CN114107344B

CN114107344B - 抗虫融合基因M2CryAb-VIP3A、其表达载体、产物及其应用

Info

Publication number: CN114107344B
Application number: CN202111346791.XA
Authority: CN
Inventors: 岳润清
Original assignee: Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-11-15
Filing date: 2021-11-15
Publication date: 2023-07-28
Anticipated expiration: 2041-11-15
Also published as: CN114107344A

Abstract

本发明涉及抗虫融合基因M2CryAb‑VIP3A、其表达载体、产物及其应用，旨在解决现有Bt融合基因难以兼顾生物安全性和高效杀虫的技术问题。抗虫融合基因M2CryAb‑VIP3A的核酸序列如SEQ ID NO.4所示，其所对应的蛋白序列如SEQ ID NO.5所示。该融合基因不含致敏原序列且能够高效表达，兼顾了生物安全性和杀虫效果，其表达产物对玉米螟、草地贪夜蛾等害虫抗性卓越、杀虫谱更广。将M2CryAb‑VIP3A基因导入玉米后，得到除抗螟虫外兼抗其它鳞翅目害虫或鞘翅目害虫（如草地贪夜蛾等）的作物新品种，基因的融合或聚合有效延缓抗性品种的使用寿命；本发明抗虫融合基因表达蛋白M2CryAb‑VIP3A具有优良的杀虫效果，可应用于制备抗虫制剂中，绿色环保，无污染。

Description

抗虫融合基因M2CryAb-VIP3A、其表达载体、产物及其应用

技术领域

本发明涉及生物基因工程技术领域，具体涉及一种抗虫融合基因M2CryAb-VIP3A、其表达载体、产物及其应用。

背景技术

害虫（pest）是对人类有害的昆虫的通称。目前已发现和确认的能够危害农作物的害虫多达上百万种之巨，这些数量众多的害虫每年都会给农业生产带来难以估量的经济损失。而当前防治农作物害虫害仍仰仗于化学合成农药；但是，长期大量的使用化学农药会给生态环境带来严重危害。随着生物基因工程技术的迅猛发展，研究人员也开始逐渐利用抗虫基因转化植物，进而培育得到具有抗性转基因作物新品种。

目前能够开发利用的抗虫基因主要有苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）抗虫基因、几丁质酶基因、蛋白酶抑制剂基因、植物凝集素基因、蝎昆虫毒素基因、豌豆脂氧合酶基因、昆虫雌虫不育蛋白因子基因、昆虫神经激素基因、昆虫保幼激素脂酶基因等等；而其中Bt抗虫基因的应用研究最为广泛、深入。目前已从大量的Bt菌株中发现、分离出多达九十种以上基因编码的杀虫结晶蛋白；昆虫病原菌Bt基因产生Cry、Cyt和Vips等蛋白；多数苏云金芽孢杆菌株系可产生几种杀虫结晶蛋白，但每种杀虫结晶蛋白寄主范围很狭窄。

然而另一方面，转抗虫基因的抗虫植物在应用中也存在着一些亟待解决的问题：如，由原始抗虫基因直接应用到转基因植物中所获得的转基因植物抗虫性很低、抗虫性效果差，毒蛋白的表达量低且表达产物不稳定，难以满足农业生产上的虫害防治需求；随着抗虫基因应用范围的扩展，昆虫会逐渐对杀虫蛋白产生抗性；现有抗虫基因的抗虫谱较窄；转化的外源基因在植物体内的表达出现基因“沉默”现象，等等。

因而，寻找新的抗虫基因或改造利用已有抗虫基因资源来应对昆虫对杀虫制剂的抗药性趋势，已成为当务之急。而目前基于杀虫作用机理存在较大差异（不存在交互抗性）的不同抗虫基因的融合或聚合改造，是一种新的应对策略：所谓基因聚合就是指在同种作物品种中转入两个不同的抗虫基因，共同使用两种Bt基因要求害虫对这两种Bt杀虫蛋白的作用机理存在较大差异，即不存在交互抗性。Cry1Ab基因对与玉米螟、东方黏虫、棉铃虫等鳞翅目玉米有很好的防控效果，Vip3A基因与Cry1Ab是完全不同的抗虫机制，对草地贪夜蛾、小地老虎等害虫抗性卓越，两类基因的融合或聚合具有以下的优势：杀虫效果好，较小比例的庇护所就可满足，经济实用；杀虫谱更广，多个抗虫基因之间杀虫谱可以互相弥补，不同的基因对同种害虫的杀虫效果也存在差异，可以相互补充；可以有效延缓抗性品种的使用寿命，理论上昆虫同时对两种不同的Bt基因同时产生抗性的几率大大低于对单个Bt基因产生抗性的几率，因而能有效延缓昆虫产生抗性的时间；发达国家普遍采用的“高剂量／庇护所策略”在我国难以严格执行，因而基因融合或聚合策略更适合我国国情。

基因的融合或聚合不仅可以增强作物的杀虫效果，而且能够拓展杀虫谱，获得除抗螟虫外兼抗其它鳞翅目害虫或鞘翅目害虫（例如粘虫、地老虎等）的作物新品种。比如，中国专利文献CN111041036A中公开了一种编码杀虫蛋白抗虫融合基因mCryAb-VIP3A，该融合基因在一定程度上增强了转化作物的抗虫、杀虫效果，但发明人进一步研究发现，该蛋白与已知过敏原具有较高的序列同源性，具有潜在过敏性的可能性较高；另外，该蛋白与已知过敏序列存在有2处至少8个连续相同的氨基酸，再次表明该融合蛋白存在着过敏性的可能性，因而其难以被用于抗虫转基因玉米的产业化生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗虫融合基因M2CryAb-VIP3A、其表达载体、产物及其应用，以解决相关Bt 融合基因难以兼顾生物安全性和高效杀虫的技术问题。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

设计一种抗虫融合基因M2CryAb-VIP3A，其核苷酸序列为：

（1）如SEQ ID NO.4所示的核酸序列；或

（2）由SEQ ID NO.4所示的核酸序列衍生的具有同等功能的核酸序列。

所述抗虫融合基因编码的蛋白M2CryAb-VIP3A，其氨基酸序列为：

（1）如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；或

（2）在SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列的基础上进行一个或多个氨基酸的添加、删除或替换而获得活性片段或保守性变异体的序列。

构建了含有所述抗虫融合基因M2CryAb-VIP3A的表达载体。

基于所述表达载体构建得到一种重组菌。

所述抗虫融合基因M2CryAb-VIP3A在培育抗虫植物品种（如单子叶植物玉米等）中的应用。

所述抗虫融合基因编码的蛋白M2CryAb-VIP3A在制备抗虫生物制剂中的应用。

与现有技术相比，本发明的主要有益技术效果在于：

1. 本发明抗虫融合基因M2CryAb-VIP3A能够高效表达，且不含致敏原序列，兼顾了生物安全性和高效杀虫效果，其表达产物的抗虫、杀虫效果大大增强，并拓展了杀虫谱（如高抗亚洲玉米螟、草地贪夜蛾等）。

2. 将本发明抗虫融合基因M2CryAb-VIP3A导入玉米后，可以得到稳定遗传的转化植物体，获得了除抗螟虫外兼抗其它鳞翅目害虫或鞘翅目害虫（如草地贪夜蛾）的作物新品种；此外，该抗虫融合基因基因也可以用于转化棉花、水稻、蔬菜等农作物，使其具备相应的抗虫活性，从而降低化学农药的使用量，减少或避免农药残留，环境友好，具有重要的经济价值和广阔的应用前景。

3. 本发明抗虫融合蛋白M2CryAb-VIP3A具有优良的杀虫效果，可应用于制备抗虫生物制剂中，绿色环保，无污染。

附图说明

图1为pCAMBIA3300+35S-M2CryAb-VIP3A载体架构示意图。

图2为转M2CryAb-VIP3A基因玉米植株获得过程照片；其中，左图为愈伤组织的筛选，中图为分化、右图为再生。

图3为T0代转化体目的基因 M2CryAb-VIP3A的PCR检测图；其中，其中，M：DL2000plus；CK1：阳性对照[质粒pCAMBIA3300- M2CryAb-VIP3A]；CK2：阴性对照：（非转基因玉米）；CK3：空白对照（双蒸水）；1～20：20个优良转基因株系LM01~20。

图4为 T0代转化体选择标记基因Bar的PCR检测图；其中，M：DL2000 plus；CK1：阳性对照(质粒pCAMBIA3300-M2CryAb-VIP3A)；CK2：阴性对照：（非转基因玉米）；CK2：空白对照（双蒸水）；1～20：20个优良转基因株系LM01~20。

图5为T0代转M2CryAb-VIP3A基因部分转化体目的蛋白Vip3A的免疫学检测图。

图6 为T0代转M2CryAb-VIP3A基因部分转化体目的蛋白CryAb的免疫学检测图。

图7 为T0代转M2CryAb-VIP3A基因部分转化体目的蛋白筛选标记蛋白bar的免疫学检测图。

图8为转M2CryAb-VIP3A抗虫基因玉米苗期叶片亚洲玉米螟抗性室内生测对比图。

图9为转M2CryAb-VIP3A抗虫基因玉米苗期叶片草地贪夜蛾抗性室内生测对比图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂或产品如无特别说明，均为市售常规试剂或产品；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例一：抗虫融合基因M2CryAb-VIP3A的获得

选择以Cry1Ab基因3468 bp长度的原始DNA序列（GenBank：AY847289.1）为基础，深入分析研究了Cry1Ab基因原始序列的功能结构域和核心区域（蛋白活性区域），保留Cry1Ab原始序列N端1845bp功能结构域和核心区域，去掉原始序列C端1620bp碱基序列；并基于长期的实践经验对所述保留的Cry1Ab核心区域核苷酸序列进行结构优化、密码子优化等多方面的定向改造，例如，排除原始抗虫基因DNA序列中多处AATGAA、ATTTA等AT富集区和基因序列中存在的反向重复序列，剔除或减少不明确的真核DNA序列内含子的序列及可能引起该基因转录提前终止或引起mRNA不稳定的序列，去除部分常用限制性内切酶识别位点序列（XbaI、SacI），并将3’端的终止密码子修改为GCC，最终得到定向改造的抗虫基因mCry1Ab（如SEQ ID NO.1所示）。经多重改造优化后保留的N端1845bp核心区域 A含量由31.92%降低到19.62%，T含量由30.73%降低到16.37%，G含量由 19.67%增加到29.21%，C 含量由 17.67%增加到34.80%，A+T含量由62.65%降低到35.99%，而 C+G由 37.34%增加到64.01%。

再以vip-s 基因2630 bp长度的原始DNA序列（GenBank：Y17158.1）为基础，分析研究vip-s 基因原始序列功能结构域和核心区域（蛋白活性区域），保留了vip-s 基因原始序列端2367bp功能结构域和核心区域；采用多重手段对保留的vip-s 基因核心区域核苷酸序列进行结构优化、密码子优化等多方面的定向改造；例如，保留的核心区段N端9个碱基ATGAACAAG分别优化为GGTAAAGGA，而起始的3个氨基酸M（甲硫氨酸）、N（天冬氨酰）和K（赖氨酸）分别优化为G（甘氨酸）K（赖氨酸）、G（甘氨酸），排除了DNA序列中存在的造成植物转录不稳定的富含AT序列（如ATTTA、AATGAA等）以及常用限制性酶切位点（HindIII、SacI），然后通过置换密码子的方法进行改正消除；最终获得了密码子优化的抗虫基因mVIP3A(a)（如SEQID NO.2所示）。改造优化后保留的2367核心区域，A含量由38.06%降低到26.49%，T 含量由31.05%降低到17.03%， G含量由 18.35%增加到29.40%， C 含量由12.53%增加到27.08%；A+T由69.11%降低到43.51%，而 C+G由 30.89%增加到56.49%。

然后将优化好的mCry1Ab基因通过一段72个核苷酸组成的序列（如SEQ ID NO.3所示）与设计改造好的mVIP3A基因连接形成融合基因，mCry1Ab基因去掉终止密码子后，其阅读框就可以连续表达至优化改造过mVIP3A基因，在设计改造好的融合基因末端加终止密码子TAA，进行全基因合成，获得一种新的抗虫融合基因M2CryAb-L-VIP3A。改造合成的融合基因编码序列编码序列密码子及推导的氨基酸序列(见如SEQ ID NO.5所示）。

实施例二：抗虫融合基因M2CryAb-VIP3A原核表达系统的构建

将改造的抗虫融合基因与原核生物高效表达载体pET28b+进行切连，构建成具有融合目标基因的原核生物表达载体，确定目标基因蛋白表达量和生物学功能。根据克隆抗虫融合基因需要，在引物序列的5’端添加NdeI内切酶识别位点序列CATATG，3’端添加HindIII内切酶识别位点序列AAGCTT。

基于合成序列对抗虫基因进行克隆，将抗虫基因构建于pET28b+原核表达系统中，然后以构建好的pET转化BL21(DE3)感受态细胞，以确定基因蛋白表达量，并在室内对融合基因表达蛋白的生物学功能进行确定。再将抗虫基因mCryAb和mVIP3A分别克隆到表达载体pET28b+限制性内切酶NdeI和HindIII之间，得到pET-mCryAb、pET-mVIP3A原核表达载体，与融合基因同时进行原核表达蛋白的生物学功能鉴定。

实施例三：杀虫蛋白M2CryAb-VIP3A的制取

将构建好的重组质粒pET-及其相应对照pET-mCryAb、pET-mVIP3A及pET28b+空载体分别导入BL21(DE3)细胞系（Escherichia coli），挑取单菌接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃下摇动培养过夜；将菌液以1：100接种到含卡那霉素的LB液体培养基中摇动培养，培养至OD600值约为0.5～0.6，加入IPTG至终浓度0.5mM继续摇动诱导4小时；收集诱导后的菌液，4000rpm离心10分钟，弃上清，收集菌体。沉淀加入20mM Tris-HCl裂解缓冲液重新悬浮，加入溶菌酶至终浓度1mg/ml，冰上放置30分；超声波破碎菌体，4000rpm离心10min，收集收集破碎混合液用来进行杀虫活性的测定。相同条件下培养含实施例一mCryAb基因序列的重组pET28b载体的E.coli BL21(DE3)和含实施例一改造的VIP3A(a)基因序列的重组pET28b载体的E.coli BL21(DE3)，进行超声波破碎，收集破碎混合液作为对照组；以清水作为空白组。

在26～28℃，相对湿度70%的环境条件下孵化玉米螟虫卵；孵化的玉米螟幼虫在26～28℃、相对湿度70%条件下进行人工饲养。共重复3次，每次接种玉米螟幼虫100只，8d后统计死亡率和幼虫虫重。

实施例四：原核表达载体表达抗虫蛋白杀虫活性测定

分别取等量的实施例三中所得各组超声波破碎液加入到配置的玉米螟饲料中作为试验饲料，饲养玉米螟进行虫试：每个试管放入一条饲料，并分别接入饲养新生-龄幼虫（玉米螟、草地贪夜蛾、甜菜夜蛾、Bt抗性棉铃虫）10头；每个处理各接10个试管；在温度26～28℃，相对湿度70%左右的环境中培养8天，检测平均死亡率和活虫单只重量。具体结果见表1。

表1人工改造合成的 M2CryAb-VIP3A基因原核表达产物的毒性鉴定

处理（三个重复）	玉米螟（%）	草地贪夜蛾（%）	甜菜夜蛾（%）	Bt抗性棉铃虫（%）
					空白组	0	0	0	0
改造mCryAb组	90.22	68.12	62.07	90.12
					改造VIP3A(a)组	78.86	92.22	91.18	68.86
M2CryAb-VIP3A组	95.52	95.06	93.96	92.06

从表1中可知，改造mCryAb原核表达载体表达的蛋白对玉米螟具有很好的杀虫效果，玉米螟死亡率达到90.22%，对草地贪夜蛾和甜菜夜蛾也有一定的杀虫效果，草地贪夜蛾死亡率为68.12%，甜菜夜蛾死亡率为62.07%，对棉铃虫也有很好的杀虫效果，棉铃虫死亡率达到90.12%；改造VIP3A(a)原核表达载体表达的蛋白对草地贪夜蛾和甜菜夜蛾具有很好的杀虫效果，死亡率分别达到92.22%和91.18%，对玉米螟和Bt抗性棉铃虫也有一定的杀虫效果，玉米螟死亡率为78.86%，棉铃虫死亡率为68.86%；抗虫融蛋白M2CryAb-L-VIP3A(a)是利用连接肽将两个独立的蛋白mCryAb和VIP3A(a)有效连接成为一个融合蛋白质，使得融合蛋白具有这两个蛋白质的功能，M2CryAb-L-VIP3A(a)抗虫融合蛋白具有很强的杀虫性，对玉米螟、草地贪夜蛾、甜菜夜蛾和Bt抗性棉铃虫杀率都达到90%以上，死亡率分别为95.52%、95.06%、93.96%和92.06%，杀虫效果非常显著。

原核表达载体表达抗虫蛋白杀虫活性测定表明：M2CryAb-VIP3A基因编码的Bt杀虫蛋白具有很强的杀虫效果，说明M2CryAb-VIP3A基因可表达出具有强生物活性、广谱性的杀虫毒蛋白。

实施例四： M2CryAb-VIP3A基因植物表达载体的构建

M2CryAb-VIP3A基因由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，构建到T载体内切酶XbaI和SacI酶切位点之间，命名为T-M2CryAb-VIP3A；以T-M2CryAb-VIP3A为模板，利用含有相同酶切位点的扩增引物克隆M2CryAb-VIP3A基因片段；双酶切后连入已经用XbaI和SacI双酶切处理的遗传转化高效植物表达载体pCAMBIA3300上，获得M2CryAb-VIP3A基因的植物表达载体，重组质粒命名为pCAMBIA3300- M2CryAb-VIP3A，质粒图谱如图1所示。将重组质粒pCAMBIA3300-M2CryAb-VIP3A转化至农杆菌EHA105中，筛选阳性菌株，得M2CryAb- VIP3A基因的重组表达菌，低温保藏。

实施例五：转基因玉米的获取

通过冻融法将重组质粒pCAMBIA3300+35-Cry1Ab-t导入农杆菌EHA105菌株中，玉米幼胚的遗传转化参照刘允军的方法。将转化后的胚性愈伤组织转移到含1.5 mg/L双丙氨磷的筛选培养基上（D培养基）进行第一轮筛选，然后将筛选到的抗性愈伤组织转移到含3.0mg/L双丙氨磷的筛选培养基上进行两轮筛选，最后转入分化培养基中进行植株分化再生，待再生苗长至4～5 cm时，移栽至温室，并进行检查，阳性植株保留，如图2所示。待其生长至吐丝散粉期时，对其进行授粉。

实施例六：M2CryAb-VIP3A基因在玉米植株中的表达验证

1. PCR检测

待实施例五培养所得的转基因植株生长到5～6叶期时，CTAB法提取植株的叶片基因组DNA，设计如表2所示的引物进行PCR扩增M2CryAb-VIP3A基因和质粒pCAMBIA3300上的抗草铵膦基因bar基因。

表2 M2CryAb-VIP3A基因和bar基因内部序列设计的PCR检测引物序

目的基因	上游引物序列	下游引物序列	片段大小（bp）
				M2CryAb-VIP3A	AACCTCGGGTCGGGGACGTCG	CGTAGTTCTGCTTCATGACGT	877
bar	ATGAGCCCAGAACGACGCCCG	TCGGTGACGGGCAGGACCGG	545

PCR的反应体系为：2ul 的DNA 模板，2uL10×PCR Buffer缓冲液，2ul的dNTP(10mM each)，1ul上游引物(10mM)，1uL下游引物(10mM)，0.3uL Tap酶，无菌水补足20 ul。PCR的反应程序如3表所示。

表3 PCR反应程序

温度（℃）	时间	阶段	循环数
				94	5min	预变性	1
94	5min	变性	33
				58	30s	退火	33
72	50s	延伸	33
				72	10min	保存	1

检测结果如图3和图4所示：表明外源基因M2CryAb-VIP3A基因和bar基因已整合到目标玉米基因组中。

2. 试纸条检测

目的蛋白M2CryAb-VIP3A的检测（Bt-Cry1Ab/1Ac免疫学和VIP3A检测）：

（1）取约1cm²左右新鲜幼嫩叶片放在1.5ml的Eppendorf 管中。然后将放有实施例五培养的转基因植株叶子的管插在冰盒中，以保持新鲜度。

（2）取液氮，将材料速冻，用钻头将材料研磨成粉，向管中迅速加入500μL-lmlSEB4样品提取缓冲液。

（3）从桶中取出检测条（北京汉德伟信科技有限公司），手持检测条顶端，做好检测标记。不要去掉保护膜。保持检测条垂直，将标记的末端插入至离心管或提取袋中。插入部分不要超过0.5cm。在检测过程中始终保持插入状态。

（4）3～5min内出现质控线，最长反应时间为30min，此时检测条可取出。质控线是用来确保试验结果的准确性的。如果质控线没有出现，检测无效。由于样品的流动性不同，产生信号的时间也不同。如果样品是阳性的，检测线将出现。如果样品是阴性的，检测线将不出现。如果想长期保存检测结果，则可剪掉样品垫，以纸巾吸干，这将阻止残存的液体干扰结果。检测线的深浅反映了被检测蛋白的含量多少。

结果如图5～7所示，抗虫基因M2CryAb-VIP3A表达的目的蛋白mCryAb、mVIP3A(a)和筛选标记基因bar在转基因玉米中高效表达。

实施例七：转基因玉米植株的抗虫性鉴定

1.转M2CryAb-VIP3A抗虫基因玉米苗期叶片亚洲玉米螟抗性室内生测鉴定

取温室中转M2CryAb-VIP3A基因玉米植株幼苗生长至5～8叶期玉米植叶片（取未展开的幼嫩心叶），用消毒剪刀剪成2～3 cm大小，放在一次性培养皿中，每皿接10头初孵幼虫。以普通玉米植株叶片为对照组，转M2CryAb-VIP3A基因植株叶片为试验组，培养3天后观察转基因玉米的抗虫效果。

结果如图8所示，3d后非转基因玉米叶片全被亚洲玉米螟吃光，表现为超感虫，而转M2CryAb-VIP3A基因玉米叶片无亚洲玉米螟虫害，抗性强，转M2CryAb-VIP3A基因抗虫玉米表现为高抗亚洲玉米螟。

2.转M2CryAb-VIP3A抗虫基因玉米苗期叶片草地贪夜蛾抗性室内生测鉴定

供试草地贪夜蛾种群于2020年1月19日采自云南省瑞丽鲜食玉米田草地贪夜蛾。取温室中转M2CryAb-VIP3A基因玉米植株幼苗生长至5～8叶期玉米植叶片（取未展开的幼嫩心叶），用消毒剪刀剪成2～3 cm大小，放在中，每孔接5头草地贪夜蛾成虫。以普通玉米植株叶片为对照组，转M2CryAb-VIP3A基因植株叶片为试验组，培养24h和3d后观察转基因玉米的抗虫效果。

结果如图9所示，仅仅24小时后，非转基因玉米叶片几乎全被草地贪夜蛾吃光，表现为感草地贪夜蛾，而转M2CryAb-VIP3A基因玉米叶片近乎完整，无草地贪夜蛾危害，抗性极强，表明转M2CryAb-VIP3A基因抗虫玉米表现为高抗草地贪夜蛾。

综上，转M2CryAb-VIP3A抗虫基因玉米苗期叶片亚洲玉米螟和草地贪夜蛾抗性室内生测鉴定结果表明：通过对MCryAb基因和VIP3A(a)基因的改造和融合，不但增加了单基因自身的抗虫性，效果显著；此外，单基因的改造和融合使得融合基因表达的蛋白不仅高抗亚洲玉米螟，而且高抗草地贪夜蛾，不仅可以增强了作物的杀虫效果，而且杀虫广谱，获得除抗螟虫外兼抗其它鳞翅目害虫或鞘翅目害虫（草地贪夜蛾）的作物新品种。

实施例八：生物安全性评测

本发明融合基因M2CryAb-VIP3A，通过设计改造、生物学分析及抗虫转基因玉米生物学效果验证，在实现融合基因高效表达、抗虫性好的基础上，依据农业部1485号公告-18-2010《转基因生物及其产品食用安全检测—外源蛋白质过敏性生物信息学分析方法》，对M2CryAb-VIP3A基因的氨基酸序列在致敏原数据库（The Allergen Online Database）和致敏蛋白结构数据库（Structural Database of Allergenic Proteins，SDAP）中分别在连续80个氨基酸和8个氨基酸两个水平上进行比对分析。

结果表明，两个蛋白连续80个氨基酸序列在The AllergenOnline Database和Structural Database of Allergenic Proteins中均未比对出同源性大于35%的疑似致敏原序列；在两个数据库中也没有比对出连续8个氨基酸水平上的同源性序列。

上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明构思的前提下，所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的替代方式，从而形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省农业科学院

<120> 抗虫融合基因M2CryAb-VIP3A、其表达载体、产物及其应用

<130> /

<160> 5

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 1845

<212> DNA

<213> 人工改造设计

<400> 1

atggacaaca acccgaacat caacgagtgc atcccctaca actgcctgag caaccccgag 60

gtcgaggtcc tcggaggcga gcggatcgag accggctaca cccccatcga catcagcctg 120

tcgctcacgc agttcctcct gtccgaattc gtgcccggcg ccggcttcgt gctgggcctg 180

gtcgacatca tctgggggat cttcgggccg agccagtggg acgccttcct ggtgcagatc 240

gagcaactca tcaaccagcg gatcgaggaa ttcgcccgca accaggccat cagccgcctg 300

gaggggctct ccaacttgta ccagatctac gccgagagct tccgcgagtg ggaggccgac 360

ccgacgaatc cggcgttgag ggaagagatg cgcatccagt tcaacgacat gaacagcgcc 420

ctcacgacgg cgatcccgct cttcgcggtc cagaattacc aggtgcccct gctgagcgtg 480

tatgtccagg cggcgaacct ccatttgtcg gtgctgcgcg acgtcagcgt gttcggccag 540

cgctgggggt tcgacgcggc gacgatcaac agccgctaca acgacctgac ccgcctgatc 600

gggaactaca cggatcacgc ggtccggtgg tacaacaccg gcctggagcg cgtgtggggt 660

ccggactcca gggactggat ccgctacaac cagttccgcc gcgagctgac cctgaccgtg 720

ctcgatatcg tcagcttgtt ccctaactac gacagccgca cctaccccat ccgcaccgtg 780

tcgcagctca cgagggagat ttacacgaac cccgtgctgg agaacttcga cggcagcttc 840

cgggggtccg cgcaggggat cgaggggtcg atccgcagcc cccacctgat ggacatcctg 900

aactcgatca cgatctacac ggacgcgcac cgcggcgagt actactggag cggccaccag 960

atcatggcgt cgccggtggg cttctcgggc cccgagttca ccttccccct gtacggcacc 1020

atggggaacg cggccccgca gcagcggatc gtggcacagc tgggccaggg agtgtaccgc 1080

acgctcagca gcacgctcta ccgccgcccg ttcaacatcg gcatcaacaa ccagcagctg 1140

tcggtcctcg atgggacgga gttcgcgtac ggcaccagca gcaacctgcc cagcgccgtg 1200

taccggaagt cagggacggt cgactcgctc gacgagatcc cccctcagaa caacaacgtg 1260

ccgccgcggc aggggttctc gcaccggctc agccacgtga gcatgttccg cagtggcttc 1320

tcgaactcgt cggtctcgat catccgcgcg cctatgttca gctggattca ccgcagtgcc 1380

gaattcaaca acatcattcc gtcgtcgcag atcacccaga tccccctgac caagagcacc 1440

aacctcgggt cggggacgtc ggtcgtcaag ggccccggct tcaccggcgg cgacatcctg 1500

cggcggacga gcccggggca gatctcgaca ctgcgcgtga acatcaccgc ccccctgagc 1560

cagcgctacc gggtgcgaat ccggtacgcg agcaccacca acctgcagtt ccacaccagc 1620

atcgacggtc ggccgatcaa ccagggaaac ttcagcgcca ccatgagcag cggcagcaac 1680

ctccagtcgg gttcgttccg gacggtaggc ttcaccaccc ccttcaactt cagcaacggc 1740

tcgtcggtct tcacgctctc ggcgcacgtc ttcaacagcg gcaacgaggt gtacatcgac 1800

aggatcgagt tcgtcccggc ggaggtcacg ttcgaggctg agtac 1845

<210> 2

<211> 2367

<212> DNA

<213> 人工改造设计

<400> 2

ggtaaaggaa acaacaccaa gttgagcacc agggcgttgc cgagcttcat cgactacttc 60

aacggcatct acggattcgc gaccggcatc aaggacatca tgaacatgat cttcaagacg 120

gacacgggcg gcgacctgac gctggacgag atcttgaaga accagcagct gctgaacgac 180

atctccggca agttggacgg ggtgaacggc agcttgaacg acctgatcgc acagggcaac 240

ttgaacacgg agttgtcgaa ggagatcttg aagatcgcca acgagcagaa ccaggtcttg 300

aacgacgtca acaacaagct cgacgcgatc aacacgatgc tgcgggtcta cctgccgaag 360

atcacctcga tgttgagcga cgtcatgaag cagaactacg cgctgagcct gcagatcgag 420

tacttgagca agcagttgca ggagatctcc gacaagttgg acatcatcaa cgtcaacgtg 480

ctgatcaact cgacgctcac cgagatcacg cctgcgtacc agaggatcaa gtacgtgaac 540

gagaagttcg aggagttgac cttcgcgacc gagaccagct cgaaggtcaa gaaggacggc 600

tcgccggccg acatcctcga cgagttgacc gagttgaccg agctagcgaa gagcgtcacc 660

aagaacgacg tcgacggctt cgagttctac ctcaacacgt tccacgacgt catggtcggc 720

aacaacttgt tcgggcgctc cgccttgaag accgcctccg agttgatcac gaaggagaac 780

gtgaagacca gcggcagcga ggtcggcaac gtctacaact tcctcatcgt cttgaccgcg 840

ctgcaggcgc aggccttcct cacgttgacg acgtgccgca agttgttggg cttggccgac 900

atcgactaca cgtccatcat gaacgagcac ttgaacaagg agaaggagga gttcagggtc 960

aacatcctgc cgacgctgtc gaacacgttc tcgaacccga actacgcgaa ggtcaagggc 1020

agcgacgagg acgcgaagat gatcgtggag gcgaagccgg gccacgcctt gatcggcttc 1080

gagatcagca acgactcgat cacggtcttg aaggtctacg aggcgaagct gaagcagaac 1140

taccaggtcg acaaggactc cttgtcggag gtcatctacg gcgacatgga caagttgttg 1200

tgcccggacc agtccgagca gatctactac acgaacaaca tcgtcttccc gaacgagtac 1260

gtcatcacga agatcgactt cacgaagaag atgaagacgt tgaggtacga ggtcacggcg 1320

aacttctacg actcgtccac gggcgagatc gacttgaaca agaagaaggt cgagtcgagc 1380

gaggcggagt acaggacgtt gagcgccaac gacgacggcg tgtacatgcc gttgggcgtc 1440

atcagtgaga cgttcttgac gccgatcaac gggttcggcc tccaggccga cgagaactcc 1500

aggttgatca cgttgacgtg caagtcctac ttgagggagc tgctgctcgc cacggacttg 1560

agcaacaagg agacgaagtt gatcgtcccg ccgagcggct tcatcagcaa catcgtcgag 1620

aacgggtcca tcgaggagga caacttggag ccgtggaagg cgaacaacaa gaacgcgtac 1680

gtcgaccaca ccggcggcgt gaacggcacg aaggcgttgt acgtccacaa ggacggcggc 1740

atctcgcagt tcatcggcga caagttgaag ccgaagacgg agtacgtcat ccagtacacg 1800

gtcaagggca agccgtcgat ccacttgaag gacgagaaca cgggctacat ccactacgag 1860

gacacgaaca acaacttgga ggactaccag acgatcaaca agcgcttcac gaccggcacg 1920

gacttgaagg gcgtgtactt gatcttgaag agccagaacg gcgacgaggc gtggggcgac 1980

aacttcatca tcttggagat cagcccgtcg gagaagttgt tgagcccgga gttgatcaac 2040

acgaacaact ggacgagcac gggctcgacg aacatcagcg gcaacacgct cacgctctac 2100

cagggcggac gcggcatcct gaagcagaac ctgcagttgg acagcttctc gacgtacaga 2160

gtgtacttct cggtgtccgg agacgcgaac gtcaggatca ggaactctag ggaagtgttg 2220

ttcgagaaga ggtacatgag cggtgcgaag gacgtctccg agatgttcac gacgaagttc 2280

gagaaggaca acttctacat cgagctgtcg caagggaaca acttgtacgg tggtcctatc 2340

gtccacttct acgacgtctc gatcaag 2367

<210> 3

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工设计

<400> 3

gccaacggaa gcggtggagg cggaggtggc agcagcggtg gtggcggagc caacgtcgcc 60

agcgtcgtcc cc 72

<210> 4

<211> 4287

<212> DNA

<213> 人工设计

<400> 4

atggacaaca acccgaacat caacgagtgc atcccctaca actgcctgag caaccccgag 60

gtcgaggtcc tcggaggcga gcggatcgag accggctaca cccccatcga catcagcctg 120

tcgctcacgc agttcctcct gtccgaattc gtgcccggcg ccggcttcgt gctgggcctg 180

gtcgacatca tctgggggat cttcgggccg agccagtggg acgccttcct ggtgcagatc 240

gagcaactca tcaaccagcg gatcgaggaa ttcgcccgca accaggccat cagccgcctg 300

gaggggctct ccaacttgta ccagatctac gccgagagct tccgcgagtg ggaggccgac 360

ccgacgaatc cggcgttgag ggaagagatg cgcatccagt tcaacgacat gaacagcgcc 420

ctcacgacgg cgatcccgct cttcgcggtc cagaattacc aggtgcccct gctgagcgtg 480

tatgtccagg cggcgaacct ccatttgtcg gtgctgcgcg acgtcagcgt gttcggccag 540

cgctgggggt tcgacgcggc gacgatcaac agccgctaca acgacctgac ccgcctgatc 600

gggaactaca cggatcacgc ggtccggtgg tacaacaccg gcctggagcg cgtgtggggt 660

ccggactcca gggactggat ccgctacaac cagttccgcc gcgagctgac cctgaccgtg 720

ctcgatatcg tcagcttgtt ccctaactac gacagccgca cctaccccat ccgcaccgtg 780

tcgcagctca cgagggagat ttacacgaac cccgtgctgg agaacttcga cggcagcttc 840

cgggggtccg cgcaggggat cgaggggtcg atccgcagcc cccacctgat ggacatcctg 900

aactcgatca cgatctacac ggacgcgcac cgcggcgagt actactggag cggccaccag 960

atcatggcgt cgccggtggg cttctcgggc cccgagttca ccttccccct gtacggcacc 1020

atggggaacg cggccccgca gcagcggatc gtggcacagc tgggccaggg agtgtaccgc 1080

acgctcagca gcacgctcta ccgccgcccg ttcaacatcg gcatcaacaa ccagcagctg 1140

tcggtcctcg atgggacgga gttcgcgtac ggcaccagca gcaacctgcc cagcgccgtg 1200

taccggaagt cagggacggt cgactcgctc gacgagatcc cccctcagaa caacaacgtg 1260

ccgccgcggc aggggttctc gcaccggctc agccacgtga gcatgttccg cagtggcttc 1320

tcgaactcgt cggtctcgat catccgcgcg cctatgttca gctggattca ccgcagtgcc 1380

gaattcaaca acatcattcc gtcgtcgcag atcacccaga tccccctgac caagagcacc 1440

aacctcgggt cggggacgtc ggtcgtcaag ggccccggct tcaccggcgg cgacatcctg 1500

cggcggacga gcccggggca gatctcgaca ctgcgcgtga acatcaccgc ccccctgagc 1560

cagcgctacc gggtgcgaat ccggtacgcg agcaccacca acctgcagtt ccacaccagc 1620

atcgacggtc ggccgatcaa ccagggaaac ttcagcgcca ccatgagcag cggcagcaac 1680

ctccagtcgg gttcgttccg gacggtaggc ttcaccaccc ccttcaactt cagcaacggc 1740

tcgtcggtct tcacgctctc ggcgcacgtc ttcaacagcg gcaacgaggt gtacatcgac 1800

aggatcgagt tcgtcccggc ggaggtcacg ttcgaggctg agtacgccaa cggaagcggt 1860

ggaggcggag gtggcagcag cggtggtggc ggagccaacg tcgccagcgt cgtccccggt 1920

aaaggaaaca acaccaagtt gagcaccagg gcgttgccga gcttcatcga ctacttcaac 1980

ggcatctacg gattcgcgac cggcatcaag gacatcatga acatgatctt caagacggac 2040

acgggcggcg acctgacgct ggacgagatc ttgaagaacc agcagctgct gaacgacatc 2100

tccggcaagt tggacggggt gaacggcagc ttgaacgacc tgatcgcaca gggcaacttg 2160

aacacggagt tgtcgaagga gatcttgaag atcgccaacg agcagaacca ggtcttgaac 2220

gacgtcaaca acaagctcga cgcgatcaac acgatgctgc gggtctacct gccgaagatc 2280

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atcaactcga cgctcaccga gatcacgcct gcgtaccaga ggatcaagta cgtgaacgag 2460

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ccggccgaca tcctcgacga gttgaccgag ttgaccgagc tagcgaagag cgtcaccaag 2580

aacgacgtcg acggcttcga gttctacctc aacacgttcc acgacgtcat ggtcggcaac 2640

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aagaccagcg gcagcgaggt cggcaacgtc tacaacttcc tcatcgtctt gaccgcgctg 2760

caggcgcagg ccttcctcac gttgacgacg tgccgcaagt tgttgggctt ggccgacatc 2820

gactacacgt ccatcatgaa cgagcacttg aacaaggaga aggaggagtt cagggtcaac 2880

atcctgccga cgctgtcgaa cacgttctcg aacccgaact acgcgaaggt caagggcagc 2940

gacgaggacg cgaagatgat cgtggaggcg aagccgggcc acgccttgat cggcttcgag 3000

atcagcaacg actcgatcac ggtcttgaag gtctacgagg cgaagctgaa gcagaactac 3060

caggtcgaca aggactcctt gtcggaggtc atctacggcg acatggacaa gttgttgtgc 3120

ccggaccagt ccgagcagat ctactacacg aacaacatcg tcttcccgaa cgagtacgtc 3180

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ttctacgact cgtccacggg cgagatcgac ttgaacaaga agaaggtcga gtcgagcgag 3300

gcggagtaca ggacgttgag cgccaacgac gacggcgtgt acatgccgtt gggcgtcatc 3360

agtgagacgt tcttgacgcc gatcaacggg ttcggcctcc aggccgacga gaactccagg 3420

ttgatcacgt tgacgtgcaa gtcctacttg agggagctgc tgctcgccac ggacttgagc 3480

aacaaggaga cgaagttgat cgtcccgccg agcggcttca tcagcaacat cgtcgagaac 3540

gggtccatcg aggaggacaa cttggagccg tggaaggcga acaacaagaa cgcgtacgtc 3600

gaccacaccg gcggcgtgaa cggcacgaag gcgttgtacg tccacaagga cggcggcatc 3660

tcgcagttca tcggcgacaa gttgaagccg aagacggagt acgtcatcca gtacacggtc 3720

aagggcaagc cgtcgatcca cttgaaggac gagaacacgg gctacatcca ctacgaggac 3780

acgaacaaca acttggagga ctaccagacg atcaacaagc gcttcacgac cggcacggac 3840

ttgaagggcg tgtacttgat cttgaagagc cagaacggcg acgaggcgtg gggcgacaac 3900

ttcatcatct tggagatcag cccgtcggag aagttgttga gcccggagtt gatcaacacg 3960

aacaactgga cgagcacggg ctcgacgaac atcagcggca acacgctcac gctctaccag 4020

ggcggacgcg gcatcctgaa gcagaacctg cagttggaca gcttctcgac gtacagagtg 4080

tacttctcgg tgtccggaga cgcgaacgtc aggatcagga actctaggga agtgttgttc 4140

gagaagaggt acatgagcgg tgcgaaggac gtctccgaga tgttcacgac gaagttcgag 4200

aaggacaact tctacatcga gctgtcgcaa gggaacaact tgtacggtgg tcctatcgtc 4260

cacttctacg acgtctcgat caagtaa 4287

<210> 5

<211> 1428

<212> PRT

<213> 人工改造

<400> 5

Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu

1 5 10 15

Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu Thr Gly

20 25 30

Tyr Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gln Phe Leu Leu Ser

35 40 45

Glu Phe Val Pro Gly Ala Gly Phe Val Leu Gly Leu Val Asp Ile Ile

50 55 60

Trp Gly Ile Phe Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile

65 70 75 80

Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala

85 90 95

Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu

100 105 110

Ser Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu

115 120 125

Glu Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr Ala

130 135 140

Ile Pro Leu Phe Ala Val Gln Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser Val

145 150 155 160

Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser

165 170 175

Val Phe Gly Gln Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg

180 185 190

Tyr Asn Asp Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp His Ala Val

195 200 205

Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg

210 215 220

Asp Trp Ile Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val

225 230 235 240

Leu Asp Ile Val Ser Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Thr Tyr Pro

245 250 255

Ile Arg Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn Pro Val

260 265 270

Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala Gln Gly Ile Glu

275 280 285

Gly Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu Asn Ser Ile Thr

290 295 300

Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Glu Tyr Tyr Trp Ser Gly His Gln

305 310 315 320

Ile Met Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly Pro Glu Phe Thr Phe Pro

325 330 335

Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala Pro Gln Gln Arg Ile Val Ala

340 345 350

Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr Arg

355 360 365

Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile Asn Asn Gln Gln Leu Ser Val Leu Asp

370 375 380

Gly Thr Glu Phe Ala Tyr Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala Val

385 390 395 400

Tyr Arg Lys Ser Gly Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln

405 410 415

Asn Asn Asn Val Pro Pro Arg Gln Gly Phe Ser His Arg Leu Ser His

420 425 430

Val Ser Met Phe Arg Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser Val Ser Ile Ile

435 440 445

Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala Glu Phe Asn Asn

450 455 460

Ile Ile Pro Ser Ser Gln Ile Thr Gln Ile Pro Leu Thr Lys Ser Thr

465 470 475 480

Asn Leu Gly Ser Gly Thr Ser Val Val Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly

485 490 495

Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr Ser Pro Gly Gln Ile Ser Thr Leu Arg

500 505 510

Val Asn Ile Thr Ala Pro Leu Ser Gln Arg Tyr Arg Val Arg Ile Arg

515 520 525

Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Leu Gln Phe His Thr Ser Ile Asp Gly Arg

530 535 540

Pro Ile Asn Gln Gly Asn Phe Ser Ala Thr Met Ser Ser Gly Ser Asn

545 550 555 560

Leu Gln Ser Gly Ser Phe Arg Thr Val Gly Phe Thr Thr Pro Phe Asn

565 570 575

Phe Ser Asn Gly Ser Ser Val Phe Thr Leu Ser Ala His Val Phe Asn

580 585 590

Ser Gly Asn Glu Val Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Phe Val Pro Ala Glu

595 600 605

Val Thr Phe Glu Ala Glu Tyr Ala Asn Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly

610 615 620

Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ala Asn Val Ala Ser Val Val Pro Gly

625 630 635 640

Lys Gly Asn Asn Thr Lys Leu Ser Thr Arg Ala Leu Pro Ser Phe Ile

645 650 655

Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp Ile

660 665 670

Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu Asp

675 680 685

Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Asp Ile Ser Gly Lys Leu

690 695 700

Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn Leu

705 710 715 720

Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln Asn

725 730 735

Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr Met

740 745 750

Leu Arg Val Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val Met

755 760 765

Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys Gln

770 775 780

Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val Leu

785 790 795 800

Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile Lys

805 810 815

Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr Ser

820 825 830

Ser Lys Val Lys Lys Asp Gly Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu Leu

835 840 845

Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val Asp

850 855 860

Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly Asn

865 870 875 880

Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile Thr

885 890 895

Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr Asn

900 905 910

Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Gln Ala Phe Leu Thr Leu

915 920 925

Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr Ser

930 935 940

Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val Asn

945 950 955 960

Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala Lys

965 970 975

Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys Pro

980 985 990

Gly His Ala Leu Ile Gly Phe Glu Ile Ser Asn Asp Ser Ile Thr Val

995 1000 1005

Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp

1010 1015 1020

Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Asp Met Asp Lys Leu

1025 1030 1035

Leu Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile

1040 1045 1050

Val Phe Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys

1055 1060 1065

Lys Met Lys Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp

1070 1075 1080

Ser Ser Thr Gly Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser

1085 1090 1095

Ser Glu Ala Glu Tyr Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val

1100 1105 1110

Tyr Met Pro Leu Gly Val Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile

1115 1120 1125

Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala Asp Glu Asn Ser Arg Leu Ile Thr

1130 1135 1140

Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp

1145 1150 1155

Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile Val Pro Pro Ser Gly Phe

1160 1165 1170

Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Gly Ser Ile Glu Glu Asp Asn Leu

1175 1180 1185

Glu Pro Trp Lys Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr Val Asp His Thr

1190 1195 1200

Gly Gly Val Asn Gly Thr Lys Ala Leu Tyr Val His Lys Asp Gly

1205 1210 1215

Gly Ile Ser Gln Phe Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Lys Thr Glu

1220 1225 1230

Tyr Val Ile Gln Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro Ser Ile His Leu

1235 1240 1245

Lys Asp Glu Asn Thr Gly Tyr Ile His Tyr Glu Asp Thr Asn Asn

1250 1255 1260

Asn Leu Glu Asp Tyr Gln Thr Ile Asn Lys Arg Phe Thr Thr Gly

1265 1270 1275

Thr Asp Leu Lys Gly Val Tyr Leu Ile Leu Lys Ser Gln Asn Gly

1280 1285 1290

Asp Glu Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile Leu Glu Ile Ser Pro

1295 1300 1305

Ser Glu Lys Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Asn Thr Asn Asn Trp

1310 1315 1320

Thr Ser Thr Gly Ser Thr Asn Ile Ser Gly Asn Thr Leu Thr Leu

1325 1330 1335

Tyr Gln Gly Gly Arg Gly Ile Leu Lys Gln Asn Leu Gln Leu Asp

1340 1345 1350

Ser Phe Ser Thr Tyr Arg Val Tyr Phe Ser Val Ser Gly Asp Ala

1355 1360 1365

Asn Val Arg Ile Arg Asn Ser Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Arg

1370 1375 1380

Tyr Met Ser Gly Ala Lys Asp Val Ser Glu Met Phe Thr Thr Lys

1385 1390 1395

Phe Glu Lys Asp Asn Phe Tyr Ile Glu Leu Ser Gln Gly Asn Asn

1400 1405 1410

Leu Tyr Gly Gly Pro Ile Val His Phe Tyr Asp Val Ser Ile Lys

1415 1420 1425

Claims

1.一种抗虫融合基因M2CryAb-VIP3A，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.一种抗虫融合基因编码的蛋白M2CryAb-VIP3A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

3.一种含有权利要求1所述抗虫融合基因M2CryAb-VIP3A的表达载体。

4.一种由权利要求3所述表达载体构建的重组菌。

5.权利要求1所述抗虫融合基因M2CryAb-VIP3A在培育抗虫玉米品种中的应用。

6.权利要求2所述抗虫融合基因编码的蛋白M2CryAb-VIP3A在制备抗虫生物制剂中的应用。