CN111344411A - 嵌合杀昆虫蛋白 - Google Patents

Abstract

公开了IRDIG35563植物性杀昆虫毒素、编码所述毒素的多核苷酸、所述毒素控制有害生物的用途以及产生所述毒素的转基因植物。本发明包括IRDIG35563变体、片段和类似物。

Description

嵌合杀昆虫蛋白

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年9月26日提交的美国临时申请号62/563,228的优先权，该临时申请通过引用以其全文结合在此。

以电子方式提交的序列表的引用

所述序列表的官方副本经由EFS-Web作为ASCII格式的序列表以电子方式提交，文件名为“80144_WO_PCT_Sequence_Listing_ST25”，创建于2018年9月25日，且具有17千字节大小，并与本说明书同时提交。包含在所述ASCII格式的文件中的序列表是本说明书的一部分并且通过引用以其整体并入本文。

技术领域

本发明总体上涉及分子生物学领域。更具体地，本发明涉及从苏云金芽孢杆菌中发现的植物性杀昆虫蛋白毒素产生的新的杀昆虫蛋白毒素及其在控制昆虫中的用途。

背景技术

昆虫和其他有害生物每年在作物损失和将这些有害生物处于防控下的费用方面花费农民数十亿美元。除田间作物损失外，昆虫有害生物还对蔬菜和水果种植者、观赏花卉生产者以及家庭园丁造成负担。在农业生产环境中由昆虫有害生物造成的损失包括作物减产，作物质量下降和收获成本增加。

昆虫有害生物主要通过大量施用化学杀有害生物剂来控制，所述化学杀有害生物剂通过抑制昆虫生长，防止昆虫摄食或繁殖或引起死亡而具有活性。因此可以达到良好的昆虫控制，但是这些化学物质有时还会影响其他有益的昆虫。广泛使用化学杀有害生物剂引起的另一个问题是出现抗性昆虫群体。通过各种抗性管理措施已部分缓解了这种情况，但是对替代性有害生物防治剂的需求日益增加。诸如表达杀有害生物毒素(如δ-内毒素)的苏云金芽孢杆菌(Bt)菌株的生物有害生物防治剂也已用于作物，效果令人满意，可替代或补充化学杀有害生物剂。已分离出编码其中一些δ-内毒素的基因，并已证明它们在异源宿主中的表达为控制经济上重要的昆虫有害生物提供了另一种工具。特别地，诸如苏云金芽孢杆菌δ-内毒素的杀昆虫毒素在转基因植物中的表达提供了对抗所选昆虫有害生物的有效保护，并且表达这种毒素的转基因植物已经被商业化，从而允许农民减少化学昆虫防治剂的应用。

土壤微生物苏云金芽孢杆菌是革兰氏阳性的、产孢细菌，其特征在于伴胞结晶蛋白包涵体。苏云金芽孢杆菌仍然是用于开发掺入植物的杀有害生物剂的新型杀昆虫蛋白的主要来源。在北美玉蜀黍抗昆虫市场中，草地贪夜蛾(秋夜蛾“FAW”)、欧洲玉米螟(欧洲玉米钻孔虫“ECB”)和谷实夜蛾(玉米穗虫“CEW”)是主要的驱动性有害生物，尽管其他地区存在其他主要的昆虫有害生物(例如棉铃虫蛾(棉螟蛉“CBW”或玉米穗虫“CEW”))以及其他次要但重要的昆虫有害生物物种。Bt毒素占市售生物杀昆虫剂产品的90％以上，并且基本上是已被开发出提供昆虫摄食抗性的转基因作物的全部基因来源。Bt细菌产生杀昆虫性δ-内毒素，包括晶体(Cry)、细胞毒素(Cyt)和植物性杀昆虫蛋白(VIP)毒素，这取决于它们的基因和蛋白质结构而定。Cry毒素在芽孢形成过程中以不溶性结晶蛋白的形式产生。另一方面，VIP毒素在Bt细菌生长的营养阶段期间以可溶性蛋白产生。VIP蛋白在结构上不同于Cry蛋白，但与Cry毒素具有共同的特性，即作为作用于位于昆虫中肠中的细胞的成孔剂。VIP蛋白的分类以前是基于它们的靶昆虫类型。当前使用的命名法是基于氨基酸序列同源性而非昆虫特异性来系统地将VIP基因分类。Crickmore,N.,Baum,J.,Bravo,A.,Lereclus,D.,Narva,K.,Sampson,K.,Schnepf,E.,Sun,M.和Zeigler,D.R.“Bacillus thuringiensistoxin nomenclature[苏云金芽孢杆菌毒素命名法]”(2016)；http://www.btnomenclature.info/；和http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html。

继续使用化学和生物试剂来控制昆虫有害生物增加了昆虫对这种控制措施产生抗性的机会。而且，生物防治剂的高选择性通常导致每种试剂仅控制少数特定昆虫有害生物。尽管抗ECB的转基因玉米取得了成功，但抗性昆虫群体发展的可能性威胁了Cry蛋白在ECB控制中的长期耐久性，并创造了发现和开发新的Cry或其他类型的生物防治剂来控制ECB和其他有害生物的需求。

仍然需要发现和开发新的有效的有害生物防治剂，其为农民提供经济利益并且是环境可接受的。特别需要靶向广谱的经济上重要的昆虫有害生物的防治剂，这些防治剂有效地控制对现有昆虫防治剂具有抗性或会变得具有抗性的昆虫群体，并且与当前防治剂相比具有相同或更高效力。

发明内容

本发明提供了杀昆虫性嵌合VIP毒素(包括命名为IRDIG35563(SEQ ID NO:2)的蛋白毒素，该蛋白毒素是基于VIP3Ab1的前613个氨基酸残基和另一种VIP毒素(IRDIG35563的变体)的C末端部分构建的)，编码这些嵌合毒素的核酸，使用这些毒素控制有害生物的方法，在转基因宿主细胞中产生这些毒素的方法以及表达这些毒素的转基因植物。本发明进一步提供了重组核酸构建体，其包含一个或多个驱动编码SEQ ID NO:2的核酸序列和选自由SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，和SEQ ID NO:4组成的组的核酸序列表达的异源调节元件。在另一个实施例中，本发明提供了核酸构建体，其包含编码IRDIG35563嵌合昆虫毒素的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作地连接至一个或多个调节区如启动子，所述调节区不是源自Bt并且能够在宿主细胞，优选植物细胞中驱动表达。本发明包括包含SEQ ID NO:2的残基1至789的杀昆虫性嵌合毒素，以及包含这种核酸构建体的植物或植物部分。本发明进一步提供了植物或植物部分，其中嵌合毒素对选自由以下组成的组的昆虫具有杀昆虫活性：甜菜夜蛾(甜菜粘虫，BAW)、亚热带粘虫(南方夜蛾，SAW)、草地贪夜蛾(秋夜蛾，FAW)、抗Cry1F的草地贪夜蛾(rFall夜蛾，rFAW)、谷实夜蛾(玉米穗虫，CEW)、大豆夜蛾(大豆尺蠖，SBL)、黎豆夜蛾(绒毛豆毛虫，VBC)、烟芽夜蛾(烟青虫，TBW)和棉铃虫(棉螟蛉，CBW)。本发明还提供了一种用于控制易感昆虫的方法，其包括使所述昆虫的肠道与有效量的所公开的嵌合毒素接触，以及一种用于控制昆虫有害生物群体的方法，其包括使所述有害生物群体的个体的肠道与杀昆虫有效量的所公开的嵌合毒素接触。还提供了一种产生昆虫抗性或昆虫耐受性植物的方法，其包括用包含稳定地在植物基因组引入中公开的DNA构建体的转基因植物育种非转基因植物，并选择含有所公开的核酸构建体的后代。

序列说明

SEQ ID NO:1是编码IRDIG35563的嵌合DNA序列。

SEQ ID NO:2是IRDIG35563的嵌合蛋白毒素序列。

SEQ ID NO:3是编码IRDIG35563的玉蜀黍优化的高GC含量的DNA序列。

SEQ ID NO:4是编码IRDIG35563的大豆最偏好的密码子优化的DNA序列。

具体实施方式

定义

如本文所用的，单数形式“一个/种(a/an)”以及“所述(the)”包括复数个指示物，除非上下文中另有明确指明。因此，例如，提及“细胞”包括多个此类细胞，并且提及“蛋白质”包括提及一种或多种蛋白及其等同物，等等。本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义，除非另有明确说明。

本文所用的“足够相同”是指，使用标准参数、使用本文所述的比对程序之一，与参比序列相比，具有至少约40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

如本文所用，术语“蛋白质”、“肽分子”或“多肽”包括发生修饰的那些分子，所述修饰包括翻译后修饰，如但不限于二硫键形成、糖基化、磷酸化或寡聚化。

术语“氨基酸”和“多种氨基酸”是指所有天然存在的L-氨基酸。

在本文中使用“保留杀昆虫活性”来指具有全长IRDIG35563多肽的至少约10％、至少约30％、至少约50％、至少约70％、80％、90％、95％或更高的杀昆虫活性的多肽。

“片段”或“生物活性部分”包括包含与IRDIG35563多肽足够相同并具有杀昆虫活性的氨基酸序列的多肽片段和编码所述片段的多核苷酸。IRDIG35563多肽的“片段”或“生物活性部分”包括如下片段，所述片段包含与列于本公开的IRDIG35563多肽中所示的氨基酸序列充分相同的氨基酸序列，其中所述多肽具有杀昆虫活性。

本文使用的“分离的”核酸分子(或DNA)是指不再处于其自然环境中并且已经通过人工置于不同环境中(例如在体外)的核酸序列(或DNA)。本文所用的“重组的”核酸分子(或DNA)是指在重组细菌或植物宿主细胞中的核酸序列(或DNA)。在一些实施例中，“分离的”或“重组的”核酸不含有在源自核酸的生物体的基因组DNA中天然地位于所述核酸侧翼的序列(即，位于所述核酸的5′和3′端的序列)(优选编码蛋白质的序列)。

本文所用的“连续核苷酸”是指彼此紧邻的核苷酸残基。

如本文所用的，非基因组核酸序列、非基因组核酸分子或非基因组多核苷酸是指与天然或基因组核酸序列相比，具有核酸序列的一个或多个改变的核酸分子。在一些实施例中，天然或基因组核酸分子的改变包括但不限于：由于遗传密码的简并性造成的核酸序列改变；用于在植物中表达的核酸序列的优化；与天然或基因组序列相比，引入至少一个氨基酸取代、插入、缺失和/或添加的核酸序列的改变；缺失与所述基因组核酸序列相关的一个或多个上游或下游调节区；插入一个或多个异源上游或下游调节区；缺失与所述基因组核酸序列相关的5’和/或3’非翻译区；插入异源5’和/或3’非翻译区；和聚腺苷酸化位点的修饰。在一些实施例中，所述非基因组核酸分子是合成的核酸序列。

本发明提供了杀昆虫蛋白毒素和递送所述毒素的方法，所述毒素对于许多昆虫目，尤其是鳞翅目昆虫在功能上具有活性且有效。“功能活性”，“功能性”“杀昆虫的”或“针对......的活性”是指所述蛋白质作为口服活性毒素或昆虫防控剂是功能性的，所述蛋白质具有毒性作用，或者能够破坏或阻止昆虫生长或进食。当昆虫摄食有效量的通过转基因植物表达、一种或多种配制的蛋白质组合物、一种或多种可喷雾的蛋白质组合物、诱饵基质或其他递送系统递送的本发明毒素时，结果通常是昆虫死亡、抑制昆虫生长或繁殖、或防止昆虫进食使毒素可供昆虫获得的源头，优选地转基因植物。本发明的功能蛋白还可以一起或单独起作用以增强或改善一种或多种其他毒素蛋白的活性。术语“毒性的”，“毒性”或“毒素”意在传达主题毒素具有如本文所定义的功能活性。

优选使摄食昆虫完全致死，但不是实现功能活性所需的。如果昆虫避开毒素或停止摄食，这种避开在某些应用中将是有用的，即使效果是亚致死性或致死性是延迟的或间接的。例如，如果需要昆虫抗性转基因植物，则昆虫不愿摄食植物与对昆虫的致命毒性一样是有用的，因为最终目的是避免昆虫诱导的植物损害。

使用细菌分离物的各种菌株，我们发明了新型嵌合毒素，这些毒素对意想不到的大量商业上重要的昆虫有害生物具有活性。我们在此描述了新的嵌合VIP毒素的发明，所述嵌合VIP毒素具有意想不到的广谱杀昆虫活性，包括对甜菜夜蛾(甜菜粘虫，BAW)、亚热带粘虫(南方夜蛾，SAW)、草地贪夜蛾(秋夜蛾，FAW)和对去调节的掺入植物的保护剂具有抗性的FAW、谷实夜蛾(玉米穗虫，CEW)、大豆夜蛾(大豆尺蠖，SBL)、黎豆夜蛾(绒毛豆毛虫，VBC)、烟芽夜蛾(烟青虫，TBW)和棉铃虫(棉螟蛉，CBW)具有杀昆虫活性。

已经描述了称为VIP3的一类杀昆虫蛋白。参见，例如，Estruch等人(1996,Proc.Natl.Acad.Sci.[美国科学院院报]93:5389-5394)和Yu等人(1997,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]63:532-536)。VIP3基因编码约88kDa的蛋白质，这些蛋白质在生长的营养阶段由Bt表达。据报道，这些毒素与形成晶体的δ-内毒素不同。对称为VIP1A(a)、VIP1A(b)、VIP2A(a)、VIP2A(b)、VIP3A(a)和VIP3A(b)的VIP毒素的提及在文献中是已知的。关于VIP蛋白的作用机制和截短的讨论，也可参见Lee等人,AEM第69卷,第8期(2003年8月),第4648-4657页。

VIP3A蛋白毒素对许多鳞翅目有害生物具有杀昆虫活性，所述鳞翅目有害生物包括FAW、CEW、小地老虎(小地蚕“BCW”)和烟芽夜蛾(烟青虫“TBW”)。最近，已发现VIP蛋白对某些物种的半翅类昆虫有害生物具有毒性((Nanasaheb,P.等人,Toxins(Basel)[毒素(巴塞尔)]第4卷,第6期(2012年6月),第405-429页,Sattar S.和Maiti M.K.,J.Microbiol.Biotechnol.[微生物与生物技术杂志]2011,21:937-946)。因此，VIP类蛋白质毒素显示出独特的杀昆虫活性谱。其他公开WO 98/18932、WO 99/33991、WO 98/00546和WO 99/57282现已鉴定出VIP3类蛋白质的同源物。

IRDIG35563多肽及其变体和片段。通过组合VIP3Ab1的N末端613个氨基酸和IRDIG10870(又名DIG740)的C末端176个氨基酸，产生一种基于VIP的新颖的嵌合杀昆虫蛋白IRDIG35563。由于遗传密码的冗余性，因此多种不同的核酸序列可以编码本文公开的氨基酸序列。一旦已知氨基酸序列，则产生编码相同或基本相同毒素的这些替代核酸序列完全在本领域技术人员的技术范围内。

IRDIG35563毒素的昆虫活性变体也在本文中描述，并且被统称为IRDIG35563昆虫毒素或IRDIG35563变体，并且包括具有添加到N末端截短的N末端Met残基的截短形式。IRDIG35563变体是基于SEQ ID NO:2定义的。对于全长毒素，与SEQ ID NO:2相差不超过5％的保留活性的保守氨基酸取代在本发明的范围内。

在一些实施例中，IRDIG35563多肽相比于SEQ ID NO:2具有至少约40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，以及具有其氨基酸取代、缺失、插入、片段及其组合。在本文中与序列同一性百分比一起使用时，术语“约”意指+/-0.5％。考虑到氨基酸相似性等，可以适当地调整这些值以确定蛋白质的相应同源性。

在一些实施例中，所述序列同一性针对IRDIG35563多肽的全长序列。

在一些实施例中，IRDIG35563多肽的片段包含与本公开的IRDIG35563多肽中列出的氨基酸序列足够相同的氨基酸序列，其中所述多肽具有杀昆虫活性。此类生物活性部分可以通过重组技术制备并评价杀昆虫活性。在一些实施例中，IRDIG35563多肽保留了针对鳞翅目物种的杀昆虫活性。在一些实施例中，杀昆虫活性是针对选自BAW、SAW、FAW、rFAW、CEW、TBW、SBL、VBC和CBW的一种或多种昆虫有害生物。

在一些实施例中，多肽片段是通过以下各项进行的来自N-末端和/或C-末端的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或更多个氨基酸的N-末端和/或C-末端截短：通过蛋白水解、通过在编码多肽片段的序列中插入起始密码子、通过缺失编码缺失的氨基酸的密码子并同时插入起始密码子、和/或插入终止密码子。

在一些实施例中，IRDIG35563多肽片段是来自SEQ ID NO:2的IRDIG35563多肽的N-末端的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个氨基酸的N-末端截短。

在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:2的IRDIG35563多肽，IRDIG35563多肽片段是来自N-末端和/或C-末端的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或更多个氨基酸的N-末端和/或C-末端截短。

在一些实施例中，IRDIG35563多肽包含与SEQ ID NO:2的IRDIG35563多肽的氨基酸序列具有至少约40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列，其中所述IRDIG35563多肽具有杀昆虫活性。

IRDIG35563的一个令人惊讶的特性是，发现它对FAW群体具有活性，所述群体已对某些Cry毒素，特别是Cry1F产生了抗性。因此，IRDIG35563毒素是控制和预防抗性鳞翅目有害生物群体的理想候选者。IRDIG35563毒素的另一个令人惊讶的特性是它们对许多鳞翅目作物有害生物具有广谱活性。这些嵌合毒素的另一个令人惊讶的特性是它们对鳞翅目物种的活性，这些鳞翅目物种既是玉蜀黍又是大豆的有害生物，包括BAW、SAW、FAW、rFAW、CEW、TBW、SBL、VBC和CBW。

IRDIG35563毒素和杀昆虫活性变体。除了SEQ ID NO:2的全长IRDIG35563毒素之外，本发明还包括SEQ ID NO:2的杀昆虫活性变体。对于术语变体，申请人打算包括某些缺失，取代和插入突变体。IRDIG35563片段是在SEQ ID NO:2中发现的小于全长IRDIG35563氨基酸序列并且具有杀昆虫特性的任何蛋白质序列。IRDIG35563变体片段也被认为是本发明的一部分，并且被定义为IRDIG35563的片段，其包含本文所述的某些缺失，取代和插入突变体，并且具有杀昆虫活性。

通过进行有限数量的氨基酸缺失、取代或添加而产生的IRDIG35563变体。对SEQID NO:2的氨基酸序列进行的氨基酸缺失、取代和添加可以容易地以顺序方式进行，并且这种变化对杀昆虫活性的影响可以通过生物测定来测试。本发明还包括SEQ ID NO:2的杀昆虫活性变体，其中已经进行了多达39个保守的独立氨基酸取代。

可以通过DNA中的突变来制备IRDIG35563多肽的氨基酸序列变体。这还可以通过若干种诱变形式之一和/或在定向进化中来完成。

在一些方面，在所述氨基酸序列中所编码的改变将基本上不影响所述蛋白质的功能。此类变体将具有所需杀有害生物活性。然而，应当理解，可以在本公开的组合物上使用这些技术来改进IRDIG35563多肽赋予杀有害生物活性的能力。

在一些实施例中，例如在许多细胞表达系统中通过甲硫氨酸氨基肽酶将IRDIG35563多肽的翻译起始子甲硫氨酸在翻译后切除。

可以通过进行随机突变来制备变体，或者可以设计变体。在设计的突变体的情况下，当毒素的关键区域中保持氨基酸同一性时，很有可能产生与天然毒素具有相似活性的变体，这些关键区域导致生物活性或参与最终负责生物活性的三维构型的确定。如果取代是保守的，也将会高可能性地保留活性。氨基酸可分为以下类别：非极性、不带电的极性、碱性和酸性。其中一种类别的氨基酸被相同类别的另一种氨基酸取代的保守取代最不可能实质上改变变体的生物学活性。表1提供了属于每个类别的氨基酸的实例的列表。

表1

氨基酸类别

可替代地，可以对氨基或羧基末端处的多种蛋白质的蛋白序列进行改变，而基本上不影响活性。这可以包括由现代分子方法所引入的插入、缺失或改变，这些方法如PCR，包括PCR扩增，这些PCR扩增通过将氨基酸编码序列包括到在PCR扩增中所使用的寡核苷酸之中而改变或延长了这种蛋白质编码序列。可替代地，添加的蛋白质序列可包括完整的蛋白质编码序列，以产生蛋白质融合体。此类融合蛋白常常用于(1)增加目的蛋白质的表达；(2)引入结合结构域、酶活性或表位以促进蛋白质纯化、蛋白质检测或其他实验用途；(3)将蛋白质的分泌或翻译靶向亚细胞器，如革兰氏阴性菌的周质空间、植物的线粒体或叶绿体或真核细胞的内质网，其中后者常常导致蛋白质的糖基化。

本公开的变体核苷酸和氨基酸序列还涵盖了源自诱变和引起重组的程序(如DNA改组)的序列。通过这种程序，可以使用一个或多个不同的IRDIG35563多肽编码区来创建具有所需特性的新颖IRDIG35563多肽。以此方式，由相关序列多核苷酸的群体产生重组多核苷酸文库，所述相关序列多核苷酸包含具有基本序列同一性并且能够在体外或体内同源重组的序列区域。例如，使用这种方法，可以将编码目的结构域的序列基序在杀有害生物基因与其他已知的杀有害生物基因之间进行改组，以获得编码具有改善的目的特性(如增加的杀昆虫活性)的蛋白的新基因。用于这种DNA改组的策略包括例如，Stemmer,(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]91:10747-10751；Stemmer,(1994)Nature[自然]370:389-391；Crameri等人,(1997)Nature Biotech.[自然生物技术]15:436-438；Moore等人,(1997)J Mol Biol[分子生物学杂志]272:336-347；Zhang等人,(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]94:4504-4509；Crameri等人,(1998)Nature[自然]391:288-291；以及美国专利号5,605,793和5,837,458。

结构域交换或改组是用于产生改变的IRDIG35563多肽的另一种机制。可以在IRDIG35563多肽之间交换结构域，导致具有改进的杀昆虫活性或靶谱的其他杂交或嵌合毒素。

本发明的杀有害生物蛋白由与SEQ ID NO:1的核苷酸序列足够相同的核苷酸序列编码，或者所述杀有害生物蛋白与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列足够相同。

为了确定两个氨基酸序列或两个核酸的同一性百分比，出于最佳比较目的，将序列进行比对。两个序列之间的百分比同一性是由序列共享的相同位置的数量的函数(即，同一性百分比＝相同位置数/位置总数(例如，重叠位置)x 100)。在一个实施例中，两个序列具有相同的长度。在另一个实施例中，同一性百分比是在整个参考序列上计算的。可使用类似于下面所述的那些技术的技术，在容许或不容许缺口的情况下确定两个序列之间的百分比同一性。在计算百分比同一性中，典型地计数确切的匹配。缺口(在一个序列中存在的残基但所述残基在另一个序列中不存在的比对位置)被认为是具有不同残基的位置。

两个序列之间的同一性百分比的确定可以通过使用数学算法来完成。用于比较两个序列的数学算法的非限制性实例是并入BLASTN和BLASTX程序中的算法。Karlin和Altschul(1990)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]87:2264，Altschul等人(1990)J.Mol.Bioi.[分子生物学杂志]215:403，以及Karlin和Altschul(1993)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]90:5873-5877。BLAST核苷酸搜索可以使用BLASTN程序、得分＝100、字长＝12来进行，以获得与本发明的杀有害生物样核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以使用BLASTX程序、得分＝50、字长＝3来进行，以获得与本发明的杀有害生物蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的有缺口的比对，可以使用如Altschul等人,(1997)Nucleic Acids Res.[核酸研究]25:3389中所述的GappedBLAST(在BLAST 2.0中)。可替代地，可以将PSI-Blast用于进行检测分子之间的距离关系的迭代检索。参见Altschul等人(1997)，同上。当利用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序，可以使用各自程序的默认参数(例如，BLASTX和BLASTN)。还可依靠手动检查，来进行比对。

用于序列比较的数学算法的另一个非限制性实例是ClustalW算法(Higgins等人,(1994)Nucleic Acids Res.[核酸研究]22:4673-4680)。ClustalW比较多个序列并且将全部的氨基酸或DNA序列进行比对，并且因此可以提供关于全部氨基酸序列的序列保守性的数据。ClustalW算法被用在若干可商购的DNA/氨基酸分析软件包中，如，Vector NTI程序套装的ALIGNX模块(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)。用ClustalW进行氨基酸序列比对之后，可以估算出氨基酸同一性百分比。用于分析ClustalW比对的软件程序的非限制性实例是GENEDOC^TM。GENEDOC^TM(Karl Nicholas)允许评估多种蛋白质之间的氨基酸(或DNA)相似性和同一性。用于序列比较的数学算法的另一个非限制性的实例是Myers和Miller(1988)CABIOS 4(1):11-17的算法。这样一种算法被结合到ALIGN程序(2.0版)中，该程序是GCG威斯康辛州遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)，版本10(可从Accelrys公司，圣迭戈，加利福尼亚州，美国获得)的一部分。当运用ALIGN程序用于比较氨基酸序列，可使用PAM120权重残基表、12的空位长度罚分以及4的空位罚分。除非另有说明，否则GAP版本10(其使用Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48(3):443-453的算法)将使用以下参数确定序列同一性或相似性：对于核苷酸序列的％同一性和％相似性，使用GAP权重50和长度权重3以及nwsgapdna.cmp评分矩阵；对于氨基酸序列的％同一性和％相似性，使用GAP权重8和长度权重2以及BLOSUM62评分程序。也可采用等效程序。“等效程序”是指任何序列比较程序，该程序对于任何两个所讨论的序列产生一个比对，当与GAP版本10所产生的对应的比对相比较时，该比对具有相同的核苷酸残基配对以及相同的序列同一性百分比。

在本发明的另一个实施例中，可在期望位置工程改造蛋白酶切割位点以影响某些昆虫有害生物的易感幼虫的中肠内的蛋白质加工。这些蛋白酶切割位点可以通过诸如化学基因合成或剪接重叠PCR(Horton等人,1989)的方法引入。例如，可将丝氨酸蛋白酶识别序列任选地插入Cry蛋白结构的特定位点，以影响易感幼虫的中肠内期望的缺失点处的蛋白加工。可以以这种方式利用的丝氨酸蛋白酶包括鳞翅目中肠丝氨酸蛋白酶，例如胰蛋白酶或胰蛋白酶样酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶等(Christeller等人,1992)。此外，可以对通过测序由未分级的幼虫中肠蛋白酶制剂产生的Cry蛋白消化产物或通过结合至刷状缘膜囊泡而凭经验鉴定的缺失位点进行工程改造，以实现蛋白活化。

鳞翅目和鞘翅目丝氨酸蛋白酶例如胰蛋白酶、糜蛋白酶和组织蛋白酶G样蛋白酶，鳞翅目和鞘翅目半胱氨酸蛋白酶例如组织蛋白酶(B样、L样、O样和K样蛋白酶)(Koiwa等人,(2000)和Bown等人,(2004))，鳞翅目和鞘翅目金属蛋白酶例如ADAM10(Ochoa-Campuzano等人,(2007))，以及鳞翅目和鞘翅目天冬氨酸蛋白酶例如组织蛋白酶D样和E类、胃蛋白酶、纤溶酶和凝乳酶可以通过在所需加工位点工程化适当的识别序列来进一步利用，以影响某些昆虫有害生物的易感幼虫的中肠内的Cry蛋白加工，并可能还用于提供对非易感昆虫有害生物的活性。

IRDIG35563变体可以通过在编码序列的适当位置处引入或消除蛋白酶加工位点来产生，以允许或消除昆虫、植物或微生物蛋白酶对较大变体蛋白的蛋白水解切割，这在本发明的范围内。这种操作的最终结果应理解为产生与完整(全长)毒素蛋白具有相同或更好功能和/或活性的毒素片段分子。

在另一个实施例中，提供了融合蛋白，在所述融合蛋白的氨基酸序列中包含含有本公开的IRDIG35563多肽的氨基酸序列。编码IRDIG35563多肽的多核苷酸可以融合到信号序列，所述信号序列将指导IRDIG35563多肽定位于原核或真核细胞的特定区室和/或指导实施例的IRDIG35563多肽从原核或真核细胞的分泌。例如，在大肠杆菌(E.coli)中，人们可能希望指导蛋白质表达至周质空间。IRDIG35563多肽可以融合以便指导多肽表达至细菌周质空间的信号序列或蛋白质(或其片段)的实例包括但不限于：pelB信号序列、麦芽糖结合蛋白(MBP)信号序列、MBP、ompA信号序列，周质性大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基的信号序列和碱性磷酸酶的信号序列。用于构建将指导蛋白质定位的融合蛋白的若干种载体是可商购的，如可从新英格兰生物实验室(New England Biolabs)获得的pMAL系列的载体(特别是pMAL-p系列)。在具体实施例中，IRDIG35563多肽可以与pelB果胶酸裂合酶信号序列融合，以增加革兰氏阴性菌中此类多肽的表达和纯化的效率(参见，美国专利号5,576,195和5,846,818)。融合蛋白可以是植物质体转运肽/多肽融合体或质外体转运肽，例如水稻或大麦α-淀粉酶分泌信号。质体转运肽通常与待靶向的多肽(例如，融合配偶体)进行N-末端融合。在一个实施例中，融合蛋白基本上由质体转运肽和待靶向的IRDIG35563多肽组成。在另一个实施例中，融合蛋白包含质体转运肽和待靶向的多肽。在这类实施例中，质体转运肽优选位于融合蛋白的N-末端。然而，如果该融合蛋白至少部分地靶向质体，另外的氨基酸残基可以是在质体转运肽的N-末端。在具体实施例中，质体转运肽在融合蛋白的N-末端一半处、N-末端三分之一处或N-末端四分之一处。当插入质体时，大部分或全部质体转运肽通常从融合蛋白上切割。由于特定的细胞间条件或所使用的转运肽/融合配偶体的组合，在不同植物发育阶段，切割位置可能在植物物种之间略有变化。在一个实施例中，质体转运肽切割是均匀的，使得切割位点在融合蛋白群体中是相同的。在另一个实施例中，质体转运肽不是均匀的，使得切割位点在融合蛋白群体中相差1-10个氨基酸。质体转运肽能以若干种方式之一重组融合到第二蛋白质。例如，可以将限制性内切核酸酶识别位点引入到对应于其C-末端的位置处的转运肽的核苷酸序列中，并且可以将相同或相容的位点工程改造为在其N-末端待靶向的蛋白质的核苷酸序列。必须注意设计这些位点，以确保转运肽和第二蛋白质的编码序列保持“框内”，以允许合成所需的融合蛋白。在一些情况下，当引入新的限制性位点时，优选去除第二蛋白质的起始因子甲硫氨酸。在两个亲本分子上引入限制性内切核酸酶识别位点，以及它们随后通过重组DNA技术连接可导致在转运肽和第二蛋白质之间添加一个或多个额外的氨基酸。如果转运肽切割位点保持可及，并且在其N-末端添加这些额外的氨基酸不改变第二蛋白质的功能，这通常不影响靶向活性。可以使用基因合成(Stemmer等人,(1995)Gene[基因]164:49-53)或相似的方法在转运肽和第二蛋白质(有或没有其起始子甲硫氨酸)之间产生精确的切割位点。另外，转运肽融合可以有意地包括切割位点下游的氨基酸。成熟蛋白质N-末端的氨基酸可影响转运肽将蛋白质靶向质体的能力和/或蛋白质输入后的切割效率。这可能取决于待靶向的蛋白质。参见，例如，Comai等人,(1988)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]263(29):15104-9。在一些实施例中，IRDIG35563多肽与异源信号肽或异源转运肽融合。

核酸分子及其变体和片段。提供了包含编码IRDIG35563多肽或其生物活性部分的核酸序列的分离或重组的核酸分子，以及足以用作杂交探针以鉴定编码具有序列同源性区域的蛋白质的核酸分子的核酸分子。如本文所用的，术语“核酸分子”是指DNA分子(例如，重组DNA、cDNA、基因组DNA、质粒DNA、线粒体DNA)和RNA分子(例如，mRNA)以及使用核苷酸类似物而产生的DNA或RNA的类似物。核酸分子可以是单链的或双链的，但优选地是双链的DNA。

编码IRDIG35563、其变体和截短的核苷酸序列可以通过常规方法合成并克隆到标准质粒载体中，或者可以通过对包含所述核苷酸序列的其他构建体进行标准分子生物学操作而获得。可以鉴定IRDIG35563编码区内部的独特限制性位点，并且可以合成包含IRDIG35563编码区的限制性位点之间的序列的DNA片段，每个这样的片段编码特定的缺失、插入或其他IRDIG35563变化。可以将编码修饰的IRDIG35563片段的DNA片段在适当的限制性位点处与其他IRDIG35563编码区片段或其他Cry或VIP编码区片段连接，以获得编码所需的全长IRDIG35563蛋白、缺失的或变体IRDIG35563蛋白的编码区。例如，可以鉴定在第一IRDIG35563编码区起始处的适当的限制性识别位点和IRDIG35563编码区内部的第二限制性位点。在这些限制性位点处切割所述第一IRDIG35563编码区将产生包含所述第一IRDIG35563编码区的一部分的DNA片段。侧翼有另一个IRDIG35563编码区特异性的相似定位的相容性限制性位点的第二DNA片段可以与第一DNA限制性片段组合使用以构建变体。

在一些实施例中，编码IRDIG35563多肽的核酸分子是具有在SEQ ID NO:1中所示序列的多核苷酸、及其变体、片段和互补序列。还涵盖了与实施例的核酸序列互补或与实施例的序列杂交的核酸序列。所述核酸序列可以在DNA构建体或表达盒中使用，以用于在多种生物体(包括微生物和植物)中进行转化和表达。所述核苷酸或氨基酸序列可以是合成序列，所述合成序列已经被设计用于在生物体中表达，所述生物体包括但不限于：微生物或植物。

在一些实施例中，编码IRDIG35563多肽的核酸分子是非基因组核酸序列。

在一些实施例中，编码IRDIG35563多肽的核酸分子是具有如下核苷酸序列的非基因组多核苷酸，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大同一性，其中编码的IRDIG35563多肽具有杀昆虫活性。

在一些实施例中，IRDIG35563多核苷酸编码与SEQ ID NO:2相比具有至少约40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的IRDIG35563多肽，并且与天然序列相比，所述多肽具有至少一个氨基酸取代、缺失、插入或其组合。

在一些实施例中，所述核酸分子编码包含与跨SEQ ID NO:2的氨基酸序列的整个长度具有至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列的IRDIG35563多肽。

细菌基因通常在可读框的起始附近具有多个甲硫氨酸起始密码子。通常，在这些起始密码子中的一个或多个处的翻译起始将导致功能性蛋白质的产生。起始密码子可以是ATG密码子。某些细菌例如芽孢杆菌属物种也将密码子GTG识别起始密码子。在极少数情况下，细菌系统中的翻译可在TTG密码子处起始。此外，通常不先验地确定细菌中天然使用了这些密码子中的哪一些。因此，应当理解，使用可替代的甲硫氨酸密码子之一也可能导致杀有害生物蛋白的产生。这些杀有害生物蛋白涵盖于本公开之中，并且可以在本公开的方法中使用。应当理解，当在植物中表达时，有必要将可替代的起始密码子改变为ATG以用于正确翻译。

可以修饰多核苷酸编码序列以在甲硫氨酸起始密码子后面的倒数第二位添加密码子以产生用于重组克隆目的和/或用于表达目的的限制性酶切位点。在一些实施例中，该IRDIG35563多肽在翻译起始因子甲硫氨酸之后的位置处进一步包含丙氨酸残基。

作为编码IRDIG35563多肽的这些核酸序列的片段的核酸分子也涵盖在实施例中。核酸序列的片段可以编码IRDIG35563多肽的生物活性部分，或者它可以是可以使用下文公开的方法用作杂交探针或PCR引物的片段。核酸分子是核酸序列的片段，所述片段是连续的或多达本文公开的全长核酸序列中存在的核苷酸数量，这取决于预期的用途。实施例的核酸序列的片段将编码保留IRDIG35563多肽的生物活性并因此保留杀昆虫活性的蛋白质片段。在一些实施例中，该IRDIG35563多肽保留全长IRDIG35563多肽的至少约10％、至少约30％、至少约50％、至少约70％、80％、90％、95％或更高的杀昆虫活性。在一些实施例中，所述杀昆虫活性针对鳞翅目物种。在一些实施例中，杀昆虫活性是针对选自BAW、SAW、FAW、CEW、TBW、SBL、VBC和CBW的一种或多种昆虫有害生物。

在一些实施例中，所述核酸编码如下IRDIG35563多肽：所述IRDIG35563多肽与SEQID NO:2相比具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性。在一些实施例中，使用ClustalW算法在Vector

程序套件(英杰公司，卡尔斯巴德市，加利福尼亚州)的

模块中在所有默认参数下计算所述序列同一性。在一些实施例中，使用ClustalW算法在Vector NTI程序套件(英杰公司，卡尔斯巴德市，加利福尼亚州)的ALIGNX模块中在所有默认参数下计算跨全长多肽的序列同一性。

这些实施例还涵盖编码IRDIG35563多肽变体的核酸分子。编码IRDIG35563多肽的核酸序列的“变体”包括编码本文公开的IRDIG35563多肽但是由于遗传密码的简并性而存在保守差异的那些序列以及如上所述的充分同一的那些序列。变体核酸序列还包括合成来源的核酸序列，所述核酸序列例如通过使用定向诱变而产生，但是仍然编码如下所讨论的所公开的IRDIG35563多肽。

本公开提供编码本文公开的任何IRDIG35563多肽的分离或重组的多核苷酸。由于遗传密码的简并性，存在编码本公开的IRDIG35563多肽的多个核苷酸序列。

可以通过核酸序列的突变引入改变，从而导致编码的IRDIG35563多肽的氨基酸序列的改变，而不损及蛋白质的功能活性。因此，变体核酸分子可以通过以下方式产生：将一个或多个核苷酸取代、添加和/或缺失引入本文公开的相应的核酸序列中，这样使得将一个或多个氨基酸取代、添加或缺失引入所编码的蛋白质中。通过标准技术可以引入突变，如定向诱变和PCR介导的诱变。此类变体核酸序列也被本公开所涵盖。

可替代地，可以通过沿编码序列的全部或部分随机引入突变(如通过饱和诱变)来制备变体核酸序列，并且可以筛选所得突变体赋予杀有害生物活性以鉴定保留活性的突变体的能力。在诱变之后，所编码的蛋白质可以进行重组表达，并且所述蛋白质的活性可以使用标准的测定技术来确定。

本公开的多核苷酸及其片段任选用作各种重组和递归(recursive)重组反应的底物，除了例如Ausubel、Berger和Sambrook所述的标准克隆方法之外，即，以产生具有所需特性的另外的杀有害生物多肽同源物及其片段。各种此类反应是已知的。用于生产本文列出的任何核酸的变体的方法(这些方法包括将此类多核苷酸与第二(或更多)多核苷酸递归重组，从而形成变体多核苷酸文库)也是本公开的实施例，所产生的文库、包含所述文库的细胞和通过此类方法产生的任何重组多核苷酸也是如此。另外，此类方法任选地包括基于杀有害生物活性从此类文库中选择变体多核苷酸，正如其中此类递归重组在体外或体内进行。

各种多样性产生方案(包括核酸递归重组方案)是可获得的并且在本领域中被充分描述。所述程序可以单独和/或组合使用以产生核酸或核酸集合的一种或多种变体，以及所编码蛋白质的变体。单独地或整体地，这些程序提供了产生多样化核酸和核酸集合(包括例如核酸文库)的稳健且广泛适用的方式，所述方式可用于，例如，具有新的和/或改善的特征的核酸、蛋白质、途径、细胞和/或生物体的工程化或快速进化。

虽然在随后的讨论过程中作出明确的区分和分类，但是应当理解，这些技术通常不是相互排斥的。实际上，各种方法可以单独使用或组合、平行或串联使用，以便取得不同的序列变体。

本文所述的任何多样性产生程序的结果可以是一种或多种核酸的产生，其可以选择或筛选具有或赋予所需特性的核酸或编码具有或者赋予所需特性的蛋白质的核酸。通过本文的或技术人员以其他方式可用的一种或多种方法进行多样化之后，可以针对所需的活性或特性(例如，杀有害生物活性)或在所需的pH下的这种活性等选择所产生的任何核酸。这可以包括通过本领域任何测定来鉴定可以例如以自动化或可自动化形式检测的任何活性，参见例如以下的杀昆虫活性筛选的讨论。各种相关(或甚至不相关)的特性可以由执业者酌情串联或平行评估。

用于产生经修饰的核酸序列(例如编码具有杀有害生物活性的多肽或其片段的那些)的各种多样性产生程序的描述可以在以下出版物和其中引用的参考文献中找到：Soong等人,(2000)Nat Genet[自然遗传学]25(4):436-439；Stemmer等人,(1999)TumorTargeting[肿瘤靶向]4:1-4；Ness等人,(1999)Nat Biotechnol[自然生物技术]17:893-896；Chang等人,(1999)Nat Biotechnol[自然生物技术]17:793-797；Minshull和Stemmer,(1999)Curr Opin Chem Biol[生物化学当代观点]3:284-290；Christians等人,(1999)NatBiotechnol[自然生物技术]17:259-264；Crameri等人,(1998)Nature[自然]391:288-291；Crameri等人,(1997)Nat Biotechnol[自然生物技术]15:436-438；Zhang等人,(1997)PNASUSA[美国科学院院报]94:4504-4509；Patten等人,(1997)Curr Opin Biotechnol[生物技术当代观点]8:724-733；Crameri等人,(1996)Nat Med[自然医学]2:100-103；Crameri等人,(1996)Nat Biotechnol[自然生物技术]14:315-319；Gates等人,(1996)J Mol Biol[分子生物学杂志]255:373-386；Stemmer,(1996)“Sexual PCR and Assembly PCR[有性PCR和组装PCR]”在：The Encyclopedia of Molecular Biology.[分子生物学百科全书]VCH出版商,纽约,第447-457页；Crameri和Stemmer,(1995)BioTechniques[生物技术]18:194-195；Stemmer等人,(1995)Gene[基因],164:49-53；Stemmer,(1995)Science[科学]270:1510；Stemmer,(1995)Bio/Technology[生物/技术]13:549-553；Stemmer,(1994)Nature[自然]370:389-391和Stemmer,(1994)PNAS USA[美国科学院院报]91:10747-10751。

产生多样性的突变方法包括例如定向诱变(Ling等人,(1997)Anal Biochem[分析生物化学]254(2):157-178；Dale等人,(1996)MethodsMol Biol[分子生物学方法]57:369-374；Smith,(1985)Ann Rev Genet[遗传学年评]19:423-462；Botstein和Shortle,(1985)Science[科学]229:1193-1201；Carter,(1986)Biochem J[生物化学杂志]237:1-7和Kunkel,(1987)“Theefficiency of oligonucleotide directed mutagenesis[寡核苷酸定向诱变的效率]”，在：Nucleic Acids&Molecular Biology[核酸与分子生物学](Eckstein和Lilley编辑,Springer Verlag[施普林格出版公司],柏林))；使用含尿嘧啶的模板的诱变(Kunkel,(1985)PNAS USA[美国科学院院报]82:488-492；Kunkel等人,(1987)Methods Enzymol[酶学方法]154:367-382以及Bass等人,(1988)Science[科学]242:240-245)；寡核苷酸定向诱变(Zoller和Smith,(1983)Methods Enzymol[酶学方法]100:468-500；Zoller和Smith,(1987)Methods Enzymol[酶学方法]154:329-350(1987)；Zoller和Smith,(1982)Nucleic Acids Res[核酸研究]10:6487-6500)；经硫代磷酸修饰的DNA诱变(Taylor等人,(1985)Nucl Acids Res[核酸研究]13:8749-8764；Taylor等人,(1985)NuclAcids Res[核酸研究]13:8765-8787(1985)；Nakamaye和Eckstein,(1986)Nucl Acids Res[核酸研究]14:9679-9698；Sayers等人,(1988)Nucl Acids Res[核酸研究]16:791-802以及Sayers等人,(1988)Nucl Acids Res[核酸研究]16:803-814)；使用有缺口的双链体DNA的诱变(Kramer等人,(1984)Nucl Acids Res[核酸研究]12:9441-9456；Kramer和Fritz,(1987)Methods Enzymol[酶学方法]154:350-367；Kramer等人,(1988)Nucl Acids Res[核酸研究]16:7207以及Fritz等人,(1988)Nucl Acids Res[核酸研究]16:6987-6999)。

其他合适的方法包括点错配修复(Kramer等人,(1984)Cell[细胞]38:879-887)、使用有修复缺陷的宿主菌株的诱变(Carter等人,(1985)Nucl Acids Res[核酸研究]13:4431-4443以及Carter,(1987)Methods in Enzymol[酶学方法]154:382-403)、缺失诱变(Eghtedarzadeh和Henikoff,(1986)Nucl Acids Res[核酸研究]14:5115)、限制性-选择和限制性-纯化(Wells等人,(1986)Phil Trans R Soc Lond A[伦敦皇家学会哲学会刊系列A]317:415-423)、通过全基因合成的诱变(Nambiar等人,(1984)Science[科学]223:1299-1301；Sakamar和Khorana,(1988)Nucl Acids Res[核酸研究]14:6361-6372；Wells等人,(1985)Gene[基因]34:315-323以及

等人,(1985)Nucl Acids Res[核酸研究]13:3305-3316)、双链断裂修复(Mandecki,(1986)PNAS USA[美国科学院院报],83:7177-7181以及Arnold,(1993)Curr Opin Biotech[生物技术当代观点]4:450-455)。许多上述方法的另外的细节可以在Methods Enzymol[酶学方法]第154卷中找到，其还描述了用各种诱变方法进行故障问题解决的有用对照。

寡核苷酸探针的开发。鉴定本发明的毒素和基因的另一种方法是通过使用寡核苷酸探针。这些探针是可检测的核苷酸序列。这些序列可以借助于适当的放射性标记物使其可检测，或者可以使其固有地发荧光，如例如美国专利号6,268,132中所述。如本领域中众所周知的，如果探针分子和核酸样品通过在两个分子之间形成强碱基配对键而杂交，则可以合理地假设探针和样品具有实质的序列同源性。优选地，杂交在严格条件下通过本领域众所周知的技术进行，例如在Keller和Manak(1993)中所述。探针的检测提供了以已知方式确定杂交是否已经发生的手段。这样的探针分析提供了一种鉴定本发明的毒素编码基因的快速方法。可以使用DNA合成仪和标准程序合成用作本发明探针的核苷酸片段。这些核苷酸序列也可以用作PCR引物以扩增本发明的基因。

核酸杂交。如分子生物学领域的技术人员众所周知的，两个核酸的相似性可以通过它们杂交的倾向来表征。如本文所用，术语“严格条件”或“严格杂交条件”意指探针与其靶序列杂交(退火)的程度比其与其他序列杂交的程度可检测地更高(例如比背景高至少2倍)的条件。严格条件是序列依赖性的，并且在不同情况下将有所不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与所述探针100％互补的靶序列(同源探测)。可替代地，可以调节严格条件以允许序列中的一些错配，以便检测到更低程度的相似性(异源探测)。通常，探针的长度为小于约1000个核苷酸，优选地长度小于500个核苷酸。

典型地，严格条件是以下条件，在这些条件下该盐浓度在pH7.0至pH 8.3时是小于约1.5M钠离子、典型为约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐)，并且对于短探针(例如，10至50个核苷酸)的温度为至少约30℃，而对于长探针(例如，超过50个核苷酸)的温度为至少约60℃。添加去稳定剂如甲酰胺也可以实现严格条件。示例性低严格条件包括在37℃下与30％至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液杂交，并且在50℃至55℃下在1X至2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性中严格条件包括在37℃下在40％至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中杂交，并且在55℃至60℃下在0.5X至1X SSC中洗涤。示例性高严格条件包括在37℃下在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，并且在60℃至65℃下在0.1X SSC中洗涤。任选地，洗涤缓冲液可以包含约0.1％至约1％SDS。杂交持续时间通常小于约24小时，通常为约4至12小时。

特异性典型地取决于杂交后洗涤的功能，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度以及温度。对于DNA/DNA杂交物，热解链点(T_m)是50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在所限定的离子强度和pH下)。对于每1％的错配，T_m降低约1℃；因此，可调整T_m、杂交条件和/或洗涤条件以促进具有所需同一性的序列的退火。例如，如果寻找具有>90％同一性的序列，则可将T_m降低10℃。通常，将严格条件选择为比特定序列及其互补序列在所限定的离子强度和pH下的T_m低约5℃。然而，高严格条件可以利用比T_m低1℃、2℃、3℃或4℃的杂交和/或洗涤；中严格条件可以利用比T_m低6℃、7℃、8℃、9℃或10℃的杂交和/或洗涤，并且低严格条件可以利用比T_m低11℃、12℃、13℃、14℃、15℃或20℃的杂交和/或洗涤。

T_m(以℃为单位)可以通过实验确定或可以通过计算进行估计。对于DNA-DNA杂交物，T_m可以从Meinkoth和Wahl(1984)等式中进行估计：T_m(℃)＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L；其中M为单价阳离子的摩尔浓度，％GC为DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％甲酰胺为杂交溶液中甲酰胺的百分比，并且L为杂交物的碱基对长度。或者，T_m通过以下公式描述(Beltz等人,1983)：T_m(℃)＝81.5℃+16.6(log[Na+])+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-600/L其中[Na+]是钠离子的摩尔浓度，％GC是在DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％甲酰胺是在杂交溶液中甲酰胺的百分比，并且L是杂交物的碱基对长度。使用等式、杂交和洗涤组合物以及所需的T_m，普通技术人员将理解，本质上描述了杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化。如果所希望的错配程度导致T_m小于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选增加SSC浓度以使得可使用较高温度。广泛的核酸杂交指南在Hybridization with Nucleic Acid Probes[与核酸探针的杂交]第1卷P.Tijssen(1993,ISBN-10:0444898840,ISBN-13:9780444898845精装本)和Ausubel等人(1995)中找到。还参见Sambrook等人(1989)。

抗毒素抗体。可以使用本领域众所周知的标准程序来制备针对本文公开的毒素或这些毒素的片段的抗体。此类抗体可用于检测IRDIG35563毒素在植物组织和各种其他物质中的存在。此类抗体和抗血清可用于检测本发明所要求保护的IRDIG35563毒素及其变体或片段的各种方法。众所周知，标记有报道基团的抗体可用于鉴定多种环境中抗原的存在。标记有放射性同位素的抗体已用于放射免疫测定中，以高度精确和灵敏性鉴定各种生物流体中抗原的存在。最近，酶标记的抗体已被用作ELISA测定中放射性标记抗体的替代品。此外，可以将对本发明的Bt杀昆虫毒素具有免疫反应性的抗体结合到固定物质例如聚苯乙烯孔或颗粒上，并用于免疫测定以确定测试样品中是否存在Bt毒素。抗IRDIG35563抗体也用于从重组生产系统或自然来源中分离出大量的IRDIG35563毒素。

提供了用于检测样品中IRDIG35563多肽的存在或检测编码IRDIG35563多肽的核苷酸序列的存在的试剂盒。在一个实施例中，试剂盒提供了用于检测组织样品中IRDIG35563多肽的存在的基于抗体的试剂。在另一个实施例中，试剂盒提供了用于检测编码IRDIG35563多肽的一种或多种多核苷酸的存在的标记的核酸探针。将所述试剂盒与用于进行检测方法的适当的试剂和对照物，以及试剂盒的使用说明书一起提供。

IRDIG35563的转基因表达。可以多种方式“应用”或提供主题蛋白毒素以接触靶昆虫。例如，IRDIG35563毒素可用作转基因植物中的并入植物的保护剂(由植物产生并存在于植物中)。毒素基因的表达还可以在植物的特定组织(例如根、叶等)中实现选择性。这可以通过使用组织特异性启动子来实现。

本发明的一个优选实施例是用编码主题杀昆虫蛋白或其变体的基因转化植物。由于在转化的植物的细胞中存在控制量的主题杀昆虫蛋白或其变体，因此转化的植物对昆虫靶有害生物的长期攻击具有抗性。通过将编码IRDIG35563毒素的遗传物质并入到特定昆虫有害生物食用的植物的基因组中并且表达，成年或幼虫将在食用所述食用植物后死去。已将单子叶和双子叶类别的许多成员转化。转基因农作物以及水果和蔬菜具有商业意义。这样的作物包括但不限于玉蜀黍、水稻、大豆、低芥酸油菜、向日葵、苜蓿、高粱、小麦、棉花、花生、番茄、马铃薯等。存在许多众所周知的技术，用于将外源遗传物质引入单子叶植物或双子叶植物细胞，并用于获得稳定维持和表达所引入的基因的可育植物。

在一个优选的实施例中，IRDIG35563或变体通过包含表达本发明毒素的核酸序列的转基因植物经口服递送。本发明提供了一种产生抗昆虫转基因植物的方法，其包括将本发明的核酸分子引入植物中，其中所述毒素可以以控制昆虫的有效量在所述转基因植物中表达。在非限制性实例中，基本的克隆策略可以是将全长或修饰的IRDIG35563编码序列在NcoI和SacI限制性位点亚克隆到植物表达质粒中。利用例如

技术或标准限制酶片段克隆程序，将含有适当IRDIG35563编码区(其在植物表达元件(例如，植物可表达的启动子，3'末端转录终止和聚腺苷酸添加决定簇等)的控制下)的所得植物表达盒亚克隆到二元载体质粒中。例如，如果使用

技术，则可使用LR Clonase^TM(Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德)将全长和修饰的基因植物表达盒重组到二元植物转化质粒中。当质粒存在于大肠杆菌和农杆菌细胞中时，使用具有细菌基因的二元植物转化载体是方便的，所述细菌基因赋予了对抗生素壮观霉素的抗性。使用二元载体质粒也是方便的，所述质粒包含在所需宿主植物中有功能的植物可表达的选择性标记基因。植物可表达的选择性标记基因的实例包括但不限于那些编码转座子Tn5的氨基糖苷磷酸转移酶基因(aphII)的基因(其赋予对抗生素卡那霉素、新霉素和G418的抗性)，以及那些编码对草甘膦；潮霉素；甲氨蝶呤；膦丝菌素(双丙氨酰膦)、咪唑啉酮类、磺酰脲类和三唑并嘧啶类除草剂(例如氯磺隆、溴苯腈、茅草枯等)的抗性或耐受性的基因。

或者，含有IRDIG35563基因插入物的二元植物转化载体的质粒结构是通过对质粒DNA进行限制性消化指纹作图来完成的，所述质粒DNA是通过农杆菌操作领域的技术人员熟知的标准分子生物学方法从候选的农杆菌分离物中制备的。

本文使用术语“核苷酸构建体”并不旨在将实施例限制为包含DNA的核苷酸构建体。核苷酸构建体，特别是由核糖核苷酸构成的多核苷酸和寡核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合也可用于本文公开的方法中。实施例的核苷酸构建体、核酸和核苷酸序列另外涵盖这种构建体、分子和序列的所有互补形式。此外，实施例的核苷酸构建体、核苷酸分子和核苷酸序列涵盖能用于实施例的转化植物方法的所有核苷酸构建体、分子和序列，包括但不限于由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及其组合所构成的那些。这种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸既包括天然存在的分子也包括合成的类似物。实施例的核苷酸构建体、核酸和核苷酸序列还涵盖核苷酸构建体的所有形式，所述形式包括但不限于单链形式、双链形式、发夹、茎环结构等。

另外的实施例涉及经转化的生物体，如选自以下的生物体：植物和昆虫细胞、细菌、酵母、杆状病毒、原生动物、线虫和藻的生物体。经转化的生物体包含：实施例的DNA分子、含有DNA分子的表达盒或含有表达盒的载体，它可以稳定地引入经转化的生物体的基因组。

在DNA构建体中提供实施例的序列，用于在目的生物体中表达。所述构建体将包括可操作地连接到实施例的序列的5'和3'的调节序列。如本文所用的，术语“可操作地连接”是指启动子和第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列启动并介导相应于第二序列的DNA序列的转录。通常，可操作地连接意味着所连接的核酸序列是连续的，并且在必要时在相同阅读框中连接两个蛋白质编码区域。所述构建体可以另外含有待共转化进生物体的至少一个另外的基因。可替代地，可以在多个DNA构建体上提供一个或多个另外的基因。

提供的这种DNA构建体具有用于插入本公开的IRDIG35563多肽基因序列以使其处于调节性区域的转录调节下的多个限制性位点。DNA构建体可以另外包含选择性标记基因。

按5'到3'的转录方向，DNA构建体将通常包括：转录和翻译起始区域(即，启动子)、实施例的DNA序列以及在用作宿主的生物体内具有功能的转录和翻译终止区域(即，终止区)。针对实施例的宿主生物体和/或序列，转录起始区(即，启动子)可以是天然的、类似的、外源的或异源的。此外，所述启动子可以是天然序列，或可替代地，是合成序列。如本文所用的，术语“外源”表示在引入启动子的天然生物体中没有发现启动子。在启动子对于实施例的序列而言是“外源的”或“异源的”情况下，它是指所述启动子对于实施例的可操作地连接的序列而言不是天然的或天然存在的启动子。如本文所用的，嵌合基因包含与转录起始区可操作地连接的编码序列，所述转录起始区对于所述编码序列是异源的。当所述启动子是天然(native或natural)序列时，可操作地连接的序列的表达从野生型表达变化，这导致表型的改变。

在一些实施例中，该DNA构建体包含编码实施例的IRDIG35563多肽的多核苷酸。

在一些实施例中，DNA构建体包含编码含有实施例的IRDIG35563多肽的融合蛋白的多核苷酸。

在一些实施例中，所述DNA构建体还可以包括转录增强子序列。如本文所用的，术语“增强子”是指可以刺激启动子活性的DNA序列，并且可以是插入以增强启动子的水平或组织特异性的启动子的先天元件或异源元件。也可以使用各种增强子，其包括在植物中具有基因表达增强特性的内含子(美国专利申请公开号2009/0144863)、泛素内含子(即，玉蜀黍泛素内含子1(参见，例如，NCBI序列S94464))、ω增强子或ω主要增强子(Gallie等人,(1989)Molecular Biology of RNA[RNA的分子生物学]，编辑：Cech(Liss公司，纽约)237-256和Gallie等人,(1987)Gene[基因]60:217-25)、CaMV 35S增强子(参见，例如，Benfey等人,(1990)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]9:1685-96)和美国专利号7,803,992的增强子，其中每一个通过引用并入。以上转录增强子的列表并不意指是限制性的。任何适当转录增强子都可用于实施例中。

终止区对于转录起始区可以是天然的，对于可操作地连接的目的DNA序列可以是天然的，对于植物宿主可以是天然的，或者可以源自另一种来源(即，对于启动子、目的序列、植物宿主、或其任何组合而言是外源的或异源的)。

方便的终止区可获自根癌农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒，如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。还参见Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet.[现代遗传学]262:141-144；Proudfoot,(1991)Cell[细胞]64:671-674；Sanfacon等人,(1991)Genes Dev.[基因与发育]5:141-149；Mogen等人,(1990)Plant Cell[植物细胞]2:1261-1272；Munroe等人,(1990)Gene[基因]91:151-158；Ballas等人,(1989)Nucleic Acids Res.[核酸研究]17:7891-7903以及Joshi等人,(1987)Nucleic Acid Res.[核酸研究]15:9627-9639。

适当时可以优化核酸以增加在宿主生物体中的表达。因此，在宿主生物体是植物的情况下，合成核酸可以使用植物偏好性密码子来合成以改善表达。有关宿主偏好性使用的讨论，参见，例如Campbell和Gowri,(1990)Plant Physiol.[植物生理学]92:1-11。例如，虽然实施例的核酸序列在单子叶和双子叶植物物种中均可以表达，但是可以修饰序列，以考虑单子叶或双子叶植物的特定偏好和GC含量偏好，因为这些偏好已经表现出了差异(Murray等人(1989)Nucleic Acids Res.[核酸研究]17:477-498)。因而，特定氨基酸的玉蜀黍偏好性密码子可以源自玉蜀黍的已知基因序列。来自玉蜀黍植物的28种基因的玉蜀黍使用在Murray等人(同上)的表4中列出。用于合成植物偏好性基因的方法可以在Murray等人,(1989)Nucleic Acids Res.[核酸研究]17:477-498，和Liu H等人Mol Bio Rep[分子生物学报告]37:677-684,2010中找到，其通过引用并入本文。玉蜀黍(Zea maize)使用表也可以在kazusa.or.jp//cgi-bin/show.cgi？species＝4577上找到，所述网址可以使用www前缀进行访问。

大豆使用表可以在kazusa.or.jp//cgi-bin/show.cgi？species＝3847&aa＝1&style＝N上找到，所述网址可以使用www前缀进行访问。

在一些实施例中，编码IRDIG35563多肽的重组核酸分子具有玉蜀黍优化的密码子。在一些实施例中，编码IRDIG35563多肽的重组核酸分子具有大豆优化的密码子。

已知有另外的序列修饰能增强细胞宿主中的基因表达。这些包括消除以下序列：编码假聚腺苷酸化信号的序列、编码外显子-内含子剪接位点信号的序列、编码转座子样重复序列的序列和得到充分表征的、可能不利于基因表达的其他序列。可以将序列的GC含量调整至给定细胞宿主的平均水平，如通过参考在所述宿主细胞中表达的已知基因而计算的。如本文所用的，术语“宿主细胞”是指包含载体并支持表达载体的复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌，或真核细胞如酵母、昆虫、两栖类或哺乳动物细胞、或单子叶或双子叶植物细胞。单子叶宿主细胞的实例是玉蜀黍宿主细胞。当可能时，修饰序列以避免出现可预见的发夹二级mRNA结构。

表达盒可以另外包含5'前导序列。此类前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译前导序列包括；小核糖核酸病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎5'非编码区)(Elroy-Stein等人,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]，86:6126-6130)；马铃薯Y病毒属前导序列，例如，TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Gallie等人,(1995)Gene[基因]165(2):233-238)、MDMV前导序列(玉蜀黍矮花叶病毒)、人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak等人,(1991)Nature[自然]353:90-94)；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA的非翻译前导序列(AMV RNA 4)(Jobling等人,(1987)Nature[自然]325:622-625)；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie等人,(1989)Molecular Biology of RNA[RNA的分子生物学],Cech编著(利斯公司，纽约),第237-256页)和玉蜀黍褪绿斑驳病毒(maize chloroticmottle)前导序列(MCMV)(Lommel,等人,(1991)Virology[病毒学]81:382-385)。还参见，Della-Cioppa等人,(1987)Plant Physiol.[植物生理学]84:965-968。此类构建体还可以包含“信号序列”或“前导序列”，以促进所述肽的共翻译成或翻译后运输至某些细胞内结构，如叶绿体(或其他质体)、内质网或高尔基体。

如本文所用的，“信号序列”是指已知或怀疑导致跨细胞膜的共翻译或翻译后肽运输的序列。在真核生物中，这典型地涉及分泌到高尔基体内，伴随某些产生的糖基化。通常将细菌的杀昆虫毒素合成为原毒素，所述原毒素在所述靶有害生物的肠中被蛋白水解激活(Chang,(1987)Methods Enzymol.[酶学方法]153:507-516)。在一些实施例中，该信号序列位于该天然的序列中，或可以源自实施例的序列。如本文所用的，术语“前导序列”是指当翻译时产生足以引发肽链与亚细胞器的共翻译转运的氨基酸序列的任何序列。因此，这包括通过进入内质网内、进入液泡、质体(包括叶绿体、线粒体)等中来对运输和/或糖基化进行靶向的前导序列。靶向叶绿体类囊体腔室的核编码蛋白具有由基质靶向信号肽和腔靶向信号肽组成的特征二分型转运肽。基质靶向信息位于转运肽的氨基-近端部分。腔靶向信号肽位于转运肽的羧基近端部分，并且包含用于靶向腔的所有信息。高等植物叶绿体蛋白质组学的最新研究已在鉴定许多核编码的腔蛋白质中取得了进展(Kieselbach等人FEBS LETT[欧洲生化学会联盟通讯]480:271-276,2000；Peltier等人.Plant Cell[植物细胞]12:319-341,2000；Bricker等人.Biochim.Biophys Acta[生物化学与生物物理学学报]1503:350-356,2001)，根据本公开可能使用所述核编码的腔蛋白质的腔靶向信号肽。Kieselbach等人,Photosynthesis Research[光合作用研究]78:249-264,2003报道了来自拟南芥属(Arabidopsis)约80种蛋白质以及来自菠菜和豌豆的同源蛋白。该出版物的表2(其通过引用并入本说明书中)公开了通过其登录号鉴定的来自叶绿体腔的85种蛋白质(还参见美国专利申请公开2009/09044298)。另外，最近公开的水稻基因组草拟版本(Goff等人,Science[科学]296:92-100,2002)是可以根据本公开使用的用于腔靶向信号肽的合适来源。

合适的叶绿体转运肽(CTP)包含嵌合CT，这些嵌合CT包括但不限于：来自以下的CTP的N-末端结构域、中心结构域或C-末端结构域：稻1-脱氧-D木酮糖-5-磷酸合酶、稻-超氧化物歧化酶、稻-可溶性淀粉合酶、稻-NADP-依赖性苹果酸酶、稻-磷酸2-脱氢-3-脱氧庚酸醛缩酶2、稻-L-抗坏血酸过氧化物酶5、稻-磷酸葡聚糖水二激酶、玉米ssRUBISCO、玉米-β-葡糖苷酶、玉米-苹果酸脱氢酶、玉米硫氧还蛋白M-型(美国专利申请公开2012/0304336)。

可以针对在叶绿体中的表达来优化待靶向叶绿体的IRDIG35563多肽基因，以解决植物核与所述细胞器之间的使用差异。以此方式，可以使用叶绿体偏好性序列合成目的核酸。

在制备表达盒时，可以操作各种DNA片段，以提供处于适当取向以及合适时，处于适当阅读框中的DNA序列。为此，可采用衔接子(adapter)或接头以连接DNA片段，或可以涉及其他操作以提供方便的限制性位点、去除多余的DNA、去除限制性位点等。为此目的，可以涉及体外诱变、引物修复、限制性酶切(restriction)、退火、再取代(例如转换和颠换)。

若干启动子可用于实施这些实施例。可基于所需结果，选择启动子。核酸可与组成型、组织偏好性、诱导型或其他启动子组合用于在宿主生物体中的表达。用于植物宿主细胞中的合适的组成型启动子包括，例如Rsyn7启动子的核心启动子和其他在WO 1999/43838和美国专利号6,072,050中公开的组成型启动子；核心CaMV 35S启动子(Odell等人,(1985)Nature[自然]313:810-812)；水稻肌动蛋白(McElroy等人,(1990)Plant Cell[植物细胞]2:163-171)；泛素(Christensen等人,(1989)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]12:619-632和Christensen等人,(1992)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]18:675-689)；pEMU(Last等人,(1991)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]81:581-588)；MAS(Velten等人,(1984)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]3:2723-2730)；ALS启动子(美国专利号5,659,026)等。其他组成型启动子包括例如以下美国专利号中所讨论的那些：5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142和6,177,611。

根据所需结果，从诱导型启动子表达基因可能是有益的。用于调节实施例的核苷酸序列在植物中表达的特别引人关注的是伤口诱导型启动子。这种伤口诱导型启动子可以对由昆虫取食引起的损害作出反应，并且包括马铃薯蛋白酶抑制剂(pin II)基因(Ryan,(1990)Ann.Rev.Phytopath.[植物病理学年鉴]28:425-449；Duan等人,(1996)NatureBiotechnology[自然生物技术]14:494-498)；wun1和wun2，美国专利号5,428,148；win1和win2(Stanford等人,(1989)Mol.Gen.Genet.[分子遗传学和普通遗传学]215:200-208)；系统素(McGurl等人,(1992)Science[科学]225:1570-1573)；WIP1(Rohmeier等人,(1993)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]22:783-792；Eckelkamp等人,(1993)FEBS Letters[欧洲生化学会联盟通讯]323:73-76)；MPI基因(Corderok等人,(1994)Plant J.[植物杂志]6(2):141-150)等，以上文献通过引用并入本文。

此外，可以在实施例的方法和核苷酸构建体中使用病原体诱导型启动子。这种病原体诱导型启动子包括来自发病相关蛋白(PR蛋白)的那些，其在病原体感染后被诱导；例如，PR蛋白、SAR蛋白、β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶等。参见，例如Redolfi等人,(1983)Neth.J.Plant Pathol.[荷兰植物病理学杂志]89:245-254；Uknes等人,(1992)Plant Cell[植物细胞]4:645-656和Van Loon,(1985)Plant Mol.Virol.[植物分子病毒学]4:111-116。还参见，WO 1999/43819，其通过引用并入本文。

引人关注的是在病原体感染部位处或附近局部表达的启动子。参见，例如Marineau等人,(1987)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]9:335-342；Matton等人,(1989)Molecular Plant-Microbe Interactions[分子植物-微生物相互作用]2:325-331；Somsisch等人,(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]83:2427-2430；Somsisch等人,(1988)Mol.Gen.Genet.[分子遗传学和普通遗传学]2:93-98以及Yang,(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]93:14972-14977。还参见Chen等人,(1996)Plant J.[植物杂志]10:955-966；Zhang等人,(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]91:2507-2511；Warner等人,(1993)Plant J.[植物杂志]3:191-201；Siebertz等人,(1989)Plant Cell[植物细胞]1:961-968；美国专利号5,750,386(线虫诱导型)及其中引用的参考文献。特别引人关注的是玉蜀黍PRms基因的诱导型启动子，其表达是由病原体串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)诱导的(参见，例如Cordero等人,(1992)Physiol.Mol.Plant Path.[生理学与分子植物病理学]41:189-200)。

可以使用化学调节型启动子以通过应用外源化学调节剂来调节植物中的基因表达。取决于目标，所述启动子可以是化学诱导型启动子，其中施用化学品来诱导基因表达，或化学抑制型启动子，其中施用化学品来抑制基因表达。化学诱导型启动子包括但不限于由苯磺酰胺除草剂安全剂激活的玉蜀黍In2-2启动子、由用作萌前除草剂的疏水亲电子化合物激活的玉蜀黍GST启动子、以及由水杨酸激活的烟草PR-1a启动子。其他感兴趣的化学调节的启动子包括类固醇反应性启动子(参见，例如如下文献中的糖皮质激素诱导型启动子：Schena等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]88:10421-10425和McNellis,等人(1998)Plant J.[植物杂志]14(2):247-257)和四环素诱导型和四环素抑制型启动子(参见例如，Gatz,等人,(1991)Mol.Gen.Genet.[分子遗传学和普通遗传学]227:229-237和美国专利号5,814,618和5,789,156)，通过引用并入本文。

组织偏好性启动子可以用于靶向特定植物组织内的IRDIG35563多肽表达。组织偏好性启动子包括描述于以下文献中的那些：Yamamoto等人,(1997)Plant J.[植物杂志]12(2):255-265；Kawamata等人,(1997)Plant Cell Physiol.[植物细胞生理学]38(7):792-803；Hansen等人,(1997)Mol.Gen Genet.[分子和普通遗传学]254(3):337-343；Russell等人,(1997)Transgenic Res.[转基因研究]6(2):157-168；Rinehart等人,(1996)PlantPhysiol[植物生理学]112(3):1331-1341；Van Camp等人,(1996)Plant Physiol.[植物生理学]112(2):525-535；Canevascini等人,(1996)Plant Physiol.[植物生理学]112(2):513-524；Yamamoto等人,(1994)Plant Cell Physiol[植物细胞生理学]35(5):773-778；Lam,(1994)Results Probl.Cell Differ.[细胞分化的结果和问题]20:181-196；Orozco等人,(1993)Plant Mol Biol.[植物分子生物学]23(6):1129-1138；Matsuoka等人,(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]90(20):9586-9590和Guevara-Garcia等人,(1993)Plant J.[植物杂志]4(3):495-505。必要的话，此类启动子可经修饰用于弱表达。

叶偏好性启动子可以在以下中找到：Yamamoto等人,(1997)Plant J.[植物杂志]12(2):255-265；Kwon等人,(1994)Plant Physiol.[植物生理学]105:357-67；Yamamoto等人,(1994)Plant Cell Physiol[植物细胞生理学]35(5):773-778；Gotor等人,(1993)Plant J.[植物杂志]3:509-18；Orozco等人,(1993)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]23(6):1129-1138以及Matsuoka等人,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]90(20):9586-9590。

根偏好性或根特异性的启动子是已知的，并且可以从来自文献中的许多可获得的启动子来选择，或者从不同相容物种重新分离。参见例如，Hire,等人,(1992)PlantMol.Biol.[植物分子生物学]20(2):207-218(大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller和Baumgartner,(1991)Plant Cell[植物细胞]3(10):1051-1061(法国菜豆GRP1.8基因中的根特异性控制元件)；Sanger等人,(1990)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]14(3):433-443(根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的甘露聚糖合成酶(MAS)基因的根特异性启动子)以及Miao等人,(1991)Plant Cell[植物细胞]3(1):11-22(编码细胞溶质谷氨酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆，其在大豆的根和根瘤中表达)。还参见，Bogusz等人,(1990)Plant Cell[植物细胞]2(7):633-641，其中描述了从来自固氮的非豆科植物榆科山黄麻(Parasponia andersonii)以及相关的非固氮的非豆科植物山黄麻(Trematomentosa)的血红蛋白基因分离的两个根特异性启动子。这些基因的启动子被连接到β-葡萄糖醛酸酶报道基因并且被引入非豆科植物烟草(Nicotiana tabacum)以及豆科植物百脉根(Lotus corniculatus)两者中，并且在两个实例中根特异性启动子活性被保留。Leach和Aoyagi,(1991)描述了他们对发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的高表达的rolC和rolD根诱导基因的启动子的分析(参见，Plant Science[植物科学](Limerick[利默里克])79(1):69-76)。他们得出结论，增强子和组织偏好性DNA决定簇在所述启动子中是解离的。Teeri等人,(1989)使用与lacZ的基因融合以显示编码章鱼碱合酶的农杆菌属T-DNA基因尤其是在根尖的表皮中有活性，并且TR2'基因在完整植物中具有根特异性并且被叶组织中的创伤刺激，这是与杀昆虫的或杀幼虫的基因一起使用的尤其希望的特征组合(参见，EMBOJ.[欧洲分子生物学学会杂志]8(2):343-350)。与nptII(新霉素磷酸转移酶II)融合的TR1'基因显示相似的特征。另外的根偏好性启动子包括VfENOD-GRP3基因启动子(Kuster等人,(1995)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]29(4):759-772)；和rolB启动子(Capana等人,(1994)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]25(4):681-691)。还参见，美国专利号5,837,876；5,750,386；5,633,363；5,459,252；5,401,836；5,110,732和5,023,179。在US20130117883中公开了拟南芥(Arabidopsis thaliana)根偏好性调节序列。

“种子偏好性”启动子包括种子特异性启动子(在种子发育期间有活性的那些启动子如种子贮藏蛋白的启动子)以及种子发芽性启动子(在种子发芽期间有活性的那些启动子)。参见，Thompson等人,(1989)BioEssays[生物测定]10:108，其通过引用并入本文。此类种子偏好性启动子包括但不限于Cim1(细胞分裂素诱导的信号)；cZ19B1(玉蜀黍19kDa玉米蛋白)；和milps(肌醇-1-磷酸盐合酶)(参见美国专利号6,225,529，通过引用结合在此)。γ-玉米醇溶蛋白和Glb-1是胚乳特异性启动子。对于双子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于：库尼兹(Kunitz)胰蛋白酶抑制剂3(KTi3)(Jofuku和Goldberg,(1989)PlantCell[植物细胞]1:1079-1093)、豆-β菜豆素、油菜籽蛋白、β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白1、大豆凝集素、十字花科蛋白等。对于单子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于玉蜀黍15kDa玉蜀黍醇溶蛋白、22kDa玉米醇溶蛋白、27kDa玉米醇溶蛋白、g-玉米醇溶蛋白、蜡质、收缩素1、收缩素2、球蛋白1等。还参见WO 2000/12733，其中公开了来自end1和end2基因的种子偏好性启动子；通过引用并入本文。在双子叶植物中，种子特异性启动子包括但不限于：来自拟南芥属的种皮启动子，pBAN；和来自拟南芥属的早期种子启动子，p26、p63、和p63tr(美国专利号7,294,760和7,847,153)。在特定组织中具有“偏好性”表达的启动子在所述组织中比在至少一种其他植物组织中以更高程度表达。一些组织偏好性启动子几乎专门在特定组织中表达。

当需要低水平表达时，可使用弱启动子。通常，如本文所用的术语“弱启动子”是指以低水平驱动编码序列的表达的启动子。低水平表达旨在约1/1000转录物至约1/100,000转录物至约1/500,000转录物之间的水平。可替代地，应当认识到，术语“弱启动子”还涵盖仅在少数细胞中驱动表达但不在其他细胞中表达，从而具有低水平总表达的启动子。当启动子以不可接受的高水平驱动表达时，可以删除或修饰部分启动子序列以降低表达水平。

此类弱组成型启动子包括例如Rsyn7启动子的核心启动子(WO 1999/43838和美国专利号6,072,050)、核心35S CaMV启动子等。其他组成型启动子包括例如以下专利文献中所公开的那些：美国专利号5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142和6,177,611，通过引用并入本文。

以上启动子的列表并不意指是限制性的。任何适当的启动子都可用于实施例中。

通常，表达盒将包含选择性标记基因，用于选择经转化的细胞。利用选择性标记基因来选择经转化的细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予除草剂化合物(如草胺磷、溴草腈、咪唑啉酮和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D))抗性的基因。合适的选择性标记基因的其他实例包括但不限于编码对如下的耐受性的基因：氯霉素(Herrera Estrella等人,(1983)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]2:987-992)；氨甲蝶呤(Herrera Estrella等人,(1983)Nature[自然]303:209-213和Meijer等人,(1991)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]16:807-820)；链霉素(Jones等人,(1987)Mol.Gen.Genet.[分子遗传学和普通遗传学]210:86-91)；壮观霉素(Bretagne-Sagnard等人,(1996)Transgenic Res.[转基因研究]5:131-137)；博来霉素(Hille等人,(1990)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]7:171-176)；磺酰胺类(Guerineau等人,(1990)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]15:127-136)；溴草腈(Stalker等人,(1988)Science[科学]242:419-423)；草甘膦(Shaw等人,(1986)Science[科学]233:478-481以及美国专利申请序列号10/004,357和10/427,692)；草丁膦(DeBlock等人,(1987)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]6:2513-2518)。主要参见Yarranton,(1992)Curr.Opin.Biotech.[生物技术当代观点]3:506-511；Christopherson等人,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]89:6314-6318；Yao等人,(1992)Cell[细胞]71:63-72；Reznikoff,(1992)Mol.Microbiol.[分子微生物学]6:2419-2422；Barkley等人,(1980)在The Operon[操纵子]中，第177-220页；Hu等人,(1987)Cell[细胞]48:555-566；Brown等人,(1987)Cell[细胞]49:603-612；Figge等人,(1988)Cell[细胞]52:713-722；Deuschle等人,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]86:5400-5404；Fuerst等人,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]86:2549-2553；Deuschle等人,(1990)Science[科学]248:480-483；Gossen,(1993)Ph.D.Thesis[博士学位论文],University of Heidelberg[德国海德堡大学]；Reines等人,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]90:1917-1921；Labow等人,(1990)Mol.Cell.Biol.[分子细胞生物学]10:3343-3356；Zambretti等人,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]89:3952-3956；Baim等人,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]88:5072-5076；Wyborski等人,(1991)NucleicAcids Res.[核酸研究]19:4647-4653；Hillenand-Wissman(1989)TopicsMol.Struc.Biol.[热点分子结构生物学]10:143-162；Degenkolb等人,(1991)Antimicrob.Agents Chemother.[抗微生物剂化学疗法]35:1591-1595；Kleinschnidt,等人,(1988)Biochemistry[生物化学]27:1094-1104；Bonin,(1993)Ph.D.Thesis[博士学位论文]University of Heidelberg[德国海德堡大学]；Gossen等人,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]89:5547-5551；Oliva等人,(1992)Antimicrob.Agents Chemother.[抗微生物剂化学疗法]36:913-919；Hlavka等人,(1985)Handbook of Experimental Pharmacology[实验药理学手册],78卷(Springer-Verlag,Berlin[柏林施普林格出版社])和Gill等人,(1988)Nature[自然]334:721-724。此类公开内容通过引用并入本文。

以上可选择标记基因的列表并不意在是限制性的。任何选择性标记基因都可用于实施例中。

通过农杆菌介导的转化方法获得转化植物的本领域技术人员将理解，可以使用除Z707S之外的其他农杆菌菌株，并且菌株的选择可以取决于要转化的宿主植物物种的身份。

所述实施例的方法涉及将多肽或多核苷酸引入植物。如本文所用的，“引入”意指将所述多核苷酸或多肽呈送给所述植物，以此类方式使得所述序列进入所述植物细胞的内部。所述实施例的方法不取决于用于将多核苷酸或多肽引入植物中的特定方法，只要所述多核苷酸或多肽进入所述植物的至少一个细胞的内部即可。将多核苷酸或多肽引入植物的方法包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法。

如本文所用的，“稳定转化”意指经引入植物中的核苷酸构建体整合到所述植物的基因组中，并且能够被其子代遗传。如本文所用的，“瞬时转化”意指将多核苷酸引入所述植物中并且不整合到所述植物的基因组中，或者将多肽引入植物中。如本文所用的，“植物”是指整株植物、植物器官(例如叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、及其胚胎和子代。植物细胞可以是分化的或未分化的(例如愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶子细胞、根细胞、韧皮部细胞和花粉)。

转化方案以及将核苷酸序列引入植物中的方案可以根据要靶向转化的植物或植物细胞的类型(即，单子叶植物或双子叶植物)而异。将核苷酸序列引入到植物细胞中并随后插入到植物基因组中的合适方法包括显微注射(Crossway等人,(1986)Biotechniques[生物技术]4:320-334)、电穿孔(Riggs等人,(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]83:5602-5606)、农杆菌介导的转化(美国专利号5,563,055和5,981,840)、直接基因转移(Paszkowski等人,(1984)EMBO J[欧洲分子生物学学会杂志]3:2717-2722)以及弹道粒子加速(参见，例如美国专利号4,945,050；5,879,918；5,886,244和5,932,782；Tomes等人,(1995)Plant Cell,Tissue,and Organ Culture:Fundamental Methods[植物细胞、组织和器官培养：基本方法]，Gamborg和Phillips编辑(Springer-Verlag，Berlin[德国柏林施普林格出版公司])；和McCabe等人,(1988)Biotechnology[生物技术]6:923-926)；以及Lecl转化法(WO 00/28058)。对于马铃薯转化法，参见Tu等人,(1998)Plant MolecularBiology[植物分子生物学]37:829-838和Chong等人,(2000)Transgenic Research[转基因研究]9:71-78。可以在以下文献中找到另外的转化方法：Weissinger等人,(1988)Ann.Rev.Genet.[遗传学年鉴]22:421-477；Sanford等人,(1987)Particulate Scienceand Technology[微粒科学与技术]5:27-37(洋葱)；Christou等人,(1988)Plant Physiol.[植物生理学]87:671-674(大豆)；McCabe等人,(1988)Bio/Technology[生物/技术]6:923-926(大豆)；Finer和McMullen,(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.[体外细胞生物学和发育生物学]27P:175-182(大豆)；Singh等人,(1998)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]96:319-324(大豆)；Datta等人,(1990)Biotechnology[生物技术]8:736-740(水稻)；Klein等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]85:4305-4309(玉蜀黍)；Klein等人,(1988)Biotechnology[生物技术]6:559-563(玉蜀黍)；美国专利号5,240,855；5,322,783和5,324,646；Klein等人,(1988)Plant Physiol.[植物生理学]91:440-444(玉蜀黍)；Fromm等人,(1990)Biotechnology[生物技术]8:833-839(玉蜀黍)；Hooykaas-VanSlogteren等人,(1984)Nature[自然](伦敦)311:763-764；美国专利号5,736,369(谷类)；Bytebier等人,(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]84:5345-5349(百合科(Liliaceae))；De Wet等人,(1985)The Experimental Manipulation of Ovule Tissues[胚珠组织的实验操作],Chapman等人编辑(Longman[朗文出版社],纽约),第197-209页(花粉)；Kaeppler等人,(1990)Plant Cell Reports[植物细胞报告]9:415-418和Kaeppler等人,(1992)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]84:560-566(晶须介导的转化)；D'Halluin等人,(1992)Plant Cell[植物细胞]4:1495-1505(电穿孔)；Li等人,(1993)PlantCell Reports[植物细胞报告]，12:250-255以及Christou和Ford,(1995)Annals ofBotany[植物学年报]75:407-413(水稻)；Osjoda等人,(1996)Nature Biotechnology[自然生物技术]14:745-750(经由根癌农杆菌的玉蜀黍)；将其全部通过引用并入本文。

在具体实施例中，可以使用各种瞬时转化方法将实施例的序列提供给植物。此类瞬时转化法包括但不限于将IRDIG35563多核苷酸或其变体和片段直接引入植物中或将IRDIG35563多肽转录物引入植物中。此类方法包括例如显微注射或粒子轰击。参见，例如，Crossway等人,(1986)Mol Gen.Genet.[分子遗传学和普通遗传学]202:179-185；Nomura等人,(1986)Plant Sci.[植物科学]44:53-58；Hepler等人,(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.[美国科学院院报]91:2176-2180和Hush等人,(1994)The Journal of Cell Science[细胞科学杂志]107:775-784，将其全部通过引用并入本文。可替代地，可以使用以下将IRDIG35563多核苷酸瞬时转化到植物中：病毒载体系统中的技术并以阻止随后释放DNA的方式沉淀多核苷酸。因此，可以从粒子结合的DNA进行转录，但其被释放以整合至基因组的频率大大降低了。此类方法包括使用包被有聚乙烯亚胺(PEI；西格玛公司(Sigma)#P3143)的粒子。

用于将多核苷酸靶向插入植物基因组中特定位置的方法包括使用位点特异性重组系统实现将多核苷酸插入所需基因组位置。参见，例如，WO 1999/25821、WO 1999/25854、WO 1999/25840、WO 1999/25855和WO 1999/25853，将其全部通过引用并入本文。简而言之，实施例的多核苷酸可以包含在侧翼为两个不相同重组位点的转移盒内。将转移盒引入植物中，所述植物已经稳定地将靶位点并入其基因组中，所述靶位点侧翼为与转移盒的位点相对应的两个不相同的重组位点。提供适当的重组酶，并将所述转移盒整合到靶位点。由此，目的多核苷酸被整合在植物基因组中的具体染色体位置处。

植物转化载体可以由实现植物转化所需的一种或多种DNA载体构成，包括由多于一个的连续DNA片段构成的植物转化载体。这些载体通常被称为“二元载体”。二元载体以及具有辅助质粒的载体最常用于农杆菌介导的转化，其中实现有效转化所需的DNA片段的大小和复杂性相当大，并且将功能分离到单独的DNA分子上是有利的。二元载体典型地含有包含T-DNA转移(如左边界和右边界)所需的顺式作用序列的质粒载体、经工程改造成能够在植物细胞中表达的选择性标记、和“目的基因”(经工程改造成能够在需要产生转基因植物的植物细胞中表达的基因)。此质粒载体上也存在细菌复制所需的序列。将顺式作用序列以允许有效转移到植物细胞中并在其中表达的方式进行排列。例如，所述选择性标记基因和杀有害生物基因位于左边界和右边界之间。通常第二质粒载体包含反式作用因子，所述反式作用因子介导从农杆菌属到植物细胞的T-DNA转化。所述质粒通常含有允许通过农杆菌感染植物细胞、以及通过在边界序列切割进行DNA的转移和vir介导的DNA转移的毒力功能(Vir基因)(Hellens和Mullineaux,(2000)Trends in Plant Science[植物科学趋势]5:446-451)。若干种类型的农杆菌菌株(例如LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105等)可用于植物转化。通过其他方法如显微投影、显微镜注射、电穿孔、聚乙二醇等来转化植物不需要第二质粒载体。

通常，植物转化方法涉及将异源DNA转移到靶植物细胞中(例如未成熟或成熟的胚、悬浮培养物、未分化的愈伤组织、原生质体等)，随后施加最大阈值水平的适当选择(取决于选择性标记基因)以从一组未转化的细胞群中回收经转化的植物细胞。在将异源外源DNA整合到植物细胞中之后，然后在培养基中施加最大阈值水平的适当选择以杀死未转化的细胞，并通过定期转移到新鲜培养基中来分离并增殖从所述选择处理中存活的推定经转化的细胞。通过连续传代和使用适当的选择进行挑战，可以鉴定并增殖这些用所述质粒载体转化的细胞。然后，可以使用分子和生物化学的方法来证实整合到所述转基因植物的基因组中的目的异源基因的存在。

典型地将外植体转移到新鲜供应的相同培养基中并将其常规培养。随后，在被置于补充有最大阈值水平的选择剂的再生培养基上之后，所述经转化的细胞分化成芽。然后将所述芽转移到用于回收已生根的芽或小植物的选择性生根培养基上。然后转基因的小植株成长为成熟植物并产生稔性种子(例如Hiei等人,(1994)The Plant Journal 6:271-282；Ishida等人,(1996)Nature Biotechnology[自然生物技术]14:745-750)。典型地将外植体转移到新鲜供应的相同培养基中并将其常规培养。用于生产转基因植物的技术和方法的一般描述发现于以下文献中：Ayres和Park,(1994)Critical Reviews in PlantScience[植物科学评论]13:219-239以及Bommineni和Jauhar,(1997)Maydica[美迪卡杂志]42:107-120。由于经转化的材料含有许多细胞；所以在受试的靶愈伤组织或组织或细胞群的任何部分中同时存在经转化的细胞和未经转化的细胞。杀死未经转化的细胞并允许经转化细胞增殖的能力产生经转化的植物培养物。通常，去除未经转化的细胞的能力限制经转化的植物细胞的快速恢复和转基因植物的成功生成。

可依据常规方式将已转化的细胞培育成植株。参见，例如，McCormick等人,(1986)Plant Cell Reports[植物细胞报告]5:81-84。然后可以培育这些植株，并用相同的经转化株系或者不同的株系授粉，并鉴定出具有所需表型特征的组成型或诱导型表达的所得杂交体。可以培育两代或更多代，以确保所需表型特征的表达稳定地保持并遗传，并且然后收获种子以确保已经实现了所需表型特征的表达。

可以通过使植物与病毒或者病毒核酸接触而向植物提供实施例的核苷酸构建体。通常，此类方法涉及将目的核苷酸构建体掺入病毒DNA或RNA分子内。应当认识到，所公开的实施例包括IRDIG35563多肽，其最初作为病毒多蛋白的一部分合成，随后可以在体内或体外通过蛋白水解进行加工以产生所需的IRDIG35563多肽终产物。还认识到，包含实施例的IRDIG35563的至少一部分氨基酸序列的这种病毒多蛋白可具有所需的杀有害生物活性。此类病毒多蛋白和编码它们的核苷酸序列涵盖在所述实施例中。为植物提供核苷酸构建体并在植物中产生编码的蛋白的方法是本领域已知的，其涉及病毒DNA或RNA分子。参见，例如美国专利号5,889,191；5,889,190；5,866,785；5,589,367和5,316,931；通过引用并入本文。

转化叶绿体的方法可在例如以下中找到：Svab,等人,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]87:8526-8530；Svab和Maliga,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]90:913-917；Svab和Maliga,(1993)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:601-606。所述方法依赖于粒子枪递送含有选择性标记的DNA和通过同源重组将DNA靶向质体基因组。另外，通过利用核编码的和质体导向的RNA合酶的组织偏好性表达，通过反式激活沉默的质体携带的转基因，实现质体转化。这种系统已被报道于以下文献中：McBride等人,(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]91:7301-7305。

所述实施例进一步涉及实施例的经转化植物的植物繁殖材料，包括但不限于种子、块茎、球茎、鳞茎、叶以及根和芽的插条。

所述实施例可用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。目的植物的实例包括但不限于玉米(corn，Zea mays)，芸苔属(Brassica)物种(例如，甘蓝型油菜(B.napus)、芜菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea))(特别是可用作种子油来源的那些芸苔属物种)，苜蓿(紫花苜蓿(Medicago sativa))，水稻(rice，Oryza sativa)，黑麦(rye，Secale cereale)，高粱(sorghum，Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)，粟(例如，珍珠粟(pearl millet，Pennisetum glaucum)、黍(proso millet，Panicum miliaceum)、谷子(foxtail millet，Setaria italica)、龙爪稷(finger millet，Eleusine coracana))，向日葵(sunflower，Helianthus annuus)，红花(safflower，Carthamus tinctorius)，小麦(wheat，Triticum aestivum)，大豆(soybean，Glycine max)，烟草(tobacco，Nicotianatabacum)，马铃薯(potato，Solanum tuberosum)，花生(peanut，Arachis hypogaea)，棉花(海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))，甘薯(番薯(Ipomoeabatatas))，木薯(cassava，Manihot esculenta)，咖啡(咖啡属(Coffea)物种)，椰子(coconut，Cocos nucifera)，菠萝(pineapple，Ananas comosus)，柑橘树(柑橘属(Citrus)物种)，可可(cocoa，Theobroma cacao)，茶树(tea，Camellia sinensis)，香蕉(芭蕉属(Musa)物种)，鳄梨(avocado，Persea americana)，无花果(fig，Ficus casica)，番石榴(guava，Psidium guajava)，芒果(mango，Mangifera indica)，橄榄(olive，Oleaeuropaea)，木瓜(番木瓜(Carica papaya))，腰果(cashew，Anacardium occidentale)，澳洲坚果(macadamia，Macadamia integrifolia)，巴旦杏(almond，Prunus amygdalus)，甜菜(sugar beets，Beta vulgaris)，甘蔗(甘蔗属(Saccharum)物种)，燕麦，大麦，蔬菜，观赏植物和针叶树。

蔬菜包括番茄(tomatoes，Lycopersicon esculentum)、莴苣(例如，莴苣(Lactucasativa))、青豆(菜豆(Phaseolus vulgaris))、利马豆(lima bean，Phaseolus limensis)、豌豆(香豌豆属(Lathyrus)物种)和黄瓜属的成员例如黄瓜(cucumber，C.sativus)、香瓜(cantaloupe，C.cantalupensis)和甜瓜(musk melon，C.melo)。观赏植物包括杜鹃(杜鹃花属(Rhododendron)物种)、绣球花(hydrangea，Macrophylla hydrangea)、木槿(hibiscus，Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(蔷薇属(Rosa)物种)、郁金香(郁金香属(Tulipa)物种)、水仙(水仙属(Narcissus)物种)、矮牵牛(petunias，Petunia hybrida)、康乃馨(carnation，Dianthus caryophyllus)、一品红(poinsettia，Euphorbia pulcherrima)和菊花。可以用于实践实施例的针叶树包括(例如)松树如火炬松(loblolly pine，Pinus taeda)、湿地松(slash pine，Pinus elliotii)、西黄松(ponderosa pine，Pinus ponderosa)、黑松(lodgepole pine，Pinus contorta)和辐射松(Monterey pine，Pinus radiata)；花旗松(Douglas-fir，Pseudotsuga menziesii)；西方铁杉(Western hemlock，Tsugacanadensis)；北美云杉(Sitka spruce，Picea glauca)；红杉(redwood，Sequoiasempervirens)；枞树(true firs)，如银杉(胶冷杉(Abies amabilis))和胶枞(香脂冷杉(Abies balsamea))；以及雪松，如西方红雪松(北美乔柏(Thuja plicata))和阿拉斯加黄雪松(黄扁柏(Chamaecyparis nootkatensis))。所述实施例的植物包括作物植物(例如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔属、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、粟、烟草等)，如玉米和大豆植物。

草坪草包括但不限于：一年生早熟禾(annual bluegrass，Poa annua)；一年生黑麦草(黑麦草(Lolium multiflorum))；加拿大早熟禾(Canada bluegrass，Poacompressa)；紫羊茅(Chewing’s fescue，Festuca rubra)；细弱翦股颖(colonialbentgrass，Agrostis tenuis)；匍匐翦股颖(creeping bentgrass，Agrostis palustris)；沙生冰草(crested wheatgrass，Agropyron desertorum)；扁穗冰草(fairwaywheatgrass，Agropyron cristatum)；硬羊茅(长叶羊茅(Festuca longifolia))；草地早熟禾(Kentucky bluegrass，Poa pratensis)；鸭茅(orchardgrass，Dactylis glomerata)；多年生黑麦草(perennial ryegrass，Lolium perenne)；红狐茅(紫羊茅(Festuca rubra))；小糠草(redtop，Agrostis alba)；粗茎早熟禾(rough bluegrass，Poa trivialis)；羊茅(sheep fescue，Festuca ovina)；无芒雀麦(smooth bromegrass，Bromus inermis)；高羊茅(tall fescue，Festuca arundinacea)；梯牧草(timothy，Phleum pratense)；绒毛剪股颖(velvet bentgrass，Agrostis canina)；碱茅(weeping alkaligrass，Puccinelliadistans)；蓝茎冰草(western wheatgrass，Agropyron smithii)；狗牙根(狗牙根属(Cynodon)物种)；圣奥古斯丁草(St.Augustine grass，Stenotaphrum secundatum)；结缕草(结缕属(Zoysia)物种)；百喜草(Bahia grass，Paspalum notatum)；地毯草(carpetgrass，Axonopus affinis)；假俭草(centipede grass，Eremochloa ophiuroides)；隐花狼尾草(kikuyu grass，Pennisetum clandesinum)；海滨雀稗(seashore paspalum，Paspalumvaginatum)；格兰马草(blue gramma，Bouteloua gracilis)；野牛草(buffalo grass，Buchloe dactyloids)；垂穗草(sideoats gramma，Bouteloua curtipendula)。

目的植物包括提供目的种子的谷物类植物、油料种子植物和豆科植物。目的种子包括谷物种子，例如玉米、小麦、大麦、稻、高粱、黑麦、粟等。油料种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔属、玉蜀黍、苜蓿、棕榈、椰子、亚麻、蓖麻、橄榄等。豆科植物包括豆类和豌豆。豆类包括瓜耳豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等。

植物转化评估。在将异源外源DNA引入植物细胞后，通过各种方法(如分析与已整合的基因相关的核酸、蛋白质和代谢物)证实异源基因在所述植物基因组中的转化或整合。

PCR分析是移植到土壤中之前在早期阶段筛选转化的细胞、组织或芽中存在并入的基因的快速方法(Sambrook和Russell,(2001)Molecular Cloning:A LaboratoryManual.[分子克隆：实验手册]Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],Cold Spring Harbor[冷泉港],NY[纽约州])。使用对目的基因或农杆菌属载体背景等具有特异性的寡核苷酸引物进行PCR。

植物转化可以通过基因DNA印迹分析来证实(Sambrook和Russell,(2001)，同上)。通常，从转化体中提取总DNA，用适当的限制性酶消化，在琼脂凝胶中进行分级并转移到硝化纤维或尼龙膜上。然后用例如放射性标记的32P靶DNA片段探测膜或“印迹”，以证实根据标准技术将引入的基因整合到所述植物基因组中(Sambrook和Russell,(2001)，同上)。

在RNA印迹分析中，从转化体的特定组织中分离RNA，在甲醛琼脂凝胶中进行分级，并根据可在Sambrook和Russell,(2001)同上)中找到的标准方法印迹到尼龙过滤器上。然后通过本领域已知的方法通过将所述过滤器与来自杀有害生物基因的放射性探针杂交来测试由所述杀有害生物基因编码的RNA的表达(Sambrook和Russell,(2001)同上)。

可以对转基因植物进行蛋白质印迹、生物化学测定等，以通过标准程序(Sambrook和Russell,2001,同上)使用与IRDIG35563多肽上存在的一个或多个表位结合的抗体来证实由杀有害生物基因所编码的蛋白质的存在。

转基因拟南芥的昆虫生物测定。表达修饰的IRDIG35563蛋白的转基因拟南芥品系可用于在人工饮食覆盖测定中证明对敏感昆虫物种的活性。从转基因和非转基因拟南芥品系中提取的蛋白质可以通过适当的方法进行定量，并调整样品量以归一化蛋白质浓度。然后按如下所述对人工饮食进行生物测定。非转基因拟南芥和/或缓冲液和水应作为背景对照处理包括在测定中。

转基因玉蜀黍的生物测定。植物细胞中产生的IRDIG35563毒素和变体的生物活性也可以通过常规的生物测定方法来证明(参见例如Huang等人，2006)。可以通过在受控的喂食环境中将源自产生IRDIG35563毒素的植物的各种植物组织或组织块喂食给靶昆虫来测试功效。可替代地，可以由源自产生IRDIG35563毒素的植物的各种植物组织制备蛋白质提取物，并将提取的蛋白质掺入人工饮食生物测定中。应当理解，将这种喂食测定的结果与使用来自不产生IRDIG35563蛋白或变体的宿主植物的适当对照组织进行的类似生物测定或与其他对照样品进行比较。

将基因组编辑技术引入植物的方法。在一些实施例中，可以使用基因组编辑技术将所公开的IRDIG35563多核苷酸组合物引入植物的基因组中，或者可以使用基因组编辑技术编辑植物基因组中先前引入的IRDIG35563多核苷酸。例如，可以通过使用双链断裂技术(如TALEN、大范围核酸酶、锌指核酸酶、CRISPR-Cas等)将所公开的多核苷酸引入植物基因组中需要的位置上。例如，为了位点特异性插入的目的，可以使用CRISPR-Cas系统将所公开的多核苷酸引入基因组中需要的位置上。植物基因组中需要的位置可以是任何对于插入来说需要的靶位点，如适于育种的基因组区域，或者可以是位于具有现有的目的性状的基因组窗口中的靶位点。现有的目的性状可能是内源性状或先前引入的性状。

在一些实施例中，在将所公开的IRDIG35563多核苷酸先前已经引入到基因组中的情况下，可以使用基因组编辑技术来改变或修饰引入的多核苷酸序列。可以将位点特异性修饰引入所公开的IRDIG35563多核苷酸组合物中，所述位点特异性修饰包括使用用于引入位点特异性修饰的任何方法产生的修饰，所述方法包括但不限于通过使用基因修复寡核苷酸(例如美国公开2013/0019349)，或通过使用双链断裂技术，如TALEN、大范围核酸酶、锌指核酸酶、CRISPR-Cas等。此类技术可用于通过在引入的多核苷酸内的核苷酸的插入、缺失或取代来修饰先前引入的多核苷酸。可替代地，可以使用双链断裂技术向引入的多核苷酸中添加另外的核苷酸序列。可以添加的另外的序列包括另外的表达元件(如增强子序列和启动子序列)。在另一个实施例中，可以使用基因组编辑技术在植物基因组内定位紧邻本文公开的IRDIG35563多核苷酸组合物的另外的杀昆虫活性蛋白，以产生杀昆虫活性蛋白质的分子堆叠件。

“改变的靶位点”、“改变的靶序列”、“修饰的靶位点”和“修饰的靶序列”在本文中可互换地使用，并且意指如本文公开的靶序列，当与未改变的靶序列相比时，所述靶序列包含至少一个改变。此类“改变”包括，例如：(i)至少一个核苷酸的替代、(ii)至少一个核苷酸的缺失、(iii)至少一个核苷酸的插入、或(iv)(i)-(iii)的任何组合。

转基因植物中性状的堆叠。转基因植物可以包含本文公开的一种或多种杀昆虫多核苷酸与一种或多种另外的多核苷酸的堆叠件，导致多个多肽序列的产生或抑制。包含多核苷酸序列堆叠的转基因植物可以通过传统育种方法或通过遗传工程方法中的一种或两种获得。这些方法包含但不限于：育种各自包含目的多核苷酸的单个系，用随后的基因转化包含本文公开的基因的转基因植物，并将基因共转化为单个植物细胞。如本文所用的，术语“堆叠”包括使多个性状在同一植物中存在(即，将两个性状并入核基因组中，将一个性状并入核基因组中，并且将一个性状并入质体的基因组中，或者这两种性状都被并入质体的基因组中)。在一个非限制性实例中，“堆叠性状”包括其中序列在物理上彼此相邻的分子堆叠物。如本文所用的性状是指源自特定序列或序列组群的表型。可以使用包含多个基因或在多个载体上分别携带的基因的单一转化载体进行基因的共转化。如果通过遗传转化植物来堆叠序列，则目的多核苷酸序列可以在任意时间并以任意顺序组合。可以用共转化方案将所述性状与转化盒的任何组合所提供的目的多核苷酸一起引入。例如，若引入两个序列，则这两个序列可包含在分开的转化盒(反式)或包含在同一个转化盒(顺式)中。所述序列的表达可以通过相同的启动子或通过不同的启动子驱动。在某些情况下，可能需要引入将抑制目的多核苷酸的表达的转化盒。这可以与其他抑制盒或过度表达盒的任何组合进行组合以在所述植物中产生所需性状组合。进一步应当认识到，可以使用位点特异性重组系统在所需的基因组位置堆叠多核苷酸序列。参见，例如，WO 1999/25821、WO 1999/25854、WO 1999/25840、WO 1999/25855和WO 1999/25853，将其全部通过引用并入本文。

在一些实施例中，单独或与一种或多种另外的昆虫抗性性状堆叠的、编码本文公开的IRDIG35563多肽的多核苷酸可以与一种或多种另外的输入性状(例如，除草剂抗性、真菌抗性、病毒抗性、胁迫耐受性、抗病性、雄性不育性、茎强度等)或输出性状(例如，增加的产量、经修饰的淀粉、改善的油特性、平衡的氨基酸、高赖氨酸或甲硫氨酸、增加的消化性、改善的纤维品质、抗旱性等)堆叠。因此，多核苷酸实施例可用于提供具有灵活地且成本有效地控制任何数量的农艺有害生物的能力的经改善的作物品质的完整农艺学方案。

可用于堆叠的转基因包括但不限于：

1.转基因，其赋予昆虫抗性或抗病性并编码：

(A)植物抗病性基因。通常通过植物中抗病性基因(R)的产物与病原体中相应的无毒性(Avr)基因的产物之间的特异性相互作用来激活植物防御。可以用经克隆的抗性基因来转化植物变种，以工程改造对具体病原体菌株具有抗性的植物。参见，例如Jones等人,(1994)Science[科学]266:789(cloning of the tomato Cf-9gene for resistance toCladosporium fulvum[克隆番茄Cf-9基因以抵抗番茄叶霉病菌])；Martin等人,(1993)Science[科学]262:1432(tomato Pto gene for resistance to Pseudomonas syringaepv.tomato encodes a protein kinase[用于抵抗丁香假单胞菌番茄致病变体的番茄Pto基因编码蛋白激酶])；Mindrinos等人,(1994)Cell[细胞]78:1089(Arabidopsis RSP2genefor resistance to Pseudomonas syringae[拟南芥RSP2基因用于对抗丁香假单胞菌])，McDowell和Woffenden,(2003)Trends Biotechnol.[生物科技趋势]21(4):178-83以及Toyoda等人,(2002)Transgenic Res.[转基因研究]11(6):567-82。与野生型植物相比，对疾病具有抗性的植物对病原体更具抗性。

(B)编码苏云金芽孢杆菌蛋白质、其衍生物或其上建模的合成多肽的基因。参见，例如，Geiser等人,(1986)Gene[基因]48:109，其公开了Btδ-内毒素基因的克隆和核苷酸序列。此外，编码δ-内毒素基因的DNA分子可购自美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)(美国马里兰州罗克韦尔市(Rockville,Md.))，例如

登录号40098、67136、31995和31998下。经遗传工程改造的苏云金芽孢杆菌转基因的其他非限制性实例在以下专利和专利申请中给出，并为此目的通过引用并入本文：美国专利号5,188,960；5,689,052；5,880,275；5,986,177；6,023,013、6,060,594、6,063,597、6,077,824、6,620,988、6,642,030、6,713,259、6,893,826、7,105,332；7,179,965、7,208,474；7,227,056、7,288,643、7,323,556、7,329,736、7,449,552、7,468,278、7,510,878、7,521,235、7,544,862、7,605,304、7,696,412、7,629,504、7,705,216、7,772,465、7,790,846、7,858,849和WO 1991/14778；WO 1999/31248；WO 2001/12731；WO 1999/24581和WO 1997/40162。

编码杀有害生物蛋白的基因也可以堆叠，包括但不限于：来自假单胞菌属物种(Pseudomonas sp.)的杀昆虫蛋白，例如PSEEN3174(Monalysin；(2011)PLoS Pathogens[PLoS病原体]7:1-13)；来自假单胞菌蛋白菌(Pseudomonas protegens)菌株CHA0和Pf-5(之前为荧光假单胞菌(fluorescens))(Pechy-Tarr,(2008)Environmental Microbiology[环境微生物学]10:2368-2386；基因库登录号EU400157)；来自台湾假单胞菌(Liu等人,(2010)J.Agric.Food Chem.[农业与食品化学杂志],58:12343-12349)和来自假产碱假单胞菌(Zhang等人,(2009)Annals of Microbiology[微生物学杂志]59:45-50和Li等人,(2007)Plant Cell Tiss.Organ Cult.[植物细胞，组织和器官培养杂志]89:159-168)的杀昆虫蛋白；来自发光杆菌属物种和致病杆菌属物种(Hinchliffe等人,(2010)The OpenToxicology Journal[开放毒理学杂志],3:101-118和Morgan等人,(2001)Applied andEnvir.Micro.[应用与环境微生物学]67:2062-2069)的杀昆虫蛋白；来自美国专利号6,048,838和美国专利号6,379,946的杀昆虫蛋白；US 9,688,730的PIP-1多肽；US 9,475,847的AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽；美国公开号US 20160186204的PIP-47多肽；PCT公开号WO2016/114973的IPD045多肽、IPD064多肽、IPD074多肽、IPD075多肽、和IPD077多肽；PCT序列号PCT/US17/56517的IPD080多肽；序列号PCT/US17/54160的IPD078多肽、IPD084多肽、IPD085多肽、IPD086多肽、IPD087多肽、IPD088多肽、和IPD089多肽；美国专利公开号US20160366891的PIP-72多肽；美国公开号US 20170166921的PtIP-50多肽和PtIP-65多肽；美国序列号62/521084的IPD098多肽、IPD059多肽、IPD108多肽、IPD109多肽；美国公开号US20160347799的PtIP-83多肽；美国公开号US 20170233440的PtIP-96多肽；PCT公开号WO2017/23486的IPD079多肽；PCT公开号WO 2017/105987的IPD082多肽、序列号PCT/US17/30602的IPD090多肽、美国序列号62/434020的IPD093多肽；序列号PCT/US17/39376的IPD103多肽；美国序列号62/438179的IPD101多肽；美国序列号US 62/508,514的IPD121多肽；和δ-内毒素，包括但不限于Cry1、Cry2、Cry3、Cry4、Cry5、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry10、Cry11、Cry12、Cry13、Cry14、Cry15、Cry16、Cry17、Cry18、Cry19、Cry20、Cry21、Cry22、Cry23、Cry24、Cry25、Cry26、Cry27、Cry28、Cry29、Cry30、Cry31、Cry32、Cry33、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry38、Cry39、Cry40、Cry41、Cry42、Cry43、Cry44、Cry45、Cry46、Cry47、Cry49、Cry50、Cry51、Cry52、Cry53、Cry54、Cry55、Cry56、Cry57、Cry58、Cry59、Cry60、Cry61、Cry62、Cry63、Cry64、Cry65、Cry66、Cry67、Cry68、Cry69、Cry70、Cry71、和Cry72类的δ-内毒素多肽以及苏云金芽孢杆菌细胞溶解性cyt1和cyt2基因。这些类别的苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白的成员可在以下中找到：Crickmore等人,“Bacillus thuringiensistoxin nomenclature[苏云金芽孢杆菌毒素命名法]”(2011)，网址为lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/，其可以使用“www”前缀在万维网上访问)。

δ-内毒素的实例还包括但不限于：美国专利号5,880,275、7,858,849和8,878,007的Cry1A蛋白；US 9,512,187的Cry1Ac突变体；美国专利号8,304,604、8.304,605和8,476,226的DIG-3或DIG-11毒素(cry蛋白(如Cry1A、Cry3A)的α螺旋1和/或α螺旋2变体的N-末端缺失)；美国专利申请序列号10/525,318、美国专利申请公开号US 20160194364和美国专利号9,404,121和8,772,577的Cry1B；PCT公开号WO 2016/61197和序列号PCT/US17/27160的Cry1B变体；美国专利号6,033,874的Cry1C；US 20170233759的Cry1D蛋白；PCT序列号PCT/US17/53178的Cry1E蛋白；美国专利号5,188,960和6,218,188的Cry1F蛋白；美国专利号7,070,982；6,962,705和6,713,063的Cry1A/F嵌合体；PCT公开号WO 2017/0233759的Cry1I蛋白；美国公开US 20170240603的Cry1J变体；美国专利号7,064,249的Cry2蛋白如Cry2Ab蛋白和US 7208474的Cry2A.127蛋白；Cry3A蛋白，包括但不限于通过融合至少两种不同Cry蛋白的可变区和保守区的独特组合产生的经工程改造的杂合杀昆虫蛋白(eHIP)(美国专利申请公开号2010/0017914)；Cry4蛋白；Cry5蛋白；Cry6蛋白；美国专利号7,329,736、7,449,552、7,803,943、7,476,781、7,105,332、7,339,092、7,378,499、7,462,760和9,593,345的Cry8蛋白；Cry9蛋白，例如像Cry9A、Cry9B、Cry9C、Cry9D、Cry9E和Cry9F家族的成员，包括美国专利9,000,261和8,802,933以及美国序列号WO 2017/132188的Cry9蛋白；Cry15蛋白，描述于以下文献中：Naimov等人,(2008)Applied and Environmental Microbiology[应用与环境微生物学],74:7145-7151；美国专利号US 8,933,299的Cry14蛋白；美国专利号6,127,180、6,624,145和6,340,593的Cry22、Cry34Ab1蛋白；美国专利号US 8,816,157的截短的Cry34蛋白；美国专利号6,248,535、6,326,351、6,399,330、6,949,626、7,385,107和7,504,229的CryET33和cryET34蛋白；美国专利公开号2006/0191034、2012/0278954，和PCT公开号WO 2012/139004的CryET33和CryET34同源物；美国专利号6,083,499、6,548,291和6,340,593的Cry35Ab1蛋白；美国专利号9,403,881的Cry46蛋白、Cry 51蛋白、Cry二元毒素；TIC901或相关毒素；美国专利申请公开号2008/0295207的TIC807；美国专利US 8,513,493的TIC853；PCT US 2006/033867的ET29、ET37、TIC809、TIC810、TIC812、TIC127、TIC128；美国专利申请公开号US 20160150795的经工程改造的半翅目毒素蛋白，美国专利号8,236,757的AXMI-027、AXMI-036和AXMI-038；美国专利号7,923,602的AXMI-031、AXMI-039、AXMI-040、AXMI-049；WO 2006/083891的AXMI-018、AXMI-020和AXMI-021；WO 2005/038032的AXMI-010；WO 2005/021585的AXMI-003；美国专利申请公开号2004/0250311的AXMI-008；美国专利申请公开号2004/0216186的AXMI-006；美国专利申请公开号2004/0210965的AXMI-007；美国专利申请号2004/0210964的AXMI-009；美国专利申请公开号2004/0197917的AXMI-014；美国专利申请公开号2004/0197916的AXMI-004；WO 2006/119457的AXMI-028和AXMI-029；WO 2004/074462的AXMI-007、AXMI-008、AXMI-0080rf2、AXMI-009、AXMI-014和AXMI-004；美国专利号8,084,416的AXMI-150；美国专利申请公开号2011/0023184的AXMI-205；美国专利申请公开号2011/0263488的AXMI-011、AXMI-012、AXMI-013、AXMI-015、AXMI-019、AXMI-044、AXMI-037、AXMI-043、AXMI-033、AXMI-034、AXMI-022、AXMI-023、AXMI-041、AXMI-063和AXMI-064；美国专利US 8461421和US 8,461,422的AXMI046、AXMI048、AXMI050、AXMI051、AXMI052、AXMI053、AXMI054、AXMI055、AXMI056、AXMI057、AXMI058、AXMI059、AXMI060、AXMI061、AXMI067、AXMI069、AXMI071、AXMI072、AXMI073、AXMI074、AXMI075、AXMI087、AXMI088、AXMI093、AXMI070、AXMI080、AXMI081、AXMI082、AXMI091、AXMI092、AXMI096、AXMI097、AXMI098、AXMI099、AXMI100、AXMI101、AXMI102、AXMI103、AXMI104、AXMI107、AXMI108、AXMI109、AXMI110、AXMI111、AXMI112、AXMI114、AXMI116、AXMI117、AXMI118、AXMI119、AXMI120、AXMI121、AXMI122、AXMI123、AXMI124、AXMI125、AXMI126、AXMI127、AXMI129、AXMI151、AXMI161、AXMI164、AXMI183、AXMI132、AXMI137、AXMI138；美国专利申请公开号2010/0197592的AXMI-R1和相关蛋白；WO 2011/103248的AXMI221Z、AXMI222z、AXMI223z、AXMI224z和AXMI225z；WO 2011/103247的AXMI218、AXMI219、AXMI220、AXMI226、AXMI227、AXMI228、AXMI229、AXMI230和AXMI231；美国专利号8,334,431的AXMI-115、AXMI-113、AXMI-005、AXMI-163和AXMI-184；美国专利申请公开号2010/0298211的AXMI-001、AXMI-002、AXMI-030、AXMI-035和AXMI-045；美国专利申请公开号2009/0144852的AXMI-066和AXMI-076；美国专利号8,318,900的AXMI128、AXMI130、AXMI131、AXMI133、AXMI140、AXMI141、AXMI142、AXMI143、AXMI144、AXMI146、AXMI148、AXMI149、AXMI152、AXMI153、AXMI154、AXMI155、AXMI156、AXMI157、AXMI158、AXMI162、AXMI165、AXMI166、AXMI167、AXMI168、AXMI169、AXMI170、AXMI171、AXMI172、AXMI173、AXMI174、AXMI175、AXMI176、AXMI177、AXMI178、AXMI179、AXMI180、AXMI181、AXMI182、AXMI185、AXMI186、AXMI187、AXMI188、AXMI189；美国专利US 8461421的AXMI079、AXMI080、AXMI081、AXMI082、AXMI091、AXMI092、AXMI096、AXMI097、AXMI098、AXMI099、AXMI100、AXMI101、AXMI102、AXMI103、AXMI104、AXMI107、AXMI108、AXMI109、AXMI110、dsAXMI111、AXMI112、AXMI114、AXMI116、AXMI117、AXMI118、AXMI119、AXMI120、AXMI121、AXMI122、AXMI123、AXMI124、AXMI1257、AXMI1268、AXMI127、AXMI129、AXMI164、AXMI151、AXMI161、AXMI183、AXMI132、AXMI138、AXMI137；美国专利US 8,461,415的AXMI192；美国专利申请公开号US20160177332的AXMI281；美国专利号US 8,252,872的AXMI422；美国专利号8,319,019的具有修饰的蛋白水解位点的Cry蛋白如Cry1A和Cry3A；美国专利申请公开号2011/0064710的来自苏云金芽孢杆菌菌株VBTS 2528的Cry1Ac、Cry2Aa和Cry1Ca毒素蛋白。美国序列号62/607372的Cry蛋白MP032、MP049、MP051、MP066、MP068、MP070、MP091S、MP109S、MP114、MP121、MP134S、MP183S、MP185S、MP186S、MP195S、MP197S、MP208S、MP209S、MP212S、MP214S、MP217S、MP222S、MP234S、MP235S、MP237S、MP242S、MP243、MP248、MP249S、MP251M、MP252S、MP253、MP259S、MP287S、MP288S、MP295S、MP296S、MP297S、MP300S、MP304S、MP306S、MP310S、MP312S、MP314S、MP319S、MP325S、MP326S、MP327S、MP328S、MP334S、MP337S、MP342S、MP349S、MP356S、MP359S、MP360S、MP437S、MP451S、MP452S、MP466S、MP468S、MP476S、MP482S、MP522S、MP529S、MP548S、MP552S、MP562S、MP564S、MP566S、MP567S、MP569S、MP573S、MP574S、MP575S、MP581S、MP590、MP594S、MP596S、MP597、MP599S、MP600S、MP601S、MP602S、MP604S、MP626S、MP629S、MP630S、MP631S、MP632S、MP633S、MP634S、MP635S、MP639S、MP640S、MP644S、MP649S、MP651S、MP652S、MP653S、MP661S、MP666S、MP672S、MP696S、MP704S、MP724S、MP729S、MP739S、MP755S、MP773S、MP799S、MP800S、MP801S、MP802S、MP803S、MP805S、MP809S、MP815S、MP828S、MP831S、MP844S、MP852、MP865S、MP879S、MP887S、MP891S、MP896S、MP898S、MP935S、MP968、MP989、MP993、MP997、MP1049、MP1066、MP1067、MP1080、MP1081、MP1200、MP1206、MP1233、和MP1311。Cry蛋白的杀昆虫活性可以在例如van Frannkenhuyzen,(2009)J.Invert.Path.[无脊椎动物病理学杂志]101:1-16)中找到。Cry蛋白作为转基因植物性状的用途和Cry转基因植物(包括但不限于表达Cry1Ac、Cry1Ac+Cry2Ab、Cry1Ab、Cry1A.105、Cry1F、Cry1Fa2、Cry1F+Cry1Ac、Cry2Ab、Cry3A、mCry3A、Cry3Bb1、Cry34Ab1、Cry35Ab1、Vip3A、mCry3A、Cry9c和CBI-Bt的植物)已获得法规性审批(参见，Sanahuja,(2011)Plant Biotech Journal[植物生物技术杂志]9:283-300和CERA(2010)环境风险评估的转基因作物数据库中心(CERA)(GMCrop Database Center for Environmental Risk Assessment(CERA)),ILSI研究基金会(ILSI Research Foundation),华盛顿特区，网址为cera-gmc.org/index.php？action＝gm_crop_database，其可以使用“www”前缀在万维网上访问)。一种以上的杀有害生物蛋白也可以在植物中表达，例如Vip3Ab&Cry1Fa(US2012/0317682)；Cry1BE&Cry1F(US2012/0311746)；Cry1CA&Cry1AB(US2012/0311745)；Cry1F&CryCa(US2012/0317681)；Cry1DA&Cry1BE(US2012/0331590)；Cry1DA&Cry1Fa(US2012/0331589)；Cry1AB&Cry1BE(US2012/0324606)；Cry1Fa&Cry2Aa和Cry1I&Cry1E(US2012/0324605)；Cry34Ab/35Ab&Cry6Aa(US20130167269)；Cry34Ab/VCry35Ab&Cry3Aa(US20130167268)；Cry1Da&Cry1Ca(US9796982)；Cry3Aa&Cry6Aa(US 9798963)；以及Cry3A&Cry1Ab或Vip3Aa(US9,045,766)。杀有害生物蛋白还包括杀昆虫脂肪酶，所述杀昆虫脂肪酶包括美国专利号7,491,869的脂质酰基水解酶，和胆固醇氧化酶，如来自链霉菌属(Purcell等人,(1993)Biochem BiophysResCommun[生物化学与生物物理学研究通讯]15:1406-1413)。杀有害生物蛋白还包括美国专利号5,877,012、6,107,279、6,137,033、7,244,820、7,615,686和8,237,020中的VIP(营养期杀昆虫蛋白)毒素等。其他VIP蛋白质可在lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html上找到，其可以使用“www”前缀在万维网上访问。杀有害生物蛋白还包括PCT序列号PCT/US2017/000510的Cyt蛋白(包括Cyt1A变体)；杀有害生物蛋白还包括毒素复合物(TC)蛋白，所述毒素复合物(TC)蛋白可从生物体如致病杆菌属、发光杆菌属和类芽孢杆菌属获得(参见，美国专利号7,491,698和8,084,418)。一些TC蛋白具有“独立”杀昆虫活性并且其他TC蛋白增强由相同给定生物体产生的独立毒素的活性。可以通过源自不同属的来源生物体的一种或多种TC蛋白“增效剂”来增强“独立”TC蛋白(例如来自发光杆菌属、致病杆菌属或类芽孢杆菌属)的毒性。有三种主要类型的TC蛋白。如本文所提及的，A类蛋白(“蛋白A”)是独立毒素。B类蛋白(“蛋白B”)和C类蛋白(“蛋白C”)增强了A类蛋白的毒性。A类蛋白的实例是TcbA、TcdA、XptA1和XptA2。B类蛋白的实例是TcaC、TcdB、XptB1Xb和XptC1Wi。C类蛋白的实例是TccC、XptC1Xb和XptB1Wi。杀有害生物蛋白还包括蜘蛛、蛇和蝎毒蛋白。蜘蛛毒肽的实例包括但不限于莱科毒素-1肽及其突变体(美国专利号8,334,366)。

(C)编码昆虫特异性激素或信息素(如蜕化类固醇和保幼激素)、其变体、基于其的模拟物、或者其拮抗剂或激动剂的多核苷酸。参见，例如Hammock等人,(1990)Nature[自然]344:458，该文献公开了经克隆的保幼激素酯酶(保幼激素的灭活剂)的杆状病毒表达。

(D)编码昆虫特异性肽的多核苷酸，其在表达时破坏受影响有害生物的生理机能。例如，参见以下公开内容：Regan,(1994)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]269:9(表达克隆产生编码昆虫利尿激素受体的DNA)；Pratt等人,(1989)Biochem.Biophys.Res.Comm.[生物化学与生物物理研究通讯]163:1243(在太平洋折翅蠊(Diploptera puntata)中鉴定咽侧体抑制素(allostatin))；Chattopadhyay等人,(2004)Critical Reviews in Microbiology[微生物学评论]30(1):33-54；Zjawiony,(2004)J Nat Prod[天然产物杂志]67(2):300-310；Carlini和Grossi-de-Sa,(2002)Toxicon[毒素]40(11):1515-1539；Ussuf等人,(2001)Curr Sci.[当代科学]80(7):847-853以及Vasconcelos和Oliveira,(2004)Toxicon[毒素]44(4):385-403。还参见，Tomalski等人的美国专利号5,266,317，他们公开了编码昆虫特异性毒素的基因。

(E)编码如下酶的多核苷酸，所述多核苷酸负责单萜、倍半萜烯、类固醇、异羟肟酸、苯丙素衍生物或具有杀昆虫活性的其他非蛋白质分子的超累积。

(F)编码参与生物活性分子的修饰(包括翻译后修饰)的酶的多核苷酸；例如糖酵解酶、蛋白水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、环化酶、转氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、弹性蛋白酶、几丁质酶和葡聚糖酶，无论是天然还是合成的。参见，PCT申请WO1993/02197，所属人为Scott等人，该文献公开了愈创葡聚糖酶(callase)基因的核苷酸序列。含有几丁质酶编码序列的DNA分子可以例如从登录号39637和67152下的

获得。还参见，Kramer等人,(1993)Insect Biochem.Molec.Biol.[昆虫生物化学与分子生物学]23:691，他们教导编码烟草钩虫几丁质酶的cDNA的核苷酸序列；和Kawalleck等人,(1993)Plant Molec.Biol.[植物分子生物学]21:673，他们提供欧芹ubi4-2多泛素基因的核苷酸序列；以及美国专利号6,563,020、7,145,060和7,087,810。

(G)编码刺激信号转导的分子的多核苷酸。例如，参见Botella等人,(1994)PlantMolec.Biol.[植物分子生物学]24:757，该文献公开了绿豆钙调素cDNA克隆的核苷酸序列，以及Griess等人,(1994)Plant Physiol.[植物生理学]104:1467，他们提供了玉蜀黍钙调素cDNA克隆的核苷酸序列。

(H)编码疏水力矩肽(hydrophobic moment peptide)的多核苷酸。参见，PCT申请WO 1995/16776和美国专利号5,580,852，其公开了速普肽(其抑制真菌植物病原体)的肽衍生物，以及PCT申请WO 1995/18855和美国专利号5,607,914(教导了赋予疾病抗性的合成抗微生物肽)。

(I)编码膜通透酶、通道形成剂(channel former)或通道阻断剂的多核苷酸。例如，参见Jaynes等人,(1993)Plant Sci.[植物科学]89:43，该文献公开了天蚕素-β裂解肽类似物的异源表达，以提供对青枯假单胞菌(Pseudomonas solanacearum)具有抗性的转基因烟草植物。

(J)编码病毒侵入性蛋白质或由其衍生的复合毒素的基因。例如，病毒外壳蛋白在转化的植物细胞中的积累赋予对由外源蛋白基因来源的病毒以及由相关病毒导致的病毒感染和/或疾病发展的抗性。参见，Beachy等人,(1990)Ann.Rev.Phytopathol.[植物病理学年鉴]28:451。外壳蛋白介导的抗性已赋予经转化的植物抵抗苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草线条病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、烟草蚀纹病毒、烟草脆裂病毒和烟草花叶病毒。同上。

(K)编码昆虫特异性抗体或由其衍生的免疫毒素的基因。因此，靶向昆虫肠道中关键代谢功能的抗体将使受影响的酶失活，杀灭昆虫。Cf.Taylor等人，摘要#497，SEVENTHINT′L SYMPOSIUM ON MOLECULAR PLANT-MICROBE INTERACTIONS[关于分子植物-微生物相互作用的第七届国际研讨会](爱丁堡，苏格兰，1994)(通过生产单链抗体片段在转基因烟草中酶促失活)。

(L)编码病毒特异性抗体的基因。参见，例如Tavladoraki等人,(1993)Nature[自然]366:469，他们提出表达重组抗体基因的转基因植物不受病毒侵袭。

(M)编码由病原体或寄生虫在自然中产生的发育阻滞蛋白的多核苷酸。因此，真菌内α-1,4-D-多聚半乳糖醛酸酶通过溶解植物细胞壁均-α-1,4-D-半乳糖醛酸酶来促进真菌定植和植物营养释放。参见Lamb等人,(1992)Bio/Technology[生物技术]10:1436。Toubart等人,(1992)Plant J.[植物杂志]2:367描述了编码豆内聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的基因的克隆和表征。

(N)编码由植物在自然中产生的发育抑制蛋白的多核苷酸。例如，Logemann等人,(1992)Bio/Technology[生物技术]10:305表明，表达大麦核糖体失活基因的转基因植物具有增加的对真菌疾病的抗性。

(O)参与系统获得抗性(SAR)应答的基因和/或发病相关基因。Briggs,(1995)Current Biology[当代生物学]5(2)，Pieterse和Van Loon,(2004)Curr.Opin.Plant Bio.[植物生物学当代观点]7(4):456-64，以及Somssich,(2003)Cell[细胞]113(7):815-6。

(P)抗真菌基因(Cornelissen和Melchers,(1993)Pl.Physiol.[植物生理学]101:709-712，和Parijs等人,(1991)Planta[植物]183:258-264，以及Bushnell等人,(1998)Can.J.of Plant Path.[加拿大植物病理学杂志]20(2):137-149)。还参见，美国专利申请序列号09/950,933；11/619,645；11/657,710；11/748,994；11/774,121以及美国专利号6,891,085和7,306,946。用于感知几丁质片段的LysM受体样激酶作为对真菌病原体的植物防御应答中的第一步(US 2012/0110696)。

(Q)解毒基因，如伏马菌素、白僵菌素、念珠菌素和玉米赤霉烯酮及其结构相关的衍生物的基因。例如，参见美国专利号5,716,820；5,792,931；5,798,255；5,846,812；6,083,736；6,538,177；6,388,171和6,812,380。

(R)编码胱抑素(Cystatin)和半胱氨酸蛋白酶抑制剂的多核苷酸。参见，美国专利号7,205,453。

(S)防御素基因。参见，WO 2003/000863和美国专利号6,911,577；6,855,865；6,777,592和7,238,781。

(T)赋予对线虫抗性的基因。参见，例如PCT申请WO 1996/30517；PCT申请WO 1993/19181、WO 2003/033651，以及Urwin等人,(1998)Planta[植物]204:472-479，和Williamson,(1999)Curr Opin Plant Bio.[植物生物学当代观点]2(4):327-31；美国专利号6,284,948和7,301,069以及miR164基因(WO 2012/058266)。

(U)赋予对疫霉根腐病抗性的基因，如Rps 1、Rps 1-a、Rps 1-b、Rps 1-c、Rps 1-d、Rps 1-e、Rps 1-k、Rps 2、Rps 3-a、Rps 3-b、Rps 3-c、Rps 4、Rps 5、Rps 6、Rps 7和其他Rps基因。参见，例如Shoemaker等人,Phytophthora Root Rot Resistance Gene Mappingin Soybean[大豆中疫霉根腐病抗性基因图谱],Plant Genome IV Conference[植物基因组第四次会议]，圣迭戈市，加利福尼亚州(1995)。

(V)赋予对褐茎腐病抗性的基因，如美国专利号5,689,035所述，并为此目的通过引入并入本文。

(W)赋予对炭疽菌抗性的基因，如美国专利申请公开US 2009/0035765中所述，并为此目的通过引用并入本文。这包括可以用作单一基因座转化的Rcg基因座。

2.赋予对除草剂的抗性的转基因，例如：

(A)编码对如下除草剂的抗性的多核苷酸，所述除草剂抑制生长点或分生组织，如咪唑啉酮或磺酰脲。此类别的示例性基因编码突变体ALS和AHAS酶，分别如以下文献中所述：Lee等人,(1988)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]7:1241和Miki等人,(1990)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]80:449。还参见，美国专利号5,605,011；5,013,659；5,141,870；5,767,361；5,731,180；5,304,732；4,761,373；5,331,107；5,928,937和5,378,824；美国专利申请序列号11/683,737和国际公开WO 1996/33270。

(B)编码对草甘膦(分别由突变体5-烯醇丙酮酰-3-磷酸合酶(EPSP)和aroA基因赋予的抗性)和其他膦酰基化合物如草铵膦(草丁膦乙酰转移酶(PAT)、天蓝色链霉菌(A3)选择标记(DSM-2)和吸水链霉菌草丁膦乙酰转移酶(bar)基因)和吡啶氧基或苯氧基丙酸和环己酮(ACC酶抑制剂编码基因)有抗性的蛋白质的多核苷酸。参见，例如Shah等人的美国专利号4,940,835，其公开了EPSPS形式的能赋予草甘磷抗性的核苷酸序列。Barry等人的美国专利号5,627,061也描述了编码EPSPS酶的基因。还参见，美国专利号6,566,587；6,338,961；6,248,876；6,040,497；5,804,425；5,633,435；5,145,783；4,971,908；5,312,910；5,188,642；5,094,945、4,940,835；5,866,775；6,225,114；6,130,366；5,310,667；4,535,060；4,769,061；5,633,448；5,510,471；Re.36,449；RE 37,287E和5,491,288以及国际公开EP1173580；WO 2001/66704；EP 1173581和EP 1173582，为此目的将以上专利通过引用并入本文。还给予植物草甘磷抗性，使所述植物表达编码草甘磷氧化还原酶的基因，这在美国专利号5,776,760和5,463,175中进行了更全面地描述，为此目的将这两份专利通过引用并入本文。另外，可通过过量表达编码草甘磷N-乙酰转移酶的基因，来赋予植物草甘磷抗性。参见，例如美国专利号7,462,481；7,405,074以及美国专利申请公开号2008/0234130。编码突变aroA基因的DNA分子可以在

登录号39256下获得，并且所述突变基因的核苷酸序列公开于Comai的美国专利号4,769,061中。Kumada等人的欧洲申请号0 333 033和Goodman等人的美国专利号4,975,374公开了赋予除草剂(如L-草铵膦)抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列。Leemans等人的EP申请号0 242 246和0 242 236中提供了草丁膦乙酰基转移酶基因的核苷酸序列；De Greef等人,(1989)Bio/Technology[生物技术],7:61描述了表达编码草丁膦乙酰转移酶活性的嵌合bar基因的转基因植物的生产。还参见，美国专利号5,969,213；5,489,520；5,550,318；5,874,265；5,919,675；5,561,236；5,648,477；5,646,024；6,177,616和5,879,903，为此目的将以上专利通过引用并入本文。US 2011/0107455公开了DSM-2基因和基因产物序列以及它们在草铵膦除草剂抗性植物中的用途。赋予苯氧基丙酸和环己酮(如稀禾啶和吡氟氯禾灵)抗性的示例性基因是Acc1-S1、Acc1-S2和Acc1-S3基因，其描述于以下文献中：Marshall等人,(1992)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]83:435。

(C)编码对抑制光合作用的除草剂(如三嗪(psbA和gs+基因)和苯甲氰(腈水解酶基因))具有抗性的蛋白质的多核苷酸。Przibilla等人,(1991)Plant Cell[植物细胞]3:169描述了用编码突变体psbA基因的质粒对衣藻进行转化。Stalker的美国专利号4,810,648中公开了腈水解酶基因的核苷酸序列，并且包含这些基因的DNA分子可在

登录号53435、67441和67442下获得。编码谷胱甘肽S-转移酶的DNA的克隆和表达描述于以下文献中：Hayes等人,(1992)Biochem.J.[生物化学杂志]285:173。

(D)编码已经被引入到各种植物中对乙酰羟酸合酶具有抗性的蛋白质的多核苷酸，已经发现其使表达此酶的植物对多种类型的除草剂具有抗性(参见，例如，Hattori等人,(1995)Mol Gen Genet.[分子和普通遗传学]246:419)。赋予除草剂抗性的其他基因包括：编码大鼠细胞色素P4507A1和酵母NADPH-细胞色素P450氧化还原酶的嵌合蛋白的基因(Shiota等人,(1994)Plant Physiol[植物生理学]106:17)，针对谷胱甘肽还原酶和超氧化物歧化酶的基因(Aono等人,(1995)Plant Cell Physiol[植物细胞生理学]36:1687)和各种磷酸转移酶的基因(Datta等人,(1992)Plant Mol Biol[植物分子生理学]20:619)。

(E)编码对靶向原卟啉原氧化酶(protox)的除草剂的抗性的多核苷酸，所述原卟啉原氧化酶是生产叶绿素所必需的。原卟啉原氧化酶用作多种除草剂化合物的靶标。这些除草剂还抑制存在的所有不同种类的植物的生长，导致其完全破坏。对这些除草剂具有抗性的、含有经改变的原卟啉原氧化酶活性的植物的开发描述于以下文献中：美国专利号6,288,306；6,282,83和5,767,373，以及国际公开WO 2001/12825。

(F)aad-1基因(最初来自鞘脂单胞菌(Sphingobium herbicidovorans))编码芳氧基链烷酸酯双加氧酶(AAD-1)蛋白。所述性状赋予对2,4-二氯苯氧基乙酸和芳氧基苯氧基丙酸酯(通常称为“fop”除草剂，如喹禾灵)除草剂的耐受性。用于植物中除草剂耐受性的aad-1基因本身首先在WO 2005/107437中公开(还参见US 2009/0093366)。来自食酸丛毛单胞菌(Delftia acidovorans)的aad-12基因，其编码芳氧基链烷酸酯双加氧酶(AAD-12)蛋白，所述蛋白通过用芳氧基链烷酸酯部分(包括苯氧基生长素(例如2,4-D，MCPA)以及吡啶氧基生长素(例如氯氟吡氧乙酸，三氯吡氧乙酸))使若干种除草剂失活来赋予对2,4-二氯苯氧基乙酸和吡啶氧基乙酸酯除草剂的耐受性。

(G)编码美国专利申请公开2003/0135879中公开的、用于赋予麦草畏耐受性的除草剂抗性麦草畏单加氧酶的多核苷酸；

(H)编码美国专利号4,810,648中所公开的、用于赋予溴苯腈耐受性的溴草腈腈水解酶(Bxn)的多核苷酸分子；

(I)编码以下文献中描述的、用于达草灭耐受性的八氢番茄红素(crtl)的多核苷酸分子：Misawa等人,(1993)Plant J.[植物杂志]4:833-840和Misawa等人,(1994)PlantJ.[植物杂志]6:481-489。

3.赋予或贡献于改变的谷物特征的转基因；

4.控制雄性不育的基因；

5.创建用于位点特异性DNA整合的位点的基因；

6.影响非生物胁迫抗性的基因；

7.赋予增加的产量的基因；和/或

8.赋予植物可消化性的基因。

9.基因沉默。在一些实施例中，堆叠的性状可以处于一种或多种目的多核苷酸沉默的形式，导致对一种或多种靶有害生物多肽的抑制。在一些实施例中，使用抑制DNA构建体来实现该沉默。

在一些实施例中，编码IRDIG35563多肽或其片段或变体的一种或多种多核苷酸可以与编码具有如上所述的杀昆虫活性或农艺性状的一种或多种多肽的一种或多种多核苷酸堆叠，并且任选地可以进一步包括提供如下文所述一种或多种靶多核苷酸的基因沉默的一种或多种多核苷酸。

“抑制DNA构建体”是重组DNA构建体，当被转化或稳定整合到植物的基因组中时，导致所述植物中靶基因的“沉默”。所述靶基因对于所述植物可以是内源的或转基因的。如本文中关于靶基因所用的“沉默”通常是指抑制由所述靶基因表达的mRNA或蛋白质/酶的水平，和/或酶活性或蛋白质功能性的水平。术语“抑制”包括调低、降低、下降、减少、阻抑、消除和预防。“沉默”或“基因沉默”并没有指定机制，并且包括但不限于反义、共抑制、病毒抑制、发夹抑制、茎环抑制、基于RNAi的方法和基于小RNA的方法。

一些实施例涉及通过干扰核糖核酸(RNA)分子下调昆虫有害生物物种中靶基因的表达。PCT公开WO 2007/074405描述了抑制无脊椎动物有害生物(包括科罗拉多马铃薯甲虫(Colorado potato beetle))中靶基因表达的方法。PCT公开WO 2005/110068描述了抑制无脊椎动物有害生物(包括西方玉米根虫)中靶基因表达以防治昆虫侵染的方法。此外，PCT公开WO 2009/091864描述了用于抑制来自昆虫有害生物物种(包括来自草盲蝽属的有害生物)的靶基因的组合物和方法。核酸分子包括用于靶向液泡ATP酶H亚基的RNAi，可用于控制如美国专利申请公开号2012/0198586中所述的鞘翅目有害生物群体和侵染。PCT公开WO2012/055982描述了抑制或下调如下靶基因的表达的核糖核酸(RNA或双链RNA)，所述靶基因编码：昆虫核糖体蛋白，如核糖体蛋白L19、核糖体蛋白L40或核糖体蛋白S27A；昆虫蛋白酶体亚基，如Rpn6蛋白、Pros 25、Rpn2蛋白、蛋白酶体β1亚基蛋白或Prosβ2蛋白；COPI囊泡的昆虫β-外被体、COPI囊泡的γ-外被体、COPI囊泡的β'-外被体蛋白或ζ-外被体；昆虫跨膜四蛋白(Tetraspanin)2A蛋白(推定的跨膜结构域蛋白)；属于肌动蛋白家族的昆虫蛋白，如肌动蛋白5C；昆虫泛素-5E蛋白；昆虫Sec23蛋白，其是参与细胞内蛋白质转运的GTP酶激活剂；涉及运动活性的作为非常规肌球蛋白的昆虫皱纹蛋白质；涉及核替代mRNA剪接调节的昆虫曲颈蛋白；昆虫囊泡H+-ATP酶G亚基蛋白和昆虫Tbp-1如Tat结合蛋白。PCT公开WO2007/035650描述了抑制或下调编码Snf7的靶基因表达的核糖核酸(RNA或双链RNA)。美国专利申请公开2011/0054007描述了靶向RPS10的多核苷酸沉默元件。美国专利申请公开2014/0275208和US2015/0257389描述了靶向RyanR和PAT3的多核苷酸沉默元件。PCT专利申请公开WO2016/138106描述了靶向外被体α或γ的多核苷酸沉默元件。美国专利申请公开2012/029750、US 20120297501和2012/0322660描述了干扰核糖核酸(RNA或双链RNA)，所述干扰核糖核酸在被昆虫有害生物物种摄取时起作用以下调昆虫有害生物中靶基因的表达，其中所述RNA包含至少一个沉默元件，其中所述沉默元件是包含经退火的互补链的双链RNA区域，所述双链RNA区域的一条链包含或由如下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列至少部分地与靶基因中的靶核苷酸序列互补。美国专利申请公开2012/0164205描述了干扰双链核糖核酸以抑制无脊椎动物有害生物的潜在靶标，包括：Chd3同源序列、β-微管蛋白同源序列、40kDa V-ATP酶同源序列、EF1α同源序列、26S蛋白质体亚基p28同源序列、保幼激素环氧化物酶水解酶同源序列、溶胀依赖氯通道蛋白同源序列、葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶蛋白同源序列、Act42A蛋白同源序列、ADP-核糖因子1同源序列、转录因子IIB蛋白同源序列、几丁质酶同源序列、泛素缀合酶同源序列、甘油醛-3-磷酸脱氢酶同源序列、泛素B同源序列、保幼激素酯酶同源物、和α微管蛋白同源序列。

在有害生物控制方面的用途。在有害生物控制或使其他生物体工程化中使用包含实施例的核酸序列或其变体的菌株作为杀有害生物剂的一般方法是本领域已知的。

可以选择已知占据一种或多种目的作物的“植物圈”(叶面、叶际、根围和/或根面)的微生物宿主。选择这些微生物以便能够在具体环境中成功地与野生型微生物竞争，为表达IRDIG35563多肽的基因供给稳定的维持和表达，并且理想的是，增加对该杀有害生物剂的保护使其不受环境降解和失活的影响。

或者，通过将异源基因引入细胞宿主中来产生IRDIG35563多肽。异源基因的表达直接或间接地导致杀有害生物剂在细胞内产生和维持。然后，当将细胞应用于一种或多种靶有害生物的环境中时，在延长所述细胞中所产生的毒素的活性的条件下处理这些细胞。所得产物保留所述毒素的毒性。然后可以根据常规技术配制这些天然包封的IRDIG35563多肽，以施用于靶有害生物所寄宿的环境(例如，土壤、水和植物的叶子)中。参见，例如EPA0192319及其中引用的参考文献。

喷涂应用是另一个实例，并且在本领域中也是已知的。可以对主题蛋白质进行适当配制用于所需的最终用途，然后在发现侵染之前，在发现靶昆虫之后，在所述之前且所述之后等，将其喷雾(或以其他方式施用)到植物上或植物周围或要保护的植物附近。例如，也可以使用诱饵颗粒并且是本领域已知的。

杀有害生物组合物。在一些实施例中，活性成分能以组合物的形式施用并且可以与其他化合物同时或相继施用于需要处理的作物区域或植物。这些化合物可以是在单次施用所述配制品后允许长期对靶区域进行给予的肥料、除草剂、冷冻保护剂、表面活性剂、洗涤剂、杀有害生物肥皂、休眠油、聚合物和/或延时释放的或可生物降解的运载体配制品。它们还可以是选择性除草剂、化学杀昆虫剂、杀病毒剂、杀微生物剂、杀变形虫剂、杀有害生物剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂或这些制剂中的若干种的混合物，如果需要，与另外的农业上可接受的运载体、表面活性剂或促进施用的佐剂一起可用于配制品中。合适的运载体和佐剂可以是固体或液体，并且对应于在配制品技术中常常采用的物质，例如天然的或再生的矿物质、溶剂、分散剂、润湿剂、增粘剂、粘合剂或肥料。类似地，配制品可以制备成可食用的“诱饵”或者塑成有害生物“陷阱”以允许靶有害生物取食或摄取所述有害生物配制品。

施用含有由细菌菌株产生的IRDIG35563多肽中的至少一种的活性成分或农用化学组合物的方法包括叶子施用、种子包衣和土壤施用。施用次数和施用速度取决于相应有害生物侵染的强度。

可以将组合物配制成粉末、尘剂、丸剂、颗粒、喷雾、乳液、胶体、溶液等，并且可以通过干燥、冻干、匀浆、萃取、过滤、离心、沉降或浓缩包含所述多肽的细胞培养物等常规方法进行制备。在所有这类含有至少一种这样的杀有害生物多肽的组合物中，所述多肽能以按重量计从约1％至约99％的浓度存在。

可以通过本公开的方法在每个区域中杀灭鳞翅目、双翅目、异翅目、线虫、半翅目或鞘翅目有害生物或减少其数量，或者可以预防性地将其施用于环境区域以防止易感有害生物的侵染。优选地，所述有害生物摄入杀有害生物有效量的多肽或与其接触。如本文所使用的“杀有害生物有效量”是指能够对至少一种有害生物造成死亡或显著减少有害生物生长、取食或正常生理发育的有害生物的量。所述量将根据例如待控制的具体靶有害生物，待处理的特定环境、地点、植物、作物或农业场所，环境条件以及杀有害生物有效的多肽组合物施用的方法、速率、浓度、稳定性和数量等因素而变化。配制品也可以根据气候条件、环境因素和/或施用频率和/或有害生物侵染的严重程度而变化。

可以通过用所需的农业上可接受的运载体配制细菌细胞、晶体和/或芽孢悬浮液或分离的蛋白组分来制备所需的杀有害生物剂组合物。可以在施用之前以适当方式(如冻干、冷冻干燥、干燥)或者在水性运载体、培养基或合适的稀释剂(例如盐水或另一种缓冲液)中配制这些组合物。配制的组合物可以是尘剂或颗粒状物质的形式或者在油(植物或矿物)或水或油/水乳液中的悬浮液或者作为可湿性粉剂或者与适用于农业应用的任何其他运载体材料组合的形式。合适的农业运载体可以是固体或液体。术语“农业上可接受的运载体”涵盖通常用于杀有害生物剂配制技术的所有佐剂、惰性组分、分散剂、表面活性剂、增粘剂、粘合剂等；这些是杀有害生物剂配制技术人员所熟知的。配制品可以与一种或多种固体或液体佐剂混合，并通过各种方法(例如通过使用常规配制技术将杀有害生物组合物与合适的佐剂均匀混合、共混和/或研磨)制备。美国专利号6,468,523中描述了合适的配制品和施用方法，其通过引用并入本文。还可以用一种或多种化学组合物处理植物，所述化学组合物包括一种或多种除草剂、杀昆虫剂或杀真菌剂。

示例性化学组合物包括：果实/蔬菜除草剂：莠去津、除草定、敌草隆、草甘膦、利谷隆、嗪草酮、西玛津、氟乐灵、吡氟禾草灵、草铵膦、氯吡嘧磺隆Gowan、百草枯、戊炔草胺、烯禾啶、氟丙嘧草酯、氯吡嘧磺隆、茚嗪氟草胺(Indaziflam)；果实/蔬菜杀昆虫剂：涕灭威、苏云金芽孢杆菌、甲萘威、克百威、毒死蜱、氯氰菊酯、溴氰菊酯、二嗪磷、马拉硫磷、阿维菌素、氟氯氰菊酯/β-氟氯氰菊酯、高氰戊菊酯、λ-氯氟氰菊酯、灭螨醌、联苯肼酯、甲氧虫酰肼、双苯氟脲、环虫酰肼、噻虫啉、呋虫胺、嘧螨酯、唑虫酰胺、噻虫胺、螺螨酯、γ-氯氟氰菊酯、螺甲螨酯、多杀菌素、氯虫酰胺、氰虫酰胺、Spinoteram、杀虫脲、螺虫乙酯、吡虫啉、氯虫双酰胺、硫双威、氰氟虫腙、氟啶虫胺腈、丁氟螨酯、Cyanopyrafen、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、Spinotoram、硫双威、氟啶虫酰胺、甲硫威、因灭汀-苯甲酸盐、茚虫威、噻唑磷、苯线磷、硫线磷、蚊蝇醚、苯丁锡、噻螨酮、灭多威、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮；果实/蔬菜杀真菌剂：多菌灵、百菌清、EBDC、硫、甲基硫菌灵、嘧菌酯、霜脲氰、氟啶胺、乙膦酸、异菌脲、醚菌酯、甲霜灵/精甲霜灵、肟菌酯、噻唑菌胺、丙森锌、肟菌酯、环酰菌胺、富马酸噁咪唑、氰霜唑、咪唑菌酮、苯酰菌胺、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯、环氟菌胺、啶酰菌胺；谷物除草剂：异丙隆、溴苯腈、碘苯腈、苯氧基类、氯磺隆、炔草酸、禾草灵、吡氟草胺、噁唑禾草灵、双氟磺草胺、氟草烟、甲磺隆、醚苯磺隆、氟酮磺隆、碘磺隆、丙苯磺隆、氟吡酰草胺、甲磺胺磺隆、氟丁酰草胺、唑啉草酯、酰嘧磺隆、噻吩磺隆甲基、苯磺隆、氟啶嘧磺隆、磺酰磺隆、磺酰草吡唑、甲氧磺草胺、氟噻草胺、肟草酮、吡咯磺隆；谷物杀真菌剂：多菌灵、百菌清、嘧菌酯、环唑醇、嘧菌环胺、丁苯吗啉、氟环唑、醚菌酯、喹氧灵、戊唑醇、肟菌酯、硅氟唑、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯、醚菌胺、丙硫菌唑、氟嘧菌酯；谷物杀昆虫剂：乐果、λ-氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、α-氯氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、联苯菊酯、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、Clorphyriphos、甲胺磷、乙酰甲胺磷、抗蚜威、甲硫威；玉蜀黍除草剂：莠去津、甲草胺、溴苯腈、乙草胺、麦草畏、二氯吡啶酸、(S-)二甲酚草胺、草铵膦、草甘膦、异噁唑草酮、(S-)异丙甲草胺、甲基磺草酮、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、砜嘧磺隆、磺草酮、甲酰胺磺隆、苯吡唑草酮、环磺酮(Tembotrione)、嘧啶肟草醚、酮脲磺草吩酯、氟噻草胺、吡咯磺隆；玉蜀 黍杀昆虫剂：克百威、毒死蜱、联苯菊酯、氟虫腈、吡虫啉、λ-氯氟氰菊酯、七氟菊酯、特丁硫磷、噻虫嗪、噻虫胺、螺甲螨酯、氯虫双酰胺、杀虫脲、氯虫酰胺、溴氰菊酯、硫双威、β-氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、联苯菊酯、虱螨脲、杀虫隆、七氟菊酯、嘧丙磷、乙虫腈、氰虫酰胺、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、阿维菌素、甲硫威、螺螨酯、螺虫乙酯；玉蜀黍杀真菌剂：种衣酯、福美双、丙硫菌唑、戊唑醇、肟菌酯；水稻除草剂：丁草胺、敌稗、四唑嘧磺隆、苄嘧磺隆、氰氟草酯、杀草隆、四唑酰草胺、唑吡嘧磺隆、苯噻草胺、去稗安、吡嘧磺隆、稗草畏、二氯喹啉酸、禾草丹、茚草酮、氟噻草胺、四唑酰草胺、氯吡嘧磺隆、去稗安、苯并双环酮、环酯草醚、五氟磺草胺、双草醚、丙炔噁草酮、乙氧嘧磺隆、丙草胺、甲基磺草酮、特呋三酮、噁草酮、噁唑禾草灵、吡丙醚；水稻杀昆虫剂：二嗪磷、杀螟硫磷、仲丁威、久效磷、丙硫克百威、噻嗪酮、呋虫胺、氟虫腈、吡虫啉、异丙威、噻虫啉、环虫酰肼、噻虫啉、呋虫胺、噻虫胺、乙虫腈、氯虫双酰胺、氯虫酰胺、溴氰菊酯、啶虫脒、噻虫嗪、氰虫酰胺、多杀菌素、Spinotoram、因灭汀-苯甲酸盐、氯氰菊酯、毒死蜱、杀螟丹、甲胺磷、醚菊酯、三唑磷、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、克百威、丙硫克百威；水稻杀真菌剂：甲基硫菌灵、嘧菌酯、环丙酰菌胺、敌瘟磷、嘧菌腙、异稻瘟净、稻瘟灵、戊菌隆、噻菌灵、咯喹酮、三环唑、肟菌酯、双氯氰菌胺、氰菌胺、硅氟唑、噻酰菌胺；棉花除草剂：敌草隆、伏草隆、MSMA、乙氧氟草醚、扑草净、氟乐灵、唑草酮、烯草酮、吡氟禾草灵-丁基、草甘膦、达草灭、二甲戊乐灵、嘧硫草醚钠、三氟啶磺隆、得杀草、草铵膦、丙炔氟草胺、塞苯隆；棉花杀昆虫剂：乙酰甲胺磷、涕灭威、毒死蜱、氯氰菊酯、溴氰菊酯、马拉硫磷、久效磷、阿维菌素、啶虫脒、因灭汀-苯甲酸盐、吡虫啉、茚虫威、λ-氯氟氰菊酯、多杀菌素、硫双威、γ-氯氟氰菊酯、螺甲螨酯、啶虫丙醚、氟啶虫酰胺、氯虫双酰胺、杀虫脲、氯虫酰胺、β-氟氯氰菊酯、螺虫乙酯、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、呋虫胺、氯虫双酰胺、氰虫酰胺、多杀菌素、Spinotoram、γ-氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、硫双威、阿维菌素、氟啶虫酰胺、啶虫丙醚、螺甲螨酯、氟啶虫胺腈、丙溴磷、三唑磷、硫丹；棉花杀真菌剂：土菌灵、甲霜灵、喹硫磷；大豆除草剂：甲草胺、灭草松、氟乐灵、氯嘧磺隆-乙基、氯酯磺草胺、噁唑禾草灵、氟磺胺草醚、吡氟禾草灵、草甘膦、甲氧咪草烟、灭草喹、咪草烟、(S-)异丙甲草胺、嗪草酮、二甲戊乐灵、得杀草、草铵膦；大豆杀昆虫剂：λ-氯氟氰菊酯、灭多威、对硫磷、硫威(Thiocarb)、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、氯虫双酰胺、氯虫酰胺、氰虫酰胺、多杀菌素、Spinotoram、因灭汀-苯甲酸盐、氟虫腈、乙虫腈、溴氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、γ和λ氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、螺虫乙酯、螺螨酯、杀虫脲、氟啶虫酰胺、硫双威、β-氟氯氰菊酯；大豆杀真菌剂：嘧菌酯、环唑醇、氟环唑、粉唑醇、吡唑醚菌酯、戊唑醇、肟菌酯、丙硫菌唑、四氟醚唑；甜菜除草剂：杀草敏、甜菜安、乙氧氟草黄、甜菜宁、野麦畏、二氯吡啶酸、吡氟禾草灵、环草定、苯嗪草酮、喹草酸、噻草酮、氟胺磺隆、得杀草、喹禾灵；甜菜杀昆虫剂：吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、溴氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、γ/λ氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、七氟菊酯、氯虫酰胺、氰虫酰胺、氟虫腈、克百威；低芥酸油菜除草剂：二氯吡啶酸、禾草灵、吡氟禾草灵、草铵膦、草甘膦、吡草胺、氟乐灵、胺苯磺隆、喹草酸、喹禾灵、烯草酮、得杀草；低芥酸油菜杀真菌剂：嘧菌酯、多菌灵、咯菌腈、异菌脲、丙氯灵、烯菌酮；低芥酸油菜杀昆虫 剂：克百威、有机磷酸盐类、拟除虫菊酯、噻虫啉、溴氰菊酯、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、啶虫脒、呋虫胺、β-氟氯氰菊酯、γ以及λ氯氟氰菊酯、τ-氟氰胺菊酯、乙虫腈、多杀菌素、Spinotoram、氯虫双酰胺、氯虫酰胺、氰虫酰胺、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮。

在一些实施例中，除草剂是莠去津、除草定、敌草隆、氯磺隆、甲磺隆、噻吩磺隆甲基、苯磺隆、乙草胺、麦草畏、异噁唑草酮、烟嘧磺隆、砜嘧磺隆、嘧硫草醚钠、丙炔氟草胺、氯嘧磺隆-乙基、嗪草酮、喹禾灵、精-异丙甲草胺(S-metolachlor)、环己通(Hexazinne)或其组合。

在一些实施例中，杀昆虫剂是高氰戊菊酯、氯虫苯甲酰胺、灭多威、茚虫威、草氨酰或其组合。

杀有害生物和杀昆虫活性。“有害生物”包括但不限于：昆虫、真菌、细菌、线虫、螨、蜱等。昆虫有害生物包括选自以下各目的昆虫：鞘翅目、双翅目、膜翅目(Hymenoptera)、鳞翅目、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目、直翅目(Orthroptera)、缨翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、虱目(Anoplura)、蚤目(Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)等，特别是鳞翅目和鞘翅目。

实施例的化合物显示针对昆虫有害生物的活性，其可以包括经济上重要的农艺学、森林、温室、苗圃观赏植物、食物和纤维，公共和动物健康，国内和商业结构，家庭和储存产品有害生物。

鳞翅目幼虫包括但不限于：夜蛾科(Noctuidae)中的夜蛾、地老虎、尺蠖和实夜蛾亚科，草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda JE Smith)(秋夜蛾(fall armyworm))；甜菜夜蛾(S.exigua Hübner)(甜菜粘虫(beet armyworm))；斜纹夜蛾(S.litura Fabricius)(斜纹夜蛾(tobacco cutworm)，茶蚕(cluster caterpillar))；蓓带夜蛾(Mamestraconfigurata Walker)(披肩粘虫(bertha armyworm))；甘蓝夜蛾(M.brassicae Linnaeus)(菜夜蛾(cabbage moth))；小地老虎(Agrotis ipsilon Hufnagel)(黑切根虫(blackcutworm))；西方灰地老虎(A.orthogonia Morrison)(西部切根虫(western cutworm))；粒肤地老虎(A.subterranea Fabricius)(粒肤切根虫(granulate cutworm))；棉叶波纹夜蛾(Alabama argillacea Hübner)(棉叶虫(cotton leaf worm))；粉纹夜蛾(Trichoplusiani Hübner)(甘蓝银纹夜蛾(cabbage looper))；大豆尺夜蛾(Pseudoplusia includensWalker)(大豆夜蛾(soybean looper))；黎豆夜蛾((Anticarsia gemmatalis Hübner)，绒毛豆毛虫(velvetbean caterpillar))；粗长须夜蛾(Hypena scabra Fabricius)(苜猜绿夜蛾(green cloverworm))；烟芽夜蛾(Heliothis virescens Fabricius)(烟青虫(tobacco budworm))；一星黏虫(Pseudaletia unipuncta Haworth)(夜蛾)；粗皮委夜蛾(Athetis mindara Barnes and Mcdunnough)(粗皮切根虫(rough skinned cutworm))；暗缘地老虎(Euxoa messoria Harris)(暗黑切根虫(darksided cutworm))；棉斑实蛾(Earias insulana Boisduval)(多刺螟蛉(spiny bollworm))；翠纹钻夜蛾(E.vittellaFabricius)(斑点螟蛉(spotted bollworm))；棉铃虫(Helicoverpa armigera Hübner)(美洲螟蛉(American bollworm))；玉米穗虫(玉米穗蛾(corn earworm)或棉螟蛉(cottonbollworm))；斑马纹夜蛾(Melanchra picta Harris)(斑马纹夜蛾(zebra caterpillar))；柑橘夜蛾(Egira(Xylomyges)curialis Grote)(柑橘地老虎(citrus cutworm))；来自螟蛾科玉米螟(Ostrinia nubilalis Hübner，欧洲玉米螟(European corn borer))的螟虫、鞘蛾、结网虫、锥形虫(coneworms)、和雕叶虫(skeletonizers)；脐橙螟蛾(Amyeloistransitella Walker)(脐橙螟(naval orangeworm))；地中海粉螟(Anagasta kuehniellaZeller)(地中海粉斑螟(Mediterranean flour moth))；干果斑螟(Cadra cautellaWalker)(粉斑螟(almond moth))；二化螟(Chilo suppressalis Walker)(水稻螟虫(ricestem borer))；斑禾草螟(C.partellus)，(高粱螟(sorghum borer))；米螟(Corcyracephalonica Stainton)(米蛾(rice moth))；玉米根草螟(Crambus caliginosellusClemens)(玉米根结网虫(corn root webworm))；早熟禾草螟(C.teterrellus Zincken)(早熟禾草螟(bluegrass webworm))；稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis Guenée)(稻纵卷叶螟(rice leaf roller))葡萄里予螟(Desmia funeralis Hübner)(葡萄野螟(grape leaffolder))；甜瓜绢野螟(Diaphania hyalinata Linnaeus)(甜瓜野螟(melonworm))；黄瓜绢野螟(D.nitidalis Stoll)(泡菜虫(pickleworm))；巨座玉米螟(Diatraeagrandiosella Dyar)(西南玉米秆草螟(southwestern corn borer))、蔗螟(D.saccharalis Fabricius)(甘蔗螟虫(surgarcane borer))；墨西哥稻螟(Eoreumaloftini Dyar)(墨西哥稻螟(Mexican rice borer))；烟草粉斑螟(Ephestia elutella Hübner)(烟草飞蛾(tobacco(cacao)moth))；大蜡螟(Galleria mellonella Linnaeus)(大蜡蛾(greater wax moth))；水稻切叶野螟(Herpetogramma licarsisalis Walker)(草地螟(sod webworm))；向日葵同斑螟(Homoeosoma electellum Hulst)(向日葵螟(sunflowermoth))；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus Zeller)(小玉米茎蛀虫(lessercornstalk borer))；小蜡螟(Achroia grisella Fabricius)(小蜡蛾(lesser waxmoth))；草地螟(Loxostege sticticalis Linnaeus)(草地螟(beet webworm))；茶树螟(Orthaga thyrisalis Walker)(茶树蛾(tea tree web moth))；豆荚野螟(Marucatestulalis Geyer)(豆荚蛀螟(bean pod borer))；印度谷螟(Plodia interpunctella Hübner)(印度谷螟(Indian meal moth))；三化螟(Scirpophaga incertulas Walker)(三化螟(yellow stem borer))；温室螟(Udea rubigalis Guenée)(芹菜卷叶螟(celeryleaftier))；和卷蛾科(Tortricidae)中的卷叶虫、蚜虫、种实虫以及果实虫，西部黑头长翅卷蛾(Acleris gloverana Walsingham)(西部黑头蚜虫(Western blackheadedbudworm))；东部黑头长翅卷蛾(A.variana Fernald)(东部黑头蚜虫(Easternblackheaded budworm))；果树黄卷蛾(Archips argyrospila Walker)(果树卷叶蛾(fruittree leaf roller))；罗萨娜黄卷蛾(A.rosana Linnaeus)(欧洲卷叶蛾(European leafroller))；和其他黄卷蛾属物种，苹小卷叶蛾(Adoxophyes orana Fischer von

)(苹果小卷蛾(summer fruit tortrix moth))；条纹向日葵螟(Cochylishospes Walsingham)(带状向日葵斑蛾(banded sunflower moth))；榛小卷蛾(Cydialatiferreana Walsingham)(filbertworm)；苹果蠹蛾(C.pomonella Linnaeus)(苹果蚕蛾(codling moth))；杂色卷叶蛾(Platynota flavedana Clemens)(色稻纵卷叶螟(variegated leafroller))；荷兰石竹小卷蛾(P.stultana Walsingham)(杂食卷叶蛾(omnivorous leafroller))；鲜食葡萄小卷蛾(Lobesia botrana Denis&Schiffermüller)(欧洲葡萄蛾(European grape vine moth))；苹白小卷蛾(Spilonota ocellana Denis&Schiffermüller)(苹果芽小卷叶蛾(eyespotted bud moth))；萄果实虫主虫(Endopizaviteana Clemens)(葡萄小卷叶蛾(grape berry moth))；女贞细卷蛾(Eupoeciliaambiguella Hübner)(葡萄果蠹蛾(vine moth))；巴西苹果卷叶虫(Bonagota salubricolaMeyrick)(巴西苹果小卷叶蛾(Brazilian apple leafroller))；东方果实蛾(Grapholitamolesta Busck)(梨小食心虫(oriental fruit moth))；向日葵芽蛾(Suleimahelianthana Riley)(向日葵芽蛾(sunflower bud moth))；带卷蛾属物种(Argyrotaeniaspp.)；和色卷蛾属物种(Choristoneura spp.)。

鳞翅目中选择的其他农艺学有害生物包括但不限于秋星尺蠖(Alsophilapometaria Harris)(秋星尺蠖(fall cankerworm))；桃条麦蛾(Anarsia lineatellaZeller)(桃条麦蛾(peach twig borer))；栎橙纹犀额蛾(Anisota senatoria J.E.Smith)(橙色斑纹橡木虫(orange striped oakworm))；柞蚕(Antheraea pernyi Guérin-Méneville)(中橡木柞蚕虫(Chinese Oak Tussah Moth))；家蚕(Bombyx mori Linnaeus)(桑蚕(Silkworm))；棉潜蛾(Bucculatrix thurberiella Busck)(棉叶潜蛾(cotton leafperforator))；纹黄豆粉蝶(Colias eurytheme Boisduval)(苜蓿粉蝶(alfalfacaterpillar))；核桃舟蛾(Datana integerrima Grote&Robinson)(核桃天社蛾(walnutcaterpillar))；落叶松毛虫(Dendrolimus sibiricus Tschetwerikov)(西伯利亚蚕蛾(Siberian silk moth))，白尺蠖蛾(Ennomos subsignaria Hübner)(榆角尺蠖(elmspanworm))；菩提尺蠖(Erannis tiliaria Harris)(椴尺蠖(linden looper))；黄毒蛾(Euproctis chrysorrhoea Linnaeus)(棕尾毒蛾(browntail moth))；黑拟蛉蛾(Harrisina americana Guérin-Méneville)(野棉花夜蛾(grapeleaf skeletonizer))；牧草天蚕蛾(Hemileuca oliviae Cockrell)(牧草天蚕蛾(range caterpillar))；美国白蛾(Hyphantria cunea Drury)(美国白蛾(fall webworm))；番茄茎麦蛾(Keiferialycopersicella Walsingham)(番茄蛲虫(tomato pinworm))；东部铁杉尺蠖指明亚种(Lambdina fiscellaria fiscellaria Hulst)(东部铁杉尺蠖(Eastern hemlocklooper))；西部铁杉尺蠖(L.fiscellaria lugubrosa Hulst)(西部铁杉尺蠖(Westernhemlock looper))；柳毒蛾(Leucoma salicis Linnaeus)(雪毒蛾(satin moth))；舞毒蛾(Lymantria dispar Linnaeus)(舞毒蛾(gypsy moth))；番茄天蛾(Manducaquinquemaculata Haworth)(五点天蛾(five spotted hawk moth)，番茄天蛾(tomatohornworm))；烟草天蛾(M.sexta Haworth)(番茄天蛾(tomato hornworm)、烟草天蛾(tobacco hornworm))；冬尺蠖蛾(Operophtera brumata Linnaeus)(冬尺蠖蛾(wintermoth))；春尺蠖(Paleacrita vernata Peck)(春尺蠖(spring cankerworm))；美洲大芷凤蝶(Papilio cresphontes Cramer)(大黄带凤蝶(giant swallowtail)，柑桔凤蝶(orangedog))；加州木角斗蛾(Phryganidia californica Packard)(加州槲蛾(Californiaoakworm))；柑桔潜蛾(Phyllocnistis citrella Stainton)(柑桔潜叶蛾(citrusleafminer))；斑幕潜叶蛾(Phyllonorycter blancardella Fabricius)(斑点幕型潜叶虫(spotted tentiform leafminer))；欧洲粉蝶(Pieris brassicae Linnaeus)(大白粉蝶(large white butterfly))；菜青虫(P.rapae Linnaeus)(小白粉蝶(small whitebutterfly))；暗脉菜粉蝶(P.napi Linnaeus)(绿脉菜粉蝶(green veined whitebutterfly))；洋蓟葱羽蛾(Platyptilia carduidactyla Riley)(洋蓟羽蛾(artichokeplume moth))；小菜蛾(Plutella xylostella Linnaeus)(小菜蛾(diamondback moth))；棉红铃虫(Pectinophora gossypiella Saunders)(粉螟蛉(pink bollworm))；多形云粉蝶(Pontia protodice)(Boisduval和Leconte)(南方菜青虫(Southern cabbageworm))；杂食尺蠖(Sabulodes aegrotata Guenée)(杂食尺蠖(omnivorous looper))；红抚天社蛾(Schizura concinna J.E.Smith)(红疣天社蛾(red humped caterpillar))；麦蛾(Sitotroga cerealella Olivier)(麦蛾(Angoumois grain moth))；松异带蛾(Thaumetopoea pityocampa Schiffermuller)(松树列队毛虫(pine processionarycaterpillar))；幕谷蛾(Tineola bisselliella Hummel)(负袋夜蛾(webbingclothesmoth))；番茄斑潜蝇(Tuta absoluta Meyrick)(番茄斑潜蝇(tomatoleafminer))；苹果巢蛾(Yponomeuta padella Linnaeus)(巢蛾(ermine moth))；Heliothis subflexa Guenée；天幕毛虫属(Malacosoma)物种和古毒蛾属(Orgyia)物种。

引人关注的是鞘翅目的幼虫和成虫，包括来自长角象虫科(Anthribidae)、豆象科(Bruchidae)和象甲科(Curculionidae)的象鼻虫，包括但不限于：墨西哥棉铃象(Anthonomus grandis Boheman)(棉铃象甲(boll weevil))；稻水象甲(Lissorhoptrusoryzophilus Kuschel)(稻水象虫(rice water weevil))；谷象(Sitophilus granariusLinnaeus)(谷象(granary weevil))；米象(S.oryzae Linnaeus)(米象(rice weevil))；三叶草叶象(Hypera punctata Fabricius)(车轴草叶象虫(clover leaf weevil))；密点细枝象(Cylindrocopturus adspersus LeConte)(向日葵茎象鼻虫(sunflower stemweevil))；黄褐小爪象(Smicronyx fulvus LeConte)(红葵花籽象甲(red sunflower seedweevil))；灰色小爪象(S.sordidus LeConte)(灰葵花籽象甲(gray sunflower seedweevil))；玉米隐啄象(Sphenophorus maidis Chittenden)(玉米象虫(maizebillbug)))；叶甲科(Chrysomelidae)的跳甲、黄瓜叶甲、根虫、叶甲、马铃薯叶甲以及潜叶虫，包括但不限于：马铃薯叶甲(Leptinotarsa decemlineata Say)(科罗拉多马铃薯甲虫)；玉米根萤叶甲指明亚种(Diabrotica virgifera virgifera LeConte)(西方玉米根虫)；北方玉米根虫(D.barberi(Smith和Lawrence))(北方玉米根虫(northern cornrootworm))；黄瓜十一星叶甲食根亚种(D.undecimpunctata howardi Barber)(南方玉米根虫(southern corn rootworm))；玉米铜色跳甲(Chaetocnema pulicaria Melsheimer)(玉米跳甲(corn flea beetle))；十字花科跳甲(Phyllotreta cruciferae Goeze)(十字花科蔬菜跳甲(Crucifer flea beetle))；黄曲条跳甲(Phyllotreta striolata)(黄曲条跳甲(stripped flea beetle))；肖叶甲褐斑(Colaspis brunnea Fabricius)(葡萄肖叶甲(grape colaspis))；橙足负泥虫(Oulema melanopus Linnaeus)(谷叶甲虫(cereal leafbeetle))；向日葵叶甲(Zygogramma exclamationis Fabricius)(向日葵叶甲(sunflowerbeetle)))；来自瓢虫科(Coccinellidae)的甲虫，包括但不限于：墨西哥豆瓢虫(Epilachnavarivestis Mulsant)(墨西哥豆瓢虫(Mexican bean beetle))；金龟子和来自金龟子科(Scarabaeidae)的其他甲虫，包括但不限于：日本丽金龟(Popillia japonica Newman)(日本甲虫)；北方圆头犀金龟(Cyclocephala borealis Arrow)(北方独角仙(northernmasked chafer)，白蛴螬(white grub))；南方圆头犀金龟(C.immaculata Olivier)(南方独角仙(southern masked chafer)，白蛴螬(white grub))；欧洲切根鳃金龟(Rhizotrogusmajalis Razoumowsky)(欧洲金龟子(European chafer))；长毛食叶然金龟(Phyllophagacrinita Burmeister)(白蛴螬(white grub))；胡萝卜金龟(Ligyrus gibbosus De Geer)(胡萝卜金龟(carrot beetle)))；来自皮蠹科(Dermestidae)的红缘皮蠹(carpetbeetle)；来自叩甲科(Elateridae)、伪金针虫属物种(Eleodes spp.)、梳爪叩头虫属物种(Melanotus spp.)的金针虫；宽胸金针虫属物种(Conoderus spp.)；叩甲属物种(Limoniusspp.)；缺隆叩甲属物种(Agriotes spp.)；特尼塞拉属物种(Ctenicera spp.)；埃俄罗斯属物种(Aeolus spp.)；来自小蠹科(Scolytidae)的树皮甲虫和来自拟步甲科(Tenebrionidae)的甲虫。

引人关注的是双翅目的成虫和未成熟的虫，包括潜叶虫玉米斑潜蝇(Agromyzaparvicornis Loew)(玉米斑潜蝇(corn blotch leafminer))；摇蚊科(包括但不限于：高粱瘿蚊(Contarinia sorghicola Coquillett)(高梁瘿蚊(sorghum midge))；黑森瘿蚊(Mayetiola destructor Say)(黑森蝇(Hessian fly))；麦红吸浆虫(Sitodiplosismosellana Géhin)(小麦吸浆虫(wheat midge))；葵花籽蚊(Neolasiopteramurtfeldtiana Felt)(向日葵籽瘿蚊(sunflower seed midge))；果蝇(实蝇科(Tephritidae))、瑞典麦秆蝇(Oscinella frit Linnaeus)(果蝇(frit flies))；蛆虫(包括但不限于：灰地种蝇(Delia platura Meigen)(种蝇(seedcorn maggot))；麦地种蝇(D.coarctata Fallen)(麦种蝇(wheat bulb fly))和其他地种蝇属，美洲麦秆蝇(Meromyza americana Fitch)(美洲麦秆蝇(wheat stem maggot))；家蝇(Muscadomestica Linnaeus)(家蝇(house flies))；夏厕蝇(Fannia canicularis Linnaeus)、小舍蝇(F.femoralis Stein)(小家蝇(lesser houseflies))；厩螫蝇(Stomoxys calcitransLinnaeus)(螫蝇(stable flies))；秋家蝇，角蝇，绿头苍蝇，金蝇属物种(Chrysomyaspp.)；蝇属物种(Phormia spp.)；和其他麝香蝇(muscoid fly)有害生物、马蝇虻属物种(horse flies Tabanus spp.)；肤蝇胃蝇属物种(bot flies Gastrophilus spp.)；狂蝇属物种(Oestrus spp.)；纹皮蝇皮蝇属物种(cattle grubs Hypoderma spp.)；鹿蝇斑虻属物种(deer flies Chrysops spp.)；绵羊虱蝇(Melophagus ovinus Linnaeus)(绵羊蜱)和其他短角亚目(Brachycera)，蚊子伊蚊属物种(mosquitoes Aedes spp.)；疟蚊属物种(Anopheles spp.)；家蚊属物种(Culex spp.)；黑蝇原蚋属物种(black fliesProsimulium spp.)；蚋属物种(Simulium spp.)；吸血蠓、沙蝇、眼菌蚊(sciarid)和其他长角亚目(Nematocera)。

作为目的昆虫包括了半翅目和同翅目的成体和若虫，例如但不限于：来自球蚜科(Adelgidae)的球蚜、来自盲蝽科(Miridae)的盲蝽、来自蝉科(Cicadidae)的蝉、叶蝉、小绿叶蝉属物种(Empoasca spp.)；来自叶蝉科(Cicadellidae)的，来自菱蜡蝉科(Cixiidae)、青翅飞虱科(Flatidae)、蜡蝉总科(Fulgoroidea)、瓢蜡蝉科(Issidae)和(Delphacidae)的飞虱，来自角蝉科(Membracidae)的角蝉，来自木虱科(Psyllidae)的木虱，来自粉虱科(Aleyrodidae)的粉虱，来自蚜科(Aphididae)的蚜虫，来自根瘤蚜科(Phylloxeridae)的葡萄根瘤蚜，来自粉蚧科(Pseudococcidae)的粉蚧，来自链介壳虫科(Asterolecanidae)、蚧科(Coccidae)、粉蚧科(Dactylopiidae)、盾蚧科(Diaspididae)、绒蚧科(Eriococcidae)、旌介壳虫科(Ortheziidae)、刺葵介壳虫科(Phoenicococcidae)和绵蚧科(Margarodidae)的介壳虫，来自网蝽科的网蝽，来自蝽科(Pentatomidae)的椿象，长蝽(cinch bug)，土长蝽属物种(Blissus spp.)；和来自长蝽科(Lygaeidae)的其他籽长蝽、来自沫蝉科(Cercopidae)的沫蝉、来自缘蝽科(Coreidae)的南瓜缘蝽和来自红蝽科(Pyrrhocoridae)的秋恙螨和棉蝽。

来自半翅目的农业上的重要成员进一步包括但不限于：豌豆蚜(Acyrthisiphonpisum Harris)(豌豆蚜虫(pea aphid))；黑豆蚜(Aphis craccivora Koch)(蚕豆蚜(cowpea aphid))；黑豆蚜(A.fabae Scopoli)(蚕豆蚜(black bean aphid))；棉蚜(A.gossypii Glover)(棉蚜(cotton aphid)，瓜叶菊蚜虫(melon aphid))；玉米根蚜(A.maidiradicis Forbes，corn root aphid)；苹果黄蚜(A.pomi De Geer)(苹蚜(appleaphid))；绣线菊蚜(A.spiraecola Patch，spirea aphid)；茄粗额蚜(Aulacorthum solaniKaltenbach)(指顶花无网长管蚜(foxglove aphid))；草莓钉蚜(Chaetosiphonfragaefolii Cockerell)(草莓毛管蚜(strawberry aphid))；麦双尾蚜(Diuraphis noxiaKurdjumov/Mordvilko)(俄罗斯小麦蚜虫(Russian wheat aphid))；车前圆尾蚜(Dysaphisplantaginea Paaserini)(苹粉红劣蚜(rosy apple aphid))；苹果绵蚜(Eriosomalanigerum Hausmann，woolly apple aphid)；甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae Linnaeus)(菜蚜(cabbage aphid))；桃粉大尾蚜(Hyalopterus pruni Geoffroy)(桃大尾蚜(mealyplum aphid))；萝卜蚜(Lipaphis erysimi Kaltenbach，turnip aphid)；麦无网长管蚜(Metopolophium dirrhodum Walker)(麦蚜虫(cereal aphid))；马铃薯长管蚜(Macrosiphum euphorbiae Thomas)(马铃薯蚜(potato aphid))；桃蚜(Myzus persicaeSulzer，peach-potato aphid，green peach aphid))；莴苣衲长管蚜(Nasonoviaribisnigri Mosley)(莴苣蚜(lettuce aphid))；癭绵对属物种(Graptostethus spp.)(根蚜虫(root aphids)和倍蚜(gall aphids))；玉米蚜(Rhopalosiphum maidis Fitch，cornleaf aphid)；禾谷缢管蚜(R.padi Linnaeus，bird cherry-oat aphid)；麦二叉蚜(Schizaphis graminum Rondani，greenbug)；牛鞭草蚜(Sipha flava Forbes)(甘蔗黄蚜(yellow sugarcane aphid))；麦长管蚜(Sitobion avenae Fabricius，English grainaphid)；苜蓿斑蚜(Therioaphis maculata Buckton，spotted alfalfa aphid)；茶二叉蚜(Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe)(黑色柑橘蚜(black citrus aphid)和褐色橘蚜(T.citricida Kirkaldy)(桔二叉蚜(brown citrus aphid))；球属物种(Adelgesspp.)(球蚜(adelgids))；长山核桃根瘤蚜(Phylloxera devastatrix Pergande)(山胡桃根瘤蚜(pecan phylloxera))；烟粉虱(Bemisia tabaci Gennadius)(烟粉虱(tobaccowhitefly)，甘薯粉虱(sweetpotato whitefly))；银叶粉虱(B.argentifolii Bellows&Perring，silverleaf whitefly)；柑橘粉虱(Dialeurodes citri Ashmead)(柑桔粉虱(citrus whitefly))；结翅白粉虱(Trialeurodes abutiloneus)(带状翅白粉虱(bandedwinged whitefly)和温室粉虱(T.vaporariorum Westwood)(温室粉虱(greenhouse whitefly))；马铃薯小绿叶蝉(Empoasca fabae Harris)(马铃薯叶蝉(potato leafhopper))；灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallen，smaller brownplanthopper)；二点叶蝉(Macrolestes quadrilineatus Forbes)(紫菀叶蝉(asterleafhopper))；黑尾叶蝉(Nephotettix cinticeps Uhler)(绿叶蝉(green leafhopper))；二条斑黑尾叶蝉(N.nigropictus

)(稻叶蝉(rice leafhopper))；褐飞虱(Nilaparvatalugens

brown planthopper)；玉米蜡蝉(Peregrinus maidis Ashmead)(玉米飞虱(corn planthopper))；白背飞虱(Sogatella furcifera Horvath，white-backedplanthopper)；稻条背飞虱(Sogatodes orizicola Muir)(稻飞虱(rice delphacid))；苹果白叶蝉(Typhlocyba pomaria McAtee)(苹白小叶蝉(white apple leafhopper))；葡萄斑叶蝉属物种(Erythroneoura spp.)(葡萄叶蝉(grape leafhoppers))；十七年蝉(Magicicada septendecim Linnaeus)(周期蝉(periodical cicada))；吹绵蚧(Iceryapurchasi Maskell，cottony cushion scale)；梨圆蚧(Quadraspidiotus perniciosusComstock，San Jose scale)；臀纹粉蚧(Planococcus citri Risso)(桔粉蚧(citrusmealybug))；粉蚧属物种(Pseudococcus spp.)(其他粉蚧系群)；梨木虱(Cacopsyllapyricola Foerster，pear psylla)；柿木虱(Trioza diospyri Ashmead，persimmonpsylla)。

来自半翅目的农业上重要的目的物种包括但不限于：拟绿蝽(Acrosternumhilare Say)(稻绿蝽(green stink bug))；南瓜缘蝽(Anasa tristis De Geer)(南瓜虫(squash bug))；美洲谷长蝽指明亚种(Blissus leucopterus leucopterus Say)(麦长蝽(chinch bug))；方翅网蝽(Corythuca gossypii Fabricius)(棉网蝽(cotton lacebug))；番茄蝽(Cyrtopeltis modesta Distant，tomato bug)；棉蝽(Dysdercussuturellus

)(棉红蝽(cotton stainer))；褐臭蝽(Euschistus servusSay，brown stink bug)；一斑臭蝽(E.variolarius Palisot de Beauvois，one-spottedstink bug)；长蝽属物种(Graptostethus spp.)(果实蝽系群(complex of seed bugs))；松叶根蝽(Leptoglossus corculus Say，leaf-footed pine seed bug)；美洲牧草盲蝽(Lygus lineolaris Palisot de Beauvois)(牧草盲蝽(tarnished plant bug))；牧草盲蝽(L.Hesperus Knight)(西部牧草盲蝽(Western tarnished plant bug))；牧草盲蝽(L.pratensis Linnaeus，common meadow bug)；长毛草盲蝽(L.rugulipennis Poppius，European tarnished plant bug)；长绿盲蝽(Lygocoris pabulinus Linnaeus)(苹绿盲蝽(common green capsid))；稻绿蝽(Nezara viridula Linnaeus)(南方绿椿象(southerngreen stink bug))；美洲稻蝽(Oebalus pugnax Fabricius)(稻褐蝽(rice stink bug))；马利筋长蝽(Oncopeltus fasciatus Dallas)(大马利筋长蝽(large milkweed bug))；棉跳盲蝽(Pseudatomoscelis seriatus Reuter)(棉跳盲蝽(cotton fleahopper))。

此外，实施例可以对半翅目有效，如草莓蝽(Calocoris norvegicus Gmelin)(草莓长蝽(strawberry bug))；荒野奥盲蝽(Orthops campestris Linnaeus)；苹果盲蝽(Plesiocoris rugicollis Fallen)(苹盲蝽(apple capsid))；番茄蝽(Cyrtopeltismodestus Distant，tomato bug)；黑斑烟盲蝽(Cyrtopeltis notatus Distant)(吸蝇(suckfly))；白斑盲蝽(Spanagonicus albofasciatus Reuter，whitemarkedfleahopper)；皂荚蝽(Diaphnocoris chlorionis Say)(皂角蝽(honeylocust plantbug))；洋葱蝽(Labopidicola allii Knight)(葱盲蝽(onion plant bug))；棉盲蝽(Pseudatomoscelis seriatus Reuter，cotton fleahopper)；苜蓿褐盲蝽(Adelphocorisrapidus Say，rapid plant bug)；四线盲蝽(Poecilocapsus lineatus Fabricius)(四线叶虫(four-lined plant bug))；小长蝽(Nysius ericae Schilling)(多彩长蝽(falsechinch bug))；假麦长蝽(Nysius raphanus Howard，false chinch bug)；稻绿蝽(Nezaraviridula Linnaeus)(南方绿椿象(Southern green stink bug))；扁盾蝽属物种(Eurygaster spp.)；缘蝽科物种(Coreidae spp.)；红蝽科物种(Pyrrhocoridae spp.)；谷蛾科物种(Tinidae spp.)；负子蝽科物种(Blostomatidae spp.)；猎蝽科(Reduviidae)物种和臭虫科(Cimicidae)物种。

另外，包括蜱螨目(Acari)(螨类)的成体和幼虫，如小麦瘤瘿螨(Aceriatosichella Keifer)(小麦卷叶螨(wheat curl mite))；麦岩螨(Petrobia latens Müller)(褐色小麦螨(brown wheat mite))；在叶螨科(Tetranychidae)中蜘蛛螨和红螨，苹果全爪螨(Panonychus ulmi Koch)(欧洲红螨(European red mite))；二斑叶螨(Tetranychus urticae Koch)(二点叶螨(two spotted spider mite))；迈叶螨(T.mcdanieli McGregor)(迈叶螨(McDaniel mite))；朱砂叶螨(T.cinnabarinusBoisduval，carmine spider mite)；土耳其斯坦叶螨(T.turkestani Ugarov&Nikolski，strawberry spider mite)；细须螨科中的葡萄短须螨，桔短须螨(Brevipalpus lewisiMcGregor，citrus flat mite)；瘿螨科(Eriophyidae)中的锈螨和芽瘿螨以及其他叶取食螨和对人类和动物健康重要的螨，即表皮螨科(Epidermoptidae)的尘螨、蠕形螨科(Demodicidae)的毛囊螨、食甜螨科(Glycyphagidae)的谷螨，硬蜱科(Ixodidae)的蜱。黑脚硬蜱(Ixodes scapularis Say)(鹿蜱(deertick))；全环硬蜱(I.holocyclus Neumann)(澳大利亚致瘫痪埤(Australian paralysis tick))；变异矩头蜱(Dermacentor variabilisSay)(美洲犬蜱(American dog tick))；美洲钝眼蜱(Amblyomma americanum Linnaeus)(孤星蜱(lone star tick))以及在痒螨科、蒲螨科和疥螨科中的痒螨和疥螨。

引人关注的昆虫有害生物包括椿象和其他相关昆虫的超家族，包括但不限于属于以下各科的物种：蝽科(稻绿蝽、茶翅蝽(Halyomorpha halys)、Piezodorus guildini、褐臭蝽、拟绿蝽、英雄美洲蝽(Euschistus heros)、美洲蝽(Euschistus tristigmus)、拟绿蝽、褐蝽(Dichelops melacanthus)、和蓓蝽(Bagrada hilaris)(蓓蝽(Bagrada Bug)))，龟蝽科(Plataspidae)(筛豆龟蝽(Megacopta cribraria)-豆平腹蝽蟓(Bean plataspid))和土蝽科(Scaptocoris castanea-Root stink bug)，以及鳞翅目物种包括但不限于：小菜蛾，例如，谷实夜蛾；大豆夜蛾，例如大豆尺夜蛾，以及黎豆夜蛾(例如梨豆夜蛾)。

用于测量杀有害生物活性的方法包括例如，Czapla和Lang,(1990)J.Econ.Entomol.[经济昆虫学杂志]83:2480-2485；Andrews等人,(1988)Biochem.J.[生物化学杂志]252:199-206；Marrone等人,(1985)J.of Economic Entomology[经济昆虫学杂志]78:290-293以及美国专利号5,743,477，将其全部通过引用以其整体并入本文。通常，在取食测定中混合并使用了所述蛋白质。参见，例如，Marrone等人,(1985),J.of EconomicEntomology[经济昆虫学杂志]78:290-293。此类测定可以包括将植物与一种或多种有害生物接触，并且确定所述植物存活和/或造成所述有害生物死亡的能力。

线虫包括寄生线虫如根结线虫、胞囊线虫、和腐线虫，包括异皮线虫属物种(Heterodera spp.)、根结线虫属物种(Meloidogyne spp.)、和球异皮线虫属物种(Globodera spp.)；特别是胞囊线虫的成员，包括但不限于：大豆异皮线虫(Heteroderaglycines)(大豆胞囊线虫(soybean cyst nematode))；甜菜异皮线虫(Heteroderaschachtii)(甜菜胞囊线虫(beet cyst nematode))；燕麦异皮线虫(Heterodera avenae)(谷物胞囊线虫(cereal cyst nematode))和马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)和马铃薯白线虫(Globodera pailida)(马铃薯胞囊线虫(potato cyst nematodes))。腐线虫包括短体线虫属物种(Pratylenchus spp)。

种子处理。为了保护并提高产量生产和性状技术，种子处理方案可以为昆虫、杂草和疾病提供另外的作物计划灵活性和成本有效的控制。种子材料可以用包含化学或生物除草剂、除草剂安全剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、发芽抑制剂和增强剂、营养素、植物生长调节剂和激活剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀鸟剂和/或杀软体动物剂的组合的组合物进行处理，典型地进行表面处理。这些化合物典型地与配制品中使用的其他运载体、表面活性剂或促进施加的佐剂一起配制。所述涂层可通过用液体配制品浸渍增殖材料或通过用组合的湿或干配制品进行涂覆来施加。在以下提供了可用作种子处理的各种类型的化合物的实例：ThePesticide Manual:A World Compendium,C.D.S.Tomlin Ed.,Published by the BritishCrop Production Council[农药手册：世界纲要，C.D.S.汤姆林编辑，由英国作物生产委员会出版]，其通过引用并入本文。

可用于作物种子的一些种子处理包括但不限于下列一种或多种：脱落酸，阿拉酸式苯-S-甲基，阿维菌素，杀草强，阿扎康唑，固氮螺菌属(azospirillum)，印楝素，嘧菌酯，芽孢杆菌属物种(包括蜡状芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)、球形芽孢杆菌(Bacillussphaericus)、枯草芽孢杆菌和/或苏云金芽孢杆菌物种中的一种或多种)，短根瘤菌属物种(bradyrhizobium spp.)(包括甜菜慢生根瘤菌(bradyrhizobium betae)、香炉盘慢生根瘤菌(bradyrhizobium canariense)、埃氏慢生根瘤菌(bradyrhizobium elkanii)、西表岛慢生根瘤菌(bradyrhizobium iriomotense)、慢生型大豆根瘤菌(bradyrhizobiumjaponicum)、bradyrhizobium liaonigense、bradyrhizobium pachyrhizi和/或圆明慢生根瘤菌(bradyrhizobium yuanmingense))，克菌丹，萎锈灵，壳聚糖，噻虫胺，铜，溴氰虫酰胺，苯醚甲环唑，氯唑灵，氟虫腈，咯菌腈，氟嘧菌酯，氟喹唑，解草胺，氟草肟，超敏蛋白，抑霉唑，吡虫啉，种菌唑，isoflavenoids，脂质几丁寡糖，代森锰锌，锰，代森锰，精甲霜灵，甲霜灵，叶菌唑，腈菌唑，PCNB，氟唑菌苯胺，青霉菌属，吡噻菌胺，氯菊酯，啶氧菌酯，丙硫菌唑，唑菌胺酯，氯虫酰胺，精-异丙甲草胺，皂苷，氟唑环菌胺，TCMTB，戊唑醇，噻苯咪唑，噻虫嗪，硫威，福美双，甲基立枯磷，三唑醇，木霉属，肟菌酯，灭菌唑和/或锌。PCNB种皮是指包含喹硫磷和氯唑灵的EPA注册号00293500419。TCMTB是指2-(硫氰基甲基硫代)苯并噻唑。

可以测试具有特定转基因性状的种子品种和种子以确定哪些种子处理方案和施用率可以补充这些品种和转基因性状以增加产量。例如，具有良好产量潜力但丝黑穗病易感性的品种可以受益于使用提供针对丝黑穗病的保护的种子处理，具有良好产量潜力但胞囊线虫易感性的品种可以受益于使用提供针对胞囊线虫的保护的种子处理等。同样，涵盖赋予抗昆虫的转基因性状的品种可以从种子处理赋予的第二种作用方式中获益，涵盖赋予除草剂抗性的转基因性状的品种可以从用安全剂的种子处理中获益，这种安全剂增强植物对所述除草剂的抗性等。此外，当与种子处理组合时，正确使用种子处理所产生的良好根系建立和早期出苗可能导致更有效的氮利用，更好的抗干旱能力以及包含某种性状的一种或多种品种的产量潜力的总体增加。

用于杀灭昆虫有害生物和控制昆虫群体的方法。在一些实施例中，提供了用于杀灭昆虫有害生物的方法，所述方法包括将昆虫有害生物同时地或依次地与杀昆虫有效量的本公开的重组IRDIG35563多肽接触。在一些实施例中，提供了用于杀灭昆虫有害生物的方法，该方法包括将昆虫有害生物与杀昆虫有效量的SEQ ID NO:2的重组杀有害生物蛋白或其变体接触。

在一些实施例中，提供了用于控制昆虫有害生物群体的方法，所述方法包括将昆虫有害生物群体同时地或依次地与杀昆虫有效量的本公开的重组IRDIG35563多肽接触。在一些实施例中，提供了用于控制昆虫有害生物群体的方法，这些方法包括使昆虫有害生物群体与杀昆虫有效量的SEQ ID NO:2的重组IRDIG35563多肽或其变体接触。如本文所用的，“控制有害生物群体”或“控制有害生物”是指对有害生物的任何影响，其导致对有害生物造成的损害的限制。控制有害生物包括但不限于以一定方式杀灭有害生物、抑制有害生物发育、改变有害生物能育性或生长，使得有害生物对植物造成较少的损害，减少所产生后代的数量，产生适应力较弱的有害生物，产生易受捕食者攻击的有害生物或阻止有害生物啃食植物。

在一些实施例中，提供了用于控制对杀有害生物蛋白具有抗性的昆虫有害生物群体的方法，所述方法包括将昆虫有害生物群体同时地或依次地与杀昆虫有效量的本公开的重组IRDIG35563多肽接触。在一些实施例中，提供了用于控制对杀有害生物蛋白有抗性的昆虫有害生物群体的方法，所述方法包括使昆虫有害生物群体与杀昆虫有效量的SEQ IDNO:2的重组IRDIG35563多肽或其变体接触。

在一些实施例中，提供了用于保护植物免受昆虫有害生物侵害的方法，所述方法包括在植物或其细胞中使至少一种编码IRDIG35563多肽的重组多核苷酸表达。在一些实施例中，提供了用于保护植物免受昆虫有害生物侵害的方法，所述方法包括在所述植物或其细胞中使编码SEQ ID NO:2的IRDIG35563多肽或其变体的重组多核苷酸表达。

抗昆虫管理(IRM)策略。苏云金芽孢杆菌δ-内毒素在转基因玉米植物中的表达已被证明是控制农业上重要的昆虫有害生物的有效手段(Perlak等人,1990；1993)。然而，昆虫已经进化，这些昆虫对在转基因植物中表达的苏云金芽孢杆菌δ-内毒素是具有抗性的。如果这种抗性普遍存在，它将明显限制包含编码这种苏云金芽孢杆菌δ-内毒素的基因的种质的商业价值。

增加转基因杀昆虫剂对靶有害生物的有效性并且同时减少杀昆虫剂抗性有害生物发展的一种方法是提供非转基因(即，非杀昆虫蛋白)庇护所(一部分非杀昆虫作物/玉米)，用于与生产对靶有害生物具有活性的单一杀昆虫蛋白的转基因作物一起使用。美国环境保护局(United States Environmental Protection Agency)(epa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm，其可以使用www前缀进行访问)发布了与生产一种对靶有害生物具有活性的单一Bt蛋白的转基因作物一起使用的要求。另外，国家玉米种植者协会(National Corn Growers Association)在其网站上(ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn，所述网址可使用www前缀访问)也提供了有关庇护所要求的类似指导。由于庇护区内的昆虫所造成的损失，较大的庇护所可能会降低总产量。

增加转基因杀昆虫剂对靶有害生物的有效性并且同时减少杀昆虫剂抗性有害生物发展的另一种方法是具有杀昆虫基因的储存库，所述储存库可以有效地对抗昆虫有害生物的组，并通过不同的作用方式显现其作用。

在植物中表达对相同昆虫物种有毒的两种或更多种杀昆虫组合物，每种杀昆虫剂以有效水平表达是实现对抗性发展的控制的另一种方法。这是基于以下原则：对两种不同作用模式的抗性演变比仅一种远远更不可能。例如，Rouss概述了用于管理杀昆虫转基因作物的双毒素策略，也称为“金字塔结构”或“堆叠”。(The Royal Society.Phil.Trans.R.Soc.Lond.B.[皇家学会伦敦皇家学会哲学会刊B系列],(1998)353:1777-1786)。每种都能有效抵抗靶有害生物并几乎没有或没有交叉抗性的两种不同蛋白质的堆叠或金字塔结构可以允许使用较小的庇护所。美国环境保护局要求所种植非Bt玉米的结构性庇护所(通常为5％)比单一性状产品(通常为20％)显著更少。存在提供庇护所的IRM效应的各种方法，包括在田地中的各种几何种植模式和包装好(in-bag)的种子混合物，如进一步通过Roush所讨论的。

在一些实施例中，本公开的IRDIG35563多肽可用作与其他杀有害生物蛋白(包括但不限于Bt毒素、致病杆菌属或发光杆菌属杀昆虫蛋白、其他杀昆虫活性蛋白等)组合(即，金字塔化)的抗昆虫管理策略。

提供了在促进抗昆虫管理的转基因植物中控制一种或多种鳞翅目和/或鞘翅目昆虫侵染的方法，所述方法包括在植物中表达具有不同作用模式的至少两种不同的杀昆虫蛋白。

在一些实施例中，控制转基因植物中鳞翅目和/或鞘翅目昆虫侵染并促进抗昆虫管理的方法中包括对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫呈现至少一种IRDIG35563多肽杀昆虫蛋白。

在一些实施例中，控制转基因植物中鳞翅目和/或鞘翅目昆虫侵染并促进抗昆虫管理的方法包括呈递对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫具有杀昆虫性的SEQ ID NO:2的IRDIG35563多肽或其变体中的至少一种。

在一些实施例中，控制转基因植物中鳞翅目和/或鞘翅目昆虫侵染并促进抗昆虫管理的方法包括在转基因植物中表达IRDIG35563多肽和对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫表达具有不同作用模式的Cry蛋白或其他杀昆虫蛋白。

在一些实施例中，控制转基因植物中鳞翅目和/或鞘翅目昆虫侵染并促进抗昆虫管理的方法包括在所述转基因植物中表达SEQ ID NO:2的IRDIG35563多肽或其变体，以及针对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫的Cry蛋白或其他杀昆虫蛋白，其中IRDIG35563多肽和Cry蛋白具有不同作用模式。

还提供了降低鳞翅目和/或鞘翅目昆虫对在这些植物中表达杀昆虫蛋白以控制这些昆虫物种的转基因植物产生抗性的可能性的方法，所述方法包括表达与具有不同作用方式的第二种杀昆虫蛋白组合的、对这些昆虫物种具有杀昆虫作用的IRDIG35563多肽。

还提供了用于转基因植物的有效鳞翅目和/或鞘翅目抗昆虫管理的手段，该手段包括在植物中以高水平共表达对鳞翅目和/或鞘翅目具有毒性的两种或更多种杀昆虫蛋白，但是每种都展现出不同的实行其杀灭活性的模式，其中两种或更多种杀昆虫蛋白包含IRDIG35563多肽和Cry蛋白。还提供了转基因植物的有效鳞翅目和/或鞘翅目抗昆虫管理的手段，该手段包括在植物中以高水平共表达对鳞翅目和/或鞘翅目具有毒性的两种或更多种杀昆虫蛋白，但是每种都展现出不同的实行其杀灭活性的模式，其中这两种或更多种杀昆虫蛋白包含SEQ ID NO:2的IRDIG35563多肽及其变体以及Cry蛋白或其他杀昆虫蛋白。

此外，提供了用于获得让监管部门批准种植或商业化表达对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫具有杀昆虫作用的蛋白的植物的方法，所述方法包括参考、提交或依据昆虫测定结合数据的步骤，所述数据显示IRDIG35563多肽不与此类昆虫中的Cry蛋白竞争结合位点。此外，提供了用于获得让监管部门批准种植或商业化表达对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫具有杀昆虫作用的蛋白的植物的方法，所述方法包括参考、提交或依据昆虫测定结合数据的步骤，所述数据显示SEQ ID NO:2的IRDIG35563多肽或其变体不与此类昆虫中的Cry蛋白竞争结合位点。

提高植物产量的方法。所述方法包括提供表达编码本文公开的杀有害生物多肽序列的多核苷酸的植物或植物细胞，并在有害生物(所述多肽对其具有杀有害生物活性)侵染的田地中种植所述植物或其种子。在一些实施例中，所述多肽对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、半翅目或线虫有害生物具有杀有害生物活性，并且所述田地被鳞翅目、半翅目、鞘翅目、双翅目或线虫有害生物侵染。

如本文所定义的，植物的“产量”是指植物生产的生物质的质量和/或数量。如本文所用的，“生物质”是指任何经测量的植物产物。生物质产量的增加是所测量的植物产物的产量上的任何改善。增加植物产量具有若干个商业应用。例如，增加植物叶生物质可以增加用于人或动物消耗的叶菜类的产量。此外，增加叶生物质可用于增加植物来源的药物或工业产品的产量。产量上的增加可以包括任何统计学上显著的增加，包括但不限于，与不表达杀有害生物序列的植物相比，产量上至少增加1％、至少增加3％、至少增加5％、至少增加10％、至少20％增加、至少30％、至少50％、至少70％、至少100％或更大的增加。

在具体方法中，由于表达本文公开的IRDIG35563多肽的植物的经改进的有害生物抗性使得植物产量得到提高。IRDIG35563多肽的表达导致有害生物侵染植物或在所述植物上取食的能力下降，从而提高植物产量。

加工方法。进一步提供了加工植物、植物部分或种子以从包含IRDIG35563多核苷酸的植物、植物部分或种子获得食物或饲料产品的方法。可以对本文提供的植物、植物部分或种子进行加工以产生通过加工具有商业价值的植物、植物部分或种子获得的衍生物的油、蛋白质产物和/或副产品。非限制性实例包括包含编码IRDIG35563多肽的核酸分子的转基因种子，其可以被加工以产生大豆油、大豆产品和/或大豆副产品。

“加工”是指用于获得任何大豆产品的任何物理和化学方法，并且包括但不限于热调节(heat conditioning)、剥落和研磨、挤出、溶剂萃取或水性浸泡以及全部或部分种子萃取。

当昆虫接触并摄入有效量的通过转基因植物表达、一种或多种配制的蛋白质组合物、一种或多种可喷雾的蛋白质组合物、诱饵基质或其他递送系统递送的毒素时，结果通常是昆虫死亡，或昆虫不以使毒素可供昆虫获得的源头为食。

使用合适的微生物宿主，例如假单胞菌属，微生物可以应用于有害生物的环境，在所述环境中它们会增殖并被摄食。结果是控制了有害生物。或者，可以在延长毒素活性并稳定细胞的条件下处理携带毒素基因的微生物。然后可以将保留毒性活性的处理的细胞施用于目标有害生物的环境。

实例

实例1

编码IRDIG35563杀昆虫毒素的表达质粒的构建及在细菌宿主中的表达。将标准克隆方法用于构建荧光假单胞菌(Pf)表达质粒，所述质粒经工程改造以产生由植物优化的编码区编码的IRDIG35563蛋白。限制性核酸内切酶和T4DNA连接酶分别获自新英格兰实验室(New England BioLabs)(NEB；马萨诸塞州伊普斯威奇(Ipswich,MA))，用于限制性消化和DNA连接。质粒制备是使用

质粒试剂盒(Macherey-Nagel Inc,宾夕法尼亚州伯利恒(Bethlehem,PA))按照供应商的低拷贝质粒纯化的说明进行。在琼脂糖Tris-醋酸盐凝胶电泳后，使用

凝胶提取试剂盒(凯杰公司(Qiagen),Venio,Limburg)纯化DNA片段。

基本的克隆策略是将IRDIG35563毒素编码序列(CDS)(SEQ ID NO:1)在SpeI和SalI限制性位点亚克隆到pDOW1169中，从而将其置于来自质粒pKK223-3(PL制药公司(PLPharmacia)，威斯康星州密尔沃基(Milwaukee,WI))的Ptac启动子和rrnBT1T2终止子的表达控制下。pDOW1169是中等拷贝质粒，其具有RSF1010复制起点、pyrF基因和在含有蛋白质编码区的DNA片段可引入其中的限制酶识别位点之前的核糖体结合位点(美国申请20080193974)。通过电穿孔将命名为pDOW1169的表达质粒转化到DC454(一种具有突变ΔpyrF和lsc::lacI^QI的近野生型荧光假单胞菌菌株)或其衍生物中，并在SOC-Soy水解物培养基中回收，并接种在选择性培养基(缺少尿嘧啶的M9葡萄糖琼脂，Sambrook等人，同上)上。微生物操作的细节可在Squires等人,(2004)、美国专利申请20060008877、美国专利申请20080193974、和美国专利申请20080058262(通过引用并入本文)中获得，。首先通过微量制备质粒DNA的限制性消化来筛选菌落。用四种限制酶消化含有IRDIG35563毒素的选定克隆的质粒DNA，并验证序列以进一步验证插入物的存在。

实例2

摇瓶中的生长和表达分析。用于表征和昆虫生物测定的IRDIG35563毒素的生产是通过摇瓶生长的含有表达构建体(pDOW1169)的荧光假单胞菌菌株完成的。将IRDIG35563培养物的甘油原液(0.5mL)接种到50mL具有9.5％甘油的确定的生产培养基(Teknova目录号3D7426,加利福尼亚州霍利斯特(Hollister,CA))中。在30℃下，摇动下初始孵育24小时后，通过添加异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导IRDIG35563毒素基因通过Ptac启动子的表达。在诱导时和诱导后的不同时间对培养物取样。通过600nm下的光密度(OD₆₀₀)测量细胞密度。例如，如美国专利申请20060008877中所述，也可以使用适合于荧光假单胞菌生长的其他培养基。

实例3

农杆菌转化。将标准克隆方法用于构建二元植物转化和表达质粒。限制性核酸内切酶和T4DNA连接酶购自新英格兰实验室。按照制造商的说明，使用

质粒制备试剂盒或

AX Xtra Midi试剂盒(均来自Macherey-Nagel,德国杜伦(Duren,Germany))来进行质粒制备。凝胶分离后，使用

PCR纯化试剂盒或QIAEX

凝胶提取试剂盒(均来自凯杰公司Venio,Limburg)纯化DNA片段。

使用电穿孔制备并转化根癌农杆菌菌株Z707S(Z707的链霉素抗性衍生物；Hepburn等人，1985)的电感受态细胞(Weigel和Glazebrook，2002)。电穿孔后，将1mL酵母提取蛋白胨(YEP)肉汤(10gm/L酵母提取物，10gm/L蛋白胨和5gm/L NaCl)添加到比色杯中，并将细胞YEP悬浮液转移至15mL培养管，在水浴中于28℃下恒速搅拌孵育4小时。将细胞接种在含有壮观霉素(200μg/mL)和链霉素(250μg/mL)的YEP plus琼脂(25gm/L)上，并将板在28℃下孵育2-4天。选择分离良好的单个菌落，并将其划线到如上所述的含有壮观霉素和链霉素的新鲜的YEP+琼脂平板上，并在28℃下孵育1-3天。

IRDIG35563基因插入物在二元植物转化载体中的存在是通过使用载体特异性引物和从选择的农杆菌菌落制备的模板质粒DNA进行PCR分析来进行的。按照制造商的说明，使用凯杰公司(Venlo,Limburg,荷兰)

Mini Preps如前从具有壮观霉素和链霉素的YEP中生长的15mL过夜培养物的4mL等分试样中提取细胞沉淀。包括来自农杆菌电穿孔转化中使用的二元载体的质粒DNA作为对照。使用来自英杰公司(Invitrogen)(加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad,CA))的Taq DNA聚合酶，按照制造商的说明，在0.5X的浓度下完成PCR反应。PCR反应在用以下条件编程的MJ研究珀尔帖热循环仪(MJ Research PeltierThermal Cycler)中进行：步骤1)94℃，持续3分钟；步骤2)94℃，持续45秒；步骤3)55℃，持续30秒；步骤4)72℃，每kb预期产物长度持续1分钟；步骤5)至步骤2，29次；步骤6)72℃，持续10分钟。循环后，将反应保持在4℃。通过琼脂糖凝胶电泳(例如0.7％至1％琼脂糖，w/v)分析扩增产物，并通过溴化乙锭染色可视化。选择其PCR产物与质粒对照相同的菌落。

实例4

IRDIG35563纯化。将含有IRDIG35563的收获的Pf细胞在裂解缓冲液中超声处理，所述裂解缓冲液由50mM Tris(pH 8.0)、1M NaCl、10％甘油和2mM EDTA与50μL蛋白酶抑制剂混合物(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO))/25mL缓冲液组成。将提取物以20,000xg离心40分钟。用50％硫酸铵沉淀上清液中的可溶性蛋白质，并以20,000xg离心30分钟。将沉淀重悬于50mM Tris(pH 8.0)中，并以20,000xg离心20分钟以沉淀任何可溶性物质。使用具有AKTAPurifier色谱系统(GE健康医疗集团(GEHealthcare)，英国)的HiTrap^TMQ HP 5mL柱，通过阴离子交换色谱法纯化含有IRDIG35563的上清液。在50mM Tris(pH 8.0)中平衡柱，用逐步梯度至1M NaCl来洗脱蛋白质。合并含蛋白质的级分，并使用具有30K MWCO(EMD密理博公司(EMD Millipore)，马萨诸塞州伯灵顿(Burlington,MA))的

Ultra-15离心过滤装置进行浓缩。将IRDIG35563蛋白样品用50mM Tris(pH 8)透析过夜，并使用NanoDrop 2000C分光光度计(赛默飞科技公司(Thermo Scientific)，马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默科技公司(Waltham,MA))使用A280方法测量总蛋白浓度。

实例5

凝胶电泳。SDS-PAGE分析使用

4％-12％Bis-Tris蛋白凝胶(赛默飞科技公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆)进行。将蛋白质在含有100mM TCEP的

LDS样品缓冲液(赛默飞科技公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆)中稀释4X，然后上样到凝胶上。将10μL

Sharp预染色蛋白标准品上样到每个凝胶的一个泳道上。按照制造商的建议，在

MES SDS运行缓冲液中运行电泳，并用SimplyBlue^TMSafeStain(赛默飞科技公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆)染色，然后在水中脱色并在平板扫描仪上成像。最终的蛋白制剂显示出单条蛋白质迁移带，其表观分子量为约88kDa。

实例6

样品制备和生物测定。将纯化的IRDIG35563制剂在50mM Tris，pH 8中适当稀释，所有生物测定均包含由所述缓冲液组成的对照处理，其作为死亡率和/或生长抑制的背景对照。使用NanoDrop 2000C分光光度计(赛默飞科技公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆)，使用A280方法估计生物测定缓冲液中的蛋白质浓度。

在用1-2天大的新生鳞翅目幼虫(食用人工昆虫饮食)进行的生物测定中，测试了纯化的蛋白质的杀昆虫活性。BAW、SAW、FAW、rFAW、CEW、TBW、SBL、VBC和CBW的幼虫是从由商业昆虫饲养所(本佐研究公司(Benzon Research Inc.)，宾夕法尼亚州卡莱尔(Carlisle,PA))饲养的群体获得的卵中孵化的。rFAW的幼虫是从由专利性群体(陶氏益农公司(DowAgroSciences LLC)，印第安纳州印第安纳波利斯(Indianapolis,IN))收获的卵中孵化的。

生物测定在专门设计用于昆虫生物测定的128孔塑料托盘中进行(C-D国际公司(C-D International)，新泽西州皮特曼(Pitman,NJ))。每个孔包含2.0mL多物种鳞翅目饮食(南陆公司(Southland)产品，阿肯色州莱克村(Lake Village,AR))。通过移液管将40μL等分试样的蛋白质样品移至每个孔的2.0cm²饮食表面(20μL/cm²)上。饮食浓度计算为孔中每平方厘米(cm²)表面积的IRDIG35563蛋白量(ng)。使用9,000至3ng/cm²范围内的9种剂量浓度，每个剂量测试16只幼虫。棉铃虫生物测定使用7种不同浓度的纯化原毒素，对照仅使用缓冲液。在25℃，16:8的光:暗光条件下7天后评估死亡率和停滞。将处理过的托盘保持在通风橱中，直到饮食表面的液体蒸发或吸收到饮食中。

在孵化的24-48小时内，用湿的骆驼毛刷挑取单个幼虫，并放置在处理的饮食上，每孔一只幼虫。然后将侵染的孔用透明塑料粘合片密封并通气以进行气体交换(C-D国际公司，新泽西州皮特曼)。将生物测定托盘在受控的环境条件下(28℃，约60％相对湿度，16:8[光:暗])放置5天，然后记录暴露于每种蛋白质样品的昆虫总数、死亡昆虫数和存活昆虫的重量。

将GI₅₀测定为GI值是50％时饮食中IRDIG35563蛋白的浓度。将50％致死浓度(LC₅₀)记录为50％测试昆虫被杀死时饮食中IRDIG35563蛋白的浓度。生长抑制浓度-响应曲线是通过JMP Pro 9.0.3版软件(SAS机构公司(SAS Institute Inc.)，北卡罗来纳州卡瑞(Cary,NC)))使用非线性逻辑3参数确定的。通过对汇总的死亡率数据进行Probit分析(Finney,1971)并使用POLO-PC(蕾奥拉软件公司(LeOra Software))执行来分析致死浓度-响应曲线。表2显示了纯化的IRDIG35563对通过人工饮食覆盖生物测定法(ng/cm²)测试的多种昆虫物种的功效。

表2

实例7

IRDIG35563 Bt杀昆虫蛋白和变体在双子叶植物中的产生。

拟南芥转化。使用花浸法转化拟南芥Col-01(Weigel和Glazebrook,2002)。将所选择的农杆菌菌落用于接种1mL至15mL含有合适抗生素的YEP液体培养物以进行选择。将培养物在28℃下以220rpm恒定搅拌孵育过夜。将每种培养物用于接种两个500mL的含有合适抗生素的YEP液体培养物以进行选择，并将新培养物在28℃下以恒定搅拌孵育过夜。在室温下以约8700xg将细胞沉淀10分钟，并丢弃所得的上清液。将细胞沉淀轻轻重悬于500mL浸润培养基中，该浸润培养基含有：1/2x Murashige和Skoog盐(西格玛奥德里奇公司)/Gamborg的B5维生素(金生物技术公司(Gold BioTechnology)，密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO))，10％(w/v)蔗糖，0.044μM苄氨基嘌呤(10μL/L的1mg/mL DMSO原液)和300μL/L Silwet L-77。将约1个月大的植物浸入培养基中15秒，注意确保浸没最新花序。然后将植物侧放并覆盖(透明或不透明)24小时，用水洗涤，然后直立放置。使植物在22℃，16:8的光:暗光周期下生长。浸入后约4周，收获种子。

拟南芥的生长和选择。将新鲜收获的T1种子在干燥剂存在下于室温干燥至少7天。将种子悬浮在0.1％琼脂/水(西格玛奥德里奇公司)溶液中，然后在4℃下分层2天。为了准备种植，将10.5英寸x 21英寸萌发托盘(T.O.塑料制品公司(T.O.Plastics Inc.)，明尼苏达州清水市(Clearwater,MN))中的Sunshine Mix LP5(新固园艺有限公司(Sun GroHorticulture Inc.)，华盛顿州贝尔维尤(Bellevue,WA))用蛭石粉覆盖，用Hoagland溶液进行底部灌溉(Hoagland和Arnon,1950)，直到潮湿，然后排水24小时。将分层的种子播种到蛭石上，并用湿气罩(KORD公司产品，加拿大安大略省布兰普顿(Bramalea,Ontario,Canada))覆盖7天。使种子萌发，并将植物在Conviron(型号CMP4030或CMP3244；环境控制有限公司(Controlled Environments Limited)，加拿大曼尼托巴省温尼伯市(Winnipeg,Manitoba,Canada))中在长日条件下(16:8的光:暗光周期)以120μmol/m²sec-150μmol/m²sec的光强度在恒定温度(22℃)和湿度(40％-50％)下生长。首先用Hoagland溶液浇植物，然后用去离子水浇，以保持土壤湿润而不湿透。

在播种后5-6天除去罩，并用化学选择剂喷雾植物以杀死从未转化的种子萌发的植物。例如，如果由二元植物转化载体提供的植物可表达的选择性标记基因是pat或bar基因(Wehrmann等人,1996)，则可以通过用1000X Finale溶液(5.78％草铵膦铵盐，法南姆公司(Farnam Companies Inc.)，亚利桑那州凤凰城(Phoenix,AZ))喷雾来选择转化的植物。间隔5-7天进行两次随后的喷雾。在最后一次喷雾后7-10天鉴定出存活者(活跃生长的植物)，并将其移植到使用Sunshine Mix LP5准备的盆中。将移植的植物用湿气罩覆盖3-4天，并在上述生长条件下置于Conviron中。

双子叶植物转化领域的技术人员将理解，当使用其他植物可表达的选择性标记基因(例如除草剂耐受性基因)时，可使用选择转化的植物的其他方法。表3显示了针对CEW、FAW、SAW、TBW和SBL的拟南芥T1生物测定结果(平均得分(SEM))。对于每个构建体产生了五个事件，并且在萌发后5周记录了平均叶损伤得分(侵染后5天，5个叶穿孔/事件)。表4报告了构建体设计和编号。

表3

表4

实例8

包含IRDIG35563的转基因大豆。

例如，通过农杆菌介导的转化，产生了具有包含IRDIG35563的核酸的表达载体的十至20株转基因T₀大豆植物。用氯气将成熟大豆(Glycine max)种子灭菌过夜16小时。用氯气灭菌后，将种子置于在LAMINAR^TM通风橱中的敞开容器中以驱散氯气。接下来，在24℃下，使用黑箱在黑暗中使经灭菌的种子吸收无菌H₂O持续十六个小时。

制备种子分裂的(split-seed)大豆。包含一部分胚轴的分裂的大豆种子方案需要准备大豆种子材料，将其使用固定在解剖刀上的#10刀片沿种脐纵向切开，以分离和去除种皮并且使种子分裂成两个子叶部分。小心操作以部分去除胚轴，其中约1/2-1/3的胚轴仍然附着在子叶的节末端。

接种。然后将包含一部分胚轴的分裂的大豆种子浸入含有包含IRDIG35563的二元质粒的根癌农杆菌(例如，菌株EHA 101或EHA 105)的溶液中持续约30分钟。在浸没包含胚轴的子叶之前，将根癌农杆菌溶液稀释至λ＝0.6OD₆₅₀的终浓度。

共培养。接种后，允许将分裂的大豆种子与根癌农杆菌菌株在盖有一张滤纸的培养皿中在共培养培养基上共培养5天(Wang,Kan.Agrobacterium Protocols.[农杆菌属方案]2.1.New Jersey:Humana Press[新泽西州：胡玛纳出版社],2006.印刷)。

芽诱导。共培养5天后，将分裂的大豆种子在液态芽诱导(SI)培养基中洗涤，所述液态芽诱导培养基由B5盐、B5维生素、28mg/L亚铁、38mg/L Na₂EDTA、30g/L蔗糖、0.6g/LMES、1.11mg/L BAP、100mg/L TIMENTIN^TM、200mg/L头孢噻肟和50mg/L万古霉素组成(pH5.7)。然后将分裂的大豆种子在芽诱导I(SI I)培养基上培养，所述芽诱导I培养基由B5盐、B5维生素、7g/L诺布尔琼脂、28mg/L亚铁、38mg/L Na₂EDTA、30g/L蔗糖、0.6g/L MES、1.11mg/L BAP、50mg/L TIMENTIN^TM、200mg/L头孢噻肟、50mg/L万古霉素组成(pH 5.7)，其中子叶的平坦侧朝上，并且将子叶的节末端浸入培养基中。培养2周后，将来自经转化的分裂的大豆种子的外植体转移到芽诱导II(SI II)培养基中，所述芽诱导II培养基含有补充有6mg/L草铵膦

的SI I培养基。

芽伸长。在SI II培养基上培养2周后，将子叶从外植体中移出，并且通过在子叶根部制造切口来切除含有胚轴的齐平芽块。将从子叶分离出的芽块转移到芽伸长(SE)培养基中。SE培养基由MS盐、28mg/L亚铁、38mg/L Na₂EDTA、30g/L蔗糖和0.6g/L MES、50mg/L天冬酰胺、100mg/L L-焦谷氨酸、0.1mg/L IAA、0.5mg/L GA3、1mg/L玉米素核苷、50mg/LTIMENTIN^TM、200mg/L头孢噻肟、50mg/L万古霉素、6mg/L草铵膦、7g/L诺布尔琼脂组成(pH5.7)。每2周将培养物转移到新鲜的SE培养基中。使培养物在CONVIRON^TM生长室中在24℃下以18h的光周期在80-90μmol/m²sec的光强度下生长。

生根。通过在子叶芽块的根部切下细长芽并且将细长芽蘸入1mg/L IBA(吲哚3-丁酸)中持续1-3分钟以促进生根，使从子叶芽块发育的细长芽分离。接下来，将细长芽转移到在phyta托盘中的生根培养基(MS盐、B5维生素、28mg/L亚铁、38mg/L Na₂EDTA、20g/L蔗糖和0.59g/L MES、50mg/L天冬酰胺、100mg/L L-焦谷氨酸、7g/L诺布尔琼脂，pH 5.6)中。

培养。在CONVIRON^TM生长室中在24℃、18h的光周期下培养1-2周后，将已经发育成根的芽转移到有盖圣代杯(sundae cup)中的土壤混合物中，并且置于CONVIRON^TM生长室(型号CMP4030和CMP3244，受控环境有限公司(Controlled Environments Limited)，加拿大马尼托巴省温尼伯)中，在长日照条件下(16小时光照/8小时黑暗)，在120-150μmol/m²sec的光强度下，在恒定温度(22℃)和湿度(40％-50％)下，用于使小植物适应环境。在将生根的小植物转移到温室以进一步适应环境并且获得强大的转基因大豆植物之前，将它们在圣代杯中适应新环境持续数周。

将转基因品系的发育和形态特征与未转化的植物进行比较。比较植物的根、芽、叶和繁殖特征。记录植物芽的特征，如高度、叶数目和大小、开花时间、花的大小和外观。通常，在体外和温室的土壤中培养时，转基因品系与未表达DIG蛋白的那些品系之间没有可观察到的形态学差异。

实例9

T0生物测定：对于每个构建体产生了五个大豆事件，并且在萌发后5周记录了平均叶损伤得分(侵染后5天，5个叶穿孔/事件)。表4报告了构建体设计和编号。表5显示了针对CEW、FAW、SAW、TBW和SBL的大豆T0生物测定的结果。叶损伤评级表使用1至9的评分系统，其中1表示88％-100％损伤。去调节的转基因大豆Conkesta被用作阳性对照。非转基因大豆品系被用作阴性对照。表5列出了可检测到蛋白质的那些事件的结果。其他测试事件产生不确定的结果，认为这是由于运输过程中遇到的环境条件。表6列出了表5中所示的损伤等级。

表5

事件	特征(RE)	BCW	CBW	CEW	FAW	SAW	SBL	TBW	VBC
										阴性对照	阴性	1	3	1	1	1	1	1	1
阴性对照	阴性	1	5	1	1	1	1	1	1
										阴性对照	阴性	1	5	1	1	5	2	1	1
阴性对照	阴性	1	9	1	1	6.2	3	1	2
										阳性对照	阳性	1	8	8	9	7	9	9	9
阳性对照	阳性	1	9	9	9	8	9	9	9
										阳性对照	阳性	3	9	9	9	8	9	9	9
阳性对照	阳性	3	9	9	9	9	9	9	9
										134635[8]-254	At肌动蛋白2	7	9	7	9	9	9	4	9
134633[9]-209	AtUbi10	8	8	9	9	8	9	9	9
										134633[10]-224	AtUbi10	8	5	7	9	9	9	4	8
134633[10]-212	AtUbi10	5	8	8	9	6.2	9	5	8

表6

损伤等级	损伤百分比
		9	0
8	12.5
		7	25
6.2	35
		5	50
4	62.5
		3	75
2	87.5
		1	100

实例10

IRDIG35563的产生

农杆菌介导的玉蜀黍转化。将来自高II或B-104F1杂交的种子(Armstrong等人,1991)种植到5加仑盆中，所述盆含有95％Metro-Mix 360无土生长介质(新固园艺有限公司，华盛顿州贝尔维尤)和5％粘土/壤土的混合物。使用高压钠灯和金属卤化物灯的组合以16:8小时的光:暗光周期生长。为了获得未成熟的F₂胚胎进行转化，进行了受控的近缘授粉。在授粉后8-10天当胚胎的大小为约1.0-2.0mm时，分离出未成熟的胚胎。

感染和共培养通过用液体肥皂擦洗，在70％乙醇中浸渍2分钟，然后在20％商业漂白剂(0.1％次氯酸钠)中浸渍30分钟，对玉蜀黍穗进行表面消毒，然后用无菌水冲洗。通过将在28℃下在含有100mg/L壮观霉素，10mg/L四环素和250mg/L链霉素的YEP固体培养基上生长2-3天的1-2环细菌转移到5mL含有100μM乙酰丁香酮的液体感染培养基(LS基础培养基(Linsmaier和Skoog,1965)，N6维生素(Chu等人,1975)，1.5mg/L 2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)，68.5gm/L蔗糖，36.0gm/L葡萄糖，6mM L-脯氨酸，pH 5.2)中，制备含有超二元载体的农杆菌细胞悬浮液。将溶液涡旋直至获得均匀的悬浮液，并使用具有紫色滤光片的Klett-Summerson比色计将浓度调节至约200Klett单位的最终密度，或在550nm下的约0.4的光密度。将未成熟的胚胎直接分离到含有2mL感染培养基的微量离心管中。除去培养基并用密度为200Klett单位的1mL农杆菌溶液代替，并将农杆菌和胚胎溶液在室温下孵育5分钟，然后转移至共培养培养基(LS基础培养基，(含有N6维生素，1.5mg/L 2,4-D，30.0gm/L蔗糖，6mML-脯氨酸，0.85mg/L AgNO₃、100μM乙酰丁香酮和3.0gm/L结冷胶(植物技术实验室(PhytoTechnology Laboratories.)，堪萨斯州莱内克萨(Lenexa,KS))，pH 5.8)中，在25℃下在暗条件下持续5天。

共培养后，将胚胎转移到选择培养基中，然后经约8周的过程获得转化的分离物。为了选择用含有植物可表达的pat或bar选择性标记基因的超二元质粒转化的玉蜀黍组织，将基于LS的培养基(LS基础培养基，具有1X N6维生素，1.5mg/L 2,4-D，0.5gm/L MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸一水合物；植物技术实验室，堪萨斯州莱内克萨)，30.0gm/L蔗糖，6mM L-脯氨酸，1.0mg/L AgNO₃、250mg/L头孢噻肟，2.5gm/L结冷胶，pH 5.7)与双丙氨酰膦(金生物技术公司，圣路易斯密苏里州)一起使用。将胚胎转移到含有3mg/L的双丙氨酰膦的选择培养基中，直到获得胚性分离物。以2周的间隔将回收的分离物转移到新鲜的选择培养基中以进行扩大，用于再生和进一步分析。玉蜀黍转化领域的技术人员将理解，当使用其他植物可表达的选择性标记基因(例如除草剂耐受性基因)时，可使用选择转化的植物的其他方法。

将质粒pDAB134672、pDAB134673和pDAB134674中包含的IRDIG35563的三个构建体转化到玉蜀黍中(表7)。再生T0植物并测试其控制靶昆虫有害生物的能力。

表7

质粒：	描述：
		pDAB134672	ZmUbi1-IRDIG35563.3-StPinII、ZC18、ZmUbi1-AAD1-ZmLip
pDAB134673	ZmCAB-IRDIG35563.3-StPinII、ZC18、ZmUbi1-AAD1-ZmLip
		pDAB134674	OsUbi1-IRDIG35563.3-OsUbi1、ZC18、ZmUbi1-AAD1-ZmLip

从V5T0转基因植物的V3或V4叶中一式两份取出1.0X 0.5英寸正方形叶插。对于每个测试，首先取样野生型植物叶组织，以防止Bt毒素在叶边缘上的交叉污染，然后取样转化的植物。在每个生物测定托盘孔(32孔托盘和盖子，CD国际公司，新泽西州皮特曼)中，将1个叶插置于2％水-琼脂(飞世尔科技公司(Fisher Scientific)，新泽西州费尔劳恩(FairLawn,NJ))上，每个昆虫物种、每个事件和每个构建体重复2次。

每个孔被十只FAW新生虫(24-48小时大)侵染，并用塑料穿孔盖密封以允许空气交换。将托盘置于28℃(16:8小时的光:暗，相对湿度40％)下，并在3天后将其进行叶损伤百分比分级。当通过使用

Pro 9.0.1(2010SAS机构公司，北卡罗来纳州卡瑞)方差均一时，使用ANOVA分析叶损伤百分比数据并且用Tukey-Kramer测试分析平均分离性(meanseparations)。表8显示了表达IRDIG35563的T0玉蜀黍中FAW叶损伤的结果。

表8.

构建体	事件	平均值(平均损伤)	标准误差
				pDAB134672	11	36.3	14.8
pDAB134673	25	58	6.08
				pDAB134674	17	6.48	5.38
B104	9	99.2	0.59
				Herculex	9	22.2	4.65

实例11

再生和种子生产。为了再生，将培养物转移至“28”诱导培养基(MS盐和维生素，30gm/L蔗糖，5mg/L苄基氨基嘌呤，0.25mg/L 2,4-D，3mg/L双丙氨酰膦，250mg/L头孢噻肟，2.5gm/L结冷胶，pH 5.7)，在弱光条件(14μEm^-2s^-1)下放置1周，然后在强光条件(约89μEm^{- 2}s^-1)下放置1周。随后将组织转移至“36”再生培养基(除缺少植物生长调节剂外，与诱导培养基相同)。将3-5cm长的植株转移到含有SHGA培养基(Schenk和Hildebrandt盐和维生素(1972)；植物技术实验室，堪萨斯州莱内克萨)、1.0gm/L肌醇、10gm/L蔗糖和2.0gm/L结冷胶，pH 5.8)的玻璃培养管中，使芽和根进一步生长和发育。将植物移植到与本文前面所述相同的土壤混合物中，并在温室中生长到开花。进行用于种子生产的受控授粉。

实例12

IRDIG35563编码序列的植物优化形式的设计。设计并合成具有植物密码子偏好性的DNA序列，以在转基因单子叶植物和双子叶植物中产生IRDIG35563蛋白。从获自保藏在GenBank中的序列的706个蛋白质编码序列(CD)计算出玉蜀黍(Zea mays L.)的密码子使用表。烟草(Nicotiana tabacum，1268CD)、低芥酸油菜(欧洲油菜(Brassica napus)，530CD)、棉花(陆地棉(Gossypium hirsutum)，197CD)和大豆(Glycine max；约1000CD)的密码子使用表可从以下网站的数据中下载：http://www.kazusa.or.jp/codon/。在省略对于任一种植物类型中氨基酸使用少于总密码子使用量约10％的多余冗余密码子后，计算出偏好性密码子集，其包含以适当的加权平均相对量计的玉蜀黍和双子叶植物数据集共有的高度使用的密码子。为了得到编码IRDIG35563蛋白的植物优化序列，对实验确定的IRDIG35563DNA序列进行密码子取代，使得所得的DNA序列具有植物优化密码子偏好表的总密码子组成。对序列进行进一步的完善，以消除不需要的限制性酶识别位点，潜在的植物内含子剪接位点，A/T或C/G残基的长序列以及可能干扰植物细胞中编码区的RNA稳定性、转录或翻译的其他基序。进行其他改变，以引入所需的限制酶识别位点，并消除长的内部开放阅读框(+1以外的框)。这些改变都是在保留植物偏好的密码子组成的限制下进行的。设计的序列的合成由供应商(DNA2.0公司，加利福尼亚州门洛帕克(Menlo Park,CA))进行。关于产生合成基因的其他指导可以在例如WO 97/13402和美国专利号5380831中找到。

编码IRDIG35563的玉蜀黍优化的高GC DNA序列在SEQ ID NO:3中给出。编码全长IRDIG35563的双子叶植物优化的DNA序列在SEQ ID NO:4公开。

固定在蛋白质印迹上的DNA与放射性标记的基因特异性探针的杂交可以通过标准方法进行(Sambrook等人,同上)。用于标记多核苷酸探针的放射性同位素可以包括32P、33P、14C或3H。可以通过分子生物学领域技术人员众所周知的几种方法中的任一种将放射性同位素掺入多核苷酸探针分子中(参见，例如，Sambrook等人，同上)。通常，杂交和随后的洗涤可以在允许检测与要求保护的毒素编码基因具有同源性的靶序列的严格条件下进行。对于双链DNA基因探针，可在6X SSPE，5X Denhardt溶液，0.1％SDS，0.1mg/mL变性DNA[20XSSPE是3M NaCl，0.2M NaHPO₄和0.02M EDTA(乙二胺四乙酸钠盐)；100X Denhardt溶液是20gm/L聚乙烯吡咯烷酮，20gm/L Ficoll 400型和20gm/L BSA(级分V)]中在低于DNA杂交体的T_m 20℃至25℃下进行杂交过夜。

洗涤通常可以如下进行：

a.在室温下在1X SSPE、0.1％SDS(低严格洗涤)中15分钟，两次。

b.在低于T_m温度20℃下在0.2X SSPE、0.1％SDS(中严格洗涤)中15分钟，一次。

对于寡核苷酸探针，可在6X SSPE、5X Denhardt溶液、0.1％SDS、0.1mg/mL变性DNA中在低于杂交体的T_m 10℃至20℃下进行杂交过夜。寡核苷酸探针的T_m可以通过下式确定(Suggs等人,1981)。

T_m(℃)＝2(T/A碱基对的数量)+4(G/C碱基对的数量)

洗涤通常可以如下进行：

a.在室温下在1X SSPE、0.1％SDS(低严格洗涤)中15分钟，两次。

b.在杂交温度下在1X SSPE、0.1％SDS(中严格洗涤)中15分钟，一次。

可以通过放射性标记以外的方法使用于杂交的探针分子以及在探针和靶分子之间形成的杂交分子可检测到。这样的替代方法意图在本发明的范围内。

实例13

其他作物物种的转化。通过利用本领域技术人员已知的方法，例如与先前在美国专利7,838,733的实例14或PCT国际专利公开号WO 2007/053482的实例12中描述的基本上相同的技术，用IRDIG35563(具有或不具有叶绿体转运肽)转化棉花以提供对昆虫有害生物的控制。

虽然本公开可能易于进行各种修改和替代形式，但是本文已经通过例示的方式详细描述了特定实施例。然而，应当理解，本公开并不旨在限于所公开的特定形式。而是，本公开将覆盖落入如由以下所附权利要求及其合法等同物所定义的本公开的范围内的所有修改、等同物和替代物。

参考书目

Beltz,G.A.,Jacobs,K.A.,Eickbush,T.H.,Cherbas,P.T.,Kafatos,F.C.(1983)Isolation of multigene families and determination of homologies by filterhybridization methods.In Wu,R.,Grossman,L.,Moldave,K.(eds.)Methods ofEnzymology,Vol.100 Academic Press,New York pp.266-285.

Crickmore,N.,Baum,J.,Bravo,A.,Lereclus,D.,Narva,K.,Sampson,K.,Schnepf,E.,Sun,M.和Zeigler,D.R.“Bacillus thuringiensis toxin nomenclature”(2016)

http://www.btnomenclature.info/

Huang,F.,Rogers,L.B.,Rhett,G.H.(2006)Comparative susceptibility ofEuropean corn borer,southwestern corn borer,and sugarcane borer(Lepidoptera:Crambidae)to Cry1Ab protein in a commercial Bacillus thuringiensis cornhybrid.J.Econ.Entomol.99:194-202。

Lee,et.al.(2003)The Mode of Action of the Bacillus thuringiensisVegetative Insecticidal Protein Vip3A Differs from That of Cry1Abδ-Endotoxin.Appl.Environ.Microbiol.vol.69no.8 4648-4657

Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.(1989)Molecular Cloning:A LaboratoryManual(2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,N.Y.)

Tijssen,P.(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology Hybridization with Nucleic Acid Probes,Part I,Chapter 2.P.C.van derVliet(ed.),(Elsevier,N.Y.)

Wang,Kan.Agrobacterium Protocols.2.1.New Jersey:Humana Press,2006.Print

Weigel,D.,Glazebrook,J.(eds.)(2002)Arabidopsis:A Laboratory Manual.ColdSpring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY,354 pages.

Yu,C.G.,Mullins,M.A.,Warren,G.W.,Koziel,M.G.and Estruch,J.J.(1997)TheBacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein Vip3A lyses midgutepithelium cells of susceptible insects.Appl.Environ.Microbiol.February 1997；63:2 532-6.

序列表

<110> 陶氏益农有限公司（Dow AgroSciences LLC）

<120> 嵌合杀昆虫蛋白

<130> 80144_WO_PCT

<150> US 62/563,228

<151> 2017-09-26

<160> 4

<170> PatentIn 版本3.5

<210> 1

<211> 2367

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 嵌合基因人工序列

<400> 1

atggcaaaca tgaacaacac caaactgaac gcgagagcgc tgcccagctt cattgattac 60

ttcaacggga tctacggttt tgcaactggc atcaaagaca tcatgaacat gatcttcaag 120

acggacacgg gtggcaacct tactctggac gagatcctca agaaccagca actcctcaat 180

gagatttctg ggaaactcga cggtgtcaac gggtctctga atgacttgat cgctcaaggc 240

aacttgaata ccgagctgtc caaggagata ctcaagatcg cgaacgagca gaatcaagtg 300

ttgaacgatg ttaacaacaa gttggatgcc atcaacacga tgctgcacat ctatctgcct 360

aagattactt ccatgctgtc cgacgtgatg aagcaaaact atgcgctgtc acttcaagtc 420

gagtacttgt ctaagcagct gaaggaaatc tcagacaagc tcgatgttat caacgtcaat 480

gttcttatca actctacttt gacggagatt actccagctt atcagcggat caagtatgtt 540

aacgagaagt tcgaagagct gactttcgca accgagacga ctctcaaggt caagaaggac 600

tcatcgccag ccgatatcct tgatgaattg actgagctta ctgagcttgc aaagtccgtg 660

accaagaatg acgtggacgg tttcgagttc tatcttaaca ccttccatga cgtgatggtt 720

ggcaacaatc tctttggcag atccgctctc aagactgcat cggaactgat cgccaaggag 780

aacgtcaaga cctccggttc agaggtgggg aacgtgtaca actttctgat tgtcctcaca 840

gcgttgcaag ctaaggcctt cctcacactc accacatgtc gcaaactttt gggactcgca 900

gatatcgact acacttccat catgaacgaa catctgaaca aggagaagga ggagttcaga 960

gtgaacatct tgccgactct ctccaatacg ttctcgaacc caaactacgc caaggtcaag 1020

ggttcagacg aggacgccaa gatgattgtt gaggctaaac ctgggcacgc tctggttggg 1080

ttcgaaatct ccaacgattc catgacggtg cttaaggtgt atgaggctaa gctcaagcag 1140

aactatcaag ttgataagga cagcctctca gaggtgatct atagcgatat ggacaagttg 1200

ctctgtccgg atcagtccga gcaaatctac tacaccaaca acatcgtgtt tcctaacgag 1260

tacgtcatca ccaagattga tttcactaag aagatgaaaa ctctcagata cgaagtcacg 1320

gcaaactctt atgactcatc gactggggaa atcgacctca acaagaagaa agtggagtcc 1380

tctgaggctg agtatcgcac cctctctgct aacaacgacg gtgtgtacat gccactcggt 1440

gtcatttccg aaacattcct tacacccatc aacggtttcg gactgcaagc ggacgagaac 1500

tctcgcttga tcacactgac gtgcaagagc tatctgagag agctgcttct tgctacggat 1560

ctttccaaca aggagacaaa gctgatcgtt cctcccatca gcttcataag caacatcgtc 1620

gagaacggca atcttgaagg tgagaatctg gagccgtgga tcgcgaacaa caagaacgcc 1680

tacgttgacc acactggagg gatcaacggc accaaggtgc tctatgtcca caaggatggc 1740

gagtttagcc agttcgtggg tggaaaactt aagtcaaaga ctgaatacgt catccagtac 1800

atcgtgaagg ggaaggcgtc aatctacttg aaagatgaaa atactggata tattctttat 1860

gaagatacaa ataatgattt agaagatttc caaactataa ctaaaaggtt cacaacagga 1920

actgatttaa tgagagtgta tttaatttta aaaagtcaaa gtggtcacga agcttgggga 1980

gataacttta caattttgga aattaagcct gcggaggctt tagtaagccc agaattgatt 2040

aatccgaatt cttggattac aactcaaggg gctagcattt caggagataa actttttatt 2100

agcttgggga caaatgggac ctttagacaa aatctttcat taaacagtta ttcaacttat 2160

agtataagct ttactgcatc gggaccattt aatgtgacgg taagaaattc tagggaagta 2220

ttatatgaac gaaacaacct tatgtcttca actagtcata tttctgggga attcaaaact 2280

gaatccaata ataccggatt atatgtagaa ctttcccgtc gttctggtgg tgctggtcat 2340

atatcatttg aaaacatttc tattaaa 2367

<210> 2

<211> 789

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 嵌合毒素人工序列

<400> 2

Met Ala Asn Met Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser

1 5 10 15

Phe Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys

20 25 30

Asp Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr

35 40 45

Leu Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly

50 55 60

Lys Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly

65 70 75 80

Asn Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu

85 90 95

Gln Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn

100 105 110

Thr Met Leu His Ile Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp

115 120 125

Val Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Val Glu Tyr Leu Ser

130 135 140

Lys Gln Leu Lys Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Val Ile Asn Val Asn

145 150 155 160

Val Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg

165 170 175

Ile Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu

180 185 190

Thr Thr Leu Lys Val Lys Lys Asp Ser Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp

195 200 205

Glu Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp

210 215 220

Val Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val

225 230 235 240

Gly Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu

245 250 255

Ile Ala Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val

260 265 270

Tyr Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Lys Ala Phe Leu

275 280 285

Thr Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr

290 295 300

Thr Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg

305 310 315 320

Val Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr

325 330 335

Ala Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala

340 345 350

Lys Pro Gly His Ala Leu Val Gly Phe Glu Ile Ser Asn Asp Ser Met

355 360 365

Thr Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val

370 375 380

Asp Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Ser Asp Met Asp Lys Leu

385 390 395 400

Leu Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val

405 410 415

Phe Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met

420 425 430

Lys Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Ser Tyr Asp Ser Ser Thr

435 440 445

Gly Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu

450 455 460

Tyr Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asn Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly

465 470 475 480

Val Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gln

485 490 495

Ala Asp Glu Asn Ser Arg Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu

500 505 510

Arg Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu

515 520 525

Ile Val Pro Pro Ile Ser Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Gly Asn

530 535 540

Leu Glu Gly Glu Asn Leu Glu Pro Trp Ile Ala Asn Asn Lys Asn Ala

545 550 555 560

Tyr Val Asp His Thr Gly Gly Ile Asn Gly Thr Lys Val Leu Tyr Val

565 570 575

His Lys Asp Gly Glu Phe Ser Gln Phe Val Gly Gly Lys Leu Lys Ser

580 585 590

Lys Thr Glu Tyr Val Ile Gln Tyr Ile Val Lys Gly Lys Ala Ser Ile

595 600 605

Tyr Leu Lys Asp Glu Asn Thr Gly Tyr Ile Leu Tyr Glu Asp Thr Asn

610 615 620

Asn Asp Leu Glu Asp Phe Gln Thr Ile Thr Lys Arg Phe Thr Thr Gly

625 630 635 640

Thr Asp Leu Met Arg Val Tyr Leu Ile Leu Lys Ser Gln Ser Gly His

645 650 655

Glu Ala Trp Gly Asp Asn Phe Thr Ile Leu Glu Ile Lys Pro Ala Glu

660 665 670

Ala Leu Val Ser Pro Glu Leu Ile Asn Pro Asn Ser Trp Ile Thr Thr

675 680 685

Gln Gly Ala Ser Ile Ser Gly Asp Lys Leu Phe Ile Ser Leu Gly Thr

690 695 700

Asn Gly Thr Phe Arg Gln Asn Leu Ser Leu Asn Ser Tyr Ser Thr Tyr

705 710 715 720

Ser Ile Ser Phe Thr Ala Ser Gly Pro Phe Asn Val Thr Val Arg Asn

725 730 735

Ser Arg Glu Val Leu Tyr Glu Arg Asn Asn Leu Met Ser Ser Thr Ser

740 745 750

His Ile Ser Gly Glu Phe Lys Thr Glu Ser Asn Asn Thr Gly Leu Tyr

755 760 765

Val Glu Leu Ser Arg Arg Ser Gly Gly Ala Gly His Ile Ser Phe Glu

770 775 780

Asn Ile Ser Ile Lys

785

<210> 3

<211> 2370

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 玉米密码子优化人工序列

<400> 3

atggcgaaca tgaataatac taaattaaac gcccgcgcgc tgcccagctt catcgactac 60

ttcaacggca tctacggctt cgccaccggc atcaaggaca tcatgaacat gatcttcaag 120

accgacaccg gcggcaacct gaccctggac gagatcctga agaaccagca gctgctgaac 180

gagatcagcg gcaagctgga cggcgtgaac ggcagcctga acgacctgat cgcgcaaggc 240

aaccttaata cagagctgtc caaggagatc ctgaagatcg ccaacgagca gaatcaagtg 300

ctgaacgacg tgaacaacaa gctggacgcc atcaacacca tgctgcacat ctacctgccc 360

aagatcacct caatgctgag cgacgtgatg aagcagaact acgccctgtc cctgcaagtg 420

gagtacctgt ccaagcagct gaaggagatc tccgacaagc tggacgtgat caacgtgaac 480

gtgctgatca acagcaccct gaccgagatc acccccgcgt accagaggat taaatacgtg 540

aatgaaaagt tcgaggaatt aaccttcgcc accgagacga ccctgaaggt gaagaaggac 600

tccagcccgg ccgacatcct ggacgagctg accgaattaa ccgagctggc gaagtccgtg 660

accaagaacg acgtggacgg cttcgagttc tacctgaata cattccacga cgtgatggtg 720

ggcaataatc tgttcggccg ctccgccctg aagaccgcct ccgaattaat cgctaaggag 780

aacgtgaaga ccagcggctc agaggtgggc aacgtgtaca acttcctgat cgtgctgacc 840

gccctgcaag ccaaggcgtt cctgaccctg accacctgta ggaagctgct gggcctggcg 900

gacatcgact atacatccat catgaacgag cacctgaaca aggagaagga ggagttccgc 960

gtgaacatcc tgcccaccct gtccaacacc ttctccaacc cgaactacgc caaggtgaag 1020

ggctccgacg aggacgccaa gatgatcgtg gaggccaagc ccggccacgc gctggtgggc 1080

ttcgagatct ccaacgactc catgaccgta ttaaaggtgt acgaggccaa gctgaagcag 1140

aactaccaag tggacaagga cagcctgagc gaggtgatct acagcgacat ggacaagctg 1200

ctgtgcccgg accagtccga gcagatctac tacaccaata atatcgtgtt ccccaacgag 1260

tacgtgatca ccaagatcga cttcaccaag aagatgaaaa ccctgcgcta cgaggtgacc 1320

gcgaacagct acgactcctc caccggcgag atcgacctga acaagaagaa ggtggaatca 1380

agcgaggcgg agtaccgcac cctgagcgcc aataatgacg gcgtgtacat gccgctgggc 1440

gtgatctccg aaaccttcct gaccccaatt aatggctttg gcctgcaagc ggatgaaaac 1500

tcaagattaa tcaccctgac ctgcaagagc tacctgcgcg agctgctgct ggccaccgac 1560

ctgtccaata aagaaacgaa actgatcgtg ccgcccatca gcttcatcag caacatcgtg 1620

gagaacggca acctggaggg cgagaacctg gagccctgga tcgccaacaa caagaacgcc 1680

tacgtggacc acaccggcgg catcaacggc accaaggtgc tgtacgtgca caaggacggc 1740

gagttcagcc agttcgtggg cggcaagctg aagtccaaga ccgagtacgt gatccagtac 1800

atcgtgaagg gcaaggccag catctacctg aaggatgaaa ataccggcta catcctgtac 1860

gaggacacca ataatgacct ggaggacttc cagaccatca ccaagaggtt caccaccggc 1920

accgacctga tgcgcgtgta cctgatcctg aagtcccagt ccggccacga ggcgtggggc 1980

gacaacttca ccatcctgga aataaagccg gccgaggccc tggtgagccc ggagctgatt 2040

aatccgaaca gctggatcac cacccaaggc gccagcatca gcggcgacaa gctgttcatc 2100

agcctgggca ccaacggcac ctttaggcag aacctgtcat taaactcata cagcacctac 2160

tccatcagct tcaccgcctc cggcccgttc aacgtgaccg tgaggaactc gagggaggtg 2220

ctgtacgaga ggaacaacct gatgagctcc acctcccata tcagcggcga gttcaagacc 2280

gagtccaata ataccggcct gtacgtggag ctgtcccgta ggagcggcgg cgcgggccac 2340

atcagcttcg agaacatctc cattaaataa 2370

<210> 4

<211> 2370

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 大豆密码子优化人工序列

<400> 4

atggctaaca tgaataatac taaattaaac gctcgtgctt tgccctcttt cattgactac 60

ttcaacggaa tctacggttt cgccactggc atcaaagaca tcatgaacat gatcttcaag 120

accgacaccg gtggcaacct cacccttgat gagattctca agaaccagca gctcctcaac 180

gagatttctg ggaaactcga tggtgtcaac ggctctctca atgacttgat tgctcaaggc 240

aacttgaata cagaactttc caaggagatt ctcaagattg ccaacgaaca gaatcaagtg 300

ttgaacgacg tcaacaacaa gttggatgcc atcaacacca tgcttcacat ctatcttccc 360

aagatcactt ccatgctcag cgatgtgatg aagcagaact acgctctttc ccttcaagtt 420

gagtacttgt ccaagcagtt gaaggaaatc tccgacaagc ttgatgtcat caacgtcaat 480

gttctcatca actctacttt gaccgagatc accccagctt atcagaggat taaatatgtg 540

aatgaaaagt ttgaagaatt aactttcgca accgagacta ccctcaaggt caagaaggac 600

tcaagcccag ctgacatcct tgatgaattg accgaattaa ctgagcttgc aaagtctgtg 660

accaagaatg atgttgacgg tttcgagttc tatctcaata catttcacga cgtcatggtt 720

ggcaataatc tctttggacg ttccgctctc aagactgcat ccgaattaat cgccaaggag 780

aacgtcaaga cctctggctc agaggtgggc aacgtgtaca acttcttgat tgttctcaca 840

gcccttcaag ccaaggcttt cctcacactc accacatgta ggaaactttt gggacttgct 900

gacattgact atacatccat catgaacgaa cacctcaaca aggagaagga agagtttaga 960

gtgaacatct tgcctactct ctccaatacc ttctccaatc caaactatgc caaggtcaag 1020

ggttcagacg aggacgccaa gatgattgtt gaggccaagc ctgggcacgc tcttgttggt 1080

tttgaaatct ccaatgactc catgaccgta ttaaaggtgt acgaggccaa gctcaagcag 1140

aactatcaag ttgacaagga cagcctctca gaggtgatct acagcgacat ggacaagctt 1200

ctctgcccag accagtccga gcagatctac tacaccaata atattgtctt tccaaacgag 1260

tacgtcatta ccaagattga tttcacaaag aagatgaaaa cccttcgtta cgaagtcacc 1320

gcaaactctt acgactcttc cactggggag attgacctca acaagaagaa agttgaatca 1380

agcgaggctg agtataggac cctctctgcc aataatgacg gtgtgtacat gccacttggt 1440

gtcatttccg aaacatttct cactccaatt aatggttttg gactccaagc agatgaaaac 1500

tcaagattaa ttacactcac ctgcaagagc tacttgagag agctccttct tgcaaccgat 1560

ctttccaata aagagacaaa gttgattgtt cctcccatca gcttcatcag caacattgtt 1620

gagaatggca atcttgaagg tgagaacctt gagccttgga ttgccaacaa caagaacgcc 1680

tacgttgatc atactggagg gatcaacggc accaaggttc tctatgttca caaggatggc 1740

gagtttagcc agtttgtggg tggaaagttg aagtcaaaga ctgaatacgt cattcagtac 1800

attgtgaaag gcaaggcctc aatctacttg aaagatgaaa atactggcta catcctttac 1860

gaagacacaa ataatgatct cgaagatttc cagaccatca caaagaggtt cacaactgga 1920

actgatctca tgagagtgta cttgatcttg aaaagccagt ccggtcacga agcttgggga 1980

gacaacttca ccatccttga aataaagcct gccgaggctt tggtcagccc agaattgatt 2040

aatcccaact cttggattac aacccaaggt gccagcattt ctggagacaa acttttcatt 2100

agcttgggga caaatgggac cttcagacag aatctttcat taaactctta ctcaacctac 2160

tccatcagct tcactgcatc cggacccttc aatgtgaccg tgaggaattc aagggaagtc 2220

ttgtacgaaa ggaacaacct catgtcttca acctcccata tcagcggaga gttcaaaacc 2280

gaatccaata ataccggatt gtacgttgaa ctttcccgtc gttctggtgg tgctggtcac 2340

atttcttttg aaaacatttc cattaaataa 2370

Claims (15)

1.一种重组核酸构建体，所述重组核酸构建体包含一个或多个异源调节元件，所述异源调节元件驱动编码与SEQ ID NO:2的多肽序列具有至少95％序列同一性的多肽的核酸序列的表达。

2.根据权利要求1所述的构建体，其中所述核酸序列选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4组成的组。

3.一种杀昆虫嵌合毒素，所述杀昆虫嵌合毒素包含SEQ ID NO:2的残基1至789。

4.根据权利要求3所述的杀昆虫嵌合毒素，所述杀昆虫嵌合毒素由SEQ ID NO:2组成。

5.一种植物或植物部分，所述植物或植物部分包含根据权利要求1所述的核酸构建体。

6.一种植物或植物部分，所述植物或植物部分包含根据权利要求2所述的核酸构建体。

7.根据权利要求5所述的植物部分，其中所述植物部分是种子。

8.根据权利要求6所述的植物部分，其中所述植物部分是种子。

9.根据权利要求5所述的植物或植物部分，其中所述核酸构建体编码嵌合毒素，所述嵌合毒素对选自以下的一种或多种昆虫具有杀昆虫活性：甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)(甜菜粘虫，BAW)、亚热带粘虫(Spodoptera eridania)(南方夜蛾，SAW)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(秋夜蛾，FAW)、抗性草地贪夜蛾(resistant Spodopterafrugiperda)(秋夜蛾，FAW)、谷实夜蛾(Helicoverpa zea)(玉米穗虫，CEW)、大豆夜蛾(Pseudoplusia includens)(大豆尺蠖，SBL)、黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)(绒毛豆毛虫，VBC)、烟芽夜蛾(Heliothis virescens)(烟青虫，TBW)和棉铃虫(Helicoverpaarmigera)(棉螟蛉，CBW)。

10.根据权利要求6所述的植物或植物部分，其中所述核酸构建体编码嵌合毒素，所述嵌合毒素对选自以下的一种或多种昆虫具有杀昆虫活性：甜菜夜蛾(甜菜粘虫，BAW)、亚热带粘虫(南方夜蛾，SAW)、草地贪夜蛾(秋夜蛾，FAW)、抗性草地贪夜蛾(抗性秋夜蛾，rFAW)、谷实夜蛾(玉米穗虫，CEW)、大豆夜蛾(大豆尺蠖，SBL)、黎豆夜蛾(绒毛豆毛虫，VBC)、烟芽夜蛾(烟青虫，TBW)和棉铃虫(棉螟蛉，CBW)。

11.一种用于控制易感昆虫的方法，所述方法包括使所述昆虫与有效量的根据权利要求3所述的毒素接触。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述毒素是SEQ ID NO:2。

13.一种用于控制昆虫有害生物群体的方法，所述方法包括使所述有害生物群体与杀昆虫有效量的根据权利要求3所述的毒素接触。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述昆虫有害生物群体选自甜菜夜蛾(甜菜粘虫，BAW)、亚热带粘虫(南方夜蛾，SAW)、草地贪夜蛾(秋夜蛾，FAW)、抗Cry1F的草地贪夜蛾、谷实夜蛾(玉米穗虫，CEW)、大豆夜蛾(大豆尺蠖，SBL)、黎豆夜蛾(绒毛豆毛虫，VBC)、烟芽夜蛾(烟青虫，TBW)和棉铃虫(棉螟蛉，CBW)。

15.一种产生昆虫抗性或昆虫耐受性植物的方法，所述方法包括用包含稳定地并入转基因植物基因组中的根据权利要求1所述的构建体的转基因植物育种非转基因植物，并选择含有根据权利要求1所述的DNA构建体的后代。