CN101883784A - N-端修饰的干扰素-α - Google Patents
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Abstract
通过将一个或多个氨基酸残基加到成熟干扰素α的N端半胱胺酸,减少成熟IFN-α中非天然双硫键的形成的方法。本发明还披露了由此修饰的IFN-α。
Description
相关申请段落的交叉引用
本发明要求在2007年10月1日提交的美国临时申请No.60/976,696的权益,在此将其内容全部纳入作为参考。
背景
干扰素(IFNs)包括干扰素-α、IFN-β和IFN-γ,都是由免疫细胞对外来物质(如病菌)或异常的自身物质(如癌细胞)的响应所产生的天然蛋白。它们已经被广泛地用于治疗病毒感染和癌症。
成熟的人IFN-α-2b(hIFN-α2b)与它在其他物种中的对应物都具有两个自然产生的二硫键,这对它们的治疗应用来说至关重要。在hIFN-α2b中,这两个二硫键分别在Cys1-Cys98和Cys29-Cys138之间形成。前者是蛋白质活性所必需的。另一方面,后者的丧失会呈现蛋白免疫原性。
hIFN-α2b通常通过在E.coli中表达其编码cDNA来制备。已经发现由此制备的蛋白包含大量的结构异构体,包括低聚体和慢单体,这二者在非还原性条件下在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中,都比他们天然的对应物迁移更慢。这些由非天然的分子间或分子内二硫键的形成而产生的异构体没有治疗价值,因为它们没有活性或者产生免疫原性。因此,人们非常希望开发用于生产几乎无异构体污染的IFN-α蛋白的新技术。
概述
本发明基于一个意外发现,即将氨基酸残基加到成熟hIFN-α2b的N-端半胱氨酸(Cys1)导致非天然二硫键的形成,由此显著降低了其结构异构体的水平。
一方面,本发明的特征在于一种分离的多肽,该多肽包含第一片段,其具有1-5(如1、2、和3)个氨基酸残基;与第二片段,其N-端部分是具有Cys1的成熟IFN-α(如成熟hIFN-α2b)。该第一片段经由肽键与成熟IFN-α的Cys1相连。在一个实施例中,所述第一片段是单个氨基酸,如脯氨酸。需要注意,当该第一片段是单个氨基酸时,它不能是甲硫氨酸。这种多肽可以用于治疗疾病,如病毒感染和癌症。
另一方面,本发明的特征在于一种包含编码上述多肽的核苷酸序列的核酸。
同时,本发明的范围还包括一种通过将1-5个氨基酸残基加到成熟IFN-α的Cys1,降低成熟IFN-α中非天然二硫键的形成的方法。例如,通过将脯氨酸残基加到Cys1,在hIFN-α2b中减少了非天然二硫键的形成。
从以下附图和对几种实施方式的详细说明,以及从附加的权利要求书中将明显看出本发明的其他特点或优点。
附图说明
图1显示hIFN-α2b的氨基酸序列及其编码核酸序列。
图2显示经修饰的成熟hIFN-α2b(Pro-IFN-α2b)的氨基酸序列及其编码核酸序列。
图3是显示在不同时间点重折叠的成熟hIFN-α2b的高效液相色谱图(HPLC);右峰:hIFN-α2b的慢单体,左峰:天然形式的hIFN-α2b。
图4是显示在不同时间点重折叠的Pro-IFN-α2b的HPLC图;峰A:未折叠的Pro-IFN-α2b,峰B:Pro-IFN-α2b的慢单体,峰C:天然形式的Pro-IFN-α2b。
图5是显示硫酸铵/氯化钠处理前后的天然hIFN-α2b和hIFN-α2b结构异构体的HPLC图;峰A:hIFN-α2b的慢单体,峰B:天然形式的hIFN-α2b。
详细说明
本发明旨在减少成熟IFN-α中非天然双硫键的形成,通过将1-5个氨基酸残基加到成熟IFN-α的Cys1来实现。
相应地,本发明提供一种包括两个片段的分离的多肽:第一片段包括多至5个氨基酸残基,而第二片段在其N-端部分包括成熟IFN-α。该第一片段通过肽键与成熟IFN-α的Cys1相连。成熟形式的有Cys1的IFN-α蛋白可以通过检索蛋白质数据库来识别,如GenBank数据库。这种IFN-α蛋白的实例包括人IFN-α2b(GenBank登录号AAP20099;也可见图1),猪IFN-α(GenBank登录号BAE93462),狗IFN-α(GenBank登录号BAE92736),以及牛IFN-α(GenBank登录号AAP87280)。
上述第一片段可以是单个氨基酸残基,如脯氨酸。然而该单个氨基酸残基不能是甲硫氨酸,因为它可以在细胞中被除去。该第一片段也可以是有2-5个氨基酸残基的肽,其序列并不重要。
上述分离的多肽可以利用重组技术来制备。下面是一个实例,通过本领域中已知的方法分离编码IFN-α的基因,例如参见Sambrook et al.,MolecularCloning:A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989。然后通过将编码上述片段的核苷酸序列直接加到编码IFN-α的Cys1的遗传密码子上,修饰上述基因。这种修饰可以通过例如聚合酶链反应(PCR)来实现。然后,如此修饰的基因,其编码N-端修饰的IFN-α,可以在E.coli、酵母、昆虫或哺乳动物细胞中表达。
该分离的多肽也可以通过合成方法或合成与重组方法联合来制备。在一种实施例中,上述第一片段通过合成方法加到成熟IFN-α的N端,将其在宿主细胞中表达和纯化。
人们可以用药学上可接受的载体配制该分离的多肽,以生产药物组合物。药学上可接受的载体是指可以与该组合物中的活性成分兼容(并且优选地,可以稳定该活性成分),并对治疗的主体无害的载体。适宜的载体包括微晶纤维素、甘露醇、葡萄糖、脱脂奶粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉,或它们的结合。然后可以将该组合物制成各种形式,如片剂、胶囊、粉末或液体。
包含该分离的多肽的组合物可以通过适宜的途径施予患者,如静脉注射或皮下注射,每天一次或多次,或每隔几天一次。无菌注射组合物可以是无毒的肠外可接受的稀释剂或溶剂中(如1,3-丁二醇中)的溶液或悬浮液。可使用的属于可接受的载体和溶剂的有甘露醇、水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外,不挥发性油被常规地用作溶剂或悬浮媒介(例如合成的甘油单酯或甘油二酯)。脂肪酸,如油酸及其甘油酯衍生物可用于注射剂的制备,天然的药学上可接受的油也是如此,如橄榄油或蓖麻油,尤其是它们的聚氧乙烯化形式。这些油溶液或悬浮液也可以含有长链醇稀释剂或分散剂,羧甲基纤维素,或类似的分散剂。为了配制的目的,还可以使用其他常用的表面活性剂,例如通常用于制备药物学上可接受的固体、液体或其他剂型的吐温、或司盘、或其他类似的乳化剂或生物利用度增强剂。
在不进一步详细说明的情况下,可以相信以上描述已经足够使本发明被授权。因此,以下实施例仅视为说明性的,而不以任何方式限制本说明书的其余实施方式。在此将本文引用的所有出版物全部纳入作为参考。
实施例1:重组hIFN-α2b和N-端修饰的hIFN-α2b(Pro-hIFN-α2b)的制备
利用人基因组DNA作为模板通过PCR扩增编码hIFN-α2b的第一核酸。见图1。基于编码hIFN-α2b基因(GenBank登录号NM_000605)的编码区域的侧翼序列设计PCR引物。将由此得到的PCR产物克隆进pGEM-T载体(Promega),然后亚克隆进蛋白表达载体pET-24a(Novagen)。
通过利用根据图2所示的核酸序列设计的引物,经PCR扩增修饰上述第一核酸,获得了编码Pro-hIFN-α2b的第二核酸。简言之,将两个另外的密码子ATG和CCG(分别编码Met和Pro)添加至编码成熟hIFN-α2b的Cys1的密码子TGT的5’。将该核酸也克隆进表达载体pET-24a。
然后,将携带hIFN-α2b和Pro-hIFN-α2b基因的pET-24a载体转化E.coli BLR-CodonPlus(DE3)-RIL株(Novagene)。选择高水平表达这两种蛋白的E.coli克隆。按照设计,Pro-hIFN-α2b基因中表达的初生蛋白在N-端有Met(Met-Pro-Cys--)。该Met残基经内部酶消化在E.coli中除去,产生具有N-端Pro的成熟蛋白,其与hIFN-α2b(Pro-Cys--)中的Cys1相连。
将表达hIFN-α2b或Pro-hIFN-α2b的E.coli克隆体在1000ml烧瓶中培养,该烧瓶含有250ml SYN Broth培养基(大豆蛋白胨,酵母提取物,和氯化钠),带有卡那霉素(50ug/ml)和改用氯霉素(50ug/ml),在37℃,200rpm培养16小时。然后将220ml过夜培养液转移到5L发酵罐(Bioflo3000;New Brunswick Scientific Co.,Edison,NJ)中,该发酵罐包含3L确定成分培养基(10g/L葡萄糖,0.7g/L MgSO4·7H2O,4g/L(NH4)2HPO4,3g/LKH2PO4,6g/L K2HPO4,1.7g/L柠檬酸盐,10g/L酵母提取物,10ml/L微量元素以及2g/L异亮氨酸),带有卡那霉素(25ug/ml),改用氯霉素(25ug/ml),0.4%甘油以及0.5%(v/v)微量元素(10g/L FeSO4·7H2O,2.25g/L ZnSO4·7H2O,1g/L CuSO4·5H2O,0.5g/L MnSO4·H2O,0.3g/LH3BO3,2g/L CaCl2·2H2O,0.1g/L(NH4)6Mo7O24,0.84g/L EDTA,和50ml/L HCl)。培养基中氧气的浓度控制在35%,并且必要时通过添加37%氨水使pH保持在7.1。制备含800g/L葡萄糖和20g/L MgSO4·7H2O的进料溶液。当溶解的氧升至大于设定点的值,添加适量的进料溶液以增加培养基中葡萄糖的浓度。在0.7mM的最终浓度下,通过IPTG诱导hIFN-α2b或者Pro-hIFN-α2b基因的表达,然后添加营养料(酵母提取物和微量元素),在IPTG诱导5小时后,收集表达这些蛋白的E.coli细胞。
将收集的E.coli细胞在TEN缓冲液中(50mM Tris-HCl,pH7.0;1mMEDTA,以及100mM NaCl)以1∶10(湿重g/ml)的比例重新悬浮,用匀质器打碎,然后以10,000rpm离心20min。将含有内含体(IB)的颗粒沉淀用TEN缓冲液洗涤两次,再按如上所述离心,悬浮在比例为1ml溶液:2.5g湿重沉淀/ml的4M盐酸胍(GnHCl)水溶液中,再以20,000rpm离心20min。将含有重组hIFN-α2b的IB溶解在50ml含5mM DTT的6M GuHCl中,然后在室温下搅拌1.5hr,接着在25℃以20,000rpm离心20min。收集上清液。在这个过程中,重组hIFN-α2b或Pro-hIFN蛋白被变性。
实施例2:hIFN-α2b和Pro-IFN-α2b的重折叠
将上述IB与1.5L新鲜制备的重折叠缓冲液(100mM Tris-HCl(pH7.0),0.5M L-精氨酸,2mM EDTA)混合。将由此产生的反应混合物在室温下不经搅拌培养24-36hr,以使该重组hIFN-α2b和Pro-hIFN-α2b蛋白重折叠。然后将重折叠的蛋白用pH 7.0的20mM Tris-HCl缓冲液透析,并进一步通过以下描述的Q-琼脂糖凝胶柱色谱纯化。
将Q-琼脂糖凝胶柱(GE Healthcare,Pittsburgh,PA)预平衡,并用20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)洗涤。然后将重折叠的重组蛋白装填到平衡的Q-琼脂糖凝胶柱上,并用含有80mM NaCl的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.0)洗脱。将含有Pro-hIFN-α2b的部分根据它们在280nm的吸收进行收集。利用Bradford方法通过蛋白检测试剂盒(Pierce,Rocford,IL)确定这些蛋白的浓度。
利用C18反相HPLC(RP-HPLC)确定重折叠的重组蛋白的构象,其中自然产生的蛋白和慢单体蛋白是分开的(用图3和4所示的不同峰表示)。RP-HPLC分析是在配备有自动梯度控制器、两个缓冲泵、UV检测器和积分记录器的Angilent HPLC系统上进行。C18HPLC柱(46mmx250mm,5μm粒径;孔径)是在80%缓冲液A:0.2%(v/v)TFA在30∶70乙腈∶水(HPLC级)中平衡。该蛋白是根据以下梯度用缓冲液B(0.2%TFA在80∶20乙腈∶水)以1ml/min的流速从C18HPLC柱中洗脱:
时间(min) 洗脱液(A) 洗脱液(B)
0 72 28
1 72 28
5 67 33
20 63 37
30 57 43
40 40 60
42 40 60
50 72 28
从C18HPLC分析获得的结果表明,大量的重折叠的重组hIFN-α2b蛋白是慢单体(图3中的右峰)。不同的是,在重折叠的重组Pro-hIFN-α2b蛋白中只有极少的慢单体污染,见图4中峰B。
实施例3:天然hIFN-α2b和hIFN-α2b异构体(isoform)的分离
将hIFN-α2b通过上述Q-琼脂糖凝胶柱色谱进行纯化。将包含于纯化蛋白中的hIFN-α2b异构体,包括寡聚体和慢单体,根据美国专利No.4,534,906中描述的方法除去。简言之,将该蛋白与ASP缓冲液(3M硫酸铵和1MNaOAc)混合至最终浓度(0.9M硫酸铵和20mM NaOAc),pH4.5。将该混合物在室温下(如34-40℃)孵育20分钟,以形成包括慢单体和寡聚体的蛋白沉淀。通过离心除去该沉淀,并收集含天然形式的hIFN-α2b上清液。在C18反相HPLC中分析硫酸铵/氯化钠处理前后的蛋白样本,由此获得的结果如图5所示。通过Q-琼脂糖凝胶柱色谱纯化制备的hIFN-α2b蛋白包括大量异构体。见图5顶部的右峰。这些异构体在硫酸铵/氯化钠处理后被除去。
其他实施方式
本说明书中披露的所有特征可以任意组合结合。本发说明书中披露的每一特征可用满足相同、等同或相似目的的供选择的特征来代替。因此,除非另有说明,披露的每一特征仅是通用系列中的等同或类似特征的一个实例。
从以上描述中,本领域的技术人员可以容易确定本发明的本质特征,并且在不背离本发明精神和范围的情况下,可以对本发明做出各种变化和修改,以适应不同的用途和条件。因此,其他的实施方式也属于以下权利要求书的范围。
Claims (20)
1.一种分离的多肽,包括:
由Xn表示的第一片段,X为氨基酸残基,n为1、2、3、4或5,其中如果n=1,X不为Met;和
包含成熟干扰素α的第二片段,其N-端是Cys,该成熟干扰素α形成所述第二片段的N-端部分,其中Cys经由肽键与所述第一片段相连。
2.如权利要求1所述的多肽,其中n为1、2或3。
3.如权利要求1所述的多肽,其中n为1,并且X为脯氨酸。
4.如权利要求1所述的多肽,其中所述干扰素α是人干扰素α-2b。
5.如权利要求3所述的多肽,其中所述干扰素α是人干扰素α-2b。
6.一种分离的核酸,包括编码多肽的核苷酸序列,该多肽包括:
由Xn表示的第一片段,X为氨基酸残基,n为1、2、3、4或5,其中,如果n为1,X不为Met;和
包含成熟干扰素α的第二片段,其N-端是Cys,该成熟干扰素α形成所述第二片段的N-端部分,其中Cys经由肽键与所述第一片段相连。
7.如权利要求6所述的核酸,其中n为1、2或3。
8.如权利要求6所述的核酸,其中n为1,并且X为脯氨酸。
9.如权利要求6所述的核酸,其中所述第一片段为Met-Pro。
10.如权利要求6所述的核酸,其中所述干扰素α是人干扰素α-2b。
11.如权利要求8所述的核酸,其中所述干扰素α是人干扰素α-2b。
12.如权利要求9所述的核酸,其中所述干扰素α是人干扰素α-2b。
13.一种包含权利要求6所述核酸的载体。
14.一种包含权利要求13所述载体的转化细胞。
15.一种治疗病毒感染的方法,包括将含有有效量的权利要求1所述多肽的组合物施予需要的主体。
16.一种治疗病毒感染的方法,包括将含有有效量的权利要求5所述多肽的组合物施予需要的主体。
17.一种减少干扰素α中非天然产生的二硫键的形成的方法,包括将一至五个氨基酸残基加到成熟干扰素α的N端Cys。
18.如权利要求17所述的方法,其中将一至三个氨基酸残基加到成熟干扰素α的N端Cys。
19.如权利要求17所述的方法,其中将Pro加到成熟干扰素α的N端Cys。
20.如权利要求17所述的方法,其中所述干扰素α是人干扰素α-2b。
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PB01 | Publication | ||
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