CN109790204A

CN109790204A - 杂合神经毒素

Info

Publication number: CN109790204A
Application number: CN201780059944.8A
Authority: CN
Inventors: E·方弗里亚苏比罗斯; D·伯金
Original assignee: Ipsen Biological Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Ipsen Biological Pharmaceutical Co Ltd; Ipsen Biopharm Ltd
Priority date: 2016-09-29
Filing date: 2017-09-28
Publication date: 2019-05-21
Also published as: TWI796305B; JP2022081642A; RU2019112106A; JP2019531733A; RU2019112106A3; TW201819403A; US20210277071A1; JP7118055B2; WO2018060351A1; EP3519430A1

Abstract

本发明涉及包含梭菌轻链和选择性神经节苷脂结合部分的杂合神经毒素，并涉及它们在治疗中的用途。

Description

杂合神经毒素

发明领域

本发明涉及具有提高的治疗特性的杂合神经毒素，特别是对于神经节苷脂具有更高的选择性结合亲和性。

背景

梭菌属(Clostridia)中的细菌产生了高强度和特异性的蛋白质毒素，其可以毒害它们所递送至的神经元和其他细胞。这样的梭菌毒素的实例包括由破伤风梭菌(C.tetani)(TeNT)和肉毒梭菌(C.botulinum)(BoNT)血清型A-G产生的神经毒素，以及由巴氏梭菌(C.baratii)和丁酸梭菌(C.butyricum)产生的那些毒素。

梭菌神经毒素中一些最强烈的毒素是已知的。例如，根据血清型，肉毒杆菌神经毒素对于小鼠具有范围为0.5至5ng/kg的中位值致死剂量(LD₅₀)。破伤风毒素和肉毒杆菌毒素通过抑制受影响的神经元的功能(尤其是神经递质的释放)来起作用。肉毒杆菌毒素在神经肌肉接头处起作用并抑制外周神经系统中的胆碱能神经传导，而破伤风毒素在中枢神经系统中起作用。

实际上，梭菌神经毒素作为单链多肽合成，其通过蛋白水解切割事件进行翻译后修饰，以形成通过二硫键连接在一起的两条多肽链。切割发生在特定的切割位点，常常称为激活位点，其位于提供链间二硫键的半胱氨酸残基之间。正是这种双链(dichain)形式是毒素的活性形式。两条链称为重链(H-链)(其具有大约100kDa的分子量)和轻链(L-链)(其具有大约50kDa的分子量)。H链包含N-末端易位组分(H_N结构域)和C-末端靶向组分(H_C结构域)。切割位点位于L-链和易位结构域成分之间。Hc结构域结合其靶神经元并且结合的毒素经由内体内在化至细胞中后，H_N结构域将L-链穿过内体膜易位并进入细胞溶质中，并且L-链提供了蛋白酶功能(也称为非细胞毒性蛋白酶)。

非细胞毒性蛋白酶通过蛋白水解切割称为SNARE蛋白(例如，SNAP-25、VAMP或突触融合蛋白(syntaxin))的胞内转运蛋白来起作用－参见Gerald K(2002)“Cell andMolecular Biology”(第4版)John Wiley&Sons，Inc。首字母缩写SNARE源自术语可溶性NSF附着受体(Soluble NSF Attachment Receptor)，其中NSF表示N-乙基马来酰亚胺-敏感因子。SNARE蛋白是胞内囊泡融合不可或缺的，并且因此是分子通过囊泡转运从细胞分泌不可或缺的。蛋白酶功能是锌依赖性内肽酶活性并且呈现出对于SNARE蛋白的高底物特异性。因此，一旦递送至目标靶细胞，非细胞毒性蛋白酶能够抑制从靶细胞的细胞分泌。梭菌神经毒性的L-链蛋白酶是切割SNARE蛋白的非细胞毒性蛋白酶。BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F和BoNT/G的L-链蛋白酶切割VAMP，BoNT/A和BoNT/E的L-链蛋白酶切割SNAP25以及BoNT/C的L-链蛋白酶切割SNAP25和突触融合蛋白，这导致神经递质释放的抑制和随后的神经性麻痹(Rossetto,O.等，“Botulinum neurotoxins:genetic,structural and mechanisticinsights.”Nature Reviews Microbiology 12.8(2014):535-549)。

鉴于SNARE蛋白普遍存在的性质，梭菌神经毒素，如肉毒杆菌毒素，已经成功地用于各种治疗中。目前全部批准的包含BoNT的药物/化妆品制剂含有天然存在的从梭菌菌株纯化的神经毒素(在或的情况中是BoNT/A，以及在的情况中是BoNT/B)。

例如，我们提及William J.Lipham，Cosmetic and Clinical Applications ofBotulinum Toxin(Slack,Inc.，2004)，其描述了梭菌神经毒素(如肉毒杆菌神经毒素(BoNT)BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F和BoNT/G)和破伤风神经毒素(TeNT)在许多治疗和化妆品或美容应用中抑制神经元传递的用途－例如，市售的肉毒杆菌毒素产品目前批准作为用于包括局灶性痉挛、上肢痉挛、下肢痉挛、颈肌张力障碍、眼睑痉挛、半面痉挛、腋窝多汗症、慢性胸膜炎、神经源性逼尿肌过度活跃、眉间纹和严重的鱼尾纹的适应症的治疗剂。此外，描述了梭菌神经毒素疗法用于治疗神经肌肉疾病(参见US 6,872,397)；用于治疗子宫疾病(参见US 2004/0175399)；用于治疗溃疡和胃食管反流病(参见US 2004/0086531)；用于治疗张力障碍(参见US 6,319,505)；用于治疗眼疾(参见US2004/0234532)；用于治疗眼睑痉挛(参见US 2004/0151740)；用于治疗斜视(参见US 2004/0126396)；用于治疗疼痛(参见US 6,869,610、US 6,641,820、US 6,464,986和US 6,113,915)；用于治疗纤维肌痛(参见US 6,623,742、US 2004/0062776)；用于治疗腰痛(参见US2004/0037852)；用于治疗肌肉损伤(参见US 6,423,319)；用于治疗窦性头痛(参见US 6,838,434)；用于治疗紧张性头痛(参见US 6,776,992)；用于治疗头痛(参见US 6,458,365)；用于减轻偏头痛(参见US 5,714,469)；用于治疗心血管疾病(参见US 6,767,544)；用于治疗神经系统疾病，如帕金森病(参见US 6,620,415，US 6,306,403)；用于治疗神经精神疾病(参见US 2004/0180061，US 2003/0211121)；用于治疗内分泌紊乱(参见US 6,827,931)；用于治疗甲状腺疾患(参见US 6,740,321)；用于治疗胆碱能影响的汗腺疾病(参见US 6,683,049)；用于治疗糖尿病(参见US 6,337,075、US 6,416,765)；用于治疗胰腺疾病(参见US 6,261,572、US 6,143,306)；用于治疗癌症，如骨肿瘤(参见US 6,565,870、US 6,368,605、US6,139,845、US 2005/0031648)；用于治疗耳疾(参见US 6,358,926、US 6,265,379)；用于治疗自主神经紊乱，如胃肠道肌肉疾病和其他平滑肌功能障碍(参见US 5,437,291)；用于治疗与皮肤细胞增殖性疾病相关的皮肤损伤(参见US 5,670,484)；用于控制神经源性炎性疾病(参见US 6,063,768)；用于减少脱发并刺激头发生长(参见US 6,299,893)；用于治疗嘴角下垂(参见US 6,358,917)；用于降低食欲(参见US 2004/40253274)；用于牙科治疗和程序(参见US 2004/0115139)；用于治疗神经肌肉疾病和病症(参见US 2002/0010138)；用于治疗与疼痛相关的各种疾病和病症(参见US 2004/0013692)；用于治疗由粘液分泌过多引起的病症，如哮喘和COPD(参见WO 00/10598)；和用于治疗非神经元病症，如炎症、内分泌病症、外分泌病症、免疫病症、心血管病症、骨病症(参见WO 01/21213)。以上出版物全部以其整体引用并入本文作为参考。

然而，天然BoNT没有区分神经肌肉接头或不同类型神经元的空间分布，这可能导致副作用。例如，使用BoNT治疗上肢痉挛可能导致不良事件，如口干和吞咽困难(Nair,K.P.和Jonathan Marsden."The management of spasticity in adults."Bmj 349(2014)：g4737)。

提高梭菌神经毒素对特定神经元群的特异性将允许定制针对特定病理学的梭菌神经毒素，安全性增加并减少副作用。

本发明提供了具有提高的治疗特性的神经毒素，特别是对于驱动肌肉收缩(神经肌肉接头)或胆碱能分泌的特定神经元更高的选择性结合亲和性。

发明概述

在第一个方面中，本发明提供了包含梭菌轻链(L)和选择性神经节苷脂结合部分(GBM)的杂合神经毒素，其中所述选择性神经节苷脂结合部分不是梭菌H_CC或H_C结构域。

在另一个方面中，本发明提供了编码本发明的杂合神经毒素的核苷酸序列。

在另一个方面中，本发明提供了包含本发明的核苷酸序列的载体。

在另一个方面中，本发明提供了包含本发明的核苷酸序列或载体的细胞。

在另一个方面中，本发明提供了包含本发明的杂合神经毒素的药物组合物。

在另一个方面中，本发明提供了根据本发明的杂合神经毒素或药物组合物，用于治疗中。

在另一个方面中，本发明提供了根据本发明的杂合神经毒素或药物组合物用于处理美学或美容状况的非治疗用途。

在另一个方面中，本发明提供了包含梭菌轻链和选择性神经节苷脂结合部分的杂合神经毒素，其中所述选择性神经节苷脂结合部分不是梭菌H_CC或H_C结构域，并且其中所述选择性神经节苷脂结合部分结合选自GM1a、GM1b、GD1a和GalNAc-GD1a的一种或多种神经节苷脂，用于治疗与不想要的神经元活性相关的肢体疾病。

在另一个方面中，本发明提供了包含梭菌轻链和选择性神经节苷脂结合部分的杂合神经毒素，其中所述选择性神经节苷脂结合部分不是梭菌H_CC或H_C结构域，并且其中所述选择性神经节苷脂结合部分结合选自GT1a和GQ1b的一种或多种神经节苷脂，用于治疗与不想要的神经元活性相关的头或颈疾病。

在另一个方面中，本发明提供了治疗方法，包括将根据本发明的治疗有效量的杂合神经毒素或药物组合物施用于需要其的患者。

在另一个方面中，本发明提供了包含梭菌轻链和选择性神经节苷脂结合部分的杂合神经毒素，其中所述选择性神经节苷脂结合部分不是梭菌H_CC或H_C结构域，并且其中所述选择性神经节苷脂结合部分结合GM1，用于治疗流涎(或过度分泌唾液或流口水)。

在另一个方面中，本发明提供了包含梭菌轻链和选择性神经节苷脂结合部分的杂合神经毒素，其中所述选择性神经节苷脂结合部分不是梭菌H_CC或H_C结构域，并且其中所述选择性神经节苷脂结合部分结合选自NeuAc GM3、NeuGc GM3、GM2、GM1、GD3和GD2的一种或多种神经节苷脂，用于治疗癌症。

在另一个方面中，本发明提供了治疗与不想要的神经元活性相关的肢体疾病的方法，包括将治疗有效量的包含梭菌轻链和选择性神经节苷脂结合部分的杂合神经毒素施用于需要其的患者，其中所述选择性神经节苷脂结合部分不是梭菌H_CC或H_C结构域，并且其中所述选择性神经节苷脂结合部分结合选自GM1a、GM1b、GD1a和GalNAc-GD1a的一种或多种神经节苷脂。

在另一个方面中，本发明提供了治疗与不想要的神经元活性相关的头或颈疾病的方法，包括将治疗有效量的包含梭菌轻链和选择性神经节苷脂结合部分的杂合神经毒素施用于需要其的患者，其中所述选择性神经节苷脂结合部分不是梭菌H_CC或H_C结构域，并且其中所述选择性神经节苷脂结合部分结合选自GT1a和GQ1b的一种或多种神经节苷脂。

在另一个方面中，本发明提供了治疗流涎(或过度分泌唾液或流口水)的方法，包括将治疗有效量的包含梭菌轻链和选择性神经节苷脂结合部分的杂合神经毒素施用于需要其的患者，其中所述选择性神经节苷脂结合部分不是梭菌H_CC或H_C结构域，并且其中所述选择性神经节苷脂结合部分结合GM1。

在另一个方面中，本发明提供了治疗癌症的方法，包括将治疗有效量的包含梭菌轻链和选择性神经节苷脂结合部分的杂合神经毒素施用于需要其的患者，其中所述选择性神经节苷脂结合部分不是梭菌H_CC或H_C结构域，并且其中所述选择性神经节苷脂结合部分结合选自NeuAc GM3、NeuGc GM3、GM2、GM1、GD3和GD2的一种或多种神经节苷脂。

发明详述

本发明是基于本发明人的以下发现：通过将外源性(非梭菌的)神经节苷脂结合结构域工程化至梭菌神经毒素中，可以改变梭菌神经毒素对神经肌肉接头的选择性。

肉毒梭菌神经毒素(BoNT)使用涉及蛋白受体和质膜神经节苷脂的双重受体结合机制靶向神经元。BoNT/B、/G和/DC已经显示出识别SytI和SytII(突触结合蛋白的两种主要同工型)的腔结构域(luminal domain)。突触囊泡糖蛋白2(SV2)，包括三种同工型，为SV2A、SV2B和SV2C，已经显示出是BoNT/A、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F的蛋白受体。

神经节苷脂是衍生自乳糖苷神经酰胺并含有唾液酸残基(如N-乙酰神经氨酸(‘NANA’或‘SA’或'Neu5Ac'或'NeuAc'))的寡糖基神经酰胺。在一些情况中，唾液酸组分是N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)，或其中胺基被OH替代的Neu5Ac类似物(3-脱氧-D-甘油基-D-半乳糖基-nonulosonic acid，给予缩写‘KDN’)。通过Svennerholm提出的命名系统来定义神经节苷脂，其中M、D、T和Q分别是指单-、二-、三-和四唾液酸神经节苷脂，而数字1、2、3等是指神经节苷脂在薄层色谱上的迁移顺序。例如，单唾液酸神经节苷脂的迁移顺序是GM3>GM2>GM1。为了表示基础结构内的变化，增加了更多术语，例如，GM1a、GD1b等。将具有0、1、2和3个连接内半乳糖单元的唾液酸残基的鞘糖脂分别称为无唾液酸(或0-)、a-、b-和c-系列神经节苷脂，而将具有连接内N-半乳糖胺残基的唾液酸残基的神经节苷脂归类为α-系列神经节苷脂。用于0-、a-、b-和c-系列的神经节苷脂的生物合成的途径涉及唾液酸转移酶和糖基转移酶的顺序活性，如Ledeen等，2015中所述(Ledeen,Robert W.和Gusheng Wu."Themulti-tasked life of GM1ganglioside,a true factotum of nature."Trends inbiochemical sciences 40.7(2015):407-418)。可以在每个系列和碳水化合物链中的不同位置产生更多的唾液酸化(sialization)，以给出越来越复杂和异质的产物范围，如具有连接内N-乙酰半乳糖胺残基的唾液酸残基的α-系列神经节苷脂。

通过涉及囊泡形成的转运系统将神经节苷脂转移至质膜的外部小叶。神经节苷脂存在并集中于细胞表面上，具有两条包埋于质膜中的神经酰胺部分的烃链和位于胞外表面上的寡糖，它们在那里呈现用于胞外分子或邻近细胞表面的识别点。神经节苷脂的唾液酸多糖(sialoglycan)组分从细胞表面延伸出来，它们在那里可以参与分子间相互作用。它们通过识别细胞表面的特定分子并通过调节质膜中蛋白质的活性来发挥作用。神经节苷脂还特异性地结合病毒和结合细菌毒素，如来自肉毒、破伤风和霍乱的那些。例如，霍乱毒素的特异性细胞表面受体是神经节苷脂GM1(或GM1a)：Neu5Acα2-3(Galβ1-3GalNAcβ1-4)Galβ1-4Glcβ1Cer。

BoNT在H_CC结构域中具有两个独立的用于神经节苷脂和神经元蛋白受体的结合区。BoNT/A、/B、/E、/F和/G在HCC结构域中具有由“E(Q)…H(K)…SXWY…G”基序组成的保守神经节苷脂结合位点，而BoNT/C、/D和/DC展示出两个独立的神经节苷脂结合位点(Lam,Kwok-Ho等，"Diverse binding modes,same goal:The receptor recognition mechanism ofbotulinum neurotoxin."Progress in biophysics and molecular biology 117.2(2015):225-231)。大部分BoNT只结合具有连接寡糖核心的Gal4的2,3-连接的N-乙酰神经氨酸残基(表示为Sia5)的神经节苷脂，而TeNT上相应的神经节苷脂结合袋还可以结合GM1a，这是缺乏Sia5糖残基的神经节苷脂。已经显示出将H1241K突变引入重组BoNT/F中赋予GM1结合能力(Benson,Marc A.等，"Unique ganglioside recognition strategies forclostridial neurotoxins."Journal of Biological Chemistry 286.39(2011):34015-34022)。已经发现了BoNT/D结合GM1a和GD1a(Kroken,Abby R.等，"Novel ganglioside-mediated entry of botulinum neurotoxin serotype D into neurons."Journal ofBiological Chemistry 286.30(2011):26828-26837.)。

结合源自神经节苷脂缺陷小鼠和生化测定的数据，BoNT/A、E、F和G显示出对GD1a和GT1b中存在的末端NAcGal-Gal-NAcNeu部分的偏好，而BoNT/B、C、D和TeNT需要GD1b、GT1b和GQ1b中发现的二唾液酸(disialyl)基序。大量的复合聚唾液酸-神经节苷脂(如GD1a，GD1b和GT1b)因此显示出：作为中毒的第一步，在神经元细胞的表面上特异性地累积所有BoNT血清型和TeNT是必不可少的。(Rummel，Andreas."Double receptor anchorage ofbotulinum neurotoxins accounts for their exquisite neurospecificity."Botulinum Neurotoxins.Springer Berlin Heidelberg，2012.61-90.)

本发明人提出这样的假设：可以利用神经节苷脂在体内的差异定位，来增强梭菌神经毒素对特定位置的神经元的选择性。发明人特别表明，霍乱毒素的B亚基可以用于将GM1结合能力工程化至BoNT/A中。

在第一个方面中，本发明提供了包含梭菌轻链和选择性神经节苷脂结合部分的杂合神经毒素，其中所述选择性神经节苷脂结合部分不是梭菌H_CC或H_C结构域。

如本文中使用的术语“神经毒素”表示进入神经元并抑制神经递质释放的任何多肽。这个过程包括神经毒素结合低或高亲和性受体、神经毒素的内在化、神经毒素的内肽酶部分易位至细胞质中以及神经毒素底物的酶促修饰。更具体地，术语“神经毒素”包含进入神经元并抑制神经递质释放的由梭菌属(Clostridium)细菌产生的任何多肽(梭菌神经毒素)，并且通过重组技术或化学技术产生这样的多肽。正是这种双链形式是毒素的活性形式。两条链称为重链(H-链)(其具有大约100kDa的分子量)和轻链(L-链)(其具有大约50kDa的分子量)。

可以基于通过特定的中和抗血清的灭活来区分不同的肉毒神经毒素(BoNT)血清型，这样通过血清型的分类与氨基酸水平的序列同一性百分数相关。基于氨基酸序列同一性百分数，将给定血清型的BoNT蛋白进一步分成不同的亚型。BoNT/A氨基酸序列的实例提供为SEQ ID NO:1(UniProt登录号A5HZZ9)。BoNT/B氨基酸序列的实例提供为SEQ ID NO:2(UniProt登录号B1INP5)。BoNT/C氨基酸序列的实例提供为SEQ ID NO:3(UniProt登录号P18640)。BoNT/D氨基酸序列的实例提供为SEQ ID NO:4(UniProt登录号P19321)。BoNT/E氨基酸序列的实例提供为SEQ ID NO:5(UniProt登录号Q00496)。BoNT/F氨基酸序列的实例提供为SEQ ID NO:6(UniProt登录号Q57236)。BoNT/G氨基酸序列的实例提供为SEQ ID NO:7(UniProt登录号Q60393)。TeNT(破伤风神经毒素)氨基酸序列的实例提供为SEQ ID NO:8(UniProt登录号P04958)。

如本文中使用的术语“梭菌轻链”(或“L”)表示具有大约50kDa分子量的具有切割SNARE蛋白并由此破坏神经递质从靶细胞释放的能力的梭菌内肽酶结构域(或非细胞毒性蛋白酶)。

如本文中使用的术语“H_N结构域”表示具有大约50kDa分子量的具有将梭菌轻链易位至靶细胞的细胞质中的能力的神经毒素重链的功能独特区域。

如本文中使用的术语“LH_N结构域”表示缺少H_C结构域并由内肽酶结构域(“L”或“轻链”)和负责内肽酶易位至细胞质中的结构域(重链的H_N结构域)组成的神经毒素。LH_N结构域在L结构域和H_N结构域之间包含激活位点。激活位点蛋白水解切割后，L结构域和H_N结构域通过二硫键连接在一起。

如本文中使用的术语“H_C结构域”表示具有大约50kDa分子量的能将神经毒素结合位于靶细胞表面上的受体的神经毒素重链的功能独特区域。H_C结构域由两个结构上不同的子结构域组成，“H_CN子结构域”(H_C结构域的N-末端部分)和“H_CC子结构域”(H_C结构域的C-末端部分)，各自具有大约25kDa的分子量。

示例性L、H_N、H_CN和H_CC结构域显示于表1中。

表1-示例性L、H_N、H_CN和H_CC结构域

以上鉴定的参考序列应被视为指导，因为根据亚血清型可能发生轻微变化。例如，US 2007/0166332(将其全部引用并入本文作为参考)引用了略有不同的梭菌序列。

在一个实施方案中，梭菌轻链来自BoNT A型、B型、C1型、D型、E型、F型或G型，或TeNT。

在一个实施方案中，梭菌轻链结构域包含选自以下的序列：

-SEQ ID NO:1的氨基酸残基1至448，或与其具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列，

-SEQ ID NO:2的氨基酸残基1至441，或与其具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列，

-SEQ ID NO:3的氨基酸残基1至449，或与其具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列，

-SEQ ID NO:4的氨基酸残基1至442，或与其具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列，

-SEQ ID NO:5的氨基酸残基1至423，或与其具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列，

-SEQ ID NO:6的氨基酸残基1至439，或与其具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列，

-SEQ ID NO:7的氨基酸残基1至446，或与其具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列，和

-SEQ ID NO:8的氨基酸残基1至456，或与其具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列。

理解根据本发明的梭菌轻链具有切割SNARE蛋白的能力。

在一个实施方案中，杂合神经毒素包含易位部分。

如本文中使用的术语“易位部分”(或“易位结构域”)是指具有将梭菌轻链易位至靶细胞的细胞质中的能力的部分。

合适的易位部分包括细菌毒素易位结构域，如来自梭菌H_N结构域和/或来自霍乱毒素的亚基A2(CtxA2)，细胞穿透肽，特别是pH敏感的细胞穿透肽。pH敏感的细胞穿透肽的实例是掺入了pH敏感的遮掩肽(masking peptide)的HBHAc(KKAAPAKKAAAKKAPAKKAAAKK)、组氨酸谷氨酸(HE)(Yeh等，Mol Pharm 2016“Selective Intracellular Delivery ofRecombinant Arginine Deiminase(ADI)Using pH-Sensitive Cell PenetratingPeptides To Overcome ADI Resistance in Hypoxic Breast Cancer Cells.”)。

在一个优选的实施方案中，杂合神经毒素包含易位部分，其是梭菌H_N结构域。在一个更优选的实施方案中，杂合神经毒素在轻链和梭菌H_N结构域之间包含激活位点。

在一个实施方案中，梭菌H_N结构域包含选自以下的序列：

-SEQ ID NO:1的氨基酸残基449至872，或与其具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列，

-SEQ ID NO:2的氨基酸残基442至859，或与其具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列，

-SEQ ID NO:3的氨基酸残基450至867，或与其具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列，

-SEQ ID NO:4的氨基酸残基442至863，或与其具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列，

-SEQ ID NO:5的氨基酸残基423至846，或与其具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列，

-SEQ ID NO:6的氨基酸残基440至865，或与其具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列，

-SEQ ID NO:7的氨基酸残基447至864，或与其具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列，和

-SEQ ID NO:8的氨基酸残基457至880，或与其具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列。

理解根据本发明的梭菌H_N结构域具有将轻链易位至靶细胞的细胞质中的能力。

在一个实施方案中，梭菌L和H_N结构域来自相同的梭菌血清型。

在一个实施方案中，梭菌L和H_N结构域来自不同的梭菌血清型。

在一个实施方案中，杂合神经毒素包含靶向部分。

如本文中使用的术语“靶向部分”(或“靶向结构域”)表示具有结合靶细胞上的受体的能力的部分。优选地，靶向部分具有结合靶细胞上的蛋白受体的能力。

合适的靶向部分包括细菌毒素靶向结构域，如梭菌H_C或H_CC结构域、肽、抗体或抗体片段。

在一个实施方案中，杂合神经毒素包含靶向部分(TM)，其结合非梭菌受体。TM可以替代梭菌神经毒素重链的H_C或H_CC结构域的一部分或全部。包含非梭菌TM的杂合神经毒素可以称为“重新靶向的神经毒素(retargeted neurotoxins)”(或“靶向的分泌抑制物”、“TSI”、“TVEMP”或“TEM”)。适用于重新靶向的神经毒素的TM实例公开于WO96/33273、WO98/07864、WO00/10598、WO01/21213、WO01/53336、WO02/07759、WO2005/023309、WO2006/026780、WO2006/099590、WO2006/056093、WO2006/059105、WO2006/059113、WO2007/138339、WO2007/106115、WO2007/106799、WO2009/150469、WO2009/150470、WO2010/055358、WO2010/020811、WO2010/138379、WO2010/138395、WO2010/138382、WO2011/020052、WO2011/020056、WO2011/020114、WO2011/020117、WO2011/20119、WO2012/156743、WO2012/134900、WO2012/134897、WO2012/134904、WO2012/134902、WO2012/135343、WO2012/135448、WO2012/135304、WO2012/134902、WO2014/033441、WO2014/128497、WO2014/053651、WO2015/004464，将它们全部引用并入本文作为参考。

在一个实施方案中，杂合神经毒素包含梭菌H_CN和/或H_CC结构域。优选地，梭菌H_CN和/或H_CC结构域来自BoNT A型、B型、C1型、D型、E型、F型或G型或TeNT。

在一个实施方案中，杂合神经毒素包含梭菌H_CN结构域，其包含选自以下的序列：

-SEQ ID NO:1的氨基酸残基873至1094，或与其具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列，

-SEQ ID NO:2的氨基酸残基860至1081，或与其具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列，

-SEQ ID NO:3的氨基酸残基868至1095，或与其具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列，

-SEQ ID NO:4的氨基酸残基864至1082，或与其具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列，

-SEQ ID NO:5的氨基酸残基847至1069，或与其具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列，

-SEQ ID NO:6的氨基酸残基866至1087，或与其具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列，

-SEQ ID NO:7的氨基酸残基865至1089，或与其具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列，或

-SEQ ID NO:8的氨基酸残基881至1111，或与其具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列。

在一个实施方案中，杂合神经毒素包含梭菌H_CC结构域，其包含选自以下的序列：

-SEQ ID NO:1的氨基酸残基1095至1296，或与其具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列，

-SEQ ID NO:2的氨基酸残基1082至1291，或与其具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列，

-SEQ ID NO:3的氨基酸残基1096至1291，或与其具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列，

-SEQ ID NO:4的氨基酸残基1083至1276，或与其具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列，

-SEQ ID NO:5的氨基酸残基1070至1252，或与其具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列，

-SEQ ID NO:6的氨基酸残基1088至1278，或与其具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列，

-SEQ ID NO:7的氨基酸残基1090至1297，或与其具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列，或

-SEQ ID NO:8的氨基酸残基1112至1315，或与其具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多肽序列。

理解根据本发明的H_CC能够结合梭菌神经毒素蛋白受体。

在一个实施方案中，梭菌H_CN和/或H_CC结构域来自与轻链相同的梭菌血清型。

在一个实施方案中，梭菌H_CN和/或H_CC结构域来自与轻链不同的梭菌血清型。

在一个实施方案中，杂合神经毒素包含梭菌H_CN和梭菌H_CC结构域。合适地，梭菌H_CN和H_CC结构域可以来自相同的血清型。合适地，梭菌H_CN和H_CC结构域可以来自不同的血清型。在一个实施方案中，梭菌轻链、H_CN和H_CC结构域来自相同的血清型。在一个实施方案中，梭菌轻链和H_CN来自相同的血清型，而H_CC结构域来自不同的血清型。

在一个实施方案中，杂合神经毒素包含梭菌H_N结构域、梭菌H_CN结构域和梭菌H_CC结构域。合适地，梭菌H_N、H_CN和H_CC结构域可以来自相同的血清型。合适地，梭菌H_N、H_CN和H_CC结构域可以来自不同的血清型。在一个实施方案中，梭菌轻链、H_N、H_CN和H_CC结构域来自相同的血清型。在一个实施方案中，梭菌轻链、H_N和H_CN结构域来自相同的血清型，而H_CC结构域来自不同的血清型。在一个实施方案中，梭菌轻链和H_N结构域来自相同的血清型，而H_CN结构域和H_CC结构域来自不同的血清型。

在一个实施方案中，杂合神经毒素包含梭菌H_CC结构域时，与天然梭菌H_CC结构域相比，所述梭菌H_CC结构域具有降低的或消除的结合神经节苷脂的能力。例如，这可以通过将突变引入H_CC结构域的神经节苷脂结合基序中来实现。

两个或更多个核酸或氨基酸序列之间的“序列同一性百分数”是在相同位置由比对的序列共享的相同核苷酸/氨基酸的数量的函数。因此，可以按照比对中每个位置相同的核苷酸/氨基酸数量除以比对序列中核苷酸/氨基酸的总数，乘以100，来计算同一性％。序列同一性％的计算还可以考虑需要引入来优化两个或更多个序列比对的缺口的数量和每个缺口的长度。可以使用特定的数学算法来进行两个或更多个序列之间的的序列比较和同一性百分数的确定，所述算法是本领域技术人员熟知的，例如，全局比对数学算法(如Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48(3)，443-453，1972描述的)。

轻链、H_N、H_CN和H_CC结构域可以来自镶嵌(mosaic)神经毒素。如这个内容中使用的术语“镶嵌神经毒素”是指这样的天然存在的梭菌神经毒素，其包含至少一个来自另一种类型的梭菌神经毒素(例如，不同血清型的梭菌神经毒素)的功能结构域，所述梭菌神经毒素通常不包含该至少一个功能结构域。镶嵌神经毒素的实例是天然存在的BoNT/DC和BoNT/CD。BoNT/DC包含血清型D的L链和H_N结构域和血清型C的H_C结构域，而BoNT/CD由血清型C的L链和H_N结构域和血清型D的H_C结构域组成。

轻链、H_N、H_CN和H_CC结构域可以来自修饰的神经毒素及其衍生物，包括但不限于以下所述的那些。修饰的神经毒素或衍生物与天然(未修饰)形式的神经毒素相比可以含有一个或多个已经修饰的氨基酸，或可以含有天然(未修饰)形式的毒素中不存在的一个或多个插入的氨基酸。例如，相对于天然(未修饰的)梭菌神经毒素序列，修饰的梭菌神经毒素可以在一个或多个结构域中具有修饰的氨基酸序列。这样的修饰可以改变神经毒素的功能特征，例如，生物学活性或持久性。

修饰的神经毒素保留神经毒素的至少一种功能，选自结合靶细胞上的低或高亲和性神经毒素受体、将神经毒素的内肽酶部分(轻链)易位至细胞质中和切割SNARE蛋白的能力。优选地，修饰的神经毒素暴露这些功能中的至少两种。更优选地，修饰的神经毒素保留这三种功能。

修饰的神经毒素可以在重链的氨基酸序列中具有一个或多个修饰(如修饰的H_C结构域)，其中修饰的重链以高于或低于天然(未修饰)神经毒素的亲和性结合靶神经细胞。H_C结构域中这样的修饰可以包括修饰H_C结构域的神经节苷脂结合位点中的残基或改变与靶神经细胞的神经节苷脂受体和/或蛋白质受体结合的蛋白质(SV2或突触结合蛋白)结合位点中的残基。这样的修饰的神经毒素的实例描述于WO2006/027207和WO2006/114308中，将两者全部引用并入本文作为参考。

修饰的神经毒素可以在轻链的氨基酸序列中具有一个或多个修饰，例如，底物结合或催化结构域中的修饰，其可以改变或修饰修饰的LC的SNARE蛋白特异性。这样的修饰的神经毒素的实例描述于WO 2010/120766和US 2011/0318385中，将两者全部引用并入本文作为参考。

修饰的神经毒素可以包含一个或多个提高或降低修饰的神经毒素的生物学活性和/或生物学持久性的修饰。例如，修饰的神经毒素可以包含基于亮氨酸或酪氨酸的基序，其中所述基序提高或降低修饰的神经毒素的生物学活性和/或生物学持久性。合适的基于亮氨酸的基序包括xDxxxLL、xExxxLL、xExxxIL和xExxxLM(其中x是任何氨基酸)。合适的基于酪氨酸的基序包括Y-x-x-Hy(其中Hy是疏水性氨基酸)。包含基于亮氨酸和酪氨酸的基序的修饰的神经毒素的实例描述于WO 2002/08268中，将其全部引用并入本文作为参考。

如本文中使用的术语“选择性神经节苷脂结合部分”表示以高于其他神经节苷脂的亲和性结合一种类型的神经节苷脂的部分。可以通过确定神经节苷脂和结合部分之间的平衡解离常数或K_d来定量结合亲和性(K_d越低，亲和性越高)。用于确定针对神经节苷脂的结合亲和性的方法是本领域已知的，并且包括例如表面等离子体共振(SPR)，如例如在Kuziemko，Geoffrey M.等，"Cholera toxin binding affinity and specificity forgangliosides determined by surface plasmon resonance."Biochemistry 35.20(1996):6375-6384，或在MacKenzie,C.Roger等，"Quantitative analysis of bacterialtoxin affinity and specificity for glycolipid receptors by surface plasmonresonance."Journal of Biological Chemistry 272.9(1997):5533-5538中所述。特别地，Kuziemko等，1996(如上述)通过使用SPR发现了霍乱毒素优选以以下顺序结合神经节苷脂：GM1>GM2>GD1A>GM3>GT1B>GD1B>无唾液酸-GM1，并且测量的霍乱毒素对神经节苷脂序列的结合亲和性(K_d)范围从针对GM1的4.61×10^-12M至针对无唾液酸GM1的1.88×10^-10M。MacKenzie等，1997(如上述)使用脂质体捕获方法通过表面等离子体共振(SPR)确定了CtxB分别以7.3×10^-10M和8×10^-9M结合GM1和GD1b，大肠杆菌热不稳定的肠毒素(LT)分别以5.7×10^-10M和3.0×10^-9M的亲和性结合GM1和GD1b，而破伤风毒素C片段分别以1.5×10^-7M和1.7×10^-7M的亲和性结合GD1b和GT1b。

还可以通过使用竞争ELISA分析来确定对于神经节苷脂的结合亲和性，例如Sinclair，Haydn R.等，"Sialyloligosaccharides inhibit cholera toxin binding tothe GM1receptor."Carbohydrate research 343.15(2008):2589-2594中所述。用于确定对神经节苷脂的结合亲和性的另一种方法是基于使用放射性标记的配体(例如，¹²⁵I标记的)，例如Nishiki，Tei-ichi等，"The high-affinity binding of Clostridiumbotulinum type B neurotoxin to synaptotagmin II associated with gangliosidesGT1b/GD1a."FEBS letters 378.3(1996):253-257中所述。用于确定神经节苷脂结合亲和性的再另一种方法是使用等温滴定量热法，如在Turnbull,W.Bruce等，"Dissecting thecholera toxin-ganglioside GM1 interaction by isothermal titrationcalorimetry."Journal of the American Chemical Society 126.4(2004):1047-1054中所述。

在一个实施方案中，选择性神经节苷脂结合部分和神经节苷脂之间的K_d低于约10^-9M，优选低于约10^-10M，更优选低于约10^-11M，更优选低于约5×10^-12M。

合适的神经节苷脂结合部分(GBM)包括细菌毒素GBM(不是梭菌H_C或H_CC结构域)、肽、蛋白质或蛋白质片段、抗体或抗体片段。

在一个实施方案中，GBM是肽。适用作GBM的肽的实例包括结合GM1的阿尔茨海默氏病的β-淀粉样蛋白肽(Aβ)、结合GM3的帕金森病相关蛋白α-突触核蛋白(α-synuclein)以及Yahi和Fantini 2014中描述的嵌合肽，如α-突触核蛋白/Aβ，其结合GM1和GM3(Yahi,Nouara和Jacques Fantini."Deciphering the glycolipid code of Alzheimer's andParkinson's amyloid proteins allowed the creation of a universal ganglioside-binding Peptide."PloS one 9.8(2014):e104751)。

在一个实施方案中，GBM是蛋白质或蛋白质片段。适宜用作GBM的蛋白质的实例包括生长因子受体，如表皮生长因子受体(EGFR)，其结合GM3、GM1、GM2、GM4、GD3、GD1a和GT1b，以及血管内皮生长因子受体(VEGFR)，其结合GM3、GD1a和GT1b(Krengel,Ute和PaulaA.Bousquet."Molecular recognition of gangliosides and their potential forcancer immunotherapies."Frontiers in Immunology，2014，vol 5，第325篇文章)。

在一个优选的实施方案中，GBM来自细菌毒素，例如，GBM选自霍乱毒素B亚基(CtxB)和大肠杆菌热不稳定的肠毒素(LT)。

GM1(或GM1a)是唯一已知的霍乱毒素B亚基(CtxB)的受体。因此，通过将霍乱毒素的B亚基工程化至梭菌神经毒素或其片段中，可以将其选择性地靶向含有GM1的神经元。GM1还是大肠杆菌的热不稳定的肠毒素的受体(Zoeteweij，J.Paul等，"GM1binding-deficientexotoxin is a potent noninflammatory broad spectrum intradermalimmunoadjuvant."The Journal of Immunology 177.2(2006):1197-1207)。

还假设根据本发明的杂合神经毒素(其中GBM来自细菌毒素)特别适用于杂合神经毒素的局部递送。实际上，也已经显示细菌外毒素可以安全地局部用于人体皮肤(Zoeteweij，J.Paul等，"GM1binding-deficient exotoxin is a potentnoninflammatory broad spectrum intradermal immunoadjuvant."The Journal ofImmunology 177.2(2006):1197-1207)。

在一个实施方案中，所述神经节苷脂是GM1并且GBM选自CtxB和大肠杆菌热不稳定的肠毒素(LT)。

霍乱毒素(CT)由革兰氏阴性细菌霍乱弧菌(Vibrio cholerae)分泌。CT属于较大的AB毒素家族，其具有负责诱导毒性的酶促活性A结构域和负责细胞进入的细胞结合B结构域。CT属于AB₅子家族，其由六个多肽组成，单个A亚基和同型五聚B亚基，在分泌前自我装配形成全毒素(holotoxin)。其他AB₅毒素包括热不稳定的肠毒素、志贺菌毒素、志贺菌样毒素和百日咳毒素。CT A-和B-亚基(分别为CtxA和CtxB)是非共价连接的。27kDa A亚基含有位于残基192和195之间的丝氨酸蛋白酶切割位点，其允许A亚基切割成两个多肽：A2链和A1链。残基187和199之间的二硫键将这些链桥接在一起。A1链负责CT的酶促活性。五个11.5kDa B亚基非共价地装配，形成结合质膜上的神经节苷脂GM1的同型五聚体。B5-亚基-GM1复合物将A亚基携入内质网中。逆易位后，A1链作为修饰异三聚体G蛋白Gsα的活性ADP-核糖基转移酶进入胞质溶胶中。这种G蛋白的修饰导致腺苷酸环化酶的组成型激活和cAMP的快速产生。在肠道细胞中，这会引起肠道氯化物分泌，其伴随着大量的水分流动和腹泻，这是霍乱的标志(Wernick，Naomi LB等，"Cholera toxin:an intracellular journeyinto the cytosol by way of the endoplasmic reticulum."Toxins 2.3(2010):310-325.)。

霍乱毒素B亚基氨基酸序列的一个实例提供为SEQ ID NO:9(UniProtKB登录号P01556)，其由信号肽(SEQ ID NO:9的氨基酸残基1至21)和B亚基(SEQ ID NO:9的氨基酸残基22至124)组成。

霍乱毒素A亚基氨基酸序列的一个实例提供为SEQ ID NO:10(UniProtKB登录号P01555)，其由信号肽(SEQ ID NO:10的氨基酸残基1至18)、A1结构域(SEQ ID NO:10的氨基酸残基19至212)和A2结构域(SEQ ID NO:10的氨基酸残基213至258)组成。

已经表明单体B亚基足以结合细胞并完成中毒途径(Jobling，Michael G.等，"Asingle native ganglioside GM1-binding site is sufficient for cholera toxin tobind to cells and complete the intoxication pathway."MBio 3.6(2012):e00401-12)。

发明人已经表明向内部阴性BoNT/A1(BoNT/A1(0))添加CtxB结构域赋予BoNT/A1结合GM1的能力，GM1是神经节苷脂，其不是BoNT/A1的天然受体。

不希望受到理论的束缚，由于霍乱毒素对GM1的结合亲和力大于BoNT对其相应神经节苷脂的结合亲和力的事实，假设CtxB亚基将导致增加的效力。例如，已显示BoNT/B对与GT1b/GD1a(双受体模型)相关的复合突触结合蛋白的亲和力在nM范围中(“高亲和力0.4nM，低亲和力4.1nM”)(Nishiki等，FEBS Letters 1996)，比Kuzimeko等，Biochemistry 1996报道的Ctx-B和GM1之间的pM亲和力高1000倍。

根据本发明的CtxB结构域优选包含SEQ ID NO：9的氨基酸残基22至124，或与其具有至少70％，优选至少75％，80％，85％，90％，95％或99％序列同一性的多肽序列。应理解，根据本发明的CtxB结构域能够结合GM1。

在一个优选的实施方案中，选择性神经节苷脂结合部分包含一个或多个霍乱毒素B亚基(CtxB)。

在一个实施方案中，轻链共价结合所述一个或多个霍乱毒素B亚基(CtxB)。

在一个实施方案中，选择性神经节苷脂结合部分包含一个CtxB。在一个实施方案中，选择性神经节苷脂结合部分包含两个CtxB。在一个实施方案中，选择性神经节苷脂结合部分包含三个CtxB。在一个实施方案中，选择性神经节苷脂结合部分包含四个CtxB。在一个实施方案中，选择性神经节苷脂结合部分包含五个CtxB。

在一个实施方案中，选择性神经节苷脂结合部分包含一个或多个CtxB，其在梭菌轻链的C末端。在一个实施方案中，选择性神经节苷脂结合部分包含一个或多个CtxB，其在梭菌轻链的N末端。在一个实施方案中，选择性神经节苷脂结合部分由一个CtxB组成，其在梭菌轻链的C末端。在一个实施方案中，选择性神经节苷脂结合部分由一个CtxB组成，其在梭菌轻链的N末端。在一个实施方案中，选择性神经节苷脂结合部分由两个CtxB组成，其在梭菌轻链的C末端。在一个实施方案中，选择性神经节苷脂结合部分由两个CtxB组成，其在梭菌轻链的N末端。在一个实施方案中，选择性神经节苷脂结合部分由三个CtxB组成，其在梭菌轻链的C末端。在一个实施方案中，选择性神经节苷脂结合部分由三个CtxB组成，其在梭菌轻链的N末端。在一个实施方案中，选择性神经节苷脂结合部分由四个CtxB组成，其在梭菌轻链的C末端。在一个实施方案中，选择性神经节苷脂结合部分由四个CtxB组成，其在梭菌轻链的N末端。在一个实施方案中，选择性神经节苷脂结合部分由五个CtxB组成，其在梭菌轻链的C末端。在一个实施方案中，选择性神经节苷脂结合部分由五个CtxB组成，其在梭菌轻链的N末端。

在一个实施方案中，杂合神经毒素包含梭菌H_N结构域和选择性神经节苷脂结合部分包含一个或多个CtxB，其在梭菌H_N结构域的C末端。在另一个实施方案中，一个或多个CtxB在梭菌H_N结构域的N末端。在一个实施方案中，选择性神经节苷脂结合部分由一个CtxB组成，其在梭菌H_N结构域的C末端。在一个实施方案中，选择性神经节苷脂结合部分由一个CtxB组成，其在梭菌H_N结构域的N末端。在一个实施方案中，选择性神经节苷脂结合部分由两个CtxB组成，其在梭菌H_N结构域的C末端。在一个实施方案中，选择性神经节苷脂结合部分由两个CtxB组成，其在梭菌H_N结构域的N末端。在一个实施方案中，选择性神经节苷脂结合部分由三个CtxB组成，其在梭菌H_N结构域的C末端。在一个实施方案中，选择性神经节苷脂结合部分由三个CtxB组成，其在梭菌H_N结构域的N末端。在一个实施方案中，选择性神经节苷脂结合部分由四个CtxB组成，其在梭菌H_N结构域的C末端。在一个实施方案中，选择性神经节苷脂结合部分由四个CtxB组成，其在梭菌H_N结构域的N末端。在一个实施方案中，选择性神经节苷脂结合部分由五个CtxB组成，其在梭菌H_N结构域的C末端。在一个实施方案中，选择性神经节苷脂结合部分由五个CtxB组成，其在梭菌H_N结构域的N末端。

在一个实施方案中，选择性神经节苷脂结合部分包含一个或多个霍乱毒素B亚基(CtxB)和杂合神经毒素进一步包含霍乱毒素A2亚基(CtxA2)。优选地，CtxA2与梭菌轻链共价结合。再优选，CtxA2与梭菌轻链共价结合，并且CtxB与梭菌轻链形成非共价连接。特别地，认为霍乱毒素A2亚基(CtxA2)可以作为栓系，与B亚基五聚体(CtxB5)形成非共价连接，其将结合靶细胞上的神经节苷脂并且将梭菌轻链内在化至细胞中。

不希望受到理论的束缚，假设这样的其中CtxB通过非共价连接(连接CtxA2亚基)结合杂合神经毒素的实施方案允许CtxB亚基的五聚排列(CtxB₅)，并且由此导致杂合神经毒素对GM1提高的结合亲和性。

根据本发明的CtxA2结构域优选包含SEQ ID NO:10的氨基酸残基213至258，或与其具有至少70％，优选至少75％，80％，85％，90％，95％或99％序列同一性的多肽序列。理解根据本发明的CtxA2结构域能够结合CtxB结构域。优选地，CtxA2结构域包含SEQ ID NO:10的残基255至258(KDEL)。

CtxA2结构域可以在梭菌轻链的C-末端或N-末端。

在一个实施方案中，选择性神经节苷脂结合部分包含一个或多个霍乱毒素B亚基(CtxB)，其与梭菌轻链非共价结合，并且杂合神经毒素进一步包含霍乱毒素A2亚基(CtxA2)和H_N结构域，其与梭菌轻链共价结合。在一个实施方案中，CtxA2结构域在梭菌H_N结构域的N末端并且优选位于激活位点和H_N结构域之间(“中心呈现(central presentation)”)。在一个实施方案中，CtxA2结构域在梭菌H_N结构域的C末端，并且当杂合神经毒素包含H_CN和/或H_CC结构域时，神经节苷脂结合部分可以位于H_CN或H_CC结构域的C末端或N末端。杂合神经毒素可以在CtxA2结构域和L、H_N、H_CN和/或H_CC结构域之间包含衔接物。

在一个实施方案中，梭菌轻链与选择性神经节苷脂结合部分共价连接。选择性神经节苷脂结合部分可以在梭菌轻链的C末端或N末端。

在一个实施方案中，杂合神经毒素包含梭菌H_N结构域，并且梭菌H_N结构域与选择性神经节苷脂结合部分共价连接。选择性神经节苷脂结合部分可以在梭菌H_N结构域的C末端或N末端。当选择性神经节苷脂结合部分在梭菌H_N结构域的N末端时，优选位于激活位点和H_N结构域之间(“中心呈现”)。

当选择性神经节苷脂结合部分在梭菌H_N结构域的C末端并且杂合神经毒素进一步包含H_CN结构域和/或H_CC结构域时，神经节苷脂结合部分可以位于H_CN或H_CC结构域的C末端或N末端。

杂合神经毒素在神经节苷脂结合结构域和L、H_N、H_CN和/或H_CC结构域之间可以包含衔接物。不希望受到理论的束缚，假设衔接物的存在可以增强杂合神经毒素的稳定性和/或神经节苷脂结合部分对其靶神经节苷脂的可利用性，和/或提高表达。

合适的衔接物的实例包括不同长度的GS衔接物，例如GS5、GS10、GS15、GS18和GS20、N10、HX27、(EAAAK)₃和A(EAAAK)₄ALEA(EAAAK)₄A。更多实例提供于文献中，例如，Chen，Xiaoying等，"Fusion protein linkers:property,design and functionality."Advanced drug delivery reviews 65.10(2013):1357-1369，在此引用并入本文作为参考。

以下显示了根据本发明的杂合神经毒素的结构排列的实例(GBM：神经节苷脂结合部分；TD：易位结构域；BD：蛋白受体结合结构域；L、H_N、H_CN、H_CC：如本文中定义的梭菌结构域；AS：激活位点；从左至右：C末端至N末端)：

·L–GBM

·GBM–L

·L–AS–GBM

·GBM–AS–L

·L–AS–GBM–TD

·L–AS–TD–GBM

·GBM–TD–AS–L

·TD–GBM–AS–L

·GBM–L–AS-TD

·L–AS–GBM–TD–BD

·L–AS–BD–TD–GBM

·GBM–TD–BD–AS–L

·BD–TD–GBM–AS–L

·L–AS–GBM–H_N

·L–AS–H_N–GBM

·GBM–H_N–AS–L

·H_N–GBM–AS–L

·GBM–L–AS-HN

·L–AS–GBM–H_N–H_CN

·L–AS–GBM–H_N–H_CN–H_CC

·L–AS–H_N–GBM

·L–AS–H_N–H_CN–GBM

·L–AS–H_N–H_CN–H_CC–GBM

·L–AS–GBM–衔接物–H_N

·L–AS–GBM–衔接物–H_N–H_CN

·L–AS–GBM–衔接物–H_N–H_CN–H_CC

·L–AS–H_N–衔接物–GBM

·L–AS–H_N–H_CN–衔接物–GBM

·L–AS–H_N–H_CN–H_CC–衔接物–GBM

·GBM–L–AS–H_N–H_CN–H_CC

·L–AS–衔接物–GBM–H_N

·L–AS–衔接物–GBM–H_N–H_CN

·L–AS–衔接物–GBM–H_N–H_CN–H_CC

·L–AS–衔接物–GBM–衔接物–H_N

·L–AS–衔接物–GBM–衔接物–H_N–H_CN

·L–AS–衔接物–GBM–衔接物–H_N–H_CN–H_CC

在一个实施方案中，本发明的杂合神经毒素包含H_N结构域并且是双链形式，并且在L结构域和H_N结构域之间包含二硫键。

优选地，杂合神经毒素的结构排列使得GBM具有游离的N-末端或C-末端。在包含允许杂合神经毒素转化成双链形式的激活位点(AS)的实施方案中，杂合神经毒素的结构排列优选使得GBM在转化成双链形式后具有游离的N-末端或C-末端。

在包含蛋白受体结合结构域(BD)的实施方案中，例如，H_C或H_CC，杂合神经毒素的结构排列优选使得BD具有游离的N-末端或C-末端，并且更优选GBM和BD两者都具有游离的N-末端或C-末端。在包含允许杂合神经毒素转化成双链形式的激活位点(AS)的实施方案中，杂合神经毒素的结构排列优选使得BD在转化成双链形式后具有游离的N-末端或C-末端，并且更优选GBM和BD两者在转化成双链形式后都具有游离的N-末端或C-末端。

使用重组技术可以生产本发明的杂合神经毒素。因此，在一个实施方案中，根据本发明的杂合神经毒素是重组杂合神经毒素。

在另一个方面中，本发明提供了编码本发明的杂合神经毒素的核苷酸序列，例如，DNA或RNA序列。在一个优选实施方案中，所述核苷酸序列是DNA序列。

可以使用本领域已知的任何合适的方法来制得本发明的核酸分子。因此，可以使用化学合成技术来制得核酸分子。或者，可以使用分子生物学技术来制得本发明的核酸分子。

优选通过计算机(in silico)来设计本发明的DNA序列，并且随后通过常规DNA合成技术来合成。

根据待使用的最终宿主细胞(例如，大肠杆菌)表达系统，任选将上述核酸序列信息针对密码子偏好来进行修饰。

在另一个方面中，本发明提供了包含本发明的核苷酸序列的载体。在一个实施方案中，作为包含启动子和终止子的DNA载体的一部分来制备核酸序列。在一个优选实施方案中，载体具有选自Tac、AraBAD、T7-Lac或T5-Lac的启动子。

载体可以适用于上述核酸序列的体外和/或体内表达。载体可以是用于瞬时和/或稳定基因表达的载体。载体可以另外包含调节元件和/或选择标记。载体可以是病毒来源的、噬菌体来源的或细菌来源的。例如，表达载体可以是pET、pJ401、pGEX载体或其衍生物。

在另一个方面中，本发明提供了包含本发明的核苷酸序列或载体的细胞。合适的细胞类型包括原核细胞，例如，大肠杆菌，和真核细胞，如酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞。优选地，细胞是大肠杆菌。

本发明的杂合神经毒素特别适用于治疗中。

Guillain-Barré综合征是一种急性炎症疾患，其影响外周神经系统并且由免疫系统产生的抗体与神经节苷脂的结合引起。基于从Guillain-Barré综合征的临床亚型的发现，神经节苷脂GM1a、GM1b、GD1a、GalNAc-GD1a与四肢的神经肌肉接头有关，而神经节苷脂GT1a、GQ1b与头颈神经肌肉接头有关(Van Den Berg,Bianca等，"Guillain-Barrésyndrome:pathogenesis,diagnosis,treatment and prognosis."Naturereviews.Neurology 10.8(2014)：469；Willison,Hugh J.和Jaap J.Plomp."Anti-ganglioside Antibodies and the Presynaptic Motor Nerve Terminal."Annals ofthe New York Academy of Sciences 1132.1(2008)：114-123)。GM1还已经显示出大量存在于腮腺(唾液腺)中(Nowroozi，Nakisa等，"HIGH LEVELS OF GM 1-GANGLIOSIDE AND GM1-GANGLIOSIDE β-GALACTOSIDASE IN THE PAROTID GLAND:A New Model for SecretoryMechanisms of the Parotid Gland."Otolaryngologic Clinics of North America32.5(1999)：779-791)。

报道了阿尔茨海默病(AD)患者的额叶和颞叶皮质的脂筏中的GM1和GM2浓度较高。GM1成簇在背根神经节神经元(感觉神经元)中得到证实(Aureli,Massimo等，"GM1ganglioside:past studies and future potential."Molecular neurobiology 53.3(2016)：1824-1842)。

已显示出神经节苷脂NeuAc GM3、NeuGc GM3、GM2、GM1、GD3和GD2在人肿瘤细胞中表达(Krengel,Ute和Paula A.Bousquet."Molecular recognition of gangliosides andtheir potential for cancer immunotherapies."Frontiers in Immunology，2014年7月，vol.5，第325篇文章)。

在一个实施方案中，选择性神经节苷脂结合部分结合选自GM1a、GM1b、GD1a和GalNAc-GD1a的一种或多种神经节苷脂。认为这些实施方案特别适用于治疗肢体疾病，例如上肢痉挛、下肢痉挛、局灶性肌张力障碍、肢体肌肉劳损、重复性劳损(RSI)、累积性创伤障碍或职业过度使用综合征。实际上，不希望受到理论的束缚，据推测，将杂交神经毒素靶向在肢体神经肌肉接头处发现的神经节苷脂可以增加肢体神经肌肉接头的选择性，并避免由于脱靶效应引起的副作用。

在一个实施方案中，选择性神经节苷脂结合部分结合选自GT1a和GQ1b的一种或多种神经节苷脂。认为这些实施方案特别适用于治疗头颈部疾病，例如颈部肌张力障碍、眼睑痉挛、偏头痛、肌筋膜疼痛、斜视、面肌痉挛、眼睑疾病、痉挛性发音困难、喉肌张力障碍、口下颌发音障碍、舌肌张力障碍、磨牙症和吞咽困难。实际上，不希望受到理论的束缚，据推测，将杂交神经毒素靶向头颈神经肌肉接头处发现的神经节苷脂允许增加头颈神经肌肉接头的选择性，并避免因脱靶效应引起的副作用。

在一个实施方案中，选择性神经节苷脂结合部分结合GM1。认为这个实施方案特别适用于治疗流涎(流涎过多，流口水)。还推测了这个实施方案可能适用于治疗患有阿尔茨海默病或其他神经疾患的患者。

在一个实施方案中，选择性神经节苷脂结合部分结合选自NeuAc GM3、NeuGc GM3、GM2、GM1、GD3和GD2的一种或多种神经节苷脂。认为这些实施方案特别适用于治疗癌症。

在另一个方面中，本发明提供了包含根据本发明的杂合神经毒素的药物组合物。优选地，药物组合物包含杂合神经毒素与至少一种选自药物学上可接受的载体、赋形剂、佐剂、推进剂和/或盐的组分。

在另一个方面中，本发明提供了根据本发明的用于治疗中的杂合神经毒素或药物组合物。

根据本发明的杂合神经毒素或药物组合物适用于治疗与不想要的神经元活性相关的病症，例如，选自痉挛性发音困难、痉挛性斜颈、喉肌张力障碍、口下肌萎缩、舌肌张力障碍、颈肌张力障碍、局灶性肌张力障碍、眼睑痉挛、斜视、面肌痉挛、眼睑紊乱、脑瘫、局灶性痉挛和其他嗓音障碍、痉挛性结肠炎、神经性膀胱、肛门痉挛、肢体痉挛、抽搐、震颤、磨牙症、肛裂、贲门失弛缓症、吞咽困难和其他肌张力障碍以及其他特征在于肌肉群不自主运动的疾患、流泪、多汗症、过度分泌唾液、过度胃肠分泌物、分泌性疾病、肌肉痉挛引起的疼痛、头痛、偏头痛和皮肤病的病症。

在另一个方面中，本发明提供了根据本发明的杂合神经毒素或药物组合物用于处理审美或美容状况的非治疗性用途。根据本发明的这个方面，针对美学或美容状况待处理的受试者优选没有患有本文中所述的任一种病理性疾患或病症。更优选地，所述受试者是健康的受试者(即，未患有任何病理性疾病或病症)。

在另一个方面中，本发明提供了包含梭菌轻链和选择性神经节苷脂结合部分的杂合神经毒素，其中选择性神经节苷脂结合部分不是梭菌H_CC或H_C结构域，并且其中所述选择性神经节苷脂结合部分结合选自GM1a、GM1b、GD1a和GalNAc-GD1a的一种或多种神经节苷脂，用于治疗与不想要的神经元活性相关的肢体疾病。在一个实施方案中，肢体疾病选自上肢痉挛、下肢痉挛和局灶性手肌张力障碍。在一个优选实施方案中，神经节苷脂是GM1a。

在另一个方面中，本发明提供了包含梭菌轻链和选择性神经节苷脂结合部分的杂合神经毒素，其中选择性神经节苷脂结合部分不是梭菌H_CC或H_C结构域，并且其中所述选择性神经节苷脂结合部分结合选自GT1a和GQ1b的一种或多种神经节苷脂，用于治疗与不想要的神经元活性相关的头或颈疾病。在一个实施方案中，头或颈疾病选自颈肌张力障碍、眼睑痉挛、偏头痛、肌筋膜疼痛、斜视、面肌痉挛、眼睑疾病、痉挛性发音困难、喉肌张力障碍、口下颌发音障碍、舌肌张力障碍、磨牙症和吞咽困难。

在另一个方面中，本发明提供了包含梭菌轻链和选择性神经节苷脂结合部分的杂合神经毒素，其中选择性神经节苷脂结合部分不是梭菌H_CC或H_C结构域，并且其中所述选择性神经节苷脂结合部分结合GM1，用于治疗流涎(或流涎过多或流口水)。

在另一个方面中，本发明提供了包含梭菌轻链和选择性神经节苷脂结合部分的杂合神经毒素，其中选择性神经节苷脂结合部分不是梭菌H_CC或H_C结构域，并且其中所述选择性神经节苷脂结合部分结合选自NeuAc GM3、NeuGcGM3、GM2、GM1、GD3和GD2的一种或多种神经节苷脂，用于治疗癌症。

在另一个方面中，本发明提供了一种治疗方法，包括将治疗有效量的根据本发明的杂合神经毒素或药物组合物施用于需要其的患者。

在另一个方面中，本发明提供了一种治疗与不想要的神经元活性相关的肢体疾病的方法，包括将治疗有效量的杂合神经毒素施用于需要其的患者，所述杂合神经毒素包含梭菌轻链和选择性神经节苷脂结合部分，其中选择性神经节苷脂结合部分不是梭菌H_CC或H_C结构域，并且其中所述选择性神经节苷脂结合部分结合选自GM1a、GM1b、GD1a和GalNAc-GD1a的一种或多种神经节苷脂。

在另一个方面中，本发明提供了一种治疗与不想要的神经元活性相关的头或颈疾病的方法，包括将治疗有效量的杂合神经毒素施用于需要其的患者，所述杂合神经毒素包含梭菌轻链和选择性神经节苷脂结合部分，其中选择性神经节苷脂结合部分不是梭菌H_CC或H_C结构域，并且其中所述选择性神经节苷脂结合部分结合选自GT1a和GQ1b的一种或多种神经节苷脂。

在另一个方面中，本发明提供了一种治疗流涎(或流涎过多，或流口水)的方法，包括将治疗有效量的杂合神经毒素施用于需要其的患者，所述杂合神经毒素包含梭菌轻链和选择性神经节苷脂结合部分，其中选择性神经节苷脂结合部分不是梭菌H_CC或H_C结构域，并且其中所述选择性神经节苷脂结合部分结合GM1。

在另一个方面中，本发明提供了一种治疗癌症的方法，包括将治疗有效量的杂合神经毒素施用于需要其的患者，所述杂合神经毒素包含梭菌轻链和选择性神经节苷脂结合部分，其中选择性神经节苷脂结合部分不是梭菌H_CC或H_C结构域，并且其中所述选择性神经节苷脂结合部分结合选自NeuAc GM3、NeuGc GM3、GM2、GM1、GD3和GD2的一种或多种神经节苷脂。

应当理解，与本文所述的杂合神经毒素相关的所有其他各种特征和优选的实施方案经必要的改变适用于本发明的治疗和美容方面。

还应当理解根据本发明的药物组合物可以用于本发明的治疗和美容目的。

本发明的工程化杂合神经毒素可以配制成用于口服、肠胃外施用、持续输注、吸入或局部施用。适用于注射的组合物以是溶液、悬浮液或乳液的形式，或干粉形式，其在使用前溶解或悬浮于合适的载体中。

在局部递送杂合神经毒素的情况中，杂合神经毒素可以配制成霜剂(例如，用于局部施用)，或用于真皮下注射。

局部递送方式可以包括气溶胶，或其他喷雾(例如，喷雾剂)。在这个方面，杂合神经毒素的气溶胶制剂能够递送至肺和/或其他鼻和/或支气管或气管通道。

可以在涉及受影响器官的神经支配的脊柱段水平，在脊柱中，通过鞘内或硬膜外注射，将本发明的杂合神经毒素给药于患者。

优选的给药途径是通过腹腔镜和/或局部的，特别是肌内注射。

给药本发明神经毒素的剂量范围是产生所需治疗效果的剂量范围。应当理解，所需的剂量范围取决于杂合神经毒素或组合物的确切性质，给药途径，制剂的性质，患者的年龄，患者症状的性质、程度或严重性，禁忌症，如果有的话，以及主治医师的判断。可以使用用于优化的标准经验程序调整这些剂量水平的变化。

通常使用杂合神经毒素和无热原的无菌载体制备流体剂型。根据所用的载体和浓度，工程化杂合神经毒素可以溶解或悬浮液载体中。在制备溶液中，可以将杂合神经毒素溶解于载体中，如果需要，通过添加氯化钠，将溶液制成等渗的，并且使用无菌技术通过无菌滤器的过滤来灭菌，接着装入合适的无菌小瓶或安瓿中，并密封。或者，如果溶液稳定性是合适的，可以通过高压灭菌将密封容器中的溶液灭菌。有利地，添加剂，如缓冲剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂或杀菌剂、悬浮剂或乳化剂和或局部麻醉剂，可以溶解于载体中。

可以在无菌区域中使用无菌技术通过将预先灭菌的成分装入无菌容器中来制备干粉，其在使用前溶解或悬浮于合适的载体中。或者，可以在无菌区域中使用无菌技术，将成分溶解于合适的容器中。随后将产品冷冻干燥并将容器无菌密封。

以基本上相同的方式来制备适用于肌内、皮下或皮内注射的肠胃外悬浮液，除了无菌组分悬浮于无菌载体中，替代溶解，并且不可以通过过滤来完成灭菌。组分可以是以无菌状态分离的，或备选地，可以在分离后灭菌，例如，通过γ辐射。

根据本发明的给药可以利用各种递送技术，包括微粒包胶、病毒递送系统或高压气溶胶撞击。

本公开不受限于本文公开的示例性方法和材料，并且与本文所述那些相似或相等的任何方法和材料可以用于本公开实施方案的实施或测试中。除非另外指明，分别地，任何核酸序列从左到右以5’到3’方向书写；氨基酸序列从左到右以氨基到羧基方向书写。

在提供值的范围的情况下，应理解的是，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限和下限之间的每个中间值，至下限单位的十分之一，也被具体公开了。在所述范围内的任何所述值或中间值与所述范围内的任何其他所述或中间值之间的每个较小范围包含在本公开中。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在该范围内或排除在该范围内，并且在较小范围内包括任一个、没有或两个限制的每个范围也包括在本公开内，受所述范围中任何特别排除的限制。

必须注意的是，如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个”，“一种”和“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“一种梭菌神经毒素”包括多种这样的候选剂，以及提及“该梭菌神经毒素”包括提及一种或多种梭菌神经毒素及其本领域技术人员已知的等价物，诸如此类。

序列信息

·SEQ ID NO:1-BoNT/A1–UniProtKB登录号P10845(肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum))

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·SEQ ID NO:2-BoNT/B1–UniProtKB登录号P10844(肉毒梭菌)

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·SEQ ID NO:3-BoNT/C1–UniProtKB登录号P18640(肉毒梭菌)

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·SEQ ID NO:4-BoNT/D–UniProtKB登录号P19321(肉毒梭菌)

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·SEQ ID NO:5-BoNT/E–登录号WP_003372387(肉毒梭菌)

MPKINSFNYNDPVNDRTILYIKPGGCQEFYKSFNIMKNIWIIPERNVIGTTPQDFHPPTSLKNGDSSYYDPNYLQSDEEKDRFLKIVTKIFNRINNNLSGGILLEELSKANPYLGNDNTPDNQFHIGDASAVEIKFSNGSQDILLPNVIIMGAEPDLFETNSSNISLRNNYMPSNHGFGSIAIVTFSPEYSFRFNDNSMNEFIQDPALTLMHELIHSLHGLYGAKGITTKYTITQKQNPLITNIRGTNIEEFLTFGGTDLNIITSAQSNDIYTNLLADYKKIASKLSKVQVSNPLLNPYKDVFEAKYGLDKDASGIYSVNINKFNDIFKKLYSFTEFDLATKFQVKCRQTYIGQYKYFKLSNLLNDSIYNISEGYNINNLKVNFRGQNANLNPRIITPITGRGLVKKIIRFCKNIVSVKGIRKSICIEINNGELFFVASENSYNDDNINTPKEIDDTVTSNNNYENDLDQVILNFNSESAPGLSDEKLNLTIQNDAYIPKYDSNGTSDIEQHDVNELNVFFYLDAQKVPEGENNVNLTSSIDTALLEQPKIYTFFSSEFINNVNKPVQAALFVSWIQQVLVDFTTEANQKSTVDKIADISIVVPYIGLALNIGNEAQKGNFKDALELLGAGILLEFEPELLIPTILVFTIKSFLGSSDNKNKVIKAINNALKERDEKWKEVYSFIVSNWMTKINTQFNKRKEQMYQALQNQVNAIKTIIESKYNSYTLEEKNELTNKYDIKQIENELNQKVSIAMNNIDRFLTESSISYLMKLINEVKINKLREYDENVKTYLLNYIIQHGSILGESQQELNSMVTDTLNNSIPFKLSSYTDDKILISYFNKFFKRIKSSSVLNMRYKNDKYVDTSGYDSNININGDVYKYPTNKNQFGIYNDKLSEVNISQNDYIIYDNKYKNFSISFWVRIPNYDNKIVNVNNEYTIINCMRDNNSGWKVSLNHNEIIWTLQDNAGINQKLAFNYGNANGISDYINKWIFVTITNDRLGDSKLYINGNLIDQKSILNLGNIHVSDNILFKIVNCSYTRYIGIRYFNIFDKELDETEIQTLYSNEPNTNILKDFWGNYLLYDKEYYLLNVLKPNNFIDRRKDSTLSINNIRSTILLANRLYSGIKVKIQRVNNSSTNDNLVRKNDQVYINFVASKTHLFPLYADTATTNKEKTIKISSSGNRFNQVVVMNSVGNNCTMNFKNNNGNNIGLLGFKADTVVASTWYYTHMRDHTNSNGCFWNFISEEHGWQEK

·SEQ ID NO:6-BoNT/F–UniProtKB登录号YP_001390123(肉毒梭菌)

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·SEQ ID NO:7-BoNT/G–UniProtKB登录号WP_039635782(肉毒梭菌)

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·SEQ ID NO:8-TeNT–UniProtKB登录号P04958(破伤风梭菌(Clostridiumtetani))

MPITINNFRYSDPVNNDTIIMMEPPYCKGLDIYYKAFKITDRIWIVPERYEFGTKPEDFNPPSSLIEGASEYYDPNYLRTDSDKDRFLQTMVKLFNRIKNNVAGEALLDKIINAIPYLGNSYSLLDKFDTNSNSVSFNLLEQDPSGATTKSAMLTNLIIFGPGPVLNKNEVRGIVLRVDNKNYFPCRDGFGSIMQMAFCPEYVPTFDNVIENITSLTIGKSKYFQDPALLLMHELIHVLHGLYGMQVSSHEIIPSKQEIYMQHTYPISAEELFTFGGQDANLISIDIKNDLYEKTLNDYKAIANKLSQVTSCNDPNIDIDSYKQIYQQKYQFDKDSNGQYIVNEDKFQILYNSIMYGFTEIELGKKFNIKTRLSYFSMNHDPVKIPNLLDDTIYNDTEGFNIESKDLKSEYKGQNMRVNTNAFRNVDGSGLVSKLIGLCKKIIPPTNIRENLYNRTASLTDLGGELCIKIKNEDLTFIAEKNSFSEEPFQDEIVSYNTKNKPLNFNYSLDKIIVDYNLQSKITLPNDRTTPVTKGIPYAPEYKSNAASTIEIHNIDDNTIYQYLYAQKSPTTLQRITMTNSVDDALINSTKIYSYFPSVISKVNQGAQGILFLQWVRDIIDDFTNESSQKTTIDKISDVSTIVPYIGPALNIVKQGYEGNFIGALETTGVVLLLEYIPEITLPVIAALSIAESSTQKEKIIKTIDNFLEKRYEKWIEVYKLVKAKWLGTVNTQFQKRSYQMYRSLEYQVDAIKKIIDYEYKIYSGPDKEQIADEINNLKNKLEEKANKAMININIFMRESSRSFLVNQMINEAKKQLLEFDTQSKNILMQYIKANSKFIGITELKKLESKINKVFSTPIPFSYSKNLDCWVDNEEDIDVILKKSTILNLDINNDIISDISGFNSSVITYPDAQLVPGINGKAIHLVNNESSEVIVHKAMDIEYNDMFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEQYGTNEYSIISSMKKHSLSIGSGWSVSLKGNNLIWTLKDSAGEVRQITFRDLPDKFNAYLANKWVFITITNDRLSSANLYINGVLMGSAEITGLGAIREDNNITLKLDRCNNNNQYVSIDKFRIFCKALNPKEIEKLYTSYLSITFLRDFWGNPLRYDTEYYLIPVASSSKDVQLKNITDYMYLTNAPSYTNGKLNIYYRRLYNGLKFIIKRYTPNNEIDSFVKSGDFIKLYVSYNNNEHIVGYPKDGNAFNNLDRILRVGYNAPGIPLYKKMEAVKLRDLKTYSVQLKLYDDKNASLGLVGTHNGQIGNDPNRDILIASNWYFNHLKDKILGCDWYFVPTDEGWTND

·SEQ ID NO:9–霍乱毒素B亚基(霍乱弧菌(Vibrio cholera))

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·SEQ ID NO:10–霍乱毒素A亚基(霍乱弧菌)

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·SEQ ID NO:11-BoNT/A1(0)-CtxBCP(人工序列)

MGSMEFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHQLIYAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVDGIITSKTKSDDDDKTPQNITDLCAEYHNTQIHTLNDKIFSYTESLAGKREMAIITFKNGATFQVEVPGSQHIDSQKKAIERMKDTLRIAYLTEAKVEKLCVWNNKTPHAIAAISMANSGGGGSGGGGSGGGGSPRGSALNLQCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPLRKSFHHHHHH

现在将参考以下附图和实施例，仅通过举例来描述本发明。

附图简述：

图1：Ctx-BoNT杂合神经毒素的实例。

图2：通过HisTrap HP捕获柱的SDS-PAGE分析的级分。级分E3-F6中的靶构建体洗脱液(250mM-500mM咪唑)。

图3：通过第二个色谱步骤阴离子交换的SDS-PAGE分析的级分。级分13-30中洗脱的靶蛋白(跨过递增的NaCl浓度)。

图4：用肠激酶激活后，通过SDS-PAGE分析的级分。分析表明了蛋白质在蛋白水解激活前不稳定，尽管一些构建体显示出保持完整。肠激酶激活确实切割轻链和重链之间的构建体，并且从SDS-PAGE分析表明至少一些产物是预计的组成，即，完整的轻链和重链以及以中心呈现中连接的GS20和CtxB。

图5：用肠激酶激活后的蛋白质印迹分析。5A-用单克隆tetra his抗体，抗小鼠二抗缀合物处理的印迹；5B-用抗LcA抗体和抗兔二抗缀合物处理的印迹。

图6：GM1竞争性结合分析中游离Ctx-B、BoNT/A1(0)-CtxBCP和BoNT/A1(0)的评价。

实施例

实施例1-BoNT/A1(0)-CtxBCP的表达和纯化

基于CtxB一级蛋白序列(SEQ ID NO:11的残基22至103)设计了(针对大肠杆菌)密码子优化的构建体，并将内部阴性(endonegative)BoNT/A亚克隆至具有T5启动子的pJ401质粒中，以产生中心呈现的构建体(BoNT/A1(0)-CtxBCP)，具有肠激酶激活位点(EK)、GS20衔接物和C-末端His标签：L_cA(0)-EK-CtxB-GS20-H_cA-6HT。

将构建体转化至补充了甘油(0.4％，Sigma)、葡糖胺(0.2％，Sigma)和30μg/mlKan(Sigma)的mTB培养基(胰蛋白胨12g/l，酵母提取物24g/l，磷酸氢二钾9.4g/l，磷酸二氢钾2.2g/l，Melford)中的大肠杆菌菌株BL21(DE3)中。挑选单个的克隆，以接种小瓶的microbank珠。将接种的珠子储存在-80℃直至需要。将一个珠子用于在37℃接种100ml mTB培养基。当600nm处的吸光值达到4.6时，将100ml培养物中的10ml加入2L烧瓶中的1L培养基中，并且将培养物在37℃生长至OD600≥1.0。将温度降至16℃，并且使培养物冷却1小时，接着添加IPTG至1mM的终浓度。诱导持续20小时。随后通过在6000g在4℃离心20分钟来收集培养物。将用过的培养基倾析，并将沉淀物冷冻并储存在-80℃，直至需要。

将细胞沉淀物融化并以6ml/g重悬浮于裂解缓冲液(50mM Tris pH8.0，200mMNaCl)中。用匀浆器通过在20kpsi单次通过来裂解细胞。通过在30,000g离心30分钟来清除细胞碎片和不溶性物质。收集上清液并加载至5ml HisTrap柱上(预先装载了Ni²⁺)并用裂解缓冲液平衡。加载后，用裂解缓冲液将柱子洗涤50ml，接着跨过25ml 40mM、50ml 80mM、25ml125mM、25ml 250mM和25ml 500mM递增的咪唑浓度的逐步梯度来洗脱蛋白质。将流通物以2.5ml级分收集，并且通过SDS-PAGE测定了目标嵌合体的位置(图2)。

将含有目标蛋白的级分E3-F6(250mM-500mM咪唑)合并并使用53ml 26/10脱盐柱脱盐。将材料脱盐至QHP结合缓冲液(50mM Tris pH8.0)中。将缓冲液交换的材料作为一个集合保存，并通过阴离子交换进一步加工。

使用5ml HiTrap QHP柱，来进一步纯化嵌合体。将柱子在结合缓冲液(50mM TrispH8.0)中预先平衡，接着加载脱盐集合。用结合缓冲液将柱子洗涤25ml，接着在100ml中的0至350mM NaCl线性梯度中洗脱蛋白质。随后用25ml中的350mM-1M NaCl的高盐步骤洗涤柱子。将流通物以2.5ml级分收集，并通过SDS-PAGE分析来测定哪些级分含有目标蛋白(图3)。

将含有目标蛋白的级分13-30合并和浓缩，接着在4℃用肠激酶激活18小时，并且添加AEBSF来终止反应。

通过SDS-PAGE分析了该最终的材料(图4)。

分析显示出蛋白质在蛋白水解激活前不稳定，尽管一些构建体显示出保持完整。肠激酶激活确实切割轻链和重链之间的构建体，并且从SDS-PAGE分析表明至少一些产物是预计的组成，即，完整的轻链和重链以及以中心呈现连接的GS20和CtxB。

还通过蛋白质印迹分析了样品，以证实轻链和his-标签的存在(图5)。使用Bio-Rad trans-blot turbo转移系统，将蛋白质从凝胶转移至硝基纤维素膜。在PBST 0.5％BSA中封闭印迹。用单克隆tetra his抗体，抗小鼠二抗缀合物处理印迹或用抗LcA和抗兔二抗处理它们。使用超级信号(super signal)底物来产生信号并以Pxi 4来检测。蛋白质印迹显示了对于全长靶标以及产物相关的截短物的阳性信号。

实施例2-BoNT/A1(0)-CtxBCP与GM1的结合

简而言之，将透明的F96Maxisorp平板用100ng/ml GM1包被过夜，用2％BSA-PBS溶液封闭，并用所示浓度的游离霍乱毒素B亚基(游离Ctx-B)、BoNT/A1(0)-CtxBCP或BoNT/A1(0)预先孵育。用40μg/ml与辣根过氧化物酶缀合的霍乱毒素B亚基(Ctx-B-HRP)进一步孵育平板。用发色液测定洗涤后平板上的HRP活性，并且停止反应后测定450nm处的吸光度。数据是三个重复孔的平均±s.e.平均(图6)。

图6显示了：

·如预期的，BoNT/A1(0)没有与Ctx-B(Ctx-B-HRP)竞争结合GM1；

·如预期的，游离Ctx-B与Ctx-B-HRP竞争，并且具有0.2μg/ml的pEC₅₀；

·BoNT/A1(0)-CtxBCP能够与Ctx-B-HRP竞争，呈现比游离Ctx-B低约100倍的pEC₅₀(49μg/ml)。

总之，添加Ctx-B结构域赋予BoNT/A1(0)以结合GM1的能力，所述GM1是一种不为BoNT/A1(0)天然受体的神经节苷脂。

Claims

1.包含梭菌轻链(L)和选择性神经节苷脂结合部分的杂合神经毒素，其中所述选择性神经节苷脂结合部分不是梭菌H_CC或H_C结构域。

2.根据权利要求1的杂合神经毒素，其中所述杂合神经毒素进一步包含易位部分。

3.根据权利要求2的杂合神经毒素，其中所述易位部分选自梭菌H_N结构域、霍乱毒素A2亚基(CtxA2)和细胞穿透肽。

4.根据权利要求2或3的杂合神经毒素，其中所述易位部分是梭菌H_N结构域，并且其中所述杂合神经毒素在轻链和梭菌H_N结构域之间包含激活位点。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的杂合神经毒素，其中所述杂合神经毒素进一步包括梭菌H_CN和/或H_CC结构域。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的杂合神经毒素，其中所述选择性神经节苷脂结合部分结合选自以下的一种或多种神经节苷脂：GM1如GM1a或GM1b、GM2、GM3如NeuAc GM3或NeuGc GM3、GM4、GD1a、GalNAc-GD1a、GT1a、GT1b、GQ1b、GD2、GD3和它们的组合。

7.根据权利要求6的杂合神经毒素，其中所述选择性神经节苷脂结合部分结合GM1，并且其中所述选择性神经节苷脂结合部分包含一个或多个霍乱毒素B亚基(CtxB)或大肠杆菌热不稳定的肠毒素(LT)。

8.根据权利要求7的杂合神经毒素，其中所述选择性神经节苷脂结合部分包含一个或多个霍乱毒素B亚基(CtxB)和所述轻链共价结合所述一个或多个霍乱毒素B亚基(CtxB)。

9.根据权利要求7的杂合神经毒素，其中所述选择性神经节苷脂结合部分包含一个或多个霍乱毒素B亚基(CtxB)和所述杂合神经毒素包含霍乱毒素A2亚基(CtxA2)，其中所述CtxA2共价结合所述梭菌轻链，并且其中所述CtxB与所述梭菌轻链形成非共价连接。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的杂合神经毒素，其中所述梭菌轻链来自BoNT A型、B型、C1型、D型、E型、F型或G型或TeNT。

11.编码根据权利要求1至10中任一项所述的杂合神经毒素的核苷酸序列。

12.包含根据权利要求11的核苷酸序列的载体。

13.包含根据权利要求11的核苷酸序列或根据权利要求12的载体的细胞。

14.包含根据权利要求1至10中任一项所述的杂合神经毒素的药物组合物。

15.根据权利要求1至10中任一项所述的杂合神经毒素或根据权利要求14的药物组合物，用于治疗中。

16.根据权利要求1至10中任一项所述的杂合神经毒素，或根据权利要求14的药物组合物，用于治疗与不想要的神经元活性相关的肢体疾病，其中所述选择性神经节苷脂结合部分结合一种或多种选自GM1a、GM1b、GD1a和GalNAc-GD1a的神经节苷脂。

17.根据权利要求1至10中任一项所述的杂合神经毒素，或根据权利要求14的药物组合物，用于治疗与不想要的神经元活性相关的头或颈疾病，其中所述选择性神经节苷脂结合部分结合一种或多种选自GT1a和GQ1b的神经节苷脂。

18.根据权利要求1至10中任一项所述的杂合神经毒素，或根据权利要求14的药物组合物，用于治疗流涎，其中所述选择性神经节苷脂结合部分结合神经节苷脂部分GM1。

19.根据权利要求1至10中任一项所述的杂合神经毒素，或根据权利要求14的药物组合物，用于治疗癌症，其中所述选择性神经节苷脂结合部分结合一种或多种选自NeuAc GM3、NeuGc GM3、GM2、GM1、GD3和GD2的神经节苷脂。

20.根据权利要求1至10中任一项所述的杂合神经毒素或根据权利要求14的药物组合物的非治疗性用途，用于处理美学状况。