JP4377242B2 - ビオチン化ドメインを含むタンパク質タグ、及び溶解性を増大させる方法、及び折り畳み状態を決定する方法 - Google Patents
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Description
組み換えタンパク質の溶解性を決定する因子は不明なところが多く、そのため、組み換えタンパク質の溶解性及び発現増大の合理的なデザインは限られた範囲でのみ可能である。しかしながら、良く発現される可溶タンパク質をタンパク質のN末端に融合することによって、ORFのみで発現したものと比べて両性質を大幅に向上することができる。例として、MBP、GST及びチオレドキシン(thioredoxin,Trx,109aa;Novagen)が挙げられる。考えられる作用機構は、未完成のポリペプチドにシャペロンが補充されることであると考えられ、シャペロンを共に過剰発現することによって、可溶タンパク質の収量を増加させることができる。次に、いくつかの融合タンパク質を、その融合タンパク質ドメイン(例えば、MBPの場合はアミロース樹脂、GSTの場合はグルタチオン樹脂)によって精製することができる。Trxタグは、タンパク質精製に用いられていないが、多くの標的タンパク質の溶解性を向上することができ、E. coli trx B変異体の細胞質においてジスルフィド結合の形成を触媒するように思われる。
レポータータンパク質(検定可能な活性を持つ)をパートナータンパク質のC末端上に融合すると、該パートナーの折り畳みを観測することが可能となることが既に示されている。本技術分野で既知であるレポーターシステムの有名な例では、緑色蛍光タンパク質(green fluorescent protein,GFP)、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ(chloramphenicol acetyl transferase,CAT),β−ガラクトシダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼのα相補性が利用されている。
BCCPドメイン:
核酸
gcagcagcggaaatcagtggtcacatcgtacgttccccgatggttggtactttcta ccgcaccccaagcccggacgcaaaagcgttcatcgaagtgggtcagaaagtcaacg tgggcgataccctgtgcatcgttgaagccatgaaaatgatgaaccagatcgaagcg gacaaatccggtaccgtgaaagcaattctggtcgaaagtggacaaccggtagaatt tgacgagccgctggtcgtcatcgagtaa
アミノ酸:
AAAEISGHIVRSPMVGTFYRTPSPDAKAFIEVGQKVNVGDTLCIVEAMKMMNQIEA DKSGTVKAILVESGQPVEFDEPLVVIE-
BCCA MYCLE (P46392)
アセチル−/プロピオニル−補酵素Aカルボキシラーゼα鎖(Acetyl-/propionyl-coenzyme A carboxylase alpha chain) [含有: ビオチンカルボキシラーゼ(Biotin carboxylase) (EC 6.3. 4.14); ビオチンカルボキシル担体タンパク質(Biotin carboxyl carrier protein,BCCP)]. {GENE: BCCA OR ML0726 OR B1308_C1_129}-Mycobacterium leprae
BCCA MYCTU (P46401)
アセチル−/プロピオニル−補酵素Aカルボキシラーゼα鎖(Acetyl-/propionyl-coenzyme A carboxylase alpha chain) [含有: ビオチンカルボキシラーゼ(Biotin carboxylase) (EC 6.3. 4.14); ビオチンカルボキシル担体タンパク質(Biotin carboxyl carrier protein,BCCP)]. {GENE: ACCA1 OR BCCA OR RV2501C OR MT2576 OR MTCY07A7.07C}- Mycobacterium tuberculosis
BCCP ANASP (Q06881)
アセチル−CoAカルボキシラーゼのビオチンカルボキシル担体タンパク質(Biotin carboxyl carrier protein of acetyl-CoA carboxylase,BCCP). {GENE: ACCB}-Anabaena sp. (株PCC 7120)
BCCP ARATH (Q42533)
アセチル−CoAカルボキシラーゼのビオチンカルボキシル担体タンパク質,葉緑体前駆体(Biotin carboxyl carrier protein of acetyl-CoA carboxylase,chloroplast precursor (BCCP)). {GENE: CAC 1 OR BCCP1 OR AT5G16390 OR
MQK4.12}-Arabidopsis thaliana (Mouse-ear cress)
BCCP BACSU (P49786)
アセチル−CoAカルボキシラーゼのビオチンカルボキシル担体タンパク質(Biotin carboxyl carrier protein of acetyl-CoA carboxylase,BCCP). {GENE: ACCB OR FABE}-Bacillus subtilis
BCCP CHLMU (Q9PKR5)
アセチル−CoAカルボキシラーゼのビオチンカルボキシル担体タンパク質(Biotin carboxyl carrier protein of acetyl-CoA carboxylase,BCCP). {GENE: ACCB OR TC0399}-Chlamydia muridarum
BCCP CHLPN (Q9Z901)
アセチル−CoAカルボキシラーゼのビオチンカルボキシル担体タンパク質(Biotin carboxyl carrier protein of acetyl-CoA carboxylase,BCCP). {GENE: ACCB OR CPN0183 OR CP0585}-Chlamydia pneumoniae (Chlamydophila pneumoniae)
BCCP CHLTR (084125)
アセチル−CoAカルボキシラーゼのビオチンカルボキシル担体タンパク質(Biotin carboxyl carrier protein of acetyl-CoA carboxylase,BCCP). {GENE: ACCB or CT123}-Chlamydia trachomatis
BCCP CYACA (019918)
アセチル−CoAカルボキシラーゼのビオチンカルボキシル担体タンパク質(Biotin carboxyl carrier protein of acetyl-CoA carboxylase,BCCP). {GENE: ACCB}-Cyanidium caldarium [葉緑体]
BCCP ECOLI (P02905)
アセチル−CoAカルボキシラーゼのビオチンカルボキシル担体タンパク質(Biotin carboxyl carrier protein of acetyl-CoA carboxylase,BCCP). {GENE: ACCB OR FABE OR B3255 OR Z4615 OR ECS4127}-Escherichia coli,
Escherichia coli O157: H7
BCCP HAEIN (P43874)
アセチル−CoAカルボキシラーゼのビオチンカルボキシル担体タンパク質(Biotin carboxyl carrier protein of acetyl-CoA carboxylase,BCCP). {GENE: ACCB OR FABE OR HI0971}-Haemophilus influenzae
BCCP LYCES (P05115)
アセチル−CoAカルボキシラーゼのビオチンカルボキシル担体タンパク質(Biotin carboxyl carrier protein of acetyl-CoA carboxylase,BCCP)(断片). -Lycopersicon esculentum (トマト)
BCCP PORPU (P51283)
アセチル−CoAカルボキシラーゼのビオチンカルボキシル担体タンパク質(Biotin carboxyl carrier protein of acetyl-CoA carboxylase,BCCP). {GENE: ACCB}-Porphyra purpurea [葉緑体]
BCCP PROFR (P02904)
メチルマロニル−CoAカルボキシルトランスフェラーゼ(トランスカルボキシラーゼ,1.3Sサブユニット)のビオチンカルボキシル担体タンパク質(Biotin carboxyl carrier protein of methylmalonyl-CoA carboxyl-transferase (Transcarboxylase, 1.3S subunit)). -Propionibacterium freudenreichii shermanii
BCCP PSEAE (P37799)
アセチル−CoAカルボキシラーゼのビオチンカルボキシル担体タンパク質(Biotin carboxyl carrier protein of acetyl-CoA carboxylase,BCCP). {GENE: ACCB OR FABE OR PA4847}-Pseudomonas aeruginosa
BCCP SOYBN (Q42783)
アセチル−CoAカルボキシラーゼのビオチンカルボキシル担体タンパク質,葉緑体前駆体(Biotin carboxyl carrier protein of acetyl-CoA carboxylase,chloroplast precursor (BCCP)). {GENE: ACCB-1}-Glycine max (Soybean)
BCCP STRMU (P29337)
ビオチンカルボキシル担体タンパク質(Biotin carboxyl carrier protein,BCCP). -Streptococcus mutans
a) ビオチン化ドメインを含むタグ部分をコードする第1の核酸分子を、前記所定のタンパク質をコードする第2の核酸分子に付着させて、結合した第1と第2の核酸分子の発現産物における前記タグ部分が、前記所定のタンパク質のN末端又はC末端に位置した前記タグ部分を含むようなコンストラクトを形成する工程と、
b) 前記コンストラクトを宿主細胞内で発現する工程を含む。
a) ビオチン化ドメインを含むタグ部分をコードする第1の核酸分子を、前記所定のタンパク質をコードする第2の核酸分子に付着させて、結合した第1と第2の核酸分子の発現産物における前記タグ部分が、前記所定のタンパク質のN末端又はC末端に位置するようなコンストラクトを形成する工程と、
b) 前記タグ部分に存在する正確に折り畳まれたビオチン化ドメインのみビオチンと結合しているような状態で、前記コンストラクトを宿主細胞内で発現する工程と、
c) 前記タグ部分を含む前記所定のタンパク質の折り畳み状態を、前記コンストラクトから発現したタンパク質にビオチン基が存在するか、又は存在しないかによって決定する工程を含む。
a)前記ライブラリーのクローン・メンバーにおいて、前記所定のタンパク質をコードする第二の核酸分子の5'に、かつ該核酸分子とインフレームで、ビオチン化ドメインを含むタグ部分をコードする第1の核酸分子を付着させて、結合した第1と第2の核酸分子の発現産物におけるタグ部分が、前記所定のタンパク質のN末端にある前記タグ部分を含むようなコンストラクトを形成する工程と、
b)前記コンストラクトを宿主細胞内で発現する工程を含む。
・ワクチンの製造
・治療用タンパク質の製造
・モノクロナール又はポリクロナール抗体の生成に用いる抗原の製造、モノクロナール抗体又は単鎖抗体の製造
・酵素の製造
・細胞のタンパク質−タンパク質相互作用の地図を作成すること、すなわち“インタラクトーム”による薬剤ターゲットの開発
・スクリーニング用のキナーゼ、ホスファターゼ、細胞受容体もしくはプロテアーゼがあるがこれらに限られないタンパク質薬剤ターゲットの生成による薬剤ターゲットの検証、酵素及び/又は毒物学研究、及びそのほかの生化学分析
において、タンパク質の発現と溶解性の両方を増大させることができる。
レーン1、2及び3:pGFP-BCCPを宿し、無傷のGFP-BCCPタンパク質を発現するクローン由来のタンパク質抽出物。
レーン4、5及び6:pMSC301A、B及びCをそれぞれ宿し、実験においてネガティブ・コントロールとして用いたクローン由来のタンパク質抽出物。
レーン1、2及び4は、GST-GFP-BCCPを発現する細胞由来のタンパク質抽出物である。
レーン3は、GFP-BCCPを、本実験においてポジティブ・コントロールとして発現する細胞由来のタンパク質抽出物である。
レーン5及び6:pMSC301A及びBを、ブロットにおけるネガティブ・コントロールとして宿すクローン由来のタンパク質抽出物。
レーン7及び8:GST-BCCPを発現する細胞由来のタンパク質抽出物。
図9は、pIFM101A/B/Cのプラスミド地図を示す。
図10は、プラスミドpIFM101Aのクローニングサイトを示す。
図11は、プラスミドpIFM101Bのクローニングサイトを示す。
図12は、プラスミドpIFM101Cのクローニングサイトを示す。
方法:
1.E.coliのK12株由来ビオチンカルボキシル担体タンパク質(アセチル−CoAカルボキシラーゼのC末端ドメイン)の単離
アセチル−CoAカルボキシラーゼの全コード領域をコードするDNA配列を、下記の遺伝子特異的プライマーを用いて、XL1-Blue(Stratagene)細胞のゲノムDNAからPCRによって増幅した。
accbfor1:5' GATGGATCCGATATTCGTAAGATTAAAAAACTGATCG 3'(5'末端にBamHI部位を有する)
bccprev1:5' GATGAGCTCAAGCTTTTACTCGATGACGACCAGCGGCTCGTC 3'(SacI及びHindIII部位を含む)
bccpfor1 : 5'GATCTGCAGGGCTCCGCAGCAGCGGAAATCAGTGGTCACATCG 3'(クローニングのためにPstI部位と、グリシン及びセリンの2個の余分なコドンを含む)
pQE-80ベクターを、ヘキサヒスチジンタグのDNA配列を削除し、クローニング部位(NotI及びSfiI)をさらに加え、3種の異なる、出発点のATGからのリーディング・フレーム(pMSC301A/B/C)を有するように再び設計した。このことは、下記のプライマーのセットを用いて逆PCRによって行った。前記プライマーのセットは、Aのリーディング・フレームでは、pQErev1: 5' PCATAGTTAATTTCTCCTCTTTAATGAATTCTG 3'と、pQEfwd1: 5' GCGGCCGCGGCCATTACGGCCGGATCCGCATGCGAGCTCGG TACCCCC 3'、Bのリーディング・フレームでは、pQErev1と、pQEfwd2: 5' G + pQEfwd1、Cのリーディング・フレームでは、pQErev1と、pQEfwd3: 5' GC + pQEfwd1である。PCRを、Pwoポリメラーゼを用いて行った(94℃ 2分;94℃ 30秒;63.5℃ 1分;72℃ 6分;25サイクル;72℃ 10分)。
COVET方法論を使用して、英国特許出願番号第0020357.0号、米国特許出願番号第60/247995号及び国際公開第01/57198号の対象である欠失のセットを生成した。以下に簡単に述べる。〜100ngの鋳型のプラスミドライブラリー(ClontechのpDNR-LIBにおけるヒト心臓cDNAライブラリー)を、下記のベクターに特異的なプライマーを用いてPCRで増幅して、α−ホスホチオエートdTTP(α-S-dTTP;Amercham)を好ましくは組み込んだ。前記プライマーは、SP5forward: 5' ATGCTCATGAGGCCGGCCGGGAATTC GGCCATTACG GCCGG 3'(FseI及びSfiI部位を有する)、及びSP3reverse: 5' GTCTAGAAAGCTTCTCGAGGGCCG 3'である。50pmolの各プライマー、2.5ユニットの熱安定性ポリメラーゼ(3'−5'エキソヌクレアーゼ活性を欠いたもの、例えばTaqポリメラーゼ)、標準緩衝液及びデオキシヌクレオチド三リン酸混合物:200μMのdATP、200μMのdGTP、200μMのdCTP、100μMのdTTP、100μMのα-S-dTTPを用いてPCR反応を行った。PCR増幅産物を、QIAquick PCR cleanup kit(Qiagen)を用いて精製し、FseIで消化して、dsDNAの5'末端を後のエキソヌクレアーゼIII(NEB)による加水分解から保護する3'核酸オーバーハングを生成した。エキソヌクレアーゼIIIによる消化を、標準条件を用いて行い、ホスホチオエートの核酸間の結合を存在させることで、これ以上加水分解しないようにした。これによって、入れ子状態の(nested)センス鎖の3'欠失のセットを生成した。グリーン・ビーンズ・ヌクレアーゼ(New England Biolabs)を用いて、アンチセンス鎖からssDNAを除去し、それによって、SfiIでさらに消化した後の方向性があるクローニングに備えてdsDNAを平滑末端化した。アガロースゲル電気泳動によってサイズ分画した後、これらの挿入物を、pIFM101A、B及びCベクターのDraIII及びSmaI部位にクローニングした。次に、ライゲーションした産物を用いて、XL1-Blue細胞(Stratagene)を形質転換した。
XL1-Blue又はXL10-Gold(Stratagene)のE.coli株を宿主細胞として用い、種々のプラスミドコンストラクトを用いて形質転換した(エレクトロポレーション又は化学的方法で)。形質転換混合物を、適切に希釈して、100μg/mlのカルベニシリンを含むLB寒天上に置いたニトロセルロース膜上に蒔いた。30℃で一晩インキュベートした後、400μMのIPTG及びカルベニシリンを含むLB-Agar上へ膜を移し、さらに4〜5時間、30℃でインキュベートした。クローンのGFP活性を、紫外線トランスイルミネーターの365nmの波長で可視化することによって評価した。ビオチン化BCCP又はGFPを検出するために膜を処理した。タンパク質をウェスタンブロットによって分析するために、培養物を、対数期の中間部(600nmにおける光学濃度が0.5〜0.6)で、培養物に400μMのIPTGを添加することによって誘導し、細胞の培養を、30℃で、さらに3〜4時間継続した。誘導期の終わりに、細胞を回収し、タンパク質を、10〜20%のグラジエントのSDSゲル(Invitrogen)上で分離し、ニトロセルロース膜上にブロットし、種々の抗体又はストレプトアビジンで探索した。
ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ(horseradish peroxidase,HRP)抱合体(Amersham)を用いて、コロニーのブロット(上記の)又は本技術分野で既知であるウェスタンブロット上で探索することによって、BCCPのビオチン化を検出した。
GFPの緑色蛍光を、トランスイルミネーターを用いて365nmの波長でコロニーを励起させることによって可視化した。
抗GSTモノクロナール抗体(Sigma)を免疫プローブ(immunoprobe)として用いて、GSTの発現を検出した。抗体を1:3000の比率で希釈して用い、免疫反応シグナルを、AmershamのECLシステムを用いて検出した。
GFP活性とBCCPのビオチン化の絶対的な相関関係
図1及び2は、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼをプローブとして用いたコロニーのウェスタンのデータを示す。GST-GFP-BCCP、GST-BCCP及びGFP-BCCPの正確なインフレームでの融合物のみ、内生のビオチン化AccB由来の全体的なバックグランドを有意に超える強い陽性シグナルを与えた。用いたクローニング戦略から生じたフレーム外の融合物は、陽性シグナルを生じなかった。ビオチン化融合タンパク質(GST-GFP-BCCP及びGFP-BCCP)のみ、すべて365nmで励起させた際に緑色の蛍光を発した。蛍光は、融合タンパク質が正確に折り畳まれていることを示し、この結果によって、C末端の融合パートナーとしてBCCPを有する正確に折り畳まれたタンパク質は、ビオチンタンパク質リガーゼ(biotin protein ligase,BPL)の活性のある基質であることが示された。図3及び4は、ビオチン化タンパク質が予想される分子量のものであり、無傷で、かつタンパク質分解されていないタンパク質が確認されたことを示す。
ヒト心臓cDNAを、ORFの終止コドンを除去するために、エキソヌクレアーゼIII(NEB)で制御して消化することによって3'末端で陥凹させた。次に、この3'の入れ子状態の欠失(nested deletion)のセットを、pIFM101A、B及びCベクター(図9〜12参照)にクローニングした。生じたGFP-BCCPとの融合物のライブラリーは、インフレーム又はフレーム外のものであった。インフレームの融合タンパク質は、正確に折り畳まれた可溶タンパク質として発現した状態では、365nmの紫外光の下で緑色の蛍光を発し(GFPは視覚的な折り畳みマーカーである)、ビオチン化もされていた。図5は、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合体で探索したコロニーのウェスタンブロットを示す。ポジティブ・ヒット(positive hit、バックグラウンドを有意に超えたもの)は、365nmで可視化したとき緑であると特徴付けられたものである。36個中4個のみビオチン化されたが、視覚的に緑でなかった。これは、BCCPのビオチン化に用いた検出方法が、緑色蛍光の視覚的な検出より感受性が高いという事実による。
材料及び方法
ベクター pQE82L-GFP-ビオチン及びpMD004プラスミド(図8)を標準技術(T. Maniatisら(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press)によって構築し、その両方ともが、pQE82Lベクター(Qiagen)のバックボーンから成り、それぞれ、RGS-Hisタグに続いて“Aviタグ”配列又はBCCPタンパク質ドメインがあり、それに続いてマルチクローニングサイトがある。それらは、T5プロモーターを厳重に制御するためのlacIqリプレッサーをコードし、SmaIとNotIで切断した際に、GFP又はp53のスタッファー断片を放出して、5'−リン酸化平滑末端及び3'−NotI粘着末端を有する遺伝子クローニング挿入物に使用できるベクターを与える。
BCCPドメインがタンパク質の折り畳みを補助することを証明するために、49のヒトタンパク質の定められたセットを、2種の異なるベクター、すなわちpQE82L-GFP-ビオチン又はpMD004(図8)のSmaI/NotI部位にクローニングした。これらのコンストラクトからタンパク質を発現すると、タンパク質は、pQE82L-GFP-ビオチンベクターの場合は、短い(19aa)N末端のペプチドタグ(ヘキサヒスチジン配列とその後に続く“Aviタグ”配列(www.avidity.com;米国特許第5,932,433)からなる)と共に、又はE.coliのBCCPタンパク質のC末端との融合物として(pMD004)発現した。表1に要約するように、タンパク質をBCCPタンパク質との融合物として発現した場合、可溶タンパク質の生産の成功率が非常に高かったことが認められた(図6及び7参照)。例えば、BCCPドメインがない状態で発現した場合、48%のクローンしか、81%が可溶であった発現を見ることができなかったのと比較して、BCCPドメインと融合した場合、98%のタンパク質が可溶して発現した。pMD004ベクターから発現したクローンの総数が、pQE82L-GFP-ビオチンからの発現と比べてより多かったという観察結果は、両コンストラクトのN末端の12アミノ酸が同一であるので、分解のためのプロテオソームへのターゲティングを決定するのにN末端におけるアミノ酸が重要である“N末端ルール”によって説明できそうにない。より適当な説明は、N末端のBCCPドメインと発現したコンストラクトは、下流のタンパク質のタンパク質折り畳みを補助し、誤って折り畳まれたタンパク質がプロテオソームへターゲティングされるのを妨げるというものである。このことは、pQE82L-GFP-ビオチンベクターからの発現と比較して、BCCPの下流部分を発現した場合、より多くのタンパク質が可溶した状態で発現したという観察結果によっても裏付けられる。BCCPが、下流のタンパク質ドメインの折り畳みを補助する機構は、シャペロンが補充されることによるか、又は融合タンパク質の可溶性が全体として増加することによるものである可能性が考えられる。
タンパク質を選択し、対応する遺伝子の挿入物を、pQE-GFP-ビオチン(ベクター1)又はBCCP pMD004(ベクター2)にクローニングし、ヘキサヒスチジン−Aviタグペプチド又はヘキサヒスチジン−BCCPタンパク質のいずれかのC末端と融合したものを生じさせた。両ベクターにクローニングした挿入物のみ、タンパク質発現の観点から比較した。表の記号表:1内部コード番号。2タンパク質データベースのアクセッション番号(www.oca.edi.au.uk)。3塩基対で表したDNA遺伝子の全長。4アミノ酸(aa)で表した、BCCPとの融合物として発現した場合のタンパク質の大きさ。5キロダルトン(kda)で表した、BCCPとの融合物として発現した場合のタンパク質の大きさ。6クローニングしたORFの領域(aa)。C−クローニングしたが、発現がない;H−SDS-PAGEウェスタンブロットにおいてヒスチジン・ポジティブのタンパク質を発現;B−SDS-PAGEウェスタンブロットにおいてビオチン・ポジティブのタンパク質を発現;S−可溶タンパク質を発現。
Claims (12)
- ビオチン化ドメインを備えるタグ部分の使用であって、興味あるタンパク質の溶解性を、前記タグ部分を前記興味あるタンパク質のN末端またはC末端に付着させることによって増加させるための使用。
- ビオチン化ドメインを備えるタグ部分の使用であって、興味あるタンパク質の折り畳み状態を、前記タグ部分を前記興味あるタンパク質のN末端またはC末端に付着させることによって定めるための使用。
- ビオチン化ドメインを備えるタグ部分をコード化する核酸分子の使用であって、クローンの割合であり、各々の前記クローンによってコード化される興味あるタンパク質を検出可能なレベルで発現するライブラリーにおけるものを、前記タグをコード化する前記核酸分子の、前記興味あるタンパク質を前記各々のクローンにおいてコード化する遺伝子に対する5′への、およびそれとインフレームでの付着によって増加させるための使用。
- 興味あるタンパク質の溶解性を、宿主細胞において発現したときに増加させる方法であって、
a)ビオチン化ドメインを備えるタグ部分をコード化する第1の核酸分子を、前記興味あるタンパク質をコード化する第2の核酸分子に付着させて、組み合わせられた第1および第2の核酸分子の発現された生成物におけるタグ部分が、備えられ、前記興味あるタンパク質のN末端またはC末端に位置するような構築物を形成する工程、
b)前記構築物を宿主細胞において発現させる工程
を具える、方法。 - 所定のタンパク質の折り畳み状態を定める方法であって、
a)ビオチン化ドメインを備えるタグ部分をコード化する第1の核酸分子を、前記興味あるタンパク質をコード化する第2の核酸分子に付着させ、組み合わせられた第1および第2の核酸分子の発現された生成物におけるタグ部分が、備えられ、前記興味あるタンパク質のN末端またはC末端に位置するような構築物を形成する工程、
b)前記タグ部分において存在する正確に折り畳まれたビオチン化ドメインだけがビオチンと連結するような条件下に、前記構築物を宿主細胞において発現させる工程、
c)前記タグ部分を備える前記興味あるタンパク質の折り畳み状態を、前記構築物から発現したタンパク質におけるビオチン基の存在または不存在によって定める工程
を具える、方法。 - クローンの割合で、各々の前記クローンによってコード化される興味あるタンパク質を宿主細胞において検出可能なレベルで発現するライブラリーにおけるものを増加させる方法であって、
a)ビオチン化ドメインを備えるタグ部分をコード化する第1の核酸分子を、前記ライブラリーのクローナルな一員において前記興味あるタンパク質をコード化する第2の核酸分子に対する5′への、およびそれとインフレームで付着させ、組み合わせられた第1および第2の核酸分子の発現生成物におけるタグ部分が、前記興味あるタンパク質のN末端に位置付けられる前記タグ部分を備えるような構築物を形成する工程、
b)前記構築物を宿主細胞において発現させる工程
を具える、方法。 - 前記興味あるタンパク質は2つまたはそれよりも多くの異なるコード配列を備えるライブラリーの一部分を形成する核酸分子によってコード化されている、請求項1もしくは
2記載の使用、または請求項4もしくは5記載の方法。 - 前記異なるコード配列は、前記タグ部分を含むように修飾され、および並行して発現される、請求項7記載の使用または方法。
- 興味あるタンパク質をコード化する核酸分子のライブラリーであって、各コード配列は、ビオチン化ドメインを備えるタグ部分が、コード化されたタンパク質のN末端またはC末端に組み込まれるように修飾される、ライブラリー。
- 可溶性の折り畳まれたタンパク質のライブラリーであって、請求項9記載のライブラリーから発現された、ライブラリー。
- 前記ビオチン化ドメインは、E. coli(エシェリキア・コリ)のBCCPである、請求項1〜8のいずれかに記載の使用または方法。
- 前記ビオチン化ドメインは、E. coli(エシェリキア・コリ)のBCCPである、請求項9または10記載のライブラリー。
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