CN114989271A

CN114989271A - 重组a型肉毒素的制备方法

Info

Publication number: CN114989271A
Application number: CN202210572145.3A
Authority: CN
Inventors: 郭力鸣; 包国庆; 沈玉保; 李佳男; 吴琪; 孙宝财; 蔡元宁; 王超; 高欣; 马庆男
Original assignee: Junhemeng Biopharmaceutical Hangzhou Co ltd
Current assignee: Junhemeng Biopharmaceutical Hangzhou Co ltd
Priority date: 2022-05-24
Filing date: 2022-05-24
Publication date: 2022-09-02
Anticipated expiration: 2042-05-24
Also published as: CN114989271B

Abstract

本发明涉及一种重组A型肉毒素的制备方法。所述方法包括：采用基因重组的方法进行制备，构建分别表达轻链蛋白、重链蛋白的基因工程菌；将轻链蛋白进行第一变性处理，得到第一变性产物；将重链蛋白进行第二变性处理，得到第二变性产物；将所述第一变性产物和第二变性产物按比例混合，进行复性及组装处理，获得所述A型肉毒素。本发明的方法工艺简单、制备流程短，制备得到的A型肉毒素的纯度高、毒性高。

Description

重组A型肉毒素的制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及一种重组A型肉毒素的制备方法，更具体地，本发明涉及一种基因重组制备A型肉毒素的方法和A型肉毒素。

背景技术

肉毒素(botulinum neurotoxin，BoNT)是一种由厌氧肉毒梭状芽孢杆菌(简称“肉毒梭菌”)产生的神经毒素，是世界上已知毒性最强的物质之一，肉毒素分为7种类型的血清型(A型-G型)，其中最常见的为A型，称为A型肉毒素(Botulinum neurotoxin of type A，BoNT/A)。多项研究表明，BoNT/A具有广泛的应用前景，不仅在医学美容方面，随着在各种肌张力障碍、手足多汗症、疼痛以及其他疑难杂症等领域的临床应用，其治疗范围在不断扩大。

BoNT/A的结构分为两部分：轻链(LC，50kD)和重链(HC，100kD)，轻链和重链间靠一对二硫键链接(C430-C454)，非酰胺键链接。轻链为活性结构域，具有锌依赖性金属内肽酶活性，是毒素的毒性部分；重链包含两个结构域，结合结构域和转位结构域，结合结构域负责与神经细胞膜上相应受体结合，并在内体膜上形成离子通道，转位结构域负责轻链的转位，将轻链移送至细胞内，轻链识别SNAP-25(一种突触囊泡相关蛋白)上的Q197-R198位点，对其进行特异性切割。

天然结构的活性BoNT/A蛋白，重链内具一对二硫键(C1235-C1280)，轻链、重链间具一对二硫键(C430-C454)。

BoNT/A的治疗机理为，在神经肌肉接头处，BoNT/A与神经细胞表面的相应受体结合，借助其重链N端，跨膜将轻链移送至细胞内，通过切割SNAP25来阻断乙酰胆碱的释放，引发肌肉持续的松弛性麻痹。

然而，在传统的制备BoNT/A的方法中，存在制备BoNT/A工艺繁杂、制备流程长、含大量非BoNT/A组分(如HA、NTNH)、纯度低等缺陷。因此，亟需开发一种新的制备BoNT/A的方法，获得高纯度的BoNT/A。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供了一种利用基因重组制备A型肉毒素的方法，本发明的方法工艺简单、制备流程短，制备的A型肉毒素不含非BoNT/A组分(如HA、NTNH)、纯度高、毒性高。

本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

自然状态下BoNT/A由肉毒梭菌产生，BoNT/A与血凝素(Hemagglutinin，HA)和非毒素非血凝素(Non-toxic non-HA，NTNH)通过非共价键组成BoNT/A复合物。目前，国内外市售BoNT/A制品大多数为BoNT/A复合物，注射后，BoNT/A复合物在偏碱性体液中非共价键被破坏，解离为独立的BoNT/A、HA和NTNH分子，BoNT/A扩散或随血液循环到达靶位点发挥作用，HA和NTNH不具有功能性作用，但具有凝血的副作用和刺激机体免疫系统产生抗体的风险。

目前，BoNT/A的制备方法有以下2种：

一是肉毒梭菌培养液提取制备BoNT/A，是目前已上市BoNT/A产品的通常制备方法。完整制备过程需16个步骤完成，包括肉毒梭菌培养、培养液过滤、超滤、凝胶层析等一系列步骤，最终得到BoNT/A原液。该制备方法提取步骤繁杂、流程长，完整流程需要15-20天时间，效率低。BoNT/A原液纯度低，除了含BoNT/A外，还含HA及NTNH等组分，具凝血、过敏等不良反应风险，不宜长期使用。

二是大肠杆菌发酵制备BoNT/A，该制备方法在专利号为US10307468B2的专利中有记载。具体为，对转化了目标蛋白基因的大肠杆菌进行发酵，发酵液经离心、细胞破碎及系列纯化过程后，进行毒性激活，制备BoNT/A原液。其制备产物为单组份，只含BoNT/A，但由于目标蛋白毒性激活需要加入Lys-C酶，虽然设计了纯化步骤将其除去，但依然会有少量Lys-C酶残余。这会产生两方面的不利作用，其一，外源Lys-C酶的引入，会导致终产品中有外源Lys-C酶的残留，影响生物药物的质量，存在很大的用药安全隐患。其二，Lys-C酶在很低的浓度下依然具有活性作用，其底物为BoNT/A，很容易产生在非目标激活位点的非特异性切割，导致轻链、重链的不均一性，影响产品质量，这同样存在很大的用药安全隐患。

理想的BoNT/A产品应具有如下特征：(1)使用安全菌株生产，代替肉毒梭菌，肉毒梭菌是自然界中最具毒性菌株之一，使用过程具高度危险性。(2)应具有单亚型、单组份，不含除BoNT/A型以外的任何血清亚型，不含HA、NTNH等非BoNT/A组分。(3)具有正确的高级结构构象，不含因序列不均一产生的序列异质体，适合长期使用。(4)BoNT/A的毒性激活不依靠外源工具酶产生，没有工具酶残留，避免对蛋白质的二次污染带来的安全风险。(5)提取步骤应简洁高效，流程短。(6)杂质少、纯度高，批次间质量均一。

但是，上述提到的两种方法均不能制备出理想的BoNT/A产品。

为了避免肉毒梭菌使用带来的安全风险、获取具有正确高级结构的不含序列异质体的BoNT/A蛋白，避免BoNT/A长期使用产生不良反应的风险，发明人通过对BoNT/A蛋白的高级结构、蛋白质特性进行研究和分析，发现部分表达体系(例如大肠杆菌B系列表达体系)能够直接表达BoNT/A的轻链蛋白和重链蛋白，表达的轻链蛋白和重链蛋白均以包涵体的形式存在，经变性、体外复性及组装后可以形成完整的BoNT/A分子，该方法的制备过程中无需使用蛋白酶进行毒性激活，可避免外源工具酶的残留及因切割不完全或非特异性切割而出现的非活性异构杂质体，同时无需单独表达完整BoNT/A分子，避免了因蛋白分子过大而形成错误高级结构的倾向和风险。并且，发明人还经过大量实验，筛选得到了本发明的复性及组装缓冲液，通过该复性及组装缓冲液可降低轻链蛋白和重链蛋白折叠过程中二硫键的错配，提高轻链蛋白和重链蛋白的正确复性及组装率，提高组装液中目标蛋白(BoNT/A)的含量。同时，发明人还经过大量实验，发现纯化步骤对BoNT/A的纯度有显著影响，依次采用疏水层析、硫酸铵盐析、透析、阴离子层析和分子筛层析处理的纯化体系，可得到纯度达98.0％以上的BoNT/A蛋白。

本发明所提出的BoNT/A制备方法简洁、高效，制备流程短，获得目标蛋白(BoNT/A)的纯度高，只需经过8个步骤、4-5天的时间即可完成全流程制备，制备得到具有正确结构构象的单亚型、单组份BoNT/A，该BoNT/A中不含HA、NTNH、酶残留等非BoNT/A组分，具有序列一致性等优点。

在本发明的第一方面，本发明提供了一种基因重组制备A型肉毒素的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将轻链蛋白进行第一变性处理，得到第一变性产物；将重链蛋白进行第二变性处理，得到第二变性产物；将所述第一变性产物和第二变性产物进行复性及组装处理，获得所述A型肉毒素。

本发明的制备方法可制备得到具有正确构象的不含序列异质体的单亚型、单组份BoNT/A蛋白，该BoNT/A中不含HA、NTNH、酶残留等非BoNT/A组分，具有批次间质量稳定等优点，更适合商业化规模生产。并且，该制备方法工艺简洁、高效，制备流程短，只需经过8个步骤、4-5天的时间即可完成全流程制备。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种A型肉毒素。根据本发明的实施例，所述A型肉毒素是依据第一方面所述的方法制备获得的。发明人经过实验发现，采用第一方面所述的方法可制备得到具有正确构象的单亚型、单组份BoNT/A，该BoNT/A中不含HA、NTNH、酶残留等非BoNT/A组分，且具有批次间的质量稳定等优点。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种A型肉毒素。根据本发明的实施例，所述A型肉毒素的LD₅₀为1-20pg/只，所述A型肉毒素的纯度在98.0％以上。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点，从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为本发明实施例2中的BoNT/A-LC、BoNT/A-HC表达及包涵体的SDS-PAGE图；

图2为本发明实施例4中复性及组装后样品的SDS-PAGE图；

图3为本发明实施例5中BoNT/A蛋白的SDS-PAGE图；

图4为本发明实施例5中BoNT/A蛋白的SEC色谱纯度；

图5为本发明实施例6结构鉴定中完整分子量数据分析图；

图6为本发明实施例6结构鉴定中还原分子量数据分析图；

图7为本发明实施例6结构鉴定中二硫键位置分析图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。

在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。

在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。

在本文中，术语“BoNT/A”、“BoNT/A蛋白”和“BoNT/A组分”均指A型肉毒素。

在本文中，术语“LC”、“BoNT/A-LC”和“BoNT/A-LC蛋白”均指A型肉毒素的轻链蛋白。

在本文中，术语“HC”、“BoNT/A-HC”和“BoNT/A-HC蛋白”均指A型肉毒素的重链蛋白。

在本文中，术语“轻链蛋白”和“轻链”同义。术语“重链蛋白”和“重链”同义。

本发明提出了一种基因重组制备A型肉毒素的方法和A型肉毒素，下面将分别对其进行详细描述。

基因重组制备A型肉毒素的方法

在本发明的第一方面，本发明提出了一种基因重组制备A型肉毒素的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将轻链蛋白进行第一变性处理，得到第一变性产物；将重链蛋白进行第二变性处理，得到第二变性产物；将所述第一变性产物和第二变性产物进行复性及组装处理，获得所述A型肉毒素。

发明人通过对BoNT/A蛋白的高级结构、蛋白质特性进行研究和分析，并经过大量的实验发现，将轻链蛋白和重链蛋白经变性处理，然后在体外进行复性及组装处理，最终形成完整的有活性的A型肉毒素。该方法无需额外使用蛋白酶进行毒性激活，即可避免外源工具酶的残留，亦可避免因切割不完全或非特异性切割而出现的非活性异构杂质体；同时无需单独表达完整BoNT/A蛋白分子，避免了因蛋白分子过大而形成错误高级结构的倾向和风险。因此，该方法可制得单亚型、单组份的BoNT/A，该BoNT/A中不含HA、NTNH、酶残留等非BoNT/A组分，具有批次间的质量稳定等优点。

根据本发明的实施例，所述轻链蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

根据本发明的实施例，所述重链蛋白具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

根据本发明的实施例，所述轻链蛋白或重链蛋白是通过如下方式获得的：将质粒导入大肠杆菌中，所述质粒携带编码所述轻链蛋白或重链蛋白的基因；将导入有所述质粒的大肠杆菌在适于蛋白表达的条件下进行培养处理，经诱导、收获菌体、菌体破碎、离心等过程，获得所述轻链蛋白或重链蛋白。由此，可获得组成BoNT/A蛋白分子的轻链蛋白或重链蛋白。

根据本发明的实施例，所述第一变性处理或所述第二变性处理在变性缓冲液中进行，所述变性缓冲液包括：5～10M尿素、5～15mM二硫苏糖醇和10～30mM Tris或Tris-HCl。发明人经过大量实验得到上述较优配方，由此，使轻链蛋白的氨基酸链和重链蛋白的氨基酸链处于完全伸展状态。

根据本发明的实施例，所述变性缓冲液的pH值为9.5～10.5。由此，更有利于轻链蛋白和重链蛋白的氨基酸链的伸展。

根据本发明的实施例，进行所述复性及组装处理之前，预先将所述第一变性产物和所述第二变性产物进行混合处理，得到变性混合液。发明人经过大量实验发现，将第一变性产物和第二变性产物先混合再同时复性，可使单链复性与重链和轻链间组装同时进行。

根据本发明的实施例，所述混合处理中所述第一变性产物和所述第二变性产物的体积比为1:(1～10)。

根据本发明的实施例，所述复性及组装处理在复性及组装缓冲液中进行，所述复性及组装缓冲液包括：50～150mM NaCl、0.1～1.0mM ZnCl₂、0.1～1.0mM CaCl₂、1.0～10.0mM还原性谷胱甘肽(GSH)、1.0～10.0mM氧化性谷胱甘肽(GSSG)、40～50mM Tris-HCl和0.4～0.6％(w/v)吐温20(Tween-20)。发明人经过大量的筛选实验得到上述优选配方，该复性及组装缓冲液可使变性的、处于伸展状态的轻链蛋白和重链蛋白进行折叠、组装，折叠、组装过程中可减少轻链或重链蛋白内及轻链蛋白和重链蛋白间二硫键的错配率，具有较高的单链(轻链、重链)正确复性率和双链间组装效率，获得组装液中具有较高的目标蛋白(BoNT/A)含量，可使后续制得的具有正确的链内二硫键及链间二硫键的BoNT/A蛋白纯度更高、活性(毒性)更好。

根据本发明的实施例，所述复性及组装缓冲液的pH值为9.5～10.5。由此，可进一步提高重链内及轻、重链间二硫键的正确配对率，提高组装液中目标蛋白的含量。

根据本发明的实施例，所述变性混合液与所述复性及组装缓冲液的体积比为1：(1～10)。发明人经过大量实验得到上述较优配比，由此，可提高复性及组装处理过程中重链内及轻、重链间二硫键的正确配对率，提高组装液中目标蛋白的含量。

根据本发明的实施例，所述复性及组装处理的处理时间为12～16h。发明人经过大量实验得到上述较优复性及组装处理条件，由此，有利于重链蛋白内或轻链蛋白和重链蛋白之间二硫键的正确连接，并组装形成具有正确高级结构的A型肉毒素。

根据本发明的实施例，所述复性及组装处理的搅拌转速为50～200rpm。发明人经过大量实验得到上述较优复性及组装处理条件，由此，有利于重链蛋白内或轻链蛋白和重链蛋白之间二硫键的正确连接，并组装形成具有正确高级结构的A型肉毒素。

根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：将所述复性及组装处理得到的组装液依次经过疏水层析、硫酸铵盐析、透析、阴离子层析和分子筛层析处理，获得所述A型肉毒素。发明人经过大量实验得到上述纯化步骤，发明人发现，在上述纯化步骤和纯化体系下，有利于去除组装液中的杂质，获得的A型肉毒素纯度可达98.0％以上。并且，发明人还发现，若改变上述五种纯化处理的顺序，或者去除其中一种或多种纯化处理，均会显著降低最终获得的A型肉毒素的纯度。

根据本发明的实施例，所述疏水层析处理的流动相A1包括10～30mmol/L Tris-HCl、2～8mmol/L EDTA和1～3mol/L NaCl，流动相B1包括10～30mmol/L Tris和2～8mmol/LEDTA，所述流动相A1和流动相B1的pH值均为8.0～9.0。发明人经过大量实验得到上述较优纯化条件，由此，对含有A型肉毒素的组装液的纯化效果较佳。

根据本发明的实施例，所述硫酸铵盐析处理包括：将硫酸铵缓慢加入所述疏水层析处理得到的洗脱液中，至硫酸铵饱和浓度80％，2～8℃条件下搅拌12～24h得盐析液，然后将盐析液在2～8℃、10000～15000rpm的条件下进行20～40min离心，弃上清，得沉淀。发明人经过大量实验得到上述较优纯化条件，由此，可进一步提高A型肉毒素的纯度。

根据本发明的实施例，所述透析处理包括：将所述沉淀物溶解于第一缓冲液中，获得待透析液；将所述待透析液与第一透析液进行第一透析处理；将得到的第一透析处理产物与第二透析液进行第二透析处理；其中，第一缓冲液选自40～60mM Tris-HCl缓冲液，第一透析液选自40～60mM Tris-HCl含盐透析液，第二透析液选自40～60mM Tris-HCl透析液。发明人经过大量实验得到上述较优纯化条件，由此，得到的A型肉毒素的纯度高。并且，发明人经过大量实验还发现，第一透析处理过程中，盐的存在可保证已溶解蛋白的持续溶解性，同时可避免杂质在目标蛋白表面的非特异性吸附，因此，第一透析液选择含盐透析液，可进一步提高透析处理得到的A型肉毒素的纯度。

需要说明的是，“40～60mM Tris-HCl含盐透析液”是指含有盐的Tris-HCl透析液，其中该透析液中的Tris-HCl的浓度为40～60mM。

根据本发明的实施例，所述沉淀物的重量g与所述第一缓冲液的体积ml比为1:(5～15)。发明人经过大量实验得到上述较优配比，由此，可进一步提高A型肉毒素的纯度。

根据本发明的实施例，所述第一透析处理的透析时间为2～5h，所述第二透析处理的透析时间为12～24h。由此，透析处理的效果较佳。

根据本发明的实施例，所述Tris-HCl含盐透析液还包括200～300mM NaCl。

根据本发明的实施例，所述第一透析处理和所述第二透析处理的透析管的截留分子量为80～120kDa。

根据本发明的实施例，所述阴离子层析处理选自DEAE纤维素阴离子层析。

根据本发明的实施例，所述DEAE纤维素阴离子层析的流动相A2包括10～30mmol/LTris-HCl，流动相B2包括10～30mmol/L Tris-HCl和0.5～1.5mol/L NaCl，所述流动相A2和流动相B2的pH值为8.5。发明人经过大量实验得到上述较优纯化条件，由此，可进一步提高A型肉毒素的纯度。

根据本发明的实施例，所述分子筛层析处理采用G-25M分子筛层析。

根据本发明的实施例，所述G-25M分子筛层析的流动相C包括10～30mmol/L Tris-HCl，所述流动相C的pH值为8.0～9.0。发明人经过大量实验得到上述较优纯化条件，由此，可进一步提高A型肉毒素的纯度。

根据本发明的实施例，所述G-25M分子筛层析的载量≤30％柱体积/cycle，线性流速250～350cm/h。

A型肉毒素

在本发明的第二方面，本发明提出了一种A型肉毒素。根据本发明的实施例，所述A型肉毒素是依据第一方面所述的方法制备获得的。发明人经过实验发现，采用第一方面所述的方法可制备得到具有正确构象的单亚型、单组份BoNT/A，该BoNT/A中不含HA、NTNH、酶残留等非BoNT/A组分，具有批次间的质量稳定性等优点。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种A型肉毒素。根据本发明的实施例，所述A型肉毒素的LD₅₀为1-20pg/只，所述A型肉毒素的纯度在98％以上。

根据本发明的实施例，所述A型肉毒素的轻链蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

根据本发明的实施例，所述A型肉毒素的重链蛋白具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：BoNT/A轻链蛋白(BoNT/A-LC)、BoNT/A重链蛋白(BoNT/A-HC)表达质粒的设计与构建

1、目的基因设计与合成：根据目的蛋白氨基酸序列，设计目的基因核苷酸序列，根据大肠杆菌偏爱密码子进行优化，确定轻链蛋白、重链蛋白的核苷酸序列。其中，设计的核苷酸序列委托宝生物工程(大连)有限公司合成，轻链蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1、重链蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，编码轻链蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO:3、编码重链蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。

轻链蛋白的氨基酸序列(LC)：

MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNK(SEQ ID NO:1)。

重链蛋白的氨基酸序列(HC)：

ALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL(SEQ ID NO:2)。

编码轻链蛋白的核苷酸序列：

ATGCCGTTTGTGAACAAACAGTTTAACTATAAAGATCCGGTGAACGGCGTGGATATTGCGTATATTAAAATTCCGAACGCGGGTCAGATGCAGCCGGTGAAAGCGTTTAAAATTCATAACAAAATTTGGGTGATTCCGGAACGCGATACCTTTACCAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAACAAGTGCCGGTGAGCTATTATGATAGCACCTATCTGAGCACCGATAACGAAAAAGATAACTATCTGAAAGGCGTGACCAAACTGTTTGAACGCATTTATAGCACCGATCTGGGCCGCATGCTGCTGACGAGCATTGTGCGCGGCATTCCGTTCTGGGGCGGCAGCACCATTGATACCGAACTGAAAGTGATTGATACCAACTGCATTAACGTGATTCAGCCGGATGGCAGCTATCGCAGCGAAGAACTGAACCTGGTGATTATTGGCCCGAGCGCGGATATTATTCAGTTTGAATGCAAAAGCTTTGGCCATGAAGTGCTGAACCTGACCCGCAACGGCTATGGCAGCACGCAGTATATTCGCTTTAGCCCGGATTTTACCTTTGGCTTTGAAGAAAGCCTGGAAGTGGATACCAACCCGCTGCTGGGCGCGGGCAAATTTGCGACCGATCCGGCGGTGACCCTGGCGCATGAACTGATTCATGCGGGCCATCGCCTGTATGGCATTGCGATTAACCCGAACCGCGTGTTTAAAGTGAACACCAACGCGTATTATGAAATGAGCGGCCTGGAAGTGAGCTTTGAAGAACTGCGCACCTTTGGCGGCCATGATGCGAAATTTATTGATAGCCTGCAAGAAAACGAATTTCGCCTGTATTACTATAACAAATTTAAAGATATTGCGAGCACCCTGAACAAAGCGAAAAGCATTGTGGGCACCACCGCGAGCCTGCAGTATATGAAAAACGTGTTTAAAGAAAAATATCTGCTGAGCGAAGATACGAGCGGCAAATTTAGCGTGGATAAACTGAAATTTGATAAACTGTATAAAATGCTGACCGAAATTTATACCGAAGATAACTTTGTGAAATTTTTTAAAGTGCTGAACCGCAAGACCTATCTGAACTTTGATAAAGCGGTGTTTAAAATTAACATTGTGCCGAAAGTGAACTATACCATTTATGATGGCTTTAACCTGCGCAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAACACCGAAATTAACAACATGAACTTTACCAAACTGAAAAACTTTACCGGCCTGTTTGAATTTTATAAACTGCTGTGCGTTCGCGGCATCATTACGAGCAAAACCAAAAGCCTGGATAAAGGCTATAACAAATAA(SEQ ID NO:3)。

编码重链蛋白的核苷酸序列：

ATGGCGCTGAACGATCTGTGCATTAAAGTGAATAATTGGGATCTGTTTTTTAGCCCGAGCGAAGATAACTTTACCAACGATCTGAACAAAGGCGAAGAAATTACGAGCGATACCAACATTGAAGCGGCGGAAGAGAACATTAGTCTGGATCTGATTCAGCAGTATTATCTGACCTTTAACTTTGATAACGAACCGGAAAACATTAGTATTGAAAACCTGAGCAGCGATATTATTGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAACATTGAACGCTTTCCGAACGGCAAAAAATATGAACTGGATAAATATACCATGTTTCATTATCTGCGCGCGCAAGAATTTGAACATGGCAAAAGCCGCATTGCGCTGACCAACAGCGTGAACGAAGCGCTGCTGAACCCGAGCCGCGTGTATACCTTTTTTAGCAGCGATTATGTGAAAAAAGTGAACAAAGCGACCGAAGCGGCGATGTTTCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTGTATGATTTTACCGATGAGACGAGCGAAGTGAGTACCACCGATAAAATTGCGGATATTACCATTATCATTCCGTATATTGGCCCGGCGCTGAACATTGGCAACATGCTGTATAAAGATGATTTTGTGGGCGCGCTGATTTTTAGCGGCGCGGTGATTCTGCTGGAATTTATTCCGGAAATCGCGATTCCGGTGCTGGGCACCTTTGCGCTGGTGAGCTATATTGCGAACAAAGTGCTGACCGTGCAGACCATTGATAACGCGCTGAGCAAACGCAACGAAAAATGGGATGAAGTGTATAAATATATTGTGACCAACTGGCTGGCGAAAGTGAACACGCAGATTGATCTGATTCGCAAAAAAATGAAAGAAGCGCTGGAAAACCAAGCGGAAGCGACCAAGGCGATTATTAACTATCAGTATAATCAGTATACCGAAGAGGAAAAAAACAACATTAACTTTAACATTGATGATCTGAGCAGCAAATTAAATGAAAGCATTAACAAAGCGATGATCAACATTAACAAGTTTCTGAATCAGTGCAGCGTGAGCTATCTGATGAACAGCATGATTCCGTATGGCGTGAAACGCCTGGAAGATTTTGATGCGAGCCTGAAAGATGCGCTGCTGAAATATATTTATGATAACCGCGGCACCCTGATTGGCCAAGTGGATCGCCTGAAAGATAAAGTTAATAACACGCTGAGCACCGATATTCCGTTTCAGCTGAGCAAATATGTGGATAATCAGCGCCTGCTGAGCACCTTTACCGAATATATTAAAAACATTATTAACACGAGCATTCTGAACCTGCGCTATGAAAGCAACCATCTGATTGATCTGAGCCGCTATGCGAGCAAAATTAACATTGGCAGCAAAGTGAACTTTGATCCGATTGATAAAAATCAGATTCAGCTGTTTAACCTGGAAAGCAGCAAAATTGAAGTGATTCTGAAAAACGCGATTGTGTATAACAGCATGTATGAAAACTTTAGCACGAGCTTTTGGATTCGCATTCCGAAATACTTTAACAGCATCAGCCTGAACAACGAATATACCATTATTAACTGCATGGAAAACAACAGCGGCTGGAAAGTGAGCCTGAACTATGGCGAAATTATTTGGACCCTGCAAGATACCCAAGAAATTAAACAGCGCGTGGTGTTTAAATATAGTCAGATGATTAACATTAGCGATTATATTAACCGCTGGATTTTTGTGACCATTACCAACAACCGTCTGAACAACAGCAAAATTTATATTAACGGCCGCCTGATTGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGCAACATTCATGCGAGCAACAACATTATGTTTAAACTGGATGGCTGCCGCGATACGCATCGCTATATCTGGATTAAATATTTTAATCTGTTCGACAAAGAACTGAACGAAAAAGAAATTAAAGATCTGTATGATAATCAGAGCAACAGCGGCATTCTGAAAGATTTTTGGGGCGATTATCTGCAGTATGATAAACCGTATTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTGAACAACGTGGGCATTCGCGGCTATATGTATCTGAAAGGCCCGCGCGGCAGCGTGATGACCACCAACATTTATCTGAACAGCAGCCTGTATCGCGGCACCAAATTTATTATTAAAAAATATGCGAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGCAACAACGATCGCGTGTATATTAACGTGGTTGTGAAAAACAAAGAATATCGCCTGGCGACCAACGCGAGCCAAGCGGGCGTGGAAAAAATTCTGAGCGCGCTGGAAATTCCGGATGTGGGCAACCTGAGCCAAGTGGTTGTGATGAAAAGCAAAAACGATCAAGGCATTACCAACAAGTGCAAAATGAACCTGCAAGATAACAACGGCAACGATATTGGCTTTATTGGCTTTCATCAGTTTAACAACATTGCGAAACTGGTGGCGAGCAACTGGTATAACCGTCAGATTGAACGCAGCAGCCGCACCCTGGGCTGCAGCTGGGAATTTATTCCGGTTGATGATGGCTGGGGCGAACGCCCGCTGTAA(SEQ ID NO:4)。

2、表达质粒的构建，获得目的基因工程菌：轻链、重链目的基因两端各自分别具有XbaI和BamHI酶切位点，分别用XbaI和BamHI双酶切轻链、重链目的基因序列及pET-28a(+)载体，切胶回收，酶切后的目的基因片段与酶切后的pET-28a(+)的长片段连接，经过转化和筛选，分别得到表达轻链、重链目的基因的基因工程菌。

实施例2：轻链蛋白、重链蛋白的表达

分别将轻链、重链目的基因工程菌接入装有LB培养基的摇瓶中培养，待OD₆₀₀达到1.6～2.0，转入5L发酵罐中培养，起始培养体积2.5L，培养温度37℃，搅拌转速800rpm，待OD₆₀₀升至30开始诱导，诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，浓度0.5mM，诱导时间4～8h。

镜检发酵液菌体生长，并观察表达状况，待观察到有蛋白表达且诱导时间在4～8h后，收集发酵液，并4℃、10000rpm条件下离心30分钟，收集菌体。

将收集的菌体进行高压匀浆破碎，破碎压力700-800Bar，至少2个循环，至镜检无完整细胞存在，离心收集包涵体，包涵体分别用1：20(w/v，g/ml)超净水洗涤2次，轻链蛋白(BoNT/A-LC)、重链蛋白(BoNT/A-HC)表达及包涵体SDS-PAGE图谱如图1。

实施例3：BoNT/A-LC蛋白、BoNT/A-HC蛋白的变性

室温下，按重量比1：4分别称取BoNT/A-LC包涵体和BoNT/A-HC包涵体，按1：20(w/v，g/ml)比例分别各自溶解于变性缓冲液中，在转速为200rpm条件下进行搅拌，至全部溶解，继续搅拌60min。其中，变性缓冲液的组成：8M尿素、10mM二硫苏糖醇(DTT)和20mM Tris-HCl，pH值为10.0。

实施例4：BoNT/A蛋白的复性及体外组装

按等体积将实施例3得到的溶解后的轻链变性产物和重链变性产物混合，得变性混合液，再将变性混合液与复性及组装缓冲液按体积比1：10的比例混合，继续在转速为200rpm条件下进行搅拌，过夜复性及组装，得组装液。

复性及组装缓冲液的组成：100mM NaCl、0.5mM ZnCl₂、0.5mM CaCl₂、5mM GSH、5mMGSSG、50mM Tris-HCl和0.5％Tween-20，pH值为10.0。

取少量组装液进行SDS-PAGE电泳，观察复性及组装情况，结果如图2。

同时，用凝胶电泳成像仪(BIO-RAD，型号:ChemiDoc^TM XRS+)Image Lab软件扫描分析目标蛋白含量，分析结果显示，该体系下获得的目标蛋白(即为表1中序列4所对应的BoNT/A蛋白)含量为30.2％。实验过程中，为优化该复性及组装缓冲液体系组成，尚进行了大量组分组成及组分浓度探索实验，如金属离子、氧化-还原对、体系pH等，且每次实验过程中，控制加入相同量、相同比例的BoNT/A-LC蛋白和BoNT/A-HC蛋白，以保证考察实验变量下实验结果的可靠性。实验结果如表1：

表1：不同复性及组装体系组成对复性及组装结果的影响

实施例5：BoNT/A蛋白的纯化

将实施例4得到的组装液(序号4的组装液)依次进行疏水层析、硫酸铵盐析、透析、DEAE阴离子层析和分子筛层析处理。具体处理过程如下所示：

疏水层析：在实施例4得到的组装液加入4mol/L NaCl，至NaCl在组装液中的终浓度为2mol/L，作为上样原液。层析条件：流动相A1的组成：20mmol/L Tris+5mmol/L EDTA+2.0mol/L NaCl，pH值为8.5；流动相B1的组成：20mmol/L Tris+5mmol/L EDTA，pH值为8.5。层析步骤：流动相A1平衡3个柱体积(CV)，上样至载量，流动相A1冲洗6CV，0％-100％流动相B1 10CV梯度洗脱，收集吸收200mAU以上样品，得疏水层析洗脱液。

硫酸铵盐析：将硫酸铵缓慢加入所述疏水层析洗脱液中，至硫酸铵饱和浓度80％，4℃条件下搅拌20h，得盐析液，将盐析液在4℃、12000rpm的条件下进行离心，离心时间30min，弃上清，得沉淀。

透析：按沉淀、缓冲液1：10(w/v，g/ml)比例取50mM Tris-HCl缓冲液(pH值8.5)溶解沉淀，得待透析液。将得到的待透析液转移至透析管(截留分子量：100kDa)，在4℃条件下，与体积为待透析液的20倍的50mM Tris-HCl缓冲液(含100mM NaCl，pH值为8.5)搅拌(100rpm)透析3h。再与体积为待透析液20倍的50mM Tris-HCl缓冲液(pH值8.5)搅拌(100rpm)透析24h。

DEAE阴离子层析：将上述透析处理得到的透析液直接上样层析。流动相A2的组成：20mmol/L Tris，pH值为8.5；流动相B2的组成：20mmol/L Tris+1.0mol/L NaCl，pH值为8.5。层析步骤：流动相A2平衡3CV，上样至载量，流动相A2冲洗3CV，0％-50％流动相B1 20CV梯度洗脱，得到洗脱液。

G-25M分子筛层析：将DEAE阴离子层析处理中得到的洗脱液直接上样进行分子筛层析。流动相C：20mmol/L Tris，pH值为8.5，载量≤30％柱体积/cycle，线性流速300cm/h。收集各洗脱峰，合样采用SDS-PAGE进行纯度检测，得到BoNT/A样品，样品SDS-PAGE电泳结果如图3，目标蛋白(即为表2中序列6所对应的BoNT/A蛋白)SEC色谱纯度98.8％(图4)。

为获得上述优化的纯化工艺，发明人进行了大量影响因素实验，目的是优化纯化过程，获得高纯度BoNT/A样品，重点从纯化单元操作组成、纯化单元操作顺序方面进行，其中每次实验过程、每个单元操作近乎执行相同的实验条件，包括但不限于上样缓冲液组成、洗脱条件、pH值、填料载量、上样流速、柱高、柱直径、柱体积等，实验结果如表2：

表2：纯化过程对目标蛋白纯度的影响

实施例6：BoNT/A蛋白的结构鉴定

1.完整分子量检测

1.1样品处理：取1ml实施例5制得的BoNT/A蛋白样品，5倍浓缩后，混匀上样。

1.2 UPLC条件：

色谱柱：BioResolve RP mAb 2.7μm，2.1mm×100mm，Waters 01093809916819；柱温：50℃；检测波长：280nm；流速：0.3ml/min；上样量：10μl。

流动相A：0.05％TFA·H₂O(三氟乙酸水溶液)；流动相B：0.05％TFA·ACN(三氟乙酸·乙腈)。

梯度：

时间(min)	0	12	13	15	16	20
							B％	10	60	90	90	10	10

1.3 MS条件：

离子化方式：ESI positive；质量扫描范围：300～4000Da；毛细管电压：3.0KV；源温度：100℃；锥孔电压：150KV；脱溶剂气温度：450℃；锥孔反吹气流速：50L/H；脱溶剂气流速：800L/H。

1.4数据采集与处理：使用Masslynx V4.1软件进行数据采集，使用UNIFI软件进行数据分析，分析结果参见表3和图5。

表3：完整分子量数据分析

2.还原分子量检测

2.1样品处理：取150μl实施例5制得的BoNT/A蛋白样品，加入150μl 7mol/L盐酸胍、0.1mol/L Tris(pH值为8.0)和3μl 1mol/L DTT，70℃恒温孵育30min，混匀。

2.2 UPLC条件同步骤1.2。

2.3 MS条件同步骤1.3，其区别在于锥孔电压为40KV。

2.4数据采集与处理：使用Masslynx V4.1软件进行数据采集，使用UNIFI软件进行数据分析，分析结果参见表4和图6。

表4：还原分子量数据分析

峰	鉴定成分	理论分子量(Da)	实测分子量(Da)	误差(ppm)
					1	BoNT/A-LC	51159.5785	51160.3744	15.6
2	BoNT/A-HC	98151.2169	98153.5471	28.8
					3	BoNT/A-HC(脱酰胺修饰)	98152.3632	98155.2075	30.0

3.二硫键分析

3.1样品处理：取1ml实施例5制得的BoNT/A蛋白样品，然后进行5倍浓缩，在每个浓缩管里加350μl 0.05mol/L碳酸氢铵混匀，浓缩至100μl，在每个浓缩管里再加4μl1mol/L碘乙酰胺溶液(IAM)和350μl 0.05mol/L碳酸氢铵混匀，浓缩至100μl，取浓缩后的样品180μl，加20μl 1％RapiGest SF表面活性剂，60℃恒温孵育30min，再加入8μg胰蛋白酶，37℃恒温孵育过夜，取出后加1μl甲酸，37℃恒温孵育45min，取出后在13000rpm条件下进行10min离心，取上清混匀进样。

3.2UPLC条件：

色谱柱：UPLC BEH C18 1.7μm，2.1mm×150mm，Waters 01443804318321；柱温：60℃；检测波长：215nm；流速：0.3ml/min；上样量：10μl。

流动相A：0.05％TFA·H₂O；流动相B：0.05％TFA·ACN。

梯度：

时间(min)	0	5	140	141	145	146	150
								B％	2	2	40	100	100	2	2

3.3 MS条件：

离子化方式：ESI positive；质量扫描范围：100～2000Da；毛细管电压：3.0KV；源温度：100℃；锥孔电压：40KV；脱溶剂气温度：450℃；锥孔反吹气流速：50L/H；脱溶剂气流速：800L/H。

3.4数据采集与处理：使用Masslynx V4.1软件进行数据采集，使用UNIFI软件进行数据分析，分析结果参见表5和图7。

表5：二硫键数据分析表

4.数据分析结果：

由表3～5分析数据可知，BoNT/A蛋白的完整分子量、还原分子量和二硫键连接与理论值保持一致，说明纯化后的BoNT/A蛋白序列正确，具有正确的高级构象。

实施例7：BoNT/A蛋白的体内活性(毒性)初步测定

实验动物：ICR小鼠，4～5周龄，17～22g。

选取用实施例5方法制得的不同批次的BoNT/A样品作为供试品，分别编号1#、2#、3#和4#，每份供试品体积0.5ml，然后加入4.5ml生理盐水进行10倍梯度稀释，振摇3～4次混匀，置冰水混合物中。采用腹腔接种方式分别将四份供试品接种于四组小鼠体内，每组5只小鼠，每只接种0.1ml，连续观察3天，每天记录动物死亡情况，分析结果参见表6。

表6：不同组的动物死亡情况

注：“-”表示实验动物健康、健存，“+”表示实验动物死亡，如实验动物异常详细说明。

从实验结果可以看出：

在给定的供试品浓度下，各批次供试品(1#、2#、3#、4#)均表现出较好的体内活性(毒性)，其中2#、3#、4#供试品具有相对更好的体内活性(毒性)。

实施例8：BoNT/A蛋白的毒力测定

取60只ICR小鼠

称重，按体重随机分成10组，每组6只

将按实施例5方法制得的BoNT/A蛋白作为供试品，以300pg/只的剂量为起始量，以2倍梯度设置10个剂量梯度：300、150、75、37.5、18.75、9.375、4.6875、2.34375、1.171875和0.5859375pg/只，进行给药。每只小鼠按组别分别给予相应浓度的供试品，每只小鼠腹腔注射0.1ml按实施例5方法制得的BoNT/A蛋白，逐日观察并记录各组死亡数，连续观察4天。采用graphpad26，以转换后的剂量对数和死亡率进行logstic回归拟合，计算LD₅₀值。结果显示，供试品的LD₅₀为4.023pg/只，折算样品毒力为1.06×10⁸LD₅₀/mg，分析结果参见表7。

表7：梯度浓度下动物死亡率

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 君合盟生物制药（杭州）有限公司

<120> 重组A型肉毒素的制备方法

<130> PDI220545

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 448

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LC

<400> 1

Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly

1 5 10 15

Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro

20 25 30

Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg

35 40 45

Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu

50 55 60

Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr

65 70 75 80

Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu

85 90 95

Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val

100 105 110

Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys

115 120 125

Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr

130 135 140

Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile

145 150 155 160

Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr

165 170 175

Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe

180 185 190

Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu

195 200 205

Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu

210 215 220

Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn

225 230 235 240

Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu

245 250 255

Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys

260 265 270

Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn

275 280 285

Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val

290 295 300

Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys

305 310 315 320

Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu

325 330 335

Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp

340 345 350

Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn

355 360 365

Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr

370 375 380

Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn

385 390 395 400

Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu

405 410 415

Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg

420 425 430

Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys

435 440 445

<210> 2

<211> 848

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HC

<400> 2

Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe

1 5 10 15

Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu

20 25 30

Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu

35 40 45

Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro

50 55 60

Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu

65 70 75 80

Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu

85 90 95

Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu

100 105 110

His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu

115 120 125

Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys

130 135 140

Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu

145 150 155 160

Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr

165 170 175

Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala

180 185 190

Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu

195 200 205

Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala

210 215 220

Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys

225 230 235 240

Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu

245 250 255

Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys

260 265 270

Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu

275 280 285

Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn

290 295 300

Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp

305 310 315 320

Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile

325 330 335

Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met

340 345 350

Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys

355 360 365

Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly

370 375 380

Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp

385 390 395 400

Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser

405 410 415

Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn

420 425 430

Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser

435 440 445

Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn

450 455 460

Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu

465 470 475 480

Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser

485 490 495

Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn

500 505 510

Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val

515 520 525

Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu

530 535 540

Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser

545 550 555 560

Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg Leu

565 570 575

Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Pro

580 585 590

Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Asn Ile Met Phe Lys

595 600 605

Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp Ile Lys Tyr Phe

610 615 620

Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu Ile Lys Asp Leu Tyr

625 630 635 640

Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asp Tyr

645 650 655

Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn

660 665 670

Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu

675 680 685

Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser

690 695 700

Ser Leu Tyr Arg Gly Thr Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly

705 710 715 720

Asn Lys Asp Asn Ile Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val

725 730 735

Val Val Lys Asn Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala

740 745 750

Gly Val Glu Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn

755 760 765

Leu Ser Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Gln Gly Ile Thr

770 775 780

Asn Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly

785 790 795 800

Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala Ser

805 810 815

Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu Gly Cys

820 825 830

Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu Arg Pro Leu

835 840 845

<210> 3

<211> 1347

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 3

<400> 3

atgccgtttg tgaacaaaca gtttaactat aaagatccgg tgaacggcgt ggatattgcg 60

tatattaaaa ttccgaacgc gggtcagatg cagccggtga aagcgtttaa aattcataac 120

aaaatttggg tgattccgga acgcgatacc tttaccaacc cggaagaagg cgatctgaac 180

ccgccaccgg aagcgaaaca agtgccggtg agctattatg atagcaccta tctgagcacc 240

gataacgaaa aagataacta tctgaaaggc gtgaccaaac tgtttgaacg catttatagc 300

accgatctgg gccgcatgct gctgacgagc attgtgcgcg gcattccgtt ctggggcggc 360

agcaccattg ataccgaact gaaagtgatt gataccaact gcattaacgt gattcagccg 420

gatggcagct atcgcagcga agaactgaac ctggtgatta ttggcccgag cgcggatatt 480

attcagtttg aatgcaaaag ctttggccat gaagtgctga acctgacccg caacggctat 540

ggcagcacgc agtatattcg ctttagcccg gattttacct ttggctttga agaaagcctg 600

gaagtggata ccaacccgct gctgggcgcg ggcaaatttg cgaccgatcc ggcggtgacc 660

ctggcgcatg aactgattca tgcgggccat cgcctgtatg gcattgcgat taacccgaac 720

cgcgtgttta aagtgaacac caacgcgtat tatgaaatga gcggcctgga agtgagcttt 780

gaagaactgc gcacctttgg cggccatgat gcgaaattta ttgatagcct gcaagaaaac 840

gaatttcgcc tgtattacta taacaaattt aaagatattg cgagcaccct gaacaaagcg 900

aaaagcattg tgggcaccac cgcgagcctg cagtatatga aaaacgtgtt taaagaaaaa 960

tatctgctga gcgaagatac gagcggcaaa tttagcgtgg ataaactgaa atttgataaa 1020

ctgtataaaa tgctgaccga aatttatacc gaagataact ttgtgaaatt ttttaaagtg 1080

ctgaaccgca agacctatct gaactttgat aaagcggtgt ttaaaattaa cattgtgccg 1140

aaagtgaact ataccattta tgatggcttt aacctgcgca acaccaacct ggcggcgaac 1200

tttaacggtc agaacaccga aattaacaac atgaacttta ccaaactgaa aaactttacc 1260

ggcctgtttg aattttataa actgctgtgc gttcgcggca tcattacgag caaaaccaaa 1320

agcctggata aaggctataa caaataa 1347

<210> 4

<211> 2550

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 4

<400> 4

atggcgctga acgatctgtg cattaaagtg aataattggg atctgttttt tagcccgagc 60

gaagataact ttaccaacga tctgaacaaa ggcgaagaaa ttacgagcga taccaacatt 120

gaagcggcgg aagagaacat tagtctggat ctgattcagc agtattatct gacctttaac 180

tttgataacg aaccggaaaa cattagtatt gaaaacctga gcagcgatat tattggtcag 240

ctggaactga tgccgaacat tgaacgcttt ccgaacggca aaaaatatga actggataaa 300

tataccatgt ttcattatct gcgcgcgcaa gaatttgaac atggcaaaag ccgcattgcg 360

ctgaccaaca gcgtgaacga agcgctgctg aacccgagcc gcgtgtatac cttttttagc 420

agcgattatg tgaaaaaagt gaacaaagcg accgaagcgg cgatgtttct gggctgggtg 480

gaacagctgg tgtatgattt taccgatgag acgagcgaag tgagtaccac cgataaaatt 540

gcggatatta ccattatcat tccgtatatt ggcccggcgc tgaacattgg caacatgctg 600

tataaagatg attttgtggg cgcgctgatt tttagcggcg cggtgattct gctggaattt 660

attccggaaa tcgcgattcc ggtgctgggc acctttgcgc tggtgagcta tattgcgaac 720

aaagtgctga ccgtgcagac cattgataac gcgctgagca aacgcaacga aaaatgggat 780

gaagtgtata aatatattgt gaccaactgg ctggcgaaag tgaacacgca gattgatctg 840

attcgcaaaa aaatgaaaga agcgctggaa aaccaagcgg aagcgaccaa ggcgattatt 900

aactatcagt ataatcagta taccgaagag gaaaaaaaca acattaactt taacattgat 960

gatctgagca gcaaattaaa tgaaagcatt aacaaagcga tgatcaacat taacaagttt 1020

ctgaatcagt gcagcgtgag ctatctgatg aacagcatga ttccgtatgg cgtgaaacgc 1080

ctggaagatt ttgatgcgag cctgaaagat gcgctgctga aatatattta tgataaccgc 1140

ggcaccctga ttggccaagt ggatcgcctg aaagataaag ttaataacac gctgagcacc 1200

gatattccgt ttcagctgag caaatatgtg gataatcagc gcctgctgag cacctttacc 1260

gaatatatta aaaacattat taacacgagc attctgaacc tgcgctatga aagcaaccat 1320

ctgattgatc tgagccgcta tgcgagcaaa attaacattg gcagcaaagt gaactttgat 1380

ccgattgata aaaatcagat tcagctgttt aacctggaaa gcagcaaaat tgaagtgatt 1440

ctgaaaaacg cgattgtgta taacagcatg tatgaaaact ttagcacgag cttttggatt 1500

cgcattccga aatactttaa cagcatcagc ctgaacaacg aatataccat tattaactgc 1560

atggaaaaca acagcggctg gaaagtgagc ctgaactatg gcgaaattat ttggaccctg 1620

caagataccc aagaaattaa acagcgcgtg gtgtttaaat atagtcagat gattaacatt 1680

agcgattata ttaaccgctg gatttttgtg accattacca acaaccgtct gaacaacagc 1740

aaaatttata ttaacggccg cctgattgat cagaaaccga ttagcaacct gggcaacatt 1800

catgcgagca acaacattat gtttaaactg gatggctgcc gcgatacgca tcgctatatc 1860

tggattaaat attttaatct gttcgacaaa gaactgaacg aaaaagaaat taaagatctg 1920

tatgataatc agagcaacag cggcattctg aaagattttt ggggcgatta tctgcagtat 1980

gataaaccgt attatatgct gaacctgtat gatccgaaca aatatgtgga tgtgaacaac 2040

gtgggcattc gcggctatat gtatctgaaa ggcccgcgcg gcagcgtgat gaccaccaac 2100

atttatctga acagcagcct gtatcgcggc accaaattta ttattaaaaa atatgcgagc 2160

ggcaacaaag ataacattgt gcgcaacaac gatcgcgtgt atattaacgt ggttgtgaaa 2220

aacaaagaat atcgcctggc gaccaacgcg agccaagcgg gcgtggaaaa aattctgagc 2280

gcgctggaaa ttccggatgt gggcaacctg agccaagtgg ttgtgatgaa aagcaaaaac 2340

gatcaaggca ttaccaacaa gtgcaaaatg aacctgcaag ataacaacgg caacgatatt 2400

ggctttattg gctttcatca gtttaacaac attgcgaaac tggtggcgag caactggtat 2460

aaccgtcaga ttgaacgcag cagccgcacc ctgggctgca gctgggaatt tattccggtt 2520

gatgatggct ggggcgaacg cccgctgtaa 2550

Claims

1.一种基因重组制备A型肉毒素的方法，其特征在于，包括：

将轻链蛋白进行第一变性处理，得到第一变性产物；

将重链蛋白进行第二变性处理，得到第二变性产物；

将所述第一变性产物和第二变性产物进行复性及组装处理，获得所述A型肉毒素。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述轻链蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

任选地，所述重链蛋白具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述轻链蛋白或重链蛋白是通过如下方式获得的：

将质粒导入大肠杆菌中，所述质粒携带编码所述轻链蛋白或重链蛋白的基因；

将导入有所述质粒的大肠杆菌在适于蛋白表达的条件下进行培养、诱导，离心收获菌体、菌体破碎、离心破碎产物，获得所述轻链蛋白或重链蛋白。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一变性处理和所述第二变性处理在变性缓冲液中进行，所述变性缓冲液包括：

5～10M尿素、5～15mM二硫苏糖醇和10～30mM Tris或Tris-HCl；

任选地，所述变性缓冲液的pH值为9.5～10.5。

5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，进行所述复性及组装处理之前，预先将所述第一变性产物和所述第二变性产物进行混合处理，得到变性混合液；

任选地，所述混合处理中所述第一变性产物和所述第二变性产物的体积比为1:(1～10)；

任选地，所述复性及组装处理在复性及组装缓冲液中进行，所述复性及组装缓冲液包括：

50～150mM NaCl、0.1～1.0mM ZnCl₂、0.1～1.0mM CaCl₂、1.0～10.0mM还原性谷胱甘肽、1.0～10.0mM氧化性谷胱甘肽、40～50mM Tris-HCl和0.4～0.6％吐温20；

任选地，所述复性及组装缓冲液的pH值为9.5～10.5；

任选地，所述变性混合液与复性及组装缓冲液的体积比例为1:(1～10)。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述复性及组装处理的处理时间为12～16h；

任选地，所述复性及组装处理的搅拌转速为50～200rpm。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括：

将所述复性及组装处理得到的组装液依次经过疏水层析、硫酸铵盐析、透析、阴离子层析和分子筛层析处理，获得所述A型肉毒素。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述疏水层析处理的流动相A1包括10～30mmol/L Tris-HCl、2～8mmol/L EDTA和1～3mol/L NaCl，流动相B1包括10～30mmol/LTris-HCl和2～8mmol/L EDTA，所述流动相A1和流动相B1的pH值均为8.0～9.0；

任选地，所述硫酸铵盐析处理包括：

将硫酸铵和所述疏水层析处理得到的洗脱液在2～8℃条件下进行12～24h混合，然后将混合产物在2～8℃、10000～15000rpm的条件下进行20～40min离心处理，获得沉淀物；

任选地，所述透析处理包括：

将所述沉淀物溶解于第一缓冲液中，获得待透析液；

将所述待透析液与第一透析液进行第一透析处理；

将得到的第一透析处理产物与第二透析液进行第二透析处理；

其中，第一缓冲液选自40～60mM Tris-HCl缓冲液，第一透析液选自40～60mM Tris-HCl含盐透析液，第二透析液选自40～60mM Tris-HCl透析液；

任选地，所述沉淀物的重量g与所述第一缓冲液的体积ml比为1:(5～15)；

任选地，所述第一透析处理的透析时间为2～5h，所述第二透析处理的透析时间为12～24h；

任选地，所述Tris-HCl含盐透析液还包括200～300mM NaCl；

任选地，所述第一透析处理和所述第二透析处理的透析管的截留分子量为80～120kDa；

任选地，所述阴离子层析处理选自DEAE纤维素阴离子层析；

任选地，所述DEAE纤维素阴离子层析的流动相A2包括10～30mmol/L Tris，流动相B2包括10～30mmol/L Tris和0.5～1.5mol/L NaCl，所述流动相A2和流动相B2的pH值为8.0～9.0；

任选地，所述分子筛层析处理采用G-25M分子筛层析。

9.一种A型肉毒素，其特征在于，所述A型肉毒素是依据权利要求1～8任一项所述的方法制备获得的。

10.一种A型肉毒素，其特征在于，所述A型肉毒素的LD₅₀为1-20pg/只，所述A型肉毒素的纯度在98.0％以上；

任选地，所述A型肉毒素的轻链蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

任选地，所述A型肉毒素的重链蛋白具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。