DE69733146T2

DE69733146T2 - Rekombinante toxinfragmente

Info

Publication number: DE69733146T2
Application number: DE69733146T
Authority: DE
Inventors: Charles Clifford Porton Down SHONE; Padraig Conrad Porton Down QUINN; Alan Keith Porton Down FOSTER
Original assignee: Health Protection Agency; Ipsen Ltd
Current assignee: Health Protection Agency; Syntaxin Ltd
Priority date: 1996-08-23
Filing date: 1997-08-22
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2017-08-23
Also published as: CA2264191C; US20070184070A1; US20020044950A1; US20050244435A1; GB9617671D0; GB9625996D0; US7897158B2; JP4273250B2; CA2264191A1; EP0939818A1; DK0939818T3; US8017134B2; US20070248626A1; AU4389597A; US20090148888A1; AU723397B2; WO1998007864A1; EP0939818B1; JP2001502890A; US20090246827A1

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf rekombinante Toxinfragmente, auf DNS, die diese Fragmente kodiert, und auf ihre Verwendungen, wie in einem Vakzin, und für In-vitro und In-vivo-Zwecke.
Die Clostridienneurotoxine sind potente Inhibitoren calciumabhängiger Neurotransmittersekretion in neuronalen Zellen. Es wird gegenwärtig angenommen, dass sie ihre Aktivität durch eine spezifische endoproteolytische Abspaltung von wenigstens einem von drei vesikel- oder mit der präsynaptischen Membran assoziierten Proteinen VAMP, Syntaxin oder SNAP-25, die für Vesikel-Andock- und -Membranfusionsereignisse der Neurotransmittersekretion zentral sind, vermitteln. Von dem neuronalen Zelltargeting von Tetanus- und Botulinumneurotoxinen wird angenommen, dass sie ein rezeptorvermitteltes Ereignis sind, nach welchem die Toxine verinnerlicht werden und nachfolgend zu dem passenden intrazellulären Kompartiment reisen, wo sie ihre Endopeptidaseaktivität ausüben. Inhibition des calciumunabhängigen [³H]-Noradrenalinausflusses aus gefroren und aufgetauten Synaptosomen wurde ebenfalls berichtet (A. Hausinger et al., 1995, Toxicon, Band 33, Nr. 11, S. 1519–1530).
Die Clostridienneurotoxine teilen eine gemeinsame Architektur einer katalytischen L-Kette (LC, ca. 50 kDa), die mit einer Rezeptorbindungs- und Translokations-H-Kette (HC, ca. 100 kDa) über Disulfid gekoppelt ist. Von dem HC-Polypeptid wird angenommen, dass es Alles oder einen Teil von zwei verschiedenen funktionellen Domänen umfasst. Die carboxyterminale Hälfte von HC (ca. 50 kDa), bezeichnet als die H_C-Domäne, ist in die hochaffine, neurospezifische Bindung des Neurotoxins an Zelloberflächenrezeptoren in dem Zielneuron verwickelt, während von der aminoterminalen Hälfte, bezeichnet als die H_N-Domäne (ca. 50 kDa), angenommen wird, dass sie die Translokation von wenigstens einem gewissen Teil des Neurotoxins über Zellmembranen hinweg vermittelt, so dass die funktionelle Aktivität der LC innerhalb der Zielzelle exprimiert wird. Die H_N-Domäne hat auch die Eigenschaft, unter Bedingungen eines niedrigen pH-Werts ionenpermeable Kanäle in Lipidmembranen zu bilden, dies kann in einer gewissen Weise eine Beziehung haben zu ihrer Translokationsfunktion.
Für das Botulinumneurotoxin vom Typ A (BoNT/A) wird von diesen Domänen angenommen, dass sie sich innerhalb der Aminosäurereste 872–1296 für die H_C, der Aminosäurereste von 449–871 für die H_N und der Reste 1–448 für die LC befinden. Verdauung mit Trypsin baut wirksam die H_C-Domäne des BoNT/A ab, um ein nichttoxisches Fragment zu erzeugen, das bezeichnet wird als LH_N, das nicht länger in der Lage ist, an Neuronen zu binden und in sie einzudringen (1). Das so produzierte LH_N-Fragment hat auch die Eigenschaft einer verbesserten Löslichkeit im Vergleich mit sowohl dem elterlichen Holotoxin als auch der isolierten LC.
Es ist deshalb möglich, funktionelle Definitionen der Domänen in dem Neurotoxin wie folgt bereitzustellen:

(A) Leichte Kette des Clostridienneurotoxins:
– Eine Metallprotease, die eine hohe Substratspezifität für vesikel- und/oder plasma-membran-assoziierte Proteine zeigt, die in den Exocytoseprozess verwickelt sind. Besonders spaltet es eines oder mehrere von SNAP-25, VAMP (Synaptobrevin/Cellubrevin) und Syntaxin ab. Von einer einzelnen Mutation (Glu²³⁴ → Ala²³⁴) in der leichten Kette von Tetanustoxin wurde gezeigt, dass es die proteolytische Aktivität aushebt (Y. Li et al., Biochemistry, 1994, 33, S. 7014–7020).
(B) H_N-Domäne der schweren Kette von Clostridienneurotoxin:
– Ein Teil der schweren Kette, der die Translokation jenes Teils des Neurotoxinmoleküls ermöglicht, so dass eine funktionelle Expression der Aktivität der leichten Kette innerhalb einer Zielzelle geschieht.
– Die Domäne, die verantwortlich ist für die Translokation der Endopeptidaseaktivität in die Zielzelle, die auf das Binden des Neurotoxins an seinen spezifischen Zelloberflächenrezeptor über die Bindungsdomäne folgt.
– Die Domäne, die verantwortlich ist für die Bildung von ionenpermeablen Poren in Lipidmembranen unter Bedingungen eines niedrigen pH-Wertes.
– Die Domäne, die verantwortlich ist für die Erhöhung der Löslichkeit des gesamten Polypeptids im Vergleich mit der Löslichkeit der leichten Kette alleine.
(C) H_C-Domäne der schweren Kette von Clostridienneurotoxin:
– Ein Teil der schweren Kette, der verantwortlich ist für die Bindung des natürlichen Holotoxins an Zelloberflächenrezeptor(en), verwickelt in die Vergiftungswirkung von Clostridientoxin vor der Verinnerlichung des Toxins in die Zelle.

Die Identität der zellulären Erkennungsmarker für diese Toxine wird gegenwärtig noch nicht verstanden und es wurden bis jetzt noch keine spezifischen Rezeptorarten identifiziert, obwohl Kozaki et al. berichtet hatten, dass Synaptotagmin der Rezeptor für das Botulinumneurotoxin vom Typ B sein könnte. Es ist wahrscheinlich, dass jedes der Neurotoxine einen unterschiedlichen Rezeptor hat.
Es ist wünschenswert, Positivkontrollen für Toxintests zu haben, um Clostridientoxinvakzine zu entwickeln und um therapeutische Mittel zu entwickeln, die wünschenswerte Eigenschaften von Clostridientoxin einbauen.
Zum Beispiel beschreibt die WO 96/12802 Vakzinzusammensetzungen, die die H_C-Region von C. botulinum umfassen.
Wegen seiner extremen Toxizität ist die Handhabung des natürlichen Toxins jedoch schädlich.
Die vorliegende Erfindung versucht, Probleme, die mit der Produktion und der Handhabung von Clostridientoxin in Verbindung stehen, zu überwinden oder wenigstens abzuschwächen.
Demgemäß stellt die Erfindung ein Polypeptid bereit, wie definiert in Anspruch 1.
Die Erfindung kann folglich eine einzelne Polypeptidkette bereitstellen, die eine Domäne enthält, die äquivalent ist mit einer leichten Kette von Clostridientoxin, und die eine zweite Domäne enthält, die die funktionellen Aspekte der H_N einer schweren Kette eines Clostridientoxins bereitstellt, während die funktionellen Aspekte der H_C-Domäne eines Clostridientoxins fehlen.
Für die Zwecke der Erfindung ist/sind die funktionelle(n) Eigenschaft oder Eigenschaften der H_N einer schweren Kette von Clostridientoxin, die durch die zweite Domäne des Polypeptids der Erfindung ausgeübt werden soll(en), entweder (i) die Translokation des Polypeptids in eine Zelle oder (ii) die Erhöhung der Löslichkeit des Polypeptids im Vergleich mit der Löslichkeit der ersten Domäne selber oder (iii) sowohl (i) als auch (ii). Bezugnahmen hiernach auf eine H_N-Domäne oder auf die Funktionen einer H_N-Domäne sind Bezugnahmen auf diese Eigenschaft oder Eigenschaften. Die zweite Domäne ist nicht erforderlich, um andere Eigenschaften der H_N-Domäne einer schweren Kette von Clostridientoxin zu zeigen.
Ein Polypeptid der Erfindung kann folglich löslich sein, es kann ihm aber die Translokationsfunktion eines nativen Toxins fehlen – dies ist von Nutzen bei der Bereitstellung eines Immunogens für das Impfen oder für die Unterstützung bei der Impfung eines Individuums gegen eine Provokation durch Toxin. In einer spezifischen Ausführung der Erfindung, beschrieben in einem Beispiel unten, löste ein Polypeptid, bezeichnet als LH₄₂₃/A, neutralisierende Antikörper gegen Typ-A-Neurotoxin aus. Ein Polypeptid der Erfindung kann folglich ebenso vergleichsweise unlöslich sein, jedoch die Translokationsfunktion eines natürlichen Toxins bewahren – dies ist von Nutzen, falls die Löslichkeit einer Zusammensetzung, die aus jenem Polypeptid und einem oder mehreren anderen Bestandteilen gemacht worden ist, durch einen oder mehrere dieser anderen Bestandteile verliehen wird.
Die erste Domäne des Polypeptids der Erfindung spaltet eines oder mehrere vesikel- oder plasma-membran-assoziierte Proteine ab, die für den spezifischen zellulären Vorgang der Exocytose essenziell sind, und Spaltung dieser Proteine resultiert in der Inhibition von Exocytose, typischerweise in einer nichtcytotoxischen Weise. Die beeinflusste(n) Zelle oder Zellen sind nicht beschränkt auf einen bestimmten Typ oder eine Untergruppe, aber können sowohl neuronale als auch nicht neuronale Zellen einschließen. Die Aktivität von Clostridienneurotoxinen bei der Inhibition von Exocytose wurde in der Tat annähernd universell in eukaryotischen Zellen, die einen relevanten Zelloberflächenrezeptor exprimieren, beobachtet, einschließlich solch verschiedener Zellen, wie die von Aplysia (Seeschnecke), Drosophila (Fruchtfliege) und Säugernervenzellen, und die Aktivität der ersten Domäne soll so verstanden werden, dass sie einen entsprechenden Bereich an Zellen einschließt.
Das Polypeptid der Erfindung kann durch Expression einer rekombinanten Nucleinsäure, bevorzugt einer DNS, gewonnen werden und ist ein einzelnes Polypeptid, das soll heißen, ist nicht gespalten in gesonderte Domänen der leichten und schweren Ketten. Das Polypeptid ist folglich in bequemen und großen Mengen unter Verwendung von rekombinanten Techniken erhältlich.
In einem Polypeptid gemäß der Erfindung umfasst diese erste Domäne bevorzugt eine leichte Kette von Clostridientoxin oder ein Fragment oder eine Variante einer leichten Kette von Clostridientoxin. Das Fragment ist wahlweise ein N-terminales oder C-terminales Fragment der leichten Kette oder ist ein inneres Fragment, solange es im Wesentlichen die Fähigkeit bewahrt, das vesikel- oder plasma-membran-assoziierte Protein, das wesentlich ist für die Exocytose, abzuspalten. Die Minimaldomänen, die notwendig sind für die Aktivität der leichten Kette von Clostridientoxinen, sind beschrieben in J. Biochem., Band 267, Nr. 21, Juli 1992, S. 14721–14729. Die Variante hat eine von der leichten Kette oder von dem Fragment verschiedene Polypeptidsequenz, obwohl sie auch in der Lage ist, das vesikel- oder plasma-membran-assoziierte Protein zu spalten. Sie wird gewöhnlich gewonnen durch Insertion, Deletion und/oder Substitution einer leichten Kette oder eines Fragmentes davon. In unten beschriebenen Ausführungsbeispielen der Erfindung umfasst eine Variantensequenz (i) eine N-terminale Verlängerung einer leichten Kette von Clostridientoxin oder eines Fragmentes davon, (ii) eine leichte Kette von Clostridientoxin oder ein Fragment davon, modifiziert durch Änderung von wenigstens einer Aminosäure, (iii) eine C-terminale Verlängerung einer leichten Kette von Clostridientoxin oder eines Fragmentes davon, oder (iv) Kombinationen von zwei oder mehr von (i) bis (iii).
In weiteren Ausführungen der Erfindung enthält die Variante eine Aminosäuresequenz, die so modifiziert ist, dass (a) es keine proteasesensitive Region zwischen den LC- und H_N-Bestandteilen des Polypeptids gibt, oder (b) dass die proteasesensitive Region spezifisch für eine bestimmte Protease ist. Diese letzte Ausführung ist von Nutzen, falls gewünscht wird, die Endopeptidaseaktivität der leichten Kette in einer besonderen Umgebung oder Zelle zu aktivieren. Jedoch werden die Polypeptide der Erfindung im Allgemeinen vor der Verabreichung aktiviert.
Die erste Domäne übt bevorzugt die Endopeptidaseaktivität spezifisch für ein Substrat aus, das ausgewählt ist aus einem oder mehreren von SNAP-25, Synaptobrevin/VAMP und Syntaxin. Das Clostridientoxin ist bevorzugt Botulinumtoxin oder Tetanustoxin.
In einem Ausführungsbeispiel der Erfindung, beschrieben in einem Beispiel unten, stammen die leichte Toxinkette und der Teil der schweren Toxinkette von Botulinumtoxin Typ A. In einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung, beschrieben in einem Beispiel unten, stammen die leichte Toxinkette und der Teil der schweren Toxinkette von Botulinumtoxin Typ B. Das Polypeptid umfasst wahlweise eine leichte Kette oder ein Fragment oder eine Variante von einem Toxintyp und eine schwere Kette oder ein Fragment oder eine Variante eines anderen Toxintyps.
In einem Polypeptid gemäß der Erfindung umfasst diese zweite Domäne bevorzugt einen H_N-Teil der schweren Kette von Clostridientoxin oder ein Fragment oder eine Variante eines H_N-Teils einer schweren Kette von Clostridientoxin. Das Fragment ist wahlweise ein N-terminales oder C-terminales oder inneres Fragment, solange es die Funktion der H_N-Domäne bewahrt. Lehren von Regionen innerhalb des H_N-Teils, die verantwortlich für seine Funktion sind, sind z. B. bereitgestellt in Biochemistry, 1995, 34, S. 15175–15181, und Eur. J. Biochem., 1989, 185, S. 197–203. Die Variante hat eine von der H_N-Domäne oder dem Fragment verschiedene Sequenz, obwohl sie ebenfalls die Funktion der H_N-Domäne bewahrt. Sie wird gewöhnlich gewonnen durch Insertion, Deletion und/oder Substitution einer H_N-Domäne oder eines Fragmentes davon. In unten beschriebenen Ausführungsbeispielen der Erfindung umfasst sie (i) eine N-terminale Verlängerung einer H_N-Domäne oder eines Fragmentes, (ii) eine C-terminale Verlängerung einer H_N-Domäne oder eines Fragmentes, (iii) eine Modifikation einer H_N-Domäne oder eines Fragmentes durch Änderung von wenigstens einer Aminosäure oder (iv) Kombinationen von zwei oder mehr von (i) bis (iii). Das Clostridientoxin ist bevorzugt Botulinumtoxin oder Tetanustoxin.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Polypeptid bereit, umfassend eine leichte Kette von Clostridienneurotoxin und ein N-terminales Fragment einer schweren Kette von Clostridienneurotoxin, wobei das Fragment bevorzugt wenigstens 423 der N-terminalen Aminosäuren der schweren Kette von Botulinumtoxin Typ A, 417 der N-terminalen Aminosäuren der schweren Kette von Botulinumtoxin Typ B oder die äquivalente Anzahl an N-terminalen Aminosäuren der schweren Kette von anderen Typen von Clostridientoxin umfasst, so dass das Fragment eine äquivalente Anordnung homologer Aminosäurereste besitzt.
Diese Polypeptide der Erindung sind folglich nicht zusammengesetzt aus zwei oder mehr Polypeptiden, die z. B. durch Disulfidbrücken in Kompositmolekülen verknüpft sind. Stattdessen sind diese Peptide Einzelketten und sind nicht aktiv oder ihre Aktivität ist signifikant reduziert in einem In-vitro-Test der Neurotoxinendopeptidaseaktiviät.
Weiter können die Polypeptide empfänglich sein dafür, dass sie durch die Wirkung eines proteolytischen Agens, wie Trypsin, in eine Form umgewandelt werden, die Endopeptidaseaktivität zeigt. Auf diesem Wege ist es möglich, die Endopeptidaseaktivität der leichten Toxinkette zu kontrollieren.
In einem spezifischen Ausführungsbeispiel der Erfindung, beschrieben in einem Beispiel unten, wird ein Polypeptid bereitgestellt, dem ein als H_C bezeichneter Teil einer schweren Kette von Clostridientoxin fehlt. Dieser Teil, der in dem natürlich produzierten Toxin zu sehen ist, ist verantwortlich für das Binden des Toxins an Zelloberflächenrezeptoren vor der Verinnerlichung des Toxins. Diese spezifische Ausführung ist deshalb so angepasst, dass sie nicht in aktives Toxin umgewandelt werden kann, z. B. durch die Wirkung eines proteolytischen Enzyms. Die Erfindung stellt folglich ebenfalls ein Polypeptid bereit, das eine leichte Kette von Clostridientoxin und ein Fragment einer schweren Kette von Clostridientoxin umfasst, wobei dieses Fragment nicht in der Lage ist, an jene Zelloberflächenrezeptoren zu binden, die in die Vergiftungswirkung von Clostridientoxin verwickelt sind, und es wird bevorzugt, dass solch einem Polypeptid ein intakter Teil, der bezeichnet wird als H_C, einer schweren Kette von Clostridientoxin fehlt.
In weiteren Ausführungen der Erfindung werden Zusammensetzungen bereitgestellt, die ein Polypeptid enthalten, umfassend eine leichte Kette von Clostridientoxin und einen als H_N bezeichneten Teil einer schweren Kette von Clostridientoxin, und worin die Zusammensetzung frei von Clostridientoxin und frei von jedem Clostridientoxinvorläufer ist, der in Clostridientoxin durch die Wirkung eines proteolytischen Enzyms umgewandelt werden kann. Beispiele dieser Zusammensetzungen schließen jene ein, die die leichte Toxinkette und H_N-Sequenzen der Botulinumtoxintypen A, B, C₁, D, E, F und G enthalten.
Die Polypeptide der Erfindung werden gewöhnlich angepasst, um an einen Liganden für das Targeting an erwünschte Zellen zu binden oder diesen einzuschließen. Das Polypeptid umfasst wahlweise eine Sequenz, die z. B. an Immunglobulin bindet. Eine geeignete Sequenz ist eine tandemartig wiederholte synthetische IgG-Bindungsdomäne, abgeleitet von der Domäne B des Staphylococcen-Proteins A. Die Auswahl der Immunglobulinspezifität bestimmt dann das Ziel für einen Polypeptid-Immunglobulin-Komplex. Alternativ umfasst das Polypeptid eine Nicht-Clostridiensequenz, die an einen Zelloberflächenrezeptor bindet, wobei geeignete Sequenzen den insulinähnlichen Wachstumsfaktor 1 (IGF-1) einschließen, welcher an seinen spezifischen Rezeptor auf bestimmten Zelltypen bindet, und die 14 Aminosäurereste lange Sequenz aus dem Carboxyterminus der Untereinheit von Choleratoxin, die in der Lage ist, an die Untereinheit B von Choleratoxin zu binden und folglich an GM1-Ganglioside. Ein Polypeptid gemäß der Erfindung umfasst folglich wahlweise eine dritte Domäne, die angepasst ist an das Binden der Polypeptide an eine Zelle.
In einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung ein Fusionsprotein bereit, umfassend eine Fusion aus (a) einem Polypeptid der Erfindung, wie oben beschrieben, mit (b) einem zweiten Polypeptid, das angepasst ist, für das Binden an eine Chromatographiematrix, um die Aufreinigung des Fusionsproteins unter Verwendung dieser Chromatographiematrix zu ermöglichen. Es ist für das zweite Peptid praktisch, so angepasst zu sein, dass es an eine Affinitätsmatrix bindet, wie z. B. Glutathionsepharose, wodurch eine schnelle Auftrennung und Aufreinigung des Fusionsproteins aus einer unreinen Quelle, wie einem Zellextrakt oder -überstand, erlaubt wird.
Ein mögliches zweites Reinigungspolypeptid ist Glutathion-S-Transferase (GST), und andere werden Fachleuten offensichtlich sein, wobei sie so gewählt werden, dass die Aufreinigung auf einer Chromatographiesäule nach gewöhnlichen Techniken ermöglicht wird.
Wie oben bemerkt, ist es durch proteolytische Behandlung eines Polypeptids der Erfindung, z. B. unter Verwendung von Trypsin, möglich, Endopeptidaseaktivität in das behandelte Polypeptid zu induzieren.
Ein dritter Aspekt der Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung umfasst, wobei diese Zusammensetzung in vivo nichttoxisch ist. Die Endopeptidase-Gesamtaktivität der Zusammensetzung wird selbstverständlich durch die Menge des anwesenden Polypeptids bestimmt werden.
Während es bekannt ist, natürlich produziertes Clostridientoxin zu behandeln, um die H_C-Domäne zu entfernen, entfernt diese Behandlung nicht vollständig die Toxizität der Zubereitung, stattdessen verbleibt eine gewisse Toxinrestaktivität. Natürliches, auf diesem Wege behandeltes Toxin ist deshalb immer noch nicht vollständig sicher. Die Zusammensetzung der Erfindung, abgeleitet durch Behandlung einer reinen Polypeptidquelle, ist vorteilhafterweise toxizitätsfrei und kann gewöhnlich als eine Positivkontrolle in einem Toxintest verwendet werden, als ein Vakzin gegen Clostridientoxin oder für andere Zwecke, wo es wesentlich ist, dass es keine Resttoxizität in der Zusammensetzung gibt.
Die Erfindung ermöglicht die Produktion von Polypeptiden und Fusionsproteinen der Erfindung durch rekombinante Mittel.
Ein vierter Aspekt der Erfindung stellt eine Nucleinsäure bereit, die ein Polypeptid oder ein Fusionsprotein gemäß jedem der oben beschriebenen Aspekte der Erfindung kodiert.
In einem Ausführungsbeispiel dieses Aspektes der Erfindung wird eine DNS-Sequenz, die bereitgestellt wird, um für das Polypeptid oder Fusionsprotein zu kodieren, nicht von natürlichen Clostridiensequenzen abgeleitet, sondern ist eine in der Natur zuvor nicht existierende, künstlich abgeleitete Sequenz.
Eine unten detaillierter beschriebene spezifische DNS (SEQ ID Nr. 1) kodiert ein Polypeptid oder ein Fusionsprotein, umfassend Nucleotide, die die Reste 1–178 von Botulinumtoxin Typ A kodieren. Dieses Polypeptid umfasst die Domäne der leichten Kette und die ersten 423 Aminosäurereste des aminoterminalen Teils einer schweren Kette von Botulinumtoxin Typ A. Dieses rekombinante Produkt wird bezeichnet als LH₄₂₃/A, SEQ ID Nr. 2.
In einem zweiten Ausführungsbeispiel dieses Aspektes der Erfindung wird eine DNS-Sequenz, die für das Polypeptid oder Fusionsprotein kodiert, von natürlichen Clostridiensequenzen abgeleitet, kodiert jedoch für ein Polypeptid oder Fusionsprotein, das nicht in der Natur gefunden wird.
Eine unten detaillierter beschriebene spezifische DNS (SEQ ID Nr. 19) kodiert ein Polypeptid oder ein Fusionsprotein und umfasst Nucleotide, die die Reste 1–1171 eines Botulinumtoxins vom Typ B kodieren. Dieses Polypeptid umfasst die Domäne der leichten Kette und die ersten 728 Aminosäurereste des aminoterminalen Proteins einer schweren Kette von Botulinum Typ B. Dieses rekombinante Produkt wird bezeichnet als LH₇₂₈/B (SEQ ID Nr. 20).
Die Erfindung stellt folglich ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptides bereit, umfassend das Exprimieren einer DNS in einer Wirtszelle gemäß dem dritten Aspekt der Erfindung. Die Wirtszelle ist geeigneterweise nicht in der Lage, ein Polypeptid oder Fusionsprotein der Erfindung abzuspalten, um leichte und schwere Toxinketten zu trennen; z. B. ein Nicht-Clostridien-Wirt.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids bereit, umfassend das Exprimieren einer DNS in einer Wirtszelle, die ein wie oben beschriebenen Fusionsprotein kodiert, das Aufreinigen des Fusionsproteins durch Elution durch eine Chromatographiesäule, die dafür angepasst ist, das Fusionsprotein zurückzuhalten, das Eluieren eines Liganden durch diese Chromatographiesäule, der so angepasst ist, dass er das Fusionsprotein verdrängt, und das Wiedergewinnen des Fusionsproteins. Die Produktion von im Wesentlichen reinem Fusionsprotein wird folglich möglich gemacht. Ähnlich wird das Fusionsprotein leicht abgespalten, um ein Polypeptid der Erfindung zu ergeben, wiederum in im Wesentlichen reiner Form, da das zweite Polypeptid gewöhnlich unter Verwendung derselben Art von Chromatographiesäule entfernt werden kann.
Das LH_N/A, das aus dem nativen zweikettigen Toxin abgeleitet wurde, erfordert eine verlängerte Verdauung mit Trypsin, um die C-terminale Hälfte der schweren Kette, die H_C-Domäne, zu entfernen. Der Verlust dieser Domäne macht das Toxin in vivo inaktiv, indem seine Wechselwirkung mit Wirtszielzellen verhindert wird. Es verbleibt jedoch eine toxische Restaktivität, die eine kontaminierende, trypsinunempfindliche Form des gesamten Typ-A-Neurotoxins anzeigen kann.
Im Gegensatz dazu sind die rekombinanten Zubereitungen der Erfindung das Produkt einer gesonderten, definierten, genkodierenden Sequenz und können nicht durch ein Toxinprotein voller Länge kontaminiert werden. Weiterhin ist das Produkt, wie es aus E. coli und aus anderen rekombinanten Expressionswirten wiedergewonnen wird, ein inaktives einzelkettiges Peptid oder, falls der Expressionswirt ein verarbeitetes aktives Polypeptid produziert, ist es nicht ein Toxin. Die Endopeptidaseaktivität von LH₄₂₃/A, wie beurteilt durch den üblichen In-vitro-Peptidspaltungstest, ist vollständig abhängig von der Aktivierung des rekombinanten Moleküls zwischen den Resten 430 und 454 durch Trypsin. Andere proteolytische Enzyme, die zwischen diesen beiden Resten spalten, sind im Allgemeinen ebenfalls für die Aktivierung des rekombinanten Moleküls geeignet. Trypsin spaltet die Peptidbindung C-terminal zu Arginin oder C-terminal zu Lysin und ist geeignet, da diese Reste in dem 430–454-Bereich gefunden werden und ausgesetzt sind (siehe 12).
Die rekombinanten Polypeptide der Erfindung sind mögliche therapeutische Mittel für das Targeting von Zellen, die das relevante Substrat exprimieren, die jedoch nicht in das Bewirken von Botulismus verwickelt sind. Ein Beispiel dafür könnte sein, wo die Sekretion von Neurotransmitter unpassend oder unerwünscht ist, oder alternativ, wo eine neuronale Zelle hyperaktiv hinsichtlich der regulären Sekretion von anderen Substanzen als Neurotransmittern ist. In solch einem Beispiel könnte die Funktion der H_C-Domäne des natürlichen Toxins durch eine alternative Targetingsequenz ersetzt werden, wobei z. B. ein Zellrezeptorligand und/oder eine Translokationsdomäne bereitgestellt wird.
Eine Anwendung der rekombinanten Polypeptide der Erfindung wird als ein Reagensbestandteil für die Synthese therapeutischer Moleküle liegen, wie offenbart in der WO-A-94/21300. Das rekombinante Produkt wird ebenfalls Anwendung als ein nichttoxischer Standard für die Beurteilung und Entwicklung von In-vitro-Tests für die Detektion funktioneller Botulinum- oder Tetanusneurotoxine entweder in Lebensmitteln oder in Umweltproben finden, z. B. wie offenbart in EP-A-0763131.
Eine weitere Option ist die Addition eines Polypeptids der Erfindung an das C-terminale Ende einer Peptidsequenz, die spezifische chemische Konjugation an Targetingliganden sowohl aus Protein- als auch Nicht-Proteinursprung erlaubt.
In noch einer weiteren Ausführung wird ein alternativer Targetingligand zu dem N-Terminus von Polypeptiden der Erfindung hinzugefügt. Es wurden rekombinante LH_N-Derivate gestaltet, die spezifische Proteasespaltungsstellen haben, die an dem C-Terminus von dem LC bei der mutmaßlichen trypsinempfindlichen Region und ebenfalls an dem äußersten C-Terminus des vollständigen Proteinprodukts verändert sind. Diese Stellen werden die aktivierende Spezifizität des rekombinanten Produktes so erhöhen, dass die zweikettige Spezies nur durch die proteolytische Spaltung einer vorhersagbareren Art als durch die Verwendung von Trypsin aktiviert werden kann.
Das aus nativem BoNT/A enzymatisch produzierte LH_N ist ein wirksames Immunogen und folglich stellt die rekombinante Form mit seiner totalen Trennung von jedem Neurotoxin voller Länge einen Vakzinbestandteil dar. Das rekombinante Produkt kann als ein Grundreagens für die Schaffung definierter Proteinmodifikationen bei der Unterstützung in jedem der obigen Bereiche dienen.
Rekombinanten Konstrukten werden unterscheidende Bezeichnungen auf der Basis ihrer Aminosäuresequenzlänge und ihres Gehalts an leichter Kette (L-Kette, L) und schwerer Kette (H-Kette, H) zugeordnet, da sich diese auf translatierte DNS-Sequenzen in der allgemein bekannten Domäne oder spezifisch auf die SEQ ID Nr. 2 und SEQ ID Nr. 20 beziehen. Auf die "LH"-Bezeichnung folgt "/X", wo "X" den entsprechenden Clostridientoxinserotyp oder -klasse bezeichnet, z. B. "A" für Botulinumneurotoxin Typ A oder "TeTx" für Tetanustoxin. Sequenzvarianten von jenem des natürlichen Toxinpolypeptids werden in Klammern im Standardformat wiedergegeben, nämlich die Restpositionsnummer, der der Rest der natürlichen Sequenz vorausgeht und der der Rest der Variante folgt.
Tief gestellte Zahlvorsilben zeigen eine aminoterminale (N-terminale) Verlängerung an oder, wo negativ, eine Deletion in der translatierten Sequenz. Ähnlich zeigen tiefgestellte Zahlennachsilben eine carboxyterminale (C-terminale) Verlängerung oder, wo negative Zahlen verwendet werden, eine Deletion an. Spezifische Sequenzinserierungen wie Proteasespaltungsstellen werden unter Verwendung von Abkürzungen angezeigt, z. B. Faktor Xa wird abgekürzt durch FXa. C-terminale L-Ketten-Nachsilben und N-terminale H-Ketten-Vorsilben werden abgetrennt durch einen "/", um die vorhergesagte Verbindung zwischen den L- und H-Ketten anzuzeigen. Abkürzungen für die veränderten Ligandsequenzen werden der Clostridien-L-Kette oder -H-Kette, entsprechend jeder Position in dem Translationsprodukt, vorgestellt oder nachgestellt.

Nach dieser Nomenklatur sind:

LH₄₂₃/A	= SEQ ID Nr. 2, enthaltend die gesamte L-Kette und 423 Aminosäuren der H-Kette von Botulinumneurotoxin Typ A;
₂LH₄₂₃/A	= eine Variante dieses Moleküls, enthaltend eine zwei Aminosäuren lange Verlängerung des N-Terminus der L-Kette;
₂L_/2H₄₂₃/A	= eine weitere Variante, in welcher das Molekül eine zwei Aminosäuren lange Verlängerung des N-Termins von sowohl der L-Kette als auch der H-Kette enthält;
₂L_FXa/2H₄₂₃/A	= eine weitere Variante, enthaltend eine zwei Aminosäuren lange Verlängerung des N-Termins der L-Kette und eine Faktor-Xa-Spaltsequenz an dem C-Terminus der L-Kette, welche nach Abspalten des Moleküls mit Faktor Xa eine zwei Aminosäuren lange N-terminale Verlängerung des H-Kettenbestandteiles belässt; und
₂L_FXa/2H₄₂₃/A-IGF-1	= eine Variante dieses Moleküls, welche eine weitere C-terminale

Verlängerung der H-Kette hat, in diesem Beispiel durch die Sequenz des insulinähnlichen Wachstumsfaktors 1 (IGF-1).
Es folgt nun die Beschreibung spezifischer Ausführungsbeispiele der Erfindung, erläutert durch die Zeichnungen, in welchen:
1 eine schematische Darstellung der Domänenstruktur von Botulinumneurotoxin Typ A (BoNT/A) zeigt;
2 eine schematische Darstellung des Zusammenbaus des Gens für eine Ausführung der Erfindung, bezeichnet mit LH₄₂₃/A, zeigt;
3 eine Grafik ist, die die Aktivität von nativem Toxin, mit Trypsin erzeugtem "nativem" LH_N/A und einer Ausführung der Erfindung, bezeichnet als ₂LH₄₂₃/A (Q₂E, N₂₆K, A₂₇Y), in einem In-vitro-Peptidspalttest vergleicht;
4 ein Vergleich der ersten 33 Aminosäuren in veröffentlichten Sequenzen von nativem Toxin und Ausführungsbeispielen der Erfindung ist;
5 die Übergangsregion eines Ausführungsbeispiels der Erfindung zeigt, bezeichnet mit L/₄H₄₂₃/A, das die Insertion von vier Aminosäuren an dem N-Terminus der H_N-Sequenz illustriert; die Aminosäuren, über die die Eco-47-III-Restriktionsendonucleasespaltstelle kodiert wird, sind markiert und die H_N-Sequenz beginnt dann mit ALN...;
6 die Übergangsregion eines Ausführungsbeispiels der Erfindung zeigt, bezeichnet als L_FXa/3H₄₂₃/A, das die Insertion der Faktor-Xa-Spaltstelle an den C-Terminus der L-Kette erläutert, und drei zusätzliche Aminosäuren, für die an dem N-Terminus der H-Sequenz kodiert wird; die N-terminale Aminosäure der durch Spaltung aktivierten H_N wird Cystein sein;
7 den C-terminalen Teil der Aminosäuresequenz einer Ausführung der Erfindung zeigt, bezeichnet als L_FXa/3H₄₂₃/A-IGF-1, ein Fusionsprotein; die IGF-1-Sequenz beginnt an der Position G₈₈₂;
8 den C-terminalen Teil der Aminosäuresequenz einer Ausführung der Erfindung zeigt, bezeichnet als L_FXa/3H₄₂₃/A-CtxA14, ein Fusionsprotein; die C-terminale CtxA-Sequenz beginnt an der Position Q₈₈₂;
9 den C-terminalen Teil der Aminosäuresequenz einer Ausführung der Erfindung zeigt, bezeichnet als L_FXa/3H₄₂₃/A-ZZ, ein Fusionsprotein; die C-terminale ZZ-Sequenz beginnt an der Position A₈₉₀ unmittelbar nach der Genenaseerkennungsstelle (unterstrichen);
10 & 11 schematische Darstellungen von Manipulationen von Polypeptiden der Erfindung zeigen; 10 zeigt LH₄₂₃/A mit einer N-terminalen Addition eines Affinitätsaufreinigungspeptids (in diesem Fall GST) und der C-terminalen Addition einer IgG-Bindungsdomäne; die Proteasespaltstellen R1, R2 und R3 ermöglichen die selektive enzymatische Auftrennung von Domänen; 11 zeigt spezifische Beispiele von Proteasespaltstellen R1, R2 und R3 und eine C-terminale Fusionspeptidsequenz;
12 zeigt die trypsinempfindliche Aktivierungsregion eines Polypeptids der Erfindung;
13 zeigt die Western-Blot-Analyse von rekombinantem LH₁₀₇/B, exprimiert durch E. coli; Platte A wurde mit Anti-BoNT/B-Antiserum sondiert: Spur 1 Molekulargewichtsstandards; Spuren 2 & 3 natives BoNT/B; Spur 4 immungereinigtes LH₁₀₇/B; Platte B wurde mit Anti-T7-Peptidanhangs-Antiserum sondiert: Spur 1 Molekulargewichtsstandards; Spuren 2 & 3 Positivkontrolle der E.-coli-T7-Expression; Spur 4 immungereinigtes LH₁₀₇/B.

Das Sequenzprotokoll, das diese Anmeldung begleitet, enthält die folgenden Sequenzen:

SEQ ID Nr.	Sequenz
1	DNS, die für LH₄₂₃/A kodiert
2	LH₄₂₃/A
3	DNS, die für ₂₃LH₄₂₃/A (Q₂E, N₂₆K, A₂₇Y) kodiert, wovon ein N-terminaler Teil in Fig. 4 gezeigt ist
4	₂₃LH₄₂₃/A (Q₂E, N₂₆K, A₂₇Y)
5	DNS, die für ₂LH₄₂₃/A (Q₂E, N₂₆K, A₂₇Y) kodiert, wovon ein N-terminaler Teil in Fig. 4 gezeigt ist
6	₂LH₄₂₃/A (Q₂E, N₂₆K, A₂₇Y)
7	DNS, die für natives BoNT/A kodiert, gemäß Binz et al.,
8	natives BoNT/A gemäß Binz et al.
9	DNS, die für L_/4H₄₂₃/A kodiert
10	L_/4H₄₂₃/A
11	DNS, die für L_FXa/3H₄₂₃/A kodiert
12	L_FXa/3H₄₂₃/A
13	DNS, die für L_FXa/3H₄₂₃/A-IGF-1 kodiert
14	L_FXa/3H₄₂₃/A-IGF-1
15	DNS, die für L_FXa/3H₄₂₃/A-CtxA14 kodiert
16	L_FXa/3H₄₂₃/A-CtxA14
17	DNS, die für L_FXa/3H₄₂₃/A-ZZ kodiert
18	L_Fxa/3H₄₂₃/A-ZZ
19	DNS, die für LH₇₂₈/B kodiert
20	LH₇₂₈/B
21	DNS, die für LH₄₁₇/B kodiert
22	LH₄₁₇/B
23	DNS, die für LH₁₀₇/B kodiert
24	LH₁₀₇/B
25	DNS, die für LH₄₂₃/A (Q₂E, N₂₆K, A₂₇Y) kodiert
26	LH₄₂₃/A (Q₂E, N₂₆K, A₂₇Y)
27	DNS, die für LH₄₁₇/B kodiert, worin die ersten 274 Basen modifiziert sind, so dass sie eine E.-coli-Codonbevorzugung haben

28	DNS, die für LH₄₁₇/B kodiert, worin die Basen 691–1641 der nativen BoNT/B-Sequenz durch eine degenerierte DNS ersetzt worden sind, die für die Aminosäurereste 231–547 des nativen BoNT/B-Polypeptids kodiert

Beispiel 1
Es wurde eine 2616 Basenpaar lange, doppelsträngige Gensequenz (SEQ ID Nr. 1) aus einer Kombination einer synthetischen, chromosomalen und mit Polymerasekettenreaktion erzeugten DNS zusammengebaut (2). Das Gen kodiert für ein Peptid mit 871 Aminosäureresten, das der gesamten leichten Kette (LC, 448 Aminosäuren) und 423 Resten des Aminoterminus der schweren Kette (H_C) für Botulinumneurotoxin Typ A entspricht. Dieses rekombinante Produkt wird als LH₄₂₃/A-Fragment (SEQ ID Nr. 2) bezeichnet.
Konstruktion des rekombinanten Produktes
Die ersten 918 Basenpaare des rekombinanten Gens wurden durch Verkettung kurzer Oligonucleotide synthetisiert, um eine kodierende Sequenz mit einer E.-coli-Codonbevorzugung zu erzeugen. Beide DNS-Stränge in dieser Region wurden vollständig synthetisiert als kurze überlappende Oligonucleotide, welche phosphoryliert, der Doppelstrangbildung unterzogen und ligiert wurden, um die vollständige synthetische Region zu erzeugen, die mit einer einzigartigen KpnI-Restriktionsstelle endet. Der Rest der LH₄₂₃/A-kodierenden Sequenz wurde mit PCR amplifiziert aus chromosomaler Gesamt-DNS aus Clostridium botulinum und wurde mit dem synthetischen Teil des Gens der Doppelstrangbildung unterzogen.
Die inneren, mit PCR amplifizierten Produktsequenzen wurden dann deletiert und mit den nativen, vollständig sequenzierten Regionen von Klonen chromosomalen Ursprungs aus C. botulinum ersetzt, um das endgültige Genkonstrukt zu erzeugen. Die endgültige Zusammensetzung ist synthetische DNS (Basen 1–913), polymeraseamplifizierte DNS (Basen 914–1138 und 1976–2616) und der Rest ist chromosomalen Ursprungs aus C. botulinum (Basen 1139–1975). Das zusammengesetzte Gen wurde dann vollständig sequenziert und in eine Reihe von E.-coli-Plasmidvektoren für die Expressionsanalyse kloniert.
Expression des rekombinanten Gens und Wiedergewinnung des Proteinproduktes
Die DNS wird in E. coli als ein einzelnes Nucleinsäuretranskript exprimiert, welches ein lösliches, einzelkettiges Polypeptid mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 99.951 Dalton produziert. Das Gen wird gegenwärtig in E. coli als eine Fusion mit der im Handel erhältlichen kodierenden Sequenz von Glutathion-S-Transferase (GST) aus Schistosoma japonicum exprimiert, es können jedoch jeder einer ausgedehnten Reihe an rekombinanten Genexpressionsvektoren, wie pEZZ18, pTrc99, pFLAG oder die pMAL-Reihen, gleich wirksam sein, wie es die Expression in anderen prokaryotischen oder eukaryotischen Wirten sein könnte, wie z. B. die gram-positiven Bacilli, die Hefe P. pastoris oder in Insekten- oder Säugerzellen unter geeigneten Bedingungen.
Gegenwärtig wird E. coli, das das Expressionskonstrukt beherbergt, in Luria-Bertani-Nährlösung (L-Nährlösung, pH 7,0, enthaltend 10 g/l Bacto-Trypton, 5 g/l Bacto-Hefeextrakt und 10 g/l Natriumchlorid) bei 37°C wachen gelassen, bis die Zelldichte (Biomasse) eine optische Extinktion von 0,4–0,6 bei 600 nm hat und die Zellen sich in einer mittleren logarithmischen Wachstumsphase befinden. Die Expression des Gens wird dann durch die Zugabe von Isopropylthio-β-D-galactosidase (PTG) auf eine Endkonzentration von 0,5 mM induziert. Der rekombinanten Genexpression wird ermöglicht, für 90 Minuten bei einer reduzierten Temperatur von 25°C fortzuschreiten. Die Zellen werden dann durch Zentrifugation geerntet, werden in einer Pufferlösung, die 10 mM Na₂HPO₄, 0,5 M NaCl, 10 mM EGTA, 0,25% Tween, enthält, pH 7,0; resuspendiert und dann bei –20°C eingefroren. Für die Extraktion des rekombinanten Proteins werden die Zellen durch Beschallung zerstört. Der Zellextrakt wird dann von Zelltrümmern durch Zentrifugation geklärt und die geklärte überständige Flüssigkeit, die lösliches rekombinantes Fusionsprotein (GST-LH₄₂₃/A) enthält, wird bei –20°C bis zur Aufreinigung gelagert. Ein Teil des rekombinanten Materials wird nicht durch das Beschallungsvorgehen freigesetzt und dies spiegelt möglicherweise die Unlöslichkeit oder die Einschlusskörperbildung wider. Gegenwärtig extrahieren wir dieses Material für die Analyse nicht, falls dies aber gewünscht wird, könnte dies leicht unter Verwendung von Fachleuten bekannten Verfahren erreicht werden.
Das rekombinante GST-LH₄₂₃/A wird durch Absorption auf einer im Handel erhältlichen zubereiteten Affinitätsmatrix aus Glutathionsepharose und durch nachfolgende Elution mit reduziertem Glutathion aufgereinigt. Der GST-Affinitätsaufreinigungsmarker wird dann durch proteolytische Spaltung und Reabsorption auf Glutathionsepharose entfernt; rekombinantes LH₄₂₃/A wird aus dem nicht absorbierten Material wieder gewonnen.
Konstruktvarianten
Es wurde eine Variante des Moleküls LH₄₂₃/A (Q₂E, N₂₆K, A₂₇Y) (SEQ ID Nr. 26) erzeugt, bei der drei Aminosäurereste innerhalb der leichten Kette von LH₄₂₃/A modifiziert worden sind, wodurch ein Polypeptid erzeugt würde, das eine Sequenz der leichten Kette enthält, die unterschiedlich ist von jener der publizierten Aminosäuresequenz der leichten Kette von BoNT/A.
Weitere Gensequenzvarianten, die exprimiert worden sind und die entsprechenden gereinigten Produkte sind ₂₃LH₄₂₃/A (Q₂E, N₂₆K, A₂₇Y) (SEQ ID Nr. 4), welches eine 23 Aminosäure lange N-terminale Verlängerung im Vergleich mit der vorhergesagten nativen L-Kette von BoNT/A hat, und ₂LH₄₂₃/A (Q₂E, N₂₆K, A₂₇Y) (SEQ ID Nr. 6), das eine zwei Aminosäure lange N-terminale Verlängerung hat (4).
Bei noch einer anderen Variante wurde ein Gen produziert, welches eine Eco-47-III-Restriktionsstelle zwischen den Nucleotiden 1344 und 1345 der Gensequenz, die in SEQ ID Nr. 1 wiedergegeben ist, enthält. Diese Modifikation stellt eine Restriktionsstelle an der Position in dem Gen bereit, das die Schnittstelle der schweren und leichten Ketten in nativem Neurotoxin darstellt, und sorgt für die Fähigkeit, Insertion an dieser Stelle unter Verwendung von Standardrestriktionsenzymmethoden, die Fachleuten bekannt sind, zu machen. Es wird auch Fachleuten offensichtlich sein, dass jede einer Anzahl von Restriktionsstellen so genutzt werden könnte und dass die Eco-47-III-Insertion einfach diesen Ansatz beispielhaft zeigt. Ähnlich wäre es für einen Fachmann offensichtlich, dass die Insertion einer Restriktionsstelle in der beschriebenen Weise an jedem Gen der Erfindung durchgeführt werden könnte. Das beschriebene Gen, wenn es exprimiert wird, kodiert für ein Polypeptid, L_/4H₄₂₃/A (SEQ ID Nr. 10), welches zusätzlich vier Aminosäuren zwischen den Aminosäuren 448 und 449 von LH₄₂₃/A an einer Position enthält, die äquivalent ist zu dem Aminoterminus der schweren Kette von nativem BoNT/A.
Es wurde eine Variante des Gens exprimiert, L_FXa/3H₄₂₃/A (SEQ ID Nr. 12), in welcher eine spezifische proteolytische Spaltungsstelle an dem carboxyterminalen Ende der Domäne der leichten Kette eingebaut worden war, genauer nach dem Rest 448 von L_/4H₄₂₃/A. Die eingebaute Spaltstelle diente für die Faktor-Xa-Protease und es wurde für diese durch Modifikation von SEQ ID Nr. 1 kodiert. Es wird für einen Fachmann offensichtlich sein, dass eine Spaltstelle für eine andere spezifizierte Protease ähnlich eingebaut werden könnte und dass jede Gensequenz, die für die erforderliche Spaltstelle kodiert, verwendet werden könnte. Die Modifikation der Gensequenz auf diese Weise, um für eine definierte Proteasestelle zu kodieren, könnte an jedem Gen der Erfindung durchgeführt werden.
Es wurden Varianten von L_FXa/3H₄₂₃/A konstruiert, bei welchen eine dritte Domäne an dem carboxyterminalen Ende des Polypeptids vorhanden ist, welche eine spezifische Bindungsaktivität in das Polypeptid einbaut.
Spezifische, beschriebene Beispiele sind:

(1) L_FXa/3H₄₂₃/A-IGF-1 (SEQ ID Nr. 14), bei welchem die carboxyterminale Domäne eine Sequenz hat, die äquivalent ist mit der des insulinähnlichen Wachstumsfaktors 1 (IGF-1), und das in der Lage ist, an den Rezeptor für den insulinähnlichen Wachstumsfaktor mit hoher Affinität zu binden;
(2) L_FXa/3H₄₂₃/A-CtxA14 (SEQ ID Nr. 16), bei welchem die carboxyterminale Domäne eine Sequenz hat, die äquivalent ist mit jener der 14 Aminosäuren von dem Carboxyterminus der A-Untereinheit von Choleratoxin (CtxA) und das dadurch in der Lage ist, mit dem Pentamer der Choleratoxin-B-Untereinheit in Wechselwirkung zu treten; und
(3) L_FXa/3H₄₂₃/A-ZZ (SEQ ID Nr. 18), bei welchem die carboxyterminale Domäne eine tandemartig wiederholte synthetische IgG-Bindungsdomäne ist. Diese Variante dient als Beispiel für eine andere Modifikation, die auf die gegenwärtige Erfindung anwendbar ist, nämlich der Einschluss einer für eine Proteasespaltstelle kodierenden Sequenz in das Gen, die zwischen dem Ende der Sequenz der schweren Kette von Clostridien und der Sequenz, die für den Bindungsliganden kodiert, lokalisiert ist. Spezifisch in diesem Beispiel wird eine Sequenz, die für eine Genenasespaltstelle kodiert, bei den Nucleotiden 2650 bis 2666 inseriert. Die Expression dieses Gens produziert ein Polypeptid, welches die gewünschte Proteasesensitivität an der Schnittstelle zwischen der Domäne, die H_N-Funktion bereitstellt, und der Bindungsdomäne hat. Solch eine Modifikation ermöglicht die selektive Entfernung der C-terminalen Bindungsdomäne durch Behandlung des Polypeptids mit der relevanten Protease.

Es wird offensichtlich sein, dass jede eine Anzahl von solchen Bindungsdomänen in die Polypeptidsequenzen dieser Erfindung eingebaut werden könnte und dass die obigen Beispiele nur dazu da sind, um als Beispiel für das Konzept zu dienen. Ähnlich können solche Bindungsdomänen in jede der Polypeptidsequenzen eingebaut werden, die die Basis dieser Erfindung sind. Weiter sollte bemerkt werden, dass solche Bindungsdomänen an jeder geeigneten Örtlichkeit innerhalb der Polypeptidmoleküle der Erfindung eingebaut werden könnten.
Weitere Ausführungsbeispiele der Erfindung werden folglich durch eine DNS der Erfindung erläutert, die weiter eine gewünschte Restriktionsendonucleasestelle an der gewünschten Örtlichkeit umfasst, und durch ein Polypeptid der Erfindung, das weiter eine gewünschte Proteasespaltstelle an einer gewünschten Örtlichkeit umfasst.
Die Restriktionsendonucleasestelle kann so eingebaut werden, dass sie die weitere Manipulation der DNS bei der Herstellung eines Expressionsvektors für die Expression eines Polypeptids der Erfindung erleichtert; sie kann als eine Folge eines vorangegangenen Schritts bei der Herstellung der DNS eingeführt werden; sie kann im Wege der Modifikation durch Insertion, Substitution oder Deletion einer bekannten Sequenz eingeführt werden. Die Folge der Modifikation der DNS kann sein, dass die Aminosäuresequenz unverändert ist, oder sie kann sein, dass die Aminosäuresequenz geändert ist, was z. B. in der Einführung einer gewünschten Proteasespaltstelle resultiert, wobei das Polypeptid bei jedem Weg seine erste und zweite Domäne mit den durch die Erfindung erforderlichen Eigenschaften behält.
10 ist eine Diagrammdarstellung eines Expressionsproduktes, das die in diesem Beispiel beschriebenen Eigenschaften veranschaulicht. Besonders erläutert sie ein einzelnes Polypeptid, das eine Domäne einschließt, die äquivalent ist mit der leichten Kette von Botulinumneurotoxin Typ A, und eine Domäne, die äquivalent ist mit der H_N-Domäne der schweren Kette von Botulinumneurotoxin Typ A mit einer N-terminalen Verlängerung, welche eine Affinitätsaufreinigungsdomäne bereitstellt, nämlich GST, und einer C-terminalen Länge, die eine Ligandenbindungsdomäne bereitstellt, nämlich eine IgG-Bindungsdomäne. Die Domänen des Polypeptids sind räumlich durch spezifische Proteasespaltstellen getrennt, was eine selektive enzymatische Trennung der Domänen erlaubt, wie in der Figur veranschaulicht. Dieses Konzept wird genauer in 11 abgebildet, wo die zahlreichen Proteaseempfindlichkeiten für die Zwecke des Beispiels definiert sind.
Test der Produktaktivität
Die LC von Botulinumneurotoxin Typ A übt eine zinkabhängige Endopeptidaseaktivität auf das synaptosomen-assoziierte Protein SNAP-25 aus, welches sie in einer spezifischen Weise an einer einzelnen Polypeptidbindung spaltet. ₂LH₄₂₃/A (Q₂E, N₂₆K, A₂₇Y) (SEQ ID Nr. 6) spaltet ein synthetisches SNAP-25-Substrat in vitro unter denselben Bedingungen wie das native Toxin (3). Folglich verhindert die Modifikation der Polypeptidsequenz von ₂LH₄₂₃/A (Q₂E, N₂₆K, A₂₇Y) im Vergleich mit der nativen Sequenz und innerhalb der minimalfunktionellen LC-Domänen nicht die funktionelle Aktivität der LC-Domäne.
Diese Aktivität ist abhängig von der proteolytischen Modifikation von rekombinantem GST-₂LH₄₂₃/A (Q₂E, N₂₆K, A₂₇Y), um das einzelkettige Polypeptidprodukt zu einer über Disulfid verknüpften zweikettigen Art umzuwandeln. Dies wird gegenwärtig unter Verwendung des proteolytischen Enzyms Trypsin gemacht. Das rekombinante Produkt (100–600 μg/ml) wird bei 37°C für 10–50 Minuten mit Trypsin (10 μg/ml) in einer Lösung, die 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄ enthält, pH 7,3, inkubiert. Die Reaktion wird durch die Zugabe eines 100-fachen molaren Überschusses an Trypsininhibitor beendet. Die Aktivierung durch Trypsin schafft eine über Disulfid verknüpfte zweikettige Art, wie bestimmt durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Immunblotting-Analyse unter Verwendung von polyklonalem Anti-Botulinumneurotoxin-Typ-A-Antiserum.
₂LH₄₂₃/A ist stabiler bei der Anwesenheit von Trypsin und aktiver in dem In-vitro-Peptidspalttest als es ₂₃LH₄₂₃/A ist. Beide Varianten sind jedoch vollständig funktionell in dem In-vitro-Peptidspalttest. Dies zeigt, dass das rekombinante Molekül N-terminale Aminosäureverlängerung tolerieren wird und dies kann auf andere chemische oder organische Einheiten ausgedehnt werden, wie es Fachleuten offensichtlich sein würde.
Beispiel 2
Als eine weitere Veranschaulichung dieser Erfindung wurden eine Anzahl von Gensequenzen zusammengebaut, die für Polypeptide kodieren, welche der gesamten leichten Kette und variierenden Zahlen von Resten von dem aminoterminalen Ende der schweren Kette von Botulinumneurotoxin Typ B entsprechen. Bei dieser Veranschaulichung der Offenbarung wurden die zusammengebauten Gensequenzen aus einer Kombination chromosomaler und durch Polymerasekettenreaktion erzeugter DNS gewonnen und haben deshalb die Nucleotidsequenz der äquivalenten Regionen der natürlichen Gene, wodurch das Prinzip veranschaulicht wird, dass die Substanz dieser Offenbarung sowohl auf natürlichen als auch auf synthetischen Gensequenzen basiert werden kann.
Die sich auf dieses Beispiel beziehenden Gensequenzen wurden sämtlich zusammengebaut und exprimiert unter Verwendung von Methoden, wie sie detailliert beschrieben sind in J. Sambrook, E.F. Fritsch & T. Maniatis (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2. Auflage), N. Ford, C. Nolan, M. Ferguson & M. Ockler (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, und wie sie Fachleuten bekannt ist.
Es wurde ein Gen zusammengebaut, das für ein Polypeptid mit 1171 Aminosäuren kodiert, was der gesamten leichten Kette (443 Aminosäuren) und 728 Resten von dem Aminoterminus der schweren Kette des Neurotoxintyp B entspricht. Die Expression dieses Gens erzeugt ein Polypeptid, LH₇₂₈/B (SEQ ID Nr. 20), welchem die spezifische neuronale Bindungsaktivität von BoNT/B voller Länge fehlt.
Es wurde ebenfalls ein Gen zusammengebaut, das für ein variantes Polypeptid kodiert, LH₄₁₇/B (SEQ ID Nr. 22), welches eine Aminosäuresequenz an seinem Carboxyterminus besitzt, die äquivalent ist durch Aminosäurehomologie mit jener an dem Carboxyterminus des Fragmentes der schweren Kette in nativem LH_N/A.
Es wurde ebenfalls ein Gen zusammengebaut, das für ein variantes Polypeptid, LH₁₀₇/B (SEQ ID Nr. 24) kodiert, welches an seinem Carboxyterminus eine kurze Sequenz aus dem Aminoterminus der schweren Kette von BoNT/B exprimiert, die ausreichend ist, um die Löslichkeit des exprimierten Polypeptids zu bewahren.
Konstruktvarianten
Eine Variante der kodierenden Sequenz für die ersten 274 Basen des in SEQ ID Nr. 21 gezeigten Gens wurde produziert, welche, während sie eine nicht native Nucleotidsequenz ist, immer noch für das native Polypeptid kodiert.
Es wurden zwei doppelsträngige Gensequenzen, eine mit 268 Basenpaaren und die andere mit 951 Basenpaaren, unter Verwendung einer überlappenden Primer-PCR-Strategie geschaffen. Nucleotidüberhang dieser Sequenzen wurde so gestaltet, um eine E.-coli-Codonbevorzugung zu haben.
Für die erste Sequenz wurden sechs Oligonucleotide synthetisiert, welche die ersten (5') 268 Nucleotide der nativen Sequenz für Botulinumtoxin Typ B repräsentieren. Für die zweite Sequenz wurden 23 Oligonucleotide synthetisiert, welche die inneren Sequenznucleotide 691–1641 der nativen Sequenz für Botulinumtoxin Typ B repräsentieren. Die Oligonucleotide bewegen sich in einem Bereich von 57–73 Nucleotiden in der Länge. Überlappende Regionen, 17–20 Nucleotide, wurden gestaltet, um Schmelztemperaturen in dem Bereich von 52–56°C zu ergeben. Zusätzlich wurden endständige Restriktionsendonucleasestellen der synthetischen Produkte konstruiert, um die Insertion dieser Produkte in die exakt entsprechende Region der nativen Sequenz zu erleichtern. Die 268 bp lange synthetische 5'-Sequenz wurde in das in SEQ ID Nr. 21 gezeigte Gen anstelle der ersten 268 Originalbasen eingebaut (und ist gezeigt in SEQ ID Nr. 27). Ähnlich könnte die Sequenz in andere Gene der Beispiele inseriert werden.
Eine andere Sequenzvariante, die äquivalent ist zu den Nucleotiden 691 bis 1641 von SEQ ID Nr. 21 und die eine nicht native Codonverwendung nutzt, während sie für eine native Polypeptidsequenz kodiert, wurde unter Verwendung der inneren synthetischen Sequenz konstruiert. Diese Sequenz (SEQ ID Nr. 28) kann alleine oder in Kombination mit anderen Sequenzvarianten anstelle der äquivalenten kodierenden Sequenz in jedem der Gene des Beispiels eingebaut werden.
Beispiel 3
Eine Veranschaulichung des Nutzens dieser Erfindung als ein nichttoxisches und wirksames Immunogen. Die nichttoxische Natur des rekombinanten, einzelkettigen Materials wurde durch die intraperitoneale Applikation von GST-₂LH₄₂₃/A in Mäuse demonstriert. Das Polypeptid wurde wie oben beschrieben zubereitet und aufgereinigt. Die Menge des immunreaktiven Materials in der Endzubereitung wurde durch enzym-gekoppelten Immunabsorptionstest (ELISA) unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers (BA11) bestimmt, der gegen ein von der Konformation abhängiges Epitop auf dem nativen LH_N/A reaktiv ist. Das rekombinante Material wurde seriell in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS; NaCl 8 g/l, KCl 0,2 g/l, Na₂HPO₄ 1,15 g/l, KH₂PO₄ 0,2 g/l, pH 7,4) verdünnt und es wurden Volumina mit 0,5 ml in 3 Gruppen mit je 4 Mäusen injiziert, so dass jede Mausgruppe 10, 5 bzw. 1 Mikrogramm Material erhielt. Die Mäuse wurden für 4 Tage beobachtet und es wurden keine Toten beobachtet.
Für die Immunisierung wurden 20 μg GST-₂LH₄₂₃/A in einem Volumen von 1,0 ml einer Wasser-in-Öl-Emulsion (1:1 Vol:Vol) unter Verwendung von Freund's vollständigem (primäre Injektionen nur) oder Freund's unvollständigem Adjuvans in Meerschweinchen über zwei subkutane dorsale Injektionen verabreicht. Drei Injektionen in 10-tägigen Intervallen wurden gegeben (Tag 1, Tag 10 und Tag 20) und das Antiserum wurde am Tag 30 gesammelt. Die Antisera wurden durch ELISA als gegen natives Botulinumneurotoxin Typ A und gegen sein Derivat LH_N/A immunoreaktiv gezeigt. Antisera, die auf Botulinumneurotoxin bei einer Verdünnung von 1:2.000 ansprechend waren, wurden für die Beurteilung der Neutralisierungswirksamkeit in Mäusen verwendet. Für die Neutralisierungstests wurden 0,1 ml Antiserum in 2,5 ml Gelatinephosphatpuffer (GPB; Na₂HPO₄, wasserfrei, 10 g/l, Gelatine (Difco) 2 g/l, pH 6,5–6,6), enthaltend eine Verdünnung im Bereich von 0,5 μg (5 × 10^–6 g) bis 5 pg (5 × 10^–12 g) verdünnt. Aliquoten von 0,5 ml wurden in Mäuse intraperitoneal injiziert und Tote wurden über einen Zeitraum von 4 Tagen aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 und Tabelle 2 gezeigt. Es kann deutlich gesehen werden, dass 0,5 ml von 1:40 verdünntem Anti-GST-₂LH₄₂₃/A-Antiserum Mäuse vor intraperitonealer Provokation mit Botulinumneurotoxin in dem Bereich von 5 pg – 50 ng (1 – 10.000 Maus-LD50; 1 Maus-LD50 = 5 pg) schützen kann.
TABELLE 1. Neutralisierung von Botulinumneurotoxin in Mäusen durch Anti-GST-₂LH₄₂₃/A-Meerschweinchen-Antiserum
TABELLE 2. Neutralisierung von Botulinumneurotoxin in Mäusen durch nicht immunes Meerschweinchen-Antiserum
Beispiel 4
Expression von rekombinanten LH₁₀₇/B in E. coli
Als eine Veranschaulichung der Expression einer Nucleinsäure, die für eine LH_N eines Clostridientoxins mit einem Serotypen, der von Botulinumneurotoxin Typ A verschieden ist, kodiert, wurde die Nucleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 23), die für das Polypeptid LH₁₀₇/B kodiert (SEQ ID Nr. 24), in das im Handel erhältliche Plasmid pET28a (Novogen, Madison, WI, USA) inseriert, Die Nucleinsäure wurde in E. coli BL21 (DE3) (New England BioLabs, Beverley, MA, USA) als ein Fusionsprotein mit einem N-terminalen T7-Fusionspeptid unter IPTG-Induktion bei 1 mM für 90 Minuten bei 37°C exprimiert. Die Kulturen wurden geerntet und das rekombinante Protein wurde extrahiert, wie zuvor beschrieben für LH₄₂₃/A.
Das rekombinante Protein wurde wiedergewonnen und aus Bakterienmasselysaten durch Immunaffinitätsabsorption an einen immobilisierten monoklonalen Anti-T7-Peptidantikörper unter Verwendung eines T7-Anhang-Aufreinigungskits (New England BioLabs, Beverley, MA, USA) aufgereinigt. Das aufgereinigte rekombinante Protein wurde durch eine denaturierende Gradienten- (4–20%) -SDS-Polyacrylamid-Gelektrophorese (Novex, San Diego, CA, USA) und durch Western-Blotting unter Verwendung von polyklonalem Anti-Botulinumneurotoxin-Typ-Antiserum oder Anti-T7-Antiserum analysiert. Western-Blot-Reagenzien waren von Novex, immungefärbte Proteine wurden unter Verwendung des Enhanced-Chemi-Luminescence-Systems (ECL) von Amersham sichtbar gemacht. Die Expression eines Anti-T7-Antikörpers und eines auf Anti-Botulinumneurotoxin-Typ-B-Antiserum ansprechenden, rekombinanten Produktes ist in 13 gezeigt.
Das rekombinante Produkt war löslich und bewahrte jenen Teil der leichten Kette, die für die Endopeptidaseaktivität verantwortlich ist.
Die Erfindung stellt folglich rekombinante Polypeptide bereit, die unter anderem als Immunogene, Enzymstandards und Bestandteile für die Synthese von Molekülen nützlich sind, wie beschrieben in WO-A-94/21300.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Polypeptid, umfassend erste und zweite Domänen, worin die erste Domäne die leichte Kette eines Clostridienneurotoxins oder ein Fragment oder eine Variante der leichten Kette des Clostridienneurotoxins ist, worin die erste Domäne einen oder mehrere Vesikel- oder Plasmamembran-assoziierte Proteine, die für die Exocytose wesentlich sind, spalten kann, worin die zweite Domäne ein H_N-Teil der schweren Kette eines Clostridienneurotoxins oder ein Fragment oder eine Variante des H_N-Teils der schweren Kette des Clostridienneurotoxins ist, worin die zweite Domäne (i) das Polypeptid in eine Zelle translozieren kann oder (ii) die Löslichkeit des Polypeptids im Vergleich zur Löslichkeit der ersten Domäne alleine erhöhen kann oder (iii) sowohl das Polypeptid in eine Zelle translozieren als auch die Löslichkeit des Polypeptids im Vergleich zur Löslichkeit der ersten Domäne alleine erhöhen kann, worin der zweiten Domäne ein zweiter, als H_C-bezeichneter intakter Teil der schweren Kette des Clostridienneurotoxins fehlt, und worin das Polypeptid ein Einzelkettenpolypeptid ist.
Polypeptid nach Anspruch 1, worin das Clostridientoxin ein Botulinustoxin ist.
Polypeptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die erste Domäne eine Endopeptidaseaktivität aufweist, die spezifisch für ein Substrat ist, ausgewählt unter einem oder mehreren von SNAP-25, Synaptobrevin/VAMP und Syntaxin.
Polypeptid nach Anspruch 1, worin der H_N-Teil der schweren Kette des Clostridienneurotoxins von einem Botulinustoxin ist.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, zusätzlich umfassend eine dritte Domäne, die von dem Polypeptid an eine Zelle bindet, und zwar indem die dritte Domäne direkt an eine Zelle bindet oder indem die dritte Domäne an einen Ligand oder an Liganden bindet, der bzw. die an eine Zelle bindet bzw. binden.
Polypeptid nach Anspruch 5, worin die dritte Domäne für die Bindung des Polypeptids an ein Immunglobulin ist.
Polypeptid nach Anspruch 6, worin die dritte Domäne eine synthetische Tandemrepeat- IgG-Bindungsdomäne ist, abgeleitet von der Domäne (3 des Staphylococcenproteins A.
Polypeptid nach Anspruch 5, worin die dritte Domäne eine Aminosäuresequenz umfasst, die an einen Zelloberflächenrezeptor bindet.
Polypeptid nach Anspruch 8, worin die dritte Domäne der insulinähnliche Wachstumsfaktor-1 (IFG-1 = insulin-like growth factor-1) ist.
Polypeptid nach einem der vorstehenden Ansprüche, umfassend eine leichte Kette eines Botulinustoxins oder ein Fragment oder eine Variante einer leichten Kette eines Botulinustoxins und einen als H_N-bezeichneten Teil der schweren Kette eines Botulinustoxins.
Polypeptid nach Anspruch 10, worin eines oder beide von (a) der leichten Kette des Toxins oder des Fragments oder der Variante der leichten Kette des Toxins und (b) des Teils der schweren Kette des Toxins vom Botulinustoxin Typ A sind.
Polypeptid nach Anspruch 11, worin die Variante der leichten Kette des Botulinustoxins Typ A an Rest 2 ein Glutamat, an Rest 26 ein Lysin und an Rest 27 ein Tyrosin aufweist.
Polypeptid nach Anspruch 10, worin eines oder beide von (a) der leichten Kette des Toxins oder des Fragments oder der Variante der leichten Kette des Toxins und (b) des Teils der schweren Kette des Toxins vom Botulinustoxin Typ B sind.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1–9, umfassend eine leichte Kette eines Botulinustoxins oder ein Fragment oder eine Variante einer leichten Kette eines Botulinustoxins und mindestens 100 N-terminale Aminosäuren einer schweren Kette eines Botulinustoxins.
Polypeptid nach Anspruch 14, umfassend eine leichte Kette eines Botulinustoxins Typ B oder ein Fragment oder eine Variante davon und 107 N-terminale Aminosäuren einer schweren Kette eines Botulinustoxins Typ B.
Polypeptid nach Anspruch 11 oder 12, umfassend mindestens 423 der N-terminalen Aminosäuren der schweren Kette des Botulinustoxins Typ A.
Polypeptid gemäß Anspruch 16, umfassend eine leichte Kette eines Botulinustoxins Typ A und 423 N-terminale Aminosäuren der schweren Kette eines Botulinustoxins Typ A.
Polypeptid gemäß Anspruch 16, umfassend eine Variante der leichten Kette des Botulinustoxins Typ A, worin Rest 2 ein Glutamat, Rest 26 ein Lysin und Rest 27 ein Tyrosin ist, und 423 N-terminale Aminosäuren einer schweren Kette eines Botulinustoxins Typ A.
Polypeptid nach Anspruch 13, umfassend mindestens 417 der N-terminalen Aminosäuren der schweren Kette des Botulinustoxins Typ B.
Polypeptid nach Anspruch 19, umfassend eine leichte Kette eines Botulinustoxins Typ B und 417 N-terminale Aminosäuren einer schweren Kette eines Botulinustoxins Typ B.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 10–20, dem ein als H_C-bezeichneter Teil einer schweren Kette eines Botulinustoxins fehlt.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1–4, worin die zweite Domäne nicht an Zelloberflächenrezeptoren binden kann.
Polypeptid nach einem der vorstehenden Ansprüche, umfassend eine Variante eines Clostridientoxins und zusätzlich umfassend eine Stelle zur Spaltung durch ein proteolytisches Enzym, welche Spaltstelle im nativen Toxin nicht vorhanden ist.
Polypeptid nach Anspruch 23, umfassend eine Variante der leichten Kette eines Clostridientoxins und zusätzlich umfassend eine Stelle zur Spaltung durch ein proteolytisches Enzym, worin die Spaltstelle in der leichten Kette des nativen Toxins nicht vorhanden ist.
Polypeptid nach Anspruch 23 oder 24, umfassend eine Variante des H_N-Teils einer schweren Kette eines Clostridientoxins und zusätzlich umfassend eine Stelle zur Spaltung durch ein proteolytisches Enzym, welche Spaltstelle in dem nativen H_N-Teil der schweren Kette des Toxins nicht vorhanden ist.
Polypeptid nach Anspruch 23, 24 oder 25, erhältlich durch Modifikation einer das Polypeptid kodierenden DNS, um ein oder mehrere Nukleotide einzuführen, welche für die Spaltstelle kodieren.
Fusionsprotein, umfassend eine Fusion von (a) einem Polypeptid nach einem der Ansprüche 1–26 mit (b) einem zweiten Polypeptid, bei dem es sich um ein Polypeptid oder Oligopeptid handelt, das an eine Affinitätsmatrix bindet, um die Reinigung des Fusionsproteins unter Verwendung der Matrix zu ermöglichen.
Fusionsprotein gemäß Anspruch 27, worin das zweite Polypeptid an eine Chromatographiesäule bindet.
Fusionsprotein nach Anspruch 28, worin die zweite Chromatographiesäule eine Affinitätsmatrix von Glutathionsepharose ist.
Fusionsprotein nach Anspruch 27, 28 oder 29, worin eine spezifische Proteasespaltstelle zwischen dem ersten und zweiten Polypeptid eingebaut ist, worin die Proteasestelle die proteolytische Trennung des ersten und zweiten Polypeptids ermöglicht.
Zusammensetzung, umfassend ein Polypeptid nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin die Zusammensetzung in vivo nicht toxisch ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 31 oder ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1–26 oder ein Fusionsprotein nach Anspruch 27, 28, 29 oder 30 zur Verwendung als Positivkontrolle in einem Toxintest.
Zusammensetzung nach Anspruch 31 oder ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1–26 oder ein Fusionsprotein nach Anspruch 27, 28, 29 oder 30 zur Verwendung als ein Vaccin gegen ein Clostridientoxin.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 31 oder ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1–26 oder ein Fusionsprotein nach Anspruch 27, 28, 29 oder 30 für die in vivo-Verwendung.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Zusammensetzung nach Anspruch 31, ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1–26 oder ein Fusionsprotein nach Anspruch 27, 28, 29 oder 30 in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Nukleinsäure, kodierend ein Polypeptid oder ein Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1–30.
Nukleinsäure nach Anspruch 36, kodierend ein Polypeptid oder ein Fusionsprotein und umfassend Nukleotide, kodierend die Reste 1–448 einer leichten Kette eines Botulinustoxins Typ A.
Nukleinsäure gemäß Anspruch 36 oder 37, umfassend Nukleotide, kodierend die Reste 1–423 einer H_N-Domäne der schweren Kette eines Botulinustoxins Typ A.
Nukleinsäure nach Anspruch 36, kodierend ein Polypeptid oder ein Fusionsprotein und umfassend Nukleotide, kodierend die Reste 1–470 der leichten Kette eines Botulinustoxins Typ B.
Nukleinsäure nach Anspruch 36 oder 39, kodierend ein Polypeptid oder ein Fusionsprotein und umfassend Nukleotide, kodierend die Reste 1–417 einer H_N-Domäne der schweren Kette des Botulinustoxins Typ B.
Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 36–40, umfassend Nukleotide, kodierend eine Restriktionsendonucleasespaltstelle, die in der nativen Sequenz des Clostridientoxins nicht vorhanden ist.
Nukleinsäure nach Anspruch 41, erhältlich durch Modifikation eines Nukleotids, kodierend ein Polypeptid oder Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1–30, um die Spaltstelle einzuführen.
DNS nach einem der Ansprüche 36–42.
DNS, ausgewählt unter den SEQ IDs der Nummern 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 27 und 28.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1–26, umfassend das Exprimieren einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 36–44 in einer Wirtszelle und die Gewinnung des Polypeptids.
Verfahren der Herstellung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1–26, umfassend das Exprimieren einer Nukleinsäure, kodierend ein Fusionsprotein nach Anspruch 27, 28, 29 oder 30 in einer Wirtszelle, das Reinigen des Fusionsproteins mittels Elution des Fusionsproteins durch eine Affinitätsmatrix, angepasst an das Zurückhalten des Fusionsproteins, und Eluieren eines Liganden durch die Matrix, der an das Verdrängen des Fusionsproteins angepasst ist, und das Gewinnen des Fusionsproteins.
Verfahren zur Herstellung nach Anspruch 45 oder 46, worin die Nukleinsäure DNS ist.
Zelle, exprimierend ein Polypeptid oder Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1–30.