JP4273250B2 - 組換え毒素フラグメント - Google Patents
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Description
クロストリジウム神経毒は、ニューロン細胞におけるカルシウム依存性神経伝達物質分泌の強力なインヒビターである。それらは現在、神経伝達物質分泌の小胞ドッキング(docking)および膜融合事象の中心である3つの小胞またはシナプス前膜結合タンパク質、VAMP、シンタキシン、またはSNAP-25の少なくとも1つの特異的エンドタンパク質分解切断を介してこの活性を媒介すると考えられている。破傷風およびボツリヌス神経毒のニューロン細胞標的化はレセプター媒介性事象であると考えられており、その後毒素はインターナライズされるようになり、その後適切な細胞内区画に輸送され、そこで毒素はそれらのエンドペプチダーゼ活性をもたらす。
クロストリジウム神経毒は、レセプター結合および輸送H鎖(HC、約100kDa)にジスルフィド結合された触媒性L鎖(LC、約50kDa)の共通の構造を共有する。HCポリペプチドは、2つの異なる機能性ドメインの全てまたは一部を含むと考えられている。HCドメインと名付けられるHCのカルボキシ末端の半分(約50kDa)は、標的ニューロン上の細胞表面レセプターへの神経毒の高親和性神経特異的結合に関与し、一方HNドメインと名付けられるアミノ末端の半分(約50kDa)は、LCの機能的活性が標的細胞内で発現されるように、細胞膜を横切る神経も毒の少なくともいくらかの部分の輸送を媒介すると考えられている。HNドメインはまた、低pHの条件下で、脂質膜中のイオン透過性チャンネルを形成する特性を有しており、これはなんらかの方法でその輸送機能に関連し得る。
ボツリヌス神経毒A型(BoNT/A)については、これらのドメインは、HCに対してはアミノ酸残基872〜1296、HNに対してはアミノ酸残基449〜871、およびLCに対しては残基1〜448内に存在すると考えられている。トリプシンでの消化は、BoNT/AのHCドメインを効果的に分解して、LHNと称する非毒性フラグメントを生じ、これはもはやニューロンに結合および侵入し得ない(図1)。そのように産生されたLHNフラグメントはまた、親ホロ毒素および単離されたLCの両方に比較して増強された溶解性の特性を有する。
それゆえ、以下のように、神経毒分子内のドメインの機能的定義を提供することが可能である:
(A)クロストリジウム神経毒軽鎖:
−エキソサイトーシスプロセスに関与する小胞および/または形質膜結合タンパク質に対する高い基質特異性を示すメタロプロテアーゼ。特に、それは、SNAP-25、VAMP(シナプトブレビン/セルブレビン(cellubrevin))、およびシンタキシンの1つ以上を切断する。
(B)クロストリジウム神経毒重鎖HNドメイン:
−軽鎖活性の機能的発現が標的細胞内で生じるように、神経毒分子の部分の輸送を可能にする重鎖の部分。
−標的細胞中への結合ドメインを介するその特異的細胞表面レセプターへの神経毒の結合後のエンドペプチダーゼ活性の輸送を担うドメイン。
−低pHの条件下での脂質膜中のイオン透過性孔の形成を担うドメイン。
−軽鎖単独の溶解性に比較しての全体のポリペプチドの溶解性の増大を担うドメイン。
(C)クロストリジウム神経毒重鎖HCドメイン.
−細胞中への毒素のインターナリゼーションの前のクロストリジウム毒素の中毒作用に関与する細胞表面レセプター(単数または複数)への天然ホロ毒素の結合を担う重鎖の部分。
これらの毒素に対する細胞性認識マーカーの正体は現在は理解されておらず、そして特異的レセプター種は未だに同定されていないが、Kozakiらは、シナプトタグミンがボツリヌス神経毒B型に対するレセプターであり得ることを報告している。各々の神経毒が、異なるレセプターを有しそうである。
クロストリジウム毒素ワクチンを開発するために、およびクロストリジウム毒素の所望される特性を組み込んだ治療剤を開発するために、毒素アッセイのためのポジティブコントロールを有することが所望される。
しかしその極度の毒性に起因して、天然毒性の取り扱いは危険である。
本発明は、クロストリジウム毒素の産生および取り扱いに関連する問題を克服するかまたは少なくとも改善しようと努める。
従って、本発明は、第1のドメインおよび第2のドメインを含むポリペプチドを提供する。ここで上記第1のドメインは、1つ以上の、ニューロンエキソサイトーシスに必須な小胞または形質膜結合タンパク質を切断するように適合され、そして上記第2のドメインは、(i)細胞中へポリペプチドを輸送するように、または(ii)第1のドメイン単独の溶解性に比較してポリペプチドの溶解性を増大させるように、または(iii)細胞中へポリペプチドを輸送するように、および第1のドメイン単独の溶解性に比較してポリペプチドの溶解性を増大させるようにの両方で適合され、上記ポリペプチドはクロストリジウム神経毒を含まず、そしてタンパク質分解作用によって毒素に転換され得るいかなるクロストリジウム神経毒前駆体も含まない。従って、本発明はこのように、クロストリジウム毒素軽鎖に等価であるドメイン、およびクロストリジウム毒素重鎖のHNの機能的局面を提供するドメインを含むが、一方クロストリジウム毒素HCドメインの機能的局面を欠如する単一のポリペプチド鎖を提供し得る。
本発明の目的のために、本発明のポリペプチドの第2のドメインによって示されることが必要とされるクロストリジウム毒素重鎖のHNの機能的特性(単数または複数)は、(i)細胞中へのポリペプチドの輸送、または(ii)第1のドメイン単独の溶解性に比較してのポリペプチドの溶解性の増加、または(iii)(i)および(ii)の両方のいずれかである。HNドメインまたはHNドメインの機能に対する本明細書中以下の言及は、この特性(単数または複数)に対する言及である。第2のドメインは、クロストリジウム毒素重鎖のHNドメインのその他の特性をを示すことを必要とされない。
従って、本発明のポリペプチドは可溶性であり得るが、天然毒素の輸送機能を欠如し得る−これは、毒素によるチャレンジに対して個体をワクチン接種するためかまたはワクチン接種を補助するための免疫原の提供において有用である。以下の例において記載される本発明の特定の実施態様において、LH423/Aと称するポリペプチドは、A型神経毒に対する中和抗体を誘起した。本発明のポリペプチドは、同様に、従って、比較的不溶性であり得るが、天然毒素の輸送機能を保持し得る−これは、そのポリペプチドおよび1つ以上のその他の成分から構成される組成物に、上記1つ以上のその他の成分によって溶解性が付与される場合に有用である。
本発明のポリペプチドの第1のドメインは、エキソサイトーシスの特異的細胞性プロセスに必須である1つ以上の小胞または形質膜結合タンパク質を切断し、そしてこれらのタンパク質の切断は、代表的には非細胞傷害性様式で、エキソサイトーシスの阻害を生じる。影響される細胞(単数または複数)は、特定の型またはサブグループには制限されず、ニューロン細胞および非ニューロン細胞の両方を含み得る。エキソサイトーシスの阻害におけるクロストリジウム神経毒の活性は、実際、ほぼ普遍的に、関連細胞表面レセプターを発現する真核生物細胞において観察されており(Aplysia(アメフラシ)、Drosophila(ショウジョウバエ)、および哺乳動物神経細胞由来の種々の細胞を含む)、そして第1のドメインの活性は、対応する範囲の細胞を含むとして理解されるべきである。
本発明のポリペプチドは、組換え核酸(好ましくはDNA)の発現によって得られ得、そして単一のポリペプチドである(すなわち、分離した軽鎖および重鎖ドメインに切断されない)。従って、ポリペプチドは、組換え技術を使用して、便利なそして多い量で入手可能である。
本発明によるポリペプチドにおいて、上記第1のドメインは、好ましくは、クロストリジウム毒素軽鎖、またはクロストリジウム軽鎖のフラグメントもしくは改変体を含む。それが実質的に、エキソサイトーシスに必須の小胞もしくは形質膜結合タンパク質を切断する能力を保持する限り、フラグメントは、必要に応じて、軽鎖のN末端もしくはC末端フラグメントであるか、または内部フラグメントである。クロストリジウム毒素の軽鎖の活性のために必要な最小のドメインは、J. Biol. Chem., Vol.267, No.21, 1992年7月、14721-14729頁に記載されている。改変体は、軽鎖またはフラグメントとは異なるペプチド配列を有するが、それも小胞または形質膜結合タンパク質を切断し得る。改変体は、軽鎖またはそのフラグメントの挿入、欠失、および/または置換によって便利に得られる。下記の本発明の実施態様において、改変体配列は、(i)クロストリジウム毒素軽鎖もしくはフラグメントに対するN末端伸長、(ii)少なくとも1つのアミノ酸の変化で改変されたクロストリジウム毒素軽鎖もしくはフラグメント、(iii)クロストリジウム毒素軽鎖もしくはフラグメントに対するC末端伸長、または(iv)(i)〜(iii)の2つ以上の組み合わせを含む。
本発明のさらなる実施態様において、改変体は、(a)ポリペプチドのLCおよびHN成分の間にプロテアーゼ感受性領域が存在しないようにか、または(b)プロテアーゼ感受性領域が特定のプロテアーゼに対して特異的であるように改変されたアミノ酸配列を含む。この後者の実施態様は、特定の環境または細胞において軽鎖のエンドペプチダーゼ活性を活性化することが所望される場合、有用である。しかし、一般に、本発明のポリペプチドは、投与の前に活性化される。
第1のドメインは、好ましくは、SNAP-25、シナプトブレビン/VAMP、およびシンタキシンの1つ以上から選択される基質に対して特異的なエンドペプチダーゼ活性を示す。クロストリジウム毒素は、好ましくはボツリヌス毒素または破傷風毒素である。
以下の例に記載される本発明の実施態様において、毒素軽鎖、および毒素重鎖の部分は、ボツリヌス毒素A型のものである。以下の例に記載される本発明のさらなる実施態様において、毒素軽鎖、および毒素重鎖の部分は、ボツリヌス毒素B型のものである。ポリペプチドは、必要に応じて、1つの毒素型の軽鎖またはフラグメントまたは改変体、および別の毒素型の重鎖またはフラグメントまたは改変体を含む。
本発明によるポリペプチドにおいて、上記第2のドメインは、好ましくは、クロストリジウム毒素重鎖HN部分またはクロストリジウム毒素重鎖HN部分のフラグメントもしくは改変体を含む。それが、HNドメインの機能を保持する限り、フラグメントは、必要に応じて、N末端またはC末端または内部フラグメントである。その機能を担うHN内の領域の教示は、例えば、Biochemistry 1995, 34, 15175-15181頁、およびEur. J. Biochem, 1989, 185, 197-203頁において提供される。改変体は、HNドメインまたはフラグメントとは異なる配列を有するが、それもHNドメインの機能を保持する。改変体は、HNドメインまたはそのフラグメントの挿入、欠失、および/または置換によって便利に得られる。下記の本発明の実施態様において、改変体は、(i)HNドメインもしくはフラグメントに対するN末端伸長、(ii)HNドメインもしくはフラグメントに対するC末端伸長、(iii)少なくとも1つのアミノ酸の変化によるHNドメインもしくはフラグメントの改変、または(iv)(i)〜(iii)の2つ以上の組み合わせを含む。クロストリジウム毒素は、好ましくは、ボツリヌス毒素または破傷風毒素である。
本発明はまた、クロストリジウム神経毒軽鎖、およびクロストリジウム神経毒重鎖のN末端フラグメントを含むポリペプチドを提供し、フラグメントは好ましくは、フラグメントが相同アミノ酸残基の等価なアラインメントを有するように、少なくとも、ボツリヌス毒素A型の重鎖のN末端アミノ酸の423、ボツリヌス毒素B型の重鎖のN末端アミノ酸の417、または他の型のクロストリジウム毒素の重鎖のN末端アミノ酸の等価な数を含む。
従って、本発明のこれらのポリペプチドは、例えばジスルフィド架橋によって複合分子に連結された、2つ以上のポリペプチドからは構成されない。代わりに、これらのペプチドは、単一鎖であり、そして活性ではないか、またはそれらの活性は、神経毒エンドペプチダーゼ活性のインビトロアッセイにおいて有意に低減されている。
さらに、ポリペプチドは、トリプシンのようなタンパク質分解薬剤の作用による、エンドペプチダーゼ活性を示す形態への転換に感受性であり得る。このようにして、毒素軽鎖のエンドペプチダーゼ活性を制御することが可能である。
以下の例において記載される本発明の特定の実施態様において、クロストリジウム毒素重鎖のHCと称する部分を欠如するポリペプチドが提供される。天然に産生される毒素において見られるこの部分は、毒素のインターナリゼーションの前の毒素の細胞表面レセプターへの結合を担う。それゆえ、この特定の実施態様は、例えば、タンパク質分解酵素の作用によって、それが活性な毒素に転換され得ないように適合される。従って、本発明はまた、クロストリジウム毒素軽鎖、およびクロストリジウム毒素重鎖のフラグメントを含むポリペプチドを提供し、上記フラグメントはクロストリジウム毒素の中毒作用に関与する細胞表面レセプターへ結合し得ず、そしてそのようなポリペプチドがクロストリジウム毒素重鎖のHCと称するインタクトな部分を欠如することが好ましい。
本発明のさらなる実施態様において、クロストリジウム毒素軽鎖、およびクロストリジウム毒素重鎖のHNと称する部分を含むポリペプチドを含む組成物が提供され、そしてここで、組成物は、クロストリジウム毒素を含まず、そしてタンパク質分解酵素の作用によってクロストリジウム毒素に転換され得るいかなるクロストリジウム毒素前駆体も含まない。これらの組成物の例としては、毒素軽鎖、ならびにボツリヌス毒素A、B、C1、D、E、F、およびG型のHN配列を含む組成物が挙げられる。
本発明のポリペプチドは、所望される細胞への標的化のためのリガンドに結合するか、またはそれを含むように便利に適合される。ポリペプチドは、必要に応じて、例えば、免疫グロブリンに結合する配列を含む。適切な配列は、StaphylococcusのプロテインAのドメインB由来の縦列反復合成IgG結合ドメインである。次いで、免疫グロブリン特異性の選択は、ポリペプチド−免疫グロブリン複合体に対する標的を決定する。あるいは、ポリペプチドは、細胞表面レセプターへ結合する非クロストリジウム配列を含み、適切な配列は、インスリン様増殖因子(IGF-1)(これは、特定の細胞型上のその特異的レセプターに結合する)、およびコレラ毒素Aサブユニットのカルボキシ末端由来の14アミノ酸残基配列(これは、コレラ毒素Bサブユニットを結合し得、それゆえGM1ガングリオシドに結合し得る)を含む。従って、本発明によるポリペプチドは、必要に応じて、ポリペプチドの細胞への結合のために適合された第3のドメインをさらに含む。
第2の局面において、本発明は、(a)上記のような本発明のポリペプチドの、(b)クロマトグラフィーマトリックスへの結合のために、上記のクロマトグラフィーマトリックスを使用する融合タンパク質の精製を可能にするように、適合された第2のポリペプチドとの融合体を含む融合タンパク質を提供する。第2のポリペプチドをアフィニティーマトリックス(例えば、グルタチオンSepharose)に結合するように適合させ、細胞抽出物または上清のような不純供給源からの融合タンパク質の迅速な分離および精製を可能にすることが便利である。
1つの可能な第2の精製ポリペプチドは、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)であり、そして他は当業者に明らかとなり、従来の技術に従うクロマトグラフィーカラム上での精製を可能にするように選択される。
上記のように、本発明のポリペプチドの、例えばトリプシンを使用するタンパク質分解処理によって、処理されるポリペプチドのエンドペプチダーゼ活性を誘導することが可能である。本発明の第3の局面は、クロストリジウム毒素の誘導体を含む組成物を提供し、上記誘導体は、クロストリジウム毒素のエンドペプチダーゼ活性の少なくとも10%を保持し、上記誘導体はさらに、細胞表面レセプターへの結合のその不能に起因して、インビボにおいて非毒性であり、そしてここで、組成物は、インビボで毒性であるいかなる成分(例えば、毒素、またはさらなる毒素誘導体)も含まない。誘導体の活性は、好ましくは、天然毒素の活性に近づき、従って、好ましくは、天然毒素の少なくとも30%、および最も好ましくは少なくとも60%である。もちろん、組成物の全体のエンドペプチダーゼ活性はまた、存在する誘導体の量によって決定される。
Hcドメインを除去するために天然に生成されるクロストリジウム毒を処理することは公知であるが、この処置は調製物の毒性を完全に除去せず、その代わりいくらかの残留毒性活性が残存する。従って、この方法で処理された天然の毒素は、まだ完全に安全ではない。ポリペプチドの純粋な供給源の処理によって得られる、本発明の組成物は好都合に毒性を含まず、そして毒素アッセイにおけるポジティブコントロールとして、クロストリジウム毒素に対するワクチンとして、または組成物における残留毒素が存在しないことが必須である他の目的のために都合良く使用され得る。
本発明によって、組換え手段による本発明のポリペプチドおよび融合タンパク質の生成が可能になる。
本発明の第4の局面は、上記の本発明の任意の局面によるポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸を提供する。
本発明のこの局面の1つの実施態様において、ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードするように提供されるDNA配列は、天然のクロストリジウム配列由来ではないが、天然に予め存在しない人工的に得られた配列である。
以下のより詳細に記載される特定のDNA(配列番号1)は、ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする。これはボツリヌス毒素A型の残基1〜871をコードするヌクレオチドを含む。上記ポリペプチドは、軽鎖ドメインおよびボツリヌス毒素A型の重鎖のアミノ末端部分の最初の423アミノ酸残基を含む。この組換え生成物をLH423/A(配列番号2)と命名する。
本発明のこの局面の第2の実施態様において、ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードするDNA配列は、天然のクロストリジウム配列に由来するが、天然には見出されないポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする。
以下により詳細に記載される特定のDNA(配列番号19)は、ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードし、そしてボツリヌス毒素B型の残基1〜1171をコードするヌクレオチドを含む。上記ポリペプチドは、軽鎖ドメインおよびボツリヌス毒素B型重鎖のアミノ末端タンパク質の最初の728アミノ酸残基を含む。この組換え生成物をLH728/B(配列番号20)と命名する。
従って、本発明はまた、本発明の第3の局面のDNAを宿主細胞中で発現させる工程を包含する、ポリペプチドの製造の方法を提供する。宿主細胞(例えば、非クロストリジウム宿主)は、軽毒鎖と重毒鎖を分離するように本発明のポリペプチドまたは融合タンパク質を、適切に切断し得ない。
本発明は、上記の融合タンパク質をコードするDNAを宿主細胞中で発現させる工程、融合タンパク質を保持するように適合されたクロマトグラフィーカラムを通して溶出することによって融合タンパク質を精製する工程、融合タンパク質を置換するように適合されたリガンドを上記クロマトグラフィーカラムを通して溶出する工程、および融合タンパク質を回収する工程を包含する、ポリペプチドの製造の方法をさらに提供する。従って、実質的に純粋な融合タンパク質の生成が可能になる。同様に、融合タンパク質は、容易に切断され、本発明のポリペプチドを、同じく実質的に純粋な形態において生じる一方、第2ポリペプチドは同じ型のクロマトグラフィーカラムを使用して都合良く除去され得る。
二本鎖の天然の毒素から得られるLHN/Aは、重鎖のC末端側1/2、Hcドメインを除去するためにトリプシンを用いる延長した消化を必要とする。このドメインの欠如は、宿主標的細胞との相互作用を防ぐことによってインビボで毒素を効果的に不活化する。しかし、残留毒素活性が存在し、これは全A型神経毒の夾雑するトリプシン非感受性形態を示し得る。
対照的に、本発明の組換え調製物は、個別的な、規定された遺伝子コード配列の生成物であり、そして全長毒素タンパク質によって夾雑され得ない。さらに、E. coliから回収された生成物および他の組換え発現宿主から回収された生成物は、不活性な単一鎖ペプチドであるか、または発現宿主が、プロセシングされた活性なポリペプチドを生成する場合、それは毒素ではない。現在のインビトロペプチド切断アッセイによって評価されるLH423/Aのエンドペプチダーゼ活性は、全体として、トリプシンによる残基430と残基454との間の組換え分子の活性化に依存する。これらの2つの残基の間を切断する他のタンパク分解性酵素はまた、一般に、組換え分子の活性化に適切である。トリプシンは、アルギニンのC末端側のペプチド結合またはリジンのC末端側のペプチド結合を切断し、そしてこれらの残基が430〜454領域に見出され、そして曝露されているので、適切である(図12を参照のこと)。
本発明の組換えポリペプチドは、関連基質を発現する細胞に標的化するための潜在的な治療剤であるが、これはボツリヌス中毒症に有効であることを意味しない。例は、神経伝達物質の分泌が不適切または望ましくない場合であり得るか、あるいはニューロン細胞が、神経伝達物質以外の物質の調節された分泌に関して機能亢進性である場合であり得る。このような例において、天然の毒素のHcドメインの機能は、例えば、細胞レセプターリガンドおよび/または移行ドメインを提供する別の標的化配列によって置換され得る。
本発明の組換えポリペプチドの1つの適用は、治療分子の合成のための試薬成分(例えば、WO-A-94/21300に開示されている)としてである。組換え生成物はまた、食料品においてまたは環境上のサンプルにおいてのいずれかでの機能的ボツリヌス神経毒または破傷風神経毒の検出のためのインビトロアッセイの評価および開発についての非毒性標準としての適用を見出す(例えば、EP-A-0763131に開示されている)。
さらなる選択は、本発明のポリペプチドのC末端への、タンパク質起源および非タンパク質起源の両方の標的化リガンドへの特異的化学的結合を可能にするペプチド配列の付加である。
なおさらなる実施態様において、別の標的化リガンドは、本発明のポリペプチドN末端に付加される。推定トリプシン感受性領域のLCのC末端でおよび完全なタンパク質生成物の最C末端で操作された特異的プロテアーゼ切断部位を有する組換えLHN誘導体が示されている。これらの部位は、組換え生成物の活性化特異性を増強し、その結果二本鎖種がトリプシンの使用より予測可能な性質のタンパク分解切断によって活性化され得る。
天然のBoNT/Aから酵素的に生成されたLHNは、効果的な免疫原であり、従って任意の全長神経毒から完全に別離した組換え形態は、ワクチン成分を示す。組換え生成物は、上記の任意の領域を支持する規定されたタンパク質修飾を作製するための基礎試薬として役立ち得る。
組換え構築物は、それらのアミノ酸配列長ならびにそれらの軽鎖(L-鎖、L)および重鎖(H-鎖、H)内容に基づいて識別名を割り当てられる。なぜなら、それらはパブリックドメインにおける翻訳されたDNA配列(すなわち、具体的には配列番号2および配列番号20)に関連するからである。命名「LH」の後ろに「/X」が続く。ここで「X」は、対応するクロストリジウム毒血清型またはクラス(例えば、ボツリヌス神経毒A型については「A」または破傷風毒素については「TeTx」)を示す。天然の毒素ポリペプチドの配列由来の配列改変体は、標準的な形式で括弧内(すなわち、天然の配列の残基の前に付けられ、そして改変体の残基の後ろに付けられる残基位置番号)に与えられる。
前に付ける下付きの数字は、翻訳された配列に対するアミノ末端(N末端)伸長(または、マイナスの場合は欠失)を示す。同様に、後ろにつける下付きの数字は、カルボキシル末端(C末端)伸長(またはマイナスの数字が使用される場合は欠失)を示す。特定の配列挿入物(例えば、プロテアーゼ切断部位)は、略語を使用して示される。例えば、第Xa因子は、FXaに略される。L鎖のC末端の後ろにつくものおよびH鎖のN末端の前に付くものは「/」によって分けられ、L鎖とH鎖との間の推定接合点を示す。操作されたリガンド配列についての略語は、翻訳産物におけるそれらの位置に対応するクロストリジウムのL鎖またはH鎖の前または後ろに付けられる。
この命名法に従って、
LH423/A = 配列番号2、これはボツリヌス神経毒A型の全L鎖およびH鎖の423アミノ酸を含む;
2LH423/A = この分子の改変体、これはL鎖のN末端の2アミノ酸の伸長を含む;
2L/2H423/A = この分子がL鎖およびH鎖の両方のN末端上に2アミノ酸伸長を含むさらなる改変体;
2LFXa/2H423/A = L鎖のN末端に2アミノ酸伸長およびL鎖のC末端に第Xa因子切断配列(第Xa因子を用いるこの分子の切断後、H鎖成分に2アミノ酸N末端伸長を残す)を含むさらなる改変体;および
2LFXa/2H423/A-IGF-1 = H鎖にさらなるC末端伸長(本例においては、インスリン様増殖因子1(IGF-1)配列)を有するこの分子の改変体。
ここで、以下は、図面によって例示される、本発明の特定の実施態様の説明がである:
図1は、ボツリヌス神経毒A型(BoNT/A)のドメイン構造の模式図を示す;
図2は、LH423/Aと命名された本発明の実施態様についての遺伝子のアセンブリの模式図を示す;
図3は、インビトロペプチド切断アッセイにおける天然の毒素、トリプシン生成「天然」LHN/A、および2LH423/A(Q2E,N26K,A27Y)と命名された本発明の実施態様の活性を比較するグラフである;
図4は、天然の毒素の公開された配列における最初の33アミノ酸と本発明の実施態様との比較である;
図5は、L/4H423/Aと命名された本発明の実施態様の移行領域を示す。これはHN配列のN末端に4アミノ酸の挿入を示す;Eco 47 III制限エンドヌクレアーゼ切断部位によってコードされるアミノ酸に記しを付け、次いでHN配列がALN...で始まる;
図6は、LFXa/3H423/Aと命名した本発明の実施態様の移行領域を示す。これは、L鎖のC末端の第Xa因子切断部位およびH配列のN末端でコードされる3つのさらなるアミノ酸の挿入を示す;切断活性化HNのN末端アミノ酸はシステインである;
図7は、融合タンパク質、LFXa/3H423/A-IGF-1と命名した本発明の実施態様のアミノ酸配列のC末端部分を示す;IGF-1配列は、G882位で始まる;
図8は、融合タンパク質、LFXa/3H423/A-CtxA14と命名された本発明の実施態様のアミノ酸配列のC末端部分を示す;C末端CtxA配列は、Q882位で始まる;
図9は、融合タンパク質LFXa/3H423/A-ZZと命名された本発明の実施態様のアミノ酸配列のC末端部分を示す;C末端ZZ配列は、genenase認識部位(下線付き)の直ぐ後ろのA890位で始まる。
図10および11は、本発明のポリペプチドの操作の模式図を示す;図10は、アフィニティー精製ペプチドのN末端付加(この場合では、GST)およびIg結合ドメインのC末端付加を有するLH423/Aを示す;プロテアーゼ切断部位R1、R2、およびR3は、ドメインの選択的酵素的分離を可能にする;図11は、プロテアーゼ切断部位R1、R2、およびR3ならびにC末端融合ペプチド配列の具体的な実施例を示す;
図12は、本発明のポリペプチドのトリプシン感受性活性化領域を示す。
図13は、E. coliから発現された組換えLH107/Bのウェスタンブロット分析を示す;パネルAは抗BoNT/B抗血清を用いてプローブされた;レーン1、分子量標準;レーン2および3、天然のBoNT/B;レーン4、免疫精製したLH107/B;パネルBは、抗T7ペプチドタグ抗血清を用いてプローブされた;レーン1、分子量標準;レーン2および3、ポジティブコントロールE.coli T7発現;レーン4、免疫精製したLH107/B。
本出願に添付される配列表は以下の配列を含む:
実施例1
2616塩基対、二本鎖遺伝子配列(配列番号1)を、合成DNA、染色体DNA、およびポリメラーゼ連鎖反応産生DNAの組み合わせからアセンブリした(図2)。この遺伝子は、ボツリヌス神経毒A型の全軽鎖(LC、448アミノ酸)および重鎖(Hc)のアミノ末端の423残基に対応する871アミノ酸残基のポリペプチドをコードする。この組換え生成物を、LH423/Aフラグメントと命名する(配列番号2)。
組換え生成物の構築
組換え遺伝子の最初の918塩基対を、短いオリゴヌクレオチドの連結によって合成し、E. coliコドン偏向を有するコード配列を生成した。この領域の両DNA鎖を、リン酸化し、アニールし、そして連結した短い重複オリゴヌクレオチドとして完全に合成し、独特のKpnI制限部位で終わる全合成領域を生成した。LH423/Aコード配列の残りの部分は、Clostridium botulinum由来の全染色体DNAからPCR増幅し、そして遺伝子の合成部分にアニールさせた。
次いで、内部PCR増幅生成物配列を欠失させ、そしてC. botulinum染色体起源のクローン由来の天然の、完全に配列決定された領域と置換し、最終的な遺伝子構築物を生成した。最終的な組成は、合成DNA(塩基1〜913)、ポリメラーゼ増幅DNA(塩基914〜1138ならびに塩基1976〜2616)、および残りはC. botulinum染色体起源のものである(塩基1139〜1975)である。次いで、アセブリされた遺伝子を、完全に配列決定し、そして発現分析のために種々のE. coliプラスミドベクターにクローン化した。
組換え遺伝子の発現およびタンパク質産物の回収
DNAは、E.coliにおいて、推定分子量99,951ダルトンの可溶性の単鎖ポリペプチドを産生する単一核酸転写物として発現される。遺伝子は、ここでは、Schistosoma japonicumのグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)の市販のコード配列との融合物として、E.coliにおいて発現されるが、広範な組換え遺伝子発現ベクター(例えば、pEZZ18、pTrc99、pFLAGまたはpMALシリーズ)のいずれもが、適切な条件下で他の原核生物宿主または真核生物宿主(例えば、グラム陽性桿菌、酵母P.pastoris、または昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞)において発現され得るように等しく有効であり得る。
ここでは、発現構築物を有するE.coliを、Luria-Bertaniブロス(10g/lバクト-トリプトン、5g/lバクト-酵母抽出物および10g/l塩化ナトリウムを含有するL-ブロス(pH7.0))において37℃にて、細胞密度(バイオマス)が600nmで0.4〜0.6の吸光度を有し、そして細胞が対数増殖中期になるまで増殖させる。次いで、遺伝子の発現を、イソプロピルチオ-β-D-ガラクトシダーゼ(IPTG)を最終濃度0.5mMまで添加することによって誘導する。組換え遺伝子発現を、25℃の低下させた温度にて90分間進行させる。次いで、細胞を遠心分離により採取し、10mM Na2HPO4、0.5M NaCl、10mM EGTA、0.25%Tweenを含有する緩衝溶液(pH7.0)中に再懸濁し、次いで−20℃で凍結した。組換えタンパク質の抽出のために、細胞を超音波処理によって破壊する。次いで、細胞抽出物から遠心分離によってデブリを取り除き、可溶性組換え融合タンパク質(GST-LH423/A)を含む明澄化された上清液を、精製まで−20℃で保存する。ある割合の組換え物質は、超音波処理手順によって遊離されず、このことはおそらく不溶性または封入体形成を反映する。ここでは、本発明者らは、分析のためにこの物質を抽出していないが、所望であれば、これは、当業者に公知の方法を用いて容易に達成され得る。
組換えGST-LH423/Aを、商業的に調製されたグルタチオンセファロースのアフィニティーマトリックス上への吸着および続く還元グルタチオンでの溶出により精製する。次いで、GSTアフィニティー精製マーカーをタンパク質分解的切断およびグルタチオンセファロースへの再吸着によって除去し、組換えLH423/Aを非吸着物質中に回収する。
構築物改変体
この分子の改変体LH423/A(Q2E、N26K、A27Y)(配列番号26)を生成した。この改変体では、3つのアミノ酸残基が、LH423/Aの軽鎖内で改変されており、BoNT/Aの軽鎖の公開されたアミノ酸配列のポリペプチドとは異なる軽鎖配列を含むポリペプチドを産生する。
発現させ、かつ対応する産物を精製した遺伝子配列の2つのさらなる改変体は、23LH423/A(Q2E、N26K、A27Y)(配列番号4)(これは、BoNT/Aの推定のネイティブL鎖と比較して、23アミノ酸のN末端伸長を有する)および2LH423/A(Q2E、N26K、A27Y)(配列番号6)(これは、2アミノ酸のN末端伸長を有する)である(図4)。
さらに別の改変体では、(配列番号1)に示された遺伝子配列のヌクレオチド1344と1345との間にEco 47 III制限部位を含む遺伝子を生成した。この改変は、ネイティブな神経毒において重鎖および軽鎖の境界面を表す遺伝子中の位置に制限部位を提供し、そして当業者に公知の標準的な制限酵素方法を用いてこの点に挿入をなす能力を提供する。多数の制限部位のいずれかを同様に用い得ること、およびEco 47 III挿入はこのアプローチを単に例示するのみであることもまた当業者に明らかである。同様に、記載されるような様式での制限部位の挿入が本発明のいずれの遺伝子に対しても実施され得ることが、当業者に明らかである。記載の遺伝子は、発現されるとき、ポリペプチドL/4H423/A(配列番号10)をコードする。このポリペプチドは、ネイティブのBoNT/Aの重鎖のアミノ末端に等価な位置のLH423/Aのアミノ酸448と449との間にさらなる4つのアミノ酸を含む。
遺伝子の改変体LFXa/3H423/A(配列番号12)(これには、特異的タンパク質分解的切断部位が軽鎖ドメインのカルボキシ末端、具体的にはL/4H423/Aの残基448の後に組み込まれた)を発現させた。組み込まれた切断部位は、第Xa因子プロテアーゼに対するものであり、そして配列番号1の改変によってコードされた。別の特定のプロテアーゼに対する切断部位が同様に組み込まれ得ること、および必要とされる切断部位をコードする任意の遺伝子配列が用いられ得ることは、当業者に明らかである。規定のプロテアーゼ部位をコードする遺伝子配列のこのような様式での改変は、本発明のいずれの遺伝子に対しても実施され得る。
LFXa/3H423/Aの改変体を構築した。この改変体では、特異的結合活性をポリペプチドに組み込む第三のドメインがポリペプチドのカルボキシ末端に存在する。
記載の具体例は、以下の通りである:
(1)LFXa/3H423/A-IGF-1(配列番号14)、ここで、カルボキシ末端ドメインは、インスリン様成長因子-1(IGF-1)の配列と等価な配列を有し、そして高い親和性でインスリン様成長因子レセプターに結合し得る;
(2)LFXa/3H423/A-CtxA14(配列番号16)、ここで、カルボキシ末端ドメインは、コレラ毒素のAサブユニット(CtxA)のカルボキシ末端由来の14アミノ酸の配列に等価な配列を有し、そしてこのことによりコレラ毒素Bサブユニット五量体と相互作用し得る;および
(3)LFXa/3H423/A-ZZ(配列番号18)、ここで、カルボキシ末端ドメインは、縦列反復合成IgG結合ドメインである。この改変体はまた、本発明に適用され得る別の改変、すなわち、クロストリジウム重鎖配列の末端と結合リガンドをコードする配列との間に位置するプロテアーゼ切断部位をコードする配列の遺伝子中への含有を例示する。詳細には、本実施例では、ゲネナーゼ(genenase)切断部位をコードする配列が、ヌクレオチド2650〜2666に挿入される。この遺伝子の発現は、HN機能を提供するドメインと結合ドメインとの間の境界面に、所望のプロテアーゼ感受性を有するポリペプチドを産生する。このような改変は、関連プロテアーゼでのポリペプチドの処理によるC末端結合ドメインの選択的除去を可能にする。
多数のこのような結合ドメインのいずれかもが本発明のポリペプチド配列に組み込まれ得ること、および上記の例がその概念を単に例示するためのみであることは明らかである。同様に、このような結合ドメインは、本発明の基礎であるポリペプチド配列のいずれにも組み込まれ得る。さらに、このような結合ドメインは、本発明のポリペプチド分子内の任意の適切な位置に組み込まれ得ることに留意されるべきである。
従って、本発明のさらなる実施態様は、所望の位置に所望の制限エンドヌクレアーゼ部位をさらに含む本発明のDNAによって、および所望の位置に所望のプロテアーゼ切断部位をさらに含む本発明のポリペプチドによって例示される。
制限エンドヌクレアーゼ部位は、本発明のポリペプチドを発現させるための発現ベクターの製造において、DNAのさらなる操作を容易にするように導入され得る。制限エンドヌクレアーゼ部位は、DNAの製造における事前の工程の結果として導入され得る。制限エンドヌクレアーゼ部位は、既知の配列の挿入、置換、または欠失による改変によって導入され得る。DNAの改変の結果は、アミノ酸配列が変更しないものであり得るか、またはアミノ酸配列が変更する(例えば、所望のプロテアーゼ切断部位の導入を生じる)ものであり得るが、いずれにしても、ヘポリペプチドは、本発明によって必要とされる特性を有する第一ドメインおよび第二ドメインを保持する。
図10は、本実施例に記載の特徴を例示する発現産物の模式図である。詳細には、図10は、ボツリヌス神経毒タイプAの軽鎖に等価なドメインおよびボツリヌス神経毒タイプAの重鎖のHNドメインに等価なドメインを、アフィニティー精製ドメインを提供するN末端伸長(すなわちGST)およびリガンド結合ドメインを提供するC末端伸長(すなわちIgG結合ドメイン)と共に組み込む単一ポリペプチドを例示する。ポリペプチドのドメインは、図中に例示されるように、ドメインの選択的酵素性分離を可能にする特異的プロテアーゼ切断部位によって空間的に分離されている。この概念は、図11においてより詳細に図示され、ここでは、種々のプロテアーゼ感受性が例示のために規定される。
産物活性のアッセイ
ボツリヌス神経毒タイプAのLCは、シナプス小胞結合タンパク質SNAP-25に対して亜鉛依存性エンドペプチダーゼ活性を発揮する。この亜鉛依存性エンドペプチダーゼは、シナプス小胞結合タンパク質SNAP-25を単一のペプチド結合にて特異的様式で切断する。2LH423/A(Q2E、N26K、A27Y)(配列番号6)は、合成SNAP-25基質をインビトロでネイティブ毒素と同じ条件下で切断する(図3)。従って、2LH423/A(Q2E、N26K、A27Y)のポリペプチド配列の、ネイティブ配列に対する、最小の機能的LCドメイン内の改変は、LCドメインの機能的活性を妨害しない。
この活性は、単鎖ポリペプチド産物をジスルフィド結合二鎖種に変換する、組換えGST-2LH423/A(Q2E、N26K、A27Y)のタンパク質分解的改変に依存する。これは、ここでは、タンパク質分解酵素トリプシンを用いてなされる。組換え産物(100〜600μg/ml)を、140mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4を含有する溶液(pH7.3)中でトリプシン(10μg/ml)と共に37℃にて10〜50分間インキュベートする。反応を100倍モル過剰のトリプシンインヒビターの添加によって終結させる。トリプシンによる活性化は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびポリクローナル抗ボツリヌス神経毒タイプA抗血清を用いる免疫ブロッティング分析により決定されるように、ジスルフィド結合二鎖種を生成する。
2LH423/Aは、23LH423/Aより、トリプシンの存在下で安定であり、そしてインビトロペプチド切断アッセイにおいて活性である。しかし、両改変体とも、インビトロペプチド切断アッセイにおいて十分に機能的である。このことは、組換え分子がN末端アミノ酸伸長に寛容であることを実証し、そしてこれは、当業者に明らかなように、他の化学部分または有機部分にも拡張され得る。
実施例2
本発明のさらなる例示として、ボツリヌス神経毒タイプBの軽鎖全体、および重鎖のアミノ末端由来の種々の数の残基に対応するポリペプチドをコードする多数の遺伝子配列が組み立てられている。開示のこの例示において、組み立てられた遺伝子配列は、染色体DNAとポリメラーゼ連鎖反応生成DNAとの組み合わせから得た。従って、この遺伝子配列は、天然遺伝子の等価な領域のヌクレオチド配列を有する。よって、この開示の物質は天然遺伝子配列および合成遺伝子配列に基づき得るという原理を例示する。
本実施例に関する遺伝子配列は全て、Sambrook J、Fritsch E FおよびManiatis T(1989)Molecular Cloning: A Laboratory Manual(第2版)、Ford N、Nolan C、Ferguson MおよびOckler M(編)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New Yorkに詳述されるような方法、および当業者に公知の方法を用いて組み立て、そして発現させた。
神経毒タイプBの軽鎖全体(443アミノ酸)、および重鎖のアミノ末端由来の728残基に対応する1171アミノ酸のポリペプチドをコードする遺伝子を組み立てた。この遺伝子の発現は、ポリペプチドLH728/B(配列番号20)を生じ、このポリペプチドは、完全長BoNT/Bの特異的神経結合活性を欠く。
改変体ポリペプチドLH417/B(配列番号22)をコードする遺伝子もまた組み立てた。このポリペプチドは、ネイティブLHN/Aにおける重鎖フラグメントのカルボキシ末端のアミノ酸配列とアミノ酸相同性により等価である、カルボキシ末端のアミノ酸配列を有する。
改変体ポリペプチドLH107/B(配列番号24)をコードする遺伝子もまた組み立てた。このポリペプチドは、発現ポリペプチドの可溶性を維持するに十分な、BoNT/Bの重鎖のアミノ末端由来の短い配列を、カルボキシ末端に発現する。
構築物改変体
配列番号21に示す遺伝子の最初の274塩基をコードする配列の改変体を生成した。このコード配列は、ネイティブでないヌクレオチド配列であるが、なおネイティブなポリペプチドをコードしている。
2つの二本鎖(268塩基対および951塩基対)の遺伝子配列を、重複プライマーPCRストラテジーを用いて作成した。これらの配列のヌクレオチドの偏りをE.coliのコドン使用頻度の偏りを有するように設計した。
第一の配列については、ボツリヌス毒素タイプBのネイティブ配列の最初(5’側)の268ヌクレオチドを表す6つのオリゴヌクレオチドを合成した。第二の配列については、ボツリヌス毒素タイプBのネイティブ配列の内部配列ヌクレオチド691〜1641を表す23のオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチドは、長さが57〜73ヌクレオチドの範囲であった。重複領域(17〜20ヌクレオチド)は、52〜56℃の範囲の融解温度を与えるように設計した。さらに、ネイティブ配列の正確に対応する領域へのこれらの産物の挿入を容易にするように、合成産物の末端制限エンドヌクレアーゼ部位を構築した。268bpの5’合成配列を、元の最初の268塩基の代わりに、配列番号21に示す遺伝子に組み込んだ(そして、これを配列番号27に示す)。同様に、この配列は、本実施例の他の遺伝子に挿入され得る。配列番号21のヌクレオチド691〜1641に等価であり、かつネイティブなポリペプチド配列をコードするがネイティブでないコドン使用頻度を用いる、別の改変体配列を、内部合成配列を用いて構築した。この配列(配列番号28)は、単独または他の改変体配列と組み合わせて、本実施例の任意の遺伝子における等価なコード配列の代わりに組み込まれ得る。
実施例3
本発明の有用性の例示は、非毒性で有効な免疫原としてである。組換え単鎖物質の非毒性の性質は、マウスにおけるGST-2LH423/Aの腹腔内投与によって実証された。ポリペプチドを上記のように調製および精製した。最終調製物中の免疫反応性物質の量を、ネイティブLHN/A上のコンホメーション依存性エピトープに対して反応性であるモノクローナル抗体(BA11)を用いて酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって決定した。組換え物質を、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS;NaCl8g/l、KCl 0.2g/l、Na2HPO4 1.15g/l、KH2PO4 0.2g/l、pH7.4)中に系列希釈し、そして0.5ml容量を、4匹マウスからなる3群に、各マウス群がそれぞれ10、5および1μgの物質を投与されるように注射した。マウスを4日間観察し、死亡は見られなかった。
免疫のために、フロイント完全アジュバント(初回注射のみ)またはフロイント不完全アジュバントを用いる1.0ml容量の水中油エマルジョン(1:1容量比)中の20μgのGST-2LH423/Aを、2箇所の背部皮下注射によりモルモットに投与した。10日間隔の3回の注射を与え(1日目、10日目および20日目)、そして抗血清を30日目に採集した。抗血清は、ELISAによって、ネイティブなボツリヌス神経毒タイプAおよびその誘導体LHN/Aに対して免疫反応性であることが示された。1:2000希釈でボツリヌス神経毒反応性である抗血清を、マウスにおいて中和効力の評価のために用いた。中和アッセイのために、0.1mlの抗血清を、0.5μg(5×10-6g)〜5ピコグラム(5×10-12g)の希釈範囲で含むように、2.5mlのゼラチンリン酸緩衝液(GPB;Na2HPO4(無水)10g/l、ゼラチン(Difco)2g/l、pH6.5〜6.6)に希釈した。0.5mlのアリコートをマウスに腹腔内投与し、4日間にわたって死亡を記録した。結果を表1および表2に示す。0.5mlの1:40希釈抗GST-2LH423/A抗血清が、5pg〜50ngの範囲のボツリヌス神経毒での腹腔内チャレンジに対してマウスを保護し得る(1〜10,000マウスLD50;1マウスLD50=5pg)ごとが明らかに理解され得る。
実施例4
E.coliにおける組換えLH107/Bの発現
ボツリヌス神経毒タイプA以外の血清型のクロストリジウム神経毒のLHNをコードする核酸の発現の例示として、ポリペプチドLH107/B(配列番号24)をコードする核酸配列(配列番号23)を市販のプラスミドpET28a(Novogen、Madison、WI、USA)に挿入した。核酸をE.coli BL21(DE3)(New England BioLabs、Beverley、MA、USA)において、N末端T7隔合ペプチドとの融合タンパク質として、1mMで37℃にて90分間のIPTG誘導下で発現させた。培養物を採取し、そして組換えタンパク質をLH423/Aについて前述したように抽出した。
組換えタンパク質を回収し、T7タグ精製キット(New England bioLabs、Beverley、MA、USA)を用いた固定化抗T7ペプチドモノクローナル抗体への免疫アフィニティ吸着により、細菌ペースト状溶解物から精製した。精製組換えタンパク質をグラジエント(4〜20%)変性SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(Novex、San Diego、CA、USA)、およびポリクローナル抗ボツリヌス神経毒タイプ抗血清または抗T7抗血清を用いるウェスタンブロッティングによって分析した。ウェスタンブロッティング試薬はNovexから入手し、免疫染色したタンパク質をAmersham製の増強化学発光システム(Enhanced Chemi-Luminescence system;ECL)を用いて可視化した。抗T7抗体および抗ボツリヌス神経毒タイプB抗血清に反応性である組換え産物の発現を図13に示す。
組換え産物は、可溶性であり、そしてエンドペプチダーゼ活性を担う軽鎖の一部を保持した。
従って、本発明は、とりわけ、免疫原、酵素標準およびWO-A-94/21300に記載の分子の合成における成分として有用な組換えポリペプチドを提供する。
配列表
(1)一般的情報:
(i)出願人:
(A)名称:マイクロバイオロジカル リサーチ オーソリティー
(B)番地:センター フォー アプライド マイクロバイオロジー アンド リサーチ,ポートン ダウン
(C)市:サリルズバリー
(D)州:ウィルトシャイアー
(E)国:イギリス
(F)郵便番号:SP4 OJG
(A)名称:ザ スペイウッド ラボラトリ リミテッド
(B)番地:ケンジントン スクウエア 14
(C)市:ロンドン
(E)国:イギリス
(F)郵便番号:W8 5HH
(A)名称:フォスター;ケイス アラン
(B)番地:センター フォー アプライド マイクロバイオロジー アンド リサーチ,ポートン ダウン
(C)市:サリスバリー
(D)州:ウィルトシャイアー
(E)国:イギリス
(F)郵便番号:SP4 OJG
(A)名称:クイン;コンラド パドレイグ
(B)番地:センター フォー アプライド マイクロバイオロジー アンド リサーチ,ポートン ダウン
(C)市:サリスバリー
(D)州:ウィルトシャイアー
(E)国:イギリス
(F)郵便番号:SP4 OJG
(A)名称:ショーン クリフォード チャールズ
(B)番地:センター フォー アプライド マイクロバイオロジー アンド リサーチ,ポートン ダウン
(C)市:サリスバリー
(D)州:ウィルトシャイアー
(E)国:イギリス
(F)郵便番号:SP4 OJG
(ii)発明の名称:組換え毒素フラグメント
(iii)配列数:28
(v)コンピューター読み出し形態:
(A)媒体型:フロッピーディスク
(B)コンピューター:IBM PC互換用
(C)OS:PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア:パテントイン リリース#1.0,バージョン#1.30(EPO)
(2)配列番号1の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:2616塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:CDS
(B)存在位置:1..2616
(xi)配列:配列番号1:
(2)配列番号2の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:872アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:配列番号2:
(2)配列番号3の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:2685塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:CDS
(B)存在位置:1..2685
(xi)配列:配列番号3:
(2)配列番号4の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:895アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:配列番号4:
(2)配列番号5の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:2622塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:CDS
(B)存在位置:1..2622
(xi)配列:配列番号5:
(2)配列番号6の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:874アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:配列番号6:
(2)配列番号7の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:2613塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:CDS
(B)存在位置:1..2613
(xi)配列:配列番号7:
(2)配列番号8の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:871アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:配列番号8:
(2)配列番号9の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:2628塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:CDS
(B)存在位置:1..2628
(xi)配列:配列番号9:
(2)配列番号10の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:876アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:配列番号10:
(2)配列番号11の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:2637塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:CDS
(B)存在位置:1..2637
(xi)配列:配列番号11:
(2)配列番号12の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:879アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:配列番号12:
(2)配列番号13の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:2862塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:CDS
(B)存在位置:1..2862
(xi)配列:配列番号13:
(2)配列番号14の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:954アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:配列番号14:
(2)配列番号15の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:2724塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:CDS
(B)存在位置:1..2724
(xi)配列:配列番号15:
(2)配列番号16の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:908アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:配列番号16:
(2)配列番号17の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:3042塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:CDS
(B)存在位置:1..3042
(xi)配列:配列番号17:
(2)配列番号18の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:1014アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:配列番号18:
(2)配列番号19の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:3509塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:CDS
(B)存在位置:1..3509
(xi)配列:配列番号19:
(2)配列番号20の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:1169アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:配列番号20:
(2)配列番号21の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:2574塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:CDS
(B)存在位置:1..2574
(xi)配列:配列番号21:
(2)配列番号22の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:858アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:配列番号22:
(2)配列番号23の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:1644塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:CDS
(B)存在位置:1..1644
(xi)配列:配列番号23:
(2)配列番号24の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:548アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:配列番号24:
(2)配列番号25の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:2616塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:CDS
(B)存在位置:1..2616
(xi)配列:配列番号25:
(2)配列番号26の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:872アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:配列番号26:
(2)配列番号27の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:2574塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(xi)配列:配列番号27:
(2)配列番号28の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:2574塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(genomic)
(xi)配列:配列番号28:
Claims (45)
- 第1のドメインおよび第2のドメインを含むポリペプチドであって、該ポリペプチドは、クロストリジウム神経毒のインタクトなHcを欠く単鎖ポリペプチドであり、ここで、
該第1のドメインはクロストリジウム神経毒軽鎖であり、
該第1のドメインは、1つ以上の、エキソサイトーシスに必須な小胞または形質膜結合タンパク質を切断することができる、第1のドメイン;
該第2のドメインは、クロストリジウム神経毒重鎖H N であり、
(i)細胞中へ該ポリペプチドを輸送することができるか、
(ii)該第1のドメイン単独の溶解性に比較して該ポリペプチドの溶解性を増大させることができるか、または
(iii)細胞中へ該ポリペプチドを輸送することができ、かつ該第1のドメイン単独の溶解性に比較して該ポリペプチドの溶解性を増大させることができる、第2のドメイン
であり、
該第1のドメインは、
(a)配列番号2もしくは20に記載されるアミノ酸配列のN末端に由来するか、または
(b)該(a)において、1もしくは数個のアミノ酸が置換、付加もしくは欠失を有し、かつエキソサイトーシスに必須な1もしくは数個の小胞または形質膜結合タンパク質を切断することができ;
該第2のドメインは、
(a)配列番号2もしくは20に記載されるアミノ酸配列のC末端に由来するか、または
(b)該(a)において、1もしくは数個のアミノ酸が置換、付加もしくは欠失を有し、かつ上記(i)、(ii)もしくは(iii)ができる、
ポリペプチド。 - 前記クロストリジウム毒素がボツリヌス毒素である、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記第1のドメインが、SNAP-25、シナプトブレビン/VAMP、およびシンタキシンの1つ以上から選択される基質に対して特異的なエンドペプチダーゼ活性を示す、請求項1または2に記載のポリペプチド。
- H N と称する前記クロストリジウム神経毒重鎖部分が、ボツリヌス毒素に由来する、請求項1に記載のポリペプチド。
- 第3のドメインの直接細胞への結合によるか、または第3のドメインの細胞に結合するリガンド(単数または複数)への結合により、前記ポリペプチドが細胞へ結合する第3のドメインをさらに含む、請求項1〜4のいずれかに記載のポリペプチド。
- 前記第3のドメインが前記ポリペプチドの免疫グロブリンへの結合のためである、請求項5に記載のポリペプチド。
- 前記第3のドメインがStaphylococcusのプロテインAのドメインβ由来の縦列反復合成IgG結合ドメインである、請求項6に記載のポリペプチド。
- 前記第3のドメインが細胞表面レセプターに結合するアミノ酸配列を含む、請求項5に記載のポリペプチド。
- 前記第3のドメインがインスリン様増殖因子-1(IGF-1)である、請求項8に記載のポリペプチド。
- 前記第1のドメインが、ボツリヌス毒素軽鎖を含み、かつ第2のドメインが、ボツリヌス毒素重鎖のH N を含む、請求項1〜9のいずれかに記載のポリペプチド。
- (a)配列番号2のN末端に由来する前記毒素軽鎖、および(b)配列番号2のC末端に由来する前記毒素重鎖の一方または両方がボツリヌス毒素A型のものである、請求項10に記載のポリペプチド。
- 前記ボツリヌス毒素A型軽鎖改変体が、配列番号4、6または26の、残基2においてグルタミン酸を、残基26においてリジンを、そして残基27においてチロシンを有する、請求項11に記載のポリペプチド。
- (a)配列番号20のN末端に由来する前記毒素軽鎖、および(b)配列番号20のC末端に由来する前記毒素重鎖の一方または両方がボツリヌス毒素B型のものである、請求項10に記載のポリペプチド。
- 前記第1のドメインが、ボツリヌス毒素軽鎖を含み、かつ第2のドメインが、配列番号2、4、6、10、12、14、16、18、20、22、24もしくは26に記載の、ボツリヌス毒素重鎖の少なくとも100のN末端アミノ酸を含む、請求項1〜9のいずれかに記載のポリペプチド。
- ボツリヌス毒素B型軽鎖、および配列番号24に記載のボツリヌス毒素B型重鎖の107のN末端アミノ酸を含む、請求項14に記載のポリペプチド。
- 配列番号2、4、6、10、12、14、16、18もしくは26に記載の、ボツリヌス毒素A型重鎖の少なくとも423のN末端アミノ酸を含む、請求項11または12に記載のポリペプチド。
- ボツリヌス毒素A型軽鎖、および配列番号2に記載のボツリヌス毒素A型重鎖の423のN末端アミノ酸を含む、請求項16に記載のポリペプチド。
- 配列番号20もしくは22に記載のボツリヌス毒素B型重鎖の少なくとも417のN末端アミノ酸を含む、請求項13に記載のポリペプチド。
- ボツリヌス毒素B型軽鎖、および配列番号22に記載のボツリヌス毒素B型重鎖の417のN末端アミノ酸を含む、請求項18に記載のポリペプチド。
- ボツリヌス毒素重鎖のHCと称する部分を欠如する、請求項10〜19のいずれかに記載のポリペプチド。
- 前記第2のドメインが細胞表面レセプターに結合しない、請求項1〜4のいずれかに記載のポリペプチド。
- クロストリジウム毒素を含み、そしてタンパク質分解酵素による切断のための部位をさらに含み、該切断部位は天然の毒素中には存在しない、請求項1〜21のいずれかに記載のポリペプチド。
- クロストリジウム毒素軽鎖を含み、そしてタンパク質分解酵素による切断のための部位をさらに含み、該切断部位は天然の毒素軽鎖中には存在しない、請求項22に記載のポリペプチド。
- H N と称するクロストリジウム毒素重鎖部分を含み、そしてタンパク質分解酵素による切断のための部位をさらに含み、該切断部位は天然のH N と称する毒素重鎖部分中には存在しない、請求項22または23に記載のポリペプチド。
- 前記切断部位をコードする1つ以上のヌクレオチドを導入するような、前記ポリペプチドをコードするDNAの改変によって得られる、請求項22〜24のいずれかに記載のポリペプチド。
- (a)請求項1〜25のいずれかに記載のポリペプチドの、(b)第2のポリペプチドとの融合体を含む融合タンパク質であって、該第2ポリペプチドが、アフィニティーマトリックスを使用する融合タンパク質の精製を可能にするように、該アフィニティーマトリックスへ結合するポリペプチドまたはオリゴペプチドである、融合タンパク質。
- 前記第2のポリペプチドが、クロマトグラフィーカラムへ結合する、請求項26に記載の融合タンパク質。
- 前記クロマトグラフィーカラムが、グルタチオンSepharoseのアフィニティーマトリックスである、請求項27に記載の融合タンパク質。
- 前記特異的プロテアーゼ切断部位が、前記第1および第2のポリペプチドの間に組み込まれ、該プロテアーゼ部位が、該第1および第2のポリペプチドのタンパク質分解的分離を可能にする、請求項26〜28のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 請求項1〜25に記載のポリペプチドまたは請求項26〜29のいずれかの記載の融合タンパク質、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物であって、該組成物がインビボで非毒性である、組成物。
- 毒素アッセイにおけるポジティブコントロールとしての使用のための、請求項30に記載の組成物、または請求項1〜25のいずれかに記載のポリペプチド、または請求項26〜29のいずれかに記載の融合タンパク質。
- クロストリジウム毒素に対するワクチンとしての使用のための、請求項30に記載の組成物、または請求項1〜25のいずれかに記載のポリペプチド、または請求項26〜29のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 請求項30に記載の組成物、請求項1〜25のいずれかに記載のポリペプチド、または請求項26〜29のいずれかに記載の融合タンパクを、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて含む、薬学的組成物。
- 請求項1〜25のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項26〜29のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする核酸。
- 配列番号1に記載のボツリヌス毒素A型軽鎖の残基1〜448をコードするヌクレオチドを含む、請求項34に記載の核酸。
- 配列番号1、3、5、9、11、13、15、17または25に記載の、ボツリヌス毒素A型重鎖HNドメインの残基1〜423をコードするヌクレオチドを含む、請求項34または35に記載の核酸。
- 配列番号19、21もしくは23に記載の、ボツリヌス毒素B型軽鎖の残基1〜470をコードするヌクレオチドを含む、請求項34に記載の核酸。
- 配列番号21、27または28に記載の、ボツリヌス毒素B型重鎖HNドメインの残基1〜417をコードするヌクレオチドを含む、請求項34または37に記載の核酸。
- 天然のクロストリジウム毒素配列中には存在しない制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む、請求項34〜38のいずれかに記載の核酸。
- 前記切断部位を導入するような、請求項1〜25のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項26〜29のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする核酸の改変により得られる、請求項39に記載の核酸。
- 請求項34〜40のいずれかに記載の核酸であって、該核酸はDNAである、核酸。
- 配列番号1、3、5、9、11、13、15、17、19、21、27および28から選択されるDNA。
- 請求項1〜25のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法であって、請求項34〜42のいずれかに記載の核酸を宿主細胞中で発現させる工程、および該ポリペプチドを回収する工程、を包含する、方法。
- 請求項26〜29のいずれかに記載の融合タンパク質の製造方法であって、請求項26〜29のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする核酸を宿主細胞中で発現させる工程、該融合タンパク質を保持するように適合されたアフィニティーマトリックスを通して該融合タンパク質を溶出しそして該融合タンパク質を置換するように適合されたリガンドを該マトリックスを通して溶出することによって該融合タンパク質を精製する工程、および該融合タンパク質を回収する工程、を包含する、方法。
- 請求項34〜41のいずれかに記載の核酸を含む細胞であって、該細胞は、請求項1〜25のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項26〜29のいずれかに記載の融合タンパク質を組換え発現する細胞。
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Cited By (1)
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TWI738789B (zh) | 2016-05-30 | 2021-09-11 | 日商日產化學工業股份有限公司 | 反應性聚矽氧烷及包含此之聚合性組成物 |
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