CN103320459A - 二硫桥连双链形式的蛋白质的重组表达 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及二硫桥连双链形式的蛋白质的重组表达，具体地本发明涉及以双链形式产生多肽或蛋白质的方法，该方法通过在大肠杆菌中的重组表达，由此i)所述多肽或蛋白质作为双链多肽或蛋白质发挥其功能，ii)第一链的C末端氨基酸基团是Arg或Lys基团，iii)所述蛋白质/多肽的第二链在其N末端具有1-20个氨基酸基团和称为PRS的五肽序列VPXGS，其中X可以是任何天然存在的氨基酸，其中V代表Val、Leu、Ile、Ala、Phe、Pro或Gly，P代表Pro、Leu、Ile、Ala、Phe、Val或Gly，G代表Gly、Leu、Ile、Ala、Pro、Phe或Val，而S代表Ser、Tyr、Trp或Thr。

Description

二硫桥连双链形式的蛋白质的重组表达
本发明申请是基于申请日为2006年1月20日，申请号为“200680002957.3”(国际申请号为PCT/DE2006/000088)，名称为“二硫桥连双链形式的蛋白质的重组表达”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明的一个方面涉及通过在大肠杆菌宿主细胞中的重组表达产生双链形式的蛋白质的方法。本发明的另一个方面涉及双链生物学活性形式的蛋白质或多肽，其可通过前述的方法产生。
它们与相应的不呈现本发明特征的重组蛋白质/多肽相比，重要的优势在于不必为了定向切割多肽链而用特异性蛋白酶处理，因而产生方法得以显著简化。本发明的其它方面为：编码根据本发明的多肽/蛋白质的核酸；含有这样的核酸或核酸序列的载体；含有前述载体的宿主细胞；和最后含有双链和生物学活性蛋白质/多肽的药物制剂。
背景技术
梭菌神经毒素是神经细胞中钙依赖性神经递质的分泌的强抑制剂。在通过口腔摄入肉毒杆菌毒素(BoNT)(例如通过腐败的食物)之后，将出现被称作肉毒中毒的临床现象，其特征在于多种肌肉的麻痹。呼吸肌的麻痹最终可导致患者的死亡。在这种情况中，从神经到肌肉的信号转移在肌感受器(myoceptor)处被中断，因为运动神经元不再能够分泌乙酰胆碱。肉毒杆菌神经毒素通过蛋白水解切割参与该分泌过程的蛋白质，即所谓SNARE蛋白，来产生它们的抑制作用。在这里，不同血清型的神经毒素在SNARE蛋白和各自氨基酸序列的切割位点方面具有不同的特异性。BoNT(A)和BoNT(E)切割SNARE蛋白SNAP-25，而BoNT(C)将SNAP-25以及突触融合蛋白-1识别为底物。同样，血清型B、D、F和G的毒素以及破伤风毒素(TeNT)切割VAMP-2(synaprobrevin-2)(Schiavo等,1997)。
梭菌神经毒素是已知的最强的毒药。例如，导致剂量组所有小鼠的一半死于肉毒中毒的静脉给药致死剂量仅为5pg。大多数血清型的毒素当口服时也是有毒的，这是由于它们被包埋在复合蛋白质中，因此在通过胃肠道时免遭消化酶分解。人们还认为它们在通过小肠上皮细胞再吸收毒素中起作用(Fujinaga,1997)。
在过去的几十年中，血清型A和B的肉毒杆菌毒素已经在治疗中得到了应用。例如，通过定位注射仅最小剂量即可能松弛个体慢性痉挛的肌肉。一个特别的优点是长效，例如，BoNT(A)和BoNT(B)的效力多于三到六个月。最先的适应证包括张力失常，例如斜颈(torticollia)、睑痉挛和斜视；又增加了更多的适应证，例如多汗或用于平滑皱纹的美容治疗。肉毒杆菌作为治疗剂的市场增长迅速，相当重要的原因是发展了更多的适应证，而且在已有的用途中有了更加广泛的使用。在这样的背景下，人们尝试了对神经毒素在活性持续时间、效力和抗原潜力方面的性质加以改进。测试显示商业上可获得的制剂(可获自Allergen的BOTOX和可获自Ipsen-Beaufort的Dysport，均为BoNT(A)制剂；以及可获自Elan的Myobloc/Neurobloc，为BoNT(B)制剂)中含有的复合蛋白质对活性持续时间和效力不具积极影响，但是由于蛋白质量比具有相同活性的纯神经毒素制剂更高，可导致患者免疫反应的触发，使进一步的注射变得无效。
由于复合蛋白质在活性成分制剂中不是必需的，甚至是不利的，并且某些用于改进特性的修饰只能通过基因技术完成，因此人们对通过重组表达产生神经毒素存在强烈的需求，例如，通过在大肠杆菌中的表达(以这种方式产生的神经毒素不含前述的复合蛋白质)。此外由于肉毒杆菌毒素将被赋予不同的细胞特异性，将发展新的适应证。这里，通过重组毒素或毒素衍生物的途径同样是优选的。
肉毒杆菌毒素以及破伤风毒素在它们的氨基酸序列上具有高同源性，并且特别是在其域结构方面是相似的。它们由受体结合域(HC)、易位域(HN)和催化亚基(L)组成，其导致神经细胞中相应SNARE蛋白的切割。HC负责神经毒素特异性结合到肌感受器，而易位域保证L能够通过核内体进入神经元的细胞质。HN(N末端)和HC(C末端)形成100kDa的重链，而L是轻链，形成50kDa的催化亚基。两种多肽链彼此通过二硫键相连。在参与的半胱氨酸残基之间有接头区或环区(还同义地称为接头序列或环序列，或更简单的，称为接头或环)，其长度在各种血清型的肉毒杆菌毒素之间变化很大。最迟在细胞溶胞过程中从梭菌释放毒素时，该环被至今还未定性的梭菌内肽酶切割，其中切割和未切割的种类的比率在血清型之间有所不同。对于神经毒素的活性而言，将环切割成双链毒素是关键的(Schiavo等,1997)。例如，在肉毒杆菌神经毒素A的情况下，从环中，即环序列VRGIITSKTKSLDKGYNKALNDL中，切出一个十肽，其在N末端以及C末端有半胱氨酸残基直接相邻，不仅一个肽键被切割，而且发生两个蛋白酶切割作用。在这种情况下，生物活性的肉毒杆菌神经毒素A的分子量天然地低于原本在梭菌中翻译的毒素的分子量。
因为其他宿主生物体例如大肠杆菌中不存在梭菌蛋白酶，重组肉毒杆菌毒素和它们的片段或衍生物在其中作为单链肽表达。对于任何其它作为双链蛋白发挥其正常生物/生化活性的蛋白质而言也是如此：一般而言，这种蛋白质通过重组DNA技术作为单链蛋白获得，它们天然作为双链蛋白发挥的生物/生化活性因此几乎不存在或完全不存在。
在过去，为了产生活性的蛋白质，尤其是活性的肉毒杆菌毒素，必须插入序列特异性蛋白酶(例如凝血酶、因子Xa AA或genenase)的识别序列，使得在纯化之后，能够通过添加内切蛋白酶进行切割并由此进行活化。这种内切蛋白酶的使用主要有两种的缺点：一方面，不能在任何情况下排除这样的可能，即除了通过基因技术方法添加的切割位点之外，氨基酸序列中还存在其它添加的切割位点。即使当这些次要切割位点的切割效率显著较低时，在蛋白酶处理之后，毒素的不同切割变体的混合物可导致分离上的困难。另一方面，在药物制剂的情况下，由于制药法律(受规章限制的考虑因素)的原因，后续添加蛋白质或让制剂接触其它蛋白质是非常不利的，因为必须证明该蛋白质和其可能存在的污染物在进一步的处理中得以完全去除；这通常需要相当的花费。
对于其它细菌毒素(例如假单胞菌外毒素或白喉毒素)，也需要通过蛋白水解切割成双链二硫桥连多肽的活化来使酶域发挥毒性作用(例如，通过ADP核糖基化延伸因子并且由此抑制蛋白质合成)。这些毒素用于产生所谓的免疫毒素，特别是用于肿瘤治疗。为此目的，将毒素的细胞结合域换成对肿瘤特异表面蛋白(分化抗原或肿瘤相关抗原)具有高结合亲和力的蛋白质域。在经典的免疫毒素中这些蛋白质域由单克隆抗体或其片段组成，但也可以利用下述蛋白质来赋予针对某些肿瘤细胞的特异性，仅举数例：细胞因子、生长因子以及affilin、锚蛋白重复蛋白或经过突变和选择的anticalin家族蛋白质等。在这种融合蛋白的重组表达中，获得单链多肽。然而，例如，除了蓖麻(Ricinus communis)的蛋白酶以外，蓖麻毒蛋白没有蛋白酶加工位点，而必须插入这种位点，白喉毒素片段和假单胞菌外毒素片段作为免疫毒素的组成部分能够在内在化于内体区室中之后被目标细胞的蛋白酶所切割。这在形成二硫键的半胱氨酸残基之间的环区域中发生。然而，仅仅最小部分而非全部内在化的免疫毒素分子以这种方式被加工(Ogata等,1990)。
为了以足够的数量和可溶的形式获得重组蛋白，尤其是较小的多肽，在许多情况下必须将它们作为融合蛋白或杂合蛋白，例如与谷胱甘肽-S-转移酶或麦芽糖结合蛋白融合或杂合的蛋白在大肠杆菌中表达。此外，市场上有许多借助用于亲和纯化的N-末端或C-末端标签(例如His标签、Strep标签或FLAG标签)来表达所需多肽的表达系统。许多情况下，表达质粒中在插入所需蛋白的编码DNA序列的多克隆位点和融合配偶体(fusion partner)或亲和标记物的编码序列之间存在蛋白酶识别序列。该序列被这样设计，使得在表达和纯化融合蛋白之后，通过添加合适的序列特异内切蛋白酶(例如，凝血酶、因子Xa或genenase)，能够将所需蛋白从额外的肽区域分离出来。如果两种融合配偶体通过二硫键而非肽键彼此共价结合，则在纯化之后借助含巯基物质例如β-巯基乙醇、DTT或还原谷胱甘肽的简单还原作用将其彼此分离是可能的。例如，可使用前述还原剂将所需的蛋白质从亲和基质(例如Ni-NTA琼脂糖或StrepTactin琼脂糖)洗脱，而亲和标签保持与基质结合。这样就可以免去分离亲和标签的进一步纯化步骤或添加内切蛋白酶。
因此，最好提供一种方法，用来重组表达各种蛋白质/多肽，尤其是神经毒素和所述神经毒素的片段和衍生物以及融合蛋白或杂合蛋白，特别是用来重组表达这样的免疫毒素：其在宿主细胞裂解之后已经以其生物活性的双链结构存在，其中所述两条链是二硫桥连的。本文所述的发明提供了这种用于产生这些蛋白质和多肽的方法。
发明内容
令人惊讶的是，发明者们发现，当BoNT(A)的LHN片段或完整的神经毒素A——二者通过重组表达作为单链获得，但均以双链二硫桥连形式发挥它们正常的生物/生化活性——被施以至少一个特定的修饰，优选核酸水平的修饰时，可通过重组表达以双链形式获得LHN片段和完整的毒素。发明者进行的后续测试已证明，对于任何其他蛋白质/多肽也是如此，如果它们依照常规重组方法作为单链获得但以双链二硫键形式发挥其生物活性的话。
前述“至少一个修饰”在BoNT(A)的情况下或在BoNT(A)的LHN片段的情况下，涉及一种五肽序列的插入，该五肽序列在本文中称为PRS(蛋白酶识别位点)。对于蛋白质/多肽的一般情况，可以对存在于待修饰(优选在核酸水平)的蛋白质/多肽中的五肽序列进行这样的修饰(例如，通过替换至少一个氨基酸残基或通过插入PRS的少数氨基酸残基或通过缺失氨基酸残基)，使得其与插入到已经存在的序列中的五肽序列PRS一致。以相同的方式可插入六/七/八(等)肽序列插入，需要或不需要缺失一个或两个或三个或数个氨基酸残基。依照本发明，有利无害的是最终表达的多肽在其环区域具有PRS(五肽)序列，其中所述“环区域”根据本发明定义为位于两个参与二硫键的半胱氨酸残基之间的氨基酸序列。当该PRS序列存在于环区域时将产生这样的结果，即在切断多肽序列PRS相邻的单链多肽后(在氨基酸水平)，天然存在于两条不同链中的序列也被分到两条不同的链上。在肉毒杆菌神经毒素A(BoNT(A))的情况下，该PRS序列优选地通过缺失BoNT(A)的五肽Asp443-Asp447而插入到环中(参见图3-1)。在其它蛋白质/多肽中(例如，在BoNT(B)、BoNT(C1)、BoNT(D)、BoNT(E)的情况下，在蓖麻毒蛋白的情况下，在假单胞菌外毒素PE40的情况下或在白喉毒素(DT)的情况下)，则优选将经修饰的BoNT(A)的环插入到环序列中(参见图3-2至3-5)，其中可缺失掉或不缺失掉天然环序列的氨基酸残基。图3-2至3-5中修饰的环序列是不具有两个末端Cys残基的那些序列，其中PRS序列的中央氨基酸不但可以是R、Y、H或Q，还可以是任何其它天然存在的氨基酸。在前述其他蛋白质/多肽的情况下，特别优选插入仅仅一部分经修饰的BoNT(A)的环，尤其是序列GIITSKTKSLVPXGSKALNDL(X=天然存在的氨基酸)，其中可以缺失掉或不缺失掉天然环序列的氨基酸残基。图3-2至3-5中的修饰的环序列是那些不具有两个末端Cys残基的序列。
因此，对于BoNT(A)的LHN片段或对于完整的重组毒素，这意味着序列修饰是L和HN之间的环区域中的改变，并且这种改变为PRS序列的存在作了准备。根据本发明，PRS序列，不只对于BoNT(A)，是五肽序列Val-Pro-Xaa-Gly-Ser。Xaa代表任何天然存在的氨基酸。与Xaa是Arg还是任何其它天然存在的氨基酸无关，在任何情况下均将五肽序列Val-Pro-Xaa-Gly-Ser称作五肽序列。然而当PRS序列的另外四个氨基酸残基之一被替换时——这在本发明的背景下确实是可能的——特别是替换为相应的亲水/疏水或极性单极残基时，将此情况下和下文中，将把该序列称为PRS五肽序列的变体。例如，当Val被Leu、Ile、Ala、Phe、Pro或Gly取代时即出现变体。此外，(还或仅)当PRS从N末端数起第二位的脯氨酸由Leu、Ile、Ala、Phe、Val或Gly取代时出现变体。同样，PRS的第四位的甘氨酸可以，例如，被Leu、Ile、Ala、Pro、Phe或Val取代；这导致其它的变体。并且当PRS的第五位的丝氨酸被例如，Tyr、Trp、Thr，及任选地Cys或Met取代时，将出现另外类型的变体。根据本发明，将至少在PRS序列的位置1、2、4和5之一含有不同于Val-1、Pro-2、Gly-4和/或Ser-5氨基酸残基的那些序列称为五肽序列的变体。
当BoNT(A)的LHN片段(或完整的毒素)或任何其它蛋白质/多肽——其通常由重组表达作为单链蛋白质/多肽获得但(仅)在双链形式是生物/生化活性的——含有五肽序列Val-Pro-Xaa-Gly-Ser(其中Xaa是20种天然存在的氨基酸中的任一种，且其中四个其它氨基酸可根据上段的含义加以取代)时，其将以双链形式存在于大肠杆菌宿主细胞(例如，大肠杆菌K12，尤其是菌株M15[pREP4]、XL1-BLUE或UT5600的大肠杆菌K12宿主细胞)的裂解物中，其中在BoNT(A)的情况下，轻链通过二硫键共价结合至HN或完整的重链(图7)。多肽链的切割在细胞裂解之后立即实现，或在温育细胞裂解物几小时后基本上完成。通过毒素或毒素片段的蛋白酶域活性的自我蛋白酶解是可以排除的，因为相应修饰了环区域的蛋白酶失活突变体在表达和大肠杆菌宿主细胞解体之后仍以双链结构存在。显而易见，负责切割PRS五肽序列的是大肠杆菌宿主菌株的蛋白酶。
根据四段之前以“令人惊讶的是，发明者们…”开始的那一段(在第4页)，另一个优选的修饰位于PRS序列N末端间隔1-20个氨基酸残基处(N末端方向上紧邻五肽PRS序列的缬氨酸残基的氨基酸——在图3-2至3-5的情况下是亮氨酸残基——与PRS序列的间隔是1个氨基酸残基)，尤其是间隔3-15个氨基酸残基处，特别是间隔3-10个氨基酸残基处，更加优选间隔3-8个氨基酸残基处，更加优选在间隔3个氨基酸残基处存在碱性氨基酸残基，优选赖氨酸残基或精氨酸残基，其中大肠杆菌宿主细胞蛋白酶在它的C末端切割环序列。切断之后即获得多肽，该多肽，例如，从PRS序列的缬氨酸残基的N末端起具有两个氨基酸残基(当以上定义的间隔是3氨基酸残基时)。在目前的情况下，“修饰”不一定意味着发生真正意义上的修饰，即氨基酸残基的插入或取代，而使得PRS序列的N末端在前面定义的间隔1-20个氨基酸残基处存在碱性氨基酸残基(例如，赖氨酸残基)。唯一重要的是与PRS序列N末端具有上述间隔的地方存在碱性氨基酸残基(例如赖氨酸残基或精氨酸残基)。
依照五段之前“令人惊讶的是，发明者们…”的那一段，另一种同样非必需但优选的修饰在于，被大肠杆菌宿主细胞蛋白酶切割的环序列长度为至少9个氨基酸残基。环序列优选的长度是至少12、至少15、至少18、至少20和至少23个氨基酸残基。环序列特别优选的长度是15-22，尤其是18-22个氨基酸残基。
根据本发明的方法在非常一般的意义上，是一种以大肠杆菌宿主细胞中的重组表达为手段来产生双链形式的蛋白质/多肽的方法，其中所述两条链是二硫桥连的，其中(i)所述蛋白质/多肽作为双链二硫桥连的蛋白质/多肽发挥其生物活性；(ii)第一链的C末端氨基酸残基是Arg残基或Lys残基；(iii)蛋白质/多肽的第二链在一个半胱氨酸残基的N端方向具有1-20氨基酸残基作为N末端，并且具有命名为PRS五肽序列VPXGS，其中X是任何天然存在的氨基酸，其中V是Val、Leu、Ile、Ala、Phe、Pro或Gly，其中P是Pro、Leu、Ile、Ala、Phe、Val或Gly，其中G是Gly、Leu、Ile、Ala、Pro、Phe或Val，并且其中S是Ser、Tyr、Trp或Thr；以及(iv)所述方法包括以下步骤：(a)在核酸水平上修饰蛋白质/多肽，使得修饰形式的该蛋白质/多肽在其环区域之内具有前述五肽序列(VPXGS)；(b)在核酸水平上插入修饰的构建体到大肠杆菌细胞中；(c)培养并且随后裂解宿主细胞；和(d)分离双链蛋白质/多肽。
具体地，本发明涉及如下方面：
1.通过在大肠杆菌宿主细胞中重组表达产生双链形式的多肽或蛋白质的方法，所述两条链是二硫桥连的，其中
(i)所述多肽或蛋白质作为双链二硫键桥连的多肽或蛋白质发挥其生物活性；
(ii)第一链的C末端氨基酸残基是Arg残基或Lys残基，
(iii)所述蛋白质/多肽的第二链在N末端具有1-20个氨基酸残基和称为PRS的五肽序列VPXGS，其中X是任何天然存在的氨基酸，其中V是Val、Leu、Ile、Ala、Phe、Pro或Gly，其中P是Pro、Leu、Ile、Ala、Phe、Val或Gly，其中G是Gly、Leu、Ile、Ala、Pro、Phe或Val，并且其中S是Ser、Tyr、Trp或Thr；并且
(iv)所述方法包含以下步骤：
(a)在核酸水平修饰多肽或蛋白质，使得经修饰形式的该多肽或蛋白质在其环区域具有序列VPXGS，其中X、V、P、G和S如上所定义；
(b)将核酸水平被修饰的构建体导入到大肠杆菌细胞中；
(c)培养并随后裂解宿主细胞；和
(d)分离所述双链二硫桥连的肽或蛋白质。
2.根据项1的方法，其中所述多肽/蛋白质的第一链是该多肽/蛋白质的较轻的链，而第二链是该多肽/蛋白质的较重的链。
3.根据项1或2的方法，其中所述多肽或蛋白质是肉毒杆菌神经毒素。
4.根据项1-3之一的方法，其中所述多肽或蛋白质是血清型A的肉毒杆菌神经毒素(BoNT(A))。
5.根据项1或2的方法，其中所述多肽或蛋白质是BoNT(A)的LHN片段。
6.根据项4或5的方法，其中将PRS序列VPXGS插入到BoNT(A)的氨基酸Leu442和Lys448之间，该BoNT(A)缺失了氨基酸443-447。
7.根据项6的方法，其中将PRS序列VPRGS、VPYGS、VPHGS或VPQGS插入。
8.根据项1-3之一的方法，其中将PRS序列VPXGS插入缺失了至少一个氨基酸的下列序列中：BoNT(B)的八肽Lys438-Ile445、BoNT(C1)的15聚体His438-Asp452、或BoNT(E)的13聚体Lys413-Ile425。
9.根据项8的方法，其中将PRS序列VPXGS以17聚体GIITSKTKSLVPRGSKA或18聚体RGIITSKTKSLVPRGSKA的形式插入。
10.根据项1或2的方法，其中所述蛋白质是杂合蛋白。
11.根据项10的方法，其中所述杂合蛋白具有以下成分A、B和C：
-效应物域，该域通过其酶促活性，能够抑制靶细胞中的分泌或杀死它们，或毒素域(成分A)；
-环序列，其包含序列VPXGS(成分B)；以及
-细胞结合域，其赋予所述融合蛋白或杂合蛋白以细胞特异性(成分C)。
12.根据项11的方法，其中所述杂合蛋白还包含作为成分D的易位域。
13.根据项11或12的方法，其中所述毒素域(A)是白喉毒素、假单胞菌外毒素或蓖麻毒蛋白的域。
14.根据项13的方法，其中所述毒素域(A)是假单胞菌外毒素的片段PE40(域III、域II和域Ib)或片段PE38(域III和域II)或蓖麻毒蛋白A链。
15.根据项11-14之一的方法，其中所述细胞结合域(C)是单克隆抗体、affilin、锚蛋白重复蛋白、anticalin、生长因子例如TGF-alpha、FGF、VEGF或IGF-1，或细胞因子例如IL2、IL4或IL6。
16.根据项10的方法，其中所述杂合蛋白具有以下成分A、B和C：
-蛋白质或寡肽，其赋予融合蛋白较好的可溶性，实现较高的表达率和/或使其能够被亲和纯化(成分A)；
-环序列，其包含序列VPXGS(成分B)，以及
-任何类型的多肽(成分C)。
17.根据项16的方法，其中所述成分A是谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、His标签、Strep标签或FLAG标签。
18.根据前述项之一的方法，其中所述大肠杆菌细胞是大肠杆菌K12细胞，尤其是菌株M15[pREP4]、XL1-BLUE或UT5600的大肠杆菌K12细胞。
19.多肽或蛋白质，其中该多肽/蛋白质作为双链二硫桥连的多肽/蛋白质存在，并且是生物活性的，其特征在于该多肽/蛋白质的第一链C末端是Arg残基或Lys残基，而该多肽/蛋白质的第二链在N末端包含1-20个氨基酸残基和称为PRS的五肽序列VPXGS，其中X是任何天然存在的氨基酸，其中V是Val、Leu、Ile、Ala、Phe、Pro或Gly，其中P是Pro、Leu、Ile、Ala、Phe、Val或Gly，其中G是Gly、Leu、Ile、Ala、Pro、Phe或Val，并且其中S是Ser、Tyr、Trp或Thr。
20.根据项19的多肽或蛋白质，其中所述多肽/蛋白质的第一链是该多肽/蛋白质的较轻的链，而第二链是该多肽/蛋白质的较重的链。
21.根据项19或20的多肽或蛋白质，其中所述第一链的C末端是Lys残基。
22.根据项19-21之一的多肽或蛋白质，其中所述第二链在N末端具有五肽序列VPXGS、六肽序列XVPXGS或七肽序列XXVPXGS。
23.根据项19或22的多肽或蛋白质，其中所述多肽/蛋白质是肉毒杆菌神经毒素、肉毒杆菌神经毒素的衍生物或片段，尤其是LHN片段，或所述多肽/蛋白质具有肉毒杆菌神经毒素的生物活性。
24.根据项19-23之一的多肽或蛋白质，其中所述多肽/蛋白质是血清型A的肉毒杆菌神经毒素(BoNT(A))或具有BoNT(A)的生物活性。
25.根据项19-22之一的多肽或蛋白质，其中所述多肽或蛋白质是BoNT(A)的LHN片段或具有BoNT(A)的LHN片段的生物活性。
26.根据项19-25之一的多肽或蛋白质，其中所述第二链在N末端具有七肽序列SLVPXGS。
27.根据项26的多肽或蛋白质，其中X是R、Y、H或Q。
28.根据项19-22、26或27之一的多肽或蛋白质，其中所述蛋白质是杂合蛋白。
29.根据项28的多肽或蛋白质，其中所述杂合蛋白具有以下成分A、B和C：
-效应物域，该域通过其酶促活性能够抑制靶细胞中的分泌或杀死它们，或毒素域(成分A)；
-环序列，其包含序列VPXGS(成分B)；以及
-细胞结合域，其赋予融合蛋白或杂合蛋白以细胞特异性(成分C)。
30.根据项29的多肽或蛋白质，其中所述杂合蛋白还具有易位域作为成分D。
31.根据项29或30的多肽或蛋白质，其中所述毒素域(A)是白喉毒素、假单胞菌外毒素或蓖麻毒蛋白的域。
32.根据项31的多肽或蛋白质，其中所述毒素域(A)是假单胞菌外毒素的片段PE40(域III、域II和域Ib)或片段PE38(域III和域II)或蓖麻毒蛋白A链。
33.根据项29-32之一的多肽或蛋白质，其中所述细胞结合域(C)是单克隆抗体、affilin、锚蛋白重复蛋白、anticalin、生长因子例如TGF-alpha、FGF、VEGF或IGF-1，或细胞因子例如IL2、IL4或IL6。
34.根据项28的多肽或蛋白质，其中所述杂合蛋白具有以下成分A、B和C：
-蛋白质或寡肽，其赋予融合蛋白较好的可溶性，实现较高的表达率和/或使其能够被亲和纯化(成分A)；
-环序列，其包含序列VPXGS(成分B)，以及
-任何类型的多肽(成分C)。
35.根据项34的多肽或蛋白质，其中所述成分A是谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、His标签、Strep标签或FLAG标签。
36.核酸，其编码根据项19-35之一的多肽或蛋白质。
37.根据项36的核酸，其是DNA。
38.载体，其包含根据项36或37的核酸。
39.宿主细胞，其包含根据项38的载体。
40.根据项39的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核的，尤其是大肠杆菌细胞，特别是大肠杆菌K12细胞。
41.根据项39或40的宿主细胞，其中所述宿主细胞是M15[pREP4]并且其中所述载体是pQE系列的质粒。
42.药物制剂，其包含根据项19-35之一的多肽或蛋白质。
发明详述
根据本发明，蛋白质/多肽的第一链优选是由相应DNA的N末端编码的链，而蛋白质/多肽的第二链因而是由相应的DNA的C末端编码的链。因为5’-DNA-3‘的表达的结果产生N-多肽-C，在前述的本发明优选的情况下，这意味着所述表达可如下表示：5’DNA-3'表达成为N-第一多肽链-C-环-N-第二多肽链-C。根据本发明，所述环已被原位切割，因而最终本发明的多肽/蛋白质N-第一多肽链-C-N-第二多肽链-C以双链结构被获得。
短语“蛋白质/多肽的第二链在一个半胱氨酸残基的N端方向具有1-20氨基酸残基作为N末端，并且具有命名为PRS五肽序列VPXGS”的意思是N末端不是由例如五肽序列VPXGS的缬氨酸残基形成，而是由其它(任何)氨基酸残基形成的。在后者和PRS的缬氨酸残基之间，还可存在1-19个氨基酸残基，但N末端氨基酸残基可通过肽键与例如所述缬氨酸残基直接结合，即，可以紧邻PRS的缬氨酸残基。
可以以它们的(生物)活性双链结构被分离的本发明的蛋白质/多肽是这样的蛋白质，其第一链的C末端具有碱性氨基酸残基，尤其是Arg残基或Lys残基，并且其第二链N末端具有1-20个氨基酸残基以及称为PRS的五肽序列VPXGS，其中X、V、P、G和S是如上所定义。
根据本发明，例如，在基于重组蓖麻毒蛋白的免疫毒素的情况下，序列特异蛋白酶(例如凝血酶或因子Xa)的处理对于活化而言是不必要的。例如，在基于白喉毒素或假单胞菌毒素的免疫毒素的情况下，预期可以获得，事实上也获得了显著增加的效率，因为不再需要靶细胞蛋白酶的加工——毒素的酶域易位至细胞质中的限速步骤了。已经作为双链二硫桥连的多肽存在的免疫毒素，可以小剂量施用并且仍然提供相同的细胞毒作用。这一方面降低了治疗成本，另一方面减少了形成可能使进一步施用该免疫毒素无效的抗体的危险。本发明提供了用于产生双链二硫桥连并由此活化免疫毒素的方法。
用本发明提供的方法还可能制备融合蛋白或杂合蛋白，即，带有用于亲和纯化的肽标签的双链形式的蛋白质，这些蛋白质的两条多肽链通过二硫键共价结合，并且在亲和层析或其它纯化方法之后，可以用含巯基物质(例如β-巯基乙醇、DTT或还原谷胱甘肽)通过简单还原作用来分离。
在大肠杆菌表达菌株例如M15[pREP4]或BL21(DE3)中重组表达梭菌神经毒素和其片段(例如，梭菌神经毒素的LHN片段或衍生物，例如具有修饰的细胞特异性)，产生单链多肽。通过用胰岛素处理这些多肽，在蛋白酶域到易位域的过渡区域的环序列区域中发生切割。因为胰岛素不是序列特异蛋白酶，在多肽的其它区域可能发生切割(通常是不希望的)。例如，BoNT(A)被胰岛素额外地在HN和HC之间切割，因而产生双链LHN片段和HC片段。为了保证大多数情况下理想的、发生在环区域中的选择性切割，特异性内切蛋白酶的识别序列的存在(可选地，在发生插入之后)是必需的。
利用序列特异内切蛋白酶例如凝血酶、因子Xa、genenase等切割重组融合蛋白/杂合蛋白，属于公知的各种方法的范围。纯化之后，可分离融合配偶体，其赋予重组蛋白/多肽更好的可溶性和/或更好的表达，或充当用于亲和纯化的肽标签。为了这种目的，将蛋白质溶液与合适的可溶形式或在基质上固定形式的内切蛋白酶一起温育。
这种技术也可以用于表达前述重组蛋白/多肽，它们作为双链蛋白质/多肽发挥它们的正常生物/生化活性，但利用重组DNA技术获得它们时是无活性的单链蛋白质/多肽(例如，表达梭菌神经毒素、梭菌神经毒素的片段例如LHN片段、或梭菌神经毒素的衍生物，例如细胞特异性被修饰的衍生物)：将内切蛋白酶的识别序列克隆到多肽中，优选在核酸水平克隆，例如克隆到L和HN之间的环区域中；此外，将另一个相同或另外的内切蛋白酶的识别序列克隆至N末端或C末端，使其两侧与用于亲和纯化的肽标签邻接。随后用相应的内切蛋白酶处理或多种内切蛋白酶同时或连续地处理被表达的单链蛋白质/多肽，在环区域的L和HN之间切割来加以活化，并去除肽标签。
这样的内切蛋白酶除了使用的成本和由此所需的额外工作步骤的成本之外，由于制药法律(受规章限制的)方面的原因，它们在药物制剂(例如，使用重组肉毒杆菌毒素或其衍生物)中的使用问题重重。一方面，所使用的内切蛋白酶的纯度必需是经实验证实的，而另一方面，完全的去除以及制剂的无病毒性在进一步纯化流程期间必需得到证明；这通常需要巨大的分析费用。由于将来肉毒杆菌毒素(例如具有性质改良的或细胞特异性被修饰的肉毒杆菌毒素)同样将由重组表达产生，因此人们非常需要这样的表达方法，可以提供前文所述的、作为双链蛋白质/多肽发挥正常生物/生化活性，但通过重组DNA技术获取时以无活性的单链蛋白质/多肽形式存在的重组蛋白质/多肽，特别地，该方法可提供这样的肉毒杆菌毒素或其衍生物，它们是双链二硫桥连的、因此具有生物活性的多肽/蛋白质，而不必要使用内切蛋白酶。
在下文中将更具体地解释本发明，因而最广义地提供一种方法，使用该方法能够通过在大肠杆菌宿主细胞中的重组表达产生蛋白质例如梭菌神经毒素以及其片段和衍生物，并且能够以它们的双链二硫桥连的并且因此是生物活性的形式分离，它们的活化不需要添加内切蛋白酶。
在本发明的第一个优选实施方案中，BoNT(A)半胱氨酸残基430和454之间的环区域的氨基酸序列(参见图3-1至3-5)已被修饰，因而在大肠杆菌宿主细胞的裂解物中表达的毒素或其片段/衍生物已作为双链多肽存在。所述两条链由半胱氨酸残基430和454参与形成二硫键而彼此共价结合。在本发明特别优选的实施方案中，如图3所说明的，五肽Asp443-Asn447(DKGYN)可以用Val-Pro-Arg-Gly-Ser(VPRGS)来取代。在本发明的另一个优选实施方案中，该五肽Asp443-Asn447(DKGYN)还可以用Val-Pro-Tyr-Gly-Ser(VPYGS)、Val-Pro-His-Gly-Ser(VPHGS)或Val-Pro-Gln-Gly-Ser(VPQGS)来取代。在这里，同样地，不仅中央氨基酸残基可以是任何天然存在的氨基酸，另外四个氨基酸残基也可以被替换，如在前文中详细说明的(当替换这些残基的至少一个时，即出现本发明意义上的PRS序列变体)。此外，对该实施方案以及所有其它在下文中将解释的优选实施方案而言仍然优选的是，环序列在PRS的N端方向间隔1-28个氨基酸处具有碱性氨基酸残基，特别是赖氨酸或精氨酸残基。
对于本领域技术人员显而易见的是，替换其它的单个或几个氨基酸残基，或在上面描述的BoNT(A)环区域中插入或缺失另外的氨基酸残基，同样会导致被表达的本发明的毒素或源自它们的片段/衍生物在裂解物中作为双链多肽存在。这些可能的变体同样被本发明所涵盖。
对于本领域技术人员同样显而易见的是，存在于野生型BoNT(A)中的五肽Asp443-Asn447(DKGYN)可以用六肽，七肽、八肽等取代，只要在被表达和单链翻译的多肽/蛋白质中，该PRS五肽序列或其可能的变体之一存在于环区域之内。如上文中已说明的，优选该五肽的N末端存在碱性氨基酸残基(优选赖氨酸)。
此外对于本领域技术人员显而易见的是，PRS五肽(Val-Pro-Arg-Gly-Ser)的优选实施方案是蛋白酶凝血酶可能的识别序列的一部分，凝血酶在凝血级联中扮演重要角色并且具有高度的序列特异性。需要明确地指出，首先，不管是在肉毒杆菌神经毒素A型中还是在其它多肽中，凝血酶切割均不是为了获得所需双链二硫桥连形式必需的，其次，凝血酶识别序列本身，即其未修饰形式，对于借助大肠杆菌裂解物蛋白酶活性的切割是有益的，但完全不是必需的。这样的PRS五肽序列的实施方案——PRS五肽序列插入到或产生在相应的多肽中(更佳：在它们的环中)，而该多肽不含C末端能被凝血酶切割的精氨酸残基(而是存在另一种天然存在的氨基酸)——也导致在环中发生切割，如上文说明的。如上所述，优选在五肽的N端方向、环中的赖氨酸残基处实现切割(同样参见实施例2；图3)。
由于肉毒杆菌毒素的其它血清型，例如作为长效神经毒素的BoNT(B)和BoNT(C1)和作为短效神经毒素的BoNT(E)可用于治疗，而且完全不同的、可作为单链重组表达但仅作为双链发挥其生物活性的多肽/蛋白质也可在治疗上使用，因此，理想地，这些神经毒素以及它们的片段或衍生物(以及其它多肽/蛋白质)也能够作为双链二硫键多肽/蛋白质从大肠杆菌裂解物获得。特别地，在BoNT(B)的情况下，在大肠杆菌裂解物中完全切割重组毒素成为双链多肽/蛋白质，与肉毒梭菌(Clostridium botulinum)分泌的天然神经毒素相比有显著的优势；该天然神经毒素通常有至少40%作为单链存在且因此是失活的多肽，并且不能与活性的双链形式分离。同样显而易见的是，血清型B、C1和E神经毒素中参与二硫键的半胱氨酸残基之间的环区域，相对于BoNT(A)的环而言显著较短(图3和4)。在BoNT(A)中存在23个氨基酸残基(Val431-Leu453)，而在BoNT(B)中仅8个(Lys438-Ile445)，在BoNT(C1)中15个(His438-Asp452)，在BoNT(E)中有13个氨基酸残基(Lys413-Ile425)存在于该区域中。尽管如此，发现除BoNT(B)之外，当这些相对缩短的区域具有根据本发明的PRS序列时，它们的长度足以使链的切割和二硫键形成成为可能。尽管BoNT(B)环中的五肽被替换为PRS五肽序列时(这样环序列的全长仅8个氨基酸残基)，BoNT(B)被切割成符合本发明含义的两条链(轻的和重的)，但是，当环是至少9个、至少15个、至少20个或甚至至少22个氨基酸残基时，获得了更好的结果，也就是说依照本发明这是优选的。最后提到的实施方案之一中，所述环具有22个氨基酸残基，图4-1和4-2的序列或二者之间的比较，对该实施方案作了示例性的说明。
还通过实验证实，对于将神经毒素切割成二硫桥连的双链多肽/蛋白质而言，优选将亚型B、C1等等中的环区域或它们的有效部分替换为BoNT(A)的环区域或它们的有效部分，尤其是当以这种方式环被延伸到至少9个、优选15个残基时，和/或当PRS的N末端插入了碱性氨基酸残基时(例如且优选Lys残基)(如果先前无N末端碱性或Lys残基存在的话)。特别优选的是图4所示的变化(其中图4中的PRS序列是VPRGS，但同时并且优选也是序列VPYGS、VPHGS、VPQGS、VPKGS、VPIGS和VPAGS)。
在本发明的其它实施方案中，将血清型B、C1、D、E、F和G肉毒杆菌毒素以及破伤风毒素中环区域的氨基酸序列和编码基因部分在参与L和HN之间二硫键的半胱氨酸残基之间修饰，使得大肠杆菌宿主细胞裂解物中表达的毒素或源自它们的片段/衍生物已经作为双链多肽存在，该双链多肽中两条链通过二硫键共价结合(对任何通过重组表达作为单链产生但仅以双链形式展现生物活性的其它多肽/蛋白质也是如此)。在本发明的优选实施方案中，神经毒素的完整环区域(或其部分)，或源自它们的毒素片段/衍生物，可以替换为BoNT(A)的完整环区域，如图3所示，或替换为BoNT(A)环区域的部分，其中优选将五肽Asp443-Asn447替换为Val-Pro-Arg-Gly-Ser(VPRGS)。在本发明另外的优选实施方案中，还可以将五肽Asp443-Asn447替换为Val-Pro Tyr-Gly-Ser、Val-Pro-His-Gly-Ser或Val-Pro-Gln-Gly-Ser。在本发明的特别优选实施方案中，前述神经毒素的环区域或环区域的部分，以及源自它们的片段/衍生物，可以被替换为寡肽Arg/Ser-Gly-Ile-Ile-Thr-Ser-Lys-Thr-Lys-Ser-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Lys-Ala(18聚体:R/SGIITSKTKSLVPRGSKA)。如果在上述环序列的区域中进一步替换、插入或缺失单个或几个氨基酸残基，如图4所示，也导致在大肠杆菌(例如，在大肠杆菌K12宿主细胞或其衍生物)中表达之后，被表达的神经毒素或其片段/衍生物成为二硫桥连的双链多肽/蛋白质，这样的替换、插入或缺失明确地包含于本发明中(对任何能够通过重组表达作为单链产生但仅以双链形式具有生物活性的其它多肽/蛋白质也是如此)。
如上文中反复重申的，用根据本发明的方法或根据本发明另外的实施方案的方法，还可以产生融合蛋白或杂合蛋白，其具有，例如，以下成分A、B和C：
-效应物域，通过其酶活性，能够例如抑制靶细胞中的分泌或杀死它们(A)；
-环序列，其被根据本发明如上的说明修饰，且具有如上定义的PRS五肽序列VPXGS(例如，如图3所示的BoNT(A)的修饰环序列或其变体)，并且可具有N末端和/或C末端附着的半胱氨酸残基(B)；以及
-细胞结合域，其赋予融合蛋白或杂合蛋白以细胞特异性(C)。
成分B(环序列)在前两个实施方案中也同样可优选为：(i)如图4所示的修饰的环序列，(ii)在PRS的中央残基可以是任何天然存在氨基酸的残基的范围内，任何源自(i)的序列，或(iii)(i)或(ii)的变体(变体的定义见上)。在图4中，BoNT(B)、BoNT(C1)或BoNT(E)的环序列分别缺失了除N末端和C末端一或两个氨基酸残基以外的部分，并且缺失的氨基酸残基被BoNT(A)的修饰环序列的17聚体GIITSKTKSLVPRGSKA(图4-2和4-6)或18聚体RGIITSKTKSLVPRGSKA(图4-4)所取代。
除了前述的成分A、B和C，融合/杂合蛋白可具有翻译域(在肉毒杆菌神经毒素中位于环序列和细胞结合域之间)。这种额外的域协助效应物域插入靶细胞的细胞质。这种融合蛋白在大肠杆菌(例如，大肠杆菌K12或其衍生菌株)中的表达产生这样的双链多肽/蛋白质，其中一个域在一条链上，而其它两个域在第二条链上(在肉毒杆菌毒素中，效应物域在轻链上，其通过二硫键与在重链上的其它两个域共价结合)。
这些本发明的融合或杂合蛋白可以是所谓的免疫毒素，它们尤其在肿瘤治疗中有用处。在这种背景下，通过使细胞结合域附着于毒素，而赋予毒素对于某种细胞类型(通常为肿瘤细胞)的特异性。作为毒素结合域，主要使用白喉毒素、假单胞菌毒素和蓖麻毒蛋白的酶域。这些毒素属于双链AB毒素，其中提供酶活性的A链通过二硫键共价结合于兼有易位活性和细胞结合活性的B链。然而，在靶细胞中产生期望的作用(例如，肿瘤细胞的杀灭)的范围内，免疫毒素中其它的毒素或毒素片段是可以想到的。第一代免疫毒素是将毒素域(例如蓖麻毒蛋白的A链)与单克隆抗体化学偶联而产生的，第二代免疫毒素是通过重组表达(主要是在大肠杆菌中)作为Fab毒素、单链Fv毒素(scFv毒素)或二硫键稳定化Fv(dsFv毒素)，以及作为与生长因子或细胞因子的融合蛋白产生的(Reiter,2001)。在将来各代免疫毒素中，还可以由经过选择的修饰多肽来赋予细胞特异性，该多肽是根据，例如，与肿瘤特异表面蛋白(如affilins、锚蛋白重复蛋白或anticalins蛋白家族的蛋白)的高亲和力结合而选择的。
在免疫毒素所有可以想到的变体中，必须保证酶性毒素域能够进入靶细胞的细胞质以在其中发生毒性作用。因为在大肠杆菌中免疫毒素作为单链多肽表达，蛋白水解切割以及二硫键的还原对于将酶性毒素域与易位单位和细胞结合域分离(对于链而言)是必需的。在重组白喉毒素片段和重组假单胞菌外毒素片段的情况下，切割于内在化之后在靶细胞的内体区室中通过细胞蛋白酶例如弗林蛋白酶发生(Williams等,1990)。另一方面，蓖麻毒蛋白不具有这样的加工位点，因此，为了作为已经双链二硫桥连的免疫毒素施用，其需要人工插入的蛋白酶识别序列。然而，在基于白喉毒素和假单胞菌外毒素的免疫毒素的情况下，内在化融合蛋白只有最小一部分被切割，因而同样只有最小一部分酶域能够到达细胞质(Ogata等,1990)。下述本发明的优选实施方案描述了多种方法和构建体，依靠这些方法，通过在大肠杆菌宿主细胞中重组表达产生如前面段落中所述的免疫毒素的变体，并且这些变体能够以它们的双链二硫桥连的从而具有生物(酶促)活性的形式被分离，它们的活化不需要细胞内切蛋白酶或体外添加内切蛋白酶。这些免疫毒素能够将酶性毒素域以具有易位能力(translocation competent)的形式转运至靶细胞中，因而不需要细胞蛋白酶的切割，并且为了达到期望的细胞毒性效应而使用的免疫毒素剂量可以显著降低。
相应地，本发明的另一个优选实施方案进一步包含融合蛋白和杂合蛋白，其具有以下成分A、B和C：
-毒素域或其片段/衍生物(A)；
-环序列，其根据本发明如上所述被修饰，并具有如上定义的PRS五肽序列VPXGS(例如，示于图3的BoNT(A)的修饰的环序列或其变体之一)，并且可能已于N末端和/或C末端附着有半胱氨酸残基(B)；以及
-细胞结合域，其可以取自下列蛋白家族中的代表：单克隆抗体蛋白、它们的片段、affilins、锚蛋白重复蛋白、anticalins、生长因子(例如，TGF-alpha、FGF、VEGF或IGF-1)或细胞因子(例如，IL2、IL4或IL6)(C)。
依照最后的这种优选实施方案，成分B(环序列)同样可以是(i)图4所示的修饰的环序列之一，(ii)在PRS的中央残基可以是任何天然存在氨基酸的残基的范围内，任何源自(i)的序列，或(iii)(i)或(ii)的变体(变体的定义见上)。
毒素域可以是蓖麻毒蛋白的A链、假单胞菌外毒素的片段例如PE40或PE38(域II和III，具有或不具有域Ib；图2)或白喉毒素的片段。前述效应物域或毒素域和细胞结合域应仅仅理解为示例。本发明涵盖所有如下所述的蛋白质或蛋白片段：一方面，其赋予融合蛋白/杂合蛋白对靶细胞(例如肿瘤细胞)表面抗原的特异性结合活性，另一方面，其在靶细胞中内在化之后发挥某种作用，例如杀死该细胞，其中在大肠杆菌中表达这种根据本发明的融合/杂合蛋白产生双链多肽/蛋白质，在这些双链多肽/蛋白质中毒素域或它们的衍生物通过二硫键共价结合于细胞结合域。
为了改善基于假单胞菌外毒素的免疫毒素的效率和特异性，曾经选择过不同的方法。例如，曾将受体结合域(域Ia氨基酸残基1-152)替换为单克隆抗体的片段，并且同时将易位域(域II)中半胱氨酸残基13和35(相对于域II编号)之间的环区域(图2和5)修饰，使得后者对普遍存在的细胞蛋白酶——福林蛋白酶的切割不再敏感，但对仅被某种肿瘤细胞以较强的程度表达并部分分泌的特殊蛋白酶的切割敏感(美国专利6,426,075)。设计这种修饰的蛋白酶敏感性，是为了在替换的受体结合域之外进一步赋予免疫毒素增加的细胞特异性。然而，不应期望利用其它细胞蛋白酶可导致环切割的增加并因此提高酶域III的易位效率。
根据另一种用于免疫毒素的方法，将受体结合域和易位域的N末端区域去除，直到环区域中的精氨酸残基27为止。通过下述手段提供这种免疫毒素中所需的细胞特异性：例如，通过在域II和III之间的Ib域处，插入以二硫键相互结合的单克隆抗体VH域和VL域；或通过附加域III的C末端(美国专利5,980,895)。在这种构建体中，通过蛋白酶的活化不再是必需的；一方面，这将导致转运效率显著增加。然而，另一方面可以预期，依靠位于酶域III的N末端或C末端的受体结合域(如单克隆抗体或TGF-alpha的VH域)的易位将被阻碍。因为这些受体结合域未与酶域分离，可以预期会影响酶活性，从而影响靶细胞中的毒性。下面两种情况下，基于假单胞菌外毒素的免疫毒素产生相对最大程度的细胞毒素活性：一方面，半胱氨酸残基13和35之间的环已经以被切割的二硫桥连形式存在，从而不再需要细胞蛋白酶的活化；另一方面，受体结合域取代外毒素的域I而融合于易位域的N末端，使得在细胞质中还原之后其与毒素域分离，从而不阻碍域III的酶活性。
因此，本发明一个特别优选的实施方案包括一种融合/杂合蛋白，其包含细胞结合域，该细胞结合域可取自以下蛋白家族的代表：单克隆抗体、它们的片段、affilins、锚蛋白重复蛋白、anticalins、生长因子(例如，TGF-alpha、FGF、VEGF或IGF-1)或细胞因子(例如，IL2、IL4和IL6)，细胞结合域的C末端融合修饰的PE38片段或其变体，该片段能够在C终端携带内质网保留信号Lys-Asp-Gly-Leu。PE38片段的修饰包含将半胱氨酸残基13和35之间的完整环序列(或仅其部分)替换为PRS五肽序列VPXGS，优选替换为图3所示的BoNT(A)的修饰的环序列或其变体，特别是替换为肽序列Arg-Gly-Ile-Ile-Thr-Ser-Lys-Thr-Lys-Ser-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Lys-Ala(图5)(变体的定义见上)。优选的，在这个实施方案中，还保证有碱性氨基酸位于PRS的N端方向间隔1-20个氨基酸处，如图5的序列中所示。如此修饰的PE38片段以及含有这种修饰片段的融合/杂合蛋白以双链二硫桥连形式存在于大肠杆菌宿主细胞(例如，M15[pREP4])的裂解物中。
和假单胞菌外毒素相反，白喉毒素的酶域——A链存在于N末端。在C末端的B链上有易位域和受体结合域。两条链均通过环序列连接，当被白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)的细胞分泌时，在所述环序列中精氨酸残基193处由蛋白酶进行蛋白水解切割(Collier,2001)。切割后，两条链通过半胱氨酸残基186和201之间的二硫键保持彼此共价结合。在这点上，白喉毒素在其域结构上与肉毒杆菌毒素和破伤风毒素相似。
为了产生重组免疫毒素，将受体结合域或其部分替换为例如VEGF或IL2(Arora等,1999;Williams等,1990)以赋予融合蛋白新的细胞特异性。为了使A链到达靶细胞的细胞质，一方面，在大肠杆菌中作为单链表达的免疫毒素的多肽链必须在A链和B链的环区域之间切割，而另一方面，必须将二硫键还原。虽然后者在易位过程中发生，但细胞蛋白酶的蛋白水解切割是不完全的，因而仅有最小部分的A链的能够释放至细胞质中(Williams等,1990)。如果免疫毒素在施用时已经以双链二硫桥连的形式存在，则可望显著地增加功效，因为所有A链都可成为具有易位能力的形式以供使用。
因此，本发明的另一个特别优选实施方案包含这样的融合或杂合蛋白，其包含细胞结合域，该细胞结合域可取自以下的蛋白家族的代表：单克隆抗体、它们的片段、affilins、锚蛋白重复蛋白、anticalins、生长因子(例如，TGF-alpha、FGF、VEGF或IGF-1)或细胞因子(例如，IL2、IL4和IL6)；所述细胞结合域的N末端融合了修饰的白喉毒素片段。此毒素片段可包含A链以及B链的至少一个易位域(Gly1-Phe389或Gly1-Asn486)。白喉毒素片段的修饰在于：半胱氨酸残基186和201之间的完整环序列(或仅其部分)被替换为图3所示的修饰的环序列或其变体，尤其是替换为肽序列Arg-Gly-Ile-Ile-Thr-Ser-Lys-Thr-Lys-Ser-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Lys-Ala(图5)(变体的定义见上)。这样修饰的白喉毒素片段，以及含有这种修饰片段的融合蛋白，均以双链二硫桥连的形式存在于大肠杆菌宿主细胞(例如M15[pREP4])的裂解物中。
第一代基于蓖麻毒蛋白的免疫毒素是通过连接蓖麻毒蛋白的A链和单克隆抗体而产生。过去这是通过具有化学接头分子的抗体衍生化完成的，其中所述接头分子与位于A链C末端的半胱氨酸残基的巯基官能团形成二硫键。由于抗体的非定向衍生化，这种偶联物是不均一的。抗肿瘤效率不足，很重要的原因是偶联物的大小，以及缺乏位于B链的易位域。当还存在天然形式的B链作为免疫毒素的成分时，毒性将显著增加，但是由于B链的凝集素样细胞结合性，被靶细胞之外的细胞非特异性地摄入也是有可能发生的。人们使用了这样一种策略来应对这种靶标冲突(target conflict)：根据该策略，对B链进行修饰，使得易位活性保持完整而对细胞表面糖结构的结合亲和性却显著降低(专利申请WO89/04839)。然而，含有这种修饰的B链的重组表达免疫毒素具有单链结构，因此，由于A链和B链之间的接头肽中缺乏细胞蛋白酶识别序列，在免疫毒素被摄入靶细胞后A链的释放和易位完全不可能发生，或仅可能以极低的效率发生。美国专利6,593,132中显示，这种天然接头肽是不同细胞特异蛋白酶的识别序列。如果能以蛋白水解方式切割修饰的接头肽的蛋白酶仅在期望的靶细胞中以显著高于其它细胞类型的量表达，具有这种修饰的蓖麻毒蛋白变体可具有相应的细胞特异性。然而，必需假设切割仅在一部分内在化的毒素分子中发生，并且因此仅相应的最小量的A链易位到细胞质中。理想的基于蓖麻毒蛋白的双链免疫毒素是这样的：其中，A链通过二硫键与修饰的B链连接，B链中易位活性保持完整，但非特异性凝集素样细胞结合性被抑制；并且在它们的C末端与特异细胞结合域融合。这种免疫毒素将兼具细胞特异性和高毒性。
因此，本发明的另一个优选实施方案包含这样的融合蛋白，其具有以下成分A、B和C：
-蓖麻毒蛋白的A链(A)；
-环序列，其根据本发明如上所述被修饰，并且具有如上定义的PRS五肽序列VPXGS(例如，示于图3的BoNT(a)的环序列或其变体之一)，并且在N末端和/或C末端可能附着有半胱氨酸残基(B)；以及
-细胞结合域，其可取自以下蛋白家族的代表：单克隆抗体、它们的片段、affilins、锚蛋白重复蛋白、anticalins、生长因子(例如，TGF-alpha、FGF、VEGF或IGF-1)或细胞因子(例如，IL2、IL4和IL6)(C)。
根据最后的优选实施方案的成分B也可以是(i)图4所示修饰的环序列之一，(ii)在PRS的中央残基能够是任何天然存在氨基酸的残基的范围内，任何源自(i)的序列，或(iii)(i)或(ii)的变体(变体的定义见上)。
具体而言，环序列可含有肽序列Ala-Pro-Pro-Arg-Gly-Ile-Ile-Thr-Ser-Lys-Thr-Lys-Ser-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Lys-Ala-Asp-Val(图5-6)，即，修饰的蓖麻毒蛋白A链的环。优选在环序列的C末端具有半胱氨酸残基。但在其中所含的Val-Pro-Arg-Gly-Ser的PRS序列中，Arg可以是任何其它天然存在的氨基酸Xaa。环序列还可以被更多的氨基酸残基(例如，甘氨酸和丝氨酸残基)所扩展。此外，蓖麻毒蛋白的A链可以通过环序列与完整的B链或其部分或变体连接，该环序列取代蓖麻毒蛋白原野生型序列半胱氨酸残基259和283之间的全部或部分氨基酸残基，并且至少包含图3所述的修饰的BoNT(A)的环或其变体。在此情况下，半胱氨酸残基259和283(相对于蓖麻毒蛋白原(pro ricin))形成二硫键。B链的C末端融合了细胞结合域，该细胞结合域取自上述多肽家族。相应的融合/杂合蛋白以双链二硫桥连的形式存在于大肠杆菌宿主细胞(例如菌株M15[pREP4]的细胞)的裂解物中。
本发明的另一个实施方案涉及重组融合蛋白，其具有以下成分A、B和C：
-蛋白质或寡肽，其赋予融合蛋白更好的可溶性，实现较高的表达率和/或使亲和纯化成为可能，（例如，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、His标签、Strep标签、FLAG标签(A)。
-环序列，其根据本发明如上所述被修饰，该环序列包含如上定义的PRS五肽序列VPXGS(例如，如图3所示的BoNT(A)修饰的环序列或其变体)，并且可能具有附着于N末端和/或C末端的半胱氨酸残基，以及
-任何类型的多肽(C)。
依照此最后优选序列的成分B(环序列)同样可以是(i)如图4所示修饰的环序列之一，(ii)在PRS的中央残基可以是任何天然存在的氨基酸残基的范围内，任何源自(i)的序列，或(iii)(i)或(ii)的变体(变体的定义如上所示)。
具体而言，环可以具有肽序列Val-Arg-Gly-Ile-Ile-Thr-Ser-Lys-Thr-Lys-Ser-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Lys-Ala-Leu-Asn-Asp-Leu，其中在PRS中央的Arg仍然可以是Xaa。其在两端均可被更多的氨基酸残基(例如，甘氨酸和丝氨酸残基)延伸。这种融合蛋白在大肠杆菌中的表达产生双链多肽/蛋白质，这些多肽/蛋白质的两条链通过二硫键共价结合，并且在完全纯化之后，可以在不添加蛋白酶的条件下，直接由含巯基物质(例如β-巯基乙醇、DTT或还原谷胱甘肽)还原后彼此分离。这种表达系统尤其适合于这样的蛋白：其要在两个末端之一提供半胱氨酸残基，以便在纯化和分离带有反应性巯基基团的融合配偶体之后，提供用来例如与巯基反应性接头分子偶联反应或供例如聚乙二醇修饰的位点。
此外本发明包含编码根据本发明前面部分所述多肽的所有核酸，并考虑到密码子使用的不同可能性。此外，本发明包含商业上可以获得的或单独构建的克隆和表达质粒，其含有根据本发明的各种多肽的编码DNA序列；以及合适的大肠杆菌克隆和表达菌株，其用相应的表达质粒转化并且能够以其双链二硫桥连形式表达各种根据本发明的多肽。这种表达系统的一个实例是pQE系列的表达质粒和大肠杆菌宿主菌株M15[pREP4]的组合。
对于本领域熟练技术人员，尤其是从事药用多肽/蛋白质开发的技术人员而言，这些多肽/蛋白质的活化不必添加内切蛋白酶的优势是显而易见的。前面部分描述的根据本发明多肽/蛋白质大多是特别以药用为目标的。因此本发明还包含药物制剂，其包含本发明的多肽/蛋白质之一或本发明的多肽/蛋白质的混合物作为有效成分，以及赋予该制剂足够稳定性的有用添加剂；并且其组成与其期望的施用形式相匹配。
附图简述
所附的附图和序列表序列如下所述：
图1显示从肉毒杆菌或大肠杆菌K12释放具有野生型环或根据本发明的修饰环的肉毒杆菌神经毒素A型的示意图。A：在肉毒杆菌细胞的裂解中，神经毒素在轻链(L)和重链(H)之间的环区域中被梭菌内切蛋白酶切割。两条链均通过二硫键彼此相连。B：具有野生型环的重组神经毒素在大肠杆菌中表达并裂解细胞之后，其以单链形式存在。C：当具有根据本发明修饰的环的重组神经毒素从大肠杆菌细胞释放时，内切蛋白酶在环区域中切割。
图2是比较具有野生型环区域以及根据本发明的修饰环区域的不同重组毒素从大肠杆菌细胞释放之后的示意图。A：肉毒杆菌神经毒素；B：假单胞菌外毒素；C：白喉毒素。
图3显示野生型环和挑选的根据本发明修饰的BoNT(A)环序列的比较。图示为核苷酸序列和衍生的氨基酸序列，其包含轻链和重链的限定性半胱氨酸残基。箭头标注大肠杆菌裂解物中内切蛋白酶的切割位点。
图4分别显示肉毒杆菌神经毒素血清型B、C1和E的野生型环和根据本发明修饰的示例环序列的比较。图示为核苷酸序列和衍生的氨基酸序列，其包含轻链和重链的限定性半胱氨酸残基。箭头标注大肠杆菌裂解物中内切蛋白酶的切割位点。
图5分别显示假单胞菌外毒素片段PE40、白喉毒素(DT)和蓖麻毒蛋白的野生型环和根据本发明修饰的示例环序列的比较。图示为核苷酸序列和衍生的氨基酸序列，其包含限定性半胱氨酸残基。箭头标注大肠杆菌裂解物中内切蛋白酶的切割位置。
图6显示用于克隆重组毒素和毒素片段的寡核苷酸的组合。限制性内切酶的识别序列以下划线标记。
图7显示具有根据本发明修饰的环序列的BoNT(A)重组LHN片段在SDS聚丙烯酰胺凝胶上的分析。LHN片段的表达在M15[pREP4]细胞中进行，该细胞被质粒pQE-BoNT(A)-Lmod1HN转化。泳道2和5：在Ni-NTA琼脂糖上纯化的LHN片段；泳道1和4：同凝血酶一起温育之后的LHN片段；泳道3：分子量标记。上样在还原条件(泳道1和2)和非还原条件下(泳道4和5)。
图8显示具有根据本发明修饰的环序列的BoNT(B)重组LHN片段在SDS聚丙烯酰胺凝胶上的分析。LHN片段的表达在M15[pREP4]细胞中进行，该细胞被质粒pQE-BoNT(B)-Lmod1HN转化。泳道1和4：在Ni-NTA琼脂糖上纯化的片段LHN；泳道2：分子量标记；泳道3：无上样。上样在还原条件(泳道1)和非还原条件下(泳道4)。
图9显示具有根据本发明修饰的环序列的重组BoNT(C1)在SDS聚丙烯酰胺凝胶上的分析。该毒素的表达在M15[pREP4]细胞中完成，该细胞被质粒pQE-BoNT(C1)-Lmod1HNHC转化。泳道1和4：在Ni-NTA琼脂糖上纯化的毒素；泳道2：分子量标记；泳道3：无上样。上样在还原条件(泳道1)或非还原条件下(泳道4)。
SEQ ID NO.1是编码具有根据本发明修饰的环序列和C末端六组氨酸标签的重组肉毒杆菌神经毒素A型(rBoTN(A)-mod1)的核酸(DNA)的实例。
SEQ ID NO.2是具有根据本发明修饰的环序列和C末端六组氨酸标签的重组肉毒杆菌神经毒素A型(rBoTN(A)-mod1)的实例。
SEQ ID NO.3是编码具有根据本发明修饰的环序列和C末端六组氨酸标签的肉毒杆菌神经毒素A型重组LHN片段(rBoTN(A)-Lmod1HN)的核酸(DNA)的实例。该序列相应于SEQ ID NO.1，其中缺失核苷酸2620-3888。
SEQ ID NO.4是具有根据本发明修饰的环序列和C末端六组氨酸标签的肉毒杆菌神经毒素A型重组LHN片段(rBoTN(A)-Lmod1HN)的实例。该序列相应于SEQ ID NO.2，其中缺失氨基酸残基874-1296。
SEQ ID NO.5是编码具有根据本发明修饰的环序列和C末端六组氨酸标记的肉毒杆菌神经毒素A型重组LHNHCN片段(rBoTN(A)-Lmod1HNHCN)的核酸(DNA)的实例。该序列相应于SEQ ID NO.1，其中缺失核苷酸3286-3888。
SEQ ID NO.6是具有根据本发明修饰的环序列和C末端六组氨酸标记的肉毒杆菌神经毒素A型重组LHNHCN片段(rBoTN(A)-Lmod1HNHCN)的实例。该序列相应于SEQ ID NO.2，其中缺失氨基酸残基1096-1296。
SEQ ID NO.7是编码具有根据本发明修饰的环序列和C末端六组氨酸标签重组肉毒杆菌神经毒素B型(rBoTN(B)-mod1)的核酸(DNA)的实例。
SEQ ID NO.8是具有根据本发明修饰的环序列和C末端六组氨酸标签的重组肉毒杆菌神经毒素B型(rBoTN(B)-mod1)的实例。
SEQ ID NO.9是编码具有根据本发明修饰的环序列和C末端六组氨酸标签的肉毒杆菌神经毒素B型重组LHN片段(rBoTN(B)-Lmod1HN)的核酸(DNA)的实例。该序列对应于SEQ ID NO.7，其中缺失了核苷酸2623-3915。
SEQ ID NO.10是具有根据本发明修饰的环序列和C末端六组氨酸标签的肉毒杆菌神经毒素B型重组LHN片段(rBoTN(B)-Lmod1HN)的实例。该序列对应于SEQ ID NO.8的序列，其中缺失了氨基酸残基875-1305。
SEQ ID NO.11是编码具有根据本发明修饰的环序列和C末端六组氨酸标签的重组肉毒杆菌神经毒素C1型(rBoTN(C1)-mod1)的核酸(DNA)的实例。
SEQ ID NO.12是具有根据本发明修饰的环序列和C末端六组氨酸标签的重组肉毒杆菌神经毒素C1型(rBoTN(C1)-mod1)的实例。
SEQ ID NO.13是编码具有根据本发明修饰的环序列和C末端六组氨酸标签的肉毒杆菌神经毒素C1型重组LHN片段(rBoTN(C1)-Lmod1HN)的核酸(DNA)的实例。该序列对应于SEQ ID NO.11，其中缺失了核苷酸2599-3858。
SEQ ID NO.14是具有根据本发明修饰的环序列和C末端六组氨酸标签的肉毒杆菌神经毒素C1型重组LHN片段(rBoTN(C1)-Lmod1HN)的实例。该序列对应于SEQ ID NO.12，其中缺失了氨基酸残基867-1286。
SEQ ID NO.15是编码具有根据本发明修饰的环序列和C末端六组氨酸标签的肉毒杆菌神经毒素E型(rBoTN(E)-mod1)的核酸(DNA)的实例。
SEQ ID NO.16是具有根据本发明修饰的环序列和C末端六组氨酸标签的重组肉毒杆菌神经毒素E型(rBoTN(E)-mod1)的实例。
SEQ ID NO.17是编码具有根据本发明修饰的环序列和C末端六组氨酸标签，并包含域II、Ib和III的假单胞菌外毒素重组40kDa片段(PE40-mod1)的核酸(DNA)的实例。
SEQ ID NO.18是具有根据本发明修饰的环序列和C末端六组氨酸标签，并包含域II、Ib和III的假单胞菌外毒素重组40kDa片段(PE40-mod1)的实例。
SEQ ID NO.19是编码具有根据本发明修饰的环序列和C末端六组氨酸标签、且包含A链和B链N末端片段的白喉毒素重组片段(DT389-mod1)的核酸(DNA)的实例。
SEQ ID NO.20是具有根据本发明修饰的环序列和C末端六组氨酸标签、且包含A链和B链N末端片段的白喉毒素重组片段(DT389-mod1)的实例。
SEQ ID NO.21是编码具有根据本发明修饰的环序列和C末端六组氨酸标签的重组蓖麻毒蛋白(rRicin-mod1)的核酸(DNA)的实例。
SEQ ID NO.22是具有根据本发明修饰的环序列和C末端六组氨酸标签的重组蓖麻毒蛋白(rRicin-mod1)的实例。
实施例
实施例1克隆和表达具有修饰的环的肉毒杆菌神经毒素A型LHN片段
为了克隆轻链以及易位域的DNA序列，将染色体DNA从肉毒梭菌A型(菌株ATCC3502)的培养物中分离。通过用引物#1和#2(图6)的PCR扩增，获得编码具有修饰的环序列和C末端His标签的BoNT(A)轻链的基因片段。借助Nco1和Sal1的限制位点将PCR扩增产物克隆到表达质粒pQE-60中，从而产生质粒pQE-BoNT(A)-Lmod1。通过用引物#3和#4(图6)的PCR扩增，产生编码BoNT(A)的易位域的基因片段。借助Stu I和Xho I的限制位点将该片段克隆到pQE-BoNT(A)-Lmod1中的环序列和His标签的序列之间(质粒pQE-BoNT(A)-Lmod1HN;序列#2,图3,No.2)。将大肠杆菌表达菌株M15[pREP4](Qiagen)用质粒pQE-BoNT(A)-Lmod1HN转化。修饰的LHN片段的表达通过用500μM终浓度的IPTG于25摄氏度过夜分步诱导进行。在具有300mM NaCl的50mM pH8.0磷酸缓冲液中通过溶菌酶处理和超声波处理将细胞裂解。将经过离心的裂解物在Ni-NTA琼脂糖柱上层析。在SDS聚丙烯酰胺凝胶上的分析显示，在还原条件下两条大约50kDA的带以及一条100kDA的带被考马斯染色，而在非还原条件下仅观察到所述100kDA的带(图7)。这样就清楚地证明，有多于75%的LHN片段是作为双链多肽从细菌中释放的，其中两条链通过二硫键彼此共价结合。后续的凝血酶处理一方面导致单链形式的切割，另一方面导致双链多肽中易位域的缩短(图7)。在纯化LHN片段之前将大肠杆菌裂解物温育两小时，导致双链多肽的完全切割。
相应被表达和纯化的具有天然环序列的LHN片段(图3，No.1)在SDS聚丙烯酰胺凝胶上于非还原以及还原条件下均呈现100kDa的带。仅在用胰蛋白酶切割时才能将该单链多肽转化成双链二硫桥连的LHN片段。
实施例2克隆和表达具有修饰的环的肉毒杆菌神经毒素A型LHNHCN片段和切割位点的鉴定
用引物#3和#5(图6)通过PCR扩增产生HNHCN片段(具有BoNT(A)受体结合域的N端一半的易位域)，并且借助Stu I和Xho I的限制性位点克隆到质粒pQE-BoNT(A)-Lmod1中(质粒pQE-BoNT(A)-Lmod1HNHCN；序列#3)。表达和纯化根据实施例1所述进行。在SDS聚丙烯酰胺凝胶上的分析显示，除了对应于单链多肽的弱带和其它未定义的带之外，有对应于轻链和HNHCN片段的50kDa的带以及一条75kDa的带。对HNHCN片段最先四个氨基酸残基的N末端测序提供了序列Ser-Leu-Val-Pro。在大肠杆菌裂解物中通过蛋白酶活性的切割由此发生在Lys440之后，从而在插入到环中的五肽Val-Pro-Arg-Gly-Ser的N端方向上。
实施例3克隆和表达具有修饰的环的肉毒杆菌神经毒素B型LHN片段
为了克隆轻链以及易位域的DNA序列，从肉毒梭菌B型(菌株Okra)的培养物中分离染色体DNA。用引物#6和#7(图6)通过PCR扩增产生了编码具有BoNT(A)修饰的环序列的BoNT(B)轻链的基因片段。用引物#8和#9(图6)了产生编码BoNT(B)的易位域的基因片段。克隆到表达质粒pQE-60中是这样实现的：首先借助Nco I和Stu I限制性位点，用BoNT(B)-Lmod1扩增产物替换pQE-BoNT(A)-Lmod1中的BoNT(A)-L基因片段。接下来，借助Stu I和XhoI限制性位点将BoNT(B)-HN扩增产物克隆在其后面，由此产生质粒pQE-BoNT(B)-Lmod1HN(序列#5)。以类似于实施例1的方式在宿主菌株M15[pREP4]中表达并纯化LHN片段。SDS聚丙烯酰胺凝胶上的分析显示在还原条件下有大约50kDa和55kDa的两条带被考马斯染色，而在非还原条件下观察到一条大约105kDa的带(图8)。这些清楚地说明LHN片段基本上作为双链多肽从细菌中释放，其中多于80%的两条链通过二硫键彼此共价连接。
实施例4克隆和表达具有修饰的环的肉毒杆菌神经毒素C1型LHN片段和切割位点的鉴定
为了克隆轻链以及易位域的DNA序列，从肉毒梭菌C1型(菌株C205)的培养物中制备染色体DNA。用引物#10和#11进行PCR扩增(图6)产生了编码具有BoNT(A)的修饰环序列的BoNT(C1)轻链的基因片段。用引物#12和#13(图6)，产生编码BoNT(C1)的易位域的基因片段。克隆到表达质粒pQE-60中是这样实现的：首先借助Nco I和Stu I的限制性位点用pQE-BoNT(C1)-Lmod1扩增产物替换pQE-BoNT(A)-Lmod1中的BoNT(A)-L基因片段。接下来，借助Stu I和Xho I限制性位点将BoNT(C1)-HN扩增产物克隆在其后面，由此产生质粒pQE-BoNT(C1)-Lmod1HN(序列#7)。以类似于实施例1的方式在宿主菌株M15[pREP4]中表达并纯化LHN片段。SDS聚丙烯酰胺凝胶上的分析显示在还原条件下有大约50kDa和55kDa的两条带被考马斯染色，而在非还原条件下观察到一条大约105kDa的带。这清楚地说明多于90%的LHN片段作为双链多肽从细菌中释放，在所述双链多肽中两条链通过二硫键彼此共价连接。对HN片段最先四个氨基酸残基的N末端测序结果为序列Ser-Leu-Val-Pro。大肠杆菌裂解物中蛋白酶活性所致的切割发生在Lys447之后，因而在插入BoNT(A)环中的五肽Val-Pro-Arg-Gly-Ser的N端方向上。通过直接诱变，将插入的五肽的精氨酸残基替换为组氨酸、酪氨酸和谷氨酰胺。温育大肠杆菌裂解物两小时之后，以相同方式表达的诱变的LHN片段中多于90%以双链二硫键化的形式存在，其中切割的效率稍低于含有用五肽Val-Pro-Arg-Gly-Ser修饰的BoNT(A)环的LHN片段。
实施例5克隆和表达带有修饰环的重组肉毒杆菌神经毒素C1型
使用肉毒梭菌C205菌株的染色体DNA，用引物#12和#14(图6)扩增编码重链的基因片段。借助Stu I和Xho I的限制性位点将其克隆到质粒BoNT(C1)-Lmod1HN中编码轻链的序列段和His标签的序列段之间(质粒pQE-BoNT(C1)-Lmod1HNHC；序列#6)。用相应的表达质粒转化大肠杆菌表达菌株M15[pREP4](Qiagen)。以类似于实施例1的方式在宿主菌株M15[pREP4]中表达并纯化。SDS聚丙烯酰胺凝胶上的分析显示在还原条件下有大约50kDa和105kDa的两条带被考马斯染色，而在非还原条件下观察到一条大约155kDa的带(图9)。这样清楚地证明，多于90%的重组神经毒素作为双链多肽从细菌中释放，在所述双链多肽中两条链通过二硫键彼此共价连接。偏侧膈鉴定(hemidiaphragm assay)中活性检测的结果是其毒性可以与分离自肉毒梭菌的天然神经毒素C1型的毒性相比较。因此轻链和易位域之间环区域的修饰对毒性不产生影响。
实施例6克隆和表达具有修饰的环的假单胞菌外毒素(Pe40)的重组片段
使用菌株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)103的染色体DNA，使用引物#17和#18(图6)通过PCR扩增了一个基因片段，其编码域II中位于半胱氨酸残基13和36之间的环的C端的区域以及域III。借助Nco I和Mlu I将扩增产物克隆到质粒pQE-BoNT(A)-Lmod1中，替换基因片段BoNT(A)-Lmod1(质粒pQE-PEII3III)。通过寡核苷酸#15和#16(图6)的杂交并借助Nco I和Kpn I限制性位点克隆，将环N端方向的域II区域的序列段插入质粒pQE-PEII3III中(质粒pQE-PEIImod III；序列#9)。用相应的表达质粒转化大肠杆菌表达菌株M15[pREP4](Qiagen)。以类似于实施例1的方式在宿主菌株M15[pREP4]中表达和纯化。SDS凝胶上还原条件下的分析产生一条较弱的40kDa的带和一条较强的37kDa的带。然而在非还原条件下，仅观察到一条40kDa的带。当亲和层析纯化之前室温温育细胞裂解物至少两小时时，在还原条件下不再能够检测到40kDa的带。用修饰的BoNT(A)环替换PE40片段的域II中半胱氨酸残基13和36之间的环区域，从而发生了多肽链的切割，其中前述半胱氨酸残基形成二硫键。在12%SDS凝胶中还原之后，不再能够检测到大约3kDa的N末端片段。
实施例7克隆和表达具有修饰的环的白喉毒素(Dt389)的重组片段
使用白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheria)NCTC13129菌株的染色体DNA，用引物#19和#20(图6)通过PCR扩增编码白喉毒素A链的基因片段。借助Nco I和Stu I的限制性位点将扩增产物克隆到质粒pQE-BoNT(A)-Lmod1中(参见实施例1)(质粒pQE-DT-Amod1)。以相同的方式，用引物#21和#22(图6)扩增编码B链N末端片段的基因片段，并且将该基因片段借助Stu I和Xho I的限制性位点克隆到pQE-DT-Amod1中(质粒pQE-DT389-mod1；序列#10)。用相应的表达质粒转化大肠杆菌表达菌株M15[pREP4](Qiagen)。以类似于实施例1的方式在宿主菌株M15[pREP4]中表达和纯化。SDS聚丙烯酰胺凝胶上的分析显示，在还原条件下两条大约22kDa的带被考马斯染色，而在非还原条件下观察到一条大约43kDa的带。这清楚地说明，多于90%的重组白喉毒素片段作为双链多肽从细菌中释放，在所述双链多肽中两条链通过二硫键彼此共价连接。
实施例8克隆和表达具有修饰的环的重组蓖麻毒蛋白
使用蓖麻的种子mRNA，用引物#23和#24(图6)通过RT-PCR扩增编码蓖麻毒蛋白A链的基因片段。借助Nco I和Xho I的限制性位点将其克隆到质粒pQE-BoNT(A)-Lmod1中(参见实施例1)(质粒pQE-Ricin-A)。以相同的方式，用引物#25和#26(图6)扩增编码B链的基因片段，并借助Kpn I和Xho I的限制性位点克隆到pQE-Ricin-A中(质粒pQE-Ricin-mod1；序列#11)。用相应的表达质粒转化大肠杆菌表达菌株M15[pREP4](Qiagen)。以类似于实施例1的方式在宿主菌株M15[pREP4]中表达并纯化所表达的蓖麻毒蛋白的可溶部分。SDS聚丙烯酰胺凝胶上的分析显示，在还原条件下有两条大约19kDa和42kDa的带被考马斯染色，而在非还原条件下观察到大约62kDa的带。这清楚的说明多于90%的重组蓖麻毒蛋白的可溶部分以双链多肽形式从细菌中释放，所述双链多肽中两条链通过二硫键彼此共价连接。
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Claims (52)

1.通过在大肠杆菌宿主细胞中重组表达产生双链形式的多肽或蛋白质的方法，所述两条链是二硫桥连的，其中
(i)所述多肽或蛋白质作为双链二硫键桥连的多肽或蛋白质发挥其生物活性；
(ii)第一链的C末端氨基酸残基是碱性氨基酸残基，
(iii)所述蛋白质/多肽的第二链在N末端按照从N到C的方向具有1-20个氨基酸残基和称为PRS的五肽序列VPXGS，其中X是任何天然存在的氨基酸，其中V是Val、Leu、Ile、Ala、Phe、Pro或Gly，其中P是Pro、Leu、Ile、Ala、Phe、Val或Gly，其中G是Gly、Leu、Ile、Ala、Pro、Phe或Val，并且其中S是Ser、Tyr、Trp或Thr；并且
(iv)所述方法包含以下步骤：
(a)在核酸水平修饰多肽或蛋白质，使得经修饰形式的该多肽或蛋白质在其环区域具有序列VPXGS，其中X、V、P、G和S如上所定义；
(b)将核酸水平被修饰的构建体导入到大肠杆菌细胞中；
(c)培养并随后裂解宿主细胞；和
(d)分离所述双链二硫桥连的肽或蛋白质。
2.根据权利要求1的方法，其中所述碱性氨基酸残基是Arg或Lys残基。
3.根据权利要求1的方法，其中所述方法不包括随后添加蛋白如内切蛋白酶的步骤，因为步骤(c)之后获得的多肽或蛋白是以其(生物学上)活性的双链结构存在的。
4.根据权利要求1的方法，其中所述多肽/蛋白质的第一链是该多肽/蛋白质的较轻的链，而第二链是该多肽/蛋白质的较重的链。
5.根据权利要求1-4之一的方法，其中所述多肽或蛋白质是肉毒杆菌神经毒素。
6.根据权利要求5的方法，其中所述多肽或蛋白质是血清型A的肉毒杆菌神经毒素(BoNT(A))或BoNT(A)的LHN片段。
7.根据权利要求6的方法，其中所述环区域定义为位于形成二硫桥连的Cys残基之间的氨基酸序列；且其中所述方法不包括随后添加蛋白如内切蛋白酶的步骤，因为步骤(c)之后获得的多肽或蛋白是以其(生物学上)活性的双链结构存在的。
8.根据权利要求6的方法，其中将PRS序列VPXGS插入到BoNT(A)的氨基酸Leu442和Lys448之间，该BoNT(A)缺失了氨基酸443-447。
9.根据权利要求8的方法，其中将PRS序列VPRGS、VPYGS、VPHGS或VPQGS插入。
10.根据权利要求1-5之一的方法，其中将PRS序列VPXGS插入缺失了至少一个氨基酸的下列序列中：BoNT(B)的八肽Lys438-Ile445、BoNT(C1)的15聚体His438-Asp452、或BoNT(E)的13聚体Lys413-Ile425。
11.根据权利要求10的方法，其中将PRS序列VPXGS以17聚体GIITSKTKSLVPRGSKA或18聚体RGIITSKTKSLVPRGSKA的形式插入。
12.根据权利要求1-6之一的方法，其中所述蛋白质是杂合蛋白。
13.根据权利要求12的方法，其中所述杂合蛋白具有以下成分A、B和C：
-效应物域，该域通过其酶促活性，能够抑制靶细胞中的分泌或杀死它们，或毒素域(成分A)；
-环序列，其包含序列VPXGS(成分B)；以及
-细胞结合域，其赋予所述融合蛋白或杂合蛋白以细胞特异性(成分C)。
14.根据权利要求13的方法，其中所述杂合蛋白还包含作为成分D的易位域。
15.根据权利要求13或14的方法，其中所述毒素域(A)是白喉毒素、假单胞菌外毒素或蓖麻毒蛋白的域。
16.根据权利要求15的方法，其中所述毒素域(A)是假单胞菌外毒素的片段PE40(域III、域II和域Ib)或片段PE38(域III和域II)或蓖麻毒蛋白A链。
17.根据权利要求13-16之一的方法，其中所述细胞结合域(C)是单克隆抗体、affilin、锚蛋白重复蛋白、anticalin、生长因子，或细胞因子。
18.根据权利要求17的方法，其中所述生长因子为TGF-alpha、FGF、VEGF或IGF-1。
19.根据权利要求17的方法，其中所述细胞因子为IL2、IL4或IL6。
20.根据权利要求12的方法，其中所述杂合蛋白具有以下成分A、B和C：
-蛋白质或寡肽，其赋予融合蛋白较好的可溶性，实现较高的表达率和/或使其能够被亲和纯化(成分A)；
-环序列，其包含序列VPXGS(成分B)，以及
-任何类型的多肽(成分C)。
21.根据权利要求20的方法，其中所述成分A是谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、His标签、Strep标签或FLAG标签。
22.根据权利要求1的方法，其中所述大肠杆菌细胞是大肠杆菌K12细胞。
23.根据权利要求22的方法，其中所述大肠杆菌细胞是菌株M15[pREP4]、XL1-BLUE或UT5600的大肠杆菌K12细胞。
24.多肽或蛋白质，其中该多肽/蛋白质作为双链二硫桥连的多肽/蛋白质存在，并且是生物活性的，其特征在于该多肽/蛋白质的第一链C末端是碱性氨基酸残基，而该多肽/蛋白质的第二链在N末端按照从N到C的方向包含1-20个氨基酸残基和称为PRS的五肽序列VPXGS，其中X是任何天然存在的氨基酸，其中V是Val、Leu、Ile、Ala、Phe、Pro或Gly，其中P是Pro、Leu、Ile、Ala、Phe、Val或Gly，其中G是Gly、Leu、Ile、Ala、Pro、Phe或Val，并且其中S是Ser、Tyr、Trp或Thr。
25.根据权利要求24的多肽或蛋白质，其中所述多肽/蛋白质的第一链是该多肽/蛋白质的较轻的链，而第二链是该多肽/蛋白质的较重的链。
26.根据权利要求24或25的多肽或蛋白质，其中所述第一链的C末端是Lys残基。
27.根据权利要求24-26之一的多肽或蛋白质，其中所述第二链在N末端具有五肽序列VPXGS、六肽序列XVPXGS或七肽序列XXVPXGS。
28.根据权利要求24或27的多肽或蛋白质，其中所述多肽/蛋白质包含肉毒杆菌神经毒素、肉毒杆菌神经毒素的衍生物或片段，或所述多肽/蛋白质具有肉毒杆菌神经毒素的生物活性。
29.根据权利要求28的多肽或蛋白质，其中所述多肽/蛋白质包含LHN片段。
30.根据权利要求24-29之一的多肽或蛋白质，其中所述多肽/蛋白质包含血清型A的肉毒杆菌神经毒素(BoNT(A))或具有BoNT(A)的生物活性。
31.根据权利要求24-27之一的多肽或蛋白质，其中所述多肽或蛋白质是BoNT(A)的LHN片段或具有BoNT(A)的生物活性。
32.根据权利要求24-31之一的多肽或蛋白质，其中所述第二链在N末端具有七肽序列SLVPXGS。
33.根据权利要求32的多肽或蛋白质，其中X是R、Y、H或Q。
34.根据权利要求24-27、32或33之一的多肽或蛋白质，其中所述蛋白质是杂合蛋白。
35.根据权利要求34的多肽或蛋白质，其中所述杂合蛋白具有以下成分A、B和C：
-效应物域，该域通过其酶促活性能够抑制靶细胞中的分泌或杀死它们，或毒素域(成分A)；
-环序列，其包含序列VPXGS(成分B)；以及
-细胞结合域，其赋予融合蛋白或杂合蛋白以细胞特异性(成分C)。
36.根据权利要求35的多肽或蛋白质，其中所述杂合蛋白还具有易位域作为成分D。
37.根据权利要求35或36的多肽或蛋白质，其中所述毒素域(A)是白喉毒素、假单胞菌外毒素或蓖麻毒蛋白的域。
38.根据权利要求37的多肽或蛋白质，其中所述毒素域(A)是假单胞菌外毒素的片段PE40(域III、域II和域Ib)或片段PE38(域III和域II)或蓖麻毒蛋白A链。
39.根据权利要求35-38之一的多肽或蛋白质，其中所述细胞结合域(C)是单克隆抗体、affilin、锚蛋白重复蛋白、anticalin、生长因子，或细胞因子。
40.根据权利要求39的多肽或蛋白质，其中所述生长因子为TGF-alpha、FGF、VEGF或IGF-1。
41.根据权利要求39的多肽或蛋白质，其中所述细胞因子为IL2、IL4或IL6。
42.根据权利要求34的多肽或蛋白质，其中所述杂合蛋白具有以下成分A、B和C：
-蛋白质或寡肽，其赋予融合蛋白较好的可溶性，实现较高的表达率和/或使其能够被亲和纯化(成分A)；
-环序列，其包含序列VPXGS(成分B)，以及
-任何类型的多肽(成分C)。
43.根据权利要求42的多肽或蛋白质，其中所述成分A是谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、His标签、Strep标签或FLAG标签。
44.核酸，其编码根据权利要求24-43之一的多肽或蛋白质。
45.根据权利要求44的核酸，其是DNA。
46.载体，其包含根据权利要求44或45的核酸。
47.宿主细胞，其包含根据权利要求46的载体。
48.根据权利要求47的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核的。
49.根据权利要求48的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌细胞。
50.根据权利要求48的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌K12细胞。
51.根据权利要求47或48的宿主细胞，其中所述宿主细胞是M15[pREP4]并且其中所述载体是pQE系列的质粒。
52.药物制剂，其包含根据权利要求24-43之一的多肽或蛋白质。
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