JP2011103791A - 融合タンパク質およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 ＦｃレセプターＦｃγＲＩを宿主で大量に発現させるためのポリヌクレオチド、およびそれを用いたＦｃγＲＩの製造方法を提供すること。
【解決手段】 ＦｃγＲＩ細胞外領域をコードするポリヌクレオチドの５’末端側に中性プロテアーゼの部分領域をコードするポリヌクレオチドを付加したポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現プラスミド、および前記プラスミドで宿主を形質転換して得られる形質転換体を用いることで、抗体結合活性を有したＦｃγＲＩを簡便に製造することができた。
【選択図】 図４

Description

本発明は医薬品、臨床検査薬、バイオセンサー、アフィニティーリガンド（分離剤）などの用途に使用可能な、ＩｇＧのＦｃ領域に特異的に結合するＦｃγレセプターを遺伝子工学的手法により製造する方法に関する。

Ｆｃレセプターは、免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する一群の分子である。Ｆｃレセプターはその結合する免疫グロブリンの種類によって分類されており、ＩｇＧのＦｃ領域に結合するＦｃγレセプター、ＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεレセプター、ＩｇＡのＦｃ領域に結合するＦｃαレセプター等がある（非特許文献１）。また、各レセプターは、その構造の違いによりさらに細かく分類され、Ｆｃγレセプターの場合、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩの存在が報告されている（非特許文献１）。

Ｆｃγレセプターの一つであるＦｃγＲＩは単球とマクロファージ中で発現しており、好中球ではγインターフェロンにより誘導的に発現される（非特許文献１）。また、ＦｃγＲＩはＩｇＧに対する結合親和性が高く、その平衡解離定数（Ｋｄ）は１０^−８Ｍ以下である（非特許文献２）。ＦｃγＲＩは、細胞外領域、細胞膜貫通領域、細胞質内領域に区分され、ＩｇＧとの結合は、ＩｇＧのＦｃ領域とＦｃγＲＩの細胞外領域で起こり、その後細胞質へとシグナルが伝達される。ＦｃγＲＩはＩｇＧとの結合に直接関わる分子量約４２０００のα鎖と、γ鎖の２種類のサブユニットによって構成されており、γ鎖は細胞膜と細胞外領域との境界で共有結合することでホモダイマーを形成している（非特許文献３）。

ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩのアミノ酸配列、および遺伝子配列（配列番号１）はＥｘＰＡＳｙ（Ｐｒｉｍａｒｙ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ１２３１４）などの公的データベースに公表されている。また、ＦｃγＲＩの構造上の機能ドメイン、細胞膜を貫通するためのシグナルペプチド配列、細胞膜貫通領域の位置についても同様に公表されている。図１にヒト型ＦｃγＲＩの構造略図を示す。なお、図中のアミノ酸番号は配列番号１に記載のアミノ酸番号に対応する。すなわち、配列番号１のアミノ酸番号１のメチオニン（Ｍｅｔ）から２８９のバリン（Ｖａｌ）までが細胞外領域、配列番号１のアミノ酸番号２９０のロイシン（Ｌｅｕ）から３７４のスレオニン（Ｔｈｒ）までが細胞膜貫通領域および細胞内領域とされている。

近年になり、Ｆｃレセプターの予想外の免疫抑制的な生物学的特性は、特に自己免疫疾患または自己免疫症候群、移植物の拒絶および悪性リンパ増殖の領域において医薬として注目を浴びつつある（非特許文献２）。また、ＦｃγＲＩの機能である抗体の吸着能は各種抗体精製用クロマトグラフィーゲルの捕捉機能を担うタンパク質としても利用することができる。

ＦｃγＲＩα鎖のアミノ酸配列および遺伝子配列（非特許文献４）はＪａｎｅｔ等により明らかにされ、その後、遺伝子組換え技術により、大腸菌（特許文献１）あるいは動物細胞を利用した発現が報告されている。しかしながら、大腸菌を利用した発現系においてはＦｃγＲＩの細胞外領域タンパク質の発現量は極めて低く、また、発現されたタンパク質は菌体内発現のため、多くの場合発現したタンパク質は不溶性の封入体となる。封入体タンパク質は可溶化等の操作をすることにより、活性型タンパク質として調製することは可能であるが、煩雑な操作を必要とする。また、動物細胞を用いた系では、大腸菌以上の発現量が報告（非特許文献３）されているが培養に多大な時間を要し、かつ、生産性も高くない。一方、バチルス属細菌をＦｃγＲＩ遺伝子を導入したプラスミドベクターで形質転換し、ＦｃγＲＩを発現させている例も知られている（特許文献２）。しかしながら、バチルス属の細菌はプロテアーゼ活性が高く、生産されたＦｃγＲＩが分解されてしまうという問題点があった。本発明者は以前、バチルス属細菌の一種であるＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ野生株（ＮＢＲＣ１５７１６）を変異原物質で処理することで得られる、プロテアーゼ活性が低下したＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ変異株を、ヒト型ＦｃγＲＩ生産における宿主として用いることで、ヒト型ＦｃγＲＩ生産量が向上することを見出している（特願２００９−００８６８０号）。しかしながら、工業的にヒト型ＦｃγＲＩを生産するにはさらなる生産性の改善が求められる。

遺伝子工学的手法により宿主から異種タンパク質を生産する際、目的タンパク質が十分に得られない場合は、多くの場合、宿主において高発現することが知られているタンパク質の部分構造を目的とするタンパク質のＮ末端側に付加することで生産性が改善されることが知られている。例えば、大腸菌を宿主として異種タンパク質を発現させる際、前述したように単独で発現すると封入体となってしまうことがある。その場合、前記異種タンパク質のＮ末端側にチオレドキシンやグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを付加することにより異種タンパク質を可溶性かつ活性を有する形態として効率よく得られることが知られている。また、タンパク質の分泌発現能が高いことで知られるバチルス属細菌の一種であるＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓを宿主とした場合、糸状菌由来のプロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）をＮ末端側に付加する（融合させる）ことにより、ＩｇＧのＬ鎖や超好熱菌由来のゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素の生産性が改善した例が知られている（非特許文献５）。しかしながら、非特許文献５の方法において、Ｎ末端側に付加するＰＤＩは約６万の分子量を有するホモダイマータンパクであるため、融合タンパク質としてそのまま使用するには分子量が大きいという問題があった。すなわち、融合タンパク質として発現させた目的タンパク質を実際に使用する場合は、多くの場合、融合したＰＤＩ部分を切断除去する必要があるため、結果として不用なＰＤＩ部分を生産するための余分な原料を必要とする。また、ＰＤＩは大きな分子量を有し、かつ二量体（ダイマー）を形成するため、立体障害の影響が大きく、ＰＤＩ部分の良好な切断ができない場合がある。

以上のような背景から、宿主、特にバチルス属細菌でヒト型ＦｃγＲＩを発現させるための、ヒト型ＦｃγＲＩのＮ末端側に付加するタンパク質として、より分子量が小さく、かつ単量体からなるタンパク質が求められていた。

特表２００４−５３０４１９号公報 特開２００９−２０１４０３号公報 特開平５−１８４３６３号公報

Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ等，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９，４５７，１９９１ Ｔｏｓｈｉｙｕｋｉ Ｔａｋａｉ，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８，３１８，２００５ Ａ．Ｐａｅｔｚ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３８，１８１１，２００５ Ｊ．Ｍ．Ａｌｌｅｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３，３７８，１９８９ Ｔ．Ｋａｊｉｎｏ等，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６６，６３８，２０００ Ｗ．Ｓｃｈｕｍａｎｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６２，１３７，２００７ Ｈａｎａｈａｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１６，５５７、１９８３ Ｄｅｂｎａｕ ａｎｄ Ａｖｉｄｏｆｆ−Ａｂｅｌｓｏｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、５６，２０９，１９７１

本発明は、医薬品、臨床検査薬、バイオセンサー、アフィニティーリガンド（分離剤）などの用途に使用可能なＦｃγＲＩを、宿主で大量に発現させるためのポリヌクレオチド、およびそれを用いたＦｃγＲＩの製造方法を提供することにある。

上記課題を鑑みてなされた本発明は、以下の発明を包含する。

（１）ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドの５’末端側に中性プロテアーゼの部分領域をコードするポリヌクレオチドを付加した、ポリヌクレオチド。

（２）中性プロテアーゼの部分領域がサーモライシンのプロ領域である、（１）に記載のポリヌクレオチド。

（３）（１）または（２）に記載のポリヌクレオチドを含む、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを発現させるためのプラスミド。

（４）（３）に記載のプラスミドで宿主を形質転換して得られる、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを発現可能な形質転換体。

（５）（４）に記載の形質転換体を用いた、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの製造方法。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明においてヒト型ＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドは、必ずしもヒト型ＦｃγＲＩの全領域のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドでなくてもよく、ヒト型ＦｃγＲＩのアミノ酸のうち、少なくとも抗体（ＩｇＧ）のＦｃ領域に結合する本来の機能を発現し得る領域のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを含んでいればよい。ヒト型ＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドの具体的態様として、配列番号１に示すヒト型ＦｃγＲＩのアミノ酸配列のうち、細胞外領域（１番目から２８９番目のアミノ酸）の全アミノ酸をコードするポリヌクレオチドや、前記細胞外領域のアミノ酸のうちＮ末端側１５から２５残基を削除したアミノ酸（１６番目から２８９番目のアミノ酸のうち、少なくとも２６番目から２８９番目のアミノ酸を含むアミノ酸）をコードするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがあげられる。

本発明のポリヌクレオチドは、前述したヒト型ＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドの５’末端側に中性プロテアーゼの部分領域をコードするポリヌクレオチドを付加していることを特徴としている。本発明における中性プロテアーゼの部分領域とは、Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ由来のプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来のプロテアーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来のプロテアーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（枯草菌）由来のプロテアーゼ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ由来のプロテアーゼ、パパイン、トリプシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のプロテアーゼ（サーモライシン）といった中性プロテアーゼの部分領域を含むポリペプチドのことをいう。ヒト型ＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドの５’末端側に付加する中性プロテアーゼの部分領域をコードするポリヌクレオチドは、前述した中性プロテアーゼの部分領域からヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを発現させる宿主に応じて適宜選択し、選択した部分領域（アミノ酸配列）をヌクレオチド配列に変換することで得られる。なお、宿主がバチルス属細菌の場合は、サーモライシンのプロ領域を中性プロテアーゼの部分領域として用いると好ましい。サーモライシンのプロ領域の具体的態様として、配列番号２に示すサーモライシンのアミノ酸配列のうち、１番目から２５０番目のアミノ酸からなるポリペプチドや、３１番目から２３６番目のアミノ酸を含むポリペプチドをあげることができる。特に宿主がバチルス属細菌の場合、配列番号２の３１番目から２３６番目のアミノ酸を含むポリペプチドを、本発明の中性プロテアーゼの部分領域として用いると好ましい。

なお、本発明においてヒト型ＦｃγＲＩおよび中性プロテアーゼの部分領域のポリペプチドは、正常な立体構造を形成し、かつ本来の機能（ヒト型ＦｃγＲＩの場合は、抗体（ＩｇＧ）のＦｃ領域に結合する機能）を発現し得る範囲で構成するアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入があってもよい。

バチルス属細菌をヒト型ＦｃγＲＩ生産の宿主とする場合における、本発明のポリヌクレオチドのより好ましい態様は、サーモライシンのプロ領域をコードするポリヌクレオチドの５’末端側に、バチルス属で機能することが知られている任意のシグナル配列をコードするポリヌクレオチドをさらに付加したポリヌクレオチドである。前記シグナル配列の一例として、配列番号２の１番目から３０番目までのアミノ酸（サーモライシンのプレ領域）からなるポリペプチドがあげられる。前記シグナル配列の別の例としては、アミラーゼのシグナル配列や、細胞壁タンパク質のシグナル配列などがあげられる。なお、ここで付加したシグナル配列は、ヒト型ＦｃγＲＩとサーモライシンのプロ領域との融合タンパク質が細胞膜を通過して分泌発現される際に、細胞膜に存在するシグナルペプチダーゼにより切除されることが知られている。

ヒト型ＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドの５’末端側に中性プロテアーゼの部分領域をコードするポリヌクレオチドを付加する際、直接付加してもよいが、任意のオリゴペプチドをコードするポリヌクレオチドを介して付加してもよい。前記任意のオリゴペプチドの一例として、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙといった、グリシンとセリンが任意に数個ずつ連結したオリゴペプチドがあげられる。また、前記任意のオリゴペプチドの別の例として、発現したヒト型ＦｃγＲＩと中性プロテアーゼの部分領域との融合タンパク質のうち中性プロテアーゼ部分とＦｃγＲＩ部分を切り離すために用いる特異的プロテアーゼを認識するオリゴペプチドがあげられ、具体的にはエンテロキナーゼで認識されるＡｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓからなるオリゴペプチドなどがある。前記任意のオリゴペプチドのさらに別の例として、分析や精製を容易にするための、６残基程度のＨｉｓよりなるＨｉｓタグペプチドやｃ−ｍｙｃ抗原ペプチドといったタグペプチドがあげられる。なお、前記タグペプチドはヒト型ＦｃγＲＩと中性プロテアーゼの部分領域との間に挿入してもよいし、ヒト型ＦｃγＲＩのＣ末端側に付加してもよい。

本発明において、ヒト型ＦｃγＲＩおよび中性プロテアーゼの部分領域のアミノ酸配列をヌクレオチド配列に変換する際、アミノ酸が変化しない範囲で置換すればよいが、好ましくは、ヒト型ＦｃγＲＩと中性プロテアーゼの部分領域との融合タンパク質を発現させる宿主におけるコドンの使用頻度を考慮の上変換するのが好ましい。コドンの使用頻度は公的データベース（ＵＲＬ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ）を用いることで解析することができる。一例として、バチルス属細菌を宿主として用いた場合、ヒト型ＦｃγＲＩ遺伝子のコドンをバチルス属細菌型のコドンに置き換えた配列番号３に示すポリヌクレオチドを、本発明におけるヒト型ＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドとして用いることができる。

本発明の形質転換体は、本発明のポリヌクレオチドを対象宿主に適切なプラスミドへ挿入することで本発明のプラスミドを調製後、本発明のプラスミドで宿主を形質転換することで得られる。バチルス属細菌を宿主として用いた場合、ｐＵＢ１１０（非特許文献６）やｐＵＢＴＺ２（バチルス・ステアロサーモフィルス由来の中性プロテアーゼ遺伝子をクローニングした大腸菌および枯草菌間のシャトルベクター、特許文献４）といったバチルス属細菌内に保持されるプラスミドの任意の位置に本発明のポリヌクレオチドを挿入することで本発明のプラスミドを調製後、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤＢ１１７株といった適切なバチルス属細菌を前記本発明のプラスミドで形質転換することで本発明の形質転換体が得られる。また、バチルス属細菌のゲノム上の任意のオリゴヌクレオチド配列（例えばアミラーゼ遺伝子の部分配列）の間に本発明のオリゴヌクレオチドを挿入し直鎖状のＤＮＡとしてバチルス属細菌を形質転換しても本発明の形質転換体を得ることができる。

前述の方法で得られた本発明の形質転換体の保存方法については特に限定はなく、任意の培地に継代培養することで菌の活性を維持した状態で保存してもよいし、凍結法や凍結乾燥法により保存してもよい。なお、継代培養により保存する場合は菌が活発に増殖している状態で新たな培地に継代するのが好ましい。凍結法により保存する場合は本発明の形質転換体の培養液に凍結補助剤を添加して凍結すればよい。凍結補助剤としては、グリセロール、マンニトール、ジメチルスルフォキシドといった通常の微生物の保存に用いられるものの中から適宜選択さればよい。また、凍結補助剤の添加量は本発明の形質転換体の生存に影響のない範囲で用いればよく、例えばグリセロールの場合は培養液容量の１０分の１から３分の１容量添加すればよい。凍結温度は特に限定はないものの、可能な限り低温であることが好ましく、具体的には−２０℃以下、特に−８０℃以下が好ましい。凍結乾燥法により保存する場合は、任意の凍結補助剤を添加し、可能な限り低温（−２０℃以下が好ましく、特に好ましくは−８０℃以下）で凍結後、減圧乾燥すればよい。凍結乾燥の場合の凍結補助剤としては前述したもののほかにスキムミルクなどがあげられる。凍結乾燥後の形質転換体は室温以下の温度で、好ましくは４℃以下で、さらに好ましくは−２０℃以下で保存すればよい。

本発明の形質転換体を培養する方法については特に限定はなく、通常の液体培地やそれを寒天で固めた固体培地を用いればよい。固体培地の形状にも限定はなく、斜面培地であってもよいし平板培地であってもよい。培地の組成としては、本発明の形質転換体が増殖し、かつヒト型ＦｃγＲＩを発現し得るものであればよい。炭素源としては、糖蜜、グルコース、フルクトース、マルトース、ショ糖、デンプン、乳糖、グリセロール、酢酸などが用いられる。窒素源としては、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、ペプトン、コーンスティープリカー、酵母エキスなどが用いられる。無機塩としては、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウムなどのリン酸塩、塩化ナトリウムなどが用いられる。金属イオンとしては、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄（ＩＩ）、硫酸鉄（ＩＩＩ）、塩化鉄（ＩＩ）、塩化鉄（ＩＩＩ）、クエン酸鉄、硫酸アンモニウム鉄、塩化カルシウム・二水和物、硫酸カルシウム、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸銅、塩化銅、硫酸マンガン、塩化マンガンなどが用いられる。ビタミン類としては、酵母エキス、ビオチン、ニコチン酸、チアミン、リボフラビン、イノシトール、ピリドキシンなどが用いられる。なお、固体培地を用いる場合には上記の組成の培地に寒天やジェランガムといった固形化剤を加熱溶解させた後に、培養に用いる試験管やシャーレに分注し、さらに目的の温度まで冷却して固形化することで得られる。培養温度は１５℃から４０℃が好ましく、ｐＨは６から８が好ましい。また、培養時間は任意に設定できるが、ヒト型ＦｃγＲＩが十分に生産される時間であることが好ましく、通常は数時間から２００時間の間に設定すればよい。

本発明の製造方法で得られたヒト型ＦｃγＲＩの分析方法は、培養液から安定的にかつ効率的に定量できる方法であれば特に限定はなく、ＥＬＩＳＡ法（酵素結合免疫吸着法）やウェスタンブロット法があげられる。

本発明の製造方法で得られたヒト型ＦｃγＲＩは培養液の状態のまま使用することも可能であり、高度に精製したものを使用することも可能であり、またその中間の純度の様々な精製度合いで使用することも可能である。ヒト型ＦｃγＲＩの精製は、遠心分離、限外ろ過、硫酸アンモニウム沈殿分画、カラムクロマトグラフィーなど様々な方法を組合わせて、目的の純度に達するまで行なえばよい。なお、本発明のポリヌクレオチドにＨｉｓタグペプチドやｃ−ｍｙｃ抗原ペプチドといったタグペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれている場合、本発明の形質転換体によって発現したヒト型ＦｃγＲＩにはそのＮ末端側またはＣ末端側に前記タグペプチドが付加されているため、前記タグペプチドを特異的に認識するアフィニティークロマトグラフィーを用いて簡便に精製することができる。

本発明の製造方法で得られたヒト型ＦｃγＲＩは、医薬品、臨床検査薬、バイオセンサー、またはアフィニティーリガンド（分離剤）といった様々な用途に用いることができる。

本発明のポリヌクレオチドは、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドの５’末端側に中性プロテアーゼの部分領域をコードするポリヌクレオチドを付加していることを特徴としている。また、本発明のポリヌクレオチドを対象宿主に適切なプラスミドに挿入することで本発明のプラスミドを調製後、前記本発明のプラスミドで宿主を形質転換して得られる本発明の形質転換体を培養することで、ヒト型ＦｃγＲＩを抗体結合活性を有した状態で発現させることができる。

特に宿主がバチルス属細菌の場合、中性プロテアーゼの部分領域としてサーモライシンのプロ領域（分子量約２万）を用いることで、バチルス属細菌でヒト型ＦｃγＲＩとサーモライシンのプロ領域とが融合したタンパク質（分子量約５万）を発現することができ、前記タンパク質は従来技術であるＰＤＩとヒト型ＦｃγＲＩとの融合タンパク質（分子量約９万）と比較し、分子量にして約４万の低分子化が可能である。また、サーモライシンのプロ領域はＰＤＩ（二量体）と異なり単量体であるため、ヒト型ＦｃγＲＩをバチルス属細菌で発現させる際に、生産性が高くかつ効率的に発現させることができる。

本発明の方法で得られたヒト型ＦｃγＲＩは、その特徴である抗体（ＩｇＧ）のＦｃ領域への特異的結合活性を保持しているため、医薬品、臨床検査薬、バイオセンサー、またはアフィニティーリガンド（分離剤）といった様々な用途に用いることができる。

ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの構造を示す図である。 プラスミドｐＵＢＣＴＰＰＦｃＲ１作成の工程図である。図中のＴＬＮ−Ｐｒｏ領域はサーモライシンのプロ領域の遺伝子断片を、Ｐｒｏはサーモライシンのプロモーターを、ＳＤはサーモライシンのＳＤ配列を、Ｓｉｇｎａｌはサーモライシンのシグナルペプチド領域を、ｃ−ｍｙｃはｃ−ｍｙｃタグの遺伝子を、ｓｔｏｐはストップコドンを、Ｋｍ^rはカナマイシン耐性遺伝子領域を、Ａｍｐ^ｒはアンピシリン耐性遺伝子領域をそれぞれ表す。また、ＳｎａＢＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩ、ＫａｓＩは対応する制限酵素の切断サイトを示す。 プラスミドｐＵＢＣＴＰＰＦｃＲ２作成の工程図である。図中のＬｉｎｋはリンカー配列を示し、他の略号は図２と同じである。 枯草菌に発現させたタンパク質をウェスタンブロット法により分析した結果を示す。レーン１は枯草菌形質転換体培養上清を、レーン２はヒト型ＦｃγＲＩを、レーン３は分子量マーカーをそれぞれ示す。

以下に実施例をあげて本発明を説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではなく、発明の要旨を逸脱しない範囲で、任意に変更が可能であることはいうまでもない。

実施例１ 融合タンパク質発現プラスミドの調製（その１）
以下に示す方法で、サーモライシンのプレ−プロ領域およびヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを含む、発現プラスミドを調製した。

（１）サーモライシンのプレ−プロ領域をコードするポリヌクレオチドの調製
鋳型として特許文献３に開示されたプラスミドｐＵＢＴＺ２を、プライマーとして配列番号４および５に示すオリゴヌクレオチドを使用し、タカラバイオ社製ＤＮＡポリメラーゼ（商品名：ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用いてＰＣＲを行ないＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ反応は９８℃で５分加熱後、９８℃での加熱（１０秒）−５５℃でのアニーリング（５秒）−７２℃での伸長反応（２分）のサイクルを２５回繰返した後、７２℃で７分加温することによって行なった。ＰＣＲ反応後の反応液よりキアゲン社製ＰＣＲ精製キットを用いて、配列番号６に示すポリヌクレオチドを含んだ溶液５０μＬを得た。

（２）ヒト型ＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドの調製
鋳型としてＤＮＡアセンブリー法によりＢａｃｉｌｌｕｓ属型のコドンに改変したＦｃγＲＩ遺伝子断片（配列番号３）が挿入されたプラスミドを、プライマーとして配列番号７および８に示すオリゴヌクレオチドを使用した他は、（１）と同様の方法で行ない、配列番号９に示すポリヌクレオチドを含んだ溶液５０μＬを得た。

（３）発現プラスミドの調製
（３−１）特許文献３に開示されたプラスミドｐＵＢＴＺ２を制限酵素ＳｎａＢＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。その後、アルカリフォスファターゼによる脱リン酸処理を行ない、１％アガロースゲル電気泳動からの切り出し精製により、約５ｋｂｐのＤＮＡ断片を調製した。前記断片に予めＴ４ＤＮＡキナーゼ処理によりリン酸化した２つのオリゴヌクレオチド（配列番号１０および１１）をＴ４リガーゼにより連結させることで、プラスミドｐＵＢＣ１を合成した。
（３−２）（１）で得られたサーモライシンのプレ−プロ領域の遺伝子断片（配列番号６）を制限酵素ＳａｌＩおよびＫａｓＩにより消化し、（２）で調製したＦｃγＲＩ遺伝子断片（配列番号９）を制限酵素ＫａｓＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより消化した。また、（３−１）で調製したプラスミドｐＵＢＣ１を制限酵素ＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、アルカリフォスファターゼによる脱リン酸化後、１％アガロースゲル電気泳動からの切り出し精製により、約５ｋｂｐのＤＮＡ断片を調製した。前記３つのポリヌクレオチド断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合させることで融合タンパク質遺伝子（配列番号１２）が挿入された発現プラスミドｐＵＢＣＴＰＰＦｃＲ１を調製した（図２）。

実施例２ 融合タンパク質発現プラスミドの調製（その２）
以下に示す方法で、サーモライシンのプレ−プロ領域、リンカー配列およびヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを含む、発現プラスミドを調製した。

（１）サーモライシンのプレ−プロ領域をコードするポリヌクレオチドの調製
プライマーとして配列番号４および１３に示すオリゴヌクレオチドを使用した他は、実施例１の（１）と同様な方法で行ない、Ｃ末端側にＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号１８）のリンカー配列を付加したサーモライシンのプレ−プロ領域のポリヌクレオチド（配列番号１４）の溶液５０μＬを得た。

（２）ヒト型ＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドの調製
プライマーとして配列番号１５および８に示すオリゴヌクレオチドを使用した他は、実施例１の（２）と同様の方法で行ない、Ｎ末端側にＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号１８）のリンカー配列を付加したＦｃγＲＩのポリヌクレオチド（配列番号１６）の溶液５０μＬを得た。

（３）リンカー配列を含む融合タンパク質遺伝子の合成
鋳型およびプライマーとして（１）および（２）で合成した二つのポリヌクレオチド、ＰＣＲのサイクル数を５回とした他は、実施例１の（１）と同様の方法でＰＣＲ反応を行なった。その後、配列番号４および８に示すオリゴヌクレオチドを終濃度５μＭになるように添加して、さらにＰＣＲ反応（反応サイクル数が３０回とした他は１回目のＰＣＲと同じ条件）を行なった。２回目のＰＣＲ反応後の反応液より１％アガロースゲル電気泳動からの切り出し精製により、約２ｋｂｐのＤＮＡ断片を調製した。

（４）発現プラスミドの調製
（３）で合成したＤＮＡを制限酵素ＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、実施例１と同様にベクターｐＵＢＣ１のＳａｌＩサイトおよびＨｉｎｄＩＩＩサイト間に挿入し、配列番号１７に示す融合タンパク質遺伝子が挿入された発現プラスミドｐＵＢＣＴＰＰＦｃＲ２を調製した（図３）。

実施例３ 枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）への形質転換
以下に示す方法により、実施例１および２で調製した発現プラスミドで枯草菌を形質転換した。
（１）大腸菌ＪＭ１０３株のコンピテントセルをＨａｎａｈａｎの方法（非特許文献７）に従って作成し、発現ベクターｐＵＢＣＴＰＰＦｃＲ１（図２）またはｐＵＢＣＴＰＰＦｃＲ２（図３）で形質転換した。
（２）（１）で得られた形質転換大腸菌を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、培養液よりキアゲン社プラスミド抽出キットを用いて各プラスミドを調製した。
（３）枯草菌ＤＢ１１７株のコンピテントセルを公知の方法（非特許文献８）に従って調製した。
（４）（３）で調製した枯草菌ＤＢ１１７株の懸濁液１００μＬに（１）で調製した各プラスミドの水溶液５μＬを加えて、３７℃で1時間穏やかに振とうした後、ＬＢ培地９００μＬを加えて１．５時間激しく振とうして培養した。
（５）（４）の培養液より遠心分離機で菌体を回収し、１００μＬの生理食塩水に再懸濁後、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ平板培地に１０μＬまたは９０μＬを塗布して３７℃で一晩静置培養した。
（６）生育したカナマイシン耐性のコロニーより目的のプラスミドを持つものを選別し、目的の枯草菌形質転換体である、ＤＢ１１７／ｐＵＢＣＴＰＰＦｃＲ１およびＤＢ１１７／ｐＵＢＣＴＰＰＦｃＲ２を調製した。

実施例４ 融合タンパク質の発現（その１）
以下に示す方法により、実施例３で調製したＤＢ１１７／ｐＵＢＣＴＰＰＦｃＲ２を用いて、サーモライシンのプレ−プロ領域とヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩとの融合タンパク質を発現させた。
（１）実施例３で調製した形質転換体枯草菌ＤＢ１１７／ｐＵＢＣＴＰＰＦｃＲ２を２Ｌ培地（ポリペプトン ２０ｇ／Ｌ、バクト酵母エキス １０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ）０．７５ｍＬを入れた９６穴深穴プレート（ＢＭ６０３０Ｓ深穴プレート角型Ｖ底、ビーエム機器製）に植菌し、温度３０℃でバイオシェーカーＭＢＲ−０２２ＵＰ（商品名）（タイテック社製）を用いて１２００ｒｐｍの振とう速度で２４時間培養した。
（２）（１）の培養液を遠心分離により菌体を除去後、上清中に分泌された融合タンパク質を下記に示すウェスタンブロット法により検出した。
（２−１）培養上清の一部に１／２量の６％ ＳＤＳ、２４％ グリセロール、１２％ ２−メルカプトエタノール、および０．１５％ ブロモフェノールブルーを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）を加えて２分間煮沸したのち、１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なった。
（２−２）泳動後のゲルよりインビトロジェン社製ｉＢｌｏｔキットを用いてＰＶＤＦ膜上に電気泳動で展開されたタンパク質を転写した。
（２−３）転写したＰＶＤＦ膜にＳＮＡＰｉｄキット（ミリポア社製）を用いてペルオキシダーゼ標識された抗ヒトＣＤ６４抗体または抗ｃ−ｍｙｃ−タグ抗体を反応後、ＧＥヘルスケア社製発光基質キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬ Ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｉｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、商品名）を用いて感光フィルム上に抗体と反応したタンパク質を検出した。

その結果を図４に示す。分子量５万の位置にヒト型ＦｃγＲＩ融合タンパク質の生成を確認した。

実施例５ 融合タンパク質の発現（その２）
実施例４と同様に枯草菌ＤＢ１１７／ｐＵＢＣＴＰＰＦｃＲ１を培養後、上清中に分泌された融合タンパク質をウェスタンブロット法により検出した。その結果、実施例４と同様、分子量５万の位置に融合タンパク質の生成が確認された。

Claims (5)

1. ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドの５’末端側に中性プロテアーゼの部分領域をコードするポリヌクレオチドを付加した、ポリヌクレオチド。
2. 中性プロテアーゼの部分領域がサーモライシンのプロ領域である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
3. 請求項１または２に記載のポリヌクレオチドを含む、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを発現させるためのプラスミド。
4. 請求項３に記載のプラスミドで宿主を形質転換して得られる、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを発現可能な形質転換体。
5. 請求項４に記載の形質転換体を用いた、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの製造方法。

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