CN115894641A - A型肉毒素突变体及其基因工程菌的构建 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种A型肉毒素突变体。A型肉毒素突变体包括：第一肽段和第二肽段，所述第一肽段和所述第二肽段通过链间二硫键相连；其中，所述第一肽段相较于野生型A型肉毒素的轻链，具有第134位和/或第165位的突变；和/或所述第二肽段相较于野生型A型肉毒素的重链，具有如下突变位点的至少之一：第791位、第967位和第1060位。本发明的A型肉毒素突变体具有二硫键的错配率低和生物活性高等优点。

Description

A型肉毒素突变体及其基因工程菌的构建

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及一种A型肉毒素突变体及其基因工程菌的构建，更具体地，本发明涉及一种A型肉毒素突变体、核酸分子、表达载体、基因工程菌、药物组合物及其用途。

背景技术

肉毒素(botulinum neurotoxin，BoNT)是一种由厌氧肉毒梭状芽孢杆菌(简称“肉毒梭菌”)产生的神经毒素，是世界上已知毒性最强的物质之一，肉毒素分为7种类型的血清型(A型-G型)，其中最常见的为A型，称为A型肉毒素(Botulinum neurotoxin of type A，BoNT/A)。

BoNT/A的结构分为两部分：轻链(LC，50kD)和重链(HC，100kD)，轻链和重链间靠一对链间二硫键链接(C₄₃₀-C₄₅₄)，非酰胺键链接。轻链为活性结构域，具有锌依赖性金属内肽酶活性，是毒素的毒性部分。重链包含两个结构域，结合结构域和转位结构域，结合结构域负责与神经细胞膜上相应受体结合，并在内体膜上形成离子通道，转位结构域负责轻链的转位，将轻链移送至细胞内，轻链识别SNAP-25(一种突触囊泡相关蛋白)上的Q197-R198位点，对其进行特异性切割。

多项研究表明，BoNT/A具有众多的应用场景，不仅在医学美容方面，在多种疾病的治疗方面也具有广泛的应用前景，随着在各种肌张力障碍、手足多汗症、疼痛以及其他多种疑难杂症等领域的临床应用，其疾病治疗范围在不断扩大。BoNT/A的治疗机理为，在神经肌肉接头处，BoNT/A与神经细胞表面的相应受体结合，借助其重链N端，跨膜将轻链移送至细胞内，通过切割SNAP-25来阻断乙酰胆碱的释放，引发肌肉持续的松弛性麻痹。

因此，亟需开发一种生物活性高的A型肉毒素。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供了一种A型肉毒素突变体，该A型肉毒素突变体具有二硫键的错配率低和生物活性(毒力)高等优点。

本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

天然结构的活性BoNT/A分子由1296个氨基酸组成，分为轻链和重链，其中轻链含有448个氨基酸(1-448)，重链含有848个氨基酸(449-1296)，重链内形成一对二硫键(C₁₂₃₅-C₁₂₈₀)，位于重链的近C端区域，轻链与重链间形成一对二硫键(C₄₃₀-C₄₅₄)，构成该二硫键的半胱氨酸分别位于轻链的近C端及重链的近N端，依靠该二硫键，轻、重链间形成完整BoNT/A分子的正确架构，使得BoNT/A分子具有结合受体、跨膜转运、发挥毒力等生物学作用。

除了构成重链内二硫键(C₁₂₃₅-C₁₂₈₀)和轻链与重链间二硫键(C₄₃₀-C₄₅₄)的4个半胱氨酸之外，轻链和重链的一级结构组成中还存在其他游离的半胱氨酸，呈未配对状态。自然界肉毒梭菌产生A型肉毒素是一个缓慢的过程，形成天然结构的肉毒素分子作用力倾向使得自然界的A型肉毒素形成正确的高级构象，人工培养的肉毒梭菌或采用其他方式(如采用大肠杆菌表达)制备BoNT/A过程中，由于人为干预了肉毒梭菌的自然生长规律或其宿主菌体内BoNT/A的形成速率，使得部分细胞内BoNT/A不能形成与自然状态下一致的正确高级构象，从而影响BoNT/A的毒力。其原因除了由于分子间力(如氢键)的作用之外，游离半胱氨酸之间在空间上错配形成错配二硫键，也一定程度上改变了BoNT/A的空间结构构象，导致完整BoNT/A分子重链C端受体结合区、或重链N端转位区、或轻链酶活性区不再具有天然BoNT/A分子的各亚基结构的高级空间构象，降低或减弱BoNT/A分子的体内生物效应，甚至由于完整分子或亚基高级结构或空间构象的变化，人体应用后会产生针对这些非天然高级结构或空间构象的抗蛋白抗体(anti-protein antibody，简称APA)。

分子结构间氢键的形成与BoNT/A分子形成过程中的转录速率、翻译效率及宿主细胞内的环境状况密切相关，过快或不匹配的转录速率、翻译效率及不适合的宿主细胞内环境，很容易导致BoNT/A分子的结构不正确。分子的体内复性及组装过程中，游离半胱氨酸的存在，也容易导致半胱氨酸分子间二硫键的错配，这或者发生在天然结构位上游离的半胱氨酸之间，或者发生在天然结构位上游离的半胱氨酸与天然结构位上具有配对位的半胱氨酸之间，或者发生在天然结构位上具有不同配对位的半胱氨酸之间，无论何种情况的发生，都会一定程度上改变BoNT/A分子的高级构象，都会影响BoNT/A分子的体内生物效应，增加人体应用后产生针对这些“非天然”结构的APA，降低药效。

基于此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种A型肉毒素突变体。根据本发明的实施例，所述A型肉毒素突变体包括：第一肽段和第二肽段，所述第一肽段和所述第二肽段通过链间二硫键相连；其中，所述第一肽段相较于野生型A型肉毒素的轻链，具有第134位和/或第165位的突变；和/或所述第二肽段相较于野生型A型肉毒素的重链，具有如下突变位点的至少之一：第791位、第967位和第1060位。发明人经过对天然BoNT/A分子的结构进行分析，并经过大量实验发现，对A型肉毒素的上述氨基酸进行突变可减少二硫键的错配，并提高其生物活性。

在本发明的另一方面，本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施例，所述核酸分子编码前述的A型肉毒素突变体中的第一肽段和/或第二肽段。根据本发明实施例的核酸分子可编码前述A型肉毒素突变体。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体携带前述的核酸分子。发明人经过实验发现，将上述表达载体导入至合适的宿主菌后，可在调控系统的介导下，有效实现A型肉毒素突变体的表达，以便大量获得A型肉毒素突变体。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种基因工程菌。根据本发明的实施例，所述基因工程菌包括：携带前述的核酸分子或前述的表达载体；或，表达前述的A型肉毒素突变体。发明人经过实验发现，将上述基因工程菌置于合适条件下，可高效表达上述A型肉毒素突变体。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，包括前述的A型肉毒素突变体。本发明的药物组合物具有较高的生物活性(毒力)，不仅可用于医学美容，还可用于治疗或改善肌张力障碍、手足多汗症或疼痛等病症。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种前述的A型肉毒素突变体或前述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于医学美容；或所述药物用于治疗或改善斜视、颈部肌张力障碍、喉肌肌张力障碍、上肢局灶性肌张力障碍、原发性手部震颤、流涎症、眼睑痉挛、偏侧面肌痉挛、脑卒中所致上/下肢痉挛、脑瘫所致的上/下肢痉挛、腋窝多汗症、手掌多汗症、逼尿肌-括约肌协同失调、慢性偏头痛及神经源性和特发性膀胱过度活动症中的至少之一。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为本发明实施例1中轻链突变体质粒双酶切琼脂糖电泳和重链突变体质粒双酶切琼脂糖电泳；

图2为本发明实施例3中野生型A型肉毒素中半胱氨酸的位置以及二硫键的连接位置。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。

在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。

在本文中，所述A型肉毒素的氨基酸编号为根据EU编号系统编号，例如，第134位是指按EU编号系统编号第134位；所述“C134G”是指按EU编号系统编号第134位的半胱氨酸被甘氨酸替代；“C791A”是指按EU编号系统编号第791位的半胱氨酸被丙氨酸替代。

在本文中，术语“表达载体”通常是指插入或可以插入在合适的宿主中自我复制的核酸分子的载体，其可将插入的核酸分子转移到宿主菌体中和/或宿主菌体之间。所述表达载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体，优选为DNA。所述表达载体还包括具有多种上述功能的载体，表达载体的类型包括但不限于质粒、线性DNA片段、病毒、细菌噬菌体、原病毒、噬粒、转座子和人工染色体等。所述表达载体可以是当引入合适的宿主菌体时能够转录并翻译成多肽的氨基酸。通常，通过培养包含所述表达载体的合适的宿主菌体，所述表达载体可以产生期望的表达产物。

在本文中，术语“基因工程菌”通常是指是将目的基因导入宿主菌体内使其表达，产生所需要的蛋白的细菌。其中，术语“宿主菌体”是指可导入重组表达载体的细菌或细胞，例如大肠杆菌。

在本文中，术语“药物组合物”通常是指单位剂量形式，并且可以通过制药领域中熟知的方法的任何一种进行制备。所有的方法包括使活性成分与构成一种或多种附属成分的载体相结合的步骤。通常，通过均匀并充分地使活性化合物与液体载体、细碎固体载体或这两者相结合，制备组合物。

在本文中，术语“药学上可接受的辅料”均可包括任何溶剂、固体赋形剂、稀释剂或其他液体赋形剂等等，适合于特有的目标剂型。除了任何常规的辅料与本发明的化合物不相容的范围，例如所产生的任何不良的生物效应或与药学上可接受的组合物的任何其他组分以有害的方式产生的相互作用，它们的用途也是本发明所考虑的范围。

在本文中，术语“治疗”是指用于获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分治疗或改善疾病或其症状而言可以是治疗性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述化合物的药物给予有需要的个体。

在本文中，术语“BoNT/A”、“BoNT/A蛋白”、“BoNT/A分子”和“A型肉毒素蛋白”均指A型肉毒素。

在本文中，术语“LC”、“轻链蛋白”和“轻链”同义。术语“HC”、“重链蛋白”和“重链”同义。术语“轻链突变体蛋白”和“轻链突变体”同义，术语“重链突变体蛋白”和“重链突变体”同义。

本发明提出了一种A型肉毒素突变体、核酸分子、表达载体、基因工程菌、药物组合物及其用途，下面将分别对其进行详细描述。

A型肉毒素突变体

在本发明的一个方面，本发明提出了一种A型肉毒素突变体。根据本发明的实施例，所述A型肉毒素突变体包括：第一肽段和第二肽段，所述第一肽段和所述第二肽段通过链间二硫键相连；其中，所述第一肽段相较于野生型A型肉毒素的轻链，具有第134位和/或第165位的突变；和/或所述第二肽段相较于野生型A型肉毒素的重链，具有如下突变位点的至少之一：第791位、第967位和第1060位。发明人经过对天然BoNT/A分子的结构进行分析，并经过大量试验发现，对A型肉毒素的上述氨基酸进行突变可减少二硫键的错配，且该A型肉毒素突变体具有较高的生物活性(毒力)。

野生型A型肉毒素的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:1：

MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNK(SEQ ID NO:1)；

野生型A型肉毒素的重链氨基酸序列为SEQ ID NO:2：

ALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL(SEQ ID NO:2)。

编码野生型A型肉毒素轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO:7：

ATGCCGTTTGTGAACAAACAGTTTAACTATAAAGATCCGGTGAACGGCGTGGATATTGCGTATATTAAAATTCCGAACGCGGGTCAGATGCAGCCGGTGAAAGCGTTTAAAATTCATAACAAAATTTGGGTGATTCCGGAACGCGATACCTTTACCAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAACAAGTGCCGGTGAGCTATTATGATAGCACCTATCTGAGCACCGATAACGAAAAAGATAACTATCTGAAAGGCGTGACCAAACTGTTTGAACGCATTTATAGCACCGATCTGGGCCGCATGCTGCTGACGAGCATTGTGCGCGGCATTCCGTTCTGGGGCGGCAGCACCATTGATACCGAACTGAAAGTGATTGATACCAACTGCATTAACGTGATTCAGCCGGATGGCAGCTATCGCAGCGAAGAACTGAACCTGGTGATTATTGGCCCGAGCGCGGATATTATTCAGTTTGAATGCAAAAGCTTTGGCCATGAAGTGCTGAACCTGACCCGCAACGGCTATGGCAGCACGCAGTATATTCGCTTTAGCCCGGATTTTACCTTTGGCTTTGAAGAAAGCCTGGAAGTGGATACCAACCCGCTGCTGGGCGCGGGCAAATTTGCGACCGATCCGGCGGTGACCCTGGCGCATGAACTGATTCATGCGGGCCATCGCCTGTATGGCATTGCGATTAACCCGAACCGCGTGTTTAAAGTGAACACCAACGCGTATTATGAAATGAGCGGCCTGGAAGTGAGCTTTGAAGAACTGCGCACCTTTGGCGGCCATGATGCGAAATTTATTGATAGCCTGCAAGAAAACGAATTTCGCCTGTATTACTATAACAAATTTAAAGATATTGCGAGCACCCTGAACAAAGCGAAAAGCATTGTGGGCACCACCGCGAGCCTGCAGTATATGAAAAACGTGTTTAAAGAAAAATATCTGCTGAGCGAAGATACGAGCGGCAAATTTAGCGTGGATAAACTGAAATTTGATAAACTGTATAAAATGCTGACCGAAATTTATACCGAAGATAACTTTGTGAAATTTTTTAAAGTGCTGAACCGCAAGACCTATCTGAACTTTGATAAAGCGGTGTTTAAAATTAACATTGTGCCGAAAGTGAACTATACCATTTATGATGGCTTTAACCTGCGCAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAACACCGAAATTAACAACATGAACTTTACCAAACTGAAAAACTTTACCGGCCTGTTTGAATTTTATAAACTGCTGTGCGTTCGCGGCATCATTACGAGCAAAACCAAAAGCCTGGATAAAGGCTATAACAAATAA(SEQ ID NO:7)

编码野生型A型肉毒素重链的核苷酸序列为SEQ ID NO:8：

ATGGCGCTGAACGATCTGTGCATTAAAGTGAATAATTGGGATCTGTTTTTTAGCCCGAGCGAAGATAACTTTACCAACGATCTGAACAAAGGCGAAGAAATTACGAGCGATACCAACATTGAAGCGGCGGAAGAGAACATTAGTCTGGATCTGATTCAGCAGTATTATCTGACCTTTAACTTTGATAACGAACCGGAAAACATTAGTATTGAAAACCTGAGCAGCGATATTATTGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAACATTGAACGCTTTCCGAACGGCAAAAAATATGAACTGGATAAATATACCATGTTTCATTATCTGCGCGCGCAAGAATTTGAACATGGCAAAAGCCGCATTGCGCTGACCAACAGCGTGAACGAAGCGCTGCTGAACCCGAGCCGCGTGTATACCTTTTTTAGCAGCGATTATGTGAAAAAAGTGAACAAAGCGACCGAAGCGGCGATGTTTCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTGTATGATTTTACCGATGAGACGAGCGAAGTGAGTACCACCGATAAAATTGCGGATATTACCATTATCATTCCGTATATTGGCCCGGCGCTGAACATTGGCAACATGCTGTATAAAGATGATTTTGTGGGCGCGCTGATTTTTAGCGGCGCGGTGATTCTGCTGGAATTTATTCCGGAAATCGCGATTCCGGTGCTGGGCACCTTTGCGCTGGTGAGCTATATTGCGAACAAAGTGCTGACCGTGCAGACCATTGATAACGCGCTGAGCAAACGCAACGAAAAATGGGATGAAGTGTATAAATATATTGTGACCAACTGGCTGGCGAAAGTGAACACGCAGATTGATCTGATTCGCAAAAAAATGAAAGAAGCGCTGGAAAACCAAGCGGAAGCGACCAAGGCGATTATTAACTATCAGTATAATCAGTATACCGAAGAGGAAAAAAACAACATTAACTTTAACATTGATGATCTGAGCAGCAAATTAAATGAAAGCATTAACAAAGCGATGATCAACATTAACAAGTTTCTGAATCAGTGCAGCGTGAGCTATCTGATGAACAGCATGATTCCGTATGGCGTGAAACGCCTGGAAGATTTTGATGCGAGCCTGAAAGATGCGCTGCTGAAATATATTTATGATAACCGCGGCACCCTGATTGGCCAAGTGGATCGCCTGAAAGATAAAGTTAATAACACGCTGAGCACCGATATTCCGTTTCAGCTGAGCAAATATGTGGATAATCAGCGCCTGCTGAGCACCTTTACCGAATATATTAAAAACATTATTAACACGAGCATTCTGAACCTGCGCTATGAAAGCAACCATCTGATTGATCTGAGCCGCTATGCGAGCAAAATTAACATTGGCAGCAAAGTGAACTTTGATCCGATTGATAAAAATCAGATTCAGCTGTTTAACCTGGAAAGCAGCAAAATTGAAGTGATTCTGAAAAACGCGATTGTGTATAACAGCATGTATGAAAACTTTAGCACGAGCTTTTGGATTCGCATTCCGAAATACTTTAACAGCATCAGCCTGAACAACGAATATACCATTATTAACTGCATGGAAAACAACAGCGGCTGGAAAGTGAGCCTGAACTATGGCGAAATTATTTGGACCCTGCAAGATACCCAAGAAATTAAACAGCGCGTGGTGTTTAAATATAGTCAGATGATTAACATTAGCGATTATATTAACCGCTGGATTTTTGTGACCATTACCAACAACCGTCTGAACAACAGCAAAATTTATATTAACGGCCGCCTGATTGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGCAACATTCATGCGAGCAACAACATTATGTTTAAACTGGATGGCTGCCGCGATACGCATCGCTATATCTGGATTAAATATTTTAATCTGTTCGACAAAGAACTGAACGAAAAAGAAATTAAAGATCTGTATGATAATCAGAGCAACAGCGGCATTCTGAAAGATTTTTGGGGCGATTATCTGCAGTATGATAAACCGTATTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTGAACAACGTGGGCATTCGCGGCTATATGTATCTGAAAGGCCCGCGCGGCAGCGTGATGACCACCAACATTTATCTGAACAGCAGCCTGTATCGCGGCACCAAATTTATTATTAAAAAATATGCGAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGCAACAACGATCGCGTGTATATTAACGTGGTTGTGAAAAACAAAGAATATCGCCTGGCGACCAACGCGAGCCAAGCGGGCGTGGAAAAAATTCTGAGCGCGCTGGAAATTCCGGATGTGGGCAACCTGAGCCAAGTGGTTGTGATGAAAAGCAAAAACGATCAAGGCATTACCAACAAGTGCAAAATGAACCTGCAAGATAACAACGGCAACGATATTGGCTTTATTGGCTTTCATCAGTTTAACAACATTGCGAAACTGGTGGCGAGCAACTGGTATAACCGTCAGATTGAACGCAGCAGCCGCACCCTGGGCTGCAGCTGGGAATTTATTCCGGTTGATGATGGCTGGGGCGAACGCCCGCTGTAA(SEQ ID NO:8)

根据本发明的实施例，所述链间二硫键通过所述第一肽链中的第430位半胱氨酸与所述第二肽链中的第454位半胱氨酸形成。

根据本发明的实施例，所述第一肽段相较于野生型A型肉毒素的轻链，具有第134位和第165位的突变；和/或所述第二肽段相较于野生型A型肉毒素的重链，具有第791位、第967位和第1060位的突变。由此，可减少A型肉毒素突变体中二硫键的错配率，并提高其生物活性。

根据本发明的实施例，所述第134位、第165位、第791位、第967位或第1060位的半胱氨酸突变为如下氨基酸中的之一：G、A、S、E和P。由此，可进一步减少A型肉毒素突变体中二硫键的错配率，并提高其生物活性。

根据本发明的实施例，所述第一肽段的第134位的C突变为G、A或S。

根据本发明的实施例，所述第一肽段的第165位的C突变为G、A、P或S。

根据本发明的实施例，所述第二肽段的第791位的C突变为G、A或S。

根据本发明的实施例，所述第二肽段的第967位的C突变为G、A或S。

根据本发明的实施例，所述第二肽段的第1060位的C突变为G、A、E或S。

根据本发明的实施例，所述第一肽段的第165位的C突变为P；或所述第二肽段的第1060位的C突变为E。

发明人经过大量试验发现，在对第一肽段和第二肽段的上述位点进行突变的过程中，将上述突变位点均突变为氨基酸G或A或S得到的A型肉毒素突变体，相比野生型A型肉毒素减少了二硫键的错配，提高了生物活性(毒力)，如表5、表7，A型肉毒素突变体2。并且发明人还意外地发现，在上述的突变方式下，充分考虑到突变位点附近肽链的组成，如氨基酸大小、疏水性、可能的氢键形成及带电状况等，将野生型A型肉毒素中发生二硫键错配几率较高的半胱氨酸(C165、C1060)突变为P或E，可更大程度地消除二硫键的错配，甚至完全消除二硫键的错配，且其生物活性也显著性提高，较野生型A型肉毒素活性提高1倍以上，如表4、表7，A型肉毒素突变体1。

根据本发明的实施例，所述第一肽段相较于野生型A型肉毒素的轻链，具有C134G和C165P的突变。由此，可进一步减少A型肉毒素突变体中二硫键的错配率，并提高其生物活性。

根据本发明的实施例，所述第二肽段相较于野生型A型肉毒素的重链，具有C791A、C967A和C1060E的突变。由此，可进一步减少A型肉毒素突变体中二硫键的错配率，并提高其生物活性。

根据本发明的实施例，所述第一肽段相较于野生型A型肉毒素的轻链，具有C134G和C165P的突变；以及所述第二肽段相较于野生型A型肉毒素的重链，具有C791A、C967A和C1060E的突变。上述的A型肉毒素突变体相较于野生型A型肉毒素，具有较高的毒力。

根据本发明的实施例，所述第一肽段具有如SEQ ID NO：3或5所示的氨基酸序列。

MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNGINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFEPKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNK(SEQ ID NO:3)；

MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNGINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFEGKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNK(SEQ ID NO:5)。

根据本发明的实施例，所述第二肽段具有如SEQ ID NO：4或6所示的氨基酸序列。

ALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQASVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINAMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGERDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL(SEQ ID NO:4)；

ALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQASVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINAMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGGRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL(SEQ ID NO:6)。

核酸分子、表达载体和基因工程菌

在本发明的另一方面，本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施例，所述核酸分子编码前述的A型肉毒素突变体中的第一肽段和/或第二肽段。本发明的核酸分子可编码前述A型肉毒素突变体。

根据本发明的实施例，所述核酸分子为DNA。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体携带前述的核酸分子。本发明的表达载体导入合适的宿主菌体后，可在调控系统的介导下，有效实现A型肉毒素突变体的表达，以便大量获得A型肉毒素突变体。

根据本发明的实施例，所述表达载体为质粒表达载体。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种基因工程菌。根据本发明的实施例，所述基因工程菌包括：携带前述的核酸分子或前述的表达载体；或，表达前述的A型肉毒素突变体。本发明的基因工程菌在合适条件下可高效表达上述A型肉毒素突变体。

根据本发明的实施例，所述基因工程菌是通过将前述的表达载体引入至宿主菌体中而获得的。

根据本发明的实施例，所述宿主菌体为大肠杆菌。

药物组合物

在本发明的又一方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，包括前述的A型肉毒素突变体。本发明的药物组合物具有较高的生物活性(毒力)，不仅可用于医学美容，还可用于治疗或改善斜视、颈部肌张力障碍、喉肌肌张力障碍、上肢局灶性肌张力障碍、原发性手部震颤、流涎症、眼睑痉挛、偏侧面肌痉挛、脑卒中所致上/下肢痉挛、脑瘫所致的上/下肢痉挛、腋窝多汗症、手掌多汗症、逼尿肌-括约肌协同失调、慢性偏头痛及神经源性和特发性膀胱过度活动症中的至少之一。

根据本发明的实施例，所述医学美容包括改善和/治疗如下症状的至少之一：皱眉纹、鱼尾纹和前额纹。

根据本发明的实施例，进一步包括药学上可接受的辅料。

根据本发明的实施例，所述药学上可接受的辅料包括选自缓冲液、保护剂、活性剂和赋形剂中的至少之一。

需要说明的是，缓冲液通常是指可起到缓冲作用的液体溶液，此处应作广义理解。示例性地，可为生理上相容的缓冲体系和/或缓冲体系组合物，包括但不限于醋酸、琥珀酸、柠檬酸、组氨酸、谷氨酸、柠檬酸盐/醋酸盐、柠檬酸盐/组氨酸、琥珀酸盐/组氨酸、磷酸盐、三羟甲基氨基甲烷缓冲体系等。

需要说明的是，保护剂通常是指可对药物组合物起到保护作用的试剂，此处应作广义理解。示例性地，包括但不限于非还原性糖海藻糖、蔗糖人、血白蛋白等。

根据本发明的实施例，所述活性剂为非离子型表面活性剂。

根据本发明的实施例，所述非离子型表面活性剂包括选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80中的至少之一。

根据本发明的实施例，所述药物组合物为液体组合物，所述保护剂包括选自非还原性糖海藻糖和/或蔗糖，所述非离子型表面活性剂包括选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60和聚山梨醇酯80中的至少之一。

根据本发明的实施例，所述药物组合物为冻干组合物，所述保护剂包括选自非还原性糖海藻糖、蔗糖和人血白蛋白中的至少之一，所述赋形剂为多元醇类赋形剂。

用途

在本发明的又一方面，本发明提出了一种前述的A型肉毒素突变体或前述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于医学美容；或所述药物用于治疗或改善斜视、颈部肌张力障碍、喉肌肌张力障碍、上肢局灶性肌张力障碍、原发性手部震颤、流涎症、眼睑痉挛、偏侧面肌痉挛、脑卒中所致上/下肢痉挛、脑瘫所致的上/下肢痉挛、腋窝多汗症、手掌多汗症、逼尿肌-括约肌协同失调、慢性偏头痛及神经源性和特发性膀胱过度活动症中的至少之一。

根据本发明的实施例，所述医学美容包括去皱和/或瘦脸。

根据本发明的实施例，所述医学美容包括改善和/治疗如下症状的至少之一：皱眉纹、鱼尾纹和前额纹。

方法

在本发明的又一方面，本发明提出了一种医学美容的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：向受试者施用药学上可接受量的前述A型肉毒素突变体或药物组合物。根据本发明实施例的方法可有效地用于医学美容。

根据本发明的实施例，所述医学美容包括去皱和/或瘦脸。

根据本发明的实施例，所述医学美容包括改善和/治疗如下症状的至少之一：皱眉纹、鱼尾纹和前额纹。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种改善和/或治疗疾病的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：向受试者施用药学上可接受量的前述A型肉毒素突变体或药物组合物，所述疾病包括选自斜视、颈部肌张力障碍、喉肌肌张力障碍、上肢局灶性肌张力障碍、原发性手部震颤、流涎症、眼睑痉挛、偏侧面肌痉挛、脑卒中所致上/下肢痉挛、脑瘫所致的上/下肢痉挛、腋窝多汗症、手掌多汗症、逼尿肌-括约肌协同失调、慢性偏头痛及神经源性和特发性膀胱过度活动症中的至少之一。

需要说明的是，在本文中，“药学上可接受量”可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化，优选为有效量。药学上可接受量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：表达A型肉毒素突变体1的轻链突变体、重链突变体的基因工程菌的构建

编码A型肉毒素突变体1的轻链突变体的核苷酸序列(氨基酸序列为SEQ ID NO:3；核苷酸序列为SEQ ID NO:9)和重链突变体的核苷酸序列(氨基酸序列为SEQ ID NO:4；核苷酸序列为SEQ ID NO:10)的两端分别添加XbaI、BamHI酶切位点，序列委托宝生物工程(大连)有限公司进行合成，分别获得轻链突变体和重链突变体的目的基因核苷酸序列。

轻链突变体和重链突变体的目的基因核苷酸序列分别用XbaI和BamHI进行双酶切，载体pET-5a(+)同样分别用XbaI和BamHI进行双酶切，将目的基因及载体双酶切后获得的目的片段切胶回收。分别将轻链突变体和重链突变体的双酶切片段与载体的双酶切片段进行连接，连接体系经转化、目标蛋白克隆筛选和质粒酶切验证后，最终分别获得表达A型肉毒素轻链突变体蛋白和重链突变体蛋白的基因工程菌。其中，轻链突变体蛋白和重链突变体蛋白的基因工程菌质粒验证如图1，左图为轻链突变体质粒双酶切琼脂糖电泳，右图为重链突变体质粒双酶切琼脂糖电泳。

其中，编码A型肉毒素突变体1轻链突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO:9：

ATGCCGTTTGTGAACAAACAGTTTAACTATAAAGATCCGGTGAACGGCGTGGATATTGCGTATATTAAAATTCCGAACGCGGGTCAGATGCAGCCGGTGAAAGCGTTTAAAATTCATAACAAAATTTGGGTGATTCCGGAACGCGATACCTTTACCAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAACAAGTGCCGGTGAGCTATTATGATAGCACCTATCTGAGCACCGATAACGAAAAAGATAACTATCTGAAAGGCGTGACCAAACTGTTTGAACGCATTTATAGCACCGATCTGGGCCGCATGCTGCTGACGAGCATTGTGCGCGGCATTCCGTTCTGGGGCGGCAGCACCATTGATACCGAACTGAAAGTGATTGATACCAACGGTATTAACGTGATTCAGCCGGATGGCAGCTATCGCAGCGAAGAACTGAACCTGGTGATTATTGGCCCGAGCGCGGATATTATTCAGTTTGAACCTAAAAGCTTTGGCCATGAAGTGCTGAACCTGACCCGCAACGGCTATGGCAGCACGCAGTATATTCGCTTTAGCCCGGATTTTACCTTTGGCTTTGAAGAAAGCCTGGAAGTGGATACCAACCCGCTGCTGGGCGCGGGCAAATTTGCGACCGATCCGGCGGTGACCCTGGCGCATGAACTGATTCATGCGGGCCATCGCCTGTATGGCATTGCGATTAACCCGAACCGCGTGTTTAAAGTGAACACCAACGCGTATTATGAAATGAGCGGCCTGGAAGTGAGCTTTGAAGAACTGCGCACCTTTGGCGGCCATGATGCGAAATTTATTGATAGCCTGCAAGAAAACGAATTTCGCCTGTATTACTATAACAAATTTAAAGATATTGCGAGCACCCTGAACAAAGCGAAAAGCATTGTGGGCACCACCGCGAGCCTGCAGTATATGAAAAACGTGTTTAAAGAAAAATATCTGCTGAGCGAAGATACGAGCGGCAAATTTAGCGTGGATAAACTGAAATTTGATAAACTGTATAAAATGCTGACCGAAATTTATACCGAAGATAACTTTGTGAAATTTTTTAAAGTGCTGAACCGCAAGACCTATCTGAACTTTGATAAAGCGGTGTTTAAAATTAACATTGTGCCGAAAGTGAACTATACCATTTATGATGGCTTTAACCTGCGCAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAACACCGAAATTAACAACATGAACTTTACCAAACTGAAAAACTTTACCGGCCTGTTTGAATTTTATAAACTGCTGTGCGTTCGCGGCATCATTACGAGCAAAACCAAAAGCCTGGATAAAGGCTATAACAAATAA(SEQ ID NO:9)；

编码A型肉毒素突变体1重链突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO:10：

ATGGCGCTGAACGATCTGTGCATTAAAGTGAATAATTGGGATCTGTTTTTTAGCCCGAGCGAAGATAACTTTACCAACGATCTGAACAAAGGCGAAGAAATTACGAGCGATACCAACATTGAAGCGGCGGAAGAGAACATTAGTCTGGATCTGATTCAGCAGTATTATCTGACCTTTAACTTTGATAACGAACCGGAAAACATTAGTATTGAAAACCTGAGCAGCGATATTATTGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAACATTGAACGCTTTCCGAACGGCAAAAAATATGAACTGGATAAATATACCATGTTTCATTATCTGCGCGCGCAAGAATTTGAACATGGCAAAAGCCGCATTGCGCTGACCAACAGCGTGAACGAAGCGCTGCTGAACCCGAGCCGCGTGTATACCTTTTTTAGCAGCGATTATGTGAAAAAAGTGAACAAAGCGACCGAAGCGGCGATGTTTCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTGTATGATTTTACCGATGAGACGAGCGAAGTGAGTACCACCGATAAAATTGCGGATATTACCATTATCATTCCGTATATTGGCCCGGCGCTGAACATTGGCAACATGCTGTATAAAGATGATTTTGTGGGCGCGCTGATTTTTAGCGGCGCGGTGATTCTGCTGGAATTTATTCCGGAAATCGCGATTCCGGTGCTGGGCACCTTTGCGCTGGTGAGCTATATTGCGAACAAAGTGCTGACCGTGCAGACCATTGATAACGCGCTGAGCAAACGCAACGAAAAATGGGATGAAGTGTATAAATATATTGTGACCAACTGGCTGGCGAAAGTGAACACGCAGATTGATCTGATTCGCAAAAAAATGAAAGAAGCGCTGGAAAACCAAGCGGAAGCGACCAAGGCGATTATTAACTATCAGTATAATCAGTATACCGAAGAGGAAAAAAACAACATTAACTTTAACATTGATGATCTGAGCAGCAAATTAAATGAAAGCATTAACAAAGCGATGATCAACATTAACAAGTTTCTGAATCAGGCAAGCGTGAGCTATCTGATGAACAGCATGATTCCGTATGGCGTGAAACGCCTGGAAGATTTTGATGCGAGCCTGAAAGATGCGCTGCTGAAATATATTTATGATAACCGCGGCACCCTGATTGGCCAAGTGGATCGCCTGAAAGATAAAGTTAATAACACGCTGAGCACCGATATTCCGTTTCAGCTGAGCAAATATGTGGATAATCAGCGCCTGCTGAGCACCTTTACCGAATATATTAAAAACATTATTAACACGAGCATTCTGAACCTGCGCTATGAAAGCAACCATCTGATTGATCTGAGCCGCTATGCGAGCAAAATTAACATTGGCAGCAAAGTGAACTTTGATCCGATTGATAAAAATCAGATTCAGCTGTTTAACCTGGAAAGCAGCAAAATTGAAGTGATTCTGAAAAACGCGATTGTGTATAACAGCATGTATGAAAACTTTAGCACGAGCTTTTGGATTCGCATTCCGAAATACTTTAACAGCATCAGCCTGAACAACGAATATACCATTATTAACGCAATGGAAAACAACAGCGGCTGGAAAGTGAGCCTGAACTATGGCGAAATTATTTGGACCCTGCAAGATACCCAAGAAATTAAACAGCGCGTGGTGTTTAAATATAGTCAGATGATTAACATTAGCGATTATATTAACCGCTGGATTTTTGTGACCATTACCAACAACCGTCTGAACAACAGCAAAATTTATATTAACGGCCGCCTGATTGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGCAACATTCATGCGAGCAACAACATTATGTTTAAACTGGATGGCGAGCGCGATACGCATCGCTATATCTGGATTAAATATTTTAATCTGTTCGACAAAGAACTGAACGAAAAAGAAATTAAAGATCTGTATGATAATCAGAGCAACAGCGGCATTCTGAAAGATTTTTGGGGCGATTATCTGCAGTATGATAAACCGTATTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTGAACAACGTGGGCATTCGCGGCTATATGTATCTGAAAGGCCCGCGCGGCAGCGTGATGACCACCAACATTTATCTGAACAGCAGCCTGTATCGCGGCACCAAATTTATTATTAAAAAATATGCGAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGCAACAACGATCGCGTGTATATTAACGTGGTTGTGAAAAACAAAGAATATCGCCTGGCGACCAACGCGAGCCAAGCGGGCGTGGAAAAAATTCTGAGCGCGCTGGAAATTCCGGATGTGGGCAACCTGAGCCAAGTGGTTGTGATGAAAAGCAAAAACGATCAAGGCATTACCAACAAGTGCAAAATGAACCTGCAAGATAACAACGGCAACGATATTGGCTTTATTGGCTTTCATCAGTTTAACAACATTGCGAAACTGGTGGCGAGCAACTGGTATAACCGTCAGATTGAACGCAGCAGCCGCACCCTGGGCTGCAGCTGGGAATTTATTCCGGTTGATGATGGCTGGGGCGAACGCCCGCTGTAA(SEQ ID NO:10)。

实施例2：A型肉毒素突变体1的制备

分别培养实施例1制备的表达轻链突变体蛋白和重链突变体蛋白的基因工程菌，经发酵表达、变复性、体外组装及纯化获得A型肉毒素突变体1(本实施例中又称A型肉毒素突变体蛋白1、或突变体1)，其中，相较于野生型A型肉毒素，突变体1的突变位点为C134G、C165P、C791A、C967A和C1060E，具体步骤如下：

(1)轻链突变体蛋白、重链突变体蛋白的发酵表达

将实施例1制得的表达轻链突变体蛋白和重链突变体蛋白的基因工程菌，分别接入装有LB培养基的摇瓶中培养，待OD₆₀₀达到1.6-2.0，转入5L发酵罐中培养，起始培养体积2.5L，培养温度37℃，搅拌转速800rpm，待OD₆₀₀升至30开始诱导，选择异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂进行诱导，浓度0.5mM，诱导时间4～8h。光学显微镜检测菌体形态为典型大肠杆菌形态、无其他微生物污染时，结束发酵培养。

转速10000rpm，温度4℃条件下，离心收集菌体。

收集菌体经高压匀浆破碎，包涵体洗涤，得轻链突变体包涵体蛋白(简称轻链突变体包涵体)、重链突变体包涵体蛋白(简称重链突变体包涵体)。

(2)轻链突变体蛋白、重链突变体蛋白的变复性

室温下，按轻链突变体包涵体和重链突变体包涵体的重量比为1：4(g/g)的比例，分别称取轻链突变体包涵体和重链突变体包涵体；然后按轻链突变体包涵体或重链突变体包涵体与变性缓冲液的重量体积比为1：20(w/v，g/ml)比例，分别将轻链突变体包涵体或重链突变体包涵体各自溶解于pH值为10.0的变性缓冲液(含8M尿素和10mM DTT的20mM Tris)中，搅拌转速200rpm，待全部溶解，得到变性液。分别将轻链突变体和重链突变体的变性液与复性缓冲液(100mM NaCl、0.5mM ZnCl₂、0.5mM CaCl₂、5mM GSH、5mM GSSG、50mM Tris-HCl、0.5％Tween-20，pH值为10.0)按1：10的体积比例混合，继续搅拌，转速200rpm，进行复性，复性时间24h，分别得轻链突变体蛋白复性液和重链突变体蛋白复性液。

(3)轻链突变体蛋白、重链突变体蛋白的体外组装

按体积比1：1的比例将上述轻链突变体蛋白复性液和重链突变体蛋白复性液进行混合，以1.0M盐酸调pH9.0，温度4℃条件下，持续搅拌16小时，搅拌转速200rpm，进行A型肉毒素突变体蛋白的体外组装，得组装液。取少量组装液按体积倍比5:1(ml/ml)浓缩，SDS-PAGE电泳观察组装情况，待SDS-PAGE电泳呈现单一150KD目的条带时，停止组装，进入下游纯化。

(4)A型肉毒素突变体蛋白的纯化

依次进行疏水层析、硫酸铵盐析、透析、DEAE阴离子层析、分子筛层析，获得A型肉毒素突变体1。

疏水层析：上述体外组装液加4mol/L NaCl，至NaCl终浓度为2mol/L，为上样原液。用流动相A平衡3CV，上样至载量，流动相A冲洗6CV，0％B-100％B 10CV梯度洗脱；

流动相A：20mmol/L Tris+5mmol/L EDTA+2.0mol/L NaCl，pH值为8.5；

流动相B：20mmol/L Tris+5mmol/L EDTA，pH8.5。

硫酸铵盐析：按硫酸铵饱和浓度80％称取适量硫酸铵加入疏水层析洗脱液中，搅拌至硫酸铵全部溶解，冰箱2-8℃放置，持续搅拌24h，搅拌转速100rpm。4℃，12000rpm离心30min，分离沉淀。

透析：按沉淀、缓冲液1：10比例(w/v，g/ml)，取50mM Tris-HCl缓冲液(pH值为8.5)溶解沉淀后，转移至透析管(截留分子量：100kDa)，4℃下，与待透析液20倍体积的50mMTris-HCl缓冲液(含250mM NaCl，pH值为8.5)搅拌(100rpm)透析3小时。再与待透析液20倍体积的50mM Tris-HCl缓冲液(pH值为8.5)搅拌(100rpm)透析24小时。

DEAE阴离子层析：上述透析液直接上样层析；

流动相A：20mmol/L Tris，pH值为8.5；

流动相B：20mmol/L Tris+1.0mol/L NaCl，pH值为8.5；

层析步骤：A平衡3CV，上样至载量，A冲洗3CV，0％B-50％B 20CV梯度洗脱。

G-25M分子筛层析：DEAE阴离子层析洗脱液直接上样进行分子筛层析；

流动相：20mmol/L Tris，pH值为8.5，载量≤30％柱体积/cycle，线性流速300cm/h，

收集各洗脱峰，合样SDS-PAGE电泳，进行纯度检测，得到A型肉毒素突变体1。

实施例3：A型肉毒素突变体1的结构鉴定

1、完整分子量检测

样品处理：取1ml实施例2制得的A型肉毒素突变体1样品，5倍浓缩后，混匀上样。

UPLC条件：

色谱柱：BioResolve RP mAb 2.7μm，2.1mm×100mm，Waters 01093809916819；柱温：50℃；检测波长：280nm；流速：0.3ml/min；上样量：10μl。

梯度：

时间(min)	0	12	13	15	16	20
							B％	10	60	90	90	10	10

MS条件：

离子化方式：ESI positive；质量扫描范围：300～4000Da；毛细管电压：3.0KV；源温度：100℃；锥孔电压：150KV；脱溶剂气温度：450℃；锥孔反吹气流速：50L/H；脱溶剂气流速：800L/H；

数据采集与处理：使用Masslynx V4.1软件进行数据采集，使用UNIFI软件进行数据分析。完整分子量数据分析如表1。

表1：A型肉毒素突变体1完整分子量数据分析

峰	鉴定成分	理论分子量(Da)	实测分子量(Da)	误差(ppm)	占比
						1	BoNT/A突变体	149216.3987	149218.3271	12.9	99.3％
2	BoNT/A突变体(脱酰胺修饰)	149218.4025	149220.3026	12.7	0.7％

2、还原分子量检测

样品处理：取150μl实施例2制得的A型肉毒素突变体1样品，加入150μl 7mol/L盐酸胍/0.1mol/LTris(pH值为8.0)和3μl 1mol/L DTT，70℃恒温孵育30min，混匀。

UPLC条件：

色谱柱：BioResolve RP mAb 2.7μm，2.1mm×100mm，Waters 01093809916819；柱温：50℃；检测波长：280nm；流速：0.3ml/min；上样量：10μl；

梯度：

时间(min)	0	12	13	15	16	20
							B％	10	60	90	90	10	10

MS条件：

离子化方式：ESI positive；质量扫描范围：300～4000Da；毛细管电压：3.0KV；源温度：100℃；锥孔电压：40KV；脱溶剂气温度：450℃；锥孔反吹气流速：50L/H；脱溶剂气流速：800L/H；

数据采集与处理：使用Masslynx V4.1软件进行数据采集，使用UNIFI软件进行数据分析。还原分子量数据分析如表2。

表2：A型肉毒素突变体1还原分子量数据分析

3、二硫键分析

样品处理：取1ml实施例2制得的A型肉毒素突变体1样品进行5倍浓缩，在每个浓缩管里加350μl0.05mol/L碳酸氢铵混匀，浓缩至100μl，在每个浓缩管里再加4μl 1mol/L碘乙酰胺溶液(IAM)和350μl0.05mol/L碳酸氢铵混匀，浓缩至100μl，取浓缩后的样品180μl，加20μl 1％RapiGest SF，60℃恒温孵育30min，再加入8μg胰蛋白酶，37℃恒温孵育过夜，取出，加1μl甲酸，37℃恒温孵育45min，取出，13000rpm离心10min，取上清混匀进样。

UPLC条件：

色谱柱：UPLC BEH C18 1.7μm，2.1mm×150mm，Waters 01443804318321；柱温：60℃；检测波长：215nm；流速：0.3ml/min；上样量：10μl；

梯度：

时间(min)	0	5	140	141	145	146	150
								B％	2	2	40	100	100	2	2

MS条件：

离子化方式：ESI positive；质量扫描范围：100～2000Da；毛细管电压：3.0KV；源温度：100℃；锥孔电压：40KV；脱溶剂气温度：450℃；锥孔反吹气流速：50L/H；脱溶剂气流速：800L/H；

野生型A型肉毒素的结构鉴定：结构鉴定内容及方法同本实施例3(野生型A型肉毒素样品的制备，具体制备方法参见实施例1和实施例2)。

数据采集与处理：使用Masslynx V4.1软件进行数据采集，使用UNIFI软件进行数据分析。具体结果参见表3和表4，表3为野生型A型肉毒素样品的检测结果，表4为实施例2制得的A型肉毒素突变体1样品的检测结果，其中，C₁-C₉的位置具体参见图2，其中C_n表示野生型A型肉毒素序列中自N端至C端的第n个半胱氨酸，C₁为第1个半胱氨酸、C₂为第2个半胱氨酸……C₉为第9个半胱氨酸。

表3：野生型A型肉毒素二硫键分析

表4：A型肉毒素突变体1二硫键分析

由上可知，A型肉毒素突变体1二硫键连接正确率为100.00％，未见二硫键错配。而野生型A型肉毒素二硫键连接正确率为94.80％，存在5.20％的错配，其中C₃＝C₈的错配率为0.67％、C₃＝C₉的错配率为0.23％。因此，相较野生型A型肉毒素，本发明的A型肉毒素突变体1二硫键错配率大幅降低，且未出现C₃＝C₈和C₃＝C₉的错配。

实施例4：A型肉毒素突变体2的制备及二硫键结构鉴定

A型肉毒素突变体2(简称突变体2)的制备，具体制备方法参见实施例1和实施例2，结构鉴定内容及方法参见实施例3，其区别仅在于突变体2的氨基酸序列不同(相较于野生型A型肉毒素，突变体2的突变位点为C134G、C165G、C791A、C967A和C1060G)，相应地，突变体2的轻链突变体的氨基酸序列和核苷酸序列(氨基酸序列为SEQ ID NO:5；核苷酸序列为SEQID NO:11)和重链突变体的氨基酸序列和核苷酸序列(氨基酸序列为SEQ ID NO:6；核苷酸序列为SEQ ID NO:12)。对A型肉毒素突变体2二硫键进行检测，具体检测方法参见实施例3，检测数据如表5。

表5：A型肉毒素突变体2二硫键分析

其中，编码A型肉毒素突变体2轻链突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO:11：

ATGCCGTTTGTGAACAAACAGTTTAACTATAAAGATCCGGTGAACGGCGTGGATATTGCGTATATTAAAATTCCGAACGCGGGTCAGATGCAGCCGGTGAAAGCGTTTAAAATTCATAACAAAATTTGGGTGATTCCGGAACGCGATACCTTTACCAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAACAAGTGCCGGTGAGCTATTATGATAGCACCTATCTGAGCACCGATAACGAAAAAGATAACTATCTGAAAGGCGTGACCAAACTGTTTGAACGCATTTATAGCACCGATCTGGGCCGCATGCTGCTGACGAGCATTGTGCGCGGCATTCCGTTCTGGGGCGGCAGCACCATTGATACCGAACTGAAAGTGATTGATACCAACGGTATTAACGTGATTCAGCCGGATGGCAGCTATCGCAGCGAAGAACTGAACCTGGTGATTATTGGCCCGAGCGCGGATATTATTCAGTTTGAAGGTAAAAGCTTTGGCCATGAAGTGCTGAACCTGACCCGCAACGGCTATGGCAGCACGCAGTATATTCGCTTTAGCCCGGATTTTACCTTTGGCTTTGAAGAAAGCCTGGAAGTGGATACCAACCCGCTGCTGGGCGCGGGCAAATTTGCGACCGATCCGGCGGTGACCCTGGCGCATGAACTGATTCATGCGGGCCATCGCCTGTATGGCATTGCGATTAACCCGAACCGCGTGTTTAAAGTGAACACCAACGCGTATTATGAAATGAGCGGCCTGGAAGTGAGCTTTGAAGAACTGCGCACCTTTGGCGGCCATGATGCGAAATTTATTGATAGCCTGCAAGAAAACGAATTTCGCCTGTATTACTATAACAAATTTAAAGATATTGCGAGCACCCTGAACAAAGCGAAAAGCATTGTGGGCACCACCGCGAGCCTGCAGTATATGAAAAACGTGTTTAAAGAAAAATATCTGCTGAGCGAAGATACGAGCGGCAAATTTAGCGTGGATAAACTGAAATTTGATAAACTGTATAAAATGCTGACCGAAATTTATACCGAAGATAACTTTGTGAAATTTTTTAAAGTGCTGAACCGCAAGACCTATCTGAACTTTGATAAAGCGGTGTTTAAAATTAACATTGTGCCGAAAGTGAACTATACCATTTATGATGGCTTTAACCTGCGCAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAACACCGAAATTAACAACATGAACTTTACCAAACTGAAAAACTTTACCGGCCTGTTTGAATTTTATAAACTGCTGTGCGTTCGCGGCATCATTACGAGCAAAACCAAAAGCCTGGATAAAGGCTATAACAAATAA(SEQ ID NO:11)；

编码A型肉毒素突变体2重链突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO:12：

ATGGCGCTGAACGATCTGTGCATTAAAGTGAATAATTGGGATCTGTTTTTTAGCCCGAGCGAAGATAACTTTACCAACGATCTGAACAAAGGCGAAGAAATTACGAGCGATACCAACATTGAAGCGGCGGAAGAGAACATTAGTCTGGATCTGATTCAGCAGTATTATCTGACCTTTAACTTTGATAACGAACCGGAAAACATTAGTATTGAAAACCTGAGCAGCGATATTATTGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAACATTGAACGCTTTCCGAACGGCAAAAAATATGAACTGGATAAATATACCATGTTTCATTATCTGCGCGCGCAAGAATTTGAACATGGCAAAAGCCGCATTGCGCTGACCAACAGCGTGAACGAAGCGCTGCTGAACCCGAGCCGCGTGTATACCTTTTTTAGCAGCGATTATGTGAAAAAAGTGAACAAAGCGACCGAAGCGGCGATGTTTCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTGTATGATTTTACCGATGAGACGAGCGAAGTGAGTACCACCGATAAAATTGCGGATATTACCATTATCATTCCGTATATTGGCCCGGCGCTGAACATTGGCAACATGCTGTATAAAGATGATTTTGTGGGCGCGCTGATTTTTAGCGGCGCGGTGATTCTGCTGGAATTTATTCCGGAAATCGCGATTCCGGTGCTGGGCACCTTTGCGCTGGTGAGCTATATTGCGAACAAAGTGCTGACCGTGCAGACCATTGATAACGCGCTGAGCAAACGCAACGAAAAATGGGATGAAGTGTATAAATATATTGTGACCAACTGGCTGGCGAAAGTGAACACGCAGATTGATCTGATTCGCAAAAAAATGAAAGAAGCGCTGGAAAACCAAGCGGAAGCGACCAAGGCGATTATTAACTATCAGTATAATCAGTATACCGAAGAGGAAAAAAACAACATTAACTTTAACATTGATGATCTGAGCAGCAAATTAAATGAAAGCATTAACAAAGCGATGATCAACATTAACAAGTTTCTGAATCAGGCAAGCGTGAGCTATCTGATGAACAGCATGATTCCGTATGGCGTGAAACGCCTGGAAGATTTTGATGCGAGCCTGAAAGATGCGCTGCTGAAATATATTTATGATAACCGCGGCACCCTGATTGGCCAAGTGGATCGCCTGAAAGATAAAGTTAATAACACGCTGAGCACCGATATTCCGTTTCAGCTGAGCAAATATGTGGATAATCAGCGCCTGCTGAGCACCTTTACCGAATATATTAAAAACATTATTAACACGAGCATTCTGAACCTGCGCTATGAAAGCAACCATCTGATTGATCTGAGCCGCTATGCGAGCAAAATTAACATTGGCAGCAAAGTGAACTTTGATCCGATTGATAAAAATCAGATTCAGCTGTTTAACCTGGAAAGCAGCAAAATTGAAGTGATTCTGAAAAACGCGATTGTGTATAACAGCATGTATGAAAACTTTAGCACGAGCTTTTGGATTCGCATTCCGAAATACTTTAACAGCATCAGCCTGAACAACGAATATACCATTATTAACGCAATGGAAAACAACAGCGGCTGGAAAGTGAGCCTGAACTATGGCGAAATTATTTGGACCCTGCAAGATACCCAAGAAATTAAACAGCGCGTGGTGTTTAAATATAGTCAGATGATTAACATTAGCGATTATATTAACCGCTGGATTTTTGTGACCATTACCAACAACCGTCTGAACAACAGCAAAATTTATATTAACGGCCGCCTGATTGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGCAACATTCATGCGAGCAACAACATTATGTTTAAACTGGATGGCGGTCGCGATACGCATCGCTATATCTGGATTAAATATTTTAATCTGTTCGACAAAGAACTGAACGAAAAAGAAATTAAAGATCTGTATGATAATCAGAGCAACAGCGGCATTCTGAAAGATTTTTGGGGCGATTATCTGCAGTATGATAAACCGTATTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTGAACAACGTGGGCATTCGCGGCTATATGTATCTGAAAGGCCCGCGCGGCAGCGTGATGACCACCAACATTTATCTGAACAGCAGCCTGTATCGCGGCACCAAATTTATTATTAAAAAATATGCGAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGCAACAACGATCGCGTGTATATTAACGTGGTTGTGAAAAACAAAGAATATCGCCTGGCGACCAACGCGAGCCAAGCGGGCGTGGAAAAAATTCTGAGCGCGCTGGAAATTCCGGATGTGGGCAACCTGAGCCAAGTGGTTGTGATGAAAAGCAAAAACGATCAAGGCATTACCAACAAGTGCAAAATGAACCTGCAAGATAACAACGGCAACGATATTGGCTTTATTGGCTTTCATCAGTTTAACAACATTGCGAAACTGGTGGCGAGCAACTGGTATAACCGTCAGATTGAACGCAGCAGCCGCACCCTGGGCTGCAGCTGGGAATTTATTCCGGTTGATGATGGCTGGGGCGAACGCCCGCTGTAA(SEQ ID NO:12)。

实施例5：A型肉毒素突变体蛋白的活性测定

供试品：

实施例2制得的A型肉毒素突变体1、实施例4制得的A型肉毒素突变体2和野生型A型肉毒素。

实验设计及分组给药：

162只小鼠于适应性喂养结束后，分别取54只用于3份待测供试品的测试，给药后密切观察小鼠的毒性反应和各组动物的死亡情况，连续4天。

实验前将实验小鼠称量体重，根据体重平均分配到各组，保证每组动物的体重平均值比较无统计学差异。每个实验分9组，每组6只，雌雄各半。以腹腔注射的方式进行供试品给予；1人抽取供试品溶液，另1人核对；1人保定动物，另1人完成动物给药操作，每组注射完成后记录给药时间。供试品A型肉毒素突变体1的分组、给药剂量信息如表6。

表6：供试品A型肉毒素突变体1小鼠死亡情况记录统计表

如上表6，50％累计死亡率位于45.45455％-83.33333％之间。

在本实验条件下，按Reed-Muench法计算得供试品A型肉毒素突变体1的LD₅₀为1.76381pg/只，折算样品毒力为5.67×10⁸LD₅₀/mg。

相同实验条件下，按Reed-Muench法计算得供试品A型肉毒素突变体2的LD₅₀为3.0770pg/只，折算样品毒力为3.25×10⁸LD₅₀/mg。

相同实验条件下，按Reed-Muench法计算得供试品野生型A型肉毒素的LD₅₀为4.5662pg/只，折算样品毒力为2.19×10⁸LD₅₀/mg。

3份不同供试品毒力比较如表7。

表7：供试品A型肉毒素突变体1&2和野生型A型肉毒素的毒力比较表

供试品(批号)	LD50(pg/只)	毒力(LD50/mg)
			野生型A型肉毒素	4.5662	<![CDATA[2.19×10<sup>8</sup>]]>
A型肉毒素突变体1	1.7638	<![CDATA[5.67×10<sup>8</sup>]]>
			A型肉毒素突变体2	3.0770	<![CDATA[3.25×10<sup>8</sup>]]>

由上表7可知，本发明的A型肉毒素突变体1相较于野生型A型肉毒素具有更高的生物学活性(毒力)，是野生型A型肉毒素毒力的2.6倍。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种A型肉毒素突变体，其特征在于，包括：

第一肽段和第二肽段，所述第一肽段和所述第二肽段通过链间二硫键相连；

其中，所述第一肽段相较于野生型A型肉毒素的轻链，具有第134位和/或第165位的突变；和/或

所述第二肽段相较于野生型A型肉毒素的重链，具有如下突变位点的至少之一：

第791位、第967位和第1060位。

2.根据权利要求1所述的A型肉毒素突变体，其特征在于，所述链间二硫键通过所述第一肽链中的第430位半胱氨酸与所述第二肽链中的第454位半胱氨酸形成。

3.根据权利要求1所述的A型肉毒素突变体，其特征在于，所述第一肽段相较于野生型A型肉毒素的轻链，具有第134位和第165位的突变；和/或

所述第二肽段相较于野生型A型肉毒素的重链，具有第791位、第967位和第1060位的突变。

4.根据权利要求1所述的A型肉毒素突变体，其特征在于，所述第134位、第165位、第791位、第967位或第1060位的半胱氨酸突变为如下氨基酸中的之一：

G、A、S、E和P；

任选地，所述第一肽段的第134位的C突变为G、A或S；

任选地，所述第一肽段的第165位的C突变为G、A、P或S；

任选地，所述第二肽段的第791位的C突变为G、A或S；

任选地，所述第二肽段的第967位的C突变为G、A或S；

任选地，所述第二肽段的第1060位的C突变为G、A、E或S。

5.根据权利要求1所述的A型肉毒素突变体，其特征在于，所述第一肽段相较于野生型A型肉毒素的轻链，具有C134G和C165P的突变；

任选地，所述第二肽段相较于野生型A型肉毒素的重链，具有C791A、C967A和C1060E的突变；

任选地，所述第一肽段具有如SEQ ID NO：3或5所示的氨基酸序列；

任选地，所述第二肽段具有如SEQ ID NO：4或6所示的氨基酸序列。

6.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1～5任一项所述的A型肉毒素突变体中的第一肽段和/或第二肽段；

任选地，所述核酸分子为DNA。

7.一种表达载体，其特征在于，携带权利要求6所述的核酸分子；

任选地，所述表达载体为质粒表达载体。

8.一种基因工程菌，其特征在于，包括：

携带权利要求6所述的核酸分子或权利要求7所述的表达载体；或，

表达权利要求1～5任一项所述的A型肉毒素突变体；

任选地，所述基因工程菌是通过将权利要求7所述的表达载体引入至宿主菌体中而获得的；

任选地，所述宿主菌为大肠杆菌。

9.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1～5任一项所述的A型肉毒素突变体；

任选地，进一步包括药学上可接受的辅料；

任选地，所述药学上可接受的辅料包括选自缓冲液、保护剂、活性剂和赋形剂中的至少之一。

10.权利要求1～5任一项所述的A型肉毒素突变体或权利要求9所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于医学美容；或

所述药物用于治疗或改善斜视、颈部肌张力障碍、喉肌肌张力障碍、上肢局灶性肌张力障碍、原发性手部震颤、流涎症、眼睑痉挛、偏侧面肌痉挛、脑卒中所致上/下肢痉挛、脑瘫所致的上/下肢痉挛、腋窝多汗症、手掌多汗症、逼尿肌-括约肌协同失调、慢性偏头痛及神经源性和特发性膀胱过度活动症中的至少之一；

任选地，所述医学美容包括改善和/治疗如下症状的至少之一：

皱眉纹、鱼尾纹和前额纹。

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