ES2262136T3 - Toxina hibrida. - Google Patents
Toxina hibrida.Info
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Abstract
LA INVENCION SUMINISTRA, "INTER ALIA", UN FRAGMENTO DE LA TOXINA HIBRIDA B.T. Y SU DOMINANTE III DEL TERMINAL C DE UNA PRIMERA PROTEINA CRY O UNA PARTE DEL DOMINANTE O UNA PROTEINA SUBSTANCIALMENTE SIMILAR AL DOMINANTE, CON LA CONDICION DE QUE LA REGION DEL TERMINAL N DEL FRAGMENTO SEA LA REGION DEL TERMINAL N DE LA SEGUNDA PROTEINA CRY O UNA PARTE DE LA REGION O UNA PROTEINA SUBSTANCIALMENTE SIMILAR A LA REGION.
Description
Toxina híbrida.
La presente invención se refiere a fragmentos de
toxinas híbridas, y toxinas que los comprenden, derivadas de
proteínas cristalinas insecticidas de Bacillus
thuringiensis.
El microorganismo Bacillus thuringiensis
(en lo sucesivo B.t.) es capaz de producir proteínas que se acumulan
intracelularmente como cristales. Estas proteínas cristalinas son
tóxicas para cierto número de larvas de insecto. Sobre la base de
la homología de secuencia y especificidad insecticida, las proteínas
cristalinas se han dividido en clases diferentes. Las mejor
estudiadas son la clase CryI de proteínas que se producen como
pro-toxinas de 140 kDa y son activas contra los
lepidópteros.
En cierta proporción, el modo de acción de las
proteínas cristalinas ha sido esclarecido. Después de la absorción
oral, los cristales se disuelven en el ambiente alcalino del
intestino medio de las larvas. Las proteínas solubilizadas son
procesadas subsiguientemente por proteinasas del intestino medio
para dar un fragmento tóxico de aproximadamente 65 kDa resistente a
las proteinasas que se fija a receptores existentes en las células
epiteliales del intestino medio del insecto y atraviesa la membrana
celular. Esto conduce finalmente al estallido de las células y la
muerte de las
larvas.
larvas.
Honée et al (Mol. Microbiology (1991) Vol
5 (11), páginas 2799-2806) expone que el dominio
C-terminal del fragmento tóxico de una proteína
cristalina de Bacillus thuringiensis determina la fijación de
receptores.
El espectro de actividad de una proteína
cristalina particular está determinado en gran proporción por la
existencia de receptores en las células epiteliales del intestino
medio de los insectos sensibles. Dicho espectro está
co-determinado por la eficiencia de solubilización
de la proteína cristalina y su activación proteolítica in
vivo.
La importancia de la fijación de la proteína
cristalina a los sectores epiteliales del intestino medio se
demuestra ulteriormente en los casos en que los insectos han
desarrollado resistencia a una de las proteínas cristalinas en el
sentido de que la fijación de las proteínas cristalinas a las
células epiteliales del intestino medio de los insectos resistentes
se reduce significativamente.
Se cree que los fragmentos tóxicos de las
proteínas cristalinas están compuestos de tres dominios
estructurales distintos. El dominio I, el dominio más próximo al
terminal N, está constituido por siete hélices \alpha. El dominio
II comprende tres hojas \beta y el dominio III (el más próximo al
terminal C) está plegado en un sándwich \beta. Si se proyectan en
secuencias CryI, el dominio I avanza desde aproximadamente el
residuo de aminoácido 28 al 260, el dominio II desde
aproximadamente 260 a 460 y el dominio III desde aproximadamente 460
a 600.
La presente invención concierne a proteínas
cristalinas híbridas que implican particularmente CryIC y CryIE o
CryIA. La secuencia de nucleótidos del gen CryIC de B.t. sub.sp.
entomocidus 60.5 se da en SEQ ID No. 1, y la secuencia de
aminoácidos correspondiente de la proteína codificada por dicha
secuencia de nucleótidos se da en SEQ ID No. 2. La secuencia de
nucleótidos del gen CryIE de B.t. sub.sp. kenyae 4FI se da en
SEQ ID No. 3, y la secuencia de aminoácidos correspondiente de la
proteína codificada por dicha secuencia de nucleótidos se da en SEQ
ID No. 4. Estas proteínas son tóxicas para los lepidópteros, pero
dentro de este orden de insectos, cada proteína tiene especificidad
diferente. CryIC es particularmente activo contra S. exigua y
M. brassicae.
La presente solicitud da a conocer una toxina
híbrida de B.t. que comprende en su terminal C el dominio III de
una primera proteína Cry o una parte del dominio o una proteína
sustancialmente similar al dominio, con la salvedad de que
la región del terminal N del fragmento es la región del terminal N
de una segunda proteína Cry o una parte de la región o una proteína
sustancialmente similar a la región. Un fragmento preferido es uno
que no se fija al sitio de fijación CryIC en el intestino de un
insecto cuando el mismo comprende en su terminal C el dominio III
de CryIC o una parte del dominio o una proteína sustancialmente
similar al dominio; o uno que no se fija a un sitio de fijación de
CryIA cuando comprende en su terminal C el dominio III de CryIA o
una parte del dominio o una proteína sustancialmente similar al
dominio.
De acuerdo con la presente invención, se
proporciona una toxina insecticida híbrida de Bacillus
thuringiensis (B.t.) que comprende en su terminal C, el dominio
III de una proteína CryIC o una parte funcionalmente equivalente de
la misma y en su terminal N, los dominios I y II de una segunda
proteína CryI seleccionada del grupo constituido por CryIA, CryIB,
CryID, CryIE, CryIF, CryIG, CryIH, en donde dicho dominio III de
CryIC o parte del mismo confiere a la toxina híbrida la plena
actividad frente a S. exigua y M. brassicae.
Por sustancialmente similar se entiende
proteínas puras que tienen una secuencia de aminoácidos que es al
menos 75% similar a la secuencia de las proteínas de acuerdo con la
invención. Se prefiere que el grado de semejanza es al menos 85%,
más preferiblemente que el grado de semejanza es al menos 90% y
todavía más preferiblemente que el grado de semejanza es al menos
95%.
En el contexto de la presente invención, dos
secuencias de aminoácidos con al menos 75%, 85%, 90% o 95% de
semejanza una con respecto a otra tienen al menos 75%, 85%, 90%, o
95% de residuos de aminoácidos idénticos o reemplazados de modo
conservador en la misma posición cuando se alinean óptimamente
dejando hasta 6 lagunas con la salvedad de que, en lo que
respecta a las lagunas, están afectados un total no mayor que 15
residuos de aminoácidos. Para el propósito de la presente
invención, los reemplazamientos conservadores pueden hacerse entre
aminoácidos dentro de los grupos siguientes:
- (i)
- serina y treonina;
- (ii)
- ácido glutámico y ácido aspártico;
- (iii)
- arginina y lisina;
- (iv)
- asparagina y glutamina;
- (v)
- isoleucina, leucina, valina y metionina;
- (vi)
- fenilalanina, tirosina y triptófano,
- (vii)
- alanina y glicina
con la salvedad de que en
SEQ ID No. 6, Ser y Tyr son reemplazamientos conservadores en la
posición 620, y Ala y Glu son reemplazamientos conservadores en la
posición 618; y que en SEQ ID No. 8 Ser y Tyr son reemplazamientos
conservadores en la posición 627, y Ala y Glu son reemplazamientos
conservadores en la posición
625.
Por "parte" de una proteína se entiende un
péptido constituido por dicha proteína y que tiene al menos 80% de
la secuencia consecutiva de la misma.
Por "sitio de fijación" se entiende un
sitio en una molécula en donde la fijación entre el sitio y la
toxina es reversible de tal modo que el valor K\alpha
entre el sitio y la toxina es del orden de al menos 10^{4}
dm^{3} mol^{-1}.
Un fragmento de toxina puede comprender en su
terminal N la región del terminal N de cualesquiera proteínas
insecticidas procedentes de B.t. que se conocen comúnmente como
"Cry" o "Cyt", que incluyen: CryIA(a),
CryIA(b), CryIA(c), CryIB, CryIC, CryID, CryIE,
CryIF, CryIG, CryIH, CryIIA, CryIIB, CryIIC, CryIIIA, CryIIIB,
CryIIIB(b), CryIVA, CryIVB, CryIVC, CryIVD, CYTA,
CryXI(IIIC), CryX2(IIID), CryX3, CryV, y CryXIV; o una
parte de la región, o una proteína sustancialmente similar a la
región, y que el terminal C del fragmento es el dominio III de
CryIC o una parte del dominio o una proteína sustancialmente similar
al dominio.
Así, la toxina puede comprender el dominio II de
CryIE, CryIB, CryID, o CryIA, o una parte del dominio o una
proteína sustancialmente similar al dominio, y el dominio III de
CryIC o una parte de dicho dominio III o una proteína
sustancialmente similar a dicho dominio III. Se prefiere
particularmente que el fragmento comprenda los dominios I y II de
CryIE, CryIB, CryID o CryIA o una parte de los mismos o una proteína
sustancialmente similar a dichos dominios, y el dominio III de
CryIC o una parte del mismo o una proteína sustancialmente similar
a dicho dominio III.
Es muy preferido que la toxina comprenda una
región en su terminal C que comprende la secuencia desde la posición
del aminoácido 454 a la posición 602 de CryIC, o una secuencia
sustancialmente similar a dicha secuencia. El fragmento puede
comprender una región en su terminal C que comprende la secuencia
desde la posición del aminoácido 478 a 602 de CryIC, o una
secuencia sustancialmente similar a dicha secuencia, con la salvedad
de que si la secuencia que comprende los aminoácidos 478 a 602 de
CryIC está fusionada directamente al terminal C del dominio II de
CryIA, CryIB, CryID o CryIE, entonces el plegamiento del producto de
fusión es satisfactorio para producir un componente insecticida de
la toxina. El experto reconocerá que puede ser necesario añadir una
región peptídica al terminal C del dominio ii que separa la región
del terminal C de CryIC, permitiendo así que el mismo se pliegue de
tal manera que exhiba actividad insecticida.
Es muy particularmente preferido que la toxina
híbrida de acuerdo con la invención comprenda:
i) una secuencia de aminoácidos desde
aproximadamente el aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 620
en SEQ ID No. 6, o una secuencia de aminoácidos desde
aproximadamente el aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 620
en SEQ ID No. 6, en donde, con respecto a dicha secuencia, está
presente al menos una de las alteraciones siguientes:
- Ile
- en la posición 609 está reemplazado con Leu;
- Ala
- en la posición 618 está reemplazado con Glu;
- Ser
- en la posición 620 está reemplazado con Tyr, o
ii) una secuencia de aminoácidos desde
aproximadamente el aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 627
en SEQ ID No. 8 o una secuencia de aminoácidos desde aproximadamente
el aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 627 en SEQ ID No.
8, en donde con respecto a dicha secuencia, está presente al menos
una de las alteraciones siguientes:
- Ile
- en la posición 616 está reemplazado con Leu;
- Ala
- en la posición 625 está reemplazado con Glu;
- Ser
- en la posición 627 está reemplazado con Tyr.
Cualesquiera que sean las alteraciones de
aminoácidos permitidas, sin embargo, uno o más de los residuos
siguientes -indicados a modo de secuencia con respecto a la
secuencia CryIC- es invariable: Phe (501); Val (478); Trp (479) y
Thr (486).
La presente solicitud da a conocer todavía
adicionalmente DNA recombinante que comprende una secuencia que
codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de las
toxinas híbridas arriba descritas. La presente solicitud da a
conocer todavía adicionalmente DNA recombinante que comprende la
secuencia desde aproximadamente el nucleótido 1 a aproximadamente
el nucleótido 1860 dada en SEQ ID No. 5 o DNA similar al mismo que
codifica una proteína sustancialmente similar, o DNA recombinante
que comprende la secuencia desde aproximadamente el nucleótido 1 a
aproximadamente el nucleótido 1881 en SEQ ID No. 7 o DNA similar al
mismo que codifica una proteína sustancialmente similar.
Por DNA similar se entiende una secuencia de
ensayo que es capaz de hibridarse a la secuencia recombinante de la
invención. Cuando las secuencias de ensayo y las de la invención son
bicatenarias, el ácido nucleico que constituye la secuencia de
ensayo tiene preferiblemente un TM dentro de 20ºC del de la
secuencia de la invención. En el caso en que las secuencias de
ensayo y las de la invención se mezclan y se desnaturalizan
simultáneamente, los valores TM de las secuencias están
preferiblemente dentro de 10ºC uno de otro. Más preferiblemente, la
hibridación se realiza en condiciones severas, estando
preferiblemente el DNA de ensayo o el DNA de la invención
soportado. Así, o bien una secuencia de ensayo o secuencia de la
invención desnaturalizada se fija preferiblemente en primer lugar a
un soporte y la hibridación se efectúa durante un período de tiempo
especificado a una temperatura comprendida entre 50ºC y 70ºC en
solución salina tamponada de citrato de doble concentración que
contiene 0,1% de SDS seguido por lavado del soporte a la misma
temperatura pero con un tampón que tiene una concentración de SC
reducida. Dependiendo del grado de severidad requerido, y por
consiguiente del grado de semejanza de las secuencias, tales
tampones de concentración reducida son típicamente SC de
concentración simple que contiene 0,1% de SDS, SC de concentración
mitad que contiene 0,1% de SDS y SC de concentración diez veces
menor que contiene 0,1% de SDS. Las secuencias que tienen el grado
máximo de semejanza son aquéllas cuya hibridación se ve menos
afectada por lavado en tampones de concentración reducida. Es muy
preferido que las secuencias de ensayo y de la invención sean tan
similares que la hibridación entre ellas no se vea sustancialmente
afectada por el lavado o la incubación en un tampón de citrato de
sodio de concentración diez veces menor que contiene 0,1% de
SDS.
El DNA recombinante puede codificar
adicionalmente una proteína que tenga resistencia a los herbicidas,
promotores de crecimiento de las plantas, propiedades
anti-fúngicas, anti-bacterianas,
anti-víricas y/o anti-nematodos. En
el caso en que el DNA debe introducirse en un organismo heterólogo,
el mismo puede modificarse para eliminar motivos de inestabilidad
del mRNA conocidos (tales como regiones ricas en AT) y pueden
utilizarse señales de poliadenilación, y/o codones que son
preferidos por el organismo ene l cual debe insertarse el DNA
recombinante a fin de que la expresión del DNA así modificado en
dicho organismo produzca proteína sustancialmente similar a la
obtenida por la expresión del DNA recombinante no modificado en el
organismo en el que los componentes proteínicos de la toxina o
fragmentos de la toxina híbrida son endógenos.
La presente solicitud describe todavía
adicionalmente una secuencia de DNA que es complementaria a una que
se hibrida en condiciones severas con el DNA recombinante de acuerdo
con la invención.
Se describen también en la presente solicitud:
un vector que contiene una secuencia de DNA recombinante de este
tipo (o complementaria a la misma); una planta o
micro-organismo que incluye dicho DNA y permite la
expresión del mismo; plantas transformadas con dicho DNA; la
progenie de dichas plantas que contienen el DNA incorporado de modo
estable y heredable de una manera mendeliana, y/o las semillas de
dichas plantas y dicha progenie.
La presente solicitud describe todavía
adicionalmente proteína derivada de la expresión de dicho DNA, y
proteína insecticida producida por expresión del DNA recombinante
dentro de plantas transformadas con el mismo.
La invención incluye todavía adicionalmente una
composición insecticida que contiene una o más de las toxinas
híbridas de acuerdo con la invención; un proceso para combatir
insectos que comprende exponer los mismos a tales toxinas o
composiciones, y un proceso de extracción para obtener proteínas
insecticidas a partir de material orgánico que contiene las mismas,
que comprende someter el material a maceración y extracción con
disolventes.
La invención será adicionalmente evidente a
partir de la descripción siguiente, que describe la producción de
toxinas híbridas de B.t. de acuerdo con la invención, tomada en
asociación con los dibujos y listados de secuencias asociados.
La Figura 1 muestra la generación de genes de
proteínas cristalinas híbridas por recombinación in vivo. Se
construyen plásmidos en tándem (pBD560 y pBD650) que llevan dos
genes de proteínas cristalinas truncados en orientación de
repetición directa. El gen localizado 5' (barra vacía) carece de la
región codificante de protoxina (barra llena) y del gen localizado
en 3' (barra de trazos) se ha delecionado parte de la región
codificante del dominio I. La recombinación in vivo entre
las regiones homólogas (dominio II y HI) tiene lugar en recA + la
cepa JM101. La selección contra materiales no recombinantes por
digestión con NotI y BamHI y transformación
subsiguiente da como resultado conjuntos de plásmidos que codifican
proteínas de cristales híbridos.
La Figura 2 muestra la alineación de los
residuos de aminoácidos 420 a 630 de CryIE y CryIC. Se indica el
límite entre los dominios II y III. Se representan únicamente los
residuos de aminoácidos de CryIC que difieren de CryIE, indicándose
los residuos idénticos por un punto. Las posiciones de cruzamiento
(G27, H13, H7, H8, H17 y H21) en los fragmentos de toxinas híbridas
CryIE-CryIC de acuerdo con la invención están
indicadas en la Figura.
La Figura 3 muestra la alineación de los
residuos de aminoácidos 420 a 630 de CryIE y CryIC. Se indica el
límite entre los dominios II y III. Se representan únicamente los
residuos de aminoácidos de CryIC que difieren de CryIE, indicándose
los residuos idénticos por un punto. Las posiciones de cruzamiento
(F59, F71, F26 y E7) en los fragmentos de toxinas híbridas
CryIC-CryIE están indicadas en la Figura.
La Figura 4 muestra los resultados de algunos
experimentos de competición heteróloga. Se incuban CryIC biotinilada
(panel A) y G27 (panel D) con vesículas BBMV de S. exigua en
ausencia (pistas a) o presencia de un exceso de proteína sin
marcar. Después de la incubación, las vesículas se lavan, se cargan
en un gel de SDS-poliacrilamida y se llevan por
transferencia a una membrana de nitrocelulosa. Las proteínas
cristalinas biotiniladas, re-aisladas con las
vesículas, se visualizan utilizando conjugado
estreptavidina-peroxidasa y se indican en la Figura
con una punta de flecha.
La Figura 5 muestra el mapa del plásmido pSB456
que codifica el fragmento de toxina híbrida G27 y se utiliza para
transformar la cepa B.t. 51 menos de la toxina cristalina.
SEQ ID No. 1 muestra la secuencia de nucleótidos
del gen CryIC de B.t. sub.sp. entomocidus 60.5.
SEQ ID No. 2 muestra la secuencia de aminoácidos
de la proteína codificada por el gen CryIC que se muestra en SEQ ID
No. 1.
SEQ ID No. 3 muestra la secuencia de nucleótidos
del gen CryIE de B.t. sub.sp. kenyae 4FI.
SEQ ID No. 4 muestra la secuencia de aminoácidos
de la proteína codificada por el gen CryIE que se muestra en SEQ ID
No. 3
SEQ ID No. 5 muestra la secuencia de nucleótidos
que codifica un fragmento de toxina híbrida CryIE/CryIC de B.t. de
acuerdo con la invención.
SEQ ID No. 6 muestra la secuencia de aminoácidos
de la proteína codificada por la secuencia de nucleótidos que se
muestra en SEQ ID No. 5.
SEQ ID No. 7 muestra la secuencia de nucleótidos
de un fragmento de toxina híbrida CryIA/CryIC de acuerdo con la
invención.
SEQ ID No. 8 muestra la secuencia de aminoácidos
de la proteína codificada por la secuencia de nucleótidos
representada en SEQ ID No. 7.
En la producción de plásmidos que llevan los
genes CryIC o CryIE, se utiliza Escherichia coli
XLI-azul (Stratagene Inc.) con plásmido hospedador
excepto en aquellos casos en que se utiliza JM101 como fondo
recA+. Un vector para la expresión de proteínas cristalinas
en E. coli se deriva de pKK233-2 (Pharmacia
LKB Biotechnology). El tamaño pKK233-2 se reduce
por deleción de un fragmento EcoRI-PvuII que lleva el
gen que codifica resistencia a la tetraciclina. Subsiguientemente
se liga un enlazador XhoI de 6 pb al sito HindIII,
dando como resultado pBD10. Se crea el plásmido BK+ por inserción
de un enlazador BglII en el sitio SacI de Bluescript
SK+ (Stratagene Inc.). El polienlazador de BK+ desde BglII
hasta XhoI se introduce entre el sitio
NcoI-XhoI en pBD10. El vector de expresión resultante
pBD11 contiene el promotor trc fuertemente expresado, el
sitio de fijación de ribosoma lacZ y el codón de iniciación
ATG. El codón de iniciación está superpuesto a un sitio NcoI
y va seguido por el polienlazador para facilitar las inserciones en
el vector. La transcripción se termina por el terminador de
transcripción rrnB.
La clonación de los genes CryIC y CryIE
de B.t. subsp. entomocidus 60.5 y kenya 4F1
respectivamente, es como se ha descrito con anterioridad (Honée
et al., 1990 (Appl. Environ. Microbiol. 56, pp
823-825; Visser et al., 1990 (J. Bacteriol.
172, pp 6783-6788)). Para propósitos de
clonación, se crea un sitio NcoI superpuesto con el codón de
partida de CryIC por mutagénesis in vitro. Se crea un
sitio BglII inmediatamente aguas abajo del codón de
terminación de la traducción de CryIC por mutagénesis orientada,
dando como resultado la secuencia ATAAGATCTGTT (codón de
parada subrayado). El fragmento NcoI-BglII que
contiene la región codificante CryIC se liga a pBDII, dando como
resultado el plásmido de expresión de CryIC, pBD150. pBD155 es un
derivado de pBD150, en el cual las secuencias polienlazadoras 3' de
CryIC se han delecionado.
Un fragmento DraI de pEM14 (Visser et
al., 1990) que contiene el gen CryIE completo se clona en
el sitio EcoRV de SK+, dando como resultado el plásmido
pEM15. Subsiguientemente, se introduce un sitio NcoI por
mutagénesis orientada en el codón de partida del gen, y se
transfiere cryIE como un fragmento NcoI-XhoI a
pBD11 dando como resultado el plásmido de expresión de CryIE,
pBD160.
Se construyen plásmidos que llevan únicamente
regiones codificantes de fragmentos tóxicos de los genes
cryI. Se ligan enlazadores BglII a sitios XmnI
presentes en la posición del par de bases 1835 de cryIC, y al
sitio HgiAI en la posición 1839 de cryIE.
Subsiguientemente, fragmentos NcoI-BglII que contienen
las regiones codificantes de fragmentos tóxicos cryIC (1835
pb) y cryIE (1839 pb) se ligan a pBD11, dando como resultado
pBD151 y pBD161 respectivamente como se describe a continuación.
Los plásmidos en tándem utilizados para la
generación de los genes híbridos cryIC-cryIE se
construyen como sigue. Se ligan enlazadores BamHI a pBD160
digerido con HpaI. Este DNA se incuba con BamHI y
XhoI y el gen cryIE truncado que se extiende desde el
par de bases 704 se liga a pBD151 dando como resultado pBD560. Para
construir un plásmido en tándem para la generación de híbridos
CryIE-CryIC, se digiere pBD155 con NsiI y
XhoI. El fragmento que lleva el gen CryIC truncado,
que se extiende desde el par de bases 266, se liga a pBD161
digerido con PstI/XhoI, dando como resultado el
plásmido pBD650. Debido a secuencias polienlazadoras, están
presentes sitios de restricción únicos NotI y BamHI entre los genes
cryI truncados presentes en los plásmidos en tándem pBD560 y
pBD650.
Todas las técnicas de DNA recombinante son como
se describe por Sambrook et al. 1989 (en Molecular Cloning,
A Laboratory Manual: Cold Spring Harbour Press, Col Spring Harbour),
y la secuenciación del DNA se lleva a cabo por el método
didesoxitrifosfato con colorantes fluorescentes fijados a los
desoxinucleótidos. El análisis es automático, utilizando un
analizador de secuencias de nucleótidos 370A de Applied
Biosystems.
La homología presente entre los genes
cryI permite la recombinación intramolecular in vivo.
Se crean dos plásmidos en tándem, cada uno de los cuales lleva dos
genes de proteínas cristalinas truncados que se superponen solamente
en los dominios II y III. Para ello, la recombinación ocurre
únicamente en las regiones que codifican los dominios II y III.
Recombinaciones en marco, que pueden seleccionarse por digestión con
enzimas de restricción, generan plásmidos que expresan protoxinas
híbridas de 140 kDa de tamaño total. Para generar recombinantes
in vivo, se transfiere un plásmido en tándem (sea pBD560 o
pBD650; Figura 2) a JM101. Se aíslan 5 \mug de DNA a partir de
recombinantes generados independientemente y se digieren con
NotI y BamHI que cortan entre los dos genes
cryI truncados para seleccionar contra materiales no
recombinantes y el DNA se transforma en XL1-azul de
E. coli. Se dejan crecer 5 colonias simples y se analizan los
patrones de proteínas y el contenido de plásmido.
Se generan toxinas híbridas
CryIC-CryIE y CryIE-CryIC utilizando
los plásmidos en tándem pBD560 y pBD650 respectivamente, que se
dejan recombinar en un fondo recA+, se aísla el DNA, se
digiere y se transfiere a la cepa recA- como se ha descrito
arriba.
Se analizan 100 colonias de 20 experimentos
independientes en SDS-PAGE. El 85% de estos clones
producen una proteína de 140 kDa que indica recombinaciones en
marco entre cryIC y cryIE, y cryIE y
cryIC respectivamente. En E. coli, se producen
proteínas CryI como cristales que pueden solubilizarse in
vitro a pH alto. Aproximadamente el 15% de las toxinas híbridas
producidas como anteriormente se solubilizan a pH alto. Los
recombinantes que producen toxinas híbridas solubles se clasifican
primeramente utilizando enzimas de restricción, y subsiguientemente
para cada clase se determina el punto de cruzamiento de híbridos
seleccionados por análisis de la secuencia de DNA. Todos los
cruzamientos que dan como resultado toxinas híbridas solubles
ocurren en o muy cerca del dominio III.
Las proteínas cristalinas se aíslan
esencialmente como se describe por Convent et al., J. Biol.
Chem. 265, pp 1369-1375; Eur. J. Biochem, 195, pp
631-635). Resumidamente, se cultivan E. coli
recombinantes a 30ºC en 250 ml de medio TB hasta una DO_{660} de
10-15. Los cristales aislados del lisado de E.
coli se solubilizan durante la incubación por espacio de 2 h en
Na_{2}CO_{3} 20 mM, ditiotreitol 10 mM, NaCl 100 mM, pH 10 a
37ºC. El pH de la solución se disminuye a 8 con
Tris-HCl y se incuba con tripsina. La solución de
toxinas se dializa contra Tris-HCl 20 mM, NaCl 100
mM, pH 9. Subsiguientemente, el fragmento tóxico se purifica en una
columna Mono Q5/5 conectada a un sistema de cromatografía líquida de
proteínas rápidas (FPLC) (Pharmacia LKB Biotechnology). Las
proteínas se separan por varias electroforesis en gel de
dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida al 7,5%.
Cristales aislados de CryIC, CryIE y de las
proteínas híbridas purificados se solubilizan a pH alto y se incuban
con tripsina. Al igual que CryIC y CryIE, todas las toxinas
híbridas solubles con cruzamientos en el dominio III se convierten
en fragmentos estables de 65 kDa. Los fragmentos de 65 kDa pueden
purificarse utilizando cromatografía de intercambio aniónico en
condiciones similares a las proteínas progenitoras. Los híbridos
F59 y F71 que tienen cruzamientos en el dominio II, son degradados
completamente por la tripsina. Aparentemente, aunque estos híbridos
no precipitan como agregados insolubles, los sitios de escisión con
tripsina ocultos en las proteínas progenitoras pueden llegar a
quedar expuestos a la tripsina. Debido a este fenómeno, no se aísla
fragmento alguno de 65 kDa a partir de F59 y F71.
La Tabla 1 muestra la constitución de 5 toxinas
híbridas CryIE-CryIC: (G27; H8; H17; H7 y H21) y 4
toxinas híbridas CryIC-CryIE (F59; F71; F26; E7)
con referencia a las proteínas CryIC y CryIE de las cuales se
derivan aquéllas. Las secuencias de aminoácidos de las toxinas
CryIE-CryIC que comprenden los fragmentos tóxicos de
la presente invención se extienden hasta el amino-ácido 1189 de la
proteína progenitora CryIC. La secuencia de aminoácidos de las
toxinas híbridas CryIC-CryIE se extienden hasta el
aminoácido 1171 de la proteína progenitora CryIE. La Tabla 1
muestra también la eficacia insecticida relativa de estas diversas
toxinas híbridas con respecto a las proteínas CryIC y CryIE.
\vskip1.000000\baselineskip
| TOX. | a.a. IE | a.a. IC | M. sexta | S. exigua | M. brassicae |
| IC | 0 | 28-627 | ++ | ++ | ++ |
| IE | 29-612 | 0 | ++ | - | - |
| G27 | 1-474 | 478-627 | ++ | ++(+) | +(+) |
| H8 | 1-497 | 501-627 | ++ | - | - |
| H17 | 1-529 | 533-627 | ++ | - | - |
| H7 | 1-577 | 588-627 | - | - | - |
| H21 | 1-605 | 621-627 | |||
| F59 | 421-612 | 1-423 | - | - | - |
| F71 | 428-612 | 1-430 | - | - | - |
| F26 | 455-612 (1171) | 1-458 | ++ | - | - |
| E7 | 588-612 (1171) | 1-602 | ++ | ++ | ++ |
| \begin{minipage}[t]{158mm} Tabla 1. Constitución y toxicidad de las toxinas híbridas con respecto a las proteínas progenitoras. La mayoría de los bioensayos se realizaron con fragmentos de toxinas purificados. En el caso de cryIC, éstos se extendían desde aproximadamente el aa 28 a aproximadamente el aa 627, y en el caso de cryIE hasta 612. La longitud de las protoxinas completas se indica entre paréntesis.\end{minipage} | |||||
Se concentran cultivos bacterianos hasta
DO_{660} 6,0 y se aplican por puntos 100 \mul sobre 2 cm^{2}
de dieta artificial en una placa de cultivo de tejidos de 24
pocillos. Alternativamente, se aplican a la dieta muestras diluidas
de toxinas purificadas. Se alimentan con esta dieta larvas de la
segunda etapa entre mudas de S. exigua, M. brassicae
o M. sexta (16 por dilución de muestra) durante 5 días,
después de lo cual se registra el peso de las larvas. El crecimiento
relativo (CE50, la concentración que da 50% de reducción de peso) se
determina por cálculo de la relación entre el peso medio de las
larvas desarrolladas sobre dieta complementada con toxina y el peso
medio de larvas de control desarrolladas sobre una dieta sin toxina.
Las capas de huevos de M. sexta son suministradas por
Carolina Biological Supply Company, North Carolina, Estados
Unidos.
Los fragmentos tóxicos codificados por los
productos génicos híbridos se ensayan respecto a actividad frente a
tres especies de insectos diferentes como se ha descrito arriba.
M. sexta es sensible tanto a CryIC como a CryIE. Como puede
anticiparse por su sensibilidad a la tripsina, los híbridos F59 y
F71 no son activos contra este insecto (Tabla 1). Aunque H7 es
convertida por la tripsina en proteínas estables de 65 kDa, no es
tóxica para M. sexta. La totalidad de los restantes híbridos
dados en la Tabla 1 son tóxicos y se encuentran aparentemente en la
conformación nativa, biológicamente activa.
El fragmento de 65 kDa de CryIC es altamente
tóxico frente a S. exigua y M. brassicae, mientras que
CryIE no lo es. G27 (Tabla 1; Fig. 2), un híbrido
CryIE-CryIC con un cruzamiento en la unión de los
dominios II y III es activo frente a ambos insectos. Esto demuestra
que el dominio III de CryIC confiere actividad plena frente a S.
exigua y M. brassicae. El híbrido H8, que difiere solo en
3 residuos de aminoácidos (véase Fig. 3) de G27, aunque es activo
contra M. sexta, no es activo contra S. exigua y M.
brassicae.
F26 (Tabla 1, Figura 3), el híbrido recíproco de
G27, en el cual el dominio III de CryIC se ha intercambiado por el
dominio III de CryIE, no es activo contra S. exigua y M.
brassicae. Aparentemente, aunque la proteína es tóxica para
M. sexta, las secuencias de CryIC que se extienden desde el
aminoácido 28 al 462 no son suficientes para destruir S.
exigua y M. brassicae. Únicamente cuando están presentes
secuencias CryIC hasta el residuo de aminoácido 602 en el híbrido
(E7), se restablece la actividad insecticida contra estos
insectos.
La presente descripción indica que los residuos
de aminoácidos desde 478 a 602 de CryIC pueden conferir actividad
insecticida elevada a CryIE contra S. exigua y M.
brassicae.
La biotinilación se realiza utilizando éster de
biotina-N-hidroxisuccinimida
esencialmente como se describe por el fabricante (Amersham). Se
incuba 1 mg de proteína cristalina con 40 \mul de reactivo de
biotinilación en NaHCO_{3} 50 mM, NaCl 150 mM de pH 8, durante 1
hora a 20ºC. La solución se carga en una columna de Sephadex 25
equilibrada con el mismo tampón que contiene BSA al 0,1% para
separar la biotina no combinada, y se aplican por puntos muestras
de las fracciones sobre una membrana de nitrocelulosa. Las
fracciones que contienen proteínas cristalinas biotiniladas se
visualizan utilizando conjugado
estreptavidina-peroxidasa (Amersham) que cataliza
la oxidación del luminol, dando como resultado quimioluminiscencia
(ECL, Amersham) y se agrupan.
Las vesículas de membrana límite pinceladas se
aíslan como se describe por Wolfersberger et al. (1987)
(Comp. Biochem. Physiol. 86a, pp 301-308) excepto
que las vesículas se lavan una vez más con tampón de aislamiento
que contiene 0,1% de Tween 20. La fijación de las proteínas
cristalinas biotiniladas a vesículas de membrana límite pinceladas
(100 \mug/ml) se realiza en 100 \mul de PBS que contiene 1% de
BSA, 0,1% de Tween-20 (pH 7,6). Las vesículas (20
\mug de proteína de vesículas) se incuban con 10 ng de proteínas
cristalinas biotiniladas en presencia o ausencia de un exceso de
1000 veces de proteínas cristalinas sin marcar durante 1 hora a
20ºC. Subsiguientemente, las vesículas se aíslan de nuevo por
centrifugación durante 10 minutos a 14.000 g en una centrífuga
Eppendorf, se lavan dos veces con tampón de fijación, se resuspenden
en tampón de muestra, se desnaturalizan por calentamiento y se
cargan sobre geles de poliacrilamida a 7,5%. Después de la
electroforesis, las proteínas se transfieren a membranas de
nitrocelulosa y las proteínas cristalinas biotiniladas que se aíslan
de nuevo con las vesículas se visualizan por incubación de la
nitrocelulosa con conjugado
estreptavidina-peroxidasa (Amersham) que cataliza
la oxidación del luminol, dando como resultado quimiolumiscencia
(ECL, Amersham).
Dado que la fijación a las células epiteliales
del intestino es un paso fundamental en el modo de acción de las
proteínas cristalinas, se investiga la fijación de las proteínas
cristalinas a las vesículas de la membrana límite pinceladas a
S. exigua en experimentos de competición heteróloga. Los
experimentos de competición demuestran que la fijación de CryIC
marcada (Figura 4A; pista a) y F26 marcada (no representada) puede
verse superada por un exceso de CryIC (pista b) o F26 (pista e) sin
marcar, pero no con un exceso de G27 (pista c) o CryIE (pista d).
Adicionalmente, la fijación de G27 marcada (Figura 4B, pista a) y
CryIE marcada (no representada) puede verse contrarrestada por un
exceso de G27 (pista b) o CryIE (pista d), pero no con un exceso de
CryIC (pista a) o F26 (pista e). A partir de estos resultados se
llega la conclusión de que G27 y CryIE reconocen los mismos sitios
de fijación en las membranas del intestino medio de S. exigua
y que estos sitios difieren de los que son reconocidos por CryIC y
F26. Los ensayos de toxicidad y fijación combinados demuestran que
G27 es tan tóxica como CryIC, pero que se fija a un receptor
diferente de ella. Dado que los insectos pueden desarrollar
resistencia contra una proteína cristalina por cambio de las
características de fijación de receptores, G27 puede utilizarse en
programas de tratamiento de resistencias como alternativa a
CryIC.
El gen de la toxina híbrida cryIE/cryIC G27 se
expresa en E. coli y el producto del gen exhibe al menos la
misma actividad insecticida (al menos contra Spodoptera) que
CryIC. Además, dicho producto exhibe una actividad incrementada de
este tipo cuando se expresa en una cepa de Bacillus
thuringiensis (véase más adelante). El gen que codifica la
toxina híbrida G27 se introduce en un sistema de vector lanzadera
adecuado, el cual se introduce luego en un hospedador B.t.
apropiado. Tales células transformadas se cultivan luego y la toxina
resultante procedente tanto de los cultivos enteros como de
cristales purificados se ensaya respecto a actividad
insecticida.
El gen que codifica G27 híbrida (3,4 kpb) se
escinde de un plásmido de expresión pKK233 de E. coli
utilizando NcoI y XhoI. El sitio XhoI se
rellena utilizando el fragmento Klenow de la
DNA-polimerasa I de E. coli. El fragmento
resultante se liga a pSB635 digerido con NcoI/SmaI
(pBluescriptKS+, P_{criIC}, y el terminador de la transcripción
CryIA(c). El plásmido resultante pSB453, se digiere con
ApaI y NotI produciendo un fragmento de 4,2 kpb
portador del promotor, el orf híbrido de G27 y el terminador. Este
fragmento se liga a pSB634 digerido con ApaI/NotI
(vector lanzadera que contiene pBC16.1 y pBluescript KS+),
obteniéndose pSB456 (véase la Figura 5). El DNA plasmídico, aislado
de E. coli DH10B, se utiliza para transformar la cepa de Bt
de la toxina cristalina menos, Bt51. Los aislados positivos son
resistentes a la tetraciclina, exhiben la presencia de pSB456, y
contienen grandes inclusiones correspondientes a una proteína de 135
kDa (como se determina por SDS-PAGE). Se preparan
muestras de la toxina híbrida G27 a partir de cultivos de B.t.51
transformados desarrollados por esporulación a 30ºC en medio
CYS-Tc^{10}. Se realizan bioensayos insecticidas
(Tabla 2) tanto sobre cultivos totalmente enteros como sobre
preparaciones de proteínas cristalinas lavadas. Los controles
incluyen Bt51 (pSB440), que contiene la toxina CryIC, y Bt51
(pSB636) que contiene CryIE. Las concentraciones de toxinas se
estiman por SDS-PAGE.
El número de muestras se da entre paréntesis. La
toxina híbrida G27 es aproximadamente 50% más eficaz que cualquiera
de CryIE o CryIC con respecto a toxicidad, al menos frente a
Spodoptera sp.
| Toxina | CL_{50} | ||||
| Cultivo entero (ppt) | Proteína cristalina lavada (ppm) | ||||
| CryIC | 56(2) | 36(2) | 40(4) | 7,8(2) | 8,1(4) |
| CryIE | 79(1) | 78(1) | 33(4) | 11,1(6) | 7,5(4) |
| G27 | 29(2) | 21(2) | 25(4) | 4,7(4) | 6,0(4) |
| Relación | 1,93 | 1,71 | 1,60 | 1,66 | 1,35 |
| (IC/G27) |
Aunque la presente invención se ha descrito
particularmente con referencia a la producción de la toxina híbrida
G27, los expertos apreciarán que pueden producirse muchas otras
toxinas híbridas que tienen características insecticidas mejoradas
de acuerdo con la presente exposición. Las SEQ ID Núms. 7 y 8, por
ejemplo, representan toxinas híbridas adicionales de acuerdo con la
invención, que tienen actividad insecticida mejorada. Pueden
producirse toxinas híbridas que comprenden el dominio III de CryIC y
un terminal N de cualquier otra proteína Cry. En términos de
bioensayos, los transformantes que llevan la toxina híbrida pueden
cultivarse en medio SOP a fin de facilitar los procedimientos de
ensayo y reducir los volúmenes de material requeridos. Además, el
gen que codifica G27 y/o otras toxinas híbridas de acuerdo con la
invención puede transferirse a cepas de B.t. codificantes de
toxinas y/o integrarse en el cromosoma de cepas seleccionadas de
B.t. o introducirse de hecho en los genomas de las plantas para
proporcionar la actividad insecticida in situ dentro de la
planta per se. A este respecto, se prefiere particularmente
el DNA recombinante que codifica las toxinas se modifique en el
sentido de que los codones que son preferidos por la planta en la
que se debe insertarse el DNA recombinante se utilicen a fin de que
la expresión del DNA así modificado en dicha planta produzca una
proteína sustancialmente similar a la obtenida por la expresión del
DNA recombinante no modificado en el organismo en el que son
endógenos los componentes proteínicos de la toxina o fragmentos de
la toxina híbrida.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Sandoz Ltd.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Lichtstrasse 35
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Basilea
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: BS
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Suiza
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: (ZIP): CH-4002
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 061-324-1111
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 061-322-7532
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Sandoz Patent GMBH
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Humboltstrasse 3
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Lorrach
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Alemania
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: (ZIP): D-7850
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Sandoz Erfindungen Verwaltungsgesellschaft MBH.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Brunnerstrasse 35
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Viena
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Austria
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: (ZIP): A-1230
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TITULO DE LA INVENCIÓN: toxina Híbrida
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 8
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Soporte Lógico: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3567 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Bacillus thuringiensis
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..3567
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1189 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3513 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Bacillus thuringiensis
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..3513
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1171 Aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3558 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Secuencia híbrida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..3558
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1186 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3579 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: toxina híbrida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..3579
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1193 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
Claims (20)
1. Una toxina híbrida insecticida de Bacillus
thuringiensis (Bt) que comprende en su terminal C, el dominio
III de una proteína CryIC o una parte funcionalmente equivalente del
mismo y en su terminal N, los dominios I y II de una segunda
proteína CryI seleccionada del grupo constituido por CryIA, CryIB,
CryID, CryIE, CryIF, CryIG, CryIH, en donde dicho dominio III de
CryIC o parte del mismo confiere a la toxina híbrida actividad
plena frente a S. exigua y M. brassicae.
2. Una toxina híbrida de Bt de acuerdo con la
reivindicación 1, en donde dicha segunda proteína CryI es CryIA.
3. Una toxina híbrida de Bt de acuerdo con la
reivindicación 1, en donde dicha segunda proteína CryI es CryIE.
4. Una toxina híbrida de Bt de acuerdo con la
reivindicación 1, en donde dicha segunda proteína CryI es CryIG.
5. Una toxina híbrida de Bt de acuerdo con la
reivindicación 1, en donde dicho terminal C comprende la secuencia
desde la posición del aminoácido 454 a la posición 602 de SEQ ID NO:
2.
6. Una toxina híbrida de Bt de acuerdo con la
reivindicación 1, en donde dicho terminal C comprende la secuencia
desde la posición del aminoácido 478 a la posición 602 de SEQ ID NO:
2.
7. Una toxina híbrida de Bt de acuerdo con la
reivindicación 1, que comprende una secuencia seleccionada del
grupo constituido por:
- a)
- los aminoácidos 1-620 de SEQ ID NO: 6; y
- b)
- los aminoácidos 1-620 de SEQ ID NO: 6, en donde está presente al menos una de las sustituciones siguientes:
- Ile en la posición 609 está reemplazado con Leu,
- Ala en la posición 618 está reemplazado con Glu,
- Ser en la posición 620 está reemplazado con Tyr.
8. Una toxina híbrida de Bt de acuerdo con la
reivindicación 1, que comprende una secuencia seleccionada del
grupo constituido por:
- a)
- los aminoácidos 1-627 de SEQ ID NO: 8; y
- b)
- los aminoácidos 1-627 de SEQ ID NO: 8, en donde está presente al menos una de las sustituciones siguientes:
- Ile en la posición 617 está reemplazado con Leu,
- Ala en la posición 625 está reemplazado con Glu,
- Ser en la posición 627 está reemplazado con Tyr.
9. Una toxina híbrida de Bt de acuerdo con la
reivindicación 1, que comprende los aminoácidos
1-602 de SEQ ID NO: 2.
10. Una toxina híbrida de Bt de acuerdo con la
reivindicación 1, en donde dicha toxina híbrida se fija a un sitio
de fijación en el intestino de un insecto que es diferente del sitio
al que se fija dicha proteína CryIC.
11. Un polipéptido que comprende la toxina
híbrida de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
12. Una composición insecticida que comprende la
toxina híbrida en una cualquiera de las reivindicaciones 1
a 10.
a 10.
13. Un proceso para combatir insectos, que
comprende exponer los insectos a la toxina híbrida de una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 10.
14. Un proceso para combatir insectos, que
comprende exponer los insectos al polipéptido de la reivindicación
11.
15. Un proceso para combatir insectos, que
comprende exponer los insectos a la composición insecticida de la
reivindicación 12.
16. Una planta que incluye, y permite la
expresión de, DNA que codifica una proteína que tiene una secuencia
de aminoácidos de una toxina híbrida de Bt de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1-10.
17. Una planta de acuerdo con la reivindicación
anterior en donde dicho DNA codifica adicionalmente una proteína
que tiene propiedades de resistencia a los herbicidas, promotoras
del crecimiento de la planta, anti-fúngicas,
anti-bacterianas, anti-víricas y/o
anti-nematodos.
18. Una planta de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 16 ó 17, en donde dicho DNA está modificado en el
sentido de que motivos de inestabilidad o señales de poliadenilación
de mRNA conocidos(as) están eliminados y/o se utilizan los
que son preferidos por la planta en la cual debe insertarse el DNA
recombinante de tal modo que la expresión del DNA así modificado en
dicha planta produce una proteína sustancialmente similar a la
obtenida por expresión del DNA recombinante no modificado en el
organismo en el que son endógenos los componentes proteínicos de la
toxina híbrida o fragmentos de la toxina.
19. Una planta de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 16 a 18, cuya progenie contiene dicho DNA
incorporado de manera estable y heredable de una manera
mendeliana.
20. Semillas de una planta de acuerdo con la
reivindicación 19 que comprenden todavía dicho DNA.
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