecilsulfato de sódio) a 1% a 37ºC e uma lavagem em 1x até 2x8SC (20xSSC=NaCl a 3,0 M/citrato trissódico a 0,3 M) a 50 ºC até 55ºC. As condições de estringência moderada exemplificativas incluem hibrida- ção em formamida de 40 até 45%, NaCl a 1,0 M, SDS a 1% a 37ºC e uma lavagem de 0,5x até 1xSSC a 55 ºC até 60ºC. As condições de estringência altas exemplificativas incluem a hibridação em formamida a 50%, NaCl a 1 M, SDS a 1% a 37ºC e uma lavagem em 0,1xSSC a 60 ºC até 65ºC. Opcionalmente, os tampões de lavagem podem com- preender SDS cerca de 0,1% a cerca de 1%. A duração da hibridação é geralmente menos do que cerca de 24 horas, usualmente cerca de 4 até 12 horas.

[0080] A especificidade é tipicamente a função de lavagens pós-hi- bridização, em que os fatores críticos são a força iônica e a temperatura da solução de lavagem final. Para híbridos de DNA/DNA, o ponto de fusão térmico (Tr) é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) à qual 50% de uma sequência-alvo complementar hibrida com uma sonda perfeitamente correspondente. T;é reduzida em cerca de 1ºC para cada 1% de emparelhamento defeituoso, assim, Tr, condições de hibridação e/ou condições de lavagem podem ser ajustadas para facilitar o empa- relhamento de sequências com a identidade desejada. Por exemplo, se sequências com >90% de identidade são pretendidas, a Tr pode ser di- minuída em 10ºC. De modo geral, condições estringentes são selecio- nadas de modo a serem cerca de 5ºC menores do que a Tr para a se- quência específica e seu complemento a uma força iônica e pH defini- dos. No entanto, condições altamente estringentes podem utilizar uma hibridação e/ou lavagem a 1ºC, 2ºC, 3ºC, ou 4ºC menor do que a Tr, condições moderadamente estringentes podem utilizar uma hibridação e/ou lavagem a 6ºC, 7ºC, 8ºC, 9ºC, ou 10ºC menor do que a Ts, e con- dições de estringência baixa podem utilizar uma hibridação e/ou lava- gem a 11ºC, 12ºC, 13ºC, 14ºC, 15ºC, ou 20ºC menor do que a Tr.

[0081] A Tr: (emºC) pode ser determinada experimentalmente ou pode ser aproximada por cálculo. Para híbridos DNA-DNA, a Tr pode ser aproximada da equação de Meinkoth e Wahl (1984): T: (ºC) = 81,5ºC + 16,6 (log M) + 0,41 (% GC) - 0,61 (% formamida) - 500/L; em que Mé a molaridade de cátions monovalentes, % GC é a percentagem de nucle- otídeos guanosina e citosina no DNA, % formamida é a percentagem de formamida na solução de hibridação, e L é o comprimento do híbrido em pares de bases. Alternativamente, a T; é descrita pela fórmula seguinte (Beltz et al., 1983): Tr (ºC) = 81,5ºC + 16,6 (log [Na+]) + 0,41 (% GC) - 0,61 (% formamida) - 600/L; em que [Na+] é a molaridade de íons sódio, % GC é a percentagem de nucleotídeos guanosina e citosina no DNA, % forma- mida é a percentagem de formamida na solução de hibridação, e Lé o comprimento do híbrido em pares de bases. Usando as equações, com- posições de hibridação e lavagem e Tr desejada, os com perícia habitual entenderão que são inerentemente descritas variações na estringência das soluções de hibridação e/ou lavagem. Se o grau desejado de empa- relhamentos defeituosos originar um Tm menor do que 45ºC (solução aquosa) ou 32ºC (solução de formamida), é preferencial aumentar a concentração de SSC de modo a poder ser usada uma temperatura mais elevada. Um guia extenso para a hibridação de ácidos nucleicos está presente em "Hybridization with Nucleic Acid Probes" Vol.1 por P. Tijssen (1993, ISBN-10: 0444898840, ISBN-13: 9780444898845 capa dura) e Ausubel et a/. (1995). Ver também Sambrook et a/. (1989).

[0082] Anticorpos antitoxinas. Anticorpos para as toxinas reveladas aqui, ou fragmentos destas toxinas, podem ser preparados usando pro- cedimentos padrão bem conhecidos na técnica. Tais anticorpos são úteis para detectar a presença de toxinas IRDIG35563 em tecidos de plantas e uma variedade de outras substâncias. Tais anticorpos e antis- soros são úteis em vários métodos de detecção das toxinas IR- DIG35563 reivindicadas da invenção, e suas variantes ou fragmentos. É bem conhecido que anticorpos etiquetados com um grupo repórter podem ser usados para identificar a presença de antígenos em uma va- riedade de meios. Anticorpos etiquetados com radioisótopos têm sido usados em radioimunoensaios para identificar, com grande precisão e sensibilidade, a presença de antígenos em uma variedade de fluidos biológicos. Mais recentemente, anticorpos etiquetados com enzimas têm sido usados como substituto de anticorpos radioetiquetados no en- saio ELISA. Além disso, anticorpos imunorreativos com a toxina inseti- cida de Bt da presente invenção podem ser ligados a uma substância imobilizadora, como um poço ou partícula de poliestireno, e usados em imunoensaios para determinar se a toxina de Bt está presente em uma amostra de teste. Anticorpos anti-| RDIG35563 também são usados para isolar quantidades de toxinas IRDIG35563 a partir de sistemas de pro- dução recombinante ou fontes naturais.

[0083] Fornece-se um kit para detectar a presença de um polipeptí- deo IRDIG35563 ou detectar a presença de uma sequência de nucleo- tídeos que codifica um polipeptídeo IRDIG35563 em uma amostra. Em uma modalidade, o kit fornece reagentes à base de anticorpos para de- tectar a presença de um polipeptídeo IRDIG35563 em uma amostra de tecido. Em outra modalidade, o kit fornece sondas de ácidos nucleicos etiquetadas úteis para detectar a presença de um ou mais polinucleotí- deos que codificam um polipeptídeo IRDIG35563. O kit é fornecido jun- tamente com reagentes e controles apropriados para executar um mé- todo de detecção, assim como instruções para uso do kit.

[0084] Expressão Transgênica de IRDIG35563. As toxinas de pro- teínas em questão podem ser "aplicadas" ou proporcionadas para con- tatar os insetos-alvo em uma variedade de modos. Por exemplo, toxinas IRDIG35563 podem ser usadas como protetores incorporados em plan- tas em plantas transgênicas (produzidos por e presentes na planta). À expressão dos genes das toxinas também pode alcançar seletividade em tecidos específicos das plantas, como as raízes, folhas, etc. Tal pode ser efetuado via o uso de promotores específicos para tecidos.

[0085] Uma modalidade preferencial da presente invenção é a transformação de plantas com genes codificando a proteína inseticida em questão ou suas variantes. As plantas transformadas são resisten- tes a ataque prolongado por uma praga de insetos-alvo em virtude da presença de quantidades controladoras da proteína inseticida em ques- tão ou suas variantes nas células da planta transformada. Ao incorporar e expressar material genético que codifica uma toxina IRDIG35563 no genoma de uma planta comida por uma praga de insetos particular, o adulto ou as larvas irão morrer depois de consumirem o alimento vege- tal. Numerosos membros das classificações de monocotiledôneas e di- cotiledôneas foram transformados. Culturas agronômicas transgênicas, bem como frutos e hortaliças, têm interesse comercial. Tais culturas in- cluem, mas sem limitação, maís, arroz, soja, colza, girassol, alfafa, sorgo, trigo, algodão, amendoim, tomates, batatas e similares. Existem numerosas técnicas bem conhecidas para introduzir material genético estranho em células de plantas monocotiledôneas ou dicotiledôneas, e para obter plantas férteis que mantêm e expressam de modo estável o gene introduzido.

[0086] Em uma modalidade preferencial, IRDIG35563 ou uma vari- ante é administrado oralmente através de uma planta transgênica com- preendendo uma sequência de ácido nucleico que expressa uma toxina da presente invenção. A presente invenção proporciona um método para produzir uma planta transgênica resistente a insetos, compreen- dendo introduzir uma molécula de ácido nucleico da invenção na planta, em que a toxina é expressável na planta transgênica em uma quanti- dade eficaz para controlar um inseto. Em um exemplo não limitador, uma estratégia de clonagem básica pode consistir em subclonar se- quências codificadoras completas ou modificadas de IRDIG35563 em um plasmídeo de expressão em plantas em sítios de restrição Ncol e Sacl. Os cassetes de expressão em plantas resultantes contendo a re- gião codificadora apropriada de IRDIG35563 sob o controle de elemen- tos de expressão em plantas (por exemplo, promotores expressáveis em plantas, determinantes de terminação da transcrição 3' terminal e adição de poliadenilato, e similares) são subclonados em um plasmídeo de vetor binário, utilizando, por exemplo, tecnologia Gatewayº ou pro- cedimentos padrão de clonagem de fragmentos por enzimas de restri- ção. LR Clonase'"“ (Invitrogen, Carlsbad, CA), por exemplo, pode ser usado para recombinar os cassetes de expressão em plantas de genes completos e modificados em um plasmídeo binário de transformação de plantas se for utilizada a tecnologia Gatewayº. É conveniente empregar um vetor binário de transformação de plantas que albergue um gene bacteriano que confere resistência ao antibiótico espectinomicina quando o plasmídeo está presente em células de E. coli e Agrobacte- rium. Também é conveniente empregar um plasmídeo de vetor binário que contém um gene marcador selecionável expressável em plantas que é funcional nas plantas hospedeiras desejadas. Exemplos de genes marcadores selecionáveis expressáveis em plantas incluem, mas sem limitação, aqueles que codificam o gene da aminoglicosídeo fosfotrans- ferase (aphll) do transposon Tn5, que confere resistência aos antibióti- cos canamicina, neomicina e G418, bem como aqueles genes que co- dificam resistência ou tolerância aos herbicidas glifosato; higromicina; metotrexato; fosfinotricina (bialafos), imidazolinonas, sulfonilureias e triazolopirimidina, como clorossulfuron, bromoxinil, dalapon e similares.

[0087] Alternativamente, a estrutura do plasmídeo do vetor binário de transformação de plantas contendo o inserto do gene IRDIG35563 é determinada por mapeamento da impressão digital do digesto de restri- ção de DNA plasmídico preparado a partir de candidatos isolados de Agrobacterium por métodos-padrão de biologia molecular bem conheci- dos dos peritos na técnica da manipulação de Agrobacterium.

[0088] O uso do termo "construtos de nucleotídeos" no presente do- cumento não é destinado a limitar as modalidades aos construtos de nucleotídeos que compreendem DNA. Construtos de nucleotídeos, par- ticularmente polinucleotídeos e oligonucleotídeos compostos por ribo- nucleotídeos e combinações de ribonucleotídeos e desoxirribonucleotí- deos podem também ser empregues nos métodos aqui revelados. Os construtos de nucleotídeos, ácidos nucleicos e sequências de nucleotí- deos das modalidades abrangem adicionalmente todas as formas com- plementares de tais construtos, moléculas e sequências. Além disso, os construtos de nucleotídeos, moléculas de nucleotídeos e sequências de nucleotídeos das modalidades abrangem todos os construtos, molécu- las e sequências de nucleotídeos que podem ser empregues nos méto- dos das modalidades para transformação de plantas, incluindo, mas não se limitando àqueles compreendidos por desoxirribonucleotídeos, ribo- nucleotídeos e suas combinações. Tais desoxirribonucleotídeos e ribo- nucleotídeos incluem tanto moléculas que ocorrem naturalmente como análogos sintéticos. Os construtos de nucleotídeos, ácidos nucleicos e sequências de nucleotídeos das modalidades também abrangem todas as formas de construtos de nucleotídeos incluindo, mas sem limitação, formas de fita única, formas de fita dupla, grampos, estruturas de haste e alça e semelhantes.

[0089] Uma modalidade adicional se refere a um organismo trans- formado, como um organismo selecionado de células de planta e inseto, bactérias, levedura, baculovírus, protozoários, nematódeos e algas. O organismo transformado compreende uma molécula de DNA das moda- lidades, um cassete de expressão que compreende a molécula de DNA ou um vetor que compreende o cassete de expressão, o qual pode ser incorporado de modo estável no genoma do organismo transformado.

[0090] As sequências das modalidades são fornecidas em constru- tos de DNA para expressão no organismo de interesse. O construto in- cluirá sequências reguladoras 5' e 3' ligadas de modo operacional a uma sequência das modalidades. O termo "ligado de modo operacional", conforme usado no presente documento, se refere a uma ligação funci- onal entre um promotor e uma segunda sequência, em que a sequência promotora inicia e medeia a transcrição da sequência de DNA corres- pondente à segunda sequência. De modo geral, ligado de modo opera- cional significa que as sequências de ácidos nucleicos em ligação são contíguas e, quando necessário, para unir duas regiões de codificação de proteína no mesmo quadro de leitura. O construto pode conter adici- onalmente pelo menos um gene adicional a ser cotransformado no or- ganismo. Alternativamente, o(s) gene(s) adicional(ais) pode(m) ser pro- porcionado(s) em múltiplos construtos de DNA.

[0091] Tal construto de DNA é dotado de uma pluralidade de sítios de restrição para inserção da sequência genética do polipeptídeo IR- DIG35563 da descrição de modo a ficar sob regulação de transcrição das regiões regulatórias. O construto de DNA pode adicionalmente con- ter genes marcadores selecionáveis.

[0092] O construto de DNA incluirá geralmente, na direção de 5' para 3' de transcrição: uma região de iniciação de transcrição e tradução (isto é, um promotor), uma sequência de DNA das modalidades, e uma região de terminação de transcrição e de tradução (isto é, região de ter- minação) funcional no organismo que serve como um hospedeiro. A re- gião de iniciação de transcrição (isto é, o promotor) pode ser nativa, análoga, estranha ou heteróloga ao organismo hospedeiro e/ou à se- quência das modalidades. Adicionalmente, o promotor pode ser a se- quência natural ou, alternativamente, uma sequência sintética. O termo "estranho", tal como aqui utilizado, indica que o promotor não se encon- tra no organismo nativo no qual o promotor é introduzido. Quando o pro- motor é "estranho" ou "heterólogo" à sequência das modalidades, se pretende que o promotor não seja o promotor nativo ou de ocorrência natural para a sequência operacionalmente ligada das modalidades. Tal como aqui utilizado, um gene quimérico compreende uma sequência codificante operacionalmente ligada a uma região de iniciação da trans- crição que é heteróloga à sequência codificante. Quando o promotor é uma sequência nativa ou natural, a expressão da sequência ligada ope- racionalmente é alterada a partir da expressão de tipo selvagem, o que resulta em uma alteração do fenótipo.

[0093] Em algumas modalidades, o construto de DNA compreende um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo IRDIG35563 das moda- lidades.

[0094] Em algumas modalidades, o construto de DNA compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão que compreende um polipeptídeo IRDIG35563 das modalidades.

[0095] Em algumas modalidades, o construto de DNA também pode incluir uma sequência de aprimoramento da transcrição. Conforme usado no presente documento, o termo um "aprimorador" se refere a uma sequência de DNA que pode estimular a atividade promotora e pode ser um elemento inato do promotor ou um elemento heterólogo inserido para acentuar o nível ou a especificidade para tecidos de um promotor. Vários intensificadores incluindo íntrons com propriedades de intensificação da expressão de genes em plantas (Publicação de Pedido de Patente Número US 2009/0144863, o íntron de ubiquitina (isto é, o íntron de ubiquitina de maís 1 (consulte, por exemplo, sequência de NCBI S94464)), o intensificador de ômega ou o intensificador de inicia- dor de ômega (Gallie, et al., (1989) Molecular Biology of RNA editor Cech (Liss, Nova lorque) 237 a 256 e Gallie, et al., (1987) Gene 60:217 a 225), o intensificador de CaMV 358 (consulte, por exemplo, Benfey, et al., (1990) EMBO J. 9:1.685 a 1.696) e os intensificadores da Patente US número 7,803,992 também podem ser usados, cada um dos quais é incorporado a título de referência. A lista acima de aprimoradores de transcrição não é destinada a ser limitante. Qualquer aprimorador de transcrição apropriado pode ser usado nas modalidades.

[0096] A região de terminação pode ser nativa com a região de ini- ciação de transcrição, pode ser nativa com a sequência de DNA de in- teresse ligada de modo operacional, pode ser nativa com o hospedeiro de planta ou pode ser derivada de outra fonte (isto é, estranha ou hete- róloga ao promotor, à sequência de interesse, ao hospedeiro de planta ou qualquer combinação dos mesmos).

[0097] Regiões de terminação convenientes são disponibilizadas pelo plasmídeo de Ti de A. tumefaciens, como as regiões de terminação de octopina sintase e nopalina sintase. Ver também, Guerineau, et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot, (1991) Cell 64:671- 674; Sanfacon, et al., (1991) Genes Dev. 5:141 a 149; Mogen, et al., (1990) Plant Cell 2:1.261 a 1.272; Munroe, et a/., (1990) Gene 91:151 a 158; Ballas, et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17:7.891 a 7.903 e Joshi,

et al., (1987) Nucleic Acid Res. 15:9.627 a 9.639.

[0098] Quando apropriado, um ácido nucleico pode ser otimizado para a expressão aumentada no organismo hospedeiro. Assim, quando o organismo hospedeiro é uma planta, os ácidos nucleicos sintéticos podem ser sintetizados utilizando-se códons preferenciais para plantas para uma expressão melhorada. Consultar, por exemplo, Campbell e Govwri, (1990) Plant Physiol. 92:1 a 11 quanto a uma discussão sobre o uso preferido de hospedeiros. Por exemplo, embora as sequências de ácidos nucleicos das modalidades possam ser expressas tanto em es- pécies vegetais monocotiledôneas quanto dicotiledôneas, as sequên- cias podem ser modificadas para tomar em consideração as preferên- cias específicas e preferências do teor de GC de monocotiledôneas ou dicotiledôneas, visto que foi mostrado que essas preferências diferem (Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498). Assim, o códon preferencial de maís para um aminoácido particular pode ser derivado de sequências de genes conhecidas de maís. O uso de maís para 28 genes de plantas de mais é listado na Tabela 4 de Murray, et al., supra. Métodos para sintetizar genes preferenciais para plantas podem ser en- contrados em Murray, et al., (1989) ácidos nucleicos Res. 17:477-498, e Liu H et al. Mol Bio Rep 37:677-684, 2010, aqui incorporados a título de referência. Uma tabela de uso de Zea maize pode também ser en- contrada em kazusa.ou.jp//cgi-bin/show.cgi?species=4577, que pode ser acessado com o uso do prefixo www.

[0099] Uma tabela de uso de Glycine max pode ser encontrada em kazusa.ou.jp//cgi-bin/show.cgi?species=3847&aa=1&style=N, que pode ser acessado com o uso do prefixo www.

[0100] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico re- combinante que codifica um polipeptídeo IRDIG35563 tem códons oti- mizados de maís. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nu-

cleico recombinante que codifica um polipeptídeo IRDIG35563 tem có- dons otimizados para soja.

[0101] Modificações de sequências adicionais são conhecidas por intensificarem a expressão genética em um hospedeiro celular. Estas incluem a eliminação de sequências que codificam sinais de poliadeni- lação espúrios, sinais de sítio de encadeamento éxon-íntron, repetições semelhantes a transposons e outras sequências bem caracterizadas que podem ser prejudiciais para a expressão de genes. O teor de GC da sequência pode ser ajustado para níveis médios para um dado hos- pedeiro celular, conforme calculado em referência a genes conhecidos expressos na célula hospedeira. O termo "célula hospedeira", conforme usado aqui, se refere a uma célula que contém um vetor e suporta a replicação e/ou expressão do vetor de expressão pretendida. As células hospedeiras podem ser células procarióticas, como E. coli, ou células eucarióticas, como células de levedura, inseto, anfíbio ou mamífero ou células de plantas monocotiledôneas ou dicotiledôneas. Um exemplo de uma célula hospedeira monocotiledônea é uma célula hospedeira de maiís. Quando possível, a sequência é modificada para evitar estruturas de mRNA secundárias em grampo previstas.

[0102] Os cassetes de expressão podem conter adicionalmente se- quências líder 5'. Tais sequências líder podem atuar para aumentar a tradução. Líderes de tradução incluem: líderes de picornavírus, por exemplo, líder de EMCV (região de não codificação 5' de Encefalomio- cardite) (Elroy-Stein, et a/., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6.126 a 6.130); líderes de potivírus, por exemplo, líder de TEV (Vírus "Etch" do Tabaco) (Gallie, et a/., (1995) Gene 165(2):233 a 238), líder de MDMV (Vírus do Mosaico do Nanismo de Maís), proteína de ligação a cadeia pesada de imunoglobulina humana (BiP) (Macejak, et a/., (1991) Nature 353:90 a 94); líder não traduzido do mMRNA da proteína de reves- timento do vírus do mosaico da alfafa (AMV RNA 4) (Jobling, et al.,

(1987) Nature 325:622 a 625); líder do vírus do mosaico do tabaco (TMV) (Gallie, et al., (1989) em Molecular Biology of RNA, editor Cech (Liss, Nova lorque), páginas 237 a 256) e líder do vírus de mancha clo- rótica do mais (MCMV) (Lommel, et a/., (1991) Virology 81:382 a 385). Também consultar Della-Cioppa, et al., (1987) Plant Physiol. 84:965 a

968. Tais construtos também podem conter uma "sequência de sinal" ou "sequência líder" para facilitar o transporte cotradução ou pós-tradu- ção do peptídeo para determinadas estruturas intracelulares, como o cloroplasto (ou outro plastídeo), retículo endoplasmático ou aparelho de Golgi.

[0103] “Sequência de sinal", conforme usado no presente docu- mento, se refere a uma sequência que é conhecida ou que há suspeitas de resultar em transporte de peptídeo cotradução ou pós-tradução atra- vés da membrana da célula. Em eucariotas, isso envolve tipicamente a secreção no aparelho de Golgi com alguma glicosilação resultante. To- xinas inseticidas de bactérias são frequentemente sintetizadas como pró-toxinas que são proteoliticamente ativadas no estômago da praga- alvo (Chang, (1987) Methods Enzymol. 153:507-516). Em algumas mo- dalidades, a sequência de sinal está localizada na sequência nativa ou pode ser derivada de uma sequência das modalidades. "Sequência lí- der", conforme usado no presente documento, se refere a qualquer se- quência que, quando traduzida, resulta em uma sequência de aminoá- cidos suficiente para acionar o transporte cotradução da cadeia peptí- dica para uma organela subcelular. Desse modo, isso inclui sequências líder que direcionam o transporte e/ou glicosilação pela passagem para o retículo endoplasmático, passagem para vacúolos, plastídeos inclu- indo cloroplastos, mitocôndrias e semelhantes. Proteínas codificadas de modo nuclear direcionadas ao compartimento do lúmen de tilacoide de cloroplasto têm um peptídeo de trânsito bipartido característico, com- posto por um peptídeo sinal de direcionamento estromal e um peptídeo sinal de direcionamento para o lúmen. As informações de direciona- mento estromal estão na porção próxima do terminal amino do peptídeo de trânsito. O peptídeo sinal de direcionamento para o lúmen está na porção próxima do terminal carboxila do peptídeo de trânsito e contém todas as informações para direcionamento para o lúmen. Pesquisa re- cente em proteômica do cloroplasto de plantas superiores alcançou a identificação de numerosas proteínas do lúmen codificadas de modo nuclear (Kieselbach et al. FEBS LETT 480:271 a 276, 2000; Peltier et al. Plant Cell 12:319 a 341, 2000; Bricker et al. Biochim. Biophys Acta 1503:350 a 356, 2001), cujo peptídeo sinal de direcionamento para o lúmen pode ser potencialmente usado de acordo com a presente des- crição. Cerca de 80 proteínas de Arabidopsis, assim como proteínas ho- mólogas de espinafre e ervilha, são relatadas por Kieselbach et a/., Pho- tosynthesis Research, 78:249 a 264, 2003. A Tabela 2 desta publicação, a qual está incorporada na descrição do presente documento a título de referência, revela 85 proteínas do lúmen de cloroplastos, identificadas por seu número de acesso (consultar também a Publicação de Pedido de Patente nº U.S. 2009/09044298). Além disso, a versão de rascunho recentemente publicada do genoma de arroz (Goff et al, Science 296:92 a 100, 2002) é uma fonte adequada para peptídeo sinal de direciona- mento para o lúmen, a qual pode ser usada de acordo com a presente descrição.

[0104] Os peptídeos de trânsito de cloroplasto (CTP) adequados in- cluem CT quiméricos que compreendem, mas sem limitação, um domí- nio N-terminal, um domínio central ou um domínio C-terminal de um CTP de Oryza sativa 1-desoxi-D-xilose-5-Fosfato Sintase de Oryza sa- tiva-Superóxido dismutase de Oryza sativa-amido sintase solúvel de Oryza sativa-enzima de ácido Málico dependente de NADP de Oryza sativa-Fosfo-2-desidro-3-desoxi-heptonato Aldolase 2 de Oryza sativa- L-Ascorbato peroxidase 5 de Oryza sativa-Fosfoglucano água dicinase,

SSRUBISCO de Zea Mays, Zea Mays-beta-glucosidase, Zea Mays-Ma- lato desidrogenase, Tiorredoxina tipo M de Zea Mays, Publicação de Pedido de Patente US 2012/0304336.

[0105] O gene de polipeptídeo IRDIG35563 a ser direcionado para o cloroplasto pode ser otimizado para expressão no cloroplasto para responder por diferenças no uso entre o núcleo vegetal e esta organela. Dessa maneira, os ácidos nucleicos de interesse podem ser sintetiza- dos com o uso de sequências preferenciais para cloroplasto.

[0106] Na preparação do cassete de expressão, os vários fragmen- tos de DNA podem ser manipulados de modo a proporcionar as sequên- cias de DNA na orientação adequada e, conforme apropriado, no qua- dro de leitura adequado. Para este fim, podem ser utilizados adaptado- res ou ligantes para juntar os fragmentos de DNA, ou outras manipula- ções podem estar envolvidas para proporcionar locais de restrição con- venientes, remoção de DNA supérfluo, remoção de locais de restrição ou semelhantes. Para este propósito, podem estar envolvidos mutagê- nese in vitro, reparo de iniciadores, restrição, emparelhamento, novas substituições, por exemplo, transições e transversões.

[0107] Vários promotores podem ser usados na prática das modali- dades. Os promotores podem ser selecionados com base no resultado desejado. Os ácidos nucleicos podem ser combinados com promotores constitutivos, preferenciais para tecidos, induzíveis ou outros promoto- res para expressão no organismo hospedeiro. Promotores constitutivos adequados para uso em uma célula hospedeira de planta incluem, por exemplo, o promotor nuclear do promotor de Rsyn7 e outros promotores constitutivos revelados no documento nº WO 1999/43838 e na Patente nº U.S.6,072,050; o promotor nuclear de CaMV 358 (Odell, et al., (1985) Nature 313:810 a 812); actina de arroz (McElroy, et a/., (1990) Plant Cell 2:163 a 171); ubiquitina (Christensen, et a/l., (1989) Plant Mol. Biol. 12:619 a 632 e Christensen, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 18:675 a 689);

PEMU (Last, et a/., (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581 a 588); MAS (Vel- ten, et al., (1984) EMBO J. 3:2.723 a 2.730); promotor de ALS (Patente nº U.S. 5,659,026) e semelhantes. Outros promotores constitutivos in- cluem, por exemplo, aqueles discutidos nas Patentes nºº U.S. 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142 e 6,177,611.

[0108] Dependendo do resultado desejado, pode ser benéfico ex- pressar o gene a partir de um promotor induzível. Os promotores indu- zíveis por ferimento são de interesse particular para regular a expressão das sequências de nucleotídeos das modalidades em plantas. Tais pro- motores induzíveis por ferimento podem responder ao dano causado por alimentação de insetos e incluem o gene de inibidor de proteinase de batata (pin II) (Ryan, (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28:425-449; Duan, et al., (1996) Nature Biotechnology 14:494-498); wun1 e wun2, Patente US Número 5,428,148; win1 e win2 (Stanford, et al/., (1989) Mol. Gen. Genet. 215:200-208); sistemina (McGurl, et al., (1992) Science 225:1570-1573); WIP1 (Rohmeier, et al., (1993) Plant Mol. Biol. 22:783- 792; Eckelkamp, et a/., (1993) FEBS Letters 323:73-76); gene MPI (Cor- derok, et a/l., (1994) Plant J. 6(2):141-150) e similares, aqui incorporados a título de referência.

[0109] Adicionalmente, os promotores induzíveis por patógenos po- dem ser empregues nos métodos e construtos de nucleotídeos das mo- dalidades. Tais promotores induzíveis por patógenos incluem aqueles de proteínas relacionadas com a patogênese (proteínas PR), que são induzidas após infecção por um patógeno; por exemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1,3-glucanase, quitinase, etc. Consultar, por exem- plo, Redolfi, et al., (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89:245 a 254; Uknes, et al., (1992) Plant Cell 4: 645 a 656 e Van Loon, (1985) Plant Mol. Virol. 4:111 a 116. Ver também, WO 1999/43819, aqui incorporado a título de referência.

[0110] De interesse são os promotores que são expressos local- mente no sítio da infecção patogênica ou perto deste. Consultar, por exemplo, Marineau, et al., (1987) Plant Mol. Biol. 9:335 a 342; Matton, et al., (1989) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325 a 331; Somsisch, et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2.427 a 2.430; Somsisch, et al/., (1988) Mol. Gen. Genet. 2:93 a 98 e Yang, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14.972 a 14.977. Também consultar Chen, et al., (1996) Plant J. 10:955 a 966; Zhang, et a/., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2.507 a 2.511; Warner, et al., (1993) Plant J. 3:191 a 201; Siebertz, et al., (1989) Plant Cell 1:961 a 968; Patente nº U.S. 5,750,386 (induzível por nematódeos) e as referências citadas nos mesmos. É de interesse particular o promotor induzível para o gene PRms de mais, cuja expressão é induzida pelo patógeno Fusarium moniliforme (consul- tar, por exemplo, Cordero, et a/l., (1992) Physiol. Mol. Plant Path. 41:189 a 200).

[0111] Promotores regulados quimicamente podem ser utilizados para modular a expressão de um gene em uma planta através da apli- cação de um regulador químico exógeno. Dependendo do objetivo, o promotor pode ser um promotor quimicamente induzível, em que a apli- cação da substância química induz a expressão genética, ou um pro- motor quimicamente repressível, em que a aplicação da substância qui- mica reprime a expressão genética. Os promotores induzíveis quimica- mente incluem, mas não estão limitados ao promotor In2-2 de maís, que é ativado por meio de agentes fitoprotetores de herbicidas benzenossul- fonamidas, o promotor GST de maís, que é ativado por compostos ele- trofílicos hidrofóbicos que são utilizados como herbicidas pré-emergen- tes e o promotor PR-1a do tabaco, que é ativado por ácido salicílico. Outros promotores de interesse regulados quimicamente incluem pro- motores responsivos a esteroides (consultar, por exemplo, o promotor induzível por glicocorticoide em Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 88:10421-10425 e MchNellis et al. (1998) Plant J. 14(2):247- 257) e promotores induzíveis por tetraciclina e repressíveis por tetraci- clina (ver, por exemplo, Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229- 237, e Patentes U.S. Nos. 5,814,618 e 5,789,156), incorporados aqui a título de referência.

[0112] Os promotores preferenciais para tecidos podem ser utiliza- dos para direcionar a expressão de polipeptídeo IRDIG35563 para um tecido de planta específico. Os promotores preferidos para tecidos in- cluem aqueles discutidos em Yamamoto, et a/., (1997) Plant J. 12(2)255 a 265; Kawamata, et al., (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792 a 803; Han- sen, et al., (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337 a 343; Russell, et al., (1997) Transgenic Res. 6(2):157 a 168; Rinehart, et al., (1996) Plant Physiol. 112(3):1.331 a 1.341; Van Camp, et al., (1996) Plant Physiol. 112(2):525 a 535; Canevascini, et al., (1996) Plant Physiol. 112(2):513 a 524; Yamamoto, et al., (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773 a 778; Lam, (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco, et al., (1993) Plant Mol Biol. 23(6):1129-1138; Matsuoka, et a/., (1993) Proc Nat!. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590 e Guevara-Garcia, et a/., (1993) Plant J. 4(3):495-505. Tais promotores podem ser modificados, se necessá- rio, para expressão fraca.

[0113] Promotores preferenciais para folhas podem ser encontra- dos em Yamamoto, et al., (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kwon, et al., (1994) Plant Physiol. 105:357-67; Yamamoto, et al., (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Gotor, et al., (1993) Plant J. 3:509-18; Orozco, et al., (1993) Plant Mol. Biol. 23(6):1129-1138 e Matsuoka, et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590.

[0114] Promotores preferenciais para raízes ou específicos para ra- ízes são conhecidos e podem ser selecionados dos muitos disponíveis na literatura ou isolados de novo de várias espécies compatíveis. Con- sultar, por exemplo, Hire, et a/., (1992) Plant Mol. Biol. 20(2):207 a 218

(gene de glutamina sintetase específico para raiz de soja); Keller e Baumgartner, (1991) Plant Cell 3(10): 1051 a 1061 (elemento de controle específico para raiz no gene GRP 1.8 de Vagem); Sanger, et a/., (1990) Plant Mol.

Biol. 14(3):433 a 443 (promotor específico para raiz do gene de manopina sintase (MAS) de Agrobacterium tumefaciens) e Miao, et al., (1991) Plant Cell 3(1):11 a 22 (clone de cDNA de comprimento com- pleto codificador de glutamina sintetase (GS) citosólica, a qual é ex- pressa em raízes e nódulos de raiz de soja). Também consultar Bogusz, et al., (1990) Plant Cell 2(7):633 a 641, em que dois promotores especí- ficos para raiz isolados de genes de hemoglobina da não leguminosa de fixação de nitrogênio Parasponia andersonii e da não leguminosa não de fixação de nitrogênio Trema tomentosa são descritos.

Os promotores destes genes foram ligados a um gene repórter de B-glucuronidase e introduzidos tanto na não leguminosa Nicotiana tabacum quanto na le- guminosa Lotus corniculatus, e em ambos os casos a atividade promo- tora específica para raízes foi preservada.

Leach e Aoyagi (1991) des- crevem sua análise dos promotores dos genes indutores de raízes rolC e rolD altamente expressos de Agrobacterium rhizogenes (consultar, Plant Science (Limerick) 79(1):69 a 76). Os mesmos concluíram que o intensificador e determinantes de DNA preferenciais para tecidos estão dissociados nesses promotores.

Teeri, et al., (1989) usaram fusão ge- nética a lacZ para mostrar que o gene de T-DNA de Agrobacterium co- dificador de octopina sintase é especialmente ativo na epiderme da ponta de raiz e que o gene de TR2' é específico para raiz na planta intacta e estimulado por ferimento no tecido foliar, uma combinação es- pecialmente desejável de características para uso com um gene inseti- cida ou larvicida (consultar, EMBO J. 8(2):343 a 350). O gene TR1' fun- dido a nptll (neomicina fosfotransferase Il) apresentou características semelhantes.

Os promotores preferidos para raiz adicionais incluem o promotor do gene VIfENOD-GRP3 (Kuster, et al., (1995) Plant Mol.

Biol.

29(4):759 a 772) e o promotor de rolB (Capana, et a/l., (1994) Plant Mol. Biol. 25(4):6881 a 691. Também consultar as Patentes nºº U.S. 5,837,876; 5,750,386; 5,633,363; 5,459,252; 5,401,836; 5,110,732 e 5,023,179. As sequências regulatórias preferenciais para raiz de Arabi- dopsis thaliana são reveladas no documento nº US20130117883.

[0115] Promotores "preferenciais para sementes" incluem tanto pro- motores "específicos para sementes" (aqueles promotores ativos du- rante o desenvolvimento de sementes tais como promotores de proteí- nas de armazenamento de sementes) assim como promotores de "ger- minação de sementes" (aqueles promotores ativos durante a germina- ção de sementes). Consultar Thompson, et al., (1989) BioEssays 10:108, incorporado no presente documento a título de referência. Tais promotores preferidos para sementes incluem, mas sem limitação, Cim1 (mensagem induzida por citoquinina); cZ19B1 (zeína de 19 kDa de mais), e milps (mio-inositol-1-fosfato sintase) (consultar a Patente nº U.S. 6.225.529 incorporada no presente documento a título de referên- cia). Gama-zeína e GlIb-1 são promotores específicos para endosperma. Para dicotiledôneas, promotores específicos para sementes incluem, mas sem limitação, inibidor de tripsina Kunitz 3 (KTi3) (Jofuku e Gold- berg, (1989) Plant Cell 1:1.079 a 1.093), B-faseolina de feijão, napina, B-conglicinina, glicinina 1, lectina de soja, cruciferina e similares. Para monocotiledôneas, promotores específicos para sementes incluem, mas sem limitação, zeína de 15 kDa de maís, zeína de 22 kDa, zeína de 27 kDa, g-zeína, waxy, shrunken 1, shrunken 2, globulina 1, etc. Con- sultar também, documento nº WO 2000/12733, em que promotores pre- ferenciais para sementes de genes end1 e end2 são revelados; no pre- sente documento incorporados a título de referência. Em dicotiledôneas, os promotores específicos para sementes incluem, mas sem limitação, promotor de revestimento de sementes de Arabidopsis, pPBAN; e os pro- motores de sementes iniciais de Arabidopsis, p26, p63 e p63tr (Patentes nº U.S. 7,294,760 e 7,847,153). Um promotor que tem expressão "pre- ferida" em um tecido particular é expresso nesse tecido em um grau maior do que em pelo menos um outro tecido de planta. Alguns promo- tores preferenciais para tecidos mostram expressão quase exclusiva- mente no tecido particular.

[0116] Quando expressão de nível baixo for desejada, os promoto- res fracos serão usados. Geralmente, o termo "promotor fraco" tal como aqui utilizado se refere a um promotor que dirige a expressão de uma sequência codificante em um nível baixo. Por expressão de nível baixo, níveis entre cerca de 1/1.000 transcritos a cerca de 1/100.000 transcri- tos a cerca de 1/500.000 transcritos são pretendidos. Alternativamente, é reconhecido que o termo "promotores fracos" também abrange os pro- motores que acionam a expressão apenas em algumas células e não em outras para gerar um nível baixo total de expressão. Quando um promotor aciona a expressão em níveis inaceitavelmente altos, porções da sequência promotora podem ser deletadas ou modificadas para di- minuir os níveis de expressão.

[0117] Tais promotores constitutivos fracos incluem, por exemplo, o promotor nuclear do promotor de Rsyn7 (documento nº WO 1999/43838 e Patente nº U.S. 6,072,050), o promotor nuclear do CaMV 358 e se- melhantes. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, aqueles revelados nas Patentes nº U.S. 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142 e 6,177,611, incorporados no presente documento a título de referência.

[0118] A lista acima de promotores não é destinada a ser limitante. Qualquer promotor apropriado pode ser usado nas modalidades.

[0119] Geralmente, o cassete de expressão compreenderá um gene marcador selecionável para a seleção de células transformadas. Genes marcadores selecionáveis são utilizados para a seleção de célu- las ou tecidos transformados. Os genes marcadores incluem os genes que codificam a resistência a antibióticos, como aqueles que codificam a neomicina fosfotransferase Il (NEO) e higromicina fosfotransferase (HPT), assim como genes que conferem resistência aos compostos her- bicidas, como glufosinato de amônio, bromoxinil, imidazolinonas e 2,4- diclorofenoxiacetato (2,4-D). Os exemplos adicionais de genes marca- dores selecionáveis adequados incluem, mas sem limitação, genes co- dificando resistência ao cloranfenicol (Herrera Estrella, et al., (1983) EMBO J. 2:987 a 992); metotrexato (Herrera Estrella, et al/., (1983) Na- ture 303:209 a 213 e Meijer, et a/., (1991) Plant Mol.

Biol. 16:807 a 820); estreptomicina (Jones, et al., (1987) Mol.

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Genet. 210:86 a 91); es- pectinomicina (Bretagne-Sagnard, et a/., (1996) Transgenic Res. 5:131 a 137); bleomicina (Hille, et a/., (1990) Plant Mol.

Biol. 7:171 a 176); sulfonamida (Guerineau, et al., (1990) Plant Mol.

Biol. 15:127 a 136); bromoxinil (Stalker, et al., (1988) Science 242:419 a 423); glifosato (Shaw, et a/l., (1986) Science 233:478 a 481 e Pedidos de Patente nº U.8.10/004,357 e 10/427,692); fosfinotricina (DeBlock, et al., (1987) EMBO J. 6:2.513 a 2.518). Consultar, de modo geral, Yarranton, (1992) Curr.

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[0120] A lista acima de genes marcadores selecionáveis não é des- tinada a ser limitante. Qualquer gene marcador selecionável pode ser utilizado nas modalidades.

[0121] Os peritos na técnica da obtenção de plantas transformadas via métodos de transformação mediada por Agrobacterium entenderão que outras cepas de Agrobacterium para além de Z707S podem ser usadas, e a escolha da cepa pode depender da identidade da espécie de planta hospedeira a ser transformada.

[0122] Os métodos das modalidades envolvem introduzir um poli- peptídeo ou polinucleotídeo em uma planta. "Introduzir" significa, con- forme usado no presente documento, apresentar à planta o polinucleo- tídeo ou polipeptídeo de tal maneira que a sequência ganhe acesso ao interior de uma célula da planta. Os métodos das modalidades não de- pendem de um método particular para introduzir um polinucleotídeo ou polipeptídeo em uma planta, apenas que o polinucleotídeo ou polipeptí- deos ganhem acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta. Os métodos para introduzir polinucleotídeo ou polipeptídeos em plantas incluem, mas sem limitação, métodos de transformação estável, méto- dos de transformação transiente e métodos mediados por vírus.

[0123] "Transformação estável" significa, conforme usado no pre- sente documento, que o construto de nucleotídeos introduzido em uma planta se integra no genoma da planta e tem capacidade para ser her- dado pela descendência da mesma. "Transformação transiente" signi- fica, conforme usado no presente documento, que um polinucleotídeo é introduzido na planta e não se integra no genoma da planta ou um poli- peptídeo é introduzido em uma planta. "Planta" se refere, conforme usado no presente documento, a plantas inteiras, órgãos de plantas (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc.), sementes, células de plantas, pro- págulos, embriões e descendência dos mesmos. As células de planta podem ser diferenciadas ou não diferenciadas (por exemplo, calo, célu- las de cultura em suspensão, protoplastos, células de folha, células de raiz, células de floema e pólen).

[0124] Os protocolos de transformação, assim como protocolos para introduzir sequências de nucleotídeos em plantas, podem variar dependendo do tipo de planta ou célula de planta, isto é, monocotiledô- nea ou dicotiledônea, visada para transformação. Métodos adequados para introduzir sequências de nucleotídeos em células de plantas e in- serção subsequente no genoma de plantas incluem microinjeção (Cros- sway, et al., (1986) Biotechniques 4:320 a 334), eletroporação (Riggs, et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602 5606), transformação mediada por Agrobacterium (Patentes nº* U.S. 5,563,055 e 5,981,840), transferência de genes direta (Paszkowski, et al., (1984) EMBO J. 3:2717 a 2722) e aceleração balística de partículas (consultar, por exemplo, Patentes nºº U.S. 4,945,050; 5,879,918; 5,886,244 e 5,932,782; Tomes, et al., (1995) em Plant Cell, Tissue, and Organ Cul- ture: Fundamental Methods, editores Gamborg e Phillips, (Springer-Ver- lag, Berlim) e McCabe, et a/., (1988) Biotechnology 6:923 a 926) e trans- formação Lecl (documento nº WO 00/28058). Para transformação de batata, consultar Tu, et a/., (1998) Plant Molecular Biology 37:829 a 838 e Chong, et al., (2000) Transgenic Research 9:71 a 78. Procedimentos de transformação adicionais podem ser encontrados em Weissinger, et al., (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421 a 477; Sanford, et al., (1987) Parti- culate Science and Technology 5:27 a 37 (cebola); Christou, et al., (1988) Plant Physiol. 87:671 a 674 (soja); McCabe, et al., (1988) Bio/Technology 6:923 a 926 (soja); Finer e McMullen, (1991) /n Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175 a 182 (soja); Singh, et a/., (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); Datta, et al., (1990) Biotechnology 8:736 a 740 (arroz); Klein, et a/., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4.305 a

4.309 (mais); Klein, et a/., (1988) Biotechnology 6:559 a 563 (maís); Pa- tentes nº* U.S. 5,240,855; 5,322,783 e 5,324,646; Klein, et al., (1988) Plant Physiol. 91:440 a 444 (maís); Fromm, et a/., (1990) Biotechnology 8:833 a 839 (maís); Hooykaas-Van Slogteren, et a/l., (1984) Nature (Lon- dres) 311:763 a 764; Patente nº U.S. 5,736,369 (cereais); Bytebier, et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5.345 a 5.349 (Liliaceae); De Wet, et al., (1985) em The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, editores Chapman, et al., (Longman, Nova lorque), páginas 197 a 209 (pólen); Kaeppler, et al., (1990) Plant Cell Reports 9:415 a 418 e Kaeppler, et a/., (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560 a 566 (transformação mediada por fibras); D'Halluin, et a/., (1992) Plant Cell 4:1.495 a 1.505 (eletroporação); Li, et al/., (1993) Plant Cell Reports 12:250 a 255 e Christou e Ford, (1995) Annals of Botany 75:407 a 413 (arroz); Osjoda, et al., (1996) Nature Biotechnology 14:745 a 750 (maís por meio de Agrobacterium tumefaciens); todos os quais são incorporados no pre- sente documento a título de referência.

[0125] Em modalidades específicas, as sequências das modalida- des podem ser fornecidas a uma planta com o uso de uma variedade de métodos de transformação transiente. Tais métodos de transforma- ção transiente incluem, mas sem limitação, a introdução do polipeptídeo IRDIG35563 ou variantes e fragmentos do mesmo diretamente na planta ou a introdução do transcrito do polipeptídeo IRDIG35563 na planta. Tais métodos incluem, por exemplo, microinjeção ou bombarde- amento de partículas. Consultar, por exemplo, Crossway, et al., (1986) Mol Gen. Genet. 202:179 a 185; Nomura, et al., (1986) Plant Sci. 44:53 a 58; Hepler, et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91:2176 a 2180 e Hush, et al., (1994) The Journal of Cell Science 107:775 a 784, todos os quais são incorporados no presente documento a título de referência. Alterna- tivamente, o polinucleotídeo IRDIG35563 pode ser transientemente transformado na planta usando técnicas em sistemas de vetores virais e a precipitação do polinucleotídeo de um modo que exclui liberação subsequente do DNA. Assim, pode ocorrer a transcrição a partir do DNA ligado a partículas, mas a frequência com que é liberado para se integrar no genoma é grandemente reduzida. Tais métodos incluem o uso de partículas revestidas com polietilimina (PEI; Sigma %&P3143).

[0126] Métodos para a inserção dirigida de um polinucleotídeo em uma localização específica no genoma da planta incluem a inserção do polinucleotídeo em uma localização genômica desejada, esta sendo al- cançada usando um sistema de recombinação específico para sítios. Consultar, por exemplo, os documentos nº WO 1999/25821, nº WO 1999/25854, nº WO 1999/25840, nº WO 1999/25855 e nº WO 1999/ 25853, todos os quais são incorporados no presente documento a título de referência. Brevemente, o polinucleotídeo das modalidades pode ser contido em um cassete de transferência flanqueado por dois sítios de recombinação não idênticos. O cassete de transferência é introduzido em uma planta que incorporou de modo estável em seu genoma um sítio-alvo que é flanqueado por dois sítios de recombinação não idênti- cos que correspondem aos sítios do cassete de transferência. Uma re- combinase apropriada é fornecida e o cassete de transferência é inte- grado no sítio-alvo. O polinucleotídeo de interesse é deste modo inte- grado em uma posição cromossômica específica no genoma da planta.

[0127] Vetores de transformação de plantas podem ser compreen- didos por um ou mais vetores de DNA necessários para alcançar a transformação das plantas, incluindo vetores de transformação de plan- tas que são compreendidos por mais do que um segmento de DNA con- tíguo.

Esses vetores são frequentemente chamados de "vetores biná- rios". Vetores binários, assim como vetores com plasmídeos auxiliado- res, são muito frequentemente usados para transformação mediada por Agrobacterium, em que o tamanho e a complexidade dos segmentos de DNA necessários para alcançar transformação eficiente são bem gran- des, e é vantajoso separar funções em moléculas de DNA separadas.

Vetores binários contêm tipicamente um vetor plasmídico que contém as sequências de atuação cis exigidas para a transferência de T-DNA (como borda esquerda e borda direita), um marcador selecionável que é modificado para ter capacidade para expressão em uma célula de planta e um "gene de interesse" (um gene modificado para ter capaci- dade para expressão em uma célula de planta para a qual a geração de plantas transgênicas é desejada). Também estão presentes nesse vetor plasmídico as sequências exigidas para replicação bacteriana.

As se- quências de atuação cis são dispostas de maneira a permitir a transfe- rência eficaz para células de plantas e expressão nas mesmas.

Por exemplo, o gene marcador selecionável e o gene pesticida são localiza- dos entre as bordas esquerda e direita.

Frequentemente, um segundo vetor plasmídico contém os fatores de atuação trans que medeiam a transferência de T-DNA de Agrobacterium para células de plantas.

Este plasmídeo contém frequentemente as funções de virulência (genes Vir) que permitem a infecção de células de plantas por Agrobacterium, e a transferência de DNA por clivagem em sequências de borda e a trans- ferência de DNA mediada por Vir (Hellens e Mullineaux, (2000) Trends in Plant Science 5:446 a 451). Diversos tipos de cepas de Agrobacte- rium (por exemplo, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA1OS, etc.) podem ser usados para transformação de plantas. O segundo vetor plasmídico não é necessário para transformar as plantas por outros métodos, como microprojeção, microinjeção, eletroporação, polietilenoglicol, etc.

[0128] Em geral, os métodos de transformação de plantas envolvem transferir DNA heterólogo para células de plantas-alvo (por exemplo, embriões imaturos ou maduros, culturas em suspensão, calo não dife- renciado, protoplastos, etc.), seguido da aplicação de um nível de limiar máximo de seleção apropriada (dependendo do gene marcador seleci- onável) para recuperar as células de plantas transformadas a partir de um grupo de massa de células não transformadas. Após a integração de DNA estranho heterólogo em células de plantas, é aplicado um nível de limiar máximo de seleção apropriada no meio para matar as células não transformadas e separar e proliferar as células transformadas de modo putativo que sobrevivem a esse tratamento de seleção transfe- rindo as mesmas de modo regular para um meio fresco. Por passagem contínua e o desafio com seleção apropriada, podem ser identificadas e proliferadas as células que são transformadas com o vetor plasmídico. Os métodos moleculares e bioquímicos podem, então, ser usados para confirmar a presença do gene heterólogo integrado de interesse no ge- noma da planta transgênica.

[0129] Explantes são tipicamente transferidos para um suprimento fresco do mesmo meio e cultivados de modo rotineiro. Subsequente- mente, as células transformadas são diferenciadas em brotos após co- locação em meio de regeneração suplementado com um nível de limiar máximo de agente de seleção. Os brotos são, então, transferidos para um meio de enraizamento seletivo para recuperar o broto ou plântula enraizado. A plântula transgênica cresce, então, para uma planta ma- dura e produz sementes férteis (por exemplo, Hiei, et al., (1994) The Plant Journal 6:271 a 282; Ishida, et al., (1996) Nature Biotechnology

14:745 a 750). Explantes são tipicamente transferidos para um supri- mento fresco do mesmo meio e cultivados de modo rotineiro. Uma des- crição geral das técnicas e métodos para gerar plantas transgênicas é encontrada em Ayres e Park, (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219 a 239 e Bommineni e Jauhar, (1997) Maydica 42:107 a 120. Visto que o material transformado contém muitas células, tanto células transformadas quanto não transformadas estão presentes em qualquer parte de calo ou tecido ou grupo de células-alvo em questão. A capaci- dade de matar células não transformadas e permitir que células trans- formadas proliferem resulta em culturas de plantas transformadas. Fre- quentemente, a capacidade para remover células não transformadas é uma limitação à recuperação rápida de células de plantas transforma- das e geração bem-sucedida de plantas transgênicas.

[0130] As células que foram transformadas podem se desenvolver em plantas, de acordo com maneiras convencionais. Consultar, por exemplo, McCormick, et a/l., (1986) Plant Cell Reports 5:81 a 84. Essas plantas podem, então, ser cultivadas e ser polinizadas com a mesma cepa transformada ou com cepas diferentes, e o híbrido resultante que tem expressão constitutiva ou induzível da característica fenotípica de- sejada pode ser identificado. Duas ou mais gerações podem ser cultiva- das para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada é mantida de modo estável e herdada e, então, as sementes são reco- lhidas para garantir que a expressão da característica fenotípica dese- jada foi alcançada.

[0131] As sequências de nucleotídeos das modalidades podem ser fornecidas à planta colocando-se a planta em contato com um vírus ou ácidos nucleicos virais. Geralmente, tais métodos envolvem incorporar o construto de nucleotídeos de interesse dentro de uma molécula de RNA ou DNA viral. Reconhece-se que as modalidades reveladas in- cluem polipeptídeos IRDIG35563 que são inicialmente sintetizados como parte de uma poliproteína viral, que posteriormente pode ser pro- cessada por meio de proteólise in vivo ou in vitro para produzir o produto final de polipeptídeo IRDIG35563 desejado. Se reconhece também que tal poliproteína viral, que compreende pelo menos uma porção da se- quência de aminoácidos de um IRDIG35563 das modalidades, pode ter a atividade pesticida desejada. Tais poliproteínas virais e as sequências de nucleotídeos que codificam as mesmas são englobadas pelas mo- dalidades. Os métodos para dotar plantas de construtos de nucleotídeos e produzir as proteínas codificadas nas plantas, que envolvem molécu- las de RNA ou DNA viral, são conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Patentes nº U.S. 5,889,191; 5,889,190; 5,866,785; 5,589,367 e 5,316,931; incorporadas no presente documento a título de referência.

[0132] Métodos para a transformação de cloroplastos podem ser encontrados, por exemplo, em Svab, et a/., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab e Maliga, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab e Maliga, (1993) EMBO J. 12:601-606. O método se baseia na entrega com canhão de partículas de DNA que contém um marcador selecionável e direcionamento do DNA para o genoma plastí- dico através de recombinação homóloga. Adicionalmente, a transforma- ção de plastídeos pode ser realizada pela transativação de um trans- gene originado por plastídeo silencioso por expressão preferida para te- cidos de uma RNA polimerase codificada de modo nuclear e direcionada para plastídeo. Tal sistema foi relatado em McBride, et a/., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301 a 7305.

[0133] As modalidades se referem adicionalmente a um material de propagação de plantas de uma planta transformada das modalidades que inclui, mas sem limitação, sementes, tubérculos, cormos, bulbos, folhas e cortes de raízes e brotos.

[0134] As modalidades podem ser usadas para transformação de quaisquer espécies de planta, incluindo, mas sem limitação, monocoti- ledôneas e dicotiledôneas. Exemplos de plantas de interesse incluem, mas sem limitação, milho (Zea mays), Brassica sp. (por exemplo, B. na- pus, B. rapa, B. juncea), particularmente aquelas espécies de Brassica úteis como fontes de óleo de semente, alfafa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeio (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), milhete (por exemplo, milhete-pérola (Pennisetum glaucum), milho miúdo (Panicum miliaceum), milho painço (Setaria italica), capim- pé-de-galinha-gigante (Eleusine coracana)), girassol (Helianthus an- nuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), batata (Solanum tubero- sum), amendoins (Arachis hypogaea), algodão (Gossypium barba- dense, Gossypium hirsutum), batata doce (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucifera), abacaxi (Ananas comosus), árvores de citrinos (Citrus spp.), cacau (Theobroma cacao), chá (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), abacate (Persea americana), figueira (Ficus casica), goiaba (Psidium guajava), manga (Mangifera indica), oliveira (Olea europaea), papaia (Carica papaya), caju (Anacardium occidentale), macadâmia (Macadamia integrifolia), amêndoa (Prunus amygdalus), beterraba sacarina (Beta vulgaris), cana- de-açúcar (Saccharum Spp.), aveia, cevada, legumes, plantas ornamen- tais e coníferas.

[0135] Legumes incluem tomates (Lycopersicon esculentum), al- face (por exemplo, Lactuca sativa), feijões verdes (Phaseolus vulgaris), feijões-de-lima (Phaseolus limensis), ervilhas (Lathyrus spp.) e mem- bros do gênero Cucumis, como pepino (C. sativus), cantalupo (C. can- talupensis) e melão (C. melo). Plantas ornamentais incluem azaleia (Rhododendron spp.), hidrângea (Macrophylla hydrangea), hibisco (Hi- biscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipas (Tulipa Spp.), narcisos (Narcissus spp.), petúnias (Petunia hybrida), craveiro (Dianthus caryophyllus), poinsétia (Euphorbia pulcherrima) e crisântemo. Conífe- ras que podem ser empregues na prática das modalidades incluem, por exemplo, pinheiros, como pinheiro (Pinus taeda), pinheiro-americano (Pinus elliotii), pinheiro ponderosa (Pinus ponderosa), pinheiro de Lod- gepole (Pinus contorta) e pinheiro de Monterey (Pinus radiata); pinheiro do Oregon (Pseudotsuga menziesii); cicuta ocidental (Tsuga canaden- sis); abeto Sitka (Picea glauca); sequoia (Sequoia sempervirens); abe- tos verdadeiros, como abeto (Abies amabilis) e abeto balsâmico (Abies balsamea); e cedros, como cedro vermelho ocidental (Thuja plicata) e cedro amarelo do Alasca (Chamaecyparis nootkatensis). As plantas das modalidades incluem plantas de cultura (por exemplo, milho, alfafa, gi- rassol, Brassica, soja, algodão, cártamo, amendoim, sorgo, trigo, mi- lhete, tabaco, etc.), tais como plantas de milho e soja.

[0136] Gramados incluem, mas sem limitação: poa-anual (Poa an- nua); azevém anual (Lolium multiflorum); poa canadiana (Poa com- pressa); festuca-encarnada (Festuca rubra); Agrostide-ténue (Agrostis tenuis); erva-fina (Agrostis palustris); grama de trigo do deserto ("cres- ted wheatgrass") (Agropyron desertorum); capim-mombaça (Agropyron cristatum); festuca rígida (Festuca longifolia); erva-de-febra (Poa praten- sis); panasco (Dactylis glomerata); azevém perene (Lolium perenne); festuca-encarnada (Festuca rubra); germínia rubra (Agrostis alba); poa- comum (Poa trivialis); festuca ovina (Festuca ovina); bromo (Bromus inermis); festuca alta (Festuca arundinacea); rabo-de-gato (Phleum pra- tense); Agrostis-de-cão ("velvet bentgrass") (Agrostis canina); "weeping alkaligrass" (Puccinellia distans); erva-trigo ocidental (Agropyron SMmithii); grama Bermuda (Cynodon spp.); grama Santo Agostinho (Ste- notaphrum secundatum); Grama Zoysia (Zoysia Spp.); grama-Bahia (Paspalum notatum); grama tapete (Axonopus affinis); grama centípede (Eremochloa ophiuroides); grama Kikuio (Pennisetum clandesinum); ca-

pim-arame-da-praia (Paspalum vaginatum); grama azul (Bouteloua gra- cilis); grama americana (Buchloe dactyloids); grama tipo aveia lateral (Bouteloua curtipendula).

[0137] As plantas de interesse incluem plantas de grãos que forne- cem sementes de interesse, plantas de sementes oleaginosas e legu- minosas. Sementes de interesse incluem sementes de grão, tais como milho, trigo, cevada, arroz, sorgo, centeio, milheto, etc. Plantas com se- mentes oleaginosas incluem algodão, soja, açafrão-bastardo, girassol, Brassica, mais, alfafa, palma, coco, linho, rícino, azeitona, etc. Plantas leguminosas incluem feijões e ervilhas. Os feijões incluem guar, feijão de alfarroba, feno-grego, soja, feijão de jardim, caupi, feijão mungo, fei- jão-de-lima, feijão-fava, lentilhas, grão-de-bico, etc.

[0138] Avaliação da Transformação de Plantas. Após a introdução de DNA estranho heterólogo em células de plantas, a transformação ou integração do gene heterólogo no genoma da planta é confirmada por vários métodos, tais como análise de ácidos nucleicos, proteínas e me- tabólitos associados ao gene integrado.

[0139] A análise de PCR é um método rápido para triar células, te- cido ou brotos transformados quanto à presença de gene incorporado no estágio inicial antes da transplantação para o solo (Sambrook e Rus- sell, (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual". Cold Spring Har- bor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). É executada PCR com o uso de iniciadores de oligonucleotídeos específicos para o gene de interesse ou fundo de vetor de Agrobacterium, etc.

[0140] A transformação da planta pode ser confirmada por análise de transferência Southern de DNA genômico (Sambrook e Russell, (2001) supra). Em geral, DNA total é extraído do transformante, digerido com enzimas de restrição apropriadas, fracionado em um gel de aga- rose e transferido para uma membrana de nitrocelulose ou náilon. À membrana ou "coloração" é então sondada com, por exemplo, um frag- mento de DNA-alvo radioetiquetado com 32P para confirmar a integra- ção do gene introduzido no genoma de planta, de acordo com técnicas padrão (Sambrook e Russell, (2001) supra).

[0141] Na análise de transferência Northern, RNA é isolado de teci- dos específicos do transformante, fracionado em um gel de agarose e formaldeído e transferido para um filtro de náilon de acordo com proce- dimentos padrão que podem ser encontrados em Sambrook e Russell, (2001) supra. A expressão de RNA codificado pelo gene pesticida é, então, testada hibridando o filtro com uma sonda radioativa derivada de um gene pesticida por métodos conhecidos na técnica (Sambrook e Russell, (2001) supra).

[0142] Transferência Western, ensaios bioquímicos e semelhantes podem ser realizados nas plantas transgênicas para confirmar a pre- sença de proteína codificada pelo gene pesticida por meio de procedi- mentos padrão (Sambrook e Russell, 2001, supra) com o uso de anti- corpos que se ligam a um ou mais epítopos presentes no polipeptídeo IRDIG35563.

[0143] Bioensaios com Insetos de Arabidopsis transgênica. Linha- gens de Arabidopsis transgênicas expressando proteínas IRDIG35563 modificadas podem ser usadas para demonstrar atividade contra espé- cies de insetos sensíveis em ensaios de sobreposição de dieta artificial. Proteína extraída de linhagens transgênicas e não transgênicas de Ara- bidopsis pode ser quantificada por métodos apropriados e volumes de amostras ajustados para normalizar a concentração de proteína. Bioen- saios são então conduzidos em dieta artificial como descrito abaixo. Ara- bidopsis não transgênica e/ou tampão e água devem ser incluídos em ensaios como tratamentos de verificação do fundo.

[0144] Bioensaio de mais transgênico. A bioatividade das toxinas IRDIG35563 e variantes produzidas em células de plantas também pode ser demonstrada por métodos de bioensaios convencionais (ver, por exemplo Huang et a/., 2006). A eficácia pode ser testada por alimenta- ção com vários tecidos ou pedaços de tecidos de plantas derivados de uma planta produtora de uma toxina IRDIG35563 de insetos-alvo em um ambiente de alimentação controlado. Alternativamente, extratos de proteína podem ser preparados a partir de vários tecidos de plantas de- rivados de uma planta produtora da toxina IRDIG35563 e incorporam as proteínas extraídas em um bioensaio de dieta artificial. Deve ser enten- dido que os resultados de tais ensaios de alimentação devem ser com- parados com bioensaios conduzidos similarmente que empregam teci- dos de controle apropriados de plantas hospedeiras que não produzem a proteína IRDIG35563 ou variantes, ou com outras amostras de con- trole.

[0145] Métodos para Introduzir Tecnologias de Edição de Genoma em Plantas Em algumas modalidades, as composições de polinucleotí- deo IRDIG35563 reveladas podem ser introduzidas no genoma de uma planta com o uso de tecnologias de edição de genoma, ou polinucleotí- deos IRDIG35563 anteriormente introduzidos no genoma de uma planta podem ser editados com o uso de tecnologias de edição de genoma. Por exemplo, os polinucleotídeos revelados podem ser introduzidos em uma localização desejada no genoma de uma planta através do uso de tecnologias de quebra de fita dupla, tais como TALENs, meganucleases, nucleases dedos de zinco, CRISPR-Cas e similares. Por exemplo, os polinucleotídeos revelados podem ser introduzidos em uma localização desejada em um genoma com o uso de um sistema CRISPR-Cas, para o propósito de inserção específica para sítios. A localização desejada em um genoma de planta pode ser qualquer local-alvo desejado para inserção, tal como uma região genômica favorável para melhoramento, ou pode ser um local-alvo localizado em uma janela genômica com um traço de interesse existente. Os traços de interesse existentes podem ser um traço endógeno ou um traço anteriormente introduzido.

[0146] Em algumas modalidades, quando o polinucleotídeo IR- DIG35563 revelado foi anteriormente introduzido em um genoma, as tecnologias de edição de genoma podem ser usadas para alterar ou modificar a sequência de polinucleotídeo introduzida. As modificações específicas de sítio que podem ser introduzidas nas composições de polinucleotídeo IRDIG35563 reveladas incluem aquelas produzidas com o uso de qualquer método para introduzir a modificação sítio específica, incluindo, mas sem limitação, através do uso de oligonucleotídeos de reparo de gene (por exemplo, Publicação dos E.U.A. 2013/0019349), ou através do uso de tecnologias de quebra de fita dupla, como TALENs, meganucleases, nucleases de dedo de zinco, CRISPR-Cas, e seme- lhantes. Tais tecnologias podem ser usadas para modificar o polinucle- otídeo anteriormente introduzido através de inserção, deleção ou subs- tituição de nucleotídeos dentro do polinucleotídeo introduzido. Alternati- vamente, tecnologias de quebra de fita dupla podem ser usadas para adicionar sequências de nucleotídeos adicionais ao polinucleotídeo in- troduzido. As sequências adicionais que podem ser adicionadas in- cluem elementos de expressão adicionais, tais como sequências inten- sificadoras e promotoras. Em outra modalidade, as tecnologias de edi- ção de genoma podem ser usadas para posicionar proteínas ativas como inseticida adicionais em proximidade com as composições de po- linucleotídeo IRDIG35563 reveladas no presente documento dentro do genoma de uma planta, a fim de gerar empilhamentos moleculares de proteínas ativas como inseticida.

[0147] Um “local-alvo alterado”, “sequência-alvo alterada”, "local- alvo modificado" e "sequência-alvo modificada" são usados de forma intercambiável no presente documento e se referem a uma sequência- alvo conforme revelada no presente documento que compreende pelo menos uma alteração em comparação com a sequência-alvo não alte- rada. Tais “alterações” incluem, por exemplo: (i) substituição de pelo menos um nucleotídeo, (ii) uma deleção de pelo menos um nucleotídeo, (iii) uma inserção de pelo menos um nucleotídeo, ou (iv) qualquer com- binação de (i) a (iii).

[0148] Empilhamento de Traços em Plantas Transgênicas. As plan- tas transgênicas podem compreender um empilhamento de um ou mais polinucleotídeos inseticidas revelados no presente documento com um ou mais polinucleotídeos adicionais que resultam na produção ou su- pressão de múltiplas sequências de polipeptídeos. As plantas transgê- nicas que compreendem empilhamentos de sequências de polinucleotí- deos podem ser obtidas por qualquer um ou ambos os métodos de re- produção tradicionais ou através de métodos de manipulação genética. Estes métodos incluem, mas sem limitação, cultivar linhas individuais, sendo que cada uma compreende um polinucleotídeo de interesse, transformar uma planta transgênica que compreende um gene revelado no presente documento com um gene subsequente e cotransformar ge- nes em uma célula de planta única. Conforme usado no presente docu- mento, o termo "empilhado" inclui ter os múltiplos traços presentes na mesma planta (isto é, ambos os traços são incorporados no genoma nuclear, um traço é incorporado no genoma nuclear e um traço é incor- porado no genoma de um plastídeo ou ambos os traços são incorpora- dos no genoma de um plastídeo). Em um exemplo não limitante, "traços empilhados" compreendem um empilhamento molecular em que as se- quências são fisicamente adjacentes entre si. Um traço, conforme usado no presente documento, se refere ao fenótipo derivado de uma sequên- cia particular ou grupos de sequências. A cotransformação de genes pode ser executada com o uso de vetores de transformação únicos que compreendem múltiplos genes ou genes portados separadamente em múltiplos vetores. Se as sequências forem empilhadas transformando geneticamente as plantas, as sequências de polinucleotídeos de inte- resse podem ser combinadas em qualquer momento e em qualquer or- dem. Os traços podem ser introduzidos simultaneamente em um proto- colo de cotransformação com os polinucleotídeos de interesse forneci- dos por qualquer combinação de cassetes de transformação. Por exem- plo, se duas sequências forem introduzidas, as duas sequências podem estar contidas em cassetes de transformação separados (trans) ou con- tidas no mesmo cassete de transformação (cis). A expressão das se- quências pode ser acionada pelo mesmo promotor ou por promotores diferentes. Em certos casos pode ser desejável introduzir um cassete de transformação que irá suprimir a expressão do polinucleotídeo de interesse. Isso pode ser combinado com qualquer combinação de ou- tros cassetes de supressão ou cassetes de sobre-expressão para gerar a combinação desejada de traços na planta. É adicionalmente reconhe- cido que as sequências de polinucleotídeos podem ser empilhadas em uma localização genômica desejada com o uso de um sistema de re- combinação específica para sítios. Consultar, por exemplo, os docu- mentos nº WO 1999/25821, nº WO 1999/25854, nº WO 1999/25840, nº WO 1999/25855 e nº WO 1999/25853, todos os quais são incorporados no presente documento a título de referência.

[0149] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo IRDIG35563 revelados no presente documento, sozinhos ou empilhados com um ou mais traços de resistência a inseto adicionais podem ser empilhados com um ou mais traços de entrada adicionais (por exemplo, resistência a herbicida, resistência fúngica, resistência a vírus, tolerância à tensão, resistência a doenças, esterilidade do macho, força da haste e semelhantes) ou traços de saída (por exemplo, rendi- mento aumentado, amidos modificados, perfil de óleo aprimorado, ami- noácidos equilibrados, lisina ou metionina alta, digestibilidade aumen- tada, qualidade de fibra aprimorada, resistência à seca e semelhantes).

Portanto, as modalidades de polinucleotídeo podem ser usadas para fornecer um pacote agronômico completo de qualidade de cultura apri- morada com a capacidade de controlar de modo flexível e rentável quaisquer pragas agronômicas.

[0150] Os transgenes úteis para empilhamento incluem, mas sem limitação:

1. Transgenes que Conferem Resistência a Insetos ou Do- ença e que Codificam:

[0151] (A) Genes de resistência a doença de plantas. As defesas de plantas são frequentemente ativadas por interação específica entre o produto de um gene de resistência a doenças (R) na planta e o produto de um gene de avirulência (Avr) correspondente no patógeno. Uma variedade de planta pode ser transformada com gene de resistência clonado para modificar plantas que são resistentes a cepas de patógenos específicos. Consultar, por exemplo, Jones, et al., (1994) Science 266:789 (clona- gem do gene Cf-9 de tomate para resistência a Cladosporium fulvum); Martin, et al., (1993) Science 262:1432 (gene Pto de tomate para resis- tência a Pseudomonas syringae pv. tomate que codifica uma proteína cinase); Mindrinos, et a/., (1994) Cell 78:1089 (gene RSP2 de Arabi- dopsis para resistência a Pseudomonas syringae), McDowell e Woffen- den, (2003) Trends Biotechnol. 21(4):178 a 183 e Toyoda, et a/l., (2002) Transgenic Res. 11(6):567 a 582. Uma planta resistente a uma doença é uma que é mais resistente a um patógeno em comparação com a planta de tipo selvagem.

[0152] (B) Genes codificadores de uma proteína de Bacillus thurin- giensis, um derivado da mesma ou um polipeptídeo sintético modelado na mesma. Ver, por exemplo, Geiser, et a/., (1986) Gene 48:109, que revelam a clonagem e sequência de nucleotídeos de um gene de delta- endotoxina Bt. Além disso, moléculas de DNA que codificam genes de delta-endotoxinas podem ser compradas à American Type Culture

Collection (Rockville, Md.), por exemplo, com Números de Acesso ATCCº 40098, 67136, 31995 e 31998. Outros exemplos não limitadores de transgenes de Bacillus thuringiensis geneticamente modificados são dados nas patentes e nos pedidos de patente a seguir e são incorpora- dos no presente documento a título de referência para este propósito: Patentes nºº* U.S. 5,188,960; 5,689,052; 5,880,275; 5,986,177; 6,023,013, 6,060,594, 6,063,597, 6,077,824, 6,620,988, 6,642,030, 6,713,259, 6,893,826, 7,105,332; 7,179,965, 7,208,474; 7,227,056, 7,288,643, 7,323,556, 7,329,736, 7,449,552, 7,468,278, 7,510,878, 7,521,235, 7,544,862, 7,605,304, 7,696,412, 7,629,504, 7,705,216, 7,772,465, 7,790,846, 7,858,849 e documento nº WO 1991/14778; do- cumento nº WO 1999/31248; documento nº WO 2001/12731; docu- mento nº WO 1999/24581 e documento nº WO 1997/40162.

[0153] Os genes que codificam proteínas pesticidas também podem ser empilhados, incluindo, mas sem limitação: proteínas inseticidas de Pseudomonas sp. como PSEEN3174 (Monalysin; (2011) PLoS Patho- gens 7:1 a 13); de cepa de Pseudomonas protegens CHAO e Pf-5 (an- teriormente fluorescens) (Pechy-Tarr, (2008) Environmental Microbio- logy 10:2.368 a 2.386; número de Acesso ao GenBank EU400157); de Pseudomonas taiwanensis (Liu, et al., (2010) J. Agric. Food Chem., 58:12343-12349) e de Pseudomonas pseudoalcaligenes (Zhang, et al., (2009) Annals of Microbiology 59:45-50 e Li, et al., (2007) Plant Cell Tiss. Organ Cult. 89:159 a 168); proteínas inseticidas de Photorhabdus sp. e Xenorhabdus sp. (Hinchliffe, et al., (2010) The Open Toxicology Journal 3:101 a 118 e Morgan, et al., (2001) Applied and Envir. Micro. 67:2.062 a 2.069); Patente no. US 6,048,838, e Patente no. US 6,379,946; um polipeptídeo PIP-1 do documento no. US 9,688,730; um polipeptídeo AfIP-1A e/ou AfIP-1B do documento no. US9,475,847; um polipeptídeo PIP-47 da Publicação no. US20160186204; um polipeptí-

deo IPDO45, um polipeptídeo IPDO64, um polipeptídeo IPDO74, um po- lipeptídeo IPDO75 e um polipeptídeo IPDO77 da Publicação PCT no WO 2016/114973; um polipeptídeo IPDO8O do documento PCT de número de série POT/US17/56517; um polipeptídeo IPDO78, um polipeptídeo IPDO84, um polipeptídeo IPDO85, um polipeptídeo IPDO86, um polipep- tídeo IPDO87, um polipeptídeo IPDO88 e um polipeptídeo IPDO89 do do- cumento de número de série POCT/US17/54160; polipeptídeo PIP-72 da Publicação de Patente no US20160366891; um polipeptídeo PtIP-50 e um polipeptídeo PtIP-65 da Publicação no.

US20170166921; um polipeptídeo IPDO98, um polipeptídeo IPDOS9, um polipeptídeo IPD108, um polipeptí- deo IPD109 do documento de número de série US 62/521084; um poli- peptídeo PtIP-83 da Publicação no US20160347799; um polipeptídeo PtIP-96 da Publicação no US20170233440; um polipeptídeo IPDO79 da Publicação PCT no.

WO2017/23486; um polipeptídeo IPDO82 da Publica- ção PCT no WO 2017/105987, um polipeptídeo IPDO90 do documento de número de série POCT/US17/30602, um polipeptídeo IPDO93 do docu- mento de número de série US 62/434020; um polipeptídeo IPD103 do documento de número de série PCT/US17/39376; um polipeptídeo IPD101 do documento de número de série US 62/438179; um polipep- tídeo IPD121 do documento de número de série US 62/508.514; e 5- endotoxinas, incluindo, porém sem limitação, classes de polipeptídeos de d-endotoxina Cry1, Cry2, Cry3, Cry4, Cry5, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry10, Cry11, Cry12, Cry13, Cry14, Cry15, Cry16, Cry17, Cry18, Cry19, Cry20, Cry21, Cry22, Cry23, Cry24, Cry25, Cry26, Cry27, Cry28, Cry29, Cry30, Cry31, Cry32, Cry33, Cry34, Cry35,Cry36, Cry37, Cry38, Cry39, Cry40, Cry41, Cry42, Cry43, Cry44, Cry45, Cry46, Cry47, Cry49, Cry50, Cry51, Cry52, Cry53, Cry54, Cry55, Cry56, Cry57, Cry58, Cry59, Cry60, Cry61, Cry62, Cry63, Cry64, Cry65, Cry66, Cry67, Cry68, Cry69, Cry70, Cry71, e Cry 72 e os genes cyt1 e cyt2 citolíticos de B. thuringiensis.

Mem- bros dessas classes de proteínas inseticidas de B. thuringiensis podem ser encontrados em Crickmore, et a/., "Bacillus thuringiensis toxin nomencla- ture" (2011), em lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil Crickmore/Bt/ que pode ser acessado na rede mundial de computadores com o uso do prefixo "www").

[0154] Os exemplos de ó-endotoxinas também incluem, porém sem limitação, proteínas Cry1A das Patentes nº U.S. 5,880,275, 7,858,849, e 8,878,007; um mutante Cry1Ac do documento nº US9,512,187; uma toxina DIG-3 ou DIG-11 (deleção N-terminal de variantes de hélice a 1 e/ou hélice a 2 das proteínas cry, tais como Cry1A, Cry3A) das Patentes nº U.S. 8,304,604, 8,304,605 e 8.476.226; Cry1B do Pedido de Patente número de série U.S. 10/525,318, Publicação de Pedido de Patente nº US20160194364 e Patentes nº U.S. 9,404,121 e 8,772,577; variantes Cry1B da Publicação PCT nº WOZ2016/61197 e número de série PCT/US17/27160; Cry1C da Patente nº U.S. 6,033,874; proteína Cry1D de US20170233759; uma proteína Cry1E de PCT Número de Série PCT/US17/53178; uma proteína Cry1F das Patentes nº U.S. 5,188,960 e 6,218,188; quimeras Cry1A/F das Patentes nº U.S. 7,070,982; 6,962,705 e 6,713,063; uma proteína Cry11 de PCT Número de Publica- ção WO 2017/0233759; uma variante Cry1J da Publicação US US2017 0240603; uma proteína Cry2, tal como a proteína Cry2Ab, da Patente nº U.S. 7,064,249 e proteína Cry2A.127 de US 7208474; uma proteína Cry3A incluindo, porém sem limitação, uma proteína inseticida híbrida geneticamente modificada (eHIP) criada fundindo-se combinações ex- clusivas de regiões variáveis e blocos conservados de pelo menos duas proteínas Cry diferentes (Publicação de Pedido de Patente nº U.S. 2010/0017914); uma proteína Cry4; uma proteína Cry5; uma proteína Cry6; proteínas Cry8 das Patentes nº U.S. 7,329,736, 7,449,552, 7,803,943, 7,476,781, 7,105,332, 7,339,092, 7,378,499, 7,462,760 e 9,593,345; uma proteína Cry9, tal como os membros das famílias Cry9A, Cry9B, Cry9C, Cry9D, Cry9E e Cry9F incluindo a proteína Cry9 das Patentes nº U.S. 9,000,261 e 8,802,933 e número de série U.S.

WO 2017/132188; uma proteína Cry 15 de Naimov, et a/l., (2008) Applied and Environmental Microbiology, 74:7.145 a 7.151; uma proteína Cry14 da Patente nº US8,933,299; uma Cry22, uma proteína Cry34Ab1 das Pa- tentes nº U.S. 6,127,180, 6,624,145 e 6,340,593; uma proteína Cry34 truncada da Patente nº US8,816,157; uma proteína CryET33 e cryET34 das Patentes nº U.S. 6,248,535, 6,326,351, 6,399,330, 6,949,626, 7,385,107 e 7,504,229; homólogos CryET33 e CryET34 da Publicação de Patente nº U.S. 2006/0191034, 2012/0278954 e Publicação PCT nº WO 2012/139004; uma proteína Cry35Ab1 das Patentes nº U.S. 6,083,499, 6,548,291 e 6,340,593; uma proteína Cry46 da Patente nº U.S. 9.403.881, uma proteína Cry 51, uma toxina binária de Cry; TIC901 ou toxina relacionada; TIC807 da Publicação de Pedido de Patente nº U.S. 2008/0295207; TIC853 da Patente nº US8,513,493; ET29, ET37, TIC809, TIC810, TIC812, TIC127, TIC128 do documento PCT US 2006/033867; proteínas tóxicas de Hemiptera geneticamente modifica- das da Publicação de Pedido de Patente nº U.S.

US20160150795, AXMI-027, AXMI-036 e AXMI-038 da Patente nº U.S. 8,236,757; AXMI- 031, AXMI-039, AXMI-040, AXMI-049 da Patente nº U.S. 7,923,602; AXMI-018, AXMI-020 e AXMI-021 do documento nº WO 2006/083891; AXMI-010 do documento nº WO 2005/038032; AXMI-003 do documento nº WO 2005/021585; AXMI-008 da Publicação de Pedido de Patente nº U.S. 2004/0250311; AXMI-006 da Publicação de Pedido de Patente nº U.S. 2004/0216186; AXMI-007 da Publicação de Pedido de Patente nº U.S. 2004/0210965; AXMI-009 do Pedido de Patente nº U.S. 2004/ 0210964; AXMI-014 da Publicação de Pedido de Patente nº U.S. 2004/0197917; AXMI-004 da Publicação de Pedido de Patente nº U.S. 2004/0197916; AXMI-028 e AXMI-029 do documento nº WO 2006/ 119457; AXMI-O007, AXMI-O08, AXMI-O080rf2, AXMI-OO09, AXMI-014 e AXMI-004 do documento nº WO 2004/074462; AXMI-150 da Patente nº

U.S. 8,084,416; AXMI-205 da Publicação de Pedido de Patente nº U.S. 2011/0023184; AXMI-011, AXMI-012, AXMI-013, AXMI-015, AXMI-019, AXMI-044, AXMI-037, AXMI-043, AXMI-033, AXMI-O034, AXMI-022, AXMI-023, AXMI-041, AXMI-O063 e AXMI-064 da Publicação de Pedido de Patente nº U.S. 2011/0263488; AXMI-O011, AXMI-012, AXMI-013, AXMI-015, AXMI-019, AXMI-O044, AXMI-037, AXMI-043, AXMI-033, AXMI-034, AXMI-022, AXMI-023, AXMI-O041, AXMI-O63 AXMIOA46, AXMIO48, AXMIOSO, AXMIO51, AXMIO52, AXMIO53, AXMIOSA, AXMIO55, AXMIOS6, AXMIO57, AXMIO58, AXMIOS9, AXMIOG6O, AXMIO61, AXMIO67, AXMIO69, AXMIO71, AXMIO72, AXMIO73, AXMIO74, AXMIO75, AXMIO87, AXMIO88, AXMIO93, AXMIO7O, AXMIO80, AXMIO81, AXMIO82, AXMIO91, AXMIO92, AXMIO96, AXMIO97, AXMIO98, AXMIO99, AXMIIODO, AXMIIO1, AXMIIO2, AXMITO3, AXMIIO4, AXMIIO7, AXMIIO8, AXMIIO9, AXMII10, AXMINI11, AXMIT12, AXMITI4, AXMITNI6, AXMIT1I7, AXMIIN18, AXMI119, AXMII20, AXMII21, AXMI122, AXMI123, AXMII2A4, AXMI125, AXMII26, AXMI127, AXMI1I29, AXMII51, AXMII61, AXMII64, AXMI183, AXMI132, AXMII137, AXMII38 das Patentes nº US8461421 e US8,461,422; AXMI-R1 e proteínas relacionadas da Pu- blicação de Pedido de Patente nº U.S. 2010/0197592; AXMI/I2217Z, AXMI222z, AXMI223z, AXMI224z e AXMI225z do documento nº WO 2011/103248; AXMI218, AXMI219, AXMI220, AXMI226, AXMI227, AXMI228, AXMI229, AXMI230 e AXMI231 do documento nº WO 2011/103247; AXMI-115, AXMI-113, AXMI-O005, AXMI-163 e AXMI-184 da Patente nº U.S. 8,334,431; AXMI-O001, AXMI-002, AXMI-030, AXMI- 035 e AXMI-045 da Publicação de Pedido de Patente nº UJS. 2010/0298211; AXMI-O66 e AXMI-076 da Publicação de Pedido de Pa- tente nº U.S. 2009/0144852; AXMI128, AXMI130, AXMII31, AXMI133, AXMIIT40, AXMII41, AXMII42, AXMII43, AXMIIT44, AXMIA46, AXMII48, AXMII49, AXMII52, AXMII53, AXMII54, AXMIISS,

AXMII56, AXMII57, AXMII58, AXMII62, AXMIIG65, AXMIIGG, AXMII67, AXMII68, AXMIIG9, AXMIITO, AXMII7T1I, AXMII72, AXMII73, AXMII74, AXMII75, AXMII76, AXMII77, AXMII78, AXMI1I79, AXMII8O, AXMII81, AXMII82, AXMII85, AXMII8G, AXMI187, AXMI188, AXMI189 da Patente nº U.S. 8,318,900; AXMIO79, AXMIO8O0, AXMIO81, AXMIO82, AXMIO91, AXMIO92, AXMIO96, AXMIO97, AXMIO98, AXMIO99, AXMITNOO, AXMITO1, AXMITO2, AXMITO3, AXMINOA, AXMITO7, AXMITO8, AXMITO9, AXMITIO, dAdsAXMIT11, AXMI12, AXMI 14, AXMI16, AXMI 17, AXMI 18, AXMI 19, AXMIN20, AXMI 21, AXMI122, AXMI1I23, AXMII24, AXMII257, AXMII268, AXMII27, AXMI1I29, AXMII64, AXMII51, AXMII61, AXMII83, AXMII3S2, AXMI138, AXMI137 da Patente US US8461421; AXMI192 da Patente nº US8,461,415; AXMI281 da Publicação de Pedido de Patente nº U.S.

US20160177332; AXMI422 da Patente nº US8.252.872; proteínas cry, tais como Cry1A e Cry3A, que têm sítios proteolíticos modificados da Patente nº U.S. 8,319,019; uma proteína de toxina Cry1Ac, Cry2Aa e Cry1Ca da cepa de Bacillus thuringiensis VBTS 2528 da Publicação de Pedido de Patente nº U.S. 2011/0064710. As proteínas Cry MPO032, MPO049, MPO51, MPO66, MPO68, MPO70, MPO91S, MP109S, MP114, MP121, MP134S, MP183S, MP185S, MP186S, MP195S, MP197S, MP208S, MP209S, MP212S, MP214S, MP217S, MP222S, MP234S, MP235S, MP237S, MP242S, MP243, MP248, MP249S, MP251M, MP252S, MP253, MP259S, MP287S, MP288S, MP295S, MP296S, MP297S, MP300S, MP304S, MP306S, MP310S, MP312S, MP314S, MP319S, MP325S, MP326S, MP327S, MP328S, MP334S, MP337S, MP342S, MP349S, MP356S, MP359S, MP360S, MP437S, MP451S, MP452S, MP466S, MP468S, MP476S, MP482S, MP522S, MP529S, MP548S, MP552S, MP562S, MP564S, MP566S, MP567S, MP569S, MP573S, MP574S, MP575S, MP581S, MP590, MP594S, MP596S, MP597, MP599S, MP600S, MP601S, MP602S, MP604S, MP626S,

MP629S, MP630S, MP631S, MP632S, MP633S, MP634S, MP635S, MP639S, MP640S, MP644S, MP649S, MP651S, MP652S, MP653S, MP661S, MP666S, MP672S, MP696S, MP704S, MP724S, MP729S, MP739S, MP755S, MP773S, MP799S, MP800S, MP801S, MP802S, MP803S, MP805S, MP809S, MP815S, MP828S, MP831S, MP844S, MP852, MP865S, MP879S, MP887S, MP891S, MP896S, MP898S, MP935S, MP968, MP989, MP993, MP997, MP1049, MP1066, MP1067, MP1080, MP1081, MP1200, MP1206, MP1233, e MP1311 do docu- mento de número de série US 62/607372. A atividade inseticida de pro- teínas Cry pode ser encontrada, por exemplo, em van Frannkenhuyzen, (2009) Jy.

Invert.

Path. 101:1 a 16). O uso de proteínas Cry como técnica de traços de planta transgênica e plantas transgênicas em Cry que in- cluem, mas sem limitação, plantas que expressam Cry1Ac, Cry 1Ac+Cry2Ab, Cry1Ab, Cry1A.105, Cry1F, Cry1Fa2, Cry1F+Cry1Ac, Cry2Ab, Cry3A, mCry3A, Cry3Bb1, Cry34Ab1, Cry35Ab1, Vip3A, MCry3A, Cry9c e CBI-Bt receberam a aprovação regulatória (consultar Sanahuja, (2011) Plant Biotech Journal 9:283 a 300 e CERA. (2010) GM Crop Database Center for Environmental Risk Assessment (CERA), ILSI Research Foundationn Washington D.C. em cera-gmc.org/in- dex.php?action=zgm crop database que pode ser acessado na rede mundial de computadores com o uso do prefixo "www"). Mais de uma proteína pesticida também pode ser expressa em plantas, tais como Vip3Ab e Cry1Fa (documento no.

US2012/0317682); Cry 1BE e Cry1F (documento no.

US2012/0311746); Cry1CA e Cry1AB (documento no.

US2012/0311745); Cry1F e CryCa (documento no.

US2012/0317681); Cry1DA e Cry 1BE (documento no.

US2012/0331590); Cry 1DA e CryiFa (documento no.

US2012/0331589); Cry1AB e Cry1BE (documento no.

US2012/0324606); Cry1Fa e Cry2Aa e Cry1l e Cry1E (documento no.

US2012/0324605); Cry34Ab/35Ab e Cry6Aa (documento no.

US2013 0167269); Cry34Ab/VCry35Ab e Cry3Aa (documento no.

US2013

0167268); Cry1Da e Cry1Ca (documento no.

US 9796982); Cry3Aa e Cry6Aa (documento no.

US 9798963); e Cry3A e Cry1Ab ou Vip3Aa (documento no.

US9,045,766). Proteínas pesticidas também incluem |i- pases inseticidas incluindo lipídio acil-hidrolases da Patente U.S.

Nº 7,491,869, e colesterol-oxidases, tais como de Streptomyces (Purcell et al. (1993) Biochem Biophys Res Commun 15:1.406 a 1.413). Proteínas pesticidas também incluem toxinas VIP (proteínas inseticidas vegetati- vas) das Patentes U.S.

Números 5,877,012, 6,107,279, 6,137,033, 7,244,820, 7,615,686 e 8,237,020 e semelhantes.

Outras proteínas VIP podem ser encontradas em lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil Crick- more/Bt/vip.html que pode ser acessado na rede mundial de computa- dores com o uso do prefixo "www". As proteínas pesticidas também in- cluem proteínas Cyt, incluindo variantes Cyt1A do documento de nú- mero de série POT/US2017/000510; as proteínas pesticidas também in- cluem proteínas de complexo de toxina (TC), obteníveis a partir de or- ganismos, tal como Xenorhabdus, Photorhabdus e Paenibacillus (con- sultar as Patentes números US 7.491.698 e 8.084.418). Algumas prote- ínas TC têm atividade inseticida "autônoma" e outras proteínas TC me- lhoram a atividade das toxinas autônomas produzidas pelo mesmo dado organismo.

A toxicidade de uma proteína TC "autônoma" (de Photorhab- dus, Xenorhabdus ou Paenibacillus, por exemplo) pode ser melhorada por um ou mais "potenciadores" de proteína TC derivados de um orga- nismo-fonte de um gênero diferente.

Há três tipos principais de proteí- nas TC.

Conforme referido no presente documento, as proteínas de Classe A ("Proteína A") são toxinas autônomas.

As proteínas de Classe B ("Proteína B") e as proteínas de Classe C ("Proteína C") aumentam a toxicidade das proteínas de Classe A.

Os exemplos de proteínas de Classe A são TcbA, TcdA, XptA1 e XptA2. Os exemplos de proteínas de Classe B são TcaC, TcdB, XptB1Xb e XptC1Wi.

Os exemplos de proteínas de Classe C são TccC, XptC1Xb e XptB1IWi.

As proteínas pesticidas também incluem proteínas de veneno de aranha, cobra e es- corpião. Exemplos de peptídeos de veneno de aranha incluem, mas sem limitação, peptídeos de licotoxina-1 e mutantes dos mesmos (Pa- tente nº U.S. 8,334,366).

[0155] (C) um polinucleotídeo que codifica um hormônio ou feromô- nio específico para inseto, tal como um ecdisteroide e hormônio juvenil, uma variante do mesmo, um mimético à base do mesmo ou um antago- nista ou agonista do mesmo. Consultar, por exemplo, a descrição por Hammock, et a/., (1990) Nature 344:458, de expressão em baculovírus de hormônio juvenil esterase clonado, um inativador de hormônio juve- nil.

[0156] (D) Um polinucleotídeo codificador de um peptídeo especí- fico para inseto que, mediante expressão, perturba a fisiologia da praga afetada. Por exemplo, consultar as revelações de Regan, (1994) J. Biol. Chem. 269:9 (clonagem de expressão rende DNA que codifica receptor de hormônio diurético de inseto); Pratt, et al., (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 163:1243 (uma alostatina é identificada em Diploptera pun- tata); Chattopadhyay, et al., (2004) Critical Reviews in Microbiology 30(1):33 a 54; Zjawiony, (2004) J Nat Prod 67(2):300 a 310; Carlini e Grossi-de-Sa, (2002) Toxicon 40(11):1515 a 1539; Ussuf, et al., (2001) Curr Sci. 80(7):847 a 853 e Vasconcelos e Oliveira, (2004) Toxicon 44(4):385 a 403. Ver também, Patente US Número 5,266,317 atribuída a Tomalski, et al., que revela genes codificando toxinas específicas para insetos.

[0157] (E) Um polinucleotídeo que codifica uma enzima responsável por um hiperacúmulo de um monoterpeno, um sesquiterpeno, um este- roide, ácido hidroxâmico, um derivado fenilpropanoide ou outra molé- cula não proteica com atividade inseticida.

[0158] (F) Um polinucleotídeo que codifica uma enzima envolvida na modificação, incluindo a modificação pós-tradução, de uma molécula biologicamente ativa; por exemplo, uma enzima glicolítica, uma enzima proteolítica, uma enzima lipolítica, uma nuclease, uma ciclase, uma tran- saminase, uma esterase, uma hidrolase, uma fosfatase, uma cinase, uma fosforilase, um polimerase, uma elastase, uma quitinase e uma glucanase, seja natural ou sintética. Consultar o Pedido PCT WO 1993/02197 no nome de Scott, et al., o qual revela a sequência de nucleotídeos de um gene de calase. As moléculas de DNA que contêm as sequências codi- ficadoras de quitinase podem ser obtidas, por exemplo, de ATCCº sob os Números de Acesso 39.637 e 67.152. Também consultar Kramer, et al., (1993) Insect Biochem. Molec. Biol. 23:691, que ensina a sequência de nucleotídeos de um cDNA codificador de quitinase de ancilóstomo de tabaco e Kawalleck, et a/l., (1993) Plant Molec. Biol. 21:673, que for- nece a sequência de nucleotídeos do gene de poliubiquitina ubi4-2 de salsa, e as Patentes nº* U.S. 6,563,020; 7,145,060 e 7,087,810.

[0159] (G) Um polinucleotídeo codificador de uma molécula que es- timula a transdução de sinal. Por exemplo, consultar a descrição por Botella, et al., (1994) Plant Molec. Biol. 24:757 de sequências de nucle- otídeos para clones de cDNA de calmodulina de feijão-mungo, e Griess, et al., (1994) Plant Physiol. 104:1467, que fornece a sequência de nu- cleotídeos de um clone de cDNA de calmodulina de mais.

[0160] (H) Um polinucleotídeo codificador de um peptídeo de mo- mento hidrofóbico. Consultar o Pedido PCT nº WO 1995/16776 e a des- crição da Patente nº U.S. 5,580,852 de derivados de peptídeos de Ta- quiplesina que inibem patógenos de planta fúngicos, e o Pedido PCT nº WO 1995/18855 e a Patente U.S. nº 5,607,914 (ensina peptídeos anti- microbianos sintéticos que conferem resistência a doenças).

[0161] (1) Um polinucleotídeo codificador de uma permease de membrana, um formador de canal ou um bloqueador de canal. Por exemplo, consultar a descrição por Jaynes, et al., (1993) Plant Sci.

89:43, de expressão heteróloga de um análogo de peptídeo lítico de ce- cropina-beta para tornar plantas de tabaco transgênicas resistentes a Pseudomonas solanacearum.

[0162] (J) Um gene codificador de uma proteína invasiva de modo viral ou uma toxina complexa derivada da mesma. Por exemplo, o acú- mulo de proteínas de revestimento viral em células de plantas transfor- madas confere resistência à infecção viral e/ou desenvolvimento de do- ença efetuado pelo vírus do qual o gene de proteína de revestimento é derivado, assim como por vírus relacionados. Ver, Beachy, et a/., (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28:451. A resistência mediada por proteínas de revestimento foi conferida mediante plantas transformadas contra vírus do mosaico da alfafa, vírus do mosaico do pepino, vírus da risca de ta- baco, vírus X da batata, vírus Y da batata, vírus "etch" do tabaco, vírus "rattle" do tabaco e vírus do mosaico do tabaco. ld.

[0163] (K) Um gene que codifica um anticorpo específico de inseto ou uma imunotoxina derivada do mesmo. Assim, um anticorpo direcio- nado para uma função metabólica crítica nos intestinos do inseto pode inativar uma enzima afetada, exterminando o inseto. Cf. Taylor, et al., Resumo nº 497, SEVENTH INTL SYMPOSIUM ON MOLECULAR PLANT-MICROBE INTERACTIONS (Edimburgo, Escócia, 1994) (inati- vação enzimática em tabaco transgênico por meio de produção de fra- gmentos de anticorpos de cadeia única).

[0164] (L) Um gene codificador de um anticorpo específico para ví- rus. Consultar, por exemplo, Tavladoraki, et al., (1993) Nature 366:469, que mostra que as plantas transgênicas que expressam genes de anti- corpo recombinante são protegidas do ataque de vírus.

[0165] (M) Um polinucleotídeo codificador de uma proteína de re- tenção de desenvolvimento produzida na natureza por um patógeno ou um parasita. Desse modo, endo alfa-1,4-D-poligalacturonases fúngicas facilitam a colonização fúngica e a liberação de nutrientes de plantas solubilizando a homo-alfa-1,4-D-galacturonase de parede de célula de planta. Ver, Lamb, et a/., (1992) Bio/Technology 10:1436. A clonagem e caracterização de um gene que codifica uma proteína de inibição de endopoligalacturonase de feijão são descritas por Toubart, et a/., (1992) Plant J. 2:367.

[0166] (N) Um polinucleotídeo codificador de uma proteína de re- tenção de desenvolvimento produzida na natureza por uma planta. Por exemplo, Logemann, et al., (1992) Bio/Technology 10:305 mostraram que plantas transgênicas que expressam o gene de inativação de ribos- somo de cevada têm uma resistência aumentada a doença fúngica.

[0167] (O) Genes envolvidos na Resposta de Resistência Adquirida Sistêmica (SAR) e/ou os genes relacionados com a patogênese. Briggs, (1995) Current Biology 5(2), Pieterse e Van Loon, (2004) Curr. Opin. Plant Bio. 7(4):456 a 464 e Somssich, (2003) Cell 113(7):815 a 816.

[0168] (P) Genes antifúngicos (Cornelissen e Melchers, (1993) PI. Physiol. 101:709-712 e Parijs, et al/., (1991) Planta 183:258-264 e Bushnell, et a/., (1998) Can. J. of Plant Path. 20(2):137 a 149. Também consultar os Pedidos de Patente nº U.S. 09/950,933; 11/619,645; 11/657,710; 11/748,994; 11/774,121 e Patentes nºº U.S. 6,891,085 e 7,306,946. As cinases semelhantes a receptor LysM para a percepção de fragmentos de quitina como uma primeira etapa na resposta de de- fesa de planta contra patógenos fúngicos (documento nº US 2012/0110696).

[0169] (Q) Genes de desintoxicação, como para fumonisina, beau- vericina, moniliformina e zearalenona e seus derivados estruturalmente relacionados. Por exemplo consultar, as Patentes nº*º U.S. 5,716,820; 5,792,931; 5,798,255; 5,846,812; 6,083,736; 6,538,177; 6,388,171 e 6,812,380.

[0170] (R) Um polinucleotídeo codificador de uma Cistatina e inibi- dores de cisteína proteinase. Consultar a Patente nº U.S. 7,205,453.

[0171] (S) Genes de defensina. Consultar o documento nº WO 2003/000863 e as Patentes nº* U.S. 6,911,577; 6,855,865; 6,777,592 e 7,238,781.

[0172] (T) Genes que conferem resistência a nematódeos. Consul- tar, por exemplo, o Pedido PCT nº WO 1996/30517; Pedido PCT nº WO 1993/19181, documento nº WO 2003/033651 e Urwin, et al., (1998) Planta 204:472 a 479, Williamson, (1999) Curr Opin Plant Bio. 2(4):327 a 331; Patentes nº* U.S. 6,284,948 e 7,301,069 e genes miR164 (docu- mento nº WO 2012/058266).

[0173] (U) Genes que conferem resistência à Podridão de Raízes de Phytophthora, como os genes Rps 1, Rps 1-a, Rps 1-b, Rps 1-c, Rps 1-d, Rps 1-e, Rps 1-k, Rps 2, Rps 3-a, Rps 3-b, Rps 3-c, Rps 4, Rps 5, Rps 6, Rps 7 e outros genes Rps. Consultar, por exemplo, Shoemaker, et al., "Phytophthora Root Rot Resistance Gene Mapping in Soybean", Plant Genome IV Conference, San Diego, Califórnia (1995).

[0174] (V) Genes que conferem resistência a Podridão do Caule Marrom, conforme descrito na Patente nº U.S. 5,689,035 e incorporada a título de referência para este propósito.

[0175] (W) Genes que conferem resistência a Colletotrichum, con- forme descrito na Publicação de Pedido de Patente nº U.S. US 2009/0035765 e incorporada a título de referência para este propósito. Isso inclui o lócus Reg que pode ser utilizado com uma conversão de lócus único.

2. Transgenes que Conferem Resistência a um Herbicida, por Exemplo:

[0176] (A) Um polinucleotídeo codificador de resistência a um her- bicida que inibe o ponto de crescimento ou meristema, como uma imi- dazolinona ou uma sulfonilureia. Genes exemplificativos nesta categoria codificam a enzima ALS e AHAS mutante conforme descrito, por exem- plo, por Lee, et al., (1988) EMBO J. 7:1241 e Miki, et al., (1990) Theor.

Appl. Genet. 80:449, respectivamente. Também consultar as Patentes nºº U.S. 5,605,011; 5,013,659; 5,141,870; 5,767,361; 5,731,180; 5,304,732; 4,761,373; 5,331,107; 5,928,937 e 5,378,824; Pedido de Pa- tente nº U.S. 11/683,737 e Publicação Internacional nº WO 1996/33270.

[0177] (B) Um polinucleotídeo codificador de uma proteína para re- sistência ao Glifosato (resistência conferida por genes de 5-enolpiruvil- 3-fosfiquimato sintase (EPSP) e aroA mutantes, respectivamente) e ou- tros compostos fosfônicos, como glufosinato (genes de fosfinotricina- acetil-transferase (PAT), marcador selecionável de Streptomyces coeli- color (A3) (DSM-2), e fosfinotricina-acetil-transferase (bar) de Strep- tomyces hygroscopicus), e ácidos piridinoxi- ou fenoxipropiônicos e ci- clo-hexonas (genes codificadores de inibidor de ACCase). Consultar, por exemplo, a Patente nº U.S. 4,940,835 atribuída a Shah, et a/l., a qual revela a sequência de nucleotídeos de uma forma de EPSPS que pode conferir resistência ao glifosato. A Patente nº U.S. 5,627,061 de Barry, et al., também descreve os genes codificadores de enzimas EPSPS. Consultar também, as Patentes Número U.S. 6,566,587; 6,338,961; 6,248,876; 6,040,497; 5,804,425; 5,633,435; 5,145,783; 4,971,908; 5,312,910; 5,188,642; 5,094,945, 4,940,835; 5,866,775; 6,225,114; 6,130,366; 5,310,667; 4,535,060; 4,769,061; 5,633,448; 5,510,471; Re. 36,449; RE 37,287 E e 5,491,288 e Publicações Internacionais EP 1173580; WO 2001/66704; EP 1173581 e EP 1173582, que são incor- poradas no presente documento a título de referência para este propó- sito. A resistência ao glifosato também é conferida a plantas que expres- sam um gene codificante de uma enzima glifosato oxidorredutase, con- forme descrito mais completamente nas Patentes nº* U.S. 5,776,760 e 5,463,175, que são incorporadas no presente documento a título de re- ferência para este propósito. Além disso, a resistência a glifosato pode ser conferida a plantas pela sobre-expressão de genes codificadores de glifosato N-acetiltransferase. Consultar, por exemplo, as Patentes nº*

U.S. 7,462,481; 7,405,074 e a Publicação de Pedido de Patente nº U.S. 2008/0234130. Uma molécula de DNA codificante de um gene aroA mu- tante pode ser obtida sob o Número de Acesso ATCCº 39256 e a se- quência de nucleotídeos do gene mutante é revelada na Patente nº U.S. 4,769,061 de Comai. O Pedido nº EP 0 333 033 de Kumada, etal, ea Patente nº U.S. 4,975,374 de Goodman, et al. revelam sequências de nucleotídeos de genes de glutamina sintetase que conferem resistência a herbicidas como L-fosfinotricina. A sequência de nucleotídeo de um gene fosfinotricina-acetil-transferase é fornecida nos Pedidos nos EP O 242 246 e O 242 236 de Leemans, et al.; De Greef, et al., (1989) Bio/Technology 7:61, que descrevem a produção de plantas transgêni- cas que expressa os genes bar quiméricos que codificam a atividade de fosfinotricina-acetil-transferase. Também consultar as Patentes nº* U.S. 5,969,213; 5,489,520; 5,550,318; 5,874,265; 5,919,675; 5,561,236; 5,648,477; 5,646,024; 6,177,616 e 5,879,903, que são incorporadas no presente documento a título de referência para este propósito. US 2011/0107455 revela o gene DSM-2 e sequências de produtos genéti- cos bem como o seu uso em plantas resistentes ao herbicida glufosi- nato. Os genes exemplificativos que conferem resistência a ácidos fe- nóxipropiônicos e ciclo-hexonas, como setoxidim e haloxifop, são os ge- nes Acc1-S1, Acc1-S2 e Acc1-S3 descritos por Marshall, et a/., (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435.

[0178] (C) Um polinucleotídeo codificador de uma proteína para re- sistência a herbicida que inibe a fotossíntese, como uma triazina (genes psbA e gs+) e uma benzonitrila (gene de nitrilase). Przibilla, et al., (1991) Plant Cell 3:169 descreve a transformação de Chlamydomonas com plasmídeos codificadores de genes psbA mutantes. As sequências de nucleotídeos para genes de nitrilase são reveladas na Patente nº U.S. 4,810,648 de Stalker e moléculas de DNA que contêm esses genes es- tão disponíveis sob os Números de Acesso ATCCº 53435, 67441 e

67442. A clonagem e a expressão de DNA que codifica uma glutationa- S-transferase são descritas por Hayes, et al., (1992) Biochem. J. 285:173.

[0179] (D) Um polinucleotídeo codificador de uma proteína para re- sistência a aceto-hidroxiácido sintase, que se verificou tornar plantas que expressam essa enzima resistentes a múltiplos tipos de herbicidas, foi introduzido em uma variedade de plantas (consultar, por exemplo, Hattori, et al., (1995) Mol Gen Genet. 246:419). Outros genes que con- ferem resistência a herbicidas incluem: um gene codificador de uma pro- teína quimérica de citocromo P4507A1 de rato e NADPH-citocromo P450 oxidorredutase de levedura (Shiota, et al., (1994) Plant Physiol 106:17), genes para glutationa redutase e superóxido dismutase (Aono, et al., (1995) Plant Cell Physiol 36:1.687) e genes para várias fosfotrans- ferases (Datta, et al., (1992) Plant Mol Biol 20:619).

[0180] (E) Um polinucleotídeo codificador de resistência a um her- bicida visando protoporfirinogênio oxidase (protox) que é necessária para a produção de clorofila. A enzima protox serve como alvo para uma variedade de compostos herbicidas. Esses herbicidas também inibem o crescimento de todas as espécies diferentes de plantas presentes, cau- sando sua destruição total. O desenvolvimento de plantas que contêm atividade de protox alterada que são resistentes a esses herbicidas é descrito nas Patentes nº U.S. 6,288,306; 6,282,83 e 5,767,373 e na Pu- blicação Internacional nº WO 2001/12825.

[0181] (F) O gene aad-1 (originalmente de Sphingobium herbicido- vorans) codifica a proteína arilalcoxialcanoato dioxigenase (AAD-1). O traço confere tolerância aos herbicidas ácido 2,4-diclorofenoxiacético e ariloxifenoxipropionato (comumente chamados de herbicidas "fop", como quizalofop). O gene aad-1, em si, para tolerância a herbicidas em plantas, foi primeiramente revelado no documento nº WO 2005/107437 (também consultar o documento nº US 2009/0093366). O gene aad-12,

derivado de Delftia acidovorans, que codifica a proteína ariloxialcanoato dioxigenase (AAD-12) que confere tolerância a ácido 2,4-diclorofenoxi- acético e herbicidas de piridiloxiacetato desativando diversos herbicidas com uma porção química de ariloxialcanoato, incluindo fenoxi-auxina (por exemplo, 2,4-D, MCPA), assim como piridiloxiauxinas (por exem- plo, fluroxipir, triclopir).

[0182] (G) Um polinucleotídeo codificador de uma dicamba mono- oxigenase resistente a herbicidas revelado na Publicação de Pedido de Patente nº U.S. 2003/0135879 para conferir tolerância a dicamba;

[0183] (H) Uma molécula de polinucleotídeo codificadora de bromo- xinil nitrilase (Bxn) revelada na Patente nº U.S. 4,810,648 para conferir tolerância a bromoxinil;

[0184] (1) Uma molécula de polinucleotídeo codificadora de fitoeno (crtl) descrita em Misawa, et al., (1993) Plant J. 4:833 a 840 e em Misawa, et al., (1994) Plant J. 6:481 a 489 para tolerância a norflura- zona.

3. Transgenes que conferem ou contribuem para uma carac- terística de grãos alterada;

4. Genes que controlam a esterilidade masculina;

5. Genes que criam um sítio para integração de DNA espe- cífica para sítios;

6. Genes que afetam a resistência a estresse abiótico;

7. Genes que conferem rendimento aumentado; e/ou

8. Genes que conferem digestibilidade de plantas.

9. Silenciamento de genes. Em algumas modalidades, o traço empilhado pode estar na forma de silenciamento de um ou mais polinucleotídeos de interesse resultando na supressão de um ou mais polipeptídeos de praga-alvo. Em algumas modalidades, o silenciamento é alcançado através do uso de um construto de DNA de supressão.

[0185] Em algumas modalidades, um ou mais polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos IRDIG35563 ou fragmentos ou variantes dos mesmos podem ser empilhados com um ou mais polinucleotídeos que codificam um ou mais polipeptídeos que têm atividade inseticida ou tra- ços agronômicos conforme estabelecido supra e, opcionalmente, po- dem incluir adicionalmente um ou mais polinucleotídeos que fornecem silenciamento de genes de um ou mais polinucleotídeos-alvo conforme discutido infra.

[0186] "Construto de DNA de supressão" é um construto de DNA recombinante que, quando transformado ou integrado de modo estável no genoma da planta, resulta no "silenciamento" de um gene-alvo na planta. O gene-alvo pode ser endógeno ou transgênico à planta. "Silen- ciamento", conforme usado no presente documento em relação ao gene-alvo, se refere geralmente à supressão de níveis de MRNA ou pro- teína/enzima expressos pelo gene-alvo, e/ou o nível da atividade enzi- mática ou funcionalidade da proteína. O termo "supressão" inclui baixar, reduzir, declinar, diminuir, inibir, eliminar e prevenir. "Silenciamento" ou "silenciamento de genes" não especifica o mecanismo e é inclusivo, e não limitado a antissentido, cossupressão, supressão viral, supressão de grampo, supressão de haste-alça, abordagens à base de RNAi e abordagens à base de RNA pequeno.

[0187] Algumas modalidades se referem à regulação descendente de expressão de genes-alvo em espécies de pragas de insetos por mo- léculas de ácido ribonucleico (RNA) interferente. A Publicação PCT nº WO 2007/074405 descreve métodos para inibir a expressão de genes- alvo em pragas invertebradas incluindo besouro do Colorado da batata. A Publicação PCT nº WO 2005/110068 descreve métodos para inibir a expressão de genes-alvo em pragas invertebradas incluindo o verme da raiz do milho do oeste para controlar a infestação de insetos. Adicional- mente, a Publicação PCT nº WO 2009/091864 descreve composições e métodos para a supressão de genes-alvo de espécies de pragas de insetos incluindo pragas do gênero Lygus.

Moléculas de ácidos nuclei- cos incluindo RNAi para visar a subunidade de ATPase H vacuolar são úteis para controlar uma população e infestação de pragas de Coleóp- teros conforme descrito na Publicação de Pedido de Patente nº U.S. 2012/0198586. A Publicação PCT WO 2012/055982 descreve um ácido ribonucleico (RNA ou RNA de fita dupla) que inibe ou regula de modo decrescente a expressão de um gene-alvo que codifica: uma proteína ribossômica de inseto, como a proteína ribossômica L19, a proteína ri- bossômica L40 ou a proteína ribossômica S27A; uma subunidade de proteassomo de inseto, como a proteína Rpn6, a Pros 25, a proteína Rpn2, a proteína de subunidade beta 1 de proteassomo ou a proteína Pros beta 2; um B-coatômero de inseto da vesícula COPI, o y-coatômero da vesícula COPI, a proteína B'-coatômero ou o C-coatômero da vesícula COPI; uma proteína Tetraspanina 2 A de inseto que é uma proteína de domínio transmembranar putativo; uma proteína de inseto que pertence à família de actina, como Actina 5C; uma proteína ubiquitina-5E de in- seto; uma proteína Sec23 de inseto que é um ativador de GTPase en- volvido em transporte de proteína intracelular; uma proteína plissada de inseto que é uma miosina não convencional que está envolvida em ati- vidade motora; uma proteína torcicolo de inseto que está envolvida na regulação de encadeamento de mRNA alternativo nuclear; uma prote- ína de subunidade G de H+-ATPase vacuolar de inseto e uma Tbp-1 de inseto, como uma proteína de ligação a Tat.

A Publicação PCT WO 2007/035650 descreve um ácido ribonucleico (RNA ou RNA de fita du- pla) que inibe ou regula de modo decrescente a expressão de um gene- alvo que codifica Snf7. A Publicação de Pedido de Patente nº US 2011/0054007 descreve elementos de silenciamento de polinucleotí- deos que visam RPS10. As Publicações de Pedidos de Patentes nº U.S. 2014/0275208 e US2015/0257389 descrevem elementos de silencia-

mento de polinucleotídeo visando RyanR e PAT3. A publicação do Pe- dido de Patente PCT WO2016/138106 descreve elementos de silencia- mento de polinucleotídeo visando o coatômero alfa ou gama.

As Publi- cações de Pedido de Patente nº U.S. 2012/029750, nº US 20120297501 e nº 2012/0322660 descrevem ácidos ribonucleicos interferentes (RNA ou RNA de fita dupla) que funcionam mediante captação por uma espé- cie de praga de inseto para regular de modo descendente a expressão de um gene-alvo na referida praga de inseto, em que o RNA compre- ende pelo menos um elemento de silenciamento, em que o elemento de silenciamento é uma região de RNA de fita dupla que compreende fitas complementares aneladas, em que uma fita compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos parcialmente complementar a uma sequência de nucleotídeos-alvo dentro do gene- alvo.

A Publicação de Pedido de Patente no US 2012/0164205 descreve direcionamentos potenciais para ácidos ribonucleicos de fita dupla inter- ferentes para inibir pragas invertebradas incluindo: uma Sequência Ho- móloga Chd3, uma Sequência Homóloga de Beta-Tubulina, uma Se- quência Homóloga de ATPase V de 40 kDa, uma Sequência Homóloga de EF1a, uma Sequência Homóloga p28 de Subunidade de Proteas- soma 268, uma Sequência Homóloga de Hidrolase de Epóxido de Hor- mônio Juvenil, uma Sequência Homóloga de Proteína de Canal de Clo- reto Dependente de Inchaço, uma Sequência Homóloga de Proteína Glicose-6-Fosfato 1-Desidrogenase, uma Sequência Homóloga de Pro- teína Act42A, uma Sequência Homóloga de Fator 1 de Ribosilação de ADP, uma Sequência Homóloga de Proteína de Fator IIB de Transcri- ção, uma Sequência Homóloga de Quitinase, uma Sequência Homó- loga de Enzima de Conjugação de Ubiquitina, uma Sequência Homó- loga de Gliceraldeído-3-Fosfato Desidrogenase, uma Sequência Homó- loga de Ubiquitina B, um Homólogo de Esterase de Hormônio Juvenil e uma Sequência Homóloga de Alfa Tubulina.

[0188] Uso em Controle Pesticida. Os métodos gerais para empre- gar cepas que compreendem uma sequência de ácido nucleico das mo- dalidades ou uma variante da mesma em controle pesticida ou na ma- nipulação de outros organismos como agentes pesticidas são conheci- dos na técnica.

[0189] Os hospedeiros de microrganismos que são conhecidos por ocuparem a "fitosfera" (filoplano, filosfera, rizosfera e/ou rizoplana) de uma ou mais culturas de interesse podem ser selecionados. Esses mi- crorganismos são selecionados de modo a terem capacidade de com- petir de modo bem-sucedido no ambiente particular com os microrga- nismos do tipo selvagem, fornecer manutenção estável e expressão do gene que expressa o polipeptídeo IRDIG35563 e, desejavelmente, for- necer proteção aprimorada do pesticida contra degradação e inativação ambientais.

[0190] Alternativamente, o polipeptídeo IRDIG35563 é produzido in- troduzindo-se um gene heterólogo em um hospedeiro celular. A expressão do gene heterólogo resulta, direta ou indiretamente, na produção intrace- lular e manutenção do pesticida. Estas células são então tratadas em con- dições que prolongam a atividade da toxina produzida na célula quando a célula é aplicada no ambiente da(s) praga(s)-alvo. O produto resultante retém a toxicidade da toxina. Esses polipeptídeos IRDIG35563 natural- mente encapsulados podem, então, ser formulados de acordo com téc- nicas convencionais para a aplicação no ambiente hospedando uma praga-alvo, por exemplo, solo, água e folhagem de plantas. Consultar, por exemplo, o documento nº EPA 0192319 e as referências citadas no mesmo.

[0191] Aplicações de pulverização sobre a superfície são outro exemplo e também são conhecidas na técnica. As proteínas em questão podem ser apropriadamente formuladas para o uso final desejado, e en- tão pulverizadas (ou de outro modo aplicadas) sobre a planta ou em redor da planta ou na vizinhança da planta a ser protegida antes de ser descoberta uma infestação, depois de serem descobertos insetos-alvo, tanto antes como depois, e similares. Grânulos de isca, por exemplo, também podem ser usados e são conhecidos na técnica.

[0192] Composições pesticidas. Em algumas modalidades, os in- gredientes ativos podem ser aplicados na forma de composições e po- dem ser aplicados na área de cultura ou planta a ser tratada, simultane- amente ou em sucessão, com outros compostos. Esses compostos po- dem ser fertilizantes, exterminadores de gramíneas, crioprotetores, ten- soativos, detergentes, sabonetes pesticidas, óleos inativos, polímeros e/ou formulações de transportador de liberação por tempo ou biodegra- dável que permitem a dosagem a longo prazo de uma área de direcio- namento após uma aplicação única da formulação. Os mesmos também podem ser herbicidas seletivos, inseticidas químicos, virucidas, microbi- cidas, amebicidas, pesticidas, fungicidas, bactericidas, nematocidas, moluscicidas ou misturas de diversas dentre essas preparações, se de- sejado, junto com transportadores adicionais agricolamente aceitáveis, tensoativos ou adjuvantes de promoção de aplicação podem ser empre- gues na formulação. Os transportadores e adjuvantes adequados po- dem ser sólidos ou líquidos e correspondem às substâncias empregues de modo comum na tecnologia da formulação, por exemplo, substâncias minerais naturais ou regeneradas, solventes, dispersantes, agentes umectantes, aprimoradores de pegajosidade, aglutinantes ou fertilizan- tes. De modo similar, as formulações podem ser preparadas em “iscas” comestíveis ou fabricadas em “armadilhas” para pragas de modo a per- mitir alimentação ou ingestão por uma praga-alvo da formulação pesti- cida.

[0193] Os métodos de aplicação de um ingrediente ativo ou uma composição agroquímica que contém pelo menos um dos polipeptídeos IRDIG35563 produzidos pelas cepas bacterianas incluem aplicação em folha, revestimento de semente e aplicação em solo. O número de apli- cações e a taxa de aplicação dependem da intensidade da infestação pela praga correspondente.

[0194] A composição pode ser formulada como um pó, poeira, pé- lete, grânulo, pulverização, emulsão, coloide, solução ou semelhantes, e pode ser preparada por meios convencionais, tais como dessecação, liofiização, homogeneização, extração, filtração, centrifugação, sedi- mentação ou concentração de uma cultura de células que compreende o polipeptídeo. Em todas as tais composições que contêm pelo menos um tal polipeptídeo pesticida, o polipeptídeo pode estar presente em uma concentração de cerca de 1% a cerca de 99% em peso.

[0195] As pragas de Lepidópteros, Dípteros, Heterópteros, nemató- deos, Hemípteros ou Coleópteros podem ser exterminadas ou seus nú- meros reduzidos em cada área pelos métodos da descrição ou podem ser aplicados de modo profilático em uma área ambiental para impedir a infestação por uma praga suscetível. Preferencialmente, a praga in- gere ou faz contato com uma quantidade eficaz como pesticida do poli- peptídeo. "Quantidade eficaz como pesticida", conforme usado no pre- sente documento, se refere a uma quantidade do pesticida que pode exterminar pelo menos uma praga ou reduzir de modo notável o cresci- mento, alimentação ou desenvolvimento fisiológico normal de pragas. Essa quantidade irá variar dependendo de fatores tais como, por exem- plo, as pragas-alvo específicas a serem controladas, o ambiente espe- cífico, a localização, a planta, cultura ou local agrícola a ser tratado, as condições ambientais e o método, taxa, concentração, estabilidade e quantidade de aplicação da composição polipeptídica eficaz como pes- ticida. As formulações também podem variar em relação a condições climáticas, considerações ambientais e/ou frequência de aplicação e/ou severidade de infestação da praga.

[0196] As composições pesticidas descritas podem ser produzidas formulando-se a célula bacteriana, suspensão de Cristal e/ou esporo ou componente de proteína isolada com o transportador agriculturalmente aceitável desejado. As composições podem ser formuladas antes da administração em um meio apropriado, como liofilizada, criodessecada, dessecada ou em um transportador, meio ou diluente aquoso adequado, como solução salina ou outro tampão. As composições formuladas podem estar na forma de uma poeira ou material granular, ou uma suspensão em óleo (vegetal ou mineral), ou água, ou emulsões de óleo/água, ou como um pó molhável ou em combinação com qualquer outro material trans- portador adequado para aplicação agrícola. Transportadores agrícolas adequados podem ser sólidos ou líquidos. O termo "transportador acei- tável de modo agrícola" abrange todos os adjuvantes, componentes inertes, dispersantes, tensoativos, aprimoradores de pegajosidade, aglutinantes, etc. que são usados de modo comum na tecnologia da for- mulação de pesticidas; esses são bem conhecidos por aqueles versa- dos na técnica da formulação de pesticidas. As formulações podem ser misturadas com um ou mais adjuvantes sólidos ou líquidos e preparadas por vários meios, por exemplo, por mistura de modo homogêneo, mes- cla e/ou trituração da composição pesticida com adjuvantes adequados utilizando-se técnicas de formulação convencionais. As formulações e métodos de aplicação adequados são descritos na Patente nº U.S. 6,468,523, incorporada no presente documento a título de referência. As plantas também podem ser tratadas com uma ou mais composições químicas, incluindo um ou mais herbicidas, inseticidas ou fungicidas.

[0197] As composições químicas exemplificativas incluem: Herbici- das de Frutas/Vegetais: Atrazina, Bromacil, Diuron, Glifosato, Linuron, Metribuzina, Simazina, Trifluralina, Fluazifop, Glufosinato, Halossulfuron Gowan, Paraquat, Propizamida, Setoxidim, Butafenacil, Halossulfuron, Indaziflam; Inseticidas de Frutas/Vegetais: Aldicarb, Bacillus thurien- giensis, Carbaril, Carbofurano, Clorpirifos, Cipermetrina, Deltametrina,

Diazinon, Malation, Abamectina, Ciflutrina/beta-ciflutrina, Esfenvalerato, Lambda-cialotrina, Acequinocil, Bifenazato, Metoxifenozida, Novaluron, Cromafenozida, Tiacloprida, Dinotefurano, FluaCripirim, Tolfenpirad, Clotianidina, Espirodiclofeno, Gama-cialotrina, Espiromesifeno, Espino- sad, Rinaxipir, Ciazipir, Espinoteram, Triflumuron, Espirotetramate, Imi- dacloprida, Flubendiamida, Tiodicarb, Metaflumizona, Sulfoxaflor, Ciflu- metofeno, Cianopirafeno, Imidacloprida, Clotianidina, Tiametoxam, Es- pinotoram, Tiodicarb, Flonicamida, Metiocarb, Emamectina-benzoato, Indoxacarb, Fostiazato, Fenamifos, Cadusafos, Piriproxifeno, Fenbuta- tina-óxido, Hexitiazox, Metomil, 4-[[(6-Cloropiridin-3-il)metil]|(2,2-difluo- retil)amino]lfuran-2(5H)-ona; Fungicidas de Frutas/Vegetais: Carbenda- zim, Clorotalonil, EBDCs, Enxofre, Tiofanato metílico, Azoxistrobina, Ci- moxanil, Fluazinam, Fosetil, Iprodiona, Cresoxim metílico, Metalaxil/me- fenoxam, Trifloxistrobina, Etaboxam, Iprovalicarb, Trifloxistrobina, Fene- xamida, Fumarato de oxpoconazol, ciazofamida, Fenamidona, Zoxa- mida, Picoxistrobina, Piraclostrobina, Ciflufenamida, Boscalida; Herbici- das de Cereais: Isoproturon, Bromoxinil, loxinil, Fenóxidos, Clorossulfu- ron, Clodinafop, Diclofop, Diflufenican, Fenoxaprop, Florasulam, Fluoro- xipir, Metsulfuron, Triassulfuron, Flucarbazona, lodossulfuron, Propoxi- carbazona, Picolinafeno, Mesossulfuron, Beflubutamida, Pinoxadeno, Amidossulfuron, Tifensulfuron Metila, Tribenuron, Flupirsulfuron, Sulfos- sulfuron, Pirassulfotol, Piroxsulam, Flufenacet, Tralcoxidim, Piroxassul- fona; Fungicidas de Cereais: Carbendazim, Clorotalonil, Azoxistrobina, Ciproconazol, Ciprodinil, Fenpropimorf, Epoxiconazol, Cresoxim metí- lico, Quinoxifeno, Tebuconazol, Trifloxistrobina, Simeconazol, Picoxis- trobina, Piraclostrobina, Dimoxistrobina, Protioconazol, Fluoxastrobina; Inseticidas de Cereais: Dimetoato, Lambda-cialotrina, Deltametrina, alfa-Cipermetrina, B-ciflutrina, Bifentrina, Imidacloprida, Clotianidina, Ti- ametoxam, Tiacloprida, Acetamiprida, Dinetofurano, Clorpirifos, Meta- midofos, Oxidemeton metílico, Pirimicarb, Metiocarb; Herbicidas de

Mais: Atrazina, Alaclor, Bromoxinil, Acetoclor, Dicamba, Clopiralida, (S- )Dimetenamida, Glufosinato, Glifosato, Isoxaflutol, (S-)Metolaclor, Me- sotriona, Nicossulfuron, Primissulfuron, Rimsulfuron, Sulcotriona, Fo- ramsulfuron, Topramezona, Tembotriona, Saflufenacil, Tiencarbazona, Flufenacet, Piroxassulfona; Inseticidas de Maís: Carbofurano, Clorpiri- fos, Bifentrina, Fipronil, Imidacloprida, Lambda-Cialotrina, Teflutrina, Terbufos, Tiametoxam, Clotianidina, Espiromesifeno, Flubendiamida, Triflumuron, Rinaxipir, Deltametrina, Tiodicarb, B-Ciflutrina, Ciperme- trina, Bifentrina, Lufenuron, Triflumoron, Teflutrina, Tebupirimifos, Eti- prol, Ciazipir, Tiacloprida, Acetamiprida, Dinetofurano, Avermectina, Metiocarb, Espirodiclofeno, Espirotetramate; Fungicidas de Maís: Feni- tropano, Tiram, Protioconazol, Tebuconazol, Trifloxistrobina; Herbicidas de Arroz: Butaclor, Propanil, Azimsulfuron, Bensulfuron, Cialofop, Dai- muron, Fentrazamida, Imazossulfuron, Mefenacet, Oxaziclomefona, Pi- razossulfuron, Piributicarb, Quinclorac, Tiobencarb, Indanofano, Flufe- nacet, Fentrazamida, Halossulfuron, Oxaziclomefona, Benzobiciclon, Piriftalida, Penoxsulam, Bispiribac, Oxadiargil, Etoxissulfuron, Preti- laclor, Mesotriona, Tefuriltriona, Oxadiazona, Fenoxaprop, Pirimissul- fano; Inseticidas de Arroz: Diazinon, Fenitrotiona, Fenobucarb, Mono- crotofos, Benfuracarb, Buprofezina, Dinotefurano, Fipronil, Imidaclo- prida, Isoprocarb, Tiacloprida, Cromafenozida, Tiacloprida, Dinotefu- rano, Clotianidina, Etiprol, Flubendiamida, Rinaxipir, Deltametrina, Ace- tamiprida, Tiametoxam, Ciazipir, Espinosad, Espinotoram, Benzoato de Emamectina, Cipermetrina, Clorpirifos, Cartap, Metamidofos, Etofen- prox, Triazofos, 4-[[(6-Cloropiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan- 2(5H)-ona, Carbofurano, Benfuracarb; Fungicidas de Arroz: Tiofanato metílico, Azoxistrobina, Carpropamida, Edifenfos, Ferimzona, Iproben- fos, Isoprotiolano, Pencicuron, Probenazol, Piroquilon, Triciclazol, Tri- floxistrobina, Diclocimet, Fenoxanil, Simeconazol, Tiadinil; Herbicidas de Algodão: Diuron, Fluometuron, MSMA, Oxifluorfeno, Prometrina, Tri- fluralina, Carfentrazona, Cletodim, Fluazifop-butila, Glifosato, Norflura- zon, Pendimetalina, Piritiobac sódico, Trifloxissulfuron, Tepraloxidim, Glufosinato, Flumioxazina, Tidiazuron; Inseticidas de Algodão: Acefato, Aldicarb, Clorpirifos, Cipermetrina, Deltametrina, Malation, Monocroto- fos, Abamectina, Acetamiprida, Benzoato de Emamectina, Imidaclo- prida, Indoxacarb, Lambda-Cialotrina, Espinosad, Tiodicarb, Gama-Cia- lotrina, Espiromesifeno, Piridalil, Flonicamida, Flubendiamida, Triflumu- ron, Rinaxipir, Beta-Ciflutrina, Espirotetramat, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprida, Dinetofurano, Flubendiamida, Ciazipir, Espinosad, Espino- toram, gama Cialotrinay 4-[[(6-Cloropiridin-3-il)metil|(2,2-difluore- til)aminolfuran-2(5H)-ona, Tiodicarb, Avermectina, Flonicamida, Pirida- lil, Espiromesifeno, Sulfoxaflor, Profenofos, Triazofos, Endossulfano; Fungicidas de Algodão: Etridiazol, Metalaxil, Quintozeno; Herbicidas de Soja: Alaclor, Bentazona, Trifluralina, Clorimuron Etílico, Cloransulam Metílico, Fenoxaprop, Fomesafeno, Fluazifop, Glifosato, Imazamox, Imazaquin, Imazetapir, (S-)Metolaclor, Metribuzina, Pendimetalina, Te- praloxidim, Glufosinato; Inseticidas de Soja: Lambda-cialotrina, Metomil, Paration, Tiocarb, Imidacloprida, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprida, Acetamiprida, Dinetofurano, Flubendiamida, Rinaxipir, Ciazipir, Espino- sad, Espinotoram, Benzoato de Emamectina, Fipronil, Etiprol, Deltame- trina, B-Ciflutrina, gama e lambda Cialotrina, 4-[[(6-Cloropiridin-3-il)me- til|(2,2-difluoretil)amino]lfuran-2(5H)-ona, Espirotetramat, Espinodiclo- feno, Triflumuron, Flonicamida, Tiodicarb, beta-Ciflutrina; Fungicidas de Soja: Azoxistrobina, Ciproconazol, Epoxiconazol, Flutriafol, Piraclostro- bina, Tebuconazol, Trifloxistrobina, Protioconazol, Tetraconazol; Herbi- cidas de Beterraba sacarina: Cloridazon, Desmedifam, Etofumesato, Fenmedifam, Trialato, Clopiralida, Fluazifop, Lenacil, Metamitron, Quin- merac, Cicloxidim, Triflussulfuron, Tepraloxidim, Quizalofop; Inseticidas de Beterraba sacarina: Imidacloprida, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprida,

Acetamiprida, Dinetofurano, Deltametrina, B-Ciflutrina, gama/lambda Ci- alotrina, 4-[[(6-Cloropiridin-3-il) metil]|(2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)- ona, Teflutrina, Rinaxipir, Ciaxipir, Fipronil, Carbofurano; Herbicidas de Canola: Clopiralida, Diclofop, Fluazifop, Glufosinato, Glifosato, Meta- zaclor, Trifluralina Etametsulfuron, Quinmerac, Quizalofop, Cletodim, Tepraloxidim; Fungicidas de Canola: Azoxistrobina, Carbendazim, Flu- dioxonil, Iprodiona, Procloraz, Vinclozolina; Inseticidas de Canola: Or- ganofosfatos de carbofurano, Piretroides, Tiacloprida, Deltametrina, Imi- dacloprida, Clotianidina, Tiametoxam, Acetamiprida, Dinetofurano, B-Ci- flutrina, gama e lambda Cialotrina, tau-Fluvaleriato, Etiprol, Espinosad, Espinotoram, Flubendiamida, Rinaxipir, Ciazipir, 4-[[(6-Cloropiridin-3- il)metil|(2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona. Em algumas modalidades, o herbicida é Atrazina, Bromacil, Diuron, Clorsulfuron, Metsulfuron, Tifensulfuron Metila, Tribenuron, Acetoclor, Dicamba, Isoxaflutol, Nicossulfuron, Rimsulfuron, Piritiobac-sódico, Flu- mioxazina, Clorimuron-Etila, Metribuzina, Quizalofop, S-metolaclor, He- xazina ou combinações dos mesmos.

[0198] Em algumas modalidades, o inseticida é Esfenvalerato, Clo- rantraniliprol, Metomil, Indoxacarb, Oxamil ou combinações dos mes- mos.

[0199] Atividade pesticida e inseticida. "Praga" inclui, mas sem limi- tação, insetos, fungos, bactérias, nematódeos, ácaros, carrapatos e se- melhantes. Pragas de insetos incluem insetos selecionados dentre as ordens Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isop- tera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc., particularmente Lepi- doptera e Coleoptera.

[0200] Os compostos das modalidades exibem atividade contra pra- gas de insetos, que podem incluir pragas agronômicas, florestais, de estufas, viveiros, plantas ornamentais, alimentos e fibras, de saúde pú- blica e animal, de estrutura doméstica e comercial, domésticas e de pro- dutos armazenados de importância econômica.

[0201] Larvas da ordem Lepidóptera incluem, mas sem limitação, lagartas-militares, larvas cortadoras, lagartas falsa-medideiras e lagar- tas da maçâá-do-algodoeiro na família Noctuidae Spodoptera frugiperda JE Smith (lagarta-do-cartucho do milho); S. exigua Húbner (lagarta-mi- litar da beterraba); S. litura Fabricius (lagarta cortadora do tabaco, la- garta-rosca de tabaco); Mamestra configurata Walker (lagarta-militar bertha); M. brassicae Linnaeus (traça do repolho); Agrotis ipsilon Hufna- gel (lagarta-rosca); A. orthogonia Morrison (lagarta-rosca ocidental); A. subterranea Fabricius (lagarta-rosca granulada); Alabama argillacea Húbner (Curuquerê-do-algodoeiro); Trichoplusia ni Húbner (falsa-medi- deira da couve); Pseudoplusia includens Walker (falsa-medideira da soja); Anticarsia gemmatalis Húbner (lagarta-da-soja); Hypena scabra Fabricius (verme-de-trevo verde); Heliothis virescens Fabricius (lagarta da maçã); Pseudaletia unipuncta Haworth (lagarta-militar); Athetis min- dara Barnes e Mcdunnough (lagarta-rosca de pele áspera); Euxoa mes- soria Harris (lagarta-rosca de lado escuro); Earias insulana Boisduval (lagarta capulho espinhosa); E. vittella Fabricius (lagarta capulho ponti- lhada); Helicoverpa armigera Húbner (lagarta capulho americana); H. zea Boddie (lagarta de espiga de milho ou lagarta de capulho de algo- dão); Melanchra picta Harris (lagartas zebra); Egira (Xylomyges) curialis Grote (lagarta-rosca de citrinos); brocas, traça-das-paredes, lagartas cone e esqueletizadores da família Pyralidae Ostrinia nubilalis Húbner (broca de milho europeia); Amyelois transitella Walker (lagarta de la- ranja naval); Anagasta kuehniella Zeller (Traça do trigo mediterrâneo); Cadra cautella Walker (traça-do-cacau); Chilo suppressalis Walker (broca de caule de arroz); C. partellus, (broca de sorgo); Corcyra cepha-

lonica Stainton (traça de arroz); Crambus caliginosellus Clemens (la- garta de rede de raiz de milho); C. teterrellus Zincken (lagarta que tece teia de gramíneas); Cnaphalocrocis medinalis Guenée (traça tortricídea de arroz); Desmia funeralis Húbner (dobrador de folha de uva); Diapha- nia hyalinata Linnaeus (lagarta de melão); D. nitidalis Stoll (lagarta de picles); Diatraea grandiosella Dyar (broca de milho sudoeste), D. sac- charalis Fabricius (broca de cana-de-açúcar); Eoreuma loftini Dyar (broca de arroz mexicano); Ephestia elutella Húbner (traça do tabaco (cacau); Galleria mellonella Linnaeus (traça grande da cera); Herpeto- gramma licarsisalis Walker (lagarta de rede de céspede); Homoeosoma electelum Hulst (traça de girassol); Elasmopalpus lignosellus Zeller (broca-do-colo); Achroia grisella Fabricius (traça da cera); Loxostege sti- cticalis Linnaeus (lagarta de rede de beterraba); Orthaga thyrisalis Wal- ker (mariposa teia da árvore do chá); Maruca testulalis Geyer (broca de feijão); Plodia interpunctella Húbner (Mariposa de refeição Indiana); Scirpophaga incertulas Walker (broca do tronco amarelo); Udea rubiga- lis Guenée (traça do aipo); e lagartas enroladeiras, lagartas de broto, lagartas de semente e lagartas de fruta na família Tortricidae Acleris gloverana Walsingham (lagarta de broto de cabeça preta do oeste); A. variana Fernald (lagarta de broto de cabeça preta do leste); Archips ar- gyrospila Walker (lagarta enroladeira de árvore frutífera); A. rosana Lin- naeus (lagarta enroladeira europeia); e outras espécies Archips, Ado- xophyes orana Fischer von Rósslerstamm (traça tortricídea dos frutos de verão); Cochylis hospes Walsingham (mariposa bandeada de giras- sol); Cydia latiferreana Walsingham (traça da avelaneira); C. pomonella Linnaeus (Bichado das pomoideas); Platynota flavedana Clemens (la- garta enroladeira de folha variegado); P. stultana Walsingham (lagarta enroladeira de folha de onívoro); Lobesia botrana Denis & Schiffermúller (Eudémis); Spilonota ocellana Denis & Schiffermúller (traça vermelha dos gomos); Endopiza viteana Clemens (mariposa de bagas de uva);

Eupoecilia ambiguella Húbner (Cochilis); Bonagota salubricola Meyrick (Lagarta enroladeira da maçã); Grapholita molesta Busck (Traça oriental do pessegueiro); Suleima helianthana Riley (mariposa de broto de gi- rassol); Argyrotaenia spp.; Choristoneura spp..

[0202] Outras pragas agronômicas selecionadas da ordem Lepidop- tera incluem, mas sem limitação, Alsophila pometaria Harris (locustas); Anarsia lineatella Zeller (broca do pêssego); Anisota senatoria J.E. Smith (lagarta de carvalho de listras laranjas); Antheraea pernyi Guérin- Méneville (Traça de Tussah de Carvalho Chinesa); Bombyx mori Lin- naeus (Mariposa-de-seda); Bucculatrix thurberiella Busck (Lagarta mi- neradora das folhas); Colias eurytheme Boisduval (lagarta de alfafa); Datana integerrima Grote & Robinson (lagarta de nogueira); Dendroli- mus sibiricus Tschetwerikov (Mariposa-de-seda siberiana), Ennomos subsignaria Húbner (lagarta de olmo); Erannis tiliaria Harris (mede- palmo de tília); Euproctis chrysorrhoea Linnaeus (mariposa de cauda marrom); Harrisina americana Guérin-Méneville (esqueletizador de fo- lha de uva); Hemileuca oliviae Cockrell (lagarta de faixa); Hyphantria cunea Drury (larva de teias de outono); Keiferia Iycopersicella Walsin- gham (oxiúro de tomate); Lambdina fiscellaria fiscellaria Hulst (lagarta- enroladora de cicuta do leste); L. fiscellaria lugubrosa Hulst (lagarta-en- roladora de cicuta do oeste); Leucoma salicis Linnaeus (mariposa de cetim); Lymantria dispar Linnaeus (mariposa-cigana); Manduca quin- quemaculata Haworth (mariposa falcão de 5 manchas, mandarová de tomate); M. sexta Haworth (mandarová de tomate, mandarová de ta- baco); Operophtera brumata Linnaeus (traça de inverno); Paleacrita ver- nata Peck (lagarta de gangrena de primavera); Papilio cresphontes Cra- mer (larva de borboleta rabo de andorinha gigante); Phryganidia califor- nica Packard (lagarta de carvalho da Califórnia); Phyllocnistis citrella Stainton (minerador de folha de citros); Phyllonorycter blancardella Fa-

bricius (minerador de folha manchado); Pieris brassicae Linnaeus (bor- boleta grande branca); P. rapae Linnaeus (borboleta pequena branca); P. napi Linnaeus (borboleta branca com verde raiado); Platyptilia car- duidactyla Riley (mariposa plumosa de alcachofra); Plutella xylostella Linnaeus (mariposa de costas de diamante); Pectinophora gossypiella Saunders (lagarta coroaulho rosa); Pontia protodice Boisduval e Le- conte (lagarta de repolho do sul); Sabulodes aegrotata Guenée (lagarta enroladora de omnívoros); Schizura concinna J.E. Smith (lagarta arque- ada vermelha); Sitotroga cerealella Olivier (mariposa Angoumois dos cereais); Thaumetopoea pityocampa Schiffermuller (mariposa processi- onária do pinheiro); Tineola bisselliella Hummel (traça doméstica de ris- cas); Tuta absoluta Meyrick (lagarta mineira do tomate); Yoonomeuta padella Linnaeus (mariposa arminho); Heliothis subflexa Guenée; Mala- cosoma spp. e Orgyia spp.

[0203] São de interesse as larvas e os adultos da ordem Coleoptera incluindo gorgulhos das famílias Anthribidae, Bruchidae e Curculionidae (incluindo, mas sem limitação: Anthonomus grandis Boheman (bicudo- do-algodeiro); Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel (gorgulho da água do arroz); Sitophilus granarius Linnaeus (gorgulho do celeiro); S. oryzae Linnaeus (gorgulho do arroz); Hypera punctata Fabricius (gorgulho da folha de trevo); Cylindrocopturus adspersus LeConte (gorgulho do caule de girassol); Smicronyx fulvus LeConte (gorgulho vermelho da semente de girassol); S. sordidus LeConte (gorgulho cinzento da semente de gi- rassol); Sphenophorus maidis Chittenden (gorgulho do maís); besouros- pulga, besouros do pepino, vermes da raiz, besouros da folha, besouros da batata e lagartas mineiras da família Chrysomelidae (incluindo, mas sem limitação: Leptinotarsa decemlineata Say (besouro do Colorado da batata); Diabrotica virgifera virgifera LeConte (verme de raiz do milho ocidental); D. barberi Smith e Lawrence (verme de raiz do milho do norte); D. undecimpunctata howardi Barber (verme de raiz do milho do sul); Chaetocnema pulicaria Melsheimer (besouro-pulga do milho); Phyllotreta cruciferae Goeze (besouro-pulga das crucíferas); Phyllotreta striolata (besouro-pulga listrado); Colaspis brunnea Fabricius (colaspis da uva); Oulema melanopus Linnaeus (besouro da folha de cereal); Zygogramma exclamationis Fabricius (besouro do girassol); besouros da família Coccinellidae (incluindo, mas sem limitação: Epilachna vari- vestis Mulsant (besouro do feijão mexicano)); escaravelhos e outros be- souros da família Scarabaeidae (incluindo, porém, sem limitação: Popi- llia japonica Newman (besouro japonês); Cyclocephala borealis Arrow (escaravelho mascarado do norte, escaravelho branco); C. immaculata Olivier (escaravelho mascarado do sul, escaravelho branco); Rhizotro- gus majalis Razoumowsky (escaravelho europeu); Phyllophaga crinita Burmeister (escaravelho branco); Ligyrus gibbosus De Geer (besouro da cenoura)); besouros de carpete da família Dermestidae; larvas- arame da família Elateridae, Eleodes spp., Melanotus spp.; Conoderus Spp.; Limonius spp.; Agriotes spp.; Ctenicera spp.; Aeolus spp.; besou- ros da casca da família Scolytidae e besouros da família Tenebrionidae.

[0204] Adultos e imaturos da ordem Diptera são de interesse, inclu- indo lagartas mineiras Agromyza parvicornis Loew (lagarta mineira da folha do milho); moscas (incluindo, mas sem limitação: Contarinia sorghicola Coquillett (mosca do sorgo); Mayetiola destructor Say (mosca Hessian); Sitodiplosis mosellana Géhin (mosca do trigo); Neo- lasioptera murtfeldtiana Felt, (mosca da semente do girassol)); moscas dos frutos (Tephritidae), Oscinella frit Linnaeus (moscas dos frutos); ver- mes (incluindo, mas sem limitação: Delia platura Meigen (verme da se- mente do milho); D. coarctata Fallen (mosca do bulbo do trigo) e outras Delia spp., Meromyza americana Fitch (verme do caule do trigo); Musca domestica Linnaeus (moscas domésticas); Fannia canicularis Linnaeus, F. femoralis Stein (moscas menores domésticas); Stomoxys calcitrans

Linnaeus (moscas estáveis)); moscas da face, moscas de corno, mos- cas de sopro, Chrysomya spp.; Phormia spp. e outras pragas de mos- cas, moscas dos cavalos Tabanus Spp.; moscas-varejeiras Gastrophilus spp.; Oestrus spp.; besouros do gado Hypoderma spp.; moscas dos ve- ados Chrysops spp.; Melophagus ovinus Linnaeus (keds) e outras Bra- chycera, mosquitos Aedes spp.; Anopheles spp.; Culex spp.; moscas negras Prosimulium spp.; Simulium spp.; moscas mordedoras, moscas da areia, esciarídeos e outras Nematocera.

[0205] Incluídos como insetos de interesse estão adultos e ninfas das ordens Hemiptera e Homoptera, tais como, mas sem limitação, adelgídeos da família Adelgidae, insetos de planta da família Miridae, cicadas da família Cicadidae, cigarrinhas, Empoasca spp.; da Cicadelli- dae, cigarrinhas de plantas das famílias Cixiidae, Flatidae, Fulgoroidea, Issidae e Delphacidae, cigarrinhas de árvore da família Membracidae, psilídeos da família Psyllidae, moscas-brancas da família Aleyrodidae, afídeos da família Aphididae, filoxera da família Phylloxeridae, cochoni- lhas-farinhentas da família Pseudococcidae, escalas das famílias Aste- rolecanidae, Coccidae, Dactylopiidae, Diaspididae, Eriococcidae Orthe- ziidae, Phoenicococcidae e Margarodidae, percevejo-de-renda da famí- lia Tingidae, percevejos da família Pentatomidae, percevejos-de-cincha, Blissus spp.; e outros percevejos de semente da família Lygaeidae, ci- garrinhas da família Cercopidae, percevejos de polpa da família Corei- dae e percevejos vermelhos e percevejos manchados de algodão da família Pyrrhocoridae.

[0206] Os membros agronomicamente importantes da ordem Ho- moptera incluem adicionalmente, mas sem limitação: Acyrthisiphon pi- sum Harris (afídeo de ervilha); Aphis craccivora Koch (afídeo do feijão- frade); A. fabae Scopoli (afídeo do feijão preto); A. gossypii Glover (afí- deo do algodão, afídeo do melão); A. maidiradicis Forbes (afídeo da raiz de milho); A. pomi De Geer (afídeo da maçã); A. spiraecola Patch (afí- deo de Spiraea); Aulacorthum solani Kaltenbach (afídeo de Dedalis); Chaetosiphon fragaefolii Cockerell (afídeo do morango); Diuraphis noxia Kurdjumov/Mordvilko (afídeo do trigo russo); Dysaphis plantaginea Paa- serini (afídeo cinzento da macieira); Eriosoma lanigerum Hausmann (afídeo lanígero das macieiras); Brevicoryne brassicae Linnaeus (afídeo do repolho); Hyalopterus pruni Geoffroy (afídeo farinhento da ameixa); Lipaphis erysimi Kaltenbach (afídeo do nabo); Metopolophium dirrho- dum Walker (afídeo do cereal); Macrosiphum euphorbiae Thomas (afí- deo da batata); Myzus persicae Sulzer (afídeo do pessegueiro, afídeo verde do pessegueiro); Nasonovia ribisnigri Mosley (afídeo da alface); Pemphigus spp. (afídeos da raiz e afídeos de galha); Rhopalosiphum maidis Fitch (afídeo da folha do milho); R. padi Linnaeus (afídeo-da-ce- rejeira-brava); Schizaphis graminum Rondani (pulgão dos cereais); Sipha flava Forbes (afídeo amarelo da cana-de-açúcar); Sitobion ave- nae Fabricius (afídeo inglês dos grãos); Therioaphis maculata Buckton (afídeo manchado da alfafa); Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe (afídeo preto dos citrinos) e T. citricida Kirkaldy (afídeo marrom dos ci- trinos); Adelges spp. (adelgídeos); Phylloxera devastatrix Pergande (fi- loxera de nogueira-pecã); Bemisia tabaci Gennadius (mosca-branca do tabaco, mosca-branca da batata doce); B. argentifolii Bellows & Perring (mosca-branca da folha de prata); Dialeurodes citri Ashmead (mosca- branca dos citrinos); Trialeurodes abutiloneus (mosca-branca de asa lis- trada) e T. vaporariorum Westwood (mosca-branca de estufa); Empo- asca fabae Harris (cigarrinha da batata); Laodelphax striatellus Fallen (cigarrinha menor marrom); Macrolestes quadrilineatus Forbes (cigarri- nha de áster); Nephotettix cinticeps Uhler (cigarrinha verde); N. nigropi- ctus Stàl (cigarrinha do arroz); Nilaparvata lugens Stàl (cigarrinha mar- rom); Peregrinus maidis Ashmead (cigarrinha do milho); Sogatella furci- fera Horvath (cigarrinha de costas brancas); Sogatodes orizicola Muir

(delfacídeo do arroz); Typhlocyba pomaria McAtee (cigarrinha branca da macieira); Erythroneoura spp. (cigarrinhas da uva); Magicicada sep- tendecim Linnaeus (cigarra periódica); lcerya purchasi Maskell (pulgão branco); Quadraspidiotus perniciosus Comstock (pulgão de São José); Planococcus citri Risso (cochonilha dos citrinos); Pseudococcus spp. (outro complexo de cochonilha); Cacopsylla pyricola Foerster (psilídeo da pera); Trioza diospyri Ashmead (psilídeo do caqui).

[0207] Espécies agronomicamente importantes de interesse da or- dem Hemiptera incluem, mas sem limitação: Acrosternum hilare Say (percevejo verde); Anasa tristis De Geer (escaravelho da abóbora); Blis- sus leucopterus leucopterus Say (escaravelho das gramíneas); Corythuca gossypii Fabricius (escaravelho da renda de algodão); Cyrto- peltis modesta Distant (escaravelho do tomate); Dysdercus suturellus Herrich-Schãffer (percevejo manchador de algodão); Euschistus servus Say (percevejo marrom); E. variolarius Palisot de Beauvois (percevejo manchado); Graptostethus spp. (complexo de escaravelhos de se- mente); Leptoglossus corculus Say (escaravelho de semente de pi- nheiro de pé em folha); Lygus lineolaris Palisot de Beauvois (escarave- lho manchado da planta); L. Hesperus Knight (escaravelho ocidental manchado da planta); L. pratensis Linnaeus (escaravelho comum de prado); L. rugulipennis Poppius (escaravelho europeu manchado da planta); Lygocoris pabulinus Linnaeus (capsídeo verde comum); Nezara viridula Linnaeus (percevejo verde do sul); Oebalus pugnax Fabricius (percevejo do arroz); Oncopeltus fasciatus Dallas (escaravelho grande da asclépia); Pseudatomoscelis seriatus Reuter (pulga do algodão).

[0208] Adicionalmente, modalidades podem ser eficazes contra He- miptera como Calocoris norvegicus Gmelin (escaravelho do morango); Orthops campestris Linnaeus; Plesiocoris rugicollis Fallen (capsídeo da maçã); Cyrtopeltis modestus Distant (escaravelho do tomate); Cyrtopel- tis notatus Distant (mosca); Spanagonicus albofasciatus Reuter (pulga de marca branca); Diaphnocoris chlorionis Say (escaravelho de espi- nheiro-da-Virgínia); Labopidicola alli Knight (escaravelho da planta de cebola); Pseudatomoscelis seriatus Reuter (pulga do algodão); Adel- bhocoris rapidus Say (escaravelho rápido da planta); Poecilocapsus li- neatus Fabricius (escaravelho da planta de quatro linhas); Nysius ericae Schilling (escaravelho falso das gramíneas); Nysius raphanus Howard (escaravelho falso das gramíneas); Nezara viridula Linnaeus (percevejo verde do sul); Eurygaster spp.; Coreidae spp.; Pyrrhocoridae spp.; Tini- dae spp.; Blostomatidae spp.; Reduviidae spp. e Cimicidae spp.

[0209] Também estão incluídos adultos e larvas da ordem Acari (ácaros), como Aceria tosichella Keifer (ácaro do enrolamento do trigo); Petrobia latens Múller (ácaro marrom do trigo); ácaros-aranha e ácaros vermelhos da família Tetranychidae, Panonychus ulmi Koch (ácaro ver- melho europeu); Tetranychus urticae Koch (ácaro-aranha de duas man- chas); (T. medanieli McGregor (ácaro McDaniel); T. cinnabarinus Bois- duval (ácaro-aranha carmim); T. turkestani Ugarov & Nikolski (ácaro- aranha do morango); ácaros planos da família Tenuipalpidae, Brevipal- pus lewisi McGregor (ácaro plano dos citrinos); ácaros da ferrugem e do broto da família Eriophyidae e outros ácaros de alimentação foliar e áca- ros importantes na saúde humana e animal, isto é, os ácaros de poeira da família Epidermoptidae, ácaros do folículo da família Demodicidae, ácaros dos grãos da família Glycyphagidae, carrapatos da ordem /xodi- dae. Ixodes scapularis Say (carrapato de veado); /. holocyclus Neumann (carrapato da paralisia australiana); Dermacentor variabilis Say (carra- pato do cão americano); Amblyomma americanum Linnaeus (carrapato lone star) e ácaros de sarna e coceira das famílias Psoroptidae, Pyemo- tidae e Sarcoptidae.

[0210] Pragas de insetos de interesse incluem a superfamília de percevejos e outros insetos relacionados incluindo, mas sem limitação,

espécies que pertencem à família Pentatomidae (Nezara viridula, Halyo- morpha halys, Piezodorus guildini, Euschistus servus, Acrosternum hi- lare, Euschistus heros, Euschistus tristigmus, Acrosternum hilare, Di- chelops furcatus, Dichelops melacanthus e Bagrada hilaris (escaravelho Bagrada)), a família Plataspidae (Megacopta cribraria - Plataspídeo do feijão) e a família Cydnidae (Scaptocoris castanea - percevejo da raiz) e espécies Lepidoptera incluindo, mas sem limitação: traça-das-crucífe- ras, por exemplo, Helicoverpa zea Boddie; lagarta falsa-medideira, por exemplo, Pseudoplusia includens Walker e lagarta-da-soja, por exem- plo, Anticarsia gemmatalis Húbner.

[0211] Métodos para medir a atividade pesticida incluem, por exem- plo, Czapla e Lang, (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480 a 2485; Andrews, et al., (1988) Biochem. J. 252:199 a 206; Marrone, et al., (1985) J. of Economic Entomology 78:290 a 293 e Patente nº U.S. 5,743,477, todos os quais são incorporados no presente documento a título de referência na sua totalidade. Geralmente, a proteína é misturada e usada em en- saios de alimentação. Consultar, por exemplo Marrone, et a/l., (1985) J. of Economic Entomology 78:290 a 293. Tais ensaios podem incluir co- locar plantas em contato com uma ou mais pragas e determinar a capa- cidade da planta para sobreviver e/ou causar o extermínio das pragas.

[0212] Nematódeos incluem nematódeos parasitários tais como ne- matódeos das galhas radiculares, formadores de cistos, e formadores de lesões, incluindo Heterodera spp., Meloidogyne spp., e Globodera spp.; particularmente membros dos nematódeos formadores de cistos, incluindo, mas não se limitando a, Heterodera glycines (nematódeo for- mador de cistos da soja); Heterodera schachtii (nematódeo formador de cistos da beterraba); Heterodera avenae (nematódeo formador de cistos de cereais); e Globodera rostochiensis e Globodera pailida (nemató- deos formadores de cistos da batata). Os nematódeos formadores de lesões incluem Pratylenchus spp.

[0213] Tratamento de sementes. Para proteger e aprimorar as tec- nologias de produção de rendimento e traço, as opções de tratamento de semente podem fornecer flexibilidade de plano de cultura adicional e controle rentável contra insetos, ervas daninhas e doenças. Material de semente pode ser tratado, tipicamente tratado na superfície, com uma composição que compreende combinações de herbicidas químicos ou biológicos, fitoprotetores herbicidas, inseticidas, fungicidas, inibidores e aprimoradores de germinação, nutrientes, reguladores e ativadores de crescimento de planta, bactericidas, nematocidas, avicidas e/ou molus- cicidas. Estes compostos são tipicamente formulados juntos com trans- portadores, tensoativos ou adjuvantes de promoção de aplicação adici- onais empregues na formulação. Os revestimentos podem ser aplicados impregnando-se o material de propagação com uma formulação líquida ou por revestimento com uma formulação úmida ou seca combinada. Os exemplos dos vários tipos de compostos que podem ser usados como tratamentos de semente são fornecidos em "The Pesticide Ma- nual: A World Compendium", C.D.S. Tomlin Ed., publicado por British Crop Production Council, que é incorporado no presente documento a título de referência.

[0214] Alguns tratamentos de sementes que podem ser usados em sementes de cultura incluem, porém sem limitação, um ou mais dentre ácido abscísico, acibenzolar-S-metila, avermectina, amitrol, azaconazol|, azospirilo, azadiractina, azoxistrobina, Bacilus spp. (incluindo um ou mais dentre as espécies cereus, firmus, megaterium, pumilis, sphaeri- cus, subtilis e/ou thuringiensis), Bradirhizobium spp. (incluindo um ou mais dentre betae, canariense, elkanii, iriomotense, japonicum, liaoni- gense, pachyrhizi e/ou yuanmingense), captana, carboxina, quitosano, clotianidina, cobre, ciazipir, difenoconazol, etidiazol, fipronil, fludioxonil, fluoxastrobina, fluquinconazol, flurazol, fluxofenim, proteína harpina,

imazalil, imidacloprida, ipconazol, isoflavenoides, lipo-quito-oligossaca- rídeo, mancozeb, manganês, maneb, mefenoxam, metalaxil, metcona- zol, miclobutanil, PONB, penflufeno, penicílio, pentiopirad, permetrina, picoxistrobina, protioconazol, piraclostrobina, rinaxipir, S-metolaclor, sa- ponina, sedaxano, TOCMTB, tebuconazol, tiabendazol, tiametoxam, tio- carb, tiram, tolclofos-metila, triadimenol, tricoderma, trifloxistrobina, triti- conazol e/ou zinco. Revestimento de semente PCNB se refere ao Nú- mero de Registro EPA 00293500419, que contém quintozeno e terrazol. TCMTB se refere a 2-(tiocianometiltio)benzotiazol.

[0215] As variedades de sementes e sementes com traços transgê- nicos específicos podem ser testadas para determinar quais as opções de tratamento de sementes e taxas de aplicação podem complementar tais variedades e traços transgênicos a fim de aprimorar o rendimento. Por exemplo, uma variedade com potencial de rendimento satisfatório, mas com suscetibilidade à ferrugem do milho pode se beneficiar do uso de um tratamento de sementes que forneça proteção contra a ferrugem do milho, uma variedade com potencial de rendimento satisfatório mas suscetibilidade a nematódeos formadores de cistos pode se beneficiar do uso de um tratamento de sementes que forneça proteção contra ne- matódeos formadores de cistos, e assim por diante. De modo seme- lhante, uma variedade que abrange um traço transgênico que confere resistência a insetos pode se beneficiar do segundo modo de ação con- ferido pelo tratamento de sementes, uma variedade que abrange um traço transgênico que confere resistência a um herbicida pode se bene- ficiar de um tratamento de sementes com um fitoprotetor que aprimora a resistência de plantas àquele herbicida, etc. Adicionalmente, o esta- belecimento de raízes satisfatórias e a emergência inicial resultantes do uso apropriado de um tratamento de sementes podem resultar em um uso de nitrogênio mais eficiente, uma capacidade melhor para resistir à seca e um aumento geral do potencial de rendimento de uma variedade ou variedades que contêm um certo traço quando combinadas com um tratamento de sementes.

[0216] Métodos para exterminar uma praga de inseto e controlar uma população de insetos. Em algumas modalidades, os métodos são fornecidos para exterminar uma praga de inseto compreendendo colo- car a praga de inseto, seja simultânea seja sequencialmente, em con- tato com uma quantidade eficaz em termos de inseticida de um polipep- tídeo IRDIG35563 recombinante da descrição. Em algumas modalida- des, os métodos são fornecidos para exterminar uma praga de inseto que compreende colocar a praga de inseto em contato com uma quan- tidade eficaz em termos inseticidas de uma proteína pesticida recombi- nante da SEQ ID NO: 2 ou uma respectiva variante.

[0217] Em algumas modalidades, os métodos são fornecidos para controlar uma população de praga de inseto compreendendo colocar a população de praga de inseto, seja simultânea ou sequencialmente, em contato com uma quantidade eficaz em termos de inseticida de um po- lipeptídeo IRDIG35563 recombinante da descrição. Em algumas moda- lidades, os métodos são fornecidos para controlar uma população de praga de inseto compreendendo colocar a população de praga de inseto em contato com uma quantidade eficaz em termos inseticidas de um polipeptídeo IRDIG35563 recombinante da SEQ ID NO: 2 ou uma res- pectiva variante. Conforme usado no presente documento, "controlar uma população de pragas" ou "controla uma praga" se refere a qualquer efeito em uma praga que resulta na limitação do dano que a praga causa. Controlar uma praga inclui, mas sem limitação, exterminar a praga, inibir o desenvolvimento da praga, alterar a fertilidade ou cresci- mento da praga de tal maneira que a praga faça menos danos à planta, diminuir o número de descendentes produzidos, produzir pragas menos adaptadas, produzir pragas mais suscetíveis a ataque de predadores ou impedir as pragas de se alimentarem da planta.

[0218] Em algumas modalidades, os métodos são fornecidos para controlar uma população de praga de inseto resistente a uma proteína pesticida compreendendo colocar a população de praga de inseto, seja simultânea ou sequencialmente, em contato com uma quantidade eficaz em termos de inseticida de um polipeptídeo IRDIG35563 recombinante da descrição. Em algumas modalidades, os métodos são fornecidos para controlar uma população de praga de inseto resistente a uma pro- teína pesticida compreendendo colocar a população de praga de inseto em contato com uma quantidade eficaz em termos inseticidas de um polipeptídeo IRDIG35563 recombinante da SEQ ID NO: 2 ou uma res- pectiva variante.

[0219] Em algumas modalidades, os métodos são fornecidos para proteger uma planta contra uma praga de inseto, compreendendo ex- pressar na planta ou célula da mesma pelo menos um polinucleotídeo recombinante que codifica um polipeptídeo IRDIG35563. Em algumas modalidades, os métodos são fornecidos para proteger uma planta de uma praga de inseto que compreende expressar na planta ou célula da mesma um polinucleotídeo recombinante que codifica o polipeptídeo IR- DIG35563 da SEQ ID NO: 2 ou respectivas variantes.

[0220] Estratégias de gerenciamento de resistência a insetos (IRM). A expressão de ôi-endotoxinas de B. thuringiensis em plantas de milho transgênicas demonstrou ser um meio eficaz para controlar pragas de insetos importantes para a agricultura (Perlak, et a/., 1990; 1993). No entanto, os insetos evoluíram, de modo que se tornaram resistentes a ôd-endotoxinas de B. thuringiensis expressas em plantas transgênicas. Tal resistência, se disseminada, limitará claramente o valor comercial de germoplasma que contém genes codificadores de tais d-endotoxinas de B. thuringiensis.

[0221] Uma maneira para aumentar a eficácia dos inseticidas trans- gênicos contra pragas-alvo e reduzir ao mesmo tempo o desenvolvimento de pragas resistentes a inseticidas é fornecer refúgios (uma seção de cul- turas/milho não inseticidas) não transgênicos (isto é, proteínas não inseti- cidas) para uso com culturas transgênicas que produzem uma proteína inseticida única ativa contra pragas-alvo. A United States Environmental Protection Agency (epa.gov/oppbppdi/biopesticides/pips/bt corn re- fuge 2006.htm, que pode ser acessado com o uso do prefixo www) pu- blica as exigências para o uso com culturas transgênicas que produzem uma única proteína Bt ativa contra pragas-alvo. Além disso, a National Corn Growers Association, em seu sítio da web: (ncga.com/inseto-resis- tência-management-fact-sheet-bt-corn, que pode ser acessado com o uso do prefixo www) também fornece orientação similar em relação a exigências de refúgio. Devido a perdas para insetos dentro da área de refúgio, os refúgios maiores podem reduzir o rendimento geral.

[0222] Outra maneira para aumentar a eficácia dos inseticidas transgênicos contra pragas-alvo e reduzir ao mesmo tempo o desenvol- vimento de pragas resistentes a inseticidas consiste em ter um depósito de genes inseticidas que são eficazes contra grupos de pragas de inse- tos e que manifestam seus efeitos através de modos de ação diferentes.

[0223] A expressão em uma planta de duas ou mais composições inseticidas tóxicas para a mesma espécie de inseto, em que cada inse- ticida é expresso em níveis eficazes, será outra maneira para alcançar o controle do desenvolvimento de resistência. Isso tem base no princípio de que a evolução de resistência contra dois modos separados de ação é muito mais improvável do que contra apenas um. Roush, por exemplo, destaca estratégias com duas toxinas, também chamadas de "formação de pirâmide" ou "empilhamento" para o gerenciamento de culturas transgênicas inseticidas. (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353:1777 a 1786). O empilhamento ou formação de pirâmide de duas proteínas diferentes, cada uma eficaz contra as pragas-alvo e com pouca ou nenhuma resistência cruzada, pode permitir uso de um refúgio menor. A US Environmental Protection Agency exige significati- vamente menos refúgio estruturado (geralmente 5%) de milho não Bt a ser plantado em relação aos produtos de traço único (geralmente 20%). Há várias maneiras para fornecer os efeitos de IRM de um refúgio, in- cluindo vários padrões de plantio geométricos nos campos e misturas de sementes em bolsas, conforme discutido adicionalmente por Roush.

[0224] Em algumas modalidades, os polipeptídeos IRDIG35563 da descrição são úteis como uma estratégia de gerenciamento de resistên- cia de insetos em combinação (por exemplo, em pirâmide) com outras proteínas pesticidas que incluem, mas sem limitação, toxinas Bt, prote- íÍnas inseticidas de Xenorhabdus sp. ou Photorhabdus sp., outras prote- íÍnas ativas como inseticida e semelhantes.

[0225] São fornecidos métodos para controlar infestação (ou infes- tações) de insetos Lepidoptera e/ou Coleoptera em uma planta transgê- nica que promovem gerenciamento de resistência a insetos, que com- preendem expressar na planta pelo menos duas proteínas inseticidas diferentes que têm modos diferentes de ação.

[0226] Em algumas modalidades, os métodos para controlar a in- festação de insetos Lepidópteros e/ou Coleópteros em uma planta transgênica e promover gerenciamento de resistência a insetos compre- endem a apresentação de pelo menos uma das proteínas inseticidas de polipeptídeo IRDIG35563 a insetos na ordem Lepidóptera e/ou Coleóp- tera.

[0227] Em algumas modalidades, os métodos para controlar infes- tação de insetos Lepidópteros e/ou Coleópteros em uma planta trans- gênica e promover gerenciamento de resistência a insetos compreen- dem a apresentação de pelo menos um dos polipeptídeos IRDIG35563 da SEQ ID NO: 2 ou variantes dos mesmos, inseticidas a insetos na ordem Lepidóptera e/ou Coleóptera.

[0228] Em algumas modalidades, os métodos para controlar infes- tação de insetos Lepidópteros e/ou Coleópteros em uma planta trans- gênica e promover gerenciamento de resistência a insetos compreen- dem expressar na planta transgênica um polipeptídeo IRDIG35563 e uma proteína Cry ou outra proteína inseticida para insetos na ordem Lepidóptera e/ou Coleóptera que têm modos diferentes de ação.

[0229] Em algumas modalidades, os métodos para controlar infes- tação de insetos Lepidópteros e/ou Coleópteros em uma planta trans- gênica e promover gerenciamento de resistência a insetos compreen- dem a expressão na planta transgênica de um polipeptídeo IRDIG35563 da SEQ ID NO: 2 ou variantes do mesmo e uma proteína Cry ou outra proteína inseticida para insetos na ordem Lepidóptera e/ou Coleóptera, em que o polipeptídeo IRDIG35563 e a proteína Cry têm diferentes mo- dos de ação.

[0230] Também são fornecidos métodos de redução da probabili- dade de emergência de resistência a insetos Lepidópteros e/ou Coleóp- teros para plantas transgênicas que expressam, nas plantas, as proteí- nas inseticidas para controlar as espécies de inseto, compreendendo a expressão de um polipeptídeo IRDIG35563 inseticida para as espécies de inseto em combinação com uma segunda proteína inseticida para as espécies de inseto que têm diferentes modos de ação.

[0231] Também são fornecidos meios para o gerenciamento de re- sistência a insetos Lepidópteros e/ou Coleópteros eficaz de plantas transgênicas compreendendo coexpressar em altos níveis nas plantas, duas ou mais proteínas inseticidas tóxicas para insetos Lepidópteros e/ou Coleópteros, mas cada uma exibindo um modo diferente de efetuar sua atividade de extermínio, em que as duas ou mais proteínas insetici- das compreendem um polipeptídeo IRDIG35563 e uma proteína Cry. Também são fornecidos meios para o gerenciamento de resistência a insetos Lepidópteros e/ou Coleópteros eficaz de plantas transgênicas compreendendo coexpressar em altos níveis nas plantas, duas ou mais proteínas inseticidas tóxicas para insetos Lepidópteros e/ou Coleópte- ros, sendo que cada uma exibe um modo diferente de efetuar sua ativi- dade de extermínio, em que as duas ou mais proteínas inseticidas com- preendem um polipeptídeo IRDIG35563 da SEQ ID NO: 2 ou variantes do mesmo e uma proteína Cry ou outra proteína ativa como inseticida.

[0232] Além disso, são fornecidos métodos para obter aprovação regulamentar para o plantio ou comercialização de plantas que expres- sam proteínas inseticidas para insetos na ordem Lepidóptera e/ou Co- leóptera, compreendendo a etapa de se referir a, apresentar ou confiar em dados de ligação de ensaio de inseto que mostram que o polipeptí- deo IRDIG35563 não compete com os sítios de ligação para proteínas Cry em tais insetos. Além disso, são fornecidos métodos para obter aprovação regulamentar para o plantio ou a comercialização de plantas que expressam proteínas inseticidas para insetos na ordem Lepidóptera e/ou Coleóptera, compreendendo a etapa de se referir a, apresentar ou confiar em dados de ligação de ensaio de inseto que mostram que o polipeptídeo IRDIG35563 da SEQ ID NO: 2 ou variante da mesma não competem com locais de ligação para proteínas Cry em tais insetos.

[0233] Métodos para aumentar o rendimento de plantas. Os méto- dos compreendem fornecer uma planta ou célula de planta que ex- pressa um polinucleotídeo codificador da sequência de polipeptídeo pesticida revelada no presente documento e cultivar a planta ou uma semente da mesma em um campo infestado com uma praga contra a qual o polipeptídeo tem atividade pesticida. Em algumas modalidades, o polipeptídeo tem atividade pesticida contra uma praga de Lepidópte- ros, Coleópteros, Dípteros, Hemípteros ou nematódeos e o campo é in- festado com uma praga de Lepidópteros, Hemípteros, Coleópteros, Díp- teros ou nematódeos.

[0234] Conforme definido no presente documento, o "rendimento"

da planta se refere à qualidade e/ou quantidade de biomassa produzida pela planta. "Biomassa", conforme usado no presente documento, se refere a qualquer produto de planta medido. Um aumento na produção de biomassa é qualquer melhora no rendimento do produto de planta medido. Aumentar o rendimento de uma planta tem diversas aplicações comerciais. Por exemplo, aumentar a biomassa da folha de planta pode aumentar o rendimento de legumes com folhas para consumo humano ou animal. Adicionalmente, o aumento da biomassa da folha pode ser usado para aumentar a produção de produtos farmacêuticos ou indus- triais derivados de planta. Um aumento do rendimento pode compreen- der qualquer aumento estatisticamente significativo incluindo, mas sem limitação, pelo menos um aumento de 1%, pelo menos um aumento de 3%, pelo menos um aumento de 5%, pelo menos um aumento de 10%, pelo menos um aumento de 20%, pelo menos de 30%, pelo menos de 50%, pelo menos de 70%, pelo menos de 100% ou um aumento maior do rendimento em comparação com uma planta que não expressa a sequência pesticida.

[0235] Em métodos específicos, o rendimento de planta é aumen- tado como resultado de resistência a praga aprimorada de uma planta que expressa um polipeptídeo IRDIG35563 revelado no presente docu- mento. A expressão do polipeptídeo IRDIG35563 resulta em uma capa- cidade reduzida de uma praga infestar ou se alimentar da planta apri- morando, assim, o rendimento da planta.

[0236] Métodos de processamento. São adicionalmente fornecidos métodos para processar uma planta, parte de planta ou semente para se obter um alimento ou produto de alimento de uma planta, parte de planta ou semente que compreende um polinucleotídeo IRDIG35563. As plantas, partes de planta ou sementes fornecidas no presente docu- mento podem ser processadas para render óleo, produtos de proteína e/ou subprodutos que são derivados obtidos por processamento que têm valor comercial. Os exemplos não limitantes incluem sementes transgênicas que compreendem uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo IRDIG35563 que pode ser processado para produzir óleo de soja, produtos de soja e/ou subprodutos de soja.

[0237] “Processar'" se refere a quaisquer métodos físicos e químicos usados para obtenção de qualquer produto de soja e incluem, mas sem limitação, o condicionamento térmico, floculação e trituração, extrusão, extração de solvente ou embebição aquosa e extração de sementes in- teiras ou parciais.

[0238] Quando um inseto contata e ingere uma quantidade eficaz de toxina administrada via expressão em plantas transgênicas, compo- sição(ões) proteicas formuladas, composição(ões) proteicas pulverizá- veis, uma matriz de isca ou outro sistema de administração, os resulta- dos são tipicamente a morte do inseto, ou os insetos não se alimentam da fonte que disponibiliza as toxinas aos insetos.

[0239] Com hospedeiros microbianos adequados, por exemplo, Pseudomonas, os micróbios podem ser aplicados no ambiente da praga, onde irão proliferar e ser ingeridos. O resultado é o controle da praga. Alternativamente, o micróbio que alberga o gene da toxina pode ser tratado sob condições que prolongam a atividade da toxina e esta- bilizam a célula. A célula tratada, que retém a atividade tóxica, pode então ser aplicada no ambiente da praga-alvo.

EXEMPLOS EXEMPLO 1

[0240] Construção de plasmídeos de expressão codificando toxina inseticida IRDIG35563 e expressão em hospedeiros bacterianos. Méto- dos de clonagem padrão foram usados na construção de plasmídeos de expressão de Pseudomonas fluorescens (Pf) manipulados para produ- zirem proteínas IRDIG35563 codificadas por regiões codificadoras oti- mizadas para plantas. Endonucleases de restrição e DNA Ligase de T4 foram obtidos da New England BioLabs (NEB; Ipswich, MA) para diges- tão de restrição e ligação de DNA, respectivamente. Preparações de plasmídeos foram produzidas usando o Kit de Plasmídeos NucleoSpinº (Macherey-Nagel Inc, Bethlehem, PA) seguindo as instruções dos for- necedores para purificação de plasmídeos com baixo número de cópias. Fragmentos de DNA foram purificados usando um Kit de Extração em Gel QIAquickº (Qiagen, Venio, Limburg) após eletroforese em gel de agarose Tris-acetato.

[0241] A estratégia de clonagem básica implicou a subclonagem da sequência codificadora (CDS) da toxina IRDIG35563 (SEQ ID NO:1) em PDOW 1169 nos sítios de restrição Spel e Sall, a qual é colocada sob o controle da expressão do promotor de Ptac e do terminador rrnBT1T2 do plasmídeo pKK223-3 (PL Pharmacia, Milwaukee, WI). pDOW1169 é um plasmídeo com número médio de cópias com a origem da replicação RSF1010, um gene pyrF, e um sítio de ligação do ribossomo prece- dendo os sítios de reconhecimento de enzimas de restrição onde podem ser introduzidos fragmentos de DNA contendo regiões codificadoras de proteína (Pedido US 20080193974). O plasmídeo de expressão, desig- nado pDOW 1169, foi transformado por eletroporação em DC454 (uma cepa de P. fluorescens quase de tipo selvagem tendo mutações delta- pyrF e Isc::laclº), ou seus derivados, recuperado em meio de SOC-Hi- drolisado de soja e plaqueado em meio seletivo (M9 glicose ágar sem uracila, Sambrook et al., supra). Detalhes das manipulações microbio- lógicas estão disponíveis em Squires et a/., (2004), Pedido de Patente US 20060008877, Pedido de Patente US 20080193974 e Pedido de Pa- tente US 20080058262, incorporados aqui a título de referência. Colô- nias foram primeiramente rastreadas por digestão de restrição de DNA plasmídico miniprep. O DNA plasmídico de clones selecionados con- tendo toxina IRDIG35563 foi digerido com quatro enzimas de restrição e a sequência foi verificada para validar adicionalmente a presença do inserto. EXEMPLO 2

[0242] Crescimento e Análise da Expressão em Balões Agitados. À produção de toxina IRDIG35563 para caracterização e bioensaio com insetos foi efetuada com cepas de P. fluorescens cultivadas em balões agitados albergando construtos de expressão (pDOW 1169). Um esto- que em glicerol da cultura de IRDIG35563 (0,5 mL) foi inoculado em 50 mL de meio de produção definido com glicerol 9,5% (Teknova Catálogo No. 3D7426, Hollister, CA). A expressão do gene da toxina IRDIG35563 via o promotor de Ptac foi induzida por adição de isopropil-B-D-1-tioga- lactopiranosídeo (IPTG) após uma incubação inicial de 24 horas a 30ºC com agitação. As culturas foram submetidas à amostragem no momento da indução e em vários momentos pós-indução. A densidade celular foi medida pela densidade óptica a 600 nm (ODçeoo). Também podem ser utilizados outros meios de cultura adequados para o crescimento de Pseudomonas fluorescens, por exemplo, como descrito no Pedido de Patente US 20060008877. EXEMPLO 3

[0243] Transformação de Agrobacterium. Métodos de clonagem pa- drão foram usados na construção de plasmídeos binários de transfor- mação e expressão em plantas. Endonucleases de restrição e DNA Li- gase de T4 foram obtidos da New England Biolabs. Preparações de plasmídeos foram produzidas usando o kit de Preparação de Plasmí- deos NucleoSpinº ou o kit NucleoBondº AX Xtra Midi (ambos da Ma- cherey-Nagel, Duren, Alemanha), seguindo as instruções dos fabrican- tes. Fragmentos de DNA foram purificados usando o Kit de Purificação de PCR QIAquickº ou o Kit de Extração em Gel QIAEX 11º (ambos da Qiagen Venio, Limburg) após isolamento do gel.

[0244] Células eletrocompetentes da cepa de Agrobacterium tume- faciens Z707S (um derivado resistente a estreptomicina de 2707;

Hepburn et a/., 1985) foram preparadas e transformadas usando eletro- poração (Weigel e Glazebrook, 2002). Após a eletroporação, 1 mL de caldo de Extrato de Levedura Peptona (YEP) (10 g/L de extrato de leve- dura, 10 g/L de peptona e 5 g/L de NaCl) foi adicionado à cubeta e a suspensão de células-YEP foi transferida para um tubo de cultura de 15 mL para incubação a 28ºC em um banho de água com agitação cons- tante durante 4 horas. As células foram plaqueadas em YEP mais ágar (25 g/L) com espectinomicina (200 ug/mL) e estreptomicina (250 ug/mL) e as placas foram incubadas durante 2-4 dias a 28ºC. Colônias isoladas bem separadas foram selecionadas e inoculadas em placas de YEP + ágar frescas com espectinomicina e estreptomicina como descrito acima, e incubadas a 28ºC durante 1-3 dias.

[0245] A presença do inserto do gene IRDIG35563 no vetor binário de transformação de plantas foi verificada por análise de PCR usando iniciadores específicos para o vetor com DNA plasmídico modelo pre- parado a partir de colônias selecionadas de Agrobacterium. O pélete celular de uma alíquota de 4 mL de uma cultura de 15 mL durante a noite cultivada em YEP com espectinomicina e estreptomicina como an- teriormente foi extraído usando Spinº Mini Preps da Qiagen (Venlo, Lim- burg, Países baixos), realizado seguindo as instruções do fabricante. DNA plasmídico do vetor binário usado na transformação por eletropo- ração de Agrobacterium foi incluído como controle. A reação de PCR foi completada usando DNA polimerase Taq da Invitrogen (Carlsbad, CA) seguindo as instruções do fabricante a concentrações 0,5X. As reações de PCR foram realizadas em um Aparelho de Aplicação de Ciclos Tér- micos MJ Research Peltier programado com as seguintes condições: Etapa 1) 94ºC durante 3 minutos; Etapa 2) 94ºC durante 45 segundos; Etapa 3) 55ºC durante 30 segundos; Etapa 4) 72ºC durante 1 minuto por kb de comprimento de produto esperado; Etapa 5) 29 vezes para o Etapa 2; Etapa 6) 72ºC durante 10 minutos. A reação foi mantida a 4ºC após a aplicação dos ciclos. Os produtos de amplificação foram anali- sados por eletroforese em gel de agarose (por exemplo, agarose 0,7% até 1%, p/v) e visualizados por coloração com brometo de etídio. Foi selecionada uma colônia cujo produto de PCR foi idêntico ao controle de plasmídeo. EXEMPLO 4

[0246] Purificação de IRDIG35563. Células Pf recolhidas contendo IRDIG35563 foram sonicadas em tampão de lise consistindo em Tris 50 mM (pH 8,0), NaCl 1 M, glicerol 10% e EDTA 2 mM com 50 uL de Co- quetel de Inibidores de Proteases (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) por 25 mL de tampão. O extrato foi centrifugado a 20 000 x g durante 40 minu- tos. A proteína solúvel presente no sobrenadante foi precipitada com sulfato de amônio 50% e centrifugada a 20 000 x g durante 30 minutos. O pélete foi ressuspenso em Tris 50 mM (pH 8,0) e centrifugado a 20 000 x g durante 20 minutos para peletizar qualquer material solúvel. O sobrenadante contendo IRDIG35563 foi purificado por cromatografia de troca aniônica usando uma coluna HiTrap*" Q HP de 5 mL com um sis- tema de cromatografia AKTA Purifier (GE Healthcare, RU). A coluna foi equilibrada em Tris 50 mM (pH 8,0), e proteínas eluíram com um gradi- ente em etapas até NaCl 1 M. Frações contendo proteína foram combi- nadas e concentradas usando Dispositivos de Filtração Centrífuga Ami- con€ Ultra-15 com um corte de peso molecular ("'MWCO") de 30 K (EMD Millipore, Burlington, MA). A amostra de proteína IRDIG35563 foi dialisada durante a noite contra Tris 50 mM (pH 8,0), e concentrações de proteína total foram medidas com Espectrofotômetro NanoDrop 2000C (Thermo Scientific, Waltham, MA), usando o método A280. EXEMPLO 5

[0247] Eletroforese em gel. Análise de SDS-PAGE foi realizada usando Géis de Proteína Bis-Tris NUPAGEG NovexO 4-12% (Thermo Scientific, Waltham, MA). Proteínas foram diluídas 4X em Tampão de

Amostras NuUPAGEGO LDS (Thermo Scientific, Waltham, MA) contendo TCEP 100 mM antes da carga no gel. Dez uL de Padrão de Proteína Pré-corado NovexO Sharp foram carregados em uma via de cada gel. Os géis foram processados em tampão de processamento NUPAGEO MES SDS de acordo com as recomendações do fabricante e corados com SimplyBlue'Y SafeStain (Thermo Scientific, Waltham, MA), então descoloridos em água e submetidos a imagiologia em um dispositivo de varredura de leito plano. A preparação de proteína final exibiu uma única banda de proteína migrando a um peso molecular aparente de cerca de 88 kDa. EXEMPLO 6

[0248] Preparação de amostras e bioensaios. Preparações purifica- das de IRDIG35563 foram diluídas apropriadamente em Tris 50 MM, pH 8, e todos os bioensaios continham um tratamento de controle consis- tindo neste tampão, que serviu de verificação de fundo quanto à morta- lidade e/ou inibição do crescimento. As concentrações de proteína no tampão do bioensaio foram estimadas com o Espectrofotômetro Nano- Drop 2000C (Thermo Scientific, Waltham, MA), usando o método A280.

[0249] As proteínas purificadas foram testadas quanto à atividade inseticida em bioensaios conduzidos com larvas Lepidópteras neonatais com 1-2 dias de idade em dieta artificial de insetos. Larvas de BAW, SAW, FAW, rFAW, CEW, TBW, SBL, VBC e CBW eclodiram de ovos obtidos de uma colônia mantida por um insetário comercial (Benzon Re- search Inc., Carlisle, PA). Larvas de rFAW eclodiram de ovos obtidos de colônias registradas (Dow AgroSciences LLC, Indianapolis, IN).

[0250] Os bioensaios foram conduzidos em tabuleiros de plástico de 128 poços especificamente planejados para bioensaios com insetos (C-D International, Pitman, NJ). Cada poço continha 2,0 mL de dieta de Lepidópteros Multiespécies (Southland Products, Lake Village, AR). Uma alíquota de 40 ul de amostra de proteína foi aplicada por pipeta sobre a superfície da dieta de 2,0 cm? de cada poço (20 uL/cm?). As concentrações da dieta foram calculadas como a quantidade (ng) de proteína IRDIG35563 por centímetro quadrado (cm?) da área superficial do poço. Foi usado um intervalo de concentrações de 9 doses desde 9 000 até 3 ng/cm? com 16 larvas testadas por dose. Bioensaios com He- licoverpa armigera usaram 7 concentrações diferentes de pró-toxinas purificadas, com um controle só de tampão. A mortalidade e a paragem foram avaliadas passados 7 dias a 25ºC com condições de luz:escuri- dão 16:8. Os tabuleiros tratados foram mantidos em uma capela até o líquido sobre a superfície da dieta ter evaporado ou ter sido absorvido na dieta.

[0251] Em um período de 24-48 horas da eclosão, larvas individuais foram recolhidas com um pincel umedecido de pelo de camelo e depo- sitadas sobre a dieta tratada, uma larva por poço. Os poços infestados foram então selados com folhas adesivas de plástico transparente e ventilados para permitir a troca de gás (C-D International, Pitman, NJ). Os tabuleiros do bioensaio foram mantidos sob condições ambientais controladas (28ºC, -60% de Umidade Relativa, 16:8 [Luz:Escuridão]) durante 5 dias, após o que foi registrado o número total de insetos ex- postos a cada amostra de proteína, o número de insetos mortos, e o peso de insetos sobreviventes.

[0252] O Gls5o foi determinado como sendo a concentração de pro- teína IRDIG35563 na dieta à qual o valor GI foi 50%. A concentração letal em 50% (LCs5o) foi registrada como a concentração de proteína IR- DIG35563 na dieta à qual 50% dos insetos de teste foram mortos. Cur- vas de resposta à concentração inibidora do crescimento foram deter- minadas usando um software logístico não linear de 3 parâmetros atra- vés de JMP Pro, versão 9.0.3, (SAS Institute Inc., Cary, NC). Curvas de resposta à concentração letal foram analisadas por análises Probit (Fin- ney, 1971) dos dados reunidos da mortalidade e foram conduzidas usando POLO-PC (LeOra Software). A Tabela 2 mostra a eficácia de IRDIG35563 purificado contra múltiplas espécies de insetos testadas no bioensaio de sobreposição de dieta artificial (ng/cm?). Tabela 2 Inseto-Alvo % mortalidade | Mortalidade prática cone jemontem rFAW (resistente a EXEMPLO 7 Produção de proteínas inseticidas de Bt IRDIG35563 e variantes em plantas dicotiledôneas.

[0253] Transformação de Arabidopsis. Arabidopsis thaliana Col-01 foi transformado usando o método de imersão floral (Weigel e Glaze- brook, 2002). A colônia de Agrobacterium selecionada foi usada para inocular culturas de 1 mL até 15 mL de caldo YEP contendo antibióticos apropriados para seleção. A cultura foi incubada durante a noite a 28ºC com agitação constante a 220 rpm. Cada cultura foi usada para inocular duas culturas de 500 mL de caldo YEP contendo antibióticos apropria- dos para seleção e as novas culturas foram incubadas durante a noite a 28ºC com agitação constante. As células foram peletizadas a aproxi- madamente 8700 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente e o sobrenadante resultante foi descartado. O pélete celular foi suavemente ressuspenso em 500 mL de meio de infiltração contendo: 1/2x sais de Murashige e Skoog (Sigma-Aldrich)/vitaminas B5 de Gamborg (Gold Bi- oTechnology, St. Louis, MO), sacarose 10% (p/v), benzilaminopurina 0,044 UM (10 uL/L de estoque de 1 mg/mL em DMSO) e 300 uL/L de Silwet L-77. Plantas com aproximadamente 1 mês de idade foram imer- sas no meio durante 15 segundos, tendo o cuidado de assegurar sub- mersão da inflorescência mais nova. As plantas foram então dispostas sobre seus lados e cobertas (transparente ou opaco) durante 24 horas, lavadas com água, e colocadas na vertical. As plantas foram cultivadas a 22ºC, com um fotoperíodo de 16:8 luz:escuridão. Aproximadamente 4 semanas após a imersão, as sementes foram recolhidas.

[0254] Crescimento e Seleção de Arabidopsis. Semente T1 reco- lhida fresca foi deixada secar durante pelo menos 7 dias à temperatura ambiente na presença de dessecativo. A semente foi suspensa em uma solução de ágar/água 0,1% (Sigma-Aldrich) e então estratificada a 4ºC durante 2 dias. Para preparar o plantio, uma Mistura Sunshine LP5 (Sun Gro Horticulture Inc., Bellevue, WA) em tabuleiros de germinação de 26,67 cm x 53,34 cm (10,5 polegadas x 21 polegadas) (T.O. Plastics Inc., Clearwater, MN) foi coberta com vermiculita fina, subirrigada com solução de Hoagland (Hoagland e Arnon, 1950) até ficar úmida, então deixada drenar durante 24 horas. A semente estratificada foi semeada na vermiculita e coberta com cúpulas de umidade (KORD Products, Bra- malea, Ontário, Canadá) durante 7 dias. As sementes foram germina- das e as plantas foram cultivadas em um Conviron (Modelos CMP4030 ou CMP3244; Controlled Environments Limited, Winnipeg, Manitoba, Canadá) sob condições de dias longos (fotoperíodo de 16:8 luz:escuri- dão) a uma intensidade de luz de 120-150 umol/m?s sob temperatura (22ºC) e umidade (40-50%) constantes. As plantas foram inicialmente regadas com solução de Hoagland e subsequentemente com água de- sionizada para manter o solo úmido, mas não molhado.

[0255] As cúpulas foram removidas 5-6 dias após a semeadura e plantas foram pulverizadas com um agente de seleção químico para matar plantas germinadas a partir de sementes não transformadas. Por exemplo, se o marcador selecionável expressável em plantas proporci- onado pelo vetor binário de transformação de plantas for um gene pat ou bar (Wehrmann et a/., 1996), as plantas transformadas podem ser selecionadas por pulverização com uma solução 1000X de Finale (glu- fosinato de amônio 5,78%, Farnam Companies Inc., Phoenix, AZ.). Duas pulverizações subsequentes foram realizadas em intervalos de 5- 7 dias. As sobreviventes (plantas crescendo ativamente) foram identifi- cadas 7-10 dias após a pulverização final e foram transplantadas para vasos preparados com Mistura Sunshine LP5. As plantas transplanta- das foram cobertas com uma cúpula de umidade durante 3-4 dias e co- locadas em um Conviron sob as condições de crescimento acima men- cionadas.

[0256] Os peritos na técnica da transformação de plantas dicotile- dôneas entenderão que outros métodos de seleção de plantas transfor- madas estão disponíveis quando são usados outros genes marcadores selecionáveis expressáveis em plantas (por exemplo, genes de tolerân- cia a herbicidas). A Tabela 3 mostra os resultados (pontuação média (EPM)) do bioensaio de T1 de Arabidopsis contra CEW, FAW, SAW, TBW e SBL. Cinco eventos foram gerados para cada construto e a pon- tuação média dos danos foliares (5 punções em folhas/evento, 5 dias após a infestação) foi registrada 5 semanas após a germinação. O pla- nejamento dos construtos e numeração são relatados na Tabela 4.

Tabela 3 means pm | nto | em | emo | ex | PDAB134633 (0,22) (0,19) (0,15) (0,21) (0,19) 0,11 IRDIG35563 : : : : 0,30 PDAB134635

ESPSFPSPNSEIPA 0,11 PDAB134636

ESSPSFPSPNSEIPA Controle Pos Vip3Ab1 (0,01) 0,1 (0) (0,06) 0,1 (0) 0,1 (0) Controle Neg Col-o 1(0) (0,07) (0,08) (0,04) (0,03) Tabela 4 Agro Vetor com AtUbi10 :: IRDIG35563.2 :: AtUbi1O + ZC21 + PDAB134633 CsVMV :: DSM2 :: Orf1 Agro Vetor com AtUbi3 :: IRDIG35563.2 :: AtUbi3 + ZC21 + CSVMV PDAB134634 :: DSM2 :: Orf1 Agro Vetor com AtAct2 :: IRDIG35563.2 :: AtAct2 + ZC21 + CSVMV PDAB134635 :: DSM2 :: Orf1 Agro Vetor com GmCAB :: IRDIG35563.2 :: GmMCAB + ZC21 + PDAB134636 CsVMV :: DSM2 :: Orf1 EXEMPLO 8 Glycine max Transgênica Compreendendo IRDIG35563.

[0257] Dez a 20 plantas To Glycine max transgênicas albergando vetores de expressão para ácidos nucleicos compreendendo IR- DIG35563 são geradas, por exemplo, por transformação mediada por Agrobacterium. Sementes maduras de soja (Glycine max) são esterili- zadas durante a noite com cloro gasoso durante dezesseis horas. Após a esterilização com cloro gasoso, as sementes são colocadas em um recipiente aberto em uma capela LAMINAR'Y para dissipar o cloro ga- soso. A seguir, as sementes esterilizadas são embebidas com H2O es- terilizada por dezesseis horas no escuro com o uso de uma caixa negra a 24ºC.

[0258] Preparação de sojas de semente dividida. A semente de soja dividida que compreende uma porção de um protocolo de eixo geomé- trico embrionário necessita de preparação de material de semente de soja que é cortada longitudinalmente, com o uso de uma lâmina n.º 10 afixada a um bisturi, juntamente com o hilo da semente para separar e remover o revestimento de semente, e dividir a semente em duas se- ções de cotilédone. Uma atenção cuidadosa é tida para remover parci- almente o eixo geométrico embrionário, em que cerca de 1/2 a 1/3 do eixo geométrico embrionário permanecem fixados à extremidade nodal do cotilédone.

[0259] Inoculação. As sementes de soja divididas que compreen- dem uma porção parcial do eixo geométrico embrionário são então imer- sas durante cerca de 30 minutos em uma solução de Agrobacterium tumefaciens (por exemplo, cepa EHA 101 ou EHA 105) que contém plasmídeo binário que compreende IRDIG35563. A solução de Agrobacterium tumefaciens é diluída para uma concentração final de A=0,6 ODss5o antes de imergir os cotilédones que compreendem o eixo geométrico embrionário.

[0260] Cocultivo. Após a inoculação, é permitido que a semente de soja dividida se cocultive com a cepa de Agrobacterium tumefaciens por dias em meio de cocultivo (Wang, Kan. Agrobacterium Protocols. 2. 1. New Jersey: Humana Press, 2006. Print.) em uma placa de Petri coberta com um pedaço de papel de filtro.

[0261] Indução de broto. Após 5 dias de cocultivo, as sementes de soja divididas são lavadas em meio de Indução de Brotos (SI) líquido que consiste em sais B5, vitaminas B5, agente Ferroso 28 mg/L, Na2zEDTA 38 mg/L, sacarose 30 g/L, MES 0,6 g/L, BAP 1,11 mg/L, TI- MENTINTY 100 mg/L, cefotaxima 200 mg/L e vancomicina 50 mg/L (pH 5,7). As sementes de soja divididas são então cultivadas em meio de

Indução de Brotos | (SI |) que consiste em sais B5, vitaminas B5, ágar Noble 7 g/L, agente Ferroso 28 mg/L, Na2EDTA 38 mg/L, sacarose 30 g/L, MES 0,6 g/L, BAP 1,11 mg/L, TIMENTINTY 50 mg/L, cefotaxima 200 mg/L, vancomicina 50 mg/L (pH 5,7), com o lado plano do cotilédone voltado para cima e a extremidade nodal do cotilédone embebida no meio. Após 2 semanas de cultura, os explantes da semente de soja di- vidida transformada são transferidos para o meio de Indução de Brotos II (SI 11) que contém meio SI | suplementado com glufosinato 6 mg/L (LIBERTY).

[0262] Alongamento de broto. Após 2 semanas de cultura em meio SI 1l, os cotilédones são removidos dos explantes e um bloco de broto nivelado que contém o eixo geométrico embrionário é excisado reali- zando-se um corte na base do cotilédone. O bloco de broto isolado do cotilédone é transferido para o meio de Alongamento de Brotos (SE). O meio SE consiste em sais de MS, agente Ferroso 28 mg/L, Na2EDTA 38 mg/L, sacarose 30 g/L e MES 0,6 g/L, asparagina 50 mg/L, ácido L- piroglutâmico 100 mg/L, IAA 0,1 mg/L, GA3 0,5 mg/L, ribosídeo de zea- tina 1 mg/L, TIMENTINTY 50 mg/L, cefotaxima 200 mg/L, vancomicina 50 mg/L, glufosinato 6 mg/L, ágar Noble 7 g/L (pH 5,7). As culturas são transferidas para meio SE fresco a cada 2 semanas. AS CULTURAS SÃO CULTIVADAS EM UMA CÂMARA DE CRESCIMENTO CONVI- RONTY a 24ºC com um fotoperíodo de 18 h a uma intensidade da luz de 80-90 umol/m?s.

[0263] Formação de raiz. Os brotos alongados que se desenvolve- ram do bloco de broto de cotilédone são isolados cortando-se o broto alongado na base do bloco de broto de cotilédone, e imergindo-se o broto alongado em IBA (Ácido indol-3-butírico) 1 mg/L por 1 a 3 minutos para promover o enraizamento. A seguir, os brotos alongados são trans- feridos para o meio de enraizamento (sais MS, vitaminas B5, agente Ferroso 28 mg/L, Na2EDTA 38 mg/L, sacarose 20 g/L e MES 0,59 g/L,

asparagina 50 mg/L, ácido L-piroglutâmico 100 mg/L, ágar Noble 7 g/L, pH 5,6) em tabuleiros Phytatray.

[0264] Cultivo. Após a cultura em uma câmara de cultivo CONVI- RONTY a 24ºC, fotoperíodo de 18 h, por 1 a 2 semanas, os brotos que desenvolveram raízes são transferidos para uma mistura de solo em um copo de sundae coberto e colocados em uma câmara de cultivo CON- VIRONTY (modelos CMP4030 e CMP3244, Controlled Environments Li- mited, Winnipeg, Manitoba, Canadá) sob condições de dia longo (16 ho- ras de luz/8 horas de escuro) a uma intensidade de luz de 120 a 150 pmol/m?s sob temperatura (22ºC) e umidade (40 a 50%) constantes para aclimatização de plântulas. As plântulas enraizadas são aclimati- zadas em copos de sundae por diversas semanas antes de serem trans- feridas para a estufa para aclimatização adicional e estabelecimento de plantas de soja transgênicas robustas.

[0265] As características de desenvolvimento e morfológicas das |li- nhagens transgênicas são comparadas com as de plantas não transfor- madas. As características de raiz, broto, folhagem e reprodução das plantas são comparadas. As características de brotos de plantas, como altura, números e tamanhos de folha, tempo de florescimento, tamanho floral e aparência são registradas. Em geral não há diferenças morfoló- gicas observáveis entre linhagens transgênicas e aquelas sem expres- são de proteínas DIG quando cultivadas in vitro e em solo na estufa. EXEMPLO 9

[0266] Bioensaios de TO: Cinco eventos de soja foram gerados para cada construto e a pontuação média dos danos foliares (5 punções em folhas/evento, 5 dias após a infestação) foi registrada 5 semanas após a germinação. O planejamento dos construtos e numeração são relata- dos na Tabela 4. A Tabela 5 mostra os resultados do bioensaio de TO de soja contra CEW, FAW, SAW, TBW e SBL. A escala de gradação de danos foliares utiliza um sistema de pontuação de 1 até 9, com 1 repre- sentando 88-100% de danos.

Soja transgênica desregulada, Conkesta, foi usada como controle positivo.

Uma linhagem de soja não transgênica foi usada como controle negativo.

Os resultados para aqueles eventos nos quais foi detectável proteína são apresentados na Tabela 5. Outros even- tos de teste produziram resultados inconclusivos, os quais se acredita se- rem devido a condições experimentais sentidas durante o transporte.

À Tabela 6 apresenta a escala de danos representada na Tabela 5. Tabela 5 Caracteris-

Evento tica (RE) CBW | CEW SBL | TBW | vBC | Controle negativo | Negativa 1 o | | der a | 2 | Controle positivo | Posta 1 e e jo dz e | o e | | Controle positivo | Posta 1 o o o je e | o o | | Controle positivo | Posta = a jo o o je o | o o | | Controle positivo | Posta a = o o o jo lo | o o |

TaA6asterasa | Ana 7 Je | 7a ja e 4 e

T346aaIÇana | AmBo e a e a de e o le

Ta46aamOnDas | AmBo es 7a ja e 4 e

TaaSaaITOÇÇta | AmBTO | 5 je e jo jor | 9 |5 |º | Tabela 6

Escala de danos Percentagem de danos LL EE ETs

EXEMPLO 10 Produção de IRDIG35563

[0267] Transformação de Maís Mediada por Agrobacterium. Se- mentes de um cruzamento High Il ou B-104 F; (Armstrong et a/l., 1991) foram plantadas em vasos de 5 galões contendo uma mistura de 95% de meio de crescimento sem solo Metro-Mix 360 (Sun Gro Horticulture, Bellevue, WA) e 5% de solo barro-argiloso. As plantas foram cultivadas em uma estufa usando uma combinação de lâmpadas de sódio a alta pressão e haleto metálico com um fotoperíodo de 16:8 horas de luz:es- curidão. Para obtenção de embriões F2 imaturos para transformação, polinizações controladas de sementes endogâmicas foram realizadas. Embriões imaturos foram isolados aos 8-10 dias pós-polinização quando os embriões tinham aproximadamente 1,0 até 2,0 mm de tama- nho.

[0268] Infeção e cocultivo Espigas de maís foram esterilizadas na superfície esfregando com sabão líquido, imergindo em etanol 70% du- rante 2 minutos, e então imergindo em lixívia comercial 20% (hipoclorito de sódio 0,1%) durante 30 minutos antes de serem enxaguadas com água esterilizada. Uma suspensão de células de Agrobacterium con- tendo um vetor superbinário foi preparada por transferência 1-2 alças calibradas de bactérias cultivadas em meio YEP sólido contendo 100 mg/L de espectinomicina, 10 mg/L de tetraciclina, e 250 mg/L de estrep- tomicina a 28ºC durante 2-3 dias para 5 mL de meio de infecção líquido (Meio LS Basal (Linsmaier e Skoog, 1965), vitaminas N6 (Chu et al, 1975), 1,5 mg/L de Ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), 68,5 g/L de sacarose, 36,0 g/L de glicose, L-prolina 6 MM, pH 5,2) contendo acetos- siringona 100 UM. A solução foi submetida a vórtice até ser alcançada uma suspensão uniforme e a concentração foi ajustada para uma den- sidade final de cerca de 200 unidades Klett, usando um colorímetro Klett-Summerson com um filtro púrpura, ou uma densidade óptica de aproximadamente 0,4 a 550 nm. Embriões imaturos foram isolados di- retamente para um tubo de microcentrifugação contendo 2 mL do meio de infecção. O meio foi removido e substituído por 1 mL da solução de Agrobacterium com uma densidade de 200 unidades Klett, e a solução de Agrobacterium e embriões foi incubada durante 5 minutos à tempe- ratura ambiente e então transferida para o meio de cocultivo (Meio LS Basal (contendo vitaminas N6, 1,5 mg/L de 2,4-D, 30,0 g/L de sacarose, L-prolina 6 mM, 0,85 mg/L de AgNO;, acetossiringona 100 UM, e 3,0 g/L de goma Gelano (PhytoTechnology Laboratories, Lenexa, KS), pH 5,8) durante 5 dias a 25ºC sob condições de escuridão.

[0269] Após o cocultivo, os embriões foram transferidos para meio seletivo após o que se obtiveram isolados transformados ao longo de aproximadamente 8 semanas. Para seleção dos tecidos de mais trans- formados com um plasmídeo superbinário contendo um gene marcador selecionável pat ou bar expressável em plantas, um meio à base de LS (meio LS Basal, com 1X vitaminas N6, 1,5 mg/L de 2,4-D, 0,5 g/L de MES (ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico mono-hidratado; Phyto- Technology Laboratories, Lenexa, KS), 30,0 g/L de sacarose, L-prolina 6 mM, 1,0 mg/L de AgNO;, 250 mg/L de cefotaxima, 2,5 g/L de goma Gelano, pH 5,7) foi usado com Bialafos (Gold BioTechnology, St. Louis, MO). Os embriões foram transferidos para o meio de seleção contendo 3 mg/L de Bialafos até serem obtidos isolados embriogênicos. Os isola- dos recuperados foram acumulados transferindo-os para um meio de seleção fresco em intervalos de 2 semanas para regeneração e análise adicional. Os peritos na técnica da transformação de maís entenderão que outros métodos de seleção de plantas transformadas estão dispo- níveis quando são usados outros genes marcadores selecionáveis ex- pressáveis em plantas (por exemplo, genes de tolerância a herbicidas).

[0270] Três construtos de IRDIG35563 contidos nos plasmídeos PDAB134672, pDAB134673, e pDAB134674 foram transformados em mais (Tabela 7). Plantas TO foram regeneradas e testadas quanto à sua capacidade de controlar pragas de insetos-alvo. Tabela 7

[0271] Um corte foliar de 2,54 X 1,27 cm (1,0 X 0,5 polegada) qua- drados(as) foi recolhido em duplicado da folha V3 ou V4 de plantas transgênicas To V5. Para cada teste, tecidos foliares de planta de tipo selvagem foram submetidos a amostragem em primeiro lugar para evi- tar contaminação cruzada de toxinas de Bt nas bordas das folhas, se- guido das plantas transformadas. Em cada poço de tabuleiros do bioen- saio (tabuleiros de 32 poços e tampas, CD International, Pitman, NJ), 1 corte foliar foi colocado sobre água-ágar 2% (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) e este foi replicado 2 vezes por espécie de inseto, por evento e por construto.

[0272] Cada poço foi infestado com dez neonatais de FAW (24-48 h de idade) e selado com uma tampa de plástico perfurada para permitir a troca de ar. Os tabuleiros foram colocados a 28ºC (16:8 h luz:escuri- dão, 40% UR) e passados 3 dias foram classificados quanto à percen- tagem de danos foliares. Os dados da percentagem de danos foliares foram analisados com ANOVA e separações médias com o teste de Tukey-Kramer quando as variâncias são homogêneas usando JMPº Pro

9.0.1 (2010 SAS Institute Inc., Cary, NC). Os resultados dos danos foli- ares de FAW em maís TO expressando IRDIG35563 são apresentados na Tabela 8.

Tabela 8. sms er ass eso ds er as EXEMPLO 11

[0273] Regeneração e produção de sementes. Para a regeneração, as culturas são transferidas para um meio de indução "28" (sais e vita- minas MS, 30 g/L de sacarose, 5 mg/L de Benzilaminopurina, 0,25 mg/L de 2,4-D, 3 mg/L de Bialafos, 250 mg/L de cefotaxima, 2,5 g/L de goma Gelano, pH 5,7) durante 1 semana sob condições de pouca luz (14 Em ?s), então 1 semana sob condições de muita luz (aproximadamente 89 pEm?s”). Os tecidos são subsequentemente transferidos para um meio de regeneração "36" (igual ao meio de indução com a exceção de falta- rem reguladores do crescimento de planta). Plântulas com 3-5 cm de comprimento são transferidas para tubos de cultura de vidro contendo um meio SHGA (sais e vitaminas de Schenk e Hildebrandt (1972); PhytoTechnology Laboratories, Lenexa, KS), 1,0 g/L de mio-inositol, 10 g/L de sacarose e 2,0 g/L de goma Gelano, pH 5,8) para permitir o cres- cimento e desenvolvimento adicionais do broto e raízes. As plantas são transplantadas para a mesma mistura de solo descrita anteriormente aqui e cultivadas até ao florescimento na estufa. São conduzidas polini- zações controladas para a produção de sementes. EXEMPLO 12

[0274] Planejamento de uma versão otimizada para plantas da se- quência codificadora de IRDIG35563. Uma sequência de DNA tendo uma preferência de códons para plantas foi planejada e sintetizada para produzir a proteína IRDIG35563 em plantas transgênicas monocotiledô- neas e dicotiledôneas.

Uma tabela de uso de códons para maís (Zea mays L.) foi calculada a partir de 706 sequências codificadoras (CDs) de proteína obtidas de sequências depositadas no GenBank.

Tabelas de uso de códons para tabaco (Nicotiana tabacum, 1268 CDs), colza (Brassica napus, 530 CDs), algodão (Gossypium hirsutum, 197 CDs), e soja (Glycine max; cerca de 1000 CDs) foram descarregadas de dados do website http://www.kazusa.or.jp/codon/. Um conjunto de códons pre- ferenciais que compreende códons altamente usados comuns a conjun- tos de dados de mais e dicotiledôneas, em quantidades relativas médias pesadas apropriadas, foi calculado após omitir qualquer códon redundante usado menos do que cerca de 10% dos usos totais de códons para esse aminoácido em qualquer um dos tipos de plantas.

Para derivar uma se- quência otimizada para plantas codificando a proteína IRDIG35563, substituições de códons na sequência de DNA de IRDIG35563 experi- mentalmente determinada foram efetuadas de modo que a sequência de DNA resultante tenha a composição global de códons da tabela de preferência de códons otimizada para plantas.

Foram efetuados refina- mentos adicionais da sequência para eliminar sítios de reconhecimento de enzimas de restrição indesejáveis, sítios potenciais de encadea- mento de íntrons de plantas, extensões longas de resíduos A/T ou C/G, e outros motivos que pudessem interferir na estabilidade, transcrição, ou tradução da região codificadora do RNA em células de planta.

Foram efetuadas outras alterações para introduzir sítios de reconhecimento de enzimas de restrição desejados, e para eliminar Quadros de Leitura Abertos internos longos (quadros diferentes de +1). Todas estas altera- ções foram efetuadas dentro das restrições de reter a composição de có- dons preferencial para plantas.

A síntese da sequência designada foi efe- tuada por uma empresa comercial (DNA2.0, Menlo Park, CA). Diretrizes adicionais respeitantes à produção de genes sintéticos podem ser encon- tradas, por exemplo, em WO 97/13402 e Patente US No. 5380831.

[0275] Uma sequência de DNA rica em GC otimizada para maís co- dificando IRDIG35563 é apresentada na SEQ ID NO:3. Uma sequência de DNA otimizada para dicotiledôneas codificando IRDIG35563 com- pleto é revelada como SEQ ID NO:4.

[0276] A hibridação de DNA imobilizado em transferências Southern com sondas específicas para genes etiquetados de modo radioativo pode ser efetuada por métodos padrão (Sambrook et al., supra.). Isóto- pos radioativos usados para etiquetar sondas polinucleotídicas podem incluir 32P, 33P, *C ou *H. A incorporação de isótopos radioativos em moléculas de sondas polinucleotídicas pode ser efetuada por quaisquer de vários métodos bem conhecidos dos peritos no domínio da biologia molecular (Ver, por exemplo, Sambrook et al., supra). Em geral, a hibri- dação e lavagens subsequentes podem ser efetuadas sob condições estringentes que permitem a detecção de sequências-alvo com homo- logia com os genes codificadores de toxina reivindicados. Para sondas de genes de DNA de fita dupla, a hibridação pode ser realizada durante a noite a 20ºC até 25ºC abaixo da Tr; do híbrido de DNA em 6X SSPE, 5X Solução de Denhardt, SDS 0,1%, 0,1 mg/mL de DNA desnaturado [20X SSPE é NaCl 3 M, NaHPO, 0,2 M, e EDTA (sal de sódio do ácido etilenodiaminotetracético) 0,02 M; 100X Solução de Denhardt é 20 g/L de Polivinilpirrolidona, 20 g/L de Ficoll de tipo 400 e 20 g/L de BSA (fra- ção V)].

[0277] As lavagens podem ser tipicamente efetuadas do seguinte modo: a. Duas vezes à temperatura ambiente durante 15 minutos em 1X SSPE, SDS 0,1% (lavagem de baixa estringência).

b. Uma vez a 20ºC abaixo da temperatura T; durante 15 mi- nutos em 0,2X SSPE, SDS 0,1% (lavagem de estringência moderada).

[0278] Para sondas oligonucleotídicas, a hibridação pode ser efetu- ada durante a noite a 10ºC até 20ºC abaixo da Tr do híbrido em 6X SSPE, 5X solução de Denhardt, SDS 0,1%, 0,1 mg/mL de DNA desna- turado. A Tr; para sondas oligonucleotídicas pode ser determinada pela seguinte fórmula (Suggs et a/., 1981). Tr: (ºC ) = 2(número de pares de bases T/A) + 4 (número de pares de bases G/C)

[0279] As lavagens podem ser tipicamente efetuadas do seguinte modo: a. Duas vezes à temperatura ambiente durante 15 minutos em 1X SSPE, SDS 0,1% (lavagem de baixa estringência).

b. Uma vez à temperatura de hibridação durante 15 minutos em 1X SSPE, SDS 0,1% (lavagem de estringência moderada).

[0280] Moléculas de sonda para hibridação e moléculas híbridas formadas entre a sonda e as moléculas-alvo podem ser tornadas detec- táveis por meios diferentes de etiquetagem radioativa. É pretendido que tais métodos alternativos estejam dentro do escopo desta invenção. EXEMPLO 13

[0281] Transformação de Espécies de Cultura Adicionais. Algodão é transformado com IRDIG35563 (com ou sem um peptídeo de trânsito de cloroplasto) para proporcionar controle de pragas de insetos utili- zando-se um método conhecido por aqueles versados na técnica, por exemplo, substancialmente as mesmas técnicas anteriormente descri- tas no Exemplo 14 da Patente nº U.S. 7,838,733 ou Exemplo 12 da Pu- blicação de Patente Internacional PCT n.º WO 2007/053482.

[0282] Embora a presente descrição possa ser suscetível a várias modificações e formas alternativas, as modalidades específicas foram descritas a título de exemplo em detalhes no presente documento. En- tretanto, deve ser entendido que a presente descrição não deve ser des- tinada a ser limitada às formas particulares reveladas. Em vez disso, a presente descrição deve cobrir todas as modificações, equivalentes, e alternativas dentro do escopo da presente descrição, conforme definido pelas reivindicações anexas a seguir e seus equivalentes legais.

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Claims (15)

REIVINDICAÇÕES

1. Construto de ácido nucleico recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais elementos reguladores hete- rólogos que acionam a expressão de uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência polipeptídica da SEQ ID NO: 2.

2. Construto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácido nucleico é escolhida do grupo consistindo em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4.

3. Toxina quimérica inseticida, caracterizado pelo fato de que compreende os resíduos 1 até 789 da SEQ ID NO:2.

4. Toxina quimérica inseticida, de acordo com a reivindica- ção 3, caracterizado pelo fato de que consiste em SEQ ID NO:2

5. Planta ou parte de planta, caracterizado pelo fato de que compreende um construto de ácido nucleico, como definido na reivindi- cação 1.

6. Planta ou parte de planta, caracterizado pelo fato de que compreende um construto de ácido nucleico, como definido na reivindi- cação 2.

7. Parte de planta, de acordo com a reivindicação 5, carac- terizado pelo fato de que a parte de planta é uma semente.

8. Parte de planta, de acordo com a reivindicação 6, carac- terizado pelo fato de que a parte de planta é uma semente.

9. Planta ou parte de planta, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o construto de ácido nucleico codifica uma toxina quimérica tendo atividade inseticida contra um ou mais inse- tos selecionados de Spodoptera exigua (Lagarta-militar da beterraba, BAW), Spodoptera eridania (Lagarta-militar do Sul, SAW), Spodoptera frugiperda (Lagarta-do-cartucho do milho, FAW), Spodoptera frugiperda resistente (Lagarta-do-cartucho do milho, FAW), Helicoverpa zea (La- garta-da-espiga-do-milho, CEW), Pseudoplusia includens (Lagarta falsa medideira, SBL), Anticarsia gemmatalis (Lagarta-da-soja, VBC), Heli- othis virescens (Lagarta-da-maçã, TBW) e Helicoverpa armigera (La- garta do capulho do algodoeiro, CBW).

10. Planta ou parte de planta, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o construto de ácido nucleico codifica uma toxina quimérica tendo atividade inseticida contra um ou mais inse- tos selecionados de Spodoptera exigua (Lagarta-militar da beterraba, BAW), Spodoptera eridania (Lagarta militar do Sul, SAW), Spodoptera frugiperda (Lagarta-do-cartucho do milho, FAW), Spodoptera frugiperda resistente (rLagarta-do-cartucho do milho, rFAW), Helicoverpa zea (La- garta-da-espiga-do-milho, CEW), Pseudoplusia includens (Lagarta falsa medideira, SBL), Anticarsia gemmatalis (Lagarta-da-soja, VBC), Heli- othis virescens (Lagarta-da-maçã, TBW) e Helicoverpa armigera (La- garta do capulho do algodoeiro, CBW).

11. Método para controlar insetos suscetíveis, caracterizado pelo fato de que compreende contatar o referido inseto com uma quan- tidade eficaz de uma toxina, como definida na reivindicação 3.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a toxina é a SEQ ID NO:2.

13. Método para controlar uma população de praga de inse- tos, caracterizado pelo fato de que compreende contatar a referida po- pulação de praga com uma quantidade eficaz em termos inseticidas de uma toxina, como definida na reivindicação 3.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a população de praga de insetos é selecionada de Spodoptera exigua (Lagarta-militar da beterraba, BAW), Spodoptera eri- dania (Lagarta militar do Sul, SAW), Spodoptera frugiperda (Lagarta-do- cartucho do milho, FAW), Lagarta-do-cartucho do milho resistente a

Cry1F, Helicoverpa zea (Lagarta-da-espiga-do-milho, CEW), Pseudo- Plusia includens (Lagarta falsa medideira, SBL), Anticarsia gemmatalis (Lagarta-da-soja, VBC), Heliothis virescens (Lagarta-da-maçã, TBW) e Helicoverpa armigera (Lagarta do capulho do algodoeiro, CBW).

15. Método para produzir uma planta resistente a insetos ou tolerante a insetos, caracterizado pelo fato de que compreende cruzar uma planta não transgênica com uma planta transgênica compreen- dendo um construto, como definido na reivindicação 1, incorporado de modo estável no genoma da planta, e selecionar progênie compreen- dendo o construto de DNA, como definido na reivindicação 1.