CN108137654A - 适用于将分子递送进入选定细胞的工程改造的肉毒梭菌毒素 - Google Patents

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Abstract

工程改造的有效载荷递送系统包括与成孔单元共价结合的靶细胞结合单元和与能够非共价结合成孔单元的区域相适应的有效载荷部分。成孔单元衍生自特定亚血清型的梭菌毒素，而有效载荷区域衍生自不同亚血清型的梭菌毒素。所公开的基于嵌合蛋白的组合物能够将有效载荷特异性地递送至神经细胞。

Description

适用于将分子递送进入选定细胞的工程改造的肉毒梭菌毒素
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年5月15日提交的申请号为62/162,582的美国临时专利申请的优先权，其通过引用以其整体并入本申请并用于所有目的。
政府权利
本发明是在由国防部国防威胁减少机构授予的资助号为HDTRA-10-C-0055的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。
背景技术
肉毒梭菌(Clostridium botulinum)是一种形成孢子的耐热厌氧细菌，产生一种基于蛋白质的毒素(肉毒毒素)，该毒素具有几种血清型，称为A至G血清型，其中血清型C具有3种亚型，称为血清型Cl、C2和C3。Cl神经毒素通过阻断由神经元释放的乙酰胆碱以低剂量使人和动物瘫痪，恢复很慢-治疗可能需要多周的机械通气才能使人能够再次呼吸。C2毒素不具有神经活性，而导致坏死和出血。C亚型血清型中对C3毒素的定义最少。
大多数基于毒素的递送系统是多结构域蛋白质，多结构域蛋白质结合靶细胞并跨越脂质双分子层将物质(有效载荷)易位到靶细胞的胞质溶胶中。这些系统是改变的AB型毒素，由有效载荷结构域(A)和结合/易位结构域(B)组成。A和B结构域可以通过多肽或二硫键共价连接，该多肽或二硫键随后在易位步骤中被切割。非共价连接的(二元)A和B毒素结构域被独立地转录和翻译并在发挥毒性之前缔合。肉毒梭菌C2毒素(C2)不是神经毒素，但具有二元AB毒素设计。
发明内容
本公开通过提供用于将有效载荷(或药剂)递送至靶细胞的基于嵌合毒素的递送组合物(或系统)来推进本领域。在一个实施方案中，组合物可以含有靶细胞结合单元、成孔单元和有效载荷单元，具有或没有其它额外的元件。
在一个实施方案中，成孔单元可以与已知毒素(例如来自肉毒梭菌的毒素)的成孔单元相同。在另一个实施方案中，成孔单元可以衍生自具有修饰物的已知毒素的成孔单元。在另一个实施方案中，成孔单元可以是可以是如成孔单元发挥作用的任何蛋白质。
有效载荷单元可以含有待递送到靶细胞的药剂。一方面，有效载荷单元可以非共价地结合到成孔单元，或结合到连接的成孔单元和靶细胞结合单元。另一方面，成孔单元和靶细胞结合单元是共价连接的。
在一个实施方案中，有效载荷单元可以与已知毒素(例如来自肉毒梭菌的毒素)的有效载荷单元相同。在另一个实施方案中，有效载荷单元可以衍生自具有修饰物的已知毒素的有效载荷单元。在另一个实施方案中，有效载荷单元可以是如用于递送药剂的有效载荷单元发挥作用的任何蛋白质。
在另一个实施方案中，靶细胞结合单元可以含有特异性靶细胞结合配体，该特异性靶细胞结合配体选自由抗体、抗体片段、亲和体、生长因子、受体结合配体或它们的组合组成的组。在另一个实施方案中，靶细胞结合单元可含有天然的或修饰的衍生自除C2以外的肉毒梭菌(C.botulinum)毒素的重链结合结构域。
在另一个实施方案中，靶细胞结合单元优先结合神经细胞。在另一个实施方案中，组合物优选将药剂递送至神经细胞。在另一个实施方案中，靶细胞结合单元是肉毒梭菌神经毒素C1的重链结合结构域(C1Hcc)(参见图2c，SEQ ID No.1)。
在另一个实施方案中，成孔单元可以是衍生自第一类非神经毒性(即非特异性靶向神经元)毒素的多肽，并且靶细胞结合单元可以是衍生自第二类毒素的多肽，其中该第二类不同于第一类毒素。在另一个实施方案中，第一类非神经毒性毒素可以是二元毒素。
在另一个实施方案中，成孔单元可以是衍生自第一梭菌(Clostridium)毒素亚血清型的多肽，而靶细胞结合单元是衍生自第二梭菌毒素亚血清型的多肽，其中第二亚血清型与第一亚血清型是不同的。在另一个实施方案中，成孔单元是衍生自肉毒梭菌毒素C2的成孔单元的重链的多肽(参见图2c，SEQ ID No.2)。
在另一个实施方案中，成孔单元可以含有天然的或修饰的衍生自除肉毒梭菌毒素C2以外的毒素的重链结合结构域。一方面，成孔单元可以含有天然的或修饰的成孔结构域，该成孔结构域衍生自选自由产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)α-毒素、β-毒素、ε-毒素和ι-毒素、螺旋梭菌(Clostridium spiroforme)ι样毒素、炭疽毒素及它们的组合组成的组的毒素。
在一个实施方案中，成孔单元是衍生自肉毒梭菌毒素C2的成孔单元的重链的多肽，而靶细胞结合单元可以含有天然的或修饰的衍生自除肉毒梭菌毒素C2以外的毒素的重链结合结构域。一方面，靶细胞结合单元可以含有天然的或修饰的重链结合结构域，该重链结合结构域衍生自选自由肉毒梭菌神经毒素、产气荚膜梭菌毒素α、β、ε和ι毒素、螺旋梭菌ι样毒素、霍乱毒素、炭疽毒素、志贺毒素、志贺样毒素、白喉毒素、蓖麻毒蛋白、外毒素A及它们的组合组成的组的毒素。
在另一个实施方案中，有效载荷单元没有共价地结合于靶细胞结合单元或成孔单元。在另一个实施方案中，有效载荷单元是衍生自肉毒梭菌毒素C2的多肽(参见图2d，SEQID No.3)。
在另一个实施方案中，药剂包含至少一种选自由治疗剂、诊断剂、显像剂及它们的组合组成的组的成员。另一方面，药剂可以含有至少一种选自由毒素、细胞周期阻滞剂、凋亡诱导剂、DNA复制抑制剂、RNA合成抑制剂、蛋白质合成抑制剂、酶、蛋白质结合剂、抗体、中和抗体、标记试剂、磁珠及它们的组合组成的组的成员。
在另一个实施方案中，药剂包含ADP-核糖基转移酶。在另一个实施方案中，药剂包含来自肉毒梭菌毒素C-2的C2I。在另一个实施方案中，试剂包含用于标记或监测靶细胞的荧光剂。
在一个实施方案中，靶细胞可以是癌细胞。在另一个实施方案中，靶细胞可以是神经元。在另一个实施方案中，靶细胞可以是脑肿瘤细胞、成神经细胞瘤细胞、成视网膜细胞瘤细胞、外周神经元、运动神经元、感觉神经元或它们的组合。
在另一个实施方案中，工程改造的有效载荷递送组合物可以包括与成孔单元共价结合的靶细胞结合单元，和与能够非共价结合成孔单元的区域相适应的有效载荷部分。在另一个实施方案中，公开了多肽(SEQ ID No.4)，该多肽可以含有通过接头(EP)10连接而共价结合的成孔单元和靶细胞结合单元，其中靶细胞结合单元是肉毒梭菌神经毒素C1的重链结合结构域(C1Hcc)，而成孔单元是衍生自肉毒梭菌毒素C2的成孔单元的重链的多肽。
在另一个实施方案中，活性有效载荷区域通过衍生自肉毒毒素C-2的轻链有效载荷部分的偶联区域与成孔单元结合。另一方面，靶细胞结合单元衍生自肉毒毒素C-1的靶细胞结合单元。
在另一个实施方案中，靶细胞结合单元是来自肉毒梭菌神经毒素C1的重链结合结构域(C1Hcc)，而成孔单元是肉毒梭菌毒素C-2的成孔单元的重链，有效载荷单元包含来自肉毒梭菌毒素C-2的C2I。
在另一个实施方案中，在用于将药剂递送至包含靶细胞结合单元、成孔单元和有效载荷单元的靶细胞的组合物中，靶细胞结合单元包含与SEQ ID No.1的氨基酸序列具有至少80、90、95、99％、或100％序列同一性的多肽，成孔单元包含与SEQ ID No.2的氨基酸序列具有至少80、90、95、99％、或100％序列同一性的多肽，有效载荷单元包含与SEQ ID No.3的氨基酸序列具有至少80、90、95、99％、或100％序列同一性的多肽。
在另一个实施方案中，在用于将药剂递送至包含靶细胞结合单元、成孔单元和有效载荷单元的靶细胞的组合物中，靶细胞结合单元和成孔单元共价连接以形成与SEQ IDNo.4的氨基酸序列具有至少80、90、95、99％、或100％的序列同一性的多肽，有效载荷单元包含与SEQ ID No.3的氨基酸序列具有至少80、90、95、99％、或100％的序列同一性的多肽。
在另一个实施方案中，公开的组合物可以通过注射施用于受试者，其中受试者含有靶细胞。
在另一个实施方案中，公开了编码多肽的多核苷酸，其中多肽与选自由SEQ ID NO1至6组成的组的多肽具有至少80、90、95、99％、或100％的同一性。一方面，多核苷酸可以被携带在载体上。一方面，载体可以能够自我复制。
在另一个实施方案中，还公开了包含该多核苷酸的宿主细胞。宿主细胞可用于产生用于将药剂递送至靶细胞的组合物。在另一个实施方案中，可以将宿主细胞引入受试者以递送药剂。在另一个实施方案中，为了本公开的目的，宿主细胞可以是细菌或病毒。
附图说明
图1示出了(a)天然C2毒素中毒的分子步骤；和(b)基于C2II-C1和C2It运输系统的神经递送模型。
图2示出了肉毒梭菌C1、肉毒梭菌C2II、融合C2II-C1和C2I的蛋白质结构域。数字对应于每种蛋白质的氨基酸残基。(a)BoNT C1具有相连的酶促轻链有效载荷和结合/易位结构域。(b)C2II结合/易位元件具有四个结构域。氨基酸残基182指示将C2II活化为C2IIa的胰蛋白酶切割位置。除去结构域4(D4)以产生C2IIΔD4作为C2II-C1的易位结构域。(c)通过用(EP)10接头(SEQ ID No.5)使C2IIΔD4(SEQ ID.No.2)和BoNT C1HCC(SEQ ID.No.1)连接来制备融合C2II-C1(SEQ ID No.4)，(EP)10接头的两侧都是甘氨酸-丝氨酸残基对。氨基酸182是C2II-C1的活化位点。(d)C2毒素的天然C2I酶促有效载荷和截短的C2It结构域。氨基酸299、348、387和389对C2I(SEQ ID.No.3)的ADP-核糖基化活性是需要的，因此不存在于C2It(SEQ ID.No.6)中。
图3示出了流式细胞术以评估C2II-C1介导的差异性富集有GT1b的细胞群对C2It-488的摄取。(a)纯化的C2It(约26kDa)的考马斯染色的SDS-PAGE。泳道：M：分子尺，1：凝血酶切割后的可溶性洗脱液(elution fraction)。(b)按所示使N2A细胞富集有GT1b，随后与活化的C2II-C1(2μg/mL)和C2It-488(4μg/mL)的重组蛋白孵育2小时。然后用链霉蛋白酶(1μg/mL)处理细胞以除去与膜结合的C2It-488。利用FACSDiva软件通过BD FACS Canto II流式细胞仪分析样品。(c)通过流式细胞术定量评估细胞内荧光。百分比表示为平均值±SEM(n＝3)，并且采用通过与每个对照平均值比较的学生t-检验来计算由C2II-C1介导的依赖于GT1b的C2It-488摄取的统计学显著性。p<0.005。
图4(a)和(b)示出了用C2II-C1和C2I-568处理的差异性富集有GT1b的N2A细胞的CLSM图像。所有图像都采用具有2倍光学变焦的60倍油镜进行拍摄。用Rab5a-GFP早期内体标志物(绿色)处理N2A细胞群24小时并用DAPI染色。将活化的C2II-C1(2μg/mL)C2It-568(红色，4μg/mL)和GT1b(50μg/mL)孵育2小时。(a)在加入蛋白质之前，使细胞富集GT1b持续4小时。(b)在加入蛋白质之前没有使细胞富集GT1b。
图5示出了由C2II-C1介导的C2I引起的差异性富集有GT1b的细胞群的细胞圆化(cell rounding)。(a)纯化的C2I的考马斯染色的SDS-PAGE。预期质量：C2I-GST(约75kDa)，C2I(约49kDa)分子尺，1：裂解上清液，2：在凝血酶切割前的纯化树脂，3：在凝血酶切割后的可溶性洗脱液。(b)A172成胶质细胞瘤细胞生长至约60％汇合度，并且使其如所示富集有GT1b或不富集有GT1b。(c)碘化丙啶染色的同步化HeLa细胞从胸腺嘧啶脱氧核苷阻断中解除(release from)或未从胸腺嘧啶脱氧核苷阻断中解除的随时间流式细胞术结果，用于证实除去过量的胸腺嘧啶脱氧核苷并添加脱氧胞嘧啶核苷以从阻断中解除后的S期DNA合成的进展。(d)差异性富集有GT1b的同步化HeLa细胞的细胞圆化。
具体实施方式
公开了将分子有效载荷递送至靶细胞的胞质溶胶的组合物和方法。细菌已经发展了靶向细胞并将毒性有效载荷递送至靶细胞的胞质溶胶的机制。这种机制可以被修改和工程改造，以递送有益的有效载荷。
通常地，有两类AB型细菌毒素：连接的和非连接的(二元的)。连接的毒素通常具有含有毒素结构域和结合/易位结构域的单链蛋白质。二元毒素通常具有两个分别表达的蛋白质分子，其中结合/易位结构域和毒素结构域通过非共价相互作用组装。
为了本公开的目的，术语“衍生”是指基于另一分子构建的分子，并且在结构上与所述另一分子相同、基本相同或基本相似。另一方面，衍生的出分子通常与所述另一分子执行相同的、基本相同的或基本相似的功能。
术语序列同一性用于表示氨基酸或核苷酸序列的相似性。在较小分子与较大分子比较的情况下，较小分子可以与较大分子的全长或部分片段进行比较。
天然的C2毒素由两种不同的蛋白质组成。B结构域蛋白(C2II)结合靶细胞并易位A结构域(C2I，有效载荷)。A结构域是ADP-核糖基转移酶，其引起通过细胞质肌动蛋白的ADP-核糖基化引发的细胞圆化和凋亡(图1a)。对C2II单体进行蛋白水解处理以从N-末端除去20kDa的片段，这使得结合/易位结构域活化为C2IIa。C2IIa单体然后自发低聚化并通过与细胞膜上连接有天冬酰胺的多糖的相互作用而结合至细胞表面。A结构域C2I与C2IIa低聚物结合，C2IIa/C2I复合体通过网格蛋白和Rho依赖性机制被内化。早期内体的酸化引起由C2IIa低聚物形成的膜孔，C2I通过膜孔被运输到细胞质中。
对于治疗发展，二元毒素的工程改造具有一定的优势，因为可以对结合/易位结构域和有效载荷结构域进行分别表达和纯化。来自肉毒梭菌的C2毒素是二元结构，但由于它结合多种细胞并且需要N-连接的多糖用于中毒(即，它不是特异性的神经毒素)，所以是非特异性的。这里公开了通过重定向到神经细胞来工程改造C2毒素结合结构域的方法。更具体地，可以采用来自C1肉毒神经毒素的靶结合结构域。来自C1肉毒神经毒素的结合结构域先前在连接的毒素设计中已经作为靶向元件用于至外周神经组织的药物递送和作为脂质体的表面修饰物。
在一个实施方案中，C2毒素的结合结构域的替换需要经过重定向的结合/易位元件在活化后保持其低聚化的能力，结合至细胞表面上的新的靶向部分的能力，和将有效载荷易位至靶细胞的胞质溶胶中的能力。C2毒素的天然结合结构域位于分子的C-末端的一端并被命名为D4(参见图2b)。一方面，D4不是低聚化所必需的，因为即使当D4不存在时也可以在人造膜中形成易位孔。另一方面，将D4从C2II中除去，并用将分子靶向至外周神经元的BoNT C1结合结构域替代。BoNT C1HCC(图2a)优先结合神经节苷脂GT1b和GD1b。
在另一个实施方案中，嵌合的C2II-C1中不包含BoNT/A N-末端重链结构域(HCN)。已经显示，HCN可以通过与磷脂酰肌醇磷酸酯的相互作用而协助毒素定向以与膜结合。结果表明，尽管HCN可能在天然的BoNT易位中有活性，但在嵌合的C2II-C1易位事件中不需要HCN。
在另一个实施方案中，结合结构域取自连接的毒素并插入到二元毒素的结合/易位结构域。这种配置使所产生的分子重定向到神经元，同时维持C2毒素的活化和易位机制。应该注意的是，BoNT和C2内吞作用和易位机制之间存在相似性，因为以pH依赖性蛋白质构象变化为特征的网格蛋白/rho/发动蛋白(dynamin)介导的内吞作用的-核内体的进入通路涉及这两种毒素。
在另一个实施方案中，已经尝试表达可溶性C2II-C1融合蛋白，可溶性C2II-C1融合蛋白在用胰蛋白酶活化时会低聚化。由于溶解度问题，C1HCC结构域的直接融合不成功。为了弥补这个限制，使用了弹性甘氨酸-丝氨酸接头(G4S)n，但遇到了类似的问题。最后，使用刚性(EP)10接头产生与活化和低聚化相容的可溶性融合蛋白。SDS-PAGE证实了C2II-C1融合蛋白可以被有限的胰蛋白酶消化活化，然后低聚化。Western印迹用于证实C1HCC结构域被并入低聚的物质中。对C2II-C1低聚物特异的BoNT C1抗原性和与C2IIΔD4相比电泳迁移率降低证明C2II-C1的C-末端处的C1HCC不会阻碍低聚化并且与有限的胰蛋白酶消化相容。
为了量化和可视化由C2II-C1有效载荷的结合和内化，构建了基于荧光标记的C末端截短的C2I的有效载荷C2It(图2d)用于流式细胞术和显微术实验。由C2I的1至226位的氨基酸(不含ADP-核糖基化活性位点残基)组成的C2It，通过胺反应性化学用Alexa Fluor488(C2It-488)和568(C2It-568)以两种不同版本进行荧光标记。先前，BoNT C1HC的进入显示在人工富集有GT1b30的N2A细胞中是GT1b依赖性的，并且该策略被改编以研究C2II-C1融合蛋白的靶向。如果工程改造的B元件C2II-C1被活化、低聚化并与荧光标记的A元件C2It结合，则应该观察到荧光标记的C2It的GT1b依赖性摄取。该细胞模型不采用先前记载的电刺激来增强BoNT C1中毒，因为假设仅进入足以使融合的非神经特异性C2元件促进易位活性。对于流式细胞术，使一份N2A细胞培养物富集有GT1b，而不使另一份N2A细胞培养物富集有GT1b，将两种培养物与活化的C2II-C1和C2It-488一起孵育，然后在分析之前用链霉蛋白酶处理两种培养物以除去细胞外蛋白质。通过流式细胞术计数具有超过103个吸光度单位的细胞内荧光的细胞，重复的结果显示富集有结合结构域受体GT1b的N2A细胞群优先摄取C2II-C1递送的荧光C2It(图3)。这里显示的结果表明BoNT C1HCC可以用于替换另一个毒素结合结构域并产生GT1b依赖性的进入特异性。为了证实这种摄取依赖于GT1b并确定N2A细胞内的亚细胞定位，使用共聚焦显微镜(图4)。C2It-568优先进入富集有GT1b的细胞并且不与荧光标记的早期内体共定位。通过从由易位结构域产生的孔运输C2It，C2It从早期内体逃逸是有效载荷递送至胞质溶胶的决定因素。这些结果与预期的工程改造的有效载荷和结合/易位结构域之间通过由C2II-C1介导的C2It的GT1b特异性递送的相关性一致。早期内体没有与C2It-568共定位(图4(a))提供了证据以深究其它具有胞质递送的目的有效载荷以操纵胞质。
为了通过C2II-C1融合将活性酶递送至胞质溶胶，可以产生天然的C2毒素A元件C2I。已知C2I酶通过胞质肌动蛋白的ADP-核糖基化引起真核细胞中的细胞圆化。在由C2II-C1介导的将C2I递送至富集有神经节苷脂GT1b的人成胶质细胞瘤A172和HeLa细胞系之后，测试C2I的作用。与没有富集GT1b的对照相比，发现两种细胞系中富集有GT1b的细胞群的细胞圆化的增加超过两倍。相比之下，在融合易位体C2II-C1存在下，有效载荷诱导的同步化HeLa细胞的细胞圆化比Barth等人报道的在天然C2II易位结构域的存在下的效率更低。在表达过程中表征的截短形式的C2II-C1可能已经并入C2II-C1低聚物中，这可能导致结合效率降低。尽管通过SDS-PAGE证实最终纯化成分中明显缺乏单体C2II-C1，但有可能的是解离的或未并入低聚物的单体C2II-C1竞争结合功能形式的低聚递送系统。这些发现证实了由C2II-C1介导的以GT1b依赖性方式特异性递送的C2I酶的天然胞质活性。
在另一个实施方案中，基于修饰的C2It的替代有效载荷可以用于影响BoNT的天然靶标的C2II-C1融合蛋白的递送应用(图1b)。C2I元件中氨基酸残基1-87的最小区域是与天然C2II易位结构域的互补活性所需的。利用修饰的C2I也可以将非标准型多肽进行易位，类似于最近用炭疽致死因子进行的有效载荷开发工作。本公开提供了探索其它结合特性和有效载荷域用于附加应用的基础。
提供以下示例来说明本公开，但不旨在限制本公开。化学品和物理参数被表示为通常的试剂或参数，并且在不脱离本发明的原理和精神的情况下，可以由本领域的技术人员根据本公开进行各种替换或修改。
示例
示例1嵌合构建体：C2II-C1、C1HCC、C2ΔD4、C2It和C2I的构建和表达。
购买质粒pUC57-C2II-C1HCC作为密码子优化的基因合成产物。它由被C1HCC序列上游的七个C-末端氨基酸截短的C2II基因组成，代表BoNT C1氨基酸Y1094-E1291。引物C2IIΔD4F和C2IIΔD4-GS(EP)R扩增对应于C2II氨基酸M1-T592的基因，并添加5’BamHI延伸和3'甘氨酸-丝氨酸-(EP)连接区域，用于与C1HCC结构域的重叠PCR。利用引物(EP)GS-C1HCCF和C1HCCR对BoNT C1HCC基因进行PCR扩增以包含3’EcoRI限制性位点。利用GS(EP)10GSF和C1HCCR进行第二轮PCR以延伸C1HCC的5’扩增子以与C2IIΔD4-GS(EP)序列的3’端互补。将两个所得片段通过重叠PCR融合以产生C2IIΔD4-GS(EP)10GS-C1HCC(C2II-C1)。为了产生C1HCC，利用引物C1HCCF和C1HCCR对pUC57-C2II-C1HCC模板进行PCR扩增。为了产生C2IIΔD4，利用引物C2ΔD4F和C2ΔD4R扩增不含有结构域4的C2II基因。购买作为密码子优化的基因合成产品的质粒pUC57-C2It。利用BamHI和EcoRI限制性位点将C2It(对应于C2I氨基酸1-226，PDB2J3V)直接亚克隆到pGex-2T中。通过将C2It与从合成DNA扩增的DNA融合，利用C2IF和C2IR作为两侧引物以及C2IOF和C2IOR作为重叠引物，通过重叠PCR产生全长C2I(对应于C2I氨基酸1-431)。所有最终的PCR产物用BamHI和EcoRI消化并连接到pGex-2T中。通过电穿孔转化DH5α以繁殖C2II-C1、C1HCC、C2IIΔD4、C2It和C2I作为N-末端GST融合体。通过测序验证DNA构建体的身份。引物序列列于表1中。
表1引物序列
融合蛋白在大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中过量产生。所有细胞系在37℃下在400mL LB，100μg/mL氨苄青霉素中生长，直到在在25℃下用0.5mM IPTG诱导16小时OD600约为0.5时。将细胞以100mL等分试样收集，并将沉淀储存于-20℃。将细胞重新悬浮于PBS，1％Triton，pH 7.4中，并使用细胞破碎仪(French press)在10,000psi下通过三次而使等分的细胞裂解。通过在4℃下以80,000×g超速离心20分钟除去细胞碎片。利用固定化的谷胱甘肽琼脂糖(Genscript)分批亲和纯化GST融合蛋白上清液，每15mL培养物上清液使用150μL清洗树脂，并且在4℃下孵育1小时。树脂用pH7.4的PBS洗涤以除去未结合的蛋白质。根据制造商的建议，利用牛凝血酶从GST标签上切下蛋白质，并通过在注射器中使用玻璃棉过滤从纯化树脂中分离蛋白质。通过以1:5酶与底物的比率与胰蛋白酶一起孵育30分钟来进一步处理C2II-C1，最终通过如所述的胰蛋白酶抑制剂的胰蛋白酶失活来活化重组C2II。
通过使用10％聚丙烯酰胺凝胶的SDS-PAGE或4至12％梯度Bis-Tris凝胶分离C2II-C1、C2IIΔD4、C1HCC、C2I和C2It。使用纯化的C1HCC作为阳性对照并使用C2IIΔD4作为阴性对照，利用抗BoNT C1多克隆抗体(Metabiologics Inc.，Madison，WI)来鉴定C2II-C1。蛋白质通过SDS-PAGE分离，转移到Towbin缓冲液(转模缓冲液)中的硝酸纤维素膜上，用5％奶粉PBS-吐温缓冲液封闭，然后按1:5000稀释在5％奶粉PBS-吐温缓冲液中的1μg/μl抗BoNT C1抗体探测。使用0.5％奶粉PBS-吐温(1:5,000)中的抗兔HRP二抗、利用ECL印迹底物进行信号检测。
在补充有10％(v/v)胎牛血清(FBS)和青霉素-链霉素的Eagle最小基本培养基(EMEM)中培养Neuro-2a细胞(N2A)(ATCC，CCL-131)。A172细胞在补充有10％(v/v)FBS和青霉素-链霉素(100U/mL-100μg/mL)的DMEM中生长。将HeLa细胞(ATCC，CCL-2)在补充有10％FBS和青霉素-链霉素的EMEM中培养。在神经节苷脂富集之前，通过胸腺嘧啶核苷双阻断法使HeLa细胞同步化，利用脱氧胞嘧啶核苷从中解除。通过在室温下在低血清(0.5％FBS)培养基中超声处理50μg/mL GT1b(Enzo Life Sciences，Farmingdale，NY)20分钟来制备富集有神经节苷脂的细胞。随后将细胞与GT1b一起孵育4小时。在加入重组蛋白之前，用PBS洗涤细胞三次以从培养基中除去游离的神经节苷脂。在BD FACSCanto II上用488nm激光谱线和586/42带通滤光器进行的流式细胞术用于通过用碘化丙锭染色DNA来确认HeLa的同步化。计数10,000个细胞/事件，并通过学生t检验(n＝3)确定每个细胞的平均荧光的统计学显著性。
将胺反应性Alexa Fluor染料溶于无水DMSO(10mg/mL)中，并在-20℃下以等分试样储存。将纯化的蛋白浓缩至>5mg/mL，并通过加入1M碳酸氢钠将pH调至8.5至9.0。将在无水DMSO中Alexa Fluor加入蛋白质溶液中，在室温下连续搅拌1小时。过量的Alexa Fluor和DMSO通过凝胶过滤(G-25树脂)除去。将标记的蛋白质以80,000×g超速离心，随后在超速离心之前和之后通过分光光度法评估标记的程度。每个蛋白质分子大于1个荧光分子的标记程度被用作质量控制截止值，并且在超速离心之后没有可见的沉淀或分光光度质量的显著变化。
N2A细胞在24孔培养板中生长至约80％汇合度。如图3c所示使细胞富集GT1b。采用0.5mL工作体积以4μg/mL加入活化的C2II-C1和以2μg/mL加入C2It-488并与细胞一起孵育2小时。细胞用PBS洗涤两次，然后胰蛋白酶消化并收集。将细胞离心并重悬于含有链霉蛋白酶(1μg/mL)的PBS中并在冰上孵育5分钟。然后加入蛋白酶抑制剂混合物，将细胞离心并重悬于含有抑制剂混合物的PBS中。然后使用488激光谱线和530/30发射带通滤光器，通过BDFACS Canto II流式细胞仪对10,000个事件/细胞进行计数。对C2It-488阳性细胞(大于吸光度阈值103吸光度单位)进行计数并评估为总细胞的百分比。通过学生t检验(n＝3)评估重复的实验。
将胶原蛋白包被的12毫米1号盖玻片置于24孔培养板中并接种N2A细胞。N2A细胞生长至约80％汇合度。纯化的C2It用Alexa Flu or 568琥珀酰亚胺酯(C2It-568)而不是Alexa Fluor 488标记以允许与早期内体标志物进行区分。在GT1b富集前约24小时加入杆状病毒转导系统BacMam 2.0 Cell Lights Rab5a-GFP早期内体标志物(LifeTechnologies)。然后如我们的方法中所述，使细胞富集GT1b。洗涤细胞以除去游离的神经节苷脂后加入重组蛋白。采用0.5mL工作体积以4μg/mL加入活化的C2II-C1和以2μg/mL加入C2It-568，并与细胞一起孵育2小时。细胞用PBS洗涤，用4％多聚甲醛固定并用DAPI染色。处理后，使用奥林巴斯倒置IX-81显微镜与奥林巴斯FV 500共聚焦激光扫描显微镜以顺序模式使用激光谱线405nm(蓝色)、488nm(绿色)和543nm(红色)来捕获荧光图像。采用的相应发射屏障分别为430至460nm，505至550nm和560至610nm。透射光用于细胞形态学，所有图像采用具有2倍光学变焦的60倍油镜捕获。所有图像的对比度增加了20％。人成胶质细胞瘤A172细胞(ATCC，CRL-1620)在24孔培养板中生长至约60％汇合度以减少较高汇合度时观察到的细胞圆化。HeLa细胞如前一节所述进行同步化。如我们的方法中所描述的，使两种细胞系都富集有50μg/mL GT1b。采用0.5mL工作体积以40μg/mL添加C2II-C1和以20μg/mL添加C2I，并与细胞一起孵育7小时。采用Amscope MT v 3.0.0.5软件，利用Amscope IN300TC倒置立体显微镜在40x下拍摄细胞的照片。计数圆化的细胞并确定为画面中总细胞的百分比。实验重复三次，并用学生t检验(n＝3)评估统计学显著性。因为与C2II-C1联合使用会产生预期毒性，在生物安全2级实验室进行C2I实验之前获得了机构生物安全委员会的批准。
示例2将肉毒梭菌C2毒素重定向神经元胞质溶胶
采用大肠杆菌表达和纯化基于BoNT亚血清型C1神经毒素和ADP-核糖基化C2毒素的多重组蛋白构建体。在图2a中绘制了天然的BoNT C1，并且在图2b中绘制了天然的C2II结合/易位结构域。制备具有C-末端结构域4缺失的C2毒素(C2IIΔD4)和C1神经毒素结合结构域C1HCC作为对照。将C2IIΔD4和BoNT C1的C1HCC(1094-1291)用十个重复的谷氨酸-脯氨酸的肽接头(EP)10连接以产生C2II-C1(图2c)。另外，构建了两种基于C2I的有效载荷，包括排除活性酶位点的无毒C2It(1-226)和全长C2I(1-431)(图2d)。
证实了谷胱甘肽亲和标签(GST)的切割和由胰蛋白酶将C2II-C1活化为低聚物。将大肠杆菌BL21(DE3)细胞裂解并超速离心除去不溶性蛋白质，使上清液通过亲和树脂。然后将树脂充分洗涤，加载蛋白质结合的树脂以检测全长的树脂结合的蛋白质的质量和凝血酶切割的程度。然后用凝血酶处理树脂以切割GST标签。然后从树脂上洗脱蛋白质并用胰蛋白酶处理。胰蛋白酶活化的C2II-C1单体按照由从观测到的约90kDa的质量移位到远大于250kDa的质量的电泳迁移示出的而进行低聚化。活化的C2IIΔD4也用相同的方法制备并与活化的C2II-C1进行比较。七聚体形式的C2II-C1具有约497kDa的预期分子量，七聚体C2ΔD4具有约350kDa的预期分子量。如预期的那样，C2II-C1低聚物具有比C2IIΔD4低聚物更高的质量。低聚形式的C2II-C1和C2ΔD4在电泳期间在SDS中保持稳定并且在额外加热时部分解离。利用抗BoNT C1抗原性在纯化期间鉴定出另外的条带。然而，在充分加热C2II-C1低聚物之后，确定出了解离的组合物主要是全长的C2II-C1单体。
对低聚化的C2II-C1和C2IIΔD4进行蛋白质印迹(Western blotting)。然后用抗BoNT C1抗体探测蛋白质。采用BoNT C1HCC(MW约23kDa)作为阳性对照。C2II-C1低聚物与抗BoNT C1抗体交叉反应，而低聚化的C2IIΔD4不进行交叉反应。这证实了BoNT C1HCC经由处于低聚状态的(EP)10重复接头成功地与C2IIΔD4融合。
由C2II-C1介导的荧光标记的C2It有效载荷的神经靶向。利用基于荧光标记的C2I的有效载荷C2It(图2d)，研究了由C2II-C1结合/易位元件介导的与具有和不具有GT1b神经节苷脂受体的细胞群的结合和有效载荷内化。鼠成神经细胞瘤Neuro-2A(N2A)细胞在细胞表面天然不存在GT1b，但可以进行人工富集。在纯化有效载荷C2后(图3a)，将AlexaFluor488琥珀酰亚胺酯标记与蛋白质缀合(C2It-488)。将C2It和活化的C2II-C1与差异性富集有GT1b的N2A细胞一起孵育。通过酶消化除去细胞外蛋白质后，采用流式细胞术定量内化的C2It-488。荧光增加的细胞的最高数目对应于富集有GT1b且添加了C2II-C1(图3b，小图2)。在存在和不存在GT1b的情况下没有添加C2II-C1时，C2It的背景摄取是很少的。仅富集GT1b不会显著增加背景荧光(图3b，小图1、4)。只添加C2It-488有效载荷的摄取也很少(图3b，小图3、6)。添加了C2II-C1和C2It但没有富集GT1b的细胞群中出现最高的非靶向摄取(约2％)(图3b，小图5)。学生t检验确定了C2It-488摄取对C2II-C1和GT1b的依赖性是显著的，实验之间p值<0.05。总体而言，在GT1b和C2II-C1的存在下，细胞内C2It-488递送效率达到约18％(细胞群的百分比)(图3c)。
通过流式细胞术定量结合和内化后，通过活化的C2II-C1递送至靶细胞的C2It通过共聚焦荧光光学显微镜进行可视化以确定细胞内定位。将C2It与Alexa Fluor 568荧光染料缀合(C2It-568)。对C2It-568(红色)、Rab5a-GFP早期内体标志物(绿色)和DAPI细胞核(蓝色)进行通道独立成像。观察到的是当使细胞富集有GT1b时，细胞内C2II-C1递送的C2It-568以低水平与早期内体共定位(图4(a))。这个结果与C2It通过活性易位结构域的内体逃逸一致。没有富集GT1b时，C2It-568信号通常被限制在细胞外部，早期内体相关的报道基因水平较低(图4(b))。这些发现与结合/内化流式细胞术数据一致(图3b，c)。另外的变换缺少C2II-C1、GT1b或C2It-568的对照随着与早期内体解离无法实现C2It报告基因的细胞内递送。
由C2II-C1介导的天然C2I酶的重定向。通过由天然C2I有效载荷引起的人成胶质细胞瘤A172和差异性富集有GT1b的同步化HeLa细胞系的细胞圆化来确定将活性酶递送至胞质溶胶。纯化全长C2I(图5a)，与活化的C2II-C1结合，然后添加至细胞系培养物中持续7小时。细胞圆化被确定为是不富集有GT1b的A172细胞群的2.8倍(图5b)。同步化HeLa细胞作为富集有GT1b的非神经细胞系研究了其递送依赖性的细胞圆化，以与先前由Barth等人Infect.Immun.67,5083–5090(1999)报道的不进行GT1b富集的野生型C2II的先前数据进行比较。流式细胞术方法通过DNA的定量证实了HeLa细胞被同步化在S期早期(图5c)。在同步化HeLa细胞中，圆化是不富集有GT1b的细胞群的超过2.1倍。(图5d)。利用学生t检验来评估实验之间的实验显著性。将对照群与富集有GT1b的群比较得到p值<0.05。
SEQ ID NO 1-6的序列列表：
SEQ ID No.1–
NNINDSKILSLQNRKNTLVDTSGYNAEVSEEGDVQLNPIFPFDFKLGSSGEDRGKVIVTQNENIVYNSMYESFSISFWIRINKWVSNLPGYTIIDSVKNNSGWSIGIISNFLVFTLKQNEDSEQSINFSYDISNNAPGYNKWFFVTVTNNMMGNMKIYINGKLIDTIKVKELTGINFSKTITFEINKIPDTGLITSDSDNINMWIRDFYIFAKELDGKDINILFNSLQYTNVVKDYWGNDLRYNKEYYMVNIDYLNRYMYANSRQIVFNTRRNNNDFNEGYKIIIKRIRGNTNDTRVRGGDILYFDMTINNKAYNLFMKNETMYADNHSTEDIYAIGLREQTKDINDNIIFQIQPMNNTYYYASQIFKSNFNGENISGICSIGTYRFRLGGDWYRHNYLVPTVKQGNYASLLESTSTHWGFVPVSE
SEQ ID No.2–
MLVSKFENSVKNSNKNYFTINGLMGYYFENDFFNLNIISPTLDGNLTFSKEDINSILGNKIIKSARWIGLIKPSITGEYILSTNSPNCRVELNGEIFNLSLNTSNTVNLIQGNVYDIRIEQLMSENQLLKNYEGIKLYWETSDIIKEIIPSEVLLKPNYSNTNEKSKFIPNNTLFSNAKLKANANRDTDRDGIPDEWEINGYTVMNQKAVAWDDKFAANGYKKYVSNPFKPCTANDPYTDFEKVSGQIDPSVSMVARDPMISAYPIVGVQMERLVVSKSETITGDSTKSMSKSTSHSSTNINTVGAEVSGSLQLAGGIFPVFSMSASANYSHTWQNTSTVDDTTGESFSQGLSINTAESAYINPNIRYYNTGTAPVYNVTPTTTIVIDKQSVATIKGQESLIGDYLNPGGTYPIIGEPPMALNTMDQFSSRLIPINYNQLKSIDNGGTVMLSTSQFTGNFAKYNSNGNLVTDGNNWGPYLGTIKSTTASLTLSLPDQTTQVAVVAPNFSDPEDKTPRLTLEQALVKAFRLEKKNGKFYFHGMEISANQKIQVFLDRNTNVDFENQLKNTANKDIMNCIIKRNMNILVKVITFKENISSINIINDTNFGVESMTGLSKRIKGNDGIYRASTKSFSFKSKEIKYPEGFYRMRFVIQSYEPFTCNFKLFNNLIYSNSFDIGYYDEFFYFYCNGSKSFFDISCDIINSINRLSGVFLI
SEQ ID No.3–
MPIIKEPIDFINKPESEAKEWGKEEEKRWFTKLNNLEEVAVNQLKNKEYKTKIDNFSTDILFSSLTAIEIMKEDENQNLFDVERIREALLKNTLDRDAIGYVNFTPKELGINFSIRDVELDRDISDETLDKVRQQIINQEYTKFSFISLGLNDNSINESVPVIVKTRVPTTFDYGVLNDKETVSLLLNQGFSIIPESAIITTIKGKDYILIEGSLSQELDFYNKGSEAWGAENYGDYISKLSHEQLGALEGYLHSDYKAINSYLRNNRVPNNDELNKKIELISSALSVKPIPQTLIAYRRVDGIPFDLPSDFSFDKKENGEIIADKQKLNEFIDKWTGKEIENLSFSSTSLKSTPSSFSKSRFIFRLRLSEGAIGAFIYGFSGFQDEQEILLNKNSTFKIFRITPITSIINRVTKMTQVVIDAEGIQNKEI
SEQ ID No.4–
MLVSKFENSVKNSNKNYFTINGLMGYYFENDFFNLNIISPTLDGNLTFSKEDINSILGNKIIKSARWIGLIKPSITGEYILSTNSPNCRVELNGEIFNLSLNTSNTVNLIQGNVYDIRIEQLMSENQLLKNYEGIKLYWETSDIIKEIIPSEVLLKPNYSNTNEKSKFIPNNTLFSNAKLKANANRDTDRDGIPDEWEINGYTVMNQKAVAWDDKFAANGYKKYVSNPFKPCTANDPYTDFEKVSGQIDPSVSMVARDPMISAYPIVGVQMERLVVSKSETITGDSTKSMSKSTSHSSTNINTVGAEVSGSLQLAGGIFPVFSMSASANYSHTWQNTSTVDDTTGESFSQGLSINTAESAYINPNIRYYNTGTAPVYNVTPTTTIVIDKQSVATIKGQESLIGDYLNPGGTYPIIGEPPMALNTMDQFSSRLIPINYNQLKSIDNGGTVMLSTSQFTGNFAKYNSNGNLVTDGNNWGPYLGTIKSTTASLTLSLPDQTTQVAVVAPNFSDPEDKTPRLTLEQALVKAFRLEKKNGKFYFHGMEISANQKIQVFLDRNTNVDFENQLKNTANKDIMNCIIKRNMNILVKVITGSEPEPEPEPEPEPEPEPEPEPGSTNVVKDYWGNDLRYNKEYYMVNIDYLNRYMYANSRQIVFNTRRNNNDFNEGYKIIIKRIRGNTNDTRVRGGDILYFDMTINNKAYNLFMKNETMYADNHSTEDIYAIGLREQTKDINDNIIFQIQPMNNTYYYASQIFKSNFNGENISGICSIGTYRFRLGGDWYRHNYLVPTVKQGNYASLLESTSTHWGFVPVSE
SEQ ID No.5–
GSEPEPEPEPEPEPEPEPEPEPGS
SEQ ID No.6–
MPIIKEPIDFINKPESEAKEWGKEEEKRWFTKLNNLEEVAVNQLKNKEYKTKIDNFSTDILFSSLTAIEIMKEDENQNLFDVERIREALLKNTLDRDAIGYVNFTPKELGINFSIRDVELDRDISDETLDKVRQQIINQEYTKFSFISLGLNDNSINESVPVIVKTRVPTTFDYGVLNDKETVSLLLNQGFSIIPESAIITTIKGKDYILIEGSLSQELDFYNKG
虽然已经参照特定示例具体示出和描述了本公开，但是本领域技术人员将会理解，在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可以进行形式和细节上的各种其它改变。应该理解的是，在不脱离本文所公开的发明概念的情况下，可以对本发明进行各种改变以适应不同的实施方案，并且这些发明概念由所附权利要求书所组成。
参考
所有引用的参考文献(包括参考文献、专利、专利申请和网站)的内容在本申请中引用或在下面列出，在此为了任何目的明确地通过引用并入本公开。除非另有说明，否则本公开可以使用本领域公知的免疫学、分子生物学和细胞生物学的常规技术。
本公开内容还整体引入分子生物学领域众所周知的技术和方法作为参考。这些技术包括但不限于以下出版物中描述的技术。
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Claims (24)

1.一种用于将药剂递送至靶细胞的组合物，包含：
靶细胞结合单元，
成孔单元，和
包含所述药剂的有效载荷单元，所述有效载荷单元非共价地结合到所述成孔单元；
其中所述成孔单元是衍生自第一AB类非神经毒性二元毒素的多肽，其中所述靶细胞结合单元是衍生自第二类毒素的多肽，所述第二类不同于所述第一类。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述成孔单元是衍生自肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)毒素C2的成孔单元的重链的多肽或多肽低聚物。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述成孔单元包含天然的或修饰的衍生自除肉毒梭菌(C.botulinum)毒素C2以外的毒素的重链结合结构域。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述成孔单元包含天然的或修饰的成孔结构域，所述天然的或修饰的成孔结构域衍生自选自由产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)α-毒素、β-毒素、ε-毒素和ι-毒素、螺旋梭菌(Clostridium spiroforme)ι样毒素、炭疽毒素组成的组的毒素。
5.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述靶细胞结合单元包含天然的或修饰的衍生自除肉毒梭菌毒素C2以外的毒素的重链结合结构域。
6.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述靶细胞结合单元包含天然的或修饰的重链结合结构域，所述天然的或修饰的重链结合结构域衍生自选自由肉毒梭菌神经毒素、产气荚膜梭菌毒素α、β、ε和ι毒素、螺旋梭菌ι样毒素、霍乱毒素、炭疽毒素、志贺毒素、志贺样毒素、白喉毒素、蓖麻毒蛋白、外毒素A组成的组的毒素。
7.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述靶细胞结合单元优先结合神经细胞。
8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物优先将所述药剂递送至神经细胞。
9.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述靶细胞结合单元衍生自肉毒梭菌神经毒素C1的重链结合结构域(C1Hcc)。
10.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述靶细胞结合单元共价结合至所述成孔单元。
11.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述有效载荷单元不与所述靶细胞结合单元或所述成孔单元共价结合。
12.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述药剂包含至少一种选自由治疗剂、诊断剂及它们的组合组成的组的成员。
13.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述药剂包含至少一种选自由毒素、细胞周期阻滞剂、凋亡诱导剂、DNA复制抑制剂、RNA合成抑制剂、蛋白质合成抑制剂、酶、蛋白质结合剂、抗体、中和抗体、标记试剂、磁珠及它们的组合组成的组的成员。
14.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述药剂包含ADP-核糖基转移酶。
15.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述药剂包含来自肉毒梭菌毒素C2的C2I。
16.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述试剂包含荧光剂。
17.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述靶细胞结合单元是来自肉毒梭菌神经毒素C1的重链结合结构域(C1Hcc)，其中所述成孔单元是肉毒梭菌毒素C-2的成孔单元的重链，其中所述有效载荷单元包含来自肉毒梭菌毒素C-2的C2I。
18.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述靶细胞结合单元包含与SEQID No.1的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的多肽，其中所述成孔单元包含与SEQ IDNo.2的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的多肽，其中所述有效载荷单元包含与SEQ IDNo.3的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的多肽。
19.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述靶细胞结合单元和所述成孔单元共价连接以形成与SEQ ID No.4具有至少90％序列同一性的多肽，其中所述有效载荷单元包含与SEQ ID No.3的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的多肽。
20.一种将药剂递送至靶细胞的方法，包括将前述权利要求中任一项所述的组合物施用于靶细胞。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述组合物通过注射施用于受试者，其中所述受试者包含所述靶细胞。
22.根据权利要求20-21中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是选自由脑肿瘤细胞、成神经细胞瘤细胞、成视网膜细胞瘤细胞、外周神经元、运动神经元、感觉神经元或它们的组合组成的组的成员。
23.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码与选自由SEQ ID NO：1-6组成的组的多肽具有至少90％同一性的多肽。
24.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求23所述的多核苷酸。
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