CN111041036B

CN111041036B - 编码杀虫蛋白抗虫融合基因mCryAb-VIP3A、其表达载体及其应用

Info

Publication number: CN111041036B
Application number: CN201911294926.5A
Authority: CN
Inventors: 岳润清; 铁双贵; 刘璐; 陈娜娜; 徐心志; 卢董华; 郭新海
Original assignee: Henan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Henan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-12-16
Filing date: 2019-12-16
Publication date: 2023-06-23
Anticipated expiration: 2039-12-16
Also published as: CN111041036A

Abstract

本发明公开了一种编码杀虫蛋白抗虫融合基因mCryAb‑VIP3A、其表达载体及其应用，旨在解决昆虫对杀虫制剂的抗药性趋势不可遏制的技术问题。本发明设计了抗虫基因和抗虫融合基因mCryAb‑VIP3A，还提供了抗虫融合基因编码的蛋白，并设计了由抗虫融合基因构建的表达载体、由表达载体构建的重组菌。将抗虫融合基因在制备抗虫植物细胞中应用。将抗虫融合基因编码的蛋白在制备抗虫制剂中应用。本发明抗虫融合基因能在玉米中稳定表达，避免了原始VIP3A (a)基因单独转入植物产生的生物毒性，克服了外源基因表达存在的基因沉默现象，为植物害虫防治提供更多的选择，为遏制昆虫对杀虫制剂的抗药性趋势提供了新的方法。

Description

编码杀虫蛋白抗虫融合基因mCryAb-VIP3A、其表达载体及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种编码杀虫蛋白抗虫融合基因mCryAb-VIP3A、其表达载体及其应用。

背景技术

以农作物为食的害虫达百万种之多，造成巨大的经济损失，严重影响作物产量和品质。目前农作物害虫的防治主要还是依赖于化学农药，长期大量使用化学农药对环境和健康造成很大的危害。为了减少环境污染和对人类健康潜在的危害，利用生物技术开发新型药剂成为研究热点。

随着分子生物学技术的发展和基因克隆、DNA操作等技术出现，人类开始将抗虫基因克隆到工程菌中，进一步获得了抗性转基因植株，其中很多已进入大田试验，甚至有的已经开始大面积种植。

优良目标基因的选择和克隆是基因工程研究的基础，现有抗虫基因的克隆主要有：

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）抗虫基因：Bt在形成芽孢的过程中产生的杀虫蛋白晶体，敏感性昆虫摄取后，在中肠碱性条件下被水解为多肽，可使细胞膜上形成孔道，进而破坏细胞的离子平衡，最终导致细胞裂解，致使昆虫死亡；蛋白酶抑制剂基因：对维持生物体正常代谢和预防外来蛋白水解酶对基体的破坏起着重要作用，可抑制昆虫肠道蛋白酶活性，造成昆虫消化不良，最终因缺乏氨基酸，生长发育受限继而死亡；植物凝集素基因：含二价金属离子的糖蛋白，可使昆虫，尤其是刺吸式口器的昆虫，红细胞发生凝聚作用，进而引发死亡；几丁质酶基因：几丁质是真菌细胞壁、昆虫外壳的重要组成部分，几丁质酶广是一种泛存在于植物中的内源性蛋白质，具有抵御病原性真菌、食草昆虫的重要作用；蝎昆虫毒素基因：可特异性结合于昆虫神经细胞膜上的钠离子通道，引起钠离子的通透性改变，从而使昆虫麻痹、死亡。

目前从大量的Bt菌株中分离出至少90种基因编码的杀虫结晶蛋白。昆虫病原菌Bt基因产生Cry、Cyt和Vips等3种蛋白。Cry和Cyt蛋白产生聚集在包涵体或旁孔晶体中的杀虫蛋白，Cry蛋白根据蛋白结构同源性和寄主范围，将这些基因划分为CryI、CryII、CryIII和CryIV4个主要类型。其中，CryI高抗鳞翅目昆虫，CryII抗鳞翅目和和双翅目昆虫，CryⅢ高抗鞘翅目昆虫，CryIV抗双翅目昆虫。近年又相继发现了兼抗鳞翅目和鞘翅目的Bt毒蛋白（CryV）、抗线虫的Bt毒蛋白（CryVI）。大多数苏云金芽孢杆菌株系可产生几种杀虫结晶蛋白，但每一种杀虫结晶蛋白寄主范围相当狭窄。

除上述几类外，还有豌豆脂氧合酶基因、昆虫雌虫不育蛋白因子基因、昆虫保幼激素脂酶基因、昆虫神经激素基因等等。

但是，上述转抗虫基因的抗虫植物在应用中的潜在问题也日益显露，影响其持续利用。如：将原始抗虫基因直接应用到转基因植物中获得的转基因植物抗虫性很低、抗虫性效果差，毒蛋白的表达量低量也很低且表达产物不稳定，不能满足农业生产上的虫害防治需求，大多难以推广应用；随着抗虫基因的大范围应用，昆虫还会对杀虫蛋白还会产生抗性；抗虫基因的抗虫谱窄；外源基因在植物体内的表达存在基因“沉默”现象，等等。

因此，研发新的抗虫基因或充分利用现有抗虫基因资源来应对昆虫对杀虫制剂的抗药性趋势，已成为当务之急。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何选择并改造出优良的抗虫基因，进而设计出编码杀虫蛋白抗虫融合基因，并将其或其表达载体应用于抗虫植物细胞或抗虫制剂中，以解决昆虫对杀虫制剂的抗药性趋势不可遏制的技术问题，以为植物害虫防治提供更多样化的技术手段。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

设计了一种抗虫基因VIP3A(a)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

基于长期大量试验和实践经验，设计了一种抗虫融合基因mCryAb-VIP3A，其特征在于，其核苷酸序列为：

（1）如SEQ ID NO.5所示的核酸序列；或

（2）由SEQ ID NO.5所示的核酸序列衍生的具有同等功能的核酸序列。

提供了一种抗虫融合基因编码的蛋白mCryAb-VIP3A，其氨基酸序列为：

（1）如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；或

（2）在SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列的基础上进行一个或多个氨基酸的添加、删除或替换而获得活性片段或保守性变异体的序列。

结合实用特性进一步设计了一种由所述抗虫融合基因mCryAb-VIP3A构建的表达载体、由所述表达载体构建的重组菌。

将所述抗虫融合基因mCryAb-VIP3A在制备抗虫植物细胞中应用。

优选的，所述植物为单子叶植物。

优选的，所述单子叶植物为玉米。

将所述抗虫融合基因编码的蛋白mCryAb-VIP3A在制备抗虫制剂中应用。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：

1. 本发明优选现有具有改造潜力的抗虫基因，并重新设计、改造得到了全新的抗虫基因CryAb和抗虫基因VIP3A(a)，其可以显著提高杀虫蛋白的表达量，进而培育转化出抗虫转基因玉米新品种。

2. 本发明通过对改造得的抗虫基因进一步的连接融合得到全新的抗虫融合基因mCryAb-VIP3A，大大增强了转化作物的抗虫、杀虫效果，且扩大了杀虫谱，获得除抗螟虫外兼抗其他鳞翅目害虫或鞘翅目害虫（如草地贪夜蛾、粘虫、地老虎等）的作物新品种。

3. 本发明抗虫融合基因mCryAb-VIP3A能够在玉米中稳定表达，避免了原始VIP3A (a)基因单独转入植物产生的生物毒性，克服了外源基因在植物体内表达存在的基因沉默现象，并能够显著提高玉米叶片的抗虫性。

4. 本发明抗虫融合基因mCryAb-VIP3A具有优良的杀虫活性，为植物害虫防治提供更多的选择，为遏制昆虫对杀虫制剂的抗药性趋势提供了新的方法。

5. 本发明抗虫融合基因mCryAb-VIP3A、重组表达载体和重组菌在提供植物抗虫性具有广阔的应用空间和市场前景。

6. 本发明将抗虫融合基因mCryAb-VIP3A导入玉米后，可以得到稳定遗传的转化体；此外，该基因也可以转化棉花、水稻、蔬菜等农作物，使其具备相应的抗虫活性，从而降低农药的使用量，以减少环境污染，具有重要的经济价值和广阔的应用前景。

7. 本发明抗虫融合基因编码的蛋白mCryAb-VIP3A具有优良的杀虫效果，可应用于制备抗虫制剂中，绿色环保，无污染。

附图说明

图1为pCAMBIA3300- mCryAb-VIP3A的质粒图谱。

图2为采用农杆菌介导法获得的转mCryAb-VIP3A基因玉米的愈伤组织的筛选。

图3为采用农杆菌介导法获得的转mCryAb-VIP3A基因玉米的愈伤组织分化。

图4为采用农杆菌介导法获得的转mCryAb-VIP3A基因玉米的转基因植株再生苗。

图5为T₀代转化体目的基因mCryAb-VIP3A的PCR检测图；

其中，M：DL2000 plus；CK1：阳性对照[质粒pCAMBIA3300-mCryAb-VIP3A]；CK2：阴性对照：（非转基因玉米）；空白：空白对照（双蒸水）；1～10：是转基因株系。

图6为T₀代转化体选择标记基因Bar的PCR检测图；

图7为T₀代转mCryAb-VIP3A基因转化体目的蛋白CryAb的免疫学检测。

图8为T₀代转mCryAb-VIP3A基因转化体目的蛋白Vip3A的免疫学检测。

图9为T₀代转mCryAb-VIP3A基因转化体目的蛋白筛选标记蛋白bar的免疫学检测。

以上图7～9中，CK为非转基因苗阴性对照；1～10为转基因株系。

图10为转mCryAb-VIP3A抗虫基因玉米苗期叶片亚洲玉米螟抗性室内生测对比图。

图11为转mCryAb-VIP3A抗虫基因玉米苗期叶片草地贪夜蛾抗性室内生测对比图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂或产品如无特别说明，均为市售常规试剂或产品；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例一：抗虫基因Cry1Ab 和VIP3A(a)的改造

发明人基于长期大量的试验研究和科研实践经验，在原始Cry1Ab（GenBank序列号为 AY847289.1）抗虫基因的基础上进行了大幅的改进设计，主要包括密码子改造，确认并排除原始抗虫基因DNA序列中多处ATTTA、AATGAA等AT富集区和基因序列中存在的反向重复序列，去掉部分常用限制性内切酶识别位点序列（XbaI、SacI），减少了不明确的真核DNA序列内含子的序列和可能引起该基因转录提前终止或引起mRNA不稳定的序列，并在3’端的终止密码子修改为GGG，最终获得了优良的适用于单子叶植物的抗虫基因Cry1Ab，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

从微生物苏云金芽孢杆菌在营养生长期产生的杀虫蛋白为VIP蛋白，是菌体在营养生长时期产生且分泌到培养基中的杀虫蛋白。VIP蛋白根据其氨基酸特性分为四个家族，且功能不尽相同。VIP1和VIP2蛋白作为二元毒素，对鞘翅目和半翅目的一些成员有毒。VIP1组分被认为与昆虫中肠膜上的受体结合，VIP2组分进入细胞，在细胞中显示其对肌动蛋白的ADP核糖转移酶活性，防止微丝形成。VIP3与VIP1或VIP2没有序列相似性。而对于最近报道的VIP4家族，还没有发现目标昆虫。发明人发现尽管VIP3a蛋白不与cry蛋白共享结合位点，后者的特性使它们很好地与转基因植物中的cry蛋白结合，以预防或延迟抗虫性，并扩大杀虫谱。

在原始VIP3A(a)（核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示）抗虫基因的基础上进行了大幅的改进设计，主要包括：只留下部分缺失的2373bp的一段碱基序列；除5’端15bp碱基序列改变，其氨基酸组成发生变化外，剩余2358bp序列在保持序列蛋白的氨基酸组成总体不变的情况下，用植物偏爱的密码子进行碱基置换，初步获得一个改造的DNA序列；排除DNA序列中存在的造成植物转录不稳定的富含AT序列（如ATTTA、AATGAA等）以及常用限制性酶切位点（HindIII、SacI），然后通过置换密码子的方法进行改正消除；并在3’端加上终止密码子TAG；最终获得按照单子叶植物编码特征设计了密码子优化的抗虫基因VIP3A(a)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

改造合成的苏云金芽胞杆菌营养杀虫蛋白VIP3A(a)基因，与原始VIP3A(a)基因的序列相比较，具有以下特点：

（1）5’端15bp碱基序列从原始的ATGAACATGAACAAG碱基序列改变为改造后的GTCCCCGGTAAAGGA碱基序列；

（2）5’端5个蛋白氨基酸序列从原始的MNMNK氨基酸改造后为VPGKGAN序列；

（3）碱基组成的统计结果为：原始基因的A+T 含量 69.11%，G+C含量为30.89%，新合成基因的A+T含量为 51.22 %，G+C含量为48.78%。

实施例二：抗虫融合基因mCryAb-VIP3A的构建

将优化好的Cry1Ab基因和优化好的vip3A(a)基因通过中间序列L进行连接，并将将Cry1Ab基因3端终止密码子除去，基因阅读框就可以连续表达至优化改造过vip3A(a)基因，形成优化改造后Cry1Ab基因和vip3A的融合基因，进行全基因合成。优化改成的抗虫融合基因mCryAb-L-VIP3A(a)，命名为mCryAb-VIP3A。连接序列L的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；抗虫融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，其编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示。

为了检测改造的mCryAb-VIP3A基因体外表达及对玉米螟等害虫的毒性情况，构建了该融合基因的原核表达载体。根据克隆Bt基因需要，在引物序列的5’端添加NdeI内切酶识别位点序列CATATG，3’端添加HindIII内切酶识别位点序列AAGCTT。

设计引物序列如下：

上游引物F1：5’-CATATGGACAACAACCCGAACATC-3’；

下游引物R1：5’-AAGCTTCTTACTTGATAGAGACGTCGT-3’。

由生工生物工程（上海）股份有限公司合成含mCryAb-VIP3A基因的pUC- mCryAb- VIP3A质粒，以该质粒为模板，以F1和R1为引物，扩增mCryAb-VIP3A基因，用限制性内切酶NdeI和HindIII进行酶切，凝胶回收试剂盒回收纯化mCryAb-VIP3A基因片段。

用限制性内切酶NdeI和HindIII酶切pET28b+，凝胶回收试剂盒回收纯化5.3kb片段。将pET28b+质粒片段和纯化mCryAb-VIP3A基因片段进行连接反应，构建所得原核表达质粒命名为pET-mCryAb-VIP3A。用限制性内切酶NdeI和HindIII进行酶切鉴定，表明载体构建正确。将pET-mCryAb-VIP3A转化BL21(DE3)感受态细胞备用。

实施例三：抗虫融合基因mCryAb-VIP3A在大肠杆菌中表达

1. 重组大肠杆菌的构建

将重组质粒pET-mCryAb-VIP3A转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，筛选出阳性转化子。提取质粒酶切验证后，挑选阳性转化子接种至抗性培养基中，37℃过夜培养，以2%的接种量转接，培养至OD₆₀₀值约为0.5～0.6，4℃保存备用。

2. 检测重组菌表达产物室内杀虫效果测试

（1）试验处理分为4组：

将含重组pET- mCryAb-VIP3A大肠杆菌经IPTG诱导后，进行超声波破碎，收集的上清作为试验组；相同条件下培养含实施例一mCryAb基因序列的重组pET28b载体的E.coliBL21(DE3)和含实施例一改造的VIP3A(a)基因序列的重组pET28b载体的E.coli BL21(DE3)，进行超声波破碎，收集的上清作为对照组；以清水作为空白组。

（2）每组取等量的上清液体加入到配置的玉米螟饲料中作为试验饲料，饲养玉米螟进行虫试。

具体步骤为：

每个试管放入一条饲料，并分别接入饲养新生一龄幼虫（玉米螟、草地贪夜蛾、甜菜夜蛾、Bt抗性棉铃虫）10头；每个处理各接10个试管；放入温度26～28℃，相对湿度70%左右的环境中培养8天，检测平均死亡率和活虫单只重量。具体结果见表1。

表1 杀虫试验结果

。

表1统计结果表明：

改造mCryAb原核表达载体表达的蛋白对玉米螟具有很好的杀虫效果，玉米螟死亡率达到94.26%，对草地贪夜蛾和甜菜夜蛾也有一定的杀虫效果，但对Bt抗性棉铃虫计划没有几乎没有杀虫性；

改造VIP3A(a)原核表达载体表达的蛋白对草地贪夜蛾和甜菜夜蛾具有很好的杀虫效果，死亡率分别达到91.51%和90.11%，对玉米螟和Bt抗性棉铃虫也有一定的杀虫效果，玉米螟死亡率为80.76%，Bt抗性棉铃虫死亡率为69.98%；

而抗虫融蛋白mCryAb-VIP3A是利用连接肽将两个独立的蛋白质mCryAb和VIP3A(a)有效连接成为一个融合蛋白质，使得融合蛋白具有这两个蛋白质的功能。杀虫测试实验结果表明：mCryAb-VIP3A抗虫融合蛋白具有很强的杀虫性，对玉米螟、草地贪夜蛾、甜菜夜蛾和Bt抗性棉铃虫杀率都达到90%以上，杀虫效果非常显著。

由以上原核表达虫试实验可知：mCryAb-VIP3A基因编码的Bt杀虫蛋白具有很强的杀虫效果，说明mCryAb-VIP3A基因改造可表达出具有强生物活性的杀虫毒蛋白。

实施例四：构建mCryAb-VIP3A基因的重组表达载体和重组表达菌

具体步骤如下：

（1）以T载体为框架，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成含mCryAb-VIP3A基因的重组载体，命名为T-mCryAb-VIP3A；

（2）以T-mCryAb-VIP3A为模板，利用扩增引物克隆mCryAb-VIP3A基因；上游引物含XbaI酶切位点，下游引物含SacI酶切位点。

（3）用XbaI和SacI双酶切克隆的mCryAb-VIP3A产物，再回收基因片段；

（4）连入已经用XbaI和SacI双酶切处理的遗传转化高效植物表达载体pCAMBIA3300上，得mCryAb-VIP3A基因的重组表达载体，重组质粒命名为pCAMBIA3300-mCryAb-VIP3A，质粒图谱如图1所示。

（5）将重组质粒pCAMBIA3300-mCryAb-VIP3A转化至农杆菌EHA105中，筛选阳性菌株，得mCryAb-VIP3A基因的重组表达菌，低温保藏，用于后续试验。

实施例五：重组农杆菌介导转化玉米幼胚和愈伤组织

1. 剥离玉米幼胚

（1）去除玉米苞叶；

（2）切除果穗顶端约1cm左右，用镊子从顶端插入果穗，以镊子当作把手，然后把果穗放入含有消毒液的烧杯里，根据实际需要，可在同一个烧杯里放4～6个果穗；

（3）向烧杯里加约700mL的消毒液（50%的漂白剂或5.25%的次氯酸钠，并加入一滴Tween 20）浸泡果穗，消毒20min；在消毒期间，不时的旋转果穗同时轻轻拍打烧杯以驱除籽粒表面的气泡，从而达到最佳的消毒效果；

（4）消毒结束后，取出果穗并放入盛满灭菌水的烧杯里，在水里洗3次，然后准备剥胚；

（5）把消毒过果穗的一端放在一个大的培养皿上，用大的手术刀削掉籽粒的顶部（1.5～1.8mm），在这过程当中，要勤消毒所用的工具，如：手术刀片、培养皿、剥胚刀等；用剥胚刀的刀尖插在胚和胚乳之间，然后轻轻向上撬出幼胚，用小的手术刀尖轻轻托起幼胚，确保幼胚不受到任何的损伤，把幼胚的胚轴面紧贴放有滤纸的N6E培养基，胚的密度大约是2×2cm（30个/皿）；

（6）封口膜封住培养皿，28℃暗培养2～3天。

2. 重组农杆菌侵染

（1）取实施例四构建的重组农杆菌在YEP（含Kan 50 mg/L 和Str100 mg/L抗生素）培养基上活化培养；

（2）划线接种在YEP培养基（含Kan 50 mg/L 和Str 50 mg/L抗生素）中在19℃培养3天；

（3）挑取重组农杆菌放入含有5 mL浸染培养基的50 mL离心管中，同时加100 uMAS（inf+AS），在室温（25℃）转速75 rpm摇菌2～4 h；

（4）把剥离的幼胚放入含有inf+AS液体培养基（2 mL）的离心管中，每管约20～100个幼胚，用这样的培养基洗涤2次，然后加入1～1.5 mL OD₅₅₀=0.3～0.4的重组农杆菌，轻轻颠倒离心管20次，然后直立放置在暗箱里5 min，确保幼胚全部浸泡在农杆菌液体里，整个过程避免旋涡振荡。

3. 共培养

侵染后，把浸染过的幼胚转移到共培养培养基，使幼胚的胚轴接触培养基表面，同时用无菌滤纸吸干，驱除培养基表面多余的农杆菌；用封口膜封住培养皿，在20℃条件下暗培养3天。

4. 静息

共培养3天后，把幼胚转移到静息培养基上面，同时用封口膜封住培养皿，放在28℃条件下暗培养7天，如图2所示。

5. 选择

7天后，把所有的幼胚转移到选择培养基上面，培养两周，选择培养基含有1.5 mg/L的双丙氨磷，两周后再进行亚培养，双丙氨磷的浓度可以上升到3 mg/L，浸染大约5周左右，含有转化子的细胞会长成可以看见的II型愈伤组织，如图3所示。

6. 转基因植株的再生

在光照培养室，取愈伤组织在再生培养基I上面长3周，然后在再生培养基II上面发芽；待转基因再生苗生长出3～4片叶时，将其转移到温室，并进行检查，阳性植株保留，如图4所示。待其生长至吐丝散粉期时，对其进行授粉。

实施例六：检测mCryAb-VIP3A基因在玉米植株中的表达

1. PCR检测

待实施例五培养的转基因植株生长到5～6叶期时，CTAB法提取植株的叶片基因组DNA，设计引物进行PCR扩增mCryAb-VIP3A基因和质粒pCAMBIA3300上的抗草铵膦基因bar基因。

依据mCryAb-VIP3A基因和bar基因内部序列设计的PCR检测引物序列如下：

mCryAb-VIP3A-F’：AACCTCGGGTCGGGGACGTCG；

mCryAb-VIP3A-R’：CCAACTTGTCAGAGATCTCTTG；

目的片段大小：937bp。

bar-F：ATGAGCCCAGAACGACGCCCG；

bar-R：GCATATCCGAGCGCCTCGTGC；

目的片段大小：428bp。

PCR的反应体系为：2ul 的DNA 模板，2uL10×PCR Buffer缓冲液，2ul的dNTP(10mM each)，1ul上游引物(10mM)，1uL下游引物(10mM)，0.3uL Tap酶，无菌水补足20 ul。

PCR的反应程序如表2所示。

表2 PCR反应程序

。

检测结果如图5和图6所示：

图5显示了T₀代转化体目的基因mCryAb-VIP3A的PCR检测结果；图6显示了T₀代转化体选择标记基因Bar的PCR检测结果。证明外源基因mCryAb-VIP3A基因和bar基因已整合到玉米基因组中。

2. 试纸条检测

目的蛋白mCryAb-VIP3A的检测（Bt-Cry1Ab/1Ac免疫学和VIP3A检测）：

（1）取约1cm²左右新鲜幼嫩叶片放在1.5ml的Eppendorf 管中。然后将放有实施例五培养的转基因植株叶子的管插在冰盒中，以保持新鲜度。

（2）取液氮，将材料速冻，用钻头将材料研磨成粉，向管中迅速加入500μL-lmlSEB4样品提取缓冲液。

（3）从桶中取出检测条（北京汉德伟信科技有限公司），手持检测条顶端，做好检测标记。不要去掉保护膜。保持检测条垂直，将标记的末端插入至离心管或提取袋中。插入部分不要超过0.5cm。在检测过程中始终保持插入状态。

（4）3～5分钟内出现质控线，最长反应时间为30分钟，此时检测条可取出。质控线是用来确保试验结果的准确性的。如果质控线没有出现，检测无效。由于样品的流动性不同，产生信号的时间也不同。如果样品是阳性的，检测线将出现。如果样品是阴性的，检测线将不出现。如果想长期保存检测结果，可剪掉样品垫，用纸巾吸干，这将阻止残存的液体干扰结果。检测线的深浅反应了被检测蛋白的含量。

结果如图7～9所示：

表明抗虫基因mCryAb-VIP3A表达的目的蛋白CryAb-L、VIP3A(a)和筛选标记基因bar在转基因玉米中高效表达。

实施例七：鉴定转基因玉米植株中的抗虫性

1. 转mCryAb-VIP3A抗虫基因玉米苗期叶片亚洲玉米螟抗性室内生测鉴定

取温室中转mCryAb-VIP3A基因玉米植株幼苗生长至5～8叶期玉米植叶片（取未展开的幼嫩心叶），用消毒剪刀剪成2～3 cm大小，放在24孔细胞培养板中，每孔接3头初孵幼虫。以普通玉米植株叶片为对照组，转mCryAb-VIP3A基因植株叶片为试验组，培养1周后观察转基因玉米的抗虫效果。

结果如图10所示，非转基因玉米叶片全被亚洲玉米螟吃光，表现为超感虫，而转mCryAb-VIP3A基因玉米叶片无亚洲玉米螟虫害，抗性强，转mCryAb-VIP3A基因抗虫玉米表现为高抗亚洲玉米螟。

2. 转mCryAb-VIP3A抗虫基因玉米苗期叶片草地贪夜蛾抗性室内生测鉴定

供试草地贪夜蛾种群于2019年1月19日采自云南省德宏州鲜食玉米田。取温室中转mCryAb-VIP3A基因玉米植株幼苗生长至5～8叶期玉米植叶片（取未展开的幼嫩心叶），用消毒剪刀剪成2～3 cm大小，放在中，每孔接5头草地贪夜蛾成虫。以普通玉米植株叶片为对照组，转mCryAb-VIP3A基因植株叶片为试验组，24小时后观察转基因玉米的抗虫效果。

结果如图11所示，仅仅24小时后，非转基因玉米叶片几乎全被草地贪夜蛾吃光，表现为感草地贪夜蛾，而转mCryAb-VIP3A基因玉米叶片无近乎完整，无草地贪夜蛾危害，抗性极强，表明转mCryAb-VIP3A基因抗虫玉米表现为高抗草地贪夜蛾。

综上，转mCryAb-VIP3A抗虫基因玉米苗期叶片亚洲玉米螟和草地贪夜蛾抗性室内生测鉴定结果表明：通过mCryAb基因和VIP3A(a)基因的改造和融合，增加了单基因自身的抗虫性；此外，单基因的改造和融合使得融合基因表达的蛋白不仅高抗亚洲玉米螟，而且高抗草地贪夜蛾，不仅可以增强了作物的杀虫效果，而且扩大了杀虫谱，获得除抗螟虫外兼抗其他鳞翅目害虫或鞘翅目害虫（草地贪夜蛾）的作物新品种。

上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南省农业科学院

<120> 编码杀虫蛋白抗虫融合基因mCryAb-VIP3A、其表达载体及其应用

<130> 2019

<160> 5

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 1848

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atggacaaca acccgaacat caacgagtgc atcccctaca actgcctgag caaccccgag 60

gtcgaggtcc tcggaggcga gcggatcgag accggctaca cccccatcga catcagcctg 120

tcgctcacgc agttcctcct gtccgaattc gtgcccggcg ccggcttcgt gctgggcctg 180

gtcgacatca tctgggggat cttcgggccg agccagtggg acgccttcct ggtgcagatc 240

gagcaactca tcaaccagcg gatcgaggaa ttcgcccgca accaggccat cagccgcctg 300

gaggggctct ccaacttgta ccagatctac gccgagagct tccgcgagtg ggaggccgac 360

ccgacgaatc cggcgttgag ggaagagatg cgcatccagt tcaacgacat gaacagcgcc 420

ctcacgacgg cgatcccgct cttcgcggtc cagaattacc aggtgcccct gctgagcgtg 480

tatgtccagg cggcgaacct ccatttgtcg gtgctgcgcg acgtcagcgt gttcggccag 540

cgctgggggt tcgacgcggc gacgatcaac agccgctaca acgacctgac ccgcctgatc 600

gggaactaca cggatcacgc ggtccggtgg tacaacaccg gcctggagcg cgtgtggggt 660

ccggactcca gggactggat ccgctacaac cagttccgcc gcgagctgac cctgaccgtg 720

ctcgatatcg tcagcttgtt ccctaactac gacagccgca cctaccccat ccgcaccgtg 780

tcgcagctca cgagggagat ttacacgaac cccgtgctgg agaacttcga cggcagcttc 840

cgggggtccg cgcaggggat cgaggggtcg atccgcagcc cccacctgat ggacatcctg 900

aactcgatca cgatctacac ggacgcgcac cgcggcgagt actactggag cggccaccag 960

atcatggcgt cgccggtggg cttctcgggc cccgagttca ccttccccct gtacggcacc 1020

atggggaacg cggccccgca gcagcggatc gtggcacagc tgggccaggg agtgtaccgc 1080

acgctcagca gcacgctcta ccgccgcccg ttcaacatcg gcatcaacaa ccagcagctg 1140

tcggtcctcg atgggacgga gttcgcgtac ggcaccagca gcaacctgcc cagcgccgtg 1200

taccggaagt cagggacggt cgactcgctc gacgagatcc cccctcagaa caacaacgtg 1260

ccgccgcggc aggggttctc gcaccggctc agccacgtga gcatgttccg cagtggcttc 1320

tcgaactcgt cggtctcgat catccgcgcg cctatgttca gctggattca ccgcagtgcc 1380

gaattcaaca acatcattcc gtcgtcgcag atcacccaga tccccctgac caagagcacc 1440

aacctcgggt cggggacgtc ggtcgtcaag ggccccggct tcaccggcgg cgacatcctg 1500

cggcggacga gcccggggca gatctcgaca ctgcgcgtga acatcaccgc ccccctgagc 1560

cagcgctacc gggtgcgaat ccggtacgcg agcaccacca acctgcagtt ccacaccagc 1620

atcgacggtc ggccgatcaa ccagggaaac ttcagcgcca ccatgagcag cggcagcaac 1680

ctccagtcgg gttcgttccg gacggtaggc ttcaccaccc ccttcaactt cagcaacggc 1740

tcgtcggtct tcacgctctc ggcgcacgtc ttcaacagcg gcaacgaggt gtacatcgac 1800

aggatcgagt tcgtcccggc ggaggtcacg ttcgaggctg agtacggg 1848

<210> 2

<211> 2376

<212> DNA

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 2

atgaacatga acaagaataa tactaaatta agcacaagag ccttaccaag ttttattgat 60

tattttaatg gcatttatgg atttgccact ggtatcaaag acattatgaa catgattttt 120

aaaacggata caggtggtga tctaacccta gacgaaattt taaagaatca gcagttacta 180

aatgatattt ctggtaaatt ggatggggtg aatggaagct taaatgatct tatcgcacag 240

ggaaacttaa atacagaatt atctaaggaa atattaaaaa ttgcaaatga acaaaatcaa 300

gttttaaatg atgttaataa caaactcgat gcgataaata cgatgcttcg ggtatatcta 360

cctaaaatta cctctatgtt gagtgatgta atgaaacaaa attatgcgct aagtctgcaa 420

atagaatact taagtaaaca attgcaagag atttctgata agttggatat tattaatgta 480

aatgtactta ttaactctac acttactgaa attacacctg cgtatcaaag gattaaatat 540

gtgaacgaaa aatttgagga attaactttt gctacagaaa ctagttcaaa agtaaaaaag 600

gatggctctc ctgcagatat tcttgatgag ttaactgagt taactgaact agcgaaaagt 660

gtaacaaaaa atgatgtgga tggttttgaa ttttacctta atacattcca cgatgtaatg 720

gtaggaaata atttattcgg gcgttcagct ttaaaaactg catcggaatt aattactaaa 780

gaaaatgtga aaacaagtgg cagtgaggtc ggaaatgttt ataacttctt aattgtatta 840

acagctctgc aagcccaagc ttttcttact ttaacaacat gccgaaaatt attaggctta 900

gcagatattg attatacttc tattatgaat gaacatttaa ataaggaaaa agaggaattt 960

agagtaaaca tcctccctac actttctaat actttttcta atcctaatta tgcaaaagtt 1020

aaaggaagtg atgaagatgc aaagatgatt gtggaagcta aaccaggaca tgcattgatt 1080

gggtttgaaa ttagtaatga ttcaattaca gtattaaaag tatatgaggc taagctaaaa 1140

caaaattatc aagtcgataa ggattcctta tcggaagtta tttatggtga tatggataaa 1200

ttattgtgcc cagatcaatc tgaacaaatc tattatacaa ataacatagt atttccaaat 1260

gaatatgtaa ttactaaaat tgatttcact aaaaaaatga aaactttaag atatgaggta 1320

acagcgaatt tttatgattc ttctacagga gaaattgact taaataagaa aaaagtagaa 1380

tcaagtgaag cggagtatag aacgttaagt gctaatgatg atggggtgta tatgccgtta 1440

ggtgtcatca gtgaaacatt tttgactccg attaatgggt ttggcctcca agctgatgaa 1500

aattcaagat taattacttt aacatgtaaa tcatatttaa gagaactact gctagcaaca 1560

gacttaagca ataaagaaac taaattgatc gtcccgccaa gtggttttat tagcaatatt 1620

gtagagaacg ggtccataga agaggacaat ttagagccgt ggaaagcaaa taataagaat 1680

gcgtatgtag atcatacagg cggagtgaat ggaactaaag ctttatatgt tcataaggac 1740

ggaggaattt cacaatttat tggagataag ttaaaaccga aaactgagta tgtaatccaa 1800

tatactgtta aaggaaaacc ttctattcat ttaaaagatg aaaatactgg atatattcat 1860

tatgaagata caaataataa tttagaagat tatcaaacta ttaataaacg ttttactaca 1920

ggaactgatt taaagggagt gtatttaatt ttaaaaagtc aaaatggaga tgaagcttgg 1980

ggagataact ttattatttt ggaaattagt ccttctgaaa agttattaag tccagaatta 2040

attaatacaa ataattggac gagtacggga tcaactaata ttagcggtaa tacactcact 2100

ctttatcagg gaggacgagg gattctaaaa caaaaccttc aattagatag tttttcaact 2160

tatagagtgt atttttctgt gtccggagat gctaatgtaa ggattagaaa ttctagggaa 2220

gtgttatttg aaaaaagata tatgagcggt gctaaagatg tttctgaaat gttcactaca 2280

aaatttgaga aagataactt ttatatagag ctttctcaag ggaataattt atatggtggt 2340

cctattgtac atttttacga tgtctctatt aagtaa 2376

<210> 3

<211> 2376

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gtccccggta aaggaaacaa cactaagttg agcacaaggg cgttgccgag cttcattgat 60

tacttcaacg gcatctacgg attcgccact ggtatcaagg acatcatgaa catgatcttc 120

aagacggaca cgggcggcga cctaacccta gacgaaatct tgaagaacca gcagttactg 180

aatgatatct ccggcaagtt ggatggggtg aatggaagtc tgaacgacct gatcgcacag 240

ggaaacttga acacggagtt gtctaaggaa atcttgaaga tcgccaacga gcagaatcaa 300

gtcttgaacg acgtcaacaa caagctcgat gcgatcaaca cgatgctgcg ggtatatcta 360

cctaagatca cctcgatgtt gagtgatgta atgaagcaga actacgcgct gagtctgcag 420

atagaatact tgagcaagca gttgcaagag atctctgaca agttggacat catcaatgtc 480

aatgtactga tcaactcgac gcttactgag atcacacctg cgtaccagag gatcaagtat 540

gtgaacgaga agttcgagga gttgaccttc gctacagaga ccagctcgaa ggtcaagaag 600

gatggctcgc cggccgacat ccttgatgag ttaactgagt tgaccgagct agcgaagagt 660

gtaacaaaga acgacgtcga cggcttcgaa ttctacctca acacgttcca cgatgtaatg 720

gtaggaaaca acttgttcgg gcgttcagct ttgaagaccg cctccgagtt gatcactaag 780

gagaatgtga agaccagcgg cagtgaggtc ggcaatgtct acaacttcct cattgtattg 840

acagctctgc aggcgcaggc cttccttacc ttgacaacgt gccgcaagtt gttaggctta 900

gcagatatcg actacacgtc catcatgaat gaacacttga acaaggagaa ggaggaattc 960

agagtaaaca tcctgccgac gctgtctaac actttctcga acccgaacta cgcaaaggtc 1020

aaaggaagcg acgaggacgc gaagatgatt gtggaagcga agccgggcca cgcattgatt 1080

gggttcgaga tcagcaacga ctcaatcaca gtattgaagg tctacgaggc gaagctgaag 1140

cagaactacc aggtcgacaa ggattcctta tcggaagtca tctacggcga catggataag 1200

ttgttgtgcc cggaccagtc cgaacagatc tactatacga acaacatcgt cttcccgaat 1260

gagtatgtca tcacgaagat cgacttcact aagaagatga agacgttgag gtatgaggta 1320

acagcgaact tctacgactc gtctacagga gagattgact tgaacaagaa gaaggtagaa 1380

tcaagtgagg cggagtacag gacgttgagt gctaacgacg acggcgtgta catgccgtta 1440

ggtgtcatca gtgagacgtt cttgactccg atcaatgggt tcggcctcca ggctgatgag 1500

aactcaaggt tgatcacgtt gacatgtaag tcatacttga gggagctgct gctagcaaca 1560

gacttgagca acaaggagac gaagttgatc gtcccgccga gcggcttcat cagcaacatt 1620

gtagagaacg ggtccatcga ggaggacaac ttagagccgt ggaaggcgaa caacaagaat 1680

gcgtatgtcg accacaccgg cggagtgaat ggaactaagg cgttgtacgt ccataaggac 1740

ggaggaatct cgcagttcat cggagataag ttgaagccga agacggagta cgtaatccag 1800

tatactgtca agggcaagcc gtctatccac ttgaaggacg agaacacggg ctacattcac 1860

tatgaagaca cgaacaacaa cttagaagac tatcaaacga tcaacaagcg cttcactaca 1920

ggaactgact tgaagggcgt gtacttgatc ttgaagagcc agaacggcga cgaggcttgg 1980

ggagataact tcatcatctt ggagattagt ccttctgaga agttgttgag cccagagttg 2040

atcaatacga acaactggac gagtacggga tcaactaaca tcagcggcaa cacactcact 2100

ctctatcagg gcggacgcgg cattctgaag cagaacctgc agttggacag cttctcaact 2160

tacagagtgt acttctcggt gtccggagat gctaacgtca ggatcaggaa ctctagggaa 2220

gtgttgttcg agaagaggta catgagcggt gctaaggacg tctccgagat gttcactacg 2280

aagttcgaga aggacaactt ctacatagag ctttctcaag ggaacaactt gtatggtggt 2340

cctattgtcc acttctacga cgtctctatc aagtaa 2376

<210> 4

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

tgcaggagcg gtggaggcgg aggtggcagc agcggtggtg gcggagccaa cgtcgccagc 60

gtc 63

<210> 5

<211> 4287

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

atggacaaca acccgaacat caacgagtgc atcccctaca actgcctgag caaccccgag 60

gtcgaggtcc tcggaggcga gcggatcgag accggctaca cccccatcga catcagcctg 120

tcgctcacgc agttcctcct gtccgaattc gtgcccggcg ccggcttcgt gctgggcctg 180

gtcgacatca tctgggggat cttcgggccg agccagtggg acgccttcct ggtgcagatc 240

gagcaactca tcaaccagcg gatcgaggaa ttcgcccgca accaggccat cagccgcctg 300

gaggggctct ccaacttgta ccagatctac gccgagagct tccgcgagtg ggaggccgac 360

ccgacgaatc cggcgttgag ggaagagatg cgcatccagt tcaacgacat gaacagcgcc 420

ctcacgacgg cgatcccgct cttcgcggtc cagaattacc aggtgcccct gctgagcgtg 480

tatgtccagg cggcgaacct ccatttgtcg gtgctgcgcg acgtcagcgt gttcggccag 540

cgctgggggt tcgacgcggc gacgatcaac agccgctaca acgacctgac ccgcctgatc 600

gggaactaca cggatcacgc ggtccggtgg tacaacaccg gcctggagcg cgtgtggggt 660

ccggactcca gggactggat ccgctacaac cagttccgcc gcgagctgac cctgaccgtg 720

ctcgatatcg tcagcttgtt ccctaactac gacagccgca cctaccccat ccgcaccgtg 780

tcgcagctca cgagggagat ttacacgaac cccgtgctgg agaacttcga cggcagcttc 840

cgggggtccg cgcaggggat cgaggggtcg atccgcagcc cccacctgat ggacatcctg 900

aactcgatca cgatctacac ggacgcgcac cgcggcgagt actactggag cggccaccag 960

atcatggcgt cgccggtggg cttctcgggc cccgagttca ccttccccct gtacggcacc 1020

atggggaacg cggccccgca gcagcggatc gtggcacagc tgggccaggg agtgtaccgc 1080

acgctcagca gcacgctcta ccgccgcccg ttcaacatcg gcatcaacaa ccagcagctg 1140

tcggtcctcg atgggacgga gttcgcgtac ggcaccagca gcaacctgcc cagcgccgtg 1200

taccggaagt cagggacggt cgactcgctc gacgagatcc cccctcagaa caacaacgtg 1260

ccgccgcggc aggggttctc gcaccggctc agccacgtga gcatgttccg cagtggcttc 1320

tcgaactcgt cggtctcgat catccgcgcg cctatgttca gctggattca ccgcagtgcc 1380

gaattcaaca acatcattcc gtcgtcgcag atcacccaga tccccctgac caagagcacc 1440

aacctcgggt cggggacgtc ggtcgtcaag ggccccggct tcaccggcgg cgacatcctg 1500

cggcggacga gcccggggca gatctcgaca ctgcgcgtga acatcaccgc ccccctgagc 1560

cagcgctacc gggtgcgaat ccggtacgcg agcaccacca acctgcagtt ccacaccagc 1620

atcgacggtc ggccgatcaa ccagggaaac ttcagcgcca ccatgagcag cggcagcaac 1680

ctccagtcgg gttcgttccg gacggtaggc ttcaccaccc ccttcaactt cagcaacggc 1740

tcgtcggtct tcacgctctc ggcgcacgtc ttcaacagcg gcaacgaggt gtacatcgac 1800

aggatcgagt tcgtcccggc ggaggtcacg ttcgaggctg agtacgggtg caggagcggt 1860

ggaggcggag gtggcagcag cggtggtggc ggagccaacg tcgccagcgt cgtccccggt 1920

aaaggaaaca acactaagtt gagcacaagg gcgttgccga gcttcattga ttacttcaac 1980

ggcatctacg gattcgccac tggtatcaag gacatcatga acatgatctt caagacggac 2040

acgggcggcg acctaaccct agacgaaatc ttgaagaacc agcagttact gaatgatatc 2100

tccggcaagt tggatggggt gaatggaagt ctgaacgacc tgatcgcaca gggaaacttg 2160

aacacggagt tgtctaagga aatcttgaag atcgccaacg agcagaatca agtcttgaac 2220

gacgtcaaca acaagctcga tgcgatcaac acgatgctgc gggtatatct acctaagatc 2280

acctcgatgt tgagtgatgt aatgaagcag aactacgcgc tgagtctgca gatagaatac 2340

ttgagcaagc agttgcaaga gatctctgac aagttggaca tcatcaatgt caatgtactg 2400

atcaactcga cgcttactga gatcacacct gcgtaccaga ggatcaagta tgtgaacgag 2460

aagttcgagg agttgacctt cgctacagag accagctcga aggtcaagaa ggatggctcg 2520

ccggccgaca tccttgatga gttaactgag ttgaccgagc tagcgaagag tgtaacaaag 2580

aacgacgtcg acggcttcga attctacctc aacacgttcc acgatgtaat ggtaggaaac 2640

aacttgttcg ggcgttcagc tttgaagacc gcctccgagt tgatcactaa ggagaatgtg 2700

aagaccagcg gcagtgaggt cggcaatgtc tacaacttcc tcattgtatt gacagctctg 2760

caggcgcagg ccttccttac cttgacaacg tgccgcaagt tgttaggctt agcagatatc 2820

gactacacgt ccatcatgaa tgaacacttg aacaaggaga aggaggaatt cagagtaaac 2880

atcctgccga cgctgtctaa cactttctcg aacccgaact acgcaaaggt caaaggaagc 2940

gacgaggacg cgaagatgat tgtggaagcg aagccgggcc acgcattgat tgggttcgag 3000

atcagcaacg actcaatcac agtattgaag gtctacgagg cgaagctgaa gcagaactac 3060

caggtcgaca aggattcctt atcggaagtc atctacggcg acatggataa gttgttgtgc 3120

ccggaccagt ccgaacagat ctactatacg aacaacatcg tcttcccgaa tgagtatgtc 3180

atcacgaaga tcgacttcac taagaagatg aagacgttga ggtatgaggt aacagcgaac 3240

ttctacgact cgtctacagg agagattgac ttgaacaaga agaaggtaga atcaagtgag 3300

gcggagtaca ggacgttgag tgctaacgac gacggcgtgt acatgccgtt aggtgtcatc 3360

agtgagacgt tcttgactcc gatcaatggg ttcggcctcc aggctgatga gaactcaagg 3420

ttgatcacgt tgacatgtaa gtcatacttg agggagctgc tgctagcaac agacttgagc 3480

aacaaggaga cgaagttgat cgtcccgccg agcggcttca tcagcaacat tgtagagaac 3540

gggtccatcg aggaggacaa cttagagccg tggaaggcga acaacaagaa tgcgtatgtc 3600

gaccacaccg gcggagtgaa tggaactaag gcgttgtacg tccataagga cggaggaatc 3660

tcgcagttca tcggagataa gttgaagccg aagacggagt acgtaatcca gtatactgtc 3720

aagggcaagc cgtctatcca cttgaaggac gagaacacgg gctacattca ctatgaagac 3780

acgaacaaca acttagaaga ctatcaaacg atcaacaagc gcttcactac aggaactgac 3840

ttgaagggcg tgtacttgat cttgaagagc cagaacggcg acgaggcttg gggagataac 3900

ttcatcatct tggagattag tccttctgag aagttgttga gcccagagtt gatcaatacg 3960

aacaactgga cgagtacggg atcaactaac atcagcggca acacactcac tctctatcag 4020

ggcggacgcg gcattctgaa gcagaacctg cagttggaca gcttctcaac ttacagagtg 4080

tacttctcgg tgtccggaga tgctaacgtc aggatcagga actctaggga agtgttgttc 4140

gagaagaggt acatgagcgg tgctaaggac gtctccgaga tgttcactac gaagttcgag 4200

aaggacaact tctacataga gctttctcaa gggaacaact tgtatggtgg tcctattgtc 4260

cacttctacg acgtctctat caagtaa 4287

<210> 6

<211> 1428

<212> PROTEIN

<213> 人工合成

<400> 6

MDNNPNINEC IPYNCLSNPE VEVLGGERIE TGYTPIDISL SLTQFLLSEF VPGAGFVLGL 60

VDIIWGIFGP SQWDAFLVQI EQLINQRIEE FARNQAISRL EGLSNLYQIY AESFREWEAD 120

PTNPALREEM RIQFNDMNSA LTTAIPLFAV QNYQVPLLSV YVQAANLHLS VLRDVSVFGQ 180

RWGFDAATIN SRYNDLTRLI GNYTDHAVRW YNTGLERVWG PDSRDWIRYN QFRRELTLTV 240

LDIVSLFPNY DSRTYPIRTV SQLTREIYTN PVLENFDGSF RGSAQGIEGS IRSPHLMDIL 300

NSITIYTDAH RGEYYWSGHQ IMASPVGFSG PEFTFPLYGT MGNAAPQQRI VAQLGQGVYR 360

TLSSTLYRRP FNIGINNQQL SVLDGTEFAY GTSSNLPSAV YRKSGTVDSL DEIPPQNNNV 420

PPRQGFSHRL SHVSMFRSGF SNSSVSIIRA PMFSWIHRSA EFNNIIPSSQ ITQIPLTKST 480

NLGSGTSVVK GPGFTGGDIL RRTSPGQIST LRVNITAPLS QRYRVRIRYA STTNLQFHTS 540

IDGRPINQGN FSATMSSGSN LQSGSFRTVG FTTPFNFSNG SSVFTLSAHV FNSGNEVYID 600

RIEFVPAEVT FEAEYGCRSG GGGGGSSGGG GANVASVVPG KGNNTKLSTR ALPSFIDYFN 660

GIYGFATGIK DIMNMIFKTD TGGDLTLDEI LKNQQLLNDI SGKLDGVNGS LNDLIAQGNL 720

NTELSKEILK IANEQNQVLN DVNNKLDAIN TMLRVYLPKI TSMLSDVMKQ NYALSLQIEY 780

LSKQLQEISD KLDIINVNVL INSTLTEITP AYQRIKYVNE KFEELTFATE TSSKVKKDGS 840

PADILDELTE LTELAKSVTK NDVDGFEFYL NTFHDVMVGN NLFGRSALKT ASELITKENV 900

KTSGSEVGNV YNFLIVLTAL QAQAFLTLTT CRKLLGLADI DYTSIMNEHL NKEKEEFRVN 960

ILPTLSNTFS NPNYAKVKGS DEDAKMIVEA KPGHALIGFE ISNDSITVLK VYEAKLKQNY 1020

QVDKDSLSEV IYGDMDKLLC PDQSEQIYYT NNIVFPNEYV ITKIDFTKKM KTLRYEVTAN 1080

FYDSSTGEID LNKKKVESSE AEYRTLSAND DGVYMPLGVI SETFLTPING FGLQADENSR 1140

LITLTCKSYL RELLLATDLS NKETKLIVPP SGFISNIVEN GSIEEDNLEP WKANNKNAYV 1200

DHTGGVNGTK ALYVHKDGGI SQFIGDKLKP KTEYVIQYTV KGKPSIHLKD ENTGYIHYED 1260

TNNNLEDYQT INKRFTTGTD LKGVYLILKS QNGDEAWGDN FIILEISPSE KLLSPELINT 1320

NNWTSTGSTN ISGNTLTLYQ GGRGILKQNL QLDSFSTYRV YFSVSGDANV RIRNSREVLF 1380

EKRYMSGAKD VSEMFTTKFE KDNFYIELSQ GNNLYGGPIV HFYDVSIK 1428

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

catatggaca acaacccgaa catc 24

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

aagcttctta cttgatagag acgtcgt 27

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

aacctcgggt cggggacgtc g 21

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

ccaacttgtc agagatctct tg 22

<210> 11

<211> 2376

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

atgagcccag aacgacgccc g 21

<210> 12

<211> 2376

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

gcatatccga gcgcctcgtg c 21

Claims

1.一种改造优化的抗虫基因VIP3A(a)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.一种抗虫融合基因mCryAb-VIP3A(a)，其特征在于，其核苷酸序列为：

如SEQ ID NO.5所示的核酸序列。

3.一种抗虫融合基因编码的蛋白mCryAb-VIP3A(a)，其氨基酸序列为：

如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。

4.一种由权利要求2所述抗虫融合基因mCryAb-VIP3A(a)构建的表达载体。

5.一种由权利要求4所述的表达载体构建的重组菌。

6.一种权利要求2所述抗虫融合基因mCryAb-VIP3A(a)在制备抗虫植物细胞中的应用。

7.依据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物为单子叶植物。

8.依据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述单子叶植物为玉米。

9.一种权利要求3所述抗虫融合基因编码的蛋白mCryAb-VIP3A(a)在制备抗虫制剂中的应用。