CN110621780A - 杀昆虫蛋白及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于控制有害生物的组合物和方法。所述方法涉及用编码杀昆虫蛋白的核酸序列来转化生物体。具体地，所述核酸序列可用于制备具有杀昆虫活性的植物和微生物。因此，提供了转化的细菌、植物、植物细胞、植物组织以及种子。组合物是植物物种的杀昆虫核酸和蛋白。所述序列可用于构建随后转化到包括植物在内的目的生物体中的表达载体，作为用于分离其他同源(或部分同源)基因的探针。所述杀有害生物蛋白可用于控制鳞翅目、鞘翅目、双翅目、真菌、半翅目和线虫有害生物群体，抑制其生长或将其杀灭，并且可用于生产具有杀昆虫活性的组合物。

Description

杀昆虫蛋白及其使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年5月11日提交的美国临时申请号62/504,650的优先权，所述临时申请通过引用以其全文并入本文。

以电子方式提交的序列表的引用

所述序列表的官方副本经由EFS-Web作为ASCII格式的序列表以电子方式提交，文件名为“7440_WO_PCT_Sequence_Listing”，创建于2018年5月2日，且具有约334千字节的大小，并与本说明书同时提交。包括在所述ASCII格式的文件中的序列表是本说明书的一部分并且通过引用以其全文并入本文。

技术领域

本公开涉及分子生物学领域。提供了编码杀有害生物蛋白的新颖基因。这些杀有害生物蛋白和编码它们的核酸序列可用于制备杀有害生物制剂和生产有害生物抗性转基因植物。

背景技术

使用微生物剂(如真菌、细菌或其他昆虫物种)对具有农业意义的昆虫有害生物进行生物防治，为合成型化学杀有害生物剂提供了环境友好且有商业吸引力的替代方案。一般来说，使用生物杀有害生物剂造成污染和环境危害的风险较低，并且生物杀有害生物剂提供比传统广谱化学杀昆虫剂所特有的靶特异性更强的靶特异性。另外，生物杀有害生物剂往往生产成本较低，并且因此能提高各种作物的经济产量。

已知芽孢杆菌属(Bacillus)微生物的某些物种对一系列昆虫有害生物具有杀有害生物活性，所述昆虫有害生物包括鳞翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、半翅目(Hemiptera)等。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)和日本金龟子芽孢杆菌(Bacillus popilliae)是迄今为止发现的最成功的生物防治剂。昆虫致病性还归因于幼虫芽孢杆菌(B.larvae)、缓病芽孢杆菌(B.lentimorbus)、球形茅孢杆菌(B.sphaericus)和蜡状芽孢杆菌(B.cereus)的菌株。微生物杀昆虫剂，特别是从芽孢杆菌属菌株获得的那些微生物杀昆虫剂，作为有害生物化学防治的替代品在农业上起着重要作用。

通过将作物植物进行遗传工程改造以从芽孢杆菌属产生杀有害生物蛋白，已经开发出昆虫抗性增强的作物植物。例如，已经对玉米和棉花植物进行遗传工程改造以产生从苏云金芽孢杆菌菌株分离的杀有害生物蛋白。现在，这些遗传工程化作物广泛应用于农业中，并且为农民提供了取代传统昆虫防治方法的环境友好型替代方案。虽然它们已被证明在商业上非常成功，但是这些遗传工程化抗昆虫作物植物可能仅针对窄范围的经济上重要的昆虫有害生物提供抗性。在某些情况下，昆虫可以对不同杀昆虫化合物产生抗性，这就导致需要鉴定用于有害生物控制的替代性生物防治剂。

因此，仍然需要对昆虫有害生物具有不同范围的杀昆虫活性的新颖杀有害生物蛋白，例如对鳞翅目和鞘翅目中的各种昆虫具有活性的杀昆虫蛋白，所述昆虫包括但不限于已对现存杀昆虫剂产生抗性的昆虫有害生物。

发明内容

在一个方面，提供了用于对细菌、植物、植物细胞、组织以及种子赋予杀有害生物活性的组合物和方法。组合物包含杀有害生物和杀昆虫多肽的核酸分子编码序列、包含那些核酸分子的载体、以及包含所述载体的宿主细胞。组合物还包括所述杀有害生物多肽序列以及针对那些多肽的抗体。组合物还包含转化的细菌、植物、植物细胞、组织以及种子。

在另一方面，提供了编码IPD121多肽的分离或重组的核酸分子，所述多肽包括氨基酸取代、缺失、插入、及其片段。提供了能够编码SEQ ID NO：124-234的IPD121多肽的分离或重组的核酸分子以及氨基酸取代、缺失、插入、其片段及其组合。还涵盖了与实施例的核酸序列互补或与实施例的序列杂交的核酸序列。所述核酸序列可以在DNA构建体或表达盒中使用，以用于在多种生物体(包括微生物和植物)中进行转化和表达。所述核苷酸或氨基酸序列可以是合成序列，所述合成序列已经被设计用于在生物体中表达，所述生物体包括但不限于：微生物或植物。

在另一方面，涵盖了IPD121多肽。还提供了SEQ ID NO：124-234的分离或重组的IPD121多肽以及氨基酸取代、缺失、插入、其片段及其组合。

在另一方面，提供了用于生产多肽和使用那些多肽用来控制或杀灭鳞翅目、鞘翅目、线虫、真菌、和/或双翅目有害生物的方法。实施例的转基因植物表达本文公开的杀有害生物序列中的一种或多种。在不同实施例中，所述转基因植物进一步包含一种或多种另外的昆虫抗性基因，例如，用于控制鞘翅目、鳞翅目、半翅目或线虫有害生物的一种或多种另外的基因。本领域技术人员将理解，转基因植物可以包含赋予目的农艺性状的任何基因。

在另一方面，还包括用于在样品中检测实施例的核酸和多肽的方法。提供了用于在样品中检测IPD121多肽的存在或检测编码IPD121多肽的多核苷酸的存在的试剂盒。所述试剂盒可以与实施预期试剂检测的方法所需的所有试剂和对照样品，以及使用说明书一起提供。

在另一方面，实施例的所述组合物和方法可用于产生具有增强的有害生物抗性或耐受性的生物体。这些生物体以及包含所述生物体的组合物对于农业目的是所希望的。实施例的组合物还可用于产生改变或改进的具有杀有害生物活性的蛋白质，或可用于检测IPD121多肽的存在。

附图说明

图1A-C显示了使用Vector套件的模块的IPD121Aa多肽(SEQ IDNO：124)、IPD121Ab多肽(SEQ ID NO：125)、IPD121Ac多肽(SEQ ID NO：228)、IPD121Ad多肽(SEQ ID NO：229)、IPD121Ae多肽(SEQ ID NO：230)、IPD121Af多肽(SEQ ID NO：231)、IPD121Ca多肽(SEQ ID NO：126)、IPD121Cb多肽(SEQ ID NO：127)、IPD121Cc多肽(SEQ IDNO：128)、IPD121Cd多肽(SEQ ID NO：129)、IPD121Ce多肽(SEQ ID NO：139)、IPD121Cf多肽(SEQ ID NO：225)、IPD121Cg多肽(SEQ ID NO：226)、IPD121Ch多肽(SEQ ID NO：227)、IPD121Da多肽(SEQ ID NO：142)、IPD121Db多肽(SEQ ID NO：232)、IPD121Dc多肽(SEQ IDNO：233)、和IPD121Dd多肽(SEQ ID NO：234)的氨基酸序列比对。突出显示了氨基酸序列之间的氨基酸序列多样性。通过(A)阴影指示保守氨基酸差异。

图2A-2D显示了在丛状菜豆(bush bean)中瞬时表达的选择的IPD121多肽针对来自所选择的鳞翅目的叶取食损害的活性。

具体实施方式

如本文所用的，单数形式“一个/种(a/an)”以及“所述/所述(the)”包括复数个指示物，除非上下文中另有明确指明。因此，例如，提及“细胞”包括多个此类细胞，并且提及“蛋白质”包括提及一种或多种蛋白及其等同物，等等。本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义，除非另有明确说明。

本公开涉及用于控制有害生物的组合物和方法。所述方法涉及用编码IPD121多肽的核酸序列来转化生物体。具体地，实施例的核酸序列可用于制备具有杀有害生物活性的植物和微生物。因此，提供了转化的细菌、植物、植物细胞、植物组织以及种子。组合物包含细菌物种的杀有害生物核酸和蛋白质。所述核酸序列可用于构建随后转化到目的生物体中的表达载体，作为用于分离其他同源(或部分同源)基因的探针，并且用于通过本领域已知的方法(如定向诱变、结构域交换或DNA改组)产生改变的IPD121多肽。IPD121多肽可用于控制或杀灭鳞翅目、鞘翅目、双翅目、真菌、半翅目和/或线虫有害生物群体并且可用于产生具有杀有害生物活性的组合物。目的昆虫有害生物包括但不限于：鳞翅目物种，所述鳞翅目物种包括但不限于：玉米穗蛾(CEW)(玉米穗虫(Helicoverpa zea))、欧洲玉米螟(ECB)(玉米螟(Ostrinia nubialis))、秋夜蛾(FAW)(草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda))、大豆夜蛾(SBL)，例如大豆尺夜蛾(Pseudoplusia includens Walker)；和黎豆夜蛾(VBC)，例如梨豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis Hübner)。

“杀有害生物毒素”或“杀有害生物蛋白”在本文中用以指对一种或多种有害生物具有毒性活性的毒素。例如，有害生物可包括鳞翅目、双翅目、半翅目和鞘翅目或线虫门的成员，或与这种蛋白质具有同源性的蛋白质。已经从生物体中分离出杀有害生物蛋白，所述生物体包括例如，芽孢杆菌属(Bacillus)物种、假单胞菌属(Pseudomonas)物种、发光杆菌属(Photorhabdus)物种、致病杆菌属(Xenorhabdus)物种、双酶梭菌(Clostridiumbifermentans)以及鲍比氏类芽孢杆菌(Paenibacillus popilliae)。

在一些实施例中，IPD121多肽包含从本文公开的全长核酸序列推导出的氨基酸序列，以及由于使用替代性下游起始位点或由于产生具有杀有害生物活性的较短蛋白的加工而比全长序列更短的氨基酸序列。加工可以在表达所述蛋白的生物体内或在摄取蛋白后的有害生物中发生。

因此，本文提供了赋予杀有害生物活性的分离或重组的核酸序列。还提供了IPD121多肽的氨基酸序列。由这些IPD121基因的翻译而产生的多肽允许细胞控制或杀灭摄取了所述多肽的有害生物。

IPD121蛋白及其变体和片段

本公开涵盖了IPD121多肽。如本文中可互换地使用的“IPD121多肽”和“IPD121蛋白”是指具有杀昆虫活性(包括但不限于对鳞翅目和/或鞘翅目的一种或多种昆虫有害生物的杀昆虫活性)，并且与SEQ ID NO：124的IPD121Aa多肽充分同源的一种或多种多肽。考虑了多种IPD121多肽。IPD121多肽或相关蛋白的来源包括选自但不限于耳蕨属(Polystichum)、骨碎补属(Davallia)、翼囊蕨属(Didymochlaena)、阴石蕨属(Humata)、球子蕨属(Onoclea)和三叉蕨属(Tectaria)物种的植物物种。IPD121多肽同源物的氨基酸序列的比对(例如，参见图1A-1C)允许鉴定所述家族中的天然同源物中高度保守的残基。

“充分同一”在本文中用以指具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同一性的氨基酸序列。在一个实施例中，相比于SEQ ID NO：124-234中任一项，IPD121多肽具有至少约40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％，、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。在一些实施例中，序列同一性针对IPD121多肽的全长序列。在本文中与百分比序列同一性一起使用时，术语“约”意指+/-1.0％。

“重组蛋白”在本文中用以指不再处于其天然环境中(例如处于体外或重组细菌或植物宿主细胞中)的蛋白质。

如本文所用的“基本上不含细胞材料”是指包括具有小于约30％、20％、10％或5％(以干重计)的非杀有害生物蛋白(在本文中也称为“污染蛋白”)的蛋白制剂的多肽。

“片段”或“生物活性部分”包括包含与IPD121多肽充分同一的氨基酸序列并且显示杀昆虫活性的多肽片段。IPD121多肽的“片段”或“生物活性部分”包括如下片段，所述片段包含与列于SEQ ID NO：124-234中任一项中所示的氨基酸序列充分同一的氨基酸序列，其中IPD121多肽具有杀昆虫活性。此类生物活性部分可以通过重组技术制备并评价杀昆虫活性。在一些实施例中，IPD121多肽片段是通过以下项进行的来自相对于SEQ ID NO：124-234中任一项的N-末端和/或C-末端的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或更多个氨基酸的N-末端和/或C-末端截短：例如通过蛋白水解、通过插入起始密码子、通过缺失编码缺失的氨基酸的密码子并同时插入起始密码子、和/或插入终止密码子。在一些实施例中，IPD121多肽片段是来自SEQID NO：124-234中任一项的N-末端的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个氨基酸的N-末端截短。在一些实施例中，IPD121多肽片段是来自相对于SEQ ID NO：124-234中任一项的N-末端和/或C-末端的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或更多个氨基酸的N-末端和/或C-末端截短。

如本文所用的“变体”是指具有与亲本氨基酸序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列的蛋白质或多肽。

在一些实施例中，IPD121多肽包含与SEQ ID NO：124-234中任一项的氨基酸序列的全长或片段具有至少约40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列，其中所述IPD121多肽具有杀昆虫活性。

在一些实施例中，IPD121多肽包含SEQ ID NO：124-234中任一个或多个的氨基酸序列，其与相应的SEQ ID NO：124-234中任一个或多个的相应位置的氨基酸相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95或更多个氨基酸取代。

用于此类操作的方法在本领域中通常是已知的。例如，可以通过DNA中的突变来制备IPD121多肽的氨基酸序列变体。这也可以通过若干种诱变形式中的一种来完成，像例如位点特异性双链断裂技术，和/或定向进化。在一些方面，在所述氨基酸序列中所编码的改变将基本上不影响所述蛋白质的功能。此类变体将具有所需杀有害生物活性。然而，应当理解，可以通过对本公开的组合物使用此类技术改进IPD121多肽赋予杀有害生物活性的能力。

可以在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处做出保守氨基酸取代。“非必需”氨基酸残基是可以从IPD121多肽的野生型序列改变而不改变生物学活性的残基。“保守氯基酸取代”是其中用具有相似侧链的氨基酸残基替换所述氨基酸残基的取代。在本领域中已经限定了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括：具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氯酸、精氨酸、组氨酸)；具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)；具有极性的、带负电荷的残基及其酰胺的氨基酸(例如，天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺)；具有不带电极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)；具有小脂肪族、非极性或微小极性的残基的氨基酸(例如，丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸)；具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)；具有大脂肪族、非极性残基的氨基酸(例如，甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、胱氨酸)；具有β-支链侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)；具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)；具有大芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。

氨基酸取代可以在保留功能的非保守性区域中进行。通常，此类取代并非针对保守氨基酸残基、或针对在保守基序内的氨基酸残基而进行，其中此类残基是蛋白质活性所必要的。保守的并且对于蛋白质活性可能是必需的残基的实例包括例如，在与实施例的序列相似或相关的毒素的比对中所包含的全部蛋白之间是相同的残基(例如，在同源蛋白比对中是相同的残基)。保守的但可以允许保守氨基酸取代、并且仍保留活性的残基的实例包括例如，在与实施例的序列相似或相关的毒素的比对中所包含的全部蛋白质之间仅具有保守取代的残基(例如，在同源蛋白比对中所包含的全部蛋白质之间仅具有保守取代的残基)。然而，本领域的技术人员应当理解，功能性变体在保守的残基中可以具有少量保守或非保守的改变。

可替代地，可以对氨基或羧基末端处的多种蛋白质的蛋白序列进行改变，而基本上不影响活性。这可以包括由现代分子方法所引入的插入、缺失或改变，所述方法如PCR，包括PCR扩增，所述PCR扩增借助于将氨基酸编码序列包括到在PCR扩增中所使用的寡核苷酸之中而改变或延长了这种蛋白质编码序列。可替代地，所添加的蛋白序列可以包括完整的蛋白质编码序列，如在本领域内通常用于产生蛋白质融合物的那些序列。此类融合蛋白常常用于(1)增加目的蛋白质的表达；(2)引入结合结构域、酶活性或表位以促进蛋白质纯化、蛋白检测或本领域已知的其他实验用途；(3)将蛋白质的分泌或翻译靶向亚细胞器，如革兰氏阴性菌的周质空间、植物的线粒体或叶绿体或真核细胞的内质网，其中后者常常导致蛋白质的糖基化。

1.)改组

本公开的变体核苷酸和氨基酸序列还涵盖了源自诱变和引起重组的程序(如DNA改组)的序列。通过这种程序，可以使用一个或多个不同的IPD121多肽编码区来创建具有所需特性的新颖IPD121多肽。以此方式，由相关序列多核苷酸的群体产生重组多核苷酸文库，所述相关的序列多核苷酸包含具有基本序列同一性并且能够在体外或体内同源重组的序列区域。例如，使用这种方法，可以将编码目的结构域的序列基序在杀有害生物基因与其他已知的杀有害生物基因之间进行改组，以获得编码具有改善的目的特性(如增加的杀昆虫活性)的新基因。这种DNA改组的策略在本领域中是已知的。参见例如，Stemmer，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]91：10747-10751；Stemmer，(1994)Nature[自然]370：389-391；以及美国专利号5,605,793和5,837,458。

结构域交换或改组是用于产生改变的IPD121多肽的另一种机制。可以在IPD121多肽之间交换结构域，导致具有改进的杀昆虫活性或靶谱的杂交或嵌合毒素。用于产生重组蛋白并测试其杀有害生物活性的方法是本领域熟知的(参见例如Naimov等人，(2001)Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]67：5328-5330；de Maagd等人，(1996)Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]62：1537-1543；Ge等人，(1991)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]266：17954-17958；Schnepf等人，(1990)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]265：20923-21010；Rang等人，91999)Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65：2918-2925)。

杀昆虫蛋白家族的系统发育、序列基序、和结构分析。

可以使用序列和结构分析方法，所述方法由四个部分组成：系统发育树构建、蛋白序列基序发现、二级结构预测以及蛋白序列和二级结构比对。关于每个部分的详细信息描述如下。

1)系统发育树构建

可以使用软件MEGA5进行系统发育分析。可以对蛋白序列进行ClustalW版本2分析(Larkin M.A等人(2007)Bioinformatics[生物信息学]23(21)：2947-2948)，用于多重序列比对。然后通过在基于JTT矩阵的模型基础上的最大似然法推断进化历史。获得具有最高对数似然值的树，以Newick格式导出，并进一步处理，以与在树中出现的相同顺序提取序列ID。可以为每个杀昆虫蛋白家族手动鉴定代表亚科的几个进化枝。

2)蛋白序列基序发现

根据先前构建的系统发育树对蛋白序列进行重新排序，并输入基序分析工具MEME(用于基序引出的多重EM)(Bailey T.L.和Elkan C.，Proceedings of the SecondInternational Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology[第二届国际分子生物学智能系统会议论文集]，第28-36页，AAAI Press[AAAI出版社]，Menlo Park[门洛帕克]，加利福尼亚，1994)，用于鉴定关键序列基序。MEME设置如下：最小位点数2，最小基序宽度5，和最大基序数30。通过视觉观察鉴定了每个亚家族独有的序列基序。基序在整个基因家族中的分布可以在HTML网页中看到。相对于每个基序的E-值的排名对基序进行编号。

3)二级结构预测

PSIPRED，排名最高的二级结构预测方法(Jones DT.(1999)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]292：195-202)，可用于蛋白质二级结构预测。所述工具使用基于PSI-BLAST输出的两个前馈神经网络提供准确的结构预测。通过去除Unirefl00中的低复杂度、跨膜和卷曲螺旋区域来创建PSI-BLAST数据库。PSIPRED结果包含预测的二级结构(α螺旋：H，β链：E和螺旋：C)和给定蛋白序列中每个氨基酸的对应置信度得分。

4)蛋白序列与二级结构的比对

可以开发脚本，以对所有蛋白质根据来自步骤1的多重蛋白序列比对来产生空位二级结构比对。将所有比对的蛋白序列和结构连接成单个FASTA文件，并然后导入到MEGA中用于可视化和鉴定保守结构。

在一些实施例中，IPD121多肽具有修饰的物理特性。如本文所用的，术语“物理特性”是指适于描述蛋白质的物理化学特征的任何参数。如本文所用的，“目的物理特性”和“目的特性”可互换使用，以指正在研究和/或修饰的蛋白质的物理特性。物理特性的实例包括但不限于：蛋白质表面上的净表面电荷和电荷分布、蛋白质表面上的净疏水性和疏水残基分布、表面电荷密度、表面疏水密度、表面电离基团的总计数、表面张力、蛋白质大小及其在溶液中的分布、熔融温度、热容量、和第二位力系数。物理特性的实例还包括，IPD121多肽具有增加的表达、增加的溶解度、降低的植物毒性、和蛋白水解片段在昆虫肠道中的可消化性。通过模拟胃液消化的模型是本领域技术人员已知的(Fuchs，R.L.和J.D.Astwood.FoodTechnology[食品技术]50：83-88，1996；Astwood，J.D.等人Nature Biotechnology[自然生物技术]14：1269-1273，1996；Fu TJ等人J.Agric Food Chem.[农业与食品化学杂志]50：7154-7160，2002)。

在一些实施例中，变体包括由于诱变而在氨基酸序列方面不同的多肽。本公开所涵盖的变体蛋白质具有生物学活性，即它们仍然具有天然蛋白质所需的生物学活性(即杀有害生物活性)。在一些实施例中，所述变体将具有至少约10％、至少约30％、至少约50％、至少约70％、至少约80％或更高的天然蛋白质的杀昆虫活性。在一些实施例中，变体可以具有比天然蛋白质改进的活性。

细菌基因通常在可读框的起始附近具有多个甲硫氨酸起始密码子。通常，在这些起始密码子中的一个或多个处的翻译起始将导致功能蛋白质的产生。这些起始密码子可以包括ATG密码子。然而，细菌(如，芽孢杆菌属物种)还将密码子GTG识别为起始密码子，并且在GTG密码子处起始翻译的蛋白在第一个氨基酸处包含甲硫氨酸。在少数情况下，细菌系统中的翻译可以在TTG密码子处起始，尽管在此事件中TTG编码甲硫氨酸。此外，通常不先验地确定细菌中天然使用了这些密码子中的哪一些。因此，应当理解，使用可替代的甲硫氨酸密码子之一也可能导致杀有害生物蛋白的产生。这些杀有害生物蛋白涵盖于本公开之中，并且可以在本公开的方法中使用。应当理解，当在植物中表达时，有必要将可替代的起始密码子改变为ATG以用于正确翻译。

在一些实施例中，IPD121多肽包含SEQ ID NO：124-234中任一个或多个的氨基酸序列。

在一些实施例中，提供了嵌合多肽，其包含本公开的至少两种不同IPD121多肽的区域。

在一些实施例中，提供了嵌合多肽，其包含选自SEQ ID NO：124-234中任一个或多个的至少两种不同IPD121多肽的区域。

在一些实施例中，提供一种或多种嵌合IPD121多肽，其包含与本公开的第二IPD121多肽的C-末端区域有效地融合的本公开的第一IPD121多肽的N-末端区域。

在其他实施例中，IPD121多肽可以表达为具有催化多步翻译后蛋白剪接的间插序列的前体蛋白。蛋白质剪接涉及从多肽切除间插序列，并伴随连接侧翼序列以产生新的多肽(Chong等人，(1996)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]，271：22159-22168)。这种被称为内含肽的间插序列或蛋白质剪接元件，通过在N-末端和C-末端剪接点处的以下三个协调反应催化其自身的切除：N-末端半胱氨酸或丝氨酸的酰基重排；两个末端之间形成支链酯或硫酯中间体的酯交换反应，和与内含肽C-末端天冬酰胺的环化相偶联释放内含肽的肽键切割(Evans等人，(2000)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]，275：9091-9094)。

在另一个实施例中，提供了融合蛋白，在所述融合蛋白的氨基酸序列中包含含有本公开的IPD121多肽的氨基酸序列。用于设计和构建融合蛋白(以及编码它们的多核苷酸)的方法是本领域技术人员已知的。编码IPD121多肽的多核苷酸可以融合到信号序列，所述信号序列将指导IPD121多肽定位于原核或真核细胞的特定区室和/或指导实施例的IPD121多肽从原核或真核细胞的分泌。例如，在大肠杆菌中，人们可能希望指导蛋白质向周质空间表达。可以与IPD121多肽融合以便指导多肽向细菌周质空间表达的信号序列或蛋白质(或其片段)的实例包括但不限于：pelB信号序列、麦芽糖结合蛋白(MBP)信号序列、MBP、ompA信号序列、周质性大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基的信号序列和碱性磷酸酶的信号序列。用于构建将指导蛋白质定位的融合蛋白的多种载体是可商购的，例如可从新英格兰生物实验室(New England Biolabs)获得的pMAL系列的载体(特别是pMAL-p系列)。在具体实施例中，IPD121多肽可以与pelB果胶酸裂合酶信号序列融合，以增加革兰氏阴性菌中此类多肽的表达和纯化的效率(参见，美国专利号5,576,195和5,846,818)。

植物质体转运肽/多肽融合是本领域熟知的。质外体转运肽如水稻或大麦α-淀粉酶分泌信号也是本领域熟知的。质体转运肽通常与待靶向的多肽(例如，融合配偶体)进行N-末端融合。在一个实施例中，融合蛋白基本上由质体转运肽和待靶向的IPD121多肽组成。在另一个实施例中，融合蛋白包含质体转运肽和待靶向的多肽。在此类实施例中，质体转运肽优选位于融合蛋白的N-末端。然而，另外的氨基酸残基可以在质体转运肽的N-末端，条件是所述融合蛋白至少部分地靶向质体。在具体实施例中，质体转运肽在融合蛋白的N-末端一半处、N-末端三分之一处或N-末端四分之一处。当插入质体时，大部分或全部质体转运肽通常从融合蛋白上切割。由于特定的细胞间条件或所使用的转运肽/融合配偶体的具体组合，因此在不同植物发育阶段，切割位置可能在植物物种之间略有变化。在一个实施例中，质体转运肽切割是均匀的，使得切割位点在融合蛋白群体中是相同的。在另一个实施例中，质体转运肽不是均匀的，使得切割位点在融合蛋白群体中相差1-10个氨基酸。质体转运肽能以若干种方式之一重组融合到第二蛋白质。在一些实施例中，IPD121多肽与异源信号肽或异源转运肽融合。

在一些实施例中，提供了包含本公开的IPD121多肽或嵌合IPD121多肽的融合蛋白，所述融合蛋白由选自由以下组成的组的式表示：

R¹L-R²、R²-L-R¹、R¹-R²或R²-R¹

其中R¹是本公开的IPD121多肽或嵌合IPD121多肽，并且R²是目的蛋白。在一些实施例中，R¹和R²是本公开的IPD121多肽或嵌合IPD121多肽。所述R¹多肽直接或通过接头(L)区段融合至R²多肽。术语“直接”定义在没有肽接头的情况下连接多肽的融合。因此，“L”表示与R¹和R²框内融合的化学结合或多肽区段，最常见的是，L是R¹和R²通过酰胺键将R¹的羧基末端连接到L的氨基末端并且将L的羧基末端连接到R²的氨基末端的线性肽。“框内融合”意指R¹和R²的阅读框之间没有翻译终止或中断。连接基团(L)通常是长度在1至500个氨基酸之间的多肽。连接两个分子的接头优选设计成(1)允许两个分子彼此独立地折叠并且起作用，(2)不具有发展可能干扰两种蛋白质的功能结构域的有序二级结构的倾向，(3)具有可与功能性蛋白质结构域相互作用的最小的疏水或带电特征，并且(4)提供R¹和R²的空间分离，使得R¹和R²可以与单个细胞上的相应受体同时相互作用。典型地，在柔性蛋白质区域中的表面氨基酸包括Gly、Asn和Ser。期望包含Gly、Asn和Ser的氨基酸序列的几乎任何排列满足上述接头序列的标准。其他中性氨基酸如Thr和Ala也可以用于接头序列。由于在接头序列中添加了独特的限制性位点以便于构建融合体，因此另外的氨基酸也可以包括在接头中。

在一些实施例中，接头包含选自以下式的组的序列：(Gly₃Ser)_n，(Gly₄Ser)_n，(Gly₅Ser)_n，(Gly_nSer)_n或(AlaGlySer)_n，其中n是整数。高度柔性接头的一个实例是存在于丝状噬菌体(例如，噬菌体M13或fd)的pIII蛋白质内的富含(GlySer)的间隔子区域(Schaller等人，1975)。所述区域在pIII表面蛋白质的两个结构域之间提供长、柔性的间隔子区域。还包括接头，在接头中包括内肽酶识别序列。这种切割位点对于分离融合物的各个组分以确定它们在体外是否适当折叠和是否具有活性可能是有价值的。各种内肽酶的实例包括但不限于：纤溶酶、肠激酶、激肽释放酶、尿激酶、组织纤溶酶原激活剂、梭菌蛋白酶、凝乳酶、胶原酶、鲁塞尔氏蝰蛇毒蛋白酶、后脯氨酸切割酶、V8蛋白酶、凝血酶和因子Xa。在一些实施例中，接头包含来自多基因表达载体(MGEV)的氨基酸EEKKN(SEQ ID NO：249)，其如美国专利申请公开号US 2007/0277263中所公开的被液泡蛋白酶切割。在其他实施例中，来自重链免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、IgD或IgE的铰链区域的肽接头区段提供所附着的多肽之间的角度关系。特别有用的是那些半胱氨酸被丝氨酸替换的铰链区域。本公开的接头包括源自鼠IgGγ2b铰链区域的序列，其中半胱氨酸已变为丝氨酸。融合蛋白不受所使用的接头序列的形式、大小或数目的限制，并且接头的唯一要求是功能上不会不利地干扰融合的各个分子的折叠和功能。

核酸分子及其变体和片段

提供了包含编码IPD121多肽或其生物活性部分的核酸序列的分离或重组的核酸分子，以及足以用作杂交探针以鉴定编码具有序列同源性区域的蛋白的核酸分子的核酸分子。如本文所用的，术语“核酸分子”是指DNA分子(例如，重组DNA、cDNA、基因组DNA、质粒DNA、线粒体DNA)和RNA分子(例如，mRNA)以及使用核苷酸类似物而产生的DNA或RNA的类似物。核酸分子可以是单链的或双链的，但优选地是双链的DNA。

“分离的”核酸分子(或DNA)在本文中用以指不再处于其天然环境中(例如处于体外)的核酸序列(或DNA)。“重组”核酸分子(或DNA)在本文中用以指在重组细菌或植物宿主细胞中的核酸序列(或DNA)。在一些实施例中，“分离的”或“重组的”核酸不含有在衍生出所述核酸的生物体的基因组DNA中天然地位于所述核酸侧翼(即，位于核酸的5′和3′端的序列)的序列(优选蛋白质编码序列)。出于本公开的目的，“分离的”或“重组的”当用于指核酸分子时排除分离的染色体。例如，在不同实施例中，编码IPD121多肽的重组核酸分子可以包含小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核酸序列，所述核酸序列在源自所述核酸的细胞的基因组DNA中天然地位于所述核酸分子的侧翼。

在一些实施例中，与天然或基因组核酸序列相比，编码IPD121多肽的分离的核酸分子在核酸序列中具有一个或多个改变。在一些实施例中，天然或基因组核酸序列的改变包括但不限于：由于遗传密码的简并性造成的核酸序列改变；与天然或基因组序列相比，由于氯基酸取代、插入、缺失和/或添加造成的核酸序列的改变；一个或多个内含子的去除；一个或多个上游或下游调节区域的缺失；和与基因组核酸序列相关的5′和/或3′非翻译区域的缺失。在一些实施例中，编码IPD121多肽的核酸分子是非基因组序列。

考虑了编码IPD121多肽或相关蛋白的多种多核苷酸。当有效地连接到合适的启动子、转录终止和/或聚腺苷酸化序列上时，此类多核苷酸可用于在宿主细胞中产生IPD121多肽。此类多核苷酸还可用作用于分离编码IPD121多肽或相关蛋白的同源或基本上同源的多核苷酸的探针。

编码IPD121多肽的多核苷酸

编码IPD121多肽或相关蛋白的多核苷酸的一个来源是耳蕨属、骨碎补属、翼囊蕨属、阴石蕨属、球子蕨属或三叉蕨属物种，其可以含有SEQ ID NO：1-123中任一项的IPD121多核苷酸，所述多核苷酸编码SEQ ID NO：124-234的IPD121多肽。SEQ ID NO：1-123中任一个或多个的多核苷酸可用于在重组细菌宿主中表达IPD121多肽，所述重组细菌宿主包括但不限于农杆菌属(Agrobacterium)、芽孢杆菌属、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、梭形杆菌属(Lysinibacillus)、醋杆菌属(Acetobacter)、假单胞菌属和根瘤菌属(Rhizobium)细菌宿主细胞。多核苷酸还可用作用于分离编码IPD121多肽或相关蛋白的同源或基本上同源的多核苷酸的探针。此类探针可用于鉴定源自耳蕨属、骨碎补属、翼囊蕨属、阴石蕨属、球子蕨属和三叉蕨属物种的同源或基本上同源的多核苷酸。

编码IPD121多肽的多核苷酸也可以从IPD121多肽序列从头合成。多核苷酸基因的序列可以通过使用遗传密码从IPD121多肽序列中推导出来。计算机程序如“BackTranslate”(GCG^TM包，阿克莱瑞公司(Acclerys，Inc.)，加利福尼亚州圣迭戈市)可用于将肽序列转换成编码所述肽的相应核苷酸序列。可以用于获得相应核苷酸编码序列的IPD121多肽序列的实例包括但不限于SEQ ID NO：124-234的IPD121多肽。此外，可以设计本公开的合成IPD121多核苷酸序列使得它们在植物中表达。

在一个实施例中，SEQ ID NO：124的多肽由SEQ ID NO：1编码；SEQ ID NO：125的多肽由SEQ ID NO：2编码；SEQ ID NO：126的多肽由SEQ ID NO：3编码；SEQ ID NO：127的多肽由SEQ ID NO：4编码；SEQ ID NO：128的多肽由SEQ ID NO：5编码；SEQ ID NO：129的多肽由SEQ ID NO：6编码；SEQ ID NO：130的多肽由SEQ ID NO：7编码；SEQ ID NO：131的多肽由SEQID NO：8编码；SEQ ID NO：132的多肽由SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：81编码；SEQ ID NO：133的多肽由SEQ ID NO：10编码；SEQ ID NO：134的多肽由SEQ ID NO：11编码；SEQ ID NO：135的多肽由SEQ ID NO：12编码；SEQ ID NO：136的多肽由SEQ ID NO：13编码；SEQ ID NO：137的多肽由SEQ ID NO：14编码；SEQ ID NO：138的多肽由SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：20编码；SEQ ID NO：139的多肽由SEQ ID NO：16编码；SEQ ID NO：140的多肽由SEQ ID NO：17编码；SEQ ID NO：141的多肽由SEQ ID NO：18编码；SEQ ID NO：142的多肽由SEQ ID NO：19编码；SEQ ID NO：143的多肽由SEQ ID NO：21编码；SEQ ID NO：144的多肽由SEQ ID NO：22编码；SEQ ID NO：145的多肽由SEQ ID NO：23编码；SEQ ID NO：146的多肽由SEQ ID NO：24和SEQID NO：78编码；SEQ ID NO：147的多肽由SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：82编码；SEQ ID NO：148的多肽由SEQ ID NO：26编码；SEQ ID NO：149的多肽由SEQ ID NO：27编码；SEQ ID NO：150的多肽由SEQ ID NO：28编码；SEQ ID NO：151的多肽由SEQ ID NO：29编码；SEQ ID NO：152的多肽由SEQ ID NO：30编码；SEQ ID NO：153的多肽由SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：37编码；SEQ ID NO：154的多肽由SEQ ID NO：32编码；SEQ ID NO：155的多肽由SEQ ID NO：33编码；SEQ ID NO：156的多肽由SEQ ID NO：34编码；SEQ ID NO：157的多肽由SEQ ID NO：35编码；SEQ ID NO：158的多肽由SEQ ID NO：36编码；SEQ ID NO：159的多肽由SEQ ID NO：38编码；SEQ ID NO：160的多肽由SEQ ID NO：39编码；SEQ ID NO：161的多肽由SEQ ID NO：40编码；SEQ ID NO：162的多肽由SEQ ID NO：41编码；SEQ ID NO：163的多肽由SEQ ID NO：42编码；SEQ ID NO：164的多肽由SEQ ID NO：43编码；SEQ ID NO：165的多肽由SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：53编码；SEQ ID NO：166的多肽由SEQ ID NO：45编码；SEQ ID NO：167的多肽由SEQ ID NO：46编码；SEQ ID NO：168的多肽由SEQ ID NO：48编码；SEQ ID NO：169的多肽由SEQ ID NO：50编码；SEQ ID NO：170的多肽由SEQ ID NO：51编码；SEQ ID NO：171的多肽由SEQ ID NO：52编码；SEQ ID NO：172的多肽由SEQ ID NO：54编码；SEQ ID NO：173的多肽由SEQ ID NO：55编码；SEQ ID NO：174的多肽由SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：109编码；SEQ ID NO：175的多肽由SEQ ID NO：57编码；SEQ ID NO：176的多肽由SEQ ID NO：58编码；SEQ ID NO：177的多肽由SEQ ID NO：59编码；SEQ ID NO：178的多肽由SEQ ID NO：60编码；SEQ ID NO：179的多肽由SEQ ID NO：61编码；SEQ ID NO：180的多肽由SEQ ID NO：62编码；SEQ ID NO：181的多肽由SEQ ID NO：63编码；SEQ ID NO：182的多肽由SEQ ID NO：64编码；SEQ ID NO：183的多肽由SEQ ID NO：65编码；SEQ ID NO：184的多肽由SEQ ID NO：66编码；SEQ ID NO：185的多肽由SEQ ID NO：67编码；SEQ ID NO：186的多肽由SEQ ID NO：68编码；SEQ ID NO：187的多肽由SEQ ID NO：69编码；SEQ ID NO：188的多肽由SEQ ID NO：70编码；SEQ ID NO：189的多肽由SEQ ID NO：71编码；SEQ ID NO：190的多肽由SEQ ID NO：72编码；SEQ ID NO：191的多肽由SEQ ID NO：73编码；SEQ ID NO：192的多肽由SEQ ID NO：74编码；SEQ ID NO：193的多肽由SEQ ID NO：75编码；SEQ ID NO：194的多肽由SEQ ID NO：76编码；SEQ ID NO：195的多肽由SEQ ID NO：77编码；SEQ ID NO：196的多肽由SEQ ID NO：79编码；SEQ ID NO：197的多肽由SEQ ID NO：80编码；SEQ ID NO：198的多肽由SEQ ID NO：83编码；SEQ ID NO：199的多肽由SEQ ID NO：84编码；SEQ ID NO：200的多肽由SEQ ID NO：85编码；SEQ ID NO：201的多肽由SEQ ID NO：88编码；SEQ ID NO：202的多肽由SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：92编码；SEQ ID NO：203的多肽由SEQ ID NO：90编码；SEQ IDNO：204的多肽由SEQ ID NO：91编码；SEQ ID NO：205的多肽由SEQ ID NO：93编码；SEQ IDNO：206的多肽由SEQ ID NO：94编码；SEQ ID NO：207的多肽由SEQ ID NO：95编码；SEQ IDNO：208的多肽由SEQ ID NO：96编码；SEQ ID NO：209的多肽由SEQ ID NO：97编码；SEQ IDNO：210的多肽由SEQ ID NO：98编码；SEQ ID NO：211的多肽由SEQ ID NO：99编码；SEQ IDNO：212的多肽由SEQ ID NO：100编码；SEQ ID NO：213的多肽由SEQ ID NO：101编码；SEQ IDNO：214的多肽由SEQ ID NO：102编码；SEQ ID NO：215的多肽由SEQ ID NO：103编码；SEQ IDNO：216的多肽由SEQ ID NO：104编码；SEQ ID NO：217的多肽由SEQ ID NO：105编码；SEQ IDNO：218的多肽由SEQ ID NO：106编码；SEQ ID NO：219的多肽由SEQ ID NO：107编码；SEQ IDNO：220的多肽由SEQ ID NO：108编码；SEQ ID NO：221的多肽由SEQ ID NO：110编码；SEQ IDNO：222的多肽由SEQ ID NO：111编码；SEQ ID NO：223的多肽由SEQ ID NO：112编码；SEQ IDNO：224的多肽由SEQ ID NO：113编码；SEQ ID NO：225的多肽由SEQ ID NO：114编码；SEQ IDNO：226的多肽由SEQ ID NO：115编码；SEQ ID NO：227的多肽由SEQ ID NO：116编码；SEQ IDNO：228的多肽由SEQ ID NO：117编码；SEQ ID NO：229的多肽由SEQ ID NO：118编码；SEQ IDNO：230的多肽由SEQ ID NO：119编码；SEQ ID NO：231的多肽由SEQ ID NO：120编码；SEQ IDNO：232的多肽由SEQ ID NO：121编码；SEQ ID NO：233的多肽由SEQ ID NO：122编码；以及SEQ ID NO：234的多肽由SEQ ID NO：123编码。

在一些实施例中，编码IPD121多肽的核酸分子是具有SEQ ID NO：1-123中任一项中所示的序列的多核苷酸、及其变体、片段和互补序列。“互补序列”在本文中用以指与给定核酸序列充分互补的核酸序列，使得其可以与所述给定核酸序列杂交从而形成稳定的双链体。“多核苷酸序列变体”在本文中用以指除遗传密码的简并性之外编码相同多肽的核酸序列。

在一些实施例中，编码IPD121多肽的核酸分子是非基因组核酸序列。如本文所用的，“非基因组核酸序列”或“非基因组核酸分子”或“非基因组多核苷酸”是指与天然或基因组核酸序列相比，在所述核酸序列上具有一个或多个改变的核酸分子。在一些实施例中，天然或基因组核酸分子的改变包括但不限于：由于遗传密码的简并性造成的核酸序列改变；用于在植物中表达的核酸序列的优化；与天然或基因组序列相比，引入至少一个氨基酸取代、插入、缺失和/或添加的核酸序列的改变；去除与所述基因组核酸序列相关的一个或多个内含子；插入一个或多个异源内含子；缺失与所述基因组核酸序列相关的一个或多个上游或下游调节区；插入一个或多个异源上游或下游调节区；缺失与所述基因组核酸序列相关的5′和/或3′非翻译区；插入异源5′和/或3′非翻译区；和聚腺苷酸化位点的修饰。在一些实施例中，非基因组核酸分子是合成的核酸序列。

在一些实施例中，编码本文公开的IPD121多肽的核酸分子是具有与SEQ ID NO：1-123中任一项的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的同一性的核苷酸序列的非基因组多核苷酸，其中所述IPD121多肽具有杀昆虫活性。

在一些实施例中，核酸分子编码IPD121多肽变体，所述变体包含对SEQ ID NO：124-234中任一项的氨基酸序列的一个或多个氨基酸取代。

还提供了编码转录和/或翻译产物的核酸分子，所述转录和/或翻译产物随后被剪接以最终产生功能性IPD121多肽。剪接可以在体外或体内完成，并且可以涉及顺式或反式剪接。用于剪接的底物可以是多核苷酸(例如，RNA转录物)或多肽。多核苷酸的顺式剪接的实例是去除插入到编码序列中的内含子并剪接两个侧翼外显子区域以产生IPD121多肽编码序列。反式剪接的实例是通过将所述编码序列分离成两个或更多个片段来对多核苷酸进行加密，所述片段可以单独转录并且然后被剪接以形成全长的杀有害生物编码序列。使用可以引入到构建体中的剪接增强子序列可以促进多肽的顺式或反式剪接(美国专利号6,365,377和6,531,316)。因此，在一些实施例中，多核苷酸不直接编码全长IPD121多肽，而是编码IPD121多肽的一个或多个片段。这些多核苷酸可用于通过涉及剪接的机制来表达功能性IPD121多肽，其中剪接可以在多核苷酸(例如内含子/外显子)和/或多肽(例如内含肽/外显肽)的水平上发生。这可以用于，例如，控制杀有害生物活性的表达，因为如果在允许剪接过程以产生功能性产物的环境中表达所有必需的片段，则仅表达功能性杀有害生物多肽。在另一个实例中，将一个或多个插入序列引入多核苷酸中可促进与低同源性多核苷酸的重组；使用针对所述插入序列的内含子或内含肽便于去除所述间插序列，从而恢复经编码的变体的功能。

作为编码IPD121多肽的这些核酸序列的片段的核酸分子也涵盖在实施例中。如本文所用的“片段”是指编码IPD121多肽的核酸序列的一部分。核酸序列的片段可以编码IPD121多肽的生物活性部分，或者它可以是可以使用下文公开的方法用作杂交探针或PCR引物的片段。作为编码IPD121多肽的核酸序列的片段的核酸分子包含至少约150、180、210、240、270、300、330、360、400、450或500个连续核苷酸或高至存在于编码本文公开的IPD121多肽的全长核酸序列中的核苷酸数目，这取决于预期用途。“连续核苷酸”在本文中用以指彼此紧邻的核苷酸残基。实施例的核酸序列的片段将编码保留IPD121多肽的生物学活性并因此保留杀昆虫活性的蛋白片段。“保留杀昆虫活性”在本文中用以指具有SEQ ID NO：124-234中所示的全长IPD121多肽中任一项的至少约10％、至少约30％、至少约50％、至少约70％、80％、90％、95％或更高的杀昆虫活性的多肽。在一些实施例中，所述杀昆虫活性针对鳞翅目物种。在一个实施例中，所述杀昆虫活性针对鞘翅目物种。在一些实施例中，所述杀昆虫活性针对玉米根虫复合体的一种或多种昆虫有害生物：西方玉米根虫，玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera)；北方玉米根虫，巴氏根萤叶甲(D.barberi)；南方玉米根虫或斑点黄瓜甲虫；黄瓜十一星叶甲食根亚种(Diabrotica undecimpunctata howardi)、南美叶甲(Diabrotica speciosa)和墨西哥玉米根虫(Mexican corn rootworm，D.virgiferazeae)。在一个实施例中，所述杀昆虫活性针对根萤叶甲属(Diabrotica)物种。

在一些实施例中，IPD121多肽由与SEQ ID NO：1-123的核酸序列中任一种充分同源的核酸序列编码。

相对于参考序列(主题序列)，“序列同一性百分比(％)”被确定为在比对序列并引入空位(如果需要)以实现最大百分比序列同一性后，并且不考虑作为序列同一性的一部分的任何氨基酸保守取代，候选序列(查询序列)中与参考序列中的相应氨基酸残基或核苷酸同一的氨基酸残基或核苷酸的百分比。用于确定序列同一性百分比目的而进行的比对能以本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用公共可用的计算机软件，例如BLAST、FASTA、以及在这些工具和其他工具中的Smith-Waterman或Needleman-Wunsch算法的各种其他实施。本领域的技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在进行比较的序列的全长度上实现最大比对所需的任何算法。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的同一位置的数目的函数(例如，查询序列的同一性百分比＝查询序列和主题序列之间的同一位置的数目/查询序列的位置总数×100)。

在一些实施例中，IPD121多核苷酸编码包含与SEQ ID NO：124-234中任一项的氨基酸序列的整个长度具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列的IPD121多肽。

在一些实施例中，提供了编码嵌合多肽的多核苷酸，所述嵌合多肽包含本公开的至少两种不同IPD121多肽的区域。

在一些实施例中，提供了编码嵌合多肽的多核苷酸，所述嵌合多肽包含与本公开的第二IPD121多肽的C-末端区域有效地融合的本公开的第一IPD121多肽的N-末端区域。

实施例还涵盖编码IPD121多肽变体的核酸分子。编码IPD121多肽的核酸序列的“变体”包括编码本文公开的IPD121多肽但是由于遗传密码的简并性而存在保守差异的那些序列以及如上所述的充分同一的那些序列。可以通过使用熟知的分子生物学技术鉴定天然存在的等位基因变体，例如聚合酶链式反应(PCR)和如下文概述的杂交技术。变体核酸序列还包括合成来源的核酸序列，所述核酸序列例如通过使用定向诱变而产生，但是仍然编码如下所讨论的所公开的IPD121多肽。

本公开提供编码本文公开的任何IPD121多肽的分离或重组的多核苷酸。本领域普通技术人员将容易理解，由于遗传密码的简并性，存在编码本公开的IPD121多肽的许多核苷酸序列。

技术人员将进一步了解，可以通过核酸序列的突变引入改变，从而导致编码的IPD121多肽的氨基酸序列的改变，而不改变蛋白质的生物学活性。因此，变体核酸分子可以通过以下方式产生：将一个或多个核苷酸取代、添加和/或缺失引入本文所公开的相应的核酸序列中，这样使得将一个或多个氨基酸取代、添加或缺失引入所编码的蛋白质中。通过标准技术可以引入突变，例如定向诱变和PCR介导的诱变。此类变体核酸序列也被本公开所涵盖。

可替代地，可以通过沿编码序列的全部或部分随机引入突变(例如通过饱和诱变)来制备变体核酸序列，并且可以筛选所得突变体赋予杀有害生物活性以鉴定保留活性的突变体的能力。在诱变之后，所编码的蛋白质可以进行重组表达，并且所述蛋白质的活性可以使用标准的测定技术来确定。

本公开的多核苷酸及其片段任选用作各种重组和递归(recursive)重组反应的底物，除了例如Ausubel、Berger和Sambrook所述的标准克隆方法之外，即，以产生具有所需特性的另外的杀有害生物多肽同源物及其片段。各种此类反应是已知的。用于生产在此列出的任何核酸的变体的方法(所述方法包括将此多核苷酸与第二(或更多)多核苷酸递归重组，从而形成变体多核苷酸文库)也是本公开的实施例，所产生的文库、包括所述文库的细胞和通过此类方法产生的任何重组多核苷酸也是如此。另外，此类方法任选地包括基于杀有害生物活性从此类文库中选择变体多核苷酸，正如其中此类递归重组在体外或体内进行。

各种多样性产生方案(包括核酸递归重组方案)是可获得的并且在本领域中被充分描述。所述程序可以单独和/或组合使用以产生核酸或核酸集合的一种或多种变体，以及所编码蛋白质的变体。单独地或整体地，这些程序提供了产生多样化核酸和核酸集合(包括例如核酸文库)的稳健且广泛适用的方式，所述方式可用于，例如，具有新的和/或改进的特征的核酸、蛋白质、途径、细胞和/或生物体的工程化或快速进化。

虽然为清除起见，在随后的讨论过程中作出了区分和分类，但是应当理解，所述技术通常不是相互排斥的。实际上，各种方法可以单独使用或组合、平行或串联使用，以便取得不同的序列变体。

本文所述的任何多样性产生程序的结果可以是一种或多种核酸的产生，其可以选择或筛选具有或赋予所需特性的核酸或编码具有或者赋予所需特性的蛋白的核酸。通过本文的或技术人员以其他方式可用的一种或多种方法进行多样化之后，可以针对所需的活性或特性(例如，杀有害生物活性)或在所需的pH下的这种活性等选择所产生的任何核酸。这可以包括通过本领域任何测定来鉴定可以例如以自动化或可自动化形式检测的任何活性，参见例如以下的杀昆虫活性筛选的讨论。各种相关(或甚至不相关)的特性可以由执业者酌情串联或平行评估。

用于产生经修饰的核酸序列(例如编码具有杀有害生物活性的多肽或其片段的那些)的各种多样性产生程序的描述可以在以下出版物和其中引用的参考文献中找到：Soong等人，(2000)Nat Genet[自然遗传学]25(4)：436-439：Stemmer等人，(1999)TumorTargeting[肿瘤靶向]4：1-4；Ness等人，(1999)Nat Biotechnol[自然生物技术]17：893-896；Chang等人，(1999)Nat Biotechnol[自然生物技术]17：793-797；Minshull和Stemmer，(1999)Curr Opin Chem Biol[生物化学当代观点]3：284-290；Christians等人，(1999)NatBiotechnol[自然生物技术]17：259-264；Crameri等人，(1998)Nature[自然]391：288-291；Crameri等人，(1997)Nat Biotechnol[自然生物技术]15：436-438；Zhang等人，(1997)PNASUSA[美国科学院院报]94：4504-4509；Patten等人，(1997)Curr Opin Biotechnol[生物技术当代观点]8：724-733；Crameri等人，(1996)Nat Med[自然医学]2：100-103；Crameri等人，(1996)Nat Biotechnol[自然生物技术]14：315-319；Gates等人，(1996)J Mol Biol[分子生物学杂志]255：373-386；Stemmer，(1996)“Sexual PCR and Assembly PCR[有性PCR和组装PCR]”在：The Encyclopedia of Molecular Biology.[分子生物学百科全书]VCH出版商，纽约，第447-457页；Crameri和Stemmer，(1995)BioTechniques[生物技术]18：194-195；Stemmer等人，(1995)Gene[基因]，164：49-53；Stemmer，(1995)Science[科学]270：1510；Stemmer，(1995)Bio/Technology[生物/技术]13：549-553；Stemmer，(1994)Nature[自然]370：389-391和Stemmer，(1994)PNAS USA[美国科学院院报]91：10747-10751。

产生多样性的突变方法包括例如定向诱变(Ling等人，(1997)Anal Biochem[分析生物化学]254(2)：157-178；Dale等人，(1996)Methods Mol Biol[分子生物学方法]57：369-374；Smith，(1985)Ann Rev Genet[遗传学年评]19：423-462；Botstein和Shortle，(1985)Science[科学]229：1193-1201；Carter，(1986)Biochem J[生物化学杂志]237：1-7和Kunkel，(1987)“The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis[寡核苷酸定向诱变的效率]”，在：Nucleic Acids&Molecular Biology[核酸与分子生物学](Eckstein和Lilley编辑，Springer Verlag[施普林格出版公司]，柏林))；使用含尿嘧啶的模板的诱变(Kunkel，(1985)PNAS USA[美国科学院院报]82：488-492；Kunkel等人，(1987)Methods Enzymol[酶学方法]154：367-382以及Bass等人，(1988)Science[科学]242：240-245)；寡核苷酸定向诱变(Zoller和Smith，(1983)Methods Enzymol[酶学方法]100：468-500；Zoller和Smith，(1987)Methods Enzymol[酶学方法]154：329-350(1987)；Zoller和Smith，(1982)Nucleic Acids Res[核酸研究]10：6487-6500)；经硫代磷酸修饰的DNA诱变(Taylor等人，(1985)Nucl Acids Res[核酸研究]13：8749-8764；Taylor等人，(1985)NuclAcids Res[核酸研究]13：8765-8787(1985)；Nakamaye和Eckstein，(1986)Nucl Acids Res[核酸研究]14：9679-9698；Sayers等人，(1988)Nucl Acids Res[核酸研究]16：791-802以及Sayers等人，(1988)Nucl Acids Res[核酸研究]16：803-814)；使用有缺口的双链体DNA的诱变(Kramer等人，(1984)Nucl Acids Res[核酸研究]12：9441-9456；Kramer和Fritz，(1987)Methods Enzymol[酶学方法]154：350-367；Kramer等人，(1988)Nucl Acids Res[核酸研究]16：7207以及Fritz等人，(1988)Nucl Acids Res[核酸研究]16：6987-6999)。

其他合适的方法包括点错配修复(Kramer等人，(1984)Cell[细胞]38：879-887)、使用有修复缺陷的宿主菌株的诱变(Carter等人，(1985)Nucl Acids Res[核酸研究]13：4431-4443以及Carter，(1987)Methods in Enzymol[酶学方法]154：382-403)、缺失诱变(Eghtedarzadeh和Henikoff，(1986)Nucl Acids Res[核酸研究]14：5115)、限制性-选择和限制性-纯化(Wells等人，(1986)Phil Trans R Soc Lond A[伦敦皇家学会哲学会刊系列A]317：415-423)、通过全基因合成的诱变(Nambiar等人，(1984)Science[科学]223：1299-1301；Sakamar和Khorana，(1988)Nucl Acids Res[核酸研究]14：6361-6372；Wells等人，(1985)Gene[基因]34：315-323以及等人，(1985)Nucl Acids Res[核酸研究]13：3305-3316)、双链断裂修复(Mandecki，(1986)PNAS USA[美国科学院院报]，83：7177-7181以及Arnold，(1993)Curr Opin Biotech[生物技术当代观点]4：450-455)。许多上述方法的另外的细节可以在Methods Enzymol[酶学方法]第154卷中找到，其还描述了用各种诱变方法进行故障问题解决的有用对照。

关于各种多样性产生方法的另外的细节可以在以下美国专利、PCT公开物和申请和EPO公开物中找到：美国专利号5,723,323、美国专利号5,763,192、美国专利号5,814,476、美国专利号5,817,483、美国专利号5,824,514、美国专利号5,976,862、美国专利号5,605,793、美国专利号5,811,238、美国专利号5,830,721、美国专利号5,834,252、美国专利号5,837,458、WO 1995/22625、WO 1996/33207、WO 1997/20078、WO 1997/35966、WO 1999/41402、WO 1999/41383、WO 1999/41369、WO 1999/41368、EP 752008、EP 1012670、WO 1999/23107、WO 1999/21979、WO 1998/31837、WO 1998/27230、WO 1998/27230、WO 2000/00632、WO 2000/09679、WO 1998/42832、WO 1999/29902、WO 1998/41653、WO 1998/41622、WO1998/42727、WO 2000/18906、WO 2000/04190、WO 2000/42561、WO 2000/42559、WO 2000/42560、WO 2001/23401和PCT/US 01/06775。

实施例的核苷酸序列也可以用于从植物来源分离相应的序列，所述植物来源包括但不限于耳蕨属、骨碎补属、翼囊蕨属、阴石蕨属、球子蕨属和/或三叉蕨属物种。以这种方式，可以使用如PCR、杂交等方法来鉴定此类序列(基于其与本文所示序列的序列同源性)。实施例涵盖基于与本文所示全部序列或其片段的序列同一性选择的序列。此类序列包含作为公开序列的直向同源物的序列。术语“直向同源物”是指源自共同祖先基因并且由于物种形成而在不同物种中发现的基因。当其核苷酸序列和/或其编码的蛋白序列共有如本文其他地方所定义的基本同一性时，在不同物种中发现的基因被认为是直向同源物。直向同源物的功能通常在物种间是高度保守的。

在PCR方法中，可以设计寡核苷酸引物用于PCR反应，以从由任何目的生物体提取的cDNA或基因组DNA扩增相应的DNA序列。用于设计PCR引物以及PCR克隆的方法通常是本领域已知的并且公开于Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册](第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社]，Plainview[普莱恩维尤]，纽约)，以下为“Sambrook”中。还参见，Innis等人编辑，(1990)PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications[PCR方案：方法和应用指南](Academic Press[学术出版社]，纽约)；Innis和Gelfand编辑，(1995)PCR Strategies[PCR策略](Academic Press[学术出版社]，纽约)；和Innis和Gelfand编辑，(1999)PCRMethods Manual[PCR方法手册](Academic Press[学术出版社]，纽约)。已知的PCR方法包括但不限于：使用成对引物、巢式引物、单特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。

为了从植物集合中鉴定潜在的IPD121多肽，可以使用蛋白质印迹和/或ELISA方法用针对IPD121多肽产生的抗体筛选植物细胞提取物。这种类型的测定能以高通量方式进行。可以通过各种技术(例如基于抗体的蛋白质纯化和鉴定)进一步分析阳性样品。产生抗体的方法是本领域公知的，如下文所述。

可替代地，基于质谱的蛋白质鉴定方法可以使用文献中的方案用于鉴定IPD121多肽的同源物(Scott Patterson，(1998)，10.22，1-24，由约翰威利父子出版公司(JohnWiley&Son Inc)出版的Current Protocol in Molecular Biology[当前分子生物学方案])。具体来说，使用基于LC-MS/MS的蛋白质鉴定方法将给定细胞裂解物或所需分子量富集样品(从IPD121多肽的相关分子量带的SDS-PAGE凝胶切除)的MS数据与本文公开的IPD121多肽的序列信息结合。肽序列中的任何匹配表明在样品中具有同源蛋白的可能性。可以使用另外技术(蛋白质纯化和分子生物学)来分离蛋白质并鉴定同源物的序列。

在杂交方法中，全部或部分杀有害生物核酸序列可用于筛选cDNA或基因组文库。用于构建此类cDNA和基因组文库的方法是本领域通常已知的，并且公开于Sambrook和Russell，(2001)，同上。所谓的杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，并且可以用一个可检测基团(如32P或任何其他可检测的标记，如其他放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)进行标记。用于杂交的探针可以通过基于本文公开的已知的编码IPD121多肽的核酸序列标记合成的寡核苷酸来制备。可以另外使用简并引物，所述简并引物是基于在所述核酸序列或所编码的氨基酸序列中的保守性核苷酸或氨基酸残基而设计的。这种探针典型地包含以下核酸序列的区域，所述核酸序列区域在严格条件下与编码本公开的IPD121多肽的核酸序列或其片段或变体的至少约12个、至少约25个、至少约50、75、100、125、150、175或200个连续核酸进行杂交。用于制备用于杂交的探针的方法和严格条件是本领域通常已知的，并且公开于Sambrook和Russell，(2001)，同上，其通过引用并入本文。

例如，编码本文公开的IPD121多肽的完整核酸序列或其一个或多个部分可以用作能够与编码IPD121多肽样序列和信使RNA的相应核酸序列特异性杂交的探针。为了实现在不同的条件下的特异性杂交，此类探针包括以下序列，所述序列是独特的并且长度优选为至少约10个核苷酸、或长度为至少约20个核苷酸。此类探针可以用于通过PCR对来自所选生物体的相应杀有害生物序列进行扩增。可以使用这种技术从所需的生物体中分离另外的编码序列，或作为用于确定生物体中存在编码序列的诊断测定。杂交技术包括铺板的DNA文库的杂交筛选(斑块或集落；参见，例如，Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual[分子克隆：实验室手册](第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress[冷泉港实验室出版社])，Cold Spring Harbor[冷泉港]，N.Y.[纽约])。

此类序列的杂交可以在严格条件下进行。“严格条件”或“严格杂交条件”在本文中用以指探针与其靶序列杂交的程度将比它与其他序列杂交的程度可检测地更高(例如，比背景高至少2倍)的条件。严格条件是序列依赖性的，并且在不同情况下将有所不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与所述探针100％互补的靶序列(同源探测)。可替代地，可以调节严格条件以允许序列中的一些错配，以便检测到更低程度的相似性(异源探测)。通常，探针的长度为小于约1000个核苷酸，优选地长度小于500个核苷酸。

抗体

还涵盖了针对实施例的IPD121多肽或其变体或片段的抗体。本公开的抗体包括保留其结合IPD121多肽的能力的多克隆和单克隆抗体及其片段。据信抗体、单克隆抗体或其片段能够与分子结合，前提是所述抗体、单克隆抗体或其片段能够与所述分子特异性反应，从而将所述分子与抗体、单克隆抗体或其片段结合。术语“抗体”(Ab)或“单克隆抗体”(Mab)意在包括能够结合半抗原的完整分子及其片段或结合区域或结构域(例如，像Fab和F(ab).sub.2片段)。此类片段典型地通过蛋白水解切割(例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)产生。可替代地，可以通过应用重组DNA技术或通过合成化学来产生半抗原结合片段。制备本公开的抗体的方法是本领域公知的。例如，参见Antibodies，A Laboratory Manual[抗体，实验室手册]，Ed Harlow和David Lane(编辑)Cold Spring Harbor Laboratory[冷泉港实验室]，N.Y.[纽约](1988)，以及其中引用的参考文献。阐述免疫学的一般原则的标准参考文献包括：Klein，J.Immunology：The Science of Cell-Noncell Discrimination[免疫学杂志：细胞-非细胞鉴别科学]，John Wiley&Sons[约翰威利父子公司]，纽约(1982)；Dennett等人，Monoclonal Antibodies，Hybridoma：A New Dimension in Biological Analyses[单克隆抗体，杂交瘤：生物分析的新维度]，Plenum Press[普莱纽姆出版社]，纽约(1980)以及Campbell，“Monoclonal Antibody Technology[单克隆抗体技术]，”在LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology[生物化学与分子生物学实验室技术]，第13卷，Burdon等人，(编辑)，Elsevier[爱思唯尔出版社]，Amsterdam[阿姆斯特丹](1984)。还参见，美国专利号4,196,265；4,609,893；4,713,325；4,714,681；4,716,111；4,716,117和4,720,459。针对IPD121多肽或其抗原结合部分的抗体可以通过多种技术产生，所述技术包括常规的单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein，(1975)Nature[自然]256：495中所述的标准体细胞杂交技术。还可以使用产生单克隆抗体的其他技术，如B淋巴细胞的病毒或致癌性转化。用于制备杂交瘤的动物系统是小鼠系统。分离用于融合的免疫的脾细胞的免疫方案和技术是本领域已知的。融合配偶体(例如，小鼠骨髓瘤细胞)和融合方法也是已知的。本公开的抗体和单克隆抗体可以通过利用IPD121多肽作为抗原来制备。

提供了用于检测样品中IPD121多肽的存在或检测编码IPD121多肽的核苷酸序列的存在的试剂盒。在一个实施例中，试剂盒提供了用于检测组织样品中IPD121多肽的存在的基于抗体的试剂。在另一个实施例中，试剂盒提供了用于检测编码IPD121多肽的一种或多种多核苷酸的存在的标记的核酸探针。将试剂盒与用于进行检测方法的适当的试剂和对照物，以及试剂盒的使用说明书一起提供。

受体鉴定和分离

还涵盖了针对实施例的IPD121多肽或针对其变体或片段的受体。用于鉴定受体的方法是本领域熟知的(参见，Hofmann等人，(1988)Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]173：85-91；Gill等人，(1995)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]27277-27282)可以使用来自易感昆虫的刷状缘膜囊泡来鉴定和分离识别IPD121多肽的受体。除了引用文献中列出的放射性标记方法之外，可以将IPD121多肽用荧光染料和其他常见标记如链霉亲和素进行标记。可以根据以上Hofmann和Gill的参考文献中列出的方案制备易感昆虫(如大豆夜蛾和椿象)的刷状缘膜囊泡(BBMV)，并在SDS-PAGE凝胶上分离，并在合适的膜上印迹。标记的IPD121多肽可以与BBMV的印迹膜一起孵育，并且标记的IPD121多肽可以用标记的报道基因鉴定。与IPD121多肽相互作用的一个或多个蛋白带的鉴定可以通过基于N-末端氨基酸气相测序或基于质谱的蛋白鉴定方法进行检测(Patterson，(1998)10.22，1-24，由约翰威利父子出版公司(John Wiley&Son Inc)出版的Current Protocol in Molecular Biology[当前分子生物学方案])。一旦鉴定出蛋白，可以从易感昆虫的基因组DNA或cDNA文库中克隆相应的基因，并且可以直接用IPD121多肽测量结合亲和力。通过IPD121多肽的杀昆虫活性的受体功能可以通过RNAi型的基因敲除法验证(Rajagopal等人，(2002)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]，277：46849-46851)。

核苷酸构建体、表达盒和载体

本文使用术语“核苷酸构建体”并不旨在将实施例限制为包含DNA的核苷酸构建体。本领域普通技术人员将认识到，核苷酸构建体，特别是由核糖核苷酸构成的多核苷酸和寡核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合也可用于本文公开的方法中。实施例的核苷酸构建体、核酸和核苷酸序列另外涵盖这种构建体、分子和序列的所有互补形式。此外，实施例的核苷酸构建体、核苷酸分子和核苷酸序列涵盖能用于实施例的转化植物方法的所有核苷酸构建体、分子和序列，包括但不限于由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及其组合所构成的那些。这种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸既包括天然存在的分子也包括合成的类似物。实施例的核苷酸构建体、核酸和核苷酸序列还涵盖核苷酸构建体的所有形式，所述形式包括但不限于单链形式、双链形式、发夹、茎环结构等。

另外的实施例涉及经转化的生物体，如选自以下的生物体：植物和昆虫细胞、细菌、酵母、杆状病毒、原生动物、线虫和藻的生物体。经转化的生物体包含：实施例的DNA分子、含有DNA分子的表达盒或含有表达盒的载体，它可以稳定地并入经转化的生物体的基因组。

在DNA构建体中提供实施例的序列，用于在目的生物体中表达。所述构建体将包括有效地连接到实施例的序列的5′和3′的调节序列。如本文所用的，术语“有效地连接”是指启动子和第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列启动并介导对应于第二序列的DNA序列的转录。通常，有效地连接意味着所连接的核酸序列是连续的，并且在必要时在相同阅读框中连接两个蛋白质编码区域。所述构建体可以另外含有待共转化进生物体的至少一个另外的基因。可替代地，可以在多个DNA构建体上提供一个或多个另外的基因。

提供的这种DNA构建体具有用于插入本公开的IPD121多肽基因序列以使其处于调节性区域的转录调节下的多个限制性位点。DNA构建体可以另外包含选择性标记基因。

DNA构建体通常在5′至3′转录方向上包括：转录和翻译起始区(即启动子)、实施例的DNA序列、以及在作为宿主的生物体中起作用的转录和翻译终止区域(即终止区)。针对实施例的宿主生物体和/或序列，转录起始区(即，启动子)可以是天然的、类似的、外源的或异源的。此外，所述启动子可以是天然序列，或可替代地，是合成序列。如本文所用的，术语“外源”表示在引入启动子的天然生物体中没有发现启动子。在启动子对于实施例的序列而言是“外源的”或“异源的”情况下，它是指所述启动子对于实施例的有效地连接的序列而言不是天然的或天然存在的启动子。如本文所用的，嵌合基因包含与转录起始区有效地连接的编码序列，所述转录起始区对于所述编码序列是异源的。当启动子是天然或自然的序列时，有效地连接的序列的表达从野生型表达变化，这导致表型的改变。

在一些实施例中，DNA构建体包含编码实施例的IPD121多肽的多核苷酸。在一些实施例中，DNA构建体包含编码含有实施例的IPD121多肽的融合蛋白的多核苷酸。

在一些实施例中，DNA构建体还可以包括转录增强子序列。如本文所用的，术语“增强子”是指可以刺激启动子活性的DNA序列，并且可以是插入以增强启动子的水平或组织特异性的启动子的先天元件或异源元件。各种增强子是本领域已知的，包括例如，在植物中具有基因表达增强特性的内含子(美国专利申请公开号2009/0144863)、泛素内含子(即，玉蜀黍泛素内含子1(参见，例如，NCBI序列S94464))、ω增强子或ω主要增强子(Gallie等人，(1989)Molecular Biology of RNA[RNA的分子生物学]，Cech编辑(利斯公司(Liss)，纽约)237-256和Gallie等人，(1987)Gene[基因]60：217-25)、CaMV 35S增强子(参见，例如，Benfey等人，(1990)EMBO J.[欧洲分子生物学杂志]9：1685-96)，并且也可以使用美国专利号7,803,992的增强子。以上转录增强子的列表并不意指是限制性的。任何适当转录增强子都可用于实施例中。

终止区对于转录起始区可以是天然的，对于有效地连接的目的DNA序列可以是天然的，对于植物宿主可以是天然的，或者可以源自另一种来源(即，对于启动子、目的序列、植物宿主、或其任何组合而言是外源的或异源的)。

方便的终止区可获自根癌农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒，例如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。还参见，Guerineau等人，(1991)Mol Gen.Genet.[分子遗传学和普通遗传学]262：141-144；Proudfoot，(1991)Cell[细胞]64：671-674；Sanfacon等人，(1991)Genes Dev.[基因与发育]5：141-149；Mogen等人，(1990)Plant Cell[植物细胞]2：1261-1272；Munroe等人，(1990)Gene[基因]91：151-158；Ballas等人，(1989)Nucleic AcidsRes.[核酸研究]17：7891-7903以及Joshi等人，(1987)Nucleic Acid Res.[核酸研究]15：9627-9639。

适当时可以优化核酸以增加在宿主生物体中的表达。因此，在宿主生物体是植物的情况下，合成核酸可以使用植物偏好性密码子来合成以改进表达。有关宿主偏好性使用的讨论，参见例如Campbell和Gowri，(1990)Plant Physiol.[植物生理学]92：1-11。例如，虽然实施例的核酸序列在单子叶和双子叶植物物种中均可以表达，但是可以修饰序列，以考虑单子叶或双子叶植物的特定偏好和GC含量偏好，因为这些偏好已经表现出了差异(Murray等人(1989)Nucleic Acids Res.[核酸研究]17：477-498)。因而，特定氨基酸的玉米偏好性可以源自玉蜀黍的已知基因序列。来自玉蜀黍植物的28种基因的玉蜀黍使用在Murray等人(同上)的表4中列出。本领域中可获得用于合成植物偏好的基因的方法。参见，例如，Murray等人，(1989)Nucleic Acids Res.[核酸研究]17：477-498，和Liu H等人MolBio Rep[分子生物学报告]37：677-684，2010，其通过引用并入本文。玉蜀黍(Zea maize)使用表也可以在kazusa.or.jp//cgi-bin/show.cgi？species＝4577上找到，所述网址可以使用www前缀进行访问。大豆使用表可以在kazusa.or.jp//cgi-bin/show.cgi？species＝3847&aa＝1&style＝N上找到，所述网址可以使用www前缀进行访问。

在一些实施例中，编码IPD121多肽的重组核酸分子具有玉蜀黍优化的密码子。

已知有另外的序列修饰能增强细胞宿主中的基因表达。这些包括消除以下序列：编码假聚腺苷酸化信号的序列、编码外显子-内含子剪接位点信号的序列、编码转座子样重复序列的序列和得到充分表征的、可能不利于基因表达的其他序列。可以将序列的GC含量调整至给定细胞宿主的平均水平，如通过参考在所述宿主细胞中表达的已知基因而计算的。如本文所用的，术语“宿主细胞”是指包含载体并支持表达载体的复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌，或真核细胞如酵母、昆虫、两栖类或哺乳动物细胞、或单子叶或双子叶植物细胞。单子叶宿主细胞的实例是玉蜀黍宿主细胞。当可能时，修饰序列以避免出现可预见的发夹二级mRNA结构。

表达盒可以另外包含5′前导序列。所述前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译前导序列在本领域是已知的，并且包括：小核糖核酸病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎5′非编码区)(Elroy-Stein等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]，86：6126-6130)；马铃薯Y病毒属前导序列，例如，TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Gallie等人，(1995)Gene[基因]165(2)：233-238)、MDMV前导序列(玉蜀黍矮花叶病毒)、人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak等人，(1991)Nature[自然]353：90-94)；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA的非翻译前导序列(AMV RNA 4)(Jobling等人，(1987)Nature[自然]325：622-625)；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie等人，(1989)Molecular Biology ofRNA[RNA的分子生物学]，Cech编著(利斯公司，纽约)，第237-256页)和玉米褪绿斑驳病毒(maize chlorotic mottle)前导序列(MCMV)(Lommel，等人，(1991)Virology[病毒学]81：382-385)。还参见，Della-Cioppa等人，(1987)Plant Physiol.[植物生理学]84：965-968。此类构建体还可以包含“信号序列”或“前导序列”，以促进所述肽的共翻译成或翻译后运输至某些细胞内结构，如叶绿体(或其他质体)、内质网或高尔基体。

如本文所用的，“信号序列”是指已知或怀疑导致跨细胞膜的共翻译或翻译后肽运输的序列。在真核生物中，这典型地涉及分泌到高尔基体内，伴随某些产生的糖基化。通常将细菌的杀昆虫毒素合成为原毒素，所述原毒素在所述靶标有害生物的肠中被蛋白水解激活(Chang，(1987)Methods Enzymol.[酶学方法]153：507-516)。在一些实施例中，所述信号序列位于所述天然的序列中，或可以源自实施例的序列。如本文所用的，术语“前导序列”是指当翻译时产生足以引发肽链与亚细胞器的共翻译转运的氨基酸序列的任何序列。因此，这包括通过进入内质网内、进入液泡、质体(包括叶绿体、线粒体)等中来对运输和/或糖基化进行靶向的前导序列。靶向叶绿体类囊体腔室的核编码蛋白具有由基质靶向信号肽和腔靶向信号肽组成的特征二分型转运肽。基质靶向信息位于转运肽的氨基-近端部分。腔靶向信号肽位于转运肽的羧基近端部分，并且包含用于靶向腔的所有信息。高等植物叶绿体蛋白质组学的最新研究已在鉴定许多核编码的腔蛋白质中取得了进展(Kieselbach等人FEBSLETT[欧洲生化学会联盟通讯]480：271-276，2000；Peltier等人.Plant Cell[植物细胞]12：319-341，2000；Bricker等人.Biochim.Biophys Acta[生物化学生物物理学报]1503：350-356，2001)，根据本公开可能使用所述核编码的腔蛋白质的腔靶向信号肽。Kieselbach等人，Photosynthesis Research[光合作用研究]78：249-264，2003报道了来自拟南芥属(Arabidopsis)约80种蛋白质以及来自菠菜和豌豆的同源蛋白。具体地，此公开物的表2(其通过引用并入本说明书中)公开了通过其登录号鉴定的来自叶绿体腔的85种蛋白质(还参见美国专利申请公开2009/09044298)。

本领域技术人员熟知的合适的叶绿体转运肽(CTP)还包含嵌合CT’s，所述嵌合CT’s包括但不限于：来自以下的CTP的N-末端结构域、中心结构域或C-末端结构域：水稻(Oryzasativa)1-脱氧-D木酮糖-5-磷酸合酶、水稻-超氧化物歧化酶、水稻-可溶性淀粉合酶、水稻-NADP-依赖性苹果酸酶、水稻-磷酸2-脱氢-3-脱氧庚酸醛缩酶2、水稻-L-抗坏血酸过氧化物酶5、水稻-磷酸葡聚糖水二激酶、玉蜀黍ssRUBISCO、玉蜀黍-β-葡糖苷酶、玉蜀黍-苹果酸脱氢酶、玉蜀黍硫氧还蛋白M-型(参见美国专利申请公开2012/0304336)。

可以针对在叶绿体中的表达来优化待靶向叶绿体的IPD121多肽基因，以解决植物核与所述细胞器之间的使用差异。以此方式，可以使用叶绿体偏好的序列合成目的核酸。

在制备表达盒时，可以操作各种DNA片段，以提供处于适当方向以及合适时，处于适当阅读框中的DNA序列。为此，可采用衔接子(adapter)或接头以连接DNA片段，或可以涉及其他操作以提供方便的限制位点、移除多余的DNA、移除限制位点等。出于这个目的，可以涉及体外诱变、引物修复、限制性酶切(restriction)、退火、再取代(例如转换和颠换)。

许多启动子可用于实施所述实施例。可基于所需结果，选择启动子。核酸可与组成性、组织偏好性、可诱导的或其他启动子组合用于在宿主生物体中的表达。用于植物宿主细胞中的合适的组成型启动子包括，例如Rsyn7启动子的核心启动子和其他在WO 1999/43838和美国专利号6,072,050中公开的组成型启动子；核心CaMV 35S启动子(Odell等人，(1985)Nature[自然]313：810-812)；水稻肌动蛋白(McElroy等人，(1990)Plant Cell[植物细胞]2：163-171)；泛素(Christensen等人，(1989)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]12：619-632和Christensen等人，(1992)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]18：675-689)；pEMU(Last等人，(1991)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]81：581-588)；MAS(Velten等人，(1984)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利号5,659,026)等。其他组成型启动子包括例如以下美国专利号中所讨论的那些：5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142和6,177,611。

根据所需结果，从诱导型启动子表达基因可能是有益的。用于调节实施例的核苷酸序列在植物中表达的特别引人关注的是伤口诱导型启动子。这种伤口诱导型启动子可以对由昆虫取食引起的损害作出反应，并且包括马铃薯蛋白酶抑制剂(pin II)基因(Ryan，(1990)Ann.Rev.Phytopath.[植物病理学年鉴]28：425-449；Duan等人，(1996)NatureBiotechnology[自然生物技术]14：494-498)；wun1和wun2，美国专利号5,428,148；win1和win2(Stanford等人，(1989)Mol.Gen.Genet.[分子遗传学和普通遗传学]215：200-208)；系统素(McGurl等人，(1992)Science[科学]225：1570-1573)；WIP1(Rohmeier等人，(1993)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]22：783-792；Eckelkamp等人，(1993)FEBS Letters[欧洲生化学会联盟通讯]323：73-76)；MPI基因(Corderok等人，(1994)Plant J.[植物杂志]6(2)：141-150)等。

此外，可以在实施例的方法和核苷酸构建体中使用病原体诱导型启动子。这类病原体诱导型启动子包括来自病程相关蛋白(PR蛋白)(例如，PR蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶等)的那些。参见例如Redolfi等人，(1983)Neth.J.Plant Pathol.[荷兰植物病理学杂志]89：245-254；Uknes等人，(1992)Plant Cell[植物细胞]4：645-656和VanLoon，(1985)Plant Mol.Virol.[植物分子病毒学]4：111-116。还参见WO 1999/43819。

引人关注的是在病原体感染部位处或附近局部表达的启动子。参见例如Marineau等人，(1987)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]9：335-342；Matton等人，(1989)Molecular Plant-Microbe Interactions[分子植物-微生物相互作用]2：325-331；Somsisch等人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]83：2427-2430；Somsisch等人，(1988)Mol.Gen.Genet.[分子和普通遗传学]2：93-98以及Yang，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]93：14972-14977。还参见Chen等人，(1996)Plant J.[植物杂志]10：955-966；Zhang等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]91：2507-2511；Warner等人，(1993)Plant J.[植物杂志]3：191-201；Siebertz等人，(1989)Plant Cell[植物细胞]1：961-968；美国专利号5,750,386(线虫诱导型)及其中引用的参考文献。特别引人关注的是玉蜀黍PRms基因的诱导型启动子，其表达是由病原体串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)诱导的(参见例如Cordero等人，(1992)Physiol.Mol.Plant Path.[生理学与分子植物病理学]41：189-200)。

可以使用化学调节型启动子以通过应用外源化学调节剂来调节植物中的基因表达。取决于目标，启动子可以是化学诱导型启动子，其中施用化学品来诱导基因表达，或化学抑制型启动子，其中施用化学品来抑制基因表达。化学诱导型启动子是本领域已知的，并且包括但不限于由苯磺酰胺除草剂安全剂激活的玉蜀黍In2-2启动子、由用作萌前除草剂的疏水亲电子化合物激活的玉蜀黍GST启动子、以及由水杨酸激活的烟草PR-1a启动子。其他引人关注的化学调节型启动子包括类固醇应答启动子(参见，例如，Schena等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]88：10421-10425和McNellis等人，(1998)Plant J.[植物杂志]14(2)：247-257中的糖皮质激素诱导型启动子)以及四环素诱导型和四环素抑制型启动子(参见，例如，Gatz等人，(1991)Mol.Gen.Genet.[分子遗传学和普通遗传学]227：229-237，以及美国专利号5,814,618和5,789,156)。

组织偏好性启动子可以用于靶向特定植物组织内的增强的IPD121多肽表达。组织偏好性启动子包括描述于以下文献中的那些：Yamamoto等人，(1997)Plant J.[植物杂志]12(2)：255-265；Kawamata等人，(1997)Plant Cell Physiol.[植物细胞生理学]38(7)：792-803；Hansen等人，(1997)Mol.Gen Genet.[分子和普通遗传学]254(3)：337-343；Russell等人，(1997)Transgenic Res.[转基因研究]6(2)：157-168；Rinehart等人，(1996)Plant Physiol[植物生理学]112(3)：1331-1341；Van Camp等人，(1996)Plant Physiol.[植物生理学]112(2)：525-535；Canevascini等人，(1996)Plant Physiol.[植物生理学]112(2)：513-524；Yamamoto等人，(1994)Plant Cell Physiol[植物细胞生理学]35(5)：773-778；Lam，(1994)Results Probl.Cell Differ.[细胞分化的结果和问题]20：181-196；Orozco等人，(1993)Plant Mol Biol.[植物分子生物学]23(6)：1129-1138；Matsuoka等人，(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]90(20)：9586-9590和Guevara-Garcia等人，(1993)Plant J.[植物杂志]4(3)：495-505。必要的话，此类启动子可经修饰用于弱表达。

叶偏好性启动子是本领域已知的。参见，例如，Yamamoto等人，(1997)Plant J.[植物杂志]12(2)：255-265；Kwon等人，(1994)Plant Physiol.[植物生理学]105：357-67；Yamamoto等人，(1994)Plant Cell Physiol[植物细胞生理学]35(5)：773-778；Gotor等人，(1993)Plant J.[植物杂志]3：509-18；Orozco等人，(1993)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]23(6)：1129-1138以及Matsuoka等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]90(20)：9586-9590。

根偏好性或根特异性的启动子是已知的，并且可以从来自文献中的许多可获得的启动子来选择，或者从不同相容物种重新分离。参见例如Hire等人，(1992)PlantMol.Biol.[植物分子生物学]20(2)：207-218(大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller和Baumgartner，(1991)Plant Cell[植物细胞]3(10)：1051-1061(法国菜豆的GRP 1.8基因中的根特异性控制元件)；Sanger等人，(1990)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]14(3)：433-443(根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的甘露聚糖合成酶(MAS)基因的根特异性启动子)以及Miao等人，(1991)Plant Cell[植物细胞]3(1)：11-22(编码细胞溶质谷氨酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆，其在大豆的根和根瘤中表达)。还参见，Bogusz等人，(1990)Plant Cell[植物细胞]2(7)：633-641，其中描述了从来自固氮的非豆科植物榆科山黄麻(Parasponia andersonii)以及相关的非固氮的非豆科植物山黄麻(Trematomentosa)的血红蛋白基因分离的两个根特异性启动子。这些基因的启动子与β-葡糖醛酸糖苷酶报告基因连接，并且被引入非豆科作物烟草(Nicotiana tabacum)和豆科作物百脉根(Lotus corniculatus)两者中，并且在两种情况下都保留了根特异性启动子活性。Leach和Aoyagi，(1991)描述了他们对发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的高表达的rolC和rolD根诱导基因的启动子的分析(参见，Plant Science[植物科学](Limerick[利默里克])79(1)：69-76)。他们得出结论，增强子和组织偏好性DNA决定簇在所述启动子中是解离的。Teeri等人，(1989)使用与lacZ的基因融合以显示编码章鱼碱合酶的农杆菌属T-DNA基因尤其是在根尖的表皮中有活性，并且TR2′基因在完整植物中具有根特异性并且被叶组织中的创伤刺激，这是与杀昆虫的或杀幼虫的基因一起使用的特别希望的特征组合(参见，EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]8(2)：343-350)。与nptII(新霉素磷酸转移酶II)融合的TR1′基因显示相似的特征。另外的根偏好性启动子包括VfENOD-GRP3基因启动子(Kuster等人，(1995)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]29(4)：759-772)；和rolB启动子(Capana等人，(1994)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]25(4)：681-691)。还参见，美国专利号5,837,876；5,750,386；5,633,363；5,459,252；5,401,836；5,110,732和5,023,179。在US20130117883中公开了拟南芥(Arabidopsis thaliana)根偏好性调节序列。

“种子偏好性”启动子包括种子特异性启动子(在种子发育期间有活性的那些启动子如种子贮藏蛋白的启动子)以及种子发芽性启动子(在种子发芽期间有活性的那些启动子)。参见Thompson等人，(1989)BioEssays[生物学论文集]10：108。此类种子偏好性启动子包括但不限于Cim1(细胞分裂素诱导的信息)；cZ19B1(玉蜀黍19kDa玉米醇溶蛋白)；和milps(肌醇-1-磷酸合酶)(参见，美国专利号6,225,529)。γ-玉米醇溶蛋白和Glb-1是胚乳特异性启动子。对于双子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于：库尼兹(Kunitz)胰蛋白酶抑制剂3(KTi3)(Jofuku和Goldberg，(1989)Plant Cell[植物细胞]1：1079-1101)、豆-β菜豆素、油菜籽蛋白、β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白1、大豆凝集素、十字花科蛋白等。对于单子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于玉蜀黍15kDa玉米醇溶蛋白、22kDa玉米醇溶蛋白、27kDa玉米醇溶蛋白、g-玉米醇溶蛋白、蜡质、收缩素1、收缩素2、球蛋白1等。还参见WO2000/12733，其中公开了来自end1和end2基因的种子偏好性启动子。在双子叶植物中，种子特异性启动子包括但不限于：来自拟南芥属的种皮启动子，pBAN；和来自拟南芥属的早期种子启动子，p26、p63、和p63tr(美国专利号7,294,760和7,847,153)。在特定组织中具有“偏好性”表达的启动子在所述组织中比在至少一种其他植物组织中以更高程度表达。一些组织偏好性启动子几乎专门在特定组织中表达。

当需要低水平表达时，可使用弱启动子。通常，如本文所用的术语“弱启动子”是指以低水平驱动编码序列的表达的启动子。低水平表达旨在约1/1000转录物至约1/100,000转录物至约1/500,000转录物之间的水平。可替代地，应当认识到，术语“弱启动子”还涵盖仅在少数细胞中驱动表达但不在其他细胞中表达，从而具有低水平总表达的启动子。当启动子以不可接受的高水平驱动表达时，可以删除或修饰部分启动子序列以降低表达水平。

此类弱组成型启动子包括例如Rsyn7启动子的核心启动子(WO 1999/43838和美国专利号6,072,050)、核心35S CaMV启动子等。其他组成型启动子包括例如以下专利文献中所公开的那些：美国专利号5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142和6,177,611。

以上启动子的列表并不意指是限制性的。任何适当的启动子都可用于实施例中。

通常，表达盒将包含选择性标记基因，用于选择经转化的细胞。利用选择性标记基因来选择经转化的细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予除草剂化合物(如草胺磷、溴草腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D))抗性的基因。合适的选择性标记基因的其他实例包括但不限于编码对如下的耐受性的基因：氯霉素(Herrera Estrella等人，(1983)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]2：987-992)；甲氨蝶呤(Herrera Estrella等人，(1983)Nature[自然]303：209-213和Meijer等人，(1991)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]16：807-820)；链霉素(Jones等人，(1987)Mol.Gen.Genet.[分子遗传学和普通遗传学]210：86-91)；壮观霉素(Bretagne-Sagnard等人，(1996)Transgenic Res.[转基因研究]5：131-137)；博来霉素(Hille等人，(1990)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]7：171-176)；磺酰胺类(Guerineau等人，(1990)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]15：127-136)；溴草腈(Stalker等人，(1988)Science[科学]242：419-423)；草甘膦(Shaw等人，(1986)Science[科学]233：478-481以及美国专利申请序列号10/004,357和10/427,692)；草丁膦(DeBlock等人，(1987)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]6：2513-2518)。主要参见Yarranton，(1992)Curr.Opin.Biotech.[生物技术当代观点]3：506-511；Christopherson等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]89：6314-6318；Yao等人，(1992)Cell[细胞]71：63-72；Reznikoff，(1992)Mol.Microbiol.[分子微生物学]6：2419-2422；Barkley等人，(1980)在The Operon[操纵子]中，第177-220页；Hu等人，(1987)Cell[细胞]48：555-566；Brown等人，(1987)Cell[细胞]49：603-612；Figge等人，(1988)Cell[细胞]52：713-722；Deuschle等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]86：5400-5404；Fuerst等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]86：2549-2553；Deuschle等人，(1990)Science[科学]248：480-483；Gossen，(1993)Ph.D.Thesis[博士学位论文]，University of Heidelberg[德国海德堡大学]；Reines等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]90：1917-1921；Labow等人，(1990)Mol.CellBiol.[分子细胞生物学]10：3343-3356；Zambretti等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]89：3952-3956；Baim等人，(1991)Proc.Natl.Acad..Sci.USA[美国科学院院报]88：5072-5076；Wyborski等人，(1991)Nucleic Acids Res.[核酸研究]19：4647-4653；Hillenand-Wissman(1989)TopicsMol.Struc.Biol.[热点分子结构生物学]10：143-162；Degenkolb等人，(1991)Antimicrob.Agents Chemother.[抗微生物剂化学疗法]35：1591-1595；Kleinschnidt，等人，(1988)Biochemistry[生物化学]27：1094-1104；Bonin，(1993)Ph.D.Thesis[博士学位论文]University of Heidelberg[德国海德堡大学]；Gossen等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]89：5547-5551；Oliva等人，(1992)Antimicrob.Agents Chemother.[抗微生物剂化学疗法]36：913-919；Hlavka等人，(1985)Handbook of Experimental Pharmacology[实验药理学手册]，78卷(Springer-Verlag，Berlin[柏林施普林格出版社])和Gill等人，(1988)Nature[自然]334：721-724。

以上选择性标记基因的列表并不意味着具有限制性。任何选择性标记基因均可用于所述实施例中。

植物转化

所述实施例的方法涉及将多肽或多核苷酸引入植物。如本文所用的，“引入”意指将所述多核苷酸或多肽呈送给所述植物，以此类方式使得所述序列进入所述植物细胞的内部。所述实施例的方法不取决于用于将一个或多个多核苷酸或一个或多个多肽引入植物中的具体方法，只要所述多核苷酸或多肽进入所述植物的至少一个细胞的内部即可。将一个或多个多核苷酸或一个或多个多肽引入植物的方法是本领域已知的，所述方法包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法。

如本文所用的，“稳定转化”意指引入植物中的核苷酸构建体整合到所述植物的基因组中，并且能够被其子代遗传。如本文所用的，“瞬时转化”意指将多核苷酸引入所述植物中并且不整合到所述植物的基因组中，或者将多肽引入植物中。如本文所用的，“植物”是指整株植物、植物器官(例如叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、及其胚胎和子代。植物细胞可以是分化的或未分化的(例如愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶子细胞、根细胞、韧皮部细胞和花粉)。

转化方案以及将核苷酸序列引入植物中的方案可以根据要靶向转化的植物或植物细胞的类型(即，单子叶植物或双子叶植物)而异。将核苷酸序列引入到植物细胞中并随后插入到植物基因组中的合适方法包括显微注射(Crossway等人，(1986)Biotechniques[生物技术]4：320-334)、电穿孔(Riggs等人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]83：5602-5606)、农杆菌介导的转化(美国专利号5,563,055和5,981,840)、直接基因转移(Paszkowski等人，(1984)EMBO J[欧洲分子生物学学会杂志]3：2717-2722)以及弹道粒子加速(参见例如，美国专利号4,945,050；5,879,918；5,886,244和5,932,782；Tomes等人，(1995)Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods[植物细胞、组织和器官培养：基本方法]，Gamborg和Phillips编辑(Springer-Verlag，Berlin[德国柏林施普林格出版公司])；和McCabe等人，(1988)Biotechnology[生物技术]6：923-926)；以及Lecl转化法(WO 00/28058)。对于马铃薯转化法，参见Tu等人，(1998)Plant MolecularBiology[植物分子生物学]37：829-838和Chong等人，(2000)Transgenic Research[转基因研究]9：71-78。可以在以下文献中找到另外的转化方法：Weissinger等人，(1988)Ann.Rev.Genet.[遗传学年鉴]22：421-477；Sanford等人，(1987)Particulate Scienceand Technology[微粒科学与技术]5：27-37(洋葱)；Christou等人，(1988)Plant Physiol.[植物生理学]87：671-674(大豆)；McCabe等人，(1988)Bio/Technology[生物/技术]6：923-926(大豆)；Finer和McMullen，(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.[体外细胞生物学和发育生物学]27P：175-182(大豆)；Singh等人，(1998)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]96：319-324(大豆)；Datta等人，(1990)Biotechnology[生物技术]8：736-740(水稻)；Klein等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]85：4305-4309(玉蜀黍)；Klein等人，(1988)Biotechnology[生物技术]6：559-563(玉蜀黍)；美国专利号5,240,855；5,322,783和5,324,646；Klein等人，(1988)Plant Physiol.[植物生理学]91：440-444(玉蜀黍)；Fromm等人，(1990)Biotechnology[生物技术]8：833-839(玉蜀黍)；Hooykaas-VanSlogteren等人，(1984)Nature[自然](伦敦)311：763-764；美国专利号5,736,369(谷类)；Bytebier等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]84：5345-5349(百合科(Liliaceae))；De Wet等人，(1985)The Experimental Manipulation of Ovule Tissues[胚珠组织的实验操作]，Chapman等人编辑(Longman[朗文出版社]，纽约)，第197-209页(花粉)；Kaeppler等人，(1990)Plant Cell Reports[植物细胞报告]9：415-418和Kaeppler等人，(1992)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]84：560-566(晶须介导的转化)；D′Halluin等人，(1992)Plant Cell[植物细胞]4：1495-1505(电穿孔)；Li等人，(1993)PlantCell Reports[植物细胞报告]，12：250-255以及Christou和Ford，(1995)Annals ofBotany[植物学年报]75：407-413(水稻)；Osjoda等人，(1996)Nature Biotechnology[自然生物技术]14：745-750(经由根癌农杆菌的玉蜀黍)。

在特定实施例中，可以使用各种瞬时转化法向植物提供所述实施例的序列。此类瞬时转化法包括但不限于将IPD121多核苷酸或其变体和片段直接引入植物中或将IPD121多肽转录物引入植物中。此类方法包括例如显微注射或粒子轰击。参见，例如，Crossway等人，(1986)Mol Gen.Genet.[分子遗传学和普通遗传学]202：179-185；Nomura等人，(1986)Plant Sci.[植物科学]44：53-58；Hepler等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.[美国科学院院报]91：2176-2180和Hush等人，(1994)The Journal of Cell Science[细胞科学杂志]107：775-784。可替代地，使用本领域已知的技术可以将IPD121多核苷酸瞬时地转化至植物中。此类技术包括病毒载体系统，和以阻止DNA后续释放的方式使多核苷酸沉淀。因此，可以从微粒结合的DNA进行转录，但其被释放以整合至基因组的频率大大降低了。此类方法包括使用包被有聚乙烯亚胺(PEI；西格玛公司(Sigma)#P3143)的颗粒。

用于在植物基因组的特定位置靶向插入多核苷酸的方法是本领域已知的。在一个实施例中，利用位点特异性重组系统实现多核苷酸在所需的基因组位置处的插入。参见，例如WO 1999/25821、WO 1999/25854、WO 1999/25840、WO 1999/25855和WO 1999/25853。简而言之，本实施例的多核苷酸可以包含在侧翼为两个不相同重组位点的转移盒内。将转移盒引入植物中，所述植物已经稳定地将靶位点并入其基因组中，所述靶位点侧翼为与转移盒的位点相对应的两个不相同的重组位点。提供适当的重组酶，并将所述转移盒整合到靶位点。由此，目的多核苷酸被整合在植物基因组中的具体染色体位置处。

植物转化载体可以由实现植物转化所需的一种或多种DNA载体组成。例如，本领域常见做法是利用由多于一个连续DNA片段组成的植物转化载体。这些载体在本领域中通常被称为“双元载体”。双元载体以及具有辅助质粒的载体最常用于农杆菌介导的转化，其中实现有效转化所需的DNA片段的大小和复杂性相当大，并且将功能分离到单独的DNA分子上是有利的。双元载体典型地含有包含T-DNA转移(如左边界和右边界)所需的顺式作用序列的质粒载体、经工程改造成能够在植物细胞中表达的选择性标记、和“目的基因”(经工程改造成能够在需要产生转基因植物的植物细胞中表达的基因)。此质粒载体上也存在细菌复制所需的序列。将顺式作用序列以允许有效转移到植物细胞中并在其中表达的方式进行排列。例如，所述选择性标记基因和杀有害生物基因位于左边界和右边界之间。通常第二质粒载体包含反式作用因子，所述反式作用因子介导从农杆菌属到植物细胞的T-DNA转化。如本领域所理解的，所述质粒通常含有允许通过农杆菌感染植物细胞、以及通过在边界序列切割进行DNA的转移和vir介导的DNA转移的毒力功能(Vir基因)(Hellens和Mullineaux，(2000)Trends in Plant Science[植物科学趋势]5：446-451)。若干种类型的农杆菌菌株(例如LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105等)可用于植物转化。通过其他方法如显微投影、显微镜注射、电穿孔、聚乙二醇等来转化植物不需要第二质粒载体。

通常，植物转化方法涉及将异源DNA转移到靶植物细胞中(例如未成熟或成熟的胚、悬浮培养物、未分化的愈伤组织、原生质体等)，随后施用最大阈值水平的适当选择(取决于选择性标记基因)以从一组未转化的细胞群中回收经转化的植物细胞。在将异源外源DNA整合到植物细胞中之后，然后在培养基中施用最大阈值水平的适当选择以杀死未转化的细胞，并通过定期转移到新鲜培养基中来分离并增殖从所述选择处理中存活的推定经转化的细胞。通过连续传代和使用合适的选择进行攻击，识别并增殖了所述用所述质粒载体转化的细胞。然后，可以使用分子和生物化学的方法来证实整合到所述转基因植物的基因组中的目的异源基因的存在。

典型地将外植体转移到新鲜供应的相同培养基中并将其常规培养。随后，在被置于补充有最大阈值水平的选择剂的再生培养基上之后，所述经转化的细胞分化成芽。然后将所述芽转移到用于回收已生根的芽或小植物的选择性生根培养基上。然后转基因的小植株成长为成熟植物并产生稔性种子(例如Hiei等人，(1994)The Plant Journal6：271-282；Ishida等人，(1996)Nature Biotechnology[自然生物技术]14：745-750)。典型地将外植体转移到新鲜供应的相同培养基中并将其常规培养。用于生产转基因植物的技术和方法的一般描述发现于以下文献中：Ayres和Park，(1994)Critical Reviews in Plant Science[植物科学评论]13：219-239以及Bommineni和Jauhar，(1997)Maydica[美迪卡杂志]42：107-120。由于经转化的材料含有许多细胞；所以在受试的靶愈伤组织或组织或细胞群的任何部分中同时存在经转化细胞和未转化细胞。杀死未转化细胞并允许经转化细胞增殖的能力产生经转化植物培养物。通常，去除未转化细胞的能力限制经转化植物细胞的快速恢复和转基因植物的成功生成。

可依据常规方式将已转化的细胞培育成植株。参见，例如，McCormick等人，(1986)Plant Cell Reports[植物细胞报告]5：81-84。然后可以培育这些植株，并用相同的经转化株系或者不同的株系授粉，并鉴定出具有所需表型特征的组成型或诱导型表达的所得杂交体。可以培育两代或更多代，以确保所需表型特征的表达稳定地保持并遗传，并且然后收获种子以确保已经实现了所需表型特征的表达。

可以通过使植物与病毒或者病毒核酸接触而向植物提供实施例的核苷酸构建体。通常，此类方法涉及将目的核苷酸构建体掺入病毒DNA或RNA分子内。应当认识到，可以最初将所述实施例的重组蛋白合成为病毒多蛋白的一部分，然后可以在体内或在体外通过蛋白水解加工以产生所需的IPD121多肽。还当认识到，包含实施例的IPD121多肽的至少一部分氨基酸序列的这种病毒多蛋白可具有所需的杀有害生物活性。此类病毒多蛋白和编码它们的核苷酸序列涵盖在所述实施例中。为植物提供核苷酸构建体并在植物中产生编码的蛋白的方法是本领域已知的，其涉及病毒DNA或RNA分子。参见例如美国专利号5,889,191；5,889,190；5,866,785；5,589,367和5,316,931。

用于转化叶绿体的方法是本领域已知的。参见例如，Svab等人，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]87：8526-8530；Svab和Maliga，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]90：913-917；Svab和Maliga，(1993)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12：601-606。所述方法依赖于粒子枪递送含有选择性标记的DNA和通过同源重组将DNA靶向质体基因组。另外，通过利用核编码的和质体导向的RNA合酶的组织偏好性表达，通过反式激活沉默的质体携带的转基因，实现质体转化。这种系统已被报道于以下文献中：McBride等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]91：7301-7305。

所述实施例进一步涉及实施例的经转化植物的植物繁殖材料，包括但不限于种子、块茎、球茎、鳞茎、叶以及根和芽的插条。

所述实施例可用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。目的植物的实例包括但不限于玉米(corn，Zea mays)，芸苔属(Brassica)物种(例如，甘蓝型油菜(B.napus)、芜菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea))(特别是可用作种子油来源的那些芸苔属物种)，苜蓿(紫花苜蓿(Medicago sativa))，水稻(rice，Oryza sativa)，黑麦(rye，Secale cereale)，高粱(sorghum，Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)，粟(例如，珍珠粟(pearl millet，Pennisetum glaucum)、黍(proso millet，Panicum miliaceum)、谷子(foxtail millet，Setaria italica)、龙爪稷(finger millet，Eleusine coracana))，向日葵(sunflower，Helianthus annuus)，红花(safflower，Carthamus tinctorius)，小麦(wheat，Triticum aestivum)，大豆(soybean，Glycine max)，烟草(tobacco，Nicotianatabacum)，马铃薯(potato，Solanum tuberosum)，花生(peanut，Arachis hypogaea)，棉花(海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))，甘薯(番薯(Ipomoeabatatas))，木薯(cassava，Manihot esculenta)，咖啡(咖啡属(Coffea)物种)，椰子(coconut，Cocos nucifera)，菠萝(pineapple，Ananas comosus)，柑橘树(柑橘属(Citrus)物种)，可可(cocoa，Theobroma cacao)，茶树(tea，Camellia sinensis)，香蕉(芭蕉属(Musa)物种)，鳄梨(avocado，Persea americana)，无花果(fig，Ficus casica)，番石榴(guava，Psidium guajava)，芒果(mango，Mangifera indica)，橄榄(olive，Oleaeuropaea)，木瓜(番木瓜(Carica papaya))，腰果(cashew，Anacardium occidentale)，澳洲坚果(macadamia，Macadamia integrifolia)，巴旦杏(almond，Prunus amygdalus)，甜菜(sugar beets，Beta vulgaris)，甘蔗(甘蔗属(Saccharum)物种)，燕麦，大麦，蔬菜，观赏植物和针叶树。

蔬菜包括番茄(tomatoes，Lycopersicon esculentum)、莴苣(例如，莴苣(Lactucasativa))、青豆(菜豆(Phaseolus vulgaris))、利马豆(lima bean，Phaseolus limensis)、豌豆(香豌豆属(Lathyrus)物种)和黄瓜属的成员例如黄瓜(cucumber，C.sativus)、香瓜(cantaloupe，C.cantalupensis)和甜瓜(musk melon，C.melo)。观赏植物包括杜鹃(杜鹃花属(Rhododendron)物种)、绣球花(hydrangea，Macrophylla hydrangea)、木槿(hibiscus，Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(蔷薇属(Rosa)物种)、郁金香(郁金香属(Tulipa)物种)、水仙(水仙属(Narcissus)物种)、矮牵牛(petunias，Petunia hybrida)、康乃馨(carnation，Dianthus caryophyllus)、一品红(poinsettia，Euphorbia pulcherrima)和菊花。可以用于实践实施例的针叶树包括例如，松树如火炬松(loblolly pine，Pinus taeda)、湿地松(slash pine，Pinus elliotii)、杰克松(西黄松(Pinus ponderosa))、黑松(小干松(Pinuscontorta))以及蒙特利松树(辐射松(Pinus radiata))；花旗松(Douglas-fir，Pseudotsuga menziesii)；美国西部铁杉(加拿大铁杉(Tsuga canadensis))；美国西加云杉(白云杉(Picea glauca))；红杉(北美红杉(Sequoia sempervirens))；冷杉如银杉(温哥华冷杉(Abies amabilis))和香脂冷杉(加拿大胶杉(Abies balsamea))；以及雪松，如美国西部侧柏(北美香柏(Thuja plicata))以及阿拉斯加黄杉(Alaska yellow-cedar)(黄扁柏(Chamaecyparis nootkatensis))。所述实施例的植物包括作物植物(例如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔属、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、粟、烟草等)，例如玉米和大豆植物。

草皮草包括但不限于：一年生早熟禾(annual bluegrass，Poa annua)；一年生黑麦草(黑麦草(Lolium multiflorum))；加拿大早熟禾(Canada bluegrass，Poacompressa)；紫羊茅(Chewing’s fescue，Festuca rubra)；细弱翦股颖(colonialbentgrass，Agrostis tenuis)；匍匐翦股颖(creeping bentgrass，Agrostis palustris)；沙生冰草(crested wheatgrass，Agropyron desertorum)；扁穗冰草(fairwaywheatgrass，Agropyron cristatum)；硬羊茅(长叶羊茅(Festuca longifolia))；草地早熟禾(Kentucky bluegrass，Poa pratensis)；鸭茅(orchardgrass，Dactylis glomerata)；多年生黑麦草(perennial ryegrass，Lolium perenne)；红狐茅(紫羊茅(Festuca rubra))；小糠草(redtop，Agrostis alba)；粗茎早熟禾(rough bluegrass，Poa trivialis)；羊茅(sheep fescue，Festuca ovina)；无芒雀麦(smooth bromegrass，Bromus inermis)；高羊茅(tall fescue，Festuca arundinacea)；梯牧草(timothy，Phleum pratense)；绒毛剪股颖(velvet bentgrass，Agrostis canina)；碱茅(weeping alkaligrass，Puccinelliadistans)；蓝茎冰草(western wheatgrass，Agropyron smithii)；狗牙根(狗牙根属(Cynodon)物种)；圣奥古斯丁草(St.Augustine grass，Stenotaphrum secundatum)；结缕草(结缕属(Zoysia)物种)；百喜草(Bahia grass，Paspalum notatum)；地毯草(carpetgrass，Axonopus affinis)；假俭草(centipede grass，Eremochloa ophiuroides)；隐花狼尾草(kikuyu grass，Pennisetum clandesinum)；海滨雀稗(seashore paspalum，Paspalumvaginatum)；格兰马草(blue gramma，Bouteloua gracilis)；野牛草(buffalo grass，Buchloe dactyloids)；垂穗草(sideoats gramma，Bouteloua curtipendula)。

目的植物包括提供目的种子的谷物类植物、油料种子植物和豆科植物。目的种子包括谷物种子，例如玉米、小麦、大麦、稻、高粱、黑麦、粟等。油料种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔属、玉蜀黍、苜蓿、棕榈、椰子、亚麻、蓖麻、橄榄等。豆科植物包括豆类和豌豆。豆类包括瓜耳豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等。

在将异源外源DNA引入植物细胞后，通过各种方法(例如分析与已整合的基因相关的核酸、蛋白质和代谢物)证实异源基因在所述植物基因组中的转化或整合。

PCR分析是移植到土壤中之前在早期阶段筛选转化的细胞、组织或芽中存在并入的基因的快速方法(Sambrook和Russell，(2001)Molecular Cloning：A LaboratoryManual.[分子克隆：实验手册]Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社]，Cold Spring Harbor[冷泉港]，NY[纽约州])。使用对目的基因或农杆菌属载体背景等具有特异性的寡核苷酸引物进行PCR。

植物转化可以通过基因DNA印迹分析来证实(Sambrook和Russell，(2001)，同上)。在RNA印迹分析中，从转化体的特定组织中分离RNA，在甲醛琼脂凝胶中进行分级，并根据本领域常规使用的标准程序将其印迹到尼龙过滤器上(Sambrook和Russell，(2001)，同上)。然后通过本领域已知的方法通过将所述过滤器与来自杀有害生物基因的放射性探针杂交来测试由所述杀有害生物基因编码的RNA的表达(Sambrook和Russell，(2001)同上)。可以对转基因植物进行蛋白质印迹、生物化学测定等，以通过标准程序(Sambrook和Russell，2001，同上)使用与IPD121多肽上存在的一个或多个表位结合的抗体来证实由杀有害生物基因所编码的蛋白质的存在。

将基因组编辑技术引入植物的方法

在一些实施例中，可以使用基因组编辑技术将所公开的IPD121多核苷酸组合物引入植物的基因组中，或者可以使用基因组编辑技术编辑植物基因组中先前引入的IPD121多核苷酸。例如，可以通过使用双链断裂技术(如TALEN、大范围核酸酶、锌指核酸酶、CRISPR-Cas等)将公开的多核苷酸引入植物基因组中需要的位置上。例如，为了位点特异性插入的目的，可以使用CRISPR-Cas系统将所公开的多核苷酸引入基因组中需要的位置上。植物基因组中需要的位置可以是任何对于插入来说需要的靶位点，例如适于育种的基因组区域，或者可以是位于具有现有的目的性状的基因组窗口中的靶位点。现有的目的性状可能是内生性状或先前引入的性状。

在一些实施例中，在将所公开的IPD121多核苷酸先前已经引入到基因组中的情况下，可以使用基因组编辑技术来改变或修饰引入的多核苷酸序列。可以将位点特异性修饰引入所公开的IPD121多核苷酸组合物中，所述位点特异性修饰包括使用用于引入位点特异性修饰的任何方法产生的修饰，所述方法包括但不限于通过使用基因修复寡核苷酸(例如美国公开2013/0019349)，或通过使用双链断裂技术，如TALEN、大范围核酸酶、锌指核酸酶、CRISPR-Cas等。此类技术可用于通过在引入的多核苷酸内的核苷酸的插入、缺失或取代来修饰先前引入的多核苷酸。可替代地，可以使用双链断裂技术向引入的多核苷酸中添加另外的核苷酸序列。可以添加的另外的序列包括另外的表达元件(例如增强子序列和启动子序列)。在另一个实施例中，基因组编辑技术可用于在植物的基因组内将另外的杀昆虫活性蛋白定位在本文公开的IPD121多核苷酸组合物附近，以产生杀昆虫活性蛋白的分子堆叠物。

“改变的靶位点”、“改变的靶序列”、“修饰的靶位点”和“修饰的靶序列”在本文中可互换地使用，并且意指如本文公开的靶序列，当与未改变的靶序列相比时，所述靶序列包含至少一个改变。此类“改变”包括，例如：(i)至少一个核苷酸的替代、(ii)至少一个核苷酸的缺失、(iii)至少一个核苷酸的插入、或(iv)(i)-(iii)的任何组合。

转基因植物中性状的堆叠

转基因植物可以包含本文公开的一种或多种杀昆虫多核苷酸与一种或多种另外的多核苷酸的堆叠件，导致多个多肽序列的产生或抑制。包含多核苷酸序列堆叠的转基因植物可以通过传统育种方法或通过遗传工程方法中的一种或两种获得。这些方法包含但不限于：育种各自包含目的多核苷酸的单个系，用随后的基因转化包含本文公开的基因的转基因植物，并将基因共转化为单个植物细胞。如本文所用的，术语“堆叠”包括使多个性状在同一植物中存在(即，将两个性状并入核基因组中，将一个性状并入核基因组中，并且将一个性状并入质体的基因组中，或者这两种性状都被并入质体的基因组中)。在一个非限制性实例中，“堆叠性状”包括其中序列在物理上彼此相邻的分子堆叠物。如本文所用的性状是指源自特定序列或序列组群的表型。可以使用包含多个基因或在多个载体上分别携带的基因的单一转化载体进行基因的共转化。如果通过遗传转化植物来堆叠序列，则目的多核苷酸序列可以在任意时间并以任意顺序组合。可以用共转化方案将所述性状与转化盒的任何组合所提供的目的多核苷酸一起引入。例如，若引入两个序列，则这两个序列可包含在分开的转化盒(反式)或包含在同一个转化盒(顺式)中。所述序列的表达可以通过相同的启动子或通过不同的启动子驱动。在某些情况下，可能所希望的是引入将抑制目的多核苷酸的表达的转化盒。这可以与其他抑制盒或过度表达盒的任何组合进行组合以在所述植物中产生所需性状组合。进一步应当认识到，可以使用位点特异重组系统在所需的基因组位置堆叠多核苷酸序列。参见，例如，WO 1999/25821、WO 1999/25854、WO 1999/25840、WO 1999/25855和WO 1999/25853，其全部通过引用并入本文。

在一些实施例中，单独或与一种或多种另外的昆虫抗性性状堆叠的编码本文公开的IPD121多肽的多核苷酸中的一种或多种可以与一种或多种另外的输入性状(例如，除草剂抗性、真菌抗性、病毒抗性、胁迫耐受性、抗病性、雄性不育性、茎强度等)或输出性状(例如，增加的产量、改性淀粉、改善的油特性、平衡的氨基酸、高赖氨酸或甲硫氨酸、增加的消化性、改善的纤维品质、抗旱性等)堆叠。因此，多核苷酸实施例可用于提供具有灵活地且成本有效地控制任何数量的农艺有害生物的能力的经改善的作物品质的完整农艺学方案。

可用于堆叠的转基因包括但不限于：赋予除草剂抗性的转基因；赋予或贡献于改变的谷物特征的转基因；控制雄性不育的基因；创建用于位点特异性DNA整合的位点的基因；影响非生物胁迫抗性的基因；赋予增加的产量的基因；赋予植物可消化性的基因；以及赋予昆虫抗性或抗病性的转基因。

赋予昆虫抗性的转基因的实例包括编码苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)蛋白质、其衍生物或其上建模的合成多肽的基因。参见，例如，Geiser等人，(1986)Gene[基因]48：109，其公开了Btδ-内毒素基因的克隆和核苷酸序列。此外，编码δ-内毒素基因的DNA分子可购自美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)(美国马里兰州罗克韦尔市(Rockville，Md.))，例如登录号40098、67136、31995和31998下。经遗传工程化的苏云金芽孢杆菌转基因的其他非限制性实例在以下专利和专利申请中给出：美国专利号5,188,960；5,689,052；5,880,275；5,986,177；6,023,013、6,060,594、6,063,597、6,077,824、6,620,988、6,642,030、6,713,259、6,893,826、7,105,332；7,179,965、7,208,474；7,227,056、7,288,643、7,323,556、7,329,736、7,449,552、7,468,278、7,510,878、7,521,235、7,544,862、7,605,304、7,696,412、7,629,504、7,705,216、7,772,465、7,790,846、7,858,849和WO 1991/14778；WO 1999/31248；WO2001/12731；WO 1999/24581和WO 1997/40162。

也可以堆叠编码杀有害生物蛋白的基因，所述蛋白包括但不限于：来自假单胞菌属物种例如PSEEN3174(Monalysin，(2011)PLoS Pathogens[PLoS病原体]，7：1-13)、来自假单胞菌蛋白菌(Pseudomonas protegens)菌株CHA0和Pf-5(之前为荧光假单胞菌(fluorescens))(Pechy-Tarr，(2008)Environmental Microbiology[环境微生物学]10：2368-2386：基因库登录号EU400157)的杀昆虫蛋白；来自台湾假单胞菌(PseudomonasTaiwanensis)(Liu等人，(2010)J.Agric.Food Chem.[农业与食品化学杂志]，58：12343-12349)和来自假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcligenes)(Zhang等人，(2009)Annals of Microbiology[微生物学杂志]59：45-50和Li等人，(2007)Plant CellTiss.Organ Cult.[植物细胞，组织和器官培养杂志]89：159-168)的杀昆虫蛋白；来自发光杆菌属(Photorhabdus)物种和致病杆菌属(Xenorhabdus)物种的杀昆虫蛋白(Hinchliffe等人，(2010)The Open Toxinology Journal[开放毒素学杂志]3：101-118和Morgan等人，(2001)Applied and Envir.Micro.[应用与环境微生物学]67：2062-2069)、美国专利号6,048,838、和美国专利号6,379,946；美国专利公开US 20140007292的PIP-1多肽；美国专利公开US 20140033361的AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽；美国专利公开US 20140274885和US20160040184的PHI-4多肽；PCT公开号WO 2015/023846的PIP-47多肽、PCT公开号WO2015/038734的PIP-72多肽；PCT公开号WO 2015/120270的PtIP-50多肽和PtIP-65多肽；PCT公开号WO 2015/120276的PtIP-83多肽；PCT序列号PCT/US 15/55502的PtIP-96多肽；US序列号62/201977的IPD079多肽；US序列号62/269482的IPD082多肽；以及δ-内毒素，包括但不限于δ-内毒素基因和苏云金芽孢杆菌溶细胞性Cyt1和Cyt2基因的Cry1、Cry2、Cry3、Cry4、Cry5、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry10、Cry11、Cry12、Cry13、Cry14、Cry15、Cry16、Cry17、Cry18、Cry19、Cry20、Cry21、Cry22、Cry23、Cry24、Cry25、Cry26、Cry27、Cry28、Cry29、Cry30、Cry31、Cry32、Cry33、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry38、Cry39、Cry40、Cry41、Cry42、Cry43、Cry44、Cry45、Cry46、Cry47、Cry49、Cry50、Cry51、Cry52、Cry53、Cry54、Cry55、Cry56、Cry57、Cry58、Cry59、Cry60、Cry61、Cry62、Cry63、Cry64、Cry65、Cry66、Cry67、Cry68、Cry69、Cry70、Cry71、和Cry72类蛋白。这些类别的苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白的成员是本领域技术人员熟知的(参见，Crickmore等人，“Bacillus thuringiensistoxin nomenclature[苏云金茅孢杆菌毒素命名法]”(2011)，网址为lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/，其可以使用“www”前缀在万维网上访问)。

δ-内毒素的实例还包括但不限于美国专利号5,880,275和7,858,849的Cry1A蛋白；美国专利号8,304,604和8.304,605的DIG-3或DIG-11毒素(cry蛋白(如Cry1A)的α螺旋1和/或α螺旋2变体的N-末端缺失)，美国专利申请序列号10/525,318的Cry1B；美国专利号6,033,874的Cry1C；美国专利号5,188,960、6,218,188的Cry1F；美国专利号7,070,982、6,962,705和6,713,063的Cry1A/F嵌合体)；美国专利号7,064,249的Cry2蛋白如Cry2Ab蛋白；Cry3A蛋白，包括但不限于通过融合至少两种不同Cry蛋白的可变区和保守区的独特组合产生的工程化杂合杀昆虫蛋白(eHIP)(美国专利申请公开号2010/0017914)；Cry4蛋白；Cry5蛋白；Cry6蛋白；美国专利号7,329,736、7,449,552、7,803,943、7,476,781、7,105,332、7,378,499和7,462,760的Cry8蛋白；Cry9蛋白，如Cry9A、Cry9B、Cry9C、Cry9D、Cry9E、和Cry9F家族的成员；Cry15蛋白，描述于Naimov等人，(2008)Applied and EnvironmentalMicrobiology[应用与环境微生物学]74：7145-7151中；美国专利号6,127,180、6,624,145和6,340,593的Cry22、Cry34Ab1蛋白；美国专利号6,248,535、6,326,351、6,399,330、6,949,626、7,385,107和7,504,229的CryET33和CryET34蛋白；美国专利公开号2006/0191034、2012/0278954，和PCT公开号WO 2012/139004的CryET33和CryET34同源物；美国专利号6,083,499、6,548,291和6,340,593的Cry35Ab1蛋白；Cry46蛋白、Cry51蛋白、Cry双元毒素；TIC901或相关毒素；US 2008/0295207的TIC807；PCT US 2006/033867的ET29、ET37、TIC809、TIC810、TIC812、TIC127、TIC128；美国专利号8,236,757的AXMI-027、AXMI-036和AXMI-038；US 7,923,602的AXMI-031、AXMI-039、AXMI-040、AXMI-049；WO 2006/083891的AXMI-018、AXMI-020和AXMI-021；WO 2005/038032的AXMI-010；WO 2005/021585的AXMI-003；US 2004/0250311的AXMI-008；US 2004/0216186的AXMI-006；US 2004/0210965的AXMI-007；US 2004/0210964的AXMI-009；US 2004/0197917的AXMI-014；US 2004/0197916的AXMI-004；WO 2006/119457的AXMI-028和AXMI-029；WO 2004/074462的AXMI-007、AXMI-008、AXMI-0080rf2、AXMI-009、AXMI-014和AXMI-004；美国专利号8,084,416的AXMI-150；US20110023184的AXMI-205；US 2011/0263488的AXMI-011、AXMI-012、AXMI-013、AXMI-015、AXMI-019、AXMI-044、AXMI-037、AXMI-043、AXMI-033、AXMI-034、AXMI-022、AXMI-023、AXMI-041、AXMI-063、和AXMI-064；US 2010/0197592的AXMI-R1和相关蛋白；WO 2011/103248的AXMI221Z、AXMI222z、AXMI223z、AXMI224z和AXMI225z；WO11/103247的AXMI218、AXMI219、AXMI220、AXMI226、AXMI227、AXMI228、AXMI229、AXMI230、和AXMI231；美国专利号8,334,431的AXMI-115、AXMI-113、AXMI-005、AXMI-163和AXMI-184；US 2010/0298211的AXMI-001、AXMI-002、AXMI-030、AXMI-035、和AXMI-045；US2009/0144852的AXMI-066和AXMI-076；美国专利号8,318,900的AXMI128、AXMI130、AXMI131、AXMI133、AXMI140、AXMI141、AXMI142、AXMI143、AXMI144、AXMI146、AXMI148、AXMI149、AXMI152、AXMI153、AXMI154、AXMI155、AXMI156、AXMI157、AXMI158、AXMI162、AXMI165、AXMI166、AXMI167、AXMI168、AXMI169、AXMI170、AXMI171、AXMI172、AXMI173、AXMI174、AXMI175、AXMI176、AXMI177、AXMI178、AXMI179、AXMI180、AXMI181、AXMI182、AXMI185、AXMI186、AXMI187、AXMI188、AXMI189；US2010/0005543的AXMI079、AXMI080、AXMI081、AXMI082、AXMI091、AXMI092、AXMI096、AXMI097、AXMI098、AXMI099、AXMI100、AXMI101、AXMI102、AXMI103、AXMI104、AXMI107、AXMI108、AXMI109、AXMI110、AXMI111、AXMI112、AXMI114、AXMI116、AXMI117、AXMI118、AXMI119、AXMI120、AXMI121、AXMI122、AXMI123、AXMI124、AXMI1257、AXMI1268、AXMI127、AXMI129、AXMI164、AXMI151、AXMI161、AXMI183、AXMI132、AXMI138、AXMI137；和美国专利号8,319,019的具有修饰的蛋白水解位点的Cry蛋白如Cry1A和Cry3A；以及美国专利申请公开号2011/0064710的来自苏云金芽孢杆菌菌株VBTS 2528的Cry1Ac、Cry2Aa和Cry1Ca毒素蛋白。其他Cry蛋白是本领域技术人员熟知的(参见Crickmore等人，“Bacillusthuringiensis toxin nomenclature[苏云金芽孢杆菌毒素命名法]”(2011)，网址为lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/，其可以使用“www”前缀在万维网上访问)。Cry蛋白的杀昆虫活性是本领域技术人员所熟知的(综述参见van Frannkenhuyzen，(2009)J.Invert.Path.[无脊椎动物病理学杂志]101：1-16)。使用Cry蛋白作为转基因植物性状是本领域技术人员所熟知的，并且Cry转基因植物(包括但不限于Cry1Ac、Cry1Ac+Cry2Ab、Cry1Ab、Cry1A.105、Cry1F、Cry1Fa2、Cry1F+Cry1Ac、Cry2Ab、Cry3A、mCry3A、Cry3Bb1、Cry34Ab1、Cry35Ab1、Vip3A、mCry3A、Cry9c和CBI-Bt)已获得监管部门的批准(参见，Sanahuja，(2011)Plant Biotech Journal[植物生物技术杂志]9：283-300和CERA(2010)转基因作物数据库环境风险评估中心(CERA)(GM Crop Database Center forEnvironmental Risk Assessment)，ILSI研究基金会，华盛顿特区，网址为cera-gmc.org/index.php？action＝gm_crop_database，其可以使用“www”前缀在万维网上访问)。本领域技术人员熟知的多于一种杀有害生物蛋白也可以在植物中表达，所述杀有害生物蛋白如Vip3Ab和Cry1Fa(US 2012/0317682)、Cry1BE和Cry1F(US 2012/0311746)、Cry1CA和Cry1AB(US 2012/0311745)、Cry1F和CryCa(US 2012/0317681)、Cry1DA和Cry1BE(US 2012/0331590)、Cry1DA和Cry1Fa(US 2012/0331589)、Cry1AB和Cry1BE(US 2012/0324606)、以及Cry1Fa和Cry2Aa、Cry1I或Cry1E(US 2012/0324605)。杀有害生物蛋白还包括杀昆虫脂肪酶，所述杀昆虫脂肪酶包括美国专利号7,491,869的脂质酰基水解酶，和胆固醇氧化酶，如来自链霉菌属(Streptomyces)(Purcell等人(1993)Biochem Biophys Res Commun[生物化学与生物物理学研究通讯]15：1406-1413)。杀有害生物蛋白还包括美国专利号5,877,012、6,107,279、6,137,033、7,244,820、7,615,686和8,237,020中的VIP(营养性杀昆虫蛋白)毒素等。其他VIP蛋白质是本领域技术人员熟知的(参见，lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html，其可以使用“www”前缀在万维网上访问)。杀有害生物蛋白还包括可从如下生物体获得的毒素复合物(TC)蛋白质：致病杆菌属、发光杆菌属和类芽孢杆菌属(Paenibacillus)(参见美国专利号7,491,698和8,084,418)。一些TC蛋白具有“独立”杀昆虫活性并且其他TC蛋白增强由相同给定生物体产生的独立毒素(stand-alone toxin)的活性。可以通过源自不同属的来源生物体的一种或多种TC蛋白“增效剂”来增强“独立”TC蛋白(例如来自发光杆菌属、致病杆菌属或类芽孢杆菌属)的毒性。有三种主要类型的TC蛋白。如本文所提及的，A类蛋白(“蛋白A”)是独立毒素。B类蛋白(“蛋白B”)和C类蛋白(“蛋白C”)提高了A类蛋白的毒性。A类蛋白的实例是TcbA、TcdA、XptA1和XptA2。B类蛋白的实例是TcaC、TcdB、XptB1Xb和XptC1Wi。C类蛋白的实例是TccC、XptC1Xb和XptB1Wi。杀有害生物蛋白还包括蜘蛛、蛇和蝎毒蛋白。蜘蛛肽的实例包括但不限于莱科毒素(lycotoxin)-1肽及其突变体(美国专利号8,334,366)。

赋予昆虫抗性的其他转基因可通过干扰核糖核酸(RNA)分子(通过RNA干扰)来下调靶基因在昆虫有害生物物种中的表达。RNA干扰是指由短干扰RNA(siRNA)介导的动物中序列特异性转录后基因沉默的过程(Fire等人，(1998)Nature[自然]391：806)。RNAi转基因可以包括但不限于下调靶基因在昆虫有害生物中的表达的dsRNA、siRNA、miRNA、iRNA、反义RNA或正义RNA分子的表达。PCT公开WO 2007/074405描述了抑制无脊椎动物有害生物(包括科罗拉多马铃薯甲虫)中靶基因表达的方法。PCT公开WO 2005/110068描述了抑制无脊椎动物有害生物(特别是包括西方玉米根虫)中靶基因表达的方法，所述方法作为控制昆虫侵染的手段。此外，PCT公开WO 2009/091864描述了用于抑制来自昆虫有害生物物种(包括来自草盲蝽(Lygus)属的有害生物)的靶基因的组合物和方法。

提供的RNAi转基因用于靶向液泡ATP酶H亚基的RNAi，可用于控制如美国专利申请公开号2012/0198586中所述的鞘翅目有害生物群体和侵染。PCT公开WO 2012/055982描述了抑制或下调编码以下的靶基因表达的核糖核酸(RNA或双链RNA)：昆虫核糖体蛋白，如核糖体蛋白L19、核糖体蛋白L40或核糖体蛋白S27A；昆虫蛋白酶体亚基，如Rpn6蛋白、Pros25、Rpn2蛋白、蛋白酶体β1亚基蛋白或Prosβ2蛋白；COPI囊泡的昆虫β-外被体、COPI囊泡的γ-外被体、COPI囊泡的β′-外被体蛋白或ζ-外被体；昆虫跨膜四蛋白(Tetraspanin)2A蛋白(推定的跨膜结构域蛋白)；属于肌动蛋白家族的昆虫蛋白，如肌动蛋白5C；昆虫泛素-5E蛋白；昆虫Sec23蛋白，其是参与细胞内蛋白质转运的GTP酶激活剂；涉及运动活性的作为非常规肌球蛋白的昆虫皱纹蛋白质；涉及核替代mRNA剪接调节的昆虫曲颈蛋白；昆虫囊泡H+-ATP酶G亚基蛋白和昆虫Tbp-1如Tat结合蛋白。PCT公开WO 2007/035650描述了抑制或下调编码Snf7的靶基因表达的核糖核酸(RNA或双链RNA)。美国专利申请公开2011/0054007描述了靶向RPS10的多核苷酸沉默元件。美国专利申请公开2014/0275208和US 2015/0257389描述了靶向RyanR和PAT3的多核苷酸沉默元件。PCT公开WO/2016/138106、WO 2016/060911、WO2016/060912、WO 2016/060913、和WO 2016/060914描述了靶向赋予对鞘翅目和半翅目有害生物的抗性的COPI外被体亚单位核酸分子的多核苷酸沉默元件。美国专利申请公开2012/029750、US 20120297501和2012/0322660描述了干扰核糖核酸(RNA或双链RNA)，所述干扰核糖核酸在被昆虫有害生物物种摄取时起作用以下调昆虫有害生物中靶基因的表达，其中所述RNA包含至少一个沉默元件，其中所述沉默元件是包含经退火的互补链的双链RNA区域，所述双链RNA区域的一条链包含或由如下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列至少部分地与靶基因中的靶标核苷酸序列互补。美国专利申请公开2012/0164205描述了干扰双链核糖核酸以抑制无脊椎动物有害生物的潜在靶标，包括：Chd3同源序列、β-微管蛋白同源序列、40kDa V-ATP酶同源序列、EF1α同源序列、26S蛋白质体亚基p28同源序列、保幼激素环氧化物酶水解酶同源序列、溶胀依赖氯通道蛋白同源序列、葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶蛋白同源序列、Act42A蛋白同源序列、ADP-核糖因子1同源序列、转录因子IIB蛋白同源序列、几丁质酶同源序列、泛素缀合酶同源序列、甘油醛-3-磷酸脱氢酶同源序列、泛素B同源序列、保幼激素酯酶同源物、和α微管蛋白同源序列。

在有害生物控制方面的用途

在有害生物控制或使其他生物体工程化中使用包含实施例的核酸序列或其变体的菌株作为杀有害生物剂的一般方法是本领域已知的。

可以选择已知占据一种或多种目的作物的“植物圈”(叶面、叶际、根围和/或根面)的微生物宿主。选择这些微生物以便能够在特定环境中与野生型微生物成功竞争，提供表达一种或多种IPD121多肽的基因的稳定的维持和表达，并且理想的是，增加对所述杀有害生物剂的保护使其不受环境降解和失活的影响。

可替代地，通过将异源基因引入细胞宿主中来产生IPD121多肽。异源基因的表达直接或间接地导致杀有害生物剂在细胞内产生和维持。然后，当将细胞应用于一种或多种靶标有害生物的环境中时，在延长所述细胞中所产生的毒素的活性的条件下处理这些细胞。所得产物保留所述毒素的毒性。然后可以根据常规技术配制这些天然包封的IPD121多肽，以施用于靶标有害生物所寄宿的环境(例如，土壤、水和植物的叶子)中。参见，例如EPA0192319及其中引用的参考文献。

杀有害生物组合物

在一些实施例中，活性成分能以组合物的形式施用并且可以与其他化合物同时或相继施用于需要处理的作物区域或植物。这些化合物可以是在单次施用所述制剂后允许长期对靶区域进行给予的肥料、除草剂、冷冻保护剂、表面活性剂、洗涤剂、杀有害生物肥皂、休眠油、聚合物和/或延时释放的或可生物降解的载体制剂。它们还可以是选择性除草剂、化学杀昆虫剂、杀病毒剂、杀微生物剂、杀变形虫剂、杀有害生物剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂或这些制品中的若干种的混合物，如果需要，与在制剂领域内通常使用的另外的农业上可接受的载体、表面活性剂或促进施用的佐剂一起。合适的载体和佐剂可以是固体或液体，并且对应于在制剂技术中常常采用的物质，例如天然的或再生的矿物质、溶剂、分散剂、润湿剂、增粘剂、粘合剂或肥料。类似地，制剂可以制备成可食用的“诱饵”或者塑成有害生物“陷阱”以允许靶标有害生物取食或摄取所述有害生物制剂。

施用含有由细菌菌株产生的一种或多种IPD121多肽中的至少一种的活性成分或农用化学组合物的方法包括叶子施用、种子包衣和土壤施用。施用次数和施用速度取决于相应有害生物侵染的强度。

可以将组合物配制成粉末、尘剂、丸剂、颗粒、喷雾、乳液、胶体、溶液等，并且可以通过干燥、冻干、匀浆、萃取、过滤、离心、沉降或浓缩包含所述多肽的细胞培养物等常规方法进行制备。在所有这类含有至少一种这样的杀有害生物多肽的组合物中，所述多肽能以按重量计从约1％至约99％的浓度存在。

可以通过本公开的方法在给定区域中杀灭鳞翅目、双翅目、异翅目、线虫、半翅目或鞘翅目有害生物或减少其数量，或者可以预防性地将其施用于环境区域以防止易感有害生物的侵染。优选地，所述有害生物摄入杀有害生物有效量的多肽或与其接触。如本文所用的，“杀有害生物有效量”是指能够对至少一种有害生物造成死亡或显著减少有害生物生长、取食或正常生理发育的杀有害生物剂的量。所述量将根据例如待控制的具体靶标有害生物，待处理的特定环境、地点、植物、作物或农业场所，环境条件以及杀有害生物有效的多肽组合物施用的方法、速率、浓度、稳定性和数量等因素而变化。制剂也可以根据气候条件、环境因素和/或施用频率和/或有害生物侵染的严重程度而变化。

可以通过用所需的农业上可接受的载体配制细菌细胞、晶体和/或孢子悬浮液或分离的蛋白组分来制备所需的杀有害生物剂组合物。可以在施用之前以适当方式(如冻干、冷冻干燥、干燥)或者在水性载体、培养基或合适的稀释剂(例如盐水或其他缓冲液)中配制所述组合物。配制的组合物可以是尘剂或颗粒状物质的形式或者在油(植物或矿物)或水或油/水乳液中的悬浮液或者作为可湿性粉剂或者与适用于农业应用的任何其他载体材料组合的形式。合适的农业载体可以是固体或液体，并且是本领域公知的。术语“农业上可接受的载体”涵盖通常用于杀有害生物剂制剂技术的所有佐剂、惰性组分、分散剂、表面活性剂、增粘剂、粘合剂等；这些是杀有害生物剂制剂技术人员所熟知的。制剂可以与一种或多种固体或液体佐剂混合，并通过各种方法(例如通过使用常规制剂技术将杀有害生物组合物与合适的佐剂均匀混合、共混和/或研磨)制备。美国专利号6,468,523中描述了合适的制剂和施用方法。还可以用一种或多种化学组合物处理植物，所述化学组合物包括一种或多种除草剂、杀昆虫剂或杀真菌剂。示例性化学组合物包括：果实/蔬菜除草剂：莠去津、除草定、敌草隆、草甘膦、利谷隆、嗪草酮、西玛津、氟乐灵、吡氟禾草灵、草铵膦、氯吡嘧磺隆Gowan、百草枯、戊炔草胺、烯禾啶、氟丙嘧草酯、氯吡嘧磺隆、茚嗪氟草胺(Indaziflam)；果实/蔬菜杀 昆虫剂：涕灭威、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuriengiensis)、甲萘威、克百威、毒死蜱、氯氰菊酯、溴氰菊酯、二嗪磷、马拉硫磷、阿维菌素、氟氯氰菊酯/β-氟氯氰菊酯、高氰戊菊酯、λ-氯氟氰菊酯、灭螨醌、联苯肼酯、甲氧虫酰肼、双苯氟脲、环虫酰肼、噻虫啉、呋虫胺、嘧螨酯、唑虫酰胺、噻虫胺、螺螨酯、γ-氯氟氰菊酯、螺甲螨酯、多杀菌素、氯虫酰胺、氰虫酰胺、Spinoteram、杀虫脲、螺虫乙酯、吡虫啉、氯虫双酰胺、硫双威、氰氟虫腙、氟啶虫胺腈、丁氟螨酯、Cyanopyrafen、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、Spinotoram、硫双威、氟啶虫酰胺、甲硫威、因灭汀-苯甲酸盐、茚虫威、噻唑磷、苯线磷、硫线磷、蚊蝇醚、苯丁锡、噻螨酮、灭多威、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮；果实/蔬菜杀真菌剂：多菌灵、百菌清、EBDC、硫、甲基硫菌灵、嘧菌酯、霜脲氰、氟啶胺、乙膦酸、异菌脲、醚菌酯、甲霜灵/精甲霜灵、肟菌酯、噻唑菌胺、丙森锌、肟菌酯、环酰菌胺、富马酸噁咪唑、氰霜唑、咪唑菌酮、苯酰菌胺、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯、环氟菌胺、啶酰菌胺；谷物除草剂：异丙隆、溴苯腈、碘苯腈、苯氧基类、氯磺隆、炔草酸、禾草灵、吡氟草胺、噁唑禾草灵、双氟磺草胺、氟草烟、甲磺隆、醚苯磺隆、氟酮磺隆、碘磺隆、丙苯磺隆、氟吡酰草胺、甲磺胺磺隆、氟丁酰草胺、唑啉草酯、酰嘧磺隆、噻吩磺隆甲基、苯磺隆、氟啶嘧磺隆、磺酰磺隆、磺酰草吡唑、甲氧磺草胺、氟噻草胺、肟草酮、吡咯磺隆；谷物杀真菌剂：多菌灵、百菌清、嘧菌酯、环唑醇、嘧菌环胺、丁苯吗啉、氟环唑、醚菌酯、喹氧灵、戊唑醇、肟菌酯、硅氟唑、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯、醚菌胺、丙硫菌唑、氟嘧菌酯；谷物杀昆虫剂：乐果、λ-氯氟氯菊酯、溴氯菊酯、α-氯氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、联苯菊酯、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、Clorphyriphos、甲胺磷、乙酰甲胺磷、抗蚜威、甲硫威；玉蜀黍除草剂：莠去津、甲草胺、溴苯腈、乙草胺、麦草畏、二氯吡啶酸、(S-)二甲酚草胺、草铵膦、草甘膦、异噁唑草酮、(S-)异丙甲草胺、甲基磺草酮、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、砜嘧磺隆、磺草酮、甲酰胺磺隆、苯吡唑草酮、环磺酮(Tembotrione)、嘧啶肟草醚、酮脲磺草吩酯、氟噻草胺、吡咯磺隆；玉蜀黍杀昆虫剂：克百威、毒死蜱、联苯菊酯、氟虫腈、吡虫啉、λ-氯氟氰菊酯、七氟菊酯、特丁硫磷、噻虫嗪、噻虫胺、螺甲螨酯、氯虫双酰胺、杀虫脲、氯虫酰胺、溴氰菊酯、硫双威、β-氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、联苯菊酯、虱螨脲、杀虫隆、七氟菊酯、嘧丙磷、乙虫腈、氰虫酰胺、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、阿维菌素、甲硫威、螺螨酯、螺虫乙酯；玉蜀黍杀真菌剂：种衣酯、福美双、丙硫菌唑、戊唑醇、肟菌酯；水稻除草剂：丁草胺、敌稗、四唑嘧磺隆、苄嘧磺隆、氰氟草酯、杀草隆、四唑酰草胺、唑吡嘧磺隆、苯噻草胺、去稗安、吡嘧磺隆、稗草畏、二氯喹啉酸、禾草丹、茚草酮、氟噻草胺、四唑酰草胺、氯吡嘧磺隆、去稗安、苯并双环酮、环酯草醚、五氟磺草胺、双草醚、丙炔噁草酮、乙氧嘧磺隆、丙草胺、甲基磺草酮、特呋三酮、噁草酮、噁唑禾草灵、吡丙醚；水稻杀昆虫剂：二嗪磷、杀螟硫磷、仲丁威、久效磷、丙硫克百威、噻嗪酮、呋虫胺、氟虫腈、吡虫啉、异丙威、噻虫啉、环虫酰肼、噻虫啉、呋虫胺、噻虫胺、乙虫腈、氯虫双酰胺、氯虫酰胺、溴氰菊酯、啶虫脒、噻虫嗪、氰虫酰胺、多杀菌素、Spinotoram、因灭汀-苯甲酸盐、氯氰菊酯、毒死蜱、杀螟丹、甲胺磷、醚菊酯、三唑磷、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、克百威、丙硫克百威；水稻 杀真菌剂：甲基硫菌灵、嘧菌酯、环丙酰菌胺、敌瘟磷、嘧菌腙、异稻瘟净、稻瘟灵、戊菌隆、噻菌灵、咯喹酮、三环唑、肟菌酯、双氯氰菌胺、氰菌胺、硅氟唑、噻酰菌胺；棉花除草剂：敌草隆、伏草隆、MSMA、乙氧氟草醚、扑草净、氟乐灵、唑草酮、烯草酮、吡氟禾草灵-丁基、草甘膦、达草灭、二甲戊乐灵、嘧硫草醚钠、三氟啶磺隆、得杀草、草铵膦、丙炔氟草胺、塞苯隆；棉花 杀昆虫剂：乙酰甲胺磷、涕灭威、毒死蜱、氯氰菊酯、溴氰菊酯、马拉硫磷、久效磷、阿维菌素、啶虫脒、因灭汀-苯甲酸盐、吡虫啉、茚虫威、λ-氯氟氰菊酯、多杀菌素、硫双威、γ-氯氟氰菊酯、螺甲螨酯、啶虫丙醚、氟啶虫酰胺、氯虫双酰胺、杀虫脲、氯虫酰胺、β-氟氯氰菊酯、螺虫乙酯、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、呋虫胺、氯虫双酰胺、氰虫酰胺、多杀菌素、Spinotoram、γ-氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、硫双威、阿维菌素、氟啶虫酰胺、啶虫丙醚、螺甲螨酯、氟啶虫胺腈、丙溴磷、三唑磷、硫丹；棉花杀真菌 剂：土菌灵、甲霜灵、喹硫磷；大豆除草剂：甲草胺、灭草松、氟乐灵、氯嘧磺隆-乙基、氯酯磺草胺、噁唑禾草灵、氟磺胺草醚、吡氟禾草灵、草甘膦、甲氧咪草烟、灭草喹、咪草烟、(S-)异丙甲草胺、嗪草酮、二甲戊乐灵、得杀草、草铵膦；大豆杀昆虫剂：λ-氯氟氰菊酯、灭多威、对硫磷、硫威(Thiocarb)、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、氯虫双酰胺、氯虫酰胺、氰虫酰胺、多杀菌素、Spinotoram、因灭汀-苯甲酸盐、氟虫腈、乙虫腈、溴氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、γ和λ氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、螺虫乙酯、螺螨酯、杀虫脲、氟啶虫酰胺、硫双威、β-氟氯氰菊酯；大豆杀真菌剂：嘧菌酯、环唑醇、氟环唑、粉唑醇、吡唑醚菌酯、戊唑醇、肟菌酯、丙硫菌唑、四氟醚唑；甜菜除草 剂：杀草敏、甜菜安、乙氧氟草黄、甜菜宁、野麦畏、二氯吡啶酸、吡氟禾草灵、环草定、苯嗪草酮、喹草酸、噻草酮、氟胺磺隆、得杀草、喹禾灵；甜菜杀昆虫剂：吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、溴氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、γ/λ氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、七氟菊酯、氯虫酰胺、氰虫酰胺、氟虫腈、克百威；低芥酸油菜除草剂：二氯吡啶酸、禾草灵、吡氟禾草灵、草铵膦、草甘膦、吡草胺、氟乐灵、胺苯磺隆、喹草酸、喹禾灵、烯草酮、得杀草；低芥酸油菜杀真菌剂：嘧菌酯、多菌灵、咯菌腈、异菌脲、丙氯灵、烯菌酮；低芥酸油菜杀昆虫剂：克百威、有机磷酸盐类、拟除虫菊酯、噻虫啉、溴氰菊酯、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、啶虫脒、呋虫胺、β-氟氯氰菊酯、γ以及λ氯氟氰菊酯、τ-氟氰胺菊酯、乙虫腈、多杀菌素、Spinotoram、氯虫双酰胺、氯虫酰胺、氰虫酰胺、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氯基]呋喃-2(5H)-酮。

在一些实施例中，除草剂是莠去津、除草定、敌草隆、氯磺隆、甲磺隆、噻吩磺隆甲基、苯磺隆、乙草胺、麦草畏、异噁唑草酮、烟嘧磺隆、砜嘧磺隆、嘧硫草醚钠、丙炔氟草胺、氯嘧磺隆-乙基、嗪草酮、喹禾灵、精-异丙甲草胺(S-metolachlor)、环己通(Hexazinne)或其组合。

在一些实施例中，杀昆虫剂是高氰戊菊酯、氯虫苯甲酰胺、灭多威、茚虫威、草氨酰或其组合。

杀有害生物和杀昆虫活性

“有害生物”包括但不限于：昆虫、真菌、细菌、线虫、螨、蜱等。昆虫有害生物包括选自以下各目的昆虫：鞘翅目、双翅目、膜翅目(Hymenoptera)、鳞翅目、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目、直翅目(Orthroptera)、缨翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、虱目(Anoplura)、蚤目(Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)等，特别是鳞翅目和鞘翅目。

本领域的技术人员会知道，不是所有的化合物均对所有有害生物同样有效。实施例的化合物显示针对昆虫有害生物的活性，其可以包括经济上重要的农艺学、森林、温室、苗圃观赏植物、食物和纤维，公共和动物健康，国内和商业结构，家庭和储存产品有害生物。

鳞翅目幼虫包括但不限于：夜蛾科(Noctuidae)中的夜蛾、地老虎、尺蠖和实夜蛾亚科，草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda JE Smith)(秋夜蛾(fall armyworm))；甜菜夜蛾(S.exigua Hübner)(甜菜夜蛾(beet armyworm))；斜纹夜蛾(S.litura Fabricius)(斜纹夜蛾(tobacco cutworm)，茶蚕(cluster caterpillar))；蓓带夜蛾(Mamestraconfigurata Walker)(披肩粘虫(bertha armyworm))；甘蓝夜蛾(M.brassicae Linnaeus)(菜夜蛾(cabbage moth))；小地老虎(Agrotis ipsilon Hufhagel)(黑切根虫(blackcutworm))；西方灰地老虎(A.orthogonia Mortison)(西部切根虫(western cutworm))；粒肤地老虎(A.subterranea Fabricius)(粒肤切根虫(granulate cutworm))；棉叶波纹夜蛾(Alabama argillacea Hübner)(棉叶虫(cotton leaf worm))；粉纹夜蛾(Trichoplusiani Hübner)(甘蓝银纹夜蛾(cabbage looper))；大豆尺夜蛾(Pseudoplusia includensWalker)(大豆夜蛾(soybean looper))；梨豆夜蛾(黎豆夜蛾)；粗长须夜蛾(Hypena scabraFabricius)(苜猜绿夜蛾(green cloverworm))；烟芽夜蛾(Heliothis virescensFabricius)(烟青虫(tobacco budworm))；一星黏虫(Pseudaletia unipuncta Haworth)(夜蛾)；粗皮委夜蛾(Athetis mindara Barnes and Mcdunnough)(粗皮切根虫(roughskinned cutworm))；暗缘地老虎(Euxoa messoria Harris)(暗黑切根虫(darksidedcutworm))；棉斑实蛾(Earias insulana Boisduval)(多刺螟蛉(spiny bollworm))；翠纹钻夜蛾(E.vittella Fabricius)(斑点螟蛉(spotted bollworm))；棉铃虫(Helicoverpaarmigera Hübner)(美洲螟蛉(American bollworm))；玉米穗虫(玉米穗蛾(corn earworm)或棉螟蛉(cotton bollworm))；斑马纹夜蛾(Melanchra picta Harris)(斑马纹夜蛾(zebra caterpillar))；柑橘夜蛾(Egira(Xylomyges)curialis Grote)(柑橘地老虎(citrus cutworm))；钻蛀虫、鞘蛾、结网毛虫、球果蛾；和来自螟蛾科(Pyralidae)玉米螟(Ostrinia nubilalis Hübner)(欧洲玉米螟)的雕叶虫(skeletonizers)；脐橙螟蛾(Amyelois transitella Walker)(脐橙螟(naval orangeworm))；地中海粉螟(Anagastakuehniella Zeller)(地中海粉斑螟(Mediterranean flour moth))；干果斑螟(Cadracautella Walker)(粉斑螟(almond moth))；二化螟(Chilo suppressalis Walker)(水稻螟虫(rice stem borer))；斑禾草螟(C.partellus)，(高粱螟(sorghum borer))；米螟(Corcyra cephalonica Stainton)(米蛾(rice moth))；玉米根草螟(Crambuscaliginosellus Clemens)(玉米根结网虫(corn root webworm))；早熟禾草螟(C.teterrellus Zincken)(早熟禾草螟(bluegrass webworm))；稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis Guenée)(稻纵卷叶螟(rice leaf roller))葡萄里予螟(Desmia funeralis Hübner)(葡萄野螟(grape leaffolder))；甜瓜绢野螟(Diaphaniahyalinata Linnaeus)(甜瓜野螟(melon worm))；黄瓜绢野螟(D.nitidalis Stoll)(泡菜虫(pickleworm))；巨座玉米螟(Diatraea grandiosella Dyar)(西南玉米秆草螟(southwestern corn borer))、蔗螟(D.saccharalis Fabricius)(甘蔗螟虫(surgarcaneborer))；墨西哥稻螟(Eoreuma loftini Dyar)(墨西哥稻螟(Mexican rice borer))；烟草粉斑螟(Ephestia elutella Hübner)(烟草飞蛾(tobacco(cacao)moth))；大蜡螟(Galleria mellonella Linnaeus)(大蜡蛾(greater wax moth))；水稻切叶野螟(Herpetogramma licarsisalis Walker)(草地螟(sod webworm))；向日葵同斑螟(Homoeosoma electellum Hulst)(向日葵螟(sunflower moth))；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus Zeller)(小玉米茎蛀虫(lesser cornstalk borer))；小蜡螟(Achroia grisella Fabricius)(小蜡蛾(lesser wax moth))；草地螟(Loxostegesticticalis Linnaeus)(草地螟(beet webworm))；茶树螟(Orthaga thyrisalis Walker)(茶树蛾(tea tree web moth))；豆英野螟(Maruca testulalis Geyer)(豆英蛀螟(beanpod borer))；印度谷螟(Plodia interpunctella Hübner)(印度谷螟(Indian mealmoth))；三化螟(Scirpophaga incertulas Walker)(三化螟(yellow stem borer))；温室螟(Udea rubigalis Guenée)(芹菜卷叶螟(celery leaftier))；和卷蛾科(Tortricidae)中的卷叶虫、蚜虫、种实虫以及果实虫，西部黑头长翅卷蛾(Acleris gloveranaWalsingham)(西部黑头蚜虫(Western blackheaded budworm))；东部黑头长翅卷蛾(A.variana Fernald)(东部黑头蚜虫(Eastern blackheaded budworm))；果树黄卷蛾(Archis argyrospila Walker)(果树卷叶蛾(fruit tree leaf roller))；罗萨娜黄卷蛾(A.rosana Linnaeus)(欧洲卷叶蛾(European leaf roller))；和其他黄卷蛾属物种，苹小卷叶蛾(Adoxophyes orana Fischer von )(苹果小卷蛾(summer fruittortrix moth))；条纹向日葵螟(Cochylis hospes Walsingham)(带状向日葵斑蛾(bandedsunflower moth))；榛小卷蛾(Cydia latiferreana Walsingham)(filbertworm)；苹果蠹蛾(C.pomonella Linnaeus)(苹果蚕蛾(codling moth))；杂色卷叶蛾(Platynotaflavedana Clemens)(色稻纵卷叶螟(variegated leafroller))；荷兰石竹小卷蛾(P.stultana Walsingham)(杂食卷叶蛾(omnivorous leafroller))；鲜食葡萄小卷蛾(Lobesia botrana Denis&Schiffermüller)(欧洲葡萄蛾(European grape vine moth))；苹白小卷蛾(Spilonota ocellana Denis&Schiffermüller)(苹果芽小卷叶蛾(eyespottedbud moth))；萄果实虫主虫(Endopiza viteana Clemens)(葡萄小卷叶蛾(grape berrymoth))；女贞细卷蛾(Eupoecilia ambiguella Hübner)(葡萄果蠹蛾(vine moth))；巴西苹果卷叶虫(Bonagota salubricola Meyrick)(巴西苹果小卷叶蛾(Brazilian appleleafroller))；东方果实蛾(Grapholita molesta Busck)(梨小食心虫(oriental fruitmoth))；向日葵芽蛾(Suleima helianthaha Riley)(向日葵芽蛾(sunflower bud moth))；带卷蛾属物种(Argyrotaenia spp.)；卷叶蛾属物种(Choristoneura spp.)。

鳞翅目中选择的其他农艺学有害生物包括但不限于秋星尺蠖(Alsophilapometaria Harris)(秋星尺蠖(fall cankerworm))；桃条麦蛾(Anarsia lineatellaZeller)(桃条麦蛾(peach twig borer))；栎橙纹犀额蛾(Anisota senatoria J.E.Smith)(橙色斑纹橡木虫(orange striped oakworm))；柞蚕(Antheraea pernyi Guérin-Méneville)(中橡木柞蚕虫(Chinese Oak Tussah Moth))；家蚕(Bombyx mori Linnaeus)(桑蚕(Silkworm))；棉潜蛾(Bucculatrix thurberiella Busck)(棉叶潜蛾(cotton leafperforator))；纹黄豆粉蝶(Colias eurytheme Boisduval)(苜蓿粉蝶(alfalfacaterpillar))；核桃舟蛾(Datana integerrima Grote&Robinson)(核桃天社蛾(walnutcaterpillar))；落叶松毛虫(Dendrolimus sibiricus Tschetwerikov)(西伯利亚蚕蛾(Siberian silk moth))，白尺蠖蛾(Ennomos subsignaria Hübner)(榆角尺蠖(elmspanworm))；菩提尺蠖(Erannis tiliaria Harris)(椴尺蠖(linden looper))；黄毒蛾(Euproctis chrysorrhoea Linnaeus)(棕尾毒蛾(browntail moth))；黑拟蛉蛾(Harrisina americana Guérin-Méneville)(野棉花夜蛾(grapeleaf skeletonizer))；牧草天蚕蛾(Hemileuca oliviae Cockrell)(牧草天蚕蛾(range caterpillar))；美国白蛾(Hyphantria cunea Drury)(美国白蛾(fall webworm))；番茄茎麦蛾(Keiferialycopersicella Walsingham)(番茄蛲虫(tomato pinworm))；东部铁杉尺蠖(Lambdinafiscellaria fiscellaria Hulst)(东部铁杉尺蠖(Eastern hemlock looper))；西部铁杉尺蠖(L.fiscellaria lugubrosa Hulst)(西部铁杉尺蠖(Western hemlock looper))；柳毒蛾(Leucoma salicis Linnaeus)(雪毒蛾(satin moth))；舞毒蛾(Lymantria disparLinnaeus)(舞毒蛾(gypsy moth))；番茄天蛾(Manduca quinquemaculata Haworth)(五点天蛾(five spotted hawk moth)，番茄天蛾(tomato hornworm))；烟草天蛾(M.sextaHaworth)(番茄天蛾(tomato hornworm)、烟草天蛾(tobacco hornworm))；冬尺蠖蛾(Operophtera brumata Linnaeus)(冬尺蠖蛾(winter moth))；春尺蠖(Paleacritavernata Peck)(春尺蠖(spring cankerworm))；美洲大芷凤蝶(Papilio cresphontesCramer)(大黄带凤蝶(giant swallowtail)，柑桔凤蝶(orange dog))；加州木角斗蛾(Phryganidia californica Packard)(加州槲蛾(California oakworm))；柑桔潜蛾(Phyllocnistis citrella Stainton)(柑桔潜叶蛾(citrus leafminer))；斑幕潜叶蛾(Phyllonorycter blancardella Fabricius)(斑点幕型潜叶虫(spotted tentiformleafminer))；欧洲粉蝶(Pieris brassicae Linnaeus)(大白粉蝶(large whitebutterfly))；菜青虫(P.rapae Linnaeus)(小白粉蝶(small white butterfly))；暗脉菜粉蝶(P.napi Linnaeus)(绿脉菜粉蝶(green veined white butterfly))；洋蓟葱羽蛾(Platyptilia carduidactyla Riley)(洋蓟羽蛾(artichoke plume moth))；小菜蛾(Plutella xylostella Linnaeus)(小菜蛾(diamondback moth))；棉红铃虫(Pectinophora gossypiella Saunders)(粉螟蛉(pink bollworm))；多形云粉蝶(Pontiaprotodice)(Boisduval和Leconte)(南方菜青虫(Southern cabbageworm))；杂食尺蠖(Sabulodes aegrotata Guenée)(杂食尺蠖(omnivorous looper))；红抚天社蛾(Schizuraconcinna J.E.Smith)(红疣天社蛾(red humped caterpillar))；麦蛾(Sitotrogacerealella Olivier)(麦蛾(Angoumois grain moth))；松异带蛾(Thaumetopoeapityocampa Schiffermuller)(松树列队毛虫(pine processionary caterpillar))；幕谷蛾(Tineola bisselliella Hummel)(负袋夜蛾(webbing clothesmoth))；番茄斑潜蝇(Tuta absoluta Meyrick)(番茄斑潜蝇(tomato leafminer))；苹果巢蛾(Yponomeutapadella Linnaeus)(巢蛾(ermine moth))；Heliothis subflexa Guenée；天幕毛虫属(Malacosoma)物种和古毒蛾属(Orgyia)物种。

引人关注的是鞘翅目的幼虫和成虫，包括来自长角象虫科(Anthribidae)、豆象科(Bruchidae)和象甲科(Curculionidae)的象鼻虫，包括但不限于：墨西哥棉铃象(Anthonomus grandis Boheman)(棉铃象甲(boll weevil))；稻水象甲(Lissorhoptrusoryzophilus Kuschel)(稻水象虫(rice water weeyil))；谷象(Sitophilus granariusLinnaeus)(谷象(granary weevil))；米象(S.oryzae Linnaeus)(米象(rice weevil))；三叶草叶象(Hypera punctata Fabricius)(车轴草叶象虫(clover leaf weevil))；密点细枝象(Cylindrocopturus adspersus LeConte)(向日葵茎象鼻虫(sunflower stemweevil))；黄褐小爪象(Smicronyx fulvus LeConte)(红葵花籽象甲(red sunflower seedweevil))；灰色小爪象(S.sordidus LeConte)(灰葵花籽象甲(gray sunflower seedweevil))；玉米隐啄象(Sphenophorus maidis Chittenden)(玉米象虫(maizebillbug)))；叶甲科(Chrysomelidae)的跳甲、黄瓜叶甲、根虫、叶甲、马铃薯叶甲以及潜叶虫，包括但不限于：马铃薯叶甲(Leptinotarsa decemlineata Say)(科罗拉多马铃薯甲虫)；玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgifera LeConte)(西方玉米根虫)；北方玉米根虫(D.barberi(Smith和Lawrence))(北方玉米根虫(northern corn rootworm))；黄瓜十一星叶甲食根亚种(D.undecimpunctata howardi Barber)(南方玉米根虫(southerncorn rootworm))；玉米铜色跳甲(Chaetocnema pulicaria Melsheimer)(玉米跳甲(cornflea beetle))；十字花科跳甲(Phyllotreta cruciferae Goeze)(十字花科蔬菜跳甲(Crueifer flea beetle))；黄曲条跳甲(Phyllotreta striolata)(黄曲条跳甲(strippedflea beetle))；肖叶甲褐斑(Colaspis brunnea Fabricius)(葡萄肖叶甲(grapecolaspis))；橙足负泥虫(Oulema melanopus Linnaeus)(谷叶甲虫(cereal leafbeetle))；向日葵叶甲(Zygogramma exclamationis Fabricius)(向日葵叶甲(sunflowerbeetle)))；来自飘虫科(Coccinellidae)的甲虫(包括但不限于：墨西哥豆甲虫(Epilachnavarivestis Mulsant)墨西哥豆瓢虫(Mexican bean beetle)))；金龟子和来自金龟子科(Scarabaeidae)的其他甲虫，包括但不限于：日本丽金龟(Popillia japonica Newman)(日本甲虫)；北方圆头犀金龟(Cyclocephala borealis Arrow)(北方独角仙(northernmasked chafer)，白蛴螬(white grub))；南方圆头犀金龟(C.immaculata Olivier)(南方独角仙(southern masked chafer)，白蛴螬(white grub))；欧洲切根鳃金龟(Rhizotrogusmajalis Razoumowsky)(欧洲金龟子(European chafer))；长毛食叶然金龟(Phyllophagacrinita Burmeister)(白蛴螬(white grub))；胡萝卜金龟(Ligyrus gibbosus De Geer)(胡萝卜金龟(carrot beetle)))；来自皮蠹科(Dermestidae)的红缘皮蠹(carpetbeetle)；来自叩甲科(Elateridae)、伪金针虫属物种(Eleodes spp.)、梳爪叩头虫属物种(Melanotus spp.)的金针虫；宽胸金针虫属物种(Conoderus spp.)；叩甲属物种(Limoniusspp.)；缺隆叩甲属物种(Agriotes spp.)；特尼塞拉属物种(Ctenicera spp.)；埃俄罗斯属物种(Aeolus spp.)；来自小蠹科(Scolytidae)的树皮甲虫和来自拟步甲科(Tenebrionidae)的甲虫。

引人关注的是双翅目的成虫和未成熟的虫，包括潜叶虫玉米斑潜蝇(Agromyzaparvicornis Loew)(玉米斑潜蝇(corn blotch leafminer))；摇蚊科(包括但不限于：高粱瘿蚊(Contarinia sorghicola Coquillett)(高粱瘿蚊(sorghum midge))；黑森瘿蚊(Mayetiola destructor Say)(黑森蝇(Hessian fly))；麦红吸浆虫(Sitodiplosismosellana Géhin)(小麦吸浆虫(wheat midge))；葵花籽蚊(Neolasiopteramurtfeldtiana Felt)(向日葵籽瘿蚊(sunflower seed midge))；果蝇(实蝇科(Tephritidae))、瑞典麦秆蝇(Oscinella frit Linnaeus)(果蝇(frit flies))；蛆虫(包括但不限于：灰地种蝇(Delia platura Meigen)(种蝇(seedcorn maggot))；麦地种蝇(D.coarctata Fallen)(麦种蝇(wheat bulb fly))和其他地种蝇属，美洲麦秆蝇(Meromyza americana Fitch)(美洲麦秆蝇(wheat stem maggot))；家蝇(Muscadomestica Linnaeus)(家蝇(house flies))；夏厕蝇(Fannia canicularis Linnaeus)、小舍蝇(F.femoralis Stein)(小家蝇(lesser houseflies))；厩螫蝇(Stomoxys calcitransLinnaeus)(螫蝇(stable flies))；秋家蝇，角蝇，绿头苍蝇，金蝇属物种(Chrysomyaspp.)；蝇属物种(Phormia spp.)；和其他麝香蝇(muscoid fly)有害生物、马蝇虻属物种(horse flies Tabanus spp.)；肤蝇胃蝇属物种(bot flies Gastrophilus spp.)；狂蝇属物种(Oestrus spp.)；纹皮蝇皮蝇属物种(cattle grubs Hypoderma spp.)；鹿蝇斑虻属物种(deer flies Chrysops spp.)；绵羊虱蝇(Melophagus ovinus Linnaeus)(绵羊蜱)和其他短角亚目(Brachycera)，蚊子伊蚊属物种(mosquitoes Aedes spp.)；疟蚊属物种(Anopheles spp.)；家蚊属物种(Culex spp.)；黑蝇原蚋属物种(black fliesProsimulium spp.)；蚋属物种(Simulium spp.)；吸血蠓、沙蝇、眼菌蚊(sciarid)和其他长角亚目(Nematocera)。

作为目的昆虫包括了半翅目和同翅目的成体和若虫，例如但不限于：来自球蚜科(Adelgidae)的球蚜、来自盲蝽科(Miridae)的盲蝽、来自蝉科(Cicadidae)的蝉、叶蝉、小绿叶蝉属物种(Empoasca spp.)；来自叶蝉科(Cicadellidae)的，来自菱蜡蝉科(Cixiidae)、青翅飞虱科(Flatidae)、蜡蝉总科(Fulgoroidea)、瓢蜡蝉科(Issidae)和(Delphacidae)的飞虱，来自角蝉科(Membracidae)的角蝉，来自木虱科(Psyllidae)的木虱，来自粉虱科(Aleyrodidae)的粉虱，来自蚜科(Aphididae)的蚜虫，来自根瘤蚜科(Phylloxeridae)的葡萄根瘤蚜，来自粉蚧科(Pseudococcidae)的粉蚧，来自链介壳虫科(Asterolecanidae)、蚧科(Coccidae)、粉蚧科(Dactylopiidae)、盾蚧科(Diaspididae)、绒蚧科(Eriococcidae)、旌介壳虫科(Ortheziidae)、刺葵介壳虫科(Phoenicococcidae)和绵蚧科(Margarodidae)的介壳虫，来自网蝽科的网蝽，来自蝽科(Pentatomidae)的椿象，长蝽(cinch bug)，土长蝽属物种(Blissus spp.)；和来自长蝽科(Lygaeidae)的其他籽长蝽、来自沫蝉科(Cercopidae)的沫蝉、来自缘蝽科(Coreidae)的南瓜缘蝽和来自红蝽科(Pyrrhocoridae)的秋恙螨和棉蝽。

来自半翅目的农业上的重要成员进一步包括但不限于：豌豆蚜(Acyrthisiphonpisum Harris)(豌豆蚜虫(pea aphid))；黑豆蚜(Aphis craccivora Koch)(蚕豆蚜(cowpea aphid))；黑豆蚜(A.fabae Scopoli)(蚕豆蚜(black bean aphid))；棉蚜(A.gossypii Glover)(棉蚜(cotton aphid)，瓜叶菊蚜虫(melon aphid))；玉米根蚜(A.maidiradicis Forbes，corn root aphid)；苹果黄蚜(A.pomi De Geer)(苹蚜(appleaphid))；绣线菊蚜(A.spiraecola Patch，spirea aphid)；茄粗额蚜(Aulacorthum solaniKaltenbach)(指顶花无网长管蚜(foxglove aphid))；草莓钉蚜(Chaetosiphonfragaefolii Cockerell)(草莓毛管蚜(strawberry aphid))；麦双尾蚜(Diuraphis noxiaKurdjumov/Mordvilko)(俄罗斯小麦蚜虫(Russian wheat aphid))；车前圆尾蚜(Dysaphisplantaginea Paaserini)(苹粉红劣蚜(rosy apple aphid))；苹果绵蚜(Eriosomalanigerum Hausmann，woolly apple aphid)；甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae Linnaeus)(菜蚜(cabbage aphid))；桃粉大尾蚜(Hyalopterus pruni Geoffroy)(桃大尾蚜(mealyplum aphid))；萝卜蚜(Lipaphis erysimi Kaltenbach，turnip aphid)；麦无网长管蚜(Metopolophium dirrhodum Walker)(麦蚜虫(cereal aphid))；马铃薯长管蚜(Macrosiphum euphorbiae Thomas)(马铃薯蚜(potato aphid))；桃蚜(Myzus persicaeSulzer，peach-potato aphid，green peach aphid))；莴苣衲长管蚜(Nasonoviaribisnigri Mosley)(莴苣蚜(lettuce aphid))；癭绵对属物种(Graptostethus spp.)(根蚜虫(root aphids)和倍蚜(gall aphids))；玉米蚜(Rhopalosiphum maidis Fitch，cornleaf aphid)；禾谷缢管蚜(R.padi Linnaeus，bird cherry-oat aphid)；麦二叉蚜(Schizaphis graminum Rondani，greenbug)；牛鞭草蚜(Sipha flava Forbes)(甘蔗黄蚜(yellow sugarcane aphid))；麦长管蚜(Sitobion avenae Fabricius，English grainaphid)；苜蓿斑蚜(Therioaphis maculata Buckton，spotted alfalfa aphid)；茶二叉蚜(Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe)(黑色柑橘蚜(black citrus aphid)和褐色橘蚜(T.citricida Kirkaldy)(桔二叉蚜(brown citrus aphid))；球属物种(Adelgesspp.)(球蚜(adelgids))；长山核桃根瘤蚜(Phylloxera devastatrix Pergande)(山胡桃根瘤蚜(pecan phylloxera))；烟粉虱(Bemisia tabaci Gennadius)(烟粉虱(tobaccowhitefly)，甘薯粉虱(sweetpotato whitefly))；银叶粉虱(B.argentifolii Bellows&Perring，silverleaf whitefly)；柑橘粉虱(Dialeurodes citri Ashmead)(柑桔粉虱(citrus whitefly))；结翅白粉虱(Trialeurodes abutiloneus)(带状翅白粉虱(bandedwinged whitefly)和温室粉虱(T.vaporariorum Westwood)(温室粉虱(greenhouse whitefly))；马铃薯小绿叶蝉(Empoasca fabae Harris)(马铃薯叶蝉(potato leafhopper))；灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallen，smaller brownplanthopper)；二点叶蝉(Macrolestes quadrilineatus Forbes)(紫菀叶蝉(asterleafhopper))；黑尾叶蝉(Nephotettix cinticeps Uhler)(绿叶蝉(green leafhopper))；二条斑黑尾叶蝉(N.nigropictus)(稻叶蝉(rice leafhopper))；褐飞虱(Nilaparvatalugensbrown planthopper)；玉米蜡蝉(Peregrinus maidis Ashmead)(玉米飞虱(corn planthopper))；白背飞虱(Sogatella furcifera Horvath，white-backedplanthopper)；稻条背飞虱(Sogatodes orizicola Muir)(稻飞虱(rice delphacid))；苹果白叶蝉(Typhlocyba pomaria McAtee)(苹白小叶蝉(white apple leafhopper))；葡萄斑叶蝉属物种(Erythroneoura spp.)(葡萄叶蝉(grape leafhoppers))；十七年蝉(Magicicada septendecim Linnaeus)(周期蝉(periodical cicada))；吹绵蚧(Iceryapurchasi Maskell，cottony cushion scale)；梨圆蚧(Quadraspidiotus perniciosusComstock，San Jose scale)；臀纹粉蚧(Planococcus citri Risso)(桔粉蚧(citrusmealybug))；粉蚧属物种(Pseudococcus spp.)(其他粉蚧系群)；梨木虱(Cacopsyllapyricola Foerster，pear psylla)；柿木虱(Trioza diospyri Ashmead，persimmonpsylla)。

来自半翅目的引人关注的农业上重要的物种包括但不限于：拟绿蝽(Acrosternumhilare Say)(稻绿蝽(green stink bug))；南瓜缘蝽(Anasa tristis De Geer)(南瓜虫(squash bug))；美洲谷长蝽(Blissus leucopterus leucopterus Say)(麦长蝽(chinchbug))；方翅网蝽(Corythuca gossypii Fabricius)(棉网蝽(cotton lace bug))；番茄蝽(Cyrtopeltis modesta Distant，tomato bug)；棉蝽(Dysdercus suturellus Herrich-)(棉红蝽(cotton stainer))；褐臭蝽(Euschistus servus Say，brown stinkbug)；一斑臭蝽(E.variolarius Palisot de Beauvois，one-spotted stink bug)；长蝽属物种(Graptostethus spp.)(果实蝽系群(complex of seed bugs))；松叶根蝽(Leptoglossus corculus Say，leaf-footed pine seed bug)；美洲牧草盲蝽(Lyguslineolaris Palisot de Beauvois)(牧草盲蝽(tarnished plant bug))；牧草盲蝽(L.Hesperus Knight)(西部牧草盲蝽(Western tarnished plant bug))；牧草盲蝽(L.pratensis Linnaeus，common meadow bug)；长毛草盲蝽(L.rugulipennis Poppius，European tarnished plant bug)；长绿盲蝽(Lygocoris pabulinus Linnaeus)(苹绿盲蝽(common green capsid))；稻绿蝽(Nezara viridula Linnaeus)(南方绿椿象(southerngreen stink bug))；美洲稻蝽(Oebalus pugnax Fabricius)(稻褐蝽(rice stink bug))；马利筋长蝽(Oncopeltus fasciatus Dallas)(大马利筋长蝽(large milkweed bug))；棉跳盲蝽(Pseudatomoscelis seriatus Reuter)(棉跳盲蝽(cotton fleahopper))。

此外，实施例可以对半翅目有效，如草莓蝽(Calocoris norvegicus Gmelin)(草莓长蝽(strawberry bug))；荒野奥盲蝽(Orthops campestris Linnaeus)；苹果盲蝽(Plesiocoris rugicollis Fallen)(苹盲蝽(apple capsid))；番茄蝽(Cyrtopeltismodestus Distant，tomato bug)；黑斑烟盲蝽(Cyrtopeltis notatus Distant)(吸蝇(suckfly))；白斑盲蝽(Spanagonicus albofasciatus Reuter，whitemarkedfleahopper)；皂英蝽(Diaphnocoris chlorionis Say)(皂角蝽(honeylocust plantbug))；洋葱蝽(Labopidicola allii Knight)(葱盲蝽(onion plant bug))；棉盲蝽(Pseudatomoscelis seriatus Reuter，cotton fleahopper)；苜蓿褐盲蝽(Adelphocorisrapidus Say，rapid plant bug)；四线盲蝽(Poecilocapsus lineatus Fabricius)(四线叶虫(four-lined plant bug))；小长蝽(Nysius ericae Schilling)(多彩长蝽(falsechinch bug))；假麦长蝽(Nysius raphanus Howard，false chinch bug)；稻绿蝽(Nezaraviridula Linnaeus)(南方绿椿象(Southem green stink bug))；扁盾蝽属物种(Eurygaster spp.)；缘蝽科物种(Coreidae spp.)；红蝽科物种(Pyrrhocoridae spp.)；谷蛾科物种(Tinidae spp.)；负子蝽科物种(Blostomatidae spp.)；猎蝽科(Reduviidae)物种和臭虫科(Cimicidae)物种。

另外，包括蜱螨目(Acari)(螨类)的成体和幼虫，如小麦瘤瘿螨(Aceriatosichella Keifer)(小麦卷叶螨(wheat curl mite))；麦岩螨(petrobia latens Müller)(褐色小麦螨(brown wheat mite))；在叶螨科(Tetranychidae)中蜘蛛螨和红螨，苹果全爪螨(Panonychus ulmi Koch)(欧洲红螨(European red mite))；二斑叶螨(Tetranychus urticae Koch)(二点叶螨(two spotted spider mite))；迈叶螨(T.mcdanieli McGregor)(迈叶螨(McDaniel mite))；朱砂叶螨(T.cinnabarinusBoisduval，carmine spider mite)；土耳其斯坦叶螨(T.turkestani Ugarov&Nikolski，strawberry spider mite)；细须螨科中的葡萄短须螨，桔短须螨(Brevipalpus lewisiMcGregor，eitrus flat mite)；瘿螨科(Eriophyidae)中的锈螨和芽瘿螨以及其他叶取食螨和对人类和动物健康重要的螨，即表皮螨科(Epidermoptidae)的尘螨、蠕形螨科(Demodicidae)的毛囊螨、食甜螨科(Glycyphagidae)的谷螨，硬蜱科(Ixodidae)的蜱。黑脚硬蜱(Ixodes scapularis Say)(鹿蜱(deertick))；全环硬蜱(I.holocyclus Neumann)(澳大利亚致瘫痪埤(Australian paralysis tick))；变异矩头蜱(Dermacentor variabilisSay)(美洲犬蜱(American dog tick))；美洲钝眼蜱(Amblyomma americanum Linnaeus)(孤星蜱(lone star tick))以及在痒螨科、蒲螨科和疥螨科中的痒螨和疥螨。

引人关注的是缨尾目(Thysanura)的昆虫有害生物，如衣鱼(Lepisma saccharinaLinnaeus)(蠹虫(silverfish))；斑衣鱼(Thermobia domestica Packard)(小灶衣鱼(firebrat))。

所覆盖的另外节肢动物有害生物包括：蜘蛛目中的蜘蛛如褐隐毒蛛(Loxoscelesreclusa Gertsch and Mulaik)(褐皮花蛛(brown recluse spider))和黑寡妇蜘蛛(Latrodectus mactans Fabricius)(黑寡妇毒蛛(black widow spider))，以及蚰蜒目(Scutigeromorpha)中的蜈蚣如蚰蜒(Scutigera coleoptrata Linnaeus)(蚰蜒(housecentipede))。

引人关注的昆虫有害生物包括椿象和其他相关昆虫的超家族，包括但不限于属于以下各科的物种：蝽科(稻绿蝽、茶翅蝽(Halyomorpha halys)、Piezodorus guildini、褐臭蝽、拟绿蝽、英雄美洲蝽(Euschistus heros)、美洲蝽(Euschistus tristigmus)、拟绿蝽、褐蝽(Dichelops melacanthus)、和蓓蝽(Bagrada hilaris)(蓓蝽(Bagrada Bug)))，龟蝽科(Plataspidae)(筛豆龟蝽(Megacopta cribraria)-豆平腹蝽蟓(Bean plataspid))和土蝽科(Scaptocoris castanea-Root stink bug)，以及鳞翅目物种包括但不限于：小菜蛾，例如，玉米穗虫；大豆夜蛾，例如大豆尺夜蛾，以及黎豆夜蛾(例如梨豆夜蛾)。

用于测量杀有害生物活性的方法是本领域中所熟知的。参见，例如，Czapla和Lang，(1990)J.Econ.Entomol.[经济昆虫学杂志]83：2480-2485；Andrews等人，(1988)Biochem.J.[生物化学杂志]252：199-206；Marrone等人，(1985)J.of EconomicEntomology[经济昆虫学杂志]78：290-293以及美国专利号5,743,477。通常，在取食测定中混合并使用了这种蛋白质。参见，例如，Marrone等人，(1985)，J.of Economic Entomology[经济昆虫学杂志]78：290-293。此类测定可以包括将植物与一种或多种有害生物接触，并且确定所述植物存活和/或造成所述有害生物死亡的能力。

线虫包括寄生线虫如根结线虫、胞囊线虫、和腐线虫，包括异皮线虫属物种(Heterodera spp.)、根结线虫属物种(Meloidogyne spp.)、和球异皮线虫属物种(Globodera spp.)；特别是胞囊线虫的成员，包括但不限于：大豆异皮线虫(Heteroderaglycines)(大豆胞囊线虫(soybean cyst nematode))；甜菜异皮线虫(Heteroderaschachtii)(甜菜胞囊线虫(beet cyst nematode))；燕麦异皮线虫(Heterodera avenae)(谷物胞囊线虫(cereal cyst nematode))和马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)和马铃薯白线虫(Globodera pailida)(马铃薯胞囊线虫(potato cyst nematodes))。腐线虫包括短体线虫属物种(Pratylenchus spp)。

种子处理

为了保护并提高产量生产和性状技术，种子处理方案可以为昆虫、杂草和疾病提供另外的作物计划灵活性和成本有效的控制。种子材料可以用包含化学或生物除草剂、除草剂安全剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、发芽抑制剂和增强剂、营养素、植物生长调节剂和激活剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀鸟剂和/或杀软体动物剂的组合的组合物进行处理，典型地进行表面处理。这些化合物典型地与制剂领域中通常使用的其他载体、表面活性剂或促进施用的佐剂一起配制。所述涂层可通过用液体制剂浸渍增殖材料或通过用组合的湿或干制剂进行涂覆来施加。可用作种子处理的各种类型化合物的实例提供在以下中：The PesticideManual：A World Compendium[农药手册：世界简编]，C.D.S.Tomlin编著，由British CropProduction Council[英国作物生产委员会]出版。

可用于作物种子的一些种子处理包括但不限于下列一种或多种：脱落酸，阿拉酸式苯-S-甲基，阿维菌素，杀草强，阿扎康唑，固氮螺菌属(azospirillum)，印楝素，嘧菌酯，芽孢杆菌属物种(包括蜡状芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)、球形芽孢杆菌(Bacillussphaericus)、枯草芽孢杆菌和/或苏云金芽孢杆菌物种中的一种或多种)，短根瘤菌属物种(bradyrhizobium spp.)(包括甜菜慢生根瘤菌(bradyrhizobium betae)、香炉盘慢生根瘤菌(bradyrhizobium canariense)、埃氏慢生根瘤菌(bradyrhizobium elkanii)、西表岛慢生根瘤菌(bradyrhizobium iriomotense)、慢生型大豆根瘤菌(bradyrhizobiumjaponicum)、bradyrhizobium liaonigense、bradyrhizobium pachyrhizi和/或圆明慢生根瘤菌(bradyrhizobium yuanmingense))，克菌丹，萎锈灵，壳聚糖，噻虫胺，铜，溴氰虫酰胺，苯醚甲环唑，氯唑灵，氟虫腈，咯菌腈，氟嘧菌酯，氟喹唑，解草胺，氟草肟，超敏蛋白，抑霉唑，吡虫啉，种菌唑，isoflavenoids，脂质几丁寡糖，代森锰锌，锰，代森锰，精甲霜灵，甲霜灵，叶菌唑，腈菌唑，PCNB，氟唑菌苯胺，青霉菌属，吡噻菌胺，氯菊酯，啶氧菌酯，丙硫菌唑，唑菌胺酯，氯虫酰胺，精-异丙甲草胺，皂苷，氟唑环菌胺，TCMTB，戊唑醇，噻苯咪唑，噻虫嗪，硫威，福美双，甲基立枯磷，三唑醇，木霉属，肟菌酯，灭菌唑和/或锌。PCNB种皮是指包含喹硫磷和氯唑灵的EPA注册号00293500419。TCMTB是指2-(硫氰基甲基硫代)苯并噻唑。

可以测试具有特定转基因性状的种子品种和种子以确定哪些种子处理方案和施用率可以补充所述品种和转基因性状以增加产量。例如，具有良好产量潜力但丝黑穗病易感性的品种可以受益于使用提供针对丝黑穗病的保护的种子处理，具有良好产量潜力但胞囊线虫易感性的品种可以受益于使用提供针对胞囊线虫的保护的种子处理等。同样，涵盖赋予昆虫抗性的转基因性状的品种可以从种子处理赋予的第二种作用方式中获益，涵盖赋予除草剂抗性的转基因性状的品种可以从用安全剂的种子处理中获益，这种安全剂增强植物对所述除草剂的抗性等。此外，当与种子处理组合时，正确使用种子处理所产生的良好根系建立和早期出苗可能导致更有效的氮利用，更好的抗干旱能力以及包含某种性状的一种或多种品种的产量潜力的总体增加。

用于杀灭昆虫有害生物和控制昆虫群体的方法

在一些实施例中，提供了用于杀灭昆虫有害生物的方法，所述方法包括将昆虫有害生物同时地或依次地与杀昆虫有效量的本公开的重组IPD121多肽接触。在一些实施例中，提供了用于杀灭昆虫有害生物的方法，所述方法包括将昆虫有害生物与杀昆虫有效量的SEQ ID NO：124-234的重组杀有害生物蛋白中的一种或多种或其变体或杀昆虫活性片段接触。

在一些实施例中，提供了用于控制昆虫有害生物群体的方法，所述方法包括将昆虫有害生物群体同时地或依次地与杀昆虫有效量的本公开的重组IPD121多肽中的一种或多种接触。在一些实施例中，提供了用于控制昆虫有害生物群体的方法，所述方法包括将昆虫有害生物群体与杀昆虫有效量的SEQ ID NO：124-234的重组IPD121多肽中的一种或多种或其变体或杀昆虫活性片段接触。如本文所用的，“控制有害生物群体”或“控制有害生物”是指对有害生物的任何影响，其导致对有害生物造成的损害的限制。控制有害生物包括但不限于以一定方式杀灭有害生物、抑制有害生物发育、改变有害生物能育性或生长，使得有害生物对植物造成较少的损害，减少所产生后代的数量，产生适应力较弱的有害生物，产生易受捕食者攻击的有害生物或阻止有害生物啃食植物。

在一些实施例中，提供了用于控制对杀有害生物蛋白具有抗性的昆虫有害生物群体的方法，所述方法包括将昆虫有害生物群体同时地或依次地与杀昆虫有效量的本公开的重组IPD121多肽中的一种或多种接触。在一些实施例中，提供了用于控制对杀有害生物蛋白具有抗性的昆虫有害生物群体的方法，所述方法包括将昆虫有害生物群体与杀昆虫有效量的SEQ ID NO：124-234的重组IPD121多肽中的一种或多种或其变体或杀昆虫活性片段接触。

在一些实施例中，提供了用于保护植物免受昆虫有害生物侵害的方法，所述方法包括使至少一种编码本公开的IPD121多肽的重组多核苷酸在植物或其细胞中表达。在一些实施例中，提供了用于保护植物免受昆虫有害生物侵害的方法，所述方法包括使编码SEQID NO：124-234的一种或多种IPD121多肽或其变体或杀昆虫活性片段的重组多核苷酸在植物或其细胞中表达。

昆虫抗性管理(IRM)策略

苏云金芽孢杆菌δ-内毒素在转基因玉米植物中的表达已被证明是控制农业上重要的昆虫有害生物的有效手段(Perlak等人，1990；1993)。然而，在某些情况下昆虫已经进化，所述昆虫对在转基因植物中表达的苏云金芽孢杆菌δ-内毒素是具有抗性的。如果这种抗性普遍存在，它将明显限制包含编码这种苏云金芽孢杆菌δ-内毒素的基因的种质的商业价值。

增加转基因杀昆虫剂对靶标有害生物的有效性并且同时减少杀昆虫剂抗性有害生物发展的一种方法是提供非转基因(即，非杀昆虫蛋白)庇护所(一部分非杀昆虫作物/玉米)，用于与生产对靶标有害生物具有活性的单一杀昆虫活性蛋白的转基因作物一起使用。美国环境保护局(United States Environmental Protection Agency)(epa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm，所述网址可以使用www前缀进行访问)发布了与生产一种对靶标有害生物具有活性的单一Bt蛋白的转基因作物一起使用的要求。此外，国家玉米种植者协会(National Corn Growers Association)在其网站上(ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-com，所述网址可使用www前缀访问)也提供了有关庇护所要求的类似指导。由于庇护区内的昆虫所造成的损失，较大的庇护所可能会降低总产量。

增加转基因杀昆虫剂对靶标有害生物的有效性并且同时减少杀昆虫剂抗性有害生物发展的另一种方法是具有杀昆虫基因的储存库，所述储存库可以有效地对抗昆虫有害生物的组，并通过不同的作用方式显现其作用。

在植物中表达对相同昆虫物种有毒的两种或更多种杀昆虫组合物，每种杀昆虫剂以有效水平表达是实现对抗性发展的控制的另一种方法。这是基于以下原则：对两种不同作用模式的抗性演变比仅一种远远更不可能。例如，Rouss概述了用于管理杀昆虫转基因作物的双毒素策略，也称为“金字塔结构(pyramiding)”或“堆叠”(The Royal Society.Phil.Trans.R.Soc.Lond.B.[皇家学会伦敦皇家学会哲学会刊B系列]，(1998)353：1777-1786)。每种都能有效抵抗靶标有害生物并几乎没有或没有交叉抗性的两种不同蛋白质的堆叠或金字塔结构可以允许使用较小的庇护所。美国环境保护局要求所种植非Bt玉米的结构性庇护所(通常为5％)比单一性状产品(通常为20％)显著更少。存在提供庇护所的IRM效应的各种方法，包括在田地中的各种几何种植模式和包装好(in-bag)的种子混合物，如进一步通过Roush所讨论的。

在一些实施例中，本公开的IPD121多肽可用作与其他杀有害生物蛋白或其他转基因(即RNAi性状)(包括但不限于Bt毒素、致病杆菌属物种或发光杆菌属物种杀昆虫蛋白、其他杀昆虫活性蛋白等)组合(即，金字塔化)的昆虫抗性管理策略。

提供了在促进昆虫抗性管理的转基因植物中控制鳞翅目和/或鞘翅目昆虫侵染的方法，所述方法包括在植物中表达具有不同作用模式的至少两种不同的杀昆虫蛋白。

在一些实施例中，控制转基因植物中鳞翅目和/或鞘翅目昆虫侵染并促进昆虫抗性管理的方法中包括对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫呈现至少一种IPD121多肽杀昆虫蛋白。

在一些实施例中，控制转基因植物中鳞翅目和/或鞘翅目昆虫侵染并促进昆虫抗性管理的方法包括对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫呈现至少一种SEQ ID NO：124-234的IPD121多肽或其变体或杀昆虫活性片段。

在一些实施例中，控制转基因植物中鳞翅目和/或鞘翅目昆虫侵染并促进昆虫抗性管理的方法包括在转基因植物中表达IPD121多肽和对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫表达具有不同作用模式的Cry蛋白或其他杀昆虫蛋白。

在一些实施例中，控制转基因植物中鳞翅目和/或鞘翅目昆虫侵染并促进昆虫抗性管理的方法包括在转基因植物中表达至少一种SEQ ID NO：124-234的IPD121多肽或其变体或杀昆虫活性片段，以及对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫表达Cry蛋白或其他杀昆虫蛋白，其中IPD121多肽和Cry蛋白具有不同作用模式。

还提供了降低鳞翅目和/或鞘翅目昆虫对在所述植物中表达杀昆虫蛋白以控制所述昆虫物种的转基因植物产生抗性的可能性的方法，所述方法包括对昆虫物种具有杀昆虫作用的至少一种IPD121多肽与具有不同作用模式的针对昆虫物种的第二杀昆虫蛋白的组合表达。

还提供了用于转基因植物的有效鳞翅目和/或鞘翅目昆虫抗性管理的手段，所述手段包括在植物中以高水平共表达对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫具有毒性的两种或更多种杀昆虫蛋白或其他杀昆虫转基因(例如RNAi性状)，但是每种都展现出不同的实行其杀灭活性的模式，其中两种或更多种杀昆虫蛋白或其他杀昆虫转基因包含IPD121多肽和Cry蛋白。还提供了转基因植物的有效鳞翅目和/或鞘翅目昆虫抗性管理的手段，所述手段包括在植物中以高水平共表达对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫具有毒性的两种或更多种杀昆虫蛋白或其他杀昆虫转基因(例如RNAi性状)，但是每种都展现出不同的实行其杀灭活性的模式，其中两种或更多种杀昆虫蛋白或其他杀昆虫转基因包含至少一种SEQ ID NO：124-234的IPD121多肽或其变体或杀昆虫活性片段以及Cry蛋白或其他杀昆虫活性蛋白。

此外，提供了用于获得让监管部门批准种植或商业化表达对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫具有杀昆虫作用的蛋白的植物的方法，所述方法包括参考、提交或依据昆虫测定结合数据的步骤，所述数据显示IPD121多肽不与此类昆虫中的Cry蛋白竞争结合位点。此外，提供了用于获得让监管部门批准种植或商业化表达对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫具有杀昆虫作用的蛋白的植物的方法，所述方法包括参考、提交或依据昆虫测定结合数据的步骤，所述数据显示一种或多种SEQ ID NO：124-234的IPD121多肽或其变体或杀昆虫活性片段不与所述昆虫中的Cry蛋白竞争结合位点。

本发明的实施例考虑了编码杀昆虫多肽的重组多核苷酸，所述杀昆虫多肽与选自SEQ ID NO：124-234的多肽具有至少76％序列同一性。在一个实施例中，重组多核苷酸编码与选自SEQ ID NO：124-234的多肽具有至少90％序列同一性的多肽。在一个实施例中，杀昆虫多肽与异源信号序列或转运序列连接。在一个实施例中，重组多核苷酸与选自SEQ IDNO：1-123中任一种的多核苷酸具有至少80％或至少90％序列同一性，其中所述多核苷酸有效地连接到异源调节元件。在一个实施例中，重组多核苷酸具有经优化用于在农业上重要的作物中表达的密码子。考虑了包含这些重组多核苷酸的DNA构建体，以及包含重组多核苷酸或DNA构建体的转基因植物。

本发明的一些实施例涉及抑制昆虫有害生物或有害生物群体的生长或将其杀灭的方法，所述方法包括使昆虫有害生物与杀昆虫多肽接触，所述杀昆虫多肽与选自SEQ IDNO：124-234的多肽具有至少76％序列同一性。一个实施例涉及抑制昆虫有害生物或有害生物群体的生长或将其杀灭的方法，所述方法包括使编码与选自SEQ ID NO：124-234的多肽具有至少76％序列同一性的杀昆虫多肽的重组多核苷酸在植物中表达。还考虑了用于控制害虫侵害的方法，所述方法包括在有害生物的饮食中提供表达重组多核苷酸的转基因植物，所述重组多核苷酸编码与选自SEQ ID NO：124-234的多肽具有至少76％序列同一性的杀昆虫多肽。

提高植物产量的方法

提供了用于提高植物产量的方法。所述方法包括提供表达编码本文公开的杀有害生物多肽序列的多核苷酸的植物或植物细胞，并在有害生物(所述多肽对其具有杀有害生物活性)侵染的田地中种植所述植物或其种子。在一些实施例中，所述多肽对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、半翅目或线虫有害生物具有杀有害生物活性，并且所述田地被鳞翅目、半翅目、鞘翅目、双翅目或线虫有害生物侵染。

如本文所定义的，植物的“产量”是指植物生产的生物质的质量和/或数量。如本文所用的，“生物质”是指任何经测量的植物产物。生物质产量的增加是所测量的植物产物的产量上的任何改进。增加植物产量具有若干个商业应用。例如，增加植物叶生物质可以增加用于人或动物消耗的叶菜类的产量。此外，增加叶生物质可用于增加植物来源的药物或工业产品的产量。产量上的增加可以包括任何统计学上显著的增加，包括但不限于，与不表达杀有害生物序列的植物相比，产量上至少增加1％、至少增加3％、至少增加5％、至少增加10％、至少20％增加、至少30％、至少50％、至少70％、至少100％或更大的增加。

在具体方法中，表达至少一种本文公开的IPD121多肽的植物的经改进的有害生物抗性使得植物产量得到增加。一种或多种IPD121多肽的表达导致有害生物侵染或取食植物的能力下降，从而提高植物产量。

加工方法

进一步提供了加工植物、植物部分或种子以从包含至少一种IPD121多核苷酸的植物、植物部分或种子获得食物或饲料产品的方法。可以对本文提供的植物、植物部分或种子进行加工以产生通过加工具有商业价值的植物、植物部分或种子获得的衍生物的油、蛋白产物和/或副产品。非限制性实例包括包含编码一种或多种IPD121多肽的核酸分子的转基因种子，其可以被加工以产生大豆油、大豆产品和/或大豆副产品。

“加工”是指用于获得任何大豆产品的任何物理和化学方法，并且包括但不限于热调节(heat conditioning)、剥落和研磨、挤出、溶剂萃取或水性浸泡以及全部或部分种子萃取。

以下实例是通过说明的方式但不是通过限制的方式来提供的。

实例

实例1-植物的转录组测序

各种植物样品的转录组制备如下。用试剂盒从冷冻组织中分离总RNA。使用来自公司(加利福尼亚州圣迭戈市(San Diego，CA))的TruSeq^TMmRNA-Seq试剂盒和方案制备来自所得总RNA的测序文库。简而言之，将mRNA经由附接至寡(dT)珠而分离，片段化至180nt的平均大小，通过随机六聚体引物反转录为cDNA，末端修复，加3′A尾，并与索引的TruSeq^TM衔接子连接。使用TruSeq^TM引物PCR扩增所连接的cDNA片段，并在AgilentDNA 7500芯片上检查纯化的PCR产物的质量和数量。在质量和数量评估之后，通过用双特异性核酸酶(DSN)(莫斯科，俄罗斯)处理将100ng转录物文库标准化。通过添加200mM Hepes缓冲液完成标准化，随后进行热变性，并在68℃退火五个小时。将退火的文库用2μL DSN酶处理25分钟，根据制造商方案通过柱进行纯化，并使用衔接子特异性引物扩增12个循环。用XP珠(贝克曼基因组学公司(BeckmanGenomics)，丹佛市(Danvers)，马萨诸塞州(MA))纯化最终产物，并在AgilentDNA 7500芯片上检查质量和数量。

根据2500的制造商方案对标准化的转录物文库进行测序。对文库进行合并、杂交、并且使用机上聚类方法(onboard clustering method)、随后是每个标准化文库六千万个75bp配对末端读数的靶深度的测序，进行三次测序/流动槽泳道。

实例2-IPD121Aa和同源物的鉴定

在专有序列数据库中鉴定了携带IPD121Aa、IPD121Ab、IPD121Ca、IPD121Cb、IPD121Cc和IPD121Cd的预测编码序列的候选转录组DNA装配序列。相应的预测编码序列(分别为SEQ ID NO 1、2、3、4、5和6)用于设计表1中列出的引物。使用κHiFi^TM聚合酶(卡帕生物科学公司(Kapa Bioscience)，威明顿市(Wilmington)，马萨诸塞州(MA))，以及使用II试剂盒(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fischer Scientific)，沃尔瑟姆(Waltham)，马萨诸塞州(MA))作为模板从植物的总RNA制备的cDNA，将这些通过聚合酶链式反应用于克隆。凝胶纯化PCR产物，用NdeI和XhoI限制性酶(新英格兰生物实验室(NewEngland Biolabs))进行消化，并且连接到也用相同酶消化的pET14b中。对克隆进行测序从而验证克隆。表2列出了克隆的多核苷酸序列的SEQ ID编号及其对应的多肽序列。

表1

表2

实例3-同源物的鉴定

通过在序列相似的默认参数下进行BLAST^TM搜索来确定基因同一性(局部比对检索工具(Basic Local Alignment Search Tool)；Altschul等人，(1993)J Mol Biol[分子生物学杂志]215：403-410；还参见ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/，所述网址可以使用www前缀进行访问)。分析IPD121Aa(SEQ ID NO：1)的多核苷酸序列。通过DUPONT PIONEER内部专有数据库中的BLAST^TM来进行基因鉴定，鉴定了IPD121Aa蛋白的多个同源物，如SEQ ID NO 2-123的多核苷酸序列和SEQ ID NO 125-234的相应多肽序列所示。

实例4-在瞬时叶组织上的表达和昆虫生物测定

为了确认IPD121Aa(SEQ ID NO：124)和同源物IPD121Ab、IPD121Ac、IPD121Ad、IPD121Ae、IPD121Af、IPD121Ca、IPD121Cb、IPD121Cc、IPD121Cd、IPD121Ce、IPD121Cf、IPD121Cg、IPD121Ch、IPD121Da、IPD121Db、IPD121Dc和IPD121Dd的活性，在病毒启动子dMMV启动子的控制下，将相应的基因克隆到瞬时表达系统中(Dey等人，(1999)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]40：771-782；PCT专利公开WO 2011133387)。将表达质粒转化到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)AGL1中，并将所得菌株用于在丛状菜豆(普通豆，菜豆(Phaseolus vulgaris))中瞬时表达。将农杆菌属细胞悬浮液引入完整组织的植物细胞以使得可重复感染和随后的植物来源的转基因表达可被测量或研究的农杆菌浸润法是本领域熟知的(Kapila等人，(1997)Plant Science[植物科学]122：101-108)。简而言之，用测试和对照菌株的标准化细菌细胞悬浮液对单叶阶段的丛状菜豆(普通豆，菜豆)进行农杆菌浸润。从每个小植株切下叶圆盘，并且用大豆夜蛾(SBL)(大豆尺夜蛾)、玉米穗蛾(CEW)(玉米穗虫)、(FAW)、黎豆夜蛾(VBC)(梨豆夜蛾)或欧洲玉米螟(ECB)(玉米螟)的新生虫侵染。用仅含有空表达载体的农杆菌产生来自对照的叶圆盘。将来自非浸润植物的叶圆盘用作第二对照。侵染后三天对绿叶组织消耗进行评分并且给出得分0至9，如表3所示。瞬时表达的IPD121Aa(SEQ ID NO：124)和多种同源物保护丛状菜豆叶圆盘免受侵染昆虫的消耗，同时观察到阴性对照和未处理组织的总绿色组织消耗。通过基于质谱法的蛋白鉴定方法，使用从浸润的叶组织提取的蛋白质裂解物确认IPD121Aa(SEQ ID NO：124)和IPD121Ab(SEQ IDNO：125)的瞬时蛋白质表达(Patterson，(1998)10(22)：1-24，Current ProtocolinMolecular Biology[当前分子生物学方案]，由John Wiley&Son Inc[约翰威利父子公司]出版)。如图2A-2D所示，IPD121Aa(SEQ ID NO：124)、IPD121Ca(SEQ ID NO：126)、IPD121Cb(SEQ ID NO：127)、IPD121Cc(SEQ ID NO：128)、IPD121Cd(SEQ ID NO：129)和IPD121Ce(SEQID NO：139)的瞬时蛋白表达导致保护丛状菜豆免受鳞翅目种类的叶取食损害。

表3

叶取食得分	％消耗
		1	86-100
2	71-85
		3	61-70
4	51-60
		5	36-50
6	11-35
		7	7-10
8	1-3
		9	0

在丛状菜豆中瞬时表达的所选择的IPD121多肽针对来自所选择的鳞翅目的叶取食损害的活性显示在图2A-2D中。显示了6次重复测量的平均得分和标准误差(SE)。在测试条件下，平均叶损害得分大于阴性对照的一个标准误差的样品被认为具有活性。因此，在测试条件下被认为不具有活性的样品为灰色阴影。

对本公开的各种所说明的实施例的上述描述并不旨在是详尽的或者限制范围于所公开的精确形式。虽然为了说明目的而在本文描述了具体实施例和实例，但是如相关领域的技术人员将认识到的，在本公开范围内的各种等效修饰是可能的。本文提供的教导可以应用于除了上述实例之外的其他目的。根据上述教导，许多修改和变化是可能的，并且因此在所附权利要求书的范围内。

可以根据上述详细描述进行这些改变和其他改变。通常，在以下权利要求书中，所用的术语不应被解释为将范围限制于说明书和权利要求书中公开的具体实施例。

背景技术、具体实施方式和实例中引用的每个文献(包括专利、专利申请、杂志文章、摘要、手册、书籍或其他公开内容)的全部公开内容通过引用以其全文并入本文。

就使用的数字(例如量、温度、浓度等)而言，已努力确保其准确性，但仍应允许有一些实验误差和偏差。除非另有说明，份为重量份，分子量为平均分子量；温度为摄氏度；并且压力为大气压或接近大气压。

Claims (22)

1.一种重组杀昆虫多肽，所述重组杀昆虫多肽包含与SEQ ID NO：124具有至少76％序列同一性的氨基酸序列，或其具有杀昆虫活性的片段。

2.根据权利要求1所述的重组杀昆虫多肽，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO：124具有至少90％序列同一性。

3.根据权利要求1或2所述的重组杀昆虫多肽，其中所述杀昆虫多肽与异源信号序列或转运序列连接。

4.根据权利要求1所述的重组杀昆虫多肽，其中所述多肽对鳞翅目农业有害生物具有杀昆虫活性。

5.一种嵌合杀昆虫蛋白，所述嵌合杀昆虫蛋白包含至少两种不同的根据权利要求1或2所述的重组杀昆虫多肽的部分。

6.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含根据权利要求1或2所述的重组杀昆虫多肽。

7.一种农业组合物，所述农业组合物包含至少一种根据权利要求1、2或3所述的重组杀昆虫多肽。

8.一种重组多核苷酸，所述重组多核苷酸编码根据权利要求1、2或3所述的杀昆虫多肽。

9.根据权利要求8所述的重组多核苷酸，其中所述多核苷酸具有经优化用于在农业上重要的作物中表达的密码子。

10.一种重组多核苷酸，所述重组多核苷酸编码根据权利要求5所述的嵌合杀昆虫蛋白。

11.一种DNA构建体，所述DNA构建体包含根据权利要求8、9或10所述的重组多核苷酸。

12.一种转基因植物，所述转基因植物包含根据权利要求8、9或10所述的多核苷酸。

13.一种转基因植物，所述转基因植物包含根据权利要求11所述的DNA构建体。

14.一种抑制昆虫有害生物或有害生物群体的生长或将其杀灭的方法，所述方法包括使所述昆虫有害生物与根据权利要求1、2或3所述的杀昆虫多肽接触。

15.一种抑制昆虫有害生物或有害生物群体的生长或将其杀灭的方法，所述方法包括在植物中表达根据权利要求8、9或10所述的多核苷酸。

16.一种控制昆虫有害生物对植物的损害的方法，所述方法包括向昆虫有害生物或有害生物群体提供根据权利要求1、2或3所述的杀昆虫多肽以供摄取，其中所述杀昆虫多肽由转基因植物产生，并存在于至少一种所述植物中。

17.一种用于控制有害生物侵染的方法，所述方法包括在所述有害生物的饮食中提供根据权利要求12或13所述的转基因植物或其一部分。

18.一种用于提高作物产量的方法，所述方法包括使根据权利要求12或13所述的转基因植物生长，其中相对于不包含所述转基因植物的作物，在昆虫有害生物存在下所述作物的产量增加。

19.根据权利要求14-18中任一项所述的方法，其中所述昆虫有害生物或有害生物群体对至少一种Cry杀昆虫蛋白具有抗性。

20.根据权利要求14-19中任一项所述的方法，其中所述转基因植物选自玉米、大豆、小麦、水稻、高粱、向日葵、低芥酸油菜、大麦、甘蔗、马铃薯、番茄、棉花、油菜籽、花生和苜蓿。

21.根据权利要求14-20中任一项所述的方法，其中所述昆虫有害生物或昆虫有害生物群体是鳞翅目中的农业上重要的物种。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述昆虫有害生物或昆虫有害生物群体选自玉米穗蛾、欧洲玉米螟、秋夜蛾、大豆夜蛾、黎豆夜蛾和小菜蛾。