RU2210593C2 - ФРАГМЕНТ ГИБРИДНОГО ТОКСИНА Bacillus thuringiensis, ОБЛАДАЮЩИЙ ИНСЕКТИЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, КОДИРУЮЩАЯ ЕГО РЕКОМБИНАНТНАЯ ДНК, СПОСОБ БОРЬБЫ С НАСЕКОМЫМИ - Google Patents
ФРАГМЕНТ ГИБРИДНОГО ТОКСИНА Bacillus thuringiensis, ОБЛАДАЮЩИЙ ИНСЕКТИЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, КОДИРУЮЩАЯ ЕГО РЕКОМБИНАНТНАЯ ДНК, СПОСОБ БОРЬБЫ С НАСЕКОМЫМИ Download PDFInfo
- Publication number
- RU2210593C2 RU2210593C2 RU96107260/13A RU96107260A RU2210593C2 RU 2210593 C2 RU2210593 C2 RU 2210593C2 RU 96107260/13 A RU96107260/13 A RU 96107260/13A RU 96107260 A RU96107260 A RU 96107260A RU 2210593 C2 RU2210593 C2 RU 2210593C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- fragment
- amino acid
- toxin
- cryic
- Prior art date
Links
- 239000003053 toxin Substances 0.000 title claims abstract description 75
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 title claims abstract description 74
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 72
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 title claims abstract description 21
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 title claims abstract description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 title claims abstract description 6
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 title claims abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 title abstract description 7
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 title abstract 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 170
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 139
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims abstract description 9
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 25
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 21
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 20
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 claims description 19
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 13
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 5
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 claims description 5
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 claims description 5
- 241001071944 Cyta Species 0.000 claims description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims description 2
- 101710182223 Toxin B Proteins 0.000 claims 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 abstract description 61
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 126
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 33
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 18
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 18
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 10
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 10
- 101150049404 cry1Ca gene Proteins 0.000 description 10
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 9
- 241000256247 Spodoptera exigua Species 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 241000555303 Mamestra brassicae Species 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 7
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 7
- 241000255908 Manduca sexta Species 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 5
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000836268 Homo sapiens U4/U6.U5 tri-snRNP-associated protein 1 Proteins 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 102100027244 U4/U6.U5 tri-snRNP-associated protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 2
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 2
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- YMXHPSHLTSZXKH-RVBZMBCESA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoate Chemical compound C([C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1)CCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O YMXHPSHLTSZXKH-RVBZMBCESA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000724266 Broad bean mottle virus Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000256248 Spodoptera Species 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001679 anti-nematodal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 108091006004 biotinylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000000855 fungicidal effect Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001418 larval effect Effects 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- -1 or a part thereof Proteins 0.000 description 1
- 239000011368 organic material Substances 0.000 description 1
- 230000017448 oviposition Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
- C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/82—Proteins from microorganisms
- Y10S530/825—Bacteria
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к фрагментам гибридных токсинов, полученных из кристаллических белков Bacillus thuringiensis, обладающих инсектицидной активностью. Данные фрагменты гибридных токсинов получены посредством единичного случая рекомбинации и содержат на своем С-терминальном конце домен III CryC или CryA белка и на N-терминальном конце домен II Cry белка. Изобретение также касается рекомбинатной ДНК, кодирующей указанные фрагменты гибридных токсинов, способа борьбы с насекомыми путем их обработки фрагментами гибридных токсинов или композициями, содержащими эти токсины. Изобретение позволяет расширить арсенал эффективных средств, используемых для борьбы с насекомыми. 3 с. и 9 з.п.ф-лы, 5 ил., 2 табл.
Description
Изобретение относится к фрагментам гибридного токсина и содержащим эти фрагменты токсинам, полученным из инсектицидных кристаллических белков Bacillus thuringiensis.
Bacillus thuringiensis(далее B. t. ) способна продуцировать белки, накапливаемые внутри клеток в виде кристаллов. Эти кристаллические белки токсичны для личинок многих насекомых. Кристаллические белки подразделяют на различные классы на основе гомологических рядов и типов токсичности. Наиболее изучен CryI-класс белков, который представлен протоксинами с молекулярной массой 140 кДа и эффективен против лепидоптер.
В некоторой степени принцип действия кристаллических белков объясним. После перорального приема кристаллы растворяются в щелочной среде средней кишки личинки. Растворенные белки затем под действием пищеварительной протеиназы превращаются в устойчивый к протеиназе токсичный фрагмент с молекулярной массой приблизительно 65 кДа, который связывается с рецепторами эпителиальных клеток в средней кишке насекомого и проникает сквозь мембраны клеток. Это приводит к разрыву клеток и гибели личинки.
Спектр действия конкретного кристаллического белка во многом зависит от наличия рецепторов на эпителиальных клетках пищеварительного тракта пораженных насекомых. Указанный спектр совместно обусловлен растворимостью кристаллического белка и его протеолитической активацией in vivo.
Важность связывания кристаллического белка с пищеварительными эпителиальными рецепторами дополнительно подтверждается тем, что у насекомых, характеризуемых устойчивостью к одному из кристаллических белков, связи кристаллических белков с эпителиальными клетками средней кишки существенно ослаблены.
Считается, что токсичные фрагменты кристаллических белков состоят из трех определенных структурных доменов. Домен I, крайний N-терминальный, состоит из 7 α-спиралей. Домен II содержит 3 β-складки, а домен III (крайний С-терминальный) складчато сложен (свернут) в β-слоистую структуру. В проекции на Cryl-последовательности домен I занимает положения аминокислотных остатков с 28 по 260, домен II приблизительно с 260 по 460 и домен III приблизительно с 460 по 600.
Предлагаемое изобретение относится, в частности, но не исключительно, к гибридным кристаллическим белкам, включая CryIC и CryIE или CryIA. Последовательность (далее этот термин обозначается SEQ с соответствующими латинскими индексами) нуклеотидов CrylC-гена B.t. подвид entomocidus 60.5 приведены в SEQ ID No.1, а соответствующая последовательность аминокислот белка, кодированная указанной последовательностью нуклеотидов, приведена в SEQ ID No. 2. Последовательность нуклеотидов CryIE-гена B.t. подвид kenyae 4FI приведена в SEQ ID 3, а соответствующая последовательность аминокислот белка, кодированная указанной последовательностью нуклеотидов, приведена в SEQ ID No.4. Эти белки токсичны для лепидоптер, но внутри этого вида насекомых каждый белок имеет разную специфичность. В частности, CryIC эффективен против S.exigua и M.brassicae.
Согласно изобретению предложен фрагмент гибридного токсина B.t, содержащий на его С-конце домен III первого Сrу-белка, или часть этого домена, или белок, существенно сходный с этим доменом, при условии, что N-терминальная область фрагмента представлена N-терминальной областью второго Сrу-белка, или частью области, или белком, существенно сходным с этой областью. Предпочтительный фрагмент - это фрагмент, который не связывается с сайтом связывания CryIC во внутренностях насекомого, когда этот фрагмент содержит на его С-конце домен III белка CryIC, или часть этого домена, или белок, существенно сходный с этим доменом, или фрагмент, который не связывается с сайтом связывания белка CryIA, когда этот фрагмент содержит на своем С-конце домен III белка CryIA, или часть домена, или белок, существенно сходный с этим доменом.
Термин "существенно сходный" относится к чистым белкам, имеющим аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 75% сходную с последовательностью белков согласно изобретению. Предпочтительна степень сходства не менее на 85%, более предпочтительна - не менее 90% и еще более предпочтительна - не менее 95%.
В контексте предлагаемого изобретения две аминокислотные последовательности, которые по меньшей мере на 75, 85, 90 и 95% сходны одна с другой, имеют по меньшей мере 75, 85, 90 и 95% идентичных или консервативно замененных аминокислотных остатков в тех же положениях при их оптимальном введении в цепь с образованием до 6 брешей при условии, что образующиеся бреши в общем не затрагивают более 15 остатков аминокислот. Консервативную замену аминокислот в соответствии с целью изобретения можно произвести в следующих группах:
(I) серин и треонин,
(II) глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота,
(III) аргинин и лизин,
(IV) аспарагин и глутамин,
(V) изолейцин, лейцин, валин и метионин,
(VI) фенилаланин, тирозин и триптофан,
(VII) аланин и глицин,
при условии, что в SEQ ID No.6 консервативно заменены в положении 620 Ser и Туr, а Аlа и Glu - в положении 618, и что в SEQ ID No.8 Ser и Туr консервативно заменены в положении 627, а Аlа и Glu - в положении 625.
(I) серин и треонин,
(II) глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота,
(III) аргинин и лизин,
(IV) аспарагин и глутамин,
(V) изолейцин, лейцин, валин и метионин,
(VI) фенилаланин, тирозин и триптофан,
(VII) аланин и глицин,
при условии, что в SEQ ID No.6 консервативно заменены в положении 620 Ser и Туr, а Аlа и Glu - в положении 618, и что в SEQ ID No.8 Ser и Туr консервативно заменены в положении 627, а Аlа и Glu - в положении 625.
Термин "часть" белка обозначает пептид, образованный указанным белком и содержащий не менее 80% его послеловательности.
Термин "сайт связывания" обозначает участок молекулы, с которым токсин образует обратимую связь при Ка между ними порядка по меньшей мере 104 дм3•моль-1.
Фрагмент токсина может содержать на своем N-конце N-терминальную область любых инсектицидных белков B.t., известных как "Cry" или "Cyt", среди которых CryIA(a), CryIA(b), CryIA(c), CryIB, CryIC, CryID, CryIE, CryIF, CryIG, CryIH, CryIIA, CryIIB, CryIIC, CryIIIA, CryIIIB, CryIIIB(b), CryIVA, CryIVB, CryIVC, CryIVD, CYTA, CryX1(IIIC), CryX2(IIID), СrуХ3, CryV и СrуХ4, или часть этой области, или белок, существенно сходный с этой областью. Он также может содержать на своем С-конце домен III белка CryIC или часть домена, или белок, существенно сходный с этим доменом.
Таким образом, фрагмент может включать домен II белка CryIE, CryIB, CryID или CryIA, или часть домена, или белок, существенно сходный с этим доменом, и домен III белка CryIC или часть этого домена III, или белок, существенно сходный с доменом III. В частности, предпочтительно, чтобы фрагмент содержал домены I и II белков CryIE, CryIB, CryID или CryIA, или их часть, или белок, существенно сходный с этими доменами, и домен III белка CryIC или его часть, или белок, существенно сходный с доменом III.
Наиболее предпочтительно, чтобы токсичный фрагмент имел на своем С-конце область, содержащую последовательность аминокислот от 454 до 602 белка CrylC, или последовательность, существенно сходную с указанной последовательностью. Фрагмент может иметь на своем C-конце область, содержащую последовательность аминокислот от 478 до 602 белка CryIC, или последовательность, существенно сходную с указанной последовательностью, при условии, что непосредственное объединение последовательности, включающей аминокислоты от 478 до 602 белка CryIC, с С-концом домена II белков CryIA, CryIB, CryIC, CryID, CryIE, даст продукт слияния, отвечающий условиям получения инсектицидного компонента фрагмента. Специалисту понятно, что может возникнуть необходимость добавить пептидную область к С-концу домена II, которая отдаляет С-терминальную область белка CrylC, позволяя ей уложиться таким образом, чтобы проявилась инсектицидная активность.
Особенно предпочтительно, чтобы токсичный фрагмент согласно изобретению содержал
I) последовательность аминокислот приблизительно от 1 до примерно 620 в SEQ ID No.6 или последовательность аминокислот приблизительно от 1 до приблизительно 620 в SEQ ID No.6, в которых произведена по меньшей мере одна из следующих замен:
Ilе в положении 609 замещен Leu;
Ala в положении 618 замещен Glu;
Ser в положении 620 замещен Туr, или
II) последовательность аминокислот от приблизительно 1 до примерно 627 в SEQ ID No. 8 или последовательность аминокислот от приблизительно 1 до приблизительно 627 в SEQ ID No.8, в которых произведена по меньшей мере одна из следующих замен:
Ilе в положении 616 замещен Leu;
Ala в положении 625 замещен Glu;
Ser в положении 627 замещен Туr.
I) последовательность аминокислот приблизительно от 1 до примерно 620 в SEQ ID No.6 или последовательность аминокислот приблизительно от 1 до приблизительно 620 в SEQ ID No.6, в которых произведена по меньшей мере одна из следующих замен:
Ilе в положении 609 замещен Leu;
Ala в положении 618 замещен Glu;
Ser в положении 620 замещен Туr, или
II) последовательность аминокислот от приблизительно 1 до примерно 627 в SEQ ID No. 8 или последовательность аминокислот от приблизительно 1 до приблизительно 627 в SEQ ID No.8, в которых произведена по меньшей мере одна из следующих замен:
Ilе в положении 616 замещен Leu;
Ala в положении 625 замещен Glu;
Ser в положении 627 замещен Туr.
Какими бы ни были допустимые замены аминокислот, один или более из следующих остатков (обозначения последовательности даны согласно последовательности белка CryIC) не подлежат изменению: Phe(501); Val(478); Trp(479) и Thr(486).
Изобретение также относится к гибридному токсину, содержащему указанный фрагмент или токсин по меньшей мере на 85% сходный с таким гибридным токсином, который имеет существенно близкую инсектицидную активность или может связывать рецепторы.
Кроме того, изобретение относится к чистым белкам, которые по меньшей мере на 90% идентичны фрагментам токсина или гибридным токсинам согласно изобретению.
Изобретение относится и к рекомбинантной ДНК, содержащей последовательность, кодирующую белок, имеющий последовательность аминокислот описанных выше токсинов или их фрагментов. Изобретение также относится к рекомбинантной ДНК, содержащей последовательность от нуклеотида 1 до нуклеотида 1860 в SEQ ID No.5 или к ДНК, сходной с ней, кодирующей существенно сходный белок, или к рекомбинантной ДНК, содержащей последовательность от нуклеотида 1 до нуклеотида 1881 в SEQ ID Nо.7, или к ДНК, сходной с ней, кодирующей существенно сходный белок.
Термин "сходная ДНК" означает, что интересующая последовательность способна образовывать гибрид с рекомбинантной последовательностью согласно изобретению. Когда интересующая последовательность и последовательность по изобретению являются двунитевыми, нуклеиновая кислота, образующая интересующую последовательность, имеет ТМ в пределах 20oС от ТМ последовательности по изобретению. В том случае, когда интересующую последовательность и последовательность по изобретению смешивают и одновременно денатурируют, значения ТМ этих последовательностей находятся предпочтительно в пределах 10oС одна по отношению к другой. Более предпочтительно гибридизацию проводят в жестких условиях, причем предпочтительно фиксируют интересующую ДНК или ДНК по изобретению. Таким образом, денатурированную либо интересующую, либо последовательность по изобретению предпочтительно сначала связывают с подложкой и проводят гибридизацию в течение определенного периода времени при температуре 50-70oС в двукратном цитратном буферном солевом растворе, содержащем 0,1% додецилсульфата натрия, после чего подложку промывают при той же температуре, но в буферном растворе с пониженной концентрацией цитрата натрия. В зависимости от необходимой жесткости условий и, следовательно, степени сходства последовательностей обычно выбирают следующие буферные растворы:
однократный цитрат натрия, содержащий 0,1% додецилсульфата натрия,
двукратно разбавленный цитрат натрия, содержащий 0,1% додецилсульфата натрия,
десятикратно разбавленный цитрат натрия, содержащий 0,1% додецилсульфата натрия. К последовательностям, имеющим наивысшую степень сходства, относятся такие, на гибридизацию которых менее всего влияет промывка в буферных растворах пониженной концентрации. Наиболее предпочтительно, чтобы интересующая последовательность и последовательность по изобретению были сходны настолько, что промывка или инкубация в десятикратно разбавленном буферном растворе цитрата натрия, содержащем 0,1% додецилсульфата натрия, не могла существенно повлиять на их гибридизацию.
однократный цитрат натрия, содержащий 0,1% додецилсульфата натрия,
двукратно разбавленный цитрат натрия, содержащий 0,1% додецилсульфата натрия,
десятикратно разбавленный цитрат натрия, содержащий 0,1% додецилсульфата натрия. К последовательностям, имеющим наивысшую степень сходства, относятся такие, на гибридизацию которых менее всего влияет промывка в буферных растворах пониженной концентрации. Наиболее предпочтительно, чтобы интересующая последовательность и последовательность по изобретению были сходны настолько, что промывка или инкубация в десятикратно разбавленном буферном растворе цитрата натрия, содержащем 0,1% додецилсульфата натрия, не могла существенно повлиять на их гибридизацию.
Рекомбинантная ДНК может также кодировать белок, обладающий гербицидной устойчивостью, стимулирующий рост растений, обладающий фунгицидными, бактерицидными, антивирусными и/или антинематодными свойствами. В случае, когда ДНК требуется ввести в гетерологичный организм, ее модифицируют, чтобы исключить известные основные элементы нестабильности мРНК (например, АТ-богатые области) и сигналы полиаденилирования, и/или используют кодоны, предпочтительные для организма, которому эта рекомбинантная ДНК предназначена, так что экспрессией такой модифицированной ДНК в указанном организме синтезируется белок, по существу сходный с белком, синтезируемым при экспрессии немодифицированной рекомбинантной ДНК в организме, для которого белковые компоненты гибридного токсина или фрагментов токсина являются эндогенными.
Кроме того, изобретение относится к последовательности ДНК, комплементарной такой последовательности, которая гибридизирована в жестких условиях с рекомбинантной ДНК согласно изобретению.
Изобретение также касается вектора, содержащего такую рекомбинантную (или комплементарную ей) последовательность ДНК; растения или микроорганизма, которые включают и в которых возможна экспрессия ДНК; растений, трансформированных с помощью такой ДНК; потомства таких растений, которое содержит ДНК, устойчиво внедренную и способную нести наследственные признаки по Менделю, и/или семян таких растений и такого потомства.
Кроме того, изобретение относится к белку, полученному экспрессией указанной ДНК, и инсектицидному белку, полученному экспрессией рекомбинантной ДНК в растениях, трансформированных этим белком.
Кроме того, изобретение относится к инсектицидной композиции, содержащей один или более токсичных фрагментов или содержащих их токсинов согласно изобретению; к способу борьбы с насекомыми, который заключается в обработке их такими фрагментами или токсинами, или композициями, и способу экстракции для получения инсектицидных белков из содержащего их органического материала, заключающемуся в том, что этот материал вымачивают и экстрагируют растворителем.
Далее изобретение будет описано на примере получения фрагментов гибридных токсинов B.t. согласно изобретению со ссылками на соответствующие чертежи и перечень последовательностей.
На фиг. 1 показана схема образования генов гибридного кристаллического белка через рекомбинацию in vivo. Образованы тандемные плазмиды (pBD560 и pBD 650), несущие два укороченных гена кристаллического белка, имеющих ориентацию с прямым поворотом. 5'-ген (контурный прямоугольник), не имеет области, кодирующей протоксин (сплошной прямоугольник), а у 3'-гена (заштрихованный прямоугольник) часть области, кодирующей домен I, удалена. Рекомбинация in vivo между гомологичными областями (домены II и III) имеет место в recA + штамм JM101. Отбор рекомбинантов путем гидролитического расщепления (нерекомбинантов) с помощью NotI и BamHI с последующей трансформацией дает ряд плазмид, кодирующих гибридные кристаллические белки.
На фиг. 2 показано расположение остатков аминокислот в положениях от 420 до 630 белков CryIE и CryIC. Граница между доменами II и III обозначена. Показаны только те аминокислотные остатки белков CryIC, которые отличаются от белка CryIE, одинаковые остатки обозначены пунктиром. Положения кроссовера (G27, Н13, Н7, Н8, Н17 и Н21) в фрагментах гибридного токсина белков CryIE-CryIC согласно изобретению также показаны.
На фиг. 3 показано расположение остатков аминокислот в положениях от 420 до 630 белков CryIE и CryIC. Граница между доменами II и III обозначена. Показаны только те аминокислотные остатки белков GryIC, которые отличаются от белка CryIE, одинаковые остатки обозначены пунктиром. Положения кроссовера (F59, F71, F26 и Е7) в фрагментах гибридного токсина белков CryIE-CryIC согласно изобретению также показаны.
На фиг. 4 показаны результаты некоторых экспериментов на гетерологическую конкуренцию. Биотинилированный белок CryIC (табло А) и G27 (табло В) инкубируют с везикулами S. exigua BBMV в отсутствие (цепочка а) или в присутствии избытка немеченого белка, как показано на табло. После инкубации везикулы промывают, загружают в полиакриламидный гель с додецилсульфатом натрия и блотируют на нитроцеллюлозные мембраны. Биотинилированные кристаллические белки, повторно отделенные с везикулами, визуализируют конъюгатом стрептавидин-пероксидаза. На фиг.4 они помечены стрелкой.
На фиг. 5 показана карта плазмиды рSВ456, которая кодирует фрагмент гибридного токсина G27 и используется для трансформации штамма B.t.51, не вырабатывающего кристалический у токсин.
SEQ ID No. 1 показывает последовательность нуклеотидсв CryIC-гена из B. t. подвид entomocidus 60.5.
SEQ ID No. 2 показывает последовательность аминокислот белка, кодированного CryIC-геном, имеющимся в SEQ ID No.1.
SEQ ID No. 3 показывает последовательность нуклеотидов CryIC-гена из B. t. подвид kenyae 4FI.
SEQ ID No. 4 показывает последовательность аминокислот белка, кодированного CryIC-геном, показанным в SEQ ID No.3.
SEQ ID No. 5 показывает последовательность нуклеотидов, кодирующую предпочтительный фрагмент гибридного токсина CryIE/CryIC B.t. согласно изобретению.
SEQ ID No. 6 показывает последовательность аминокислот белка, кодированного последовательностью нуклеотидов, показанной в SEQ ID No.5.
SEQ ID No. 7 показывает последовательность нуклеотидов фрагмента гибридного токсина CryIA/CryIC согласно изобретению.
SEQ ID No. 8 показывает последовательность аминокислот белка, кодированного последовательностью нуклеотидов согласно SEQ ID No.7.
Получение плазмид, кодирующих фрагменты гибридного токсина.
При получении плазмид, несущих CryIC или CryIE гены, используют Escherichia coli XLI-blue (Stratagene Inc.) в качестве хозяина, исключая тот случай, когда штамм JM101 используют как rесА+фон. Вектор для экспрессии кристаллических белков в E.coli получают из рКК233-2 (Pharmacia LKB Biotechnology). Размер рКК233-2 уменьшают, удаляя EcoRI-PvuII фрагмент, несущий ген, кодирующий устойчивость к тетрациклину. Впоследствии линкер XhoI с шестью парами оснований встраивают в сайт HindIII, получая pBD10. Плазмиду ВК+ образуют, встраивая линкер BglII в сайт Sacl плазмиды Bluescript SK+ (Stratagene Inc. ). Полилинкер плазмиды ВК+ на участке от BglII до XhoI встраивают в сайт NcoI-XhoI в pBD10. Полученный экспрессирующий вектор pBD11 содержит ярко выраженный trc промотор, lacZ сайт связывания рибосом и инициирующий ATG кодон. Инициирующий кодон частично перекрывается сайтом Ncol и за ним следует полилинкер, что облегчает включение вставок в вектор. Транскрипция заканчивается rrnВ терминатором транскрипции.
Гены сrуIС и cryIE клонируют соответственно из B.t. подвид entomocidus 60.5 и kenya 4F1, как ранее описано Honee et al., 1990 (Appl. Environ. Microbiol. , 56, р. 823-825); Visser et al., 1990 (J. Bacteriol., 172, р. 6783-6788). Для клонирования мутагенезом in vitro был создан сайт NсоI, частично перекрывающийся с инициирующим кодоном гена cryIC. Сайт BglII был создан непосредственно за терминирующим кодоном белка cryIC сайт-специфическим мутагенезом, в результате чего была получена последовательность 
(стоп-кодон подчеркнут). Фрагмент NcoI-BglII, содержащий cryIC кодирующую область, встраивают в вектор pBD11, получая плазмиду pBD150, дающую возможность экспрессии белка CryIC. Плазмида pBD155 является производной от pBD150, в которой последовательность 3' полилинкеров гена cryIC удалена.
Фрагмент DraI плазмиды рЕМ14 (Visser et al., 1990), содержащий полный ген cryIE, клонируется в сайте EcoRV плазмиды SK+, в результате чего получается плазмида рЕМ15. Впоследствии сайт NcoI вводят сайт-специфическим мутагенезом в инициирующий кодон этого гена, и cryIE переносят как фрагмент NcoI-XhoI в вектор pBD11, получая плазмиду рВD60, дающую возможность экспрессии белка CryIE.
Получены плазмиды, несущие только области, кодирующие токсичный фрагмент сrуI генов. Линкеры ВglII встроены в сайты ХmnI, представленные в паре оснований для положения 1835 гена cryIC, и в сайт HgiAI в положении 1839 гена cryIE. Впоследствии фрагменты Ncol-BglII, содержащие области, кодирующие токсичные фрагменты генов сrуIС (пара оснований 1835) и cryIE (пара оснований 1839), встраивают в вектор pBD11, получая соответственно плазмиды pBD151 и pBD161, как описано ниже.
Тандемные плазмиды, используемые для получения гибридных генов cryIC-cryIE, конструируют следующим образом. Линкеры BamHI лигируют в плазмиде pBD160, гидролизованной с помощью НраI. Эту ДНК инкубируют с ВаmНI и XhoI, а укороченный ген cryIE, начинающийся от пары оснований 704, встраивают в плазмиду pBD151, получая плазмиду pBD560. Чтобы сконструировать тандемную плазмиду для получения гибридов сrуIЕ-сrуIС, плазмиду pBD155 гидролизуют с помощью NsiI и XhoI. Фрагмент, несущий укороченный ген cryIC, начинающийся от пары оснований 266, встраивают в плазмиду pBD161, гидролизованную PstI/XhoI, получая плазмиду pBD650. Присутствие уникальных сайтов рестрикции на NotI и BamHI между укороченными генами cryI в тандемных плазмидах pBD560 и pBD650 обусловлено последовательностями полилинкеров.
Манипулирование ДНК и конструирование гибридного токсина.
Все приемы манипулирования рекомбинантной ДНК проводили в соответствии с Sambrook et al.,1989 (в "Molecular Cloning, A Laboratory Manual: Cold Spring Harbour Press, Cold Spring Harbour), причем последовательность ДНК расшифровывали дидезокситрифосфатным методом с флуоресцентным окрашиванием дидезоксинуклеотидов, используя анализатор последовательности нуклеотидов Applied Biosystems 370A.
Выявленная степень подобия cryI генов позволяет проводить внутримолекулярную рекомбинацию in vivo. В результате получают пару тандемных плазмид, каждая из которых несет два укороченных гена кристаллических белков, перекрывающиеся только в доменах II и III. Таким образом, рекомбинация происходит только в областях, кодирующих домены II и III. Рамочные рекомбинации, которые можно отбирать, используя рестриктазы для гидролиза, производят плазмиды, дающие возможность экспрессии полномерных гибридных протоксинов с молекулярной массой 140 кДа. Для получения in vivo рекомбинантов тандемную плазмиду (pBD560 или pBD650; фиг.2) переносят в JM101. ДНК в количестве 5 мкг выделяют из отдельно полученных рекомбинантов и гидролизуют с помощью NotI и BamHI, делая разрез между двумя укороченными cryI генами для селекции из нерекомбинантов, и ДНК трансформируется в E.coli XL1-голубую. Затем выращивают 5 отдельных колоний и анализируют характер белков и содержание плазмид.
Гибридные токсины CryIC-CryIE и CryIE-CryIC получают с использованием соответственно тандемных плазмид pBD560 и pBD650, допуская их рекомбинацию в rесА+фон, выделяют ДНК, гидролизуют и переносят в штамм rесА, как описано выше.
100 колоний из 20 отдельных экспериментов анализируют электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Из этих колоний 85% дают белок молекулярной массой 140 кДа, задаваемый рамочными рекомбинациями соответственно генов сrуIС и cryIE, cryIE и cryIC. E.coli продуцируют белки CryI в виде кристаллов, растворяющихся in vitro при высоких значениях рН. Приблизительно 15% гибридных токсинов, полученных описанным способом, растворяются при высоких значениях рН. Рекомбинанты, продуцирующие растворимые гибридные токсины, сначала классифицируют с использованием рестриктазы, затем определяют положение кроссовера в селекционированных гибридах каждого класса, анализируя последовательность ДНК. Все кроссоверы, которые приводят к получению растворимых гибридных токсинов, обнаруживаются очень близко от домена III или в нем.
Очистка и анализ белков.
Кристаллические белки выделяют в основном по методу Convents et al. (J. Biol. Chem. , 265, р.1369-1375; Eur. J. Biochem., 195, р.631-635). Вкратце, рекомбинантные E.coli выращивают при 30oС в 250 мл в ТВ-среде до ОП660 10-15. Кристаллы, выделенные из лизата E.coli, растворяют при инкубации в течение 2 часов в присутствии 20 мМоль Nа2СО3, 10 мМоль дитиотреитола, 100 мМоль NaCl при рН 10 и температуре 37oС. рН раствора понижают до 8 с помощью 100 мМоль буфера Tris-HCl, и инкубируют в присутствии трипсина. Раствор токсина диализируют против 20 мМоль буфера Tris-HCl и 100 мМоль NaCl при рН 9. Затем токсичный фрагмент очищают на колонке Mono Q 5/5, включенной в систему (FPLC) скоростной жидкостной хроматографии белков (Pharmacia LKB Biotechnology). Белки выделяют электрофорезом в полиакриламидном геле, содержащем 7,5% додецилсульфата натрия.
Биохимический анализ и выделение токсичных фрагментов с молекулярной массой 65 кДа.
Выделенные кристаллы очищенных белков CryIC, CryIE и гибридные белки растворяют при высоком значении рН и инкубируют с трипсином. Подобно белкам CryIC и СryIЕ все растворимые гибридные токсины при кроссовере в домене III превращаются в устойчивые фрагменты с молекулярной массой 65 кДа. Фрагменты с молекулярной массой 65 кДа можно очищать анионообменной хроматографией при таких же условиях, как и родительские белки. Tрипсин полностью разрушает гибриды F59 и F71, которые имеют кроссоверы в домене II. Несмотря на то, что эти гибриды не осаждаются в виде нерастворимых агрегаций, по-видимому, индуцированные трипсином места расщепления в родительских белках могут подвергнуться действию трипсина. Поэтому фрагменты с молекулярной массой 65 кДa не могут быть выделены из гибридов F59 и F71.
В табл. 1 показана структура 5 гибридных токсинов CryIE-CryIC (G27, Н8, Н17, Н13, Н7) и 4 CryIC-CryIE гибридных токсинов (F59, F71, F26, Е7) в сравнении с белками CryIE и CryIC, из которых они получены. Аминокислотные последовательности гибридных токсинов CryIE-CryIC, содержащих токсичные фрагменты согласно изобретению, занимают положения до аминокислоты 1189 родительского белка CryIC, а гибридных токсинов CryIC-CryIE - до аминокислоты 1171 родительского белка CryIE. В табл. 1 приведены также значения относительной инсектицидной активности этих гибридных токсинов в сравнении с белками CryIE и CryIC.
Большинство биологических анализов было проведено на очищенных фрагментах токсинов. Белки cryIC занимают положения от приблизительно аминокислоты 28 до 627, a cryIE - до 612. Полная длина последовательностей протоксинов указана в скобках.
Определение токсичности для насекомых и инсектицидная активность cryICI cryIE продуктов гибридных генов.
Бактериальные культуры концентрируют до ОП660 6,0 и 100 мкл наносят в виде точек на искусственную питательную среду на матрас для культуры тканей, имеющий 24 лунки. Наряду с этим разбавленные образцы очищенных токсинов наносят на питательную среду. Личинки во втором инстаре насекомых S.exigua, M. bras-sicae или M. sexta содержат на этой питательной среде (16-кратное разбавление на образец) 5 дней, после чего учитывают массу личинок. Относительный рост (равновесную концентрацию, снижающую рост на 50%) определяют по отношению средней массы личинок, содержащихся на питательной среде с токсином, к средней массе контрольных личинок, содержащихся на питательной среде без токсина. Насекомых вида M.sexta для кладки яиц поставляет Carolina Biological Supply Company, North Carolina, US.
Токсичные фрагменты, кодированные продуктами гибридных генов, испытывают на активность против трех различных видов насекомых, описанных выше. Насекомые вида M. sexta восприимчивы как к CryIC, так и СrуIЕ. По их чувтствительности к трипсину можно предположить, что гибриды F59 и F71 не обладают активностью против этого насекомого (табл. 1). Несмотря на то, что Н7 конвертируется трипсином в устойчивые белки с молекулярной массой 65 кДа, он не токсичен для M. sexta. Все остальные гибриды, представленные в табл. 1, токсичны и, по-видимому, имеют нативную биологически активную конформацию.
Фрагмент белка CrylC молекулярной массой 65 кДа в отличие от белка CryIE высокотоксичен по отношению к видам S. exigua и M.brassicae. Токсин G27 (табл. 1; фиг. 2), гибрид CryIE-CryIC с кроссовером в месте соединения доменов II и III активен по отношению к обоим видам насекомых. Это указывает на то, что домен III белка CryIC придает ему полную активность по отношению к S.exigua и M.brassicae. Гибрид Н8, который отличается от G27 только тремя аминокислотными остатками (см. фиг.3), будучи активным против M.sexta, не активен против S.exigua и M.brassicae.
Антипод гибрида G27 - гибрид F26 (табл. 1, фиг.3), в котором домен III белка CryIC заменен доменом III белка CryIE, не активен против S.exigua или M. brassicae. Несмотря на то, что он токсичен по отношению к M.sexta, последовательности белка CryIC, включающие положения от аминокислот 28 до 462, вероятно, не достаточны для поражения S.exigua и M.brassicae. Последовательности белка CryIC только тогда восстановливают инсектицидную активность против этих насекомых, когда в этом гибриде (Е7) присутствуют аминокислотные остатки не ниже положения 602. В этом описании показано, что аминокислотные остатки в положениях 478-602 последовательности белка CrylC могут придать белку CrylE высокую инсектицидную активность против S.exigua и M.brassicae.
Биотинилирование кристаллических белков и их анализ по степени связывания.
Биотинилирование проводят с использованием биотин-N-гидроксисукцинимиидного эфира по существу таким образом, как оно описано изготовителем (Amersham). 1 мг кристаллического белка инкубируют в течение одного часа с 40 мкл биотинилирующего реагента в присутствии 50 мМоль NаНСО3, 15 мМоль NaCl при рН 8 и температуре 20oС. Раствор заливают в колонку, заполненную Sephadex 25, уравновешенным тем же буфером, содержащим 0,1% бычьего сывороточного альбумина для удаления несвязанного биотина, и образцы фракций наносят пятнами на нитроцеллюлозную мембрану. Фракции, содержащие биотинилированные кристаллические белки, визуализируют с помощью конъюгата стрептавидин-пероксидаза (Amersham), который катализирует окисление люминола, вызывающего хемилюминесценцию (ECL, Amersham), и сливают.
Мембранные везикулы собирают по Wolfersberger et al. (Сотр. Biochem. Physiol., 86a, p.301-308, 1987) и, кроме того, еще раз промывают изолирующим буфером, содержащим 0,1% среды Tween-20. Связывание биотинилированных кристаллических белков с мембранными везикулами (100 мкг/мл) проводят в 100 мкл среды PBS, содержащей 1% бычьего сывороточного альбумина и 0,1% среды Tween-20 при рН7,6. Везикулы (20 мкг белка) инкубируют с 10 мг биотинилированных кристаллических белков в течение одного часа при 20oС в присутствии или при отсутствии 1000-кратного избытка немеченых кристаллических белков. Затем везикулы снова отделяют центрифугированием в течение 10 мин при 14000 g в центрифуге Eppendorf, дважды промывают связующим буфером, снова суспендируют в образцовом буфере, денатурируют нагреванием и вводят в 7,5%-ный полиакриламидный гель. После электрофореза белки блотируют на нитроцеллюлозные мембраны и биотинилированные кристаллические белки, которые повторно выделены с везикулами, визуализуют, инкубируя нитроцеллюлозу с конъюгатом стрептавидин-пероксидаза (Amersham), который катализирует окисление люминола, вызывающего хемилюминесценцию (ECL, Amersham).
Поскольку связывание с эпителиальными клетками средней кишки - основная часть механизма действия кристаллических белков, их связывание мембранными везикулами S.exigna исследуют в экспериментах на гетерологическую конкуренцию. Конкурентные эксперименты показывают, что связывание меченого белка CryIC (фиг. 4А, цепочка а) и меченого гибрида F26 (не показан) может быть исключено при избытке немеченого белка CryIC (цепочка b) или гибрида F26 (цепочка е), но не при избытке гибрида G27 (цепочка с) или белка CryIE (цепочка d). Кроме того, связывание меченого гибрида G27 (фиг.4В, цепочка а) и меченого белка CryIE (не показан) может быть исключено при избытке гибрида G27 (цепочка b) или белка CryIE (цепочка d), но не при избытке белка CryIC (цепочка а) или гибрида F26 (цепочка е). Это позволяет сделать вывод, что G27 и CryIE "узнают" те же сайты связывания на мембранах средней кишки S. exigna и что эти сайты отличаются от сайтов, "узнаваемых" белком СrуIС и гибридом F26. Совместные испытания на токсичность и степень связывания показывают, что G27 обладает такой же токсичностью, как и CryIC, но связывается с иным рецептором. Поскольку насекомые могут приобретать сопротивляемость к кристаллическим белкам, изменяя показатели связывания рецепторов, G27 может быть полезен для контроля сопротивляемости насекомых в качестве варианта замены CryIC.
Экспрессия генов гибридного токсина cryIE/cryIC в гетерологичных системах.
Ген cryIE/cryIC гибридного токсина G27 экспрессируется в E.coli, и генный продукт проявляет по меньшей мере такую же инсектицидную активность (по меньшей мере против Spodoptera) как CryIC. Более того, этот продукт проявляет повышенную активность, если ген экспрессируется в штамме Bacillys thuringienses (см. ниже). Ген, кодирующий гибридный токсин G27, вводят в подходящий вектор-челнок, который затем вводят в соответствующего хозяина B.t. Такие трансформированные клетки культивируют, а получаемый от обеих цельных культур токсин и очищенные кристаллы проверяют на инсектицидную активность.
Конструирование вектора-челнока, содержащего G27, трансформация штамма Bt 51 и очистка от него токсичного белка.
Ген, кодирующий гибрид G27 (3400 пар оснований), отщепляют от плазмиды, индуцирующей экспрессию рКК233 Е.соli, с использованием Nсо1 и Хhо1. Сайт Xho1 заполняют фрагментом Кленова, т.е. фрагментом ДНК-полимеразы I от Е. соli. Полученный фрагмент лигируют с Nco1/Sma1, гидролизованной рSB635 (pBluescript KS+, PcryIC и CryIA(c) терминаторы транскрипции). Полученную плазмиду рSВ454 гидролизуют с Ара1 и Nоt1, образуя фрагмент с 4200 пар оснований, несущий промотор, гибрид G27 и терминатор. Этот фрагмент лигируют с Ара1/Not1 гидролизованной рSВ634 (челнок-вектор, содержащий рВС16.1 и pBluescript KS+), образуя рSВ456 (см. фиг.5). Плазмиду ДНК, выделенную из E.coli, ДН10В, используют для трансформации B.t.51, штамма B.t., не вырабатывающего кристаллический токсин. Положительные изоляты устойчивы к тетрациклину, что говорит о присутствии pSB456, и содержат большие включения, соответствующие белку с молекулярной массой 135 кДа (выявлено с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия). Образцы гибридного токсина G27 готовят из культур трансформированного штамма Bt51, выращенного спорообразованием при 30oС в среде цистеин-тетрациклин10. Биологический анализ инсектицидности (табл. 2) проводят как на полных цельных культурах, так и на отмытых препаратах кристаллического белка. Контрольные образцы включают Bt51 (рSВ440), содержащий токсин CryIC, и Bt51 (рSВ636), содержащий CryIE. Концентрацию токсина определяют электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия.
Несмотря на то, что изобретение описано на примере получения гибридного токсина G27, специалисту будет понятно, что, пользуясь информацией из этого описания, можно получить многие другие гибридные токсины с улучшенными инсектицидными показателями. Например, в SEQ ID No.7 и 8 представлены другие гибридные токсины согласно изобретению, которые обладают повышенной инсектицидной активностью. Можно получить гибридные токсины, содержащие домен III белка CryIC и N-конец любого иного белка Cry. Что касается биологических испытаний, триансформанты, несущие гибридный токсин, можно вырастить в SOP средах для ускорения испытаний и уменьшения объемов используемого материала. Кроме того, ген, кодирующий G27 и/или другие гибридные токсины, согласно изобретению можно перенести в кодирующие токсин штаммы B.t. и/или интегрировать в хромосому выведенных штамов B.t. или даже ввести в геномы растений для обеспечения инсектицидной активности in situ в этом растении. В этом случае особенно предпочтительно рекомбинантную ДНК, кодирующую токсины, модифицировать так, чтобы кодоны, предпочтительные для растения, которому эта рекомбинантная ДНК предназначена, были использованы так, что экспрессией такой модифицированной ДНК в указанном растении синтезируется белок, по существу сходный с белком, синтезируемым при экспрессии немодифицированной рекомбинантной ДНК в организме, для которого белковые компоненты гибридного токсина или фрагментов токсина являются эндогенными.
Claims (12)
1. Фрагмент гибридного токсина Bacillus thuringiensis (B. t), обладающий инсектицидной активностью, где ДНК гена, кодирующего указанный фрагмент, получен посредством единичного случая рекомбинации, содержащего на своем С-терминальном конце домен III белка СrуС или СrуА, при условии, что N-терминальная область фрагмента содержит домен II белка, выбранного из группы, включающей CryIA(a), CryIA(b), CryIA(c), CryIB, CryIC, CryID, CryIE, CryIF, CryIG, CryIH, CryIIA, CryIIB, CryIIC, CryIIIA, CryIIIB, CryIIIB(b), CryIVA, CryIVB, CryIVC, CryIVD, CYTA, CryXI(IIIC), CryX2(IIID), СrуХ3, CryV и CryX4, и этот фрагмент токсина B. t. связывается с рецептором, расположенным в кишке насекомого, отличающимся от рецептора, который связывается с CryC- или СrуА- белком.
2. Фрагмент гибридного токсина B. t. по п. 1, отличающийся тем, что он не связывается с рецептором, связывающимся с CryIC.
3. Фрагмент токсина по любому предшествующему пункту, отличающийся тем, что N-терминальная область содержит домен II белков CryIE, CryIB, CryID или CryIA(a), CryIA(b), CryIA(c) и домен III белка CryIC.
4. Фрагмент токсина по любому предшествующему пункту, отличающийся тем, что N-терминальная область кроме домена II, содержит домены I белков CrylE, CryIB, CryID, CryIA(a), CryIA(b) или CryIA(c), и домен III белка CryIC.
5. Фрагмент токсина по любому предшествующему пункту, отличающийся тем, что он имеет на своем С-терминальном конце область, содержащую последовательность от аминокислотного положения 454 до положения 602 белка СrуIC.
6. Фрагмент токсина по любому предшествующему пункту, отличающийся тем, что он имеет на своем С-терминальном конце область, содержащую последовательность от аминокислоты в положении 478 до аминокислоты в положении 602 белка CryIC.
7. Фрагмент токсина по п. 1, отличающийся тем, что он содержит последовательность аминокислот приблизительно от аминокислоты 1 до приблизительно аминокислоты 620 в SEQ ID No. 6 или последовательность аминокислот от приблизительно аминокислоты 1 до приблизительно аминокислоты 620 в SEQ ID No. 6, в которой по отношению к указанной последовательности произведена по меньшей мере одна из следующих замен: Ilе в положении 609 заменен Leu; Ala в положении 618 заменен Glu; Ser в положении 620 заменен Туr.
8. Фрагмент токсина по п. 1, отличающийся тем, что он содержит последовательность аминокислот приблизительно от аминокислоты 1 до приблизительно аминокислоты 627 в SEQ ID No. 8 или последовательность аминокислот от приблизительно аминокислоты 1 до приблизительно аминокислоты 627 в SEQ ID No. 8, в которой по отношению к указанной последовательности произведена по меньшей мере одна из следующих замен: Ilе в положении 617 заменен Leu; Ala в положении 625 заменен Glu; Ser в положении 627 заменен Туr.
9. Рекомбинантная ДНК, кодирующая фрагмент гибридного токсина Bacillus thuringiensis по любому из пп. 1-8, содержит фрагмент нуклеотидной последовательности от нуклеотида 1 до приблизительно нуклеотида 1860, приведенной в SEQ ID No. 5, или фрагмент нуклеотидной последовательности от нуклеотида 1 до приблизительно нуклеотида 1881, приведенной в SEQ ID No. 7.
10. Рекомбинантная ДНК по п. 9, отличающаяся тем, что она модифицирована так, что из нее исключены известные основные элементы нестабильности мРНК или сигналы полиаденилирования, и/или ее кодоны являются предпочтительными для организма, которому эта рекомбинантная ДНК предназначена, и ее используют так, что при экспрессии такой модифицированной ДНК в указанном организме синтезируется белок, по существу, сходный с белком, синтезируемым при экспрессии немодифицированной рекомбинантной ДНК в организме, содержащем эндогенные компоненты белка гибридного токсина или фрагментов токсина.
11. Рекомбинантная ДНК по любому из пп. 9 и 10, которая содержится в векторе.
12. Способ борьбы с насекомыми, который заключается в обработке их фрагментом гибридного токсина по любому из пп. 1-8 или композициями, содержащими этот токсин.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB939318207A GB9318207D0 (en) | 1993-09-02 | 1993-09-02 | Improvements in or relating to organic compounds |
| GB9318207.9 | 1993-09-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU96107260A RU96107260A (ru) | 1998-10-10 |
| RU2210593C2 true RU2210593C2 (ru) | 2003-08-20 |
Family
ID=10741404
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU96107260/13A RU2210593C2 (ru) | 1993-09-02 | 1994-09-01 | ФРАГМЕНТ ГИБРИДНОГО ТОКСИНА Bacillus thuringiensis, ОБЛАДАЮЩИЙ ИНСЕКТИЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, КОДИРУЮЩАЯ ЕГО РЕКОМБИНАНТНАЯ ДНК, СПОСОБ БОРЬБЫ С НАСЕКОМЫМИ |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5736131A (ru) |
| EP (1) | EP0719335B1 (ru) |
| JP (1) | JPH09502343A (ru) |
| KR (1) | KR100360918B1 (ru) |
| AT (1) | ATE329033T1 (ru) |
| AU (1) | AU691522B2 (ru) |
| BR (1) | BR9407377A (ru) |
| CA (1) | CA2168011C (ru) |
| DE (1) | DE69434758T2 (ru) |
| ES (1) | ES2262136T3 (ru) |
| GB (1) | GB9318207D0 (ru) |
| IL (1) | IL110829A (ru) |
| PL (1) | PL181408B1 (ru) |
| RU (1) | RU2210593C2 (ru) |
| TW (1) | TW430669B (ru) |
| UA (1) | UA57698C2 (ru) |
| WO (1) | WO1995006730A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA946770B (ru) |
Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2497830C2 (ru) * | 2007-03-28 | 2013-11-10 | Зингента Партисипейшнс Аг | Гибридный инсектицидный белок, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая такой белок, трансгенные растения и их семена, содержащие такой белок, способ получения белка и его применение |
| RU2569108C2 (ru) * | 2009-12-16 | 2015-11-20 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | ПРИМЕНЕНИЕ Cry1Da В СОЧЕТАНИИ С Cry1Ca ДЛЯ УПРАВЛЕНИЯ УСТОЙЧИВЫМИ НАСЕКОМЫМИ |
| RU2569460C2 (ru) * | 2009-12-16 | 2015-11-27 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | Инсектицидные белковые комбинации, содержащие cry1ab и cry2aa, для регулирования кукурузного мотылька и способы борьбы с устойчивостью насекомых |
| RU2575084C2 (ru) * | 2009-12-16 | 2016-02-10 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | ПРИМЕНЕНИЕ Vip3Ab В СОЧЕТАНИИ С Cry1Ca ДЛЯ УПРАВЛЕНИЯ УСТОЙЧИВЫМИ НАСЕКОМЫМИ |
| RU2582249C2 (ru) * | 2010-04-23 | 2016-04-20 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | КОМБИНАЦИИ, ВКЛЮЧАЮЩИЕ БЕЛКИ Cry34Ab/35Ab И Cry3Aa, ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ РАЗВИТИЯ УСТОЙЧИВОСТИ У КУКУРУЗНЫХ КОРНЕВЫХ ЖУКОВ (Diabrotica spp.) |
| RU2583288C2 (ru) * | 2009-12-16 | 2016-05-10 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | Применение cry1ab в комбинации с cry1be для управления резистентностью насекомых |
| RU2590592C2 (ru) * | 2009-12-16 | 2016-07-10 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | ПРИМЕНЕНИЕ Cry1Da В СОЧЕТАНИИ С Cry1Be ДЛЯ УПРАВЛЕНИЯ УСТОЙЧИВЫМИ НАСЕКОМЫМИ |
| RU2593961C2 (ru) * | 2009-12-16 | 2016-08-10 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | КОМБИНИРОВАННОЕ ПРИМЕНЕНИЕ БЕЛКОВ CRY1Ca И CRY1Fa ДЛЯ БОРЬБЫ С РЕЗИСТЕНТНОСТЬЮ У НАСЕКОМЫХ |
| RU2596406C2 (ru) * | 2009-12-16 | 2016-09-10 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | КОМБИНИРОВАННОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БЕЛКОВ CRY1Ca И CRY1Ab ДЛЯ КОНТРОЛЯ УСТОЙЧИВОСТИ НАСЕКОМЫХ |
| RU2599446C2 (ru) * | 2010-07-07 | 2016-10-10 | Зингента Партисипейшнс Аг | Борьба с жесткокрылыми насекомыми-вредителями |
| RU2603257C2 (ru) * | 2009-12-16 | 2016-11-27 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | КОМБИНИРОВАННОЕ ПРИМЕНЕНИЕ БЕЛКОВ Cry1Da И Cry1Fa ДЛЯ ВЫРАБАТЫВАНИЯ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К НАСЕКОМЫМ |
| RU2607666C2 (ru) * | 2009-12-16 | 2017-01-10 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | КОМБИНИРОВАННОЕ ПРИМЕНЕНИЕ БЕЛКОВ Vip3Ab И Cry1Fa ДЛЯ ВЫРАБАТЫВАНИЯ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К НАСЕКОМЫМ |
| RU2608500C2 (ru) * | 2010-12-16 | 2017-01-18 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | Комбинированное применение vip3ab и cry1ab для регулирования устойчивых насекомых |
| RU2624031C2 (ru) * | 2011-08-05 | 2017-06-30 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | Применение инсектицидного кристаллического белка dig3 в комбинации с cry1ab для регулирования устойчивости к кукурузному мотыльку |
| US10119149B2 (en) | 2011-08-05 | 2018-11-06 | Dow Agrosciences Llc | Use of DIG3 insecticidal crystal protein in combination with cry1Ab for management of resistance in european cornborer |
Families Citing this family (49)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0413019B1 (en) * | 1989-02-24 | 2001-10-04 | Monsanto Technology LLC | Synthetic plant genes and method for preparation |
| GB9318207D0 (en) | 1993-09-02 | 1993-10-20 | Sandoz Ltd | Improvements in or relating to organic compounds |
| US6780408B1 (en) | 1993-09-02 | 2004-08-24 | Syngenta Participations Ag | Genes encoding hybrid bacillus thuringiensis toxins |
| US5593881A (en) * | 1994-05-06 | 1997-01-14 | Mycogen Corporation | Bacillus thuringiensis delta-endotoxin |
| US6063756A (en) | 1996-09-24 | 2000-05-16 | Monsanto Company | Bacillus thuringiensis cryET33 and cryET34 compositions and uses therefor |
| CA2272843C (en) * | 1996-11-20 | 2009-11-10 | Ecogen, Inc. | Broad-spectrum delta-endotoxins |
| US6713063B1 (en) | 1996-11-20 | 2004-03-30 | Monsanto Technology, Llc | Broad-spectrum δ-endotoxins |
| US6017534A (en) | 1996-11-20 | 2000-01-25 | Ecogen, Inc. | Hybrid Bacillus thuringiensis δ-endotoxins with novel broad-spectrum insecticidal activity |
| US5942664A (en) * | 1996-11-27 | 1999-08-24 | Ecogen, Inc. | Bacillus thuringiensis Cry1C compositions toxic to lepidopteran insects and methods for making Cry1C mutants |
| US6121436A (en) * | 1996-12-13 | 2000-09-19 | Monsanto Company | Antifungal polypeptide and methods for controlling plant pathogenic fungi |
| EP1555319A3 (en) * | 1997-10-20 | 2006-03-15 | GTC Biotherapeutics, Inc. | Modified nucleic acid sequences and method to increasing mRNA levels and protein expression in cell systems |
| US6218188B1 (en) | 1997-11-12 | 2001-04-17 | Mycogen Corporation | Plant-optimized genes encoding pesticidal toxins |
| AU774176B2 (en) * | 1997-11-12 | 2004-06-17 | Mycogen Corporation | Plant-optimised genes encoding pesticidal toxins |
| US6121521A (en) * | 1998-04-01 | 2000-09-19 | Novartis Ag | Chimeric insecticidal protein and DNA coding therefor |
| EP1099760A1 (en) * | 1999-11-09 | 2001-05-16 | Centrum Voor Plantenveredelings- En Reproduktieonderzoek (Cpro) | Bacillus thuringiensis Cry1Ia-Cry1Ba hybrid toxins |
| ES2243543T3 (es) * | 2000-08-25 | 2005-12-01 | Syngenta Participations Ag | Hibridos de proteinas cristalinas de bacillus thurigiensis. |
| CA2446215A1 (en) * | 2001-05-04 | 2002-11-14 | North Carolina State University | Polymer conjugates of insecticidal peptides or nucleic acids and methods of use thereof |
| US20030108585A1 (en) * | 2001-05-04 | 2003-06-12 | Roe R. Michael | Polymer conjugates of insecticidal peptides or nucleic acids or insecticides and methods of use thereof |
| US20060009409A1 (en) | 2002-02-01 | 2006-01-12 | Woolf Tod M | Double-stranded oligonucleotides |
| WO2003064621A2 (en) * | 2002-02-01 | 2003-08-07 | Ambion, Inc. | HIGH POTENCY siRNAS FOR REDUCING THE EXPRESSION OF TARGET GENES |
| ATE508188T1 (de) * | 2002-02-01 | 2011-05-15 | Life Technologies Corp | Oligonukleotid-zusammensetzungen mit verbesserter wirksamkeit |
| US7557186B2 (en) * | 2002-03-27 | 2009-07-07 | Council Of Scientific & Industrial Research | Chimeric CrylE δ endotoxin and methods of controlling insects |
| US7053266B2 (en) * | 2002-03-27 | 2006-05-30 | Council Of Scientfic And Industrial Research | Chimeric cry1E δendotoxin and methods of controlling insects |
| US20040029275A1 (en) * | 2002-08-10 | 2004-02-12 | David Brown | Methods and compositions for reducing target gene expression using cocktails of siRNAs or constructs expressing siRNAs |
| US7393922B2 (en) * | 2003-08-29 | 2008-07-01 | The Ohio State University Research Foundation | Insecticidal Cry4Ba proteins with enhanced toxicity |
| CA2771677A1 (en) | 2005-08-31 | 2007-03-08 | Monsanto Technology Llc | Nucleotide sequences encoding insecticidal proteins |
| CN100510081C (zh) | 2005-10-17 | 2009-07-08 | 华中农业大学 | 苏云金芽胞杆菌的杀虫晶体蛋白基因cry7Bal |
| AU2007228981B2 (en) * | 2006-03-21 | 2012-10-04 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Novel genes encoding insecticidal proteins |
| EP2021476B1 (en) | 2006-05-26 | 2014-07-09 | Monsanto Technology, LLC | Corn plant and seed corresponding to transgenic event mon89034 and methods for detection and use thereof |
| US9522937B2 (en) | 2007-03-28 | 2016-12-20 | Syngenta Participations Ag | Insecticidal proteins |
| WO2008145406A1 (en) * | 2007-06-01 | 2008-12-04 | Bayer Bioscience N.V. | Novel genes encoding insecticidal proteins |
| MX348698B (es) | 2008-12-16 | 2017-06-26 | Syngenta Participations Ag | Evento 5307 del maiz. |
| AU2010221135A1 (en) | 2009-03-05 | 2011-09-29 | Metabolix, Inc. | Propagation of transgenic plants |
| DK2419441T3 (en) | 2009-04-17 | 2015-04-27 | Dow Agrosciences Llc | Insecticidal dig-3-cry toxins |
| BR112012009381A2 (pt) | 2009-10-02 | 2017-03-01 | Syngenta Participations Ag | "proteínas inseticidas" |
| CA2782554A1 (en) | 2009-12-16 | 2011-07-14 | Dow Agrosciences Llc | Modified cry1ca insecticidal cry proteins |
| CA3049609C (en) * | 2010-02-18 | 2024-02-13 | Athenix Corp. | Axmi221z, axmi222z, axmi223z, axmi224z, and axmi225z delta-endotoxin genes and methods for their use |
| US8735560B1 (en) * | 2010-03-02 | 2014-05-27 | Monsanto Technology Llc | Multiple domain lepidopteran active toxin proteins |
| US9234208B1 (en) | 2010-05-10 | 2016-01-12 | Dow Agrosciences Llc | DIG-13 insecticidal cry toxins |
| WO2012131619A1 (en) * | 2011-03-30 | 2012-10-04 | Metahelix Life Sciences Limited | A nucleotide sequence, expression cassette, transgenic events, cells and methods thereof |
| CN103923204B (zh) * | 2014-04-04 | 2016-06-08 | 湖北省生物农药工程研究中心 | 杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌的活性物质及其应用 |
| SG10201913870RA (en) | 2014-10-16 | 2020-03-30 | Monsanto Technology Llc | Novel chimeric insecticidal proteins toxic or inhibitory to lepidopteran pests |
| US10487123B2 (en) | 2014-10-16 | 2019-11-26 | Monsanto Technology Llc | Chimeric insecticidal proteins toxic or inhibitory to lepidopteran pests |
| TW201615095A (zh) | 2014-10-31 | 2016-05-01 | 陶氏農業科學公司 | Ｄｉｇ－３０３殺蟲ｃｒｙ毒素 |
| CN114213510A (zh) | 2014-12-30 | 2022-03-22 | 美国陶氏益农公司 | 可用于控制昆虫害虫的修饰的Cry1Ca毒素 |
| CN109952024B (zh) * | 2016-10-10 | 2023-11-03 | 孟山都技术公司 | 新型昆虫抑制蛋白 |
| US11692013B2 (en) | 2016-10-19 | 2023-07-04 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Broad spectrum insecticidal polypeptide against lepidopteran pests and methods of use thereof |
| CA3037371A1 (en) * | 2016-10-19 | 2018-04-26 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Broad spectrum insecticidal polypeptide against lepidopteran pests and methods of use thereof |
| CN111465406A (zh) | 2017-12-15 | 2020-07-28 | 先正达参股股份有限公司 | 用于检测靶蛋白的非抗体配体 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1341092C (en) | 1985-12-12 | 2000-09-05 | David L. Edwards | Process for altering the host range of bacillus thuringiensis toxins, and novel toxins produced thereby |
| IT1231157B (it) * | 1989-07-20 | 1991-11-19 | Crc Ricerca Chim | Nuovi geni ibridi funzionali di bacillus thuringiensis ottenuti mediante ricombinazione in vivo. |
| HU220773B1 (hu) * | 1990-01-22 | 2002-05-28 | Dekalb Genetics Corporation | Eljárás termő transzgenikus kukoricanövények előállítására |
| GB9318207D0 (en) | 1993-09-02 | 1993-10-20 | Sandoz Ltd | Improvements in or relating to organic compounds |
| US5593881A (en) * | 1994-05-06 | 1997-01-14 | Mycogen Corporation | Bacillus thuringiensis delta-endotoxin |
| US5527883A (en) | 1994-05-06 | 1996-06-18 | Mycogen Corporation | Delta-endotoxin expression in pseudomonas fluorescens |
| US5508264A (en) | 1994-12-06 | 1996-04-16 | Mycogen Corporation | Pesticidal compositions |
-
1993
- 1993-09-02 GB GB939318207A patent/GB9318207D0/en active Pending
-
1994
- 1994-01-09 UA UA96010346A patent/UA57698C2/ru unknown
- 1994-08-31 IL IL110829A patent/IL110829A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-09-01 AU AU76932/94A patent/AU691522B2/en not_active Expired
- 1994-09-01 JP JP7507955A patent/JPH09502343A/ja active Pending
- 1994-09-01 ES ES94927535T patent/ES2262136T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-01 PL PL94313317A patent/PL181408B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1994-09-01 RU RU96107260/13A patent/RU2210593C2/ru active
- 1994-09-01 WO PCT/EP1994/002909 patent/WO1995006730A1/en active IP Right Grant
- 1994-09-01 US US08/602,737 patent/US5736131A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-01 DE DE69434758T patent/DE69434758T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-01 AT AT94927535T patent/ATE329033T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-09-01 BR BR9407377A patent/BR9407377A/pt not_active Application Discontinuation
- 1994-09-01 EP EP94927535A patent/EP0719335B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-01 CA CA002168011A patent/CA2168011C/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-01 KR KR1019960700973A patent/KR100360918B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1994-09-02 ZA ZA946770A patent/ZA946770B/xx unknown
- 1994-09-06 TW TW083108194A patent/TW430669B/zh not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-12-31 US US09/001,982 patent/US6204246B1/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2497830C2 (ru) * | 2007-03-28 | 2013-11-10 | Зингента Партисипейшнс Аг | Гибридный инсектицидный белок, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая такой белок, трансгенные растения и их семена, содержащие такой белок, способ получения белка и его применение |
| RU2532838C2 (ru) * | 2007-03-28 | 2014-11-10 | Зингента Партисипейшнс Аг | Инсектицидные белки |
| RU2590592C2 (ru) * | 2009-12-16 | 2016-07-10 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | ПРИМЕНЕНИЕ Cry1Da В СОЧЕТАНИИ С Cry1Be ДЛЯ УПРАВЛЕНИЯ УСТОЙЧИВЫМИ НАСЕКОМЫМИ |
| RU2596406C2 (ru) * | 2009-12-16 | 2016-09-10 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | КОМБИНИРОВАННОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БЕЛКОВ CRY1Ca И CRY1Ab ДЛЯ КОНТРОЛЯ УСТОЙЧИВОСТИ НАСЕКОМЫХ |
| RU2575084C2 (ru) * | 2009-12-16 | 2016-02-10 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | ПРИМЕНЕНИЕ Vip3Ab В СОЧЕТАНИИ С Cry1Ca ДЛЯ УПРАВЛЕНИЯ УСТОЙЧИВЫМИ НАСЕКОМЫМИ |
| RU2575611C2 (ru) * | 2009-12-16 | 2016-02-20 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | КОНТРОЛЬ УСТОЙЧИВОСТИ НАСЕКОМЫХ С ПОМОЩЬЮ КОМБИНАЦИИ БЕЛКОВ Cry1Be И Cry1F |
| RU2577141C2 (ru) * | 2009-12-16 | 2016-03-10 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | Инсектицидные комбинации белков для борьбы с совкой травяной и кукурузным мотыльком и способы управления устойчивостью насекомых |
| RU2569460C2 (ru) * | 2009-12-16 | 2015-11-27 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | Инсектицидные белковые комбинации, содержащие cry1ab и cry2aa, для регулирования кукурузного мотылька и способы борьбы с устойчивостью насекомых |
| RU2607666C2 (ru) * | 2009-12-16 | 2017-01-10 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | КОМБИНИРОВАННОЕ ПРИМЕНЕНИЕ БЕЛКОВ Vip3Ab И Cry1Fa ДЛЯ ВЫРАБАТЫВАНИЯ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К НАСЕКОМЫМ |
| RU2583288C2 (ru) * | 2009-12-16 | 2016-05-10 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | Применение cry1ab в комбинации с cry1be для управления резистентностью насекомых |
| RU2569108C2 (ru) * | 2009-12-16 | 2015-11-20 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | ПРИМЕНЕНИЕ Cry1Da В СОЧЕТАНИИ С Cry1Ca ДЛЯ УПРАВЛЕНИЯ УСТОЙЧИВЫМИ НАСЕКОМЫМИ |
| RU2603257C2 (ru) * | 2009-12-16 | 2016-11-27 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | КОМБИНИРОВАННОЕ ПРИМЕНЕНИЕ БЕЛКОВ Cry1Da И Cry1Fa ДЛЯ ВЫРАБАТЫВАНИЯ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К НАСЕКОМЫМ |
| RU2593961C2 (ru) * | 2009-12-16 | 2016-08-10 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | КОМБИНИРОВАННОЕ ПРИМЕНЕНИЕ БЕЛКОВ CRY1Ca И CRY1Fa ДЛЯ БОРЬБЫ С РЕЗИСТЕНТНОСТЬЮ У НАСЕКОМЫХ |
| RU2582249C2 (ru) * | 2010-04-23 | 2016-04-20 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | КОМБИНАЦИИ, ВКЛЮЧАЮЩИЕ БЕЛКИ Cry34Ab/35Ab И Cry3Aa, ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ РАЗВИТИЯ УСТОЙЧИВОСТИ У КУКУРУЗНЫХ КОРНЕВЫХ ЖУКОВ (Diabrotica spp.) |
| RU2591519C2 (ru) * | 2010-04-23 | 2016-07-20 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | КОМБИНАЦИИ, ВКЛЮЧАЮЩИЕ БЕЛКИ Cry34Ab/35Ab И Сry3Ba, ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ РАЗВИТИЯ УСТОЙЧИВОСТИ У КУКУРУЗНЫХ КОРНЕВЫХ ЖУКОВ (Diabrotica spp.) |
| RU2582262C2 (ru) * | 2010-04-23 | 2016-04-20 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | КОМБИНАЦИИ, ВКЛЮЧАЮЩИЕ БЕЛКИ Cry34Ab/35Ab И Cry6Aa, ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ РАЗВИТИЯ УСТОЙЧИВОСТИ У КУКУРУЗНЫХ КОРНЕВЫХ ЖУКОВ (Diabrotica spp. ) |
| RU2599446C2 (ru) * | 2010-07-07 | 2016-10-10 | Зингента Партисипейшнс Аг | Борьба с жесткокрылыми насекомыми-вредителями |
| RU2608500C2 (ru) * | 2010-12-16 | 2017-01-18 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | Комбинированное применение vip3ab и cry1ab для регулирования устойчивых насекомых |
| RU2624031C2 (ru) * | 2011-08-05 | 2017-06-30 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | Применение инсектицидного кристаллического белка dig3 в комбинации с cry1ab для регулирования устойчивости к кукурузному мотыльку |
| US10119149B2 (en) | 2011-08-05 | 2018-11-06 | Dow Agrosciences Llc | Use of DIG3 insecticidal crystal protein in combination with cry1Ab for management of resistance in european cornborer |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL110829A0 (en) | 1994-11-11 |
| PL181408B1 (pl) | 2001-07-31 |
| PL313317A1 (en) | 1996-06-24 |
| DE69434758T2 (de) | 2006-11-09 |
| DE69434758D1 (de) | 2006-07-20 |
| UA57698C2 (ru) | 2003-07-15 |
| ZA946770B (en) | 1996-03-04 |
| BR9407377A (pt) | 1996-07-16 |
| CA2168011C (en) | 2007-11-06 |
| CA2168011A1 (en) | 1995-03-09 |
| EP0719335A1 (en) | 1996-07-03 |
| EP0719335B1 (en) | 2006-06-07 |
| TW430669B (en) | 2001-04-21 |
| KR100360918B1 (ko) | 2005-01-15 |
| ES2262136T3 (es) | 2006-11-16 |
| GB9318207D0 (en) | 1993-10-20 |
| WO1995006730A1 (en) | 1995-03-09 |
| AU691522B2 (en) | 1998-05-21 |
| US6204246B1 (en) | 2001-03-20 |
| ATE329033T1 (de) | 2006-06-15 |
| IL110829A (en) | 2006-08-20 |
| JPH09502343A (ja) | 1997-03-11 |
| US5736131A (en) | 1998-04-07 |
| AU7693294A (en) | 1995-03-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2210593C2 (ru) | ФРАГМЕНТ ГИБРИДНОГО ТОКСИНА Bacillus thuringiensis, ОБЛАДАЮЩИЙ ИНСЕКТИЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, КОДИРУЮЩАЯ ЕГО РЕКОМБИНАНТНАЯ ДНК, СПОСОБ БОРЬБЫ С НАСЕКОМЫМИ | |
| Bosch et al. | Recombinant Bacillus thuringiensis crystal proteins with new properties: possibilities for resistance management | |
| US8796026B2 (en) | Insecticidal proteins secreted from Bacillus thuringiensis and uses therefor | |
| de Maagd et al. | Domain III substitution in Bacillus thuringiensis delta-endotoxin CryIA (b) results in superior toxicity for Spodoptera exigua and altered membrane protein recognition | |
| AU645080B2 (en) | B. Thuringiensis CRYIIIC gene and coleopteran toxic protein | |
| EP0758385B1 (en) | Chimeric delta-endotoxin expression in pseudomonas fluorescens | |
| JP3325564B2 (ja) | Ｂｔ耐性発現の防止 | |
| US5338544A (en) | CryIIB protein, insecticidal compositions and methods of use thereof | |
| CA1341388C (en) | Hybrid pesticidal toxins | |
| CA2187534A1 (en) | Improved bacillus thuringiensis .delta.-endotoxin | |
| JPH10506532A (ja) | 新規な有害生物防除性タンパク質および菌株 | |
| CA2117270A1 (en) | Use of bacillus thuringiensis isolates for controlling pests in the family aphididae | |
| US6780408B1 (en) | Genes encoding hybrid bacillus thuringiensis toxins | |
| WO1988006631A1 (en) | Hybrid genes incorporating a dna fragment containing a gene coding for an insecticidal protein, plasmids, transformed cyanobacteria expressing such protein and method for use as a biocontrol agent | |
| Luo et al. | Removal of adsorbed toxin fragments that modify Bacillus thuringiensis CryIC δ-endotoxin iodination and binding by sodium dodecyl sulfate treatment and renaturation | |
| CA2325831C (en) | Bacillus thuringiensis cryiiic gene and protein toxic to coleopteran insects | |
| JPH08510637A (ja) | バチルス・チュリンゲンシスの新菌株及びその殺虫性タンパク質 | |
| Audtho | Mode of action of Cry2Aa, a Bacillus thuringiensis dual active insecticidal crystal protein | |
| Ge | Hyperexpression of a Bacillus thuringiensis delta-endotoxin gene in Escherichia coli and localization of its specificity domain |